( PDF ) Estudos farmacognósticos e avaliação de atividades biológicas de extratos obtidos das cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES

BIOLÓGICAS DE EXTRATOS OBTIDOS DAS CASCAS PULVERIZADAS DE

Endopleura uchi (HUBER) CUATREC. (HUMIRIACEAE)

Mestrando: Flávio Augusto Sanches Politi

Orientadora: Profa. Dra. Rosemeire C. L. R. Pietro

Co-Orientadora: Profa. Dra. Raquel Regina Duarte Moreira

ARARAQUARA – SP

2009

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Livros Grátis

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES

BIOLÓGICAS DE EXTRATOS OBTIDOS DAS CASCAS PULVERIZADAS DE

Endopleura uchi (HUBER) CUATREC. (HUMIRIACEAE)

FLÁVIO AUGUSTO SANCHES POLITI

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e

Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Mestrando: Flávio Augusto Sanches Politi

Orientadora: Profa. Dra. Rosemeire C. L. R. Pietro

Co-Orientadora: Profa. Dra. Raquel Regina Duarte Moreira

ARARAQUARA – SP

2009

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Ficha Catalográfica

Elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

CAPES: 40300005

Politi, Flávio Augusto Sanches

P769e Estudos farmacognósticos e avaliação de atividades biológicas de

extratos obtidos das cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber)

Cuatrec. / Flávio Augusto Sanches Politi. – Araraquara, 2009.

143 f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós

Graduação em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro

Co-orientador: Raquel Regina Duarte Moreira

. 1. Endopleura uchi. 2. Estudos farmacognósticos. 3. Atividades

biológicas. 4. uchi-amarelo. I. Pietro, Rosemeire C. L. Rodrigues, orient.

II. Moreira, Raquel Regina Duarte, co-orient. III. Título.

“A mente que se abre

a uma nova idéia

jamais voltará ao seu

tamanho original”

(Albert Einstein)

Ao meu saudoso pai,

José Américo Politi e à

minha querida mãe,

Delci Aparecida

Sanches Politi

AGRADECIMENTOS

 Ao meu pai José Américo Politi, ausente materialmente, mas pela força

do amor, presente constantemente em minha vida, tendo sido

responsável direto pela formação do meu caráter, ensinando-me os

valores de Honestidade, Humanidade e Humildade

 À minha mãe Delci Aparecida Sanches Politi, que me deu a Vida e,

enquanto pôde, depositou-me todo o carinho, preocupação e amor

 À Profa. Dra. Rosemeire C. L. R. Pietro pela orientação exemplar,

sempre disposta a colaborar, com empenho incansável e exemplo de

profissionalismo, tendo acreditado e me incentivado desde o princípio,

sendo a grande responsável pelo meu crescimento e desenvolvimento

intelectual

 À Profa. Dra. Raquel R. D. Moreira, não só pela co-orientação, mas

também pela amizade e pela oportunidade dada no início do trabalho,

”abrindo-me as portas” para uma área de estudos totalmente nova e

fascinante

 Ao Prof. Dr. Luís Vítor S. Sacramento, pela amizade e pela ajuda

primorosa em diversos momentos

 À Profa. Dra. Hérida R. N. Salgado, pelo incentivo e pelas cobranças,

além das informações e sugestões dadas, não só no momento da

defesa, mas também ao longo de todo o curso

 À Profa. Dra. Elfriede M. Bacchi e à Profa. Dra. Taís M. Baub, pelas

sugestões e dicas dadas por ocasião da qualificação, bem como pelas

palavras de incentivo

 À Profa. Dra. Niege A. J. C. Furtado, pela valiosa presença na minha

defesa, bem como por suas palavras de apoio e sugestionamentos

muito bem assimilados

 Ao Prof. Dr. João C. P. de Mello, por ter fornecido o reagente para

execução do doseamento de taninos totais

 Ao técnico do Laboratório de Farmacognosia, Luís Eduardo, por estar

sempre disposto a colaborar

 Aos técnicos do Laboratório de Química Farmacêutica, Osmar e

Matheus, por terem me ajudado e disponibilizado equipamentos em

diversos momentos

 Aos meus colegas de Laboratório, Émerson, Tatiana, Filipe, Elzira,

Natália, Lara, Carol, Henrique, Ana Paula e Renata, pela amizade e boa

convivência

 Aos amigos Ademir, Marcelo, Silviane, Ketelyn e Andréia pela ajuda em

diversos momentos

 Aos funcionários da Biblioteca, Ana, Irani, Sônia e Moacir, e às

funcionárias da Secretaria de Pós Graduação da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, Cláudia, Sônia e Laura

 À CNPQ pela bolsa concedida

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 6

2.1. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) ............................................ 6

2.2. Constituição fitoquímica ................................................................................... 8

2.3. Taninos ............................................................................................................. 9

2.4. Processos extrativos ...................................................................................... 12

2.5. Atividade antibacteriana e toxicidade ............................................................. 15

2.6. Microrganismos utilizados .............................................................................. 19

3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 23

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 24

4.1. MATERIAL ..................................................................................................... 24

4.1.1. Solventes, reagentes e meios de cultura..................................................... 24

4.1.2. Equipamentos e utensílios .......................................................................... 26

4.1.3.1. Cascas de Endopleura uchi pulverizadas adquiridas da empresa “Sítio da

Mata” ..................................................................................................................... 28

4.1.3.2. Cascas in natura (secas) de Endopleura uchi adquiridas no Mercado

Municipal “Ver-o-Peso” (Belém, PA) ..................................................................... 28

4.1.4. Cepas padrão .............................................................................................. 29

4.1.5. Células de mamíferos.................................................................................. 29

4.2. METODOLOGIAS .......................................................................................... 29

4.2.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS .................................................................. 29

4.2.1.1. Granulometria ........................................................................................... 29

4.2.1.2. Determinação do pH................................................................................. 30

4.2.1.3. Determinação da densidade aparente não compactada .......................... 30

4.2.1.4. Determinação do teor de cinzas totais .................................................... 31

4.2.1.5. Determinação da perda por dessecação em balança com infravermelho

(INFRATEST) ........................................................................................................ 31

4.2.1.6. Perda por dessecação em estufa ............................................................. 32

4.2.1.7. Determinação do teor de extrativos para a droga .................................... 32

4.2.2. ANÁLISES MICROSCÓPICAS .................................................................. 33

4.2.2.1. Análise microscópica comparativa das amostras pulverizadas com as

amostras in natura (secas) de cascas de E. uchi .................................................. 33

4.2.2.2. Montagem de lâminas com material pulverizado de E. uchi adquirido da

empresa “Sítio-da-Mata” ....................................................................................... 33

4.2.2.3. Inclusão em historresina do material vegetal adquirido do Mercado

Municipal “Ver-o-Peso” (Belém, PA) ..................................................................... 34

4.2.2.4. Pesquisa histoquímica para compostos fenólicos .................................... 35

4.2.3. ANÁLISES FITOQUÍMICAS ....................................................................... 35

4.2.3.1. Triagem fitoquímica das classes de metabólitos secundários .................. 35

4.2.3.1.1. Flavonóides ........................................................................................... 36

4.2.3.1.1.1. Reações de caracterização de flavonóides ........................................ 36

4.2.3.1.2. Antraquinonas ....................................................................................... 37

4.2.3.1.2.1. Antraquinonas livres ........................................................................... 37

4.2.3.1.2.2. Glicosídeos antraquinônicos (reação de Borntraeger) ....................... 37

4.2.3.1.2.3. Glicosídeos Cardiotônicos .................................................................. 38

4.2.3.1.3. Reações de caracterização de glicosídeos cardiotônicos ..................... 38

4.2.3.1.3.1. Reação com anel lactônico insaturado ............................................... 38

4.2.3.1.3.2. Reação com desoxi-açúcares ............................................................ 39

4.2.3.1.4. Taninos .................................................................................................. 40

4.2.3.1.4.1. Testes de identificação de taninos ..................................................... 40

4.2.3.1.5. Saponinas ............................................................................................. 41

4.2.3.1.6. Alcalóides .............................................................................................. 41

4.2.3.1.7. Cumarinas ............................................................................................. 41

4.2.3.2. Perfil cromatográfico ................................................................................. 42

4.2.3.3. Perfil espectrofotométrico na região de luz ultravioleta ............................ 43

4.2.3.4. Obtenção e rendimento dos extratos........................................................ 43

4.2.3.4.1. Obtenção de extratos por percolação.................................................... 45

4.2.3.4.2. Obtenção dos extratos por maceração .................................................. 46

4.2.3.4.3. Obtenção dos extratos por turbo-extração ............................................ 46

4.2.3.4.4. Obtenção dos extratos por decocção .................................................... 47

4.2.3.4.5. Obtenção dos extratos por infusão ........................................................ 47

4.2.4. ANÁLISE QUANTITATIVA ......................................................................... 48

4.2.4.1 Determinação do teor de fenóis totais ....................................................... 48

4.2.4.1.1. Preparo da solução padrão de ácido tânico .......................................... 48

4.2.4.1.2. Preparo das soluções de amostra ......................................................... 49

4.2.4.1.3. Cálculo do teor de fenóis totais ............................................................. 49

4.2.4.2. Doseamento de taninos totais em extratos vegetais ................................ 50

4.2.5. Determinação da capacidade de seqüestro de radicais livres ..................... 52

4.2.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................ 53

4.2.6.1. Preparo dos antibióticos ........................................................................... 53

4.2.6.2. Solução estoque de extrato ...................................................................... 53

4.2.6.3. Preparo da suspensão de bactéria ........................................................... 54

4.2.6.4. Preparo da suspensão de levedura .......................................................... 54

4.2.6.5. Teste de difusão em ágar com templates ................................................. 54

4.2.6.6. Teste de difusão em ágar com discos de papel ....................................... 55

4.2.6.7. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) através do método

de diluição em microplaca e concentração bactericida mínima (CBM) ................. 56

4.2.7. TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA EM CAMUNDONGOS .............. 58

4.2.8. TESTE DA MOTILIDADE INTESTINAL EM CAMUNDONGOS ................. 58

4.2.9. AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE .......................................................... 59

4.2.9.1. Preparo das amostras .............................................................................. 59

4.2.9.2. Avaliação da citotoxicidade dos extratos .................................................. 60

4.2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 62

5. RESULTADOS .................................................................................................. 63

5.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ..................................................................... 63

5.1.1. Granulometria .............................................................................................. 63

5.1.2. Determinação do pH.................................................................................... 64

5.1.3. Determinação da densidade aparente não compactada ............................. 65

5.1.4. Determinação do teor de cinzas totais ....................................................... 65

5.1.5. Determinação da perda por dessecação em balança com infravermelho ... 66

5.1.6. Determinação da perda por dessecação em estufa .................................... 67

5.1.7. Determinação do teor de extrativos para a droga ....................................... 67

5.2. ANÁLISES MICROSCÓPICAS ...................................................................... 68

5.2.1. Análise microscópica comparativa das amostras pulverizadas de cascas de

Endopleura uchi com amostras de cascas in natura (secas) ................................ 68

5.2.2. Pesquisa histoquímica para compostos fenólicos ....................................... 70

5.3. ANÁLISES FITOQUÍMICAS ........................................................................... 71

5.3.1. Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários ..... 71

5.3.2. Perfil cromatográfico.................................................................................... 72

5.3.3. Perfil espectrofotométrico na região de luz ultravioleta ............................... 77

5.3.4. Obtenção e rendimento dos extratos .......................................................... 79

5.4. ANÁLISES QUANTITATIVAS ....................................................................... 79

5.4.1. Determinação do teor de fenóis totais ......................................................... 79

5.4.2. Doseamento de taninos totais em extratos vegetais ................................... 82

5.4.3. Determinação da capacidade de sequestro de radicais livres ..................... 84

5.5. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................... 86

5.5.1. Teste de difusão em ágar ............................................................................ 86

5.5.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) através do método

de diluição em microplaca e concentração bactericida mínima (CBM) ................. 91

5.6. TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA EM CAMUNDONGOS ................. 92

5.7. TESTE DA MOTILIDADE INTESTINAL EM CAMUNDONGOS .................... 92

5.8. AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE ............................................................ 93

6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 95

7. CONCLUSÕES ............................................................................................... 108

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 110

9. ANEXOS ......................................................................................................... 124

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. A) Vista panorâmica da espécie; B)

Fotografia de uma tora do caule .............................................................................. 6

FIGURA 2. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. A) Casca do caule in natura; B)

Cascas pulverizadas, embaladas em pacotes para comercialização em mercados,

férias livres e farmácias magistrais ......................................................................... 7

FIGURA 3. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 5% (m/v) ..................................................................................................... 44

FIGURA 4. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 10% (m/v) ................................................................................................... 44

FIGURA 5. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 20% (m/v) ................................................................................................... 45

FIGURA 6. Esquema da microplaca utilizada para determinação da concentração

inibitória mínima para bactérias ............................................................................. 57

FIGURA 7. Representação esquemática da avaliação de citotoxicidade de

extratos vegetais de E. uchi em microplaca de 96 poços ...................................... 61

FIGURA 8. Tamanho médio da partícula das cascas pulverizadas de Endopleura

uchi ........................................................................................................................ 64

FIGURA 9. Secções anatômicas de cascas in natura secas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae). A) Secção longitudinal radial, submetida ao

reagente azul de toluidina, evidenciando a disposição anatômica estrutural. A seta

indica células parenquimáticas preenchidas por material fenólico, corado mais

intensamente. A ponta de seta indica idioblastos cristalíferos dispostos ao longo

do esclerênquima. B) Secção longitudinal radial, submetida ao reagente cloreto

férrico 10%, evidenciando a presença de material fenólico no tecido

parenquimático ...................................................................................................... 69

FIGURA 10. Microscopia do pó da casca de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec.

(Humiriaceae) submetida ao reagente azul de toluidina. Ga – grão de amido; Ic –

idioblastos cristalíferos; Cp – célula pétrea; Fg – fibra gelatinosa ............................. 70

FIGURA 11. Secções anatômicas de cascas in natura secas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae). A) Secção longitudinal radial evidenciando os

principais tecidos formadores, bem como os idioblastos cristalíferos abundantes

dispostos ao longo do esclerênquima (ponta de seta). As esclereides mostram-se

acompanhadas de conteúdo fenólico, corado intensamente (seta); B) Visualização

do resultado da reação com FeCl

10% (m/v), evidenciando os depósitos de

compostos fenólicos (seta) no interior das esclereides ............................................. 71

FIGURA 12. Cromatograma das frações acetato de etila do extrato decocção 20%

(m/v) obtidos das cascas pulverizadas de Endopleura uchi ...................................... 74

FIGURA 13. Cromatograma dos seguintes extratos de E. uchi: decocção a 5, 10 e

20% (m/v) (D5, D10 e D20); infusão a 5, 10 e 20% (m/v) (I5, I10 e I20);

maceração a 5, 10 e 20% (m/v) (M5, M10 e M20); percolação a 5, 10 e 20% (m/v)

(P5, P10 e P20) e turbo-extração a 5, 10 e 20% (m/v) (T5, T10 e T20). Sistema

eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (9:5:1 v/v/v).; revelador: cloreto férrico

2% em metanol ......................................................................................................... 76

FIGURA 14. Perfil espectrofotométrico, na região de luz ultravioleta, de ácido

gálico (linha azul) e ácido tânico (linha preta) ........................................................... 78

FIGURA 15. Perfil espectrofotométrico, na região de UV (190-400 nm), dos

seguintes extratos de cascas pulverizadas de Endopleura uchi: linha preta –

decocção 20% (m/v); linha azul – infusão 10% (m/v); linha vermelha – maceração

5% (m/v); linha rosa – percolação 10% (m/v); linha amarela – turbo-extração 20%

(m/v) .......................................................................................................................... 78

FIGURA 16. Curva analítica de absorvância da solução de ácido tânico ................. 80

FIGURA 17. Teor de fenóis totais dos extratos de cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) ..................................................... 82

FIGURA 18. Teor de taninos totais dos extratos de cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) ..................................................... 84

FIGURA 19. Atividade anti-radicalar percentual das substâncias padrão e dos

extratos estudados na concentração de 250 µg/mL. (1) ácido gálico; (2) rutina; (3)

vitamina C; (4) extrato de Ginkgo biloba; (5) decocção 20% (m/v); (6) infusão 10%

(m/v); (7) maceração 5% (m/v); (8) percolação 10% (m/v); (9) turbo-extração 20%

(m/v) .......................................................................................................................... 86

FIGURA 20. A) Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em

ágar com template dos extratos de E. uchi contra Candida albicans; B) Avaliação

da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar com template dos

extratos de E. uchi contra E. coli. Anf: anfotericina B; Amp: ampicilina; D20:

decoccção 20% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); M5: maceração 5% (m/v); P10:

percolação 10% (m/v); T20: turbo-extração 20% (m/v) ............................................. 90

FIGURA 21. A) Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em

ágar com discos dos extratos de E. uchi contra Candida albicans; B) Avaliação da

atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar com discos dos extratos

de E. uchi contra S. aureus. Anf: anfotericina B; Amp: ampicilina; D20: decoccção

20% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); M5: maceração 5% (m/v); P10: percolação

10% (m/v); T20: turbo-extração 20% (m/v)................................................................ 90

FIGURA 22. Determinação de CIM pelo método de microdiluição em microplaca

contra Staphylococcus aureus .................................................................................. 92

FIGURA 23. Representação dos resultados de citotoxicidade dos extratos obtidos

de cascas pulverizadas de E. uchi ............................................................................ 94

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1. Cepas de bactérias e levedura utilizadas no projeto .......................... 29

TABELA 2. Porcentagens cumulativas de passagem e de retenção do pó das

cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) ........... 63

TABELA 3. Média dos valores de pH do pó das cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. e pH da água destilada utilizada ..................... 64

TABELA 4. Densidade aparente de três amostras de cascas pulverizadas de E.

uchi, obtidas comercialmente ................................................................................ 65

TABELA 5. Teor de cinzas totais de cascas pulverizadas de E. uchi .................... 65

TABELA 6. Decréscimo de massa das amostras iniciais do pó das cascas

pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. ............................................... 66

TABELA 7. Decréscimo de massa das amostras iniciais do pó das cascas

pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. ............................................... 67

TABELA 8. Análise fitoquímica das cascas pulverizadas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) ............................................................................ 72

TABELA 9. Fator de retenção das manchas apresentadas no cromatograma da

figura 12 ................................................................................................................ 75

TABELA 10. Fator de retenção das manchas apresentadas no cromatograma da

figura 13 ................................................................................................................ 77

TABELA 11. Valores de rendimento em porcentagem (%) dos extratos obtidos a

partir de cascas pulverizadas de E. uchi (Huber) Cuatrec. ................................... 79

TABELA 12. Valores dos teores de fenóis totais (TFT) dos extratos de E. uchi ... 61

TABELA 13. Valores de teores de extrativos (TE) e taninos totais (TT) para cada

um dos extratos obtidos a partir de cascas pulverizadas de E. uchi ..................... 83

TABELA 14. Atividade anti-radicalar percentual das substâncias padrão e dos

extratos estudados na concentração de 250 µg/mL .............................................. 85

TABELA 15. Diâmetro dos halos (mm) de diferentes extratos de cascas de E. uchi

pelo teste de difusão em ágar com templates ....................................................... 88

TABELA 16. Diâmetro dos halos (mm) de diferentes extratos de cascas de E. uchi

pelo teste de difusão em ágar com discos ............................................................ 89

TABELA 17. Distância percorrida pelo carvão ativo no intestino dos camundongos

após a administração do extrato aquoso das cascas pulverizadas de Endopleura

uchi e da solução fisiológica controle ........................................................................ 93

TABELA 18. Avaliação da citotoxicidade de extratos de cascas pulverizadas de E.

uchi frente a células da córnea de coelhos da linhagem SIRC CCL-60 .................... 94

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Aa: Absorvância da amostra

Ad: Absorvância da solução de DPPH

ATCC: American Type Culture Collection

BHI: Brain-heart infusion

BM: Banho-maria

CC: Cepa clínica

CCDC: Cromatografia em camada delgada comparativa

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

: Densidade aparente

DMSO: Dimetilsulfóxido

DP: Desvio padrão

DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

EtOH 50%: Etanol 50%

FD: Fator de diluição

GMA: Glicol metacrilato

: Massa da proveta cheia

: Massa da proveta vazia

NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards

PNA: Polifenóis não adsorventes

PT: Polifenóis totais

TE: Teor de extrativos

TT: Taninos totais

USP: United States Pharmacopeia

UV: Ultra-violeta

: Volume da proveta

RESUMO

O desenvolvimento de agentes antimicrobianos eficazes e seguros para

combater infecções bacterianas revolucionou o tratamento médico nos últimos

60 anos. Entretanto, aliado à própria evolução dos organismos, o uso

indiscriminado dos antibióticos selecionou espécies extremamente resistentes

aos agentes químicos utilizados. Como uma tentativa de contornar tal situação

e ampliar o arsenal de compostos ativos contra microrganismos patógenos, o

estudo de plantas tornou-se crescente no cenário científico. Para utilizarmos os

fitoterápicos na prevenção e/ou cura de doenças são necessários estudos

prévios relativos a aspectos botânicos, farmacognósticos, fitoquímicos,

farmacológicos e toxicológicos. Neste trabalho, foram estudados extratos

obtidos com as cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec.,

quanto aos aspectos farmacognósticos, propriedades antimicrobianas frente a

diversas linhagens bacterianas e uma levedura, e a citotoxicidade contra

células de mamíferos. Nossos resultados mostraram que quanto ao

rendimento, o melhor extrato foi obtido com a percolação 20% (m/v) e, quanto

ao teor de taninos totais, o melhor extrato foi obtido com a percolação 10%

(m/v). Nenhum dos extratos utilizados apresentou efetividade na inibição do

crescimento para a os microrganismos testados. A exceção ocorreu para

Staphylococcus aureus, no qual os extratos apresentaram baixa atividade.

Quanto à citotoxicidade, todos os extratos analisados apresentaram IC

maior

que a maior concentração aplicada (2 mg/mL).

ABSTRACT

The development of effective and safe antimicrobial agents to combat

microbial infections revolutionized the medical treatment in the last 60 years.

However, together to the self evolution of the organisms, the indiscriminate use

of the antibiotics selected extremely resistant species to chemical agents used.

As an attempt of to avoid this situation and to enlarge the arsenal of active

compounds against pathogenic microorganisms, the study of plants has been

growing in the scientific scenary. For the use of phytotherapics in the prevention

and/or cure of diseases are necessary previous studies relative to botanical,

pharmacognostics, phytochemical, pharmacological and toxicological aspects.

In this work, were studied extracts obtained with the powdered barks of

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec., for their pharmacognostic aspects,

antimicrobial properties against to several bacterial strains and a yeast, and the

cytotoxicity against mammals cells. Our results showed that, related to yield, the

best extract was obtained with the percolation 20% (w/v) and, related to total

tannins teor, the best extract was obtained with the percolation 10% (w/v). None

of the used extracts presented inhibition of the growth to the most analyzed

microorganisms. The exception occurred against the Staphylococcus aureus

strain, in which the extracts presented a low activity. All analyzed extracts for

cytotoxicity presented IC

higher than the higher applied concentration (2

mg/mL).

1 INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único

recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas

no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto a espécie

humana. No processo histórico das plantas medicinais, muitas civilizações

descreveram a utilização de ervas e outros vegetais como forma de

medicamento, em seus registros e manuscritos. Os babilônios e sumerianos

(2.600 a.C.) usavam em seus remédios, frutos, folhas, flores, cascas e raízes

como a oliveira e o alho. A “Tabuinha Sumeriana”, uma coleção de textos

médicos em tabletes de argila, contém registros dos primeiros sintomas de

doenças e a prescrição para cada enfermidade, sendo considerado o mais

antigo tratado de medicina (TEIXEIRA, 1994; MIGUEL e MIGUEL, 1999). Já no

primeiro século da era Cristã, Dioscórides, médico-cirurgião grego, publicava

“De Materia Medica”, um catálogo contendo cerca de 600 plantas do

Mediterrâneo, incluindo informações de como os gregos as utilizavam para fins

médicos, locais onde poderiam ser encontradas e informações sobre uso, se

eram comestíveis ou venenosas (SIMÕES, 2004). Foi durante a Renascença

(séculos XIV a XVI) que aparecem as primeiras farmacopéias, com o propósito

de padronizar a composição e a forma de preparações prescritas pelos

médicos da época. A primeira farmacopéia européia foi publicada em 1498, em

Florença: “Nuovo Receptario Compositio”; sendo que a segunda foi publicada

em Barcelona, em 1511: “Concordie apothecariorum Barchinone medicines

Compositis” (LÓPEZ-MUÑOZ et al., 2006). Em 1929 foi oficializado o Código

Farmacêutico Brasileiro, ou seja, a primeira edição da Farmacopéia Brasileira,

2 INTRODUÇÃO

apresentada pelo farmacêutico e professor de Farmácia Rodolpho Albino Dias

da Silva, sendo uma obra de um único autor, equiparando-se às farmacopéias

dos países tecnologicamente desenvolvidos, diferenciando-se por conter

descrições de mais de 200 plantas medicinais, a maioria delas de origem

brasileira (ANVISA, 2004). Parte destas plantas foi suprimida da segunda

edição e outra parte foi destinada ao Formulário Nacional. Atualmente, a quarta

edição da Farmacopéia Brasileira (1988 e seus suplementos publicados em

1996, 2000, 2002) conta com apenas 23 monografias atualizadas que, na sua

grande maioria, são monografias de plantas exóticas (FARIAS, 1999).

Apesar de as plantas representarem, durante séculos, a única fonte de

agentes terapêuticos para o homem, na primeira metade do século XX, com o

advento da Revolução Industrial e o desenvolvimento da química orgânica, os

produtos de origem vegetal foram temporariamente esquecidos em detrimento

dos compostos sintéticos. Isto ocorreu, entre outros fatores, pela maior

facilidade de obtenção dos compostos puros, possibilidade de modificações

estruturais e pelo crescente poder econômico das indústrias farmacêuticas

(RATES, 2001a).

Atualmente, apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de

novos processos biotecnológicos, observamos um aumento notável da prática

fitoterápica. Aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos nos países

industrializados são originários de plantas e aproximadamente 120 compostos

de origem natural, obtidos a partir de cerca de 90 espécies de plantas, são

utilizados na terapêutica moderna. De fato, os produtos naturais estão

envolvidos no desenvolvimento de 44% de todos os novos fármacos

(HOSTETTMANN et al., 2003). Os produtos atualmente disponíveis no

3 INTRODUÇÃO

mercado, em algumas situações, têm-se tornado ineficientes e/ou inseguros. O

excesso de efeitos colaterais, o uso abusivo, a prescrição indiscriminada e o

emprego incorreto destes produtos resultam em uma razão risco/benefício

indesejada, tornando as linhagens microbianas extremamente resistentes aos

antibióticos sintéticos. Outro motivo que levou ao crescimento da fitoterapia é

que parte da população mundial não tem acesso à medicina convencional,

devido à situação econômica ou ao descaso com a população por parte do

sistema político econômico mundial ou mesmo pela política adotada pelas

grandes indústrias farmacêuticas (TOLEDO, 2002). A dependência das plantas

como fonte de fármacos é prevalente em países em desenvolvimento, nos

quais a medicina tradicional baseada nos conhecimentos populares possui

papel central nos cuidados à saúde (AUSTIN, 1991; CLARK, 1996). A

Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que um terço da população

global ainda não tem acesso a medicamentos essenciais e, mais do que isso,

nas áreas mais pobres da África e Ásia, esse valor sobe para 50 % da

população (WHO, 2002). Além disso, este órgão considera a fitoterapia nos

seus programas e sugere procedimentos básicos para a avaliação de drogas

vegetais (WHO, 1992; RATES, 2001b).

O desenvolvimento de fitoterápicos inclui várias etapas e envolve,

atualmente, um processo interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional. A

pesquisa inicia-se pela busca de literatura científica e catálogos internacionais

nas áreas específicas do referido conhecimento, seguindo em paralelo a

pesquisa etnobotânica, que descreve o uso popular de plantas nas diferentes

culturas (CAMARGO, 1999).

4 INTRODUÇÃO

Além da descoberta de fármacos naturais que sirvam como protótipos

para o desenvolvimento de novos medicamentos a pesquisa com as plantas

visa fornecer subsídios para a prática de uma fitoterapia racional, através do

uso de medicamentos fitoterápicos de qualidade, com eficácia e segurança

comprovada. Entre os estudos necessários para garantir a qualidade de uma

droga vegetal encontram-se os testes de autenticidade (caracterização

organoléptica e identificação macroscópica e microscópica), testes de pureza e

integridade (cinzas totais, cinzas insolúveis em ácido, umidade e determinação

de materiais estranhos, contaminantes microbiológicos e metais pesados) e

análises qualitativas e quantitativas dos constituintes ativos, quando

conhecidos (BRASIL, 2000). Deve-se destacar ainda, que o desenvolvimento

de um novo medicamento envolve um processo complexo de alto custo, onde

se requer investimentos em torno de 100-360 milhões dólares em um período

de 10-12 anos para que um fármaco seja desenvolvido (YUNES, 2001).

No Brasil aproximadamente 80.000 espécies de plantas são descritas,

oferecendo enorme propulsão para o descobrimento de novos fármacos.

Entretanto, considerando esta enorme variedade de espécies, o potencial como

fonte de novos fármacos não é completamente explorado, sendo que, somente

17% deste grupo de plantas tem sido foco de estudos sistemáticos na busca de

compostos biologicamente ativos (SOERJATO, 1996). As matérias-primas

vegetais que são utilizadas no preparo de medicamentos fitoterápicos

necessitam de um controle de qualidade. As condições de coleta,

armazenagem, secagem, dentre outras, interferem diretamente na qualidade e

quantidade de princípios ativos extraídos e consequentemente no efeito

farmacológico dos mesmos. A tradição popular de que produto "natural" não

5 INTRODUÇÃO

tem efeito colateral é equivocada e faz com que muitas pessoas busquem esta

terapia sem ao menos saber o que estão consumindo (SIMÕES et al., 2004).

Uma limitação em relação aos fitoterápicos é o número reduzido de estudos

controlados em comparação com os medicamentos sintéticos. Mais ainda,

esses poucos estudos nem sempre empregam metodologias adequadas. Essa

escassez de estudos, associada à falta de sistematização do levantamento e

de farmacovigilância, pode, pelo menos em parte, contribuir para o reduzido

número de relatos de efeitos adversos pelos fitoterápicos (WINSLOW e

KROLL, 1998).

6 REVISÃO DA LITERATURA

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae)

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. [sinonímia Sacoglottis uchi Huber]

(Humiriaceae) é uma espécie originária da Amazônia brasileira, encontrada em

estado silvestre em mata de terra firme, dispersa por toda a Bacia Amazônica.

A família foi descrita por Antoine Laurent de Jussieu, a qual inclui 50 espécies

classificadas em 8 gêneros, distribuídas principalmente em regiões tropicais

das Américas. A planta é conhecida na região Amazônica como uchi, uxi-

amarelo, cumatê, pururu, uxi-liso, uxi-ordinário ou uchi-pucu (CUATRECASAS,

1961; SCHULTES, 1979). As árvores eretas e de casca cinza atingem entre 25

e 30 metros de altura, com diâmetro do caule de até 1 metro (Figura 1).

FIGURA 1. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. A) Vista panorâmica da espécie

(fonte: http://www.ibama.gov.br); B) Fotografia de uma tora do caule (fonte:

http://www.ibama.gov.br).

7 REVISÃO DA LITERATURA

O fruto tem uma dupla camada oblongo-elipsóide de 5 a 7 cm de

comprimento, 3 a 4 cm de diâmetro, com peso entre 50 e 70 g e apresenta

coloração verde-amarelada ou parda-escuro quando maduro. É considerado

um alimento de grande importância para subsistência de muitas comunidades

rurais mais distantes, no entanto na última década tem sido detectado um

mercado em expansão na área periurbana de Belém durante os quatro meses

de frutificação, gerando renda para várias famílias. A polpa in natura é

consumida pura bem como na fabricação de sorvete e licor. O fruto é também

apreciado por vários animais silvestres, tornando-o favorito aos caçadores para

construção de armadilhas de caça (SHANLEY et al., 2002).

A casca é amplamente comercializada em feiras, mercados e até mesmo

farmácias (Figura 2), sendo prescrita sua utilização na forma de maceração ou

chá, para o tratamento de artrite, colesterol, diabete e como antiinflamatório

(CORRÊA, 1984).

FIGURA 2. Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. A) Casca do caule in natura

(fonte: http://www.ibama.gov.br); B) Cascas pulverizadas, embaladas em

pacotes para comercialização em mercados, férias livres e farmácias

magistrais (fonte: http://enkantusdafloresta.com).

8 REVISÃO DA LITERATURA

2.2. Constituição fitoquímica

Em seu trabalho, LUNA et al. (2000a), a partir do extrato etanólico bruto das

cascas de E. uchi, realizaram sucessivas extrações com solventes de diferentes

polaridades, que foram fracionadas e subsequentemente purificadas. As substâncias

puras tiveram suas estruturas elucidadas com base em dados espectroscópicos no

ultravioleta, infravermelho, espectrometria de massas e principalmente ressonância

magnética nuclear, caracterizando a presença de duas cumarinas, a bergenina e

seu derivado dimetilado, a dimetilbergenina, dois triterpenóides pentacíclicos

pertencentes à série dos oleonanos: o ácido masílinico e o éster masilinato de metila

(LUNA et al., 2000b; LUNA et al., 2001). Num estudo posterior, LAGOS (2006)

demonstrou que o fracionamento cromatográfico das cascas de E. uchi resultou no

isolamento de uma mistura de esteróides constituída por β-sitosterol (75,5%) e

estigmasterol (24,5%), do triterpeno pentacíclico 3-oxo-friedelina, do triterpeno

pentacíclico pseudotaraxasterol e da bergenina, uma lactona-isocumarina

polifenólica, também isolada nos frutos (FERREIRA et al., 2005; MAGALHÃES et al.,

2007). Extratos contendo bergenina obtidos a partir de Macaranga peltata são

usados na medicina popular indiana para o tratamento de doenças venéreas e a

bergenina acetilada tem mostrado um efeito anti-hepatotóxico em animais de

experimentação (KIM et al., 2000). A bergenina por si só têm demonstrado

atividades antioxidantes (TAKAHASHI et al., 2003), gastroprotetivas (GOEL et al.,

1997) e anti-HIV (PIACENTE et al., 1996). Este composto também é um ingrediente

farmacologicamente ativo da medicina chinesa, descrito como sendo efetivo contra

resfriados e bronquite (HERZNER et al., 2002). A bergenina está relatada na

literatura por sua atividade antiinflamatória (SWARNALAKSHMI, 1984), e também foi

descrita na espécie Humiria balsamifera (HARBORNE e BAXTER, 1993).

9 REVISÃO DA LITERATURA

Os estudos com polpa de frutos de uchi-amarelo o indicaram como fonte

de ácidos graxos, fibras, esteróides, sais minerais, vitaminas C e E. Os

principais ácidos graxos identificados foram o ácido oléico (7,38%) e ácido

palmítico (3,78%). A composição do aroma nos frutos também foi avaliada,

sendo identificados 42 componentes, com predominância de 3,3-dimetil-2-

butanol (18,8%) e eugenol (14,0%) (MARX et al., 2002).

Além dos derivados cumarínicos, POLITI et al. (2008) relatou a presença

preponderante de taninos em amostras de cascas pulverizadas por meio de

uma triagem fitoquímica preliminar.

2.3. Taninos

Os taninos são polifenóis encontrados em plantas superiores (SIMÕES et

al., 2004). Possuem peso molecular entre 500 e 3000 Daltons (SANTOS e

MELLO, 2003), são solúveis em água e possuem a propriedade de precipitar

proteínas e alcalóides (HASLAM, 1996). A capacidade de precipitar proteínas,

particularmente salivares da cavidade oral, caracteriza o sabor adstringente dos

taninos, possibilitando seu fácil reconhecimento em frutos verdes. Tal

propriedade é relevante para a proteção do vegetal frente a ataques de

patógenos e herbívoros (MADHAN et al., 2005).

Estruturalmente, os taninos possuem 12-16 grupos fenólicos, 5-7 anéis

aromáticos com 1000 unidades relativas de massa molecular e são divididos

segundo sua estrutura química em dois grupos: taninos hidrolisáveis e taninos

condensados (BHAT et al., 1998; HAGERMAN, 2002).

Os taninos hidrolisáveis são caracterizados por um poliol central,

geralmente D-glucose, cujas funções hidroxilas são esterificadas com ácido

10 REVISÃO DA LITERATURA

gálico e seus derivados (galotaninos e elagitaninos) (MELLO e SANTOS,

2004). Os elagitaninos estão amplamente distribuídos nas subclasses HDR

(Hamamelidae, Dilleniidae e Rosidae), por esse motivo são usados como

marcadores taxonômicos (HASLAM, 1996).

Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela

policondensação de duas unidades ou mais de flavan-3-ol e flavan-3-4-diol.

Esta classe também é denominada de proantocianidina ou leucocianidinas

(SANTOS e MELLO, 2004). Os taninos condensados são formados por

unidades elementares de flavan-3-ol com ligações C-C e ocasionalmente

ligações C-O-C. Os flavan-3-óis possuem um esqueleto típico flavonóidico com

ligações C6-C3-C6 (BUELGA e SCALBERT, 2000). Os taninos ocorrem

amplamente nos vegetais, porém, sua extração comercial é feita através da

casca e/ou do cerne da madeira, locais onde são encontrados em maiores

teores e também onde costumeiramente ocorrem os maiores problemas com

injúrias e ataques de agentes xilófagos. Geralmente, os taninos ocorrem mais

abundantemente nas células do raio e no parênquima longitudinal do cerne. O

alburno contém pouco ou nenhum tanino. Na casca, quase sempre ocorrem

nas células corticais (BROWN et al., 1952). A luminosidade é um fator que

afeta a produção de taninos, sendo diminuída em ambientes sombreados

comparados a espécies cultivadas ao sol. Tem sido relatado também que,

quanto mais velha a planta, maior a concentração de taninos (SCHEFFER,

2002).

As atividades farmacológicas dos taninos são atribuídas a três ações

(SIMÕES et al., 2004): complexação com íons metálicos; atividade antioxidante

e sequestradora de radicais livres; complexação com macromoléculas

11 REVISÃO DA LITERATURA

(proteínas e polissacarídeos). Com base nisto, já foram identificadas atividades

bactericidas, fungicidas, antivirais, moluscicidas, inibidoras de enzimas, de

peroxidação lipídica, antitumoral e sequestradora de radicais livres. Alguns

taninos mostraram capacidade de inibir seletivamente a replicação do vírus HIV

(KANBABAEE e REE, 2001). Na indústria, os taninos são usados no curtimento

de couro, produção de vários tipos de polímeros, preservação de madeiras,

entre outros (SIMÕES et al., 2004).

De acordo com Farmer (1967), os taninos possuem propriedade

antimicrobiana e são responsáveis pela durabilidade natural de algumas

madeiras. Segundo Aqüegil et al. (apud Granja, 1986), os taninos têm função

fungicida e bactericida em qualquer solução que possua seus componentes,

desempenhando papel moderador nas oxidações das substâncias

antiorgânicas e antifermentativas. Scalbert (1991) revisou as propriedades

antimicrobianas dos taninos, listando 33 estudos que documentaram as

atividades inibitórias destes metabólitos e de acordo com estes estudos, os

mesmos podem ser tóxicos a fungos filamentosos, leveduras e bactérias. Os

taninos foram considerados parcialmente responsáveis pela atividade

antimicrobiana de extratos metanólicos de cascas de Terminalia alata

encontrada no Nepal (TAYLOR et al., 1996). Uma investigação da atividade

antimicrobiana de diversos taninos frente a Staphylococcus aureus demonstrou

que o ácido tânico é um ótimo adjuvante no tratamento de infecções da pele

(AKIYAMA et al., 2001). A atividade biológica dos taninos tem relação com o

tamanho das moléculas, ou seja, a polimerização que sofrem; por exemplo,

alguns taninos hidrolisáveis apresentam maior atividade anti-HIV em moléculas

12 REVISÃO DA LITERATURA

grandes e o aumento do número de grupamentos galoil proporciona uma maior

complexação com as proteínas.

2.4. Processos extrativos

A literatura classifica os processos extrativos mais utilizados em dois

grupos: a maceração e a percolação, que em seus fundamentos são capazes

de correlacionar outras técnicas, como a digestão, a infusão, a decocção e a

turbo-extração (DÄR, 1981; VOIGT e BORNSCHEIN, 1982; PRISTA et al.,

1996; ANSEL et al., 2000; SIMÕES et al., 2003).

Antes de iniciar o processo extrativo, e independente do processo a ser

usado, a secagem do material é um procedimento de extrema importância. A

secagem tem por finalidade a retirada de água evitando reações de hidrólise e

de crescimento microbiano, além de garantir a estabilidade química do material

vegetal. Pode ser realizada ao ar livre, em estufas aplicando ar quente, ou com

o emprego de liofilizadores. A secagem ao ar livre é mais econômica, embora

exija maior vigilância para garantir a uniformidade das condições durante a

operação. Preferencialmente, deve ser realizada à sombra, já que a irradiação

solar pode alterar a constituição química do material. O local deve permanecer

convenientemente seco e protegido do ataque de insetos ou outros

contaminantes ambientais, sendo um procedimento comum dispor o material

sobre papel para absorção da umidade (DÄR, 1981; VOIGT e BORNSCHEIN,

1982; PRISTA et al., 1996; ANSEL et al., 2000; SIMÕES et al., 2003).

Na secagem por ar quente são utilizadas estufas equipadas com um

termostato, o que garante a manutenção de temperatura constante durante o

tempo desejado. É conveniente deixar escapar o ar da estufa, a fim de evitar a

13 REVISÃO DA LITERATURA

sua saturação com o vapor d’água que vai sendo desprendido do material a

secar. A secagem a frio, com liofilizadores, frequentemente é usada para

preservar a integridade da amostra sensível ao aquecimento. A operação de

secagem, independente de como é realizada, propicia a redução de volume e

de peso e facilita a moagem dos materiais (DÄR, 1981; VOIGT e

BORNSCHEIN, 1982; PRISTA et al., 1996; ANSEL et al., 2000; SIMÕES et al.,

2003).

A preparação de amostras vegetais é muito complexa apresentando

várias etapas. A primeira etapa, e certamente a mais importante, é a extração

que tem a finalidade de separar substâncias de interesse de uma matriz

complexa (COSTA, 1994; BANDEIRA, 2004).

Antes de executar uma extração, deve-se levar em consideração uma

série de fatores que interferem nesta operação tais como granulometria do

material, polaridade do solvente, acidez do meio, agitação, temperatura e

tempo de extração (SOARES et al., 1998).

A granulometria do material influencia diretamente na eficiência da

extração. A estrutura histológica das diversas partes componentes de uma

planta é bastante heterogênea. Existem órgãos como as raízes e os caules,

cujos tecidos estão fortemente compactados, ao passo que em folhas e flores

os tecidos se apresentam com textura mais delicada. Como o poder de

penetração dos solventes depende, entre outros fatores, da consistência dos

tecidos que formam o material a extrair, quanto mais rígido for o material menor

deve ser sua granulometria (COSTA, 1994; SIMÕES et al., 2003).

A polaridade do solvente também influencia a eficiência de extração. O

solvente escolhido deve ser o mais seletivo possível, pois é devido à

14 REVISÃO DA LITERATURA

seletividade que se podem extrair as substâncias desejadas. Como a

seletividade depende da polaridade, o grau de polaridade do grupo que se

pretende extrair determina o solvente ou a mistura de solventes que mais se

aproxima do ótimo de seletividade para aquela extração (PRISTA et al., 1996;

SIMÕES et al., 2003).

A extração de determinadas substâncias ainda pode ser influenciada pela

acidez do meio extrator. Considerando que os processos de extração

dependem, em grande parte, de fenômenos de difusão e que a renovação do

solvente em contato com as substâncias a dissolver desempenha um papel de

grande influência na velocidade da dissolução, pode-se concluir que a agitação

pode diminuir a duração de um processo extrativo (DÄR, 1981; VOIGT e

BORNSCHEIN, 1982; PRISTA et al., 1996; ANSEL et al., 2000; SIMÕES et al.,

2003).

O aumento da temperatura provoca um aumento da solubilidade de

qualquer substância, motivo pelo qual os métodos de extração a quente são

sempre mais rápidos do que aqueles realizados à temperatura ambiente.

Entretanto, o calor nem sempre pode ser empregado, já que muitas

substâncias são instáveis em altas temperaturas (DÄR, 1981; VOIGT e

BORNSCHEIN, 1982; PRISTA et al., 1996; ANSEL et al., 2000; SIMÕES et al.,

2003).

Na escolha de um método extrativo, deve-se avaliar a eficiência, a

seletividade, a estabilidade das substâncias extraídas e o custo do processo

escolhido, considerando principalmente a finalidade do extrato que se quer

preparar (COSTA, 1994; SIMÕES et al., 2003).

15 REVISÃO DA LITERATURA

2.5. Atividade antimicrobiana e toxicidade

A história do desenvolvimento e uso de substâncias antimicrobianas na

prática médica antecedeu a descoberta de espécies microbianas, uma vez que

Hipócrates (460–337 a.C.) recomendava a lavagem de ferimentos com vinho

para impedir o processo infeccioso. Documentos datados de 2500 a 3000 anos

atrás, mostram que alguns povos como chineses e indianos, ainda primitivos,

utilizavam mofo, papa de soja e outros produtos correlatos para o tratamento

de lesões infectadas e processos inflamatórios (LIMA et al., 2000).

O uso de agentes antimicrobianos derivados de produtos naturais é muito

importante no tratamento terapêutico de várias patologias. Todavia, para

muitas das plantas em uso, a real eficácia e os princípios ativos relevantes não

são conhecidos. Consequentemente, estudos que objetivem demonstrar as

atividades farmacológicas destas plantas e que identifiquem os princípios

ativos são necessários (FERREIRA et al., 1998).

Muitas plantas têm sido usadas devido às suas propriedades

antimicrobianas, que estão relacionadas a compostos sintetizados no

metabolismo secundário das mesmas. Estes compostos são conhecidos como

substâncias ativas, como por exemplo, os compostos fenólicos, que podem ser

parte dos óleos essenciais e também dos taninos (JANSEN et al., 1987;

SAXENA et al., 1994). Porém, diferentemente do que ocorre com os agentes

antibióticos e quimioterápicos, há poucos registros na literatura quanto ao

possível mecanismo de ação dos produtos oriundos de plantas. Os compostos

isolados das plantas são substâncias com estruturas químicas bem

diferenciadas dos agentes antimicrobianos isolados a partir de bactérias,

leveduras e fungos filamentosos. Tais produtos podem atuar no metabolismo

16 REVISÃO DA LITERATURA

intermediário ativando enzimas, alterando a ação de inibidores que influenciam

os nutrientes do meio, interferindo nos processos enzimáticos em nível nuclear

ou ribossomal, provocando alterações nas membranas ou ainda interferindo no

metabolismo secundário (COWAN, 1999).

Vários métodos podem ser utilizados para a determinação da atividade

antimicrobiana in vitro, sendo aplicados em estudos de triagem de novas

substâncias ativas, tais como a técnica de difusão em ágar, métodos de

diluição em caldo em tubos e/ou microplacas, bioautografia etc. Tais técnicas

permitem a análise de vários compostos e diferentes espécies bacterianas

concomitantemente (KONEMAN et al., 1997; ELOFF et al., 1998; SOUZA et al.,

2003).

No método de difusão a substância alvo da pesquisa é colocada num

reservatório (disco de papel, cavidade no meio de cultura, cilindro sobre a

superfície ou “template”), em contato com um meio de cultura sólido, inoculado

com um determinado microrganismo. Após o tempo adequado de incubação,

afere-se o diâmetro do halo de inibição – zona clara onde não houve

crescimento microbiano – ao redor da substância em pesquisa (BARRY, 1991;

ESPINEL-INGROFF e PFALLER, 1995). Neste método a informação é

qualitativa, útil para estabelecer a sensibilidade do microrganismo. O método

apresenta problemas com as substâncias que não se difundem no meio

(ZACCHINO, 2001).

A técnica de diluição, que emprega a amostra a ser testada dissolvida

num meio sólido ou líquido conveniente, possui a vantagem de ser quantitativa.

A desvantagem deste método reside no fato do excessivo trabalho envolvido

17 REVISÃO DA LITERATURA

na realização, no consumo considerável de material e de estar sujeito à

solubilidade no sistema aquoso (FREIBURGHAUS et al., 1996).

Os ensaios da atividade antimicrobiana são influenciados por um grande

número de variáveis técnicas ou fatores que podem interferir significativamente

na pesquisa de atividade de agente antimicrobiano, incluindo a preparação e o

tamanho do inoculo, a formulação do meio e seu pH, duração e temperatura de

incubação e o critério usado para a verificação do resultado do ensaio. Para se

obter êxito e uniformidade nos testes de atividade, estes fatores devem ser

muito bem controlados (ESPINEL-INGROFF e PFALLER, 1995). No que diz

respeito ao microrganismo em teste, a atividade antimicrobiana pode depender

do tipo, gêneros, espécies e cepas. O meio de cultura e as soluções diluentes

deverão ser selecionados de modo que previnam danos celulares. Células

injuriadas requerem um meio nutritivo de recuperação (meio de

enriquecimento) sem a presença de agentes inibidores ou de diferenciação. O

meio de cultura inadequado pode produzir resultados onde os microrganismos

aparentemente apresentam alta susceptibilidade ao agente que se está

pesquisando (BARRY, 1991). A uniformidade de preparação do agente

antimicrobiano, pureza do solvente utilizado, solubilidade e sua estabilidade,

também podem influenciar no ensaio. O tempo de exposição deve ser

cuidadosamente controlado, assim como o número inicial de células utilizadas

durante o ensaio deve ser consistente para assegurar resultados reprodutíveis.

O efeito da temperatura também é importante, seja durante a exposição ou

durante a etapa de incubação. A temperatura de exposição deve ser ótima para

o organismo testado, para se recuperar o número máximo de células viáveis e

prevenir a impressão do aumento de atividade do agente. Condições de

18 REVISÃO DA LITERATURA

anaerobiose ou microaerofilia deve ser considerada na composição da

atmosfera. Níveis de pH também podem afetar a atividade de antimicrobianos.

(WOODS e WASHINGTON, 1995). Finalmente as propriedades básicas

próprias dos agentes antimicrobianos como sua solubilidade, estabilidade

química, ação e tendência de produzir inibição parcial do crescimento sob

diferentes concentrações, devem ser levadas em consideração (ESPINEL-

INGROFF e PFALLER, 1995).

A segurança na utilização de produtos de origem vegetal é outro fator de

grande importância nos dias atuais. Avaliando-se a citotoxicidade de uma

planta medicinal, pode-se garantir que um produto elaborado com esta seja

livre de efeitos tóxicos indesejáveis (KUSUMOTO et al., 1995). As

metodologias que utilizam tecidos e células vivas são as mais empregadas,

pois a intrínseca complexidade celular é mantida. As células utilizadas podem

ser de vários tecidos, tanto de origem humana quanto animal, sendo que a

sobrevivência e/ou proliferação celular podem ser avaliadas por contagem do

número de células ou pelo uso de corantes vitais. A incorporação de

radioisótopos, formação de colônias, aderência celular, produtos de

metabolismo entre outros são parâmetros que também podem ser utilizados

(RIDDELL et al., 1986; DE ANGELIS et al., 1986; SAOTOME et al., 1989;

NOSER, 1991; SASAKI et al., 1991; HUSOY et al., 1993).

No início da década de 80, Mosmann (1983), Borenfreud e Puerner (1984)

descreveram uma técnica para análise de citotoxicidade que servia para várias

amostras simultaneamente. Nesta técnica, as células são semeadas em

microplaca e a viabilidade celular é avaliada por métodos colorimétricos,

utilizando a redução do MTT (brometo de 3 (4,5 dimetitiazol-2-il) 2,5

19 REVISÃO DA LITERATURA

difeniltetrazólio) ou a incorporação do vermelho neutro (cloridrato de 3-amino-7-

dimetilamino-2-metilfenazina), os quais são quantificados por

espectrofotometria. Esta técnica é rápida e quantitativa, pois permite avaliar

várias concentrações de amostras e calcular a concentração que causa 50%

de morte celular.

Como opção para a investigação da presença de possíveis agentes

tóxicos nos extratos vegetais, o método de toxicidade aguda em dose simples

representa uma avaliação estimativa e preliminar das propriedades tóxicas de

um fitoterápico, fornecendo informações iniciais acerca dos riscos sobre a

saúde, resultante de uma exposição de curta duração pela via de

administração selecionada. Após a administração da substância teste, pela via

escolhida, é feita uma observação clínica dos sintomas produzidos pela

administração do fitoterápico nos animais. A anotação das respostas é

efetuada em 30 minutos, 1, 2, 4, 12 e 24 horas após a administração e a partir

deste tempo, uma vez ao dia durante o período de observação de 2 semanas,

sendo as mais importantes: alterações de pêlo, pele e mucosas; sistemas

respiratório e circulatório; sistemas nervoso central e periférico, atividade

somatomotriz e comportamento. Especial atenção é dada a comportamentos

tais como: tremores, convulsões, salivação, diarréia, letargia e coma. Os

resultados do estudo podem demonstrar a necessidade de estudos de média e

longa duração (BRITO, 1994).

2.6. Microrganismos utilizados

Para os testes antimicrobianos, as bactérias utilizadas neste trabalho

estão diretamente ligadas à rotina dos seres humanos.

20 REVISÃO DA LITERATURA

Staphylococcus aureus, bactéria Gram-positiva, está amplamente

distribuída na natureza e faz parte da microbiota normal da pele e mucosas de

mamíferos e aves. Apresenta-se como anaeróbio facultativo, mesófilo, com

temperatura ótima de crescimento na faixa de 30-37 ºC (WILLIAMS e WILKINS,

1994). É o agente mais comum de infecções piogênicas e em indivíduos

debilitados pode causar doenças de caráter mais grave, sendo bastante

reconhecida sua elevada capacidade de desenvolver resistência a diversos

antibióticos (MARTINS, 1999). Isolados de S. aureus resistentes à penicilina

foram observados quase concomitantemente a sua introdução no uso clínico

devido à produção de β-lactamases ou penicilases, enzimas que hidrolisam o

anel β-lactâmico das penicilinas, inativando-as (DEL FIOL et al., 2000; AMATO

et al., 2000; MULLIGAN et al., 1993; TAVARES, 1996).

Staphylococcus epidermidis (Gram-positiva) também é habitante comum

da epiderme e mucosas, sendo considerada a espécie de estafilococos de

maior persistência na pele humana (MARTINS, 1999). É um microrganismo

aeróbico que usualmente está envolvido a processos de infecção dentro da

unidade sebácea (CHOMNAWANG et al., 2005). Nos últimos anos, entretanto,

vem apresentando-se como causa de infecções hospitalares, atingindo,

principalmente, pacientes imunocomprometidos, e/ou com doenças graves. É

uma bactéria comensal, sendo esse um fator que dificulta os clínicos decidirem

quando sua presença em um material indica que é o agente causativo de uma

doença ou apenas uma contaminação do material. Apresenta ainda, a

capacidade de formação de biofilme em equipamentos utilizados em ambientes

hospitalares e flexibilidade genômica, tendo desenvolvido cepas de resistência

que facilitam sua disseminação com mais frequência em indivíduos

21 REVISÃO DA LITERATURA

imunocomprometidos. Por estes motivos, devem ser seguidas as mesmas

medidas restritivas de higiene que foram estabelecidas para S. aureus em

hospitais (ZIEBUHR et al., 2006).

Bacillus subtilis, bactéria Gram-positiva, é utilizada no controle de

qualidade em testes de esterilização por óxido de etileno e a vapor, pois é

capaz de sobreviver em condições muito adversas de dessecação, temperatura

e pH devido à sua capacidade de produzir esporos, fato pelo qual também se

deve sua ampla distribuição na natureza (MÓS, 1999). Recentemente, esta

bactéria tem sido associada à incidência de gastroenterites em bebês que

receberam alimentos contaminados (ABDOU et al., 2007).

Shigella sonnei é uma espécie bacteriana fermentadora de lactose, que

pode causar desde diarréias até gastroenterites. Foram estimados cerca de

165 milhões de casos anuais de shigelose, dos quais cerca de 163 milhões

ocorrem em países em desenvolvimento, resultando em mais de 1 milhão de

mortes/ano (FLÓREZ, 2005). Aumentos desordenados da incidência de

infecções por Shigella são difíceis de controlar devido à facilidade com que os

inóculos se espalham e também ao progressivo aumento da resistência a

múltiplos antibióticos (SOBEL et al., 1998).

Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa muito versátil quanto a sua

patogenicidade, podendo causar infecções intestinais, urinárias, septicemias,

meningites, além de outros tipos (CAMPOS et al., 1999). É uma das causas

mais comuns de infecções da via urinária, sendo tratada eficientemente com

cotrimoxazol, mas resistência in vitro foi relatada para casos não resolvidos de

tratamento (CAMARGO et al., 2002; RODRIGUES et al., 2006).

22 REVISÃO DA LITERATURA

Candida albicans é a espécie de levedura mais frequentemente isolada a

partir de amostras biológicas. É um habitante normal do trato gastrintestinal dos

seres humanos e pode ser reconhecido em mais de um terço das cavidades

orais de indivíduos normais e dois terços daqueles indivíduos com doenças

imunodepressivas como a AIDS (ODDS, 1988; FITCHENBAUM, 2000).

Colonização oral com organismos resistentes a agentes antimicrobianos é mais

comum em infecção avançada por HIV. A candidíase das mucosas pode afetar

a cavidade oral, canal vaginal, traquéia, brônquios e canal alimentar, sendo as

doenças orofaríngeas e vulvovaginais as formas mais comuns de candidíase

mucocutânea (FITCHENBAUM, 2000; DUERR, 1993). O tratamento das

candidíases vem se tornando difícil devido à emergência de cepas resistentes

aos antifúngicos costumeiramente utilizados. Há um grande número de novos

antifúngicos em várias fases de desenvolvimento clínico, incluindo triazóis,

equinocandinas, sordarinas e inibidores de topoisomerase. A atividade in vitro

de pelo menos 3 novos triazóis (posaconazol, ravuconazol e voriconazol)

contra espécies de Candida mostrou-se bastante eficiente (RUHNKE et al.,

1997; NIETO et al., 2000).

23 OBJETIVOS

3. OBJETIVOS

Apesar do número crescente de publicações relatando a análise

fitoquímica e a avaliação da atividade farmacológica de espécies vegetais, até

o presente não existem estudos suficientes para a utilização racional da

maioria das plantas medicinais brasileiras, inclusive do E. uchi.

Existe uma crescente demanda na comercialização de medicamentos e

fitoterápicos à base de E. uchi pelas farmácias magistrais, drogarias, feiras

públicas e até mesmo pela Internet, expondo a população que os consomem a

riscos ainda desconhecidos. O presente trabalho visa realizar estudos

farmacognósticos e biológicos desta droga vegetal que contribuam para

comprovar a eficácia e segurança do seu uso. Assim, este trabalho tem como

objetivos principais:

 Controle de qualidade das cascas pulverizadas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae) obtidas comercialmente;

 Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários

presentes nas cascas de E. uchi;

 Doseamento das principais classes de metabólitos secundários

presentes nas cascas de E. uchi;

 Análise cromatográfica dos extratos vegetais obtidos a partir das cascas

pulverizadas de E. uchi;

 Avaliação das atividades antimicrobiana e citotóxica dos extratos

vegetais obtidos a partir das cascas pulverizadas de E. uchi.

24 MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material

4.1.1. Solventes, reagentes e meios de cultura

• 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) – Vetec

• Acetato de chumbo – Reagen

• Acetato de etila – Labsynth

• Acetona – Labsynth

• Ácido 3-5 dinitrobenzóico – Labsynth

• Ácido acético – Labsynth

• Ácido bórico – Labsynth

• Ácido clorídrico – Labsynth

• Àcido fórmico - Labsynth

• Ácido gálico – Vetec

• Ácido oxálico – Labsynth

• Ácido sulfúrico - Labsynth

• Ácido tânico – Vetec

• Ágar desidratado – Acumedia

• Água destilada

• Água Milli-Q

• Água oxigenada – Labsynth

• Amônia – Labsynth

• Ampicilina – Medley genéricos, comprimidos de 500 mg de ampicilina

• Anidrido acético – Labsynth

25 MATERIAL E MÉTODOS

• Anfotericina B de Streptomyces – Sigma-Aldrich

• Azul de metileno – Labsynth

• Bergenina – Merck

• Carbonato de cálcio - Vetec

• Carbonato de sódio – Vetec

• Cloreto de alumínio – Reagen

• Cloreto férrico – Reagen

• Clorofórmio – Labsynth

• D-glicose anidra – Labsynth

• Dimetilsulfóxido (DMSO) – Labsynth

• Etanol – Labsynth

• Éter etílico - Labsynth

• Etilenodiamina - Labsynth

• Formaldeído – Labsynth

• Gelatina – Kraft Foods

• Glicol metacrilato (GMA) – Technovit 7100

• Hipocloreto - Labsynth

• Hidróxido de sódio – Labsynth

• Historresina – Leica

• Lugol – Merck

• Magnésio metálico - Merck

• Meio ágar Sabouraud – Acumedia

• Meio ágar-Mueller-Hinton – Acumedia

• Meio de infusão de cérebro e coração (BHI) – Biobrás

• Meio Eagle – Gibco

26 MATERIAL E MÉTODOS

• Meio RPMI-1640 – Sigma-Aldrich

• Metacrilato - Leica

• Metanol – Labsynth

• Nitroprussiato de sódio – Labsynth

• Piridina - Vetec

• Pó ativador – Leica

• Pó-de-pele – Merck

• Reagentes de Dragendorff, Bouchardat, Mayer e Bertrand

• Reagente de Folin-Ciocalteau – Reagen

• Reagente de Folin-Denis – Reagen

• Reagentes de Kedde, Pezez A, Pezez B

• Resazurina – Sigma-Aldrich

• Resina Permount - Permount

• Rutina – Vetec

• Soro bovino fetal - Gibco

• Sulfato de sódio anidro – Labsynth

• Tween 80

– Labsynth

• Vitamina C – Vetec

• Xantidrol - Labsynth

• Xilol – Merck

4.1.2. Equipamentos e utensílios

• Agitador – Superohm G-25

• Autoclave vertical – Fabbe 103

• Balança analítica – Micronal AB 204

27 MATERIAL E MÉTODOS

• Balança de infravermelho – Mettler LP12

• Balança semi-analítica – Owa Labor

• Banho de aquecimento – Fistom

• Banho-maria – Fanem Mod.100

• Bomba a vácuo – Motores Elétricos Brasil

• Câmara de fluxo laminar – Veco

• Câmara de Neubauer - Boeco

• Câmara de ultravioleta 254 nm

• Centrífuga – Excelsa Baby

• Cubetas de quartzo

• Deionizador de água – System Millipore

• Discos de papel com 6 mm de diâmetro

• Espectrofotômetro – Shimadzu-1603

• Estufa de ar circulante – Fanem

• Estufa de CO

- Thermo Electron Corporation

• Estufa de esterilização – Fanem 315 SE

• Estufa de incubação bacteriológica – Olidef cz

• Evaporador rotatório – Marconi TE120

• Liofilizador – Solab

• Microscópio – Carl Zeiss Jena

• Microscópio Óptico – Olympus CH20

• Micrótomo Rotatório - Leica

• Paquímetro digital – Starrett

• Peagômetro – Micronal B374

• Placa de alumínio de gel de sílica F

254

– Merck

28 MATERIAL E MÉTODOS

• Placas de molde histoquímico - Histomold

• Placas de 96-wells – TPP 92096

• Tamisador vibratório

• Templates de aço (peça única) com 6 orifícios de 6 mm de diâmetro

• Vidrarias e porcelanas em geral

• Vórtex – Biomixer Mult-Mixer MVS-1

4.1.3. Material vegetal

4.1.3.1. Cascas pulverizadas de E. uchi adquiridas da empresa “Sítio da

Mata”

Cascas finamente pulverizadas de Endopleura uchi (Huber)

(Humiriaceae), fornecida pela empresa Sítio da Mata (lote: Uxi03/01; N° Inscr.

Prod.: 024.308.176; colheita: 01/09/2005; validade: 30/09/2008), localizada na

Rodovia Cajuru, Cássia dos Coqueiros (SP), Brasil, utilizadas para todos os

ensaios farmacognósticos bem como para os testes de atividades biológicas

(anexo 1).

4.1.3.2. Cascas in natura (secas) de E. uchi adquiridas no Mercado

Municipal “Ver-o-Peso” (Belém, PA)

Cascas in natura de Endopleura uchi compradas no Mercado Municipal

Ver-o-Peso, localizado em Belém (PA), Brasil, e enviada pelo Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia (INPA), utilizadas exclusivamente na confecção de

cortes histológicos para as análises microscópicas comparativas com o

material pulverizado.

29 MATERIAL E MÉTODOS

4.1.4. Cepas padrão

Os microrganismos selecionados para o projeto, obtidos do American

Type Culture Collection (ATCC), são apresentados na Tabela 1.

TABELA 1. Cepas de bactérias e levedura utilizadas no projeto

Microrganismo ATCC

Bacillus subtilis 9372

Staphylococcus aureus 25923

Staphylococcus epidermidis 27853

Escherichia coli 25922

Shigella sonnei CC

Candida albicans 64548

4.1.5. Células de mamíferos

O ensaio de citotoxicidade foi conduzido utilizando células fibroblásticas

de córnea de coelho da linhagem SIRC CCL-60, procedência ATCC-USA,

adquirida do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil.

4.2. METODOLOGIAS

4.2.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

4.2.1.1. Granulometria

Baseado na Farmacopéia Brasileira (1988), 25 g do material vegetal

pulverizado foram submetidos à passagem forçada por vibração, através de

tamises com abertura de malhas e coletor correspondentes a 0,074; 0,125;

0,177; 0,25 e 0,42

µm, utilizando tamisador vibratório, na escala oito do

30 MATERIAL E MÉTODOS

aparelho, durante 30 minutos. Após este processo, as frações foram retiradas

dos tamises e do coletor e quantificadas quanto às suas proporções. Este

procedimento foi realizado em triplicata. Para os estudos de passagem e

retenção a partir da quantidade de pó das cascas pulverizadas recolhida de

cada tamis, foram elaboradas planilhas no software Excel

onde foram

calculadas as frequências percentuais, e também, as frequências percentuais

cumulativas.

4.2.1.2. Determinação do pH

Foi preparada uma solução a 1% por infusão com a droga vegetal. Em

erlenmeyer, 99 g de água foram colocados sobre uma chapa-elétrica para

ebulir durante 5 minutos. Em seguida, a água foi vertida sobre a droga e o

recipiente foi fechado e deixado em infusão por 15 minutos. Após este tempo, a

mistura foi filtrada e arrefecida, procedendo-se à leitura em peagômetro

calibrado em pH de 4 a 9. O experimento foi realizado em triplicata e os

resultados equivalem à média dessas medições (FARMACOPÉIA

BRASILEIRA, 1988).

4.2.1.3. Determinação da densidade aparente não compactada

Uma proveta de 100 mL foi previamente pesada e, posteriormente,

preenchida com a droga vegetal. A densidade aparente foi determinada com

os dados de volume e massa, de acordo com os seguintes cálculos:

= M

– M

/ V

31 MATERIAL E MÉTODOS

Em que: D

=densidade aparente; M

= massa da proveta vazia; M

massa da proveta cheia; V

= volume da proveta.

4.2.1.4. Determinação do teor de cinzas totais

Cadinhos de porcelana foram previamente calcinados em mufla a 450

por 30 minutos, resfriados em dessecador (15 minutos) e suas massas (taras)

foram determinados em balança analítica. Em cada cadinho foram adicionados

cerca de 3,0 g da droga vegetal triturada, pesados em balança analítica, os

quais foram incinerados (levados ao estado de carvão) e, posteriormente,

submetidos à calcinação em mufla à temperatura de 450

C por duas horas.

Foram deixados em dessecador para arrefecimento (15 minutos), com

pesagem realizada posteriormente. A técnica foi repetida até massa constante.

O resultado foi expresso em porcentagem em massa de cinza na droga (%,

m/m) e representa a média de três determinações (FARMACOPÉIA

BRASILEIRA, 1988).

4.2.1.5. Determinação da perda por dessecação em balança com

infravermelho (INFRATEST)

Amostras pesando 4,032 g, 4,010 g e 4,021 g da droga vegetal foram

submetidas ao aquecimento (115

C) através de raios infravermelhos pelo

período de 1 hora aproximadamente. Após esse tempo, foram feitas as leituras

das massas. Repetiu-se o procedimento de hora em hora até que a massa não

variasse mais do que 0,25%. Os valores foram expressos em porcentagem (%,

m/m), através da média de três determinações (FARMACOPÉIA BRASILEIRA,

1988).

32 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1.6. Perda por dessecação em estufa

Foram pesados 2 g da droga e colocados em “pesa-filtros” previamente

tarados. Em seguida, foram levados até estufa a 105 ºC por duas horas. Após

esse tempo, os “pesa-filtros” foram mantidos para arrefecimento em

dessecador por mais 30 minutos, e então, pesados. Depois dessa pesagem, os

“pesa-filtros” foram colocados normalmente em estufa, repetindo o

procedimento, até obtenção de massa constante. Os resultados foram

expressos em perda de massa percentual, através da média de três

determinações (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).

4.2.1.7. Determinação do teor de extrativos para a droga

Cerca de 1 g da droga vegetal foi pesado e submetido à decocção com

100 g de água, durante 10 minutos. Após resfriamento, o volume foi

completado para 100 mL e a solução resultante foi filtrada em papel de filtro,

sendo os primeiros 20 mL desprezados. Do restante do filtrado, foi pesada uma

alíquota equivalente a 20 g, em pesa-filtro tarado e evaporado até secura em

banho-maria, sob agitação ocasional (DEUTSCHES ARZNEIBUCH, 1994).

O teor de extrativos foi calculado em massa percentual, pela média de

cinco determinações segundo equação abaixo:

TE = g.FD.100 / m

Em que: TE = teor de extrativos (%); g = massa do resíduo seco (g); m =

massa da amostra (g); FD = fator de diluição (5).

33 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.2. ANÁLISES MICROSCÓPICAS

4.2.2.1. Análise microscópica comparativa das amostras pulverizadas com

as amostras in natura (secas) de cascas de E. uchi

Com o intuito de verificar a autenticidade do material vegetal utilizado neste

trabalho e comprovar que o farmacógeno empregado nas análises

farmacognósticas bem como nos ensaios biológicos tratava-se de cascas

pulverizadas de Endopleura uchi, efetuou-se a preparação de lâminas

microscópicas destas amostras bem como das amostras in natura, para posterior

análise histológica comparativa. A análise da lâmina com material pulverizado não

visa o estudo da organização dos tecidos vegetais da amostra, mas sim,

identificar elementos anatômicos vegetais característicos da parte específica da

planta (cascas), tais como células pétreas, fibras, cristais, drusas, dentre outros.

4.2.2.2. Montagem de lâminas com material pulverizado de E. uchi adquirido

da empresa “Sítio-da-Mata”

Para análise microscópica da droga pulverizada foram utilizadas amostras

do material pulverizado submetido à passagem forçada em tamis contendo malha

de abertura 0,210 mm. Este pó foi colocado em béquer com solução de hipoclorito

de sódio (2-2,5%), para clareamento, durante 24 horas; filtrou-se a suspensão

com papel filtro e, na sequência, passou-se três vezes pelo pó adsorvido ao papel

filtro, volume suficiente de tampão fosfato (pH 6,8) para a remoção do excesso de

hipoclorito. Em seguida, adicionou-se a solução de azul de toluidina 0,025% em

tampão fosfato (pH 6,8). As partículas assim coradas foram removidas, com ajuda

de uma espátula, e colocados em lâminas de vidro contendo solução de glicerina-

34 MATERIAL E MÉTODOS

água a 50% (v/v). Observações em microscópio óptico Olympus CH20, foram

feitas para a determinação dos marcadores microscópicos (MARTINS e

SACRAMENTO, 2004).

4.2.2.3. Inclusão em historresina do material vegetal adquirido do Mercado

Municipal “Ver-o-Peso” (Belém, PA)

As cascas in natura (secas) foram fragmentadas em unidades de 0,125 cm

as quais foram imersas em etanol 50% e levadas para aquecimento durante 60

minutos, com adições ocasionais de água, à medida da evaporação do etanol,

repetindo-se o procedimento por diversas vezes. Após, com o intuito de

intensificar o amolecimento dos tecidos vegetais, os fragmentos foram deixados

em solução de etilenodiamina 4% (v/v) por sete dias em estufa a 40 ºC, e em

seguida, solução de etilenodiamina 10% (v/v) por mais três dias. As amostras

foram retiradas desta solução e lavadas em água destilada por três vezes, com

intervalos de duas horas entre cada oportunidade.

A fixação do material vegetal foi executada em fragmentos de 0,06 cm

aproximadamente, os quais foram mantidos em solução de formaldeído 4%

neutro (pH 7,2-7,4) por 24 horas sob acondicionamento de vácuo (KARNOVSKY,

1965). Na sequência, procedeu-se à desidratação em série etanólica: etanol 10%

por 30 minutos; etanol 30% por 30 minutos; etanol 50% por 30 minutos; etanol

70% por 2 horas; etanol 96% por 2 horas; etanol 100% por 2 horas. Em seguida,

promoveram-se as etapas de inclusão em metacrilato, seguindo-se as

recomendações de Kraus e Arduin (1997), observando as instruções do fabricante

da resina (Leica



35 MATERIAL E MÉTODOS

Os cortes anatômicos foram executados em micrótomo de rotação e

subseqüente disposição dos mesmos em lâminas de vidro. As lâminas foram

mantidas em estufa a 40 ºC até completa secagem e aderência dos cortes. Na

seqüência procederam-se à coloração com azul de toluidina 0,01% durante 3

minutos (pH 6,8) (O’BRIEN et al., 1964). As lâminas foram lavadas em água

corrente durante 2 minutos e postas à secagem durante 24 horas em estufa a 40

ºC. Após este período, sobre as lâminas foram depositadas quantidades

suficientes de resina Permount

para recobrimento com lamínulas. Após secagem

em local sob temperatura ambiente e ao abrigo da luz, procedeu-se à análise

exploratória dos cortes em microscópio óptico Olympus CH20.

4.2.2.4. Pesquisa histoquímica para compostos fenólicos

Baseando-se em resultados de estudo preliminar prévio a respeito da

constituição fitoquímica das cascas de Endopleura uchi (POLITI et al., 2008), que

atestam a presença de taninos como uma das classes preponderantes de

metabólitos secundários, executou-se a coloração de algumas lâminas

(confeccionadas com o material in natura) com cloreto férrico 10% (m/v) para

comprovar a presença de compostos fenólicos (KRAUS e ARDUIN, 1997).

4.2.3. ANÁLISES FITOQUÍMICAS

4.2.3.1. Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos

secundários

Essas análises objetivaram analisar a presença de grupos químicos por

reações específicas (COSTA, 1994; HARBORNE, 1998; SIMÕES et al., 2004):

36 MATERIAL E MÉTODOS

(1) flavonóides, (2) taninos, (3) saponinas, (4) glicosídeos cardiotônicos, (5)

antraquinonas, (6) alcalóides.

4.2.3.1.1. Flavonóides

Em um béquer adicionou-se 3 g da droga pulverizada e 20 mL de éter de

petróleo. Agitou-se durante 10 minutos, com aquecimento em banho-maria

(BM). Filtrou-se ainda a quente. Secou-se o pó, colocando-o num béquer com

20 mL de metanol. Aqueceu-se em BM por 10 minutos. Filtrou-se ainda a

quente, evaporando-se posteriormente o filtrado até a secura. Por fim,

ressuspendeu-se com 10 mL de etanol, obtendo-se assim, o extrato final.

4.2.3.1.1.1. Reações de caracterização de flavonóides

• Reação de Shinoda

Colocou-se 1 mL do extrato final em tubo de ensaio, adicionando-se um

fragmento de magnésio metálico e gotas de HCl concentrado. Observou-se,

após o desprendimento de hidrogênio nascente o aparecimento de coloração

róseo ou vermelha.

• Reação de Taubock

Evaporou-se (BM) 3 mL do extrato final até a secura. O resíduo foi

resfriado e umedecido com algumas gotas de acetona. Adicionaram-se alguns

cristais de ácido bórico e ácido oxálico. Evaporou-se (BM) novamente até a

secura evitando aquecimento prolongado. Dissolveu-se o resíduo em 5 mL de

éter etílico e observou-se sob luz UV. Em caso positivo aparecerá fluorescência

amarelo esverdeada.

37 MATERIAL E MÉTODOS

• Reação de Pew

Evaporou-se (BM) 3 mL do extrato final em tubo de ensaio até a secura.

Ao resíduo adicionou-se 3 mL de metanol e uma pequena porção de zinco

metálico. Colocou-se aproximadamente 3 gotas de HCl concentrado. Em caso

positivo aparecerá coloração vermelha.

• Reação do cloreto férrico

Adicionou-se a 1 mL do extrato final algumas gotas de FeCl

a 2%.

Deverá aparecer colocação verde, amarelado, ou ainda, violáceo dependendo

do flavonóide presente.

• Reação do cloreto de alumínio

Umedeceram-se áreas diferentes de papel de filtro com o extrato.

Colocou-se sobre uma das manchas uma gota de cloreto de alumínio 5% em

etanol. Observou-se, sob luz UV, a intensificação da fluorescência verde

amarelada.

4.2.3.1.2. Antraquinonas

4.2.3.1.2.1. Antraquinonas livres

Agitou-se 1 g da droga em pó com 10 mL de éter etílico. À solução etérea,

adicionou-se 1 mL de amônia diluída e agitou-se. A camada aquosa deverá

tornar-se rósea no caso positivo.

4.2.3.1.2.2. Glicosídeos antraquinônicos (reação de Borntraeger)

Ao pó anterior, seco, adicionou-se 20 mL de água e aqueceu-se à

ebulição por 5 minutos. Após resfriamento, filtrou-se a solução. Ao filtrado,

38 MATERIAL E MÉTODOS

juntou-se 10 mL de HCl, 1N, e 3 mL de água oxigenada 30%. Após

resfriamento, filtrou-se a solução. Extraiu-se por duas vezes com 5 mL de éter

etílico. Juntaram-se as fases etéreas e agitou-se com 3 mL de amônia diluída.

A camada aquosa deverá tornar-se rósea em caso positivo.

4.2.3.1.2.3. Glicosídeos cardiotônicos

Em um béquer colocou-se 5 g de droga vegetal moída, adicionou-se 50

mL de etanol:água (70:30). Submeteu-se a aquecimento suave em BM durante

10 minutos. Após esfriou-se, filtrou-se, e completou-se o volume até 30 mL,

lavando o resíduo e o filtro com a mistura etanol/água.

Na purificação, ao filtrado adicionou-se 30 mL de água e 15 mL de

acetato de chumbo a 10%. Agitou-se bem e filtrou-se. O filtrado foi transferido

para um funil de separação, onde foram realizadas duas extrações sucessivas,

com 15 mL de clorofórmio cada vez. Após juntar as fases orgânicas, tratou-se

com sulfato de sódio anidro e evaporou-se até a metade do volume (12 mL no

mínimo).

4.2.3.1.3. Reações de caracterização de glicosídeos cardiotônicos

4.2.3.1.3.1. Reação com anel lactônico insaturado

• Reação de Legal

Evaporou-se 2 mL de extrato clorofórmico em um tubo de ensaio.

Dissolveu-se o resíduo em 1 mL de piridina e adicionou-se 0,5 mL de NaOH a

10% e 0,5 mL de nitroprussiato de sódio 10%. Deverá aparecer uma coloração

vermelha intensa, se positivo.

39 MATERIAL E MÉTODOS

• Reação de Kedde

Evaporou-se 2 mL de extrato em um tubo de ensaio. Dissolveu-se o

resíduo com 0,5 mL de reagente de Kedde (ácido 3-5 dinitrobenzóico 1% em

MeOH) e adicionou-se 1 mL de uma mistura de NaOH 10% em MeOH 1:1 (v/v),

preparada pouco antes do uso. Deverá aparecer uma coloração vermelha

violácea até castanho (fugaz).

4.2.3.1.3.2. Reação com desoxi-açúcares

• Reação de Pesez

Evaporou-se 2 mL do extrato em um tubo de ensaio. Adicionou-se ao

resíduo 1 mL do reagente de Pesez A (Xantidrol 0,5% em MeOH recente) e

aqueceu-se aproximadamente 100 ºC por 3 minutos. Esfriou-se e colocou-se o

reagente de Pesez B (HCl a 2% em ácido acético): Deverá aparecer coloração

vermelha. Aqueceu-se novamente.

• Reação de Keller-Kiliani

Evaporou-se 2 mL do extrato em um tubo de ensaio. Tratou-se o resíduo

com 1 mL de ácido acético, adicionou-se 2 gotas de FeCl

a 2% e transferiu-se

o conteúdo deste tubo cuidadosamente para um outro contendo 2 mL de

concentrado. Na zona de contato dos líquidos deverá aparecer um anel

castanho avermelhado, e a camada acética deverá tomar coloração verde-

azulada.

40 MATERIAL E MÉTODOS

• Reação de Liebermann-Burchard

Evaporou-se 2 mL do extrato em um tubo de ensaio. Ao resíduo,

adicionou-se 1 mL de anidrido acético e 10 gotas de ácido sulfúrico

concentrado. Deverá aparecer coloração castanha.

4.2.3.1.4. Taninos

Preparou-se um decocto (15 minutos) com 5 g da droga vegetal

pulverizada e 100 mL de água destilada. Filtrou-se e deixou-se esfriar (solução

extrativa A).

4.2.3.1.4.1. Testes de identificação de taninos

• Reação de Gelatina

Misturou-se 2 mL da solução A, com 2 gotas de HCl diluído e solução de

gelatina 2,5% gota a gota. No caso positivo haverá formação de precipitado.

• Reação de sais de ferro

Misturou-se 2 mL da solução A, com 10 mL de água destilada e 2 a 4

gotas de solução de FeCl

a 1% em metanol. No caso positivo aparecerá

coloração azul (taninos hidrolisáveis) ou verde (taninos condensados).

• Reações de acetato de chumbo

Misturou-se 5 mL da solução A com 10 mL de solução de ácido acético

10% e 5 mL de solução de acetato de chumbo a 10%. Em caso positivo

aparecerá formação de precipitado esbranquiçado (taninos hidrolisáveis).

41 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.3.1.5. Saponinas

Aqueceu-se sob refluxo, durante 10 minutos, 2 g do material vegetal

pulverizado com 10 mL de água destilada. Esfriou-se e filtrou-se para um tubo

de ensaio, completando-se para 10 mL o volume final. Agitou-se o tubo no

sentido do seu comprimento, vedando com uma rolha, durante 15 segundos.

Deixou-se em repouso por 15 minutos. Verificou-se em seguida o aparecimento

de um anel de espuma persistente, de aproximadamente 1 cm de altura, e que

não desaparece pela adição de 1 mL de HCl 2N (20%).

4.2.3.1.6. Alcalóides

Numa primeira etapa, realizou-se a extração em meio alcalino. Foram

utilizados 5 g da droga vegetal pulverizada, sendo homogeneizada e

alcalinizada com carbonato de cálcio a 10%. Adicionou-se 25 mL de

clorofórmio e, depois de homogeneizado, filtrou-se a mistura para um funil de

separação através de papel previamente embebido em clorofórmio, agitando o

filtrado com 7 mL de HCl 2%. Separou-se a camada superior para a realização

das reações de caracterização (precipitação) com os reagentes de Dragendorff,

Bouchardat, Mayer e Bertrand, colocando-se uma gota do reagente ao lado de

outra da solução ácida em uma lâmina de microscópio, unindo-as

posteriormente. A caracterização de alcalóides deu-se pela visualização da

reação sob luz ultravioleta.

4.2.3.1.7. Cumarinas

Preparou-se uma solução extrativa com 5 g da droga vegetal em 20 mL

de água fervida. Após filtração, adicionou-se HCl 1 M, até que fosse alcançado

42 MATERIAL E MÉTODOS

pH 1. A solução acidificada foi submetida à partição líquido-líquido com 10 mL

de éter etílico. A fase etérea foi concentrada até metade de seu volume e a

mesma foi aplicada em duas manchas sobre um pedaço de papel de filtro. Em

uma das manchas foi adicionada uma gota de NaOH 1M, sendo esta

observada à luz UV (365 nm); na outra mancha não foi aplicado nada. O

aparecimento de fluorescência, no primeiro caso, deverá indicar a presença de

cumarinas.

4.2.3.2. Perfil cromatográfico

Foi realizada a cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)

dos extratos de cascas pulverizadas de Endopleura uchi, obtidos por diferentes

procedimentos e sob diferentes concentrações. A fase móvel foi composta pela

fase orgânica da mistura clorofórmio:acetato de etila:ácido fórmico (5:4:1,

v/v/v). A fase estacionária utilizada foi placa de alumínio de gel de sílica 60

254

. As amostras foram aplicadas e reveladas com cloreto férrico 2% em

metanol, baseado na triagem fitoquímica previamente executada, que indica os

taninos como principal classe de metabólitos secundários.

Além disso, foi feito um cromatograma com frações de um extrato

preparado por decocção 20% (m/v). O decoccto foi filtrado e submetido à uma

partição líquido-líquido com acetato de etila (20 mL, 3 vezes). A fração aquosa

e a fração orgânica foram, posteriormente, evaporadas em banho de

aquecimento e ressuspendidas em metanol para serem analisadas por CCDC.

A fase móvel foi composta por acetato de etila:ácido fórmico:água (9:5:1, v/v/v)

e a placa foi revelada com cloreto férrico 2% em metanol.

43 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.3.3. Perfil espectrofotométrico na região de luz ultravioleta

Foram pesados, exatamente, 10,0 mg de ácido gálico, de ácido tânico e

de cada extrato, dissolvidos em 1 mL de água:metanol (1:1; v/v) e diluídos

1:1000 (v/v) em metanol. A concentração final das soluções de leitura das

substâncias padrão e dos extratos foi de 0,01 mg/mL. A leitura de absorvância

foi realizada em faixa de 190 a 400 nm de comprimento de onda em

espectrofotômetro Shimadzu-1603 com cubetas de quartzo de 1 cm de

caminho óptico. As amostras foram lidas frente a branco de metanol (CHOI et

al., 2006).

4.2.3.4. Obtenção e rendimento dos extratos

Os extratos vegetais são obtidos fundamentalmente pelo emprego de

vegetais secos. Como o principal objetivo é retirar do vegetal diversas

possibilidades dentre um universo químico extraordinariamente complexo, a

seletividade exigida fundamenta-se em dois principais fatores, as

características do solvente e o processo extrativo aplicado (DÄR, 1981; VOIGT

e BORNSCHEIN, 1982; PRISTA et al., 1996; ANSEL et al., 2000).

Neste trabalho foram preparados extratos vegetais a 5, 10 e 20% (m/v),

de acordo com as Figuras 3, 4 e 5, segundo diferentes procedimentos: (1)

maceração, (2) turboextração, (3) percolação, (4) infusão, (5) decocção. Nos

três primeiros procedimentos, utilizou-se etanol (50%) como solvente e nos

dois últimos, água destilada.

44 MATERIAL E MÉTODOS

FIGURA 3. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 5% (m/v).

FIGURA 4. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 10% (m/v).

45 MATERIAL E MÉTODOS

FIGURA 5. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de Endopleura

uchi a 20% (m/v).

4.2.3.4.1. Obtenção de extratos por percolação

Na obtenção de extratos por percolação foi usado o Processo Geral P,

descrito na Farmacopéia dos Estados Unidos do Brasil, 1959. Foi utilizado

como solvente extrator etanol 50% (EtOH 50%). Para o preparo de extrato a

5% (m/v) foram utilizados 25 g de cascas pulverizadas de E. uchi para 500 mL

de solvente; para o extrato 10% (m/v) foram utilizados 50g de cascas

pulverizadas de E. uchi para 500 mL de solvente e para o preparo do extrato a

20% (m/v) foram utilizados 200 g de cascas pulverizadas de E. uchi para 1000

mL de solvente.

Todos os extratos assim obtidos foram evaporados. Após rotaevaporação,

o fim da secagem foi realizado em capela, à temperatura ambiente, até que

atingisse massa constante. Os extratos obtidos foram pesados e armazenados

em dessecador para evitar que incorporassem umidade.

46 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.3.4.2. Obtenção dos extratos por maceração

Para o preparo dos extratos foi utilizado como solvente extrator EtOH

50%. Para o preparo de extrato a 5% (m/v) foram utilizados 25 g de cascas

pulverizadas de E. uchi para 500 mL de solvente; para o extrato 10% (m/v)

foram utilizados 50g de cascas pulverizadas de E. uchi para 500 mL de

solvente e para o preparo do extrato a 20% (m/v) foram utilizados 200 g de

cascas pulverizadas de E. uchi para 1000 mL de solvente. Essas soluções

foram mantidas durante duas semanas em vidros âmbar, sob o abrigo da luz e

com agitações ocasionais. Após, procedeu-se à filtração do líquido extrativo,

que, em seguida, foi posto em rotaevaporador, sob pressão reduzida, à

temperatura de banho-maria de 40-50 °C, até quase a secura. Após

rotaevaporação, o fim da secagem foi realizado em capela, à temperatura

ambiente, até que atingisse massa constante. Os extratos obtidos foram

pesados e armazenados em dessecador para evitar que incorporassem

umidade.

4.2.3.4.3. Obtenção dos extratos por turbo-extração

Para o preparo dos extratos foi utilizado como solvente extrator EtOH

50%. Para o preparo de extrato a 5% (m/v) foram utilizados 25 g de cascas

pulverizadas de E. uchi para 500 mL de solvente; para o extrato 10% (m/v)

foram utilizados 50 g de cascas pulverizadas de E. uchi para 500 mL de

solvente e para o preparo do extrato a 20% (m/v) foram utilizados 200 g de

cascas pulverizadas de E. uchi para 1000 mL de solvente. As soluções foram

colocadas no turbo-extrator e processadas por 30 minutos, em intervalos de 10

min, para o resfriamento do sistema. Após, as soluções foram filtradas a vácuo

47 MATERIAL E MÉTODOS

e rotaevaporadas, sob pressão reduzida, até quase secura. Após a

rotaevaporação, o fim da secagem foi realizado em capela, à temperatura

ambiente, até que atingisse massa constante. Os extratos obtidos foram

pesados e armazenados em dessecador para evitar que incorporassem

umidade.

4.2.3.4.4. Obtenção dos extratos por decocção

Para o preparo de extrato a 5% (m/v) foram utilizados 25 g de cascas

pulverizadas de E. uchi para 500 mL de água destilada; para o extrato 10%

(m/v) foram utilizados 50g de cascas pulverizadas de E. uchi para 500 mL de

água destilada e para o preparo do extrato a 20% (m/v) foram utilizados 200 g

de cascas pulverizadas de E. uchi para 1000 mL de água destilada. As

soluções foram postas em béqueres e levadas à chapa aquecida a 100 ºC.

Aqueceu-se por 15 minutos. As soluções foram filtradas e então liofilizadas. Os

extratos obtidos foram pesados e armazenados em dessecador para evitar que

incorporassem umidade.

4.2.3.4.5. Obtenção dos extratos por infusão

Para o preparo de extrato a 5% (m/v) foram utilizados 25 g de cascas

pulverizadas de E. uchi para 500 mL de água destilada; para o extrato 10%

(m/v) foram utilizados 50g de cascas pulverizadas de E. uchi para 500 mL de

água destilada e para o preparo do extrato a 20% (m/v) foram utilizados 200 g

de cascas pulverizadas de E. uchi para 1000 mL de água destilada. Após

ebulição da água, a mesma foi despejada sobre o material vegetal num béquer,

e o sistema foi mantido tampado por 15 minutos. As soluções foram filtradas e

48 MATERIAL E MÉTODOS

então liofilizadas. Os extratos obtidos foram pesados e armazenados em

dessecador para evitar que incorporassem umidade.

4.2.4. ANÁLISE QUANTITATIVA

4.2.4.1 Determinação do teor de fenóis totais

A análise do extrato foi feita em espectrofotômetro, em comprimento de

onda de 730 nm, utilizando cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico.

Como branco utilizou-se a solução obtida pela mistura entre 0,5 mL do

reagente de Folin-Denis e 1 mL de solução de carbonato de sódio 30% (m/v),

ajustando-se o volume a 10 mL com água destilada.

A concentração de fenóis totais do extrato foi determinada utilizando-se

uma curva analítica estabelecida com soluções de concentração conhecida do

polifenol ácido tânico. Os resultados foram expressos, pela média de três

determinações, em porcentagem da concentração de fenóis totais frente à

concentração inicial de leitura das amostras (AOAC, 1984; TEIXEIRA et al.,

1990), mais ou menos os desvios-padrões. Esses dados foram analisados

estatisticamente em nível de segurança de 95%.

4.2.4.1.1. Preparo da solução padrão de ácido tânico

Foram dissolvidos 10 mg de ácido tânico em água destilada, completando

o volume para 100 mL em balão volumétrico . Foram tomadas alíquotas de 0,1

a 0,5 mL desta solução, recém-preparada, adicionando-se 7 mL de água

destilada e 0,5 mL do reagente Folin-Denis. Após 3 minutos de agitação, foi

adicionado 1 mL de solução saturada de carbonato de sódio (35 g de

49 MATERIAL E MÉTODOS

carbonato de sódio anidro dissolvido em 100 mL de água destilada a 70-80 ºC)

e o volume ajustado para 10 mL com água destilada. A leitura foi feita 30

minutos após a reação colorimétrica a qual a solução foi submetida, em

triplicata, ao abrigo de luz.

4.2.4.1.2. Preparo das soluções de amostra

Amostras de 0,200 g das cascas pulverizadas de E. uchi, exatamente

pesadas, foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL, completando-se

o volume com água destilada. Desta primeira solução, foram transferidos 100

µL para balão volumétrico de 20 mL, completando-se o volume com água

destilada. Desta segunda solução, uma alíquota de 0,5 mL foi adicionada à 7

mL de água destilada e mais 0,5 mL de solução de Folin-Denis, sendo esta

nova solução, mantida por agitação por cerca de 3 minutos. Após este tempo,

foi adicionado 1 mL de solução de carbonato de sódio

30% (m/v) e o volume

completado com água destilada em balão volumétrico de 10 mL. A reação

colorimétrica das amostras, em triplicata, foi determinada por leituras realizadas

após 30 minutos da adição do último reagente.

4.2.4.1.3. Cálculo do teor de fenóis totais

A concentração de fenóis totais do extrato foi determinada, utilizando-se a

curva analítica estabelecida com soluções de concentração conhecida do

polifenol ácido tânico. Os resultados foram expressos pela média de três

determinações, em porcentagem da concentração de fenóis totais frente à

concentração inicial de leitura das amostras (0,005 mg/mL).

50 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.4.2. Doseamento de taninos totais em extratos vegetais

A metodologia utilizada foi baseada e adaptada do trabalho de Glasl

(1983) e da Farmacopéia Brasileira IV (1996). No doseamento de taninos totais

para a droga vegetal, está referenciado na literatura o uso de 0,750 g da

amostra. Porém, para os extratos, foi necessário proceder a uma pequena

correção (YAMAGUTI-SASAKI et al., 2007). Assim, a quantidade de amostra

pesada para cada extrato foi obtida de acordo com o seguinte cálculo (a

porcentagem de resíduo seco corresponde ao teor de extrativos (TE) de cada

um dos extratos, obtidos separadamente):

extrato

= (%) resíduo seco do extrato (TE) x 0,750 / 100

Cada amostra foi transferida para erlenmeyer com 150,0 mL de água

purificada, e deixada durante 30 minutos em banho termostatizado à

temperatura de 80-90 ºC. Após este período, o erlenmeyer foi resfriado em

água corrente e o seu conteúdo transferido quantitativamente para balão

volumétrico de 250 mL, aferindo-se o volume. Após a homogeneização, todo o

conteúdo foi filtrado desprezando-se os primeiros 50,0 mL, e o filtrado restante

foi acondicionado sob proteção da luz, sendo denominado de solução-mãe

(SM). Para a determinação de polifenóis totais (PT), 5,0 mL da SM foram

diluídos com água purificada em balão volumétrico de 25,0 mL. Desta solução,

2,0 mL foram transferidos e adicionados de 1,0 mL de solução de ácido

fosfotúngstico (Reagente fenólico de Folin-Ciocalteau 2 N) para balão

volumétrico de 25,0 mL, sendo completado o volume com solução de

carbonato de sódio a 10,6%. Após 3 minutos da adição da última solução foi

medida a absorvância a 730 nm, sendo empregada a água como branco. Para

51 MATERIAL E MÉTODOS

determinação de polifenóis não adsorventes (PNA), 10,0 mL de SM foram

transferidos e adicionados de 0,10 g de pó-de-pele (Merck

) para béquer e

agitados durante 60 minutos. Após, a solução foi filtrada e 5,0 mL do filtrado

foram diluídos com água purificada para 25,0 mL em balão volumétrico. A

seguir, 2,0 mL do filtrado desta solução foram transferidos e adicionados de 1,0

mL de solução de ácido fosfotúngstico (Reagente fenólico de Folin-Ciocalteau

2N) para balão volumétrico de 25,0 mL sendo completado o volume com

solução de carbonato de sódio a 10,6%. Após 3 minutos da adição da última

solução foi medida a absorvância a 730 nm, sendo empregada a água como

branco. O conjunto de operações (extrações e diluições) foi realizado sob

proteção da ação da luz direta, e o valor de comprimento de onda utilizado, 730

nm, foi obtido através de uma varredura espectrofotométrica realizada

previamente com as amostras e também com o padrão ácido gálico. Os

resultados foram expressos pela média de três determinações, mais ou menos

os desvios-padrões.

Esses dados foram analisados estatisticamente em nível de

segurança de 95%.

A porcentagem de taninos totais foi calculada segundo as fórmulas:

PT = 15625 x Abs/ 1000 x m PNA = 15625 x Abs/ 1000 x m

TT = PT – PNA

Em que: PT = Polifenóis totais (%), PNA = Polifenóis não adsorventes

(%), Abs = Absorvância medida, m = massa da amostra em gramas, TT = teor

de taninos totais (%).

52 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.5. Determinação da capacidade de sequestro de radicais livres

O potencial de atividade antioxidante dos extratos foi determinado baseado

na atividade sequestrante da solução de 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH)

(MACHADO, 2005; FALCÃO et al., 2006)

. Foi utilizado ácido gálico, rutina e

vitamina C, na concentração de 250 µg/mL em metanol, como substâncias

reconhecidamente antioxidantes (BROGGINI, 2006). O extrato de Ginkgo biloba

L., adquirido da empresa Santosflora (Anexo 2) também foi utilizado neste teste,

na concentração de 250 µg/mL em metanol, por ter uma reconhecida atividade

antioxidante (FALCÃO et al., 2006). Os testes foram feitos com os mesmos

extratos utilizados nos ensaios biológicos, selecionados por apresentaram os

maiores teores de taninos totais: decocção 20% (m/v); infusão 10% (m/v);

maceração 5% (m/v) (EtOH 50%), percolação 10% (m/v) (EtOH 50%); turbo-

extração 20% (m/v) (EtOH 50%). A 1 mL das soluções de amostra foram

adicionados 2,5 mL da solução de DPPH 0,004% em metanol. As soluções foram

agitadas em vórtex e mantidas no escuro por 30 minutos a temperatura ambiente.

A leitura foi feita posteriormente a este período, a 517 nm, em espectrofotômetro,

com cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico. A solução utilizada como

branco consistiu em 1 mL da solução metanólica de amostra e 2,5 mL de metanol.

Foi utilizada solução de 1 mL de metanol e 2,5 mL de solução de DPPH como

controle negativo. A atividade anti-radicalar foi calculada como a porcentagem de

descoloração do radical DPPH, segundo a equação:

% descoloração do DPPH = (Ad - Aa) x 100/ Ad

Em que: Aa = absorvância da amostra; Ad = absorvância da solução de

DPPH (controle negativo)

53 MATERIAL E MÉTODOS

Os valores calculados representam a média de três determinações, mais

ou menos os desvios-padrões. Para análise estatística, executamos o teste de

análise de variância ANOVA, para P < 0,05.

4.2.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A atividade antimicrobiana dos extratos de E. uchi foi avaliada pelo

método de difusão em ágar, utilizando-se “templates” e discos de papel.

4.2.6.1. Preparo dos antibióticos

O antibiótico ampicilina foi utilizado como substância de controle positivo,

uma vez que as cepas bacterianas utilizadas são sensíveis à sua ação.

Partindo de uma solução-mãe de 500 mg/L, foi diluído na proporção 1:10 (m/v)

em Brain Heart Infusion (BHI), de maneira que a concentração dessa solução

estoque fosse de 50 µg/mL.

A anfotericina B foi o antifúngico usado como controle positivo para a

cepa de Candida albicans. Foram dissolvidos 16 mg de anfotericina B em 10

mL de dimetilsulfóxido (DMSO) (solução estoque de 16 µg/mL) sendo diluídos,

posteriormente, duas vezes na proporção 1:5 (m/v) em BHI.

4.2.6.2. Solução estoque de extrato

Ressuspendeu-se 200 mg dos seguintes extratos de cascas pulverizadas

de Endopleura uchi em 1 mL de solução de DMSO e Tween

80 10% (v/v):

decocção 20% (m/v); infusão 10% (m/v); maceração 5% (m/v) (EtOH 50%),

percolação 10% (m/v) (EtOH 50%); turbo-extração 20% (m/v) (EtOH 50%).

54 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.6.3. Preparo da suspensão de bactéria

Uma colônia de cada cepa bacteriana utilizada, ou aproximadamente 150

µL de suspensão bacteriana previamente preparada e armazenada sob

refrigeração adequada, foi inoculada em BHI e incubada a 37 ºC durante 24

horas. A partir deste inóculo foi padronizada a turvação até escala 0,5 de Mc

Farland (~ 1,5 x 10

células/mL) em solução salina 0,9%.

4.2.6.4. Preparo da suspensão de levedura

Cinco colônias de Candida albicans foram inoculadas em caldo

Sabouraud e incubadas a 35 ºC durante 48 horas. A partir deste inóculo foi

padronizada a turvação até escala 0,5 de Mc Farland (de 1 x 10

a 5 x 10

leveduras/mL) em solução salina 0,9%.

4.2.6.5. Teste de difusão em ágar com templates

O teste de difusão em ágar foi realizado baseado na Norma M2-A8 do

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2003, porém com

algumas modificações (NCCLS, 2003a).

As placas de Petri receberam ágar Müeller Hinton, sobre as quais foram

adicionadas 150 µL de suspensão bacteriana em concentração adequada

(escala 0,5 McFarland). Nos testes para Candida albicans, as placas de Petri

receberam ágar Müeller Hinton suplementado com 2% de glicose e 0,5 µg/mL

de azul de metileno, sobre o qual foram adicionados 100 µL da suspensão

desta levedura previamente diluída. Depois de homogeneizadas, as placas

receberam os “templates” com 6 orifícios de 6 mm de diâmetro interno. Cada

poço recebeu separadamente 50 µL de solução de ampicilina/anfotericina B; 50

55 MATERIAL E MÉTODOS

µL de cada extrato de E. uchi utilizado e 50 µL de solução de DMSO-BHI como

controle negativo (DMSO e BHI diluídos na proporção 1:1 v/v) colocado nas

placas. Antes da incubação a 37 ºC por 24-48 horas, as placas foram deixadas

1 hora a temperatura de 4º C para permitir a difusão das amostras. A inibição

do crescimento bacteriano e/ou fúngico foi determinada pela medida dos halos

ao redor dos poços com auxílio do paquímetro digital, e foi expressa como a

média de três determinações.

4.2.6.6. Teste de difusão em ágar com discos de papel

O teste de difusão em ágar foi realizado baseado na Norma M2-A8 do

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2003 (NCCLS, 2003a).

As placas de Petri receberam ágar Müeller Hinton, sobre as quais foram

adicionadas 150 µL de suspensão bacteriana em concentração adequada. Nos

testes para Candida albicans as placas de Petri receberam ágar Saboraud,

sobre o qual foram adicionados 100 µL da suspensão desta levedura

previamente diluída. Depois de homogeneizadas, discos de papel com 6 mm

de diâmetro, impregnados com 40 µL dos extratos a serem testados, 40 µL da

solução controle DMSO:BHI (1:1, v/v) e 40 µL dos antibióticos

(ampicilina/anfotericina B) foram colocados sobre a superfície do ágar MH

inoculado. Antes da incubação a 37 ºC por 24-48 horas, as placas foram

deixadas 1 hora a temperatura de 4º C para permitir a difusão das amostras. A

inibição do crescimento bacteriano e/ou fúngico foi determinada pela medida

dos halos ao redor dos discos com auxílio do paquímetro digital, e foi expressa

como a média de três determinações.

56 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.6.7. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) através do

método de diluição em microplaca e concentração bactericida mínima

(CBM)

Foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) utilizando

diluição em microplaca, com modificações, segundo a Norma M7-A6 do Clinical

and Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2003 (NCCLS, 2003b).

Em todos os poços foram colocados 100 µL de BHI. Os extratos foram

diluídos 1:5 em BHI a partir da solução estoque de 200 mg/mL, obtendo-se

soluções teste de 10 mg/mL. Foram pipetados 100 µL de cada uma destas

soluções nos respectivos poços da primeira coluna da microplaca (linhas 1 a

5). Um poço foi utilizado para adição de 100 µL de DMSO:BHI (1:5; v/v) para

controle do solvente (linha 6) e em outro poço foram colocados 100 µL da

solução de ampicilina anteriormente preparada (linha 7). Foram realizadas

diluições seriadas, transferindo-se 100 µL do poço anterior para o poço

subsequente. A linha 8 foi utilizada para controle positivo do crescimento

bacteriano e para controle negativo de esterilidade do meio. Na coluna 12

foram colocados 50 µL da solução teste dos extratos para controle

microbiológico destes. A todos os poços, exceto os de controle de esterilidade

do meio e microbiológico dos extratos, foram adicionados 100 µL da suspensão

bacteriana diluída 1:300 (v/v) em BHI (Figura 6). As microplacas foram

incubadas por 24 horas a 37 ºC. A inibição do crescimento bacteriano foi

evidenciada pela adição de 20 µL de uma solução aquosa de 0,01 % de

resazurina após incubação a 37 ºC por 1 hora, e foi determinada como

concentração inibitória mínima a menor concentração que inibiu o crescimento

bacteriano. Os testes foram realizados em duplicata.

57 MATERIAL E MÉTODOS

Após, foi realizada uma subcultura de cada microplaca, utilizando Müeller

Hinton Agar em placa de Petri de 12 cm de diâmetro, determinando o valor da

concentração bactericida mínima. As placas de Petri foram incubadas por 24

horas a 37 ºC. A concentração bactericida mínima foi então observada pela

ausência ou presença de crescimento bacteriano.

Amostras testadas C+ crescimento bacteriano

Controle negativo (DMSO:BHI) Somente amostras (C-)

Controle positivo (Ampicilina) C- crescimento bacteriano

FIGURA 6. Esquema da microplaca utilizada para determinação da

concentração inibitória mínima para bactérias (a primeira concentração é de 10

mg/mL com subsequente diluição 1:1).

D 20

I 10

M 5

P 10

T 20

58 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.7. TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA EM CAMUNDONGOS

Para este teste, seguindo as diretrizes da OECD (Organization for

Economic Co-operation and Development), Guideline 423, foram utilizados 20

camundongos (Mus musculus) Swiss, machos adultos, pesando entre 29-35 g,

distribuídos em 4 grupos (n = 5), de acordo com as doses recebidas por via

oral. As doses foram únicas e administradas nas concentrações 500 mg/kg,

1000 mg/kg, 2000 mg/kg de extrato obtido por decocção 20% (m/v) de

Endopleura uchi, utilizando água destilada para o grupo controle. Os animais

foram mantidos em caixas, em sala com ciclo claro-escuro de 12 horas e

temperatura de 20 ºC. Permaneceram em jejum 12 horas antes da

administração dos extratos e voltaram a receber ração e água somente 4 horas

após a administração dos extratos (BRITO, 1994). Foram observados nos

primeiros 30, 60, 120, 240 e 360 minutos e a cada 24 horas durante 14 dias,

observando-se o aparecimento de parâmetros tais como alteração da

locomoção, frequência cardíaca e respiratória, piloereção, diarréia, sialorréia,

hipnose, convulsões e número de óbitos.

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Araraquara (SP) (Anexo 3).

4.2.8. TESTE DA MOTILIDADE INTESTINAL EM CAMUNDONGOS

No ensaio de trânsito intestinal foi utilizado o extrato obtido por decocção

20% (m/v) de E. uchi, ressuspendido em solução fisiológica. Foram

constituídos 2 grupos experimentais com 10 animais cada, sendo que um

grupo foi tratado com o extrato aquoso de E. uchi (200 mg/kg), e o outro com

59 MATERIAL E MÉTODOS

solução fisiológica (10 mL/kg), como controle negativo, os quais receberam as

soluções por via oral através de “gavage”. Após 90 minutos, os animais

receberam a suspensão de carvão ativo 10% em solução de goma arábica 5%,

0,5 mL/animal, também através de “gavage”. Decorridos 45 minutos, os

camundongos foram sacrificados em câmara de CO

e foi realizada a

extirpação imediata do intestino desde o piloro até o início do ceco. Assim, foi

feita a medida do comprimento total do intestino delgado e da distância

percorrida pela suspensão de carvão ativo. A atividade sobre o trânsito

intestinal foi determinada segundo Janssen e Jageneau (1957) e Wong e Wai

(1981). A análise estatística foi realizada pelo teste-t de Student (P < 0,05).

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Araraquara (SP) (Anexo 3).

4.2.9. AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE

A citotoxicidade foi realizada frente a células fibroblásticas de córnea de

coelho da linhagem SIRC CCL-60. Estas células foram mantidas em garrafas

de cultura incubadas em estufa a 37 ºC sob atmosfera de 5% de CO

em meio

Eagle (pH 7) suplementado 15% de soro bovino fetal e sem bicarbonato de

sódio.

4.2.9.1. Preparo das amostras

Dissolvemos 10 mg de cada um dos seguintes extratos em 1 mL de

DMSO: decocção 20% (m/v); infusão 10% (m/v); maceração 5% (m/v) (EtOH

50%), percolação 10% (m/v) (EtOH 50%); turbo-extração 20% (m/v) (EtOH

60 MATERIAL E MÉTODOS

50%. A seguir, a partir dessas soluções-estoque iniciais, foi feita uma nova

diluição 1:5 (m/v) em meio Eagle, obtendo-se as soluções-teste.

4.2.9.2. Avaliação da citotoxicidade dos extratos

A técnica consistiu em coletar as células crescidas nas garrafas de cultura

por raspagem, centrifugá-las a 1500 rpm por 10 minutos e contá-las com

auxílio do corante Turk, em câmara de Neubauer, ajustando para a

concentração de 1 x 10

células/mL em meio Eagle suplementado. As células

desta suspensão foram incubadas em microplaca de 96 poços a 37 ºC em

atmosfera de 5% de CO

por 72 h. Após este período, foi observada a

formação de tapete celular e, subsequentemente, foi retirado o meio existente,

já inadequado para a manutenção celular. Foram colocados 100 µL de meio

novo, exceto no primeiro poço de cada linha no qual foram colocados 180 µL

de meio Eagle suplementado, e 20 µL das amostras de E. uchi.

Posteriormente, em cada linha foi realizada uma diluição seriada 1:1 (v/v) nos

demais poços da microplaca. A coluna 11 foi utilizada como controle do

solvente colocando-se 20 µL de solução DMSO:Eagle (1:5; v/v), e quatro poços

da coluna 12 foram utilizados para controle positivo do crescimento celular e

quatro como controle negativo de ausência de crescimento. A concentração

inicial dos extratos testados foi de 2 mg/mL, seguindo-se diluições seriadas na

proporção 1:1 (v/v) (Figura 7). A microplaca foi incubada por 24 h a 37 ºC em

estufa com atmosfera de 5% de CO

(LEI et al., 2008; OHNO et al., 1998;

TAKAHASHI et al., 2008). Posteriormente, adicionaram-se 15 µL de solução

aquosa de resazurina 0,1 mg/mL, incubando a microplaca em estufa sob

atmosfera a 5% de CO

a 37 ºC para leitura após 3 h. A leitura dos resultados

61 MATERIAL E MÉTODOS

foi feita visualmente pela diferenciação entre a cor azul (ausência de células

vivas) e cor-de-rosa (presença de células vivas) (O’BRIEN et al., 2000) e por

meio de leitor de fluorescência utilizando filtros de 530 e 590 nm.

180 µL Eagle suplementado + 20 µL amostras

20 µL DMSO:Eagle (5:1 v/v)

Controle positivo do crescimento

Controle negativo do crescimento

2 mg/mL 0,019 mg/mL

FIGURA 7. Representação esquemática da avaliação de citotoxicidade de

extratos vegetais de E. uchi em microplaca de 96 poços.

1:1 (v/v)

D 20

I 10

M 5

P 10

T 20

62 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como a média de três determinações ± os

desvios-padrões dos valores obtidos, utilizando-se o programa Microsoft Office

Excel 2007

. Quando conveniente, foi realizado o teste-t de Student ou a

análise de variância ANOVA, com P < 0,05.

63 RESULTADOS

5. RESULTADOS

5.1. ANÁLISES FISICO-QÚIMICAS

5.1.1. Granulometria

Os resultados da avaliação da granulometria estão apresentados na

Tabela 2. A aplicação de análise estatística dos resultados, expressos na

Tabela 2 e demonstrada na Figura 8, revela um diâmetro médio de partículas

de 0,268 mm ± 0,01.

TABELA 2. Porcentagens cumulativas de passagem e de retenção do pó das

cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae).

Tamanho da malha (mm) % Passagem % Retenção

0 0 100

0,074 1,74 98,2

0,125 16,25 83,74

0,177 33,67 66,33

0,250 50,33 49,67

0,420 80,38 19,62

Média de três determinações

64 RESULTADOS

FIGURA 8. Tamanho médio da partícula das cascas pulverizadas de

Endopleura uchi.

5.1.2. Determinação do pH

Em relação ao pH do pó das cascas pulverizadas de E. uchi, apresenta-se

o valor da média de três determinações na Tabela 3. O valor do pH da água

destilada foi de 6,77.

TABELA 3. Média dos valores de pH do pó das cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. e pH da água destilada utilizada.

pH da água destilada Média do valor de pH ± DP

6,77 4,85 ± 0,01

DP = desvio padrão

0,268

65 RESULTADOS

5.1.3. Determinação da densidade aparente não compactada

A Tabela 4 apresenta os valores das três determinações, em g/mL, da

densidade aparente não compactada das cascas pulverizadas de E. uchi.

TABELA 4. Densidade aparente de três amostras de cascas pulverizadas de

E. uchi, obtidas comercialmente

Amostras Proveta (g) Proveta Cheia (g) Densidade (g/mL)

Amostra 1 98,432 156,286 0,578

Amostra 2 97,427 149,325 0,519

Amostra 3 97,104 151,281 0,542

A densidade aparente não compactada média encontrada foi de 0,546

g/mL ± 0,03.

5.1.4. Determinação do teor de cinzas totais

A Tabela 5 apresenta os valores das três determinações, em

porcentagem relativa à massa de amostra inicialmente pesada, do teor de

cinzas totais apresentado pelo pó das cascas pulverizadas de E. uchi obtido

comercialmente.

TABELA 5. Teor de cinzas totais de cascas pulverizadas de E. uchi

Amostras massa inicial (g) massa cinzas (g) teor cinzas (%)

Amostra 1 3,004 0,175 5,83

Amostra 2 3,001 0,201 6,70

Amostra 3 3,007 0,214 7,12

66 RESULTADOS

Assim, foi encontrado um valor médio de teor de cinzas totais de 6,55% ±

0,65.

5.1.5. Determinação da perda por dessecação em balança com

infravermelho (INFRATEST)

A Tabela 6 apresenta o decréscimo de massa das amostras iniciais de

cascas pulverizadas de Endopleura uchi.

TABELA 6. Decréscimo de massa das amostras iniciais do pó das cascas

pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec.

Pesagem Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

1 4,032 4,01 4,021

2 3,881 3,715 3,798

3 3,846 3,701 3,773

4 3,829 3,699 3,764

5 3,819 3,698 3,758

6 3,812 3,696 3,754

7 3,811 3,691 3,751

8 3,811 3,691 3,751

Os cálculos revelaram uma perda porcentual média de massa de 6,72% ±

1,23.

67 RESULTADOS

5.1.6. Determinação da perda por dessecação em estufa

Após cada pesagem, foi calculada a média de massa perdida, a partir de

uma amostra inicial de 2 g de pó das cascas de E. uchi. Assim, seguem na

tabela 7 os valores de perda, em gramas, de massa das amostras iniciais da

droga vegetal.

TABELA 7. Decréscimo de massa das amostras iniciais do pó das cascas

pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec.

Pesagem Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

1 27,630 27,430 26,960

2 27,525 27,274 26,814

3 27,523 27,272 26,813

4 27,520 27,269 26,809

5 27,519 27,268 26,808

6 27,519 27,268 26,808

A média da massa perdida total, após todas as pesagens, foi de 0,1417g.

Assim, foi obtida uma perda por dessecação de 7,08% ± 1,35 em massa da

amostra inicial do pó das cascas pulverizadas de E. uchi.

5.1.7. Determinação do teor de extrativos para a droga

O valor médio do teor de extrativos encontrado para a droga foi de

13,77% ± 2,04. Esse valor corresponde à média de três determinações.

68 RESULTADOS

5.2. ANÁLISES MICROSCÓPICAS

5.2.1. Análise microscópica comparativa das amostras pulverizadas com

as amostras in natura (secas) de cascas de E. uchi

A análise das lâminas contendo os cortes anatômicos das amostras in

natura possibilitou evidenciar a disposição da estrutura da casca de E. uchi.

Fica evidente uma distribuição periclinal das células do esclerênquima em

relação ao parênquima radial (Figura 9). Há grande abundância de idioblastos

cristalíferos contendo monocristais poliédricos, em meio ao tecido

parenquimático, o qual é preenchido por células com reservas de compostos

fenólicos em seu interior (Figura 9).

Na microscopia de pó da casca do uchi-amarelo, foi observada a

presença de fragmentos de fibras lignificadas envolvidas por bainha cristalífera,

de cristais prismáticos, de fragmentos de fibras gelatinosas, poucas células

pétreas e grãos de amido pequenos, esféricos e isolados (Figura 10).

69 RESULTADOS

FIGURA 9. Secções anatômicas de cascas in natura secas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae). A) Secção longitudinal radial, submetida ao

reagente azul de toluidina, evidenciando a disposição anatômica estrutural. A

seta indica células parenquimáticas preenchidas por material fenólico, corado

mais intensamente. A ponta de seta indica idioblastos cristalíferos dispostos ao

longo do esclerênquima. B) Secção longitudinal radial, submetida ao reagente

cloreto férrico 10%, evidenciando a presença de material fenólico no tecido

parenquimático.

10 µm

20 µm

70 RESULTADOS

FIGURA 10. Microscopia do pó da casca de Endopleura uchi (Huber) Cuatrec.

(Humiriaceae) submetida ao reagente azul de toluidina. Ga – grão de amido; Ic

– idioblastos cristalíferos; Cp – cristal poliédrico; Fg – fibra gelatinosa.

5.2.2. Pesquisa histoquímica para compostos fenólicos

Foi verificada a positividade da reação com cloreto férrico 10% (m/v), pelo

surgimento de pequenos depósitos de coloração bastante escura, negro-

esverdeada, ao longo de toda a estrutura do material vegetal, sobretudo em

depósitos no esclerênquima, dispostos radialmente ao longo do parênquima

(Figura 11).

10 µm

20 µm

10 µm

71 RESULTADOS

FIGURA 11. Secções anatômicas de cascas in natura secas de Endopleura

uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae). A) Secção longitudinal radial

evidenciando os principais tecidos formadores, bem como os idioblastos

cristalíferos abundantes dispostos ao longo do esclerênquima (ponta de seta).

As esclereides mostram-se acompanhadas de conteúdo fenólico, corado

intensamente (seta); B) Visualização do resultado da reação com FeCl

10%

(m/v), evidenciando os depósitos de compostos fenólicos (seta) no interior das

esclereides.

5.3. ANÁLISES FITOQUÍMICAS

5.3.1. Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos

secundários

Os dados da triagem fitoquímica, realizada com as cascas pulverizadas

de E. uchi (Tabela 8), revelaram os taninos, as saponinas e as cumarinas como

grupos de substâncias químicas que podem ser empregadas para a

caracterização da matéria-prima. Vale ressaltar que para que fique

caracterizada a presença de determinado grupo de substância química na

amostra, todos os testes executados devem ser positivos.

40 µm

A B

72 RESULTADOS

TABELA 8. Análise fitoquímica das cascas pulverizadas de Endopleura uchi

(Huber) Cuatrec. (Humiriaceae).

Classes Reações Resultado

Flavonóides

Shinoda

Taubock

Pew

cloreto férrico

cloreto de alumínio

Taninos

gelatina

sais de ferro

acetato de chumbo

Saponinas

formação e permanência de

espuma

Glicosídeos

Cardiotônicos

Legal

Kedde

Pesez

Keller-Kiliani

Liebermann-Burchard

Antraquinonas

livres

Borntrager

Alcalóides

Bertrand

Bouchardat

Dragendorff

Mayer

Cumarinas NaOH +

( + ): reação positiva; ( - ): reação negativa

5.3.2. Perfil cromatográfico

Na Figura 12 pode-se visualizar o cromatograma obtido da partição com

acetato de etila do decocto 20% (m/v) a partir de cascas pulverizadas de E.

73 RESULTADOS

uchi. A figura mostra ainda as manchas apresentadas por substâncias puras

padrão, da classe dos taninos, evidenciados na triagem fitoquímica. Na Tabela

9 encontramos os valores dos fatores de retenção (Rf) das manchas

apresentadas para cada uma das amostras e das substâncias padrão. O fator

de retenção consiste na seguinte razão:

Rf = dA / dF

Em que: Rf = fator de retenção; dA = distância percorrida pela amostra;

dF = distância da fase móvel

74 RESULTADOS

Figura 12. Cromatograma das frações acetato de etila do extrato decocção

20% (m/v) obtidos das cascas pulverizadas de Endopleura uchi. Sistema

eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (9:5:1 v/v/v).; revelador: cloreto

férrico 2% em metanol. (A) ácido tânico (B) ácido gálico; (C) bergenina; (D)

fração acetato de etila; (E) fração aquosa.

B C D E A

12 cm

75 RESULTADOS

TABELA 9. Fator de retenção das manchas apresentadas no cromatograma da

figura 12.

Amostra Nº da mancha Rf

Ácido tânico 1 0,89

Ácido gálico 2 0,86

Bergenina 3 0,67

Fração acetato de etila

0,89

0,66

0,52

Fração aquosa

0,90

0,69

Na Figura 13 pode-se visualizar o cromatograma obtido com todos os

extratos preparados neste trabalho. A Tabela 10 apresenta os valores

correspondentes de Rf.

76 RESULTADOS

Figura 13. Cromatograma dos seguintes extratos de E. uchi: decocção a 5, 10

e 20% (m/v) (D5, D10 e D20); infusão a 5, 10 e 20% (m/v) (I5, I10 e I20);

maceração a 5, 10 e 20% (m/v) (M5, M10 e M20); percolação a 5, 10 e 20%

(m/v) (P5, P10 e P20) e turbo-extração a 5, 10 e 20% (m/v) (T5, T10 e T20).

Sistema eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (9:5:1 v/v/v).; revelador:

cloreto férrico 2% em metanol.1) Grupo de manchas com Rf = 0,89; 2) Grupo

de manchas com Rf = 0,64.

D5 I5 M5 P5 T5 D10 I10 M10 P10 T10 D20 I20 M20 P20 T20

10,3 cm

77 RESULTADOS

TABELA 10. Fator de retenção das manchas apresentadas no cromatograma

da figura 13.

A N° Rf A N° Rf A N° Rf

0,89

0,64

D10

0,89

0,64

D20

0,89

0,64

0,89

0,64

I10

0,89

0,64

I20

0,89

0,64

0,89

0,64

M10

0,89

0,64

M20

0,89

0,64

0,89

0,64

P10

0,89

0,64

P20

0,89

0,64

0,89

0,64

T10

0,89

0,64

T20

0,89

0,64

A: amostra; N°: número da mancha; Rf: fator de rete nção

5.3.3. Perfil espectrofotométrico na região de luz ultravioleta

O perfil espectrofotométrico dos compostos padrão da classe dos taninos,

ácido gálico e ácido tânico, está mostrado na Figura 14 e o perfil dos extratos

na Figura 15.

78 RESULTADOS

FIGURA 14. Perfil espectrofotométrico, na região de luz ultravioleta, de ácido

gálico (linha azul) e ácido tânico (linha preta).

FIGURA 15. Perfil espectrofotométrico, na região de UV (190-400 nm), dos

seguintes extratos de cascas pulverizadas de Endopleura uchi: linha preta –

decocção 20% (m/v); linha azul – infusão 10% (m/v); linha vermelha –

maceração 5% (m/v); linha rosa – percolação 10% (m/v); linha amarela – turbo-

extração 20% (m/v)

Absorbância

Comprimento de onda (nm)

79 RESULTADOS

5.3.4. Obtenção e rendimento dos extratos

Foram calculados os valores de rendimento para todos os processos,

obtendo os seguintes valores, listados na Tabela 11 abaixo:

TABELA 11. Valores de rendimento em porcentagem (%) dos extratos obtidos

a partir de cascas pulverizadas de E. uchi (Huber) Cuatrec.

Extrato Rm (%) Rp (%) Rt (%) Rd (%) Ri (%)

EtOH 50%

(5%, m/v)

4,564 11,464 8,568 x x

EtOH 50%

(10%, m/v)

11,000 14,160 8,980 x x

EtOH 50%

(20%, m/v)

12,031 23,870 14,470 x x

Aquoso

(5%, m/v)

x x x 7,520 8,128

Aquoso

(10%, m/v)

x x x 5,590 6,220

Aquoso

(20%, m/v)

x x x 4,370 13,270

EtOH 50%: etanol 50%; x: não se aplica; Rm: rendimento final em porcentagem

da maceração; Rp: rendimento final em porcentagem da percolação; Rt:

rendimento final em porcentagem da turbo-extração; Rd: rendimento final em

porcentagem da decocção; Ri: rendimento final em porcentagem da infusão

5.4. ANÁLISES QUANTITATIVAS

5.4.1. Determinação do teor de fenóis totais

As leituras de absorvância da solução padrão de ácido tânico e do extrato

foram feitas em triplicata, portanto, os resultados apresentados referem-se à

80 RESULTADOS

média da absorvância, para cada concentração (em µg/mL) utilizada nas

leituras. A Figura 16 apresenta a curva analítica construída com diferentes

concentrações da solução padrão de ácido tânico.

FIGURA 16. Curva analítica de absorvância da solução padrão de ácido tânico

A partir da curva analítica obtida com a solução padrão de ácido tânico

pôde-se calcular a porcentagem de fenóis totais existentes nas amostras de

cascas pulverizadas de E. uchi utilizando a equação da reta da solução padrão

de ácido tânico. As porcentagens finais são expressas pela média dos valores

de porcentagem da absorvância de cada solução de leitura das amostras e

podem ser visualizadas na Tabela 12 e Figura 17.

Concentração µg/mL

Absorbância

81 RESULTADOS

TABELA 12. Valores dos teores de fenóis totais (TFT) dos extratos de

Endopleura uchi

amostras TFT (%) ± DP

D5 5,810 ± 0,81

D10 4,940 ± 2,44

D20 5,610 ± 1,18

I5 4,620 ± 2,34

I10 3,830 ± 0,98

I20 4,150 ± 1,81

M5 3,326 ± 0,16

M10 3,920 ± 1,10

M20 3,130 ± 0,13

P5 3,327 ± 0,63

P10 3,220 ± 0,97

P20 3,170 ± 0,81

T5 3,520 ± 0,99

T10 3,110 ± 0,48

T20 3,290 ± 1,09

D5: decocção 5% (m/v); D10: decocção 10% (m/v); D20: decocção 20% (m/v);

I5: infusão 5% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); I20: infusão 20% (m/v); M5:

maceração 5% (m/v); M10: maceração 10% (m/v); M20: maceração 20% (m/v);

P5: percolação 5% (m/v); P10: percolação 10% (m/v); P20: percolação 20%

(m/v); T5: turbo-extração 5% (m/v); T10: turbo-extração 10% (m/v); T20: turbo-

extração 20% (m/v). Os extratos obtidos por maceração, percolação e turbo-

extração foram preparados com etanol 50% (v/v).

82 RESULTADOS

FIGURA 17. Teor de fenóis totais dos extratos de cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae).

Na análise da Figura 17 foi verificado que algumas amostras

apresentaram, para um nível de confiança de 95%, desvios-padrões acima do

limite estatístico aceitável, como no caso dos extratos D10 e I5.

5.4.2. Doseamento de taninos totais em extratos vegetais

Os valores médios das quantidades de taninos totais (TT) e os valores

médios de resíduo seco (teor de extrativos, TE) para cada um dos extratos das

cascas pulverizadas de Endopleura uchi estão apresentados na Tabela 13 e na

Figura 18, assim como mais ou menos seus respectivos desvios-padrões.

83 RESULTADOS

TABELA 13. Valores de teores de extrativos (TE) e taninos totais (TT) para

cada um dos extratos obtidos a partir de cascas pulverizadas de E. uchi.

amostras TT (%) TE (%)

D5 19,65 ± 1,59 12,53 ± 1,02

D10 16,34 ± 3,18 11,41 ± 0,40

D20 20,27 ± 1,16 9,65 ± 0,22

I5 22,66 ± 0,53 9,70 ± 0,05

I10 26,06 ± 4,27 8,85 ± 0,05

I20 12,08 ± 2,11 8,525 ± 0,25

M5 23,62 ± 1,00 13,73 ± 0,11

M10 23,41 ± 2,47 13,10 ± 0,17

M20 23,18 ± 0,93 13,04 ± 0,05

P5 20,72 ± 0,79 18,60 ± 0,26

P10 32,85 ± 1,62 16,80 ± 0,39

P20 18,56 ± 1,79 18,87 ± 0,27

T5 19,99 ± 0,49 12,83 ± 0,32

T10 20,26 ± 0,50 12,95 ± 0,62

T20 24,77 ± 2,54 14,85 ± 0,54

D5: decocção 5% (m/v); D10: decocção 10% (m/v); D20: decocção 20% (m/v);

I5: infusão 5% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); I20: infusão 20% (m/v); M5:

maceração 5% (m/v); M10: maceração 10% (m/v); M20: maceração 20% (m/v);

P5: percolação 5% (m/v); P10: percolação 10% (m/v); P20: percolação 20%

(m/v); T5: turbo-extração 5% (m/v); T10: turbo-extração 10% (m/v); T20: turbo-

extração 20% (m/v). Os extratos obtidos por maceração, percolação e turbo-

extração foram preparados com etanol 50% (v/v). Os valores estão expressos

como porcentagem da média de três determinações mais ou menos os

desvios-padrões.

84 RESULTADOS

FIGURA 18. Teor de taninos totais dos extratos de cascas pulverizadas de

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. (Humiriaceae).

Na análise da Figura 18 foi verificado que algumas amostras

apresentaram, para um nível de confiança de 95%, desvios-padrões acima do

limite estatístico aceitável. Foi o caso dos extratos D10, I10, I20 e M10.

5.4.3. Determinação da capacidade de sequestro de radicais livres

O potencial da atividade antioxidante dos extratos foi determinado

baseado na atividade sequestrante da solução de 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

(DPPH). A atividade anti-radicalar, em porcentagem, dos padrões e das

amostras, em suas definidas concentrações, está apresentado na Tabela 14 e

ilustrado na Figura 19.

85 RESULTADOS

TABELA 14. Atividade anti-radicalar percentual das substâncias padrão e dos

extratos estudados na concentração de 250 µg/mL.

Amostra (250 µg/mL) Atividade anti-radicalar (%)

ácido gálico 97,24 ± 0,05

rutina 96,83 ± 0,06

vitamina C 98,14 ± 0,06

extrato de Ginkgo biloba

96,97 ± 0,09

D20 87,46 ± 2,59

I10 79,54 ± 2,63

M5 89,22 ± 0,82

P10 88,9 ± 2,52

T20 90,58 ± 0,62

Os valores correspondem à média de três determinações e estão expressos

em porcentagem ± os desvios-padrões. D20: decocção 20% (m/v); I10: infusão

10% (m/v); M5: maceração 5% (m/v); P10: percolação 10% (m/v); T20: turbo-

extração 20% (m/v).

As análises estatísticas dos valores observados na Tabela 14 (ANOVA)

mostraram que há diferença significativa entre as porcentagens de atividade

anti-radicalar dos extratos em relação aos padrões.

86 RESULTADOS

FIGURA 19. Atividade anti-radicalar percentual das substâncias padrão e dos

extratos estudados na concentração de 250 µg/mL. (1) ácido gálico; (2) rutina;

(3) vitamina C; (4) extrato de Ginkgo biloba; (5) decocção 20% (m/v); (6)

infusão 10% (m/v); (7) maceração 5% (m/v); (8) percolação 10% (m/v); (9)

turbo-extração 20% (m/v).

5.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

5.5.1. Teste de difusão em ágar

A solução de controle de atividade do DMSO não apresentou formação de

halo de inibição contra as bactérias em estudo, portanto, este solvente não foi

interferente da atividade antimicrobiana apresentada pelos extratos utilizados.

Os resultados dos testes de difusão com templates são apresentados na

Tabela 15 e os resultados dos testes de difusão com discos na Tabela 16.

A Figura 20A ilustra o halo de inibição do antibiótico anfotericina B frente

à linhagem de C. albicans pelo método de difusão com “template”. Foi

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

amostras

Amostras

Porcentagem (%)

87 RESULTADOS

constatado ainda, da análise desta figura, que nenhum dos extratos testados

foi efetivo na inibição do crescimento do microrganismo. A Figura 20B ilustra o

halo de inibição do antibiótico ampicilina frente à linhagem de E. coli pelo

método de difusão com “template”. Também foi observado da análise desta

figura que nenhum dos extratos testados foi efetivo na inibição do crescimento

do microrganismo.

A Figura 21A ilustra o halo de inibição do antibiótico anfotericina B e

também um pequeno halo de inibição do extrato I10 (infusão 10%, m/v) frente à

linhagem de Candida albicans pelo método de difusão com discos. A Figura

21B ilustra o halo de inibição do antibiótico ampicilina frente à linhagem de

Staphylococcus aureus pelo método de difusão com discos. Apesar de não

aparecer claramente nesta figura, foi observado o aparecimento de pequenos

halos de inibição para todos os extratos testados.

88 RESULTADOS

TABELA 15. Diâmetro dos halos (mm) de diferentes extratos de cascas de E.

uchi pelo teste de difusão em ágar com templates.

Amostra EC SA BS SS SE CA

D20 - 15,0 - - - -

I10 - 15,0 - - - -

M5 - 13,0 - - - -

P10 - 13,0 - - - -

T20 - 14,0 - - - -

A 18,0 23,0 15,5 13,0 17,5 23,5

C - - - - - -

Os valores representam a média de três determinações. D20 – decoccção 20%

(m/v); I10 – infusão 10% (m/v); M5 – maceração 5% (m/v); P10 – percolação

10% (m/v); T20 – turbo-extração 20% (m/v). A = antibiótico

(ampicilina/anfotericina B); C = controle negativo (solução de DMSO-BHI); EC =

Escherichia coli; SA = Staphylococcus aureus; BS = Bacilus subtilis; SS =

Shigella sonnei; SE = Staphylococcus epidermidis; CA = Candida albicans

89 RESULTADOS

TABELA 16. Diâmetro dos halos (mm) de diferentes extratos de cascas de E.

uchi pelo teste de difusão em ágar com discos.

Amostra EC SA BS SS SE CA

D20 - 7,0 - - - -

I10 - 7,0 - - - 8,0

M5 - 7,0 - - - -

P10 - 8,1 - - - -

T20 - 7,9 - - - -

A 13,7 19,3 19,7 17,5 12,7 17,5

C - - - - - -

Os valores representam a média de três determinações. D20 – decoccção 20%

(m/v); I10 – infusão 10% (m/v); M5 – maceração 5% (m/v); P10 – percolação

10% (m/v); T20 – turbo-extração 20% (m/v). A = antibiótico

(ampicilina/anfotericina B); C = controle negativo (solução de DMSO-BHI); EC =

Escherichia coli; SA = Staphylococcus aureus; BS = Bacilus subtilis; SS =

Shigella sonnei; SE = Staphylococcus epidermidis; CA = Candida albicans

90 RESULTADOS

FIGURA 20. A) Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão

em ágar com templates dos extratos de E. uchi contra Candida albicans; B)

Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar com

discos dos extratos de E. uchi contra E. coli. Anf: anfotericina B; Amp:

ampicilina; D20: decoccção 20% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); M5: maceração

5% (m/v); P10: percolação 10% (m/v); T20: turbo-extração 20% (m/v).

FIGURA 21. A) Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão

em ágar com discos dos extratos de E. uchi contra Candida albicans; B)

Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar com

discos dos extratos de E. uchi contra S. aureus. Anf: anfotericina B; Amp:

ampicilina; D20: decoccção 20% (m/v); I10: infusão 10% (m/v); M5: maceração

5% (m/v); P10: percolação 10% (m/v); T20: turbo-extração 20% (m/v).

Anf

Amp

D20

I10

P10

T20

Anf

D20

Amp

I10

P10

T20

P10

T20

DMSO

91 RESULTADOS

5.5.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) através do

método de diluição em microplaca e concentração bactericida mínima

(CBM)

A Figura 22 mostra uma microplaca incubada com Staphylococcus

aureus, segundo o esquema apresentado na Figura 6. Houve crescimento

bacteriano nos poços selecionados para controle positivo de crescimento.

Nota-se ausência de crescimento bacteriano nos poços que não receberam o

inóculo, indicando a esterilidade do meio de cultura (controle negativo) e a

ausência de contaminação dos extratos. Houve crescimento bacteriano nos

poços onde foram colocados os controles de solvente DMSO indicando que

este solvente não foi interferente dos resultados de inibição do crescimento

bacteriano apresentados pelos extratos. Quanto ao antibiótico, mostrou-se

efetivo nas quatro primeiras diluições, perdendo sua atividade a partir daí (CIM

= 0,125 mg/ mL). Em relação aos extratos, nenhum deles foi efetivo em

nenhuma das diluições. Assim sendo, também não foram encontrados

resultados positivos na determinação de concentração bactericida mínima,

tendo havido crescimento da linhagem de S. aureus em todas as diluições

empregadas.

92 RESULTADOS

FIGURA 22. Determinação de CIM pelo método de microdiluição em

microplaca contra Staphylococcus aureus.

5.6. TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA EM RATOS

Os resultados não revelaram sinais de toxicidade sistêmica com a

administração do extrato aquoso obtido por decocção 20% (m/v) de Endopelura

uchi. Não foram observadas mortes e nem alterações de comportamento dos

animais, tampouco ocorreram alterações de massa corporal dos animais.

5.7.

TESTE DA MOTILIDADE INTESTINAL EM CAMUNDONGOS

O ensaio do trânsito intestinal em camundongos demonstrou que houve

uma redução na distância percorrida pelo carvão ativo após administração do

extrato obtido por decocção 20% (m/v) de cascas pulverizadas de Endopleura

uchi, quando comparados com o controle negativo (solução fisiológica) (Tabela

17). Porém, para P < 0,05, o valor de “t” encontrado (t = 0,9057) foi menor que

93 RESULTADOS

o “T” tabelado (T=2,101), sugerindo que o resultado apresentado pela nossa

amostra não difere significativamente do controle.

TABELA 17. Distância percorrida pelo carvão ativo no intestino dos

camundongos após a administração do extrato aquoso das cascas

pulverizadas de Endopleura uchi e da solução fisiológica controle.

Tratamento Dose (mg/kg) Distância média (cm)

Extrato aquoso 200 mg/kg 43,81 ± 11,84

Controle negativo 10 mL/kg 48,00 ± 8,58

Os resultados representam a média de três determinações ± os desvios-

padrões.

5.8. AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE

A Figura 23 mostra um esquema, baseado na Figura 7, com os resultados

do teste de citotoxicidade. A Tabela 18 apresenta os valores, em porcentagem,

de sobrevivência das células da córnea de coelhos da linhagem SIRC CCL-60.

Verificamos a partir do teste que nenhum dos extratos aplicados foi tóxico,

em nenhuma das concentrações utilizadas, apresentando IC

maior que 2

mg/mL.

94 RESULTADOS

Presença de células vivas Ausência de células vivas

FIGURA 23. Representação dos resultados de citotoxicidade dos extratos

obtidos de cascas pulverizadas de Endopleura uchi.

TABELA 18. Avaliação da citotoxicidade de extratos de cascas pulverizadas de

E. uchi frente a células da córnea de coelhos da linhagem SIRC CCL-60

Amostra % Sobrevivência IC

D20 100 > 2 mg/mL

I10 100 > 2 mg/mL

M5 100 > 2 mg/mL

P10 100 > 2 mg/mL

T20 100 > 2 mg/mL

D20: decocção 20% (m/v), I10: infusão 10% (m/v), M5: maceração 5% (m/v);

P10: percolação 10% (m/v), T20: turbo-extração 20% (m/v); IC

: índice de

citotoxicidade para 50% das células testadas.

95 DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

A atividade farmacêutica teve origem na preparação artesanal de

medicamentos, posteriormente evoluindo para a fase industrial. Por motivos

diversos, a atividade magistral teve uma retomada de interesse nas últimas

décadas e hoje ocupa setores expressivos de mercado. O volume de matérias-

primas associadas a essa atividade e as dificuldades de avaliação da qualidade

dos materiais levou ao surgimento de problemas de diversas ordens,

estimulando a regulamentação oficial do segmento para assegurar a qualidade

dessa classe de produtos. Para isso, o Ministério da Saúde Brasileiro, através

da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, vem instituindo uma série de

normas com o objetivo de organizar a produção dos medicamentos

fitoterápicos comercializados no país. Para se obter os registros de

comercialização junto a ANVISA, as empresas produtoras precisam cumprir

uma série de procedimentos, indispensáveis para a preparação dos produtos

dentro de padrões de qualidade. A legislação que rege o registro destes

medicamentos é a RDC 48/04, sendo complementada pelas RE 88, 89, 90 e

91/04 (BRASIL, 2004). No entanto, tal norma foi editada com enfoque

predominantemente voltado às boas práticas farmacêuticas e com exigências

de controle de qualidade específicas para fármacos sintéticos, geralmente

inaplicáveis aos produtos da classe de fitoterápicos (TOBIAS, 2007).

Uma grande parte das plantas medicinais brasileiras encontra-se descrita

apenas na primeira edição da Farmacopéia Brasileira, editada em 1926, com

partes das mesmas suprimidas na Segunda edição ou destinadas ao

Formulário Nacional. Com os avanços científicos e tecnológicos, suas

96 DISCUSSÃO

monografias tornaram-se obsoletas para fins analíticos. Sendo assim, quando

uma droga vegetal não consta em uma Farmacopéia atualizada, é essencial

que a empresa que emprega essa planta como matéria-prima elabore uma

monografia estabelecendo seus padrões de qualidade (FARIAS, 1999). Porém,

fica evidente em nosso país, ainda bastante enraizado às tradições populares,

que grande parte das drogas vegetais estão sendo utilizadas

indiscriminadamente, sem quaisquer cuidados ou medidas de controle,

fundamentado no pensamento de que “o que é natural não faz mal”. É fato

bastante conhecido nos meios científicos que dependendo da dose, podem-se

ter plantas com atividade terapêutica ou tóxica. Como exemplo, a Digitalis

purpurea L. (popularmente conhecida como “dedaleira”), espécie vegetal que

contém glicosídeos cardiotônicos, utilizada em casos de insuficiência cardíaca,

com dose terapêutica muito próxima à dose tóxica. Uma dose um pouco mais

elevada pode causar intoxicação, provocando a morte por parada cardíaca

(SIMÕES, 2004).

Os processos de prospecção fitoquímica são de extrema importância, pois

permitem identificar quais classes de metabólitos secundários e/ou princípios

ativos estão presentes em determinada amostra vegetal e, a partir daí, orientar

a extração e/ou fracionamento de extratos para isolamento de compostos de

maior interesse.

Muitas substâncias, quando tratadas com determinados reativos,

apresentam reações de coloração e/ou precipitação características, que

permitem a identificação das amostras que as contêm. As plantas produzem

diferentes substâncias químicas e o fazem em diferentes proporções,

dependendo do hábitat, do regime de chuvas, da insolação, do solo, enfim, das

97 DISCUSSÃO

características climato-edáficas. Entretanto, algumas substâncias químicas são

bastantes características para um determinado vegetal, e desta forma podem

servir como parâmetro para sua caracterização e identificação.

No caso das cascas pulverizadas de E. uchi, ficou bem evidente, a partir

da triagem fitoquímica executada, a presença de três grupos: saponinas,

cumarinas e taninos. Apesar da reação de cloreto férrico no teste para

flavonóides ter sido positiva, as demais reações não apresentaram

positividade, descaracterizando assim a presença deste grupo de substâncias

na amostra em estudo.

A positividade para taninos pode representar uma explicação quanto ao

uso das cascas como antibacteriano ou mesmo antiinflamatório. Tal afirmação

encontra respaldo ao confirmar-se o uso de plantas medicinais ricas em

polifenóis para obtenção de efeito anti-séptico (KOLODZIEJ et al., 2003).

A presença de substâncias antimicrobianas nos vegetais superiores, bem

como o seu uso para tratar infecções não são fatos recentes (RODRIGUES,

1980; BUHNER, 1999; COWAN, 1999; YUNES e CALIXTO, 2001). Durante a

sua vida, as plantas reagem a várias injúrias advindas do ambiente, e são

capazes de produzir compostos antimicrobianos para protegê-las contra

infecções causadas por patógenos como bactérias, fungos e vírus

(RODRIGUES, 1980; WOJTASZEK, 1997; YUNES e CALIXTO, 2001;

ESQUENAZI et al., 2002).

Em vista da resistência que muitos patógenos humanos apresentam

devido à seleção a que passaram pelo uso indiscriminado de antimicrobianos,

da emergência de infecções incomuns e efeitos adversos apresentados por

alguns medicamentos, as pesquisas tornaram-se mais direcionadas às plantas

98 DISCUSSÃO

medicinais, sendo que muitas espécies já se mostraram eficazes como agentes

antimicrobianos (ZAMPINI et al., 2005).

Entre tantas plantas nativas e aclimatadas no Brasil, o objetivo deste

trabalho foi o estudo farmacognóstico e das atividades antimicrobiana e

citotóxica de extratos de cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber)

Cuatrec. As cascas de uchi-amarelo, como conhecido popularmente, são

vendidas, trituradas ou pulverizadas, em mercados municipais, feiras de

produtos naturais, internet ou até mesmo em farmácias magistrais, sem

quaisquer restrições, e o que é mais preocupante, sem que haja estudos que

comprovem sua real eficácia e segurança. A população utiliza o chá destas

cascas no tratamento de diversos males, destacando-se seu uso no tratamento

de miomas e inflamações do trato digestivo, gripes, resfriados e afecções

intestinais. Assim, para atingir os objetivos deste trabalho, foram necessários

estudos de caracterização físico-química, qualitativa e quantitativa da droga e

dos extratos utilizados. É importante ressaltar que praticamente não existem

estudos de referência com esta droga na literatura, o que torna este trabalho

pioneiro, aumentando sua importância.

Inicialmente, foi determinada a granulometria da droga para sua

padronização, a fim de otimizar os processos extrativos (SONAGLIO et al.,

2004). A granulometria, que é o grau de divisão de pós, é expressa em

referência à abertura nominal da malha do tamis utilizado (FARMACOPÉIA,

1988). Segundo a literatura (LIST e SCHMIDT, 2000), a droga pulverizada que

apresente partículas de tamanho superior à classificação de fino é mais

adequada para os processos de extração. No caso do material utilizado neste

trabalho, aconteceu justamente o contrário. A granulação muito fina dificultou a

99 DISCUSSÃO

obtenção de extratos por turbo-extração e por percolação, sobretudo no

momento da filtração. Constata-se que o uchi-amarelo é vendido como pó fino

para facilitar o seu encapsulamento, mesmo sendo proibido, por empresas que

lidam com o comércio de produtos naturais. Para fins científicos, o ideal seria

trabalhar com cascas moídas de forma mais grosseira, acima da classificação

de pó muito fino.

Uma das importâncias do pH nos vegetais está no mecanismo de

formação de ATP, que é impulsionado por uma força próton-motriz durante a

fotofosforilação nos cloroplastos (STRAYER, 1996). O ATP é uma molécula de

alta energia, que acopla reações não favoráveis no interior das células. Entre

essas reações, estão aquelas que fazem parte da biossíntese de enzimas

importantes no metabolismo secundário (STRAYER, 1996). As alterações

metabólicas provocadas por reações de óxido-redução podem modificar o pH

das células vegetais, promovendo desvio das rotas metabólicas normais

(STRAYER, 1996). De acordo com os dados da Tabela 3, encontrou-se um pH

médio de 4,85 na amostra de E. uchi, conferindo-a um caráter ácido.

A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de

impurezas inorgânicas não-voláteis (SIMÕES et al., 2004; VIGO et al., 2004).

Essa análise permite a verificação de adulteração da amostra, através da

observação da quantidade de material contaminante na mesma, após a

calcinação. As cinzas totais incluem aquelas derivadas de tecido vegetal

(cinzas fisiológicas) e derivadas de materiais estranhos, especialmente areia e

terra aderente à superfície da droga (cinzas não fisiológicas) (FARMACOPEIA

BRASILEIRA, 2000). Como não existem valores de teor de cinzas totais, na

100 DISCUSSÃO

literatura, para as cascas de Endopleura uchi, os resultados obtidos neste

trabalho tornam-se importantes para o processo de sua padronização.

Outro parâmetro que auxilia a caracterização da droga é representado

pela perda por dessecação, que está ligada à estabilidade microbiológica da

droga, como expressão de sua susceptibilidade ao desenvolvimento de

bactérias e fungos, e estabilidade química, representada especialmente pelos

processos de hidrólise (WHO, 1992). A variabilidade nos valores pode ser

reduzida, desde que haja padronização nos parâmetros de plantio, coleta,

armazenagem e tratamento prévio da droga utilizada. A perda por dessecação

pode fornecer dados acerca do rendimento de extração, já que a secagem influi

no estado de integridade das estruturas celulares, expondo-as mais ou menos

ao contato com solventes (HARBORNE, 1993). Além do mais, sob o ponto de

vista tecnológico e de produção, é importante conhecer quantitativamente o

conteúdo de água presente na matéria-prima vegetal, para que este valor seja

considerado nos cálculos de rendimento. Embora não existam dados de

referência na literatura para E. uchi, os valores encontrados tanto para perda

por dessecação em balança com infravermelho quanto para perda por

dessecação em estufa, estão abaixo dos limites máximos encontrados no

código oficial brasileiro (8 a 14% de umidade), com relação à maioria das

drogas vegetais constituídas de sumidades floridas (FARMACOPÉIA, 2000).

Há uma considerável variação na distribuição dos extrativos através da

madeira de uma determinada espécie vegetal. Açúcares e outros constituintes

da seiva e as substâncias de reserva como ácidos graxos e amidos são

encontradas no alburno. Materiais fenólicos, contudo, são usualmente

depositados no cerne. Existe ainda uma variação na quantidade de material

101 DISCUSSÃO

depositado através da altura da árvore e entre o tronco e os galhos

(BUCHANAN, 1963). De acordo com BROWNING (1967), a extração com

solventes orgânicos (éter, acetona, etanol, benzeno, e álcool-benzeno) retira da

madeira, resina, ácidos graxos, ésteres, ceras, substâncias insaponificáveis e

materiais corantes. A extração em água retira sais inorgânicos, açúcares,

polissacarídeos e algumas substâncias fenólicas. Alguns dos materiais solúveis

em água são mais ou menos solúveis em solventes orgânicos (NEARN, 1955).

O ensaio do teor de extrativos (TE) indica a quantidade de substâncias

extraíveis, ou seja, solúveis em determinado sistema solvente. É um método

empregado na seleção do solvente mais adequado à extração das substâncias

de interesse de uma planta ou como indicativo para o ajuste da quantidade de

matéria-prima a ser utilizada visando uma concentração final determinada de

substância de interesse no produto da extração. Neste estudo, o teor de

extrativos da droga vegetal foi empregado exclusivamente como um ensaio

auxiliar na caracterização físico-química, visto que se trata de um parâmetro

importante no controle de qualidade da matéria-prima vegetal. O valor de TE

encontrado para a droga vegetal em estudo foi de 13,77 % (m/m).

Considerando que o presente trabalho propôs-se a buscar e comprovar o

efeito antibacteriano de extratos de cascas pulverizadas de E. uchi e

considerando ainda a bem documentada atividade antimicrobiana apresentada

pelos taninos, justifica-se a realização do doseamento deste grupo de

substâncias presentes neste farmacógeno. Porém, ao efetuarem-se os

doseamentos, estava-se na verdade sendo escolhido um parâmetro pelo qual

pudéssemos optar pelos melhores extratos, ao menos segundo o teor total de

taninos, para que fossem empregados nos testes antimicrobianos e citotóxicos.

102 DISCUSSÃO

Das análises dos dados apresentados na Tabela 14, constatou-se que o

extrato a 5% (m/v) com maior teor de taninos totais foi o preparado por

maceração (23,62% ± 1,0); o extrato a 10% (m/v) com maior teor de taninos

totais foi o preparado por percolação (32,85% ± 1,62), sendo também, o extrato

com o maior teor de taninos totais dentre todos os demais; por fim, o extrato a

20% (m/v) com o maior teor de taninos totais foi o preparado por turbo-extração

(24,77% ± 2,54).

Ainda, além destes três extratos, foram inclusos, nos testes biológicos, a

infusão 10% (m/v) (26,06% ± 4,27) e a decocção 20% (m/v) (20,27% ± 1,16),

uma vez que o uso popular é quase que totalmente baseado no consumo de

chás. Verificamos que para alguns processos de extração, os valores do teor

de taninos totais (TT) encontrados nos extratos a 5% (m/v) são muito próximos

aos valores encontrados nos extratos a 20% (m/v), sendo que estas diferenças

não são estatisticamente significativas (P<0,05), o que os tornam mais

interessantes do ponto de vista econômico, uma vez que é necessário menos

material vegetal ao prepará-los. Esses valores de TT encontrados para os

extratos de cascas pulverizadas de E. uchi, em torno de 21%, podem ser

considerados razoáveis, comparando-se com os valores encontrados por

Yamaguti-Sasaki e colaboradores (2007), que trabalharam com extratos

aquosos 5% (m/v) (16,16% ± 0,44), brutos (acetona:água) (31,15% ± 1,46) e

frações semi-purificadas (30,05% ± 0,54; 17,09% ± 0,52) de sementes de

Paullinia cupana H. B. K. var. sorbilis (Mart.) Ducke (“guaraná”).

O reagente de Folin-Denis não é específico para uma determinada classe

de metabólitos e pode detectar todos os fenóis, ácidos fenólicos, flavonóides e

taninos presentes em uma planta. Assim, esta metodologia pode ser usada

103 DISCUSSÃO

para a quantificação do total de fenóis, uma vez que ocorre a oxidação de

qualquer fenol presente pela reação com o ácido fosfomolibídico e tungístico do

reagente de Folin-Denis (TEIXEIRA et al., 1990, FERREIRA et al., 2004). A

partir da curva analítica obtida com a solução padrão de ácido tânico pôde-se

calcular, através da equação da reta, a porcentagem de fenóis totais existentes

nas amostras. Assim, constatamos que os extratos aquosos obtidos por

decocção e infusão apresentaram os maiores valores de fenóis totais, o que

pode ser explicado, pela polaridade similar do solvente e dos polifenóis.

Podemos sugerir também que os processos de decocção e infusão, por serem

métodos de extração com aquecimento, retiram uma quantidade maior de

substâncias, uma vez que o calor aumenta a solubilidade das mesmas.

Ainda com relação à caracterização fitoquímica, procurou-se avaliar a

atividade antioxidante dos extratos. O DPPH é um radical livre estável que

interage com substâncias antioxidantes, que, por sua vez, transferem elétrons

ou átomos de hidrogênio ao DPPH, neutralizando o radical livre. Quando o

processo antioxidante ocorre, a coloração da reação muda de violeta a amarelo

e a absorvância torna-se reduzida a 517 nm (BANERJEE et al., 2005). A

análise de variância demonstrou que os extratos testados apresentaram

valores semelhantes de atividade anti-radicalar quando comparados entre si e

diferenças estatísticas significantes quando comparados com o extrato de

Ginkgo biloba e demais padrões (ácido gálico, vitamina C e rutina). Porém, há

de se dizer que os valores de atividade sequestrante do radical estável DPPH

dos padrões são altos por se tratarem de substâncias puras isoladas e que,

desta forma, não descaracterizam a atividade antioxidante de nossas amostras.

Na verdade, como não há valores de referência citados na literatura para as

104 DISCUSSÃO

cascas de E. uchi, devemos aceitar os resultados aqui apresentados como

padrão para o controle de qualidade desta droga vegetal.

A partir do perfil espectrofotométrico na faixa de comprimento de onda da

radiação ultravioleta, observou-se correspondência do pico de máxima

absorção entre todos os extratos e os padrões. No entanto, como não foi

isolada nenhuma substância dos extratos, não é possível afirmar a constituição

dos mesmos com base nos espectros de ultravioleta.

Quanto ao preparo dos extratos, a escolha dos solventes para extração

deve basear-se, principalmente, na seletividade que o mesmo apresenta pelos

compostos a serem extraídos. No entanto, outras características não podem

ser ignoradas, como a facilidade de manuseio, proteção ao ambiente e

toxicidade (LIST e SCHMIDT, 2000). Foi possível observar que a extração mais

eficiente, em termos de rendimento, foi a percolação. Cabe ressaltar que dos

processos extrativos utilizados, o único que se enquadra no grupo de

processos extrativos exaustivos é este, possibilitando o esgotamento da

matéria-prima. Assim, considerando apenas o rendimento final obtido para os

extratos, podemos assegurar que a percolação trata-se do processo extrativo

mais apropriado. Porém, na escolha de um método extrativo, deve-se avaliar a

eficiência, a seletividade, a estabilidade das substâncias extraídas e o custo do

processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar

(COSTA, 1994; SIMÕES et al., 2003). Assim sendo, a turbo-extração aparece

como uma boa alternativa. Esta técnica baseia-se na extração com simultânea

redução do tamanho de partícula, resultado da aplicação de elevadas forças de

cisalhamento, geradas no pequeno espaço compreendido entre o extrator e um

rotor de alta velocidade. A redução drástica do tamanho da partícula e, o

105 DISCUSSÃO

conseqüente rompimento das células, favorece a rápida dissolução das

substâncias ativas. Nestas circunstâncias, a difusão das substâncias

dissolvidas pela membrana celular fica relegada a um plano secundário,

resultando em tempos de extração da ordem de minutos e o quase

esgotamento da droga. A esse incremento da eficiência somam-se a

simplicidade, rapidez e versatilidade da técnica, que permitem a fácil utilização

dela em processamentos em pequena e média escala (DÄR, 1981; VOIGT e

BORNSCHEIN, 1982; SIMÕES et al., 2003). No caso da decocção e da

infusão, o solvente aquoso apresenta certos inconvenientes, tais como o alto

ponto de ebulição, que pode corromper a estrutura de algumas substâncias

presentes no material vegetal, e o fato de extrair sais inorgânicos, que

possivelmente interferirão nos ensaios biológicos. Portanto, antes de utilizá-los,

seria necessário fazer uma partição, para remover estes reagentes.

Nas análises de atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em

ágar, não obtivemos resultados satisfatórios para nenhum dos extratos

testados, sendo que verificamos uma pequena atividade destes frente a S.

aureus nos testes de difusão com templates e com discos e ainda uma ação

isolada do extrato I10 contra C. albicans no teste de difusão com discos.

Porém, em estudos preliminares com outros extratos de cascas pulverizadas

de E. uchi realizados por POLITI et al. (2008), verificou-se uma pequena

atividade frente a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureus e Candida albicans. Aqui vale ressaltar que, pelo fato

dos taninos complexarem-se com proteínas, pode ter ocorrido precipitação

local, impedindo os mesmos de difundirem-se no meio de cultura,

impossibilitando sua real atividade, mesmo tendo sido utilizado o Tween

80.

106 DISCUSSÃO

De forma geral, o extrato de uma planta contém baixa concentração de

compostos ativos e um grande número de outros compostos que podem ter

atividades promissoras, embora necessitando para isto, adequada

sensibilidade dos testes (RATES, 2001a). É possível também que existam

outras substâncias nos extratos interferindo com o potencial antimicrobiano real

dos taninos neles presentes, sendo, portanto, bem mais interessante fracioná-

los para isolarmos os compostos, obtendo-se assim, uma avaliação precisa.

Apesar desta baixa atividade apresentada pelos extratos testados, foi feita

a determinação da concentração inibitória e bactericida mínima para a

linhagem de S. aureus utilizada. Ao menos para as concentrações utilizadas,

não foi verificada nenhuma atividade. Desta forma, seria necessário realizar

novos testes, com outras concentrações, para assegurar de fato a atividade

antimicrobiana dos extratos de cascas de E. uchi.

O ensaio do trânsito intestinal em camundongos demonstrou que houve

uma pequena redução na distância percorrida pelo carvão ativo nos animais

após administração do extrato decocção 20% (m/v), obtido de cascas

pulverizadas de E. uchi, quando comparados com o controle negativo (solução

fisiológica). Porém, segundo o teste t de Student realizado, o valor de distância

percorrida pelo carvão ativo encontrado na amostra não é significativamente

diferente do valor encontrado para o controle. Assim sendo, não podemos

concluir que o extrato aplicado tenha alterado a motilidade intestinal dos

animais. Uma possibilidade alternativa seria testar frações dos extratos, em

busca de um resultado mais satisfatório.

Nos testes de toxicidade oral aguda em camundongos os resultados não

revelaram sinais de toxicidade sistêmica com a administração do extrato obtido

107 DISCUSSÃO

por decocção 20% (m/v). Não foram observadas mortes, tampouco alterações

fisiológicas ou comportamentais em nenhum dos animais. Os resultados

caracterizam o extrato de cascas de Endopleura uchi como pouco tóxico,

conforme Larini (1987), que classifica os agentes tóxicos via oral como

extremamente tóxicos (DL

igual ou inferior a 25 mg/kg), altamente tóxicos

(DL

entre 100 e 500 mg/kg), mediamente tóxicos (DL

entre 500 e 2000

mg/kg) e pouco tóxicos (DL

acima de 2000 mg/kg).

Na avaliação de citotoxicidade em células fibroblásticas da córnea de

coelho da linhagem SIRC CCL-60, nenhum dos extratos avaliados mostraram-

se tóxicos, sendo que todos os valores, em porcentagem, de sobrevivência das

células foi 100%. Assim sendo, o IC

para os extratos utilizados é maior que a

maior concentração testada (2 mg/mL).

108 CONCLUSÕES

7. CONCLUSÕES

 Uma vez que nenhum estudo de controle de qualidade fora feito com

cascas de E. uchi, os resultados obtidos em nosso trabalho conferem um

padrão para eventuais pesquisas futuras.

 A triagem fitoquímica revelou a presença de três classes de metabólitos

secundários predominates: taninos, cumarinas e saponinas, embora a

importância da droga como agente fitoterápico ao menos em nosso trabalho

esteja voltada para o estudo dos primeiros. Aqui cabe ressaltar que, apesar

de enfocarmos esta classe, sabemos que o principal marcador do uchi

amarelo é uma isocumarina, a bergenina. Porém, não foi a intenção trabalhar

com composto isolado, mas sim com extratos, sobretudo considerando-se

que o uso popular é basicamente voltado ao consumo de chás.

 A análise microscópica comparativa comprovou que as amostras

utilizadas em nosso trabalho são de fato cascas de Endopleura uchi.

 O doseamento de taninos totais de todos os extratos revelou que o

processo mais eficaz em extração foi a percolação 10% (m/v), embora em

termos de rendimento bruto, o melhor extrato tenha sido a percolação 20%

(m/v).

 A análise cromatográfica dos extratos revelou a presença dos principais

marcadores utilizados, a bergenina e o ácido gálico, sendo que este último

confirma que os extratos possuem taninos em sua constituição.

 Dos extratos escolhidos para os testes antimicrobianos, nenhum

apresentou atividade inibitória de crescimento satisfatória; mesmo os que

109 CONCLUSÕES

apresentaram, não foram efetivos na determinação da concentração inibitória

mínima.

 O ensaio de trânsito intestinal em camundongos, executado com o

extrato decocção 20% (m/v), não apresentou alterações significativas de

motilidade do carvão ativo.

 No teste de toxicidade oral aguda em camundongos, executado também

com o extrato decocção 20% (m/v), os animais não apresentaram quaisquer

sinais de alterações fisiológicas ou comportamentais, tampouco ocorreram

mortes. Assim, para a concentração testada, o extrato não apresentou traços

de toxicidade.

 As análises de citotoxicidade indicaram que todos os extratos testados

apresentaram IC

maior que a maior concentração aplicada, indicando assim,

que não conferem riscos de consumo.

110 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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124 ANEXOS

9. ANEXOS

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