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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO – NÍVEL DOUTORADO
CONCENTRAÇÃO PATOLOGIA BUCAL
ESTUDOS DA AÇÃO DA NIFEDIPINA SOBRE O ESTADO
PERIODONTAL DE RATOS
Marilene Issa Fernandes
Prof. Orientador:
Dr. Pantelis Varvaki Rados
Prof. Co-Orientador:
Dr. Rui Vicente Oppermann
Porto Alegre, outubro 2006
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“...nenhum poder, um pouco de saber, um pouco de sabedoria e o máximo de
sabor... “ roland barthes
Ao meu amor Jorge, pela tua presença e
cumplicidade em todos os momentos.
Aos meus filhos, Geórgia e Carlo, pelo amor e
alegria de viver.
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Quero agradecer, de coração, a todas as pessoas que participaram desta
jornada, contribuindo para a concretização deste trabalho e me presenteando com
energia, carinho, amizade e sabedoria.
A minha Mãe, Saide, pelo exemplo de garra e liderança,
e ao meu Pai, Hamilton, pelo apoio.
Aos meus Irmãos, Neca e Hamilton,
que me acompanham e vibram com minhas conquistas.
A minha irmã, e colega Marisa, que sempre me apoiou
na busca de meus ideais.
Ao meu querido orientador, Prof. Dr. Pantelis Varvaki Rados,
meu mestre e amigo, que desde sempre me ensina os caminhos da patologia,
obrigado pelo apoio incondicional.
Ao meu amigo de sempre, Prof. Dr. Rui Vicente Oppermann, meu mestre de
plantão, mais uma vez meu agradecimento por todos os momentos que pude
compartilhar o teu saber.
Duda, sem teu trabalho incansável esta jornada seria bem mais difícil. Meu muito
obrigado por todas as ajudas, em todos os dias, com chuva ou com sol, com praia ou
com festa. Não tenho palavras, os ratos que o digam!
Ao Cassiano, pela atenção e grande auxílio na parte experimental, me ensinando as
lides com os ratos.
Ao Susin, que pegou o bonde andando, mas em tempo para me orientar nos
caminhos da estatística.
4
Aos Professores, Dr. João Jorge Diniz Barbachan, Dr. Manoel Sant’Ana Filho, Dr.
Onofre Francisco Quadros e Dra. Anna Chaves, pelos ensinamentos.
Aos meus colegas, Simone, Márcia, e João Batista, pelo convívio
ao longo do curso, e principalmente a Bere, pela amizade, carinho e
companheirismo em todos os dias desta batalha
À Isabel da Silva Lauxen, pelo apoio no laboratório de patologia.
Ao Zeca, pelo auxílio imediato com o português.
À Gê, que soube entender a importância deste trabalho
para mim, me ajudando com os ratos.
A todos os colegas da perio, Patrícia, Alex e Carlos Heitor, obrigado pelos
momentos de descontração.
Aos meus amigos Fernando e Alessandra, que me acompanharam durante todo
esse trabalho.
À Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde do Rio Grande do Sul
pela utilização do biotério.
À Edinete, que todas as manhãs me acordou com seu café.
À Susi e Adriana, que se empenharam em todos os momentos
desta jornada, me auxiliando no que fosse preciso.
A todos os Mestres que participaram desta caminhada.
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SUMÁRIO
Introdução
• A ação da nifedipina sobre o estado periodontal
• Considerações metodológicas
6
10
Objetivo geral
• Objetivos metodológicos
• Objetivos experimentais
12
12
Estudos metodológicos
• ANÁLISE COMPARATIVA DA ALTURA ÓSSEA HISTOMÉTRICA E
MORFOMÉTRICA NA PERIODONTITE INDUZIDA POR LIGADURA EM
RATO
• AVALIAÇÃO QUALITATIVA MICROSCÓPICA DO TEMPO DE
FIXAÇÃO E MEIO DE DESCALCIFICAÇÃO DO PERIODONTO EM
MAXILA DE RATOS
Estudo experimental
•
AÇÃO DA NIFEDIPINA SOBRE O ESTADO PERIODONTAL DE RATOS
WISTAR
13
18
25
Estudos metodológicos
• Discussão
Estudos experimentais
• Discussão
40
45
Referências bibliográficas
49
Artigo I
• COMPARAÇÃO DA ALTURA ÓSSEA HISTOMÉTRICA E
MORFOMÉTRICA EM RATOS COM PERIODONTITE INDUZIDA
(Aceito para publicação no Brazilian Oral Research)
54
Artigo II
• AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA QUALITATIVA DO TEMPO DE FIXAÇÃO
E MEIOS DE DESCALCIFICAÇÃO DO PERIODONTO DE RATOS
(Aceito para publicação no Brazilian Oral Research)
67
Artigo III
•
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA NIFEDIPINA SOBRE OS TECIDOS
PERIODONTAIS DE RATOS WISTAR
83
6
INTRODUÇÃO
A ação da nifedipina sobre o estado periodontal
A nifedipina pode apresentar como efeito colateral um aumento de volume
gengival relatado pioneiramente por Lederman, Lumerman et al. (1984). Nesse relato
de caso, os tecidos lembravam clínica e histologicamente a hiperplasia induzida por
fenitoína. O aumento de volume gengival foi observado entre um e dois meses após
o início da utilização da droga e uma parcial resolução do quadro foi vista com a
interrupção do uso.
A prevalência dos aumentos de volume gengival é bastante variável. Barak,
Engelberg et al. (1987) relataram que 14,7% dos pacientes usuários de nifedipina
desenvolveram hiperplasia gengival clínica, enquanto Slavin e Taylor (1987),
mostraram que 51% de 55 indivíduos sob terapia com nifedipina, desenvolveram
aumento de volume gengival. Resultados semelhantes foram encontrados por Nery,
Edson et al. (1995). No entanto, outros relatos mostram prevalências variáveis,
chegando até 83% (Fattore, Stablein et al., 1991; Barclay, Thomason et al., 1992;
Ellis, Seymour et al., 1999).
A nifedipina é um bloqueador de canais de cálcio que age inibindo o influxo de
íons cálcio pela membrana das células da musculatura lisa de vasos e do coração,
sem alterar as concentrações de cálcio no soro. Promove uma vasodilatação
prolongada das artérias coronarianas, aumentando o suplemento de oxigênio e
inibindo o processo de contratura muscular (Butler, Kalkwarf et al., 1987). O processo
de contração do músculo cardíaco e musculatura lisa vascular são dependentes do
movimento dos íons cálcio extracelulares para dentro dessas células através de
canais específicos (Henry, 1980). A nifedipina é um bloqueador de canais de cálcio
de alta especificidade utilizado para o tratamento das desordens cardiovasculares
tais como: angina pectoris, arritmias ventriculares e hipertensão.
As manifestações clínicas dos aumentos de volume gengival usualmente se
apresentam entre um e três meses após o início do tratamento com a droga. Inicia
nos espaços interproximais e caracteriza-se por um aumento na região vestibular dos
7
dentes anteriores confinados a gengiva inserida. Podem se estender coronariamente
e interferir com a estética e mastigação (Hallmon e Rossmann, 1999).
Um modelo experimental em ratos, com a administração de drogas como a
nifedipina, induziu a um aumento de volume gengival macroscópico em um período
de 20 a 30 dias, alcançando um máximo de crescimento em 40 dias, que regrediu
espontaneamente com a descontinuidade da droga. Tratamentos longos não
resultam em maior aumento de volume gengival. A avaliação histológica mostrou um
severo infiltrado inflamatório nos tecidos gengivais de ratos infectados (Nishikawa,
Nagata et al., 1996).
As alterações do tecido epitelial gengival associado com nifedipina mostraram
uma marcada hiperplasia com longas cristas epiteliais no epitélio sulcular, sem
alterações no epitélio juncional, vistas tanto em estudos animais quanto em humanos
(Barak, Engelberg et al., 1987; Morisaki, Kato et al., 1993). Também o tecido
conjuntivo, em ratos, apresenta densa substância intercelular fibrosa associada a um
infiltrado inflamatório na porção subepitelial (Morisaki, Kato et al., 1993). As
alterações epiteliais e conjuntivas se mostraram mais relacionadas com a severidade
do aumento de volume gengival do que com o uso de nifedipina (Spolidorio,
Spolidorio et al., 2002).
Os mecanismos associados com aumento de volume gengival que melhor
explicam sua ocorrência e distribuição apontam para um modelo multifatorial.
Considerando o sexo, os homens teriam três vezes mais chance do que as
mulheres de desenvolver um aumento de volume significativo (Ellis, Seymour et al.,
1999). Estudos em animais também observaram que ratos machos são mais
propensos a um aumento de volume gengival que ratas (Ishida, Kondoh et al., 1995;
Nishikawa, Nagata et al., 1996).
A idade se mostrou inversamente associada com o aumento de volume.
Quanto mais jovem, maior o aumento de volume gengival observado (Nakou, Kamma
et al., 1998). Em relação à dose de nifedipina, Barclay, Thomason et al. (1992) em
um estudo com 19 pacientes, utilizando a medicação há pelo menos seis meses, e
Nery, Edson et al. (1995), em um estudo com 181 pacientes, sob medicação há no
8
mínimo quatro meses, não encontraram relação significativa. Por outro lado,
Nishikawa, Nagata et al. (1996) acreditaram ser a dosagem diária da droga o aspecto
etiopatológico mais importante do aumento de volume gengival em ratos. Ishida,
Kondoh et al. (1995) concordaram com esses achados observando não haver uma
concentração da droga no soro que seja um gatilho para os aumentos de volume
gengival.
A concentração máxima de nifedipina no fluido gengival é 84 vezes maior que
no plasma. Sua presença no fluido crevicular gengival está diretamente relacionada
com a extensão da inflamação gengival (Ellis, Seymour et al., 1992). Mostrando ser a
inflamação gengival um importante co-fator para a expressão do aumento de volume
gengival (Ellis, Seymour et al., 1999). Em contrapartida, no estudo de Thomason,
Ellis et al. (1997), considerando as variáveis farmacológicas da nifedipina, somente a
concentração no plasma foi identificada como um fator de risco associado com a
severidade do aumento de volume gengival. Assim, a redução da concentração de
nifedipina no plasma pode atenuar a manifestação clínica do aumento de volume
gengival.
A presença do biofilme é também reconhecida pelo sistema de classificação
das doenças periodontais como um co-fator associado à etiologia dos aumentos de
volume gengival (Fu, Nieh et al., 1997), estando classificada como doenças gengivais
induzidas por placa e modificadas por medicações (Armitage, 1999). No entanto, a
presença do biofilme e inflamação gengival por si só não explicam esta condição.
Morisaki, Kato et al. (1993), observaram, em ratos Fischer, que a nifedipina levou a
um aumento de volume gengival tanto na presença como na ausência de inflamação
gengival e biofilme dental, embora esses fatores estivessem associados com um
maior efeito da droga. A profundidade de sondagem, também considerada um
descritor inflamatório, se mostrou maior no grupo com nifedipina, achados esses que
concordam com o estudo de Ishida, Kondoh et al. (1995). Nesses estudos a
profundidade de sondagem foi avaliada clinicamente, sob um microscópio
estereoscópico, utilizando uma película de slide com faixas coloridas impressas com
o objetivo de mimetizar uma sonda periodontal. É importante observar que as
9
medidas de profundidade de sondagem podem ser alteradas por diferentes fatores,
como situação inflamatória dos tecidos, posição e inclinação da sonda, tipo da sonda
e força de sondagem, além do treinamento e calibragem do examinador (Bulthuis,
Barendregt et al., 1998; Garnick e Silverstein, 2000). Somado a isso, cabe lembrar o
diminuto tamanho da união dento-gengival de ratos.
A influência da nifedipina sobre a evolução da periodontite em ratos foi
avaliada. Os resultados histométricos foram realizados quantificando o volume de
perda óssea na região da bifurcação, não sendo observadas diferenças significativas
entre os grupos (Gonçalves, Nogueira Filho et al., 2003). Morisaki, Kato et al. (1993)
em uma análise histológica descritiva não observaram perda óssea ou de inserção.
Nesses estudos, a sistemática de avaliação dos descritores inflamatórios e de
destruição não foi utilizada considerando os critérios atuais de diagnóstico e pesquisa
em periodontia. Pois a sistemática usual de determinar perda óssea está associada
com a distância da junção amelo-cementária a crista óssea e não com o volume
ósseo na área da furca. Também uma descrição histológica não basta para avaliar
níveis de inserção ou ósseo principalmente na ausência de um cegamento do
examinador.
Desta forma, considerando a necessidade da determinação de descritores da
doença associados tanto com a etiologia como com a situação inflamatória e de
destruição dos tecidos periodontais, se faz necessário reavaliar os aumentos de
volume gengival de forma sistemática, de acordo com padrões atuais de diagnóstico.
Assim, estudos que estabeleçam qual a repercussão clínica e histopatológica da
nifedipina em situação de saúde e periodontite devem ser realizados de forma a
permitir uma avaliação do processo saúde/doença baseados em conceitos que
descrevam claramente essas alterações.
Considerações metodológicas
Os estudos experimentais em ratos podem representar grandes auxílios para
a pesquisa, já que é possível induzir doenças e avaliar diferentes aspectos das
condições sistêmicas dos animais. Achados clínicos e histopatológicos da doença
10
periodontal em ratos apresentam muitas semelhanças em relação ao que é visto em
seres humanos. Podem ser criados em condições livres de germes e facilmente se
induz imunodeficiências nos mesmos, além das semelhanças morfológicas,
microbiológicas e imunológicas (Klausen, 1991).
Johnson (1975) observou, com a utilização de ligaduras de seda para induzir
periodontite, um achatamento e deslocamento da crista gengival, acúmulo de
depósitos, aumento da proliferação de infiltrado inflamatório no tecido conjuntivo
subjacente e migração do epitélio juncional apicalmente. Reabsorções da crista
óssea alveolar ocorreram após 17 dias da colocação de ligaduras nos ratos. Sallay,
Sanavi et al. (1982), observaram que a destruição óssea vista em ratos com ligadura
tem origem bacteriana, e a supressão das defesas locais facilita tal destruição.
A literatura que relata os estudos de doença periodontal em animais não
apresenta uma padronização no que se refere ao processamento histológico como o
tempo de fixação, descalcificação e tipo de substância descalcificadora utilizada. O
tempo de fixação das peças histológicas é variável e não se apresentam critérios de
avaliação pré-determinados na relação entre os métodos de fixação com a
descalcificação. Nishikawa, Nagata et al. (1996) utilizaram a formalina neutra a 10%
durante 48 horas em ratos de 20 dias de vida, não informando qual o método de
descalcificação utilizado. Chiu, Fu et al. (2001) utilizaram a formalina a 10% e o ácido
clorídrico a 5% para descalcificação não determinando os períodos. Shimizu, Kataoka
et al., 2002 não informaram nem o período de fixação nem qual o descalcificador
utilizado.
É importante ressaltar que o tempo de fixação e o agente descalcificador
utilizado têm relevância para a qualidade dos preparos histológicos e,
conseqüentemente, na precisão da análise dos resultados das pesquisas. É
necessário que o processo de preparo das lâminas, também, seja eficiente, sem
perda de qualidade do resultado final.
Tradicionalmente, a avaliação histológica representa o padrão na maioria dos
trabalhos. Susin e Rösing (2003), estudaram em ratos Wistar a altura óssea
histologicamente de forma linear, considerando o espaço interproximal de primeiros e
11
segundos molares, medindo da JAC até o ponto mais apical da crista óssea. Já nos
estudos de Nociti, Nogueira-Filho et al. (2000) e Nogueira-Filho, Froes Neto et al.
(2004) a forma de avaliar histologicamente correspondeu a uma área (mm
2
) de perda
óssea na região da furca dos primeiros molares de ratos Wistar.
Mais recentemente, outras formas de avaliar perda óssea estão sendo
empregadas. Rivaldo, Padilha et al. (2005) em um modelo de estudo em ratos Mus
domesticus, avaliaram as alterações da altura óssea em mandíbulas descarnadas,
na área (mm
2
) correspondente à perda óssea no primeiro e segundo molares. A área
de perda óssea foi definida considerando: mesialmente, uma linha da junção
cemento-esmalte até a altura óssea na raiz mesial do primeiro molar; e distalmente,
por uma linha da junção cemento-esmalte até a crista óssea na raiz distal do
segundo molar; coronariamente correspondia à porção mais apical da junção
cemento-esmalte e apicalmente à posição mais apical da crista óssea. Por outro
lado, Kuhr, Popa-Wagner et al. (2004), avaliaram em ratos a perda óssea induzida,
considerando dois diferentes métodos em mandíbulas descarnadas: em um a
distância da junção amelo-cementária até a crista óssea foi medida linearmente em
diferentes sítios; noutro, a área de superfície radicular exposta foi medida. O estudo
conclui que o método de medir a distancia linearmente deve ser preferido ao método
de avaliação da área.
Na avaliação histométrica o plano de corte pode eventualmente não
corresponder à zona de maior perda óssea, enquanto na avaliação morfométrica o
ponto com maior perda óssea em maxilas ou mandíbulas descarnadas pode ser
visualizado.
Considerando que não está estabelecida na literatura qual a melhor forma de
avaliar os tecidos periodontais e considerando que houve uma nova sistematização
para o diagnóstico do processo saúde/doença periodontal, a metodologia de
avaliação para os tecidos periodontais em estudos animais necessita ser reavaliada.
12
OBJETIVO GERAL
Estudar os efeitos da nifedipina sobre os tecidos gengivais e periodontais de
ratos em situação de saúde periodontal e periodontite.
Objetivos metodológicos
1. Comparar o procedimento de medição da altura óssea, em periodonto saudável e
com periodontite, através de cortes histológicos e morfologicamente em osso
seco.
2. Avaliar as características histológicas dos tecidos periodontais em maxila de ratos
Wistar, comparando diferentes tempos de fixação associados a descalcificação
das peças por ácido nítrico a 5% ou ácido fórmico a 50% + citrato de sódio a
20%;
Objetivos experimentais
1. Avaliar as possíveis alterações histológicas sobre os tecidos epitelial, conjuntivo e
infiltrado inflamatório decorrente da administração de nifedipina, em situação de
saúde gengival;
2. Avaliar as possíveis alterações histológicas na relação entre junção amelo-
cementária e crista óssea decorrente da administração de nifedipina, em situação
de saúde gengival;
3. Avaliar as possíveis alterações histológicas sobre os tecidos epitelial, conjuntivo e
infiltrado inflamatório decorrente da administração de nifedipina, em situação de
periodontite;
4. Avaliar as possíveis alterações histológicas na relação entre junção amelo-
cementária e crista óssea decorrente da administração de nifedipina, em situação
de periodontite.
13
ESTUDOS METODOLÓGICOS
1. ANÁLISE COMPARATIVA DA ALTURA ÓSSEA HISTOMÉTRICA E
MORFOMÉTRICA NA PERIODONTITE INDUZIDA POR LIGADURA EM
RATOS
METODOLOGIA
Foram utilizados 10 ratos Wistar machos com 60 dias de vida, pesando entre
250 e 350 gramas. Os ratos permaneceram em caixa-moradia de plástico, com
acesso a comida e água ad libitum. Os animais foram mantidos em ambiente
climatizado no Instituto de Ciências Biomédicas da UFRGS. O protocolo de pesquisa
foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia da UFRGS.
Desenvolvimento do experimento
Anestesia geral foi obtida pela administração intramuscular da associação das
drogas Hidrocloridrato de Ketamina /Cloridrato de Xilazina para possibilitar a
colocação de ligadura (fio de sutura de algodão 3-0) com o objetivo de induzir perda
óssea. As ligaduras foram colocadas no segundo molar superior esquerdo (lado
teste), permanecendo durante 30 dias. Os dentes contra-laterais foram considerados
controle (sem ligadura). A morte dos ratos ocorreu por deslocamento cervical. As
maxilas foram removidas e divididas na sua linha média.
Processamento das peças e análise histológica
Dez hemimaxilas (lado teste e controle) foram fixadas em formalina
tamponada a 10% por 48 horas. Após, as peças foram submetidas à descalcificação
por solução de Anna Morse (Citrato de Sódio a 20% + Ácido Fórmico a 50%) durante
40 dias. As peças descalcificadas contendo somente os três molares, foram
individualmente mergulhadas em bicarbonato de sódio para fins de neutralização e
submetidas ao processamento histológico. As peças foram incluídas em parafina,
14
cada uma dando origem a três cortes, a cada 20µm, realizados em micrótomo
*
, no
sentido vestíbulo-palatino de 3µm referentes ao segundo molar superior. Na
seqüência, os cortes foram corados pela técnica de H/E.
Considerou-se como critério de inclusão para avaliação, lâminas com porção
radicular, epitelial e crista óssea no mesmo corte. Imagens desses cortes foram
capturadas por máquina digital
†
. Todos os cortes foram capturados com um aumento
de 50 vezes. Para fins de conversão dos resultados de medição, foi fotografada uma
escala microscópica calibradora
‡
de medida conhecida na mesma objetiva. Usando o
sistema de análise de imagem
§
, um examinador que desconhecia a que grupo
pertencia a lâmina obteve 3 registros lineares da crista óssea à junção amelo-
cementária (JAC), dos quais o de maior comprimento foi selecionado para análise
dos resultados (Figura 1).
Processamento das peças e análise morfológica
Dez hemimaxilas (lado teste e controle) tiveram toda sua matéria orgânica
removida após imersão em Hipoclorito de Sódio 8%
**
durante 4 horas. As peças
foram lavadas em água corrente e, imediatamente, secas com ar comprimido. A fim
de delinear mais claramente a junção amelo-cementária (JAC) aplicou-se Azul de
Metileno a 1% durante 1 minuto. Fotografias foram realizadas através de câmera
digital
††
acoplada em tripé, de modo que a máquina permanecesse paralela ao solo,
com a distância focal mínima. As peças foram fixadas em cera nº 7 e mantidas com
seu plano oclusal paralelo ao solo e seu longo eixo perpendicular à câmera. Foram
tomadas fotografias das faces vestibulares e palatinas. Para fins de validação de
conversão de medida, todas as peças foram fotografadas com o auxílio de régua
*
RM2155 Ernst Leitz® - Germany
†
Nikon® Coolpyx, 4 Megapixels
‡
E. Leitz® Wetzlar
§
IMAGETOOL®
**
Qboa®
††
Nikon® D100, 6.1 Megapixels
15
milimetrada. Usando o sistema de análise de imagem
‡‡
, um examinador
desconhecedor da distribuição de grupos obteve 3 registros lineares da crista óssea
a JAC, dos quais o de maior comprimento foi selecionado para análise (Figura 2)
Análise estatística
Média (± desvio-padrão) das distâncias entre a JAC e as cristas ósseas foram
obtidas para os lados teste e controle tanto para as maxilas analisadas pelo método
histométrico como pelo método morfométrico. Para a análise intra-grupo
(morfométrico ou histométrico), as medições dos lados ligadura e sem ligadura
foram comparadas pelo teste t para amostras pareadas. Para a análise entre os
grupos (morfometria x histologia), os lados teste e controle foram comparados pelo
teste t para amostras independentes. O nível alfa estabelecido para o presente
estudo foi de 0,05.
RESULTADOS
Os resultados do presente estudo estão demonstrados no Gráfico 1 e na
Tabela 1. Observa-se que em todas as áreas avaliadas (vestibulares e palatinas),
tanto através da análise histométrica quanto pela análise morfométrica, a presença
de ligaduras gerou maior perda óssea alveolar (diferenças estatisticamente
significativas, teste t pareado, p<0,05).
A tabela 1 compara os métodos histométrico e morfométrico. Observa-se que,
nas áreas palatinas dos dentes com ou sem ligadura e nas vestibulares dos dentes
com ligadura, não existem diferenças estatisticamente significativas entre os métodos
(teste t pareado para amostras independentes, p>0,05). Entretanto, verificou-se uma
média (± desvio padrão) de 0,23 (± 0,08) para as áreas vestibulares dos dentes sem
ligadura através da histometria, resultado estatisticamente diferente da média obtida
nas áreas correspondentes para o método morfométrico (0,41 ± 0,10).
‡‡
IMAGETOOL®
16
Figura 1 – Análise histológica - registros lineares da crista óssea até a junção amelo-cementária em
vestibular.(H/E 100X).
Figura 2 – Análise morfométrica - registros lineares da crista óssea até a junção amelo-cementária na
face vestibular em maxila descarnada (coloração azul de metileno).
17
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Vestibular
histométrico
Palatina
histométrico
*Diferenças estatisticamente significativas entre os
dentes com e sem ligadura - teste t para amostras
pareadas
Sem ligadura
Com ligadura
Gráfico 1 - Análise entre o método histológico e morfológico para faces vestibulares e palatinas,
com e sem ligadura
.
Tabela 1. Análise entre o método histológico e morfológico para as áreas vestibulares e palatinas com
e sem ligadura.
Vestibular com
ligadura
Palatina com
ligadura
Vestibular sem
ligadura
Palatina sem
ligadura
Histometria
0,92 +
0,16
0,95 + 0,25
0,23 + 0,08*
0,44 + 0,15
Morfometria
1,08 +
0,35
1,07 + 0,30
0,41 + 0,10*
0,47 + 0,11
* Diferença estatisticamente significativa p< 0.05.
*
*
*
*
18
2. AVALIAÇÃO QUALITATIVA MICROSCÓPICA DO TEMPO DE FIXAÇÃO E
MEIO DE DESCALCIFICAÇÃO DO PERIODONTO EM MAXILA DE RATOS
METODOLOGIA
Foram utilizados 15 ratos Wistar machos com 60 dias de vida. Os mesmos
foram mortos por deslocamento cervical, sendo que as maxilas foram removidas e
fixadas em formalina tamponada a 10% por 24, 48 e 72 horas. Cada maxila foi
seccionada na linha média, de modo que uma hemi-maxila fosse descalcificada com
ácido nítrico a 5% durante 7 dias e a outra em solução de Anna Morse durante 35
dias. O processo de descalcificação foi monitorado radiograficamente e por inspeção
tátil, utilizando uma sonda exploradora. As peças descalcificadas foram
individualmente submetidas ao processo de neutralização com bicarbonato de sódio
e depois ao processamento histológico, que se constituiu de quatro banhos em álcool
95% (80 minutos cada), um banho em álcool absoluto (de 60 minutos), três banhos
em xilol (80 minutos) e dois banhos em parafina líquida a 60°C (120 minutos cada),
seqüencialmente para posterior inclusão em parafina. Para a inclusão foi observado
que a face mesial do primeiro molar ficasse voltada para o plano de corte do bloco.
Os cortes foram realizados em micrótomo
§§
, com 3µ de espessura até alcançar
planos de corte do segundo molar, avaliados por meio de lupa. Cada bloco deu
origem a três cortes escolhidos entre os melhores, avaliados por meio de
microscopia de luz, os quais deveriam possuir os seguintes critérios para inclusão no
estudo: apresentar o dente com porção coronária e radicular, junção amelo-
cementária evidente em pelo menos uma face, vestibular ou palatina e crista óssea
passível de identificação. Os cortes foram coletados em lâminas de vidro e
submetidos a desparafinização por dois banhos de xilol (10 minutos cada),
desidratação por dois banhos de álcool absoluto (5 minutos cada), hidratação (1
minuto) e coloração por hematoxilina de Harris (2 minutos) e eosina (1 minuto) de
forma seqüencial. Em seguida, a desidratação rápida, por meio de três banhos em
§§
RM2155 Ernst Leitz® - Germany
19
álcool absoluto (1 minuto cada) e diafanização (processo de clareamento) realizado
com dois banhos de xilol (10 minutos cada), que garantem transparência ao material.
A montagem das lâminas foi realizada pelo meio de inclusão
†††
(Junqueira e
Junqueira, 1985).
As lâminas foram examinadas por dois observadores treinados e cegos em
relação ao tempo de fixação e tipo de descalcificação. A leitura das lâminas foi
realizada em um microscópio óptico
‡‡‡
(aumento de 40 X), com o objetivo de avaliar:
epitélio sulcular (íntegro ou rompido); deslocamento do cemento (ausente, terço
cervical, terço médio/apical); desmineralização da dentina (adequada, ou inadequada
e se coronária, cervical ou apical); desmineralização óssea (adequada ou
inadequada). Para os tecidos meineralizados, dentina e osso, os cortes foram
considerados adequados quando se apresentavam de forma uniforme e sem
rompimento.
A mensuração da distância entre a junção amelo-cementária e a porção mais
coronal da crista alveolar foi realizada capturando-se as imagens através de um
microscópio de luz transmitida
§§§
, acoplado a uma câmera de vídeo colorida
****
, com
as seguintes especificações: sistema de sinal NTSC standart, tamanho da imagem
1/3 polegada, resolução 479 linhas horizontais na TV, 380,00 pixels 771 (H) e 490
(V), sensor de imagem CCD que digitalizou as imagens para o programa de Sistema
de Processamento e Análise de Imagens
††††
, instalado em um computador.
‡‡‡‡
Análise Estatística
A análise estatística das características histológicas foi realizada por meio de
teste ranqueado de Wilcoxon, considerando-se as variáveis descritas no item
†††
Entelan® Merk®
10
‡‡‡
ZEISS®,Jena, Germany
§§§
ZEISS®,Jena, Germany
****
JVC® modelo TK – C 620
††††
IMAGELAB®
‡‡‡‡
UNISYS®
20
avaliação histológica. Para a análise da distância entre a junção amelo-cementária e
a crista óssea utilizou-se o teste ANOVA (p<
0,05).
RESULTADOS
A avaliação linear da altura da crista óssea em relação à junção amelo-
cementária, medida em pixels, mostrou que tanto para o ácido nítrico como para a
solução de Anna Morse, nos diferentes tempos experimentais, não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas, para p<
0,05, quando comparadas as faces
vestibulares e palatinas (tabela 1).
A presença do cemento íntegro e ligado ao dente é de fundamental importância
na determinação da altura óssea. A tabela 2 mostra a situação do cemento acelular
após descalcificação com Ácido Nítrico e Ana Morse nos diferentes tempos de fixação
em formalina 10%, mostrando ausência de deslocamento, em cervical ou na porção
média e apical. Os menores índices de deslocamento aconteceram no período de
fixação de 48 horas, principalmente quando a descalcificação foi por ácido Anna
Morse. Nessas condições, 73,3 % das amostras não apresentaram deslocamento;
enquanto, no mesmo tempo experimental, quando se usou ácido nítrico, somente
23,1% não apresentaram deslocamento.
A tabela 3 mostra o padrão de desmineralização da dentina em valores
percentuais com ácido nítrico e Anna Morse nos diferentes tempos de fixação em
formalina 10%. Considerando uma desmineralização adequada, uma
desmineralização inadequada somente na porção coronária, simultaneamente na
coronária e cervical e na coronária, cervical e apical. Os resultados mostraram
situações variadas nos diferentes momentos experimentais para os diferentes
descalcificadores, não obedecendo a um padrão. Para o ácido nítrico o melhor tempo
foi 48 horas, onde 38,5 % das amostras foram consideradas adequadas. Já para a
solução de Anna Morse o tempo de fixação não mostrou um padrão determinante.
A avaliação microscópica descritiva dos cortes histológicos mostrou uma
melhor uniformidade na coloração e diferenciação na união do tecido epitelial e
21
conjuntivo quando se utilizou um período de fixação de 48 horas e descalcificação
em solução de Anna Morse, bem como a preservação dos tecidos moles presentes
na maxila. Nos tempos experimentais de 24 e 72 horas, tanto para ácido nítrico
como para a solução de Anna Morse, os tecidos mostraram alterações tanto de
preservação como de afinidade pela coloração de hematoxilina e eosina (Figura 1).
Quando analisados os padrões de processamento das peças histológicas, pôde-se
observar que os melhores resultados obtidos em relação à integridade do epitélio
sulcular foram encontrados no período de fixação de 48 horas (Gráfico 1).
Quando analisado histologicamente o padrão de descalcificação do osso
maxilar, pôde-se observar que as melhores condições de descalcificação foram as
fixadas por 48 horas. O ácido nítrico, neste período, foi o que demonstrou os
melhores resultados para a desmineralização (Gráfico 2).
Tabela 1. Valor médio, em pixels (desvio padrão) da medida entre a porção mais coronária da crista
óssea e a junção amelo-cementária, comparando faces vestibulares e palatinas para os diferentes
períodos de fixação e descalcificação com ácido nítrico e solução de Anna Morse
.
Tempo de fixação
Descalcificação
24 horas
48 horas
72 horas
P
Ácido nítrico
Vestibular
205,99 (34,20)
210,95 (39,33)
176,59 (60,45)
0,496
Anna Morse
Vestibular
205,21 (54,77)
200,77 (45,78)
186,12 (35,73)
0,794
Ácido nítrico
Palatino
199,69 (38,34)
254,14 (66,50)
248,83 (38,71)
0,202
Anna Morse
Palatino
231,39 (46,55)
268,69 (69,26)
298,55 (70, 82)
0,280
22
Tabela 2. Freqüência percentual de deslocamento do cemento.
Tempo de fixação
Deslocamento do cemento
24 horas
Ac. Nítrico / A. Morse
48 horas
Ac. Nítrico / A. Morse
72 horas
Ac. Nítrico / A. Morse
Ausente 0 53,3 23,1 73,3 6,7 66,7
Terço cervical 40 13,3 38,5 6,7 33,3 13,3
Terço médio/apical 60 33,3 38,5 20 60 20
P
0,006 0,015 0,014
Tabela 3 – Padrão de desmineralização da dentina (percentual) com ácido nítrico e Anna Morse nos
diferentes tempos de fixação em formalina tamponada 10%.
Tempo de fixação
Desmineralização da Dentina
24 horas
Ac. Nítrico/A. Morse
48 horas
Ac. Nítrico/A. Morse
72 horas
Ac. Nítrico/A. Morse
Adequada
6,7 26,7 38,5 13,3 0 33,3
Inadequada coronária
33,3 20 23,1 40 6,7 6,7
Inadequada
coronária/cervical
20 46,7 7,7 13,3 40 6,7
Inadequada
coronária/cervical/apical
40 6,7 7,7 33,3 53,3 53,3
P
0,094 0,837 0,510
23
Gráfico 1 - Situação do epitélio sulcular, íntegro ou rompido, após descalcificação com Ácido Nítrico e
Anna Morse nos diferentes tempos de fixação em formalina 10%.
Gráfico 2 - Padrão de desmineralização óssea após descalcificação com Ácido Nítrico e Anna Morse
nos diferentes tempos de fixação em formalina 10%.
0
20
40
60
80
100
24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS
Período de Fixação
C o ndiçõ es do Epitélio Sulcular
Íntegro Ac. Nítrico
Íntegro Anna Morse
Rompido Ac. Nítrico
Rompido Anna Morse
Desmineralização Adequada do Osso
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas 72 horas
Ácido Nítrico
Anna Morse
24
Figura 1 - Avaliação microscópica dos cortes histológicos mostrou melhor uniformidade na cor e
diferenciação dos tecidos epitelial e conjuntivo com um período de fixação de 48 horas e
descalcificação em solução de Anna Morse. Coloração hematoxilina e eosina (aumento 10X).
ESTUDO EXPERIMENTAL
72 horas / Anna Morse
72 horas / Ác. Nítrico
48 horas / Anna Morse
48 horas / Ác. Nítrico
24 horas / Anna Morse
24 horas / Ác. Nítrico
25
AÇÃO DA NIFEDIPINA SOBRE O ESTADO PERIODONTAL DE RATOS WISTAR
METODOLOGIA
Descrição da amostra
Para a realização deste estudo, foram utilizados 50 ratos Wistar machos, com
60 dias de idade, peso variando entre 144 e 170g no momento experimental. Foram
mantidos em caixas–moradia, confeccionadas em plexiglass, medindo 65 x 25 x 15
cm, com assoalho recoberto de serragem, dividida conforme os grupos experimentais
no Biotério da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde do Rio Grande
do Sul. Os animais foram submetidos a ciclo claro/escuro (luzes acessas das 8:00 às
20:00 h).
Delineamento do estudo
Os animais foram divididos em grupos conforme segue:
- Grupo controle:
Dez ratos foram utilizados como controle, mantidos em duas caixas-moradia
(cinco ratos por caixa), recebendo ração padronizada e água ad libitum. Durante o
período experimental os ratos receberam diariamente 50ml/kg/dia de soro fisiológico
via sonda gástrica
§§§§
, ajustado para o peso semanalmente.
- Grupo controle com nifedipina 50mg/kg/dia:
Dez ratos submetidos nifedipina 50mg/kg/dia (Gonçalves, Nogueira Filho et
al., 2003), via sonda gástrica, por trinta dias, sendo a dose ajustada semanalmente
de acordo com o peso, recebendo ração padronizada, água ad libitum, e mantidos
em duas caixas-moradia (cinco ratos por caixa).
- Grupo ligadura:
§§§§
BECTON DICKINSON - DB®, São Paulo, Brasil
26
Dez ratos foram submetidos a modelo experimental de periodontite induzida
por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005), e mantidos em duas caixas-moradia (cinco
ratos por caixa), recebendo ração padronizada e água ad libitum. Durante o período
experimental os ratos receberam 50ml/kg/dia de soro fisiológico via sonda gástrica,
ajustado para o peso semanalmente.
- Grupo ligadura e nifedipina 50mg/kg/dia:
Dez ratos foram submetidos a modelo experimental de periodontite induzida
por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005), administrados nifedipina, 50mg/kg/dia
(Gonçalves, Nogueira Filho et al., 2003), via sonda gástrica, por trinta dias, sendo a
dose ajustada semanalmente de acordo com o peso, recebendo ração padronizada,
água ad libitum, e mantidos em duas caixas-moradia (cinco ratos por caixa).
- Grupo ligadura e nifedipina 10mg/kg/dia:
Cinco ratos foram submetidos a modelo experimental de periodontite induzida
por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005), administrados nifedipina, 10mg/kg/dia
(Chiu, Fu et al., 2001), via sonda gástrica, por trinta dias, sendo a dose ajustada
semanalmente de acordo com o peso, recebendo ração padronizada, água ad
libitum, e mantidos em duas caixas-moradia (cinco ratos por caixa).
- Grupo ligadura e nifedipina 100mg/kg/dia:
Cinco ratos foram submetidos a modelo experimental de periodontite induzida
por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005), administrados nifedipina, 100mg/kg/dia
(Nishikawa, Nagata et al., 1996), via sonda gástrica, por trinta dias, sendo a dose
ajustada semanalmente de acordo com o peso, recebendo ração padronizada, água
ad libitum, e mantidos em duas caixas-moradia (cinco ratos por caixa).
Medicação sistêmica utilizada
27
A obtenção da nifedipina em forma líquida foi a partir do conteúdo de
cápsulas, Adalat
*****
, pelo método da tesoura. Desta forma, a ponta da cápsula foi
cortada com uma tesoura cirúrgica e o conteúdo retirado comprimindo a cápsula com
um porta agulhas (Rosen e Johnson, 1989). A nifedipina é sensível à luz, assim a
remoção do conteúdo da cápsula foi realizada com proteção adequada, tanto durante
o manuseio quanto para a armazenagem (Helin e Kontra, 2000).
Indução de doença periodontal
Os ratos do grupo ligadura e os do grupo ligadura com nifedipina 50mg/kg
foram submetidos à colocação de uma ligadura com fio de seda preta trançada
†††††
ao redor dos segundos molares superiores esquerdos, com o objetivo de favorecer o
acúmulo de biofilme subgengival e o estabelecimento de perda tecidual (Cavagni,
Soletti et al., 2005).
A colocação da ligadura foi realizada sob anestesia geral. Os ratos dos quatro
grupos experimentais, inclusive aqueles que não receberam ligadura, foram
submetidos à anestesia geral pela administração intramuscular da associação (1:1)
das drogas Hidrocloridrato de Ketamina
‡‡‡‡‡
e Cloridrato de Xilazina
§§§§§
, na dose de
50mg/kg de peso corporal. Durante a anestesia, a fim de prevenir hipotermia, os
ratos foram mantidos aquecidos, enrolando-os em papel alumínio e mantendo-os sob
lâmpada de 60 watts.
Estando os ratos anestesiados, foram individualmente colocados sobre uma
mesa clínica, onde as arcadas superiores e inferiores foram afastadas com o auxílio
de atilhos de borracha. Estabelecida uma visão adequada dos molares superiores, foi
colocado em torno do segundo molar superior esquerdo, um fio de seda. Com o uso
de duas pinças porta agulha, tipo Castro-Viejo
******
, o fio foi colocado nos espaços
interproximais, circundando a coroa do dente junto do sulco gengival, com nós
*****
Bayer®, São Paulo, Brasil
†††††
Ethicon 3-0 Johnson-Johnson®, São Paulo, Brasil
‡‡‡‡‡
Dopalen®, Agribrands Brasil Ltda., Paulínea, Brazil
§§§§§
Rompun®, Bayer S.A., São Paulo, Brazil
******
Quinelato®, Rio Claro, Brasil
28
cirúrgicos na face palatina. Com o auxílio de uma sonda milimetrada o fio foi
introduzido no sulco gengival. A permanência do fio foi avaliada semanalmente
(Rovin, Costich et al., 1966; Sanavi, Listgarten et al., 1985; Samejima, Ebisu et al.,
1990). Quando sua ausência foi constatada o rato era novamente anestesiado e o fio
recolocado.
Todos os animais foram observados até a recuperação da anestesia, quando
começavam a se locomover, sendo então recolocados nas caixas-moradia.
Dieta
Os ratos receberam ração padronizada
††††††
, tendo como composição básica
milho, farelo de soja, farinha de carne, sorgo, caulim, sal, premix mineral e premix
vitamínico.
Avaliação da saúde geral
A fim de avaliar as condições de saúde geral, os ratos foram submetidos a
controles de peso corporal. Os ratos foram pesados com uma freqüência semanal
durante o período experimental, 30 dias.
Procedimentos experimentais
Para possibilitar a avaliação do comportamento dos tecidos periodontais frente
ao uso de nifedipina em situações clínicas de saúde e periodontite, os ratos foram
mortos em câmara de CO
2
e imediatamente após as maxilas foram removidas e
fixadas em formalina tamponada 10%. Os corpos dos ratos foram descartados de
acordo com as normas do biotério.
Preparação das amostras para análise
Os procedimentos laboratoriais de confecção das peças histológicas foram
realizados no Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia – UFRGS.
††††††
Alisul/Supra®, Anápolis, Brasil
29
As maxilas removidas foram fixadas em formalina tamponada 10% por um
período de 48 horas. Após fixação, as peças foram submetidas ao processo de
descalcificação por solução de Anna Morse (Citrato de Sódio a 20% + Ácido Fórmico
a 50%) durante 40 dias aproximadamente (Anna-Morse, 1945).
As peças descalcificadas foram individualmente submetidas ao processo de
neutralização com bicarbonato de sódio durante 1 hora. O processamento histológico
para inclusão das peças em parafina, constituiu-se da desidratação por quatro
banhos em álcool 95% (80 minutos cada), um banho em álcool absoluto (de 60
minutos), e diafanização por três banhos em xilol (80 minutos) e dois banhos em
parafina líquida a 60°C (120 minutos cada), seqüencialmente para posterior
emblocamento. No momento da inclusão, a face distal do segundo molar foi colocada
paralela ao solo de forma que ficasse perpendicular ao plano de corte do bloco. Os
cortes foram realizados em micrótomo
‡‡‡‡‡‡
com 5 µm de espessura, até alcançar a
região contendo as raízes em seu longo eixo, conforme inspeção com auxílio de
lupa. Cada bloco deu origem a três cortes, coletados a cada 20 µm de avanço.
Os cortes foram coletados em lâminas de vidro e submetidos a
desparafinização por dois banhos de xilol (10 minutos cada), desidratação por dois
banhos de álcool absoluto (5 minutos), hidratação (1 minuto) e coloração por
hematoxilina de Harris (2 minutos) e eosina (1 minuto) de forma seqüencial. Em
seguida, a desidratação rápida, por meio de três banhos em álcool absoluto (1
minuto cada) e diafanização (processo de clareamento) realizado com dois banhos
de xilol (10 minutos). A montagem final das lâminas foi realizada com auxílio de
Entelan
§§§§§§
(Junqueira e Junqueira, 1985).
‡‡‡‡‡‡
RM2155, E. Leitz®, Wetzlar, Germany
§§§§§§
Merck Sharp & Dohme®, São Paulo, Brazil
30
Análise histológica descritiva
A análise histológica do tipo descritiva foi realizada por dois examinadores. A
leitura das lâminas foi realizada em um microscópio binocular óptico
*******
com
aumento de 40 vezes.
A análise descritiva considerou o aspecto do epitélio interno, juncional e
sulcular, observando suas características como a presença de cristas epiteliais,
ceratina, espaços intercelulares e degeneração hidrópica. Estas mesmas
características foram avaliadas no epitélio externo ou epitélio bucal. No tecido
conjuntivo foi observada a presença de infiltrado inflamatório mononuclear ou
polimorfonuclear, assim como, sua extensão e os sinais vasculares do processo
inflamatório. Também foi observada a relação da base do epitélio juncional com a
junção amelo cementária, o ligamento periodontal, cemento e osso alveolar.
Análise Histológica Quantitativa
Para a análise quantitativa os cortes histológicos foram visualizados em um
microscópio óptico com aumento de 40 vezes. As imagens foram então digitalizadas
por meio de fotografias realizadas com uma máquina digital 4 megapixels
†††††††
com
distância focal de 4 vezes e velocidade de 1/60, acoplada a lente do microscópio. As
faces vestibulares e palatinas dos cortes histológicos foram fotografadas
individualmente. Para fins de conversão dos resultados de medição, foi fotografada
uma escala microscópica calibradora
‡‡‡‡‡‡‡
de medida conhecida na mesma objetiva.
Os campos utilizados para esta avaliação respeitavam os seguintes critérios:
presença da porção coronária e radicular do segundo molar, junção amelo-
cementária evidente e crista óssea passível de identificação. Também o tecido
epitelial sulcular, juncional e bucal e tecido conjuntivo sem alterações decorrentes do
processamento histológico.
*******
Zeiss®, Jena, Germany
†††††††
Nikon® Coolpyx, Ayuthaya, Thailand
‡‡‡‡‡‡‡
E. Leitz®, Wetzlar, Germany
31
Mensurações lineares e de área foram realizadas usando um sistema de
análise de imagem Imagetool
§§§§§§§
. Estas foram realizadas por um único examinador
que desconhecia a relação da lâmina com o seu grupo experimental. As medidas de
área foram delimitadas da seguinte maneira (Figura 1):
o Área do epitélio interno considerava área do epitélio juncional de sua porção
mais apical até a porção mais coronária e marginal do epitélio sulcular, que
claramente dividia a área em epitélio interno e epitélio bucal (área amarela).
o Área do epitélio bucal considerava a área mais coronária do epitélio bucal que
claramente dividia a área em epitélio bucal e epitélio interno, se estendendo
apicalmente até a altura correspondente à base do epitélio juncional (área
azul).
o Área do tecido conjuntivo gengival total considerava toda a área de conjuntivo
gengival até a porção mais apical do infiltrado inflamatório relacionada com a
base do epitélio juncional (área vermelha).
o Área de tecido conjuntivo inflamado correspondia a toda a área de tecido
conjuntivo gengival inflamado, apresentando alterações vasculares e acúmulo
de células inflamatórias, que se observou desde a porção mais próxima do
epitélio interno ininterruptamente (área rosa).
As medidas lineares realizadas foram (figura 2):
o Perda óssea - Junção amelo-cementária à crista óssea;
o Espessura gengival - medida da junção amelo-cementária até a porção mais
distante do epitélio bucal;
o Altura gengival – da base do epitélio juncional até a margem gengival;
§§§§§§§
UTHSCSA, San Antonio, USA
32
Aspectos Éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade
de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. O uso e a
manipulação dos animais seguiram as normas éticas de pesquisa em saúde e direito
dos animais (Goldim e Raymundo, 1997), estando de acordo com as normas
operacionais do Biotério da Fundação Estadual de Pesquisa e Ensino do Rio Grande
do Sul.
Análise Estatística
Os valores obtidos pela análise histológica quantitativa foram expressos
através de números absolutos, médias e desvio padrão. A comparação estatística
entre as medidas de área e lineares dos tecidos gengivais dos diferentes grupos
experimentais foi realizada através do teste ANOVA, com 5% de significância. A
significância estatística foi corrigida para múltiplas comparações usando o método de
Bonferroni.
33
Figura 1 – Área do epitélio interno, juncional e sulcular (cor amarela), área do epitélio bucal (cor azul),
área do tecido conjuntivo total (cor vermelha) e área do conjuntivo inflamado (cor rosa). Coloração HE,
aumento de 5X.
Figura 2 – Medidas lineares. Altura gengival (azul), espessura (amarelo), distância da junção amelo-
cementária a crista óssea (vermelho) Coloração HE, aumento de 5X.
34
RESULTADOS
No grupo com ligadura um rato foi excluído em decorrência de um seqüestro
ósseo junto à margem gengival, ficando este grupo com nove ratos. O grupo ligadura
com nifedipina 50mg/kg/dia, perdeu um rato devido ao processamento histológico da
peça, o que também ocorreu no grupo ligadura com nifedipina 10mg/kg/dia.
Análise histológica descritiva
Para a análise histológica descritiva (Figura 3) os examinadores foram
informados sobre os grupos experimentais.
Na avaliação histológica do grupo controle, foi possível observar o epitélio
interno dividido em epitélio juncional e epitélio sulcular com nitidez. O epitélio
juncional com base na junção amelo-cementária mostrou poucas camadas celulares
com união no tecido conjuntivo em linha reta (ausência de papilas coriais). O epitélio
sulcular era do tipo estratificado pavimentoso ceratinizado. Observava-se diminuição
progressiva da ceratinização em direção ao epitélio juncional. Nessa porção do
epitélio as cristas epiteliais eram poucas e superficiais. E estas, quando presentes,
estavam associadas a um infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário discreto, no tecido
conjuntivo fibroso, localizado na porção mais coronária. O epitélio bucal do tipo
estratificado pavimentoso ceratinizado apresentava papilas coriais e ausência de
qualquer sinal degenerativo e/ou proliferativo.
No grupo experimental controle com nifedipina 50mg/kg/dia, a avaliação
microscópica foi semelhante ao grupo anterior. Observamos que em quatro de nove
animais o epitélio interno se apresentou mais espesso, não permitindo uma
diferenciação obvia entre epitélio juncional e sulcular. O epitélio juncional se manteve
com a base na junção amelo-cementária. O infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário,
presente no tecido conjuntivo fibroso, acompanhava paralelamente o epitélio interno.
No grupo com ligadura, foi possível observar em todos os animais perda de
inserção microscopicamente já que a base do epitélio interno, epitélio da bolsa, se
encontrava em posição apical à junção amelo-cementária. Neste grupo, a
diferenciação morfológica entre epitélio juncional e sulcular estava perdida. O epitélio
35
interno mostrava papilas coriais em pontos variáveis da sua extensão e sinais de
degeneração hidrópica. Outro detalhe a ser ressaltado foi o aumento da espessura
da camada de ceratina em relação aos grupos controle e controle com nifedipina
50mg/kg/dia. O epitélio bucal apresentava cristas epiteliais mais longas quando
comparado aos grupos anteriores. O infiltrado inflamatório crônico acompanhava a
parede do revestimento epitelial e já se estendia de maneira mais difusa para o
interior do tecido conjuntivo, em alguns casos ultrapassando a porção intermediária
da espessura do tecido conjuntivo gengival. Convém salientar que, devido ao modelo
experimental proposto, era possível perceber o espaço ocupado pela ligadura.
Os ratos com ligadura que receberam nifedipina 50mg/kg/dia como
característica morfológica mais significativa a transformação da margem gengival em
uma estrutura de formato retangular com a criação de um “plateau” de tecido. Esta
mudança do formato gengival se deveu principalmente ao crescimento do tecido
conjuntivo. Este tecido apresentava infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário mais
concentrado na vertente interna da bolsa, mas se estendendo até o epitélio bucal. O
epitélio externo apresentou projeções epiteliais abundantes e profundas. No epitélio
interno não se observou distinção entre os epitélios juncional e sulcular, também
mostrando projeções epiteliais e degeneração hidrópica. Neste grupo observou-se
também a presença de camada de ceratina no epitélio interno que foi diminuindo sua
espessura em direção ao fundo da bolsa.
O grupo com ligadura que recebeu nifedipina 10mg/kg/dia, se apresentava
semelhante ao grupo com ligadura, enquanto o grupo com ligadura e nifedipina
100mg/kg/dia foi semelhante ao grupo com ligadura que recebeu 50mg/kg/dia,
revelando as características microscópicas de maneira mais extensa.
36
Figura 3 – Cortes histológicos corados com HE, dos grupos experimentais: grupos controle com soro
fisiológico e nifedipina 50 mg/kg/dia e grupos teste: ligadura com soro fisiiológico, ligadura com
nifedipina 50 mg/kg/dia, ligadura com nifedipina 10 mg/kg/dia e ligadura com nifedipina 100mg/kg/dia.
Análise histológica quantitativa
As medidas de área são semelhantes estatisticamente entre os ratos do grupo
controle que receberam ou não nifedipina 50mg/kg/dia (Tabela 1). Entre os ratos com
ligadura que receberam ou não nifedipina 50mg/kg/dia de peso, houve diferenças
significativas em relação à área de epitélio interno, que para o grupo que recebeu a
medicação foi de 57% maior. O tecido conjuntivo total teve um aumento de 70% em
sua área, enquanto que o tecido conjuntivo com infiltrado inflamatório mostrou um
aumento de 65%, sendo estas diferenças estatisticamente significativas. Assim, a
administração de nifedipina associada a uma acumulação de biofilme subgengival
Controle + soro fisiológico
Controle + nif 50mg/kg/dia Ligadura + nif 50mg/kg/dia
Ligadura + soro fisiológico
Ligadura + nif 10mg/kg/dia
Ligadura + nif 100mg/kg/dia
37
levou a uma maior área de epitélio interno e tecido conjuntivo, associada com um
infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário. A área do epitélio bucal se mostrou
semelhante entre os dois grupos.
Grupos
Epitélio interno Epitélio bucal
Conjuntivo
total
Conjuntivo
inflamado
Controle
18479,60 a
(5231,80)
31890,22 a
(9117,38)
38178,63 a
(11596,30)
8764,54 a
(2442,46)
Controle c/
nif 50mg/kg
16782,64 a
(4025,45)
31359,23 a
(8514,91)
38505,61 a
(10897,00)
7888,72 a
(1766,13)
Ligadura
37576,38 b
(11917,42)
54098,13 b
(18286,19)
82621,53 b
(29472,43)
26645,22 b
(7223,64)
Ligadura com
nif 50mg/kg
60798,50 c
(12036,67)
66014,44 b
(29780,29)
118213,00 c
(16341,34)
40510,53 c
(9632,50)
Tabela 1 – Média e desvio-padrão das medidas de área em
µm
2
. Médias seguidas de letras
diferentes, entre os grupos, mostram diferença estatisticamente significativa.
As medidas lineares entre os grupos controle e controle com nifedipina são
semelhantes entre si (Tabela 2). Para os grupos ligadura e ligadura com nifedipina
50mg/kg/dia pôde-se observar diferenças significativas estatisticamente em relação à
altura gengival e espessura da gengiva. A altura gengival aumentou 75% e a
espessura gengival 80% aproximadamente. Em relação à distância entre a junção
amelo-cementária e crista óssea, no grupo ligadura com nifedipina 50mg/kg/dia
houve uma maior perda óssea, aproximadamente 18%, que estatisticamente foi
semelhante entre os dois grupos para esse período experimental.
38
Grupos
JAC / crista
óssea
Espessura
Altura gengival
Controle
222,02 a
(29,51)
386,07 a
(54,42)
441,34 a
(58,98)
Controle c/
nif 50mg/kg
217,57 a
(26,96)
387,50 a
(65,20)
438,61 a
(68,02)
Ligadura
503,58 b
(122,46)
566,40 b
(96,26)
503,86 b
(122,19)
Ligadura c/
nif 50mg/kg
562,13 b
(55,44)
712,25 c
(81,39)
667,91 c
(90,96)
Tabela 2 – Medidas lineares e desvio-padrão em µm. Médias seguidas de letras diferentes, entre os
grupos, mostram diferença estatisticamente significativa.
O gráfico 1 mostra a área do epitélio interno, epitélio bucal conjuntivo total e
conjuntivo inflamado. Foram considerados os grupos que receberam ligadura com
dosagens de nifedipina de 10mg/kg/dia, 50mg/kg/dia e 100mg/kg/dia, comparados
com o grupo ligadura. O epitélio interno aumentou sua área gradualmente de
10mg/kg/dia para 50mg/kg/dia, a área na dosagem de 100mg/kg/dia ficou
semelhante ao grupo de 10mg/kg/dia. No entanto, o epitélio bucal manteve um
aumento gradual de acordo com a dosagem. A área do conjuntivo total variou entre
os grupos conforme a dosagem de nifedipina.
As medidas lineares, considerando os grupos que receberam ligadura com
dosagens de nifedipina de 10, 50 e 100mg/kg/dia, comparados com o grupo ligadura
são mostrados no gráfico 2. A distância da junção amelo-cementária até a crista
óssea aumentou em relação ao grupo ligadura e grupo ligadura com nifedipina
50mg/kg/dia, se mantendo estável em relação ao grupo ligadura com nifedipina
100mg/kg/dia. O mesmo ocorrendo em relação à espessura e altura gengival.
39
Medidas de área
25000,00
50000,00
75000,00
100000,00
125000,00
Controle 10mg 50mg 100mg
Dose de Nifedipina
área (µm2)
epitélio interno epitélio bucal conjuntivo total conjuntivo inflamatório
Gráfico 1 – Medidas de área em µm
2
. Grupos controle com ligadura e teste com ligadura e diferentes
dosagens de nifedipina.
Medidas lineares
200,00
400,00
600,00
800,00
Controle 10mg 50mg 100mg
Dose de nifedipina
Distância (µm)
JAC-crista espessura altura gengival
Gráfico 2 – Medida linear em µm, considerando os grupos controle com ligadura e teste com ligadura
e diferentes dosagens de nifedipina.
40
ESTUDOS METODOLÓGICOS
DISCUSSÃO
A avaliação do processo saúde/doença periodontal vem gradualmente se
modificando a partir do entendimento da etiologia e patogenia das doenças
periodontais. Tradicionalmente, os métodos de diagnóstico consistiam de medidas de
profundidade de sondagem e nível ósseo radiográfico, parâmetros associados
principalmente com um histórico da doença (Nonnemacher, 2001). O conhecimento
atual mostra a necessidade da determinação de descritores da doença associados
tanto com a etiologia como com a situação inflamatória e de destruição dos tecidos
periodontais. Desta forma, os descritores etiológicos são avaliados pela
determinação da presença do biofilme supra e subgengival, assim como do cálculo
dental. Os descritores inflamatórios são mensurados pela profundidade de sondagem
e sangramento e/ou supuração e os descritores de destruição pela avaliação dos
níveis clínicos de inserção e perda óssea vista radiograficamente.
Na medida em que houve uma nova sistematização para o diagnóstico do
processo saúde/doença periodontal, a metodologia de avaliação para os tecidos
periodontais em estudos animais necessita ser adequada a estas sistemáticas. A
melhor forma de avaliar o periodonto considerando os descritores inflamatórios e de
destruição em modelos animais não está totalmente aceita na literatura. Duas
metodologias têm sido utilizadas, uma histológica e outra morfológica.
A avaliação histológica representa o padrão na maioria dos trabalhos que
avaliam os tecidos periodontais. Susin e Rösing (2003) estudaram em ratos Wistar a
altura óssea histologicamente de forma linear, considerando o espaço interproximal
de primeiros e segundos molares, medindo da junção amelo-cementária até o ponto
mais apical da crista óssea. Já nos estudos de Nociti, Nogueira-Filho et al. (2000) e
Nogueira-Filho, Froes Neto et al. (2004) a forma de avaliar histologicamente
correspondeu a uma área em mm
2
de perda óssea na região da furca dos primeiros
molares de ratos Wistar.
41
Mais recentemente, a avaliação morfométrica dos tecidos periodontais para
avaliar perda óssea está sendo empregada. Rivaldo, Padilha et al. (2005) em um
modelo de estudo em ratos Mus domesticus, avaliaram as alterações da altura óssea
em mandíbulas descarnadas, na área em mm
2
correspondente à perda óssea no
primeiro e segundo molares. Por outro lado, Kuhr, Popa-Wagner et al. (2004),
avaliaram em ratos Sprague-Dawley as perdas ósseas induzidas, considerando dois
diferentes métodos em mandíbulas descarnadas: em um, a distância da junção
amelo-cementária até a crista óssea foi medido linearmente em diferentes sítios,
noutro a área de superfície radicular exposta foi medida. O estudo conclui que o
método de medir a distancia linearmente deve ser preferido ao método de avaliação
da área. Fica, porém, a dúvida sobre o melhor entre os diferentes métodos,
histológico e morfológico, na determinação das perdas ósseas. Ainda que
histologicamente seja possível à determinação das perdas, é inegável que o exame
direto de maxilas é mais simples de ser realizado.
Desta forma, foi realizado um estudo em ratos Wistar para comparar os
métodos histométrico e morfométrico com o objetivo de determinar a melhor maneira
de reproduzir as alterações das estruturas ósseas periodontais, tanto em saúde
como em doença periodontal induzida (Fernandes, Gaio, Oppermann et al., 2006). A
análise morfométrica foi realizada a partir de fotografias digitais das faces vestibular e
palatina das maxilas descarnadas; a análise histométrica, a partir de cortes
histológicos, os quais foram digitalizados, por fotografias, para a avaliação. O estudo
utilizou ratos Wistar machos, para avaliar a perda óssea induzida, comparando as
duas formas uma histométrica, que mede a perda óssea de forma linear (Susin e
Rösing, 2003) e outra morfométrica, que mede linearmente a perda óssea em
maxilas descarnadas (Kuhr, Popa-Wagner et al., 2004). Procurou-se utilizar grupos
de comparação tanto em relação à capacidade do método de indução em
efetivamente produzir perda óssea alveolar, quanto comparar as situações das
maxilas nas quais foi induzida a perda óssea através dos dois métodos de análise.
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que ambos os métodos,
morfométrico e histométrico foram capazes de detectar a presença de perda óssea
42
periodontal. As diferenças estatisticamente significativas observadas entre os dentes
com e sem perda óssea induzida, para ambos os métodos, demonstrou que a
colocação de ligaduras gerou perda óssea, o que pôde ser observado com as duas
formas de análise. Nas áreas palatinas dos dentes com ou sem ligadura e nas
vestibulares dos dentes com ligadura, não existiram diferenças estatisticamente
significativas entre os métodos. Entretanto, para as áreas vestibulares dos dentes
sem ligadura, a avaliação histométrica mostrou um resultado estatisticamente
diferente das áreas correspondentes para o método morfométrico.
Objetivamente, verificou-se que uma das limitações da histometria na
medição de perda óssea alveolar induzida por ligadura em ratos foi a possibilidade
de uma inclinação indesejável do corte histológico que, apesar dos cuidados
normalmente dispensados, pode gerar uma imagem de projeção da crista óssea
alveolar para oclusal. Este fato, no entanto, não descarta sua utilização, pois a
análise histológica mostra características positivas para outras análises como, por
exemplo, a possibilidade de avaliação celular, de estrutura dos tecidos epitelial,
conjuntivo e ósseo. Já a avaliação morfométrica ficaria limitada à avaliação das
alterações da crista óssea alveolar.
Estudos objetivando analisar o processo de doença através da perda óssea
poderiam optar pelo método morfométrico em maxilas descarnadas. Estudos onde
além da progressão da doença também respostas inflamatórias sejam consideradas
devem optar por análises histológicas. Uma outra questão pendente a este último
método é a otimização do processamento histológico buscando uma melhor
visualização dos cortes.
Na literatura, os estudos de doença periodontal em animais não apresentam
uma padronização no que se refere ao processamento histológico, quanto ao tempo
de fixação, descalcificação e tipo de substância descalcificadora utilizada (Nishikawa,
Nagata et al., 1996; Chiu, Fu et al., 2001; Shimizu, Kataoka et al., 2002). O tempo de
fixação das peças histológicas é variável e não se apresentam critérios de avaliação
pré-determinados na relação entre os métodos de fixação com a descalcificação. É
importante ressaltar que o tempo de fixação e o agente descalcificador utilizado têm
43
relevância para a qualidade dos preparos histológicos e, conseqüentemente, na
precisão da análise dos resultados das pesquisas (Stevens, Lowe et al., 1996). Os
tecidos epiteliais e conjuntivos são alterados pela exposição prolongada aos meios
de descalcificação. Muitas vezes, na tentativa de se obter um bom resultado
histológico dos tecidos calcificados, danos são observados nos tecidos moles
(Correa, Oliveira et al., 2003). Outras vezes, o tecido mole está convenientemente
preservado, porém a peça não se encontra completamente descalcificada, o que
dificulta a obtenção de cortes que preencham os requisitos necessários para a
análise simultânea de ambos tipos de tecidos. As técnicas de fixação e
descalcificação são práticas de rotina nos diferentes laboratórios. No entanto, os
estudos apresentam poucos detalhes acerca do processamento histológico, não
estando essa rotina acessível nos meios de consulta bibliográfica disponível (Rovin,
Costich et al., 1966; Nociti, Nogueira-Filho et al., 2000; Chiu, Fu et al., 2001).
Assim, foi realizado um estudo com objetivo de avaliar as características
histológicas dos tecidos periodontais em maxila de ratos Wistar, comparando
diferentes tempos de fixação associados à descalcificação das peças por ácido
nítrico a 5% ou ácido fórmico a 50% + citrato de sódio a 20% (Fernandes, Gaio,
Rosing et al., 2006).
As repercussões histológicas dos diferentes tempos de fixação em
formalina 10 % utilizando duas soluções descalcificadoras mostrou que a relação
entre a junção amelo-cementária e a crista óssea se mantiveram sem alterações
significativas. Quando a presença de cemento íntegro e ligado à superfície radicular
foi determinada, os menores índices de deslocamento aconteceram no período de
fixação de 48 horas, principalmente quando a descalcificação foi por ácido fórmico a
50% + citrato de sódio a 20%. O padrão de desmineralização da dentina,
considerando uma desmineralização adequada e uma desmineralização inadequada,
mostrou situações variadas nos diferentes momentos experimentais para as
diferentes soluções descalcificadoras, não obedecendo a um padrão. A avaliação
microscópica descritiva dos cortes histológicos mostrou uma melhor uniformidade na
coloração e diferenciação na união do tecido epitelial e conjuntivo quando se utilizou
44
um período de fixação de 48 horas e descalcificação em ácido fórmico a 50% +
citrato de sódio a 20%.
As contribuições metodológicas do presente estudo permitiram que se
abordassem os objetivos experimentais de forma mais segura, com base em
evidências que suportam os métodos empregados. Além disso, as considerações
metodológicas devem contribuir para que estudos realizados nesta linha de pesquisa
possam se referenciar de forma a assegurar melhores resultados baseados em
técnicas apropriadas para o estudo do processo saúde/doença periodontal.
ESTUDOS EXPERIMENTAIS
DISCUSSÃO
A avaliação do processo saúde/doença periodontal vem gradualmente se
modificando a partir do entendimento da etiologia e patogenia das doenças
periodontais. Na medida em que houve uma nova sistematização para o diagnóstico
do processo saúde/doença, a metodologia de avaliação para os tecidos periodontais,
em estudos animais, foi adequada a estas (Gaio, Fernandes et al., 2003). Surgindo,
desta forma, um questionamento sobre qual a repercussão clínica e histopatológica
dos aumentos de volume gengival frente a esta sistemática de avaliação, que
considera descritores etiológicos, inflamatórios e de destruição. Pois, de uma
maneira geral os estudos que avaliam aumentos de volume gengival não inter-
relacionam os diferentes descritores de doença (Morisaki, Kato et al., 1993;
Spolidorio, Spolidorio et al., 2002; Gonçalves, Nogueira Filho et al., 2003).
Neste estudo, dois grupos com saúde periodontal receberam um
administração de 50mg/kg/dia de soro fisiológico, e outro nifedipina 50mg/kg/dia
(Nishikawa, Nagata et al., 1996). Os grupos teste foram submetidos a modelo
experimental de periodontite induzida por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005) e
receberam soro fisiológico ou nifedipina 50mg/kg/dia (Nishikawa, Nagata et al.,
1996). Para outros dois grupos teste foi administrado nifedipina 10mg/kg/dia ou
100mg/kg/dia como forma de avaliar o efeito das diferentes dosagens sobre os
tecidos periodontais. Para os grupos experimentais controle e teste com nifedipina 50
45
mg/kg/dia foram utilizados dez ratos, enquanto que para os grupos teste com
nifedipina 10 e 100 mg/kg/dia foram cinco ratos por grupo.
A maioria das pesquisas trabalha com grupos que variam de cinco a quinze
ratos, amostras estas que se assemelham às utilizadas nesse estudo (Morisaki, Kato
et al., 1993; Ishida, Kondoh et al., 1995; Chiu, Fu et al., 2001; Shimizu, Kataoka et al.,
2002; Cavagni, Soletti et al., 2005).
A administração de nifedipina via oral foi efetuada por meio de sonda gástrica,
por apresentar absorção estável e controlada (Kondo e Sugimoto, 1987). Outros
estudos também utilizam a administração da nifedipina por via oral (Morisaki, Kato et
al., 1993; Ishida, Kondoh et al., 1995), no entanto, esta é colocada na alimentação. A
nifedipina é sensível à luz, e sofre fotodegradação de 20% em três horas e 40% em
seis horas (Helin, Kontra et al., 1998). Desta forma, a colocação da nifedipina na
dieta pode não ser a forma mais adequada.
Os resultados histológicos descritivos (Figura 3), deste estudo mostraram que
quatro de nove animais, do grupo controle com nifedipina 50 mg/kg/dia,
apresentavam um epitélio interno mais espesso, não permitindo uma diferenciação
óbvia entre epitélio juncional e sulcular, representando uma discreta hiperplasia
epitelial. A avaliação da área do tecido epitelial interno não mostrou diferenças
significativas entre os ratos que receberam ou não nifedipina. O infiltrado inflamatório
linfo-plasmocitário, presente no tecido conjuntivo fibroso, acompanhava
paralelamente o epitélio interno. Não existindo diferenças na medida entre a área do
tecido conjuntivo total, a área de conjuntivo inflamado ou a espessura gengival.
Caracterizando, com estes resultados, que ratos submetidos à nifedipina
apresentaram alterações histopatológicas, mas não um aumento de volume gengival.
Morisaki, Kato et al. (1993) avaliaram histologicamente os tecidos periodontais
de ratos com saúde periodontal submetidos à administração de nifedipina e
mostraram um tecido epitelial com marcada hiperplasia. Cristas epiteliais longas
foram observadas no epitélio sulcular, sem alterações no epitélio juncional. O tecido
conjuntivo apresentou infiltrado inflamatório na porção subepitelial. Clinicamente foi
possível observar aumento de volume gengival. Achados semelhantes foram vistos
46
por Kataoka, Shimizu et al. (2001) e Shimizu, Kataoka et al. (2002) que avaliando a
).espessura do tecido epitelial encontraram diferenças significativas estatisticamente,
resultados semelhantes aos encontrados por Spolidorio, Spolidorio et al. (2002
A altura gengival, avaliada em cortes histológicos, nos ratos que receberam
nifedipina 50mg/kg/dia, não mostrou alterações consideráveis. Morisaki, Kato et al.
(1993) e Ishida, Kondoh et al. (1995) avaliaram a profundidade de sondagem
clinicamente, sob um microscópio estereoscópico, e observaram diferenças
significativas. A comparação desses resultados com os do presente estudo é
limitada, pois os autores utilizam um modelo de mensuração da profundidade de
sondagem que pode ser alterado por diferentes fatores (Bulthuis, Barendregt et al.,
1998; Garnick e Silverstein, 2000).
As diferenças entre os resultados se devem, principalmente, à forma de
avaliação. Na maioria dos estudos não foi realizado o cegamento do examinador
quanto aos grupos experimentais, noutros estudos as diferenças de espessura são
observadas qualitativamente o que torna difícil uma comparação dos resultados.
As maiores alterações foram observadas entre os grupos onde a periodontite
foi induzida pelo uso de ligaduras. Histologicamente, a diferenciação morfológica
entre o epitélio juncional e sulcular estava perdida. O epitélio interno mostrava
papilas coriais em pontos variáveis da sua extensão e sinais de degeneração
hidrópica. O epitélio bucal apresentava cristas epiteliais mais longas quando
comparado aos grupos anteriores. A área do epitélio interno e epitélio bucal
mostraram uma diferença significativa para o grupo que recebeu nifedipina
50mg/kg/dia.
Todos os animais apresentavam perda de inserção microscopicamente, mas o
grupo que recebeu nifedipina teve uma perda óssea 18% maior, ainda que sejam
valores semelhantes. Gonçalves, Nogueira Filho et al. (2003) quantificou o volume de
perda óssea na região da bifurcação, e também não observou diferenças
significativas estatisticamente entre os grupos.
Poucos estudos em animais estão relacionados com periodontite. Fu, Nieh et
al. (1997) avaliaram em ratos o efeito da ciclosporina, comparando um lado com
47
ligadura com o contralateral sem ligadura. Os resultados mostraram que dentes com
ligadura apresentavam um aumento estatisticamente significativo no volume dos
tecidos epitelial e conjuntivo total, assim como no infiltrado inflamatório e tecido
gengival total. Observaram, assim, um aumento de volume gengival óbvio nos dentes
com ligadura.
Estudos em humanos também observaram ser as variáveis periodontais,
principalmente o biofilme e a inflamação gengival, importantes fatores de risco para a
expressão dos aumentos de volume gengival (Bullon, Machuca et al., 1995;
Tavassoli, Yamalik et al., 1998).
O infiltrado inflamatório crônico acompanhava a parede do revestimento
epitelial e já se estendia de maneira mais difusa para o interior do tecido conjuntivo.
Os ratos com ligadura e administração de nifedipina tiveram como característica
morfológica mais significativa à transformação da margem gengival em uma estrutura
de formato retangular com a criação de um “plateau” de tecido. Esta mudança do
formato gengival se deveu principalmente ao crescimento do tecido conjuntivo. Este
tecido apresentava um infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário mais concentrado na
vertente interna da bolsa, se estendendo até o epitélio bucal. Neste grupo, tanto a
área total do tecido conjuntivo como a área de conjuntivo inflamado se mostrou maior
estatisticamente significativa, assim como a altura gengival e espessura gengival,
caracterizando, desta forma não somente alterações histopatológicas, mas também
um aumento de volume gengival.
O grupo com ligadura que recebeu nifedipina 10mg/kg/dia, se apresentava
semelhante ao grupo com ligadura sem medicação, enquanto que o grupo com
ligadura e nifedipina 100mg/kg/dia, foi semelhante ao grupo que recebeu
50mg/kg/dia, revelando as características microscópicas de maneira mais extensa
(Figura 3). Estes resultados confirmaram os achados de Chiu, Fu et al. (2001) que
compararam dosagens de 10 e 50mg/kg/dia e encontraram diferenças somente
quando a dosagem de nifedipina foi maior.
Desta forma, podemos concluir que a presença de nifedipina por si só não
acarreta um aumento de volume gengival em uma situação de saúde periodontal em
48
ratos. Nesta situação podemos observar somente discretas alterações
histopatológicas vistas no epitélio interno, como a ausência de diferenciação entre
epitélio juncional e sulcular. Os aumentos de volume gengival em ratos se
mostraram dependentes de um padrão inflamatório bem estabelecido, mostrado
tanto pelo aumento do infiltrado inflamatório como pelo aumento da espessura e
altura gengival.
49
CONCLUSÕES
- A presença de nifedipina por si só não acarretou um aumento de volume genvival;
- A presença de nifedipina levou a discretas alterações histopatológicas,
representadas pela ausência de diferenciação entre epitélio juncional e sulcular;
- Os aumentos de volume gengival foram dependentes de um padrão inflamatório
bem estabelecido.
50
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54
ARTIGO I
55
Comparison of histometric and morphometric analyses of bone height in ligature-induced periodontitis
in rats
Marilene Issa Fernandes
1,2
Eduardo José Gaio
1
Rui Vicente Oppermann
2
Pantelis Varvaki Rados
2
Cassiano Kuchenbecker Rösing
2
1
Graduate students, Graduate Dentistry Program, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
2
Professors, Graduate Dentistry Program, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, Brazil.
Running title: Bone height in periodontitis in rats
Author responsible for correspondence:
Marilene Issa Fernandes
Avenida Getúlio Vargas, 1570/202
90150-004 Porto Alegre – RS - Brazil
Key words:
alveolar bone loss, experimental models, histometric analysis, morphometric analysis
Aceito para publicação no Brazilian Oral Research.
56
ABSTRACT
Objective: To compare histologic and morphometric procedures of bone height measurement.
Background: Microscopic measurements are the most frequent method in periodontal studies with
animals, but have limited capacity to identify bone levels associated with both healthy tissues and
periodontal disease.
Methods: Ligatures were placed in maxillary left second molars of 10 male 60-day-old Wistar rats for
30 days. Left and right maxillary sides of 5 rats were processed for histologic analysis (H), sectioned
buccolingually, and stained with HE. The maxillae of the other 5 rats were defleshed and used for
morphometric analysis (M). Histometric measurements from the cementoenamel junction to the bone
crest were performed. Standardized photographs were used for morphometric analysis. T tests were
used for dependent or independent samples (α=0.05%).
Results: Distances from cementoenamel junction to bone crest were 0.95±0.25 and 1.07±0.30 for the
H and M. Buccal measurements were 0.92±0.16 and 1.08±0.35 for H and M. Values obtained using the
H and M for areas without ligatures were 0.44±0.15 and 0.47±0.11 mm for lingual measurements and
0.23±0.008 and 0.41±0.10 for buccal measurements.
Conclusion: No significant differences were found between the two methods in the detection of bone
height differences associated with the placement of ligatures in rats.
57
INTRODUCTION
Rats have been used in periodontal disease studies (1-5) because their periodontal tissue
structure in the molar region is similar to that of human beings (6). Moreover, rats can be kept in
germfree conditions (7,8) and have their immunologic capacity compromised (9), which makes them
an attractive model for better understanding of the pathogenesis of periodontal diseases.
Several methods have been used to evaluate periodontal bone loss in rats. Studies have
described lesions macroscopically (10-12), histologically (13-15) or radiographically (3,10,11). The
histologic method is the criterion standard currently, but has drawbacks, especially because the pattern
of bone resorption in periodontitis is not uniform (4,16). In addition, problems during histologic
processing, difficulties in carrying it out, its high cost and high time demands are well-known
disadvantages of histologic analyses. However, histologic sections can be used not only for the
investigation of alveolar bone loss, but also for other studies, such as loss of attachment (17),
inflammatory infiltrate (18), tissue characteristics such as collagen type (19), and immunohistochemical
analyses (20)
Differences in bone resorption may be important for the evaluation of the methods under
investigation in this study. As bone loss is one of the outcomes of periodontal disease, the
development of an alternative method to determine the exact anatomy of bone defects is necessary.
Therefore, this study compared the measurement of bone height in healthy and diseased periodontal
tissue using histologic sections and morphologic analysis of dry bone.
METHODS
Animal Model
Ten male 60-day-old Wistar rats weighing 250 to 350 grams were used. The rats were kept in
plastic cages and received food and water ad lib. The animals were kept in a gnotobiotic environment
in the Biomedical Sciences Institute of Universidade Federal do Rio Grande do Sul. This study was
58
approved by the Ethics Committee of the School of Dentistry, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, Brazil.
Experiment For the placement of ligatures (3-0 cotton suture) to induce bone loss, the animals
were anesthetized with IM administration of ketamine hydrochloride and xylazine hydrochloride.
Ligatures were placed in the maxillary left second molar (test side) and were kept for 30 days.
Contralateral teeth, without ligatures, were used as controls. Rats were euthanized by cervical
dislocation. Maxillae were removed and sectioned medially.
Specimen preparation and histologic analysis
Ten maxillary sides (test and control sides) were fixed in 10% buffered formalin for 48 hours.
The specimens were kept in 20% sodium citrate-50% formic acid solution for 40 days for
decalcification. The decalcified specimens were individually neutralized in sodium bicarbonate and
prepared for histologic analysis. The specimens were embedded, and three 3-µm buccolingual
sections (RM2155 Microtome, Ernst Leitz® - Germany) from the maxillary second molar area (21)
were obtained from each specimen. The sections were stained with HE (22).
The criterion for inclusion of slides was the presence of a portion of root, epithelial tissue and
bone crest in the same section. Images of these sections were captured by a 4-megapixel digital
camera (Nikon® Coolpyx) at 50X magnification. A calibrating microscopic scale (E. Leitz® Wetzlar)
was photographed together with the section to be used for conversion of measurement results. An
observer, blinded to the group to which the slide belonged, used the ImageTool® software to obtain 3
linear measurements from bone crest to cementoenamel junction (CEJ) at the buccal and palatal root
of the second upper molar. The longest measure was selected for the analysis of results (Figure 1).
Specimen preparation and morphologic analysis
Ten maxillary sides (test and control sides) were defleshed after immersion in 8% sodium
hypochlorite (Qboa®) for 4 hours. The specimens were washed in running water and immediately dried
59
with compressed air. To outline the CEJ, 1% methylene blue was applied to the specimens for 1
minute. Photographs were obtained with a 6.1-megapixel digital camera (Nikon® D100) on a tripod to
keep the camera parallel to the ground at the minimal focal distance. The specimens were fixed in wax
and kept with their occlusal plane parallel to the ground and their long axis perpendicular to the
camera. Photographs of the buccal and lingual aspects were made. To validate measurement
conversions, a millimeter ruler was photographed together with all specimens. The ImageTool®
software was used by an observer blinded to the group to which the slide belonged to obtain 3 linear
measurements from the bone crest to the cementoenamel junction (CEJ). The longest measure was
selected for the analysis of results (Figure 2).
Statistical analysis
Mean (± standard deviation) distances from the CEJ to the bone crest were obtained for the
test and control sides of the maxillae analyzed by both the histologic and morphometric methods. For
intragroup morphometric or histologic analysis, the measure of the ligature sides and the sides without
ligatures were compared with a t test for paired samples. For the analysis between groups, comparing
morphometry with histology, the test and control sides were compared with a t test for independent
samples. Significance level was established at α = 0.05.
RESULTS
Results are shown in Figure 3 and Table 1. In all the buccal and lingual areas evaluated by
histometric and morphometric analyses, ligatures generated a greater alveolar bone loss, and
differences were statistically significant (t test for paired samples; p<0.05).
Table 1 compares the histometric and morphometric methods. The lingual areas of teeth with
or without ligature and the buccal areas of teeth with ligatures showed no significant differences
between methods (t test for paired samples; p>0.05). However, a mean value (± standard deviation) of
60
0.23 (± 0.08) for the buccal area of teeth without ligature was found in the histometric analysis. This
result was statistically different from the mean obtained for corresponding areas when the
morphometric method was used (0.41 ± 0.10).
DISCUSSION
This study compared two methods - histometry and morphometry - to evaluate ligature-induced
alveolar bone loss in Wistar rats. As different forms of bone loss evaluation have been reported in
literature, the purpose of this study was to develop a reliable study method.
Histologic evaluation is the standard method used in most studies. Susin & Rösing (23) used
Wistar rats and evaluated bone height histologically in a linear procedure; they used the interproximal
space of first and second molars and measured the distance from the CEJ up to the apical-most point
of the bone crest. Nociti et al. (13) and Nogueira-Filho et al. (24) used histology to measure bone loss
area (mm
2
) in first molar furcation of Wistar rats.
Other forms of bone loss evaluation have been used recently. Rivaldo et al. (25) used
defleshed mandibles of Mus domesticus rats to evaluate changes in bone height and measured bone
loss as the exposed root surface area (mm
2
) in first and second molars. Bone loss was measured as
follows: mesially, a line from CEJ to the bone height in the mesial root of the first molar, and distally, a
line for the CEJ to the bone crest of the distal root of the second molar; coronally, to the apical-most
portion of the CEJ, and apically, to the apical-most point of the bone crest. Kuhr et al. (26) evaluated
ligature-induced bone loss in defleshed mandibles of rats using two methods. In one method, the
distance from the CEJ to the bone crest was measured linearly in different sites; in the other, the
exposed root surface area was measured. Their study concluded that the method of measuring the
linear distance should be preferred to the method of area evaluation.
This study used 5 Wistar rats to evaluate induced bone loss and compare two methods:
histologic evaluation, measuring bone loss linearly (23); and morphometric evaluation, measuring bone
loss linearly in defleshed maxillae (26). The observer was previously trained to conduct the
61
measurements and was blinded to which experimental group the images belonged (27). The study and
control groups were used to compare the capacity of the induction method to generate alveolar bone
loss and to compare maxillae in which bone loss was induced using two different methods of analysis.
The main purpose of this study was the comparison of the histometric and morphometric
methods. Therefore, sections were buccolingual and not mesiodistal, differently from most studies
(14,28). Morphometric analysis used digital photographs of the buccal and lingual aspects of the dry
maxillae. The histometric analysis used histologic sections whose images were digitized for evaluation.
The results of this study showed that both methods are capable of detecting vertical periodontal bone
loss in test and control teeth. The statistically significant differences found between teeth with and
without ligatures in both methods demonstrated that the placement of ligatures generated bone loss,
which validates the use of ligatures in this study. Moreover, bone loss generated by ligatures was
found in both histometric and morphometric analyses (Figure 3).
The comparison between methods, however, revealed statistically significant differences
between the groups without ligature when the buccal surface was analyzed. No differences between
methods were found in the analysis of the other tooth surfaces (Table 1). Future studies should
investigate an explanation for this finding. However, the low values (mean = 0.23) found for the control
group (without ligature) in the histometric analysis of the buccal surfaces were substantially lower than
those reported for control groups in studies with rats in which the same distance was measured.
Moreover, the mean value for the group without ligature in the morphometric analysis was 0.41 mm,
similar to the values obtained in the histometric and morphometric analyses of the lingual areas. This
finding was discrepant with findings for the other groups in this study, and might have been caused by
an unwanted inclination of the histologic sections. Despite the care taken, such inclination may have
generated an occlusal image of alveolar bone crest. This is one of the problems of histometry,
particularly when maxillae, for which parallel positioning may be difficult to obtain, are the object of
investigation. The concomitant use of morphometric analysis may mitigate such effect. However, this
objective limitation of histometric measurements of ligature-induced alveolar bone loss in rats should
62
not preclude its use. Other positive characteristics of histologic analysis should be explored, such as
the possibility of identifying cell elements and components of soft tissue.
This study contributed to the understanding that the use of morphometric analysis may be an
alternative to histometric evaluations because it is faster, easier and less expensive, particularly when
the only purpose of the study is to measure bone loss. Both methods are capable of detecting ligature-
induced differences in bone height in rats.
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65
Figure 1 – Histologic analysis: linear measurement from bone crest to cementoenamel junction.
Figure 2 – Morphometric analysis: linear measurement from bone crest to cementoenamel junction.
66
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Buccal
histometry
Buccal
morphometry
Lingual
histometry
Lingual
morphometry
mm
Without ligature
With ligature
Figure 3 – Comparison between histologic and morphologic methods for buccal and lingual areas with
and without ligatures. *Statistically significant different mean values between teeth witch and without
ligatures – paired simple t test.
Table 1 – Comparison between histologic and morphologic methods for buccal and lingual areas with
and without ligatures
* statistically significant difference between Histometry and Morphometry (t test for independent
samples)
Buccal with
ligature
Lingual with
ligature
Buccal without
ligature
Lingual without
ligature
Histometry
0.92 +
0.16 0.95 + 0.25 0.23 + 0.08* 0.44 + 0.15
Morphometry
1.08 +
0.35 1.07 + 0.30 0.41 + 0.10* 0.47 + 0.11
*
*
*
*
67
ARTIGO II
68
Microscopic qualitative evaluation of fixation time and decalcification media in rat
maxillary periodontium
Avaliação microscópica qualitativa do tempo de fixação e meios de descalcificação do
periodonto de ratos
Marilene Issa Fernandes, DDS, MSc*
Eduardo José Gaio, DDS***
Cassiano Kuchenbecker Rösing, DDS, MSc, PhD *
Rui Vicente Oppermann, DDS, PhD *
Pantelis Varvaki Rados, DDS, MSc, PhD
ABSTRACT: The rat model is widely used in periodontal research and quality of
histological sections is essential. The purpose of this study was to evaluate
histological characteristics of periodontal tissues in Wistar rat maxillae, with different
times of fixation and decalcified by nitric acid (NA) or formic acid (FASC). 15 rats were
used. Fixation was performed for 24, 48 and 72 hours, hemi-sectioned and each part
decalcified in NA for 7 days or FASC (Anna Morse solution) for 35 days. A trained and
blinded examiner performed the evaluation. 48
* Professor of Periodontology, Faculty of Dentistry, Federal University of Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, Brazil
** Professor of Oral Pathology, Faculty of Dentistry, Federal University of Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, Brazil
***Post-graduate student, Faculty of Dentistry, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Brazil
Aceito para publicação no Brazilian Oral Research.
69
hours of fixation and decalcification with FA showed more clear characteristics at
epithelium- connective tissue interface and in periodontal
structures. Mean measurements between the cementum-enamel junction and the
bone crest varied from 176,5(± 60,45) to 210,94(± 39,33) pixels and in the buccal
aspects from 199,69(± 38,33) to 298,55(± 70,81) pixels in the palatal sections, with no
statistically significant differences (ANOVA, α=0.05). In the same fixation period,
decalcification with NA or FA did not display any statistically significant differences.
It may be concluded that for the qualitative histological analysis, fixation should
preferably be for 48 hours and the demineralization by FA. For the histomorphometric
analysis the decalcification solution does not interfere in the results.
DESCRIPTORS: Dental research; Oral histology; Periodontal.
RESUMO: O modelo rato é extensamente usado na pesquisa periodontal e a qualidade dos
cortes histológicos é essencial. A proposta deste estudo foi avaliar as características
histológicas dos tecidos periodontais nas maxilas de ratos Wistar, em diferentes períodos de
fixação e descalcificação pelo ácido nítrico (AN) ou pelo ácido fórmico (AF). Quinze ratos
foram usados. A fixação foi realizada nos períodos de 24, 48 e 72 horas. As maxilas foram
divididas e parte foi descalcificada em AN durante 7 dias e parte com AF (solução de Anna
Morse) por 35 dias. Um examinador treinado e cegado executou a avaliação. Quarenta e oito
horas de fixação e descalcificação com AF mostraram claras características na interface
epitélio-conjuntivo, assim como nas estruturas periodontais. As médias, por vestibular, entre a
70
junção cemento-esmalte e a crista óssea nos diferentes tempos experimentais variaram entre
176,5(± 60,45) e 210,94(± 39,33) pixels, e nas faces palatinas entre 199,69(± 38,33) e
298,55(± 70,81) pixels, sem nenhuma diferença estatisticamente significativa (ANOVA,
α=0.05). Não houve diferenças significativas intra-grupo para os diferentes períodos de
fixação. Pode-se concluir que, para a análise histológica qualitativa, a fixação deve ser
preferivelmente em 48 horas e a desmineralização por AF. Para a análise histo-morfométrica a
solução descalcificadora não interferiu nos resultados.
DESCRITORES: Histologia oral; Periodonto; Pesquisa odontológica.
INTRODUCTION
Animal models are used to investigate events associated with periodontal diseases.
Wistar rats are utilized as an experimental model due to their similar characteristics to humans
as well as to their similar patterns of periodontal disease development, mainly in the molar
region
5,7,12
.
Studies reporting periodontal disease in animals are not standardized regarding
histological procedures such as fixation time, decalcification and type of decalcification
substances used. The fixation time of the histological specimens vary, and pre-
established evaluation criteria are not presented, especially concerning the
relationship between the fixation method and decalcification. Nishikawa et al.
10
, used
10% neutral buffered formalin in 20-day-old rats for 48 hours, not informing which
decalcification method was used. Chiu et al.
3
used 10% formalin and 5% chloridric
71
acid for decalcification, not specifying the time periods. Shimizu et al.
14
did not state
the fixation period neither which decalcifier was used.
It is important to point out that the fixation time and decalcifying agent used are
relevant to the quality of the histological sections and, consequently, to the accuracy of
the research results. It is necessary that the sections preparation process be also
efficient without loss of quality. Thus, Stevens et al.
15
reported that the fixation process
involves a series of chemical events that differ depending on the tissues to be
preserved, and have as the main objective to avoid autolysis of the specimens. The
use of the decalcifying agent depends on four factors: the urgency of the case,
mineralization stage, the aim of the research and the staining technique to be used.
All acids somehow affect tissue stability. This is dependent on the solution acidity and
the time it will take to decalcify. Thus, the quicker the decalcifications the greater will
the injury and its effects on H/E
15
. Correa et al.
4
reported that the decalcification
process causes important molecular and morphological alterations in the tissues such
as edema, vacuolation and ruptures not attributable to the pathologic condition.
Decalcifying agents are divided into strong and weak acids and chelators. The
choice will depend on the way the agent affects cell elements. Small specimens can
rapidly be demineralized; however, with the purpose of removing the calcium from the
center of the specimens, the superficial portion will be in contact with the acid for
longer periods of time. This might lead to the distortion of the specimens, reducing
stability and affecting staining, especially with eosin
15
.
Anna Morse solution, composed of 50% formic acid and 20% sodium citrate
apparently has shown the best decalcification results. The cell elements are practically
72
not affected, and the staining looks as if the tissues had not been submitted to the
decalcification process. Frequent alterations such as the tendency to cellular edema,
caused by formic acid, can be minimized by using sodium citrate
1
.
Quantitative and qualitative analyses are used when examining periodontal
specimens. Measurement of bone loss and attachment as well as the analysis of the
sulcular epithelium characteristics, junctional epithelium, presence of inflammatory
infiltrate, verification of the blastic and clastic cells require a histological evaluation of
utmost quality, standardized and reproducible
6
.
Considering the need to optimize results with the fixation and decalcification of the
specimens, the aim of this study was to evaluate the histological characteristics of the
periodontal tissues in Wistar rat maxillae by comparing different fixation times associated with
the decalcification of the specimens by means of 5% nitric acid or Anna Morse solution (50%
formic acid + 20% sodium citrate)
1
.
MATERIALS AND METHODS
Fifteen 60-day-old male Wistar rats were used. They were sacrificed by cervical
displacement; the maxillae were removed and fixed in 10% buffered
formalin for 24, 48 and 72 hours. Following sectioning of the maxilla on the mediun line half-
maxilla was be decalcified by 5% nitric acid for 7 days while the other half was decalcified in
Anna Morse solution for 35 days. The specimens, around 4mm
2
were immersed in single vials
with 15mL of acid and maintained at room temperature of around 21°C. The acid solution
was changed every 24 hours, without any adjunct as vaccum agitation or heating. The
decalcification process was monitored radiographically (Dabi Atlante®, Ribeirão Preto,
73
Brazil) and by means of an explorer. Daily, the specimens were tested with a hystotogic
needle. The decalcified specimens were each submitted to the neutralization process with
sodium bicarbonate (buffered solution for 1 hour) and then submitted to a histological
processing which comprised sequentially four immersions in 95% alcohol (Pró-Cito®, Porto
Alegre, Brazil) (80-minutes), one immersion in absolute alcohol (60-minutes), three
immersions in xylol (Pró-Cito®, Porto Alegre, Brazil) (80-minutes) and two immersions in
liquid paraffin (Biotec®, Porto Alegre, Brazil) at 60
o
C (120 minutes each), and at last
embedment in paraffin.
Care was taken during embedment so that the mesial aspect of the first molar faced the
block section plan. 3µ thick sections were sliced in a microtome (E. Leitz®, Wetzlar,
Germany) until reaching the second molar. From each block, three sections were chosen, after
each 20µ, evaluated by light microscopy, which should attend to the following criteria in order
to be included in the study: presence of the tooth with radicular and coronary portion,
cementum-enamel junction evident in at least one side, buccal or palatal, and identifiable bone
crest. The sections were mounted and submitted to two xylol immersions (10 minutes each),
dehydration with two absolute alcohol immersions (5 minutes each), hydration (1 minute) and
staining by means of Harris Hematoxylin (Pró-Cito®, Porto Alegre, Brazil) (2 minutes) and
eosin and fucsin (1 minute), sequentially followed by, quick dehydration by means of three
immersions in absolute alcohol (1 minute each) and diaphanization (clarifying process) carried
out in two xylol immersions (10 minutes each). Final mounting was carried out with the aid of
Entelan (Merck Sharp & Dohme®, São Paulo, Brazil)
9
.
Sections were analysed by two trained examiners blinded for fixation time and type of
decalcification. The analysis of the sections was performed in a optical microscope (Zeiss®,
74
Jena, Germany) (40x magnification) with the aim of evaluating: sulcular epithelium (intact or
not); cement dislocation (absent, present at cervical third, present at medium/apical third);
dentine demineralization (adequate or inadequate and whether coronal, cervical or apical);
bone demineralization (adequate or inadequate).
The measurement of the distance from the cementum-enamel junction to the most
coronal portion of the bone crest was carried out analyzing pictures in a transmitted light
microscope (Zeiss®, Jena, Germany), attached to a camera model TK – C 620 (JVC®,
Oyama, Japan) color video camera with the following specifications: standard NTCS signal
system, 1/3 inch picture, 479 horizontal lines resolution on TV, 380.00 pixels 771 (H) and 490
(V), CCD picture sensor that digitalized the pictures for the Picture Analysis and Processing
System - Imagelab® (Sausage, EUA), installed in a Unisys® computer (Univac, EUA).
Statistical Analysis
Differences in the variables described in the histological evaluation were tested using the
Wilcoxon test. ANOVA (α=0.05) was used to analyze differences in distance between the
cementum-enamel junction and the bone crest of the experimental groups.
RESULTS
The linear evaluation of the distance between the bone crest and the cementum-enamel
junction, measured in pixels, showed that for both nitric acid and Anna Morse solution,
regardless of experimental times, statistically significant differences were not observed for α =
0.05, when the buccal and palatal surfaces were compared (Table 1).
75
Table 2 shows the situation of the acellular cement after decalcification by Nitric Acid
and Anna Morse in the different fixation times in 10% buffered formalin. No dislocation in the
cervical, or in the apical and medium portion was observed. The lowest rates of dislocation
occurred in the 48-hour fixation period, especially when it was performed by Anna Morse
solution. Under such conditions, 73.3% of the samples did not present any displacement;
however, when nitric acid was used for the same experimental period, only 23.1% did not
present dislocation.
Table 3 shows the dentine demineralization pattern, in percentage values, using nitric acid and
Anna Morse in the different fixation times in 10% buffered formalin. The results showed a
variety of situations in the different stages of the experiment, for different decalcifiers, which
did not follow a pattern. Forty eight hours was found to be the best time for nitric acid, where
38.5% of the samples were considered adequate, whereas for Anna Morse solution the fixation
time did not present an established pattern.
The descriptive microscopic evaluation of the histological sections showed more
uniformity in staining and better differentiation between the epithelial and connective tissues
when a 48-hour fixation period and Anna Morse solution
decalcification were used. At 24 hours and 72 hours periods for both nitric acid and Anna
Morse solution tissues were less preserved and affinity to eosin and hematoxylin was
diminished.
When the histological processing patterns were analyzed, it was noticeable that the best results
obtained regarding the integrity of the sulcular epithelium were found in the 48-hour fixation
period (Graphic 1).
76
Analysis of jaw bone decalcification pattern revealed that the best decalcification
conditions were at 48-hours of fixation. Nitric Acid, in that period of time, showed the best
results for demineralization (Graphic 2).
DISCUSSION
The understanding of pathogenesis of periodontal diseases is based in microscopic
studies in animal models. The aim of this study was to standardize histotechnical procedures in
order to minimize possible bias in this experimental phase. Our discussion, thus, is associated
to microscopic quality observation of tissues involved in periodontal disease.
It is important for histological analysis that the sections are obtained with the least
alterations during the entire process. However, medular and trabecular bones, and the tooth
hard tissues (dentine and enamel) have different mineralization patterns. Often, epithelial and
connective tissues are altered by long expositions to acids leading to degeneration. Frequently,
on trying to obtain a good histological result for the calcified tissues, damage to the soft
tissues, are observed. On the other hand, when the soft tissue is adequately preserved and the
specimen is not completely decalcified, it is difficult to fulfill the requirements for the
simultaneous analysis of mineralized and non-mineralized tissues. Fixation and decalcification
techniques are routine practices in laboratories. However, in general, this routine is not
questioned with regards to modifications leading to a better quality of the sections.
Studies performed in animals involving hard and soft tissues are frequently
published
2,11,13
. Without details concerning the histological processing, making this kind of
discussion difficult in the literature.
77
It is known that the aim of fixation is to preserve tissues from autolysis and bacterial
attack; also shape and volume should not be altered
8
. Among the main factors involving tissue
fixation are temperature, penetration and duration. The temperature used during fixation in a
histochemical process is the traditional room temperature; in warmer locations this process
occurs more rapidly. The penetration phenomenon occurs relatively slowly and depends on the
kind of tissue and size of specimens. Fixation time is of utmost importance in the histological
process. Long periods of exposure of the specimens to the fixation agent can cause significant
damage, such as oxidation, degeneration, tissue hardening and shrinking
8
.
The present study was carried out in a location where the average room temperature
was about 21°C and a 24-hour routine fixation time was observed. The material comprises soft
and hard tissues of about 120mm
3
. In this study, three fixation periods were evaluated: 24, 48
and 72 hours. The period where best results were obtained, both for soft and mineralized
tissues, was 48-hours. During this period, both epithelial and connective tissues presented
adequate staining.
The decalcifying agents, classified in strong and weak, are influenced by a series of
factors. Among the most important, chemical substances concentration, temperature and
agitation. Strong acids - commonly used in diagnostic urgencies - have a high free hydrogen
ions concentration. They provoke significant alterations in the soft tissues, especially the cells.
Moreover, important damages can be observed depending on the quality of the histochemical
technique employed. The decalcification process can be accelerated by increasing the medium
temperature and agitation. It is important to point out that all decalcification processes cause
some sort of damage to the specimens
4,8
. In our study, staining was performed in different
timing always with frost solutions.
78
CONCLUSION
In the present study, we tried to evaluate the histological outcomes of the different
fixation periods in 10% formalin using two decalcifying solutions: one strong, nitric acid, and
the other weak, Anna Morse solution. It was possible to observe, regarding the distance
between the cementum-enamel junction and the bone crest that both acids kept the mineralized
structures without significant alterations. For the histometric analysis, the fixation time and
decalcifying solution used did not alter the results. However, for the qualitative histological
analysis, fixation should preferably be of 48-hours, and demineralization by Anna Morse
solution.
Table 1 - Mean value (standard deviation), in pixels, of the distance between the bone crest and the cementum-
enamel junction, in buccal and palatal surfaces for the different fixation periods, and decalcification.
Fixation Time
Decalcification
24 hours
48 hours
72 hours
p
Nitric acid Buccal
205.99 (34.20) 210.95 (39.33) 176.59 (60.45) 0,496
Anna Morse Buccal
205.21(54.77) 200.77 (45.78) 186.12 (35.73) 0,794
Nitric acid Palatal
199.69 (38.34) 254.14 (66.50) 248.83(38.71) 0,202
Anna Morse Palatal
231.39(46.55) 268.69 (69.26) 298.55 (70.82) 0,280
79
Table 2 - Frequency distribution of cement dislocation.
Table 3 - Dentine demineralization pattern (percentage) by means of nitric acid and Anna Morse in the different
fixation times in 10% buffered formalin.
Fixation time
Cementum dislocation
24 hours
Nitric acid / A. Morse
48 hours
Nitric acid / A. Morse
72 hours
Nitric acid / A. Morse
Absent 0 53.3 23.1 73.3 6.7 66.7
Cervical Third 40 13.3 38.5 6.7 33.3 13.3
Apical/Mid third 60 33.3 38.5 20 60 20
p 0,006 0,015 0,014
Fixation time
Dentine demineralization
24 hours
Nitric acid/A. Morse
48 hours
Nitric acid/A. Morse
72 hours
Nitric acid/A. Morse
Adequate
6.7 26.7 38.5 13.3 0 33.3
Coronary inadequate
33.3 20 23.1 40 6.7 6.7
Coronary/cervical
Inadequate
20 46.7 7.7 13.3 40 6.7
Coronary/cervical/apical
Inadequate
40 6.7 7.7 33.3 53.3 53.3
p
0,094 0,837 0,510
80
Graphic 1 - Conditions of the sulcular epithelium (intact or not), after decalcification with nitric acid and Anna
Morse in the different fixation times in 10% formalin.
Graphic 2 - Bone demineralization pattern after decalcification with nitric acid and Anna Morse in the different
fixation times in 10% formalin.
0
20
40
60
80
100
24 hours 48 hours 72 hours
Fixation time
Sulcular epithelium characteristics
Intact Nitric Acid
Intact Anna Morse
Non-intact Nitric Acid
Non-intact Anna Morse
Adequte bone desmineralization
0
20
40
60
80
100
24 hours 48 hours 72 hours
Nitric acid
Anna Morse
81
REFERENCES
1. ANNA MORSE MS. Formic acid-sodium citrate decalcification and butyl
alcohol dehydration of teeth and bones for sectioning in paraffin. J Dent Res
1945;24:143-53.
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phosphatidylserine containing liposomes alter the steric stabilization properties of poly
(ethylene glycol). Biochim Biophys Acta 2001;9;1510(1-2):56-69.
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induced gingival overgrowth? An experiment in rats. J Periodontol
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em material submetido a agentes descalcificadores. In: XV Salão de Iniciação
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Available from:
http://iadr.confex.com/iadr/brazil04/preliminaryprogram/abstract55977.htm
7. HEIJL L, WENNSTRÖM J, LINDHE J, SOCRANSKY SS. Periodontal disease in
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82
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th
ed. New York: Churchill
Livingstone; 1996. p.309-39.
83
ARTIGO III
84
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA NIFEDIPINA SOBRE OS TECIDOS PERIODONTAIS
DE RATOS WISTAR
Marilene Issa Fernandes*
Eduardo José Gaio***
Cassiano Kuchenbecker Rösing *
Rui Vicente Oppermann*
Pantelis Varvaki Rados**
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ação da nifedipina, sobre os
aumentos de volume gengival em ratos Wistar em periodontite induzida. O estudo
envolveu cinqüenta ratos Wistar, divididos em 6 grupos. Dois grupos com saúde
periodontal receberam administração diária 50mg/kg/dia de soro fisiológico, e outro
com nifedipina 50mg/kg/dia, via sonda gástrica. Os grupos teste foram submetidos a
modelo experimental de periodontite induzida por ligadura, receberam diariamente
50mg/kg/dia de soro fisiológico ou nifedipina 10, 50 e 100 mg/kg/dia, via sonda
gástrica. O processo saúde/doença periodontal foi avaliado pelos descritores
etiológicos, inflamatórios e de destruição. Na ausência de ligaduras, foram
observadas somente alterações histopatológicas, mas não aumento de volume
gengival. Os ratos com ligadura, que receberam nifedipina 50 mg/kg/dia, mostraram
na avaliação histológica, uma transformação significativa da margem gengival em
uma estrutura de formato retangular. A área total do tecido conjuntivo e a área de
conjuntivo inflamado se mostrou maior estatisticamente significativa, assim como a
altura gengival e espessura gengival, caracterizando, desta forma
*Professor de Periodontia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil.
**Professor de Patologia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
***Aluno do Programa de pós-graduação, Faculdade de Odontologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
85
não somente alterações histopatológicas, mas também um aumento de volume.
Assim concluímos que a presença de nifedipina por si só não acarreta um aumento
de volume gengival em ratos. Nessa situação, observamos discretas alterações
histopatológicas. Os aumentos de volume gengival em ratos se mostraram
dependes de um maior acúmulo do biofilme, associados com um padrão inflamatório
bem estabelecido.
INTRODUÇÃO
O aumento de volume gengival como um efeito adverso do uso de nifedipina
foi pioneiramente descrito por Lederman, Lumerman et al. (1984). Nesse relato de
caso, os tecidos lembravam clínica e histologicamente a hiperplasia induzida por
fenitoína. O aumento de volume gengival foi observado entre um e dois meses após
o início da utilização da droga e uma parcial resolução do quadro foi vista com a
interrupção do uso.
Um modelo experimental em ratos, com a administração de drogas como a
nifedipina, induziu a um aumento de volume gengival macroscópico em um período
de 20 a 30 dias, alcançando um máximo de crescimento em 40 dias, que regrediu
espontaneamente com a descontinuidade da droga. Tratamentos longos não
resultam em maior aumento de volume gengival. Avaliação histológica mostrou um
severo infiltrado inflamatório nos tecidos gengivais de ratos infectados (Nishikawa,
Nagata et al., 1996).
Histologicamente, o tecido epitelial gengival associado com nifedipina
apresentou marcada hiperplasia, com longas cristas epiteliais no epitélio sulcular,
sem alterações no epitélio juncional. O tecido conjuntivo, em ratos, mostrou densa
substância intercelular fibrosa, associada a um infiltrado inflamatório na porção
subepitelial (Morisaki, Kato et al., 1993; Nishikawa, Nagata et al., 1996). As
alterações epiteliais e conjuntivas se mostraram mais relacionadas com a severidade
do aumento de volume gengival do que com o uso de nifedipina (Spolidorio,
Spolidorio et al., 2002).
86
Os mecanismos associados com aumento de volume gengival que melhor
explicam sua ocorrência e distribuição apontam para um modelo multifatorial.
A presença do biofilme é reconhecida pelo sistema de classificação das
doenças periodontais como um co-fator associado à etiologia dos aumentos de
volume gengival (Fu, Nieh et al., 1997). No entanto, a presença do biofilme e
inflamação gengival por si sós não explicam esta condição. Morisaki, Kato et al.
(1993), observaram, em ratos Fischer, que a nifedipina levou a um aumento de
volume gengival tanto na presença como na ausência de inflamação gengival e
biofilme dental, embora esses fatores estivessem associados com um maior efeito da
droga. A altura gengival, também considerada um descritor inflamatório, se mostrou
maior no grupo com nifedipina, achados esses que concordam com o estudo de
Ishida, Kondoh et al., 1995. Nestes estudos, a profundidade de sondagem foi
avaliada clinicamente, sob um microscópio estereoscópico, utilizando uma película
de slide com faixas coloridas impressas com o objetivo de mimetizar uma sonda
periodontal. É importante observar que as medidas de profundidade de sondagem
podem ser alteradas por diferentes fatores, como situação inflamatória dos tecidos,
posição e inclinação da sonda, tipo da sonda e força de sondagem, além do
treinamento e calibragem do examinador (Bulthuis, Barendregt et al., 1998; Garnick e
Silverstein, 2000). Somado a isto cabe lembrar o diminuto tamanho da união dento-
gengival de ratos.
A influência da nifedipina sobre a evolução da periodontite em ratos foi
avaliada. Os resultados histométricos foram realizados quantificando o volume de
perda óssea na região da bifurcação, não sendo observadas diferenças significativas
entre os grupos (Gonçalves, Nogueira Filho et al., 2003). Morisaki, Kato et al. (1993)
em uma análise histológica descritiva não observaram perda óssea ou de inserção.
Nesses estudos, a sistemática de avaliação dos descritores inflamatórios e de
destruição não foram utilizados considerando os critérios atuais de diagnóstico e
pesquisa em periodontia. A sistemática usual de determinar perda óssea está
associada com a distância da junção amelo-cementária a crista óssea, e não com o
volume ósseo na área da furca. Também uma descrição histológica não basta para
87
avaliar níveis de inserção ou ósseo, principalmente na ausência de um cegamento do
examinador.
Desta forma, considerando a necessidade da determinação dos descritores
da doença, associados tanto com a etiologia como com a situação inflamatória e de
destruição dos tecidos periodontais, se faz necessário reavaliar os aumentos de
volume gengival de forma sistemática, de acordo com padrões atuais de diagnóstico.
Assim, o propósito do presente estudo foi estabelecer qual a repercussão
histopatológica da nifedipina em situação de saúde e periodontite sobre o processo
saúde/doença baseado em descritores que claramente avaliem o efeito da nifedipina
sobre os tecidos periodontais.
MATERIAL E MÉTODO
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Para a
realização deste estudo, foram utilizados 50 ratos Wistar machos, com 60 dias de
idade e peso variando entre 144 e 170g no momento experimental.
Os animais foram divididos em 6 grupos que receberam ração padronizada e
água ad libitum. Dois grupos, com dez ratos cada, foram considerados controle. Um
grupo com administração diária 50ml/kg/dia de soro fisiológico, e outro com
nifedipina 50mg/kg/dia (Gonçalves, Nogueira Filho et al. 2003), via sonda gástrica.
Os grupos teste foram submetidos a modelo experimental de periodontite induzida
por ligadura (Cavagni, Soletti et al., 2005). Dez ratos receberam diariamente
50ml/kg/dia de soro fisiológico e outros dez receberam nifedipina 50mg/kg/dia
(Gonçalves, Nogueira Filho et al. 2003), via sonda gástrica. Para testar diferenças de
dosagem, para cinco ratos foi administrada nifedipina 10mg/kg/dia (Chiu, Fu et al.,
2001) e para outros cinco nifedipina 100mg/kg/dia, via sonda gástrica. Durante o
período experimental de 30 dias, a dosagem administrada foi ajustada semanalmente
de acordo com o peso.
Os ratos foram mortos em câmara de CO
2
e, imediatamente após as maxilas
foram removidas e fixadas em formalina tamponada 10%, por um período de 48
88
horas. Após fixação, as peças foram submetidas ao processo de descalcificação por
solução de Anna Morse (Citrato de Sódio a 20% + Ácido Fórmico a 50%) durante 40
dias aproximadamente (Anna-Morse, 1945). As peças descalcificadas foram
submetidas ao processamento histológico para inclusão em parafina. No momento
da inclusão, a face distal do segundo molar foi colocada paralela ao solo de forma
que ficasse perpendicular ao plano de corte do bloco. Os cortes foram realizados no
sentido vestíbulo/lingual, em micrótomo
********
com 5µm de espessura, até alcançar a
região contendo as raízes em seu longo eixo. Cada bloco deu origem a três cortes,
coletados a cada 20µm de avanço.
Análise histológica descritiva
A análise histológica descritiva foi realizada por dois examinadores em um
microscópio binocular óptico
††††††††
com aumento de 40 vezes. Foram avaliados o
aspecto do epitélio interno, juncional e sulcular, e o epitélio bucal e suas
características, como a presença de cristas epiteliais, ceratina, espaços intercelulares
e degeneração hidrópica. No tecido conjuntivo, a análise envolveu a presença de
alterações inflamatórias e celulares. A relação da base do epitélio juncional com a
junção amelo-cementária, o ligamento periodontal, cemento e osso alveolar também
foram observados.
Análise Histológica Quantitativa
Para a análise quantitativa, os cortes histológicos foram visualizados em um
microscópio óptico com aumento de 40 vezes. As imagens foram então digitalizadas
por meio de fotografias realizadas com uma máquina digital de 4 megapixels
‡‡‡‡‡‡‡‡
com distância focal de 4 vezes e velocidade de 1/60, acoplada à lente do
microscópio. Para fins de conversão dos resultados de medição, foi fotografada uma
********
RM2155, E. Leitz®, Wetzlar, Germany
††††††††
Zeiss®, Jena, Germany
‡‡‡‡‡‡‡‡
Nikon® Coolpyx, Ayuthaya, Thailand
89
escala microscópica calibradora
§§§§§§§§
de medida conhecida na mesma objetiva. Os
campos utilizados para esta avaliação respeitavam os seguintes critérios: presença
da porção coronária e radicular do segundo molar, junção amelo-cementária evidente
e crista óssea passível de identificação. Também o tecido epitelial sulcular, juncional
e bucal e tecido conjuntivo não deveriam ter alterações decorrentes do
processamento histológico.
Mensurações lineares e de área foram realizadas por um único examinador
que desconhecia a relação da lâmina com o seu grupo experimental. A área do
epitélio interno considerava a área do epitélio juncional de sua porção mais apical até
a porção mais coronária e marginal do epitélio sulcular, que claramente dividia a área
em epitélio interno e epitélio bucal. A área do epitélio bucal considerava a área mais
coronária do epitélio bucal que claramente dividia a área em epitélio bucal e epitélio
interno, se estendendo apicalmente até a altura correspondente à base do epitélio
juncional. A área do tecido conjuntivo gengival total considerava toda a área de
conjuntivo gengival até a porção mais apical do infiltrado inflamatório relacionada
com a base do epitélio juncional. A área de tecido conjuntivo inflamado correspondia
a toda a área de tecido conjuntivo gengival inflamado, apresentando alterações
vasculares e acúmulo de células inflamatórias. As medidas lineares realizadas foram
de perda óssea, correspondendo a distância da junção amelo-cementária até à crista
óssea, a espessura gengival foi da junção amelo-cementária até a porção mais
distante do epitélio bucal e a altura gengival da base do epitélio juncional até a
margem gengival.
- Análise Estatística
Os valores obtidos pela análise histológica quantitativa foram expressos
através de números absolutos, médias e desvio-padrão. A comparação estatística
entre as medidas de área e lineares dos tecidos gengivais dos diferentes grupos
experimentais foi realizada através do teste ANOVA, com 5% de significância. A
§§§§§§§§
E. Leitz®, Wetzlar, Germany
90
significância estatística foi corrigida para múltiplas comparações usando o método de
Bonferroni.
RESULTADOS
No grupo com ligadura, um rato foi excluído em decorrência de um seqüestro
ósseo junto à margem gengival, ficando este grupo com nove ratos. O grupo ligadura
com nifedipina 50mg/kg/dia, perdeu um rato devido ao processamento histológico da
peça o que também ocorreu no grupo ligadura com nifedipina 10mg/kg/dia.
Análise histológica descritiva
Na avaliação microscópica (Figura 1) o grupo experimental controle com
nifedipina 50mg/kg/dia, mostrou em quatro de nove animais um epitélio interno mais
espesso não permitindo uma diferenciação obvia entre epitélio juncional e sulcular. O
epitélio juncional se manteve com a base na junção amelo-cementária. O grupo com
ligadura mostrou em todos os animais perda de inserção microscopicamente, já que
a base do epitélio juncional se encontrava em posição apical à junção amelo-
cementária. O epitélio da bolsa mostrava papilas coriais em pontos variáveis da sua
extensão e sinais de degeneração hidrópica. Outro detalhe a ser ressaltado foi o
aumento da espessura da camada de ceratina em relação aos grupos controle e
controle com nifedipina 50mg/kg/dia. O epitélio bucal apresentava cristas epiteliais
mais longas quando comparado aos grupos anteriores. O infiltrado inflamatório
crônico se estendia de maneira mais difusa no conjuntivo gengival. Os ratos com
ligadura que receberam nifedipina 50mg/kg/dia tiveram como característica
morfológica mais significativa a transformação da margem gengival em uma estrutura
de formato retangular com a criação de um “plateau” de tecido. Essa mudança do
formato gengival se deveu principalmente ao crescimento do tecido conjuntivo. Este
tecido apresentava infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário mais concentrado na
vertente interna da bolsa, mas se estendendo até o epitélio bucal. O epitélio externo
apresentou projeções epiteliais abundantes e profundas.
91
O grupo com ligadura que recebeu nifedipina 10mg/kg/dia se apresentava
semelhante ao grupo com ligadura, enquanto que o grupo com ligadura e nifedipina
100mg/kg/dia foi semelhante ao grupo que recebeu 50mg/kg/dia, revelando as
características microscópicas de maneira mais extensa .
Figura 1 – Cortes histológicos corados com HE, dos grupos experimentais: grupos controle
com soro fisiológico e nifedipina 50 mg/kg/dia e grupos teste: ligadura com soro fisiiológico,
ligadura com nifedipina 50 mg/kg/dia, ligadura com nifedipina 10 mg/kg/dia e ligadura com
nifedipina 100mg/kg/dia.
Controle + soro fisiológico
Controle + nif 50mg/kg/dia Ligadura + nif 50mg/kg/dia
Ligadura + soro fisiológico
Ligadura + nif 10mg/kg/dia
Ligadura + nif 100mg/kg/dia
92
Análise histológica quantitativa
As medidas de área são semelhantes estatisticamente entre os ratos do grupo
controle que receberam ou não nifedipina 50mg/kg/dia (Tabela 1). Entre os ratos com
ligadura que receberam ou não nifedipina 50mg/kg/dia de peso, houveram diferenças
significativas em relação à área de epitélio interno, que para o grupo que recebeu a
medicação foi 57% maior. O tecido conjuntivo total teve um aumento de 70% em sua
área, enquanto que o tecido conjuntivo com infiltrado inflamatório mostrou um
aumento de 65%, sendo estas diferenças estatisticamente significativas. Assim, a
administração de nifedipina associada a uma acumulação de biofilme subgengival
levou a uma maior área de epitélio interno e tecido conjuntivo, associada com um
infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário. A área do epitélio bucal se mostrou
semelhante entre os dois grupos.
Grupos Epitélio interno Epitélio bucal
Conjuntivo
total
Conjuntivo
inflamado
Controle
18479,60 a
(5231,80)
31890,22 a
(9117,38)
38178,63 a
(11596,30)
8764,54 a
(2442,46)
Controle c/
nif 50mg/kg
16782,64 a
(4025,45)
31359,23 a
(8514,91)
38505,61 a
(10897,00)
7888,72 a
(1766,13)
Ligadura
37576,38 b
(11917,42)
54098,13 b
(18286,19)
82621,53 b
(29472,43)
26645,22 b
(7223,64)
Ligadura com
nif 50mg/kg
60798,50 c
(12036,67)
66014,44 b
(29780,29)
118213,00 c
(16341,34)
40510,53 c
(9632,50)
Tabela 1 – Média e desvio-padrão das medidas de área em µm
2
. Médias seguidas de letras
diferentes, entre os grupos com ou sem nifedipina (nif), mostram diferença estatisticamente
significativa.
93
As medidas lineares entre os grupos controle e controle com nifedipina
são semelhantes entre si (Tabela 2). Para os grupos ligadura e ligadura com
nifedipina 50mg/kg/dia pôde se observar diferenças significativas estatisticamente em
relação à altura gengival e espessura da gengiva. A altura gengival aumentou 75% e
a espessura gengival 80%. Em relação à distância entre a junção amelo-cementária
e a crista óssea, no grupo ligadura com nifedipina 50mg/kg houve uma maior perda
óssea, aproximadamente 18%, que estatisticamente foi semelhante entre os dois
grupos para esse período experimental.
Grupos
JAC / crista
óssea
Espessura Altura gengival
Controle
222,02 a
(29,51)
386,07 a
(54,42)
441,34 a
(58,98)
Controle c/
nif 50mg/kg
217,57 a
(26,96)
387,50 a
(65,20)
438,61 a
(68,02)
Ligadura
503,58 b
(122,46)
566,40 b
(96,26)
503,86 b
(122,19)
Ligadura c/
nif 50mg/kg
562,13 b
(55,44)
712,25 c
(81,39)
667,91 c
(90,96)
Tabela 2 – Medidas lineares e desvio-padrão em µm. Médias seguidas de letras diferentes,
entre os grupos com ou sem nifedipina (nif), mostram diferença estatisticamente significativa.
O gráfico 1 mostra a área do epitélio interno, epitélio bucal conjuntivo total e
conjuntivo inflamado. Foram considerados os grupos que receberam ligadura com
dosagens de nifedipina de 10mg/kg/dia, 50mg/kg/dia e 100mg/kg/dia, comparados
com o grupo ligadura. O epitélio interno aumentou sua área gradualmente dos grupos
94
com 10mg/kg/dia para 50mg/kg/dia, já a área na dosagem de 100mg/kg/dia ficou
semelhante ao grupo de 10mg/kg/dia. No entanto, o epitélio bucal manteve um
aumento gradual de acordo com a dosagem. A área do conjuntivo total variou entre
os grupos conforme a dosagem de nifedipina.
As medidas lineares, considerando os grupos que receberam ligadura com
dosagens de nifedipina de 10, 50 e 100mg/kg/dia, comparados com o grupo ligadura
são mostradas no gráfico 2. A distância da junção amelo-cementária até a crista
óssea aumentou em relação ao grupo ligadura e grupo ligadura com nifedipina
50mg/kg/dia, se mantendo estável em relação ao grupo ligadura com nifedipina
100mg/kg/dia. O mesmo ocorreu em relação à espessura e altura gengival.
95
Medidas de área
25000,00
50000,00
75000,00
100000,00
125000,00
Controle 10mg 50mg 100mg
Dose de Nifedipina
área (µm2)
epitélio interno epitélio bucal conjuntivo total conjuntivo inflamatório
Gráfico 1 – Medidas de área em µm
2
. Grupos controle e teste com ligadura e diferentes
dosagens de nifedipina.
Medidas lineares
200,00
400,00
600,00
800,00
Controle 10mg 50mg 100mg
Dose de nifedipina
Distância (µm)
JAC-crista espessura altura gengival
Gráfico 2 – Medida linear em µm, considerando os grupos controle e teste com ligadura e
diferentes dosagens de nifedipina.
96
DISCUSSÃO
Este estudo teve por objetivo avaliar a ação da nifedipina, administrada por via
oral, sobre os tecidos periodontais em ratos Wistar machos. Os resultados
mostraram que em uma gengiva clinicamente saudável a administração de nifedipina
por via oral, 50 mg/kg/dia, não desencadeou aumento de volume gengival. Por outro
lado, quando a periodontite foi induzida, e nifedipina administrada em uma dosagem
de 50mg/kg/dia, houve aumento de volume gengival visto pelo aumento na
espessura gengival, área de tecido conjuntivo e epitelial, além da altura gengival.
Estes resultados diferem daqueles descritos na literatura, pela sistematização
da avaliação dos descritores etiológicos, inflamatórios e de destruição que permitiram
mostrar o efeito da nifedipina sobre os aumentos de volume gengival de acordo com
os padrões atuais de diagnóstico periodontal.
Na avaliação histológica descritiva (Figura 1), este estudo mostrou que quatro
dentre os nove ratos, que receberam nifedipina 50 mg/kg/dia, apresentaram um
epitélio interno sem uma diferenciação óbvia entre epitélio juncional e sulcular,
caracterizado como discreta hiperplasia epitelial. Estes resultados histologicamente
são semelhantes a estudos que observaram tecido epitelial hiperplásico, com cristas
epiteliais longas no epitélio sulcular, sem alterações no epitélio juncional (Morisaki,
Kato et al., 1993; Kataoka, Shimizu et al., 2001; Shimizu, Kataoka et al., 2002).
Estas alterações histológicas não determinaram diferenças na área do epitélio
interno. No entanto, estudos que mediram, de forma linear e pontual, ou mesmo
visual, a espessura do tecido epitelial, encontraram diferenças estatisticamente
significativas (Morisaki, Kato et al., 1993; Kataoka, Shimizu et al., 2001; Shimizu,
Kataoka et al., 2002; Spolidorio, Spolidorio et al., 2002). Saito et al., 2002, também
observaram, em espécimes humanos, um aumento na espessura epitelial. As
diferenças entre os resultados se devem principalmente à forma de avaliação, pois
na maioria dos estudos não foi realizado cegamento do examinador quanto aos
grupos experimentais. Em outros, as diferenças de espessura são observadas
qualitativamente o que torna difícil uma comparação dos resultados.
97
A altura gengival, avaliada em cortes histológicos, nos ratos que receberam
nifedipina 50mg/kg/dia, não mostrou diferenças significativas. Morisaki, Kato et al.
(1993) e Ishida, Kondoh et al. 1995 avaliaram a profundidade de sondagem
clinicamente, sob um microscópio estereoscópico, e observaram diferenças
estatiticamente significativas. A comparação desses resultados com os do presente
estudo é limitada, pois os autores utilizam um modelo de mensuração da
profundidade de sondagem que pode ser alterado por diferentes fatores (Bulthuis,
Barendregt et al., 1998; Garnick e Silverstein, 2000).
O infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário no grupo que recebeu nifedipina 50
mg/kg/dia acompanhava paralelamente o epitélio interno, não ocorrendo diferenças
significativas na área do tecido conjuntivo total ou inflamado em relação ao grupo
sem nifedipina. Esses resultados são semelhantes a outros estudos em animais que
observaram poucas células inflamatórias no conjuntivo subepitelial. No entanto,
diferem em relação ao aumento de volume gengival que alguns estudos mostram ter
ocorrido mesmo na ausência de inflamação (Morisaki, Kato et al., 1993; Kataoka,
Shimizu et al., 2001). Estudos em humanos com aumento de volume gengival, pela
administração de nifedipina, mostraram graus variáveis de infiltrado inflamatório, não
relacionando com a situação periodontal (Barak, Engelberg et al., 1987).
No presente estudo, as maiores alterações foram observadas entre os grupos
onde a periodontite foi induzida pelo uso de ligaduras, favorecendo uma maior
acumulação do biofilme subgengival.
Os ratos com ligadura, que receberam nifedipina 50 mg/kg/dia, mostraram na
avaliação histológica descritiva (Figura 1), uma transformação significativa da
margem gengival em uma estrutura de formato retangular, característica de aumento
de volume gengival. Essa mudança, em nossa opinião, se explica principalmente
pelo crescimento de tecido conjuntivo. A diferenciação morfológica entre epitélio
juncional e sulcular estava perdida. O epitélio interno mostrava papilas coriais em
pontos variáveis da sua extensão, sinais de degeneração hidrópica e a medida da
área significativamente maior. O epitélio bucal apresentava cristas epiteliais mais
longas quando comparado aos grupos anteriores. O infiltrado inflamatório crônico
98
acompanhava a parede do revestimento epitelial e já se estendia de maneira mais
difusa para o interior do tecido conjuntivo. Neste grupo, tanto a área total do tecido
conjuntivo como a área de conjuntivo inflamado se mostrou maior estatisticamente
significativa, assim como a altura gengival e espessura gengival, caracterizando,
desta forma, não somente alterações histopatológicas, mas também um aumento de
volume.
Poucos estudos em animais estão relacionados com periodontite. Fu, Nieh et
al., 1997, avaliaram em ratos o efeito da ciclosporina comparando um lado com
ligadura com o contralateral sem ligadura. Os resultados mostraram que dentes com
ligadura apresentavam um aumento estatisticamente significativo no volume dos
tecidos epitelial e conjuntivo total, assim como no infiltrado inflamatório e tecido
gengival total. Observaram assim, um aumento de volume gengival óbvio nos dentes
com ligadura.
Estudos em humanos também observaram ser as variáveis periodontais,
principalmente o biofilme e a inflamação gengival, importantes fatores de risco para a
expressão dos aumentos de volume gengival (Bullon, Machuca et al., 1995;
Tavassoli, Yamalik et al., 1998).
Nesse estudo todos os animais apresentaram perda de inserção
microscopicamente. O grupo que recebeu nifedipina 50mg/kg/dia teve uma perda
óssea 18% maior, ainda que esses valores sejam estatisticamente semelhantes.
Gonçalves, Nogueira Filho et al. (2003) quantificaram o volume de perda óssea na
região da bifurcação observando 13% mais perda, não sendo esta diferença
significativa entre os grupos. Shen et al., 2001, avaliando o efeito da ciclosporina
sobre o osso alveolar em ratos observaram diferenças significativas no volume ósseo
alveolar, mas não na área do osso alveolar.
O grupo com ligadura que recebeu nifedipina 10mg/kg/dia foi semelhante ao
grupo com ligadura sem medicação, enquanto o grupo com ligadura e nifedipina
100mg/kg/dia foi semelhante ao grupo que recebeu 50mg/kg/dia, revelando as
características microscópicas de maneira mais extensa. Estes resultados
confirmaram os achados de Chiu, Fu et al. (2001), que compararam dosagens de 10
99
e 50mg/kg/dia e encontraram diferenças somente quando a dosagem de nifedipina
foi maior.
Desta forma, podemos concluir que a presença de nifedipina por si só não
acarreta um aumento de volume gengival em uma situação de saúde periodontal em
ratos. Nesta situação podemos observar somente discretas alterações
histopatológicas vistas no epitélio interno, como a ausência de diferenciação entre
epitélio juncional e sulcular. Os aumentos de volume gengival em ratos se
mostraram dependentes de um padrão inflamatório bem estabelecido, mostrado
tanto pelo aumento do infiltrado inflamatório como pelo aumento da espessura e
altura gengival.
.
100
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