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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PATRÍCIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ESTUDO SOBRE A PARTICIPAÇÃO DE ROEDORES NA
CADEIA DE TRANSMISSÃO DE Leishmania infantum
(PROTOZOA: TRYPANOSOMATIDAE) NO RIO GRANDE DO
NORTE
NATAL
2005
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PATRÍCIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ESTUDO SOBRE A PARTICIPAÇÃO DE ROEDORES NA
CADEIA DE TRANSMISSÃO DE Leishmania infantum
(PROTOZOA: TRYPANOSOMATIDAE) NO RIO GRANDE DO
NORTE
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Orientadora:
Dra. Maria de Fátima de
M. Ximenes.
NATAL
2005
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PATRÍCIA BATISTA BARRA MEDEIROS BARBOSA
ESTUDO SOBRE A PARTICIPAÇÃO DE ROEDORES NA
CADEIA DE TRANSMISSÃO DE Leishmania infantum
(PROTOZOA: TRYPANOSSOMATIDAE) NO RIO GRANDE DO
NORTE
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
11/07/2005
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Profa. Dra. Maria de Fátima de M. Ximenes.
Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN
Orientadora
____________________________________________________
Prof. Dr. Moacir Franco de Oliveira
Departamento de Ciências Animal - ESAM
1º Examinador
____________________________________________________
Prof. Dr. João Felipe de Souza filho
Departamento de Bioquímica – UFRN
2º Examinador
A vocês que estão sempre comigo.
A vocês que inundam minha vida de carinho.
A vocês que me emprestam o colo.
A vocês com quem rio e choro.
A vocês que me dão força para caminhar.
A vocês por quem vivo só para amar.
A vocês Cleyton Marcelo e Davi Marcelo...
...dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu Mestre, Senhor e Guia. De tuas mãos tudo recebo e pela sua
graça sigo meu caminho que, sobretudo é vosso;
Ao meu Pai, Melquíades Barra, presença e apoio constante, que para a
concretização deste trabalho percorreu longos caminhos em busca dos animais
necessários, além de cuidar pessoalmente do transporte, e em algumas ocasiões,
do manejo dos mesmos;
À minha mãe, Luzia Rosado, pelo exemplo de luta e determinação e por sua
orientação. Ensinou-me, entre inúmeras outras coisas, o que significava
alfabetização, vestibular, graduação e mestrado;
Ao meu marido Cleyton Marcelo, pela participação em todas as fases do
experimento, pelas críticas e revisão deste texto, mas, sobretudo pelo seu apoio
incondicional e incentivo essencial em mais esta etapa de minha vida;
À professora Maria de Fátima de Melo Freire Ximenes pela orientação na
execução do estudo e redação deste trabalho, mas principalmente por ter-me
confiado a execução deste projeto;
Ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte pela concretização deste projeto;
À CAPES, pela bolsa concedida;
À professora Selma Jerônimo pelas sugestões e por ter disponibilizado
equipamentos e materiais de procedimentos essenciais em diversas etapas deste
trabalho.
À Paula Viviane pela total disponibilidade e ajuda nas eutanásias, viagens a
campo, infecções e preparação das culturas e tantos outros procedimentos
laboratoriais;
À equipe do laboratório de Imunogenética, em especial à Núbia, pela ajuda
na realização da PCR e ELISA, e à Glória, no preparo dos meios de culturas e a
Olívia nos exames hematológicos e bioquímicos;
Aos professores do Departamento de Bioquímica pelos conhecimentos
transmitidos em sala de aula;
Aos professores João Felipe e Moacir Franco por terem aceitado participar
da banca de examinação final desta dissertação;
Aos professores Elizeu Antunes dos Santos e Edda Lisboa Leite pelas
sugestões no exame de qualificação
A Elenilson e seu Raimundo, imprescindíveis no manejo dos animais;
A Edson Santana do Departamento de Microbiologia e Parasitologia pelo
auxílio nas viagens de campos e em tantas outras atividades laboratoriais;
Aos técnicos da Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), em especial Sr.
Robeval e Sr. Torres pelo auxílio na coleta de Santo Antônio-RN;
Ao bioquímico Dr. Sebastião Farias por ter cedido o contador automático
para a realização dos hemogramas;
À Professora Dra. Gorette pela realização dos histopatológicos;
Ao CEMAS-ESAM (Centro de Multiplicação de Animais Silvestres) na
pessoa do Prof. Moacir Franco pelo fornecimento de animais e orientações no
manejo dos mesmo;
Aos meus colegas de turma, em especial à Raquel, Rose, Olívia e Ivan, que
tornaram esta jornada uma bela caminhada de amizade;
Ao Colega José Flavio Coutinho pelos inúmeros “socorros” prestados,
através do empréstimo de medicamentos, livros ou artigos, sempre em momentos
emergenciais;
A Rose Anny que orientou-me na inscrição do Mestrado;
A meus irmãos, Snyder, Clarissa e Larissa e minha avó, Maria Letice, pela
torcida de sempre;
Ao meu pequeno Davi, de quem tantas vezes precisei distanciar-me para o
cumprimento de minhas tarefas, pela sua fiel companhia durante toda a redação
deste trabalho. De sua voz, estórias, brincadeiras e rabiscos veio toda a inspiração
que transformou meus pensamentos em palavras e minhas ações neste texto.
Mas agradeço principalmente pelo seu carinho. Do seu pequeno colo, querido
filho, vem a força que me fez persistir.
RESUMO
A leishmaniose visceral americana é uma zoonose causada pelo parasita
Leishmania infantum e transmitida pela picada do flebótomo Lutzomya longipalpis.
O cão é o principal reservatório doméstico, enquanto que raposas e gambás são
os reservatórios silvestres conhecidos. No entanto, a identificação de infecções
naturais com L. infantum em roedores aponta para a necessidade de se investigar
a participação destes animais como fonte de infecção do parasita para os insetos
vetores. No presente trabalho investigou-se a infecção com parasita Leishmania
infantum em roedores capturados no Rio Grande do Norte, objetivando oferecer
subsídios à compreensão das cadeias epidemiológicas da LVA no Estado. Treze
preás da espécie Galea spixii foram distribuídos em quatro grupos, sendo G1 o
grupo controle com quatro animais e os demais, G2, G3 e G4, com três animais
cada. Esses animais foram inoculados por via intraperitonial com 10
7
promastigotas de L. infantum e acompanhados por, respectivamente, 30, 90 e 180
dias. Semanalmente os animais foram monitorados quanto ao peso corporal e
temperatura retal. Ao final de cada período estipulado os animais foram
eutanasiados. O sangue colhido foi utilizado na determinação dos parâmetros
bioquímicos e hematológicos, PCR, ELISA, confecção de esfregaço sanguíneo e
cultivo em meio NNN. Fragmentos de fígado, baço e linfonodos foram utilizados
para confecção de lâminas por aposição e cultivo em meio NNN. Fragmentos de
fígado e baço foram ainda utilizados para realização de PCR e histopatológico,
respectivamente. Concomitantemente 79 roedores das espécies Rattus rattus,
Bolomys lasiurus, Oligoryzomys nigripis, Oryzomys subflavus e Trichomys
apereoides foram capturados nos Municípios de Brejinho, Campo Grande, Coronel
Ezequiel, Passa e Fica e Várzea para identificação de infecção natural por L.
infantum. O diagnóstico da infecção nos animais foi realizado pelo exame direto
das impressões coradas com Giemsa e cultura em meio NNN de fígado, baço e
sangue. Não foram encontradas diferenças no o ganho de peso total, temperatura
retal e parâmetros bioquímicos e hematológicos dos preás controles e infectados.
A temperatura retal variou entre 36
O
C e 40
O
C. Pela primeira vez foram
determinados os valores do hematócrito (33,6% a 42,8%), hemoglobina (10,2 a
14,5g/dl), número de eritrócitos (4,67x10
6
a 6,90x10
6
/mm
3
), leucócitos totais
(0,9x10
3
a 9,2x10
3
/mm
3
), plaquetas (49x10
3
a 509x10
3
/mm
3
),
proteínas totais (1,56
a 6,06 g/dl), albumina (1,34 a 3,05 g/dl) e globulinas (0,20 a 3,01 g/dl) nesta
espécie. Os linfócitos foram os leucócitos mais abundantes. Infecção por L.
infantum foi diagnosticada em dois animais eutanasiados aos 180 dias, sendo que
em um desses também foram identificados anticorpos contra o parasita. Não foi
observada positividade em nenhuma das cinco outras espécies de roedores
capturadas. A espécie Galea spixii é resistente à infecção por L. infantum e,
portanto, não é bom modelo para o estudo da leishmaniose visceral, embora
possam atuar como fontes de infecção. Mais estudos são necessários para que se
possa determinar o papel dos roedores na cadeia epidemiológica da leishmaniose
visceral no Estado do Rio Grande do Norte
Palavras-chaves: Leishmania infantum. Parâmetros hematológicos e bioquímicos.
Galea spixii
ABSTRACT
American visceral leishmaniasis is a zoonosis caused by Leishmania infantum and
transmitted by the bite of the sand flies Lutzomia longipalpis.The main domestic
reservoir is the dog, while foxes and opposums are the known wild reservoirs.
However, identification of natural infections with L. infantum in rodents appears for
need of investigating the participation of these rodents how source of infection of
the parasite. In the present work the Leishmania infantum infection was
investigated in rodents captured in Rio Grande do Norte, aiming at to offer
subsidies to the understanding of the epidemic chains of LVA in the State. Thirteen
Galea spixii were distributed in four groups, being G1 the group control with four
animals and the others, G2, G3 and G4, with three animals each. Those animals
were intraperitoneally inoculated with 10
7
promastigotas of L. infantum and
accompanied for, respectively, 30, 90 and 180 days. Weekly the animals were
monitored as for the corporal weight and rectal temperature. At the end of each
stipulated period the animals were killed. Blood were used for determination of the
parameters biochemical and haematological, PCR, ELISA, microscopic
examination and cultivation in NNN medium. Liver, spleen and lymph node were
used in Giemsa-stained impression and cultivation in NNN medium. Liver and
spleen fragments were still used in PCR and histopathological, respectively. At the
same time 79 rodents of the species Rattus rattus, Bolomys lasiurus, Oligoryzomys
nigripis, Oryzomys subflavus and Trichomys apereoides were captured in the
Municipal districts of Brejinho, Campo Grande, Coronel Ezequiel, Passa e Fica and
Vázea for identification of natural infection with L. infantum. Evidence of infection
was checked by direct examination of Giemsa-stained impression of liver, spleen
and blood and culture of these tissues in NNN medium. Antibodies were
researched by ELISA. They were not found differences among the weigh corporal
final, rectal temperature and biochemical and haematological parameters of the
Galea spixii controls and infected. The rectal temperature of the animals varied
from 36
O
C to 40
O
C. For the first time values of the haematocrit (33,6% to 42,8%),
hemoglobin (10,2 to 14,5g/dl), erythrocyts number (4,67x106 to 6,90x106/mm
3
),
total leukocytes (0,9x103 to 9,2x103/mm
3
), platelets (49x103 to 509x103/mm
3
)
total proteins (1,56 to 6,06 g/dl), albumin (1,34 to 3,05 g/dl) and globulins (0,20 to
3,01 g/dl) of the Galea spixii were determined. The lymphocytes were the most
abundant leucocytes. Infection for L. infantum was diagnosed in two animals
euthanasied 180 days after the infection. In one of the animals was also identified
antibodies anti-Leishmania. The parasite was not found in none of the five other
species of rodents captured. Galea spixii are resistant to the infection for L.
infantum and they are not good models for the study for visceral leishmaniose,
although they can act as infection sources. More studies are necessary to
determine the paper of the rodents in the epidemic chain of transmission of the
visceral leishmaniose in the State of Rio Grande do Norte
Key-words: Leishmania infantum. Biochemical and Haematological Parameters.
Galea spixii
LISTA DE FiGURAS
Figura 1 Preá da espécie Galea spixii.............................................................. 38
Figura 2 Gaiola metálica com abrigo confeccionado com cano de policloreto
de vinila (PVC) onde os preás foram mantidos durante o
experimento.......................................................................................
38
Figura 3 Mensuração do peso corporal de preá.............................................. 40
Figura 4 Mensuração da temperatura retal de preá......................................... 40
Figura 5 Localização geográfica do Estado do Rio Grande do Norte e dos
municípios onde foram realizadas capturas de roedores..................
47
Figura 6 Células sanguíneas de Galea spixii (x100): A- Neutrófilo; B-
Eosinófilo; C- Monócito, linfócito e plaquetas (setas); D- Linfócito....
54
Figura 7 Histopatológico de baço de preás infectados com Leishmania
infantum (x100): A e B: baço do preá PS2 (HE); C e D: baço do
preá PS3 (HE e Giemsa, respectivamente); setas brancas
amastigotas de Leishmania; setas pretas hemossiderina e
eosinófilos..........................................................................................
56
Figura 8 Anticorpos séricos anti-Leishmania de preás infectados
experimentalmente com Leishmania chagasi. A - mensuração de
anticorpos pelo ELISA com extrato bruto; B – mensuração de
anticorpos pelo ELISA rK39...............................................................
57
Figura 9 Outras espécies de roedores capturados em cinco Municípios do
Estado do Rio Grande do Norte: A- Trichomys apreoides; B-
Bolomys lasiurus; C- Rattus rattus; D- Oryzomys subflavus-; E-
Oligoryzomys nigripis.........................................................................
59
Figura 10 Anticorpos séricos anti-Leishmania de roedores capturados no Rio
Grande do Norte................................................................................
60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Ganho de peso e temperatura retal de preás dos grupos controle e
experimentais......................................................................................
50
Tabela 2 Parâmetros bioquímicos de preás dos grupos controle e
experimental (Média
+ desvio padrão e nível de significância)..........
51
Tabela 3 Valores referentes ao hemograma completo de preás controle e
infectados experimentalmente com L. infantum: (Média
+ desvio
padrão e nível de significância)..........................................................
53
Tabela 4 Contagem diferencial de leucócitos de preás dos grupos controle e
experimental ( Média
+ desvio padrão e nível de significância).........
53
Tabela 5 Valores hematológicos e bioquímicos séricos de preás comparado
com outras espécies de roedores.......................................................
53
Tabela 6 Achados histopatológicos de baço de preás dos grupos controle e
experimental. .....................................................................................
56
Tabela 7 Distribuição dos roedores de acordo com o local de captura............. 60
LISTA DE ABREVIATURAS
CHCM: Concentração hemoglobínica corpuscular média
DNA: Ácido desoxirribonucleico
dNTPs: Desoxirribonucleosídeos trifosfatados (ATP, TTP, CTP, GTP)
EDTA: Ácido tetracético etilenoediamina
ELISA: Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima
GPD: Ganho de peso diário
GPT: Ganho de peso total
IC: Intracardíaco
IM: Intramuscular
IP: Intraperitoneal
HCM: Hemoglobina corpuscular média
kDNA: DNA do cinetoplasto
LV: Leishmaniose visceral
LVA: Leishmaniose visceral americana
NNN: Meio de cultivo bifásico usando ágar sangue como fase sólida e Schneider
como fase líquida
PB: Pares de bases
PBS: Tampão salina fosfatada
PCR: Reação da polimerase em cadeia (polymerase chain reaction
)
PS1,2 e 3: Preás monitorados por cento e oitenta dias pós-infecção
PC1,2,3,4: Preás controles
PN1,2,3: Preás monitorados por noventa dias pós-infecção
PT1,2,3: Preás monitorados por trinta dias pós-infecção
rK39: Antígeno recombinante K39
SDS: Dodecil sulfato de sódio
TBE: Tampão formado por Tris, ácido bórico e EDTA
TRIS: Hidroximetil aminometano
VCM: Volume corpuscular médio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
2 MATERIAL E MÉTODOS 36
2.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA 36
2.2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE PREÁS DA ESPÉCIE GALEA
SPIXII COM LEISHMANIA INFANTUM
36
2.2.1 Captura dos animais 36
2.2.2 Manejo 37
2.2.3 Infecção experimental e monitoramento 39
2.2.4 Eutanásia e coleta de amostras 41
2.2.5 Testes hematológicos e bioquímicos 41
2.2.7 Demonstração direta do parasito e histopatologia 42
2.2.6 Extração do DNA 42
2.2.8 Amplificação do DNA do parasito através de PCR 44
2.2.9 Sorologia 45
2.2.10 Análise estatística 46
2.3 INVESTIGAÇÃO DE ROEDORES NATURALMENTE
INFECTADOS COM L. INFANTUM
46
2.3.1 Captura dos roedores 46
2.3.2 Eutanásia e coleta de amostras 48
2.3.3 Processamento das amostras e pesquisa do parasita L.
infantum nos roedores
48
2.3.4 Sorologia 49
3 RESULTADOS 50
3.1 INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE PREÁS DA ESPÉCIE GALEA
SPIXII COM LEISHMANIA INFANTUM
50
3.2 INVESTIGAÇÃO DE ROEDORES NATURALMENTE
INFECTADOS POR LEISHMANIA INFANTUM
58
4 DISCUSSÃO 61
5 CONCLUSÕES 70
REFERÊNCIAS 71
APÊNDICE 86
19
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são zoonoses com vasta distribuição no globo terrestre,
excetuando apenas a Austrália e Antártida (KAFETZIS, 2003). São causadas por
parasitas pertecentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. O gênero
Leishmania é subdividido em dois sub-gêneros, Leishmania (Leishmania) spp e
Leishmania (Viannia) spp (WILSON; JERONIMO; PEARSONC, 2005), conforme o
desenvolvimento do parasita (suprapilariano ou peripilariano, respectivamente) no
interior do hospedeiro invertebrado (GOSSAGE; ROGER; BATES, 2003). Das trinta
espécies de leishmanias descritas até o presente, cerca de vinte são potencialmente
patogênicas para humanos (DESJEUX, 1996; 2004).
O ciclo de vida de Leishmania spp. envolve alternância entre hospedeiros
invertebrados e mamíferos. Os primeiros são pequenos dípteros da subfamília
Phlebotominae, com o gênero Phlebotomus hospedando as espécies do Velho
Mundo e o gênero Lutzomya, as espécies do Novo Mundo (KILLICK-KENDRICK,
1990; ALMEIDA et al., 2003). No Brasil e nas demais áreas endêmicas do continente
americano o agente etiológico da leishmaniose visceral é transmitido pela espécie
Lutzomya longipalpis. No Estado do Rio Grande do Norte esta espécie se encontra
amplamente distribuída e bem adaptada aos ambientes peridomiciliares, expondo
um grande número de pessoas ao risco de contraírem a doença (XIMENES et al.,
2000).
Em mamíferos podem ser encontradas duas formas de desenvolvimento do
parasita, a promastigota metacíclica e a amastigota (GOSSAGE; ROGER; BATES,
2003). A primeira é introduzida na pele pela picada de flebotomíneos e ao adotar
mecanismos de escape à ação do sistema imune, invade o macrófago, auxiliada por
lipofosfoglicanos (LPG) e glicoproteínas (GP63) presentes em sua membrana. No
20
interior desta célula, o parasita na forma amastigota, aflagelada, perdurará a
depender das interações parasito–célula hospedeira e respostas imunes
desencadeadas (CUNNINGHAM, 2002). As amastigotas se replicam no ambiente
ácido do fagolisossoma e, em seguida, lisam a célula liberando formas livres que
infectam células vizinhas. Ao se alimentar de sangue infectado, o hospedeiro
invertebrado adquire amastigotas livres ou no interior de células mononucelares
(MOSSER e BRITTINGHAM, 1997) que no tubo digestivo são convertidas em
promastigotas. Segue-se uma série de estágios biológicos até a transformação na
forma infectante metacíclica, que retornará ao hospedeiro mamífero no momento do
repasto sanguíneo (GOSSAGE; ROGER; BATES, 2003).
As leishmanioses apresentam ampla diversidade clínica em função da
espécie do parasita, patrimônio genético e resposta imune do hospedeiro
(BLACKWELL, 1996; CUNNINGHAM; 2002; WILSON; JERONIMO; PEARSONC,
2005). Em humanos são identificadas as formas cutânea, cutânea difusa, cutâneo-
mucosa e visceral (DESJEUX, 2004)
A leishmaniose cutânea se caracteriza pelo aparecimento de uma lesão no
local da picada do inseto, cujo tempo de permanência varia amplamente conforme o
local e a espécie do parasita, com tendência à cura espontânea e sem presença de
sinais sistêmicos. As principais espécies incriminadas como agentes etiológicas são
Leishmania tropica, L. major, L. aethiopica, L. mexicana, L. amazonensis, L.
panamensis, L. guyanensis, L. peruviana e L. braziliensis (ASHFORD, 2000;
DESJEUX, 2004).
A leishmaniose cutânea difusa ocorre em indivíduos com resposta imune
celular deficiente e se caracteriza por lesões disseminadas que assemelham-se as
21
da hanseníase. Requer tratamento e as recidivas são freqüentes. Esta forma é
causada por L. aethiopica e L. amazonensis (ASFHORD, 2000; DESJEUX, 2004).
A leishmaniose cutâneo-mucosa, também conhecida como espúndia, causa
destruição extensiva das cavidades oral-nasal e faríngea com lesões desfigurantes e
mutilações na face. Embora causada principalmente por espécies do Novo Mundo,
tais como L. braziliensis e L. guyanensis, tem sido também relatada no Velho Mundo
devido a L. major, L. donovani e, em pacientes imunossuprimidos, com L. infantum
(DESJEUX, 2004).
A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é a forma mais grave e, se não
tratada, é fatal. Ela resulta de uma infecção sistêmica do fígado, baço e medula
óssea, caracterizando-se por episódios febris, hepatoesplenomegalia, pancitopenia,
hipergamaglobulinemia e perda de peso (KAFETZIS, 2003). Entretanto, após a
infecção muitos casos permanecem assintomáticos ou associados a sintomas que
eventualmente resolvem-se espontaneamente (ASHFORD, 2000). É causada por L.
donovani e L. infantum no Velho Mundo e L. chagasi no Novo Mundo. Embora
diferentes no nome e localização geográfica, dados moleculares confirmam que L.
infantum e L. chagasi sejam uma única espécie (MAURÍCIO; STOTHARD; MILES,
2000) e neste trabalho serão tratadas como sinonímia.
Casos de LV em humanos ocorrem principalmente em áreas rurais pobres e
suburbanas de cinco países: Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil (DESJEUX,
2004). Além da espécie, fatores epidemiológicos e clínicos caracterizam os casos de
LV de acordo com sua distribuição geográfica (HOMMEL, 1978). Assim, utiliza-se a
denominação leishmaniose visceral americana (LVA) para designar a enfermidade
que ocorre na América do Sul e Central, causada pelo parasita Leishmania infantum
22
e transmitido pela picada de Lutzomyia longipalpis (SOARES; TURCO, 2003;
ALMEIDA et al. 2005b).
Nas últimas décadas, alterações no padrão epidemiológico da LVA têm sido
verificadas. Embora nas áreas endêmicas as crianças sejam mais susceptíveis que
os adultos (MARZOCHI et al., 1985; JERÔNIMO et al., 1994; GUERRA et al., 2004),
especialmente as desnutridas, que tendem a desenvolver as formas mais graves da
doença (CERF et al., 1987), observa-se um número crescente de casos em adultos,
como conseqüência do aparecimento infecções mistas graves em pacientes
portadores de HIV e da transmissão de Leishmania infantum entre pessoas
dependentes de drogas (TESH, 1995).
É também perceptível uma mudança na distribuição geográfica dos casos de
LVA. Inicialmente ela era considerada uma doença silvestre ou de área rural e a
ocorrência de casos humanos era associada a esses ambientes (DEANE; DEANE,
1962). Todavia, fatores como crescimento populacional, acelerado processo de
urbanização, mudanças ambientais causadas pelo homem e migração da população
rural para centros urbanos contribuíram para modificar o perfil epidemiológico da
propagação da doença (SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997; JERÔNIMO et al., 1994;
ORSINI et al., 2002) de forma que esta tem sido relatada em importantes centros
urbanos como, por exemplo, Teresina (COSTA; PEREIRA; ARAÚJO, 1990;
WERNECK et al.; 2002), São Luiz (RAFAEL DA SILVA, et al., 1997), Rio de Janeiro
(MARZOCHI et al., 1985; MARZOCHI; MARZOCHI; CARVALHO, 1994), Belo
Horizonte (MICHALICK, 1993; SILVA et al 2001) e Natal (JERÔNIMO et al., 1994).
Como reflexo deste processo de urbanização observam-se alterações na
distribuição dos casos de LVA por região brasileira. Na década de 90,
aproximadamente 90% dos registros foram feitos na região Nordeste. Atualmente
23
esta região concentra 74% das notificações, embora estas ocorrências continuem
em ascensão, caracterizando uma expansão da área tradicional de concentração
dos casos (DESJEUX, 2004; LIMA et al., 2004; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005).
No Rio Grande do Norte a LVA tem sido notificada em pelo menos 106 dos
seus 162 municípios (SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE, 2005) e com crescente
número de casos. Na década de 80 foram notificados 277 casos, enquanto que na
década de 90 este número subiu para 1405, e entre os anos de 2000 e 2002 foram
registrados 617 novos casos da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). Mesmo
diante desta situação ainda são poucos os estudos desenvolvidos no sentido de
conhecer as características do ciclo de transmissão de LV neste Estado.
Apesar da vasta literatura sobre infecção natural de mamíferos, é válido
salientar que para considerar um animal como reservatório de Leishmania não basta
simplesmente descobrir indivíduos infectados ou susceptíveis (ASHFORD, 1996).
Alguns animais, embora possam servir de fonte de infecção para o vetor, não são
capazes de manter o ciclo de transmissão indefinidamente (reservatórios
secundários) e outros, embora possam vir a se infectar, não são utilizados pelo
hospedeiro invertebrado como fonte de infecção (hospedeiros acidentais) (SHAW,
1988).
No Brasil, China e em outros países situados na América do Sul e Bacia do
Mediterrâneo, os cães são apontados como o principal reservatório de L. infantum
(CAMPINO et al., 2000) e a propagação da moléstia é favorecida pelo elevado
parasitismo cutâneo observado nos animais infectados (DEANE; DEANE,1955).
Cães também são encontrados infectados com leishmanias responsáveis
pelas formas tegumentares da doença, tais como a L. tropica, L. major e L.
braziliensis, mas seu papel nestes sistemas é ainda desconhecido, embora
24
evidências apontem para sua atuação como reservatório secundário de L.
braziliensis em áreas suburbanas do Brasil (ASHFORD, 1996).
Elevadas prevalências de leishmaniose visceral canina (LVC) foram
observadas em diversas cidades brasileiras (NUNES et al., 1988; CABRERA, 1999;
FRANÇA-SILVA et al., 2003; CORTADA et al., 2004; GUERRA et al., 2004; SILVA et
al., 2005), especialmente na região Nordeste (EVANS et al.1992; PARANHOS-
SILVA et al., 1998; ASHFORD et al., 1998; BORJA-CABRERA, 1999; QUEIROZ,
2003). No Rio Grande do Norte eles são mantenedores da LV nas áreas urbanas e
periurbanas (QUEIROZ, 2003).
A constatação de que muitos dos animais atingidos pela LVC desenvolvem
uma infecção severa, podendo até ser fatal, reforça a idéia de uma relação parasita-
hospedeiro recente (ASHFORD, 2000). Por outro lado muitos animais embora
albergando o parasita, permanecem assintomáticos (PINELLI et al., 1994; CAMPINO
et al., 2000; PARANHOS-SILVA et al., 2003; LIMA et al., 2004; ALMEIDA et al.,
2005a). Não obstante que estes animais igualmente participem da cadeia
epidemiológica de transmissão, pois, mesmo escassos, os parasitas podem infectar
flebótomos (MOLINA et al., 1994; TRAVI et al., 1998a; GUARGA et al.,2000; LIMA et
al., 2004), eles tendem a permanecer por mais tempo em convívio humano sem que
se suspeite de sua enfermidade. Este fato aliado à ausência de métodos eficientes
de diagnóstico e profilaxia e à existência de animais silvestres servindo de fonte do
parasita, têm dificultado o controle da LV.
Embora não existam protocolos que possam prontamente ser utilizados para
identificação de um real reservatório silvestre, diretrizes são propostas para análise
de casos concretos, dentre elas, tempo de vida do mamífero, que deve ser
suficientemente longo para garantir a transmissão; a existência de uma infecção sem
25
alterações patológicas que comprometam gravemente o mamífero; densidade
populacional do mamífero elevada; superposição da distribuição geográfica e
temporal do mamífero e vetores; presença do parasita na pele ou sangue periférico
do mamífero de forma que permita o acesso do parasita ao vetor e mesma
identidade da espécie patogênica nos mamíferos, vetores e humanos infectados
(CHABLE-SANTOS et al., 1995).
A primeira identificação de Leishmania infantum em animais silvestres no
continente americano foi feita por Deane e Deane (1955) ao examinar raposas
Dusicyon vetulus no Estado do Ceará. Estudos seguintes indicaram a participação
deste animal no ciclo de transmissão peridoméstica. No entanto, sinais de uma
infecção muito severa sugerem que este também não seja um reservatório nativo, e
sim um recente hospedeiro (DEANE; DEANE, 1962) e que, portanto, outras fontes
silvestres primárias devem existir (LAINSON, 1982).
Posteriormente, Leishmania infantum foi identificada em uma outra espécie de
raposa, a Cerdocyon thous, no Estado do Pará (LAINSON; SHAW; LINS, 1969;
SILVEIRA et al, 1982; COURTENAY et al., 1994) e no Mato Grosso do Sul (MELLO
et al., 1988). Na ilha de Marajó a raposa Cerdocyon thous infectada foi capturada
próxima à residência de um caso fatal de leishmaniose visceral em humanos
(SILVEIRA et al., 1982). Lainson et al. (1990) verificaram a infectividade destes
animais para Lutzomya longipalpis, apesar da natureza oculta da infecção e,
adicionalmente, conseguiram infectar uma raposa através da picada de apenas dois
flebótomos infectados, indicando a alta susceptibilidade deste reservatório.
Buscando reunir elementos que reforçassem o papel de Cerdocyon thous na
epidemiologia da leishmaniose visceral na região amazônica, Courtenay et al. (1994)
fizeram um estudo sorológico comparativo entre cães e raposas rastreadas e,
26
embora não tenham conseguido fazer uma associação entre raposas infectadas e
sua freqüência de contato com humanos, cães ou vilarejos, observaram uma maior
incidência de Leishmania na população de cães da área rural do que na urbana e
entre os cães de caça do que nos de estimação, evidenciando a presença da fonte
de infecção no ambiente silvestre.
Embora os casos de LV sejam esporádicos na região amazônica, o que
dificulta a investigação epidemiológica, o fato da espécie de Leishmania encontrada
nestas raposas ser a mesma identificada em pacientes e animais em Estados
próximos como Maranhão, Ceará e Bahia, reforça a idéia que as endemias dos dias
atuais possam ter sido originadas de uma enzootias primárias silvestres. Além disso,
a inaparente natureza da infecção neste animal indica tratar-se de um hospedeiro
natural primitivo de Leishmania (LAINSON; SHAW, 1979; LAINSON, 1982;
SILVEIRA et al., 1982).
Coube a Sherlock et al. (1984) a identificação do primeiro mamífero selvagem
não canídeo naturalmente infectado com Leishmania infantum no Novo Mundo. O
gambá Didelphis albiventris foi encontrado em uma área com casos recentes de LVA
humana e canina em Jacobina, Bahia. Posteriormente, Cabrera (1999) observou
elevada prevalência (29%) em uma outra espécie, D. marsupialis, na Barra de
Guaratiba, uma área endêmica de LVA no Rio de Janeiro, e constatou que a
presença desses animais no peridomicílio aumentava o risco de infecção canina.
Outros autores também confirmaram a infecção natural de gambás na Colômbia
(CORREDOR et al., 1989a; 1989b; TRAVI et al., 1994), apontando-os como
importantes reservatórios naquele país (TRAVI et al., 1998a). Na região amazônica
Didelphis marsupialis tem sido encontrado naturalmente infectado com L.
guyanensis, a mais freqüente espécie causadora de leishmaniose tegumentar
27
americana na bacia Amazônica, e também com Leishmania amazonensis (ARIAS et
al., 1981; LAINSON; SHAW; POVOÁ, 1981a; GRIMALDI JR. et al., 1991). Arias e
Naiff (1981) ao verificarem alta prevalência de gambás infectados (61,9%) aponta-os
como principais reservatórios de leishmaniose tegumentar em áreas urbanas de
Manaus.
Os edentados também são sabidamente hospedeiros naturais de várias
espécies de Leishmania (DEDET; GAY; CHATENAY, 1989). A preguiça Choloepus
hoffmanni foi encontrada infectada por Leishmania braziliensis no Panamá
(HERRER; CHISTENSEN, 1980) e em Costa Rica (ZELEDON; PONCE; PONCE,
1975) e os Choloepus didactylus são considerados os principais reservatórios
primários de Leishmania guyanensis na porção setentrional da bacia amazônica
(GENTILE et al., 1981; LAINSON et al., 1981b; PAJOT et al., 1982; DEDET, 1992).
Por sua vez, o tamanduá (Tamandua tetradactyla) tem seu papel como reservatório
secundário de Leishmania guyanensis no Estado do Pará (LAINSON et al., 1981b).
Eqüinos também são apontados como possíveis reservatórios de L.
braziliensis em diferentes regiões brasileiras (AGUILAR; RANGEL; DEANE, 1986;
BARRETTO et al., 1986; YOSHIDA et al., 1990; BARBOSA-SANTOS et al., 1994).
Recentemente Queiroz (2003) ao encontrar 50% de positividade ao teste
intradérmico em asininos, sugeriu o envolvimento destes animais na transmissão de
Leishmania braziliensis no Rio Grande do Norte.
Quanto ao papel dos humanos na transmissão de leishmanioses, sabe-se que
na Índia e na África Oriental eles são a única fonte conhecida de L. donovani
(DESJEUX, 2004). Recente pesquisa realizada no Piauí demonstrou que pacientes
com infecção ativa podem atuar como fonte L. infantum para L. longipalpis (COSTA
et al., 2000).
28
Entre os roedores, exemplares da espécie Rattus rattus estão entre os mais
pesquisados na busca de reservatórios de Leishmania. Animais infectados foram
identificados em áreas de ocorrência de leishmaniose visceral, como por exemplo,
Sudão (HOOGSTRAAL et al., 1963), Yugoslávia (PETROVIC; BORDJOSKI; SAVIN,
1975), Iraque (EL-ADHAMI, 1976) e Itália (BETTINI; POZIO; GRANDONI, 1980;
POZIO et al., 1981), sem que, no entanto, a espécie de parasita tenha sido
identificada. Estudos posteriores na Arábia Saudita (IBRAHIM et al., 1992),
Venezuela (ZULUETA et al., 1999) e Itália (GRAMICCIA et al., 1982; DI BELLA et
al., 2003), confirmaram infecção com Leishmania infantum e Leishmania donovani
nesta espécie. A identidade das espécies de Leishmania encontradas em humanos
com a observada neste roedor sugere que o mesmo possa atuar como reservatório
silvestre nas regiões acima mencionadas.
Na Itália ratos (Rattus norvegicus) também foram encontrados infectados com
L. infantum (DI BELLA et al., 2003).
Diversas outras espécies de roedores foram identificadas albergando
diferentes Leishmania, especialmente as relacionadas com a forma tegumentar da
doença. No Novo Mundo entre as espécies consideradas como reservatórios de
Leishmania destacam-se: Ototylomys phyllotis (DISNEY, 1968) em Belize,
Peromyscus yucatanicus e Ototylomys phyllotis (VAN WYNSBERGHE et al., 2000)
no México e Neotoma micropus (KERR; MCHUGH; DRONEN, 1995) no Texas,
Estados Unidos da América, como reservatórios de L. mexicana; Proechimys
guyanensis (LAINSON et al., 1981b) e Oryzomys spp (NERY-GUIMARÃES;
AZEVEDO; DAMASCENO, 1966), reservatórios de Leishmania amazonensis na
região amazônica; Agouti paca, reservatório de Leishmania lainsoni na mesma
29
região (SILVEIRA et al., 1991); e Proechimys canicollis, reservatório de L. infantum
na Colômbia (TRAVI et al., 1998b).
No Brasil, especialmente nas Regiões Sudeste e Nordeste, estudos têm sido
conduzidos com o intuito de encontrar outros roedores infectados com Leishmania.
Cantarino (1998) examinando roedores taxidermizados da coleção do Museu
Nacional do Rio de Janeiro utilizando PCR, identificou L. amazonensis em
Thrichomys apereoides e Oryzomys subflavus. Os animais eram oriundos do
município de Baturité, Estado do Ceará e foram capturados na década de 50 durante
uma epidemia de peste bubônica. No mesmo Estado, Rattus rattus foi encontrado
infectado por L. braziliensis em área de transmissão de leishmaniose tegumentar
(VASCONSELOS et al, 1994).
Em Pernambuco, Brandão-Filho et al (2003) utilizando PCR e impressões de
baço, identificaram Leishmania braziliensis em cinco roedores (Rattus rattus,
Nectomys squamipes, Bolomys lasiurus, Akodon arviculoides e Holochilus sciureus)
capturados em áreas endêmicas de leishmaniose tegumentar. O mesmo parasita foi
encontrado em gambás, cães e cavalos, evidenciando a hipótese que pequenos
mamíferos, incluindo os roedores, são os principais reservatórios de L. braziliensis
no Estado. Em Minas Gerais, o parasita L. braziliensis também foi identificado em
Akodon arviculoides (ROCHA et al., 1988) e, recentemente, Oliveira et al. (2005)
identificou DNA dos parasitas L. braziliensis, L. mexicana e L infantum em diversos
indivíduos da espécie Rattus rattus e relatou pela primeira vez infecção por L.
infantum em Trichomys apereoides.
É provável que no território brasileiro existam outros reservatórios de
Leishmania entre as populações de roedores silvestres, participando da difusão da
doença em ambiente doméstico e peridomiciliar juntamente com o cão. Todavia, faz-
30
se necessário que estudos sejam feitos em áreas de transmissão ativa para
identificar novas fontes de infecção e esclarecer o papel dos animais já identificados
albergando o parasita (VASCONCELOS et al.,1994; CANTARINO, 1998).
Os preás da espécie Galea spixii (Wagler) são pequenos roedores
pertencentes à subordem Hystricognathi, família Caviidae, subfamília Caviinae. São
animais desprovidos de cauda, com superfície dorsal escura, acinzentada, e ventral
branca, com manchas infra-oculares e pós-auriculares também brancas
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002) e morfologicamente semelhantes às demais
espécies da subfamília Caviinae Todavia, sua característica diferenciadora é a cor
amarela dos incisivos (LACHER, 1981).
São encontrados em todos os Estados da Região Nordeste e também em
Minas Gerais e Mato Grosso (MOOJEN, 1952). Habitam uma variedade de
formações abertas, como savanas do Cerrado, Floresta Atlântica e Caatinga no
semi-árido nordestino (LACHER, 1981), e nesta região, em razão de sua rusticidade,
têm conseguido se adaptar às inóspitas condições locais, representando importante
fonte de proteína animal para populações rurícolas pouco favorecidas (PINHEIRO;
ANDRADE; CUNHA, 1989).
Embora estudos venham sendo conduzidos no sentido de viabilizar a criação
destes animais em cativeiro (PINHEIRO; ANDRADE; CUNHA, 1989), pouco tem sido
pesquisado sobre as zoonoses que poderiam ser transmitidas por estes animais.
Santos et al. (1999), estudando 51 amostras de tecido renal de Galea spixii (W.)
observaram uma positividade de 7,84% para leptospiras patogênicas. Aragão et al.
(2002) encontraram anticorpos contra Yersinia pestis, pela técnica de
hemaglutinação, em 11 Galea spixii do Estado do Ceará.
31
Ximenes et al. (2002)
1
estudando a preferência alimentar de L. longipalpis
verificaram um elevado percentual de fêmeas (81%) realizando repasto sanguíneo
em Galea spixii imobilizados, além de uma elevada postura média destas fêmeas
quando comparada a outras que se alimentaram em hamster, cão, timbu, galinha,
sagüi e gato, despertando o interesse deste animal na cadeia da transmissão da
leishmaniose visceral na região Nordeste.
Para maior compreensão da relação parasita-hospedeiro e suas
consequências, infecções artificialmente produzidas em laboratórios constituem uma
ferramenta de grande valia na pesquisa médica. Seu campo de possibilidades varia
desde a pesquisa de animais susceptíveis até estudo dos aspectos clínicos,
patológicos ou imunológicos da doença. Além diso, também são úteis quando se
necessitam de modelos animais para testes de vacinas ou tratamentos.
No estudo dos efeitos e progressão da infecção causada por Leishmania
infantum ou Leishmania donovani não se conhece, no entanto, um convincente e
comparável modelo de infecção (REQUENA et al., 2000). Todavia, dada a
semelhança dos sintomas da leishmaniose visceral canina e humana e os
sucessivos relatos de reprodução da infecção experimental condizente com a
infecção natural, os cães tornaram-se modelos laboratoriais essenciais (CAMPINO
et al., 2000; REQUENA et al., 2000; LIMA et al., 2004). Entretanto, o uso deste
modelo apresenta inconvenientes, tais como, dificuldade de manejo, longos períodos
de incubação e alto custo da manutenção, além das implicações éticas em estudos
para os quais são requeridos grande número de animais (GUARGA et al., 2000;
REQUENA et al., 2000; RICA-CAPELA et al., 2003).
1
XIMENES, M. F. F. M.; SILVA, V. P. M.; QUEIROZ, P. V. S.; MONTEIRO, G. R. G.; MELO, S. B. F.;
MARTINS, D. R. A.; COUTINHO, J. F. V.; BARBOSA, A. M.; JERÔNIMO, S. M. B. 2002
Physiological and behavioral parameters associated with the feeding of Lutzomyia longipalpis females
(Diptera: Psychodidae) in different animals host. Manuscritos
32
Entre os animais de laboratório os hamsters são particularmente úteis no
estudo da LV causada por Leishmania infantum e, principalmente, por L. donovani
(BORIES et al., 1998; GHOSE et al., 1999; REQUENA et al., 2000; RICA-CAPELA et
al., 2003), não obstante a verificação de não serem susceptíveis a alguns
zimodemas de L. infantum (SANTOS-GOMES; ABRANCHES, 1996, RICA-CAPELA
et al., 2003) e a existência de certas diferenças patológicas e imunológicas
observadas durante a progressão da doença quando comparada com a observada
em humanos e cães (WILSON; JERONIMO; PEARSONC, 2005).
Em camundongos, fatores genéticos determinam a susceptibilidade ou
resistência à infecção, mas até as raças susceptíveis alcançam a cura da infecção,
sendo, portanto, melhores modelos de auto-cura ou infecções subclínicas do que de
doença visceral disseminada (WILSON; JERONIMO; PEARSONC, 2005). Modelos
murinos têm sido particularmente úteis no estudo da resposta imune à leishmanias.
Em infecções com L. major foi estabelecido o paradigma Th1 versus Th2, como
mecanismos opostos de resistência versus susceptibilidade. Células T CD4
produtoras de interferon γ (IFNγ) (resposta Th1) são responsáveis pelo controle da
doença em variedades não resistentes à infecção, enquanto que células T CD4
produtoras de interleucina 4 (IL4) e outras citocinas (resposta Th 2) estão
associadas à doença em variedades de camundongos susceptíveis à infecção
(REINER; LOCKSLEY, 1995). No entanto, esta dicotomia não é tão perceptível
durante a infecção murina com L. infantum e L. donovani (WILSON; JERONIMO;
PEARSONC, 2005)
A infecção natural com Leishmania em humanos e hospedeiros vertebrados é
causada por formas promastigotas inoculadas na derme pela picada do inseto. Na
produção da infecção experimental, no entanto, para garantir a infecção, são
33
utilizadas tanto inoculação do parasita na forma promastigota quanto na amastigota
(ABRANCHES et al., 1991; CAMPINO et al., 2000; SANTOS-GOMES; CAPELA;
RAMADA, 2003; RIÇA-CAPELA et al., 2003) assim como variadas vias de
administração e diferentes doses de inoculação (PARANHOS-SILVA et al., 1993;
KILLICK-KENDRICK et al., 1994; MBATI et al. 1994; REQUENA et al., 2000;
SANTOS-GOMES; CAMPINO; ABRANCHES, 2001; PARANHOS-SILVA et al., 2003;
ROLÃO; MELO; CAMPINO, 2004)
Objetivando a obtenção de infecção mais semelhante à natural, autores têm
utilizados os próprios flebotomíneos para transmitir L. infantum (POZIO et al., 1985;
KNECHTLI; JENNI, 1990). Todavia, a necessidade de um grande número de vetores
infectados associada à obtenção de apenas um pequeno número de animais
infectados, indica não se tratar de um método adequado para reprodução em
laboratório.
Durante a transmissão natural, a saliva dos flebótomos provavelmente atua
reduzindo a exposição das promastigotas ao sistema imune ao atrair macrófagos
para o local de inoculação e acelerar a entrada de promastigotas nestas células
(ZER et al. 2001). No entanto, vantagens quanto ao uso de saliva de L. longipalpis
como agente potencializador de infecção visceral, sob condições experimentais e
utilizando cães (PARANHOS-SILVA et al., 1993, PARANHO-SILVA et al., 2003) e
gambás (TRAVI et al., 1998a), não foram demonstradas.
Diversos autores utilizando-se das técnicas de infecção experimental, têm
investigado a susceptibilidade de roedores silvestres às espécies visceralizantes de
Leishmania. De acordo com Melo e Teixeira (1984), o primeiro trabalho nesta linha
foi realizado por Adler e Theodor (1931) utilizando Microtus guntheri. Os autores
observaram que os animais desenvolveram baço hipertofiado e rico em amastigotas.
34
A susceptibilidade do Arvicanthis niloticus à L. donovani foi demonstrada por
Stauber, Melo e Campino (1966) e Ranque, Quilici e Camerlynck (1974) que
verificaram animais com hepato e esplenomegalia. Grandoni et al. (1983), tentando
esclarecer o papel de Rattus rattus na transmissão de L. infantum na Itália,
observaram uma considerável resistência à infecção nos animais utilizados e raras
detecções do parasita por microscopia.
Melo e Teixeira (1984) descreveram infecção em Calomys callosus, um
roedor silvestre bastante distribuído no Brasil e bem adaptado às condições de
cativeiro. De acordo com os autores todos os animais desenvolveram infeccção com
sinais típicos de leishmaniose visceral, demonstrando que este roedor pode ser um
eficiente modelo para uso em estudos experimentais com L. infantum.
Para verificar a susceptibilidade e possível participação na cadeia de
trasmissão de L. infantum, infecções foram realizadas em Proechimys semispinosus
(TRAVI et al 2002), o mamífero mais abundante nas florestas úmidas tropicais da
costa pacífica colombiana, e em Proechimys guyanensis (LAINSON; ISHIKAWA;
SILVEIRA, 2002), uma espécie bastante comum na região amazônica. No primeiro
estudo verificou-se controlada e compartimentalizada infecção e fraca infectividade
para L. longipalpis, mas por serem animais abundantes e que geralmente estão em
contato com humanos, o potencial destes animais como reservatório foi sugerido. No
segundo, a ausência de sinais de infecção associada à relutância de L. longipalpis
para alimentar-se neste roedor, levou os autores a descartar a participação desta
espécie na eco-epidemiologia de LVA na Região Norte do Brasil.
No intuito de fornecer subsídios à compreensão das cadeias epidemiológicas
da leishmaniose visceral no Estado do Rio Grande do Norte, o presente estudo teve
como objetivo investigar a susceptibilidade de preás Galea spixii ao parasita
35
Leishmania infantum, através da infecção experimental desses animais e identificar
roedores naturalmente infectados por Leishmania, em localidades com transmissão
ativa do parasita.
36
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa
O protocolo do experimento foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN), recebendo parecer
favorável de N
o
130/2004, conforme a Resolução N
o
196/96-CNS.
2.2 Infecção experimental de preás da espécie Galea spixii com Leishmania
infantum
2.2.1 Captura dos animais
Foram capturados 15 preás da espécie Galea spixii (Figura 1), com o auxílio
de fojos (covas, cuja abertura é disfarçada com ramos) em áreas periféricas do
município de Mossoró-RN. Adicionalmente seis animais foram gentilmente cedidos
pelo CEMAS-ESAM (Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da Escola
Superior de Agricultura de Mossoró-RN). Ressalta-se que embora se trate de um
local de criação em cativeiro, os animais cedidos tinham sido recentemente
capturados nas redondezas do criatório.
Os animais foram transportados para o Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da UFRN, Natal-RN, em gaiolas metálicas com alimento e água. A
permissão para captura foi concedida pelo Instituto Brasileiro de Meio Ambiente
(IBAMA), através de projeto coordenado pela prof
a
. Maria de Fátima Freire de Melo
Ximenes, o qual tinha por objetivo a investigação de animais silvestres como
reservatórios de Leishmania em diferentes municípios do Estado.
37
2.2.2 Manejo
Inicialmente todos os preás foram examinados clinicamente e, em seguida,
acondicionados em gaiolas metálicas (80 x 45 x 60cm) contendo comedouro,
bebedouro e abrigos construídos com cano de policloreto de vinila (PVC) (Figura 2).
Estas permaneceram durante todo o experimento em uma sala de uso exclusivo
situada na área externa do Centro de Biociência e que permanecia constantemente
fechada. A abertura para ventilação foi protegida por grade de ferro e tela contra
insetos.
A distribuição dos animais por gaiola foi realizada aleatoriamente,
independentemente do sexo, e respeitando o máximo de quatro animais. Em
situações excepcionais (tratamentos e pré e pós-parto), os animais foram isolados
em gaiolas plásticas (40 x 33 x 16cm) forradas com serragem. O animais que
apresentaram ferimentos por agressão foram tratados com antibiótico (terramicina) e
só reintroduzidos no experimento após recuperação, permanecendo isolados dos
demais para evitar novos incidentes.
A alimentação dos animais foi fornecida “ad libidum” e substituída
diariamente, sendo composta de ração para roedores (Labina, Purina),
complementada com batata-doce, folhagem (alface, rama de cenoura e capim
elefante picado) e vagem. Cenoura, repolho e couve também foram oferecidos, mas
com menor aceitação.
Todos os animais foram submetidos a um período de 40 dias de observação e
adaptação às condições do experimento antes de serem utilizados na fase
experimental.
38
Figura 1- Preá da espécie Galea spixii
Figura 2 – Gaiola metálica com abrigo confeccionado com cano
de policloreto de vinila (PVC) onde os preás foram
mantidos durante o experimento.
39
2.2.3 Infecção experimental e monitoramento
Treze preás, sendo seis machos e sete fêmeas, foram distribuídos em quatro
grupos, sendo G1 o grupo controle com quatro animais (dois machos e duas
fêmeas) e os demais, G2, G3 e G4, com três animais cada. Esses animais foram
inoculados por via intraperitonial com 10
7
formas promastigotas de L. infantum e
monitorados por, respectivamente, 30, 90 e 180 dias. As formas promastigotas de L.
infantum foram obtidas de baço e fígado de cães naturalmente infectados, após
eutanásia, e cultivadas em meio NNN/Schneider. A contagem das formas
promastigotas foi realizada em câmara de Neubauer. Um animal morreu quinze dias
após a inoculação e como o parasita não foi visualizado por microscopia nas lâminas
de fígado e baço coradas com Giemsa, ele foi substituído. Para controle da
virulência dos parasitas dois hamsters foram infectados nas mesmas condições dos
preás.
Semanalmente os animais foram avaliados clinicamente. Os parâmetros
adotados incluíram a observação da elasticidade da pele, coloração da mucosa
bucal e conjuntiva, sensibidade abdominal, revestimento corporal e aspecto geral.
Também verificou-se o comportamento diante do alimento e dos demais animais e
mensurou-se a temperatura retal e peso corporal (Figuras 3 e 4) para avaliação do
ganho de peso total durante o experimento (GPT) e ganho de peso diário (GPD). No
entanto, em vitude das gestações que ocorreram nos animais PS3 (151
0
dia após a
infecção) e PC4 (70
0
e 131
0
dia do experimento), resultando em ganho de peso
semanal muito superior aos demais, especialmente nas últimas semanas da
gestação, os dados de GPD foram utilizados apenas para acompanhamento do
desenvolvimento dos animais (Apêndice).
40
Figura 3 – Mensuração do peso corporal do preá
Figura 4 – Mensuração da temperatura retal do
preá.
41
2.2.4 Eutanásia e coleta de amostras
Completado o período pós-infecção, os animais foram anestesiados com
Zoletil 50 (cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam), 75mg/Kg,
intramuscular (IM). A colheita de sangue foi feita por punção cardíaca e, após a
confecção de esfregaços sanguíneos, foi dividido em dois tubos com e sem EDTA.
Em seguida procedeu-se à tricotomia, assepsia local e abertura da cavidade
abdominal para retirada de fragmentos de fígado, baço e linfonodos mesentéricos.
Também foi feita uma incisão na região posterior da coxa para a extração de
linfonodos poplíteos. Por fim, os animais foram eutanasiados com administração
intracardíaca de cloreto de potássio a 10%.
2.2.5 Testes hematológicos e bioquímicos
O sangue colhido com ácido etilenodiamino tetracético (EDTA) foi utilizado na
realização do hemograma completo em contador automático (Cell-dyn 1400)
(cortesia do Dr. Sebastião Farias, Laboratório PAPI, Natal-RN). Esfregaços
sangüíneos foram corados com panótico (azul de metileno, eosina, álcool etílico,
Laborclin) para contagem diferencial de leucócitos. Os diâmetros médios dos
leucócitos foram obtidos pela mensuração de 100 células de cada tipo leucocitário
utilizando ocular micrométrica e objetiva de x100 .
O sangue sem EDTA foi centrifugado (Beckman, GS – 6R) a 2000rpm
durante dez minutos e o soro obtido conservado a -20
o
C. A determinação dos
valores de proteína total e albumina foi realizada através de testes comerciais
(Labtest) e o de globulina por diferença (proteínas totais – albumina).
42
2.2.6 Demonstração direta do parasito e histopatologia
Alíquotas de sangue periférico e fragmentos de fígado, baço e linfonodos
poplíteos dos preás foram semeados em meio NNN para pesquisa de Leishmania.
Antes de serem semeados os fragmentos foram macerados com 2ml de Schneider
(TC-100 insect cell culture medium (Gibcobrl); NaHCO
3
; NaCl) e o produto obtido foi
centrifugado a 2000rpm, 4
o
C, por dez minutos, para retirada do excesso de material
celular. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspenso em 0,5ml de
Schneider suplementado e então inoculado em meio de cultivo bifásico (NNN),
usando Schneider como fase líquida. As culturas foram incubadas a 24
o
C durante
um período de até quatro semanas e observadas diariamente.
Fragmentos de fígado, baço e linfonodos mesentéricos foram também
utilizados para confecção de lâminas por aposição. Após secagem em temperatura
ambiente estas lâminas e as de esfregaços sanguíneos foram fixadas com álcool
metílico por três minutos e em seguida coradas com solução de Giemsa (Sigma) por
45 minutos.
Para confecção de cortes histológicos fragmentos de baço foram
conservados em formol tamponado (pH=7,0) antes da impregnação por parafina. As
lâminas preparadas foram coradas com hematoxilina-eosina e Giemsa.
2.2.7 Extração do DNA
A extração de DNA foi realizada a partir de amostras de sangue periférico e
fragmentos de fígado, conforme protocolos descritos por Grimberg, Maguires e
Belluscio (1989) e Sambrook e Russell (2001), respectivamente.
O sangue coletado foi acondicionado em tubos com EDTA e, em virtude de
sua pequena quantidade, foi misturado ao concentrado de células obtido após a
43
centrifugação para obtenção do soro. Em seguida foi adicionada solução de lise de
hemácias (NH
4
Cl 1,3 mM/NH
4
CO
3
88,54 mM) (3,5 ml para cada 1 ml de sangue) e a
mistura foi mantida a 4
o
C por 30 minutos, após o que o material foi centrifugado a
3200 rpm a 4
o
C por 15 minutos, sendo o sobrenadante desprezado e a camada
leucocitária presente no precipitado resuspensa em tampão de lise de células
brancas (Tris 0,2 M, SDS 1%, EDTA 10 mM, pH 8,5) (0,5 ml para cada 1ml de
sangue). Após a lise dos leucócitos, adicionou-se 2,5 ml de acetato de amônia 5M e
realizou-se nova centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante
contendo o DNA foi então transferido para outro tubo, onde foram adicionado 2 ml de
álcool isopropílico para a precipitação do DNA. O ácido nucléico foi transferido para
outro tubo, lavado com etanol a 70% e colocado para secar em capela de fluxo
laminar. Por fim o DNA foi solubilizado em água estéril e, após determinação de sua
concentração em espectrofotômetro (Hitachi, U – 2000) (260 nm), foi estocado a
-20
o
C (GRIMBERG; MAGUIRES; BELLUSCIO,1989).
Para a extração do DNA de fígado foi utilizado um fragmento de 100 mg
resuspenso em 1,2 ml de solução TE (Tris-Cl 10 mM pH 8,0; EDTA 0,1 mM pH 8,0)
e homogeneizado com maceradores estéreis. Em seguida foram adicionados 40 µl
de SDS 20% e 60 µl de proteinase K (20 mg/ml), incubando-se a 55
o
C por 2 horas.
Sucessivas extrações foram realizadas utilizando um volume de fenol, de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1),
com constante aproveitamento do sobrenadante após centrifugação por 5 minutos a
3500 rpm. Ao término adicionou-se 0,5 volume de acetato de amônia 7,5 M e, para a
precipitação do DNA, 2 volumes de etanol gelado foram acrescidos, seguidos de
centrifugação por 10 minutos a 3500 rpm. Descartado o sobrenadante, o DNA foi
lavado com 250 µl de etanol 70%, secado à temperatura ambiente em capela de
44
fluxo laminar, ressolubilizado em 200 µl de TE e incubado a 37
o
C por 30 minutos
antes de ser congelado a – 20
o
C (SAMBROOK; RUSSELL,2001).
2.2.8 Amplificação do DNA do parasito através de PCR
Para a detecção do parasita L. infantum, realizou-se a amplificação do DNA
extraído do sangue periférico e fragmentos de fígado, através da reação em cadeia
da polimerase (PCR). Oligonucleotídeos complementares de seqüências do
minicírculo do cinetoplasto de Leishmania foram utilizados conforme descrito por
SMYTH et al. (1992). Na reação foram adicionados 20 ng do DNA extraído a uma
mistura de 4,185µl de água bi-destilada estéril, 1,25 µl de tampão de PCR dez vezes
concentrado (Tris-HCl 100 mM, KCl 500 mM, MgCl
2
15 mM, pH 8,3), 1,25 µl de cada
oligonucleotídeo, na concentração de 20 nmol, (direito – 5´GGG GTT GGT GTA AAA
TAG e reverso – 5´ CCA GTT TCC CGC CCC G), 2,5 µl de uma solução contento
desoxiribonucleosídeos trifosfatados 1,25 mM (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) e 0,0625
µl de DNA polimerase termo-resistente 5 U/µl. As amostras foram inicialmente
desnaturadas a 93
o
C por 30 segundos, o anelamento ocorreu a 60
o
C por 1 minuto e
a extensão final a 72
o
C por 1 minuto.
A identificação do produto da PCR foi realizada por eletroforese em gel de
agarose a 1% e tampão TBE uma vez concentrado (Tris 0,04 M, ácido bórico 0,04
M, EDTA 0,02 M). No gel foram aplicados 5 µL do DNA amplificado misturado a 1 µl
de brometo de etídio (1 g/ml). Um controle negativo (água) e um controle positivo
(DNA de Leishmania) foram utilizados em cada experimento. O gel foi submetido à
corrente constante de 100 V e 0,6 A durante 30 minutos. A visualização do
fragmento de 800pb foi feita pela absorção da luz ultravioleta. O produto da PCR foi
45
analisado comparando o seu tamanho com o do marcador padrão de 1KB (BRUIJN;
BARKER, 1992; SHEFFIELD et al., 1995).
2.2.9 Sorologia
A pesquisa de anticorpos anti-Leishmania nos animais infectados foi realizada
através do ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando a proteína recombinante de
L. infantum rK39 (QU et al., 1994) e o antígeno total de Leishmania (extrato bruto).
As microplacas (Falcon Probind, cat. N
o
3915) foram sensibilizadas com o
antígeno de Leishmania diluído em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e
incubado por 18 horas a 4
o
C. Em seguida, o excesso de antígeno foi removido e o
tampão de bloqueio (PBS/Tween 20 1%) foi adicionado e mantido durante 1 hora à
temperatura ambiente. As microplacas foram então lavadas quatro vezes com
PBS/Tween 20 0,1% e os soros dos roedores capturados e controles, diluídos em
PBS na proporção de 1:100, foram aplicados às microplacas sensibilizadas, sendo
as mesmas incubadas por 1 hora a 37
o
C. Após a retirada do excesso dos soros, a
proteína-A (proteína HRP conjugada EIA grade/CN biomed OH44202), marcada com
peroxidase e diluida em PBS-Tween 20 0,1% na proporção de 1:10000 (para o
antígeno rK39) e 1:1000 (para o extrato bruto), foi adicionada e incubada durante 1
hora a 37
o
C. O excesso foi descartado e a placa foi novamente lavada para
aplicação do substrato (peróxido de hidrogênio) na presença do cromógeno (ABTS
0,001 mM) diluído em tampão citrato-fosfato pH 4,2, o qual permaneceu por 1 hora à
temperatura ambiente e na ausência de luz . A reação foi interrompida pela adição
de SDS 5%. A microplaca foi então submetida à leitura a 405 nm (Titerteck
Instruments, Inc., Huntsville, AL, EUA) para quantificação dos anticorpos presentes
revelados pelo valor da densidade óptica (QU et al., 1994).
46
Como controle positivo foi utilizado soro de cães positivos para LV e, como
controle negativo, utilizou-se soro de animais pertencentes ao grupo controle (G1) e
de mais quatro preás nascidos durante a realização deste experimento. Os valores
do ponto de corte foram 0,159 (rK39) e 0,050 (extrato bruto), obtidos a partir da
média das absorbâncias dos animais controle mais 3 ou mais 5 desvios padrões,
respectivamente.
2.2.10. Análise estatística
Para comparação das médias dos parâmetros analisados foi utilizado o teste
não paramétrico Kruskal-Wallis (SIEGEL, 1975) utilizando o software estatístico
Statistica versão 5.0 e considerado o nível de significância maior ou igual a 5%
(p
>0,005), para rejeição da hipótese de nulidade (H0).
2.3 Investigação de roedores naturalmente infectados com L. infantum
2.3.1 Captura dos roedores
Os roedores foram capturados no período de março a dezembro de 2004 por
técnicos da FUNASA (Fundação Nacional de Saúde) e Secretaria Estadual de
Saúde do Rio Grande do Norte, utilizando gaiolas metálicas com iscas e com o
objetivo inicial de realizar monitoramento de Yersinia (Pasteurella) pestis, agente
causador da peste bubônica. As armadilhas foram colocadas em propriedades
aleatoriamente selecionadas, nas redondezas das residências e em locais
inabitados (silvestres), no perímetro rural dos municípios de Brejinho, Campo
Redondo, Coronel Ezequiel, Passa e Fica e Várzea no Estado do Rio Grande do
Norte (Figura 5).
47
N
Figura 5 – Localização geográfica do Estado do Rio Grande do Norte e
dos municípios onde foram realizadas capturas de roedores.
48
2.3.2 Eutanásia e coleta de amostras
Os roedores capturados foram conduzidos para o Laboratório da Peste
localizado no Município de Santo Antônio-RN onde foi feita a coleta de amostras
para realização de exames sorológicos ou xenodiagnóstico para diagnóstico da
peste. Na oportunidade, amostras de sangue e fragmentos de tecidos foram
retiradas para a pesquisa de L. infantum. A retirada de sangue foi feita pela via retro
orbital. Uma gota do sangue colhido foi colocada sobre lâmina para confecção de
esfregaços sanguíneos, enquanto que o restante foi acondicionado em tubos
estéreis sem anticoagulante. Em seguida, os animais foram colocados em uma cuba
fechada e eutanasiados com éter. Posteriormente foi realizada a tricotomia e, após
rigorosa assepsia com álcool iodado, procedeu-se à abertura da cavidade abdominal
para a retirada de fragmentos de fígado e baço, destinados à confecção de
impressões por aposição em lâminas. Adicionalmente, fragmentos de fígado e baço
foram conservados em tubos estéreis contendo 2 ml de Schneider para cultivo do
parasita. Ao final as carcaças foram autoclavadas e destruídas.
2.3.3 Processamento das amostras e pesquisa do parasita L. infantum nos
roedores
O material coletado foi transferido para a Universidade Federal do Rio Grande
do Norte (UFRN) e processado nos Laboratórios de Parasitologia e de
Imunogenética. Os esfregaços sangüíneos e as lâminas de vísceras, após fixação
com álcool metílico, foram corados com Giemsa. O sangue sem EDTA foi
centrifugado (Beckman, GS – 6R) a 2000 rpm, durante dez minutos, e o soro obtido
conservado a -20
o
C. Os fragmentos de fígado e baço acondicionados em Schneider
foram utilizados para cultivo em meio bifásico como anteriormente descrito.
49
2.3.4 Sorologia
A pesquisa de anticorpos anti-Leishmania nos roedores infectados foi
realizada através do ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando a proteína
recombinante de L. infantum rK39 (QU et al., 1994), como descrito anteriormente.
Como controle positivo foram utilizados soros de cães positivos para LV.
Para o controle negativo utilizou-se soro de doze ratos Wistar criados em biotério,
cujos valores de absorbância foram utilizados para o estabelecimento do ponto de
corte (0,131) obtido a partir da média das absorbâncias mais três desvios padrões.
50
3 Resultados
3. 1 Infecção experimental de preás da espécie Galea spixii com Leishmania
infantum
Nos preás capturados, sinais sugestivos de leishmaniose ou outra
enfermidade não foram observados. Entretanto, durante o período de quarentena
sete animais vieram a óbito. Necropsias foram realizadas em três destes animais,
sendo que no primeiro nenhum sinal de alteração patológica foi observado, no
segundo verificou-se derrame pleural e no terceiro visualizou-se dilatação gástrica
com sobrecarga alimentar, congestão gástrica, hepática e renal e hemorragias em
algumas regiões do intestino delgado.
No monitoramento pós-infecção com L. infantum verificou-se ampla variação
no GPT dos indivíduos (Tabela 1). Para os animais do grupo G4 o GPT variou de
14g (PS1) a 130g (PS3), no entanto não houve diferença significativa entre as
médias do GPT entre os animais dos diferentes grupos (p= 0,45).
Tabela 1: Ganho de peso e temperatura retal de preás dos grupos controle e
experimentais.
PMPI
1
Animais sexo GPT (%)
2
TRE (
o
C)
3
/ ATR (
o
C)
4
PC1
5
M 0,98 38,1 (36,5 – 40,0)
PC2
5
M 42,1 38,0 (37,0 – 39,6)
PC3
5
F 31,17 38,2 (37,0 – 39,8)
Controle
PC4
6
F 23,28 37,7 (37,5 - 38,0)
PT1 F 0,98 37,2 (36,0 – 37,5)
PT2 M 5,68 37,4 (36,8 – 38,1)
30
PT3 M 19,32 37,7 (37,5 – 38,0)
PN1 F 10,19 38,2 (37,2 – 38,7)
PN3 F 29,74 37,9 (37,0 – 38,8)
90
PN3 M 28,02 37,6 (37,0 – 38,2)
PS1 M 4,28 38,1 (36,7 – 39,5)
PS2 F 26,77 38,5 (37,5 – 39,5)
180
PS3 F 54,62 38,2 (37,0 – 38,9)
1
Período de monitoramento pós-infecção;
2
ganho de peso total;
3
temperatura retal no momento
da eutanásia;
4
amplitude da temperatura retal ;
5
Acompanhamento por 180 dias,
6
Acompanhamento
por 30 dias
51
Na Tabela 1 observa-se a variação da temperatura retal dos preás. No animal
PC1 esta variação chegou a 3,5
o
C. Considerando os animais controles e infectados,
a amplitude de variação foi de 36
O
C a 40
O
C. A temperatura retal (média + desvio
padrão) observada nos animais do grupo controle e infectados por 30, 90 e 180 dias
foram, respectivamente, 38,1
o
C + 0,7; 37,3
o
C + 0,5; 37,9
o
C + 0,5 e 38,3
o
C + 0,6.
Quanto aos parâmetros bioquímicos séricos avaliados não foram verificadas
diferenças significativas entre os grupos (Tabela 2). O teor de proteína total
observado (valor médio
+ desvio padrão) foi de 3,6 g/dl +1,4, variando de 1,6 g/dl a
6,1 g/dl. Para a albumina e globulina os valores foram, respectivamente 2,1 g/dl
+
0,6, variando de 1,3 g/dl a 3,0 g/dl e 1,5 g/dl
+ 1,0 variando de 0,2 g/dl a 3,0 g/dl.
Tabela 2: Parâmetros bioquímicos de preás dos grupos controle e experimental
(Média
+ desvio padrão e nível de significância)
Período pós- infecção (dias) p
Parâmetros Controle
(0
+ s)
30 (0
+ s) 90 (0 + s) 180 (0 + s)
Proteínas totais (g/dl)
4,5
± 1,1 3,0 ± 1,3 3,2 ± 1,5 3,3 ± 1,7
0,48
Albumina (g/dl)
2,0 ± 0,7 1,9 ± 0,6 2,2 ± 0,6 2,1 ± 0,8
0,88
Globulina (g/dl)
2,5 ± 0,6 1,0 ± 0,7 1,0 ± 0,9 1,2 ± 1,1
0,11
Igualmente os valores médios do hemograma completo dos preás e a
contagem diferencial dos leucócitos não diferiram entre os animais controle e
infectados com L. infantum (Tabelas 3 e 4). O hematócrito dos animais variou de
33,6% a 42,8%, enquanto que o teor de hemoglobina variou de 10,2 g/dl a 14,5g/dl,
o número de eritrócitos variou de 4,67x10
6
/mm
3
a 6,90x10
6
/mm
3
e o de plaquetas de
49x10
3
/mm
3
a 509x10
3
/mm
3
.
Os leucócitos variaram de 0,9x10
3
/mm
3
a 9,2x10
3
/mm
3
e as células
sanguíneas mais abundantes foram os linfócitos (55%), seguidas dos neutrófilos
(34%), monócitos (9%) e eosinófilos (2%), enquanto que os basófilos não foram
52
identificados. Morfologicamente os linfócitos exibiram núcleo com aspecto rugoso e
altamente basófilo, indicando uma cromatina organizada em grumos grosseiros, um
citoplasma pequeno e escasso aparecendo como um anel delgado em volta do
núcleo e diâmetro médio de 9,2 + 1,1 µm. Os neutrófilos caracterizam-se pela
presença de núcleo com dois a cinco lóbulos e diâmetro médio de 11,5
+ 1 µm; os
eosinófilos pelos abundantes grânulos acidófilos do citoplasma e diâmetro médio de
12,5 + 1,1 µm e os monócitos pelo núcleo com formato riniforme, cromatina em
arranjo mais frouxo e delicado do que o verificado nos linfócitos e diâmetro médio de
13,5 + 0,8 µm. Na Figura 6 são mostradas as células sanguíneas de Galea spixii e
na Tabela 5 os valores bioquímicos e hematológicos obtidos dos preás são
confrontados com os de outros roedores.
Formas amastigotas de Leishmania e em quantidades escassas foram
visualizadas nas lâminas por aposição e do histopatológico de baço dos animais
PS2 e PS3 (Figura 7). Não foram observadas alterações patológicas nesse órgão,
embora elevada quantidade de hemossiderina e eosinófilos (Tabela 6) tenha sido
presenciada tanto nos animais infectados e como nos controles. Anticorpos anti-
Leishmania foram encontrados no animal PS3 (Figura 8). A extração de DNA de
fragmentos de fígado foi realizada em todos os animais infectados e controle, mas a
de sangue só foi possível para os animais PS3 e PT1, em virtude da pequena
quantidade de material disponível. O DNA de L. infantum não foi encontrado em
nenhuma das amostras submetidas à PCR.
53
Tabela 3: Valores referentes ao hemograma completo de preás controle e infectados
experimentalmente com L. infantum: (Média
+ desvio padrão e nível de significância).
Período pós-infecção (dias) Parâmetros Controle
(0 + s)
30
(0 + s) 90 (0 + s) 180 (0 + s)
p
Hematócrito (%)
39,3 ± 1,4 40,5 ± 2,2 40,6 ± 1,6 36,8 ± 2,8
0,23
Eritrócitos (10
6
/mm
3
)
6,2 ± 0,5 6,0 ± 0,4 5,8 ± 0,6 5,3 ± 0,7
0,50
Hemoglobina (g/dl)
12,8 ± 1,2 12,4 ± 1,3 12,5 ± 1,2 11,2 ± 1,0
0,50
VCM (fL)
65,2 ± 1,3 67,7 ± 1,2 70,7 ± 5,7 69,8 ± 5,9 0,30
HCM (pg)
20,8 ± 0,5 20,5 ± 0,9 21,8 ± 0,4 21,2 ± 1,1 0,13
CHCM (g/dl)
31,8 ± 0,4 30,3 ± 1,7 31,0 ± 2,1 30,5 ± 1,1 0,42
Leucócitos (10
3
/mm
3
)
2,4 ± 1,6 3,6 ± 1,6 3,5 ± 2,1 5,6 ± 4,2
0,78
Plaqueta (10
3
/mm
3
)
439 ± 27 98 ± 45 236 ± 237 389 ± 135
0,19
Tabela 4: Contagem diferencial de leucócitos de preás dos grupos controle e
experimental (Média
+ desvio padrão e nível de significância).
Período pós-infecção (dias) Leucócitos Controle
(0 + s)
30
(0 + s) 90 (0 + s) 180 (0 + s)
p
(%)
1
35 ± 10,9 33 ± 16,0 35 ± 9,2 36 ± 5,5
0,99
Neutrófilos
(mm
3
)
2
744 ± 942,9 1056 ± 214,7 1085 ± 310,5 2011 ± 1460,7
0,84
(%)
1
1 ± 1,9 2 ±1,2 1 ± 0,6 3 ± 2,5
0,41 Eosinófilos
(mm
3
)
2
36 ± 45,8 72 ± 15,9 42 ± 16,6 231 ± 203,3
0,38
(%)
1
54 ± 12,4 59 ± 17,8 55 ± 10,4 51 ± 9,2
0,96 Linfócitos
(mm
3
)
2
2317 ±763,6 2290 ±1677,8 2069± 1638,2 2801± 2311,6
0,92
(%)
1
10 ± 2,9 6 ± 3,8 8 ± 1,7 9 ± 2,0
0,38 Monócitos
(mm
3
)
2
419 ±314,8 182 ± 89,7 256 ± 89,0 577 ± 453,4
0,53
Onde: 1-valores relativos; 2- valores absolutos
Tabela 5 : Valores hematológicos e bioquímicos séricos de preás comparado com
outras espécies de roedores
Espécies de roedores
Galea
spixii
1
Cavia
porcellus
2
Ratttus
norvegicus
2,3
Mus
musculus
2
Mesocricetus
auratus
2
Neotoma
fuscipes
4
Pr. tt (g/dl) 1,6 - 6,1 4,6 - 6,2 6,3 - 8,6 3,5 - 7,2 4,5 - 7,5 4,8 - 8,0
Alb (g/dl) 1,4 - 3,0 2,1 - 3,9 3,3 - 4,9 2,5 - 4,8 2,6 - 4,1 1,2 - 4,2
Glb (g/dl) 0,2 - 3,0 1,7 - 2,6 2,4 - 3,9 0,6 2,7 - 4,2 1,8 - 5,6
Ht (%) 33 - 42 37 - 48 37 - 49 39 - 49 36 - 55 37 - 49
Hg (g/dl) 10,2 - 14,5 11 - 15 11,5 - 16 10,2- 16 10 - 16 8,2 -14
Et (10
6
/mm
3
) 4,6 - 6,9 4,5 - 7,0 4,8 - 8,5 7 - 12,5 6 - 10 5,7 - 11,2
Lc(10
3
/mm
3
) 0,9 - 9,2 7 - 18 4 - 10,2 6 - 15 10 - 16 4,2 - 31,5
Linf (%) 40 - 78 39 - 72 65 - 85 55 - 95 50 - 95 17 - 44
Nt (%) 18 - 50 28 - 44 9 - 34 10 - 40 10 - 42 27 - 50
Mn (%) 3 - 14 3 - 12 0 - 5 0,1-3,5 0 - 3 2 - 5
Eos (%) 0 - 6 1 - 5 0 - 6 0 - 4 0 - 4,5 0 - 6
Bas (%) 0 0 - 3 0 - 1,5 0 - 0,3 0 - 1 0 - 3
Pl (10
3
/mm
3
) 49 - 509 250 - 850 450 - 885 160 - 410 200 - 500 449 - 933
Prt = Proteínas totais, Alb = Albumina, Glb = globulina, Ht = Hematócrito, Hg= Hemoglobina, Ert=
Eritrócitos, Leu = Leucócitos totais, Linf= Linfócitos, Nt = Neutrófilos, Mn = Monócitos,
Eos=Eosinófilos, Bas = Basófilos, Plq = Plaquetas
1- Trabalho atual; 2- HARKNESS e WAGNER (1993); 3- PRITCHETT e CORNING (2004); 4-
WEBER et al. (2002).
54
B
A
C
D
Figura 6- Células sanguíneas de Galea spixii (x100): A - Neutrófilo; B-
Eosinófilo; C – Monócito, linfócito e plaquetas (setas); D
–
Linfócito.
55
O manejo dos animais foi facilitado tendo em vista que os animais não
demostraram comportamento agresssivo quando manipulados. No entanto, em
algumas circunstâncias verificou-se que os preás demonstraram-se inquieto,
movendo-se velozmente dentro da gaiola dificultando sua apreensão. Agressões
entre os animais foram observadas em duas situações. Na primeira uma mãe
agrediu seu filhote de quatro semanas de vida, após ausência por dois dias na
gaiola. Numa outra circustância duas fêmeas agrediram uma terceira, dois dias após
a chegada ao cativeiro.
Tabela 6 – Achados histopatológicos de baço de preás dos grupos controle e
experimental.
PMPI Animais Eosinófilos Hemossiderina
Leishmania
PC1
+++ ++ -
PC2
++ + -
PC3
++++ ++++ -
Controle
PC4
++++ ++ -
PT1 + + -
PT2 ++ ++ -
30
PT3 + +++ -
PN1 ++ +++ -
PN2 ++ ++++ -
90
PN3 +++ ++ -
PS1 + + -
PS2 ++++ ++++ +
180
PS3 ++++ + +
Mesmo em condições de laboratório ocorreram gestações em fêmeas que
estavam na companhia de machos. No total foram quatro, uma envolvendo o animal
PS3 (151
0
dia após a infecção), duas com o PC3 (70
0
e 131
0
dia do experimento) e
uma outra com o PN1 (após a quarentena e 30 dias antes da infecção). Neste último
foi verificada uma gestação de 47
+ 2 dias. Os animais PS3 e PN1 tiveram
gestações com um filhote apenas, enquanto que nas duas gestações do PC3
obteve-se dois filhotes em cada. Do total de filhotes (6) dois morreram (um aos 15
dias e o outro aos 56 dias após nascimento).
56
A B
Figura 7 – Histopatológico de baço de preás infectados com Leishmania infantum
(x1000): A e B – baço do preá PS2 (HE) ; C e D – baço do preá PS3
(HE e Giemsa, respectivamente); setas brancas amastigotas de
Leishmania; setas pretas hemossiderina ( ) e ( ) eosinófilos.
C
D
57
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
Anticorpos anti-Leishmania (DO=460nm)
A
0,050
30 90 180
Dias
p
ós-infec
ç
ão
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Anticorpos anti-Leishmania (DO 460nm)
B
0,148
30 90 180
Dias pós-infecção
Figura 8- Anticorpos séricos anti-Leishmania de
preás infectados experimentalmente com
Leishmania infantum. A - mensuração de
anticorpos pelo ELISA com extrato bruto;
B – mensuração de anticorpos pelo ELIS
A
rK39.
58
3.2 Investigação de roedores naturalmente infectados por Leishmania
infantum
No perímetro rural dos municípios de Brejinho, Campo Redondo, Coronel
Ezequiel, Passa e Fica e Várzea, no Estado do Rio Grande de Norte, foram
capturados 79 roedores pertencentes às espécies Rattus rattus, Bolomys lasiurus,
Oligoryzomys nigripis, Oryzomys subflavus e Trichomys apereoides (Figura 9). A
espécie Rattus rattus foi a mais abundante e a única capturada em ambiente
peridomiciliar e silvestre (Tabela 7).
No momento da coleta os animais foram examinados quanto ao seu estado
corpóreo, aspecto da pelagem, elasticidade da pele e presença de lesões ou áreas
de alopecia, não tendo sido encontrado nenhum sinal sugestivo de enfermidade. O
parasita L. infantum não foi visualizado nos esfregaços sanguíneos e lâminas
confeccionadas a partir de fragmentos de fígado e baço dos animais capturados, e
nem nas cultura de fragmentos de tecidos colhidos dos animais capturados a campo.
Igualmente, anticorpos anti-Leishmania não foram encontrados em nenhuma das
amostras analisadas (Figura 10).
59
AB
C
D
E
Figura 9 – Outras espécies de roedores capturadas em cinco municípios do
Estado do Rio Grande do Norte: A- Trichomys aperoides; B-
Bolomys lasiurus; C- Rattus rattus; D- Oryzomys subflavu
s
(BRASIL,2002) -; E- Oligoryzomys nigripis.
60
Tabela 7- Distribuição dos roedores de acordo com o local de captura
Espécies
Rattus rattus
Municípios
P
1
S
2
Bolomys
lasiurus
Oligoryzomys
nigripis
Oryzomys
subflavus
Trichomys
apereoides
Total
Brejinho 12 - 3 1 1 - 17
Campo
Redondo
11 - - - - 1 12
Coronel
Ezequiel
1 - - - - - 1
Passa e
Fica
7 3 - - - 3 12
Várzea 13 2 17 1 4 37
Total 44 5 20 2 1 7 79
1
Peridomicílio,
2
silvestre
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
Anticorpos anti-Leishmania (DO 460nm)
0, 131
Rattus
rattus
Origor
y
zomys
nigripes
Bolomys
lasiurus
Trichomys
apereoides
Oryzomys
subflavus
Espécies
Figura 10 – Anticorpos séricos anti-Leishmania de
roedores capturados no Rio Grande do Norte.
61
4 Discussão
A leishmaniose visceral americana permanece um importante problema de
saúde pública no Brasil, não obstante as medidas de controle que vêm sendo
realizadas pelos órgãos de saúde pública. Estas incluem a eliminação de cães,
quando sorológico ou parasitologicamente positivos. No entanto, a existência de
reservatórios silvestres, alguns ainda desconhecidos, atuando como fontes de
infecção, provavelmente impossibilita a erradicação da doença (LAINSON;
ISHIKAWA; SILVEIRA, 2002).
No presente estudo investigou-se a presença de infecção por L. infantum em
roedores capturados no Estado do Rio Grande do Norte. Esses animais são os
principais reservatórios silvestres das espécies de Leishmania responsáveis pela
forma tegumentar e registros de infecção natural por L. infantum no Brasil
(OLIVEIRA et al., 2005) e Colômbia (TRAVI et al., 1998b) despertam atenção para
necessidade de melhor conhecer a participação destes animais na transmissão da
LVA.
Num primeiro momento foi verificada a possibilidade de infectar
experimentalmente preás Galea spixii (Wagler) com L. infantum. Estes pequenos
roedores são bastante abundantes no Estado e em virtude de sua boa adaptação às
inóspitas condições do semi-árido nordestino, são considerados importantes fontes
de proteína animal para as populações rurícolas, especialmente nos períodos de
escassez pluviométrica (PINHEIRO; ANDRADE; CUNHA, 1989), sendo comumente
encontrados próximos às residências em propriedades rurais e periferias das
cidades interioranas.
A principal dificuldade encontrada para a concretização do estudo foi a
elevada mortalidade, verificada principalmente durante o período de quarentena
62
(34,78%). Esta mesma dificuldade foi relatada por Pinheiro, Andrade e Cunha
(1989) em tentativas de criação em cativeiro (mortalidade de 48,69%, 73,33% e
38,95% para matrizes, reprodutores e filhotes, respectivamente), indicando a
dificuldade de adaptação de alguns animais às condições artificiais. No entanto, a
ocorrência de coberturas e nascimentos de filhotes e a observação de parâmetros,
tais como, peso corporal, período de gestação e intervalos entre partos, semelhantes
aos descritos por Lacher (1981), em cujo experimento os animais foram mantidos
em condições semelhantes à natural, corroboram para a possibilidade de
manutenção destes animais em condições laboratoriais, quando necessário for, para
conhecimento e esclarecimento de aspectos sanitários relativos à espécie.
Após monitoramento por 30, 90 e 180 dias, não se constatou diferenças no
ganho de peso total e temperatura retal entre os animais infectados com L. infantum
e os controles. O fato de alguns animais pertencentes aos diferentes grupos terem
apresentado um ganho de peso muito pequeno pode ser explicado pelo alcance do
peso adulto, a partir do qual os acréscimos são quase insignificantes (LACHER,
1981). Elevação de temperatura e perda de peso têm sido descritos em humanos
(MINODIER et al, 1998; HAIDAR; DIAB; EL-SHEIKH, 2001; KAFETZIS, 2003) e
animais (CIARAMELLA et al, 1997; KOUTINAS et al, 1999; MATTOS JR et al., 2004;
BARROUIN-MELO et al., 2005) com LV.
Os dados de temperatura retal registrados nos preás Galea spixii variaram de
36,0
o
a 40ºC. Dellias (1969) monitorando 25 preás da espécie Cavia aperea
capturados em Campos do Jordão, São Paulo, e mantidos em biotério simulando o
habitat natural, observou amplitude total de 35
o
C a 39
o
C, face às variações
termométricas do meio ambiente. A amplitude encontrada foi superior a registrada
para outros roedores freqüentemente utilizados em estudos laboratoriais, como
63
cobaia (Cavia porcellus, família Cavidae), 37,2º a 39,5ºC; rato norueguês (Rattus
norgegicus, família Muridae), 35,9º a 37,5ºC; camundongo (Mus musculus, família
Muridae), 36,5º a 38,0ºC; e hamster (Mesocricetus auratus, família Cricetidae), 37,0
o
a 38
o
C (HARKNESS e WAGNER, 1993).
Os valores dos hematócritos completos e os parâmetros bioquímicos
proteínas totais, albumina e globulina também não diferiram entre os grupos,
provavelmente em razão da inexistência de uma infecção severa com
comprometimento sistêmico nos animais infectados. Em cães acometidos por LV os
achados laboratoriais mais frequentes são: hiperproteinemia, hiperglobulinemia,
hipoalbuminemia, anemia, trombocitopenia, leucocitose ou leucopenia e aumento
sérico das enzimas hepáticas, da uréia e da creatinina (CIARAMELLA et al., 1997;
CAMPINO et al., 2000; SANTOS-GOMES et al., 2002 e 2003; ALMEIDA et al.,
2005b, COUTINHO, 2005). Em gambás Didelphis marsupialis experimentalmente
infectados, Travi et al. (1998a) verificou hipoalbuminemia. Quanto aos roedores, os
registros da variação destes parâmetros em animais infectados são escassos.
Monitorando Proechimys semispinosus, Lainson, Ishikawa e Silveira (2002)
verificaram hematócrito variando entre 29 a 42% entre os animais infectados com L.
infantum e controles, sem diferenças significativas entre os dois grupos.
Ressalta-se que este é o primeiro registro de parâmetros hematológicos e
bioquímicos em preás. Os valores encontrados assemelharam-se aos observados
em outros roedores de uso rotineiro em práticas laboratoriais e com o roedor
silvestre Neotoma fuscipes (Muridae), encontrado nos EUA e México, cujos valores
foram obtidos pelo exame de 36 animais (WEBWE et al., 2002). Todavia, os valores
mínimos de proteína total, globulina, leucócitos totais, hematócrito e plaquetas
observados nos preás foram inferiores aos dos outros roedores. Maior semelhança
64
foi verificada com os dados da cobaia, que guarda com o preá maior relação
morfológica e filogenética, pois ambos pertencem a mesma família Caviidae
Na contagem diferencial dos leucócitos também não houve diferença
significativa entre os grupos. O leucócito mais abundante foi o linfócito, como
também observado em outros roedores como cobaia, rato norueguês, camundongo
e hamster (HARKNESS; WAGNER, 1993; WEBWE et al., 2002, PRITCHETT;
CORMING, 2004), embora em humanos os neutrófilos sejam os leucócitos mais
freqüentes (CORMACK, 1991; PRITCHETT; CORMING, 2004). Os leucócitos dos
preás são morfologicamente semelhantes aos encontrados em humanos
(CORMACK, 1991), sendo que os eosinófilos apresentam grânulos acidófilos mais
evidentes, como observado em eqüinos (BANKS, 1992).
A infecção com L. infantum foi obtida em dois animais eutanasiados 180 dias
após a inoculação e diagnosticada a partir das análises histopatológicas e lâminas
por aposição confeccionadas com fragmentos de baço. A visualização de escassos
parasitas e a ausência de alterações patológicas significativas indicam uma infecção
sub-patente com baixa carga parasitária e, por isso, não identificada nas culturas.
Em um desses preás a infecção também foi confirmada pela identificação de
anticorpos anti-Leishmania pelo ELISA. Quanto às elevadas quantidades de
hemossiderina e eosinófilos observadas, essas não estão relacionadas à presença
de Leishmania, mas, provavelmente, à presença de outro(s) microsganismo(s) não
identificado(s).
Com relação a não positividade dos animais infectados pela PCR, técnica
cuja elevada precisão torna possível a detecção do kDNA equivalente a um único
parasita (RODGERS et al.,1990), deve-se considerar que o parasita primeiro
coloniza os linfonodos regionais e baço e, só então, migra para outros órgãos como
65
medula óssea e fígado (RIÇA-CAPELA et al., 2003). Uma outra possibilidade que se
afigura é que a Leishmania poderia estar distribuída no fígado de maneira multifocal,
como observado em situações de colonização recente (PARANHOS-SILVA et al.,
2003) e, assim, ausente no fragmento analisado. Nossos resultados concordam com
os obtidos por Di Bella et al., (2003) pesquisando Leishmania infantum em Rattus
rattus, que verificaram maior positividade dos animais pela sorologia do que pela
técnica de PCR.
Para compreensão da infecção em apenas dois animais, mesmo que todos
tenham sido submetidos às mesmas condições do experimento, necessário se faz
considerar a heterogeneidade genética das populações silvestres, o que implica na
existência de diferentes graus de susceptibilidade entre os indivíduos, como tem sido
bem estabelecido em modelos murinos (BLACKWELL, 1996). Grandoni et al (1983)
verificaram que dos 22 ratos (Rattus rattus) infectados experimentalmente, apenas
um exibiu uma elevada carga parasitária.
Esta dificuldade em infectar preás experimentalmente indica, mesmo sem o
conhecimento do perfil das citocinas produzidas, que eles são resistentes à infecção
por L. infantum e que, portanto, não são bons modelos para estudos da interação
parasita–hospedeiro em laboratório, pois haveria necessidade de infectar um grande
número de animais para garantir a infecção de uma parcela limitada. No entanto,
quanto à possibilidade destes animais serem reservatórios naturais da enfermidade
é necessário que fatores epidemiológicos e ambientais como, por exemplo,
incidência de infecção em cães, abundância de insetos vetores, degradação
ambiental, entre outros, sejam considerados.
Na Itália, mesmo que apenas um baixo número de Rattus rattus tenha sido
encontrado naturalmente infectado (POZIO et al., 1981), a constatação de
66
infectividade para as espécies Phlebotomus perniciosus e P. perfiliewi, responsáveis
pela propagação do parasita na região, determinou o papel destes animais como
importante fonte de infecção local (GRANDONI et al., 1983). No mesmo sentido
Travi et al (2002), embora verificando infecção compartimentalizada e baixa
infectividade para Lutzomya longipalpis, consideraram a possibilidade do
Proechimys semispinosus atuar como reservatório de L. infantum na Colômbia,
graças à sua elevada densidade populacional e próximo contato com humanos.
No Rio Grande do Norte a espécie Lutyzomia longipalpis é a espécie mais
abundante e, provavelmente, mais adaptada ao ambiente peridomiciliar (XIMENES
et al., 2000). Esta espécie é responsável pela transmissão de leishmaniose visceral
em todo o nordeste brasileiro, sendo atraída pela presença de diversos animais
mantidos em abrigos improvisados próximos às residências (XIMENES; SOUZA;
CASTELLÓN, 1999). Embora próximos geograficamente, não existe registro de que
na natureza L. longipalpis utilize preás como fonte de alimentação preferencial.
Todavia, fêmeas Phlebotominae ingurgitadas foram capturadas em abrigos destes
animais (XIMENES; SOUZA; CASTELLÓN, 1999) e estas não recusam alimentar-se
desta espécie em condições de laboratório, com animais anestesiados (XIMENES et
al., 2002)
2
, sugerindo esta possibilidade também “in natura”.
Neste estudo não foi avaliada a transmissão de L. infantum durante o repasto
de L. longipalpis. Entretanto, ponderando o fato de que na natureza estes animais
poderiam servir de fonte de alimentação para fêmeas flebotomíneas e considerando
que os preás são animais abundantes, de alta prolificidade e convivendo em
proximidade com o homem e o cão, parcela susceptível da população de preás, se
capaz de manter o parasita em seu organismo, poderia atuar como elo de ligação
2
Ximenes et al, op. cit.
67
entre o ciclo silvestre e peridomiciliar de transmissão da leishmaniose visceral no
nordeste brasileiro.
A forma de infecção dos animais deve ainda ser avaliada para compreensão
dos resultados. Embora seja possível infectar experimentalmente um animal
utilizando o parasita na sua forma de amastigota ou promastigota, obtendo-se
infecções com similares características parasitológicas, histopatológica e
imunológica, um maior período de latência e um maior percentual de animais
assintomáticos são verificados quando se utiliza a forma promastigota (RIÇA-
CAPELA et al., 2003, PARANHO-SILVA et al., 2003). Adicionalmente, um período
maior de monitoramento poderia seria necessário para acompanhar o
estabelecimento da infecção, considerando que essas só foram identificadas em
animais com 180 dias pós-infecção e que, embora não se conheça a longevidade de
preás em ambiente natural, em cativeiro sabe-se que este é superior a quatro anos
(LACHER, 1981). Um tempo de vida suficientemente longo e a ausência de uma
infecção aguda, sem grandes prejuízos ao hospedeiro são características apontadas
por Chable-Santos et al. (1995) para um reservatório animal ideal ao parasita.
Faz-se necessário que outros estudos sejam realizados a fim de confirmar o
papel dos preás Galea spixii como hospedeiros de Leishmania infantum no Rio
Grande do Norte e a possibilidade de, albergando o parasita em seu organismo, ele
possa ser fonte de infecção para os hospedeiros invertebrados que trariam o
parasita ao cão ou ao próprio homem.
Concomitantemente investigou-se infecção natural por Leishmania infantum
em roedores capturados em cinco municípios situados na região Trairi (Campo
Redondo e Coronel Ezequiel) e Agreste (Brejinho, Passa e Fica e Várzea) do Rio
Grande do Norte. Todos os municípios investigados caracterizam-se por ter na
68
agropecuária sua principal atividade econômica e pequena população, variando de
5.409 (Coronel Ezequiel) a 10.370 (Brejinho) habitantes (INSTITUTO BRASILEIRO
DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2005).
Não obstante a seleção dos municípios ter sido feita pela Secretaria Estadual
de Saúde-RN para realização de monitoramento da presença de Yersina pestis, em
todos eles há fortes indícios da presença de transmissão ativa de leishmaniose
visceral. No período de janeiro de 2000 a junho de 2004, registros da enfermidade
canina foram realizados em todos os municípios, enquanto que a doença humana só
não foi constatada em Campo Redondo. Nos demais, Brejinho, Coronel Ezequiel,
Passa e Fica e Várzea, foram notificados 1, 1, 2 e 3 casos autóctones,
respectivamente (SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE, 2005).
Foram capturados 79 roedores de cinco espécies diferentes: Rattus rattus,
Bolomys lasiurus, Oligoryzomys nigripis, Oryzomys subflavus e Trichomys
apereoides. Nenhum dos animais apresentou sinais aparentes de infecção e em
nenhum deles foi demonstrada a presença de Leishmania infantum e nem de
anticorpos anti-Leishmania.
O Rattus rattus, também conhecido como rato preto ou ratazana, foi a espécie
mais freqüentemente encontrada e a única capturada em áreas peridomiciliares.
Esta espécie tem sido identificada com infecção por L. infantum em regiões no Velho
Mundo (BETTINI; POZIO; GRANDONI, 1980; POZIO et al., 1981; GRAMICCIA et al.,
1982; IBRAHIM et al., 1992; DI BELLA et al., 2003) e Novo Mundo (ZULUETA et al.,
1999). Quando infectados experimentalmente esses animais mostram-se bastante
resistentes ao parasita Leishmania infantum e alguns se tornam portadores de uma
infecção sub-patente que persiste por um longo período (GRANDONI et al., 1983).
No Brasil exemplares de Rattus rattus foram encontrados albergando L. mexicana e
69
L. braziliensis em Minas Gerais (OLIVEIRA et al., 2005) e L. braziliensis nos
Estados do Ceará (VASCONCELOS et al., 1994) e Pernambuco, onde, juntamente
com o Bolomys lasiurus, têm sido considerado como elo de ligação entre o ciclo
doméstico e silvestre de transmissão deste parasita (BRANDÃO-FILHO et al., 2003).
Uma outra espécie de roedor capturado neste trabalho e constatada livre do
parasita Leishmania, o Oryzomys subflavus, conhecido vulgarmente como rato-de-
arroz, foi encontrado infectado por L. amazonensis no Ceará (CANTARINO, 1998),
enquanto que animais do gênero Oryzomys spp são considerados reservatórios de
Leishmania mexicana na região amazônica (NERY-GUIMARÃES; AZEVEDO;
DAMASCENO, 1966). Quanto à espécie Trichomys apereoides, pequeno roedor
conhecido como punaré, que habita áreas rochosas, vivendo em fendas ou debaixo
de rochas ou sob plantas suculentas como cactus (NOWAK, 1991), um espécime foi
recentemente encontrado infectado por L. infantum no Estado de Minas Gerais e seu
papel como fonte destes parasitas no ciclo silvestre de transmissão da leishmaniose
visceral foi pela primeira vez sugerido (OLIVEIRA et al., 2005).
Embora não tenham sido identificados animais positivos para Leishmania
neste estudo, não se descarta a participação destes animais no ciclo epidemiológico
de transmissão de leishmaniose visceral. Ao contrário, a concentração de casos
humanos e de animais em áreas rurais e, mais recentemente, nas áreas suburbanas
dos grandes centros, onde as condições de higiene são geralmente precárias,
reforça a suspeita de que, juntamente com os cães, roedores possam estar atuando
como elos de ligação entre os ciclos silvestre e peridomiciliar de transmissão das
leishmanioses. No entanto, mais investigações devem ser realizadas no sentido de
identificar animais positivos e esclarecer seu papel na transmissão.
70
5 Conclusões
1. Os preás da espécie Galea spixii (Wagler) são resistentes à infecção por L.
infantum e não são bons modelos para o estudo da leishmaniose visceral,
embora possam atuar como fontes de infecção do parasita em áreas
endêmicas do Estado do Rio Grande do Norte;
2. A utilização de formas promastigotas na inoculação de preás pode ter
retardado o estabelecimento da infecção com L. infantum;
3. Valores hematológicos e bioquímicos séricos de preás foram pela primeira
vez descritos, assemelhando-se com os valores de roedores de uso
rotineiro em laboratório;
4. As análises histopatológicas e as lâminas por aposição foram as técnicas
que apresentaram maior sensibilidade na identificação de animais com
baixa carga parasitária de L. infantum;
5. O parasita Leishmania infantum não foi identificado em nenhum dos
roedores capturados nos municípios de Brejinho, Campo Redondo,
Coronel, Ezequiel, Passa e Fica e Várzea, RN;
71
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APÊNDICE
TABELA I: Peso corporal dos Galea spixii dos grupos controle e experimentais
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175 180
P1C
304 307 299 294 302 306 298 290 292 294 299 300 302 304 305 306 300 295 296 299 300 301 304 304 303 306 307
P2C
190 201 210 218 224 229 236 243 246 248 249 250 251 255 251 254 253 253 259 262 261 265 269 270 274 270 272
P3C
324 322 320 316 327 340 361 387 392 415 425 380 375 373 383 396 421 440 459 370 375 381 392 408 419 423 425
P4C
262 312 316 320 323
P1T
305 309 307 309 308
P2T
352 356 360 371 372
P3T
238 243 247 259 274
P1N
363 369 363 365 366 362 366 368 377 385 380 384 391 400
P2N
269 271 277 285 299 288 286 294 306 312 321 338 347 356
P3N
182 185 188 192 196 204 212 215 214 218 224 233 228 233
P1S
327 320 319 323 327 332 333 345 347 332 331 324 327 328 329 335 343 355 340 333 346 351 353 349 351 340 341
P2S
254 251 247 249 250 258 258 260 258 263 268 272 271 266 271 284 295 304 300 297 321 362 380 303 308 315 320
P3S 238 260 261 263 264 266 260 254 259 269 284 310 323 334 332 306 318 328 335 342 350 359 345 351 356 361 368
TABELA II: Temperatura retal dos Galea spixii dos grupos controle e experimentais
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175 180
P1C
37,4 37,5 38,6 37,4 37,4 37,9 38,2 38,2 37,8 38,3 38,4 38,5 38,7 39 38,1 38,2 37,6 37,5 36,5 38,3 37 38,5 38,8 39 40 38,3 37,6
P2C
37,9 38 38,5 37,8 37,8 37,3 38,6 38,7 37,6 38,2 37,9 37,5 39 39,2 38,4 38,1 37,7 37,6 37,5 37 37,1 38 37,9 38 37,5 39,6 37
P3C
38 38,4 38,3 37 38 38,1 38,8 38,3 38,1 39 38,1 38 39,1 39,3 39 39 37,3 37,4 38,4 39,8 37,4 38,5 37 38,3 37,5 37 37,8
P4C
37,9 37,5 37,5 37,6 38
P1T
36 37 37,5 37,47 3
P2T
36,8 37 37,5 37,6 38,1
P3T
37,6 37,8 37,5 37,8 38
P1N
38,4 38,6 38,3 38 38,5 38,7 38,6 38 38,7 38 38 37,7 37,5 37,2
P2N
37 37,5 37,5 37,7 38 38 37,9 38 38,4 38,1 38,8 38,6 38 37,6
P3N
37 37,1 37,8 37,9 37,5 37,6 37,8 37,5 37,3 37,6 38,2 37,6 38 37,5
P1S
38,7 38,4 38,3 38,2 38 38,1 37,7 38,5 39,3 38 36,8 37,5 38,5 38,6 39,5 39,1 39,2 39 38 38,2 37 37 37 36,7 37,6 37,5 37,5
P2S
39,4 38,7 38,8 38,7 38,7 37,7 37,5 38,1 39,5 38,2 37,5 37,8 38,5 38,7 39,2 38,5 38,2 38,7 38,5 38 39 39 39,2 9,4 38,6 38,5 38
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