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ADRIANO ANTONIO SILVA
_________________________________________________________________________
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA PLANTA CENCHRUS ECHINATUS L.
(POACEAE)
_________________________________________________________________________
Dissertação apresentada ao curso de Pós-graduação em
Química da Universidade Estadual de Maringá,
como requisito parcial para o título de Mestre em
Química.
Área de Concentração: Química dos Produtos Naturais
Orientador: Prof. Dr. Gentil José Vidotti
Maringá – PR
Universidade Estadual de Maringá – UEM
2008
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“A sabedoria da vida não está em fazer aquilo que se gosta,
mas em gostar daquilo que se faz”.
(Leonardo da Vinci)
Aos meus sogros, Codi e Eva, pelo apoio, compreensão e confiança.
Ao meu porto seguro e amada esposa Shirani,
por compartilhar e participar da minha vida
em todos os momentos!!!!
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, família e amigos.
À minha mãe, meus sogros, meus avós e à tia Silvia pelo amor, carinho e apoio de
sempre.
Á minha esposa Shirani pelo amor, amizade, carinho, dedicação, paciência e
principalmente, por ser minha base forte em todos os momentos em que necessitei de
amparo.
Ao prof. Dr. Gentil José Vidotti pelos conhecimentos transmitidos, pela orientação,
conselhos, paciência e, sobretudo, pela sincera amizade e auxilio em momentos difíceis
que surgiram durante todo o processo de execução deste trabalho.
Á Profa. Dra. Maria Helena Sarragioto pelas valiosas sugestões, as quais foram de
grande importância a este trabalho.
Á Profa. Dra. Cleuza Conceição da Silva pelo auxilio, atenção e sugestões que foram
cruciais para a conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Adley Forti Rubira, pela amizade, reconhecimento, conselhos e,
principalmente, o estímulo para buscar sempre o melhor de si.
Aos meus eternos amigos, “Crespo”, “Marcão”, “Marcola”, “Rafa”, “Rafão”, “Raíssa” e
Thelma, pela sincera amizade, alegria, companherismo, força, apoio e carinho.
É claro que não poderia deixar de agradecer, especialmente, a melhor aluna de iniciação
científica com a qual já trabalhei, minha querida amiga Thelma. Muito obrigado pelo
empenho, dedicação, compreensão e, principalmente, pela tão grande vontade de
aprender.
Enfim, agradeço a todos os colegas de laboratório pela amizade e as contribuições a este
trabalho.
À CAPES e à UEM pelo suporte financeiro.
Ao Departamento de Química da UEM, pela disponibilidade de concretização deste
trabalho.
Aos membros da Secretaria de Pós-Graduação Claudemir e Cristina, pela
disponibilidade e amizade.
Ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura e à aluna Karine do Departamento de Análises
Clínicas da UEM pelas análises da atividade antiproliferativa.
A Profa. Drª. Maria Lucília Zamuner do Departamento de Farmácia da UEM pelo
auxilio no teste moluscicida.
A Profa. Drª. Ciomar Basani e à aluna Juliana Oliveira do Departamento de Farmácia da
UEM pelas análises das atividades antiinflamatória e antimicrobiana.
Ao Prof. Dr. Jesui Vergílio e à aluna Ana Carolina do Departamento de Química da
UEM pelas análises de Teor de Ácidos Graxos e Análise Centesimal.
À Ivânia pela amizade, ajuda e realização dos espectros de RMN, que foi uma das
partes mais importantes e mais difíceis do meu trabalho.
Aos professores membros da banca: Profª. Drª. Maria Helena Sarragiotto, Cleuza
Conceição da Silva, Ernani Abicht Basso, César Cornélio Andrei e Terezinha de Jesus
Faria, pela disponibilidade.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.
i
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS iv
ÍNDICE DE TABELAS v
ANEXO - ÍNDICES DE ESPECTROS vi
ANEXO - ÍNDICE DE TABELAS DE COMPARAÇÃO x
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS xi
RESUMO xiv
ABSTRACT xv
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Química de produtos naturais 1
1.2. Produtos naturais no Brasil 3
1.3. Produtos naturais e interações com meio ambiente 3
1.4. Ácidos graxos em plantas 4
1.5. Proteínas e minerais 6
1.6. Atividades biológicas 7
1.6.1. Atividade antiinflamatória 7
1.6.2. Atividade antimicrobiana 7
1.6.3. Atividade antiproliferativa 8
1.6.4. Atividade antioxidante 8
1.6.5. Atividade moluscicida 9
1.6.6. Toxicidade frente à Artemia salina Leach 9
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 10
2.1. Gramíneas e Cenchrus echinatus 10
3. PARTE EXPERIMENTAL 13
3.1. Instrumentação e material cromatográfico 13
3.2. Solventes utilizados 14
3.3. Coleta e secagem da planta 14
ii
3.4. Preparação e particionamento do extrato bruto das sementes 14
3.5. Preparação e particionamento do extrato bruto das raízes 15
3.6. Preparação e particionamento do extrato bruto das folhas e caules 15
3.7. Preparação e fracionamento do extrato alcaloídico das sementes 15
3.8. Elaboração do perfil cromatográfico dos extratos 16
3.9. Avaliação da atividade antiinflamatória dos extratos brutos e partições
das sementes e raízes
16
3.10. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos brutos e partições
das sementes e raízes
17
3.11. Avaliação da atividade antiproliferativa 17
3.11.1. Cultura das células 17
3.11.2. Atividade antiproliferativa 18
3.12. Avaliação da atividade antioxidante dos extratos brutos e partições 19
3.13. Avaliação da toxicidade frente à Artemia salina L. 19
3.14. Avaliação da atividade moluscicida 20
3.15. Teor de ácidos graxos das sementes, folhas e caules 20
3.16. Análise centesimal das sementes e folhas 21
3.16.1. Teor de umidade e cinzas 21
3.16.2. Proteína bruta 21
3.17. Isolamento de CE-01 e CE-02 22
3.18. Isolamento de CE-03 e CE-04 22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 24
4.1. Extratos e perfis cromatográficos 24
4.2. Avaliação da atividade antiinflamatória 24
4.3. Avaliação da atividade antimicrobiana 27
4.4. Composição de acidos graxos e análise centesimal 27
4.5. Avaliação da atividade antioxidante 29
4.6. Avaliação da atividade contra Artemia Salina L. 30
4.7. Avaliação da atividade antiproliferativa 31
4.8. Avaliação da atividade moluscicida 32
4.9. Identificação de CE-01 32
4.10. Identificação de CE-02 39
iii
4.11. Identificação de CE-03 47
4.12. Identificação de CE-04 50
5. CONCLUSÕES 53
6. PRINCIPAIS REFERÊNCIAS 54
ANEXO - EXPECTROS 57
ANEXO - TABELAS DE COMPARAÇÃO 86
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Efeito dos extratos da raiz (EMR) e da semente (EMS) de Cenchrus echinatus
sobre o edema de orelha induzido pelo óleo de cróton (OC). Animais que receberam
apenas veículo acetona/água (V)
25
Figura 2. Efeito antiinflamatório tópico das frações de Cenchus echinatus L. 26
Figura 3. (-) Palidol 34
Figura 4. Expansão dos hidrogênios dos anéis para e meta substituídos. 34
Figura 5. Expansão dos hidrogênios de carbonos saturados. 35
Figura 6. Espectro de
1
H de CE-01 35
Figura 7: Espectro de RMN de
13
C para CE-01 36
Figura 8. Mapa de contornos NOESY para CE-01 36
Figura 9. Correlação através de NOE entre os hidrogênios dos anéis ciclopenteno 37
Figura 10. Algumas correlações de HMBC dos carbonos de junção de anel 37
Figura 11. Mapa de contornos HMBC para CE-01 38
Figura 12. Espectro de ESI – MS/MS para CE-01 38
Figura 13. Estrutura molecular deCE - 02 39
Figura 14. Espectro de RMN de
1
H para CE - 02 41
Figura 15. Espectro de
13
C para CE - 02 41
Figura 16. Espectro de
13
C para CE - 02 42
Figura 17. Expansão do Espectro de RMN de
13
C para CE - 02 42
Figura 18. Correlações de HMBC do grupo furano com as demais partes da molécula
de CE-02
43
Figura 19. Correlações de HMBC do grupo furano com as demais partes da molécula
de CE-02
44
Figura 20. Leachianol D à esquerda e Lechianiol E à direita. 45
Figura 21. Principais correlações de NOESY para CE-02 46
Figura 22. Espectro de RMN de
1
H da mistura de CE-01 e CE-03 47
Figura 23. Espectro de RMN de
1
H, em CD
3
OD, da mistura de CE-01 e CE-03 47
Figura 24. Mapa de Contornos COSY, em CD
3
OD, da mistura de CE-01 e CE-03 48
Figura 25. Isômero CE-03 à esquerda, Palidol (CE-01) à direita 49
Figura 26. Nepalensinol B 49
Figura 27. Espectro de ESI – MS/MS para o íon de CE-04 Dicarregado 51
Figura 28. Espectro de ESI – MS/MS para o íon de CE-04 Monocarregado 52
v
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Porcentagem de inibição do edema de orelha induzido pelo óleo de Cróton
(200 μg)
25
Tabela 2. Composição e somatórios de ácidos graxos na semente de Cenchrus
echinatus L.
28
Tabela 3. Composição e somatórios de ácidos graxos na folha de Cenchrus echinatus L. 28
Tabela 4. Comparação da composição de alguns ácidos graxos de Cenchrus echinatus
com outras oleaginosas
24
.
29
Tabela 5: Resultados da Análise Centesimal do C. echinatus. 29
Tabela 6. Resultados para a atividade antioxidante (IC
50
). 30
Tabela 7. Resultados para toxicidade frente à A. salina (DL
50
). 30
Tabela 8. Resultados para o teste antiproliferativo. 31
Tabela 9. Resultados para o teste antiproliferativo em tempos determinados. 32
Tabela 10. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e NOESY
(300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) para o composto CE-01.
33
Tabela 11. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e NOESY
(300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) para o composto CE-02.
40
Tabela 12. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e NOESY
(300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) para o composto CE-04.
50
vi
ANEXO - ÍNDICES DE ESPECTROS
Espectros de RMN de
1
H
E R
1
H-1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01. 57
E R
1
H-1 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
57
E R
1
H-1 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
58
E R
1
H-2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02. 66
E R
1
H-2 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
66
E R
1
H-2 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
67
E R
1
H-2 - Expansão 3. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
67
E R
1
H-3. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04. 76
E R
1
H-3 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
76
E R
1
H-3 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
77
Espectros de RMN de
13
C
E R
13
C-1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE - 01. 58
E R
13
C-1 - Expansão 1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
58
E R
13
C-1 - Expansão 2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
59
E R
13
C-1 - Expansão 3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
59
E R
13
C-1 - Expansão 4. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE - 01.
59
E R
13
C-2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02. 68
vii
E R
13
C-3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE -
04.
77
E R
13
C-3 - Expansão 1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
77
E R
13
C-3 - Expansão 2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
78
E R
13
C-3 - Expansão 3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
78
Espectros de RMN de DEPT
E R DEPT-1. Espectro de RMN de DEPT (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE
- 01.
60
E R DEPT-2. Espectro de RMN de DEPT (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE
- 02.
68
E R DEPT-3. Espectro de RMN de DEPT (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto
CE - 04.
78
Espectros de RMN de HMQC
E R HMQC-1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
60
E R HMQC-2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
69
E R HMQC-2 - Expansão 1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
69
E R HMQC-2 - Expansão 2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
70
E R HMQC-3. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
79
E R HMQC-3 - Expansão 1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
79
E R HMQC-3 - Expansão 2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
80
viii
Espectros de RMN de HMBC
E R HMBC-1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
61
E R HMBC-1 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
61
E R HMBC-1 - Expansão 2. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
62
E R HMBC-1 - Expansão 3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
62
E R HMBC-2 Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
70
E R HMBC-2 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
71
E R HMBC-2 - Expansão 2. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
71
E R HMBC-2 - Expansão 3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
72
E R HMBC-3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
80
E R HMBC-3 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
81
E R HMBC-3 - Expansão 2. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
81
E R HMBC-3 - Expansão 3 Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
82
Espectros de RMN de COSY
E R COSY-1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE-01.
63
E R COSY-2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE-02.
72
ix
E R COSY-2 - Expansão 1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
73
E R COSY-2 - Expansão 2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
73
E R COSY-3. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto
CE-04.
82
E R COSY-3 - Expansão 1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS)
do composto CE-04.
83
E R COSY-3 - Expansão 2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS)
do composto CE-04.
83
Espectros de RMN de NOESY
E R NOESY-1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
63
E R NOESY-1 - Expansão 1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
64
E R NOESY-1 - Expansão 2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
64
E R NOESY-2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
74
E R NOESY-2 - Expansão 1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
75
E R NOESY-2 - Expansão 2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
75
E R NOESY-3. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
84
E R NOESY-3 - Expansão. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
84
Espectros de Massas
E M-1. Espectro de massas (ESI-MS/MS) do composto CE-01. 65
x
E M-2 - Monocarregado. Espectro de massas monocarregado (ESI-MS/MS) do
composto CE-04.
85
E M-2 - Dicarregado. Espectro de massas dicarregado (ESI-MS/MS) do composto CE-
04.
85
ANEXO - ÍNDICE DE TABELAS DE COMPARAÇÃO
Tabela 1 - Anexo. Comparação dos dados de RMN de
1
H,
e
13
C (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS e (CD
3
)
2
CO/TMS) de CE-01 e (-) palidol.
86
Tabela 2 - Anexo. Comparação dos dados de RMN de
1
H,
e
13
C (300,06 e 400
MHz para
1
H; 75,45 e 100 MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) de CE-04 e
Nepalensinol B.
86
xi
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
AA
Atividade Antioxidante
Abs
Absorbância
AGMI
Ácido Graxos Monoinsaturados
AGPI
Ácidos Graxos Poliinsaturados
AGS
Ácido Graxo Saturados
13
C
Carbono-13
CCD
Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CCDP
Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
(CD
3
)
2
CO
Acetona Deuterada
CD
3
OD
Metanol Deuterado
CE Cenchrus echinatus
CE-01
Substância 01 isolada
CE-02
Substância 02 isolada
CE-03
Substância 03 isolada
CE-04
Substância 04 isolada
CE-EASC
2
Extrato Aquoso das Sementes particionado com Clorofórmio em pH 2
CE-EASC
7
Extrato Aquoso das Sementes particionado com Clorofórmio em pH 7
CE-EASC
10
Extrato Aquoso das Sementes particionado com Clorofórmio em pH 10
CE-EASB
10
Extrato Aquoso das Sementes particionado com Butanol em pH 10
CE-EHS
Extrato bruto Hexânico das Sementes
CE-EMF
Extrato bruto Metanólico das Folhas
CE-EMFA
Extrato bruto Metanólico das Folhas particionado com Acetato de Etila
CE-EMFAq
Fração Aquosa residual das Folhas após as partições
CE-EMFB
Extrato bruto Metanólico das Folhas particionado com Butanol
CE-EMFH
Extrato bruto Metanólico das Folhas particionado com Hexano
CE-EMR
Extrato bruto Metanólico das Raízes
CE-EMRA
Extrato bruto Metanólico das Raízes particionado com Acetato de Etila
CE-EMRAq
Fração Aquosa residual das Raízes após as partições
CE-EMRB
Extrato bruto Metanólico das Raízes particionado com Butanol
CE-EMRD
Extrato bruto Metanólico das Raízes particionado com Diclorometano
CE-EMS
Extrato bruto Metanólico das Sementes
CE-EMSA
Extrato bruto Metanólico das Sementes particionado com Acetato de Etila
CE-EMSAq
Fração Aquosa residual das Sementes após as partições
xii
CE-EMSB
Extrato bruto Metanólico das Sementes particionado com Butanol
CE-EMSD
Extrato bruto Metanólico das Sementes particionado com Diclorometano
CMI
Concentração Mínima Inibitória
COSY
Correlation Spectroscopy (
1
H-
1
H), Espectroscopia de Correlação ou
Correlação Homonuclear (
1
H-
1
H)
d
Dubleto
Da
Dalton – Unidade de Massa
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, Incremento sem
Distorção por Transferência de Polarização
DL
50
Concentração requerida para morte de 50% da população
DMSO
Dimetilsulfóxido
DMSO-d
6
Dimetilsulfóxido Deuterado
DP
Desvio Padrão
DPPH
1,1-difenil-2-picrilhidrazil
E
Espectro
ESI - MS/MS
Espectrometria de Massa/Massa de Ionização por Eletro-Spray
1
H
Próton
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Coherence, Correlação Heteronuclear a
Mútliplas Ligações
HMQC
Heteronuclear Multiple Quantum Coherence, Correlação Heteronuclear de
Quantum-Múltiplo
Hz
hertz
IC50
Concentração requerida para 50% de Inibição
J
Constante de Acoplamento
m/z
Relação massa/carga
MHz
megahertz
NOESY
Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy, Espectroscopia de
Amplificação Nuclear de Overhauser ou Efeito Overhauser Nuclear (NOE) a
Duas Dimensões
OC
Óleo de Cróton
ppm
Partes Por Milhão
Rf
Fator de Retenção
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
s
Singleto
sl
Singleto Largo
t
Tripleto
xiii
TMS
Tetrametilsilano
TR
Tempo de Retenção
UV-Vis
Ultra-violeta - Visível
δ
Deslocamento Químico
δC
Deslocamento Químico de Carbono-13
δH
Deslocamento Químico de Próton
xiv
RESUMO
A espécie Cenchrus echinatus L., conhecida popularmente como capim-
carrapicho, é uma das ervas daninhas que mais dificulta o cultivo de diversas espécies,
como trigo, algodão, soja e etc., devido aos seus frutos possuírem espinhos e pelo fato
de se alastrar rapidamente em diversos tipos de solos, mesmo em más condições.
Não existem muitos estudos sobre o isolamento e caracterização de substâncias
produzidas por essa espécie, assim como não há estudos sobre atividades biológicas que
essa planta possa apresentar. Contudo, existem diversos estudos que visam o controle
e/ou eliminação dessa espécie, com o intuito de melhorar a produtividades das lavouras
das quais o C. echinatus é infestante. Dessa forma, no presente trabalho, foi feito o
estudo fitoquímico da espécie Cenchrus echinatus L., a fim de avaliar o potencial
biológico da mesma, bem como isolar os compostos biologicamente ativos ou que
possam enriquecer o que se conhece até o momento em substâncias produzidas por esta
espécie.
Foram obtidos os extratos hexânico, metanólico e aquoso ácido das sementes,
bem como o extrato metanólico das raízes e folhas da espécie C. equinatus. Os perfis
cromatográficos dos extratos foram averiguados via CCD e foram realizados os testes
antiinflamatórios oral e tópico, microbiológico (fungos e bactérias), antiproliferativo,
moluscicida, toxicidade frente à artemia salina e antioxidante. Também foi determinado
o teor de ácidos graxos e foram isoladas substâncias polifenólicas da classe dos
estilbenóides.
Alguns dos extratos e partições apresentaram atividade antiinflamatória,
antiproliferativa, antioxidante e toxicidade frente à artemia salina. Com a análise do
perfil de ácidos graxos da planta foi constatado a presença de ácidos graxos essenciais,
como ômega-3 e ômega-6, dentre outros. Foram isoladas três substâncias, o Palidol
(CE-01), o Carasiphenol C (CE-02) e o Nepalensinol B (CE-04).
PALAVRAS-CHAVES: Poaceae; atividades biológicas, estilbenóides, Cenchrus
echinatus.
xv
ABSTRACT
The specie Cenchrus echinatus L., popularly known as “capim-carrapicho”, is
one of the weeds that hinder the agronomical cultivation of several species, as wheat,
cotton, soy, etc., due to its fruit’s thorns and for the fact that this species quickly
invades, even in bad conditions, several types of soils.
There aren’t many studies on the isolation and characterization of substances
produced by this species, as well as no studies on biological activities of this plant.
However, there are several studies that seek the control and/or elimination of this
species, with the intention of getting better farming productivity where C. echinatus is a
weed. For this, in the present work, it was done the phytochemical study of the species
Cenchrus echinatus L., in order to evaluate the biological potential, as well as to isolate
biologically active compounds or to enrich the knowledge on substances produced by
this plant.
There were obtained hexanic, methanolic and acid aqueous extracts of the
seeds, as well as methanolic extract of the roots and leaves of C. echinatus. The
chromatographic profiles of the extracts were analyzed through TLC and many tests
were accomplished, like: oral and topical anti-inflammatory effect, antimicrobial (yeasts
and bacteria), antiproliferative, moluscicidal, toxicity against Artemia salina and
antioxidant activity. It was also determined the fat acids presence and it was also
isolated polyphenolics substances of stilbenoids class.
Some of the extracts and partitions presented anti-inflammatory activity,
antiproliferative effect, toxicity to A. salina and antioxidant effect. With the analysis of
the profile of fat acids in this plant, it was verified the presence of essential fat acids,
like omega-3 and omega-6, and others. Three substances were isolated, the pallidol
(CE-01), Carasiphenol C (CE-02) and Nepalensinol B (CE-04).
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Química de produtos naturais
As primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem remontam
às sagradas escrituras e ao papiro de Ebers que foi encontrado nas proximidades da casa
mortuária de Ramsés II, porém pertence à época da XVIII dinastia. Este papiro
traduzido em 1890, por H. Joachin, enumera mais ou menos 100 doenças e descreve um
grande número de drogas de natureza animal e vegetal
1
.
No que antecedeu à era cristã, conhecido como civilização grega, vários
filósofos podem ser destacados por suas obras sobre história natural como: Hipócrates,
considerado o pai da medicina moderna, e Teofrasto (372 aC), discípulo de Aristóteles,
que escreveu vários livros sobre a história das plantas, é seu o registro da utilização da
espécie botânica Papaver somniferum, planta cujo princípio ativo é a morfina (1)
1
.
01
A civilização árabe contribuiu muito para a medicina natural, como no
emprego dos purgativos vegetais e o conhecimento do sabor doce da urina dos
diabéticos. No século X, o médico islâmico Avicena (Abu Ali al Hussin ibn Abdallah
ibn Sina), estudioso botânico, criador de um tratado sobre medicamentos cardíacos teve
sua obra mais importante, “Canon”, que foi durante muito tempo o texto médico mais
popular da Europa
1
.
A Paracelso (1493-1541) deve-se todo o empirismo mágico-feiticeiro da arte
de curar ao longo da história da humanidade. É sua a criação da teoria da “assinatura
dos corpos” onde a “atividade farmacológica” de uma planta estaria relacionada com o
seu aspecto físico. Assim, por exemplo, a serpentária, erva da família das aráceas cuja
haste lembra o corpo de uma serpente, serviria para a cura de picadas de cobra
1
.
As grandes navegações e excursões marítimas levaram a ser descobertos novos
continentes e, com isso, novos arsenais terapêuticos naturais, destacando os das culturas
2
Inca, Asteca, Maya, Olmeca e Tolteca que disponibilizaram à civilização moderna a
quina, a ipecacuanha, a coca e muitas outras drogas de valor terapêutico
1
.
Após a metade do século XVIII, com a destruição da teoria do flogístico por
Lavoisier (1743-1794), foram criadas as bases da química moderna ao estabelecer a
natureza da combustão, o que permitiu, desse modo, a determinação da composição
centesimal das substâncias orgânicas
1
.
Em meados do século XIX surgiram os primeiros resultados sobre os trabalhos
de degradação química, o que culminou, em 1873, com a síntese da alizarina. No ano
seguinte ao desta síntese, Van’t Hoff e Le Bel, ao mesmo tempo e isoladamente,
propõem a estrutura tetraédrica do carbono, lançando as bases fundamentais da
estereoquímica
1
.
Em 1916, quando G. N. Lewis propôs a ligação covalente, já se conheciam
várias estruturas de substâncias orgânicas naturais, resultado de laboriosos estudos de
degradação química e de síntese orgânica. Esse período representa o apogeu da síntese
dos corantes
1
.
Entre as décadas de 1920-1930 um grande número de trabalhos sobre o
isolamento e identificação de substâncias de natureza esteroidal foram publicados, e o
colesterol teve sua estrutura determinada. Nos anos seguintes, Woodward sintetizou a
cortisona. Além disso, a genialidade deste químico, pode ser avaliada através de suas
sínteses dos alcalóides quinina (2) (1945), estriquinina (3) (1954) e reserpina (4)
(1958)
1
.
02 03
04
3
1.2. Produtos naturais no Brasil
O Brasil com toda sua extensão territorial, desde a costa até as florestas, é
detentor de um grande potencial para estudo sobre produtos naturais. A Química de
Produtos Naturais é, dentro da Química brasileira, a área mais antiga e a que, talvez
ainda hoje, congregue o maior número de pesquisadores. Os primeiros médicos que
vieram ao Brasil perceberam muito cedo a importância da utilização da medicina
indígena, baseada na utilização de plantas
1
.
Na comitiva que acompanhou a Princesa Leopoldina da Áustria, noiva de D.
Pedro I, veio o médico português Bernardino António Gomes, que no Laboratório
Chimico da Casa da Moeda, em Lisboa, isolou a cinchonina, primeiro alcalóide natural
sob a forma de base pura, das cascas da quina
1
.
Theodoro Peckolt veio para o Brasil em 1847 para estudar a flora brasileira e
contribuiu muito no estudo químico de plantas do Brasil. Este farmacêutico pode ser
considerado, pelo seu trabalho fantástico, o pai da fitoquímica brasileira. Entre os
muitos trabalhos de Peckolt se destacam o isolamento da substância de Plumeria
lancifolia, que ele denominou de agoniadina
1
. Este foi o primeiro iridóide a ser isolado
da natureza em forma pura, porém só 88 anos depois do seu isolamento teve sua
estrutura química determinada.
Uma das instituições pioneiras de grande importância para a química dos
produtos naturais foi a Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro. Nessa escola, dentre
os que se dedicaram ao estudo químico de plantas, destaca-se o nome de Domingos José
Freire Júnior (1842-1899), que foi catedrático da cadeira de Química Orgânica e
Biológica (1874-1895). Além de suas obras didáticas, deixou uma série de publicações
científicas, algumas dessas na área de fitoquímica. Descreveu, por exemplo, a
grandiflorina isolada da fruta do lobo (Solanum grandiflora), que hoje é conhecido pelo
nome de solasonina.
1.3. Produtos naturais e Interações com Meio Ambiente
Em 1976, realizou-se na cidade do Vaticano, a semana de estudos “Produtos
Naturais e a Proteção de Plantas”, onde foram discutidos o papel de determinados
metabólitos secundários na proteção da planta, contra diversos predadores naturais
1
. A
4
importância deste tema pode ser avaliada pela destruição cada vez maior dos cultivares
de cereais pelo ataque de pragas, que chega a causar a perda de 1/3 da produção
mundial de cereais. Este problema vem sendo agravado pela prática cada vez mais
freqüente de monoculturas e pela resistência dos predadores aos inseticidas sintéticos.
Devido aos efeitos desagradáveis causado por inseticidas sintéticos, busca-se,
até hoje, meios de utilizar metabólitos de defesa da própria planta, para o controle
natural das pragas. Estas defesas são de natureza química e, normalmente, envolvem
substâncias do metabolismo secundário, as quais podem ser chamadas de fitotoxinas ou
aleloquímicos
1
. Esse fenômeno é conhecido como alelopatia. A primeira interação
planta-planta foi descrita pelo naturalista romano Plínio, que observou que sob a copa
das nogueiras não crescem outros vegetais
1
. Hoje, sabe-se que a fitotoxina responsável
por este fenômeno é a juglona (5), um poderoso inibidor de germinação, presente na
forma de glicosídeo nas folhas, que sofre hidrólise e oxidação à quinona no solo
1
.
05
A definição mais recente de alelopatia, que é aceita pela Sociedade
Internacional de Alelopatia, é muito abrangente e diz que: “É a ciência que estuda
qualquer processo envolvendo, principalmente, metabólitos secundários produzidos por
plantas, algas, bactérias e fungos que influenciam o crescimento de sistemas biológicos
com efeitos positivos e negativos”
1
.
1.4. Ácidos graxos em plantas
Ácidos graxos são ácidos carboxílicos alifáticos de cadeias longas, encontrados
em gorduras e óleos naturais, que podem ou não apresentar ligações duplas entre as
moléculas de carbono, sendo classificados como saturados (nenhuma ligação dupla) ou
insaturados (com ligações duplas)
2
. Os ácidos graxos insaturados podem ser
monoinsaturados (apenas uma ligação dupla) ou poliinsaturados (mais de uma ligação
dupla).
5
Ácidos graxos saturados: São os mais comuns em nossa dieta. São encontrados
principalmente em alimentos de origem animal, tais como carne, ovos e gordura animal,
e em óleos de plantas tropicais (palma e côco). Dietas ricas em gordura saturada são
associadas com altos riscos de doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer. O
óleo de soja é considerado um dos mais bem balanceados óleos vegetais, com baixo
conteúdo de gordura saturada (em torno de 15%)
2
. Os ácidos graxos saturados da soja
são o ácido palmítico e o ácido esteárico. Ácidos graxos saturados aumentam o ponto de
fusão das gorduras. Por este motivo, gordura animal (rica em ácidos graxos saturados) é
sólida, e gordura vegetal (pobre em ácidos graxos saturados) é líquida a temperatura
ambiente
2
.
Ácidos graxos monoinsaturados: São ácidos graxos insaturados onde a cadeia
de átomos de carbono perdeu dois átomos de hidrogênio, gerando uma ligação dupla
ente os dois átomos de carbono. São encontrados em óleos vegetais, tais como soja,
oliva, canola, amendoin. Quando substituem ácidos graxos saturados na dieta, ajudam a
baixar o colesterol LDL (mau colesterol) sem alterar o HDL (bom colesterol). Como
possuem grande estabilidade, óleos ricos em ácidos graxos monoinsaturados são
utilizados em frituras. O óleo de soja contém cerca de 25% de ácidos graxos
monoinsaturados (ácido olêico). Quando substituem os ácidos graxos saturados na dieta,
ajudam a baixar o colesterol LDL (mau colesterol) sem alterar o HDL (bom colesterol)
2
.
Ácidos graxos poliinsaturados: São ácidos graxos insaturados, cujas cadeias de
átomos de carbono perderam quatro ou mais átomos de hidrogênio. São encontrados em
amêndoas e óleos vegetais (soja, milho, girassol, oliva, canola) e óleo de peixe. Quando
substituem os ácidos graxos saturados na dieta, ajudam a baixar o colesterol LDL (mau
colesterol) sem alterar o HDL (bom colesterol). O ácido linolênico e o ácido linoléico
(ácidos graxos poliinsaturados da soja) são dois dos ácidos graxos essenciais a dieta
humana. Ácidos graxos essencias são aqueles que necessitam fazer parte da dieta (não
são sintetizados pelo organismo). A Organização Mundial da Saúde recomenda que
25% das calorias ingeridas na dieta sejam ácidos graxos essenciais. O óleo de soja
possui cerca de 61% de ácidos graxos poliinsaturados (ácido linoléico e ácido
linolênico)
2
.
Ácido palmítico (16:0)
: É um ácido graxo com 16 átomos de carbono na cadeia
e nenhuma ligação dupla. Corresponde a cerca de 11% da composição de ácidos graxos
do óleo de soja. Por ser o ácido graxo saturado mais abundante no óleo de soja, os
6
programas de melhoramento de soja que objetivam produzir variedades com óleo de
melhor qualidade procuram obter variedades com menor conteúdo de ácido palmítico
2
.
Ácido esteárico (18:0): É um ácido graxo com 18 átomos de carbono na cadeia
e nenhuma ligação dupla. Corresponde a cerca de 4% da composição de ácidos graxos
do óleo de soja. É importante para a fabricação de margarinas (aumenta o ponto de
fusão)
2
.
Ácido olêico (18:1): É um ácido graxo com 18 átomos de carbono na cadeia e
uma ligação dupla. Corresponde a cerca de 25% da composição de ácidos graxos da
soja. Confere maior estabilidade ao óleo, do que os ácidos graxos poliinsaturados. Por
resistir a rancificação, um óleo rico em ácido linolênico confere maior "vida de
prateleira" ao óleo
2
, também é conhecido com ômega-9.
Ácido linoléico (18:2): É um ácido graxo com 18 átomos de carbono na cadeia,
e duas ligações duplas. É um dos ácidos graxos essenciais, também conhecido com
ácido ômega-6. Corresponde a cerca de 54% da composição de ácidos graxos da soja. O
consumo de ácidos graxos poliinsaturados pode diminuir os níveis de lipídios no
sangue, e então diminuir o colesterol
2
.
Ácido linolênico (18:3): É um ácido graxo com 18 átomos de carbono na
cadeia, e três ligações duplas. É um dos ácidos graxos essenciais também conhecido
com ácido ômega-3. Corresponde a cerca de 7% da composição de ácidos graxos da
soja. A soja é um dos poucos vegetais com quantidades nutricionalmente significativas
de ômega-3
2
.
1.5. Proteínas e Minerais
A determinação das cinzas fornece uma indicação da riqueza da amostra em
elementos minerais
3
. Por meio de aquecimento, em temperatura elevada, todas as
substâncias voláteis que se decompõem pelo calor serão eliminadas e a matéria orgânica
é toda transformada em CO
2
e H
2
O, etc. As cinzas, no alimento e em plantas, contêm,
principalmente, os seguintes cátions: cálcio, potássio, sódio, magnésio, ferro, cobre,
cobalto, alumínio e, os seguintes ânions: sulfato, cloreto, silicato, fosfato, etc
3
.
As proteínas são os maiores constituintes de toda a célula viva, e cada uma
delas de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às
atividades vitais. A determinação do teor de proteína é baseada, no fato, de elas se
7
apresentarem uma porcentagem de nitrogênio quase constante, em torno de 16%. O
método mais utilizado é o semi-micro Kjelahl, onde se determina o nitrogênio protéico
propriamente dito e outros compostos nitrogenados não protéicos. Tais como, aminas,
amidas, lecitinas, nitrilas e aminoácidos. Nesse caso o resultado será dado em termos de
proteína bruta
3
.
1.6. Atividades biológicas
1.6.1. Atividade antiinflamatória
São utilizados vários testes in vivo para avaliar a atividade antiinflamatória de
uma substância pura ou de um extrato de planta. Um dos testes utilizados para avaliar a
atividade antiinflamatória oral de uma substância ou extrato é o teste da pleurisia, onde
a pleura de um animal, geralmente camundongo, é induzida a um processo inflamatório
causada por um indutor, comumente a carraginina. O substrato é administrado
oralmente e, em seguida, é feita a indução de inflamação da pleura. O substrato que
possui atividade antiinflamatória inibe a evolução da inflamação
4
.
Para avaliar a atividade antiinflamatória tópica, o substrato é utilizado
topicamente sobre a pata ou orelha do camundongo e, em seguida, é induzida a
inflamação da mesma parte utilizando um indutor inflamatório, comumente o óleo de
cróton. Da mesma forma se o substrato possuir atividade antiinflamatória, este inibirá a
evolução da inflamação
4
.
1.6.2. Atividade antimicrobiana
O crescente interesse em plantas medicinais com propriedades antimicrobianas
vem ressurgindo devido ao fato de bactérias consideradas como já controladas, estarem
reemergindo e apresentando multirresistência aos antimicrobianos utilizados na rotina
clínica
5
. O teste é realizado in vitro, com vários tipos de fungos e bactérias e a atividade
antimicrobiana é positiva se o substrato inibir o crescimento das colônias desses
microorganismos.
8
1.6.3. Atividade antiproliferativa
A importância do estudo da atividade antiproliferativa de plantas medicinais
está relacionada com o fato do câncer ser um dos maiores problemas de saúde pública
no Brasil e no mundo
6
. A cada ano, segundo dados da OMS, o câncer atinge 9 milhões
de pessoas, levando a óbito 5 milhões de pacientes. No Brasil, o número de casos de
câncer aumenta a cada ano e no Sudeste brasileiro, os tumores malignos representam a
segunda maior causa de óbitos, sendo superadas apenas por doenças cardiovasculares
6
.
Nos testes são utilizadas linhagens de células cancerígenas e o teste, in vitro,
visa a inibição do crescimento dessas células para que o substrato seja considerado
ativo.
1.6.4. Atividade antioxidante
No organismo humano, a atividade metabólica normal produz constantemente
radicais livres. Estas moléculas geradas, in vivo, reagem com DNA, RNA, proteínas e
outras substâncias oxidáveis, promovendo danos que podem contribuir para o
envelhecimento e a instalação de doenças degenerativas, como câncer, aterosclerose,
artrite reumática, entre outras
4
.
Os compostos fenólicos, constituintes de um amplo e complexo grupo de
fitoquímicos, são produtos secundários do metabolismo vegetal que apresentam em sua
estrutura um anel aromático com uma ou mais hidroxilas, o que possibilita atuarem
como agentes redutores, exercendo proteção ao organismo contra o “stress” oxidativo.
E, em função da grande diversidade química existente, particularmente, entre os
compostos fenólicos, vários ensaios têm sido desenvolvidos para avaliar a capacidade
antioxidante de diferentes amostras
7
.
Dentre os diferentes métodos existentes destacam-se o ensaio do DPPH (1,1-
difenil-2-picrilhidrazil)
8
, neste ensaio o antioxidante reage com o radical DPPH,
convertendo-o em sua forma reduzida (1,1-difenil-2-picrilhidrazina). Nesta reação, a
solução metanólica de DPPH, inicialmente de coloração violeta, torna-se amarelada e o
grau deste descoramento indica a habilidade do antioxidante em seqüestrar o radical
livre.
9
1.6.5. Atividade moluscicida
As substâncias moluscicidas são um fator crucial para o controle da
esquistossomose. No presente momento apenas uma substância sintética, a niclosamida,
é recomendada pela OMS como moluscicida
9
. Em países do Terceiro Mundo o uso de
moluscicidas sintéticos tem causado problemas de toxicidade, contaminação do meio
ambiente e a resistência dos caramujos (Biomphalaria glabrata) transmissores da
esquistossomose. Em contraste, o uso de plantas com atividade moluscicida pode
representar uma alternativa barata, além de não poluir o meio ambiente
10,11
.
1.6.6. Toxicidade Frente à Artemia salina Leach
O ensaio de toxicidade frente à Artemia salina, por ser um ensaio biológico
rápido, de baixo custo e simples, tem sido amplamente utilizado e demonstrado uma boa
correlação com a atividade antitumoral, sendo então um indicativo de atividade na
avaliação preliminar de extratos vegetais e compostos puros
12
.
10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Gramíneas e Cenchrus echinatus
As gramíneas (também conhecidas como gramas, relvas ou capins) são plantas
monocotiledôneas (classe Liliopsida) da família Poaceae (anteriormente Graminae). Há
700 gêneros e talvez 12.000 espécies de gramas. Estima-se que pastos e savanas
compreendem 20% da vegetação que cobre a terra
14
.
A espécie Cenchrus echinatus L. é conhecida popularmente, em nossa região,
por capim-carrapicho e se apresenta como um tipo de gramínea, (inicialmente), que
evolui para uma planta com haste longa cujos frutos são cariopses cobertos por
espinhos. Essa planta é da mesma família de algumas das espécies mais conhecidas,
como: milho (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), arroz (Oryza sativa) e cana-de-
açúcar (Saccharum officinarum), por isso são semelhantes em algumas das suas
características
14
.
A espécie Cenchrus echinatus L é uma gramínea altamente competitiva com as
culturas em água, nutrientes e luz. É uma espécie infestante em culturas anuais e
perenes, além de terrenos baldios e beira de estradas. Também, é uma planta infestante
daquelas que mais dificultam as colheitas pelo fato de seus frutos serem espinescentes.
Invadem culturas de algodão, amendoim, arroz de sequeiro, café, cana-de-açúcar, feijão,
frutíferas, fumo, mandioca, milho, pastagem, soja e sorgo
14
. Esta espécie surge também
em pastagens onde o pisoteio foi intenso em época adversa e indica campos agrícolas
muito decaídos, erodidos e adensados.
Na medicina Zulu (África), é muito utilizada uma espécie do mesmo gênero
(Cenchrus ciliaris)
15
, para o tratamento de desordens menstruais e infecções,
principalmente urinária.
Em um estudo das sementes de Cenchrus echinatus L. infectada pelo fungo
Balansia Obtecta, foram isolados novos tipos de alcalóides Ergot
16
, cuja estrutura é
encontrada abaixo.
11
Possivelmente, esses metabólitos foram produzidos em resposta à infecção,
porém não se sabe da presença ou não desses metabólitos em plantas não infectadas. Já
no estudo das raízes de Cenchrus echinatus L., observou-se que o extrato
diclorometânico apresenta grande atividade inibitória na germinação e crescimento da
espécie Panicum maximum (capim-colonião), evidenciando o efeito alelopático do
Cenchrus sobre essa espécie
17
. Nesse extrato foram identificados, via CG-EM, diversos
terpenóides como linalol, trans-geraniol, trans-a-bergamoteno, dentre outros
17
.
Dentro da família existem diversos relatos de isolamento de várias classes de
compostos, onde podemos citar algumas substâncias:
Terpenos isolados da espécie Cymbopogon citratus
18
.
Arundarina, alcalóide bis-indólico, isolado da espécie Arundo donax L.
19
12
Compostos isolados contendo esqueletos: Benzoxazinona (06),
Benzoxazolinona (07), Aminofenoxazina (08), Ácido Malonâmico (09), são
responsáveis por atividade alelopática de diversas espécies de gramíneas
20
.
06 07
08 09
Pesquisas de diversas espécies da família Poaceae
14
demonstraram vários tipos
de atividades como anti-HIV, antitumoral, antihipertensivo, antiinflamatório e
bactericida, dentre outros.
Como não há estudos biológicos e fitoquímico da espécie Cenchrus echinatus
L., têm-se como objetivos:
- Avaliar o potencial biológico dos extratos brutos, partições e substâncias
isoladas do C. echinatus.
- Estudar fitoquimicamente a espécie com o intuito de isolar e identificar os
compostos bioativos e/ou majoritários da planta.
- Realizar os ensaios que se façam relevantes durante a execução do trabalho.
13
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Instrumentação e material cromatográfico
Os espectros de RMN de
1
H e de
13
C foram obtidos em um espectrômetro
VARIAN, modelo Mercury Plus, operando a 300,06MHz para
1
H e 75,45MHZ para
13
C
tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos (δ)
foram dados em ppm e os solventes utilizados foram CD
3
OD, (CD
3
)CO e DMSO-d
6
. A
interpretação dos dados foi auxiliada pelas técnicas de DEPT 135 e 90, HMBC, HMQC,
COSY e NOESY.
Os ésteres de ácidos graxos foram analisados utilizando um cromatógrafo gasoso
14-A (Shimadzu, Japão), equipado com detector de ionização de chama e coluna capilar
de sílica fundida CP-Sil-88 (100 m, 0,25 mm e 0,25 μm).
A identificação de ácidos graxos foi feita comparando os tempos de retenção
relativo dos picos de (EMAG) de amostras com padrões de ésteres metílicos de ácidos
graxos (Sigma), por co-eluição (“spiking”) de padrões juntamente com as amostras. As
áreas de picos foram determinadas pelo Integrador-Processador CG-300.
Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em um espectrômetro
Q-Tof ESI/MS e ESI-MS/MS utilizando mistura de água/metanol 50% v/v e hidróxido
de amônia 0,01% até concentração de 1,0 μg/mL, com vazão de 10 μL/minuto. Os
espectros foram adquiridos no modo de íons negativos. O experimento foi realizado no
Laboratório Thomson da UNICAMP, sob a responsabilidade do Prof, Dr. Marcos
Eberlin.
As cromatografias de exclusão por tamanho, empregadas na separação das
substâncias, foram preparadas utilizando colunas de vidro e Sephadex LH20 como fase
estacionária.
Para o acompanhamento das cromatografias de exclusão por tamanho foram
realizadas cromatografias em camada delgada analítica (CCD), em placas de vidro de
5,0 x 20, 0 cm com espessura da camada de sílica-gel (sílica-gel 60G e 60GF
254
– 1:1,
Merck) de aproximadamente 0,25 mm.
As revelações destas foram obtidas por irradiação com lâmpada de ultravioleta
em 254 e 366nm, utilização de solução de H
2
SO
4
/MeOH (1:1) e/ou do revelador para
terpenos (anisaldeído, MeOH, H
2
SO
4
, 1:1:1).
14
Para o isolamento das substâncias foram realizadas cromatografias em camada
delgada preparativa (CCDP), em placas de vidro de 20,0 x 20,0cm com espessura da
camada de sílica-gel (sílica-gel 60G e 60GF
254
– 1:1, Merck) de aproximadamente 0,50
mm. As revelações destas foram obtidas por irradiação com lâmpada de ultravioleta em
254 e 366nm.
3.2. Solventes utilizados
Os solventes utilizados foram hexano P.A. (Chemco), diclorometano P.A.-
A.C.S. (Dinâmica, 99,5%), acetato de etila P.A.-A.C.S. (Dinâmica), clorofórmio P.A.-
A.C.S. estabilizado com amileno (Nuclear, 99,8%), álcool etílico P.A.-A.C.S.
(Dinâmica, 95%), álcool metílico P.A.-A.C.S. (Nuclear, 99,8%), álcool (n) butílico
P.A.-A.C.S. (Labsynth, 99,4%) e acetona P.A.-A.C.S. (Labsynth, 99,5%). Estes foram
empregados após terem sido previamente evaporados sob pressão reduzida e destilados.
3.3. Coleta e secagem da planta
O material (sementes, raízes, folhas e caules) foi coletado na Fazenda
Experimental de Iguatemi, no município de Iguatemi, Paraná. Uma exsicata encontra-se
depositado no Herbário NUPÉLIA sob o número HUEM 14425. As sementes e raízes
foram secas em estufa de ar circulante à 40º C. Posteriormente, foram moídas, rendendo
1,20 kg de sementes e 0,24 kg de raízes.
As folhas e caules (0,15 kg) foram utilizados in natura, sendo os mesmos
agrupados como um só material.
3.4. Preparação e particionamento do extrato bruto das sementes
O material seco e moído (1,2 kg de sementes) foi submetido à extração com
hexano à frio por maceração – remaceração, resultando, após evaporação, em 10,0 g de
extrato bruto hexânico.
15
Em seguida o mesmo material foi também macerado com metanol, resultando
após evaporação em 36,0 g de extrato bruto metanólico das sementes de coloração
avermelhada.
O extrato bruto metanólico das sementes foi dissolvido em água e então
particionado com 3 X 150 mL de diclorometano, acetato de etila, butanol e o resíduo da
partição foi denominado fração aquosa das sementes.
Obteve-se após evaporação 1,1 g da fração diclorometano das sementes, 1,2 g
da fração acetato de etila das sementes, 5,5 g da fração butanólica das sementes e 7,2 g
da fração aquosa das sementes.
3.5. Preparação e particionamento do extrato bruto das raízes
O material seco e moído (244,0 g de raízes) foi submetido à extração com
metanol à frio por maceração – remaceração, resultando, após evaporação, em 2,00 g de
extrato bruto metanólico das raízes de coloração avermelhada. O extrato bruto
metanólico das raizes foi dissolvido em água e então particionado com 3 X 150 mL de
diclorometano, acetato de etila, butanol e o resíduo da partição foi denominado de
fração aquosa das raízes.
Obteve-se após evaporação 210,0 mg da fração diclorometano das raízes, 340,0
mg da fração acetato de etila das raízes, 250 mg da fração butanólica das raízes e 350
mg da fração aquosa das raízes.
3.6. Preparação e particionamento do extrato bruto das folhas e caules
O material in natura (150,0 g) foi submetido a turbo cisalhamento com
metanol à frio, resultando, após evaporação, em 2,00 g de extrato bruto metanólico das
folhas e caules. O extrato bruto metanólico das folhas e caules foi dissolvido em água e
então particionado com 3 X 100 mL de hexano, acetato de etila, butanol e o resíduo da
partição foi denominado fração aquosa das folhas e caules.
3.7. Preparação e fracionamento do extrato alcaloídico das sementes
16
As sementes moídas (150 g) foram maceradas com solução de ácido cítrico 5%
por 48 horas.
O extrato aquoso em pH 2 foi então particionado com 3 X 150 mL de
clorofórmio. A fração aquosa foi levada à pH 7 com solução de bicarbonato de sódio
10% sendo novamente particionada com 3 X 150 mL de clorofórmio. Novamente a
fração aquosa foi basificada à pH 10 e extraída com 3 X 150 mL de clorofórmio,
seguida de 3 X 150 mL de n-butanol.
A partição com clorofórmio em pH 2 (CE-EASC
2
) resultou em 71,9 mg de
extrato, em pH 7 (CE-EASC
7
) 61,7 mg e em pH 10 (CE-EASC
10
) 61,2 mg de extrato.
A partição com n-butanol em pH 10 (CE-EASB
10
) resultou em 1 g de extrato.
3.8. Elaboração do perfil cromatográfico dos extratos
Foram averiguados os perfis cromatográficos dos extratos obtidos, utilizando
diferentes combinações de solventes por cromatografia em camada delgada. Foi
possível constatar a presença de diferentes classes de substâncias nos extratos obtidos
utilizando reveladores específicos, como Dragendorff, Anisaldeído 10%, Cloreto
férrico, Ácido Sulfúrico/Metanol 1% e luz UV nos comprimentos de onde de 364 e 254
nm. .
3.9. Avaliação da atividade antiinflamatória dos extratos brutos e
partições das sementes e raízes
A avaliação das atividades antiinflamatória oral e tópica foi realizada no
Departamento de Farmácia e Farmacologia da UEM sob a responsabilidade da Prof
a
.
Drª. Ciomar A. Bersani Amado.
Para a avaliação da atividade oral, a pleurisia foi induzida em ratos Wistar pela
injeção intrapleural de 0,5 mL de uma suspensão de carragenina 1% em solução salina
estéril. Grupos de seis ratos foram tratados com os extratos hexânico e metanólico, das
sementes e raízes (solubilizados em solução Tween 80, 1/1, V/V), nas doses de 100 e
200 mg/kg e ainda, indometacina (branco) na dose de 10 mg/kg, uma hora antes da
17
aplicação do agente indutor. Quatro horas após a indução da inflamação, os animais
foram anestesiados e sacrificados. O exsudato pleural foi coletado, transferido a um
tubo cônico de centrífuga, o volume foi determinado e comparado ao volume do
exsudato do branco.
Para avaliação da atividade antiinflamatória tópica, os animais (n=9),
camundongos Swiss, foram tratados topicamente com os extratos brutos, nas doses de
2,5 (raízes) e 5,0 mg (sementes), e partições na dose de 5,0 mg (solubilizados em
acetona/água 1/1, V/V), imediatamente após a aplicação do óleo de cróton (200 mg) na
orelha esquerda. A indometacina (Indo), 1 mg, foi utilizada como antiinflamatório de
referência (controle positivo) na orelha direita de cada animal. Após 6h os animais
foram anestesiados e sacrificados. As massas das orelhas foram determinadas e a
porcentagem de inibição calculada.
3.10. Avaliação da Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos e
Partições das Sementes e Raízes
Os testes antimicrobianos foram realizados no Departamento de Análises
Clínicas da UEM, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura, de
acordo com os procedimentos padrões de microdiluição. Foram testadas as espécies S.
aureus, Bacillus subtilis, E.coli, P. aeruginosa, C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis.
3.11. Avaliação da atividade antiproliferativa
31
3.11.1. Cultura das células
A Avaliação da atividade antiproliferativa
foi realizada no Departamento de
Análises Clínicas da UEM, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura.
Células Caco-2 (células de adenocarcinoma intestinal) provenientes do
Instituto Nacional de Câncer – RJ (INCa), foram utilizadas para a realização dos
experimentos. Elas foram cultivadas em DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium -
Gibco
®
) suplementado com 10% de SFB (soro fetal bovino - Gibco
®
) e 50 µg/ml de
18
gentamicina. A cultura foi mantida em garrafas plásticas com tampa-rosca e dispositivo
para entrada de CO
2
e incubadas a 37°C em estufa úmida com tensão de 5% de CO
2
(Fischer Scientific
®
, modelo Isotemp). As células foram observadas em microscópio
invertido (Zeiss
®
, modelo Axiovert 25), diariamente, e o meio trocado quando o pH
apresentou-se ácido.
A fim de promover a manutenção das células de linhagem contínua, estas
foram renovadas sempre que houve a formação de uma monocamada de células
confluentes. Para isto foi retirado o meio antigo e adicionado PBS - Phosphate Buffered
Saline- estéril para “lavar” o tapete celular, removendo assim restos de soro e
metabólitos celulares. Foi adicionado solução de tripsina (Gibco®) a 37ºC por 4
minutos, após o qual foi imediatamente removida. O aspecto das células foi observado
em microscópio invertido. Após o descolamento da camada celular, estas foram
ressupendidas em DMEM, sendo que 1/6 desta suspensão foi incubada nas mesmas
condições iniciais.
3.11.2. Atividade Antiproliferativa
31
A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada pelo método da
Sulforodamina B. Células Caco-2 foram cultivadas em placas de 96 poços, conforme
descrito no item anterior. Após a formação da monocamada confluente, o meio foi
retirado e 100 µL das várias concentrações dos extratos foram adicionados em triplicata.
Inicialmente foram testados as concentrações de 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25
µg/mL.. Também foi realizado o controle de células, onde, não houve adição dos
extratos.
A placa foi incubada em estufa úmida a 37°C com tensão de 5% de CO
2
durante 48 h. Em seguida, o meio dos poços foi removido, o tapete lavado com PBS e
fixado com ácido tricloroacético à 10% (SYNTH
®
) no volume de 50 µL/poço por 1h
sob refrigeração e ao abrigo de luz. A placa foi lavada quatro vezes em água corrente e
mantida em temperatura ambiente até secar.
A atividade antiproliferativa foi avaliada pelo método colorimétrico da
sulforodamina B em placa de 96 poços, que baseia-se na afinidade do corante
sulforodamina B pelas proteínas celulares propiciando uma avaliação colorimétrica
diretamente proporcional ao número de células viáveis. Em cada poço foram
19
adicionados 50 µL de uma solução 4% de sulforodamina B (Sigma
®
) em ácido acético
1%, a placa foi então incubada novamente por 30 min sob refrigeração e ao abrigo da
luz. O corante foi retirado e a placa lavada quatro vezes com ácido acético glacial à 1%
para remoção do corante em excesso. O corante ligado às células viáveis foi dissolvido
em 150 µL de solução Tris-base 10mM. A absorbância foi determinada em leitor de
ELISA (Bio-Tek
®
, modelo Power Wave XS) em 530 nm.
Posterior a leitura, foi realizado cálculos para determinar as concentrações dos
extratos capazes de destruir 50% da monocamada celular (IC
50
).
3.12. Avaliação da atividade antioxidante dos extratos brutos e partições
Uma alíquota dos extratos e partições, foi solubilizada em metanol obtendo-se
uma solução estoque de concentração final de 2,0 mg/mL. Diferentes volumes da
solução estoque (25 uL à 1000uL), foram acondicionadas com 2 mL de solução de
DPPH (0,03 mM) gerando diferentes concentrações (25-1000 µg/mL). Após o tempo de
reação de 30 min a absorbância foi lida em 515,5 nm e convertida em porcentagem da
atividade antioxidante (AA) usando a seguinte fórmula:
AA% = 100 – {[(Abs
amostra
– Abs
controle
) x 100] / Abs
controle
}
Um controle foi feito com 2 mL de DPPH (controle negativo). Os testes foram
feitos em triplicata. Os valores das IC
50
foram calculados por regressão linear e plotados
em gráfico onde a abscissa representa a concentração do extrato testado e a ordenada à
proporção da porcentagem da atividade antioxidante.
Análise estatística: Os experimentos foram realizados em triplicata. Os
resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP).
3.13. Avaliação da toxicidade frente à Artemia salina
Uma alíquota dos extratos foi solubilizada em 2 mL de metanol obtendo uma
solução estoque de concentração final de 10,0 mg/mL. Diferentes volumes da solução
estoque (20, 100, 500 uL) foram evaporadas e diluídas em 5 mL de água e 50 μL de
20
DMSO, gerando concentrações de 40, 200 e 1000 ug/mL.
Após a eclosão dos ovos de Artemia (48 horas), acerca de 15 espécimes foram
introduzidas nas soluções que, posteriormente, ficaram em repouso por 24 horas até a
contagem de indivíduos mortos. Foi realizado o branco nas mesmas condições. Os
experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados são apresentados como
média ± desvio padrão (DP) da percentagem de mortos. Os valores das IC
50
foram
calculados por regressão linear e plotados em gráfico onde a abscissa representa a
concentração do extrato testado e a ordenada à proporção da porcentagem de indivíduos
mortos.
Não foi realizado esse ensaio para os extratos das folhas e caules por falta de
substrato.
3.14. Avaliação da atividade moluscicida
O ensaio de avaliação de atividade moluscicida foi realizado sob a
responsabilidade d Proª. Drª. Maria Lucília Zamuner, do Departamento de Farmácia da
Universidade Estadual de Maringá.
Uma alíquota do extrato bruto metanólico das sementes e das frações
diclorometano, acetato de etila, butanólica e aquosa das sementes, foi dissolvida em
água do próprio aquário, gerando concentrações de 500 e 1000 ppm. Foram utilizados 5
caramujos da espécie Biomphalária glabrata com diâmetro da concha entre 15 e 20 mm
para cada ensaio. Os caramujos foram colocados em contatos com as soluções por 24 e
48 horas. Após cada período fez-se a leitura dos batimentos cardíacos dos caramujos
para evidenciar ou não a morte dos espécimes.
3.15. Teor de ácidos graxos das sementes, folhas e caules
Foi realizada análise de lipídios totais pelo método Bligh e Dyer
21
. Os ácidos
graxos foram esterificados com metanol segundo o procedimento de Hartman & Lago
22
.
A amostra esterificada foi mantida em repouso na geladeira até a separação das fases. O
sobrenadante foi recolhido e transferido para frasco de âmbar, armazenados a 18ºC até a
posterior análise cromatográfica.
21
Os ésteres de ácidos graxos foram analisados utilizando um cromatógrafo
gasoso 14-A (Shimadzu, Japão), equipado com detector de ionização de chama e coluna
capilar de sílica fundida CP-Sil-88 (100 m, 0.25 mm e 0,25 μm). Foi programada
temperatura de coluna a 2
o
C /min de 180
o
C a 240
o
C, enquanto que a temperatura do
injetor e do detector foi mantido a 220
o
C e 245
o
C, respectivamente. Os fluxos dos
gases, foram de 1,4 mL.min
-1
para o gás de arraste (H
2
); 30 mL.min
-1
para o make-up
(N
2
) e 30 mL.min
-1
e 300 mL.min
-1
para o H
2
e para o ar sintético da chama,
respectivamente. A razão de divisão da amostra (split) foi de 1/100. A identificação de
ácidos graxos foi feita comparando os tempos de retenção relativo dos picos das
amostras com padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos (Sigma), por co-eluição dos
padrões juntamente com as amostras.
3.16. Análise centesimal das sementes e folhas
10
3.16.1. Teor de umidade e cinzas
10
Foram pesados, aproximadamente 2,0g de amostra, em cadinho de porcelana
previamente tarados em mufla. O teor de umidade foi determinado em estufa a 105
o
C
por 4 horas. Após este tempo, os cadinhos foram transferidos para um dessecador e
resfriados a temperatura ambiente, esta operação foi repetida até peso constante; a
umidade foi determinada por gravimetria. Em seguida, os cadinhos foram colocados em
uma mufla a 600
o
C por 6 horas. Após, foram colocados em dessecador e resfriados à
temperatura ambiente. Fez-se a pesagem e, por gravimetria, o teor de cinza foi
determinado nas amostras.
3.16.2. Proteína bruta
10
A análise do teor de proteína bruta foi realizada pelo processo semi micro
Kjeldahl. Este método consiste das seguintes etapas: digestão das amostras (nitrogênio
total é transformado em amônia e os componentes orgânicos são convertidos em gás
carbônico e água), neutralização/destilação (amônia é separada e recolhida em uma
solução receptora) e a titulação (determinação quantitativa da amônia contida na
22
solução receptora). Foram pesados 0,2g de amostra e transferidos para tubos de
digestão, foram adicionados aproximadamente 2,0g de mistura catalítica composta por
Na
2
SO
4
anidro + CuSO
4
.5H
2
O + Se metálico em pó (100:1:0,8, respectivamente) e 10,0
mL de H
2
SO
4
(conc). Em seguida, os tubos foram levados ao bloco digestor para
digestão da amostra. Em seguida realizou-se a destilação em destilador semi-automático
através da reação com hidróxido de sódio 40%, todo nitrogênio contido na amostra foi
convertido em amônia, que foi coletada em erlenmeyer contendo solução de ácido
bórico 4% e indicador (mistura de verde de bromocresol e vermelho de metila). A
solução resultante foi titulada com ácido clorídrico 0,1 mol.L
-1
padrão. A quantidade de
nitrogênio total da amostra foi obtida através da seguinte equação:
m
fLMolV
N
100.14../.
% =
onde:
%N = porcentagem de nitrogênio total da amostra;
V = Volume de HCl gasto na titulação ;
Mol/L = concentração da solução padrão de HCl;
f
= Fator de correção do padrão;
m = massa da amostra (mg).
O fator de conversão de nitrogênio total para proteína bruta foi 6,25 e o teor de
proteína bruta na amostra foi obtido pela seguinte equação:
%PB= %N x FE
onde: %PB = porcentagem de proteína bruta contida na amostra;
FE = Fator específico (6,25).
3.17. Isolamento de CE-01 e CE-02
Uma alíquota (35,0 mg) da fração acetato de etila das raízes foi solubilizada em
metanol e submetida à CCDP por três vezes seguidas em diclorometano/acetato de etila
23
40%. Foram coletadas duas faixas com o auxilio de luz ultravioleta. Verificou-se que
haviam outras faixas, mas não foi possível efetuar a coleta destas devido à proximidade
das mesmas. A substância CE-01 (6,0 mg), na forma sólida de coloração marrom
avermelhada foi coletada em Rf de 0,6 e a substância CE-02 (5,7 mg), na forma sólida
também de coloração marrom avermelhada, foi coletada em Rf de 0,38 sendo as duas
desorvidas com metanol. O Rf considerado foi em relação à última corrida
cromatográfica. As substâncias isoladas foram enviadas para análises de RMN
1
H e
13
C
uni e bidimensionais.
3.18. Isolamento de CE-03 e CE-04
Uma alíquota (200,0 mg) da fração acetato de etila da sementes foi solubilizada
em metanol e submetida à filtração em coluna Sefadex – LH 20, utilizando metanol
como solvente. Foram coletadas 40 frações de 25 mL cada, que foram agrupadas depois
de análise por CCD em acetato de etila puro. As frações agrupadas de 20 – 40 foram
submetidas à CCDP por três vezes seguidas em diclorometano/acetato de etila 40%.
Foram coletadas quatro faixas com o auxilio de luz ultravioleta. Foi observado que
haviam outras faixas, mas não foi possível efetuar a coleta destas devido à proximidade
das mesmas. A substância CE-03 (3,0 mg) foi coletada em Rf de 0,52 e a substância
CE-04 (10,0 mg) foi coletada em Rf de 0,2 sendo as duas desorvidas com metanol.
Ambas as substâncias apresentavam-se na forma sólida de coloração marrom
avermelhado. As outras duas frações também foram coletadas, mas não estavam puras e
não foi possível realizar outra separação devido à pequena massa encontrada. O Rf
considerado foi em relação à última corrida cromatográfica. As substâncias isoladas
foram enviadas para análises de RMN
1
H e
13
C uni e bidimensionais.
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Extratos e perfis cromatográficos
Os extratos foram preparados e foi observada uma coloração vermelho intenso
para os extratos metanólico das raízes e sementes. Essa coloração pode ser devido à
presença de antocianinas, que são responsáveis pela coloração rosa, laranja, escarlate,
violeta e azul em flores, frutos, folhas e raízes de algumas plantas
23
. Essa coloração
também pode ser devido á presença de estilbenóides, como ocorre mais frequentemente
em algumas espécies de uvas. As substâncias isoladas do C. echinatus apresentaram
coloração marrom avermelhada, e foram identificadas como estilbenóides derivados do
resveratrol, também isoladas das espécies Vitis amurensis e Kobresia nepalensis
27,30
.
No caso do C. echinatus, essa coloração é observada na folhas e nos cariopses.
Dependendo do grau de maturação da planta, há maior produção desses compostos, que
têm importante papel na proteção e polinização de algumas espécies. As antocianinas e
os estilbenóides também são responsáveis pela atividade inibidora do crescimento de
larvas de alguns insetos
23
. As aplicações para esses compostos vão desde aditivos
eficazes e seguros na indústria alimentar, como conservantes, até utilização como
fármaco, resultante de suas atividades antiinflamatórias e antiedematogênias
23
.
Os perfis cromatográficos dos extratos foram averiguados através de técnicas
de CCD, resultando em misturas de solventes como hexano, diclorometano, acetato de
etila e metanol. Os compostos que anteriormente eram revelados com o reagente de
Dragendorff e anisaldeído 10%, eram misturas de ácidos graxos em quantidade
significativa, por isso foi realizado o ensaio de teor de ácidos graxos das sementes. Com
isso, o ensaio de obtenção de alcalóides através do extrato alcaloídico não forneceu
resultado positivo.
4.2. Avaliação da atividade antiinflamatória
A avaliação de atividade antiinflamatória via oral demonstrou que os extratos
não são ativos. Já o ensaio de atividade antiinflamatório tópico indica que os extratos
das raízes e das sementes possuem boa atividade quando comparado ao controle com
25
indometacina, que é um antiinflamatório potente, isso pode ser visto na Figura 1 e
Tabela 1.
Figura 1. Efeito dos extratos brutos metanólico das raízes (CE-EMR) e das sementes
(CE-EMS) de Cenchrus echinatus sobre o edema de orelha induzido pelo óleo de cróton
(OC). Animais que receberam apenas veículo acetona/água (V).
Tabela 1. Porcentagem de inibição do edema de orelha induzido pelo óleo
de Cróton (OC) (200 μg)
Extratos/Frações Dose (mg/orelha) Inibição (%)
OC -
OC+ Indometacina
-
1,0 74
OC + Extrato bruto metanólico (raízes) 2,5 46
OC + Fração acetato de etila (raízes) 39
OC + Fração Butanólica (raízes) 30
OC + Fração aquosa (raízes)
5,0
45
OC + Extrato bruto metanólico (sementes) 74
OC + Fração acetato de etila (sementes) 25
OC + Fração Butanólica (sementes) 48
OC + Fração aquosa (sementes)
5,0
55
Com base nos resultados obtidos todas as frações reduziram significativamente
a evolução da inflamação (Figura 2 e Tabela 1).
26
A = Veículo (Acetona/Água) B= Óleo de cróton + Veículo
C = OC + Indometacina D = OC+ Fração acetato de etila (sementes)
E = OC + Fração butanólica (sementes) F = OC + Fração aquosa (sementes)
G = OC + Fração acetato de etila (raízes) H = OC + Fração butanólica (raízes)
I = OC+ Fração aquosa raízes
* P < 0.01, ** P < 0.001, comparado com o grupo controle (ANOVA, Tukey’s test).
Figura 2. Efeito antiinflamatório tópico das frações de Cenchus echinatus L.
Os extratos brutos das sementes e raízes de C. echinatus possuem atividade
antiinflamatória significativa, sendo que o extrato bruto das sementes, na dose testada,
teve a mesma atividade que o controle indometacina, evidenciando o seu alto poder
antiinflamatório. Para o extrato bruto das raízes, não foi possível realizar o teste
utilizando 5,0 mg do extrato, uma vez que este não foi totalmente solúvel no solvente
utilizado por este modelo experimental, mesmo assim a atividade desse extrato foi
significativa.
Após o fracionamento dos extratos brutos pôde-se perceber que há uma
diminuição da atividade, quando comparados aos extratos de onde estes provêm, isso
pode ser devido ao efeito sinérgico, onde se têm várias substâncias agindo em conjunto,
isso eleva o potencial biológico do extrato bruto. Quando o extrato bruto foi fracionado
a atividade antiinflamatória diminuiu, porém, mesmo com a diminuição da atividade,
todas as frações se mantiveram significativamente ativas, e apresentaram atividades
estatisticamente equivalentes.
Quando comparamos as atividades das frações acetato de etila das raízes e
sementes, e ainda, as frações butanólica das raízes e sementes, percebemos que há uma
inversão de potencial antiinflamatório. Isso pode estar relacionado às diferentes
27
concentrações de substâncias ativas nessas partes da planta, que pode ser influenciada
pela época de coleta da mesma. Dependendo da estação do ano em que a planta é
coletada pode-se ter diferença na biossíntese dessas substâncias que poderiam estar em
estágios diferentes de formação e agindo de maneira diferente para proteção ou
crescimento da planta.
4.3. Avaliação da atividade antimicrobiana
Os extratos não apresentaram atividade contra as espécies testadas com
exceção à Bacillus subtilis, onde o extrato hexânico apresentou uma leve atividade com
CMI (concentração mínima inibitória) de 500 μg/mL. Os demais extratos apresentaram
CMI maiores que 1000 μg/mL.
4.4. Composição de Ácidos Graxos e Análise Centesimal
As Tabelas 02 e 03 indicam a composição dos ácidos graxos presentes nas
sementes e folhas de C. echinatus. De acordo com os resultados obtidos e a comparação
com os valores descritos na literatura
24
, percebe-se que, mesmo não sendo uma semente
com característica oleaginosa, existe uma boa correlação quando comparamos os teores
de ácidos graxos obtidos com as das principais sementes utilizadas para obtenção de
óleos (Tabela 04). Apesar de apresentar apenas 3% de gordura total em relação ao peso
das sementes (300 mg de gordura em 10 g de sementes), o teor de ácidos graxos
presentes na mesma são significativos. Pela comparação entre as Tabelas 2 e 3
percebemos que existem ácidos graxos em comum entre as sementes e folhas. A
quantidade de ácido graxo ômega 3 nas folhas é maior do que na semente, isso faz com
que a razão ômega 6 / ômega 3 para as folhas seja bem menor. A análise dos somatórios
obtidos mostra uma boa razão entre ácidos graxos poliinsaturados / saturados
(AGPI/AGS), tanto nas sementes como nas folhas, evidenciando a existência de
quantidades significativas de ácidos poliinsaturados em ambas as partes da planta.
28
Tabela 2. Composição e somatórios de ácidos graxos na semente de Cenchrus
echinatus L.
Ácidos Graxos média±dp (%) Ácidos Graxos média±dp (%)
14:0
0,159±0,01
22:0
0,631±0,15
14:1n-2
0,102±0,00
Y
0,202±0,04
15:1n-7
0,178±0,04
24:0
1,117±0,31
16:0
19,158±0,85
Z
0,994±0,24
16:1n-7
1,158±0,05
W
0,422±0,14
17:0
0,143±0,00
Somatórios e Razões média±dp (%)
17:1n-9
0,103±0,01
AGPI
44,960±0,09
18:0
2,062±0,04
AGMI
29,073±0,22
18:1n-9
27,533±0,14
AGS
24,079±0,33
18:2n-6
42,814±0,06
Ni
1,889±0,43
18:3n-6
0,110±0,01
n-6
42,923±0,06
20:0
0,809±0,06
n-3
2,036±0,04
18:3n-3
2,036±0,04
AGPI/AGS
1,867±0,03
X
0,270±0,04
n-6/n-3
21,083±0,38
Tabela 3. Composição e somatórios de ácidos graxos na folha de Cenchrus
echinatus L.
Ácidos Graxos
Média ± dp (%)
Ácidos Graxos
Média ± dp (%)
10:00
1,43 ± 0,45
22:00
1,82 ± 0,30
11:00
2,30 ± 0,14
24:00
2,48 ± 0,45
12:00
3,51 ± 0,13
14:01
2,27 ± 0,27
Somatório e
Razões
15:00
2,91 ± 0,44
AGPI
42,00 ± 0,98
15:01
4,32 ± 0,27
AGS
45,32 ± 0,20
16:00
26,98 ± 1,21
AGMI
12,61 ± 1,07
18:00
3,99 ± 0,67
n-3
28,19 ± 0,62
18:1n-9
5,49 ± 0,45
n-6
13,82 ± 0,92
18:2n-6
14,33 ± 0,24
AGPI/AGS
0,93 ± 0,09
18:3n-3
28,17 ± 0,88
n-6/n-3
0,49 ± 0,44
Os valores são médias ± dp (desvio padrão) de analises em triplicatas. As
somatórias são de ácidos graxos: AGS (saturados); AGMI (monoinsaturados) AGPI
(poliinsaturados); n-3 (ômega-3); n-6 (ômega-6); Ni (ácidos graxos não identificados).
As razões são entre as somatórias dos grupos: ômega-6/ômega-3 (n-6/n-3) e ácidos
graxos poliinsaturados/saturados (AGPI/AGS).
29
Tabela 4. Comparação da composição de alguns ácidos graxos de Cenchrus
echinatus
com outras oleaginosas
24
.
16:1 18:0 20:0 22:0 24:0 18:1 22:1 18:2 18:3
Milho 11,67 1,85 0,24 0,00 0,00 25,16 0,00 60,60 0,48
Algodão 28,33 0,89 0,00 0,00 0,00 13,27 0,00 57,51 0,00
Amendoim 11,38 2,39 1,32 2,52 1,23 48,28 0,00 31,95 0,93
Crambe 20,7 0,70 2,09 1,12 18,86 58,51 9,00 6,85 0,36
Canola 3,49 0,85 0,00 0,00 0,00 64,4 0,00 22,30 8,23
Soja 11,75 3,15 0,00 0,00 0,00 23,26 0,00 55,53 6,31
Girassol 6,08 3,26 0,00 0,00 0,00 16,93 0,00 73,73 0,00
Cenchrus
Sementes
1,158 2,062 0,809 0,631 1,117 27,533 0,00 42,814 2,036
Cenchrus
Folhas
0,00 3,99 0,00 1,82 2,48 5,49 0,00 14,33 28,17
*Valores em %.
Observando os resultados da análise centesimal (Tabela 5) temos que as
sementes de C. echinatus apresentaram uma quantidade relativamente pequena de
proteína bruta e uma grande quantidade de cinzas, o que indica alta concentração de
minerais. Em contrapartida, as folhas e caules de C. echinatus apresentaram grande
quantidade de cinzas e de proteína bruta. O teor mínimo de proteína bruta necessário
para a manutenção de bovinos adultos
13
é de 8,60 %, dessa forma, as folhas e caules de
C. echinatus possuem quantidade de proteína acima da média para uma planta
forrageira e, se utilizada adequadamente pode ser promissora na alimentação de bovinos
e caprinos.
Tabela 5: Resultados da Análise Centesimal do C. echinatus
Composição Centesimal
semente Folhas e caules
Média (%) Desvio (%) Média (%) Desvio (%)
Umidade
9,10 0,13 14,69 0,38
Cinzas
11,75 0,12 8,84 0,4
Proteínas
3,22 0,25 21,78 1,47
4.5. Avaliação da atividade antioxidante
Na Tabela 6 encontram-se os valores de IC
50
para os ensaios de atividade
antioxidante.
30
Tabela 6. Resultados para a atividade antioxidante (IC
50
).
Extratos IC
50
(ppm)
Extrato bruto metanólico (raízes)
150,7 ± 3,4
Fração butanólica (raízes)
94,5 ± 1,7
Fração aquosa (raízes) >500
Extrato bruto metanólico (folhas)
489,7 ± 6,2
Fração acetato de etila (folhas)
151,8 ± 5,1
Fração butanólica (folhas)
206,2 ± 3,1
Fração aquosa (folhas)
279,5 ± 7,5
Extrato bruto metanólico (sementes)
207,2 ± 5,5
Extrato bruto hexânico (sementes) > 1000
Fração diclorometano (sementes)
49,3 ± 1,3
Fração acetato de etila (sementes)
53,6 ± 2,1
Fração butanólica (sementes)
49,8 ±2,2
Fração aquosa (sementes)
105,0 ± 1,7
*IC
50
. Concentração inibitória mínima
* Não foi realizado o teste para a fração acetato das raízes por falta de substrato.
Com base nos resultados obtidos para o ensaio de atividade antioxidante
percebe-se que essa espécie possui atividade significativa, quando comparado ao
controle positivo BHT, cujo IC
50
encontrado foi de 16 ppm. As frações de média
polaridade, Diclorometano, acetato de etila e butanólica das sementes, apresentaram
maiores potenciais antioxidantes.
4.6. Avaliação da Atividade contra Artemia salina
Na Tabela 7 encontram-se os valores de DL
50
, para o ensaio de toxicidade
frente à Artemia salina.
Tabela 7. Resultados para toxicidade frente à A. salina (DL
50
).
Extratos DL
50
(ppm) ± D. Padrão
Hexânico Sementes 26,7 ± 0
Metanólico Sementes 30 ± 0
Diclorometano Sementes 25,8 ±6,3
Acetato de Etila Sementes 25,6 ±1,4
Butanólica Sementes 25,3 ±4,8
Hexânico das Raízes 26,66 ±5,3
Metanólico das Raízes 28,22 ±3,8
*DL
50
. Concentração mínima que causa a morte de 50 % dos náuplios
31
Pelos dados obtidos observamos que os extratos e partições possuem alta
toxicidade frente á Artemia salina, devido aos baixos valores de DL
50
, uma vez que são
considerados ativos extratos que apresentam DL
50
< 1000 ppm
12
.
O teste de toxicidade frente á Artemia salina vem sendo correlacionado com
algumas atividades biológicas importantes, como a atividade antiproliferativa por
exemplo
12
. Quando um extrato tem alta toxicidade (baixo DL
50
), maiores são as chances
de este possuir atividades específicas
12
.
4.7. Avaliação da atividade antiproliferativa
Pela análise dos resultados obtidos para o teste antiproliferativo, que compõem
a Tabela 8, percebemos que a fração acetato de etila e as substâncias CE-02 e CE-04
apresentaram IC
50
próximas, indicando atividades parecidas. A substância CE-01
também possui atividade, porém menor que os outros substratos testados, enquanto que
a fração butanólica não exerceu qualquer atividade dentro das concentrações testadas.
Tabela 8. Resultados para o teste antiproliferativo
Substratos IC
50
(μg/mL)
±DP
Fração Butanólica
> 800 ± 0
Fração Acetato de Etila
123,4 ± 32,2
CE-01
306,0 ± 79,8
CE-02
147,7 ± 32,6
CE-04
172,0 ± 0
Mesmo com os resultados positivos para alguns dos substratos testados, a
atividade demonstrada é relativamente baixa, uma vez que são considerados ativos,
extratos que exibem IC
50
< 100 μg/mL
25,31
. Contudo, devemos lembrar que os substratos
utilizados não foram ativos eficazmente contra as células testadas, mas isso não pode
ser estendido para os outros tipos de células, uma vez que o mecanismo de ação
depende da tipagem celular utilizada
25
. Com os resultados obtidos percebemos que os
substratos possuem atividade citotóxica, o que condiz com o resultado positivo para o
teste contra a
A. salina, uma vez que estes dois ensaios vêm sendo correlacionados
12
.
32
Dias
As soluções estoques preparadas para a realização do ensaio foram reservadas
em congelador, e após determinado tempo a atividade antiproliferativa foi reavaliada, e
os resultados são encontrados na Tabela 9.
Tabela 9. Resultados para o teste antiproliferativo em tempos determinados.
IC
50
(μg/mL) Substratos
0 20 35 60
Fração Butanólica
> 800 ± 0
>1000 >1000 >1000
Fração Acetato de
Etila
123,4 ± 32,2
331,3 Não foi realizado Não foi realizado
CE-01
306,0 ± 79,8
750 1000 >1000
CE-02
147,7 ± 32,6
212 300 Não foi realizado
CE-04
172,0 ± 0
850 >1000 >1000
Conforme visualizado na Tabela 9 percebemos que os extratos, assim como as
substâncias puras, perdem a atividade quando armazenadas em solução, mesmo que
congeladas, mas quando armazenados secos e em geladeira, a atividade se mantêm.
Então, além do processo de degradação natural dos compostos, o armazenamento na
solução requerida para esse experimento, acelera o processo e, consequentemente, os
compostos perdem a atividade.
4.8. Avaliação da atividade moluscicida
A avaliação de atividade contra a espécie Biomphalária glabrata demonstrou
que os extratos não possuem atividade, uma vez que não houve mortes dos caramujos
nem diminuição dos batimentos cardíacos.
4.9. Identificação de CE-01
A estrutura de CE-01 foi elucidada com base nos dados espectroscópicos uni e
bidimensionais de
1
H e
13
C, Tabela 10, e dados de espectrometria de massas.
33
Tabela 10. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e
NOESY (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) para o composto
CE-01.
δ
C
(DEPT) HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
HMBC -
2
J
H-C
e
3
J
H-C
COSY
-
1
J
H-H
NOESY
1,1’ 150,8 (C) - - -
2,2’ 103,3 (CH) 6,52 (d, 1,8; 2H) 3, 4, 6, 7 4 7, 8, 10
3,3’ 159,3 (C) - - - -
4,4’ 102,5(CH) 6,10 (d, 1,8; 2H) 2, 3, 6 2 -
5,5’ 155,3 (C) - - - -
6,6’ 123,8 (C) - - - -
7,7’ 61,0 (CH) 3,72 (s, 2H) 1, 2, 6, 9 8 2, 10
8,8’ 54,7 (CH) 4,46 (s, 2H) 1, 6, 7, 9,
10, 14
7 10, 2
9,9’ 138,4 (C) - - - -
10,10’,14,14’ 129,2 (CH) 6,92 (d, 8,7; 4H) 8, 12, 14 11 8, 7, 2
11,11’,13,13’ 116,0 (CH) 6,64 (d, 8,7; 4H) 9, 12, 13 10 -
12,12’ 156,3 (C) - - - -
OH - - - - -
Pela comparação com dados da literatura
26,27
a substância CE-01 foi
identificada como palidol de formula molecular C
28
H
22
O
6
, cuja estrutura encontra-se na
Figura 3.
Figura 3. Palidol
No espectro de hidrogênio, se observa dois dubletos em δ
H
6,92 e 6,64,
respectivamente, com J = 8,7 Hz, relativos aos 8 hidrogênios 11, 13, 10, 14, 11’, 13’,
10’ e 14’ dos anéis A’ e B (Figura 4). Observa-se ainda dois dubletos em δ
H
6,52 e
A
B
A’
B’
C D
34
6,10, respectivamente, com J = 1,8 Hz, relativos aos 4 hidrogênios 2, 4, 2’, 4’ dos anéis
A e B’ (Figura 4).
Figura 4. Expansão dos hidrogênios dos anéis A, A’ e B, B’.
Os hidrogênios dos carbonos saturados 8, 8’ e 7, 7’ foram observados na forma
de singletos largos com deslocamentos químico de δ
H
4,46 e 3,72, respectivamente,
(Figura 5). Não foi observado o acoplamento efetivo entre os hidrogênios 7, 8 ou 7’,8’.
A explicação para esse fato é devido ao ângulo entre eles ser próximo a 90º, com isso o
acoplamento é muito pequeno e não foi observado, essa é uma das características da
estrutura do palidol
26,27
, que é um estilbenóide com duas unidades do resveratrol.
Figura 5. Expansão dos hidrogênios dos carbonos saturados.
A substância isolada possui simetria, portanto aparece apenas um sinal para os
hidrogênios e carbonos quimicamente equivalentes e a razão dos valores das integrações
dos sinais no espectro de hidrogênio é 4 para 2, isso pode ser visualizado na Figura 6.
35
Figura 6. Espectro de RMN de
1
H de CE-01.
No espectro de
13
C foram observados os sinais de carbonos monohidrogenados
insaturados entre δ
C
100 e 130, característicos dos anéis aromáticos, os sinais entre δ
C
150 e 160 dos carbonos não hidrogenados substituídos pelas hidroxilas, e os carbonos
monohidrogenados saturados entre δ
C
54 e 62, que formam a junção dos anéis
ciclopenteno aos anéis aromáticos substituídos, provenientes das duas unidades do
resveratrol (Figura 7).
Figura 7: Espectro de RMN de
13
C para CE-01.
36
Através dos dados de DEPT de CE-01, E R DEPT-1 - Anexo, confirmamos a
presença de apenas carbonos mono e não hidrogenados na molécula.
Pelo mapa de contornos NOESY, E R NOESY-1 - Anexo e Figura 8, foi
observado que os hidrogênios 7 e 7’ estão no mesmo plano dos anéis aromáticos para-
substituídos
(anéis A’ e B), comprovado pela correlação entre os hidrogênios 7, 7’ com
os hidrogênios 10, 10’ e 14, 14’. Dessa forma há a junção dos anéis ciclopenteno (C e
D) onde os hidrogênios idênticos 7 e 7’ estão na configuração cis (Figura 9),
confirmando que a substância isolada é palidol.
Figura 8. Mapa de contornos NOESY para CE-01
Figura 9. Correlação através de NOE entre os hidrogênios dos anéis ciclopenteno.
A
B
A’
B’
C D
37
Os dados do mapa de contornos HMBC, E R HMBC-1 - Anexo, também
condizem com a estrutura proposta, principalmente pelas correlações dos hidrogênios 7,
7’ e 8, 8’. Algumas correlações podem ser visualizadas nas Figuras 10 e 11.
Figura 10. Algumas correlações de HMBC dos hidrogênios de junção de anel
Figura 11. Mapa de contornos HMBC para CE-01
Mesmo de posse de todas as informações espectroscópicas, a determinação da
estrutura da molécula foi dificultada devido à impossibilidade de perceber a simetria da
mesma. A estrutura molecular de CE-01 só pôde ser elucidada depois da obtenção dos
A
B
A’
B’
38
dados espectrométricos, pois sabendo a massa molecular de CE-01, pôde-se perceber a
simetria existente e, consequentemente, a estrutura molecular da mesma.
Na Figura 12 temos o espectro de ESI - MS/MS para CE-01.
Figura 12. Espectro de ESI – MS/MS para CE-01
A dissociação foi realizada através de colisão com nitrogênio, onde o íon de
m/z 453 fragmenta-se por perdas neutras consecutivas de unidades fenólicas, formando
os íons de m/z 359 (- 94 Da) e m/z 265 (- 188 Da), que são as duas unidades presentes
na estrutura do palidol.
De posse dessas informações podemos dizer com certeza que a substância
isolada é realmente o estilbenóide palidol
26,27
, um dímero derivado do estilbeno
resveratrol..
As comparações entre os dados espectroscópicos para CE-01 e o palidol podem
ser encontrados em Anexo.
4.10. Identificação de CE-02
A estrutura de CE-02 foi elucidada com base nos dados espectroscópicos uni e
bidimensionais de RMN de
1
H e
13
C, Tabela 11.
Pela comparação com dados da substância CE-01 percebe-se que substância
CE-02 possui sinais comuns a essa, e as correlações entre os hidrogênios e carbonos
desta molécula permitem deduzir que ela contém parte da estrutura de CE-01 acrescido
de mais uma unidade do resveratrol, formando um anel extra diidrofurânico Figura 13.
Esse composto, já foi isolado anteriormente da espécie Caragana sinica, e é conhecido
como Carasiphenol C.
28
39
Figura 13. Estrutura molecular de CE - 02
A
B
B’
A’
A’’
B’’
C
D
E
40
Tabela 11. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e
NOESY (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) para o composto
CE-02.
δ
C
(DEPT)
HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
HMBC -
2
J
HC
e
3
J
HC
COSY -
1
J
HH
NOESY
1 150,0(C) - - - -
2 116,4(C) - - - -
3 163,7(C) - - - -
4 97,0(CH) 6,28 (s, 1H) 2, 3, 5, 6 - -
5 156,0(C) - - - -
6 126,3(C) - - - -
7 60,8(CH) 3,80 (d, 6,6; 1H) 1, 1’, 6’, 9 7’ 7’’, 10(14),
10’(14’)
8 50,1(CH) 4,17 (s, 1H) 1, 9, 10(14), 1’, 6’,
7’,
- 7’’, 2’’(6’’),
10(14)
9 138,8(C) - - - -
10(14) 129,3(CH) 6,67 (d, 8,7; 2H) 8, 10(14), 12 11(13) 7, 7’, 8, 7’’
11(13) 115,7(CH) 6,53 (d, 8,4; 2H) 9, 11(13), 12 10(14) -
12 155,9(C) - - - -
1’ 145,8(C) - - - -
2’ 102,6(CH) 6,46 (d, 1,8; 1H) 3’, 4’, 6’ 4’ 7’, 8’
3’ 158,9(C) - - - -
4’ 102,2(CH) 6,00 (d, 1,8; 1H) 2’, 6’ 2’ -
5’ 155,6(C) - - - -
6’ 124,6(C) - - - -
7’ 61,1(CH) 3,73 (d, 6,6; 1H) 1, 6, 8, 1’, 9’ 7 2’, 10(14),
10’(14’)
8’ 54,6(CH) 4,52 (s, 1H) 1, 6, 7, 1’, 9’,
10’(14’)
- 10’(14’), 2’
9’ 138,7(C) - - - -
10’(14’) 129,1(CH) 6,88 (d, 8,4; 2H) 8’, 10’(14’), 12’ 11’(13’) 7, 7’, 8’
11’(13’) 116,0(CH) 6,66 (d, 8,4; 2H) 9’, 11’(13’), 12’ 10’(14’) -
12’ 156,3(C) - - - -
1’’ 149,1(C) - - - -
2’’(6’’) 106,8(CH) 6,14 (sl, 2H) 7’’, 4’’ 4’’ 8, 7’’, 8’’
3’’(5’’) 160,3(C) - - - -
4’’ 102,3(CH) 6,19 (t, 1,8; 1H) 2’’(6’’), 3’’(5’’), 2’’(6’’) -
7’’ 57,6(CH) 4,34 (d, 1,8; 1H) 2, 1’’, 2’’(6’’), 9’’,
3,
8’’ 8, 2’’(6’’),
10’’(14’’), 7
8’’ 94,5(CH) 5,30 (d, 1,8; 1H) 2, 1’’, 10’’(14’’), 3 7’’ 2’’(6’’),
10’’(14’’)
9’’ 135,1(C) - - - -
10’’(14’’) 127,5(CH) 7,15 (d, 8,7; 2H) 8’’, 10’’(14’’), 12’’ 11’’(13’’) 7’’, 8’’
11’’(13’’) 116,3(CH) 6,76 (d, 8,7; 2H) 9’’, 11’’(13’’), 12’’ 10’’(14’’) -
12’’ 158,3(C) - - - -
OH - - - -
41
Como houve perda de simetria devido às substituições na estrutura base de CE-
01, no espectro de RMN de
1
H, E R
1
H-2 - Anexo e Figura 14, os sinais que antes se
sobrepunham na região de δ
H
5,20 - 7,30 e na região entre δ
H
3,70 e 4,70, no espectro de
hidrogênio, agora aparecem em deslocamentos químicos diferentes, ou seja, separados
(Figura 14).
Figura 14. Espectro de RMN de
1
H para CE - 02
O mesmo ocorre para o espectro de carbono, E R
13
C-2 - Anexo, onde há a
separação dos sinais nas regiões entre δ
C
100,0 -165,0 e δ
C
50,0 - 65,0, que na estrutura
de CE-01 apareciam sobrepostos (Figuras 15 e 16).
Figura 15. Espectro de RMN de
13
C para CE - 02
42
Figura 16. Espectro de RMN de
13
C para CE - 02
Além dos sinais relativos à estrutura de CE-01, temos o aparecimento dos
sinais do carbono 8’’ em δ
C
94,5, ligado ao oxigênio do anel aromático pertencente a
CE-01 (anéis A e E). O carbono 8’’ ainda está ligado ao carbono 9’’ do grupo fenólico
da nova estrutura (anel B’’), isso explica o alto valor do seu deslocamento químico. O
carbono 2 de CE-02 (também carbono 2 em CE-01), agora não é hidrogenado e
apresenta deslocamento químico de δ
C
116,4 (103,3 em CE-01). Houve também o
aparecimento do sinal em δ
C
57, 6, relativo ao carbono 7’’ de CE -02, que é mono
hidrogenado ligado ao outro grupamento aromático (anel A’’), inserido na molécula de
CE-01, que gerou a estrutura de CE-02 (Figura 17).
Figura 17. Expansão do Espectro de RMN de
13
C para CE - 02
43
Através dos dados de RMN de DEPT, E R DEPT-2 - Anexo, confirmamos a
presença de apenas carbonos mono e não hidrogenados na molécula.
O mapa de contornos HMBC, E R HMBC-2 - Anexo, se repete como na
estrutura de CE-01, contudo há o aparecimento das correlações da estrutura base da
molécula de CE-01 com os novos grupos químicos que compõem a molécula de CE-02.
As correlações de maior importância são aquelas entre o anel diidrofurano (anel E) com
a estrutura base de CE-01, e com os novos anéis aromáticos inseridos na molécula, que
comprovam as conexões propostas pela estrutura citada na Figura 13. Essas correlações
podem ser visualizadas nas Figuras 18 e 19.
Figura 18. Correlações de HMBC do grupo diidrofurano (anel E), com as demais partes
da molécula de CE-02
A
B
B’
A’
A’’
B’’
C
D
E
44
Figura 19. Correlações de HMBC do grupo furano com as demais partes da molécula
de CE-02.
Sendo assim, temos as correlações para a molécula de CE-02 que confirmam as
disposições dos átomos na estrutura proposta.
A origem biossintética de CE-02 pode ser sugerida a partir de CE-01 com a
inclusão de mais uma unidade do resveratrol ligando-se ao carbono 2 e OH fenólico em
3, gerando assim um anel diidrofurânico E. Na estrutura proposta para CE-02 o
fechamento ocorre no carbono 2 de CE-01, porém há a possibilidade da união da nova
unidade do resveratrol no carbono 4 com formação do anel diidrofurânico junto as
hidroxilas 3 ou cinco, o que resultaria nos isômeros Leachianol D e E
29
, como na
Figura 20.
Hidrogênio 7’’
Hidrogênio 8’’
45
OH
OH
OH
OH
H
H
H
OH
H
H
O
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
H
OH
H
O
H
H
OH
OH
OH
Figura 20. Leachianol D à esquerda e Lechianiol E à direita.
Os deslocamentos químicos dos hidrogênios e carbonos não devem mudar
consideravelmente, uma vez que o ambiente químico e as conexões pouco foram
alteradas. Porém, para o Lechianiol D, não há a correlação de HMBC necessária entre o
carbono 20 e o hidrogênio 19, que são vizinhos na estrutura proposta para CE-02. Já
para o Lechianiol E, todas as correlações são observadas, então não há diferença
significativa nas conexões entre a estrutura de CE-02 e seu isômero Lechianiol E.
As correlações de NOESY da molécula de CE-01 também foram visualizadas
para CE-02, então essa parte da molécula é mantida, contudo os outros dados de
NOESY para CE-02, E R NOESY-2 - Anexo, foram de suma importância para
determinação da estrutura correta, uma vez que são observadas as correlações entre os
hidrogênios 7 – 7’’, 8’ - 4 e 8 – 2’’(6’’). Essas correlações não são possíveis para os
isômeros Lechianiol D e E, já que o sentido do fechamento do anel dididrofurânico faz
com que haja um distanciamento espacial entre os hidrogênios em questão,
impossibilitando tais correlações. Dessa forma, a estrutura que se adequa aos dados
espectroscópicos obtidos experimentalmente para CE-02, de formula molecular
C
42
H
32
O
9
, é a apresentada na Figura 13.
As disposições espaciais para os anéis ligados ao anel diidrofurânico foram
propostas seguindo os dados do mapa de contornos NOESY onde observamos as
correlações entre os hidrogênios 7’’ – 10’’(14’’) e 8 – 2’’(6’’), com isso esses
hidrogênios devem estar no mesmo plano dos anéis B’’ e A’’, respectivamente, assim
46
como o hidrogênio 8’’ tem correlação com os hidrogênios 2’’(6’’), dessa forma esse
hidrogênio também está no mesmo plano do anel A’’, como na Figura 21.
Figura 21. Principais correlações de NOESY para CE-02.
Com base nos dados da literatura, a substância CE-02 isolada é com certeza o
Carasiphenol C
28
.
4.11. Identificação de CE-03
A substância CE-03 trata-se na verdade da mistura de CE-01 com seu possível
isômero que possui os hidrogênio 7’, 8’ e 7, 8 com ângulo diferente de 90º, então o
acoplamento que anteriormente não era observado por ser pequeno, agora passa a ter 4,8
Hz (Figuras 22 e 23).
A
B
B’
A’
A’’
B’’
C
D
E
47
Palidol (CE-01)
Isômero CE-03
Figura 22. Expansão 1 do espectro de RMN de
1
H da mistura de CE-01 e CE-03
Figura 23. Expansão 2 do espectro de RMN de
1
H da mistura de CE-01 e CE-03
No mapa de contornos COSY (Figura 24), também é possível visualizar as
correlações entre os hidrogênios que compõem a molécula de CE-03. Os dados são
muito parecidos, variando apenas nos valores dos deslocamentos químicos, como
percebemos no espectro de hidrogênio acima.
48
Figura 24. Mapa de Contornos COSY, em CD
3
OD, da mistura de CE-01 e CE-03
Devido à pequena massa da mistura, não foi possível realizar a purificação e
isolamento de CE-03. Também não foi possível obter os espectros de
13
C, DEPT,
HMQC e HMBC, uma vez que a quantidade de CE-03 é cerca de 6 vezes menor que a
concentração de CE-01 na mistura, isso pode ser observado pela integração no espectro
de RMN de
1
H. Sendo assim, fica a hipótese de a substância CE-03 ser um isômero do
CE-01 ou outra molécula muito parecida, como mostrado na figura 25.
49
Figura 25. Isômero CE-03 à esquerda, Palidol (CE-01) à direita.
4.12. Identificação de CE-04
A estrutura de CE-04 foi elucidada com base nos dados espectroscópicos uni e
bidimensionais de RMN de
1
H e
13
C, Tabela 12, além dos dados de espectrometria de
massas.
Pela comparação dos dados da substância CE-04 percebe-se que essa molécula
possui sinais comuns à CE-02, e as correlações entre os hidrogênios e carbonos desta
molécula permitem deduzir que ela contém parte da estrutura de CE-02 acrescido de
mais um grupamento diidrofuranofurano substituído por anéis aromáticos, tornando a
molécula simétrica. Pela comparação com dados da literatura
30
temos que a substância
isolada trata-se do Nepalensinol B, cuja estrutura pode ser observada na Figura 27.
Figura 26. Nepalensinol B
50
Tabela 12. Dados de RMN de
1
H,
13
C/DEPT, HMQC, HMBC, COSY e
NOESY (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) para o composto
CE-04.
δ
C
(DEPT)
HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J =
Hz,
n° de H)
HMBC -
2
J
HC
e
3
J
HC
COSY -
1
J
HH
NOESY
7, 7’
60,6
(CH)
3,96
(s, 2H)
1, 1’, 6, 6’, 8, 8’, 9, 9’ 8, 8’
7’’, 7’’’, 10,
10’(14, 14’)
1, 1’
144,6
(C)
- - - -
2, 2’
116,2
(C)
- - - -
7’’, 7’’’
57,2
(CH)
4,31
(d, 1,8; 2H)
2, 2’, 3, 3’, 1’’, 1’’’, 2’’, 2’’’,
(6’’, 6’’’),
8’’, 8’’’, 9’’, 9’’’
8’’, 8’’’
7, 7’, 10’’,
10’’’(14’’,
14’’’), 2’’,
2’’’(6’’, 6’’’), 8,
8’
1’’, 1’’’
148,7
(C)
- - - -
2’’, 2’’’
(6’’, 6’’’)
106,7
(CH)
6,28
(sl, 4H)
3’’, 3’’’, 4’’, 4’’’, 7’’, 7’’’ 4’’
10, 10’(14, 14’),
8’’, 8’’’, 7’’, 7’’’
3’’, 3’’’
(5’’, 5’’’)
160,2
(C)
- - - -
4’’, 4’’’
102,3
(CH)
6,31
(t, 2,1; 2H)
2’’, 2’’’, (6’’, 6’’’), 3’’, 3’’’(5’’,
5’’’)
2’’, 2’’’
(6’’, 6’’’)
-
8’’, 8’’’
93,9
(CH)
5,30
(d, 1,8; 2H)
2, 2’, 3, 3’, 1’’, 1’’’, 7’’, 7’’’,
10’’, 10’’’(14’’, 14’’’)
7’’, 7’’’
10’’, 10’’’(14’’,
14’’’), 2’’,
2’’’(6’’, 6’’’)
9’’, 9’’’
134,8
(C)
- - - -
10’’,10’’’
(14’’,14’’’)
127,3
(CH)
7,11
(d, 8,4; 4H)
10’’, 10’’’(14’’, 14’’’), 8’’, 8’’’,
12’’, 12’’’
11’’,
11’’’(13’’,
13’’’)
8’’, 8’’’, 7’’,
7’’’, 4, 4’
11’’, 11’’’
(13’’, 13’’’)
116,1
(CH)
6,75
(d, 8,4; 4H)
9’’, 9’’’, 11’’, 11’’’(13’’, 13’’’),
12’’, 12’’’
10’’,
10’’’(14’’,
14’’’)
-
12’’, 12’’’
158,0
(C)
- - - -
3, 3’
163,3
(C)
- - - -
4, 4’
96,8
(CH)
6,20
(s, 2H)
2, 2’, 5, 5’, 6, 6’ -
10’’, 10’’’(14’’,
14’’’)
5, 5’
155,6
(C)
- - - -
6, 6’
126,6
(C)
- - - -
8, 8’
50,3
(CH)
4,29
(s, 2H)
1, 1’, 5, 5’, 9, 9’, 10, 10’ (14,
14’), 7, 7’
7, 7’
7’’, 7’’’, 10, 10’
(14, 14’)
9, 9’
138,6
(C)
- - - -
10, 10’ (14, 14’)
129,3
(CH)
6,75
(d, 8,4; 4H)
10, 10’(14, 14’), 8, 8’, 12, 12’
11, 11’(13,
13’)
7, 7’, 8, 8’, 2’’,
2’’’(6’’, 6’’’)
11, 11’ (13, 13’)
115,5
(CH)
6,56
(d, 8,4; 4H)
9, 9’, 11, 11’(13, 13’), 12, 12’
10, 10’(14,
14’)
-
12, 12’
156,1
(C)
- - - -
OH -
7,40 - 8,40
(10H)
- - -
51
A geometria espacial da molécula de CE-04 se mantém a mesma da molécula
de CE-02, uma vez que as correlações por HMBC e NOESY, E R HMBC-3 e E R
NOESY-3 - Anexo
, se mantiveram entre os hidrogênios 7, 7’ – 7’’, 7’’’, que são as
principais correlações na definição de conectividade e da geometria espacial. No mapa
de contornos NOESY é possível visualizar essas correlações e ainda a correlação entre
os hidrogênios 10, 10’(14, 14’) com 2’’, 2’’’(6’’, 6’’’), dos anéis aromáticos, o que
comprova que estes estão próximos no espaço, confirmando a geometria espacial da
molécula proposta na Figura 26. Da mesma forma percebemos que o fechamento do
anel diidrofurano ocorre de maneira idêntica ao proposto para CE-02.
As mesmas dificuldades encontradas em resolver a estrutura de CE-01 também
estavam presentes na elucidação estrutural de CE-04, devido à alta simetria da
molécula. Dessa forma, os dados espectrométricos foram cruciais para resolução dos
problemas encontrados, pois com a massa molecular de CE-04 pôde-se perceber a
simetria da molécula e determinar a sua estrutura. Sendo assim, temos que CE-04 possui
a estrutura base de CE-01, acrescido de duas unidades do resveratrol, o que caracteriza a
sua simetria.
Nas Figuras 27 e 28 temos os espectros de ESI - MS/MS para CE-04.
Figura 27. Espectro de ESI – MS/MS para o íon de CE-04 Dicarregado.
A dissociação foi realizada através de colisão com nitrogênio, onde o íon
dicarregado de m/z 452,6 (906 Da) fragmenta-se por perda neutra de fenol (-94 Da),
formando o íon monocarregado de
m/z 811,2 e íon dicarregado de m/z 405,5 (- 47 m/z,
94 Da). O íon de
m/z 811,2 fragmenta-se perdendo um fenol (-94 Da) formando o íon de
m/z 717. O íon dicarregado de m/z 405,5 fragmenta-se perdendo um fenol (-m/z 47, 94
Da), formando o íon dicarregado de m/z 358,5 (717 Da).
52
Na Figura 28 observa-se que o íon monocarregado de m/z 905 (906 Da),
fragmenta-se por duas perdas neutras consecutivas de fenóis, formando os íons de m/z
811 (-94 Da) e m/z 717 (-188 Da).
Figura 28. Espectro de ESI – MS/MS para o íon de CE-04 Monocarregado.
De posse dessas informações podemos dizer com certeza que a substância
isolada é realmente o estilbenóide Nepalensinol B cuja formula molecular é C
56
H
42
O
12
.
53
5. CONCLUSÕES
Os objetivos propostos no início do projeto foram alcançados com êxito dentro
das possibilidades encontradas e criadas durante a execução do trabalho. Foram
avaliadas as atividades biológicas, tanto daquelas com metodologia simples, até as mais
complexas.
As atividades biológicas mais importantes que renderam resultados
satisfatórios e, de certa forma, inesperadas foram: atividade antiinflamatória tópica,
atividade antioxidante e antiproliferativa. Apesar das atividades biológicas
demonstradas pela planta não serem altas, elas são consideráveis e possibilitam a
utilização da planta como matéria prima na produção de fármacos, uma vez que sejam
isoladas as substâncias ativas.
Os estudos que foram realizados nesse trabalho e que, geralmente, não são
feitos em estudos fitoquímicos, foram àqueles pertencentes à análise centesimal, que são
comumente realizados em trabalhos sobre química de alimentos. Os resultados obtidos
para esses testes foram importantes, pois demonstram que a espécie estudada possui
uma quantidade relativamente grande de ácidos graxos, sendo alguns deles de suma
importância na alimentação, seja de animais, seja de seres humanos. Outro dado
importante é o alto teor de proteína bruta, principalmente das folhas. Esses resultados
indicam que a espécie estudada apresenta um grande potencial alimentício, e poderia ser
utilizada no enriquecimento de rações para bovinos, caprinos etc.
Foram isoladas 3 substâncias conhecidas como o palidol (dímero do
resveratrol), o carasiphenol C (trímero do resveratrol) e o nepalensinol B (tetrâmero do
resveratrol), que são estilbenóides encontrados, principalmente em espécies de uvas.
O resveratrol é um composto pertencente à classe dos estilbenos, isolado em
1974 pela primeira vez de uma leguminosa Peruviana, a Cássia quinquagulata. Os
estilbenos são comuns em Gnetaceae, Dipterocarpaceae e Vitaceae
26
. O resveratrol é
encontrado em várias plantas, contudo espécies de uvas e produtos relacionados são
consideradas as fontes mais importantes e o teor dessas substâncias estão relacionados
com as espécies e a maneira de cultivo das mesmas
32
. O resveratrol também é precursor
de viniferinas, fitoalexinas produzidas em folhas de
Vitis vinifera L. e é um componente
com atividade antifúngica em Vitis vinifera (Vitaceae), funcionando como fitoalexina,
após uma infecção por patógenos como Botrytis cinerea e Plasmopara viticola. O
resveratrol tem atividade contra dermatófitos e bactérias da pele em humanos, sugerindo
54
que o resveratrol poderia ser utilizado como agente terapêutico no combate a algumas
infecções fúngicas
32
.
Dessa forma alguns dos atrativos da planta para produção de fármacos ou
complemento nutricional para ração animal, por exemplo, é a quantidade de matéria
prima que pode ser produzida facilmente e sem necessidade de controles especiais, por
se tratar de uma erva daninha.
55
6. PRINCIPAIS REFERÊNCIAS
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26. Khan, M.A.; Nabi, S.G.; Prakash, S.; Zaman, A. Phytochem. 1986, 25,
1945–1948.
27. Kulesh, N. I.; Veselova, M. V.; Fedoreev, S. A.; Denisenko, V. A. Chem.
of Nat Comp.
2006, 42,(2).
28. Wang, S., Ma, D., Hu, C. Helv. Chim. Acta, 2005, 88(8), 2315-2321.
29. Ohyama, M.; Tanaka, T.; Iinuma, M. Phytochem. 1995, 38(3), 733-740.
30. Yamada, M.; Hayashi, K.; Hayashi, H.; Ikeda, S.; Hoshino, T.; Tsutsui, K.;
Tsutsui, K.; Linuma, M.; Nozaki, H. Phytochem. 2006, 67, 307–313.
31. Skehan, P.; Storeng, R.; Scudeiro, D.; Monks, A.; Mcmahon, J.; Vistica,
D.; Warren, J. T.; Bokesch, H.; Kenney, S.; Boyd, M. R.. J. of the Nat. Cancer Inst.,
Bethesda, 1990, v. 82, p. 1107-1112.
32. Da Silva, L., Oniki, G. H., Agripino D. G., Moreno, P. R. H., Young, M. C.
M., Mayworm, M. A. S., Ladeira, A. M.
Braz. J. of Pharm. 2007, 17(3): 361-367.
58
ANEXO
ESPECTROS
E R
1
H-1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
CE-01
1
H
E R
1
H-1 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
59
E R
1
H-1 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
E R
13
C-1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
E R
13
C-1 - Expansão 1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
60
E R
13
C-1 - Expansão 2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
E R
13
C-1 - Expansão 3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
E R
13
C-1 - Expansão 4. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
61
E R DEPT-1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-
01.
E R HMQC-1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
62
E R HMBC-1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
E R HMBC-1 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
63
E R HMBC-1 - Expansão 2. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
E R HMBC-1 - Expansão 3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
64
E R COSY-1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE-01.
E R NOESY-1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-01.
65
E R NOESY-1 - Expansão 1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
E R NOESY-1 - Expansão 2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-01.
66
E M-1. Espectro de massas ESI-MS/MS do composto CE-01.
67
E R
1
H-2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R
1
H-2 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
68
E R
1
H-2 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
E R
1
H-2 - Expansão 3. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
69
E R
13
C-2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto CE - 02.
E R DEPT-2. Espectro de RMN de DEPT (75,45MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE - 02.
70
E R HMQC-2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R HMQC-2 - Expansão 1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
71
E R HMQC-2 - Expansão 2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R HMBC-2 Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
72
E R HMBC-2 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R HMBC-2 - Expansão 2. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
73
E R HMBC-2 - Expansão 3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R COSY-2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE-02.
74
E R COSY-2 - Expansão 1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
E R COSY-2 - Expansão 2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
75
E R NOESY-2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-02.
76
E R NOESY-2 - Expansão 1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
E R NOESY-2 - Expansão 2. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
CD
3
OD/TMS) do composto CE-02.
77
E R
1
H-3. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E R
1
H-3 - Expansão 1. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
78
E R
1
H-3 - Expansão 2. Espectro de RMN de
1
H (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
E R
13
C-3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE -
04.
E R
13
C-3 - Expansão 1. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE - 04.
79
E R
13
C-3 - Expansão 2. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE - 04.
E R
13
C-3 - Expansão 3. Espectro de RMN de
13
C (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE - 04.
E R DEPT-3. Espectro de RMN de DEPT (75,45MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto
CE - 04.
80
E R HMQC-3. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E R HMQC-3 - Expansão 1. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
81
E R HMQC-3 - Expansão 2. Mapa de contornos HMQC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E R HMBC-3. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e 75,45MHz para
13
C,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
82
E R HMBC-3 - Expansão 1. Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E R HMBC-3 - Expansão 2 Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
83
E R HMBC-3 - Expansão 3 Mapa de contornos HMBC (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E R COSY-3. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do composto
CE-03.
84
E R COSY-3. Expansão 1. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, CD
3
OD/TMS) do
composto CE-03.
E R COSY-3 - Expansão 2. Mapa de contornos COSY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS)
do composto CE-04.
85
E R NOESY-3. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz, (CD
3
)
2
CO/TMS) do
composto CE-04.
86
E R NOESY-3 - Expansão 1. Mapa de contornos de NOESY (300,06MHz,
(CD
3
)
2
CO/TMS) do composto CE-04.
E M-2 - Monocarregado. Espectro de massas do íon monocarregado (ESI-MS/MS) do
composto CE-04.
E M-2 - Dicarregado. Espectro de massas do íon dicarregado (ESI-MS/MS) do
composto CE-04.
87
TABELAS DE COMPARAÇÃO
Tabela 13. Comparação dos dados de RMN de
1
H,
e
13
C (300,06MHz para
1
H e
75,45MHz para
13
C, CD
3
OD/TMS e (CD
3
)
2
CO/TMS) de CE-01 e (-) palidol.
CE-01 (-) Palidol
26,27
δ
C
(DEPT) HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
δ
C
(DEPT) HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
1,1’ 150,8 (2C) - 150,4 (2C) -
2,2’ 103,3 (2CH) 6,52 (d, 1,8; 2H) 103,5 (2CH) 6,18 (t, 2,1; 2H)
3,3’ 159,3 (2C) - 159,5 (2C) -
4,4’ 102,5(2CH) 6,10 (d, 1,8; 2H) 102,7(2CH) 6,05 (d, 2,4; 2H)
5,5’ 155,3 (2C) - 155,4 (2C) -
6,6’ 123,8 (2C) - 123,4 (2C) -
7,7’ 61,0 (2CH) 3,72 (s, 2H) 60,6 (2CH) 3,75 (s, 2H)
8,8’ 54,7 (2CH) 4,46 (s, 2H) 54,2 (2CH) 3,95 (s, 2H)
9, 9’ 138,4 (2C) - 137,9 (2C) -
10, 10’(14,
14’)
129,2 (4CH) 6,92 (d, 8,7; 4H) 129,2 (2CH);
129,5 (2CH)
7,05 (d, 8,5; 4H)
11, 11’(13,
13’)
116,0 (4CH) 6,64 (d, 8,7; 4H) 115,9 (4CH) 6,79 (d, 8,5; 4H)
12, 12’ 156,3 (2C) - 156,5 (2C) -
OH - - - 8,05 - 8,37 (6H)
88
Tabela 14. Comparação dos dados de RMN de
1
H,
e
13
C (300,06 e 400 MHz para
1
H;
75,45 e 100 MHz para
13
C, (CD
3
)
2
CO/TMS) de CE-04 e Nepalensinol B.
CE-04 Nepalensinol B
30
δ
C
(DEPT) HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
δ
C
(DEPT) HMQC -
1
J
CH
H: δ
H
(mult., J = Hz,
n° de H)
1, 1’ 144,6(2C) - 143,9(2C) -
2, 2’ 116,2(2C) - 115,6(2C) -
3, 3’ 163,3(2C) - 162,6(2C) -
4, 4’ 96,8(2CH) 6,20 (s, 2H) 96,1(2CH) 6,20 (s, 2H)
5, 5’ 155,6(2C) - 154,9(2C) -
6, 6’ 126,6(2C) - 125,9(2C) -
7, 7’ 60,6(2CH) 3,96 (s, 2H) 59,9(2CH) 3,97 (s, 2H)
8, 8’ 50,3(2CH) 4,29 (s, 2H) 49,6(2CH) 4,29 (s, 2H)
9, 9’ 138,6(2C) - 137,9(2C) -
10, 10’
(14, 14’)
129,3(4CH) 6,75 (d, 8,4; 4H) 128,6(4CH) 6,75 (d, 8,5; 4H)
11, 11’
(13, 13’)
115,5(4CH) 6,56 (d, 8,4; 4H) 114,8(4CH) 6,56 (d, 8,5; 4H)
12, 12’ 156,1(2C) - 155,3(2C) -
1’’, 1’’’ 148,7(2C) - 148,0(2C) -
2’’, 2’’’
(6’’, 6’’’)
106,7(4CH) 6,28 (sl, 4H) 106,0(4CH) 6,29 (sl, 4H)
3’’, 3’’’
(5’’, 5’’’)
160,2(4C) - 159,5(4C) -
4’’, 4’’’ 102,3(2CH) 6,31 (t, 2,1; 2H) 101,6(2CH) 6,31 (t, 2,0; 2H)
7’’, 7’’’ 57,2(2CH) 4,31 (d, 1,8; 2H) 56,4(2CH) 4,31 (d, 1,7; 2H)
8’’, 8’’’ 93,9(2CH) 5,30 (d, 1,8; 2H) 93,2(2CH) 5,31 (d, 1,7; 2H)
9’’, 9’’’ 134,8(2C) - 134,0(2C) -
10’’, 10’’’
(14’’, 14’’’)
127,3(4CH) 7,11 (d, 8,4; 4H) 126,6(4CH) 7,11 (d, 8,5; 4H)
11’’, 11’’’
(13’’, 13’’’)
116,1(4CH) 6,75 (d, 8,4; 4H) 115,4(4CH) 6,75 (d, 8,5; 4H)
12’’, 12’’’ 158,0(2C) - 157,3(2C) -
OH - 7,40 - 8,40 (10H) - 7,94 - 8,70 (10H)
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