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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
“ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE VEGETAL Mabea fistulifera Mart.
(EUPHORBIACEAE)”
Dissertação apresentada por
Aline Coqueiro ao Programa de Pós-
Graduação em Química do
Departamento de Química do Centro
de Ciências Exatas da Universidade
Estadual de Maringá como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Química
MARINGÁ, MAIO/2006
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Coqueiro, Aline
C786e Estudo químico e avaliação de atividades
biológicas da espécie vegetal "Mabea fistulifera
Mart." (Euphorbiaceae) / Aline Coqueiro. -- Maringá
: [s.n.], 2006.
111 f. : il. color., figs.
Orientador : Prof. Dr. Gentil José Vidotti.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-Graduação em Química, 2006.
1. Mabea fistulifera Mart. 2. Euphorbiaceae -
Estudo químico e atividade biológica. 3.
Flavonóides. 4. Triterpenos. 5. Ensaios biológicos.
I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de
Pós-graduação em Química. II. Título.
CDD 21.ed. 583.69
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Dissertação de Mestrado
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE VEGETAL “Mabea fistulifera
Mart.” (Euphorbiaceae)
Mestranda: Aline Coqueiro
Orientador: Prof. Dr. Gentil José Vidotti
2006
Aline Coqueiro
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE VEGETAL “Mabea fistulifera
Mart.” (Euphorbiaceae)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química Aplicada do
Departamento de Química do Centro de
Ciências Exatas da Universidade Estadual de
Maringá, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Gentil José Vidotti.
2006
minha mãe Maria, ao meu pai Ubaldo e
a minha irmã Letícia pelo amor, apoio,
incentivo e dedicação incondicional. Em
especial a minha avó Aparecida (in
memorian) que mesmo com todas as palavras
do mundo não conseguiria agradecer e dizer
o quanto foi e sempre será importante para
mim.
A
gradecimentos
- A Deus pela força e superação dos momentos mais difíceis, por todas as
oportunidades e principalmente pela minha vida.
- Ao professor Dr. Gentil José Vidotti pela paciência, orientação, disponibilidade,
apoio e por todos os ensinamentos profissionais e pessoais.
- À minha mãe pelo exemplo de coragem e superação e pelo incentivo constante
durante toda minha vida.
- Ao meu pai pelo incentivo e força nas horas de alegria e tristeza.
- À minha irmã pelo amor e incentivo.
- Ao meu namorado Carlos Salamão Júnior pelo incentivo, compreensão e
confiança.
- A todos os professores da UEM que contribuíram direta ou indiretamente com
minha formação acadêmica.
- Aos Profs. Maria Helena Sarragiotto, Cleuza Conceição da Silva, Clara Megumi
Abe Tanaka, Ernani Abchit Basso, Adley Forti Rubira e Gizilene Carvalho pelo apoio
e contribuições para o trabalho.
- Ao Prof. Marcos Alberto Zocoler pela coleta da planta.
- À Profa. Dra. Ciomar A. Bersani Amado, ao técnico Jailson Araújo Dantas e ao
aluno Arthur Estivalet Svidzinski pela realização do teste antiinflamatório.
- À Profa. Dra. Lucília Motinha Zamuner pela supervisão no teste moluscicida.
- Ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura pela realização do teste antimicrobiano.
- À técnica Ivânia pela realização das análises de RMN e disposição para
esclarecimento de dúvidas.
- Ao Prof. Dr. Willian Ferreira da Costa e as alunas de doutorado Anelise e Lílian
pela ajuda com o experimento de atividade antioxidante.
- À Inês Lunardi pela realização das análises de RMN realizadas na Unicamp.
- À Patrícia Valderrama pelos artigos fornecidos, pela paciência e apoio.
- Ao Claudemir e Cristina da secretaria de pós-graduação de química.
- Aos colegas do Laboratório pelo companheirismo.
A
- Aos amigos Ana Paula, Jacqueline e Marcos H. Kunita (Marcão) pela força e
incentivo e pelos momentos de descontração.
- Aos colegas do laboratório Janaína, Juliana, Viviane, Cristiana, Raíssa, Elidia,
Andrelson, Marcos J. L. Santos, Rafael Sanches, Luiz Henrique, Rafael e
Washington.
- Aos familiares pela força e carinho.
- Ao Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá por possibilitar
a realização deste trabalho.
- E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
RESUMO
Palavras-chave: Mabea fistulifera Mart., flavonóides, triterpenos e ensaios biológicos.
O presente trabalho teve por objetivo o estudo químico e avaliação de algumas
atividades biológicas, tais como: toxicidade com Artemia salina, susceptibilidade
antibacteriana/antifúngica, atividade moluscicida, atividade antioxidante e antiinflamatória de
Mabea fistulifera Mart.
A espécie vegetal foi dividida em diferentes partes: folhas, galhos, pedúnculos florais,
cascas do caule, cascas das sementes e sementes, sendo cada uma das partes submetida a
diferentes extrações com vários solventes e os extratos tiveram suas atividades biológicas
testadas, porém apenas os extratos hexânico, etanólico e diclorometânico das folhas e
etanólico das cascas das sementes foram estudados quimicamente.
O fracionamento do extrato hexânico em diferentes solventes utilizando técnicas
cromatográficas resultou na separação de duas misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa e
de uma mistura dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol.
As flavanonas: 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (2), 7-O-β-
[(3”-p-coumaroil) glucopiranosil] naringenina (3), 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil]
naringenina (4) e 7-O-β glucopiranosil naringenina e uma mistura dos triterpenos α e β-
amirina foram isolados das cascas das sementes.
Todos os extratos etanólicos e as frações diclorometânica e butanólica foram ativos no
teste de toxicidade com Artemia salina sendo o extrato etanólico das cascas do caule o mais
ativo com IC
50
= 48,17 µg/mL. No teste de susceptibilidade antibacteriana/antifúngica alguns
extratos demonstraram atividade moderada para: B. subtilis; C. parapsilosis e C. tropicalis.
Nenhum dos extratos testados foi ativo para as bactérias Gram negativas: E. coli e P.
aeruginosa e nem para à levedura C. albicans. Dos extratos e frações testados para atividade
moluscicida, nenhum pode ser considerado ativo.
No teste de atividade antioxidante, a fração acetato de etila do extrato etanólico das
folhas foi a mais ativa com IC
50
= 4,75 µg/mL.
Para o teste antiinflamatório somente os resultados do extrato etanólico dos
pedúnculos florais sugerem uma possível atividade antiinflamatória.
ABSTRACT
Keywords: Mabea fistulifera Mart., flavonoids, triterpenes and biological assays
In the present work we reported the chemical and biological evaluation, such as
toxicity against Artemia salina, antibacterial, atifungal, molluscicidal, antioxidant and anti-
inflammatory activities of Mabea fistulifera Mart.
The plant material was divided in: leaves, stem, floral stalks, peels, seeds peels and
seeds and each one was submitted to different exactions using different solvents and were
submitted to biological assays, however only the extracts hexane, ethanolic, dicloromethane
on leaves and ethanolic on seeds peels were chemically study.
The fractionation of the hexane extract with different solvents using chromatographic
techniques resulted on the isolation of two mixture of long chain hidrocarbon and of the
mixture of β-sitosterol and stigmasterol steroids.
The flavanons: naringenin 7-O-β-(3”,6”-di-p-coumaroyl)glucoside (2), naringenin 7-
O-β-(3”-p-coumaroyl)glucoside (3), naringenin 7-O-β-(6”-p-coumaroyl)glucoside (4) and
naringenin 7-O-β-glucoside and of the triterpene mixture of α and β-amirine was isolated of
seeds peels.
All the ethanolic extracts and dicloromethane and buthanol fractions were toxic
against Artemia salina being ethanolic peels extract the most active with an IC
50
= 48.17 µg/
mL.
For the antibacterial and antifungal evaluation some extracts gave a moderated activity
for S. aureus, B. subtilis, C. parapsilosis and C. tropicalis. None of the extracts were active
on the Gran-negative E. coli and P. aeruginosa or even for the yeast C. albicans. For the
mollucicidal evaluation none of the extracts were active.
For the antioxidant assay the ethyl acetate fraction most active with a IC
50
= 4.75 µg/
mL.
For the antiinflamatory evaluation only the floral stalks ethanolic extract suggesting a
possible antiinflamatory active.
ÍNDICE ANALÍTICO
ÍNDICE DE TABELAS ............................................................................................................i
ÍNDICE DE FIGURAS ...........................................................................................................iii
ÍNDICE DE ESQUEMAS.......................................................................................................vi
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ........................................................................................vii
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................1
1.1. Ocorrências e posição taxonômica...............................................................................5
1.2. Testes biológicos.............................................................................................................7
1.2.1. Toxicidade com Artemia salina................................................................................7
1.2.2. Atividade antibacteriana/antifúngica........................................................................7
1.2.3. Atividade moluscicida..............................................................................................8
1.2.4. Atividade antioxidante............................................................................................10
1.2.5. Atividade antiinflamatória......................................................................................12
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................15
3. PARTE EXPERIMENTAL...............................................................................................16
3.1. Materiais e métodos.....................................................................................................16
3.2. Preparação dos extratos e avaliação de atividades biológicas da espécie vegetal
Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae) ........................................................................18
3.2.1. Coleta e secagem da espécie vegetal......................................................................18
3.2.2. Avaliação das atividades biológicas.......................................................................21
3.2.2.1. Teste de toxicidade com Artemia salina..........................................................22
3.2.2.2. Teste de susceptibilidade antibacteriana/antifúngica pelo método da
microdiluição................................................................................................................23
3.2.2.2.1. Teste de susceptibilidade antibacteriana...................................................23
3.2.2.2.2. Teste de susceptibilidade antifúngica.......................................................24
3.2.2.3. Atividade moluscicida.....................................................................................24
3.2.2.4. Atividade antioxidante.....................................................................................26
3.2.2.5. Teste de atividade antiinflamatória por indução de pleurisia em rato.............27
3.3. Estudo químico ............................................................................................................28
3.3.1. Estudo das folhas....................................................................................................28
3.3.1.1. Fracionamento do extrato hexânico bruto das folhas/Isolamento das
substâncias MF-1 e MF-2.............................................................................................29
3.3.1.1.1. Estudo da fração MF-HF 5/Isolamento da substância MF-3....................30
3.3.1.2. Partição do extrato etanólico total das folhas..................................................31
3.3.2. Estudo das cascas das sementes .............................................................................31
3.3.2.1. Fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes I ..............32
3.3.2.1.1. Estudo da fração MF-ECS 10/Isolamento das substâncias MF-4 e MF-534
3.3.2.1.2. Estudo da fração MF-ECS 12/Isolamento das substâncias MF-6, MF-7 e
MF-4.........................................................................................................................35
3.3.2.2. Fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes
II/Isolamento da substância MF-8................................................................................35
3.3.2.2.1. Estudo da fração MF-ECS II.13/Isolamento da substância MF-4............37
3.3.2.2.1.1. Estudo da fração MF-ECS II.13.4 .....................................................39
3.3.2.2.1.1.1. Estudo da fração MF-ECS II.13.4.S.2/Isolamento das substâncias
MF-4 e MF-5 ....................................................................................................40
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .....................................................................................43
4.1. Avaliação das atividades biológicas ...........................................................................43
4.1.1. Avaliação da toxicidade com Artemia salina.........................................................43
4.1.2. Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica ..............................................44
4.1.3. Avaliação da atividade moluscicida .......................................................................45
4.1.4. Avaliação da atividade antioxidante.......................................................................45
4.1.5. Avaliação da atividade antiinflamatória.................................................................47
4.2. Identificação das substâncias isoladas.......................................................................51
4.2.1. Composto MF-1/MF-2 ...........................................................................................51
4.2.2. Composto MF-3......................................................................................................55
4.2.3. Composto MF-6......................................................................................................61
4.2.4. Composto MF-4......................................................................................................68
4.2.5. Composto MF-7......................................................................................................80
4.2.6. Composto MF-5......................................................................................................91
4.2.7. Composto MF-8....................................................................................................101
5. CONCLUSÕES.................................................................................................................106
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................108
i
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Relação da coleta das diferentes partes da planta e dos extratos obtidos.................21
Tabela 2: Dados do fracionamento do extrato hexânico total da folhas (MF-HF) por coluna
cromatográfica..................................................................................................................30
Tabela 3: Dados do fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes (MF-
ECS) por coluna cromatográfica. .....................................................................................33
Tabela 4: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS.....................................34
Tabela 5: Dados do fracionamento do extrato etanólico total da cascas das sementes II (MF-
ECS II) por coluna cromatográfica...................................................................................36
Tabela 6: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II. ................................37
Tabela 7: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13 por coluna cromatográfica........38
Tabela 8: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13. ...........................38
Tabela 9: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13.4 por coluna cromatográfica em
Sephadex LH-20...............................................................................................................39
Tabela 10: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13.4. ......................40
Tabela 11: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13.4.S.2 por coluna cromatográfica.
..........................................................................................................................................41
Tabela 12: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13.4.S.2.................41
Tabela 13: Dados de letalidade de Artemia salina dos extratos obtidos da espécie Mabea
fistulifera Mart. (Euphorbiaceae) (LC
50
e LC
90
em µg/mL).............................................43
Tabela 14: Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica com as respectivas CMI e
CMB para os extratos e frações que demonstraram atividade..........................................44
Tabela 15: Avaliação da atividade moluscicida da espécie Mabea fistulifera Mart. ...............45
Tabela 16: Comparação dos dados de deslocamentos químicos de RMN
13
C (75,45 MHz em
CDCl
3
) de MF-3 com os dados da literatura
61,62
para estigmasterol e β-sitosterol. .........56
Tabela 17: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY de MF-6 em
C
2
D
6
CO. ...........................................................................................................................63
Tabela 18: Dados de RMN
1
H (300,06 MHz, C
2
D
6
CO) para a substância MF-6 e comparação
com os dados da literatura
19
(δ
1
H
a
)...................................................................................64
Tabela 19: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas através do espectro de COSY de
MF-4 em C
2
D
6
CO. ...........................................................................................................71
Tabela 20: Dados de
13
C (75,45 MHz) e valores de RMN 2D (300,06 MHz em C
2
D
6
CO) para
o composto MF-4 (3) e comparação com dados da literatura
19
(
13
C
a
e HMQC
a
). ...........72
ii
Tabela 21: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY de MF-7 em
C
2
D
6
CO. ...........................................................................................................................83
Tabela 22: Dados de
13
C (75,45 MHz) e valores de RMN 2D (300,06 MHz em C
2
D
6
CO) para
o composto MF-7 (4) e comparação com dados da literatura
63
(
13
C
a
, HMQC
a
). .............84
Tabela 23: Dados de RMN
13
C (75,45 MHz) para MF-5 em C
2
D
6
CO. ...................................94
Tabela 24: Dados de
1
H (300,06 MHz) para o composto MF-5 (2) (C
2
D
6
CO) e comparação
com dados da literatura
19
(δ
1
H
a
). ......................................................................................95
Tabela 25: Dados de deslocamentos de carbono para MF-8
(a e b) em CDCl
3
e comparação
com dados da literatura
64
para β-amirina
a
, α-amirina
a
...................................................102
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae). Quatá-SP, com detalhes dos pedúnculos
florais, frutos e folhas.........................................................................................................6
Figura 2: Ciclo do Schistossoma mansoni a) ovo com miracídeo alcançando a água; b)
miracídeo nadando para um caramujo – Biomphalaria; c) penetração do miracídeo nas
partes moles do caramujo; d) esporocisto 1º; e) esporocisto 2º; f) esporocisto 2º com
cercarias dentro; g) cercária saindo do caramujo; h) cercária nadando para novo
hospedeiro
39
........................................................................................................................9
Figura 3: Materiais utilizados no laboratório de fitoquímica para realização do teste de
toxicidade com Artemia salina.........................................................................................22
Figura 4: Método de pleurisia em rato na determinação de atividade antiinflamatória. ..........28
Figura 5: Descoramento da solução de DPPH
•
à medida que a reação se processa.................46
Figura 6: Comparação entre valores de IC
50
(µg/mL) realizados pelo método do DPPH
•
(P<0,05)............................................................................................................................47
Figura 7: Efeito dos extratos etanólicos da espécie Mabea fistulifera Mart. sobre o volume do
exsudato pleural induzido pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle
(Anova, teste de Tukey). ..................................................................................................48
Figura 8: Efeito dos extratos etanólicos da espécie Mabea fistulifera Mart. sobre a migração
de leucócitos induzida pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle
(Anova, teste de Tukey). ..................................................................................................48
Figura 9: Efeito do extrato etanólico dos pedúnculos florais da espécie Mabea fistulifera Mart.
utilizando água e solução de DMSO como solvente, sobre o volume do exsudato pleural
induzido pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de
Tukey)...............................................................................................................................49
Figura 10: Efeito do extrato etanólico da espécie Mabea fistulifera Mart. utilizando água e
solução de DMSO como solvente, sobre a migração de leucócitos induzida pela injeção
de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey)......................49
Figura 11: Efeito dos extratos das folhas da espécie Mabea fistulifera Mart. e comparação
entre diferentes métodos de extração sobre o volume do exsudato pleural induzido pela
injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey). ........50
Figura 12: Efeito dos extratos das folhas da espécie Mabea fistulifera Mart. e comparação
entre diferentes métodos de extração sobre a migração de leucócitos induzida pela
injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey). ........50
iv
Figura 13: A) Espectro de RMN
1
H para MF-1 (mistura de hidrocarbonetos de cadeia longa)
(300,06 MHz) em CDCl
3
..................................................................................................53
Figura 14: A) Espectro de RMN
1
H para MF-2 (misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa)
(300,06 MHz) em C
5
D
5
N. ................................................................................................54
Figura 15: Espectro de IV (KBr) para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol).............................57
Figura 16: Espectro de RMN
1
H para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol) (300,06 MHz) em
CDCl
3
. ..............................................................................................................................59
Figura 17: Espectro de RMN
13
C/DEPT para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol) (
,
75,45
MHz) em CDCl
3.
..............................................................................................................60
Figura 18: Conformação preferencial do anel C da flavanona.................................................62
Figura 19: Espectro de IV (filme) para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil naringenina.
..........................................................................................................................................65
Figura 20: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil -naringenina
(300,06 MHz) em C
2
D
6
CO...............................................................................................66
Figura 21: Espectro de COSY para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil naringenina em
C
2
D
6
CO. ...........................................................................................................................67
Figura 22: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-4.......................69
Figura 23: Representação das interações observadas pela irradiação do sinal em δ
H
5,26 (H-
1”) e 12,09 (HO-5). ..........................................................................................................70
Figura 24: Espectro de IV (KBr) para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina. ...........................................................................73
Figura 25: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO................................74
Figura 26: Espectro de
1
H x
1
H COSY para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................75
Figura 27: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em C
2
D
6
CO..................................76
Figura 28: Espectro de HMQC para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................77
Figura 29: Espectro de HMBC para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................78
Figura 30: Espectro de diferença de NOE em C
2
D
6
CO de MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................79
v
Figura 31: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-7.......................82
Figura 32: Espectro de IV (filme) para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina. ...........................................................................85
Figura 33: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO................................86
Figura 34: Espectro de COSY para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................87
Figura 35: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em C
2
D
6
CO..................................88
Figura 36: Espectro de HMQC para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................89
Figura 37: Espectro de HMBC para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................90
Figura 38: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-5.......................93
Figura 39: Espectro de RMN
1
H para a substâncias MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO................................96
Figura 40: Espectro de COSY para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................97
Figura 41: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em C
2
D
6
CO..................................98
Figura 42: Espectro de HMQC para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO........................................................99
Figura 43: Espectro de HMBC para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO......................................................100
Figura 44: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-8 (α e β-amirina) (300,06 MHz) em
CDCl
3
. ............................................................................................................................103
Figura 45: Espectro de RMN
13
C/DEPT da mistura MF-8 (α e β-amirina) (75,45 MHz) em
CDCl
3
. ............................................................................................................................104
Figura 46: Espectro de HMQC para MF-8 (α e β-amirina) em CDCl
3
..................................105
vi
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1: Procedimento empregado para obtenção dos extratos das folhas (---) e das cascas
das sementes (---) e atividades realizadas: 1- Toxicidade com Artemia salina; 2-
Atividade moluscicida; 3-Atividade antimicrobiana; 4- Atividade antioxidante e 5-
Atividade antiinflamatória................................................................................................19
Esquema 2: Procedimento empregado para obtenção dos extratos da casca do caule (---),
galhos (---), pedúnculos florais (---) e sementes (---) e atividades realizadas: 1-
Toxicidade com Artemia salina; 2- Atividade moluscicida; 3-Atividade antimicrobiana;
4- Atividade antioxidante e 5- Atividade antiinflamatória...............................................20
Esquema 3: Procedimento utilizado para avaliação da atividade moluscicida da espécie
Mabea fistulifera Mart......................................................................................................25
Esquema 4: Procedimento empregado para o isolamento dos constituintes das folhas de
Mabea fistulifera Mart......................................................................................................29
Esquema 5: Procedimento empregado para o isolamento dos constituintes das cascas das
sementes de Mabea fistulifera Mart. ................................................................................32
20
vii
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
δ Deslocamento Químico (em ppm)
ATCC American Type Culture Collection
CC Coluna Cromatográfica
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CG Cromatografia Gasosa
CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
d Dupleto
dd Duplo Dupleto
DEPT Disctortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO Dimetilsulfóxido
EM Espectrometria de Massas
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Hz Hertz
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento
m Multipleto
MHz Megahertz
NOE Nuclear Overhauser Enhancement
ppm Partes por Milhão
RMN Ressonância Magnética Nuclear
UV Ultravioleta
1
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico alternativo de
grande aceitação pela população e vem crescendo junto à comunidade médica, desde que
sejam utilizadas plantas cujas atividades biológicas tenham sido investigadas cientificamente,
comprovando sua eficácia e segurança
1,2
.
A importância de plantas medicinais deve-se também por sua contribuição como fonte
natural de fitoterápicos e por proporcionar grandes chances de obter-se uma molécula
protótipo para a produção de fármacos devido à diversidade dos constituintes presentes nestas
2,3,4,5
. No entanto inúmeras plantas que são usadas em preparações fitoterápicas carecem de
um maior controle de qualidade, uma vez que a literatura científica indica que muitas destas
podem apresentar substâncias tóxicas ou composição química variável
6,7
.
A utilização de plantas na arte de curar é uma forma de tratamento muito antiga, e está
relacionada aos primórdios da medicina e fundamentada no acúmulo de informações através
de sucessivas gerações. Ao longo dos séculos, produtos de origem vegetal constituíram as
bases para tratamento de diferentes doenças.
A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez tenha sido
uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. A história do desenvolvimento
das civilizações Oriental e Ocidental é rica em exemplos da utilização de recursos naturais na
medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa, merecendo destaque à
civilização Egípcia, Greco-romana e Chinesa. A medicina tradicional chinesa desenvolveu-se
com tal grandiosidade e eficiência que até hoje muitas espécies e preparados vegetais
medicinais são estudados na busca pelo entendimento de seu mecanismo de ação e no
isolamento dos princípios ativos
8
.
Estima-se que 25% de todos os medicamentos modernos são derivados diretos ou
indiretos de plantas medicinais
9,10
, nos países em desenvolvimento esta taxa alcança 80%
11
.
Em alguns casos, como a terapia antitumoral e antimicrobiana, 60% dos medicamentos
disponíveis no mercado e a maioria dos que se encontram nas últimas fases de ensaios
clínicos, são provenientes de plantas superiores
11
.
Apesar dos estudos com plantas medicinais virem crescendo, eles revelam que
somente de 15 a 17% das plantas que habitam o globo, foram estudadas do ponto de vista
medicinal
12
. Da mesma forma é relativamente baixa a quantidade de plantas que tenham sido
submetidas a uma avaliação científica com vistas a demonstrar seu uso seguro, efeitos
potencias e efetividade
7
.
2
O Brasil possui uma das maiores diversidades genéticas de plantas do mundo, porém
menos de 10% têm sido avaliadas com respeito às suas características biológicas e menos de
5% têm sido submetidas a estudos fitoquímicos detalhados. Apesar do recente aumento nas
pesquisas na área das atividades, as plantas até agora são pouco utilizadas, porém
potencialmente muito valiosas como fontes para futuras descobertas de substâncias
biologicamente ativas
13
.
A família Euphorbiaceae consiste em 290 gêneros e 7500 espécies distribuídas nas
regiões tropicais e temperadas do globo, concentrando-se principalmente na África e América
Tropical. A família Euphorbiaceae consiste de plantas dicotiledôneas, ervas, arbustos e
árvores, algumas suculentas semelhantes a cactos que são caracterizadas freqüentemente pela
ocorrência de seiva leitosa geralmente tóxica
14
, com folhas inteiras ou partidas, em geral com
estípulas, latescentes ou não
15
. O gênero Euphorbia, que dá nome à família, é atípico,
marcado por uma inflorescência de flores reduzidas, rodeadas por brácteas e glândulas. A
coroa-de-cristo é um representante deste gênero muito cultivado como ornamental, sendo um
grande causador de intoxicações.
Esta família possui espécies com grande interesse comercial como, por exemplo, a
mamona (Ricinus communis L.) e o tungue (Aleurites fordii Hansley) que produzem óleo de
baixo ponto de congelamento, usados em certos tipos de lubrificações. São desta família,
ainda, as seringueiras (Hevea Brasileisis M. Arg.) e a mandioca (Manihot esculenta Crantz).
A primeira produz látex que é usado na fabricação de borracha, e a outra serve-nos de
alimento
2
. Em geral se pode afirmar que as Euphorbiaceae têm sido muito menos estudadas
que outras grandes famílias de angiospermas, tais como Compositeae, Gramineae,
Leguminoseae, Curciferae, Solanaceae, Orchidiaceae e Umbelliferae.
Atualmente, algumas plantas desta família têm despertado interesse pelo seu potencial
moluscicida (agentes que exterminam moluscos vetores da esquistossomose). Outro interesse
que leva ao estudo desta família é a presença de compostos químicos chamados diterpenóides,
os quais mostram atividades promotoras de tumor. Vários outros terpenóides também são
encontrados no látex das Euphorbiaceae, bem como em diferentes partes das plantas
16
.
Estudos realizados durante 150 anos para estabelecer os princípios purgativos de
Croton tiglium Linneo, tomaram novos ímpetos depois do descobrimento da atividade
potencializadora de tumores (co-carcinogênica) do “óleo de cróton”, estes esforços
culminaram no isolamento de substâncias co-carcinogênicas do óleo como diterpenos ésteres
de forbol tetracíclico. Depois da elucidação da estrutura do forbol, foram identificados muitos
ésteres diterpenos relacionados, das espécies de Euphorbia. Alguns destes compostos são
3
promotores de tumores, enquanto que outros têm ação antitumoral. Porém, todos eles são
potentes irritantes primários sobre a pele dos mamíferos
16
.
A maioria dos trabalhos publicados sobre as atividades tóxicas de representantes desta
família discute os efeitos carcinogênicos de seus compostos químicos. Os tumores só se
desenvolvem depois de uma exposição crônica a estas plantas, e este fenômeno tem sido
demonstrado apenas na pele de camundongos. O efeito da exposição aguda da pele de
humanos a estas plantas leva à inflamação, e os sintomas pré-inflamatórios são dor e necrose
do tecido epitelial. Quando partes das plantas são ingeridas, os sintomas são ardências nos
lábios, língua e mucosas orais, seguidos de dores intestinais, vômitos e diarréias severas. O
contato com os olhos pode causar conjuntivite e edema
16
.
Vários gêneros já foram estudados quimicamente, especialmente Euphorbia, para o
qual se encontram relatos de estudos de mais de 120 espécies. Uma revisão destes dados
demonstrou que os triterpenóides (mais de 55 triterpenóides tetra e pentacíclicos já foram
isolados), seguidos pelos flavonóides (principalmente flavonas, flavonols e flavanonas) e
alcalóides são as principais classes de substâncias de interesses para os fitoquímicos.
Entretanto, também existem relatos da presença de outras classes de compostos tais como
cumarinas, glucosídeos cianogênicos, taninos, álcoois graxos (principalmente n-octacosanol e
n-hexacosanol), hidrocarbonetos, ácidos graxos saturados e insaturados, saponinas
triterpenoidais, antocianinas, lignanas, fenantrenos e quinonas, ácidos fenólicos, além de
outros compostos aromáticos e demais classes de compostos que vêm sendo encontradas em
plantas da família Euphorbiaceae
16
.
As plantas da família Euphorbiaceae têm demonstrado atividade antiinflamatória, além
de sua atividade para conjuntivite
16
.
As principais aplicações e usos populares das Euphorbiaceae estão relacionados com
aplicações para dores abdominais, antistamínicos, afrodisíacos, bronquites, diabetes,
enfermidades urinárias entre outras
16
.
A planta em estudo Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae) é uma planta nativa,
amplamente encontrada no Cerrado e em áreas de transição para Mata Estacional
Semidecidual. Ocorre nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. É
normalmente encontrada agregada em bordas de mata e em locais com impacto antrópico
acentuado. Sua presença é muito comum na região noroeste do estado de São Paulo. A
floração desta planta ocorre de fevereiro a junho, atingindo o pico entre abril e maio, que
corresponde ao início da estação seca na região; por ocorrer durante o período de escassez de
alimento, muitos animais utilizam seu pólen e néctar, produzidos em abundância, como fonte
4
alternativa de alimento
17
. Popularmente esta espécie é conhecida como: Canudo-de-pito,
Canudeiro, Mamoninha do mato e Leiteira preta. Neste trabalho realizamos o estudo desta
espécie devido à inexistência de estudos químicos e biológicos da mesma.
Através da revisão da literatura para o gênero Mabea, foram encontrados relatos de
estudos com duas espécies desse gênero: Mabea excelsa
18
e Mabea fistulifera subsp. robusta
20
e da espécie Mabea caudata Peth
19
do gênero Mabea Aubl.
Estudos realizados com as espécies Mabea caudata Peth
19
e Mabea fistulifera subs.
robusta
20
evidenciaram compostos com estrutura coumaroilglucopiranosil naringenina como
principais componentes.
O gênero Mabea Aubl. compreende 50 espécies distribuídas sobre a América Central e
América do Sul sendo uma delas a espécie Mabea Caudata Peth., bem representada nas
florestas da região Amazônica. De frutos desta espécie foram isolados (2S)-5,7,4’-flavanona
(naringenina, 1), e dois novos compostos (2 e 3)
19
.
ORO
OH O
OH
1 R = H
2 R = β-3”,6”-di-p- coumaroilglucopiranosil
3 R = β-3”-p-coumaroilglucopiranosil
Para a espécie Mabea fistulifera subs. robusta foi encontrado relato do estudo com o
extrato etanólico dos frutos. A espécie originária do norte e centro-oeste do Brasil apresentou
atividade significante no bioensaio com Artemia salina. Desta espécie foram isolados os
seguintes compostos: 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (2), 7-O-β-
[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (3) e 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil]
naringenina (4) sendo o composto 2 o bioativo no teste com Artemia salina
20
.
5
OO
OH O
OH
O
OH
OR
2
HO
R
1
O
2 R
1
= R
2
= p-coumaroil
3 R
1
= p-coumaroil, R
2
=H
4 R
1
= H, R
2
= p-coumaroil
Pelo fato da família Euphorbiaceae ser pouco estudada quimicamente quando
comparada a outras grandes famílias de plantas superiores, a investigação química e
farmacológica de mais uma espécie, a Mabea fistulifera Mart., poderá ampliar os estudos,
podendo resultar no isolamento de substâncias importantes farmacologicamente e que possam
contribuir para o estudo quimiotaxonômico do gênero e da família.
1.1. Ocorrências e posição taxonômica
A espécie em estudo, Mabea fistulifera Mart. (Figura 1) tem como nomes populares:
Canudo-de-Pito, Canudeiro, Mamoninha do mato e Leiteira preta.
Suas ocorrências são:
Porte: árvore
Ambiente em que se encontra: cerradão
Época de florescimento: fevereiro a junho
Época de frutificação: setembro-outubro
A espécie vegetal possui a seguinte posição taxonômica
21
:
Reino: Plantae
Filo: MAGNOLIOPHYTA
Classe: Magnoliopsida
Ordem: Euphorbiales
Família: Euphorbiaceae
Gênero: Mabea
Espécie: Mabea fistulifera Mart.
6
Figura 1: Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae). Quatá-SP, com detalhes dos pedúnculos
florais, frutos e folhas.
7
1.2. Testes biológicos
1.2.1. Toxicidade com Artemia salina
Muitos laboratórios de Produtos Naturais têm inserido dentro de suas rotinas de
isolamento, purificação e elucidação estrutural, diversos ensaios biológicos simples, no intuito
de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de extratos de plantas na procura de
substâncias bioativas. Dentre estes bioensaios encontra-se a Toxicidade sobre Artemia salina
(TAS).
O TAS se caracteriza por ser de baixo custo, rápido e não exigir técnicas assépticas.
Inúmeros constituintes bioativos têm sido obtidos de extratos vegetais através da utilização
deste teste na monitoração de estudos fitoquímicos
22,23
.
Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada que é utilizado como alimento
vivo para peixes, sendo seus ovos facilmente encontrados em lojas de aquaristas. A
simplicidade do bioensaio TAS facilita sua utilização rotineira, podendo ser desenvolvido no
próprio laboratório de fitoquímica
22
.
Diversos trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com
atividades como antifúngica, viruscida e antimicrobiana
24
, parasiticida
25
, tripanocida
26
, entre
outras. McLaughlin e colaboradores
22,23,27-30
têm utilizado sistematicamente este bioensaio na
avaliação prévia de extratos de plantas conhecidas como antitumorais. As frações ou
substâncias ativas são posteriormente testadas em diferentes culturas de células tumorais,
obtendo-se uma boa correlação. Uma das classes de compostos com atividades antitumorais é
a dos terpenóides, os quais são relatados em muitos gêneros da família Euphorbiaceae.
1.2.2. Atividade antibacteriana/antifúngica
Tendo em vista que bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos representam um
desafio no tratamento de infecções, é notória a necessidade de se encontrar novas substâncias
com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses
microorganismos
31
.
A savana brasileira é muito diversificada e rica, muitas das plantas encontradas nesse
ecossistema são usadas na medicina natural, no tratamento de doenças tropicais, incluindo
8
infecções bacterianas
32
. Por outro lado, devido ao desconhecimento da possível existência da
ação tóxica, bem como de sua indicação adequada, as plantas medicinais são muitas vezes
usadas de forma incorreta, não produzindo os efeitos desejados.
Dentre as atividades biológicas mais estudadas nos laboratórios de Produtos Naturais
está a atividade antibacteriana e antifúngica, com a perspectiva de obtenção de produtos que
possam ser utilizados na produção de fármacos para a terapêutica das infecções produzidas
por bactérias e fungos. Neste sentido inclui-se o estudo da atividade antibacteriana e
antifúngica de extratos, óleos e compostos em grande número de gêneros de plantas
brasileiras
33
.
A atividade antimicrobiana pode ser atribuída a diferentes classes de compostos sendo
uma delas os compostos fenólicos como evidenciado para o extrato alcoólico de própolis
34
,
estando esta classe de compostos presente em diversos gêneros da família Euphorbiaceae,
bem como para as espécies estudadas do gênero Mabea.
1.2.3. Atividade moluscicida
A esquistossomose é uma doença crônica e debilitante que afeta pessoas que têm
contato com águas que abrigam caramujos infectados, tais como: trabalhadores rurais,
crianças, lavadeiras em áreas sem tratamento de água e esgoto, etc. Esta doença afeta milhões
de pessoas em vários países e é um dos principais problemas de saúde pública do mundo
35
.
Entre as doenças parasitárias humanas a esquistossomose é a segunda colocada, atrás
da malária, em termos de gravidade sócio-econômica e saúde pública em áreas tropicais e
sub-tropicais
36
.
Esta doença é endêmica em 74 paises em desenvolvimento, infectando cerca de 200
milhões de pessoas em áreas rurais e urbanas. Destas 20 milhões sofrem severas
conseqüências e 120 milhões são sintossomáticas. Em muitas áreas a esquistossomose
contamina uma grande proporção de crianças menores de quatorze anos e estima-se que 500-
600 milhões de pessoas mundialmente corram o risco de contrair esta doença
37
.
O verme Schistossoma mansoni, é o agente etiológico e requer o caramujo
Biomphalaria glabrata como maior hospedeiro intermediário para transmissão
38
. Esta
transmissão acontece quando as cercarias penetram na pele, mais freqüentemente nos pés e
pernas por serem áreas do corpo que mais freqüentemente ficam em contato com águas
contaminadas. O horário em que são vistas em maior quantidade na água e com maior
9
atividade é entre 10 e 16 horas, quando a luz solar e o calor são mais intensos. Os locais onde
ocorrem a transmissão mais freqüentemente são os focos peridomiciliares: valas de irrigação
de horta, açudes (reservatórios de água e local de brinquedo de crianças) e pequenos córregos
onde as lavadeiras e crianças costumam ir
39
. Por meio da Figura 2 pode-se observar o ciclo do
Schistossoma mansoni.
Figura 2: Ciclo do Schistossoma mansoni a) ovo com miracídeo alcançando a água; b)
miracídeo nadando para um caramujo – Biomphalaria; c) penetração do miracídeo nas partes
moles do caramujo; d) esporocisto 1º; e) esporocisto 2º; f) esporocisto 2º com cercarias
dentro; g) cercária saindo do caramujo; h) cercária nadando para novo hospedeiro
39
.
O uso de produtos naturais na terapêutica está crescendo em todo o mundo, tal como o
interesse por pesquisas nesta área
40
. O Brasil devido a sua riqueza em biodiversidade tem
estimulado e focado suas pesquisas em novos fármacos de derivados naturais e seu interesse
tem se estendido para o campo do controle dos vetores
40
. As pesquisas por moluscicidas
eficazes, com menores custos e menor impacto ambiental estimularam a pesquisa por
substâncias potencialmente ativas de plantas nativas
41
. As substâncias moluscicidas são um
fator crucial para o controle da esquistossomose. Apenas uma substância, a niclosamida, é
recomendada pela OMS como moluscicida
42
.
10
Em países de Terceiro Mundo o uso de moluscicidas sintéticos tem causado problemas
de toxicidade, contaminação do meio ambiente e a resistência dos caramujos (Biomphalaria
glabrata) transmissores da esquistossomose. Em contraste, o uso de plantas com atividade
moluscicida pode representar uma alternativa barata, além de não poluir o meio ambiente
43
.
O ensaio para avaliação da atividade moluscicida, utilizado neste trabalho, constitui
uma importante alternativa para o controle do vetor dos parasitas da esquistossomose, pois é
um teste rápido, barato e recomendado pela OMS, porém existem muitos pré-requisitos para
uma planta ser utilizada como moluscicida
43,44
. Apenas os extratos brutos de plantas em
concentrações abaixo de 100 ppm são considerados ativos
45
.
Uma das desvantagens quanto aos moluscicidas obtidos na forma de extratos brutos de
plantas é a necessidade de uma padronização dos mesmos, em decorrência da variação do
conteúdo dos princípios ativos nas plantas de acordo com a época do ano. Por outro lado,
passam a ter valor comercial somente as substâncias puras com atividade moluscicida nas
concentrações menores que 10 ppm
46
.
A família Euphorbiaceae é rica em terpenóides, flavonóides e taninos, também são
encontrados alcalóides em alguns gêneros desta família os quais fazem parte das maiores
classes de compostos com reconhecida atividade moluscicida
43
. Devido a isso a avaliação da
atividade moluscicida foi realizada para a espécie em estudo Mabea fistulifera Mart.
(Euphorbiaceae).
1.2.4. Atividade antioxidante
As atividades metabólicas normais do organismo humano produzem constantemente
radicais livres. Estes são intermediários que possuem elétrons livres, ou não emparelhados em
sua órbita externa. Os elétrons livres destes intermediários fazem com que os mesmos se
tornem altamente reativos, atacando componentes celulares como DNA e RNA, membrana
celular e outras substâncias oxidáveis, acelerando o envelhecimento e, podendo assim,
contribuir para a instalação de doenças degenerativas
47
.
A participação de radicais livres de oxigênio (RLO) nos processos patológicos, nas
intoxicações e no envelhecimento tem se tornado uma área de pesquisa de grande interesse.
Esses RLO estão envolvidos com diversas patologias, tais como: câncer, doenças cardíacas,
doenças inflamatórias, doenças degenerativas (Alzheimer, Parkinson, artereosclerose,
demência senil) e em certas doenças sanguíneas
48
.
11
Na formação dos radicais livres, a molécula de oxigênio é a grande vilã, por ser
relativamente lábil e reagir mais facilmente para formar radicais livres. Não está devidamente
esclarecido, mas acredita-se que o oxigênio, na presença de catalisadores como luz visível,
radiação ionizante, temperatura e metais pesados, sejam os iniciadores desta etapa.
Existem no nosso organismo enzimas e moléculas de baixo peso molecular que são
denominadas genericamente de antioxidantes por inibirem a ação destes RLO. Um campo
crescente de investigação tem sido à procura de antioxidantes de origem natural que possam
ser utilizados como adjuvantes em muitas doenças. Esses constituintes são representados por
flavonóides, triterpenóides, derivados fenólicos, peptídeos, etc
48
.
Os antioxidantes podem ser classificados em primários e secundários, de acordo com
seu tipo de ação e sintéticos ou naturais, de acordo com a origem. Agem em pequenas
concentrações, quando comparados com o substrato oxidável, prevenindo significantemente, a
oxidação do mesmo
49
.
Os antioxidantes verdadeiros (primários) agem interrompendo a cadeia da reação
através de doação do elétron ou hidrogênio aos radicais livres, transformando-os em
compostos estáveis. Vários antioxidantes agem desta maneira como: butilhidroxianisol,
butilhidroxitolueno, ésteres do ácido gálico, t-butilhidroquinona, tocoferol e flavonóides. Os
antioxidantes secundários agem retardando a etapa da auto-oxidação por diferentes
mecanismos que incluem: complexação com metais, seqüestro de oxigênio e decomposição
de hidroperóxidos
50
.
O interesse por novos e seguros antioxidantes de fontes naturais tem aumentado,
principalmente para prevenir a deterioração de alimentos e para minimizar o dano oxidativo
às células vivas. O uso de antioxidantes sintético tem diminuído devido a suspeita de
atividade como promotores de carcinogênese, bem como devido à rejeição de aditivos
sintéticos em alimentos. O papel de antioxidantes dietários e seus benefícios para a saúde têm
atraído grande atenção nos últimos anos, especialmente os extraídos de plantas
51
.
Na década de 80 teve início o interesse pelos antioxidantes naturais, mais precisamente
os de origem vegetal, devido aos estudos que comprovaram os efeitos tóxicos de doses
elevadas de antioxidantes sintéticos (butilhidroxitolueno, butilhidroxianisol e t-
butilhidroquinona). Efeitos sobre o peso do fígado e marcada proliferação do retículo
endoplasmático foram observados
47
.
A maioria das substâncias naturais, com exceção do tocoferol, deve sua ação
antioxidante à presença de hidroxilas fenólicas. A maioria dessas substâncias possui grupos
funcionais ativos na posição orto, enquanto nos antioxidantes sintéticos, com exceção dos
12
galatos, esses grupos encontram-se na posição para, mas, não possuindo por este motivo,
mudança na ação dos mesmos.
Várias substâncias de origem vegetal têm sido apontadas como antioxidantes.
Recentemente, o interesse por elas aumentou muito. Assim o uso terapêutico de antioxidantes
requer que sejam determinados seus efeitos sobre diferentes moléculas biológicas, por isso,
muito embora extratos de plantas tenham sido consagrados pelo uso, é necessário que
trabalhos científicos analisem tais propriedades
51
.
As plantas produzem uma grande variedade de substâncias antioxidantes contra os
danos moleculares causados por RLO. As substâncias fenólicas compreendem o principal
grupo de antioxidantes de origem vegetal
51
.
Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais e algumas vezes
como quelantes de metais
52
.
Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os compostos fenólicos
têm sido apontados como responsáveis pela maior capacidade antioxidante, sendo
representados pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas, xantonas entre outros.
Como relatado pela literatura
16
os taninos e flavonóides assim como outras classes de
compostos fenólicos vêm sendo isolados de plantas da família Euphorbiaceae, bem como do
gênero Mabea, sendo um indicativo de atividade antioxidante para a espécie em estudo.
1.2.5. Atividade antiinflamatória
A inflamação constitui um mecanismo de defesa local, exclusivo de tecidos
mesenquimais (tecido conjuntivo, ósseo e cartilaginoso, vasos sanguíneos e linfáticos e
tecidos musculares) lesados. Pode ser definida como sendo uma resposta local do tecido
vascularizado agredido, caracterizada por alterações do tecido vascular, dos componentes
líquidos e celulares, bem como adaptações do tecido conjuntivo vizinho
53
.
Essas alterações dos componentes teciduais são resultantes de modificações que
ocorrem nas células agredidas, estas passando a adquirir comportamentos diferentes:
movimentos novos, alterações de forma e liberação de enzimas e de substâncias
farmacológicas.
Toda essa transformação morfológica e funcional do tecido, característica dos
processos inflamatórios, visa destruir, diluir ou isolar o agente lesivo, sendo, portanto uma
reação de defesa e de reparação do dano tecidual.
13
Para se tornar um agente inflamatório, ou seja, um estímulo que desencadeie esses
fenômenos de transformação nos tecidos, o agente lesivo tem que ser suficientemente intenso
para provocar tais reações e ultrapassar as barreiras de defesas externas (como o derma, por
exemplo), sem, contudo alterar a vitalidade do tecido em que atua. Portanto, qualquer causa
de agressão, é potencialmente, um agente flogístico.
Classicamente, existem alguns fenômenos básicos comuns a qualquer tipo de
inflamação e que independem do agente inflamatório. Esses momentos ou fases caracterizam
a inflamação do tipo aguda, a qual sempre antecede a inflamação do tipo crônica.
Os fenômenos irritativos estão intimamente ligados aos fenômenos vasculares, por
envolverem a mediação química de fármacos que agem diretamente sobre a parede vascular,
ocasionando as alterações vasculares.
A fase vascular envolve todas as transformações ocorridas na microcirculação do local
inflamado. Isso ocorre após alguns minutos do início da ação do agente flogístico, intervalo
em que se processa a liberação dos mediadores químicos, tais como: histaminas, iminas,
prostaglandinas, leucotrienos, fator ativador de plaquetas, etc.
As modificações vasculares incluem alterações no leito vascular e no fluxo sanguíneo,
o que origina diferentes formas por hiperemia (aumento do volume de sangue em uma região
por intensificação do aporto sanguíneo ou diminuição do escoamento venoso), estas
moduladas pela intensidade do agente agressor e pelos graus de resposta do tecido.
Acompanhando a hiperemia vêm à isquemia (diminuição do afluxo de sangue em uma região)
e o edema (acúmulo de líquido no tecido intercelular, nos espaços ou nas cavidades do corpo),
outras duas formas de reações vasculares. Esses três fenômenos juntos formam um conjunto
de respostas vasculares imediatas à presença do estímulo agressor, sendo esse conjunto
denominado de Tríplice resposta de Lewis. Em termos macroscópicos, assim, imediatamente
após a agressão, observa-se inicialmente uma zona esbranquiçada (isquemia), a qual é
substituída por uma zona avermelhada ou eritema (hiperemia) ao redor do local agredido;
mais tardiamente, surge aumento de volume do local (edema)
53
.
Os fenômenos da exsudação referem-se à migração de células e saída de plasma para o
foco migratório, provenham eles de vasos ou dos tecidos vizinhos. Distinguem-se dois tipos
de exsudação nessa fase: a exsudação plasmática (saída de plasma para fora da luz vascular,
com quantidades diversas de água, eletrólitos e proteínas), composta essencialmente por
líquidos, e a exsudação celular (passagem de células pela parede vascular, em direção ao
interstício, ao local atuante do agente inflamatório).
14
Os fenômenos celulares da inflamação envolvem o acionamento das capacidades
celulares de movimentação, de adesão e de englobamento de partículas. O principal fenômeno
é à saída de leucócitos da luz vascular e sua migração para o local agredido.
Os fatores que alteram a inflamação estão relacionados com o agente agressor e com o
hospedeiro. Esses dois elementos (agressor e hospedeiro) estabelecem uma inter-relação que
assume características particulares, ou seja, cada hospedeiro, dependendo de suas
características próprias e da relação com as características do agente agressor, manifestará um
quadro inflamatório peculiar a seu estado pessoal. Assim ao se analisar um processo
inflamatório, deve-se observar principalmente o binômio agressão-reação.
Como citado anteriormente o interesse por substâncias ativas de origem natural é
responsável pelo aumento dos estudos fitoquímicos e aplicações das substâncias isoladas para
diversas atividades, sendo uma delas a atividade antiinflamatória.
Partindo do relato de que os flavonóides são substâncias de reconhecida atividade
antiinflamatória e que estes estão presentes em vários gêneros da família Euphorbiaceae,
principalmente no gênero estudado Mabea esta atividade foi avaliada para a espécie Mabea
fistulifera Mart.
15
2. OBJETIVOS
- Avaliar as atividades de toxicidade com Artemia salina, susceptibilidade
antibacteriana/antifúngica, moluscicida, antioxidante e antiinflamatória dos extratos obtidos
das folhas, cascas das sementes, cascas do caule, sementes, pedúnculos florais e galhos.
- Isolar, purificar, caracterizar e elucidar estruturalmente os metabólitos secundários
dos extratos das folhas e das cascas das sementes de Mabea fistulifera Mart.
16
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Materiais e métodos
Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um equipamento CG/EM
SHIMADZU a 70 eV, modelo QP 2000A, com sonda para sólidos.
Os espectros de transmissão na região de infravermelho (IV) foram registrados em
pastilhas de KBr, na região de 400 a 4000 cm
-1
por um espectrômetro BOMEN, modelo MB-
series. A referência utilizada foi a banda de transmissão em 1601 cm
-1
de um filme de
poliestireno.
Os espectros de RMN
1
H e
13
C foram obtidos em espectrômetro VARIAN, modelo
GEMINI 2000 BB e MERCURY plus BB ambos operando a 300,06 MHz para
1
H e 75,45
MHz para
13
C. Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como referência
interna o tetrametilsilano TMS (δ 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados foram CDCl
3
,
C
2
D
6
CO e C
5
D
5
N ISOTEC ou Aldrich.
A interpretação dos dados foi realizada com o auxílio de dados espectroscópicos de
correlações bidimensionais como COSY 45, HMQC e HMBC e da técnica DEPT, onde CH
3
apresenta sinal positivo no espectro de DEPT 135º, CH sinal positivo tanto no DEPT 135º
quanto no DEPT 90º, CH
2
sinal negativo no DEPT 135º e C não ligado a hidrogênio não
apresenta sinal em nenhum dos dois espectros DEPT.
Para realização dos extratos foram utilizados solventes orgânicos previamente tratados
(evaporação e/ou destilação) tais como: hexano, diclorometano, acetato de etila, etanol e
butanol.
O perfil cromatográfico dos extratos obtidos da maceração e das frações foram
construídos através de cromatografia em camada delgada (CCD).
Foram utilizadas as seguintes técnicas de fracionamento: cromatografia em coluna
(CC) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP).
As cromatografias em coluna foram realizadas em colunas de vidro, utilizando sílica
gel 60 [(0,063 – 0,200 mm), (70 – 230 mesh ASTM)] da Merck e Vetec; sílica para
cromatografia flash [(0,035 – 0,070 mm), (220 – 440 mesh ASTM) da Fluka e Sephadex LH-
20 da Sigma como fases estacionárias. A quantidade de adsorvente, o diâmetro e a altura das
colunas variaram de acordo com a quantidade de material adsorvido. Foram utilizados como
fase móvel, solventes puros e/ou combinados em ordem crescente de polaridade e as frações
17
coletadas foram concentradas sob pressão reduzida em evaporador rotativo. Para
acompanhamento da cromatografia em coluna utilizou-se CCD.
As placas para cromatografia analítica em camada delgada e cromatografia em camada
delgada preparativa foram feitas utilizando-se sílica gel 60 GF
254
e 60 G (Fluka), suspensa em
água destilada numa proporção de 1:2 e distribuída em camada de aproximadamente 0,25 mm
e 1,00 mm de espessura sobre placas de vidro de 5,0 x 20,0 e 20,0 x 20,0 cm,
respectivamente.
Para visualização dos compostos em CCD utilizou-se irradiação com luz ultravioleta a
254 e 366 nm, e pulverização com solução de H
2
SO
4
/MeOH (1:1) ou de ácido
acético/H
2
SO
4
/anisaldeído (revelador específico para terpenos) seguido de aquecimento em
chapa.
Na avaliação da toxicidade com Artemia salina foi utilizada solução de água marinha
(3,8 g de NaCl para cada litro de água), ovos do microcrustáceo (Artemia salina) adquiridos
em uma loja de aquários local e um recipiente plástico, com dois compartimentos onde um
deles se encontrava ao abrigo da luz que foi desenvolvido no próprio laboratório.
Para a avaliação da atividade moluscicida foram utilizados caramujos da espécie
Biomphalaria glabrata, e DMSO utilizado na solubilização das amostras a serem testadas.
Na avaliação da atividade antibacteriana utilizou-se meio Ágar Mueller-Hinton, cepas
das bactérias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC-25923 e Bacillus subtilis ATCC-
6623 e Gram negativas: Escherichia coli ATCC-23110 e Pseudomonas aeruginosa ATCC-
27853; suspensão padrão de sulfato de bário (0,5 mL de uma solução 0,048 M de cloreto de
bário; 99,5 mL de H
2
SO
4
a 1% (v/v); estufa de cultura FANEM, modelo 002CB e autoclave
FABBE, modelo 103. Na avaliação da atividade antifúngica utilizou-se meio Ágar Sabourand,
e fungos Candida albicans ATCC-10231, Candida parapsilosis ATCC-22019 e Candida
tropicalis ATCC-28707.
A avaliação da atividade antioxidante foi realizada pelo método de seqüestro do
radical livre DPPH
•
(2,2-difenil-1-picrilhidrazila). As leituras de absorbância foram realizadas
a 515,5 nm em um espectrofotômetro UV/VIS, marca VARIAN modelo CARY 50 Conc.
Para solubilização das amostras foi utilizado metanol de alta pureza e como padrão o BHT
(butilhidroxitolueno).
Para avaliação da atividade antiinflamatória o modelo utilizado foi o de indução de
pleurisia em rato. Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar pesando de 180 a 220
gramas. Os animais foram mantidos sob temperatura controlada a 22ºC e ciclo claro/escuro de
18
12 horas, com água e ração à vontade. Foi mantido um jejum de 18 horas antecedentes à
pleurisia, utilizando-se como agente irritante a carragenina.
3.2. Preparação dos extratos e avaliação de atividades biológicas da espécie vegetal
Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae)
3.2.1. Coleta e secagem da espécie vegetal
A espécie vegetal Mabea fistulifera Mart. (Euphorbiaceae) foi coletada na cidade de
Quatá-SP.
A identificação da espécie foi realizada pelo professor da UNOESTE Edson Bucchi e
uma exsicata foi depositada no herbário da Universidade Estadual de Maringá - HUM, sob
registro nº 12.112.
As diferentes partes da planta foram secas em estufa de ar circulante a 35 ºC e moídas
em moinho de facas. Após a extração os extratos foram evaporados em evaporador rotativo e
liofilizados. Por meio dos Esquema 1 eEsquema 2 pode-se ter uma visão geral da preparação
dos extratos e das avaliações das atividades realizadas nas diferentes partes da planta.
A relação da coleta das diferentes partes da planta, assim como os extratos obtidos,
seus respectivos códigos e massas estão apresentados na Tabela 1.
19
Esquema 1: Procedimento empregado para obtenção dos extratos das folhas (---) e das cascas
das sementes (---) e atividades realizadas: 1- Toxicidade com Artemia salina; 2- Atividade
moluscicida; 3-Atividade antimicrobiana; 4- Atividade antioxidante e 5- Atividade
antiinflamatória.
20
Esquema 2: Procedimento empregado para obtenção dos extratos da casca do caule (---),
galhos (---), pedúnculos florais (---) e sementes (---) e atividades realizadas: 1- Toxicidade
com Artemia salina; 2- Atividade moluscicida; 3-Atividade antimicrobiana; 4- Atividade
antioxidante e 5- Atividade antiinflamatória.
21
Tabela 1: Relação da coleta das diferentes partes da planta e dos extratos obtidos.
Partes da Planta Data da Coleta Massa da
planta seca e
moída (g)
Extratos
Massa do extrato
(g) (Código)
Folhas 06/2004 750,0 Hexânico 26,1 (MF-HF)
Etanólico
Aquoso (Infusão)
Aquoso (Soxhlet)
142,3 (MF-EF)
3,1 (MF-AFI)
2,7 (MF-AFS)
Cascas do caule 04/2005 944,5 Hexânico 4,2 (MF-HCC)
Etanólico 189,4 (MF-ECC)
Sementes 04/2005 223,5 Hexânico 92,3 (MF-HS)
Etanólico 6,4 (MF-ES)
Pedúnculos
florais
06/2005 405,5 Hexânico 7,4 (MF-HPF)
Diclorometânico 2,7 (MF-CPF)
Acetato de etila 12,1 (MF-APF)
Etanólico 110,9 (MF-EPF)
Cascas da
semente
04/2005 1.162,9 Etanólico 93,6 (MF-ECS)
Galhos 04/2005 149,2 Etanólico 20,29 (MF-EG)
3.2.2. Avaliação das atividades biológicas
O ensaio de avaliação de atividade antimicrobiana foi realizado pelo laboratório de
Microbiologia aplicado a Produtos Naturais e Sintéticos no departamento de Análises Clínicas
– UEM sob orientação do Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura, aplicando-se o teste de
susceptibilidade antibacteriana/antifúngica para determinação da concentração mínima
inibitória e bactericida/fungicida.
A avaliação da atividade moluscicida foi realizada sob coordenação da Professora Dra.
Maria Lucília Motinha Zamuner do departamento de Farmácia e Farmacognosia – UEM.
A avaliação da atividade antiinflamatória foi realizada no Departamento de Farmácia e
Farmacognosia – UEM sob coordenação da Professora Dra. Ciomar A. Bersani Amado.
22
3.2.2.1. Teste de toxicidade com Artemia salina
Os ovos de camarão, Artemia salina foram adquiridos em uma loja de aquários local.
A água marinha utilizada para o cultivo foi feita utilizando-se 3,8 g de sal marinho para cada
litro de água conforme descrito pela literatura
54
.
Os ovos de Artemia foram eclodidos em um aquário oval montado no laboratório
utilizando-se água do mar artificial (3,8 g de NaCl para 1000 mL de água). O aquário foi
construído com uma divisão interna contendo vários orifícios, produzindo dois
compartimentos de mesmo tamanho. Os ovos foram colocados no compartimento
previamente escurecido. O outro compartimento foi extremamente iluminado, de modo a
atrair os camarões para este compartimento após eclosão, através de fototropismo. Os ovos
foram incubados durante 48 horas em temperatura ambiente. O procedimento descrito
anteriormente está ilustrado na Figura 3.
As amostras foram preparadas nas concentrações de 10, 25, 50, 100, 250, 500 e 1000
ppm. O solvente foi evaporado e o volume de cada frasco completado para 5 ml com água
marinha. Quando necessário até 5 µl de DMSO foi adicionado à 5 ml de amostra sem que este
fosse tóxico para os camarões. Todas as amostras inclusive o controle foram realizados em
triplicata. Após 48 horas 10-15 camarões foram transferidos para cada frasco. As amostras,
bem como os controles ficaram por mais 24 horas sob iluminação à temperatura ambiente, e
após este período os sobreviventes foram contados com auxílio de uma lupa.
Figura 3: Materiais utilizados no laboratório de fitoquímica para realização do teste de
toxicidade com Artemia salina.
23
3.2.2.2. Teste de susceptibilidade antibacteriana/antifúngica pelo método da
microdiluição
A CMI (concentração mínima inibitória/concentração bacteriostática ou concentração
fungistática) é a menor concentração de uma droga em µg/mL que inibe o crescimento de
microrganismos. No teste de susceptibilidade, a CMI é determinada pela ausência de
crescimento de microrganismos na menor concentração da droga-teste. A concentração
mínima tanto fungicida (CMF) ou bactericida (CMB) é a menor concentração da droga que
mata 99,9% do fungo ou bactéria teste. A CMF ou CMB é determinada pela subcultura do
poço (well) “sem crescimento” do teste de determinação do CMI em placa de Petri contendo o
meio Agar Sabourand para o teste fungicida e Mueller-Hinton para o bactericida.
O potencial de atividade antibacteriana e antifúngica das amostras e dos antibióticos
de referência foi estabelecido de acordo com a concentração mínima inibitória (CMI): CMI
>500 µg/mL (inativa); CMI 250 à 125 µg/mL (moderadamente ativa); CMI 62,5 à
31,2 µg/mL (ativa); CMI 15,6 µg/mL (mais ativa); CMI 7,8 µg/mL (fortemente ativa).
O teste foi realizado com os extratos MF-HF, MF-EF, MF-EG, MF-HS, MF-ES, MF-
HCC, MF-ECC, MF-ECS, MF-HPF, MF-CPF e MF-APF e com as frações MF-CF, MF-AF e
MF-BF.
3.2.2.2.1. Teste de susceptibilidade antibacteriana
As bactérias utilizadas foram Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis
ATCC 6623, Escherichia coli ATCC 23110 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e os
antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina como padrões de referência para os
extratos e frações citados anteriormente.
Os ensaios para avaliação da atividade antibacteriana foram realizados, aplicando-se o
teste de susceptibilidade pelo método de microdiluição
55
para determinação da concentração
mínima inibitória (CMI) da amostra e dos antibióticos de referência usando meio Mueller-
Hinton segundo normas descritas pelo NCCLS.
A solução estoque da amostra (20 mg) dissolvida em DMSO (1 mL) foi diluída
repetidamente em meio Mueller-Hinton, obtendo-se uma série de concentrações na ordem de
1000 µg para 10 µg/mL. O inóculo bacteriano foi preparado com o mesmo meio e a densidade
ajustada por comparação ao tubo nº 0,5 da escala Mc Farland (1,5 x 10
8
UFC/mL), e em
24
seguida diluída 1:100 no mesmo meio. Alíquotas de 5 µL da suspensão de bactérias foram
adicionadas a cada poço da placa de microdiluição contendo 100 µL das diluições decimais da
amostra ou de antibióticos de referência. Foram utilizados também como controle, meio não
inoculados (controle de esterilidade) e meio sem droga (controle negativo). As placas foram
incubadas a 37 ºC por 24 horas.
3.2.2.2.2. Teste de susceptibilidade antifúngica
O teste foi realizado com os extratos e frações citadas anteriormente utilizando
leveduras Candida albicans ATCC 10231, Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida
tropicalis ATCC 28707 e como antifúngico padrão utilizou-se a nistatina.
Para a padronização do inóculo do fungo leveduriforme foram utilizadas 5 colônias de
uma cultura de levedura Agar Sabourand, em 5 mL de solução salina estéril, e comparadas
com o tubo 0,5 da escala Mc Farland (1-5 x 10
6
UFC/mL). A suspensão do fungo
leveduriforme foi diluída 1:100 em água destilada (4,95 mL de água destilada + 50 µL da
suspensão). Em seguida 2 mL dessa suspensão foram adicionados em 38 mL de meio RPMI-
1640 (diluição 1:20).
Para a determinação da concentração mínima inibitória (método de esterilidade), um
volume de 0,9 mL da suspensão do fungo diluída em RPMI-1640 1:20 foi transferido para
tubos (12 x 75 mm) estéreis numerados de 1 a 13. No tubo 13 (controle de crescimento em
DMSO) foi colocado 100 µL de DMSO 80 a 1%. Nos tubos 1 a 11 foram adicionados 100 µL
do extrato a ser testado diluído seriadamente. Os tubos foram incubados à temperatura de
37 ºC por 24 horas.
3.2.2.3. Atividade moluscicida
O Esquema 3 mostra uma visão geral do procedimento utilizado para a avaliação da
atividade moluscicida, conforme procedimento descrito por HOSTETTMANN
46
. Na
seqüência será feita a descrição da metodologia utilizada.
25
Esquema 3: Procedimento utilizado para avaliação da atividade moluscicida da espécie
Mabea fistulifera Mart.
O teste foi realizado com caramujos da espécie Biomphalaria glabrata, hospedeiro
intermediário do parasita Shistossoma mansoni, causador da esquistossomose.
O bioensaio consiste basicamente na imersão do caramujo da espécie Biomphalaria
glabrata na solução da amostra a ser testada.
O ensaio in vivo para avaliação da atividade moluscicida realizado no presente estudo
testou os extratos: MF-HF, MF-EF, MF-EG, MF-ECS, MF-ECC, MF-HS, MF-ES, MF-HPF,
MF-CPF, MF-APF e MF-EPF e as frações MF-CF, MF-AF e MF-BF.
Os extratos totais e as frações foram testados inicialmente na concentração de
400 ppm. Sendo confirmada a atividade nesta concentração a mesma foi reduzida até a
obtenção da LC
50
.
Para cada caramujo foi utilizada a quantidade de 50 mL de solução. As amostras
(40 mg cada) foram dissolvidas em até 0,2 mL de DMSO, sendo este o volume máximo de
DMSO que pode ser utilizado sem interferir no teste. Após a solubilização da amostra em
DMSO estas foram diluídas para 100 mL de água do aquário, onde estavam mantidos os
26
caramujos. O material foi dividido em dois béqueres (50 mL de solução cada), e em cada um
deles foram colocados dois caramujos viáveis, ou seja, com batimentos cardíacos e tamanhos
apropriados. Após 24 horas de permanência dos caramujos em solução, os batimentos
cardíacos foram observados com auxílio de um estereomicroscópio, e foram transferidos para
um béquer contendo a mesma quantidade de água (50 mL) onde permaneceram por mais 24
horas. Após as 48 horas (tempo total do teste) novamente foram avaliados os batimentos
cardíacos. O teste foi considerado positivo quando os caramujos morreram. O branco
(controle) foi realizado nas mesmas condições sem adição da amostra, porém foram utilizados
quatro caramujos.
3.2.2.4. Atividade antioxidante
A atividade antioxidante dos extratos brutos, MF-EF, MF-EG, MF-ECS, MF-ECC,
MF-ES, MF-APF e MF-EPF e das frações MF-AF e MF-BF foi efetuada através do método
de seqüestro do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH
•
)
56
.
Inicialmente foi feita uma solução dos extratos totais e frações na concentração de
2 mg/mL em metanol de alta pureza. Em seguida diferentes volumes em µL da solução inicial
foram adicionados em 2 mL da solução de DPPH
•
preparada a partir de 0,0047 g de DPPH
•
em 75 mL de MeOH.
A triagem foi então realizada em diferentes concentrações dos extratos totais e frações
até a obtenção da IC
50
. As concentrações foram corrigidas para o volume final, após adição
dos diferentes volumes da amostra aos 2 mL de solução de DPPH
•
. Cada concentração foi
realizada em triplicata. A mistura foi mantida em temperatura ambiente durante 30 min. Em
seguida procedeu-se a leitura em espectrofotômetro UV/VIS a 515,5 nm.
A medida do branco foi realizada utilizando-se apenas a solução de DPPH
•
preparada
anteriormente sem adição de extrato.
O padrão utilizado foi o butilhidroxitolueno (BHT) preparado nas mesmas
concentrações feitas para as amostras testadas.
A atividade anti-radicalar (RSA – radical scavenging activity) foi calculada como uma
porcentagem de descoloração do radical DPPH
•
, através da equação:
27
% I = [(A
0
- A
am
)/A
0
] x 100
Onde:
A
0
= Absorbância da solução de DPPH
•
.
A
am
= Absorbância da solução quando um extrato ou fração foi adicionado em
determinada concentração.
Os resultados foram expressos em IC
50
, que representa a quantidade de antioxidante
necessária para reduzir em 50% a concentração inicial de DPPH
•
. Esses cálculos foram
realizados através da regressão linear utilizando-se o programa computacional ORIGIN 7.0
.
3.2.2.5. Teste de atividade antiinflamatória por indução de pleurisia em rato
O protocolo para o experimento realizado foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação animal da Universidade Estadual de Maringá - UEM.
Os experimentos foram realizados utilizando ratos machos da linhagem Wistar
pesando de 180 a 220 g. Os animais foram mantidos sob temperatura controlada a 22 ºC e
ciclo claro/escuro de 12 horas, com água e ração à vontade.
Os ratos foram mantidos sem alimentação por um período de 18 horas antecedentes à
pleurisia.
A pleurisia foi induzida pela injeção de 0,25 mL de uma suspensão de carragenina
(200 µg) na cavidade intrapleural, na região do mediastino direito, entre a 3
a
e 4
a
costelas, 30
minutos após a administração por via oral (gavagem) da droga (extrato) de acordo com a
técnica descrita por Vinegar et al
57
.
A carragenina foi diluída em salina tamponada com fosfato (PBS – pH 7,4). Na 4
a
hora após a indução da pleurisia, os animais foram anestesiados utilizando-se éter etílico P. A.
e sacrificados para a coleta do exsudato inflamatório intrapleural.
O material coletado por aspiração foi transferido para tubos cônicos de centrífuga. O
volume total do exsudato foi medido e uma alíquota de 50 µL usada para determinar o
número de leucócitos em câmara de Neubauer. O procedimento empregado no teste de
pleurisia em rato se encontra ilustrado na Figura 4.
Grupos de animais controles receberam o veículo (água ou DMSO 16%) por via oral
(gavagem), trinta minutos antes da indução da pleurisia.
28
Figura 4: Método de pleurisia em rato na determinação de atividade antiinflamatória.
3.3. Estudo químico
3.3.1. Estudo das folhas
O estudo fitoquímico da espécie Mabea fistulifera Mart. foi realizado inicialmente
com as folhas, pois este material foi o primeiro a ser coletado.
O Esquema 4 mostra uma visão geral do procedimento empregado no isolamento das
substâncias das folhas de Mabea fistulifera Mart.
29
Esquema 4: Procedimento empregado para o isolamento dos constituintes das folhas de
Mabea fistulifera Mart.
3.3.1.1. Fracionamento do extrato hexânico bruto das folhas/Isolamento das substâncias
MF-1 e MF-2
Parte do extrato hexânico total MF-HF (8,0 g) foi adsorvido em 16,0 g de sílica gel e
submetido ao fracionamento em coluna cromatográfica (φ = 5,5 cm; 150,0 g sílica gel). Foram
utilizados como eluentes: hexano como eluente de empacotamento, misturas de
hexano/acetato de etila e acetato de etila/metanol em ordem crescente de polaridade. Após
obtenção das frações, estas foram reunidas baseando-se na análise em CCD (
Tabela 2).
A fração MF-HF 3 foi recromatografada em coluna de sílica gel e algumas de suas
frações submetidas à CCDP, porém devido à complexidade das frações e a baixa quantidade
de massa obtida não foi possível o isolamento de nenhuma substância pura.
30
Tabela 2: Dados do fracionamento do extrato hexânico total da folhas (MF-HF) por coluna
cromatográfica.
Eluente utilizado Código das frações Massa das frações (g)
Hexano MF-HF 1 0,2390
Hexano/AcOEt 1% MF-HF 2 -------
Hexano/AcOEt 5% MF-HF 3 3,6080
Hexano/AcOEt 10% MF-HF 4 1,1400
Hexano/AcOEt 25% (I) MF-HF 5 0,1630
Hexano/AcOEt 25% (II) MF-HF 6 1,8000
Hexano/AcOEt 50% MF-HF 7 0,5150
Hexano/AcOEt 80% MF-HF 8 0,4400
AcOEt MF-HF 9 0,0570
ACOEt/MeOH 2% MF-HF 10 0,0240
ACOEt/MeOH 10% MF-HF 11 0,0240
ACOEt/MeOH 50% MF-HF 12 0,2750
MeOH MF-HF 13 0,0050
* Recuperou-se 97 % do material inicial.
Após análise em CCD pode-se verificar que a fração MF-HF 1 estava pura como
cristais brancos em formato de agulhas sendo esta denominada por MF-1 (239 mg).
Após a evaporação do solvente da fração MF-HF 4 houve a formação de um pó
branco, este foi então denominada por MF-2 (1,14 g).
A fração MF-HF 5 apresentou fortes manchas rosa e marrom quando cromatografada
em CCD e revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguida de aquecimento, sendo assim esta fração foi
selecionada para estudo.
3.3.1.1.1. Estudo da fração MF-HF 5/Isolamento da substância MF-3
A fração MF-HF 5 foi submetida a uma CCDP em sílica gel (hexano/acetato de etila
30%), fornecendo a mistura MF-3 (12,4 mg) na forma de cristais do tipo agulha após
dessorção da faixa com fluorescência sob irradiação com luz UV a 365 nm. Esta substância
quando revelada com revelador de terpenos ácido acético/H
2
SO
4
/anisaldeído apresentou uma
forte mancha cor rosa escura característica de terpenos.
31
3.3.1.2. Partição do extrato etanólico total das folhas
Parte do extrato etanólico (10,0 g) foi solubilizado em água e submetido à partição
com diferentes solventes. A partir deste procedimento foram obtidas as seguintes frações:
diclorometânica (MF-CF-1,0 g), acetato de etila (MF-AF-2,3 g) e butanólica (MF-BF-2,5 g).
O Esquema 1 mostra uma visão geral do procedimento empregado na partição por
solvente do extrato etanólico.
Durante a partição do extrato etanólico com diclorometano houve o aparecimento de
um precipitado pardo na forma de um pó, porém este não foi identificado.
Os extratos MF-EF e a fração MF-CF foram submetidos à coluna (ver procedimento
Esquema 1) em sílica gel e algumas de suas frações foram submetidas à CCDP, porém devido
a grande quantidade de clorofila e complexidade das frações, assim como a baixa quantidade
de massa não foi possível o isolamento de nenhuma substância pura.
As frações MF-AF e MF-BF não foram estudadas quimicamente. A fração aquosa foi
descartada.
3.3.2. Estudo das cascas das sementes
Por meio do perfil cromatográfico obtido para os diferentes extratos da planta, pode-se
selecionar o extrato das cascas das sementes para estudo fitoquímico devido a menor
complexidade quando comparado aos demais e à presença de flavonóides, substâncias com
reconhecida atividade antioxidante.
Através do
Esquema 5 têm-se uma visão geral dos procedimentos empregados para o isolamento das
substâncias do extrato etanólico das cascas das sementes.
32
Esquema 5: Procedimento empregado para o isolamento dos constituintes das cascas das
sementes de Mabea fistulifera Mart.
3.3.2.1. Fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes I
A amostra do extrato etanólico total das cascas das sementes (2,5 g) foi adsorvida em
3,0 g de sílica gel e em seguida submetida ao fracionamento por cromatografia “flash” (φ =
2,5 cm; 30,0 g, sílica para cromatografia “flash” - 0,035 à 0,070 mm). Foram utilizados como
eluentes: diclorometano como eluente de empacotamento e misturas de
diclorometano/metanol em ordem crescente de polaridade como pode ser observado na Tabela
3. Foram coletadas 204 frações de aproximadamente 20 mL cada.
33
Tabela 3: Dados do fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes (MF-
ECS) por coluna cromatográfica.
Eluente utilizado Frações coletadas
CH
2
Cl
2
1-45
CH
2
Cl
2
/MeOH 3% 46-84
CH
2
Cl
2
/MeOH 5% 85-109
CH
2
Cl
2
/MeOH 8% 110-128
CH
2
Cl
2
/MeOH 15% 129-143
CH
2
Cl
2
/MeOH 20% 144-148
CH
2
Cl
2
/MeOH 30% 149-158
CH
2
Cl
2
/MeOH 40% 159-165
CH
2
Cl
2
/MeOH 50% 166-179
CH
2
Cl
2
/MeOH 80% 180-193
MeOH 194-204
Todas as frações foram submetidas à CCD e reunidas conforme apresentado na Tabela
4, porém a fração denominada por MF-ECS 10 (122,9 mg) eluida em CH
2
Cl
2
/MeOH 5 %
chamou a atenção pelo fato de apresentar um precipitado branco na forma de cristal solúvel
em acetona, com uma massa considerável (50,0 mg), este precipitado foi lavado com
diclorometano e quando submetido a CCD apresentou duas fluorescências amarelas sob
irradiação na luz UV a 365 nm. Esta fração quando revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguido por
aquecimento apresentou duas manchas fortes de cor amarela característica de flavonóides.
A fração MF-ECS 12 eluída em CH
2
Cl
2
/MeOH 15 % (123,7 mg) quando submetida a
CCD apresentou várias manchas de coloração amarela intensa sob luz UV a 365 nm e quando
revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento surgiu uma coloração amarela. Devido
a estas características estas frações foram selecionadas para estudo.
34
Tabela 4: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS.
Frações reunidas Código das frações Massa das frações (mg)
1-4 MF-ECS 1 0,0122
5-6 MF-ECS 2 0,0032
7-10 MF-ECS 3 0,0060
13-16 MF-ECS 4 0,0112
17-26 MF-ECS 5 0,0323
27-34 MF-ECS 6 0,0078
35-52 MF-ECS 7 0,0044
53-59 MF-ECS 8 0,0702
60-90 MF-ECS 9 0,1030
91-102 MF-ECS 10 0,1229
103-134 MF-ECS 11 0,7562
135-137 MF-ECS 12 0,1237
138-142 MF-ECS 13 0,0958
143-151 MF-ECS 14 0,2835
152-161 MF-ECS 15 0,3130
162-180 MF-ECS 16 0,0741
181-190 MF-ECS 17 0,1305
191-201 MF-ECS 18 0,0986
* Recuperou-se 89,9 % do material inicial.
3.3.2.1.1. Estudo da fração MF-ECS 10/Isolamento das substâncias MF-4 e MF-5
O precipitado da fração MF-ECS 10 foi submetido a uma CCDP (CH
2
Cl
2
/MeOH
10%), onde pode-se visualizar duas faixas com fluorescência amarela sob irradiação na luz
UV a 365 nm. A dessorção dessas faixas forneceu as substâncias denominadas por MF-4
(14,7 mg) e MF-5 (7,6 mg). Estas substâncias quando reveladas com H
2
SO
4
/MeOH seguido
por aquecimento apresentaram uma mancha forte de cor amarela característica de flavonóides.
35
3.3.2.1.2. Estudo da fração MF-ECS 12/Isolamento das substâncias MF-6, MF-7 e MF-4
A fração MF-ECS 12 foi submetida a uma CCDP (CH
2
Cl
2
/MeOH 20%), na qual pode-
se visualizar quatro fluorescências sob luz UV a 365 nm. Uma das faixas com fluorescência
azul e as demais com fluorescência amarela. A faixa de fluorescência azul não estava pura,
portanto não pode ser identificada. As demais faixas após a dessorção e análise em CCD
apresentaram após revelação com H
2
SO
4
/MeOH seguido por aquecimento manchas amarelas.
Este procedimento levou ao isolamento de duas substâncias que ainda não haviam sido
isoladas no presente estudo e que foram denominadas por MF-6 (2,6 mg) e MF-7 (37,9 mg) e
de uma terceira substância que por comparação com os Rfs das substâncias anteriormente
isoladas foi novamente denominada por MF-4 (8,7 mg).
3.3.2.2. Fracionamento do extrato etanólico total das cascas das sementes II/Isolamento
da substância MF-8
Uma nova coluna cromatográfica do extrato etanólico total foi realizada com maior
quantidade de massa no intuito de isolar novas substâncias das frações que não puderam ser
anteriormente estudadas por falta de massa.
Parte do extrato total das cascas das sementes (10 g) foi adsorvido em 16 g de sílica
gel e em seguida submetido ao fracionamento em coluna cromatográfica (φ = 4,50 cm; 91 g
sílica gel). Foram utilizados como eluentes: diclorometano como eluente de empacotamento e
misturas de diclorometano/metanol em ordem crescente de polaridade como mostra a
Tabela 5.
Após obtenção das frações, estas foram reunidas baseando-se na análise em CCD
como demonstrado na Tabela 6.
Algumas das frações chamaram a atenção pelo seu perfil cromatográfico e por não se
mostrarem tão complexas. Algumas frações pela análise em CCD apresentaram apenas uma
mancha, por esta razão estas frações foram submetidas a análises espectroscópicas.
36
Tabela 5: Dados do fracionamento do extrato etanólico total da cascas das sementes II (MF-
ECS II) por coluna cromatográfica.
Eluente utilizado Frações coletadas
CH
2
Cl
2
1-76
CH
2
Cl
2
/MeOH 3% 77-116
CH
2
Cl
2
/MeOH 5% 117-125
CH
2
Cl
2
/MeOH 8% 126-149
CH
2
Cl
2
/MeOH 10% 150-158
CH
2
Cl
2
/MeOH 15% 159-187
CH
2
Cl
2
/MeOH 25% 188-196
CH
2
Cl
2
/MeOH 50% 197-219
MeOH 220-242
A fração denominada por MF-ECS II.1 eluída em CH
2
Cl
2
apresentou mancha de
coloração rosa escuro característica de terpenos quando submetida à análise em CCD e
revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento. Após análises espectroscópicas
verificou-se que se tratava de uma mistura de terpenos a qual não foi posteriormente
purificada devido à baixa quantidade de massa.
A fração denominada por MF-ECS II.5 eluída em CH
2
Cl
2
assim como a fração MF-
ECS II.1 apresentou uma mancha de forte coloração rosa característica de terpenos quando
revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento. Esta substância foi denominada por
MF-8 (32,2 mg) e submetida a análises espectroscópicas.
A fração que apresentou manchas de coloração amarela característica de flavonóides
chamou a atenção por seu perfil cromatográfico e pela quantidade de massa (1,460 g) sendo
esta a fração denominada por MF-ECS II.13, sendo assim esta foi recromatografada.
37
Tabela 6: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.
Frações reunidas Código das frações Massa das frações (g)
1-9 MF-ECS II.1 0,0207
10-16 MF-ECS II.2 0,0695
17-27 MF-ECS II.3 0,0215
28-29; 34-36 MF-ECS II.4 0,0326
30-33 MF-ECS II.5 0,0322
37-46 MF-ECS II.6 0,1823
47-59 MF-ECS II.7 0,1575
60-77 MF-ECS II.8 0,1148
78-116 MF-ECS II.9 0,0129
117-122 MF-ECS II.10 0,0147
123-132 MF-ECS II.11 0,9000
133-138 MF-ECS II.12 0,070
139-143 MF-ECS II.13 1,4600
144-149 MF-ECS II.14 0,1823
150-158 MF-ECS II.15 0,7263
159-187 MF-ECS II.16 0,0492
188-196 MF-ECS II.17 1,3400
197-219 MF-ECS II.18 3,8970
220-242 MF-ECS II.19 0,5802
243-251 MF-ECS II.20 0,0323
* Recuperou-se 98,33 % do material inicial.
3.3.2.2.1. Estudo da fração MF-ECS II.13/Isolamento da substância MF-4
A fração MF-ECS II.13 (1,3 g) foi submetida à cromatografia “flash” (φ = 2,50 cm;
36,5 g sílica para cromatografia “flash” - 0,035 à 0,070 mm). Foram utilizados como eluentes:
diclorometano como eluente de empacotamento e misturas de diclorometano/metanol em
ordem crescente de polaridade. Estes dados estão dispostos na Tabela 7.
38
Tabela 7: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13 por coluna cromatográfica.
Eluente utilizado Frações coletadas
CH
2
Cl
2
1-69
CH
2
Cl
2
/MeOH 2% 70-77
CH
2
Cl
2
/MeOH 4% 78-109
CH
2
Cl
2
/MeOH 5% 110-124
CH
2
Cl
2
/MeOH 8% 125-149
CH
2
Cl
2
/MeOH 10% 150-157
CH
2
Cl
2
/MeOH 15% 158-170
CH
2
Cl
2
/MeOH 20% 171-178
CH
2
Cl
2
/MeOH 30% 179-185
CH
2
Cl
2
/MeOH 50% 186-193
CH
2
Cl
2
/MeOH 80% 194-201
MeOH 202-209
MeOH/H
2
O 50% 210-222
H
2
O 223-242
As frações coletadas foram submetidas à análise em CCD e reunidas de acordo com
seus perfis cromatográficos como demonstrado na Tabela 8.
Tabela 8: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13.
Frações reunidas Código das frações Massa das frações (g)
1-97 MF-ECS II.13.1 0,0079
98-119 MF-ECS II.13.2 0,0092
120-135 MF-ECS II.13.3 0,0104
137-175 MF-ECS II.13.4 1,0980
145-175 MF-ECS II.13.5 0,0320
176-181 MF-ECS II.13.6 0,0285
182-204 MF-ECS II.13.7 0,0115
205-219 MF-ECS II.13.8 0,0162
220-226 MF-ECS II.13.9 0,0221
227-230 MF-ECS II.13.10 ------
* Recuperou-se 95,06 % do material inicial.
39
A fração MF-ECS II.13.4 eluída em CH
2
Cl
2
/MeOH 8% foi selecionada para estudo
por apresentar fluorescências amarelas sob luz UV a 365 nm e manchas amarelas quando
submetida a CCD e revelada com H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento e também por
possuir uma considerável quantidade de massa. Esta fração foi recromatografada em
Sephadex LH-20.
Houve a formação de um precipitado branco nos tubos 164 e 165 que foram eluídos
em CH
2
Cl
2
/MeOH 15% sendo este solúvel em acetona e seu Rf comparado ao das demais
substâncias isoladas, sendo assim a substância foi novamente denominada por MF-4 (6,2 mg).
O precipitado quando submetido à CCD e revelado com H
2
SO
4
/MeOH seguido por
aquecimento evidenciou mancha característica de flavonóide.
As demais frações não foram estudadas, pois seus perfis cromatográficos se mostraram
complexos, além da baixa quantidade de massa.
3.3.2.2.1.1. Estudo da fração MF-ECS II.13.4
A fração MF-ECS II.13.4 (1,1 g) foi cromatografada em coluna de Sephadex LH-20
(φ = 2,5 cm; 13,0 g). Foram utilizados como eluentes: metanol/acetona em ordem decrescente
de polaridade como exposto na Tabela 9.
Tabela 9: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13.4 por coluna cromatográfica em
Sephadex LH-20.
Eluente utilizado Frações coletadas
MeOH 1-53
MeOH/Acetona 10% 54-56
MeOH/Acetona 20% 57-60
MeOH/Acetona 50% 61-92
Acetona 93-102
As frações foram reunidas com base em seus perfis cromatográficos como
demonstrado na Tabela 10.
40
Tabela 10: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13.4.
Frações reunidas Código das frações Massa das frações (mg)
1-10 MF-ECS II.13.4.S.1 0,0270
11-32 MF-ECS II.13.4.S.2 0,7000
33-41 MF-ECS II.13.4.S.3 0,035
42-102 MF-ECS II.13.4.S.4 0,040
* Recuperou-se 72,91 % do material inicial.
A fração MF-ECS II.13.4.S.2 eluída em metanol evidenciou através de análise em
CCD compostos com características de flavonóides, sendo assim esta fração foi submetida a
análise tanto em CCDP como por cromatografia “flash”.
A fração MF-ECS II.13.4.S.3 eluída em metanol também evidenciou através da
análise em CCD, perfil cromatográfico característico de flavonóides, porém devido a baixa
quantidade de massa esta foi submetida apenas à análise em CCDP.
3.3.2.2.1.1.1. Estudo da fração MF-ECS II.13.4.S.2/Isolamento das substâncias MF-4 e
MF-5
A fração MF-ECS II.13.4.S.2 (500,0 mg) foi submetida à cromatografia “flash”
(φ = 2,5 cm; 36,5 g sílica para cromatografia “flash” - 0,035 à 0,070 mm). Foram utilizados
como eluentes: diclorometano/acetona 40% como eluente de empacotamento e misturas
destes solventes em ordem crescente de polaridade, sendo utilizados posteriormente misturas
de acetona/metanol também em ordem crescente de polaridade. Estes dados estão dispostos na
Tabela 11.
Após análise em CCD as frações foram reunidas de acordo com seus perfis
cromatográficos (Tabela 12).
Após análise em CCD da fração denominada por MF-ECS CS.2.1 eluída em
diclorometano/acetona 40% pode-se observar que a mesma não estava pura e devido à baixa
quantidade de massa esta não foi submetida a uma nova purificação.
A fração MF-ECS CS.2.3 eluída em diclorometano/acetona 40% evidenciou uma
fluorescência amarela sob radiação UV a 365 nm. Quando submetida à CCD e revelada com
H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento houve o aparecimento de uma mancha amarela. Por
41
meio do procedimento realizado e comparação com os perfis cromatográficos das substâncias
anteriormente isoladas, a substância foi caracterizada por MF-4 (10,8 mg).
Tabela 11: Dados do fracionamento da fração MF-ECS II.13.4.S.2 por coluna
cromatográfica.
Eluente utilizado Frações reunidas
CH
2
Cl
2
/Acetona 40% 1-75
CH
2
Cl
2
/Acetona 50% 76-93
CH
2
Cl
2
/Acetona 60% 94-101
CH
2
Cl
2
/Acetona 70% 102-109
CH
2
Cl
2
/Acetona 80% 110-118
Acetona 119-127
Acetona/MeOH 2% 128-135
Acetona/MeOH 5% 136-143
Acetona/MeOH 10% 144-162
Acetona/MeOH 30% 163-180
Acetona/MeOH 50% 181-198
MeOH 199-216
Tabela 12: Códigos e massas das frações reunidas da CC de MF-ECS II.13.4.S.2.
Frações reunidas Código das frações Massa das frações (mg)
1-3 MF-ECS CS.2.1 1,5
4 MF-ECS CS.2.2 24,4
5 MF-ECS CS.2.3 12,9
6-16 MF-ECS CS.2.4 159,3
17 MF-ECS CS.2.5 10,8
18-40 MF-ECS CS.2.6 102,2
41-81 MF-ECS CS.2.7 38,7
81-150 MF-ECS CS.2.8 20,1
* Recuperou-se 73,98 % do material inicial.
42
A fração MF-ECS CS.2.5 eluída em diclorometano/acetona 40% quando exposta à luz
UV a 365 nm apresentou fluorescência amarela. Quando submetida à CCD e revelada com
H
2
SO
4
/MeOH seguida por aquecimento houve o aparecimento de uma mancha amarela porém
quando comparada com a fração MF-ECS CS.2.3 pode-se observar diferença de Rf. Através
da comparação do Rf da substância isolada de MF-ECS CS.2.5 com as demais substâncias
isoladas esta foi caracterizada como sendo novamente a substância MF-5 (12,9 mg).
As demais frações obtidas pelo fracionamento de MF-ECS II.13.4.S.2 devido a baixa
quantidade de massa e a presença de várias substâncias não foram submetidas a purificação.
43
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Avaliação das atividades biológicas
4.1.1. Avaliação da toxicidade com Artemia salina
O teste de toxicidade com Artemia salina foi realizado conforme procedimento
descrito na literatura
54
. Através das porcentagens de mortalidade foi possível determinar a
LC
50
para os extratos.
O teste de toxicidade com Artemia salina foi realizado para os extratos: MF-HF, MF-
EF, MF-EG, MF-ECS, MF-HCC, MF-ECC, MF-HS, MF-ES, MF-HPF, MF-CPF, MF-APF e
MF-EPF e para as frações MF-CF, MF-AF e MF-BF.
Os extratos que apresentaram LC
50
>1000 ppm foram considerados inativos sendo que
os extratos testados que mostraram toxicidade para Artemia salina estão dispostos na Tabela
13 assim como suas respectivas LC
50
e LC
90.
Tabela 13: Dados de letalidade de Artemia salina dos extratos obtidos da espécie Mabea
fistulifera Mart. (Euphorbiaceae) (LC
50
e LC
90
em µg/mL).
Extrato LC
50
LC
90
MF-EF 554 892
MF-CF 156 >1000
MF-BF 386 >1000
MF-EG 215 417
MF-ECS 150 239
MF-ECC 48 348
MF-ES 78 187
MF-EPF 114 230
Das quinze amostras testadas entre elas extratos hexânicos, etanólicos,
diclorometânico e acetato de etila e as frações diclorometânica, acetato de etila e butanólica
44
das folhas apenas os extratos etanólicos das diferentes partes da planta e as frações
diclorometânica e butanólica das folhas demonstraram atividade.
Essa atividade pode ser atribuída a compostos fenólicos presentes nas diferentes partes
da planta sendo que o extrato mais ativo foi o extrato etanólico das cascas do caule (MF-ECC)
com LC
50
de 48 µg/mL. O teste de atividade antioxidante realizado para o extrato MF-ECC
foi um dos que deram resultado mais positivo indicando a presença de alta concentração dessa
classe de compostos.
4.1.2. Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica
Os microorganismos testados foram bactérias do tipo Gram positivas, tais como:
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Bacillus subtilis ATCC 6623 e Gram negativas:
Escherichia coli ATCC 23110 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Os extratos foram
também testados frente às leveduras Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida
tropicalis.
Através da Tabela 14 pode-se observar quais os extratos e frações que demonstraram
atividade nas bactérias e leveduras testadas, sendo esta atividade considerada moderada (entre
125 e 500 µg/mL).
Tabela 14: Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica com as respectivas CMI e
CMB para os extratos e frações que demonstraram atividade.
Bactérias/fungos Extrato/fração CMI (µg/mL) CMB/CMF (µg/mL)
S. aureus
B. subtilis
C.parapsilosis
C. tropicalis
MF-ECC
MF-AF
MF-BF
MF-CPF
MF-CF
MF-CF
MF-AF
MF-EF
250
250
250
250
250
125
125
250
>1000
500
>1000
500
>1000
>1000
500
>1000
45
Nenhum dos extratos testados mostrou atividade frente às bactérias Gram negativas e
também frente à levedura Candida albicans.
4.1.3. Avaliação da atividade moluscicida
O ensaio in vivo para a avaliação da atividade moluscicida realizado no presente
estudo testou os extratos: MF-HF; MF-EF; MF-EG; MF-ECS; MF-ECC; MF-HS; MF-ES;
MF-HPF; MF-CPF; MF-APF e MF-EPF e as frações; MF-CF; MF-AF e MF-BF. Estes foram
testados inicialmente na concentração de 400 ppm, sendo esta concentração reduzida até a
obtenção da LC
50
. Foram realizadas duplicatas para cada extrato contendo dois caramujos por
amostra.
Dos extratos testados apenas os extratos MF-EPF, MF-ECC e as frações MF-BF e
MF-AF demonstraram mortalidade dos caramujos com LC
50
= 300, 300-400, 400 e >400 ppm
respectivamente após 48 h como evidenciado na Tabela 15.
Tabela 15: Avaliação da atividade moluscicida da espécie Mabea fistulifera Mart.
Concentração
(ppm)
MF-AF
% mortalidade
24h 48h
MF-BF
% mortalidade
24h 48h
MF-ECC
% mortalidade
24h 48h
MF-EPF
% mortalidade
24h 48h
400 0 25 0 50 75 100 75 100
300 --- --- --- --- --- --- --- ---
Apesar da mortalidade provocada pelos extratos citados anteriormente, são
considerados ativos apenas extratos totais de plantas com concentração abaixo de 100 ppm
58
.
4.1.4. Avaliação da atividade antioxidante
Existem várias metodologias para determinação da atividade antioxidante. O método
do seqüestro do radical livre DPPH
•
(2,2-difenil-1-picrilhidrazila) tem sido muito utilizado
para avaliar a atividade de seqüestro de radicais livres de antioxidantes naturais.
A atividade antioxidante foi realizada utilizando o método citado anteriormente
(DPPH
•
), o qual é um radical livre estável, que na presença de um antioxidante doador de
hidrogênio, pode ser reduzido em meio alcoólico, formando difenil picrilhidrazina
59
. Esta
46
redução pode ser acompanhada espectrofotometricamente a 515,5 nm, pela diminuição da
absorbância, com simultânea mudança de coloração violeta escura original do radical livre
para uma coloração amarela do produto reduzido, descorando à medida que a reação se
processa (Figura 5). Quanto maior a atividade antioxidante, menor será a coloração violeta da
solução, ou seja, o DPPH
•
residual, mensurado após um período de tempo, corresponde
inversamente à atividade antioxidante da substância analisada. A intensidade dessa mudança
de coloração é proporcional à concentração da(s) substância(s) com potencial antioxidante
presente(s), em conformidade com as leis de Lambert e Beer. Essa descoloração gradativa
deve-se ao pareamento, também gradativo, dos elétrons de DPPH
•
disponíveis
60
.
Figura 5: Descoramento da solução de DPPH
•
à medida que a reação se processa.
A avaliação da capacidade antioxidante dos extratos totais (MF-EF, MF-EG, MF-EPF,
MF-APF MF-ES, MF-ECC e MF-ECS) e das frações (MF-AF e MF-BF) foi realizada pelo
método do seqüestro do radical livre DPPH
•
, empregando-se o BHT como padrão de
referência.
Na Figura 6 pode-se observar os valores de IC
50
dos extratos totais, frações e do
padrão BHT.
Pode-se avaliar que os extratos etanólicos totais e as frações das folhas testadas da
espécie Mabea fistulifera Mart. possuem atividade antioxidante consideráveis quando
comparadas com BHT substância esta de reconhecida ação antioxidante, utilizada como
conservante em diferentes produtos (alimentos, cosméticos, etc.). A amostra testada que
apresentou melhor potencial antioxidante foi a fração acetato de etila das folhas (MF-AF).
47
0
10
20
30
40
50
60
70
EF
ES
ECC
BF
ECS BHTEG
AF
APF
IC
50
µg/mL
EPF
Figura 6: Comparação entre valores de IC
50
(µg/mL) realizados pelo método do DPPH
•
(P<0,05).
A ação antioxidante dos extratos testados pode ser atribuída à presença de substâncias
fenólicas. A presença destas substâncias foi confirmada com o isolamento de quatro
flavonóides do extrato etanólico das cascas das sementes. Para os demais extratos e frações a
presença de flavonóides foi confirmada pela análise dos perfis cromatográficos, os quais
demonstraram ao serem analisados por CCD e revelados com H
2
SO
4
/MeOH seguido por
aquecimento manchas amarelas que antes da revelação apresentavam fluorescência amarela
sob luz UV a 365 nm características para estas substâncias.
4.1.5. Avaliação da atividade antiinflamatória
O teste de atividade antiinflamatória, utilizando os extratos MF-EF, MF-EPF, MF-ES,
MF-EG, MF-ECC, MF-ECS, MF-AFS e MF-AFI, foi realizado frente ao agente irritante
carragenina, pelo modelo de pleurisia induzida no rato.
O extrato foi utilizado na concentração de 500 mg/Kg de massa corporal. A injeção
intrapleural de carragenina em grupos de animais pré-tratados, via oral, com água ou DMSO
induziu uma resposta inflamatória aguda, caracterizada pelo aumento do volume do exsudato
pleural e no número de leucócitos migrados para a cavidade (Vol. Exsudato: Cg + salina = 1,1
± 0,08 mL; Cg + DMSO = 1,0 ± 0,07 mL; número de leucócitos / mm
3
: Cg + salina = 78080 ±
4841; Cg + DMSO = 77130 ± 1625). Como apresentado nas Figura 7Figura 8Figura 11Figura
12. O tratamento dos animais com o extrato total dos pedúnculos florais (MF-EPF) dissolvido
48
em água ou DMSO 16% reduziu o volume do exsudato inflamatório pleural (MF-EPF
500 mg/kg
= 24% e 37% (P<0,05), respectivamente (Figura 9). Também ocorreu uma redução no número
de células migradas. Os resultados estão apresentados na Figura 10.
Controle
M
F
-E
P
F
M
F
-
EG
MF
-
ECC
MF-EF
M
F
-E
S
M
F-
E
C
S
0.0
0.5
1.0
1.5
Volume Exsudato (ml)
Figura 7: Efeito dos extratos etanólicos da espécie Mabea fistulifera Mart. sobre o volume do
exsudato pleural induzido pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle
(Anova, teste de Tukey).
C
ontrole
MF-E
PF
MF-EF
MF-EG
M
F-E
CC
MF
-
ES
MF
-EC
S
0
25000
50000
75000
100000
Contagem de Células
Figura 8: Efeito dos extratos etanólicos da espécie Mabea fistulifera Mart. sobre a migração
de leucócitos induzida pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova,
teste de Tukey).
*
49
C
o
ntr
o
le
-
Á
g
u
a
MF-E
P
F -
Águ
a
Controle - DMSO
MF-E
P
F
-
D
MS
O
0.0
0.5
1.0
1.5
Volume Exsudato (ml)
Figura 9: Efeito do extrato etanólico dos pedúnculos florais da espécie Mabea fistulifera
Mart. utilizando água e solução de DMSO como solvente, sobre o volume do exsudato pleural
induzido pela injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de
Tukey).
Controle
Á
g
u
a
MF-EPF
Águ
a
C
o
nt
r
ole
DMS
O
MF-EPF DMSO
0
25000
50000
75000
100000
Contagem de Células
Figura 10: Efeito do extrato etanólico da espécie Mabea fistulifera Mart. utilizando água e
solução de DMSO como solvente, sobre a migração de leucócitos induzida pela injeção de
carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey).
*
*
*
50
Cont
r
o
l
e
MF-EF
MF-A
FC
MF-
AFS
0.0
0.5
1.0
1.5
Volume Exsudato (ml)
Figura 11: Efeito dos extratos das folhas da espécie Mabea fistulifera Mart. e comparação
entre diferentes métodos de extração sobre o volume do exsudato pleural induzido pela
injeção de carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey).
Controle
M
F-EF
M
F
-AF
C
MF-AF
S
0
25000
50000
75000
100000
Contagem de Células
Figura 12: Efeito dos extratos das folhas da espécie Mabea fistulifera Mart. e comparação
entre diferentes métodos de extração sobre a migração de leucócitos induzida pela injeção de
carragenina. *P<0,05 comparado ao controle (Anova, teste de Tukey).
De todos os extratos testados somente o extrato MF-EPF reduziu significantemente o
volume do exsudato inflamatório e a migração de células no modelo de pleurisia induzida
pela carragenina no rato, sugerindo uma possível atividade antiinflamatória. É importante
51
ressaltar, no entanto, que apenas o extrato dissolvido em DMSO reduziu significantemente o
número de células migradas.
Pode-se observar pela comparação dos resultados obtidos para a redução do volume do
exsudato inflamatório (Figura 9) e a migração de células (Figura 10) para o extrato MF-EPF
que quando este foi solubilizado apenas em água formando uma suspensão e quando se
utilizou DMSO para melhora da solubilização houve uma melhora na atividade
antiinflamatória. Por meio destes dados comprova-se também que o DMSO na concentração
utilizada não interferiu no resultado final da avaliação da atividade.
Comparando os resultados obtidos para redução do volume do exsudato inflamatório
(Figura 11) e para migração de células (Figura 12) dos extratos aquosos das folhas obtidos por
diferentes métodos de extração (Infusão e Soxhlet), pode-se observar que não houve uma
diferença significativa na atividade antiinflamatória entre os extratos. Neste caso pode-se
afirmar que o método de extração não interferiu no resultado.
4.2. Identificação das substâncias isoladas
4.2.1. Composto MF-1/MF-2
♦ MF-1
O composto MF-1 foi isolado da fração MF-HF 1 como cristais brancos na forma de
agulhas.
Através da análise do espectro de RMN
1
H (Figura 13 A), observou-se a presença de
um singleto em δ
H
1,25, integração de 92 hidrogênios, sinal este característico de uma
seqüência de hidrogênios metilênicos e um tripleto em δ
H
0,88, integração de 6 hidrogênios,
característico de metila.
O espectro de RMN
13
C (Figura 13 B), confirmou sinais característicos de CH
2
e CH
3.
O composto MF-1 foi identificado como sendo uma mistura de hidrocarbonetos de
cadeia longa, obedecendo a fórmula C
n
H
2n
+2.
52
♦ MF-2
O composto MF-2 foi isolado da fração MF-HF 4 na forma de um pó branco.
No espectro de RMN
1
H (Figura 14 A) para MF-2 observam-se um tripleto em δ
H
0,88, integração de 6 hidrogênios, um quinteto em δ
H
1,82, integração de 4 hidrogênios; um
tripleto em δ
H
2,54, integração de 4 hidrogênios e sinais em δ
H
1,42, 1,33 e 1,28, integração
total para 58 grupamentos CH
2
, sinais estes característicos de hidrogênios de hidrocarbonetos.
O espectro de RMN
13
C (Figura 14 B) confirmou sinais característicos de CH
2
e CH
3
.
A substância MF-2 assim como a substância MF-1 foi caracterizada como sendo uma
mistura de hidrocarbonetos de cadeia longa.
53
Figura 13: A) Espectro de RMN
1
H para MF-1 (mistura de hidrocarbonetos de cadeia longa) (300,06 MHz) em CDCl
3
.
B) Espectro de RMN
13
C para MF-1 (mistura de hidrocarbonetos de cadeia longa) (75,45 MHz) em CDCl
3
.
B
A
54
Figura 14: A) Espectro de RMN
1
H para MF-2 (misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa) (300,06 MHz) em C
5
D
5
N.
B) Espectro de RMN
13
C para MF-2 (misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa) (75,45 MHz) em C
5
D
5
N.
B
A
55
4.2.2. Composto MF-3
HO
18
19
21
29
26
27
3
HO
18
19
21
29
26
27
3
MF-3a (β-sitosterol) MF-3b (Estigmasterol)
MF-3 foi isolado da fração MF-HF 5 da coluna do extrato hexânico total das folhas
como cristais transparentes em formato de agulhas.
No espectro de IV (Figura 15) observam-se bandas de transmissão em 3432 cm
-1
relativa à vibração de estiramento
_
OH, bandas na região de 3000 – 2800 cm
-1
referentes à
deformação axial C
_
H, em 1651 cm
-1
relativa à deformação axial da insaturação entre os
carbonos C-22 e C-23 do estigmasterol e bandas em 1466 e 1382 cm
-1
deformação axial dos
carbonos do anel C-5 e C-6.
No espectro de RMN
1
H (Figura 16) observam-se sinais característicos de hidrogênios
olefínicos trans em δ
H
5,15 (J = 8,4 e 15,3 Hz, dd) atribuído ao H-22 e δ
H
5,01 (J = 8,4 e 15,3
Hz, dd) atribuído ao H-23 do estigmaterol (MF-3b).
A presença do H-3 (multipleto) na região de 3,55-3,51 ppm e do hidrogênio olefínico
H-6 em δ
H
5,35 ppm (J = 5,1 Hz, d) e o acúmulo de sinais na região de 0,60 - 2,40 ppm
atribuídos à presença de vários hidrogênios metílicos, metínicos e metilênicos são sinais
característicos dos esteróides β-sitosterol (MF-3a) e estigmasterol (MF-3b).
Pela análise dos espectros de RMN
13
C e DEPT (Figura 17) podem-se observar entre
outros, sinais de carbonos insaturados em δ
C
140,98 (C), 121,95 (CH), 138,54 (C) e 129,45
(CH).
Baseado nos dados espectrais de RMN
1
H e
13
C e por comparação destes com os
dados encontrados na literatura
61,62
(Tabela 16) a mistura MF-3 foi identificada como uma
mistura dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol.
56
Tabela 16: Comparação dos dados de deslocamentos químicos de RMN
13
C (75,45 MHz em
CDCl
3
) de MF-3 com os dados da literatura
61,62
para estigmasterol e β-sitosterol.
C MF-3a MF-3b
β-sitosterol
Estigmasterol
1 37,46 37,46 37,25 37,25
2 31,88 31,88 31,64 31,64
3 72,02 72,02 71,81 71,81
4 42,51 42,51 42,29 42,29
5 140,98 140,98 140,73 140,73
6 121,95 121,95 121,72 121,72
7 32,10 32,10 31,89 31,89
8 32,10 32,10 31,89 31,89
9 50,33 50,33 50,12 50,12
10 36,71 36,71 36,40 36,40
11 21,30 21,30 21,08 21,08
12 39,98 39,98 39,78 39,68
13 42,51 42,51 42,29 42,29
14 56,97 57,08 56,75 56,87
15 24,52 24,58 24,30 24,38
16 28,47 28,47 28,24 28,24
17 56,25 56,19 56,05 55,93
18 12,08 12,08 11,87 11,87
19 19,62 19,62 19,38 19,38
20 36,36 40,56 36,16 40,50
21 19,24 21,43 19,03 21,20
22 34,15 138,54 33,94 138,40
23 26,26 129,50 39,12 129,27
24 46,04 51,43 45,83 51,23
25 29,34 31,88 26,03 31,89
26 18,99 19,25 18,76 19,00
27 20,04 19,25 19,81 19,00
28 23,27 25,62 23,06 25,42
29 12,20 12,47 11,99 12,27
57
Figura 15: Espectro de IV (KBr) para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol).
58
59
Figura 16: Espectro de RMN
1
H para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol) (300,06 MHz) em CDCl
3
.
60
Figura 17: Espectro de RMN
13
C/DEPT para MF-3 (β-sitosterol e estigmasterol) (
,
75,45 MHz) em CDCl
3.
61
4.2.3. Composto MF-6
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
O
OH
OH
HO
O
H
MF-6
A substância MF-6 foi isolada da fração MF-ECS 12 da coluna do extrato etanólico
das cascas das sementes na forma de cristais brancos.
No espectro no IV (Figura 19) observam-se bandas de transmissão em 3414 cm
-1
relativa à vibração de estiramento
_
OH e em 1727 cm
-1
relativa à vibração de estiramento
C=O da carbonila do anel C.
A unidade aglicona da substância MF-6 foi evidenciada como uma flavanona pela
presença de quatro sinais na região de hidrogênios ligados a anel aromático em δ
H
7,40 (J =
8,4 Hz, d) (H-2’/6’), integração para dois hidrogênios; e δ
H
6,90 (J = 8,4 Hz, d) (H-3’/5’),
integração para dois hidrogênios ambos correspondentes ao anel B da flavanona e pelos sinais
em δ
H
6,17 (J = 2,1 Hz, d) (H-8) e δ
H
6,13 (J = 2,1 Hz, d) (H-6) ambos com integração para
um hidrogênio sendo estes atribuídos ao anel A da flavanona que puderam ser observados
pelo espectro de RMN
1
H (Figura 20).
As constantes de acoplamento dos sinais dos hidrogênios aromáticos em δ
H
7,40
(J = 8,4 Hz, d) e δ
H
6,90 (J = 8,4 Hz, d) evidenciam acoplamento orto, e as constantes de
acoplamento dos hidrogênios aromáticos em δ
H
6,17 (J = 2,1 Hz, d) e 6,13 (J = 2,1 Hz, d)
indicam acoplamento meta entre eles.
Ainda por meio do espectro de RMN
1
H foram observados sinais em δ
H
5,50 (J = 3,0 e
12,9 Hz; dd) (H-2),integração para um hidrogênio e os sinais em δ
H
2,78 (J = 3,0 e 17,1 Hz,
dd) (H-3
eq
) e 3,24 (J = 12,9 e 17,1 Hz; dd) (H-3
ax
) integração para um hidrogênio cada, estes
deslocamentos, constantes de acoplamento e multiplicidades estão em concordância com a
conformação meia cadeira, preferencialmente assumida pelo anel C da flavanona. Por meio
da Figura 18 é possível a visualização destes acoplamentos.
62
Figura 18: Conformação preferencial do anel C da flavanona.
Nesta conformação o hidrogênio em δ
H
2,78 se encontra em posição equatorial e o
hidrogênio em δ
H
3,24 em posição axial concordando com as constantes de acoplamento entre
eles e com o hidrogênio em δ
H
5,50 (H-2). Além destes sinais foram observados também dois
singletos em δ
H
12,07 e 8,58 atribuídos às hidroxilas fenólicas.
Por meio dos deslocamentos de hidrogênio e constantes de acoplamento encontrados e
por comparação destes com modelos da literatura
19
(Tabela 18) caracterizou-se a aglicona
como sendo a naringenina.
O espectro de COSY (Figura 21) confirma as correlações entre os hidrogênios δ
H
7,40
e δ
H
6,90 correspondentes ao anel B da naringenina. O anel C também foi confirmado pelos
acoplamentos entre os hidrogênios H-3
eq
e H-3
ax
e destes com o H-2. É possível observar o
acoplamento dos hidrogênios em δ
H
6,13 e δ
H
6,17 correspondentes aos hidrogênios H-6 e H-
8 do anel A da naringenina. Os acoplamentos observados pelo espectro de COSY estão
apresentados na Tabela 17.
A unidade glicosídica foi confirmada pela presença do sinal de hidrogênio em δ
H
5,07
(J = 7,5 Hz, d) com integral para um hidrogênio, correspondente ao hidrogênio anomérico.
Por meio da constante de acoplamento (J =7,5 Hz) para o hidrogênio anomérico foi possível
estabelecer a configuração β para o carbono anomérico, acoplamento este do tipo axial-axial
entre o hidrogênio anomérico H-1”e o hidrogênio H-2” (multipeto δ
H
3,40-3,90) da unidade
glicosídica. Os demais hidrogênios da unidade glicosídica também foram atribuídos ao
multipleto em δ
H
3,40-3,90.
63
Tabela 17: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY de MF-6
em C
2
D
6
CO.
δ
1
H
(mult., J Hz, H) δ
1
H
(mult., J Hz, H)
6,13 (d, J = 2,1 Hz, H-6) 6,17 (d, J 2,1 Hz, H-8)
5,50 (dd, J = 3,0 e 12,9 Hz, H-2) 2,78 (dd, J = 3,0 e 17,1Hz, H-3
eq
)
3,24 (dd, J = 12,9 e 17,1 Hz, H-3
ax
)
2,78 (dd, J = 3,0 e 17,1 Hz, H-3
eq
) 3,24 (dd, J = 12,9 e 17,1 Hz, H-3
ax
)
6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’/5’) 7,40 (d, J = 8,7 Hz, H-2’/6’)
Por meio das análises de RMN
1
H, COSY, IV e comparação com modelo da
literatura
19
(Tabela 18) caracterizou-se a substância MF-6 como 7-O-β-glucopiranosil
naringenina (prunin).
64
Tabela 18: Dados de RMN
1
H (300,06 MHz, C
2
D
6
CO) para a substância MF-6 e comparação
com os dados da literatura
19
(δ
1
H
a
).
H
δ
1
H
a
mult. (J Hz) δ
1
H
(Hz) mult. (J Hz)
H-2 5,50 dd
(12,5; 3,0)
5,50 dd
(12,9;3,0)
H-3
eq
2,79 dd 2,78 dd
(17,0;3,0) (17,1;3,0)
H-3
ax
3,25 dd 3,24 dd
(17,0;12,5) (17,1;12,9)
HO-5 11,50 s 12,07 s
H-6 6,17 d 6,13 d
(2,5) (2,1)
H-8 6,21 d 6,17 d
(2,5) (2,1)
H-2’/6 7,40 d 7,40 d
(8,7) (8,4)
H-3’/5’ 6,90 d 6,90 d
(9,0) (8,4)
H-1” 5,26 dd 5,07 d
(7,5;4,5) (7,5)
H-2” 3,70 dd 3,49 m
(9,5; 7,5)
H-3” 5,23 m 3,41-3,89 m
H-4” 3,92 d 3,41-3,89 m
(7,5)
H-5” 3,75 m 3,41-3,89 m
H-6”
a
3,75 m 3,41-3,89 m
H-6”
b
3,75 m 3,41-3,98 m
65
Figura 19: Espectro de IV (filme) para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil naringenina.
66
Figura 20: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil -naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO.
67
Figura 21
: Espectro de COSY para a substância MF-6 - 7-O-β-glucopiranosil naringenina em C
2
D
6
CO.
68
4.2.4. Composto MF-4
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
7
'"
1
'"
HO
O
O
OH
OH
HO
O
8
'"
(MF-4)
A substância MF-4 foi isolada da fração MF-ECS 10 da coluna do extrato etanólico
das cascas das sementes na forma de cristais brancos.
No espectro de IV (Figura 24) verificam-se bandas de transmissão em 3397 cm
-1
relativa à vibração de estiramento
_
OH, uma banda em 1702 cm
-1
relativa à vibração de
estiramento C=O da carbonila do anel C e bandas em 1604 e 1643 cm
-1
referentes à vibração
de estiramento C=C e de C=O α, β insaturada respectivamente.
A unidade aglicona da substância MF-4 foi evidenciada como uma flavanona assim
como para a substância MF-6, pelos sinais, no espectro de RMN
1
H (Figura 25) de dois
dupletos em δ
H
6,17 e 6,19, integração de um hidrogênio cada, com padrão de acoplamento
meta (J = 2,1 Hz) correspondendo ao anel A da flavanona (H-6 e H-8) e dois dupletos em
δ
H
7,40 e 7,56, integração de dois hidrogênios cada, ambos com acoplamento orto (J = 8,7
Hz) com um dupleto em δ
H
6,90, integração de quatro hidrogênios correspondentes aos
hidrogênios H-3’/5’ do anel B da flavanona e H-3’”/5’” do grupo coumaroil. Por meio das
correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY (Figura 26) pode-se
confirmar os acoplamentos descritos anteriormente entre os hidrogênios dos anéis aromáticos
H-6 com H-8 do anel A, H-2’/H-6’com H-3’/5’ do anel B da flavanona e H-2’”/6’”com H-
3’”/5’” do grupo coumaroil. Além destes, também foram observado os sinais em δ
H
12,09,
8,58 e 8,93 correspondentes respectivamente às hidroxilas fenólicas dos anéis A e B da
flavanona e a do grupo coumaroil.
O anel C da flavanona foi confirmado pelos sinais no espectro de RMN
1
H (Figura 25)
dos hidrogênios em δ
H
2,78 (J
= 3,0 e 17,1 Hz, dd) com integral equivalente a um hidrogênio,
em δ
H
3,26 (J = 12,9 e 17,1 Hz, dd) correspondente a um hidrogênio e em δ
H
5,50 (J = 3,0 e
12,9 Hz, dd) também com integral para um hidrogênio, estes deslocamentos químicos,
constantes de acoplamento e multiplicidades são típicos de H-3
eq
, H-3
ax
e H-2 na
69
conformação meia cadeira do anel C de uma flavanona, como observado para o composto
MF-6.
O espectro de RMN
13
C e DEPT (Figura 27) é característico de uma flavanona pelos
sinais em δ
C
43,5 correspondente ao carbono metilênico, em δ
C
80,2, carbono metínico, em
δ
C
198,1 referente à carbonila e em δ
C
158,8 correspondente ao carbono aromático ligado a
hidroxila, além dos sinais atribuídos aos carbonos aromáticos.
Através dos deslocamentos químicos, constantes de acoplamento e comparação com
modelos da literatura
19
para a unidade aglicona, esta foi caracterizada como sendo a
naringenina assim como para o composto MF-6.
A unidade glicosídica foi evidenciada pela presença do carbono anomérico em
δ
C
100,9 o qual está correlacionado com o hidrogênio em δ
H
5,26 (J = 7,8 Hz, H-1”) pelo
espectro de HMQC (Figura 28) e pela presença do carbono metilênico em δ
C
62,1 (C-6”)
correlacionado pelo HMQC (Figura 28) com o multipleto em δ
H
3,75 e 3,92.
A posição da glucose foi estabelecida com base na correlação heteronuclear
1
H x
13
C a
três ligações (
3
J) observada pelo espectro de HMBC (Figura 29) entre o hidrogênio anomérico
H-1” (δ
H
5,26) e o carbono da flavanona C-7 (δ
C
166,5) (Figura 22).
OO
H
H
OH
O
H
O
HO
H
OH
OH O
O
HO
1'
29
7'"
1'"
8'"
6"
OH
1"
7
Figura 22: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-4.
O espectro de diferença de NOE (Figura 30) também confirmou o posicionamento da
glucose ligada ao carbono C-7, mostrando um aumento na intensidade dos sinais dos
hidrogênios H-6 e H-8 pela irradiação do sinal em δ
H
5,26 (H-1”). A posição do H-6 também
pode ser confirmada pelo espectro de diferença de NOE, mostrando um aumento na
intensidade do H-6 pela irradiação do hidrogênio da hidroxila em δ
H
12,09 (HO-5) (Figura
23).
70
OO
H
H
OH
O
H
O
HO
H
OH
OH O
O
HO
1'
29
7'"
1'"
8'"
6"
OH
1"
7
Figura 23: Representação das interações observadas pela irradiação do sinal em δ
H
5,26 (H-
1”) e 12,09 (HO-5).
A constate de acoplamento de (J = 7,8 Hz) do hidrogênio anomérico H-1” da glucose
indica que o hidrogênio anomérico encontra-se em posição axial, levando a uma configuração
β para o carbono anomérico. Este valor corresponde a um acoplamento de tipo axial-axial
entre os hidrogênios H-1” com o hidrogênio H-2” δ
H
3,70 multipleto observada pelo espectro
de HMBC (Figura 29), estando o hidrogênio H-2”correlacionado através do espectro de
HMQC (Figura 28) com o carbono em δ
C
72,9. Os demais hidrogênios da glucose foram
atribuídos ao multipleto em δ
H
3,75 e δ
H
3,92 (Figura 25), os quais se correlacionaram com os
carbonos em δ
C
78,4; 69,3; 77,8 e 62,1 no espectro de HMQC (Figura 28).
A correlação heteronuclear
1
H x
13
C a três ligações (
3
J) do hidrogênio da glucose em
δ
H
5,24 (multipleto, H-3”) com o carbono em δ
C
167,5 (Figura 22), observada no espectro de
HMBC (Figura 29) evidenciou uma substituição no carbono C-3” da glucose, sendo que o
maior deslocamento apresentado pelo hidrogênio H-3” da glucose também é característico
desta substituição.
Por meio do espectro de RMN
1
H (Figura 25) observou-se sinais para uma unidade
coumaroila, os quais não foram observados para o composto MF-6 sendo esta evidenciada
pelos sinais para hidrogênios olefínicos com acoplamento trans em δ
C
7,65 (J = 15,9 Hz, d) e
δ
C
6,40 (J = 15,9 Hz, d) e os já citados hidrogênios aromáticos em δ
H
7,56 (J = 8,7 Hz, d) e δ
H
6,90 (J = 8,7 Hz, d). Por meio do espectro de HMBC (Figura 29) pode-se verificar a
correlação heteronuclear
1
H x
13
C a duas ligações (
2
J)
do hidrogênio em δ
H
6,40 com o
carbono da carbonila em δ
C
167,5 sendo este então o H-α (H-8’”) e a correlação heteronuclear
1
H x
13
C a três ligações (
3
J) da carbonila com o hidrogênio em δ
H
7,65 sendo este, portanto o
H-β (H-7’”).
71
A unidade coumaroila pode ser confirmada pelos sinais de carbonos olefínicos em
δ
C
145,6 e 115,4, pelo sinal de carbono da carbonila em δ
C
167,5 e pelos sinais de carbonos
aromáticos. Observou-se no espectro de RMN
1
H (Figura 25) sinal de aromático ligado à
hidroxila da unidade coumaroila em δ
C
160,6.
As correlações heteronucleares
1
H x
13
C através do espectro de HMQC (Figura 28) e
HMBC (Figura 29) auxiliaram na atribuição dos deslocamentos químicos dos carbonos e
hidrogênios da substância MF-4.
A análise das correlações
1
H x
1
H confirmou os acoplamentos descritos anteriormente,
os quais estão apresentados na Tabela 19.
Tabela 19: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas através do espectro de COSY de
MF-4 em C
2
D
6
CO.
δ
1
H (mult., J Hz, H) δ
1
H (mult., J Hz, H)
6,17 (d, J = 2,1 Hz, H-6) 6,19 (d, J 2,1 Hz, H-8)
5,50 (dd, J = 3,0 e 12,9 Hz, H-2) 2,78 (dd, J = 3,0 e 17,1 Hz, H-3
eq
)
3,26 (dd, J = 12,9 e 17,1 Hz, H-3
ax
)
2,78 (dd, J = 3,0 e 17,1 Hz, H-3
eq
) 3,26 (dd, J = 12,9 e 17,1 Hz, H-3
ax
)
6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’/5’)
6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’”/5’”)
7,65 (d, J = 15,9 Hz, H-β)
7,40 (d, J = 8,7 Hz, H-2’/6’)
7,56 (d, J = 8,7 Hz, H-2’”/6’”)
6,40 (d, J = 15,9 Hz, H-α)
A concordância dos dados de RMN
1
H e
13
C da substância MF-4 isolada da fração
MF-ECS 10 com os dados da literatura para 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil]
naringenina
19
(3) (Tabela 20) confirmou a estrutura proposta.
Os espectros das substâncias isoladas das frações MF-ECS 12, MF-ECS II.13 e MF-
ECS II.13.4.S.2 que também receberam a denominação de MF-4 por apresentarem mesmo Rf
que a substância isolada da fração MF-ECS 10 quando comparados entre si e com os dados da
literatura mostraram que realmente a substância MF-4 foi isolada de quatro frações diferentes.
72
Tabela 20: Dados de
13
C (75,45 MHz) e valores de RMN 2D (300,06 MHz em C
2
D
6
CO) para
o composto MF-4 (3) e comparação com dados da literatura
19
(
13
C
a
e HMQC
a
).
C
δ
13
C
a
HMQC
a
(
13
C x
1
H)
δ
1
H mult. (J Hz)
HMQC (
13
C x
1
H)
δ
1
H mult. (J Hz)
δ
13
C
/ (DEPT)
2 79,3 H-2 5,50 dd
(12,5; 3,0)
H-2 5,50 dd
(12,9; 3,0)
80,2 (CH)
3 42,6 H-3
eq
2,79 dd
(17,0; 3,0)
H-3
ax
3,25 dd
( 17,1; 12,9)
H-3
eq
2,78 dd
(17,1; 3,0)
H-3
ax
3,26 dd
(17,1; 12,9)
43,5 (CH
2
)
4 197,8 -------------- 198,1 (C)
OH-5 163,5 11,50 s 12,09 s 164,8 (C)
6 97,1 H-6 6,17 d
(2,5)
H-6 6,17 d
(2,1)
97,7 (CH)
7 165,6 -------------- 166,5 (C)
8 96,0 H-8 6,21 d
(2,5)
H-8 6,21 d
(2,1)
96,5 (CH)
9 163,3 -------------- 164,2 (C)
10 103,9 -------------- 104,6 (C)
1’ 129,1 -------------- 130,6 (C)
2’ e 6’ 129,0 H-2’,6’ 7,40d
(8,5)
H-2’,6’ 7,40 d
(8,7)
129,2 (CH )
3’ e 5’ 115,4 H-3’,5’ 6,90 d
(9,0)
H-3’,5’ 6,90 d
(8,7)
116,2 (CH)
4’ 158,4 -------------- 158,8 (C)
1” 99,8 H-1” 5,26 dd
(7,5;4,5)
H-1” 5,26 d
(7,8)
100,9 (C)
2” 71,7 H-2” 3,70 dd
(9,5; 7,5)
H-2” 3,70 m
72,9 (CH)
3” 77,7 H-3” 5,23 m H-3” 5,24 m 78,4 (CH)
4” 68,0
H-4” 3,92 ≈ d (7,5)
H-4” 3,80 m 69,3 (CH)
5” 77,3 H-5” 3,75 m H-5” 3,75 m 77,8 (CH)
6” 60,8 H-6”
a
3,75 m
H-6”
b
3,75 m
H-6”
a
3,75 m
H-6”
b
3,92 m
62,1 (CH
2
)
1’” 126,0 --------------- 127,1 (C)
2’” e 6’” 130,8 H-2’”,6’” 7,55 d
(8,5)
H-2’”,6’” 7,56 d
(8,7)
131,0 (CH)
3’” e 5’” 116,4 H-3’”, 5’” 6,90 d
(8,5)
H-3’”, 5’” 6,90 d
(8,7)
116,8 (CH)
4’” 160,3 --------------- 160,6 (C)
7’” 145,1 H-7’” 7,65 d
(16,0)
H-7’” 7,65 d
(15,9)
145,6 (CH)
8’” 115,9 H-8’” 6,38 d
(16,0)
H-8’” 6,40 d
(15,9)
115,4 (CH)
9’” 168,7
-----------------
167,5 (C)
73
Figura 24: Espectro de IV (KBr) para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina.
74
Figura 25: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO.
75
Figura 26: Espectro de
1
H x
1
H COSY para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
76
Figura 27: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em
C
2
D
6
CO.
77
Figura 28: Espectro de HMQC para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
78
Figura 29: Espectro de HMBC para a substância MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
79
Figura 30: Espectro de diferença de NOE em C
2
D
6
CO de MF-4 - 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
80
4.2.5. Composto MF-7
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
1
''''
O
OH
7
''''
O
O
OH
HO
O
H
(MF-7)
A substância MF-7 foi isolada como um precipitado amarelado da fração MF-ECS 12
da coluna do extrato etanólico das cascas das sementes após cromatografia em CCDP.
Observaram-se no espectro de IV (Figura 32) bandas de transmissão em 3388 cm
-1
relativa à vibração de estiramento
_
OH, uma banda em 1700 cm
-1
relativa à vibração de
estiramento C=O da carbonila do grupamento do anel C e bandas em 1640 e 1604 cm
-1
referentes respectivamente à vibração de estiramento C=O e de C=C α, β insaturada.
Pelo espectro de RMN
1
H (Figura 33) da substância MF-7 foi possível caracterizar a
unidade aglicona como sendo uma flavanona, pelos sinais de dois dupletos em δ
H
7,37, e
7,51, integração de dois hidrogênios cada e ambos com acoplamento orto (J = 8,7 Hz) com
um dupleto em δ
H
6,89, integração de quatro hidrogênios correspondentes aos hidrogênios (H-
3’/5’) do anel B da flavanona e H-3’”/5’” do grupo coumaroil. O anel A da flavanona foi
evidenciado pela presença dos sinais de hidrogênios em δ
H
6,16 e 6,22, integração de um
hidrogênio cada, com padrão de acoplamento meta (J = 2,4 Hz) correspondentes aos
hidrogênios H-6 e H-8. Por meio das correlações homonucleares
1
H x
1
H observada no
espectro de COSY (Figura 34), pode-se confirmar os acoplamentos descritos anteriormente
entre os hidrogênios aromáticos H-2”/6” com H-3”/5” do anel B da flavanona e H-2’”/6’”com
H-3’”/5’” do grupo coumaroil. Além destes também foram observados sinais em δ
H
12,11,
8,63 e 8,99 correspondentes às hidroxilas fenólicas dos anéis A e B da flavanona e a do grupo
coumaroil.
81
Os sinais de hidrogênio em δ
H
5,45 (3,0 e 12,9 Hz, dd), integração de um hidrogênio;
δ
H
2,78 (3,0 e 17,3 Hz, dd), integração de um hidrogênio e δ
H
3,26 (12,9 e 17,3 Hz, dd),
integração de um hidrogênio, evidenciam deslocamentos, acoplamentos e multiplicidades
característicos do anel C da flavanona em sua conformação meia cadeira assumida
preferencialmente. Estes sinais podem ser atribuídos respectivamente aos hidrogênios H-2, H-
3
ax
e H-3
eq
. Pelo espectro de COSY (Figura 34) pode-se confirmar a existência do
acoplamento axial entre os hidrogênios H-2 e H-3
ax
e equatorial entre os hidrogênios H-2 e
H-3
eq
e também o acoplamento geminal entre os hidrogênios H-3
ax
e H-3
eq
.
O espectro de RMN
13
C e DEPT (Figura 35) mostrou-se característico de uma
flavanona pelos sinais em δ
C
42,9 correspondentes ao carbono metilênico, δ
C
79,4 carbono
metínico, δ
C
197,4 referente à carbonila e δ
C
158,2 correspondente ao carbono aromático
ligado a hidroxila, além dos outros atribuídos aos carbonos aromáticos.
As correlações entre
1
H e
13
C (
1
J,
2
J e
3
J) obtidas através dos espectros de HMQC
(Figura 36) e HMBC (Figura 37), confirmam a estrutura proposta para a unidade aglicona
como sendo a da naringenina, assim como para as substâncias MF-6 e MF-4 (3).
A presença da unidade glicosídica foi evidenciada pela presença do carbono
anomérico em δ
C
100,3 o qual está correlacionado com o hidrogênio em δ
H
5,14 (J = 7,8 Hz,
d, H-1”), integração de um hidrogênio, através do espectro de HMQC (Figura 36). Esta foi
caracterizada como sendo a glucose, pela presença do carbono metilênico em δ
C
63,6 (C-6”) o
qual se correlaciona com os hidrogênios em δ
H
4,29 (6,9 e 11,9 Hz, dd, H-6”
a
), e δ
H
4,57 (2,1
e 11,9 Hz, dd, H-6”
b
), ambos com integração de um hidrogênio (Figura 33).
A constate de acoplamento de (J = 7,8 Hz) para a glucose indica que o hidrogênio
anomérico encontra-se em posição axial, levando a uma configuração β para o carbono
anomérico (C-1”).
A posição da glucose foi estabelecida com base na correlação heteronuclear
1
H x
13
C a
três ligações (
3
J) observada pelo espectro de HMBC (Figura 37) entre o hidrogênio anomérico
H-1” (δ
H
5,14) com o carbono da flavanona C-7 (δ
C
166,0) (Figura 31).
82
H
1
''''
O
OH
7
''''
O
O
OH
HO
O
H
H
H
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
Figura 31: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-7.
Por meio do espectro de RMN
1
H (Figura 33) observaram-se sinais para uma unidade
coumaroila, sendo esta evidenciada pelos sinais para hidrogênios olefínicos com acoplamento
trans em δ
H
7,60 (J = 15,9 Hz, d) e δ
H
6,36 (J = 15,9 Hz, d), ambos com integração de um
hidrogênio e os hidrogênios ligados a anéis aromáticos em δ
H
7,51 (J = 8,7 Hz, d), integração
de dois hidrogênios e δ
H
6,89 (J = 8,4 Hz, d), integração para quatro hidrogênios. Por meio do
espectro de HMBC (Figura 37) pode-se verificar a correlação heteronuclear
1
H x
13
C a duas
ligações (
2
J)
do hidrogênio em δ
H
6,36 com o carbono da carbonila em δ
C
166,9 sendo este
então o H-α (H-8’”) e a correlação heteronuclear
1
H x
13
C a três ligações (
3
J) da carbonila
com o hidrogênio em δ
H
7,60 sendo este, portanto o H-β (H-7’”).
A unidade coumaroila pode ser confirmada pelos sinais de carbonos olefínicos em
δ
C
145,1 e 115,6, pelo sinal de carbono de carbonila em δ
C
166,9 e pelos sinais de carbonos
aromáticos. Observou-se no espectro de RMN
1
H (Figura 33) sinal de carbono aromático
ligado à hidroxila da unidade coumaroila em δ
C
160,1.
Os deslocamentos e sinais observados anteriormente estão em concordância com os
dados encontrados para a substância MF-4 (3) que foi caracterizada como 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina, divergindo apenas na correlação heteronuclear
1
H x
13
C a três ligações (
3
J) do carbono da carbonila do grupamento coumaroila em δ
C
166,9 com
os hidrogênios em δ
H
4,29 (J = 6,6 e 11,9 Hz, 1H, dd, H-6”
a
) e δ
H
4,57 (J = 2,1 e 11,9 Hz, 1H,
dd, H-6”
b
) observada pelo espectro de HMBC (Figura 37) para MF-7 e em MF-4 (3) foi
observada correlação heteronuclear
1
H x
13
C (
3
J) entre o hidrogênio H-3” e o carbono
carbonílico do grupamento coumaroila.
83
Pela correlação entre o carbono da carbonila do radical coumaroil com os hidrogênios
H-6” observada no espectro de HMBC (Figura 37) confirmou-se a posição do grupamento
coumaroila estando este ligado ao carbono C-6” da glucose (Figura 31).
As correlações heteronucleares
1
H x
13
C do espectro de HMQC (Figura 36),
auxiliaram na atribuição dos deslocamentos químicos dos carbonos e hidrogênios da
substância MF-7.
A análise das correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas para o espectro de
COSY (Figura 34) confirmou os acoplamentos descritos anteriormente, os quais estão
apresentados na Tabela 21.
Tabela 21: Correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY de MF-7
em C
2
D
6
CO.
δ
1
H (mult., J Hz, H) δ
1
H (mult., J Hz, H)
6,16 (d, J = 2,4 Hz, H-6) 6,22 (d, J = 2,4 Hz, H-8)
5,45 (dd, J = 12,9 e 3,0 Hz, H-2) 2,76 (dd, J = 3,0 e 17,25 Hz, H-3
eq
)
3,21 (dd, J = 12,9 e 17,25 Hz, H-3
ax
)
2,76 (dd, J = 3,0 e 17,25 Hz, H-3
eq
) 3,21 (dd, J = 12,9 e 17,25 Hz, H-3
ax
)
6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’/5’)
6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3’”/5’”)
7,60 (d, J = 15,9 Hz, H-β)
7,37 (d, J = 8,7 Hz, H-2’/6’)
7,51 (d, J = 8,7 Hz, H-2’”/6’”)
6,40 (d, J = 15,9 Hz, H-α)
A concordância dos dados de RMN
1
H e
13
C da substância MF-7 com os dados da
literatura para 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina
63
(4) (Tabela 22)
confirmou a estrutura proposta.
84
Tabela 22: Dados de
13
C (75,45 MHz) e valores de RMN 2D (300,06 MHz em C
2
D
6
CO) para
o composto MF-7 (4) e comparação com dados da literatura
63
(
13
C
a
, HMQC
a
).
C
δ
13
C
a
HMQC
a
(
13
C x
1
H)
δ
1
H mult. (J Hz)
HMQC(
13
C x
1
H)
δ
1
H mult (J Hz)
δ
13
C
/ (DEPT)
2 78,6 H-2 5,50 d
(12,0)
H-2 5,45 dd
(12,9; 3,0)
79,4 (CH)
3 42,0 H-3
eq
2,70-4,15m
H-3
ax
2,70-4,15 m
H-3
eq
2,76 dd
(17,3; 3)
H-3
ax
3,21 dd
(17,3;12,9)
42,9 (CH
2
)
4 197,2 -------------- 197,4 (C)
OH-5 163,0 12,09 s 164,2 (C)
6 96,3 H-6 6,22 sl
H-6 6,16 d
(2,4)
96,9 (CH)
7 165,0 -------------- 166,0 (C)
8 95,5 H-8 6,22 sl
H-8 6,22 d
(2,4)
96,0 (CH)
9 162,6 -------------- 163,4 (C)
10 103,3 -------------- 104,0 (C)
1’ 128,6 -------------- 130,0 (C)
2’ e 6’ 128,4 H-2’,6’ 7,35 d
(8,5)
H-2’,6’ 7,37 d
(8,7)
128,5 (CH )
3’ e 5’ 115,1 H-3’,5’ 6,83d
(9)
H-3’,5’ 6,90 d
(8,7)
116,1 (CH)
4’ 157,7 -------------- 158,2 (C)
1” 99,2 H-1” 5,13 dl
(6)
H-1” 5,14 d
(7,8)
100,3 (C)
2” 72,9 H-2” 2,70-4,15 m
H-2” 3,52 m
73,9 (CH)
3” 76,1 H-3” 2,70-4,15 m H-3” 3,60 m 77,1 (CH)
4” 69,8 H-4” 2,70-4,15 m H-4” 3,50 m 70,6 (CH)
5” 73,8 H-5” 2,70-4,15 m H-5” 3,91 m 74,6 (CH)
6” 63,3 H-6”
a
4,41 m
H-6”
b
4,41 m
H-6”
a
4,29 dd
(2,1 e 11,9)
H-6”
b
4,57 dd
(6,6 e 11,9)
63,6 (CH
2
)
1’” 125,0 --------------- 126, 4 (C)
2’” e 6’” 130,3 H-2’”,6’” 7,55 d
(9)
H-2’”,6’” 7,51 d
(8,7)
130,4 (CH)
3’” e 5’” 115,7 H-3’”, 5’” 6,83 d
(9)
H-3’”, 5’” 6,9 d
(8,7)
116,1 (CH)
4’” 159,8 --------------- 160,1 (C)
7’” 144,9 H-7’” 7,59d
(16)
H-7’” 7,60d
(15,9)
145,1 (CH)
8’” 113,9 H-8’” 6,63 d
(16)
H-8’” 6,40 d
(15,9)
115,6 (CH)
9’” 166,4
-----------------
166,9 (C)
85
Figura 32: Espectro de IV (filme) para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina.
86
Figura 33: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO.
87
Figura 34: Espectro de COSY para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
88
Figura 35: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em C
2
D
6
CO.
89
Figura 36:
Espectro de HMQC para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
90
Figura 37: Espectro de HMBC para a substância MF-7 - 7-O-β-[(6”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
91
4.2.6. Composto MF-5
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
7
'"
1
'"
HO
O
O
O
OH
HO
O
8
'"
1
''''
O
OH
7
''''
(MF-5)
Pelo espectro de RMN
1
H (Figura 39) da substância MF-5 isolada da fração MF-ECS
10 da coluna do extrato etanólico das cascas das sementes na forma de um precipitado branco,
pode-se observar sinais característicos de uma flavanona, tais como os sinais de hidrogênio
em δ
H
6,06 e 6,12, integração de um hidrogênio cada, com padrão de acoplamento meta (J =
2,1 Hz) correspondentes aos hidrogênios do anel A da flavanona (H-6 e H-8) e dois dupletos
em δ
H
7,26 e 6,77, integração de dois hidrogênios cada, acoplando entre si com constante de
acoplamento orto (J = 8,7 Hz) correspondentes aos hidrogênios H-2’/6’ e H-3’/5’do anel B da
flavanona. Por meio das correlações homonucleares
1
H x
1
H observadas no espectro de COSY
(Figura 40), pode-se confirmar os acoplamentos descritos anteriormente entre os hidrogênios
aromáticos H-6 e H-8 do anel A e H-2’/6’ com H-3’/5’do anel B. Além destes também foram
observados sinais em δ
H
12,00 e 8,44 ambos com integração para um hidrogênio,
correspondendo às hidroxilas fenólicas dos anéis A e B da flavanona.
O anel C da flavanona foi confirmado pelos sinais no espectro de RMN
1
H (Figura 39)
em δ
H
2,64 (J = 17,25 e 3,0 Hz, dd), integração equivalente a um hidrogênio, em δ
H
3,11 (J =
17,25 e 12,9 Hz, dd), integração de um hidrogênio e em δ
H
5,35 (J = 12,9 e 3,0 Hz, dd),
integração para um hidrogênio, estes deslocamentos químicos, constante de acoplamento e
multiplicidades são típicos de H-3
eq
, H-3
ax
e H-2 do anel C de uma flavanona.
O anel C como discutido anteriormente possui preferencialmente a conformação meia
cadeira, onde observam-se claramente os acoplamentos equatorial e axial entre os hidrogênios
H-3
eq
e H-2 com constante de acoplamento J = 3,0 Hz e entre H-3
ax
e H-2 com constante de
acoplamento J = 12,9 Hz. A constante de acoplamento J = 17,25 Hz entre os hidrogênios H-
3
eq
e H-3
ax
concorda com o acoplamento geminal entre eles.
92
O espectro de RMN
13
C/DEPT (Figura 41) é característico de uma flavanona pelos
sinais em δ
C
43,5 correspondente ao carbono metilênico, em δ
C
80,1 para o carbono metínico,
em δ
C
198,1 correspondente ao deslocamento do carbono da carbonila, δ
C
158,9
correspondente ao carbono aromático do anel B ligado à hidroxila e em δ
C
164,9
correspondente ao carbono aromático do anel A ligado à hidroxila, além dos demais sinais
atribuídos a carbonos aromáticos.
Os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento observados para a unidade
aglicona e comparação com dados da literatura
19
levaram a estrutura da naringenina, assim
como para as demais flavanonas isoladas.
A unidade glicosídica foi evidenciada pela presença do carbono anomérico em
δ
C
100,8 o qual se correlaciona com o hidrogênio δ
H
5,20 (J = 7,8 Hz, dd) pelo espectro de
HMQC (Figura 42) e pela presença do carbono metilênico em δ
C
63,9 (C-6”) o qual se
correlaciona pelo HMQC com os hidrogênios em δ
H
4,46 (J = 12,0 e 2,0 Hz, dd) e em δ
H
4,24 (J = 12,0 e 6,0 Hz, dd). A presença do carbono metilênico C-6” leva à estrutura da
glucose.
A constante de acoplamento de (J = 7,8 Hz) para a glucose indica que o hidrogênio
anomérico encontra-se em posição axial, levando a uma configuração β para o carbono
anomérico. Este valor corresponde a um acoplamento do tipo axial-axial com o hidrogênio H-
2” (δ
H
3,63, m) que pode ser observado no espectro de COSY (Figura 40). Pelas demais
correlações entre os hidrogênios do açúcar (Figura 40) e entre estes e seus respectivos
carbonos (Figura 42) foi possível atribuir aos hidrogênios em: δ
H
5,13
(J = 9,3 Hz, t) à posição
3” o qual se correlaciona com carbono em δ
C
78,2 (C-3”), o maior deslocamento deste
hidrogênio indica uma substituição neste carbono, em δ
H
3,68 (m) correlação com o carbono
em δ
C
69,6 (C-4”); em δ
H
3,97 (J = 6,3; 6,3 e 2,0 Hz, ddd) correlacionado com 75,2 (C-5”);
em δ
H
4,24 (J = 12,0 e 6,0 Hz, dd) e 4,46 (J = 12,0 e 2,0 Hz, dd) ambos correlacionados com o
carbono em δ
C
63,9 (C-6”).
A posição da glucose foi estabelecida com base na correlação heteronuclear
1
H x
13
C a
três ligações (
3
J) observada pelo espectro de HMBC (Figura 43), entre o hidrogênio
anomérico H-1” (δ
H
5,20) com o carbono C-7 da flavanona em δ
C
166,4 (Figura 38).
93
7
'"
1
'"
HO
O
O
O
OH
HO
O
H
H
H
H
8
'"
1
''''
O
OH
7
''''
OH
OH
O
O
O
6
"
1
"
2
3
9
10
7
5
1
'
Figura 38: Principais correlações observadas no espectro de HMBC de MF-5.
Por meio do espectro de RMN
1
H (Figura 39) observaram-se sinais para duas unidades
coumaroilas, sendo evidenciada pelos sinais para hidrogênios olefínicos com acoplamento
trans em δ
H
6,27, 6,26, 7,49 e 7,53 (integração de um hidrogênio cada). Por meio do espectro
de HMBC (Figura 43) pode-se verificar a correlação heteronuclear
1
H x
13
C dos carbonos das
carbonilas em δ
C
167,4 e 167,5 a duas ligações (
2
J) com os hidrogênios em δ
H
6,26 e 6,27,
sendo estes portanto os hidrogênios H-α (H-8’”) e as correlações heteronucleares
1
H x
13
C a
três ligações (
3
J) das carbonilas anteriormente citadas com os hidrogênios em δ
H
7,49 e 7,53,
sendo estes os hidrogênios H-β (H-7’”).
Outra evidência da existência de duas unidades coumaroila é o sinal da hidroxila
correspondente a este grupo em δ
H
8,80 ter integração para dois hidrogênios e ainda o fato de
se observar sempre dois carbonos de deslocamentos muito próximos para o grupamento
coumaroila, sendo que o mesmo não ocorre para os carbonos da glucose e tão pouco para a
flavanona. Isso pode ser evidenciado pela presença de dois carbonos correspondentes aos
carbonos β (C-7’”) em δ
C
145,9 e 145,7 e em δ
C
115,2 e 115,8 correspondentes aos carbonos
α (C-8’”) e pela duplicação dos sinais de deslocamentos típicos dos aromáticos do grupo
coumaroila (Tabela 23).
Outra evidencia da existência de dois grupos coumaroila é a presença de quatro
dupletos na região de aromático com constante de acoplamento orto em δ
H
7,41 (J = 8,7 Hz,
d), δ
H
7,45 (J = 8,4 Hz, d), δ
H
6,78 (J = 8,7 Hz, d) e δ
H
6,76 (J = 8,4 Hz, d), integração de dois
hidrogênios cada, além dos já discutidos dupletos pertencentes ao anel B da unidade aglicona.
A posição dos dois grupamentos coumaroila pode ser evidenciada pelas correlações entre os
carbonos das carbonilas em δ
C
167,5 e 167,4 com os hidrogênios do açúcar em δ
H
5,13 (H-3”)
94
e em δ
H
4,24 (H-6”) a três ligações (
3
J) (Figura 43). Porém devido à proximidade dos
deslocamentos das carbonilas não foi possível definir qual estaria na posição 3” e qual estaria
na posição 6”.
As correlações entre
1
H e
13
C (
1
J,
2
J e
3
J) obtidas através dos espectros de HMQC
(Figura 42) e HMBC (Figura 43) e comparação dos deslocamentos de hidrogênio com os
encontrados na literatura
19
(
Tabela 24) confirmam a estrutura proposta para a substância MF-5, como sendo 7-O-
β[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (2).
A comparação dos espectros da substância isolada da fração MF-ECS II.13.4.S.2 que
por comparação de Rf com a substância isolada da fração MF-ECS 10 recebeu também a
denominação de MF-5 confirmou que realmente se trata da mesma substância.
Tabela 23: Dados de RMN
13
C (75,45 MHz) para MF-5 em C
2
D
6
CO.
δ
13
C
(flavanona) δ
13
C
(p-coumaroil) δ
13
C
(glucosil)
80,06 (C-2) 127,03 (C-1”’) 100,8 (C-1”)
43,51 (C-3) 127,00 (C-1’”) 72,8 (C-2”)
198,10 (C-4) 131,03 (C-2’”/6’”) 78,2 (C-3”)
164,87 (C-5) 131,10 (C-2’”/6’”) 69,6 (C-4”)
97,56 (C-6) 116,82 (C-3’”/5’”) 75,2 (C-5”)
166,40 (C-7) 116,78 (C-3’”/5’”) 63,9 (C-6”)
96,66 (C-8) 160,81 (C-4’”)
164,08 (C-9) 160,84 (C-4’”)
104,68 (C-10) 145,70 (C-7’”)
130,56 (C-1’) 145,90 (C-7’”)
129,15 (C-2’/6’) 115,25 (C-8’”)
158,92 (C-4’) 115,77 (C-8’”)
116,29 (C-3’/5’) 167,51 (C-9’”)
167,44 (C-9’”)
95
Tabela 24: Dados de
1
H (300,06 MHz) para o composto MF-5 (2) (C
2
D
6
CO) e comparação
com dados da literatura
19
(δ
1
H
a
).
H
δ
1
H
a
(mult.,J Hz) δ
1
H
(mult.,J Hz)
H-2 5,40 dd (12,9 e 3,0) 5,35 dd (12,9 e 3,0)
H-3
eq
2,77 dd (17,0 e 3,0) 2,64 dd (17,3 e 3,0)
H-3
ax
3,21 dd (17,0 e 12,5) 3,11 dd (17,3 e 12,9)
HO-5 11,50 s 12,00
H-6 6,20 d (2,0) 6,06 d (2,1)
H-8 6,25 d (2,0) 6,12 (2,1)
H-2’/6’ 7,51 d (8,5) 7,26 d (8,7)
H-3’/5’ 6,90 d (9.0) 6,77 d (8,7)
H-1” 5,32 d (7,5) 5,20 d (7,8)
H-2” 3,78 dd (9,0e 7,5) 3,63 m
H-3” 5,28 t (9,0) 5,13 t (9,3)
H-4” 3,78 dd (9,0 e 7,5) 3,68 m
H-5” 4,08 ddd
(9,5; 6,0 e 2,0)
3,97 ddd
(6,3; 6,3 e 2,0)
H-6” 4,37 dd (12,0 e 2,0) 4,46 dd (12,0 e 2,0)
4,60 dd (12,0 e 6,0) 4,24 dd (12,0 e 6,0)
H-2’”/6’” 7,37 d (8,5) 7,41 d (8,7)
7,56 d (8,5) 7,45 d (8,7)
H-3’”/5’” 6,90 d (8,4) 6,76 d (8,4)
6,90 d (8,5) 6,78 d (8,4)
H-8’” 6,38 d (16,0) 6,26 d (15,9)
6,40 d (16,0) 6,27 d (15,9)
H-7’” 7,62 d (16,0) 7,49 d (15,9)
7,67 d (16,0) 7,53 d (15,9)
96
Figura 39: Espectro de RMN
1
H para a substâncias MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (300,06 MHz) em C
2
D
6
CO.
97
Figura 40: Espectro de COSY para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
98
Figura 41: Espectro de RMN
13
C/DEPT para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (75,45 MHz) em
C
2
D
6
CO.
99
Figura 42: Espectro de HMQC para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
100
Figura 43: Espectro de HMBC para a substância MF-5 - 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina em C
2
D
6
CO.
101
4.2.7. Composto MF-8
HO
3
25
27
29
28
30
23
24
HO
3
25
27
29
28
30
23
24
MF-8a
(α-amirina) MF-8b (β-amirina)
Através do espectro de RMN
1
H (Figura 44) pode-se observar dois tripletos, ambos
com integração para um hidrogênio em δ
H
5,13 (J = 3,6 Hz) ligado ao carbono metínico em δ
C
124,65 (C-12) (Figura 46) e em δ
H
5,20 (J =3,6 Hz) ligado ao carbono metínico em δ
C
121,95
(C-12) (Figura 46). Esses deslocamentos de hidrogênio e carbono são característicos dos
triterpenos α e β-amirina.
Os deslocamentos de carbono em δ
C
139,8 (C) e δ
C
145,4 (C) podem ser atribuídos aos
carbonos C-13 e os deslocamentos de carbono em δ
C
124,7 e 121,9 aos carbonos C-12 da α e
β-amirina, respectivamente.
O deslocamento de RMN
13
C/DEPT (Figura 45) para o carbono C-3 em δ
C
79,26
(CH)
encontrado está em concordância com o valor encontrado na literatura
64
. Através do espectro
de HMQC (Figura 46) atribui-se aos hidrogênios H-3 da α e β-amirina o sinal em δ
H
3,22 (m).
Os demais sinais de hidrogênio na região de 0,7-2,3 ppm são característicos de
triterpenos.
Por meio dos deslocamentos de hidrogênios e carbonos encontrados e comparação
com os deslocamentos de carbono encontrados na literatura
64
confirmaram-se as estruturas
propostas.
102
Tabela 25: Dados de deslocamentos de carbono para MF-8
(a e b) em CDCl
3
e comparação
com dados da literatura
64
para β-amirina
a
, α-amirina
a
.
C
β-amirina
a
MF-8b
α-amirina
a
MF-8a
1 38,7 (CH
2
) 39,0 38,7 (CH
2
) 38,8
2 27,3 (CH
2
) 27,4 27,2 (CH
2
) 27,5
3 79,0 (CH) 79,3 78,3 (CH) 79,3
4 38,8 (C) 38,6 38,7 (C) 38,3
5 55,3 (CH) 55,4 55,2 (CH) 55,4
6 18,5 (CH
2
) 18,6 18,3 (CH
2
) 18,3
7 32,8 (CH
2
) 32,7 32,9 (CH
2
) 33,2
8 38,8(C) 38,3 40,0 (C) 40,3
9 47,7 (CH) 47,9 47,7 (CH) 47,9
10 37,6 (C) 37,6 36,9 (C) 37,2
11 23,6 (CH
2
) 23,8 23,3 (CH
2
) 23,6
12 121,8 (CH) 121,9 124,3 (CH) 124,7
13 145,1 (C) 145,4 139,3 (C) 139,8
14 41,8 (C) 41,8 42,0 (C) 42,3
15 26,2 (CH
2
) 26,4 28,7 (CH
2
) 29,6
16 27,0 (CH
2
) 27,2 26,6 (CH
2
) 26,8
17 32,5 (C) 32,9 33,7 (C) 34,0
18 47,4 (CH) 47,4 58,9 (CH) 59,3
19 46,9 (CH
2
) 47,0 39,6 (CH) 39,2
20 31,1 (C) 31,3 39,6 (CH) 39,9
21 34,8 (CH
2
) 35,0 31,2 (CH
2
) 31,3
22 37,2 (CH
2
) 37,4 41,5 (CH
2
) 41,9
23 28,2 (CH
3
) 28,3 28,1 (CH
3
) 28,6
24 15,5 (CH
3
) 15,7 15,6 (CH
3
) 15,9
25 15,6 (CH
3
) 15,8 15,6 (CH
3
) 15,9
26 16,9 (CH
3
) 17,0 16,8 (CH
3
) 17,1
27 26,0 (CH
3
) 26,2 23,3 (CH
3
) 23,5
28 28,4 (CH
3
) 28,6 28,1 (CH
3
) 28,2
29 33,3 (CH
3
) 33,6 17,4 (CH
3
) 17,7
30 23,7 (CH
3
) 23,9 21,3 (CH
3
) 21,6
103
Figura 44: Espectro de RMN
1
H para a substância MF-8 (α e β-amirina) (300,06 MHz) em CDCl
3
.
104
Figura 45: Espectro de RMN
13
C/DEPT da mistura MF-8 (α e β-amirina) (75,45 MHz) em CDCl
3
.
105
Figura 46: Espectro de HMQC para MF-8 (α e β-amirina) em CDCl
3
.
106
5. CONCLUSÕES
Através da revisão bibliográfica realizada pode-se observar que não constam relatos de
uso na medicina popular, assim como não constam relatos de estudo fitoquímico da planta
Mabea fistulifera Mart.
O estudo fitoquímico das folhas e cascas das sementes resultou no isolamento e
identificação de: duas misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa, quatro flavanonas
glicosiladas e duas misturas de triterpenos.
Através do levantamento bibliográfico observou-se que a substância MF-3a,
identificada como sendo o β-sitosterol, MF-3b identificada com sendo o estigmasterol, MF-
8a caracterizada como α-amirina e MF-8b identificada como β-amirina ainda não haviam
sido isoladas neste gênero apesar de terem sido isoladas de outros gêneros da família
Euphorbiaceae.
As substâncias isoladas: MF-4 identificada como sendo 7-O-β-[(3”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (3) ; MF-5 identificada como 7-O-β-[(3”,6”-di-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (2) e MF-7 identificada como 7-O-β-[(6”-p-
coumaroil)glucopiranosil] naringenina (4) já haviam sido isoladas de outras duas espécies do
gênero Mabea
19,20
.
O composto 7-O-β-glucopiranosil naringenina (MF-6) apesar de já ter sido isolado
63
de várias outras espécies ainda não havia sido relatado no gênero em estudo.
O isolamento das flavanonas 7-O-β-[(3”,6”-di-p-coumaroil)glucopiranosil]
naringenina (2) e 7-O-β-[(3”-p-coumaroil)glucopiranosil] naringenina (3) de duas outras
espécies Mabea caudata Peth. e Mabea fistulifera subsp. robusta e agora também de Mabea
fistulifera Mart. é significativo do ponto de vista quimiotaxonômico, podendo contribuir para
estudos de outras espécies do gênero Mabea.
O teste realizado para Artemia salina com a espécie em estudo mostrou que todos os
extratos etanólicos e as frações MF-CF e MF-BF foram ativos, sendo o extrato etanólico das
cascas do caule (MF-ECC) o mais ativo.
Os resultados para os testes antibacteriano e antifúngico demonstraram apenas uma
atividade considerada moderada para alguns extratos.
Apenas alguns extratos causaram mortalidade no teste moluscicida, porém não foram
considerados moluscicidas potencias, pois apenas os extratos brutos de plantas com
concentração abaixo de 100 ppm são considerados ativos.
107
O teste antioxidante mostrou que todos os extratos etanólicos totais e as frações
butanólica e acetato das folhas possuem atividade antioxidante considerável quando
comparados ao padrão BHT sendo a fração MF-AF a mais antioxidante, sendo assim esta
pode ser alvo para novos estudos, visando o isolamento de substâncias com potencial
antioxidante.
De todos os extratos testados somente o extrato MF-EPF reduziu significantemente o
volume do exsudato inflamatório e a migração de células no modelo de pleurisia induzida
pela carragenina no rato, sugerindo uma possível atividade antiinflamatória.
108
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Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
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