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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E
MATURAÇÃO OVOCITÁRIA IN VITRO EM BUBALINOS
E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE
REPRODUTIVA
LUCIANA DA SILVA LEAL
BOTUCATU - SP
MAIO, 2008
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1
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ESTUDO MORFOFISIOMÉTRICO DE OVÁRIOS E
MATURAÇÃO OVOCITÁRIA IN VITRO EM BUBALINOS
E BOVINOS NAS DIFERENTES FASES DA ATIVIDADE
REPRODUTIVA
LUCIANA DA SILVA LEAL
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Medicina Veterinária
para obtenção do Título de Doutor
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientadora: Profa. Dra. Eunice Oba
BOTUCATU - SP
MAIO, 2008
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2
COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA
Autora: Luciana da Silva Leal
Título: Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em
bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva
Data: 05/05/08
Nome Assinatura
Profa. Dra. Eunice Oba ________________________
Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga _______________________
Profa. Dra. Mayra Elena Ortiz D’Ávila Assumpção _______________________
Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda ________________________
Prof. Dr. Otávio Mitio Ohashi ________________________
3
A um poeta
Longe do estéril turbilhão da rua, Beneditino, escreve!
No aconchego do claustro, na paciência e no sossego,
Trabalha, e teima, e lima e sofre, e sua!
Mas que na forma se disfarce o emprego de esforço;
e a trama viva se construa de tal modo,
que a imagem fique nua,
rica mas sóbria, como um templo grego.
Não se mostre na fábrica o suplício do mestre.
E, natural, o efeito agrade,
sem lembrar os andaimes do edifício:
Porque a beleza, a gêmea da verdade,
arte pura, inimiga do artifício,
é a força e a graça na simplicidade.
Olavo Bilac
4
DEDICATÓRIA
A DEUS, por estar sempre cuidando de mim.
Aos meus amados pais, Fernando e Maria de Lourdes, e irmãs, Fernanda e
Debora, pelo apoio, dedicação, incentivo, confiança, respeito, torcida,
alegrias... A vocês dedico todo o esforço, tentativas e amor incondicional!!!
Às minhas avós, Josefina e Ermelinda (in memorian), aos meus avôs, Albertino
e Manuel (in memorian) e ao meu irmão, Fernando (in memorian), por iniciarem
a trajetória.
5
AGRADECIMENTOS
À minha família, por estar sempre presente nas vitórias e nas dificuldades e por
todo o amor dedicado.
À Profa. Titular Eunice Oba, pela orientação, oportunidade, incentivo e
colaboração constante na realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, pelo auxílio fundamental
nas análises ultra-estruturais, por permitir a utilização do laboratório e tempo
dedicado.
Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes, pelo apoio diário, respeito e amizade
sincera.
À Banca Examinadora (Professores Eunice, Fernanda, Mayra, Marcelo e
Ohashi), pelas ótimas sugestões e idéias para a melhoria da tese.
À Profa. Dra. Lídia Raquel de Carvalho, pela realização das análises
estatísticas.
À Carla F. Moya, Cláudia Barbosa Fernandes e Lílian Rigatto Martins, pela
amizade, generosidade e colaboração incomensurável para a execução deste
trabalho.
À Camila Dias Porto, pela amizade e processamento das amostras para as
análises histológicas.
À Maria Inês Lenz Souza, pela amizade, respeito e colaboração nas dosagens
hormonais.
6
Aos docentes e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e
Radiologia Veterinária, pelo convívio e dedicação diários.
Aos residentes, colegas de pós-graduação e de orientação, especialmente à
Tatiana, Liani e Daniela, pela ajuda nas rotinas.
À estagiária Camila Chavier, pela colaboração na execução do projeto.
Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de
Biociências, pelo processamento das amostras para avaliação ultra-estrutural.
À Profa. Dra. Kunie I. Rabello Coelho e ao funcionário Carlão, por permitirem a
utilização do microscópio eletrônico de transmissão no Departamento de
Patologia Humana da Faculdade de Medicina.
Aos funcionários da pós-graduação, pela presteza e cordialidade.
Aos funcionários do Setor de Transportes, pela disponibilidade e boas horas de
viagem.
Aos funcionários do Hospital Veterinário, pela presteza e convívio diário.
Aos funcionários dos frigoríficos Frigol, Better Beef e Frivale, pela colheita do
material.
Às queridas amigas Fernanda, Marcella, Márcia, Soraya e Tatiana da turma
XXXIII, pelo companheirismo.
Ao colega Ian Martin, pela idéia de classificar o corpo lúteo.
À bibliotecária Selma Maria de Jesus, pela elaboração da ficha catalográfica.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, pela formação pessoal e
profissional.
7
Ao Curso de Pós-graduação, pelo aprimoramento científico.
À CAPES, pela bolsa concedida e possibilidade de realização do doutorado.
À FAPESP e FUNDUNESP, pelos auxílios financeiros concedidos para a
execução desta pesquisa.
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Freqüência de búfalas e vacas gestantes e não gestantes segundo a
forma do ovário..................................................................................................64
Tabela 2. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas...........................................66
Tabela 3. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o período de gestação das búfalas.....................................................67
Tabela 4. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o período de gestação das vacas.......................................................68
Tabela 5. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo a espécie animal.................................................................................71
Tabela 6. Freqüência da presença de folículos em búfalas e vacas não
gestantes e nos períodos inicial, médio e final da gestação..............................73
Tabela 7. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos números de corpos lúteos (N
0
de CL) e
folículos ≥ 7/ 6 mm (N
0
de Fol ≥ 7/ 6 mm) segundo o estado reprodutivo das
búfalas e vacas..................................................................................................74
Tabela 8. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos números de corpos lúteos (N
0
de CL) e
folículos ≥ 7/ 6 mm (N
0
de Fol ≥ 7/ 6 mm) segundo o período de gestação das
búfalas e vacas..................................................................................................75
9
Tabela 9. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] referentes às presenças de corpo lúteo (CL)
e folículos ≥ 7/ 6 mm segundo a espécie animal...............................................76
Tabela 10. Freqüência da presença de corpo lúteo (CL) e a época do ano em
búfalas...............................................................................................................76
Tabela 11. Distribuição da freqüência de corpos lúteos (CL) segundo a
classificação em búfalas e vacas.......................................................................77
Tabela 12. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo
(µm) segundo a classificação do folículo ovariano para as búfalas...................84
Tabela 13. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo
segundo a classificação do folículo ovariano para as vacas.............................85
Tabela 14. Média e desvio-padrão do número de células foliculares ao redor do
ovócito segundo a classificação do folículo ovariano em búfalas e vacas........88
Tabela 15. Freqüência de folículos ovarianos de búfalas (n= 103) e vacas (n=
161) segundo a presença de vacúolos no ovócito.............................................89
Tabela 16. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a espécie animal.........................................................116
Tabela 17. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a época do ano em vacas...........................................117
Tabela 18. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo o período de gestação das búfalas.............................119
Tabela 19. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a presença do CL em búfalas.....................................120
10
Tabela 20. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e
TOT COR segundo a espécie animal..............................................................124
Tabela 21. Matriz de correlações de Spearman referentes às variáveis
analisadas (GI, GII, GIII, DESN, EXP, TOT RECUP, VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI
e TOT COR) nas vacas...................................................................................125
Tabela 22. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e
TOT COR segundo o estado reprodutivo das búfalas.....................................127
Tabela 23. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/NI e
TOT COR segundo o período de gestação das búfalas..................................127
Tabela 24. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e
vacas................................................................................................................131
Tabela 25. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo o período de gestação das
búfalas.............................................................................................................132
Tabela 26. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo a presença de corpo lúteo (CL) em
búfalas e vacas................................................................................................132
Tabela 27. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo a época do ano em búfalas e
vacas................................................................................................................135
Tabela 28. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de insulina
(µUI/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas..........................135
11
Tabela 29. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] concentração plasmática de insulina
(µUI/mL) segundo o período de gestação das búfalas e vacas.......................136
Tabela 30. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de
progesterona (P
4
) (ng/mL) em folículos < e ≥ 7/ 6 mm em búfalas e
vacas................................................................................................................138
Tabela 31. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de estradiol
(E
2
) (ng/mL) em folículos < e ≥ 7 mm em búfalas............................................139
Tabela 32. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de IGF-I
(ng/mL) em folículos < e ≥ 7 mm em búfalas...................................................140
Tabela 33. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis P
4
p, INSp, IGF-I Fol < 7/ 6
mm, IGF-I Fol ≥ 7/ 6 mm, P
4
Fol < 7/ 6 mm e P
4
Fol ≥ 7 /6 mm, segundo a
espécie animal.................................................................................................141
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Colheita do sangue no momento do abate.........................................53
Figura 2. Dissecção de um ovário com o auxílio de tesoura e pinça anatômica
para extrair os tecidos ao seu redor, permitindo melhor acurácia nas avaliações
realizadas...........................................................................................................54
Figura 3. Mensuração de um ovário com o auxílio de um paquímetro (a) e no
detalhe o paquímetro digital (b).........................................................................54
Figura 4. Corpos lúteos seccionados ao meio para classificação e
determinação do diâmetro médio utilizando-se paquímetro
digital..................................................................................................................55
Figura 5. Aspiração dos folículos antrais com auxílio de agulha 30 x 8 e seringa
de 10 mL............................................................................................................56
Figura 6. Gotas de meio de maturação identificadas com o número da fêmea,
contendo os CCOs em placa de Petri................................................................57
Figura 7. Microscópio invertido Leica equipado com epifluorescência utilizado
para a visualização dos ovócitos corados com Hoechst 33342........................58
Figura 8. Ovários seccionados e fixados em solução de formalina
10%....................................................................................................................60
Figura 9. Fragmentos de ovário em solução de glutaraldeído 2,5%.................61
Figura 10. Aparelho Gamma Count Cobra II para leitura de amostras por
procedimento de radioimuniensaio....................................................................62
13
Figura 11. Ovários bubalinos com formato redondo (a); alongado (b; esquerda)
e oval (b; direita)................................................................................................79
Figura 12. Ovário bubalino com corpo lúteo cavitário (a); ovário bovino com
corpo lúteo cavitário (b).....................................................................................79
Figura 13. Classificações dos corpos lúteos bubalino. CL I (a); CLII (b, c); CLIII
(d, e) e CL IV (f, g).............................................................................................80
Figura 14. Classificações dos corpos lúteos bovino. CL I (a); CLII (b, c, d); CLIII
(e, f)....................................................................................................................81
Figura 15. Micrografias de folículos ovarianos bubalinos: primordial (a; 400x);
primário (b; 400x); secundário em fase inicial (c; 400x); secundário em fase
tardia (d; 400x); antral com antro menos desenvolvido (e; 100x) e pré-ovulatório
(f; 50x). A: antro.................................................................................................91
Figura 16 Micrografias de folículos ovarianos bovinos: primordial (a; 400x); em
transição (b; 400x, setas indicam células pavimentosas); primário (c; 400x);
secundário (d; 400x); terciário (e; 400x); pré-ovulatório (f; 200x); complexo
cumulus oophorus (g; 400x); parede folicular de folículo pré-ovulatório (h;
200x). A: antro; CG: células da granulosa; CT: células tecais; N: núcleo; O:
ovócito; ZP: zona pelúcida.................................................................................92
Figura 17. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: espaço entre a
membrana plasmática do ovócito e da célula da granulosa, iniciando-se a
deposição de material da zona pelúcida, indicada pela seta (77.500x). CG:
célula da granulosa; O: ovócito..........................................................................98
Figura 18. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: presença de
microvilosidades entre o ovócito e a célula da granulosa (42.000x). As setas
indicam vesículas cobertas (coated vesicles). CG: célula da granulosa; O:
ovócito................................................................................................................99
14
Figura 19. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: organelas
distribuídas no citoplasma do ovócito (5.750x). CG: célula da granulosa; L:
lisossomo (vesícula digestória); N: núcleo; V: vesícula...................................100
Figura 20. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: prevalência de
mitocôndrias circulares no citoplasma do ovócito (23.000x). A seta indica uma
mitocôndria alongada. RE: retículo endoplasmático........................................101
Figura 21. Células da granulosa de folículo secundário bubalino (9.750x). A
mais escura apresenta abundância em RE. A mais clara apresenta menos RE
e mais mitocôndrias. C: centríolo; CGo: complexo de Golgi; M: mitocôndria; N:
núcleo; RE: retículo endoplasmático...............................................................102
Figura 22. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário. A seta indica
secreção de fluido (5.750x). MB: membrana basal.........................................103
Figura 23. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário: espaço entre
as células da granulosa (42.000x). As setas indicam gap junctions entre as
células da granulosa........................................................................................104
Figura 24. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: distribuição
das organelas no citoplasma (3.250x). CG: célula da granulosa; M: mitocôndria;
N: núcleo; Nu: nucléolo....................................................................................109
Figura 25. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: mitocôndrias
predominantemente de formato circular no citoplasma do ovócito (42.000x). A
seta indica coated vesicle (vesícula coberta). CG: célula da granulosa; GM:
grânulo mitocondrial; Mi: microvilosidades; O: ovócito; RE: retículo
endoplasmático................................................................................................110
Figura 26. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: núcleo do
ovócito (9.750x). As setas apontam os poros nucleares. CFE: centro fibrilar
externo; Nu: nucléolo.......................................................................................111
15
Figura 27. Eletromicrografia de folículo primário bovino: microvilos (12.000X) -
projeções do citoplasma do ovócito emitidas no citoplasma da célula da
granulosa. CG: célula da granulosa; L: lisossomo; M: mitocôndria; N: núcleo; O:
ovócito..............................................................................................................112
Figura 28. Eletromicrografia de folículo primário bovino: complexo juncional
(30.000x). A seta indica gap junctions. ZA: zona de
aderência.........................................................................................................113
Figura 29. Eletromicrografia de folículo primário bovino: mitocôndrias circulares
com grânulos (7.000x). A seta aponta uma mitocôndria em processo de divisão.
CG: célula da granulosa; L: lisossomo; O: ovócito; RE: retículo
endoplasmático................................................................................................114
Figura 30. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de búfalas
após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento
40x)..................................................................................................................129
Figura 31. Fotografia de ovócito de búfala (aumento 400x), no estágio de
Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido
equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e
emissão, respectivamente)..............................................................................129
Figura 32. Fotografia de zigoto bubalino partenoto (aumento 100x), visualizado
em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro
350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente)...................................130
Figura 33. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de vacas
após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento
40x)..................................................................................................................130
16
Figura 34. Fotografia de ovócito de vaca (aumento 400x), no estágio de
Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido
equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e
emissão, respectivamente)..............................................................................131
17
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
AI: anáfase I
BEN: balanço energético negativo
CCOs: complexos cumulus oophorus
CG: célula da granulosa
CGo: complexo de Golgi
CIV: cultivo in vitro
CL: corpo lúteo
DEG/ NI: degenerado/ não identificado
DESN: desnudo
DNA: ácido desoxirribonucléico
E
2
: estradiol
eCG: gonadotrofina coriônica eqüina
EGF: fator de crescimento epidermal
EXP: expandido
FF: fluido folicular
FIV: fertilização in vitro
FSH: hormônio folículo estimulante
GC: grânulos corticais
GH: hormônio de crescimento
GI: grau I
GII: grau II
GIII: grau III
GnRH: hormônio liberador de gonadotrofina
hCG: gonadotrofina coriônica humana
IA: inseminação artificial
IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I
Insp: insulina plasmática
LH: hormônio luteinizante
MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno
MI: metáfase I
MII: metáfase II
18
MIV: maturação in vitro
MOET: embryo transfer and multiple ovulation
µUI/mL: microunidades internacionais por mililitro
NaCl: cloreto de sódio
OD: ovário direito
OE: ovário esquerdo
P
4
: progesterona
P
4
p: progesterona plasmática
PBS: phosphate buffer saline
PIV: produção in vitro
PMSG: gonadotrofina sérica da égua prenhe
QVG: quebra da vesícula germinativa
REL: retículo endoplasmático liso
RER: retículo endoplasmático rugoso
RNA: ácido ribonucléico
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro
SFB: soro fetal bovino
TCM-199: Tissue Culture Medium-199
TE: transferência de embriões
TI: telófase I
TOT COR: número total de ovócitos corados
TOT RECUP: número total de ovócitos recuperados
UI: unidade internacional
VG: vesícula germinativa
19
SUMÁRIO
RESUMO...........................................................................................................21
ABSTRACT........................................................................................................23
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................25
2. REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................27
2.1. O Ovário...............................................................................................27
2.2. Ovogênese e Foliculogênese...............................................................29
2.3. Reinício da Meiose...............................................................................30
2.4. Folículos Ovarianos.............................................................................32
2.5. O Corpo Lúteo (CL)..............................................................................36
2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina...............................37
2.7. Características Reprodutivas da Fêmea Bovina..................................39
2.8. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)......................................................41
2.9. Hormônios e IGF-I no Líquido Folicular...............................................48
2.10. Insulina Plasmática............................................................................49
3. HIPÓTESE.....................................................................................................50
4. OBJETIVOS...................................................................................................51
5. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................52
5.1. Colheita do Sangue..............................................................................52
5.2. Colheita e Avaliação Morfométrica dos Ovários..................................53
5.3. Recuperação e Seleção dos Ovócitos.................................................56
5.4. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)......................................................57
5.4.1. Avaliação da Maturação Nuclear..................................................57
5.5. Processamento Histológico dos Ovários para Microscopia de
Luz.....................................................................................................................59
20
5.6. Processamento dos Ovários para Microscopia Eletrônica de
Transmissão......................................................................................................60
5.7. Dosagens Hormonais...........................................................................61
5.7.1. Plasma..........................................................................................61
5.7.2. Fluido Folicular..............................................................................61
5.8. Metodologia Estatística...............................................................................62
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................64
6.1. Morfometria do Ovário.........................................................................64
6.2. Morfometria dos Folículos Ovarianos..................................................82
6.3. Características Ultra-estruturais dos Folículos Ovarianos...................93
6.3.1. Búfalas..........................................................................................93
6.3.2. Vacas..........................................................................................104
6.4. Recuperação e Qualidade do Ovócito...............................................114
6.5. Maturação Nuclear Ovocitária in vitro................................................122
6.6. Concentração Plasmática de Progesterona e Insulina......................131
6.6.1 Concentração Plasmática de Progesterona.................................131
6.6.2. Concentração Plasmática de Insulina.........................................135
6.7. Concentração Intrafolicular de Progesterona, Estradiol e IGF-I........138
7. CONCLUSÕES............................................................................................142
8. BIBLIOGRAFIA............................................................................................145
ANEXO I..........................................................................................................179
21
RESUMO
LEAL, L.S. Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in
vitro em bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade
reprodutiva. [Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of
oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and bovine].
2008. 179f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração:
Reprodução Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2008.
Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos
biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária
in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção
e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a
morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos
folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade
ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de
progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides
(estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas.
Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não
gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em
abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina
acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram
mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação
ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados
por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199
suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH,
estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de
38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO
2
em ar. Para as técnicas de
histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados
10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de
progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido
folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-
se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se que os diâmetros dos
folículos e dos ovócitos aumentaram conforme o desenvolvimento folicular. A
caracterização ultra-estrutural dos folículos ovarianos de búfalas e vacas
22
mostrou um aparato celular especializado para a metabolização de substratos,
produção de energia e síntese de hormônios esteróides. Além disso, foram
identificadas microvilosidades e junções específicas entre o ovócito e as
células da granulosa. Nas búfalas, a gestação influenciou negativamente o
número de folículos ovarianos superficiais, a recuperação ovocitária e a taxa de
ovócitos que estavam em estágio de metáfase II. Em ambas espécies (bubalina
e bovina), a concentração plasmática de progesterona foi maior (p< 0,001) nas
fêmeas gestantes (4,7 ± 2,1 e 8,5 ± 2,8 ng/mL, respectivamente) do que nas
não gestantes (2,4 ± 2,6 e 3,6 ± 3,5 ng/mL, respectivamente). A concentração
de insulina foi superior nas fêmeas não gestantes do que nas gestantes (4,2 ±
5,5 e 2,1 ± 1,3 µUI/mL, búfalas; p= 0,016) e (5,9 ± 5,8 e 3,4 ± 2,8 µUI/mL,
vacas; p= 0,028) Os fluidos dos folículos < 7 mm (búfalas) e < 6 mm (vacas)
apresentaram maior concentração de progesterona (207,6 ± 194,5 e 239,8 ±
133,7 ng/mL, respectivamente) e menor nível de IGF-I (187,7 ± 153,6 e 80,7 ±
98,0 ng/mL, respectivamente) comparados aos folículos ≥ 7 mm (búfalas) (76,3
± 171,1 ng/mL de P
4
e 290,4 ± 177,7 ng/mL de IGF-I) e ≥ 6 mm (vacas) (104 ±
120,1 ng/mL de P
4
e 165,6 ± 166,5 ng/mL de IGF-I). Comparando as espécies,
o tamanho e o peso dos ovários foram menores (p< 0,001) para as búfalas
(24,4 x 17,1 x 13,1 mm e 4,0 g/ comprimento, largura, altura e peso,
respectivamente) do que para as vacas (30,9 x 21,7 x 15,4 mm e 7,7 g/
comprimento, largura, altura e peso, respectivamente). Nas búfalas, os índices
de recuperação de todas as categorias de CCOs (grau 1: 25,9%; grau 2:
30,7%; grau 3: 10,2%; desnudos: 18,6 e expandidos: 14,6%) foram inferiores
aos obtidos para as vacas (31,8; 30,6; 15,4; 4,5 e 17,7%, respectivamente). A
porcentagem de ovócitos que atingiu o estágio de metáfase II também foi
menor nas búfalas (63,4%; 242/396) do que nas vacas (67,8%, 696/1234).
Foram observadas diferenças em todas as análises realizadas, indicando que
cada espécie possui características fisiológicas próprias.
Palavras-chave: Búfalas, Hormônios, Maturação in vitro, Ovário, Ovócito,
Vacas.
23
ABSTRACT
LEAL, L.S. Morphophysiometric study of ovaries and in vitro maturation of
oocytes during different phases of reproductive activity in bubaline and
bovine. [Estudo morfofisiométrico de ovários e maturação ovocitária in vitro em
bubalinos e bovinos nas diferentes fases da atividade reprodutiva]. 2008. 179f.
Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de concentração: Reprodução
Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 2008.
Researchers around the world have investigated the function of biological
factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro
maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of
embryo production and manipulation. The aim of the present study was to
evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of
ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and
in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations;
progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine
species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non
pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at
slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline
solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian
dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro
maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by
follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10%
fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and
cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas
atmosphere of 5% CO
2
in humidified air for 22-24 hours. For classical histology
and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species
respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I
concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of
radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the
diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development.
Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed
a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, energy production
and hormone synthesis. Furthermore, microvillis and specific junctions were
24
identified between granulosa cells and oocyte. In buffaloes, the pregnancy
affected negativelly the number of ovarian follicles from surface, oocyte
recovered and oocytes that were in metaphase II stage. In both species
(bubaline vs. bovine), plasma progesterone concentration was higher (p<
0.001) for pregnant (4.7 ± 2.1, n= 33 and 8.5 ± 2.8 ng/mL, n= 36, respectively)
than for non pregnant females (2.4 ± 2.6, n= 51 and 3.6 ± 3.5 ng/mL, n= 59,
respectively). Insulin concentration was higher for non pregnant than pregnant
animals (4.2 ± 5.5 e 2.1 ± 1.3 µUI/mL for buffaloes; p= 0.016) and (5.9 ± 5.8
and 3.4 ± 2.8 µUI/mL for cows; p= 0,028) The fluid from follicles < 7 mm
(buffaloes) and < 6 mm (cows) had more progesterone concentration (207.6 ±
194.5 and 239.8 ± 133.7 ng/mL, respectively) and less IGF-I (187.7 ± 153.6 and
80.7 ± 98.0 ng/mL, respectively) when compared with follicles ≥ 7 mm
(buffaloes) (76.3 ± 171.1 ng/mL - P
4
and 290.4 ± 177.7 ng/mL - IGF-I) and ≥ 6
mm (cows) (104.0 ± 120,1 ng/mL - P
4
and 165.6 ± 166.5 ng/mL - IGF-I). Among
the species, dimensions and weigth of ovaries were lower (p< 0.001) for
buffaloes (24.4 x 17.1 x 13.1 mm and 4.0 g to length, width, thickness and
weight, respectively) than cows (30.9 x 21.7 x 15.4 mm and 7.7 g to length,
width, thickness and weight, respectively). In the buffaloes, the recovery rates of
each COCs categories (grade 1: 25.9%; grade 2: 30.7%; grade 3: 10.2%;
denuded: 18.6% and expanded: 14.6%) were lower than cows (31.8; 30.6; 15.4;
4.5 and 17.7%, respectively). The percentage of bubaline oocytes that reached
metaphase II (63.4%; 242/396) was lower than bovine oocytes (67.8%,
696/1234). Differences were observed in all analysis, indicating that each
species has its own physiological characteristics.
Keywords: Buffaloes, Hormones, In vitro maturation, Ovary, Oocyte, Cows.
25
1. INTRODUÇÃO
A criação de búfalos tem despertado interesse crescente dos pecuaristas
por sua comprovada rusticidade, produtividade de carne e leite e poder de
tração. O rebanho mundial bubalino é de aproximadamente 174 milhões de
animais e apresentou, nos últimos dez anos, um crescimento de 9,1% e um
incremento de 70,6% na produção leiteira (FAO, 2005). O maior rebanho
bubalino da América Latina encontra-se no Brasil, fato que pode fazer do país
um grande exportador de material genético (OHASHI et al., 2003).
O búfalo possui fácil adaptabilidade às condições brasileiras e é
caracterizado por apresentar boa eficiência reprodutiva e crescimento ponderal
(BARUSELLI & CARVALHO, 2002).
A aplicação de biotécnicas da reprodução é importante em fêmeas
bubalinas porque estes animais apresentam características reprodutivas
particulares, tais como: expressão discreta do comportamento de estro e
períodos longos de anestro pós-parto e intervalo entre partos, principalmente
quando submetidos a uma dieta inadequada (MISHRA et al., 2008). O fato
desta espécie apresentar índices reprodutivos inferiores aos bovinos está
relacionado com manejo deficiente e/ou seleção inadequada, além do
conhecimento não absoluto acerca da sua fisiologia (VALE & RIBEIRO, 2005).
Em bubalinos, uma fertilidade reduzida é observada com a aplicação de
algumas biotecnologias sendo provavelmente decorrente de um menor número
de folículos primordiais no ovário, pouca responsividade à estimulação
hormonal, baixa recuperação de embriões e menor taxa de prenhez quando
comparados aos bovinos (NEGLIA et al., 2003).
No entanto, Baruselli et al. (1999) verificaram por exames ultra-
sonográficos, que as búfalas apresentam resposta positiva ao tratamento
superovulatório. Porém, a taxa de recuperação embrionária não é compatível à
resposta ovariana. Devido à baixa eficiência de programas de ovulação múltipla
e transferência de embriões (MOET) nesta espécie, há um grande interesse na
produção in vitro de embriões para a rápida propagação do germoplasma
superior, conservação de animais ameaçados de extinção e manipulação de
26
constituintes genéticos (DATTA & GOSWAMI, 1998; GASPARRINI, 2002;
OHASHI et al., 2002).
O Brasil desempenha um papel importante na bovinocultura mundial
porque é o maior criador comercial. Segundo os últimos dados do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o rebanho nacional bovino era de
aproximadamente 207 milhões de animais em 2005.
Embora a transferência de embriões (TE) em bovinos seja rotineiramente
empregada, a técnica apresenta variabilidade na resposta ovariana das
doadoras ao estímulo hormonal e no número de estruturas viáveis
recuperadas, além do mais, caracteriza-se pela estagnação nos resultados
alcançados.
Os procedimentos de punção folicular e produção in vitro de embriões
representam método alternativo ou complementar à TE, proporcionando a
multiplicação de genótipos desejáveis, além de serem aplicados em fêmeas
portadoras de transtornos reprodutivos adquiridos. No Brasil, essa associação
tem sido empregada comercialmente com sucesso nos últimos anos, fazendo
com que o país contribua com quase 50% do número total de embriões
produzidos em laboratório no mundo (VIANA, 2003).
No entanto, a referida técnica apresenta custo elevado e entraves que
precisam ser solucionados, tais como: resultados ainda não satisfatórios de
produção de estruturas viáveis para transferência, dificuldade na
criopreservação dos embriões, aumento na incidência de abortamentos,
gestação nitidamente prolongada, anormalidades congênitas e maior
mortalidade perinatal (GARCIA et al., 2003).
O conhecimento de como diferentes componentes do sistema in vitro
influenciam o desenvolvimento embrionário, fetal e placentário poderá resultar
em método de cultivo mais confiável no sentido de produzir bezerros normais
(PRESTES, 2005).
Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e
eventos biológicos envolvidos no processo de maturação nuclear e
citoplasmática de ovócitos de diferentes espécies animais, pois o sucesso de
tecnologias que visam a produção, manipulação e criopreservação de embriões
depende da quantidade e, principalmente, qualidade de ovócitos no início do
procedimento.
27
Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal estudar a
fisiologia, morfologia e biometria dos ovários e folículos ovarianos, assim como
a maturação ovocitária in vitro nas espécies bubalina e bovina, em diferentes
fases da atividade reprodutiva.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O Ovário
Os ovários de ruminantes são órgãos pares localizados no terço médio das
superfícies laterais da entrada da pelve, suspensos pelo mesovário, na porção
cranial do ligamento largo, conectados ao útero pelo ligamento ovárico e ao
peritôneo parietal pelo ligamento suspensor do ovário (NUNEZ, 1993).
O ovário de búfala é ovóide e consideravelmente menor do que o da vaca
(DYCE et al., 1996). Em búfalas adultas, Fadle et al. (1974) e Vale et al. (1982)
descreveram medidas para o ovário direito (OD) de 24,0 e 25,4 mm
(comprimento), 16,5 e 14,5 mm (largura) e 12,5 e 15,7 mm (espessura) e para
o ovário esquerdo (OE) de 22,0 e 24,7 mm (comprimento), 15,5 e 14,1 mm
(largura) e 14,0 e 14,8 mm (espessura), respectivamente. Em novilhas, Danell
(1987) registrou para o OD 22,8 mm (comprimento), 18,2 mm (largura) e 14,2
mm (espessura) e OE 22,7 mm (comprimento), 16,6 mm (largura) e 13,8 mm
(espessura). Parkale & Hukeri (1989), com base em 128 pares de ovários,
encontraram as seguintes médias: 24,8 mm de comprimento, 16,7 mm de
largura e 14,6 mm de espessura (OE); e 24,4 mm de comprimento, 17,4 mm de
largura e 14,6 mm de espessura (OD). Para Vale & Ribeiro (2005), os ovários
apresentaram em média, comprimento de 25 a 30 mm e largura de 14 mm.
Alvarez & Oba (1995) avaliaram a biometria ovariana de 18 búfalas
superovuladas com FSH-p e PMSG (gonadotrofina sérica da égua prenhe). O
comprimento e largura dos ovários foram respectivamente 30 e 33 mm (FSH;
OE); 29 e 42 mm (PMSG; OE); 33 e 23 mm (FSH; OD) e 42 e 29 mm (PMSG;
OD).
De acordo com relatos na literatura, o peso mínimo e máximo do ovário de
búfalas é de 2,9 e 6,1 g, respectivamente (EL-WISHY et al., 1971), e médio de
28
4,6 g (VALE & RIBEIRO, 2005). Danell (1987) observou peso médio de 3,44 ±
1,29 g (OE) e 3,59 ± 1,54 g (OD) em 30 novilhas bubalinas cíclicas avaliadas.
Nos bovinos, os ovários são geralmente ovais a aplanados lateralmente,
medindo em média de 30 a 45 mm de comprimento; 15 a 20 mm de largura e
20 a 28 mm de “profundidade” (SISSON & GROSSMAN, 1981). De acordo com
Sisson (1986), o peso dos ovários de vacas adultas varia de 15 a 20 g.
Em experimento realizado por Nascimento et al. (2003), os tamanhos dos
ovários para vacas apresentando atividade ovariana luteal cíclica e vacas
gestantes foram de 30,8 ± 0,7 (OD) e 30,2 ± 0,9 mm (OE); 33,0 ± 0,7 (OD) e
31,9 ± 0,8 mm (OE), respectivamente.
Chacur et al. (2006) descreveram valores médios de 27,5; 19,5 e 16,5 mm
(OD) e 28,0; 18,3 e 15,6 mm (OE) para comprimento, largura e espessura,
respectivamente, quando avaliaram ovários de vacas zebus não gestantes,
recuperados em matadouro.
Danell (1987) detectou a presença de CL em 51,2% dos ovários esquerdos
e 48,8% dos ovários direitos, revelando que a distribuição da ovulação é similar
entre as gônadas. Entretanto, para vacas, ampla literatura descreve que a
localização do CL é mais freqüente no ovário direito (HASLER et al., 1987;
JAINUDEEN & HAFEZ, 1995; DEMCZUK et al., 1998; VIANA et al., 1999;
SPELL et al., 2001; LEAL, 2004).
Sabe-se que as búfalas apresentam menor número de folículos primordiais
e maior taxa de atresia folicular do que as vacas (DANELL, 1987; LE VAN TY
et al., 1989). Danell (1987) encontrou 12.636 e 10.132 folículos primordiais em
novilhas bubalinas cíclicas e não cíclicas; número muito inferior ao previamente
reportado para vacas (150.000) (ERICKSON, 1966). Os resultados de Carvalho
(2005) evidenciaram um número médio de 15.449 folículos pré-antrais
morfologicamente normais/ ovário em búfalas impúberes, adultas gestantes e
não gestantes. Em revisão realizada por Vale & Ribeiro (2005), os autores
descreveram 60 a 100 mil folículos primordiais para vacas (Bos taurus taurus) e
apenas 12 a 20 mil folículos primordiais para búfalas. Porém existem na
literatura registros de 235 mil (BETTERIDGE et al., 1989) e 720 mil
(ERICKSON, 1986) folículos primordiais para vacas. Settergren (1964)
constatou taxa de atresia de 50% nos folículos de vacas, inferior à encontrada
por Danell (1987) (70,6%).
29
Além do mais, os ovários bubalinos também contém menor número de
folículos antrais do que ovários bovinos (46,3 vs. 90 folículos ≥1mm por par de
ovários) (SETTERGREN, 1964; DANELL, 1987; KUMAR et al., 1997; PALTA &
CHAUHAN, 1998; GUPTA et al., 2001).
2.2. Ovogênese e Foliculogênese
Na fêmea, a gametogênese é o resultado da associação de dois
fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a ovogênese e a foliculogênese
(revisado por CARVALHO, 2005).
A ovogênese é definida como o processo de formação, crescimento e
maturação do gameta feminino, que tem início na vida fetal e culmina anos
depois, pouco antes da ovulação, no animal adulto (WASSARMAN &
ALBERTINI, 1994).
As células germinativas primordiais, originárias no saco vitelínico, migram
para a crista genital e proliferam-se por mitose. Completada a proliferação
mitótica, após o crescimento celular e redistribuição das organelas
citoplasmáticas, as células germinativas primordiais passam a ser
denominadas ovogônias (BAKER, 1971).
Nos bovinos, as ovogônias também se dividem repetidas vezes por mitose
(HILSCHER et al., 1974) e, em torno de 72 a 82 dias de gestação, algumas já
iniciaram a primeira prófase meiótica e, então, passam a ser designadas
ovócitos primários (ERICKSON, 1966; HILSHER et al., 1974).
O processo de formação dos gametas resulta da divisão de uma célula
germinativa diplóide (2n) em células haplóides (n), ou seja, células que
recebem apenas um cromossomo de cada par de homólogos e que
apresentam, então, só a metade do número de cromossomos encontrada nas
células somáticas da espécie. Para que ocorra a redução do número
cromossômico é necessário que aconteça duas divisões celulares sucessivas,
as quais são chamadas de meiose I e II, após uma única duplicação do DNA,
que ocorre no período S anterior à primeira divisão meiótica (JORDÃO &
ANDRADE, 2000).
30
A prófase meiótica é caracterizada pela sua longa duração sendo dividida
em: leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno (RÜSSE, 1983; JORDÃO &
ANDRADE, 2000). Neste último estágio, também chamado de núcleo dictiado,
os ovócitos permanecem em repouso até pouco antes da ovulação, quando se
reinicia a meiose em resposta à estimulação hormonal (BUCCIONE et al.,
1990). Esses ovócitos não possuem a habilidade de reassumir a meiose ou de
serem fertilizados, permanecendo os seus núcleos em um estágio de
imaturidade conhecido como vesícula germinativa (VG) (LANDIM-
ALVARENGA, 2006). Ainda nesta fase, os ovócitos primários são circundados
pelas células foliculares, formando assim, os folículos primordiais,
caracterizando, desta forma, o início da foliculogênese (RÜSSE, 1983).
A foliculogênese é definida como o processo de formação, crescimento e
maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e
finalizando-se com o estágio de folículo maduro ou pré-ovulatório
(SAUMANDE, 1981; PICTON, 2001). Em ruminantes, a foliculogênese tem
início ainda durante a vida fetal (RÜSSE, 1983).
Antes da formação do folículo, ocorre a colonização do ovário fetal por
células mesonéfricas, que são fontes precursoras de células foliculares
(PICTON, 2001). As células somáticas que acompanham a trajetória das
células germinativas até a crista genital, circundam o gameta formando uma
membrana basal deixando-o isolado. Tais células estão destinadas a tornarem-
se células da granulosa, da teca e do estroma ovariano (ERICKSON, 1986). A
interação entre as células da granulosa e o gameta é de fundamental
importância para o desenvolvimento do ovócito, sendo que as trocas
metabólicas entre esses dois tipos celulares ocorrem por meio de zonas de
aderência e complexos intercomunicantes (EPPIG& SHROEDER, 1989).
2.3. Reinício da Meiose
Os ovócitos devem crescer e sofrer várias mudanças ultra-estruturais e
bioquímicas, tornando-se competentes para reiniciar e completar a maturação
meiótica (DEKEL, 1996).
31
O bloqueio da meiose é regulado em dois pontos: no estágio de diplóteno
da primeira divisão meiótica, no qual os ovócitos se detêm por longos períodos
de tempo, até o reinício do crescimento ovocitário, e no estágio de metáfase II,
no qual permanecem até a fecundação (JORDÃO & ANDRADE, 2000). Na
maioria dos vertebrados, o reinício da meiose é mediado pela interação entre
receptores de membrana das células do cumulus e o LH (hormônio
luteinizante). Esse sinal hormonal ativa o MPF (fator promotor de maturação)
que induz a condensação cromossômica, ruptura do envoltório nuclear e
formação do primeiro fuso meiótico (MURRAY, 1989; VERLHAC et al., 1994;
JORDÃO & ANDRADE, 2000).
O MPF é um complexo protéico dimérico, composto por duas subunidades-
chave: a p34
cdc2
e a ciclina. A p34
cdc2
é a subunidade enzimática com atividade
de proteína quinase, e a ciclina é uma proteína regulatória que controla a
capacidade da cdc2 em fosforilar proteínas-alvo adequadas (VERLHAC et al.,
1994; JORDÃO & ANDRADE, 2000; NURSE, 2000).
Em mamíferos há evidências de que outros agentes, como as enzimas da
família MAP quinase (proteína quinase mitógeno ativada) e fatores de
crescimento também estão envolvidos nos eventos que ocorrem durante a
maturação do ovócito e expansão das células do cumulus (NURSE, 1990;
VERLHAC, et al., 1994; FISSORE et al., 1996).
A maturação nuclear completa ocorre com a ativação do ovócito em
estágio de VG, incluindo o rompimento da VG até a segunda parada meiótica
em metáfase II (MII). Os ovócitos passam pelos estágios de diaquinese,
metáfase I (MI), anáfase I (AI), telófase I (TI) e então rapidamente passam para
MII. Como resultados dessas mudanças, os cromossomos homólogos se
separam com a formação do primeiro corpúsculo polar. Esse corpúsculo polar
contém uma pequena parte de citoplasma e a metade dos cromossomos
homólogos. Logo após, os cromossomos do ovócito ingressam na segunda
divisão da meiose formando-se a placa metafásica II. Neste momento, o
ovócito é conhecido por ovócito secundário e pára novamente a divisão celular,
permanecendo neste estágio (MII) até ser fertilizado pelo espermatozóide ou
sofrer atresia (WASSARMAN, 1988; WU et al., 1997; LANDIM-ALVARENGA,
2006). O tempo requerido para a maturação nuclear varia dependendo da
espécie. No bovino, a QVG (quebra da vesícula germinativa) ocorre de 8 a 12
32
horas, a MI de 12 a 15 horas, a AI e a TI de 15 a 18 horas e a MII de 18 a 22
horas (SIRARD et al., 1989; WU et al., 1997).
As diversas mudanças que ocorrem no citoplasma durante o
desenvolvimento e maturação dos ovócitos são essenciais para a capacidade
de desenvolvimento, aquisição da competência meiótica, fertilização e
desenvolvimento embrionário. Os ovócitos com maturação nuclear normal, em
tempo regular, mas que possuem uma assincronia entre maturação
citoplasmática e nuclear, não serão fecundados ou não irão redundar em um
desenvolvimento embrionário (BEVERS et al., 1997; BLONDIN et al., 1997;
HYTTEL et al., 1997).
2.4. Folículos Ovarianos
O folículo ovariano é considerado a unidade funcional da gônada feminina
(ARIYARATNA & GUNAWARDANA, 1997). Além disso, é uma estrutura
altamente organizada, constituída essencialmente pelo ovócito circundado por
células foliculares e demarcado por uma membrana basal que os separa do
estroma ovariano (LANDIM-ALVARENGA, 2006).
2.4.1. Função dos Folículos Ovarianos
O folículo ovariano apresenta duas funções principais: proporcionar um
ambiente ideal para o crescimento e maturação do ovócito e produzir
hormônios esteróides, como o estrógeno e o estradiol e peptídeos, como
inibina A e B, ativina e folistatina (GORDON, 1994a; LANDIM-ALVARENGA,
2006).
2.4.2. Classificação dos Folículos Ovarianos
De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser divididos em:
folículos pré-antrais ou não cavitários (não possuem antro; primordiais,
primários e secundários) e folículos antrais ou cavitários (possuem a cavidade
antral no seu interior, repleta de líquido folicular; terciários e pré-ovulatórios)
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2005).
33
• Folículos primordiais: são os primeiros folículos formados no ovário e
encontram-se em estágio de quiescência. Consistem em um ovócito
primário centralizado, circundado por uma única camada de células da
granulosa de forma pavimentosa e demarcado por uma membrana basal
(ERICKSON, 1986; EPPIG, 1991; HIRSHFIELD, 1991; FORTUNE,
1994; EPPIG & O’BRIEN, 1996; LANDIM-ALVARENGA, 2006);
• Folículos primários: representam o primeiro estágio de crescimento
folicular. Caracterizam-se pela presença de um ovócito centralizado,
circundado por uma camada de células da granulosa de forma cúbica
(HULSHOF et al., 1994; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Nesse tipo de
folículo, as células da granulosa aumentam em número e tornam-se
mais volumosas (VAN DEN HURK et al., 1997);
• Folículos secundários: caracterizam-se pela presença de um ovócito
centralizado, circundado por duas ou mais camadas de células da
granulosa de forma cúbica (HULSHOF et al., 1994; LANDIM-
ALVARENGA, 2006). Nos folículos secundários, em estágios mais
avançados, as fibras de tecido conjuntivo se organizam paralelamente à
membrana basal para formar a camada de células tecais (VAN DEN
HURK et al., 1997), podendo então ser identificadas células tecais
diferenciadas, bem como uma membrana hialinizada, denominada zona
pelúcida (FIGUEIREDO, 1995);
• Folículos terciários: consistem em um ovócito circundado pela zona
pelúcida, corona radiata e células do cumulus. Possuem ainda células
foliculares, uma pequena cavidade contendo líquido folicular (antro),
uma membrana basal e duas camadas de células tecais (FIGUEIREDO,
1995; LANDIM-ALVARENGA, 2006);
• Folículos pré-ovulatórios (cuja nomenclatura antiga era De Graaf):
representam o estágio final de desenvolvimento folicular e apresentam
um ovócito secundário e todos os componentes dos folículos terciários
(revisado por LANDIM-ALVARENGA, 2006).
34
2.4.3. Morfologia e Ultra-estrutura dos Folículos Ovarianos
Os folículos primordiais têm cerca de 40 µm (vacas) e 35 µm (búfalas) e
apresentam um ovócito (20 µm, na maioria das espécies) rodeado por uma
camada de 4 a 8 células achatadas da granulosa. O ovócito pode apresentar
um formato que varia de esférico a ovóide (HULSHOF et al., 1992; VAN
WEZEL & RODGERS, 1996; FAIR et al., 1997a; PRIEDKALNS & LEISER,
1998; PICTON, 2001; MONDADORI et al., 2007). No ooplasma, visualizam-se
numerosas vesículas com distribuição homogênea, que apresentam
membrana, mitocôndrias, associadas ou não aos retículos endoplasmáticos liso
(REL) e rugoso (RER). Em pequeno número observam-se complexos de Golgi
(CGo) e gotas lipídicas (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al., 1997).
Os folículos primários apresentam diâmetro de 60 a 100 µm (vacas) e 25 a
80 µm (búfalas) e o ovócito é rodeado por uma camada completa de 11 a 20
células da granulosa de forma cubóide. O ovócito é geralmente esférico e
apresenta abundância de mitocôndrias de forma alongada e em divisão e
aumento nos números de REL e RER, refletindo o crescimento dos
requerimentos de energia e de síntese de lipídios e proteínas pelo ovócito.
Complexos de Golgi e polirribossomos também estão presentes (FAIR et al.,
1997a; HYTTEL et al., 1997; KUMAR et al., 1997).
Nos folículos primordial e primário, as comunicações entre as células da
granulosa e o ovócito são mediadas por endocitose (HYTTEL et al., 1997).
As principais modificações observadas durante a fase de desenvolvimento
do ovócito são: formação das junções intercomunicantes entre o ovócito e as
células somáticas circundantes; desenvolvimento e deslocamento do CGo,
REL e das gotas lipídicas para a periferia do ovócito; formação dos grânulos
corticais (GC) e zona pelúcida; diferenciação da mitocôndria; quebra dos
centríolos e deposição ou síntese dos RNAm maternos para a produção de
proteína do ovócito, das células somáticas e mais tarde para o
desenvolvimento (FAIR et al., 1996; HYTTEL et al., 1997).
A progressão para o estágio de folículo secundário é marcada pelo
surgimento de uma segunda camada de células da granulosa e pela deposição
inicial de material da zona pelúcida em torno do ovócito de 50 a 60 µm de
diâmetro (vacas) (DRIANCOURT, 1991; HYTTEL et al., 1997). Ao mesmo
tempo, os grânulos corticais são formados no ooplasma (FAIR et al., 1997a). É
35
neste ponto do desenvolvimento que o folículo parece tornar-se responsivo ao
FSH (hormônio folículo estimulante) (FAIR, 2003). Quando duas a três
camadas de células da granulosa são formadas, é possível a identificação de
células tecais em torno da membrana basal (SCARAMUZZI et al., 1993). O
estágio de folículo secundário é também associado aos primeiros sinais
detectáveis de síntese de RNA (ácido ribonucléico) no ovócito (FAIR et al.,
1997b).
Um aspecto importante durante o crescimento do ovócito é seu alto grau
de atividade transcricional. O acúmulo de RNAm (ácido ribonucléico
mensageiro), ribossomos e polipeptídeos no ovócito, durante a fase de
crescimento, é crucial para o desenvolvimento posterior. Os ovócitos bovinos
que não estão completamente desenvolvidos no momento da fertilização in
vitro falham em alcançar o estágio de blastocisto (FAIR & HYTTEL, 1997).
Em búfalas, Kumar et al. (1997) relataram diâmetros médios de 20 a 30 µm
(ovócito); 50 a 100 µm (folículo); 30 a 60 µm (ovócito) e 100 a 300 µm (folículo)
para folículos secundários e terciários, respectivamente.
A transição para o estágio de folículo terciário é caracterizada pela
continuada proliferação e diferenciação das células foliculares em células da
teca interna e externa, lâmina basal, células do cumulus e a formação de fluido
na cavidade antral (DRIANCOURT, 1991). Em bovinos, o aparecimento do
antro ocorre em folículos com 120 a 160 µm de diâmetro (MONNIAUX et al.,
1993). No momento da formação da teca interna é possível detectar a
expressão de RNAm para receptor de LH nas células tecais (XU et al., 1995).
À medida que o folículo cresce e o antro é formado, as células da
granulosa se separam em dois subtipos: células do cumulus que são íntima e
metabolicamente ligadas ao ovócito e células murais, que formam a parede do
folículo (GILCHRIST et al., 2004). Em folículos terciários mais desenvolvidos,
as células da granulosa imediatamente ao redor do ovócito, tornam-se
colunares e radialmente dispostas, formando a corona radiata (PRIEDKALNS &
LEISER, 1998). As células da granulosa têm características estruturais de
células secretoras de proteínas, notavelmente um extensivo RER
(PRIEDKALNS & LEISER, 1998).
As células do cumulus são altamente especializadas e têm projeções
celulares que atravessam a zona pelúcida e formam pequenas junções com o
36
citoplasma do ovócito (gap junctions) (RODRIGUEZ & FARIN, 2004). A
comunicação entre as células do cumulus e o ovócito é bidirecional e, além das
junções gap, é mediada por sinais parácrinos (GANDOLFI et al., 2005).
As gap junctions são compostas por proteínas conhecidas como conexinas
e se localizam entre as células da granulosa e entre estas e as superfícies de
membrana do ovócito e das células da granulosa que o circundam. Essas
junções intercomunicantes permitem a transferência direta para o ovócito de
moléculas de baixo peso molecular, tais como: íons, metabólitos da glicose,
nucleotídeos e aminoácidos necessários para o seu crescimento, assim como
pequenas moléculas reguladoras como o AMPc (EPPIG, 1991; GANDOLFI et
al., 2005). As moléculas maiores também são transferidas por essas junções,
mas de forma indireta, ou seja, após se ligarem a seus receptores celulares
(DODE, 2006). Após o pico de LH há uma evidente diminuição do fluxo de
substâncias e ocorrem mudanças morfológicas nas gap junctions. A maturação
do ovócito parece estar correlacionada negativamente com o número de gap
junctions por células (LARSEN et al., 1986).
Durante a maturação, o nucléolo se compacta, sugerindo a diminuição da
atividade transcricional. Do mesmo modo, ocorrem mudanças na organização
do citoplasma tais como: um contínuo desenvolvimento dos estoques de
lipídios, redução do aparelho de Golgi, redistribuição de ribossomos, rearranjo
das mitocôndrias e alinhamento dos GC próximo à membrana plasmática
(HYTTEL et al., 1997). Antes da ovulação, as células da granulosa assumem
características secretoras de esteróides e são encontrados, especialmente,
RER e mitocôndrias com crista tubular (PRIEDKALNS & LEISER, 1998).
2.5. O Corpo Lúteo (CL)
Segundo Fields & Fields (1996) o CL é formado a partir da hiperplasia e
diferenciação das células da granulosa e da teca do folículo ovulatório. É uma
estrutura primariamente reconhecida pela habilidade em sintetizar e secretar
progesterona (P
4
), hormônio que está intimamente relacionado com a
manutenção de um ambiente adequado ao desenvolvimento embrionário e
37
manutenção do próprio CL durante o período compreendido entre a ovulação e
a implantação, quando ocorre o reconhecimento materno da gestação.
A avaliação do CL fornece informações importantes sobre o estado
reprodutivo da fêmea e possibilita a adequação de procedimentos de
manipulação ou sincronização do ciclo estral (VIANA et al., 1999).
O CL das búfalas está comumente inserido no estroma ovariano sendo
geralmente menor do que na vaca, podendo atingir um peso máximo de 2,3 g e
um diâmetro máximo de 15 mm (ROY & MULLICK, 1964). Figueiredo et al.
(1997) encontraram diâmetro luteal máximo de 17,7 mm em animais da raça
Nelore. Na mesma raça, Neves et al. (2002) reportaram em animais gestantes
e não gestantes diâmetro luteal de 18,4 e 18,7 mm; 15,3 e 16,4 mm para
ovários esquerdo e direito, respectivamente.
De acordo com Ireland et al. (1980) existem quatro mudanças prontamente
identificáveis na aparência do CL bovino após a ovulação. Segundo esses
autores, os diâmetros dos CL nos estágios I, II, III e IV variaram de 5 a 15; 16 a
20; 16 a 20 e <10 mm, respectivamente.
2.6. Características Reprodutivas da Fêmea Bubalina
Os búfalos de água domésticos são classificados em búfalo de pântano e
búfalo de rio, de acordo com o habitat e uso. O búfalo de rio (2n= 50) prefere
água fresca sendo criado para produção de leite e carne. Já o búfalo de
pântano (2n= 48) prefere água turva e barrenta e foi primariamente utilizado
para tração e secundariamente para carne (GANGULI et al., 1998; HUFANA-
DURAN et al., 2004; PRESICCE, 2007).
Os búfalos são considerados animais sazonais, sendo que a eficiência
reprodutiva é, geralmente, afetada pelo comprimento de luz do dia. Em vários
países do mundo, a época em que os animais apresentam maior atividade
reprodutiva é o outono, sendo que a concentração de partos ocorre de julho a
dezembro, no hemisfério norte, e de janeiro a março, no hemisfério sul.
Durante os meses quentes do ano, existe um aumento na incidência de cios
silenciosos e ciclos estrais irregulares na fêmea, diminuição da libido e
qualidade seminal nos machos. Esse comportamento não é observado nas
38
regiões equatoriais onde a função reprodutiva é influenciada principalmente
pela oferta de alimentos. Nestas regiões, o búfalo é um animal poliéstrico
contínuo. Os efeitos sazonais na função reprodutiva são comandados pela
melatonina, que é um hormônio sintetizado pela glândula pineal (BITTMAN &
KARSCH, 1985; ZICARELLI, 1994; ZICARELLI & VALE, 2002).
Existe na literatura internacional um conceito errôneo de que o búfalo é
um animal tardio ou de baixa performance reprodutiva. O fato dessa espécie
apresentar índices de fertilidade inferiores aos bovinos parece estar
relacionado com manejo deficiente e/ou de seleção inadequada (VALE &
RIBEIRO, 2005). Porém, certa vantagem é observada na criação de búfalos em
climas tropicais, pois são mais bem adaptados ao estresse térmico do que os
bovinos (VILLARES, 1994; ZICARELLI, 1994).
O grupo de pesquisa de Baruselli analisou a divergência folicular em 19
novilhas cíclicas da raça Murrah. O mecanismo de divergência folicular é
definido como o início da diferença na taxa de crescimento entre os dois
maiores folículos, estabelecendo-se a dominância de apenas um deles, o qual
poderá se tornar ovulatório (GIMENES et al., 2005).
No experimento de Gimenes et al. (2005), a determinação do diâmetro dos
dois maiores folículos e do momento esperado para a ocorrência do desvio
folicular foi realizada de duas maneiras: análise visual do gráfico de cada
novilha (1) e modelo matemático de Regressão Linear Segmentada (2). O
momento de divergência folicular avaliado pelos métodos 1 e 2 foi de 63,2 ±
5,65 e 61,9 ± 4,94 horas após a ovulação, respectivamente. Já para diâmetros
foliculares no momento do desvio, os resultados foram de 7,2 ± 0,3 (folículo
dominante; FD) e 6,4 ± 0,3 mm (folículo subordinado; FS) no método 1 e 7,3 ±
0,3 (FD) e 6,3 ± 0,3 mm (FS) no método 2. Não houve diferença estatística
entre os dois métodos.
Devido às semelhanças na dinâmica e no padrão de dominância folicular
entre as espécies bubalina e bovina, as tecnologias de MOET utilizadas em
bovinos são, via de regra, adaptadas aos bubalinos (BARUSELLI et al., 1997).
Fertilidade reduzida é observada quando estas técnicas são aplicadas
sendo decorrente dos seguintes fatores: pouca responsividade à estimulação
hormonal, baixa recuperação de embriões e menor taxa de prenhez
comparados aos bovinos (NEGLIA et al., 2003).
39
No entanto, Baruselli et al. (1999) verificaram por exames ultra-
sonográficos, que as búfalas apresentam resposta ao tratamento
superovulatório, seguida de ovulação e formação de CL. Porém, a taxa de
recuperação embrionária não é compatível com a resposta ovariana. Esses
pesquisadores sugeriram que o número reduzido de embriões recuperados
pode ser devido a uma falha na captação de ovócitos pelo oviduto
(BARUSELLI et al., 2000).
Na ausência de ovulação, os folículos anovulatórios de búfalas
superestimuladas secretam altas concentrações de estradiol (E
2
)
(SCHALLENBERGER et al., 1990). O desequilíbrio na proporção estrógeno:
progesterona pode interferir nos mecanismos de captação dos ovócitos pelas
fímbrias (HUNTER, 1988; MISRA et al., 1998).
2.7. Características Reprodutivas da Fêmea Bovina
Nos bovinos, cada ciclo estral apresenta duas ou três ondas de
crescimento folicular (SAVIO et al., 1988; SIROIS & FORTUNE, 1988;
GINTHER et al., 1989) e, eventualmente, uma ou quatro (SIROIS & FORTUNE,
1988; RHODES et al., 1995; FIGUEIREDO et al., 1997). Uma nova onda
folicular ocorre, aproximadamente, a cada 10 dias (6 a 15 dias de variação) e
precedendo o início de cada onda, existe um aumento da secreção de FSH
(ADAMS et al., 1992a; ADAMS et al., 1992b; HAMILTON et al., 1992;
SUNDERLAND et al., 1994; GONG et al., 1995; GINTHER et al., 1996).
Dos folículos que iniciam a emergência da onda, um deles é selecionado
tornando-se dominante e continua crescendo, enquanto os outros regridem e
tornam-se atrésicos (REICHENBACH et al., 2001). Um dos mecanismos
essenciais para a divergência folicular é a diminuição da concentração
plasmática de FSH (GINTHER et al., 1999). A capacidade do folículo
dominante em continuar crescendo após o declínio da concentração de FSH
pode ser decorrente do aumento da biodisponibilidade do IGF-I (fator de
crescimento semelhante à insulina do tipo I) no folículo, da expressão de
RNAm do receptor de LH e da expressão de receptores de LH nas células da
40
granulosa, que conferem maior responsividade ao LH em relação aos folículos
menores (CROWE, 1999).
Em novilhas holandesas, o desvio e a subseqüente dominância ocorrem,
em média, 2,8 dias após a emergência da onda, quando o futuro folículo
dominante tiver 8,5 mm (GINTHER et al., 1996). Em animais da raça Nelore,
Sartorelli et al. (2005) reportaram que o desvio ocorreu 2,8 dias após a
ovulação, quando o maior folículo atingiu 5,7 mm em novilhas (n=8) e, 2,4 dias
após a ovulação, quando o maior folículo atingiu 6,1 mm em vacas não
lactantes (n=11).
O desenvolvimento das biotecnologias de MOET possibilitou o aumento
dos índices reprodutivos em fêmeas bovinas, maior intensidade de seleção,
diminuição do intervalo entre gerações, maior disponibilidade de animais para
reposição (PENNA, 1993) e, além disso, também permitiu que uma fêmea de
elevado padrão zootécnico fosse utilizada de uma forma mais racional,
fornecendo um grande número de descendentes, num curto espaço de tempo
(FERNANDES, 1994). No entanto, apresentam custo elevado e variação nos
resultados, devido aos fatores que influenciam a resposta ovulatória de
doadoras, que afetam a fertilização e a viabilidade embrionária e aqueles
relacionados ao programa e manejo animal (ARMSTRONG, 1993).
Mesmo assim, as fêmeas bovinas são mais eficientes do que as fêmeas
bubalinas na recuperação de embriões. Adams (1994) relatou taxas de
recuperação de embriões de 62 a 78% em relação ao número de ovulações e
de 63 a 80% em relação ao número de CL. Em vacas de raças taurinas,
Gradela et al. (1996) obtiveram índice de recuperação de embriões de 78% e
para Leal et al. (2005), as taxas de recuperação de embriões foram de 57,51 e
50,09% considerando-se o número total de CL à palpação retal e à ultra-
sonografia, respectivamente.
Para Farin et al. (2004), o estabelecimento da FIV e de sistemas de cultivo
tem facilitado a utilização da tecnologia de embriões na pesquisa, indústria e
aplicação clínica. Além do mais, a PIV permite o uso de fêmeas inaptas a
produzir descendentes pelas técnicas convencionais, fêmeas a partir dos seis
meses de idade, gestantes (até o terceiro mês) e no período pós-parto (2 a 3
semanas) (GARCIA et al., 2003).
41
Diferenças nas fontes de obtenção dos ovócitos, maturação ovocitária,
técnicas de preparação espermática, condições de fecundação e ambiente de
cultivo têm efeito sobre o desenvolvimento e qualidade dos embriões (FARIN et
al., 2001).
A viabilidade econômica da referida técnica está diretamente ligada à
eficiência dos laboratórios; não somente com relação ao incremento na
produção, mas principalmente com a obtenção de embriões capazes em
estabelecer crescimento e gestação normais (GARCIA et al., 2003).
A despeito do custo, variação nas taxas de produção de embriões viáveis
para transferência, reduzida criotolerância embrionária e incidência de
gestação prolongada, distocia, mortalidade perinatal e anomalias congênitas no
recém-nascido (GARCIA et al., 2003), o Brasil contribui com quase 50% do
número total de embriões produzidos em laboratório no mundo (VIANA, 2003).
2.8. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)
A maturação ovocitária é definida como o reinício e término da primeira
divisão meiótica, do estágio de quebra da vesícula germinativa até a fase de
metáfase II, acompanhada da maturação citoplasmática necessária para a
fertilização e desenvolvimento embrionário (CHA & CHIAN, 1998).
Os ovócitos reiniciam a meiose espontaneamente quando isolados de seus
folículos, ou seja, retirados da ação inibitória das células foliculares e cultivados
in vitro (SIRARD & COENEN, 1993). As células da granulosa apresentam um
papel regulatório no desenvolvimento do ovócito, afetando o perfil de
fosforilação das proteínas (CECCONI et al., 1991). O contato funcional entre as
células do cumulus e o ovócito durante a maturação é essencial para
expressão da total competência ovocitária (ALI et al., 2005).
2.8.1. Fatores que afetam a competência do ovócito
O tempo da colheita, a temperatura e o transporte dos ovários (oriundos de
abatedouros) ou ovócitos (aspirados por via transvaginal) até o laboratório
influenciam na porcentagem de ovócitos que alcançam o estágio de metáfase
42
II. Nos trabalhos em que os ovários são provenientes de vacas de abatedouros,
estes normalmente são transportados em solução salina a 0,9% de NaCl
aquecida a 30-35ºC. O tempo transcorrido entre a obtenção dos ovários e o
início da colheita varia entre grupos de pesquisa, mas não parece afetar a
viabilidade dos ovócitos quando realizado no período de até 3 horas
(GONÇALVES et al., 2002).
O fluido folicular (FF) tem sido utilizado para o transporte de ovócitos
bovinos com resultados satisfatórios, quando o tempo de transporte é
relativamente curto. O fluido folicular proporciona graus variáveis de bloqueio
da meiose, possibilitando maior sincronia entre maturação nuclear e
citoplasmática. Entretanto, para períodos mais prolongados de transporte, o
bloqueio produzido pelo FF pode determinar redução no futuro
desenvolvimento embrionário (VIZCARRA et al., 2000; LEHMKUHL, 2001;
LEIVAS et al., 2005).
A maioria dos ovócitos provenientes de folículos antrais é capaz de
completar a maturação nuclear, mas somente os competentes têm a
capacidade de ter desenvolvimento embrionário normal (SIRARD et al., 2006).
Os benefícios obtidos com suplementações no meio de maturação são
geralmente modestos e mesmo nos melhores resultados, aproximadamente
metade dos ovócitos ainda falha em atingir o estágio de blastocisto (DODE,
2006).
Alguns autores acreditam que existe uma correlação evidente entre o
tamanho dos folículos e a competência dos ovócitos. Segundo Dode et al.
(2000), ovócitos provenientes de folículos de maior diâmetro apresentam maior
potencial de desenvolvimento do que aqueles provenientes de folículos de
menor diâmetro. No entanto, para Seneda et al. (2001), a qualidade dos
complexos cumulus oophorus originados de folículos ≤ 4 mm e > 4 mm de
vacas Holandesas foi similar.
Durante a foliculogênese, o ovócito cresce até atingir um diâmetro de cerca
de 110 µm, o que corresponde a um tamanho folicular de 3 mm. É neste
estágio que os ovócitos atingem o seu crescimento, cessam a atividade do
nucléolo e adquirem a competência meiótica (HYTTEL et al., 1997). Apesar da
drástica diminuição transcricional que ocorre quando o ovócito completa seu
crescimento, a transcrição não é totalmente inativada e o diâmetro do ovócito
43
pode ter um pequeno aumento no período final do desenvolvimento folicular
(DODE et al., 2000; GANDOLFI et al., 2005).
Diferente do que ocorre in vivo, os ovócitos utilizados para a PIV são
normalmente obtidos de folículos de 3 a 8 mm, que não são expostos às
mudanças pré-ovulatórias do ambiente folicular, e são menos competentes do
que os ovócitos de folículos acima de 8 mm (HENDRIKSEN et al., 2000).
Em bovinos, Lonergan et al. (1994) obtiveram 66 e 34% de blastocistos a
partir de ovócitos de folículos maiores (6 a 8 mm) e menores (2 a 6 mm),
respectivamente.
Existem autores (HAGEMANN et al., 1997) que acreditam que a
competência do ovócito é influenciada pelo estágio do ciclo estral e outros não
(ARLOTTO et al., 1996). Hagemann et al. (1997) relataram que ovócitos de
vaca colhidos durante os dias 2 e 10 do ciclo foram mais viáveis para utilização
na FIV. Abdoon & Kandil (2001) recuperaram maior porcentagem de ovócitos
de boa qualidade de ovários de búfalas cíclicas nos dias 1 a 3 e 10 a 16 do
ciclo estral.
O estudo realizado por Abdoon & Kandil (2001) indicou que o status
reprodutivo da fêmea, no momento do abate, pode afetar o número de folículos
ovarianos e a qualidade dos ovócitos aspirados. O número total de folículos
superficiais foi menor em ovários de búfalas em anestro do que em cíclicas ou
gestantes. Ainda com relação às búfalas em anestro, a porcentagem de
ovócitos considerados bons foi menor do que a porcentagem de ovócitos ruins
e desnudos, indicando que a maioria dos folículos ovarianos nesta categoria de
búfalas deve ser atrésica. Em ovários de búfalas gestantes também foi
recuperada elevada porcentagem de ovócitos desnudos.
Dominguez (1995) reportou que a gestação não afetou a qualidade
ovocitária, sendo que a proporção de ovócitos viáveis foi similar entre vacas
cíclicas e prenhes. Porém, vacas prenhes apresentaram menor número de
folículos considerados médios (4 a 9 mm) e grandes (≥10 mm) do que vacas
cíclicas, contudo o desenvolvimento de folículos pequenos (1 a 3 mm) não foi
impedido durante a gestação. Abdoon & Kandil (2001) também observaram,
em búfalas, que o desenvolvimento de folículos pequenos é contínuo durante a
gestação e independe do estágio do ciclo estral.
44
Manjunatha et al. (2007a) determinaram o desenvolvimento in vitro da
competência de ovócitos de búfalas derivados de ovários de vacas de
abatedouro em vários estágios do ciclo estral e status folicular. Os ovários
foram divididos em 5 grupos: grupo 1 - ovário com CL hemorrágico e sem FD;
grupo 2 - ovário com CL maduro e funcional e FD; grupo 3 - ovário com CL
maduro e funcional, sem FD; grupo 4 - ovário com CL em regressão e FD e
grupo 5 - ovário sem estrutura luteal e com folículos pequenos. As taxas de
clivagem foram mais elevadas (p< 0,05) nos grupos 1 (59,6%) e 3 (59,2%).
2.8.2. Considerações Gerais da MIV em Bubalinos
Muitos ovócitos de bubalinos falham em se desenvolver até o estágio de
blastocisto após a FIV e esse fato tem sido atribuído à qualidade do ovócito no
início da maturação (MANJUNATHA et al., 2007a).
A despeito de uma série de fatores que afeta a taxa de maturação, a
colheita de ovócitos de alta qualidade capazes de maturarem in vitro é um fator
limitante, particularmente em espécies como a bubalina em que o
procedimento de FIV é ainda menos desenvolvido (TOTEY et al., 1992).
O meio de MIV utilizado pela maioria dos pesquisadores tem sido o
TCM-199 (Tissue Culture Medium) suplementado com SFB (soro fetal bovino),
FSH, LH e estradiol, sendo que pode ser usado também eCG (gonadotrofina
coriônica eqüina) e hCG (gonadotrofina coriônica humana) em substituição ao
FSH e LH, respectivamente (SANTOS et al., 2002).
Em búfalas, Ravindranatha et al. (2003) determinaram que a temperatura
de incubação de 38,5ºC durante a MIV foi considerada ótima, em comparação
com 36,5, 37,5 e 39,5ºC.
O tempo de incubação utilizado em búfalas é similar àquele empregado em
bovinos. Segundo Santos et al. (2002), em meio de maturação suplementado
com gonadotrofinas e estradiol, a maturação nuclear ocorre normalmente,
obtendo-se elevados percentuais de MII e baixos índices de degeneração em
búfalas. Os pesquisadores cultivaram os ovócitos por 14 a 17 h; 20 a 22 h; 23 a
25 h; 26 a 28, 29 e 32 h e utilizaram quatro tratamentos distintos: meio base +
SFB (tratamento 1); tratamento 1 + células da granulosa (tratamento 2),
tratamento 2 + eCG e hCG (tratamento 3) e tratamento 3 + estradiol
45
(tratamento 4). O maior índice de MII foi atingido no período de 23 a 25 horas
com o meio 4 (90,9%).
Em búfalas de rio, Gasparrini et al. (2008) avaliaram a maturação nuclear 0,
3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 horas após o início da MIV e concluíram que a
maioria dos ovócitos bubalinos completa a maturação nuclear entre 21 (89%) a
24 horas (90%). Com 15 e 18 horas de cultivo, os resultados foram de 6 e 32%,
respectivamente. Para Ganguli et al. (1998) maior tempo foi requerido para a
maturação nuclear in vitro (57% 24 horas e 64% 30 horas). Já Neglia et al.
(2001) observaram que, 19 horas após a MIV, 87% dos núcleos estavam em
metáfase II.
Para búfalos de pântano, o melhor resultado de maturação foi verificado
após 30 horas de cultivo (76%) do que 24 (70%) e 29 horas (72%)
(KAMONPATANA & CHUANGSOONGNEON, 1994).
Meios de maturação com FSH, LH e estradiol e com EGF e IGF-I (juntos
ou não) foram testados por Purohit et al. (2005) com grande sucesso. As taxas
de maturação foram 46,6% (controle: meio de cultura, piruvato e antibióticos),
74,7% (controle + hormônios), 63,2% (controle + EGF), 64,7% (controle + IGF-
I) e 81,0% (controle + EGF + IGF-I).
É sabido que o desenvolvimento de embriões mamíferos in vitro é afetado
negativamente pelo aumento do estresse oxidativo que ocorre sob as
condições de cultivo. O dano oxidativo dos componentes celulares interfere
com a própria função celular. A maioria das células mamíferas possui sistemas
antioxidantes eficientes como a catalase ou superóxido dismutase, tão bem
como os compostos thiol que agem como tampões metabólicos (DEL CORSO
et al., 1994).
Na maturação in vitro, a síntese de GSH (glutationa) é estimulada por
alguns substratos (cisteína e cistina) ou precursores (cisteamina e ß-
mercaptoetanol) (de MATOS & FURNUS, 2000). A glutationa é um composto
thiol tripeptídeo que possui muitas funções importantes na fisiologia e no
metabolismo intracelular. Um dos papéis mais importantes da glutationa é
manter o status redox nas células, protegendo-as contra os efeitos do
aquecimento causados pelas injúrias oxidativas (GASPARRINI et al., 2006).
Em adição, outras funções têm sido descritas como: efeito no transporte de
46
aminoácidos, sínteses de DNA (ácido desoxirribonucléico) e proteínas e
redução de dissulfitos (LAFLEUR et al., 1994).
Em alguns grupos de pesquisa, já é prática a utilização de antioxidantes no
meio de maturação de ovócitos bubalinos. Gasparrini et al. (2006) compararam
o efeito da suplementação do meio de MIV com cisteamina, cisteína e as duas
associadas. A adição dessas substâncias não afetou a porcentagem de MII,
contudo incrementou o processo de clivagem. Em outro experimento, em que
conferiram a ação de doses distintas de cisteamina (0, 50, 100 e 200 µmol/L)
na clivagem, determinaram que a cisteamina na concentração de 50 µmol/L
apresentou melhor efeito.
2.8.3. Considerações gerais da MIV em Bovinos
Para que todos os eventos da maturação ovocitária ocorram in vitro, é
necessário que os meios utilizados durante este processo simulem as
condições encontradas in vivo. Os meios podem ser divididos em simples ou
complexos. Os simples são constituídos de uma fonte salina acrescida de uma
fonte energética e um tamponante de pH (LEIVAS et al., 2004).
Com relação à atmosfera gasosa, o CO
2
é utilizado para controlar o pH dos
meios tamponados com bicarbonato (BOONE & SHAPIRO, 1990). O HEPES
vem sendo muito utilizado como tampão para evitar grandes variações de pH
nos meios de maturação e de cultivo embrionário (MONTAGNER et al., 2000).
Vários constituintes têm sido adicionados ao meio para aumentar a taxa de
maturação, tais como: SFB, soro de fêmea em estro, hormônios, líquido
folicular e fatores de crescimento e ainda co-cultivo com células do cumulus e
células da granulosa (revisado por SANTOS et al., 2002).
A maioria dos laboratórios tem optado pela suplementação do meio com
SFB, gonadotrofinas (FSH e LH) e estradiol em condições controladas de
atmosfera e temperatura (GARCIA et al., 2003).
A adição de hormônios gonadotróficos e esteróides ao meio de
maturação tem sido amplamente estudada em função da especificidade de
ação que cada hormônio exerce e contribui para maximizar a porcentagem de
ovócitos que completam a meiose, porém os resultados são contraditórios
(ALVES et al., 2001; COELHO et al., 2002). Os resultados conflitantes
47
provavelmente são decorrentes das distintas concentrações e fontes hormonais
utilizadas (COELHO et al., 2002).
O efeito positivo de gonadotrofinas, como o FSH, na maturação in vitro, é
mediado pelas células do cumulus, pela ação específica direta ou mediante
interação com fatores de crescimento celular e/ou receptores (HARPER &
BRACKETT, 1993).
Alves et al. (2001) avaliaram a adição de 10, 20 e 40 µg/mL de FSH ao
meio de maturação e constataram que nas duas últimas concentrações, o
processo de maturação dos ovócitos bovinos foi retardado ou inibido, visto que
as taxas de MII foram inferiores (55,5 e 50% para 20 e 40 µg/mL e 81,8% para
10 µg/mL).
Coelho et al. (2002) compararam o uso da eCG (gonadotrofina coriônica
eqüina) e hCG com FSH e LH no meio de MIV em vacas, e obtiveram taxas de
clivagem e formação de blastocisto de 60 e 13,9% e 61,2 e 10,6% para os
primeiro e segundo protocolos, respectivamente, não apontando diferença
entre eles.
A adição de GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) ao meio de
maturação foi pesquisada. CALEGARI et al. (2003) averiguaram que o GnRH
apresentou habilidade em promover a maturação dos ovócitos bovinos em
substituição ao FSH, apesar de não ter ocorrido expansão das células da
granulosa.
Para aumentar e melhorar o desenvolvimento embrionário,
principalmente em condições sub-ótimas de cultivo é comum a utilização de
fatores de crescimento já que, de acordo com algumas pesquisas em diversas
espécies animais, estes fatores modulam a sobrevivência, a proliferação e a
diferenciação de células foliculares, agindo e interagindo com gonadotrofinas
(MONNIAUX et al., 1997).
Ponchirolli et al. (2005) concluíram que a adição de GH (hormônio
de crescimento), IGF-I e insulina separadamente ou juntos não incrementou a
produção de blastocistos. Isto pode ter ocorrido devido à presença de SFB, que
já é rico em fatores de crescimento, mascarando a ação das substâncias que
foram adicionadas nos diferentes tratamentos. Apesar disso, acredita-se que o
GH acelera a QVG, induz a expansão das células, melhora a maturação
citoplasmática e aumenta a produção embrionária (IZADYAR et al., 1996).
48
A adição de células da granulosa ao meio de MIV parece favorecer a
produção de blastocistos, entretanto Coelho et al. (1998) não observaram este
efeito. Esses pesquisadores explicam que isto pode ter ocorrido porque a
concentração das células da granulosa utilizada não foi previamente
determinada e para que tal efeito ocorra é necessária uma concentração de no
mínimo 1 x 10
6
/mL (CRISTER et al., 1986).
O acréscimo de antioxidantes (ß-mercaptoetanol, cisteína e cisteamina) ao
meio de maturação pode prover aumento nos índices de MII, como
demonstraram de Matos & Furnus (2000) e Gotardi et al. (2005).
2.9. Hormônios e IGF-I no Líquido Folicular
Progesterona, estradiol, LH, FSH e fatores de crescimento podem afetar
potencialmente a competência do ovócito durante a PIV de embriões. Baixas
concentrações de IGF-I e outros fatores de crescimento, seguidas por
mudanças hormonais que ocorrem durante a fase de dominância possibilitam a
indução da atresia folicular e alteram a competência do ovócito (MELO et al.,
2005).
O conteúdo esteróide no fluido folicular reflete a capacidade de síntese das
células da granulosa e da teca (ZAIN et al., 1997). A progesterona e o 17β
estradiol do fluido folicular, produzidos pelas células somáticas do folículo, são
os dois maiores reguladores do desenvolvimento folicular e da atresia. A
atresia em folículos pode ser caracterizada por crescimento e decréscimo na
produção de progesterona e estradiol, respectivamente, pelo folículo (SPICER
et al., 1987). A variação nas concentrações desses hormônios esteróides no FF
indica mudanças nas taxas de produção destes pelas células foliculares, que
também pode ter efeito no ovócito.
Na vaca, o pico de LH inibe a produção de androstenediona pelas células
da teca e induz a luteinização das células da granulosa mural. Esse processo é
refletido pelos níveis de esteróides no FF do folículo pré-ovulatório que mostra
uma elevada concentração de E
2
de aproximadamente 1 µg/mL antes e até 6 h
após o pico de LH; logo após, um severo declínio nas concentrações desse
hormônio é verificado. Esse acontecimento é seguido por um aumento gradual
49
na P
4
iniciando-se aproximadamente 20 horas após o pico de LH (DIELEMAN
et al., 1983; FORTUNE & HANSEL, 1985).
Ao mesmo tempo em que as gonadotrofinas apresentam um papel primário
no controle do crescimento e desenvolvimento folicular ovariano, outros fatores
estão envolvidos no processo da foliculogênese. O IGF-I é um de muitos
fatores de crescimento, com funções especialmente na regulação das células
da granulosa e potentes ações na proliferação, diferenciação e
esteroidogênese destas células. Não obstante, também há participação do
hormônio de crescimento e da insulina. Ademais, existe uma completa
interação entre as gonadotrofinas, fatores de crescimento, esteróides e outros
hormônios no controle do desenvolvimento folicular (SOUZA et al., 2007).
O IGF-I também está envolvido na estimulação do folículo primordial, como
tem sido demonstrado em ovelhas, ratas, porcas e mulher, por instigar a
proliferação e diferenciação das células da granulosa (ADASHI, 1992;
MONNIAUX & PISSELET, 1992). Outros fatores de crescimento podem
modular a ação do IGF-I, por exemplo: altas concentrações de EGF em
folículos pequenos podem promover a ação proliferativa do IGF-I, e baixas
concentrações de EGF nos folículos maiores podem promover a ação de
diferenciação das células da granulosa (HSU et al., 1987).
2.10. Insulina Plasmática
Muitos pesquisadores verificaram que concentrações elevadas de insulina
circulante apresentam efeitos benéficos na reprodução de fêmeas bovinas.
Para isso, diversos experimentos avaliaram as implicações do fornecimento de
dietas de diferentes níveis energéticos na fertilidade. Entretanto, até o
momento, esse efeito benéfico só foi verificado nas vacas de raças européias,
pois em estudo de Martins et al. (2008) com fêmeas azebuadas, as inter-
relações entre glicose-insulina-IGF-I não ficaram bem definidas.
Nas vacas produtoras de leite, o status metabólico afeta uma variedade de
hormônios e fatores de crescimento circulantes como o GH, insulina, leptina,
cortisol, tiroxina e IGF-I que têm grande participação na função ovariana
(WEBB et al., 2004). Vacas de leite, sob condições de estresse térmico,
50
reduzem a ingestão de matéria seca, prolongando o balanço energético
negativo (BEN) (CALEGARI, 2005). O BEN, por sua vez, leva ao decréscimo
da concentração plasmática de insulina, glicose e IGF-I, e aumento nas
concentrações de GH e de ácidos graxos não esterificados (JOLLY et al.,
1995). Existem evidências de que a reduzida fertilidade das vacas de leite,
durante o BEN, associa-se às baixas concentrações de insulina e IGF-I
(BUTLER, 2000).
Dietas que visam o aumento do nível de insulina circulante, oferecidas
durante a fase inicial de lactação, podem antecipar a primeira ovulação pós-
parto (GONG et al., 2002). Do mesmo modo, essas dietas estimulam o
desenvolvimento folicular em novilhas (GUTIERREZ et al., 1997).
D’Occhio et al. (2007) avaliaram vacas alimentadas com pasto enriquecido
e com pasto de qualidade moderada. As vacas submetidas à dieta melhorada
apresentaram maior concentração plasmática de insulina do que as outras (6,5
± 1,3 e 3,6 ± 0,3 µUI/mL, respectivamente) uma semana após o parto. Todas
as vacas melhor alimentadas ovularam entre 12 e 15 semanas pós-parto. Já
nas demais vacas, em apenas uma das sete estudadas foi detectada a
ovulação durante o período do experimento (20 semanas após o parto).
O mesmo modelo experimental foi adotado para as búfalas. Búfalas que
receberam uma dieta com alta energia também apresentaram maiores
concentrações de insulina circulante (7,5 ± 0,6 mmol/L) e glicose (91,0 ± 1,0
mg/dL) comparadas com búfalas submetidas à uma dieta de baixa energia (3,9
± 0,2 mmol/L e 75,0 ± 2,0 mg/dL, respectivamente). No entanto, o número de
folículos superficiais e diâmetro do folículo dominante não diferiram (D’OCCHIO
et al., 2007).
3. HIPÓTESE
O presente trabalho verificou a hipótese de que existem diferenças na
morfologia, biometria e fisiologia do aparelho reprodutor entre as espécies
bubalina e bovina e que por isso, fatores fisiológicos distintos e climáticos
atuam na competência ovocitária.
51
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo geral
Estudar a fisiologia, a morfologia e a biometria dos ovários e dos folículos
ovarianos, assim como a maturação ovocitária in vitro nas espécies bubalina e
bovina.
4.2. Objetivos específicos
• Avaliar a morfometria (forma, coloração, peso, comprimento, largura e
altura) e o número de folículos superficiais dos ovários de búfalas e de
vacas;
• Determinar os diâmetros e os formatos dos folículos, dos ovócitos e dos
núcleos ovocitários nas diferentes categorias foliculares (pré-antrais e
antrais), o número de células da granulosa que circundam o ovócito e a
espessura da zona pelúcida pela microscopia de luz, em búfalas e
vacas;
• Analisar membranas e organelas citoplasmáticas do ovócito e das
células da granulosa pela microscopia eletrônica de transmissão nas
espécies bubalina e bovina;
• Verificar se o estado reprodutivo da fêmea (gestante ou não), período de
gestação (inicial, médio ou final), época do ano (primavera/ verão ou
outono/ inverno) e as concentrações plasmáticas de progesterona e
insulina, no momento do abate, influenciam a recuperação, a qualidade
e a maturação in vitro dos ovócitos;
• Determinar se a presença do CL e de folículos ≥ 7mm nas búfalas e ≥ 6
mm nas vacas interfere na recuperação, na qualidade e na maturação
dos ovócitos in vitro;
• Determinar a concentração de hormônios esteróides e IGF-I nos
folículos < e
≥ 7mm (búfala) e < e ≥ 6 mm (vaca).
52
5. MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de sangue e os ovários foram obtidos de 86 búfalas mestiças
Murrah x Mediterrâneo e 95 vacas zebuínas abatidas em matadouros
localizados nas cidades de Lençóis Paulista (Frigol
®
, distância 55 Km),
Rancharia (Better Beef
®
, distância 318 Km) e Cajati (Frivale
®
, distância 460
Km), no interior do estado de São Paulo, sem considerar a procedência dos
animais; no entanto, o estado reprodutivo (gestante ou não) e o período de
gestação (inicial, médio e final) foram estimados. Não foram determinados o
peso e a idade dos animais, porém todas as fêmeas avaliadas eram adultas. O
tempo de transporte para a chegada dos ovários das búfalas ao laboratório era
de 4 a 6 horas e para as vacas, de 45 minutos.
As análises foram realizadas considerando-se duas épocas climáticas:
primavera/ verão e outono/ inverno.
O clima predominante na cidade de Botucatu é CA, com temperaturas
entre 3 e 8ºC no inverno seco e > 22ºC no verão (www.botucatu.sp.gov.br).
Quanto às características geográficas, a cidade de Botucatu apresenta altitude
média de 804 m, latitude 22º 52’ 20”S e longitude 48º 26’ 37”W.Gr
(www.citybrazil.com.br).
5.1. Colheita do Sangue
A colheita do sangue foi realizada diretamente da veia jugular, no momento
da sangria, na linha de abate (Figura 1). O sangue foi acondicionado em tubos
de colheita de sangue heparinizados (Vacutainer
BD) e transportados ao
laboratório de Endocrinologia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, UNESP/Botucatu-SP em caixa isotérmica, à temperatura ambiente,
onde foi centrifugado a uma velocidade de 1.500 x g por 15 minutos (Centrífuga
Excelsa Baby II, modelo 206-R, FANEM
®
). O plasma foi armazenado em tubos
plásticos de 2 mL (eppendorfs) identificados, em duplicata e mantido a
temperatura de -80ºC (Deep Freezer ilShin, ilShin
®
Lab. Co., Ltda) até o
momento da descongelação e análise.
53
Figura 1. Colheita do sangue no momento do abate.
5.2. Colheita e Avaliação Morfométrica dos Ovários
Os ovários de cada fêmea foram colhidos separadamente, mantidos em
sacos plásticos identificados contendo solução fisiológica aquecida (36ºC),
acrescida de 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina e
transportados ao laboratório em caixa isotérmica.
No laboratório, os ovários (n= 172 ovários de búfalas; n= 190 ovários de
vacas) foram dissecados com o auxílio de tesoura e pinça anatômica
autoclavadas para, a seguir, serem realizadas as seguintes avaliações: forma
(alongada, arredondada e ovalada), coloração (amarelada e rosada), peso (g),
comprimento (mm), largura (mm) e altura (mm) do ovário; presença e diâmetro
médio (mm) de folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥ 6 mm (vacas); número de
folículos ovarianos superficiais; presença, classificação e diâmetro médio (mm)
dos corpo lúteos (Figuras 2, 3a e 4). As medidas 7 mm (búfalas) e 6 mm
(vacas) do folículo ovariano adotadas como diferenciais nas análises
realizadas, partiram dos conceitos estabelecidos nos estudos de Gimenes et al.
(2005) e Sartorelli et al. (2005) em búfalas Murrah e vacas zebuínas,
respectivamente.
O peso do ovário foi determinado em balança digital (Bel Engineering
) e
as medidas do ovário, folículo e corpo lúteo com o auxílio de paquímetro digital
(Digimess
; Figura 3b).
A consistência do ovário foi classificada em fibro-elástica (mais firme) e
flácida (macia) em analogia aos termos utilizados para a avaliação da
1
54
consistência testicular. Ovários com consistência fibro-elástica foram
considerados mais saudáveis do que aqueles com consistência flácida.
Figura 2. Dissecção de um ovário com o auxílio de tesoura e pinça anatômica
para extrair os tecidos ao seu redor, permitindo melhor acurácia nas avaliações
realizadas.
Figura 3. Mensuração de um ovário com o auxílio de um paquímetro (a) e no
detalhe o paquímetro digital (b).
2
3a
3
b
55
Figura 4. Corpos lúteos seccionados ao meio para classificação e
determinação do diâmetro médio utilizando-se paquímetro digital.
O corpo lúteo foi classificado segundo Ireland et al. (1980) em quatro
estágios:
• Estágio I: compreende o intervalo entre a ovulação e o crescimento do
epitélio sobre o ponto de ruptura. O CL apresenta-se como um pequeno
ponto avermelhado, não coberto pelo epitélio. Corresponde aos dias 1 a
4 do ciclo estral;
• Estágio II: o início deste estágio é marcado pela formação do ápice
(protrusão) de um novo CL. O CL é completamente formado, com
vascularização visível na periferia. Quando é seccionado, o ápice
mostra-se vermelho ou marrom, enquanto que o restante é laranja ou
amarelo. Corresponde aos dias 5 a 10 do ciclo estral;
• Estágio III: inicia-se quando as cores vermelha ou marrom do ápice do
CL desaparecem e o CL se apresenta inteiramente laranja ou amarelo
brilhante. Mais tarde neste estágio, a vascularização é visível sobre o
ápice do CL. Corresponde aos dias 11 a 17 do ciclo estral;
• Estágio IV: o ovário usualmente contém um grande folículo e um CL em
regressão, de cor amarela clara ou branca, sem vascularização aparente
em sua superfície. Corresponde aos dias 18 a 20 do ciclo estral.
Ainda segundo esses autores, os diâmetros dos CL nos estágios I, II, III e
IV variam de 5 a 15; 16 a 20; 16 a 20 e <10 mm, respectivamente.
4
56
5.3. Recuperação e Seleção dos Ovócitos
No laboratório de Reprodução Avançada e Terapia Celular (LANÇA) da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP/Botucatu-SP, realizou-
se a aspiração dos folículos com diâmetros entre 2 e < 7 mm (búfalas) e 2 e < 6
mm (vacas), utilizando-se agulha 30 x 8 e seringa de 10 mL (Figura 5). O
líquido folicular aspirado das gônadas de cada fêmea foi depositado em tubos
plásticos de 2 mL, identificados e mantidos em posição vertical à temperatura
de 36ºC em placa aquecedora (Eletrovet
®
). A seguir, o líquido folicular foi
transferido para uma placa de Petri 40 x 10 ou 60 x 16 mm, conforme o volume
obtido, para a seleção dos CCOs (complexo cumulus oophorus).
Os CCOs foram avaliados em estereomicroscópios (Unico
®
e Leica
®
MZ
125) e classificados em graus 1, 2, 3, desnudos e expandidos, de acordo com o
número de camadas de células do cumulus e o aspecto do citoplasma do
ovócito.
• Grau 1: complexo cumulus oophorus compacto e uniforme, com três ou
mais camadas de células e citoplasma homogêneo;
• Grau 2: complexo cumulus oophorus ligeiramente menos compacto, com
menos de três camadas de células ou citoplasma menos homogêneo;
• Grau 3: complexo cumulus oophorus com camadas incompletas de
células e citoplasma menos homogêneo;
• Desnudos: sem células ao redor do ovócito;
• Expandidos: células do cumulus oophorus expandidas.
Figura 5. Aspiração dos folículos antrais com auxílio de agulha 30 x 8 e seringa
de 10 mL.
5
57
Foram recuperados 714 CCOs bubalinos e 1.983 CCOs bovinos.
5.4. Maturação Ovocitária in vitro (MIV)
Apenas os CCOs classificados como graus 1 e 2 foram utilizados no
experimento. Após a seleção, os CCOs foram lavados em 3 a 5 gotas do meio
de lavagem constituído de TCM 199 com HEPES, 10% de SFB, 22 µg/mL de
piruvato de sódio e 50 µg/mL de gentamicina. Os CCOs de cada animal foram
cultivados separadamente em gotas de 90 µL de meio MIV cobertas com óleo
mineral, em placas de Petri 40 x 10 ou 60 x 16 mm (Figura 6), a uma
temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO
2
em ar (CO
2
water
jacketed incubator modelo 3110, Forma Scientific
®
). O número de CCOs em
cada gota variou de acordo com a recuperação dos mesmos de cada fêmea.
De maneira geral foram colocados de 10 a 12 CCOs por gota. O meio de
maturação utilizado foi composto de TCM 199 acrescido de 10% de SFB, 22
µg/mL de piruvato de sódio, 1 µg/mL de FSH, 5 µg/mL de LH, 10 µg/mL de E
2,
50 µg/mL de gentamicina e 50 µM/mL de cisteamina. Os códigos e marcas dos
produtos utilizados estão no anexo I.
Figura 6. Gotas de meio de maturação identificadas com o número da fêmea,
contendo os CCOs em placa de Petri.
5.4.1. Avaliação da Maturação Nuclear
A maturação nuclear foi avaliada após o período de maturação in vitro (22
a 24 horas). Para isso, as células da granulosa dos CCOs foram removidas em
6
58
meio de lavagem acrescido de hialuronidase do tipo II ou V (5 mg/mL), com
auxílio de capilar de vidro de ponta fina.
Os ovócitos totalmente desnudos foram incubados em 5 µL do meio
supracitado e 5 µL de bisbenzemide (Hoechst 33342; 1 mg/mL) em lâmina
histológica coberta com lamínula e examinados em microscópio invertido
(Leica
®
DMIRB) equipado com luz fluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm,
excitação e emissão, respectivamente) para determinar a configuração nuclear
(Figura 7). Foram avaliadas as configurações nucleares de 396 ovócitos de
búfalas e 1.234 ovócitos de vacas.
Os ovócitos foram classificados segundo o estágio da meiose em:
• Vesícula Germinativa (VG): presença de núcleo vesicular com
cromossomos pouco condensados;
• Quebra da Vesícula Germinativa (QVG): cromossomos apresentando
algum grau de condensação com dispersa distribuição, porém ainda
com núcleo de aspecto vesicular;
• Metáfase I (MI): cromossomos atingem grau máximo de condensação;
• Metáfase II (MII): presença de um grupo denso de cromossomos
formando o primeiro corpúsculo polar e outro grupo caracterizado pela
placa metafásica;
• Degenerado/ não identificado (DEG/NI): núcleo degenerado ou não
passível de identificação.
Figura 7. Microscópio invertido Leica equipado com epifluorescência utilizado
para a visualização dos ovócitos corados com Hoechst 33342.
7
59
5.5. Processamento Histológico dos Ovários para
Microscopia de Luz
Foram utilizados dez ovários de cada espécie, escolhidos aleatoriamente,
com ou sem CL, e processados segundo a técnica rotineira de histologia
clássica na Área de Patologia Animal, Departamento de Clínica Veterinária,
FMVZ, UNESP/Botucatu-SP. Os ovários foram seccionados ao meio, fixados
em formalina a 10% por 24 horas (Figura 8), mantidos em álcool 70%,
desidratados, diafanizados e embebidos em parafina. O material incluído em
parafina foi seccionado em micrótomo (espessura de 3 µm) e submetido à
coloração de Hematoxilina/Eosina. Foram realizados de dois a três cortes na
região cortical da cada metade ovariana.
Os folículos ovarianos foram classificados de acordo com a morfologia em:
primordial (uma camada de células ao redor do ovócito de forma pavimentosa);
em transição (uma camada de células ao redor do ovócito de forma
pavimentosa e cúbica); primário (uma camada de células ao redor do ovócito
de forma cúbica); secundário (duas ou mais camadas de células ao redor do
ovócito de forma cúbica); terciário (ovócito circundado pela zona pelúcida,
corona radiata, células do cumulus, células foliculares, uma pequena cavidade
contendo líquido folicular, uma membrana basal e duas camadas de células
tecais) e pré-ovulatório (todos os componentes do folículo terciário e antro bem
desenvolvido). Além disso, determinou-se os diâmetros (µm) dos folículos,
ovócitos e núcleos (quando aparentes), o número de células foliculares em
contato com o ovócito e a espessura da zona pelúcida (µm; folículos
secundários e antrais) utilizando-se um programa de analisador de imagens
(Axiophoto 3.0) acoplado ao microscópio óptico (Zeiss
®
).
Foram contabilizados 103 e 161 folículos ovarianos bubalinos e bovinos,
sendo 14 e 47 folículos primordiais; 14 e 19 folículos em transição; 54 e 56
folículos primários; 14 e 14 folículos secundários, 0 e 10 folículos terciários; 7 e
15 folículos pré-ovulatórios para búfalas e vacas, respectivamente.
60
Figura 8. Ovários seccionados e fixados em solução de formalina 10%.
5.6. Processamento dos Ovários para Microscopia
Eletrônica de Transmissão
O processamento das amostras para a técnica de microscopia eletrônica
de transmissão foi realizado no Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de
Biociências, UNESP/Botucatu-SP. As eletromicrografias foram feitas nesse
Centro e no Departamento de Patologia Humana da Faculdade de Medicina
pertencente à mesma universidade. Os fragmentos do córtex ovariano (5
ovários de cada espécie, escolhidos aleatoriamente) foram fixados em
glutaraldeído a 2,5%, em tampão fosfato (0,1 M; pH 7,4) (Figura 9) e mantidos
em refrigeração. A seguir, foram pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% em
tampão cacodilato de sódio 0,2 M, por duas horas, a 4ºC, lavados três vezes
em água destilada e desidratados em séries crescentes de acetona. A
polimerização foi feita com Araldite
®
, durante 72 horas a 60ºC. Os cortes
semifinos (3 µm) corados com azul de Toluidina foram observados ao
microscópio óptico para a localização dos folículos ovarianos. Os cortes
ultrafinos (70 nm) foram colhidos em grade de cobre, contrastados com acetato
de uranila em álcool 50% e citrato de chumbo e submetidos ao microscópio
eletrônico de transmissão com o intuito de analisar as membranas e organelas
citoplasmáticas do ovócito e células da granulosa e, ainda, observar possíveis
diferenças entre as espécies bovina e bubalina.
8
61
Figura 9. Fragmentos de ovário em solução de glutaraldeído 2,5%.
5.7. Dosagens Hormonais
5.7.1. Plasma
As amostras de plasma sangüíneo (n= 84 búfalas e n= 95 vacas) foram
quantificadas em suas concentrações de progesterona e insulina por
procedimento de radioimunoensaio (Gamma Count Cobra II, Packard
Bioscience Company
®
; Figura 10), utilizando-se kits comerciais (DPC Medlab
®
),
no Laboratório de Endocrinologia do Departamento de Reprodução Animal e
Radiologia Veterinária, FMVZ, UNESP/Botucatu-SP.
5.7.2. Fluido folicular
O fluido dos folículos ≥ 6 mm (vacas; n= 40) e ≥ 7 mm (búfalas; n= 40)
foram aspirados separadamente para determinar as concentrações de estradiol
(búfalas), progesterona e IGF-I (búfalas e vacas) por procedimento de
radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais (IGF-I e estradiol - DSL
Gênese
®
e progesterona - DPC Medlab
®
). Os mesmos hormônios e fator de
crescimento foram dosados no líquido folicular remanescente de cada fêmea,
ou seja, aquele que restou após a seleção dos ovócitos (n= 39 búfalas, n= 40
vacas). Ambos fluidos foliculares foram armazenados em tubos plásticos de 2
mL e mantidos a temperatura de -80ºC até a descongelação. Para a
determinação dos hormônios esteróides, as amostras foram diluídas na
proporção de 1:1000 (estradiol) e 1:100 (progesterona) em solução de PBS
(Phosphate Buffer Saline; Nutricell
).
9
62
Após a leitura das amostras e obtenção dos valores de estradiol e
progesterona do líquido folicular, estes foram multiplicados por 1000 e 100,
respectivamente. Porém, após a multiplicação, os resultados do estradiol em
pg/mL foram muito elevados, então adotou-se como unidade de medida ng/mL
para facilitar a compreensão e comparação dos dados, uma vez que na
literatura, a concentração de estradiol do líquido folicular se apresenta, na sua
maioria, em ng/mL.
Figura 10. Aparelho Gamma Count Cobra II para leitura de amostras por
procedimento de radioimuniensaio.
5.8. Metodologia Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada no Departamento de
Bioestatística, Instituto de Biociências, UNESP/Botucatu-SP. Os resultados
foram submetidos aos tratamentos estatísticos da média, desvio-padrão,
mediana, primeiro e terceiro quartis e porcentagem.
Para o estudo das variáveis peso, comprimento, altura, largura, número de
folículos superficiais no ovário segundo o estado reprodutivo e período de
gestação, foram utilizados os testes t de Student e análise de variância, uma
vez que as mesmas apresentaram distribuição normal.
Para as variáveis CL e folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥ 6 mm (vacas),
segundo o estado reprodutivo e período de gestação, foram empregados os
10
63
testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, uma vez que as mesmas não
apresentaram distribuição normal.
Para as variáveis diâmetro do folículo, ovócito e núcleo e número de
células ao redor do ovócito foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis.
Para as variáveis (GI, GII, GIII, DESN, EXP, TOT RECUP, VG, QVG, MI,
MII, DEG/NI e TOT COR) cujo interesse era comparar em relação às
presenças de CL e folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥ 6 mm (vacas), época do ano
e estado reprodutivo foi utilizado o teste de Mann-Whitney, já para essas
variáveis cujo interesse era comparar quanto ao período de gestação foi
utilizado o teste de Kruskal-Wallis.
Na comparação entre espécies, para todas as variáveis foi utilizado o teste
de Mann-Whitney. Para determinar a correlação entre as variáveis foi utilizado
o coeficiente de correlação de Spearman. Para estudo da associação entre
variáveis e comparação de freqüências das diversas categorias de cada
variável foi utilizado o teste do qui-quadrado.
Em todas as análises realizadas foram consideradas diferenças
significativas quando p< 0,05. As correlações foram consideradas quando r≥
0,60.
64
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Morfometria do Ovário
A forma ovariana ovalada foi predominante tanto para as búfalas, como
para as vacas, nas categorias estudadas: fêmeas não gestantes (72,6 e 78,8%,
respectivamente) e gestantes (86,4 e 80,6%, respectivamente), conforme se
verifica na tabela 1.
Tabela 1. Freqüência de búfalas e vacas gestantes e não gestantes segundo a
forma do ovário.
Forma do ovário
Espécie
Estado
reprodutivo
Alongada (%)
Ovalada (%)
Arredondada(%)
Total (%)
Bubalina
Gestante
(n= 33)
6 (9,1) b
A
57 (86,4) a
A
3 (4,5) b
B
66 (100,0)
Não gestante
(n= 53)
3 (2,8) c
A
77 (72,6) a
A
26 (24,5) b
A
106 (100,0)
Total
(n= 86)
9 134 29 172
Bovina
Gestante
(n= 36)
10 (13,9) 58 (80,6) 4 (5,6) 72 (100,0)
Não gestante
(n= 59)
13 (11,0) 93 (78,8) 12 (10,2) 118 (100,0)
Total
(n= 95)
23 151 16 190
Χ
2
= 13,7; p= 0,001 (Búfalas) e Χ
2
= 1,5; p= 0,484 (Vacas). Letras minúsculas comparam
proporções nas linhas dentro de cada estado. Letras maiúsculas comparam proporções nas
colunas dentro de cada forma. Proporções seguidas de pelo menos uma letra em comum não
diferem significativamente.
A leitura dos dados corroborou com registros na literatura de que os
ovários de búfalas (DYCE et al., 1996) e vacas (SISSON & GROSSMAN, 1981;
PRIEDKALNS & LEISER, 1998) são ovóides.
65
Na espécie bubalina, os ovários mostraram-se, em sua maioria, rosados e
na espécie bovina, amarelados. Não houve diferença significativa com relação
ao estado reprodutivo e aos períodos de gestação (p> 0,05) em ambas
espécies. Nas búfalas, os valores obtidos para coloração amarelada e rosada
foram, respectivamente, 28,3 e 71,7% (não gestante); 34,6 e 65,4% (período
inicial); 35,0 e 65,0% (período médio) e 35,0 e 65,0% (período final). Já nas
vacas, os resultados para coloração amarelada e rosada foram,
respectivamente, 96,6 e 3,4% (não gestante); 100 e 0% (período inicial); 100 e
0% (período médio) e 87,5 e 12,5% (período final). No entanto, Junqueira &
Carneiro (1995) afirmaram que o ovário bovino possui coloração rósea clara.
Os resultados para consistência dos ovários bubalino e bovino
demonstraram que esta foi, em sua maioria fibro-elástica (p= 0,027/ búfalas e
p= 0,000/ vacas). As búfalas e vacas apresentaram porcentagens de ovários
considerados fibro-elásticos de 99,1 e 99,2% (não gestantes); 100 e 95,2%
(período inicial); 100 e 81,8% (período médio) e 90 e 62,5% (período final),
respectivamente.
Não foram encontradas descrições sobre a consistência ovariana na
literatura.
Com relação à biometria ovariana de búfalas e vacas, esta não foi
influenciada pela gestação; contudo, o número médio de folículos superficiais
foi superior (p< 0,001) nas búfalas não gestantes, conforme mostra a tabela a
seguir.
66
Tabela 2. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas.
Ovários
Búfalas Vacas
Variável
Não
gestante
(n= 53)
Gestante
(n= 33)
p
Não
gestante
(n= 59)
Gestante
(n= 36)
p
Peso (g)
4,0 ± 2,7 4,0 ± 1,1
0,95
7,9 ± 2,8 7,3 ± 1,9
0,33
Comprimento
(mm)
23,8 ± 4,3 25,3 ± 3,2
0,08
30,5 ± 4,9 31,5 ± 5,1
0,37
Largura (mm)
16,7 ± 2,9 17,7 ± 2,6
0,12
21,7 ± 3,8 21,8 ± 2,5
0,94
Altura (mm)
13,1 ± 2,3 13,0 ± 2,0
0,83
15,7 ± 2,3 15,0 ± 1,8
0,16
N
0
de
Folículos
superficiais
25,8 ± 16,2
14,7 ± 5,0
<0,001
36,7 ± 20,5
33,8 ± 14,5
0,46
Pela análise de variância, foram observadas diferenças nas medidas
ovarianas e no número de folículos superficiais durante o período de gestação
das búfalas. As búfalas no período final e inicial apresentaram,
respectivamente, menor altura (p= 0,038) e número de folículos superficiais (p=
0,004; Tabela 3).
67
Tabela 3. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o período de gestação das búfalas.
Período de gestação
Variável
Não
gestante
(n= 53)
Inicial
(n= 13)
Médio
(n= 10)
Final
(n= 10)
p
Peso (g)
4,0 ± 2,7 4,3 ± 1,3 4,0 ± 1,2 3,6 ± 0,6
0,90
Comprimento
(mm)
23,8 ± 4,3 24,3 ± 4,3 25,8 ± 3,0 26,1 ± 1,3
0,22
Largura (mm)
16,7 ± 2,9 18,3 ± 3,0 17,0 ± 2,4 17,6 ± 2,2
0,31
Altura (mm)
13,1 ± 2,3ab
14,0 ± 1,7a 13,3 ± 2,1ab
11,4 ± 1,4b
0,038
N
0
de
Folículos
superficiais
25,8 ± 16,2a
14,0 ± 4,2b 15,0 ± 5,8ab
15,3 ± 5,4ab
0,004
Letras minúsculas comparam médias dos períodos. Médias seguidas de pelo menos uma letra
em comum não diferem significativamente.
No entanto, as fases da gestação não influenciaram os resultados obtidos
nas vacas (Tabela 4).
68
Tabela 4. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo o período de gestação das vacas.
Período de gestação
Variável Não
gestante
(n= 59)
Inicial
(n= 21)
Médio
(n= 11)
Final
(n= 4)
p
Peso (g)
7,9 ± 2,8 7,5 ± 2,1 7,2 ± 1,9 7,0 ± 1,5
0,76
Comprimento
(mm)
30,5 ± 4,9 31,0 ± 4,6 31,8 ± 6,6 33,1 ± 3,4
0,70
Largura (mm)
21,7 ± 3,8 21,7 ± 2,7 22,1 ± 2,4 21,2 ± 1,7
0,97
Altura (mm)
15,7 ± 2,3 15,4 ± 2,0 14,8 ± 1,5 13,9 ± 1,1
0,30
N
0
de
Folículos
superficiais
36,7 ± 20,5 36,1 ± 15,4 30,8 ± 12,9 30,1 ± 15,3
0,73
Os pesos ovarianos foram similares aos relatos da literatura para búfalas
(EL-WISHY et al., 1971; VITTORIA, 1997; GANGULI et al., 1998; VALE &
RIBEIRO, 2005; CARVALHO, 2006, este último em búfalas da raça Murrah).
Não obstante, foram um pouco maiores do que os descritos por Danell (1987),
uma vez que o autor determinou o peso dos ovários em novilhas, que
apresentam sistema genital menos desenvolvido do que animais adultos.
Já nas vacas, o peso ovariano foi semelhante ao descrito por Carvalho
(2006) em vacas da raça Nelore (7,9 g) e inferior ao comunicado por Sisson
(1986) e Vittoria (1997) em vacas taurinas (15 a 20 g e 8,5 g, respectivamente).
Nos artigos consultados que estudaram a biometria ovariana de búfalas, a
comparação dos dados foi feita entre os ovários direito e esquerdo e não entre
ovários de animais gestantes e não gestantes. Contudo, foram encontrados
trabalhos que avaliaram ovários de vacas gestantes e “vazias”.
De forma geral, as medidas ovarianas bubalinas foram semelhantes a
Fadle et al. (1974), Vale et al. (1982), Danell (1987), Parkale & Hukeri (1989) e
Vale & Ribeiro (2005) e menores do que Alvarez & Oba (1995) devido ao fato
destes autores terem avaliado os ovários após a estimulação com FSH ou
PMSG.
69
Pequenas diferenças acerca do peso e medidas do ovário são esperadas,
já que podem variar com o peso corporal do animal. Em novilhas bubalinas da
raça Surti, Danell (1987) verificou uma correlação positiva entre o peso do
sistema genital e o peso e tamanho corporais. Nos diversos trabalhos, a
população de animais estudada é heterogênea, incluindo diferentes idades e
pesos.
As mensurações ovarianas foram compatíveis às anteriormente citadas na
literatura para a espécie bovina (SISSON & GROSSMAN, 1981; CARVALHO,
2006) e superiores às médias de Chacur et al. (2006) (com exceção da
espessura). Para estes autores, o comprimento, largura e espessura do ovário
foram de 2,8; 2,0 e 1,7 cm (lado esquerdo) e 2,8; 1,8 e 1,6 cm (lado direito) em
vacas zebuínas não prenhes.
Nascimento et al. (2003) também não relataram diferenças no tamanho
dos ovários direito (3,1 ± 0,1 e 3,3 ± 0,1 cm) e esquerdo (3,0 ± 0,1 e 3,2 ± 0,1
cm) de vacas cíclicas e gestantes, respectivamente. Entretanto, quando os
pesquisadores determinaram o tamanho do ovário nos terços inicial (3,0 ± 0,1
cm), médio (3,4 ± 0,1 cm) e final (3,5 ± 0,1 cm) da gestação, os ovários foram
menores no período inicial (P< 0,05). Os autores não especificaram a raça dos
animais utilizados no experimento.
No presente trabalho constatou-se que, quando o CL estava presente no
ovário das búfalas, ocupava uma grande área do ovário, restando menos tecido
ovariano para o desenvolvimento folicular. Frente a isso, as búfalas gestantes
mostraram menos folículos superficiais, pois todas tinham CL. O mesmo evento
não foi verificado nas vacas, já que o número de folículos superficiais não foi
afetado pelo estado reprodutivo. Para comprovar este evento, o número de
folículos superficiais dos ovários com CL e sem CL foi determinado, sem
considerar o par de ovários e sim, a unidade. De um total de 172 ovários
bubalinos avaliados, 104 (60,5%) não apresentavam CL e 68 (39,5%)
continham CL. O número médio de folículos superficiais contabilizados nos
ovários sem CL foi 24,9 ± 15,5 e nos ovários com CL 16,4 ± 11,6 (p= 0,0002;
teste ‘t’ de Student). Já nas vacas, de 190 ovários analisados, 91(47,9%) não
apresentavam CL e 99 (52,1%) continham CL. O número médio de folículos
superficiais contabilizados nos ovários sem CL foi 34,9 ± 18,3 e nos ovários
com CL 36,3 ± 21,4 (p= 0,65; teste ‘t’ de Student). Ficou claro que o CL tem
70
uma influência negativa no número de folículos superficiais dos ovários
bubalinos.
Das et al. (1996) notificaram que a presença do CL reduz
significativamente o número de folículos ovarianos em búfalas. Em contradição,
quando Abdoon & Kandil (2001) estudaram o efeito da presença do CL no
número de folículos ovarianos superficiais de búfalas egípcias (pântano)
obtiveram 5,8 ± 0,3 (com CL) e 4,3 ± 0,2 (sem CL) folículos/ ovário (p< 0,05).
Para os autores, a razão para essa incoerência foi atribuída à raça ou às
diferenças genotípicas na função ovariana entre búfalos de rio e de pântano.
No entanto, não foram encontrados outros artigos que comprovassem que as
diferenças genotípicas entre as duas classificações de búfalos apresentam
efeito na função ovariana, necessitando-se de experimentos repetidos para
afirmar tal ocorrência.
Em 300 ovários recuperados de búfalas de rio abatidas, apresentando em
média 2,3 ± 0,5 cm (comprimento) e 1,9 ± 0,4 cm (largura), Ganguli et al.
(1998) observaram 10,0 ± 3,0 folículos superficiais, no entanto os ovários com
CL não foram avaliados separadamente.
Ohashi et al. (1998) avaliaram ovários de búfalas e vacas zebuínas
abatidas em matadouros localizados no estado do Pará. Os autores reportaram
4,5 ± 1,9 e 8,7 ± 5,9 folículos superficiais em ovários bubalinos e bovinos,
respectivamente. Esses valores foram bem inferiores aos obtidos no presente
experimento, porém deve-se considerar que os animais utilizados no
experimento de Ohashi et al. (1998) eram criados sob um manejo alimentar
inadequado, refletindo em escore corporal baixo.
Abdoon & Kandil (2001) também analisaram a população folicular em
relação ao status reprodutivo e verificaram que búfalas Egípcias gestantes e
cíclicas continham número semelhante de folículos, o que não foi averiguado
nesta pesquisa. Ainda segundo os autores, as fêmeas em anestro
apresentaram um pequeno número de folículos superficiais (p< 0,01).
A tabela 5 apresenta os resultados da morfometria ovariana das duas
espécies avaliadas no experimento. Notou-se que em todas as variáveis, a
espécie bubalina atingiu valores menores. Os dados corroboram com a
literatura, pois o ovário de búfala apresentou-se menor, mais leve e contendo
menos folículos superficiais do que o ovário de vaca (SETTERGREN, 1964;
71
EL-WISHY et al., 1971; ERICKSON, 1986; DANELL, 1987; BETTERIDGE et
al., 1989; LE VAN TY et al., 1989; PARKALE & HUKERI, 1989; GANGULI et
al., 1998; PALTA & CHAUHAN, 1998; GUPTA et al., 2001; VALE & RIBEIRO,
2005; CARVALHO, 2006).
Tabela 5. Média e desvio-padrão das variáveis peso (g), comprimento (mm),
largura (mm) e altura (mm) dos ovários e número de folículos superficiais
segundo a espécie animal.
Espécie animal
Variável
Bubalina
(n= 86)
Bovina
(n= 95)
p
Peso (g)
4,0 ± 2,2 7,7 ± 2,5
<0,001
Comprimento (mm)
24,4 ± 4,0 30,9 ± 5,0
<0,001
Largura (mm)
17,1 ± 2,8 21,7 ± 3,3
<0,001
Altura (mm)
13,1 ± 2,2 15,4 ± 2,1
<0,001
N
0
de Folículos
superficiais
21,5 ± 14,1 35,6 ± 18,5
<0,001
Com relação às presenças de corpo lúteo e folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥
6 mm (vacas), estas foram influenciadas pela gestação.
Todas as búfalas (33/33; 100%) e vacas (36/36; 100%) gestantes
apresentavam CL. Quanto às fêmeas “vazias”, 54,7% (29/53; búfalas) e 86,4%
(51/59; vacas) também possuíam ovários com CL. Das búfalas que
apresentavam CL (n= 62), 8 animais possuíam 2 CL nos ovários. Das vacas
que apresentavam CL (n= 87), 18 fêmeas possuíam mais de 1 CL.
Na comparação das porcentagens pelo teste do qui-quadrado, evidenciou-
se diferença (p= 0,000/ búfalas e p= 0,023/ vacas) para os dois estados
reprodutivos nas duas espécies avaliadas. Na espécie bubalina também se
observou diferença entre não gestantes e todos os períodos de gestação
avaliados (p= 0,000).
Os diâmetros médios para os CL de búfalas e vacas não gestantes e nas
fases inicial, intermediária e final da prenhez foram, respectivamente, 12,7 ±
5,7 mm (n= 36) e 15,3 ± 6,6 mm (n= 71); 17,3 ± 3,3 mm (n= 13) e 20,5 ± 3,7
72
mm (n= 22); 17,6 ± 2,2 mm (n= 10) e 20,9 ± 1,9 mm (n= 12); 16,8 ± 2,7 mm (n=
11) e 20,6 ± 0,7 mm (n= 5).
Em apenas 3 corpos lúteos de búfalas (4,3%; 3/70) e 9 corpos lúteos de
vacas (8,2%; 9/110) foram encontradas cavidades na massa luteal. O diâmetro
médio da cavidade foi de 8,1 ± 5,1 e 9,9 ± 6,5 mm para búfalas e vacas
respectivamente. A figura 12 ilustra os corpos lúteos cavitários bubalino e
bovino.
Viana et al. (1999) encontraram, em vacas Gir, 37,1% de cavidades luteais
entre os dias 7 e 16 do ciclo por meio de ultra-som. Neves et al. (2002)
observaram 16,3% de cavidade luteais em vacas Nelore não gestantes e 2,3%
em gestantes. No presente estudo, todas as fêmeas que apresentaram CL
cavitário estavam “vazias” no momento do abate, corroborando com os
achados de Neves et al. (2002). Segundo estes pesquisadores, as cavidades
luteais tendem a se obliterar em CL cíclicos e gestacionais, por isso a baixa
incidência deste tipo de CL em fêmeas gestantes.
Da mesma maneira, Barile et al. (2007) e Neves et al. (2002) trabalhando
com búfalas e vacas zebus, respectivamente, reportaram diâmetro luteal
superior para animais gestantes.
Barile et al. (2007) compararam o diâmetro médio do CL em búfalas que
emprenharam ou não, após a inseminação artificial (IA). Os valores obtidos
para fêmeas prenhes e não prenhes foram: 19,6 ± 1,0 e 16,6 ± 1,0 mm (7 dias
após a IA); 21,2 ± 0,9 e 18,5 ± 1,0 mm (14 dias após a IA); 20,1 ± 0,9 e 16,3 ±
1,0 mm (21 dias após a IA); 20,5 ± 0,9 e 11,9 ± 1,2 mm (28 dias após a IA) e
21,1 ± 0,9 e 11,3 ± 1,7 mm (35 dias após a IA).
Em zebuínos, o diâmetro do CL variou de 15,9 a 17,7 mm (Figueiredo et
al., 1997). Trabalhando com animais da mesma subespécie não gestantes,
Chacur et al. (2006) encontraram diâmetro médio do CL de 16,7 mm (lado
esquerdo) e 15,8 mm (lado direito), resultados superiores aos obtidos no
presente estudo para essa categoria de vacas.
Na leitura dos dados do presente estudo, notou-se que o tamanho do CL
não alterou conforme o avanço da gestação nas búfalas e nas vacas. Porém,
quando Singh et al. (1990) verificaram o tamanho e o peso do CL em búfalas
prenhes, essas variáveis aumentaram até o quarto mês de gestação,
73
permanecendo estáveis até o quinto mês (momento final de avaliação dos
autores).
Apesar de ter havido predominância de CL nas fêmeas gestantes, a
presença de tal estrutura não interferiu no peso e nas medidas do ovário, uma
vez que essas mensurações foram similares na análise estatística.
A presença de folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥ 6 mm (vacas) foi superior nas
fêmeas não gestantes (77,4 e 84,7%, respectivamente) do que nas demais
(57,6 e 47,2%). No entanto, quando se avaliou cada período separadamente foi
possível identificar que o estágio final da gestação foi responsável pela
diferença, conforme apresentado na tabela 6.
Tabela 6. Freqüência da presença de folículos em búfalas e vacas não
gestantes e nos períodos inicial, médio e final da gestação.
Presença de folículo ≥ 7/ 6 mm
Espécie Período de gestação Não (%) Sim (%) Total (%)
Não gestante (n= 53)
12 (22,6) 41 (77,4) A 53 (100)
Inicial (n= 13) 3 (23,1) 10 (76,9) A 13 (100)
Médio (n= 10) 2 (20,0) 8 (80,0) A 10 (100)
Final (n= 10) 9 (90,0) 1 (10,0) B 10 (100)
Bubalina
Total 26 60 86
Não gestante (n= 59)
9 (15,3) 50 (84,7) A 59 (100)
Inicial (n= 21) 10 (47,6) 11 (52,4) AB 21 (100)
Médio (n= 11) 6 (54,5) 5 (45,5) AB 11 (100)
Final (n= 4) 3 (75,0) 1 (25,0) B 4 (100)
Bovina
Total (n= 95) 28 67 95
Χ
2
= 19,196; p = 0,000 (búfalas) e Χ
2
= 16,4; p = 0,001 (vacas). Letras maiúsculas comparam
percentuais nos períodos. Períodos seguidos de pelo menos uma letra em comum não diferem
significativamente.
Os diâmetros médios para os folículos contabilizados (≥ 7 mm/ búfalas e ≥
6 mm/ vacas) de búfalas e vacas não gestantes e nas fases inicial,
intermediária e final da prenhez foram, respectivamente, 8,6 ± 1,6 (n= 48) e 8,4
± 2,2 (n= 72); 9,1 ± 1,9 (n= 10) e 7,3 ± 1,7 (n= 14); 8,6 ± 1,8 (n= 10) e 7,0 ± 0,7
(n= 7); 7,5 mm (n= 1) e 7,5 mm (n= 1).
74
Em vacas não gestantes, Chacur et al. (2006) identificaram e mensuraram
o maior folículo presente nos ovários direito (8,4 mm) e esquerdo (8,1 mm),
continuando em concordância com os resultados descritos no presente
trabalho.
Búfalas prenhes (p= 0,006), em todos os períodos gestacionais (p= 0,013),
apresentaram maior número de CL do que as não prenhes. No entanto, este
fato não foi observado na espécie bovina, uma vez que as vacas gestantes e
em todas as fases gestacionais apresentaram números de CL semelhantes às
não gestantes, conforme está demonstrado nas tabelas 7 e 8.
Por sua vez, os animais não gestantes possuíram mais folículos ≥ 7 mm
(p= 0,009) e ≥ 6 mm (p= 0,025), principalmente com relação aos animais no
início da gestação (Tabelas 7 e 8).
Tabela 7. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos números de corpos lúteos (N
0
de CL) e
folículos ≥ 7/ 6 mm (N
0
de Fol ≥ 7/ 6 mm) segundo o estado reprodutivo das
búfalas e vacas.
Estado Reprodutivo
Espécie Variável Não gestante Gestante p
N
0
de CL 1,0 [0,0; 1,0] 1,0 [1,0; 1,0] 0,006
Bubalina
N
0
de Fol ≥ 7 mm
1,0 [0,8; 1,0] 0,0 [0,0; 1,0] 0,009
N
0
de CL 1,0 [1,0; 1,8] 1,0 [1,0; 1,0] 0,68
Bovina
N
0
de Fol ≥ 6 mm
1,0 [1,0; 2,0] 1,0 [0,0; 1,0] 0,025
75
Tabela 8. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos números de corpos lúteos (N
0
de CL) e
folículos ≥ 7/ 6 mm (N
0
de Fol ≥ 7/ 6 mm) segundo o período de gestação das
búfalas e vacas.
Período de gestação
Espécie
Variável
Não
gestante
Inicial
Médio
Final
p
N
0
de
CL
1,0[0,0;1,0]b
1,0[1,0;1,0]a
1,0[1,0;1,0]a
1,0[1,0;1,0]a
0,013
Bubalina
N
0
de
Fol ≥ 7
mm
1,0[0,8;1,0]a
0,0[0,0;0,5]b
0,0[0,0;1,0]ab
0,0[0,0;1,0]ab
0,041
N
0
de
CL
1,0[1,0;1,8]
1,0[1,0;1,0]
1,0[1,0;1,0] 1,0[1,0;1,5] 0,85
Bovina
N
0
de
Fol ≥ 6
mm
1,0[1,0;2,0]a
0,0[0,0;1,0]b
1,0[1,0;1,0]ab
1,0[0,5;1,5]ab
0,02
Letras minúsculas comparam períodos. Períodos seguidos de pelo menos uma letra em
comum não diferem significativamente.
Para Abdoon & Kandil (2001) a população de folículos com diâmetro médio
de 4 a 9 mm foi semelhante entre búfalas do pântano gestantes (0,6 ± 0,0) e
nos dias 1-3 (0,8 ± 0,2) e 4-9 (0,8 ± 0,3) do ciclo estral e inferior à verificada em
animais em anestro e nos dias 10-16 e 17-22 do ciclo estral. No presente
estudo, as fêmeas gestantes apresentaram menos folículos ≥ 7 mm, todavia os
dias do ciclo estral não foram determinados nas fêmeas não gestantes.
Em 11 búfalas cíclicas da raça Murrah, Gupta et al. (2006) observaram que
17% dos folículos estudados eram médios (6 – 9 mm; média de 0,6).
Apesar do número de folículos ovarianos ser menor na espécie bubalina e,
conseqüentemente, o número de folículos antrais, nesse experimento, a
proporção encontrada para folículos ≥ 7 mm (búfalas) e ≥ 6 mm (vacas) foi
semelhante nas duas espécies. Porém, as búfalas possuíram menor número
de corpos lúteos do que as vacas, indicando que apresentaram menos
ovulações (Tabela 9).
76
Tabela 9. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] referentes às presenças de corpo lúteo (CL)
e folículos ≥ 7/ 6 mm segundo a espécie animal.
Espécie animal
Variável
Bubalina
(n= 86)
Bovina
(n= 95)
p
N
0
de CL 1,0 [0,0; 1,0] 1,0 [1,0; 1,0] 0,003
N
0
de Fol ≥ 7/ 6
mm
1,0 [0,0; 1,0] 1,0 [0,0; 1,0] 0,07
Considerando-se a época do ano, búfalas abatidas na primavera/ verão
(27/51; 52,9%) não apresentaram corpos lúteos na mesma constância (p=
0,000) do que as fêmeas abatidas no outono/ inverno (35/35; 100%). Os dados
estão apresentados na tabela 10. Os folículos ≥ 7 mm foram encontrados
igualmente nas referidas épocas.
Com relação às vacas, fêmeas abatidas na primavera ou verão (68/75;
90,7%) apresentaram corpos lúteos na mesma freqüência do que as fêmeas
abatidas no outono ou inverno (19/20; 95,0%). Da mesma forma, os folículos ≥
6 mm foram encontrados igualmente nas épocas do ano avaliadas (73,3%
primavera/ verão e 60,0% outono/ inverno).
Tabela 10. Freqüência da presença de corpo lúteo (CL) e a época do ano em
búfalas.
Presença de CL
Época do ano Não (%) Sim (%) Total (%)
Primavera/ Verão 24 (47,1) 27 (52,9) 51 (100)
Outono/ Inverno 0 (0) 35 (100) 35 (100)
Total 24 62 86
Χ
2
= 22,846; p= 0,000
Das búfalas abatidas na primavera/ verão que apresentaram CL (n= 27),
51,9% (14/27) estavam “vazias” e 48,1% (13/27) estavam prenhes. Das búfalas
abatidas no outono/ inverno (n= 35), 15 (42,9%) estavam “vazias” e 20 (57,1%)
prenhes. É sabido que a atividade reprodutiva cíclica das fêmeas bubalinas é
influenciada pelo comprimento de luz do dia, sendo que a maior prevalência de
77
estros é observada no outono. No estado de São Paulo, as búfalas são
sazonais. Apesar do número de animais avaliado ter sido pequeno, os
resultados do presente experimento mostraram que todas as fêmeas abatidas
no outono/ inverno apresentaram CL, indicando que as búfalas “vazias”
ovularam e estavam em atividade cíclica.
Conforme apresenta a tabela 11, os corpos lúteos classificados como II
(correspondentes aos dias 5 a 10 do ciclo estral) e III (dias 11 a 17 do ciclo
estral) foram mais freqüentes nas duas espécies estudadas. Os estágios dos
CL estão ilustrados nas figuras 13 e 14.
Esse comportamento foi semelhante ao descrito por Abdoon & Kandil
(2001), que determinaram os dias do ciclo estral das búfalas abatidas usando
uma classificação semelhante para o CL e obtiveram 16,1; 25,3; 40,2 e 18,4%
para CL correspondentes às classificações I, II, III e IV, respectivamente.
Tabela 11. Distribuição da freqüência de corpos lúteos (CL) segundo a
classificação em búfalas e vacas.
Classificação do CL
Espécie
I (%) II (%) III (%) IV (%)
Total (%)
Bubalina 7 (10,0)b 25 (35,7)a 29 (41,4)a 9(12,9)b 70(100,0)
Bovina 20 (18,2)b 48 (43,6)a 39 (35,5)a 3 (2,7)b 110(100,0)
p< 0,0001
Com relação aos animais que continham CL nos ovários, as 29 búfalas
“vazias” apresentaram um total de 36 CL, pois 7 fêmeas possuíam 2 CL. Dos
36 CL, 7 (19,4%) foram classificados como CL I; 12 (33,3%) CL II; 10 (27,8%)
CL III e 7 (19,4%) CL IV. As 33 búfalas prenhes apresentaram um total de 34
CL, sendo 0 (0%) CL I; 13 (38,2%) CL II; 19 (55,9%) CL III e 2 (5,9%) CL IV. As
51 vacas “vazias” apresentaram um total de 71 CL, sendo 19 (26,8%) CL I; 34
(47,9%) CL II; 15 (21,1%) CL III e 3 (4,2%) CL IV. As 36 vacas gestantes
apresentaram 39 CL e destes, 1 (2,6%) era CL I; 14 (35,9%) CL II; 24 (61,5%)
CL III e 0 (0%) CL IV. Os mais “vazios” apresentaram mais CLII e os animais
gestantes mais CLIII, em ambas espécies.
Os diâmetros médios de cada classificação dos CL bubalino e bovino
foram 5,2 ± 0,9 (n= 7) e 6,4 ± 1,8 (n= 20) mm para CL I; 17,6 ± 2,6 (n= 25) e
78
19,8 ± 3,2 (n= 48) mm para CL II; 17,2 ± 2,1 (n= 29) e 20,0 ± 3,2 (n= 39) mm
para CL III; 7,8 ± 1,8 (n= 9) e 8,7 ± 2,7 (n= 3) mm para CL IV, respectivamente.
As medidas de todos os estágios do CL bubalino e bovino corresponderam
aos achados de Ireland et al. (1980), mesmo tendo em vista que os
pesquisadores avaliaram corpos lúteos de novilhas da raça Hereford. Em 146
animais, as porcentagens de novilhas com CL de aparência I, II, III e IV foram
20, 29, 36 e 15%, respectivamente.
Nascimento et al. (2003) determinaram as diferentes fases do ciclo estral
em vacas apresentando atividade ovariana luteal cíclica, utilizando a mesma
classificação de Ireland et al. (1980). As freqüências dos animais que
apresentavam CL nos estágios I, II, III e IV foram 28,1; 28,1; 28,1 e 15,6%,
respectivamente. Em adição, eles mediram as áreas dos CL, que foram 2,3 ±
0,4 cm
2
(estágio I), 3,1 ± 0,4 cm
2
(estágio II), 3,9 ± 0,4 cm
2
(estágio III) e 2,4 ±
0,5 cm
2
(estágio IV).
79
Figura 11. Ovários bubalinos com formato redondo (a); alongado (b; esquerda)
e oval (b; direita).
Figura 12. Ovário bubalino com corpo lúteo cavitário (a); ovário bovino com
corpo lúteo cavitário (b).
11b
11a
12a
12b
80
Figura 13. Classificações dos corpos lúteos bubalino. CL I (a); CLII (b, c); CLIII
(d, e) e CL IV (f, g).
13a
13b
13c
13d
13f
13e
13g
81
Figura 14. Classificações dos corpos lúteos bovino. CL I (a); CLII (b, c, d); CLIII
(e, f).
14a
14c
14d
14b
14e
14f
82
6.2. Morfometria dos Folículos Ovarianos
Apesar do material processado conter muitos folículos, para uma avaliação
mais precisa e confiável, foram contabilizados apenas os folículos que
apresentavam ovócito e aparência morfológica normal, ou seja, aqueles que
não apresentavam retração, culminando em um número pequeno de folículos
avaliados (n= 103 – búfalas e n= 161 – vacas), principalmente os antrais.
Os folículos primordiais (Figuras 15a e 16a) estavam envolvidos por uma
camada de células de forma pavimentosa. Nos folículos em transição (Figura
16b), verificou-se que algumas células já apresentavam forma cuboidal,
enquanto que, nos primários (Figuras 15b e 16c), todas as células possuíam tal
formato. Nestas categorias, o ovócito representou grande parte no tamanho
total do folículo. A transição para o folículo secundário (Figura 15c)
caracterizou-se pela formação de duas camadas de células e progrediu com a
visualização da zona pelúcida e células tecais, nos estágios mais avançados
(Figuras 15d e 16d). Folículos terciários com morfologia normal e ovócito no
seu interior não foram observados nas búfalas. Já nas vacas, os folículos
terciários (Figura 16e) possuíam ovócito envolto pela zona pelúcida, corona
radiata, células do cumulus e tecais e um pequeno espaço preenchido com
líquido secretado pelas células foliculares (antro). Nas búfalas, foi verificado um
folículo em uma fase mais adiantada, constituindo um folículo maduro em
estágio inicial (Figura 15e). No folículo pré-ovulatório, notou-se a presença de
todos os constituintes do folículo terciário, porém, o complexo cumulus
oophorus se apresentava bem destacado das células murais e o antro era bem
desenvolvido (Figuras 15f, 16f, 16g e 16h). Conforme a evolução dos folículos,
a relação ovócito: folículo diminuiu. Em todos os tipos de folículos visualizou-se
uma fina camada de glicoproteínas, caracterizando a membrana plasmática
que os individualizavam do estroma ovariano.
83
Nas búfalas, a média e o desvio-padrão do diâmetro do folículo primordial
(n= 14), em transição (n= 14), primário (n= 54), secundário (n= 14) e pré-
ovulatório (n= 7) foram, respectivamente, 37,0 ± 3,5; 37,9 ± 5,9; 42,9 ± 9,7;
94,3 ± 34,7 e 1.208,0 ± 1.106,6 µm. Os diâmetros médios foram menores para
os folículos primordiais, em transição e primários e maiores para os folículos
secundários e pré-ovulatórios (p< 0,001).
Nas vacas, a média e desvio-padrão do diâmetro do folículo primordial (n=
47), em transição (n= 19), primário (n= 56), secundário (n= 14), terciário (n= 10)
e pré-ovulatório (n= 15) foram, respectivamente, 37,9 ± 5,2; 41,6 ± 4,9; 45,7 ±
10,0; 110,2 ± 61,1; 348,0 ± 143,2 e 1.742,0 ± 1.372,1 µm. Os diâmetros médios
foram menores para os folículos primordiais, em transição e primários e
maiores para os folículos secundários, terciários e pré-ovulatórios (p< 0,001).
Os diâmetros médios dos ovócitos provenientes dos folículos primordiais
foram de 24,9 ± 3,5 µm (n= 14/ búfalas) e 25,5 ± 4,2 µm (n= 47/ vacas); dos
folículos em transição de 23,9 ± 5,8 µm (n= 14/ búfalas) e 27,5 ± 3,8 µm (n= 19/
vacas); dos folículos primários de 26,6 ± 9,1 µm (n= 54/ búfalas) e 29,0 ± 7,7
µm (n= 56/ vacas); dos folículos secundários de 37,8 ± 8,4 µm (n= 14/ búfalas)
e 43,9 ± 14,4 µm (n= 14/ vacas); dos folículos terciários de 73,5 ± 20,1 µm (n=
10/ vacas) e dos folículos pré-ovulatórios de 75,2 ± 20,7 µm (n= 7/ búfalas) e
92,1 ± 22,7 µm (n= 15/ vacas).
Na espécie bubalina, o diâmetro dos ovócitos foi maior quando
provenientes dos folículos pré-ovulatórios (p< 0,001). Na espécie bovina, o
diâmetro foi superior para os ovócitos procedentes dos folículos secundários,
terciários e pré-ovulatórios (p< 0,001).
Nos ovócitos dos folículos ovarianos bubalinos, os núcleos estavam
aparentes somente em 11 folículos primordiais (9,6 ± 1,5 µm), 9 em transição
(8,6 ± 2,0 µm), 40 primários (10,0 ± 2,1 µm) e 1 secundário (9,0 µm). Não
houve diferenças entre esses valores (p= 0,43; n= 61). Já nos ovócitos dos
folículos ovarianos bovinos, os núcleos estiveram evidentes em 25 folículos
primordiais (11,0 ± 1,6 µm), 14 em transição (10,5 ± 1,9 µm), 37 primários (10,4
± 2,3 µm), 7 secundários (20,2 ± 5,0 µm), 2 terciários (22,0 ± 7,5 µm) e 2 pré-
ovulatórios (26,5 ± 7,1 µm, em média). Os núcleos foram maiores para os
folículos pré-ovulatórios e menores para os folículos em transição e primários
(p< 0,001; n= 88).
84
Os diâmetros médios do antro dos folículos terciários (vacas) e pré-
ovulatórios (búfalas e vacas) foram de 104,2 ± 79,6 (n= 10), 798,9 ± 933,8 (n=
7) e 1.353,1 ± 1.358,0 µm (n= 15).
Os dados dos diâmetros dos folículos, ovócitos e núcleos estão
representados nas tabelas 12 (búfalas) e 13 (vacas).
Tabela 12. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo
(µm) segundo a classificação do folículo ovariano para as búfalas.
Diâmetros
Classificação
Folículo (µm)
(n)
Ovócito (µm)
(n)
Núcleo (µm)
(n)
Primordial
37,4 [34,3; 40,1]
(n= 14) B
24,6 [22,9; 27,9]
(n= 14) B
9,5 [8,7; 10,3]
(n= 11)
Transição
38,4 [33,8; 40,2]
(n= 14) B
22,2 [20,6; 27,8]
(n= 14) B
9,5 [6,8;9,9]
(n= 9)
Primário
40,6 [37,1; 46,6]
(n= 54) B
25,3 [21,4; 28,9]
(n= 54) B
9,9 [8,4;11,1]
(n= 40)
Secundário
85,0 [73,6; 95,7]
(n= 14) A
36,5 [33,0; 39,7]
(n= 14) B
9,0 [9,0;9,0]
(n= 1)
Pré-ovulatório
553,6 [467,3; 1.690,5]
(n= 7) A
69,5 [60,9; 92,1]
(n= 7) A
(n= 0)
p <0,001 (n= 103) <0,001 (n= 103) 0,43 (n= 61)
Letras maiúsculas comparam classificações. Classificações seguidas de pelo menos uma letra
em comum não diferem significativamente.
85
Tabela 13. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] dos diâmetros do folículo, ovócito e núcleo
segundo a classificação do folículo ovariano para as vacas.
Diâmetros
Classificação
Folículo (µm)
(n)
Ovócito (µm)
(n)
Núcleo (µm)
(n)
Primordial
37,7 [34,6; 41,1]
(n= 47) B
26,2 [22,2; 28,3]
(n= 47) B
11,0 [10,1; 11,7]
(n= 25) AB
Transição
41,1 [38,0; 44,7]
(n= 19) B
27,9 [25,1; 29,5]
(n= 19) B
10,0 [9,3; 11,1]
(n= 14) B
Primário
44,8 [40,5; 50,2]
(n= 56) B
28,2 [23,8; 32,1]
(n= 56) B
10,6 [8,7; 11,5]
(n= 37) B
Secundário
83,1 [71,7; 118,3]
(n= 14) A
38,0 [34,3; 54,7]
(n= 14) A
18,8 [16,6; 24,5]
(n= 7) AB
Terciário
342,8 [219,1; 491,3]
(n= 10) A
68,9 [62,1; 90,3]
(n= 10) A
22,0 [16,6; 27,3]
(n= 2) AB
Pré-ovulatório
1.167,2[624,5; 3.001,4]
(n= 15) A
88,1 [75,2,8; 115,2]
(n= 15) A
29,8 [21,2; 30,9]
(n= 3) A
P <0,001 (n= 161) <0,001 (n= 161) <0,001 (n= 88)
Letras maiúsculas comparam classificações. Classificações seguidas de pelo menos uma letra
em comum não diferem significativamente.
Comparando-se as dimensões do folículo ovariano nas espécies bubalina
e bovina, verificou-se diferença significativa entre os diâmetros: do folículo
primário (p= 0,038), dos ovócitos provenientes dos folículos em transição (p=
0,021) e dos folículos primários (p= 0,015) e do núcleo do ovócito do folículo
primordial (p= 0,016), segundo o teste de Mann-Whitney.
Os tamanhos foliculares e ovocitários obtidos foram compatíveis com os
intervalos estabelecidos por Kumar et al. (1997) em búfalas do tipo rio. Para os
pesquisadores, os diâmetros dos folículos primário, secundário e pré-ovulatório
variaram de 25 a 80; 50 a 100 e 300 a 3.000 µm. No entanto, para os diâmetros
dos ovócitos, os valores registrados por eles foram menores (12 a 24 e 20 a 30
µm, primário e secundário, respectivamente) e similar (60 a 200 µm, pré-
ovulatório) aos averiguados nesse experimento.
86
Carvalho (2005) obteve medidas inferiores quando estimou o diâmetro de
folículos pré-antrais de búfalas mestiças Murrah x Mediterrâneo adultas, sendo
32,7; 35,1; 39,3 e 83,1 µm os diâmetros dos folículos primordial, em transição,
primário e secundário, respectivamente. Entretanto, para diâmetros dos
ovócitos e núcleos dos folículos primordial, em transição, primário e
secundário, as medidas verificadas por essa pesquisadora foram maiores
(26,3; 26,9; 28,0 e 40,9 µm para o ovócito) e (10,3; 10,6; 12,1 e 12,9 µm para o
núcleo), respectivamente. As diferenças nos resultados decorreram da
utilização de animais provenientes de abatedouro, resultando na avaliação de
ovários de uma população variada. Nesse sentido, apesar da autora ter
estudado a mesma raça avaliada na presente tese, a idade precisa, o peso e o
escore corporal das fêmeas não foram estimados em ambos estudos.
Os resultados do presente experimento em fêmeas bubalinas foram
similares aos encontrados por Mondadori et al. (2007). Somente as medidas
para o ovócito e o folículo secundário foram inferiores para os autores (53,3 e
29,4 µm, respectivamente). Pela descrição e fotos documentadas, os folículos
avaliados por eles representavam o início da passagem para folículo
secundário.
Os diâmetros do folículo e ovócito bovino, em cada categoria, foram
superiores para os descritos em búfalas (MONDADORI et al., 2007), ovelhas
(van den HURK & ZHAO, 2005) e cabras (ARIYARATNA & GUNAWARDANA,
1997; LUCCI et al., 2001). No entanto, os valores foram idênticos para o
diâmetro do folículo secundário (83,1 µm) e menores do que ovócitos do
folículo primordial (26,3 µm) e secundário (40,9 µm) em búfalas adultas
(CARVALHO, 2005).
Nas vacas, os valores obtidos para diâmetro folicular foram próximos aos
divulgados na literatura para a mesma espécie. Os folículos podem variar de 30
a 50 µm (primordial), 40 a 60 µm (primário) e chegar a 150 µm (secundário)
(GORDON, 1994a). Para Hulshof (1995) e Braw-Tal & Yossefi (1997),
estudando vacas taurinas, os folículos primordial, primário e secundário
possuíram diâmetros médios de 34,6 e 35,2; 46,1 e 55,1; 101,7 e 81-250 µm,
respectivamente. Kacinskis et al. (2005) descreveram as seguintes medidas em
vacas zebuínas: 36,0 ± 0,9; 48,5 ± 1,4 e 88,4 ± 2,9 µm para as mesmas
87
classes foliculares, todavia, os folículos secundários avaliados eram pequenos,
segundo os autores.
Os ovócitos bovinos podem ter 20 a 35 µm (primordial), 30 a 40 µm
(primário) e aproximadamente 60 µm (secundário) (GORDON, 1994a).
Considerando-se a dimensão do ovócito, os resultados foram abaixo dos
enunciados por Gordon (1994a) (com exceção do ovócito do folículo
primordial), Hulshof (1995) e Kacinskis et al. (2005). Nas duas últimas
referências, os valores médios foram 27,9 ± 3,3 e 28,1 ± 0,6 µm (primordial),
31,6 ± 4,3 e 31,7 ± 0,7 µm (primário) e 45,6 ± 14,0 e 43,8 ± 1,4 µm
(secundário), respectivamente.
De forma geral, os resultados obtidos foram previstos, uma vez que, com o
crescimento do folículo ovariano esperava-se encontrar aumento nos diâmetros
folicular e ovocitário. Comparando-se os valores do presente experimento com
os registrados na literatura, existem algumas diferenças, que podem ser
decorrentes da utilização de animais de subespécies, raças, idades e pesos
distintos. Deve-se salientar que a maioria dos estudos com a espécie bovina é
realizada com fêmeas de raças taurinas e poucos dados são encontrados
referentes a animais zebuínos, os avaliados neste estudo. Além disso, a região
do ovário onde foram realizados os cortes, o número de cortes, o
processamento histológico do material, a leitura das lâminas, são fatores que
influenciam a população de folículos analisada em cada artigo.
Com relação ao número de células que circundam o ovócito, as médias
para cada tipo de folículo estão demonstradas na tabela 14. Segundo a análise
de variância, os ovócitos provenientes dos folículos pré-ovulatórios de búfalas e
vacas apresentaram mais células circundantes. Isso se deve ao fato de que
esses ovócitos também apresentaram os maiores diâmetros e
conseqüentemente continham maior superfície de contato.
88
Tabela 14. Média e desvio-padrão do número de células foliculares ao redor do
ovócito segundo a classificação do folículo ovariano em búfalas e vacas.
Espécie Classificação N
0
de células foliculares
Bubalina
Primordial (n)
Transição (n)
Primário (n)
Secundário (n)
Pré-ovulatório (n)
8,8 ± 2,6 (14) C
11,0 ± 2,5 (14) C
12,2 ± 4,3 (54) C
16,8 ± 6,3 (14) B
32,4 ± 8,3 (7) A
p <0,001 (103)
Bovina
Primordial (n)
Transição (n)
Primário (n)
Secundário (n)
Terciário
Pré-ovulatório (n)
8,0 ± 2,4 (47) E
10,4 ± 2,5 (19) DE
12,7 ± 4,0 (56) D
21,6 ± 7,5 (14) C
32,0 ± 7,7 (10) B
39,1 ± 9,3 (15) A
p <0,001 (161)
Letras maiúsculas comparam classificações. Classificações seguidas de pelo menos uma letra
em comum não diferem significativamente.
Para Mondadori et al. (2007) os folículos primordiais de búfalas
apresentaram 4 a 8 células ao redor do ovócito e os primários, 8 a 20. Já
Carvalho (2005) contabilizou 5,7; 7,7; 11,6 e 25,4 células circundando os
ovócitos dos folículos primordiais, em transição, primários e secundários,
respectivamente. Em cabras, os números de células da granulosa foram 5,7 ±
0,2 (primordial) e 11,4 ± 0,3 (primário) (LUCCI et al., 2001). Na presente
pesquisa, foram constatadas mais células ao redor do ovócito do folículo
primordial (8,8 ± 2,6) do que nas três referências, este fato pode ser devido ao
pequeno número de folículos avaliados (n= 14), que aumentou a média final.
No entanto, o valor para o folículo secundário foi menor (16,8 ± 6,3) do que o
encontrado por Carvalho (2005) (25,4), porque em nosso experimento, apenas
as células que estavam em contato direto com o ovócito foram avaliadas.
Os resultados para a espécie bovina corroboram com os achados de Fair
et al. (1997a), que consideraram o folículo primordial envolto por 5 a 8 células
89
da granulosa e o folículo em transição, que eles denominaram “folículo
primordial ativado”, circundado por 5 a 14 células. Já o folículo primário
apresentou uma camada de 11-20 (HULSHOF et al., 1992) e 8-20 células
(FAIR et al., 1997a) em vacas taurinas e 14,6 ± 0,7 células (KACINSKIS et al.,
2005) em vacas zebuínas. Entretanto, para Kacinskis et al. (2005), o folículo
secundário apresentou mais células (62,0 ± 4,6), visto que foram somadas
todas as células do folículo, em contradição ao presente experimento, que
considerou exclusivamente as células em contato direto com o ovócito.
No quesito forma do folículo, do ovócito e do núcleo, esta foi
predominantemente oval (95,2; 94,2 e 88,5% - búfalas e 94,4; 87,0 e 78,2% -
vacas, respectivamente). Os ovócitos bubalino (MONDADORI et al., 2007) e
bovino (HULSHOF et al., 1992; FAIR et al., 1997a) podem apresentar formato
esférico ou ovóide.
Em ambas espécies, prevaleceram os ovócitos que apresentavam
vacúolos no citoplasma (97,1%- búfalas e 88,8% - vacas), conforme se verifica
na tabela 15.
Tabela 15. Freqüência de folículos ovarianos de búfalas (n= 103) e vacas (n=
161) segundo a presença de vacúolos no ovócito.
Presença de vacúolos
Espécie Não (%) Sim (%) Total (%)
Bubalina 3 (2,9) 100 (97,1) 103 (100,0)
Bovina 18 (11,2) 143 (88,8) 161 (100,0)
Total 21 243 264
Χ
2
= 5,864 p = 0,015
Os vacúolos visualizados no citoplasma dos ovócitos eram anteriormente
preenchidos por gordura. No processamento das amostras para a técnica
histológica utilizou-se o xilol, que é um solvente de gordura. Então, o que se
observou foram espaços em branco deixados pelas gotículas de gordura no
citoplasma. Foi possível verificar com a análise das amostras que os ovócitos
bubalinos continham mais lipídios no citoplasma do que os ovócitos bovinos,
uma vez que apresentaram maior porcentagem de vacúolos.
90
Nos folículos ovarianos das búfalas, foi constatada a presença de zona
pelúcida em um folículo secundário (espessura de 2,3 µm), em 9 folículos
terciários (espessura de 4,7 ± 1,8 µm, em média) e em 15 folículos pré-
ovulatórios (espessura de 8,7 ± 2,2 µm, em média). Nos folículos ovarianos das
vacas, foi visualizada zona pelúcida em apenas um folículo secundário (7,6 µm
de espessura) e nos sete folículos pré-ovulatórios (7,6 ± 2,6 µm de espessura,
em média). As zonas pelúcidas foram comparativamente mais espessas do
que as medidas descritas para caprinos, que foram de 2,2 ± 0,3 µm (folículo <
1 mm; n= 40) e 3,2 ± 0,3 µm (folículo > 2 mm; n= 34). (ARIYARATNA &
GUNAWARDANA, 1997).
91
Figura 15. Micrografias de folículos ovarianos bubalinos: primordial (a; 400x);
primário (b; 400x); secundário em fase inicial (c; 400x); secundário em fase
tardia (d; 400x); antral com antro menos desenvolvido (e; 100x) e pré-ovulatório
(f; 50x). A: antro.
15
a
15b
15c
15d
15e
15f
A
92
Figura 16. Micrografias de folículos ovarianos bovinos: primordial (a; 400x); em
transição (b; 400x, setas indicam células pavimentosas); primário (c; 400x); secundário
(d; 400x); terciário (e; 400x); pré-ovulatório (f; 200x); complexo cumulus oophorus (g;
400x); parede folicular de folículo pré-ovulatório (h; 200x). A: antro; CG: células da
granulosa; CT: células tecais; N: núcleo; O: ovócito; ZP: zona pelúcida.
ZP
N
O
A
A
CG
CT
A
16a
16b
16c
16d
16e
16f
16g
16h
A
93
6.3. Características Ultra-estruturais dos Folículos Ovarianos
6.3.1. Búfalas
Em búfalas, de todo material processado para microscopia eletrônica de
transmissão foram recuperados poucos folículos, restringindo-se aos
secundários e em progressão para terciário. No entanto, esta avaliação foi
significativa porque forneceu informações importantes acerca da biologia
celular dos ovócitos e células foliculares.
Em geral, a ultra-estrutura dos folículos analisados foi similar à descrita
para búfalas e outras espécies (bubalina: CARVALHO, 2005; MONDADORI et
al., 2007; bovina: FAIR et al. 1997a; HYTTEL et al., 1999; BASSO & ESPER,
2002; KACINSKIS et al., 2005; caprina: LUCCI et al., 2001), mas algumas
diferenças foram observadas, tais como: a maior quantidade de vesículas com
membrana, forma e conteúdo interno das mitocôndrias (comparado a outras
espécies) e presença de junções especializadas entre o ovócito e as células
adjacentes, que não foi anteriormente relatada para búfalas.
O folículo secundário apresentou pelo menos duas camadas de células da
granulosa de forma cuboidal. O folículo era destacado do estroma ovariano
pela membrana basal. Muitas funções têm sido atribuídas para a membrana
basal do folículo, dentre elas a manutenção da integridade tissular, transporte
de várias substâncias e ligação a alguns fatores de crescimento (HESSLE et
al., 1994).
Segundo Kacinskis et al. (2005), os folículos secundários podem ser
divididos em pequenos e grandes, sendo verificadas muitas diferenças entre
eles, com relação à organização e estrutura celular. Os folículos secundários
pequenos são menos desenvolvidos e possuem ultra-estrutura semelhante à
verificada em folículos primários. Nessa fase, a zona pelúcida está começando
a se formar ao redor do ovócito. Foi nessa etapa da evolução que estavam os
folículos avaliados nesse experimento, pois em folículos secundários grandes,
a zona pelúcida está completamente desenvolvida, formando uma camada fina
ao redor do ovócito (KACINSKIS et al., 2005).
Em um dos folículos foi recuperada uma imagem que apresentava espaços
entre as membranas plasmáticas do ovócito e das células foliculares, sugerindo
94
o início da deposição do material da zona pelúcida (Figura 17). Em vacas, Fair
et al. (1997a) observaram pequenos depósitos de zona pelúcida, geralmente
associados a microvilosidades, em metade dos folículos secundários
estudados. Igualmente ocorreu em cabras e búfalas, cujos sinais da zona
pelúcida foram percebidos no mesmo estágio (LUCCI et al., 2001;
MONDADORI et al., 2007).
A membrana plasmática ovocitária manteve estreito contato com a
membrana plasmática das células da granulosa, mostrando regiões
semelhantes às zonas de aderência, junções do tipo gap e muitas
microvilosidades. No entanto, Mondadori et al. (2007) não presenciaram tipos
especiais de junções (zonas de aderência ou gap junctions) nos folículos
ovarianos pré-antrais de búfalas. Segundo eles, isso pode ter ocorrido porque
nenhum dos folículos avaliados tinha o ovócito completamente envolvido pela
zona pelúcida. Já nas cabras, somente contatos endocíticos foram claramente
visíveis nesse estágio de desenvolvimento folicular (LUCCI et al., 2001).
As microvilosidades são projeções do citoplasma do ovócito nas células da
granulosa adjacentes. Entre as membranas plasmáticas do ovócito e das
células da granulosa, muitas vesículas endocíticas estavam presentes. A
substância a ser incorporada adere a receptores da superfície celular
afundando a membrana (coated pits) e o material a ela aderido é introduzido no
citoplasma por meio das vesículas revestidas de clatrina. Quando a vesícula se
destaca, sua superfície é irregular e filamentosa, por isso são denominadas
vesículas cobertas (coated vesicle). Depois da liberação das moléculas de
clatrina e proteínas a ela associadas, a vesícula se funde com componentes do
compartimento endossomal, que é um local de separação e endereçamento
das moléculas introduzidas no citoplasma (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2000).
Nas avaliações realizadas, as vesículas cobertas foram freqüentemente
encontradas entre as membranas do ovócito e as células adjacentes (Figura
18).
O núcleo do ovócito (Figura 19) estava localizado centralmente e
apresentava aspecto granular e regiões de cromatina condensada. O envoltório
nuclear apresentava poros, que são formados pela fusão da membrana nuclear
interna com a externa. Os poros permitem o trânsito de macromoléculas entre
95
o núcleo e o citoplasma do ovócito (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2000). O
nucléolo não estava evidente em nenhum dos cortes analisados.
As organelas apresentavam-se distribuídas uniformemente por todo o
ooplasma (Figura 19). As estruturas mais comumente encontradas foram as
mitocôndrias e as vesículas com membrana (Figura 19), que acumulam
material e são mais claras, merecendo destaque também as vesículas
digestórias (lisossomos), com grânulos escuros no seu interior (corpos
residuais; Figura 19). Foi possível identificar mitocôndrias alongadas e em
divisão, sendo as circulares predominantes. Em grande parte notou-se cristas
transversais ou longitudinais (Figura 20). Não foram visualizados grânulos
mitocondriais.
De acordo com Fair et al. (1997a), as mitocôndrias redondas representam
formas imaturas que, ao se desenvolverem, adquirem a forma alongada. Para
esses autores, as mitocôndrias alongadas estavam presentes em quase todos
os ovócitos dos folículos secundários bovinos e, em alguns, consistiam a ampla
maioria. Em vacas da raça Nelore, Basso & Esper (2002) destacaram a
prevalência de mitocôndrias alongadas espalhadas por todo o oolema do
folículo secundário. Resultado contraditório foi obtido por Kacinskis et al. (2005)
na mesma subespécie, porque as mitocôndrias arredondadas estavam
consistentemente presentes em todas as categorias de folículos pré-antrais. No
folículo secundário de cabras, a vasta maioria das mitocôndrias era alongada
(LUCCI et al., 2001).
No entanto, no presente estudo as mitocôndrias de forma circular foram
predominantes, tanto no folículo secundário, quanto no folículo em transição
para o estágio terciário. Nas búfalas, as mitocôndrias circulares ainda são
abundantes no folículo secundário e as alongadas, raramente observadas.
Além do mais, os grânulos mitocondriais visualizados em outras espécies não
foram documentados para as búfalas (MONDADORI et al., 2007).
A grande quantidade de vesículas com membrana, espalhadas por todo o
citoplasma do ovócito bubalino, foi verificada por Boni et al. (1992) e Mondadori
et al. (2007). Vesículas com grânulos escuros também foram descritas
previamente. Segundo os últimos pesquisadores, o grande número de
vesículas com membrana, que ocupa um vasto volume no ooplasma,
comparado a outras organelas funcionais, pode ser uma das causas da menor
96
habilidade do ovócito bubalino em originar embriões in vitro. Porém deve-se
ressaltar que essas vesículas também são funcionais e apresentam como
características importantes: o armazenamento de substâncias que serão
utilizadas para o desenvolvimento e maturação do ovócito e a reciclagem da
membrana plasmática do ovócito.
Outras organelas estavam presentes em menor quantidade, como o
complexo de Golgi e retículos endoplasmáticos liso e rugoso, associados ou
não às mitocôndrias (Figura 20). O aparelho de Golgi evidenciava as vesículas
achatadas e esféricas que constituem esta estrutura (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2000).
As células da granulosa (Figura 19) apresentavam núcleos grandes, com
elevada proporção núcleo:citoplasma e continham mitocôndrias, retículos
endoplasmáticos liso e rugoso e complexos de Golgi no citoplasma. Também
estavam presentes algumas gotas de lipídios. O formato do núcleo
acompanhava o formato celular, ou seja, na célula alongada, o núcleo
mostrava-se alongado também. Lucci et al. (2001) e Kacinskis et al. (2005)
também constataram que a forma do núcleo era irregular.
Um elemento importante encontrado nesse folículo foi a visualização de
células da granulosa de colorações distintas, uma população mais escura que
apresentava retículo endoplasmático em abundância e poucas mitocôndrias e
aparelho de Golgi (Figura 21), e outra mais clara, com aparelho de Golgi, maior
quantidade de mitocôndrias e poucos retículos endoplasmáticos (Figura 21).
Essa constatação permite afirmar que as células da granulosa do folículo
secundário estão se especializando para a produção hormonal, pois a
presença de grande quantidade de retículo endoplasmático liso é um indicativo
de síntese de esteróides (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2000). Essa
particularidade foi mais pronunciada no folículo em progressão para o estágio
terciário.
Para Basso & Esper (2002), algumas células da granulosa apresentavam
citoplasma de eletro-densidade diferente das demais. Sanbuissho et al. (1993)
em ratos, e Lucci et al. (2001) em cabras, notificaram que as células da
granulosa se caracterizavam pela atividade esteroidogênica evidenciada pelo
retículo endoplasmático liso abundante e mitocôndrias, como encontrado na
presente pesquisa.
97
O folículo em progressão para o estágio terciário era composto por
diversas camadas celulares da granulosa e envolto pela membrana basal,
sendo possível visualizar células da teca em diferenciação (Figura 22).
Não foi possível a identificação do ovócito e núcleo devido à região do
corte do folículo. No entanto, observou-se a secreção de fluído, na região
central, originando provavelmente o futuro antro (Figura 22).
Entre as células da granulosa evidenciou-se algumas microvilosidades,
zonas de aderência e gap junctions. Os núcleos das células da granulosa
apresentavam muitas áreas de condensação da cromatina. Também foi
possível perceber o afastamento entre as células devido à formação do antro
(Figura 23).
O folículo terciário de vaca é caracterizado por múltiplas camadas de
células da granulosa, com pequenas cavidades entre as células ou uma única
e pequena cavidade antral (FAIR et al., 1997a). No presente estudo, espaços
intercelulares foram verificados antes da formação do antro propriamente dito,
semelhante aos achados de Lucci et al. (2001) e Kacinskis et al. (2005) de que
ainda nos folículos secundários grandes, algumas células da granulosa
perderam o contato com as adjacentes, dando lugar a pequenas áreas
preenchidas por fluidos.
98
Figura 17. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: espaço entre a
membrana plasmática do ovócito e da célula da granulosa, iniciando-se a
deposição de material da zona pelúcida, indicada pela seta (77.500x). CG:
célula da granulosa; O: ovócito.
17
CG
O
99
Figura 18. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: presença de
microvilosidades entre o ovócito e a célula da granulosa (42.000x). As setas
indicam vesículas cobertas (coated vesicles). CG: célula da granulosa; O:
ovócito.
18
O
CG
100
Figura 19. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: organelas
distribuídas no citoplasma do ovócito (5.750x). CG: célula da granulosa; L:
lisossomo (vesícula digestória); N: núcleo; V: vesícula.
19
L
V
CG CG
N
101
Figura 20. Eletromicrografia de folículo secundário bubalino: prevalência de
mitocôndrias circulares no citoplasma do ovócito (23.000x). A seta indica uma
mitocôndria alongada. RE: retículo endoplasmático.
20
RE
102
Figura 21. Células da granulosa de folículo secundário bubalino (9.750x). A
mais escura apresenta abundância em RE. A mais clara apresenta menos RE
e mais mitocôndrias. C: centríolo; CGo: complexo de Golgi; M: mitocôndria; N:
núcleo; RE: retículo endoplasmático.
21
CGo
M
RE
CGo
C
N
N
103
Figura 22. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário. A seta indica
secreção de fluido (5.750x). MB: membrana basal.
22
MB
104
Figura 23. Folículo bubalino em transição para o estágio terciário: espaço entre
as células da granulosa (42.000x). As setas indicam gap junctions entre as
células da granulosa.
6.3.2. Vacas
Apesar do escasso material, informações interessantes sobre a fisiologia
celular dos folículos ovarianos de vacas foram adquiridas.
Em geral, as características ultra-estruturais dos folículos primordial
ativado e primário nas vacas foram equivalentes às descritas na literatura para
vacas e outras espécies (Bos taurus taurus: FAIR et al. 1997a e HYTTEL et al.,
1999; Bos taurus indicus: BASSO & ESPER, 2002 e KACINSKIS et al., 2005;
bubalina: CARVALHO, 2005 e MONDADORI et al., 2007; caprina: LUCCI et al.,
2001). A principal diferença encontrada entre o presente trabalho e a literatura
foi a presença de junções gap entre o ovócito e as células da granulosa nos
23
105
folículos primários, cujo achado, em folículos de vacas, búfalas e cabras, só foi
comunicado por outros autores no folículo secundário.
A análise ultra-estrutural dos ovários bovinos mostrou um folículo
primordial já ativado, pois este apresentava sinais de modificação da
morfologia das células foliculares. Circundando o ovócito, havia uma camada
de células da granulosa de formato pavimentoso, porém algumas células
apresentavam formato em um estágio intermediário entre pavimentoso e
cubóide (Figura 24). Tais características também foram descritas por Fair et al.
(1997a), Lucci et al. (2001), Basso & Esper (2002), Kacinskis et al. (2005) e
Mondadori et al. (2007). O folículo apresentava-se individualizado do estroma
ovariano pela presença de uma membrana basal bem definida.
Na interface entre as células da granulosa e o ovócito foi possível
identificar microvilosidades (Figura 25), assim como zonas de aderência. As
presenças de microvilosidades (FAIR et al., 1997a; BASSO & ESPER, 2002;
KACINSKIS et al., 2005) e zonas de aderência (FAIR et al., 1997a; BASSO &
ESPER, 2002) já foram relatadas anteriormente em vacas, neste estágio de
desenvolvimento folicular.
Depressões na membrana (coated pits) e vesículas cobertas (coated
vesicles) foram identificadas entre as membranas das células da granulosa e o
ovócito (Figura 25). Estas estruturas também foram notificadas em folículos
ovarianos de vacas, ovelhas e búfalas (FAIR et al., 1997a; HYTTEL et al.,
1999; LUCCI et al., 2001; KACINSKIS et al., 2005; MONDADORI et al., 2007).
O ovócito apresentou-se de forma ovalada. O núcleo grande ocupava uma
posição excêntrica e possuía aspecto granular e áreas de cromatina
condensada. Os poros nucleares estavam visíveis. Já o nucléolo encontrava-se
bem evidente, com vacúolos e dois centros fibrilares externos associados à
cromatina condensada (Figura 26). Em células que apresentam alta atividade
de produção de ribossomos, os nucléolos são geralmente grandes e
complexos. Os genes que codificam os RNA ribossômicos estão localizados e
são transcritos nos centros fibrilares e no componente fibrilar denso. O
processamento dos RNA ribossômicos e sua complexação com proteínas
iniciam-se no componente fibrilar denso, continuando no componente granular,
onde estão em processo final de montagem das subunidades ribossômicas,
que serão exportadas para o citoplasma. Essas subunidades saem do núcleo
106
pelos poros nucleares e se transformam em ribossomos livres no citoplasma,
que se associam ao retículo endoplasmático, formando o retículo
endoplasmático rugoso (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2000).
Não foi possível observar o início da formação da zona pelúcida ao redor
do ovócito. Da mesma forma, esse evento não foi descrito em folículos
primordiais ativados de vacas taurinas (FAIR et al., 1997a), vacas zebuínas
(BASSO & ESPER, 2002 e KACINSKIS et al., 2005), ovelhas (LUNDY et al.,
1999), cabras (LUCCI et al., 2001) e búfalas (MONDADORI et al., 2007). Os
autores documentaram o início da formação da zona pelúcida somente nos
folículos secundários, com exceção de Basso & Esper (2002) e Mondadori et
al. (2007) que registraram esse acontecimento no folículo primário. Em
camundongos (OAKBERG, 1979), coelhos (NICOSIA et al., 1975), gatos
(JEWGENOW & STOLTE, 1996), macacos (ZAMBONI, 1974) e humanos
(HIMELSTEIN-BRAW et al., 1976), a zona pelúcida se formou no folículo
primário.
De forma geral, as organelas localizavam-se em todo o citoplasma do
ovócito, porém em algumas regiões apresentavam-se aglomeradas. As
organelas citoplasmáticas mais abundantes foram as mitocôndrias e o retículo
endoplasmático liso (Figuras 24 e 25), indicando que o ovócito produz muita
energia para o desenvolvimento. Foi possível identificar mitocôndrias
alongadas e até em divisão, mas as circulares foram predominantes,
concordando com os achados de Fair et al. (1997a) em vacas taurinas e Basso
& Esper (2002) em vacas Nelore. Em poucas mitocôndrias se observou cristas
transversais e longitudinais.
Foram encontradas mitocôndrias com pequenos grânulos densos na matriz
mitocondrial (Figura 25). Os grânulos mitocondriais já foram descritos
anteriormente em vacas (ASSEY et al., 1994; FAIR et al., 1997a; BASSO &
ESPER, 2002; KACINSKIS et al., 2005). Eles são muito encontrados em
células hepáticas, renais e pancreáticas. Parecem estar presentes
principalmente em tecidos que transportam grande quantidade de íons ou
água, sugerindo que esses grânulos estão relacionados com a regulação do
ambiente interno iônico da mitocôndria (FAWCETT, 1966).
Na região perinuclear, o aparelho de Golgi apresentava-se bem
desenvolvido e foi possível visualizar as vesículas achatadas e esféricas que
107
compõem esta estrutura. Retículos endoplasmáticos liso e rugoso (próximos às
mitocôndrias) e algumas vesículas com membrana e lisossomos foram
visualizados.
Dentre as organelas mais freqüentes no citoplasma das células da
granulosa estavam as mitocôndrias e os retículos endoplasmáticos. Também
foram encontrados os aparelhos de Golgi.
Os folículos primários foram caracterizados por um ovócito circundado por
uma camada simples de células da granulosa de formato cuboidal. Às vezes o
citoplasma do ovócito invadia o espaço entre duas células da granulosa. Esse
evento também foi comunicado por Kacinskis et al. (2005) para folículos
primários em vacas.
As comunicações entre as células da granulosa e o ovócito do folículo
primário eram mantidas por endocitose e junções especializadas (zonas de
aderência e gap juntions; Figura 28). O citoplasma do ovócito apresentou
pequenas projeções que penetravam por entre as células adjacentes, formando
microvilos, sendo que alguns se apresentavam eretos (Figura 27). As
microvilosidades, que se localizavam no estreito espaço entre o ovócito e as
células da granulosa, estavam mais presentes no folículo primário do que no
primordial ativado. Lucci et al. (2001), Basso & Esper (2002) e Kacinskis et al.
(2005) também verificaram tal característica. As gap junctions não foram
observadas nesta fase de desenvolvimento folicular por outros autores,
somente a partir dos folículos secundários. Nos folículos primários, Fair et al.
(1997a) identificaram as junções intercomunicantes somente entre células da
granulosa adjacentes. Em caprinos, o ovócito e as células da granulosa
aparecem justapostos, sem junção específica entre eles (LUCCI et al., 2001),
em qualquer estágio do desenvolvimento folicular.
Segundo Hyttel et al. (1997), nos folículos primordial e primário, as
comunicações entre as células da granulosa e o ovócito são mediadas por
endocitose, sendo a formação das junções intercomunicantes uma das
características observadas durante a fase de crescimento do ovócito. A função
principal da zona aderente é unir fortemente as células umas às outras ou à
matriz extracelular. Já as junções do tipo gap estabelecem comunicação entre
uma célula e outra. Através destas junções, podem passar nucleotídeos,
aminoácidos e íons, todavia os poros das junções comunicantes não permitem
108
a passagem de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2000). As moléculas maiores são transferidas por
essas junções, mas de forma indireta, ou seja, após se ligarem a seus
receptores celulares (DODE, 2006). O achado das junções do tipo gap no
folículo primário pode indicar que o folículo analisado apresentava-se em uma
fase mais adiantada daquela avaliada por outros autores, pois a foliculogênese
é um processo evolutivo e dinâmico.
Nos folículos primários, as mitocôndrias estavam distribuídas por todo o
ooplasma. Nesse estágio folicular, ainda prevalecia o formato circular, porém
muitas delas já se apresentavam alongadas, sinalizando o crescimento da
atividade metabólica (HYTTEL et al., 1999). As mitocôndrias apresentavam
cristas transversais ou longitudinais, grânulos na matriz e algumas estavam em
processo de divisão (Figura 29). Gotas de lipídios, aparelhos de Golgi, retículos
endoplasmáticos liso e rugoso e vesículas digestórias estavam presentes em
maior quantidade do que no folículo primordial ativado (Figura 29).
As células da granulosa continham muitas mitocôndrias, aparelhos de
Golgi e inúmeros retículos endoplasmáticos, em comparação às mesmas
células do folículo primordial, sinalizando o crescimento folicular. No entanto,
não foram observadas colorações distintas, como apresentavam as células da
granulosa dos folículos secundários de búfalas, cujas características foram
descritas antecipadamente.
109
Figura 24. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: distribuição
das organelas no citoplasma (3.250x). CG: célula da granulosa; M: mitocôndria;
N: núcleo; Nu: nucléolo.
CG
M
24
N
N
Nu
CG
CG
N
N
110
Figura 25. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: mitocôndrias
predominantemente de formato circular no citoplasma do ovócito (42.000x). A
seta indica coated vesicle (vesícula coberta). CG: célula da granulosa; GM:
grânulo mitocondrial; Mi: microvilosidades; O: ovócito; RE: retículo
endoplasmático.
GM
GM
Mi
RE
RE
O CG
25
111
Figura 26. Eletromicrografia de folículo primordial ativado bovino: núcleo do
ovócito (9.750x). As setas apontam os poros nucleares. CFE: centro fibrilar
externo; Nu: nucléolo.
26
CFE
CFE
Nu
112
Figura 27. Eletromicrografia de folículo primário bovino: microvilos (12.000X) -
projeções do citoplasma do ovócito emitidas no citoplasma da célula da
granulosa. CG: célula da granulosa; L: lisossomo; M: mitocôndria; N: núcleo; O:
ovócito.
27
CG
O
M
L
N
M
113
Figura 28. Eletromicrografia de folículo primário bovino: complexo juncional
(30.000x). A seta indica gap junctions. ZA: zona de aderência.
28
ZA
114
Figura 29. Eletromicrografia de folículo primário bovino: mitocôndrias circulares
com grânulos (7.000x). A seta aponta uma mitocôndria em processo de divisão.
CG: célula da granulosa; L: lisossomo; O: ovócito; RE: retículo endoplasmático.
6.4. Recuperação e Qualidade do Ovócito
Em 86 búfalas avaliadas, foram recuperados 714 CCOs, sendo 185
(25,9%) grau I (GI); 219 (30,7%) grau II (GII); 73 (10,2%) grau III (GIII); 133
(18,6%) desnudos e 104 (14,6%) expandidos. As médias/ animal dos CCOs
classificados como GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e do número total
recuperado foram, respectivamente, 2,2; 2,5; 0,8; 1,5; 1,2 e 8,3.
Em 95 vacas avaliadas, foram recuperados 1.983 CCOs, sendo 630
(31,8%) grau I (GI); 607 (30,6%) grau II (GII); 306 (15,4%) grau III (GIII); 90
(4,5%) desnudos e 350 (17,7%) expandidos. As médias/ animal dos CCOs
classificados como GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e do número total
recuperado foram, respectivamente, 6,6; 6,4; 3,2; 0,9; 3,7 e 20,9.
Nas búfalas, observou-se uma correlação positiva (r= 0,72) e significativa
(p< 0,0001) entre CCOs GI e número total recuperado, apesar desta categoria
29
O
CG
L
L
RE
115
ter sido menos observada do que os ovócitos GII, cuja correlação com o
número total de CCOs foi r= 0,54; p< 0,0001.
Nas vacas, os CCOs denominados grau 1 (r= 0,67; p< 0,0001), grau 2 (r=
0,64; p< 0,0001) e expandidos (r= 0,59; P< 0,0001) foram correlacionados de
forma positiva com o número total de CCOs, isto ocorreu porque as referidas
classificações representaram uma grande parte das estruturas colhidas.
Das et al. (1996) e Abdoon & Kandil (2001) recuperaram menos ovócitos/
ovário pela aspiração folicular (1,7 e 3,3) do que pelo fatiamento (slicing) do
ovário de búfalas (2,8 e 8,1). Dentre os ovócitos obtidos (por aspiração) pelos
grupos de pesquisa 0,2 e 2,0; 0,7 e 0,8; 0,8 e 0,3 foram considerados ótimos,
bons e ruins, respectivamente. Ohashi et al. (1998) obtiveram em média 2,2 ±
1,1 ovócitos em 53 ovários.
Em búfalos de pântano, o número de ovócitos aspirados de folículos de 2 a
4 mm foi baixo, aproximadamente 2 ovócitos/ ovário (TASRIPOO &
KAMONPATANA, 1997).
Devido à elevada incidência de atresia na espécie bubalina, a média de
ovócitos de boa qualidade é reduzida (GASPARRINI, 2002): 0,4 (TOTEY et al.,
1992), 0,9 (DAS et al., 1996) e 1,76 (SAMAD et al., 1998). Ganguli et al. (1998)
descreveram percentuais de 24,3% (CCOs compacto), 47,8% (CCOs escasso)
e 27,0% (ovócitos desnudos) para búfalas e 65,0% (CCOs compacto), 20,9%
(CCOs escasso) e 13,8% (ovócitos desnudos) para vacas.
Em comparação com os dados da literatura, é pertinente concluir que a
recuperação de ovócitos bubalinos por aspiração folicular (8,3/ animal) foi muito
boa, levando-se em conta que nos artigos, o valor descrito é para cada ovário,
enquanto que na presente pesquisa o valor é por animal.
Em vacas taurinas, 8 a 12 ovócitos de boa qualidade foram obtidos, em
média, por ovário (GORDON, 1994b). Para Watanabe et al. (1995) esse valor
foi de 6,2/ ovário em fêmeas Nelore. Na mesma subespécie, Ohashi et al.
(1998) recuperaram, por ovário, 4,1 ± 2,6 ovócitos, sendo 2,9 ± 2,3 (cumulus
compacto), 0,6 ± 0,6 (2 a 3 camadas de células) e 0,3 ± 0,3 (parcialmente
desnudos). Em novilhas de corte da raça Japanese Black (JBC), uma média de
18,9 ovócitos foi adquirida/ fêmea (IWATA et al., 2006).
116
A recuperação de ovócitos mostrou-se superior quando foi realizado o
fatiamento do córtex ovariano. Hazeleger et al. (1995) obtiveram, em média, 49
CCOs/ animal utilizando este método.
Em vista dos valores relatados na literatura, os resultados obtidos foram
considerados bons, uma vez que foram recuperados 10,4 CCOs/ ovário, sendo
6,5 de boa qualidade (GI + GII).
Comparando-se a recuperação ovocitária nas duas espécies, foram
observadas diferenças em quase todas as variáveis, sendo que nas búfalas, a
obtenção de CCOs classificados como GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e
número total foi inferior aos índices bovinos (Tabela 16). Este acontecimento
também foi relatado por Gasparrini (2002), Neglia et al. (2003) e Ohashi et al.
(2003).
Tabela 16. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a espécie animal.
Espécie animal
Variável Bubalina (n= 85) Bovina (n= 95)
p
GI 1,0 [0,0; 4,0] 5,0 [3,0; 9,0] <0,001
GII 2,0 [1,0; 4,0] 5,0 [3,0; 9,8] <0,001
GIII 0,0 [0,0; 1,0] 2,0 [0,0; 5,0] <0,001
DESN 1,0 [0,0; 2,0] 0,0 [0,0; 1,0] 0,016
EXP 1,0 [0,0; 2,0] 3,0 [1,0; 5,0] <0,001
TOT RECUP 7,0 [4,0; 11,0] 20,0 [11,0; 28,8] <0,001
GI (grau I), GII (grau II), GIII (grau III), DESN (desnudos), EXP (expandidos) e TOT RECUP
(número total de ovócitos recuperados).
Os dados foram avaliados quanto à época do ano, que foi dividida em
primavera/ verão (n= 51 búfalas/ 59,3% e n= 75 vacas/ 78,9%) e outono/
inverno (n= 35 búfalas/ 40,7% e n= 20 vacas/ 21,1%).
Não se encontrou influência da época do ano no número total e na
recuperação de ovócitos GI, GII, GIII, desnudos e expandidos nas búfalas. Ao
contrário, em búfalas de rio, Data & Goswami (1998) determinaram que nos
meses quentes (> 30ºC) e moderadamente quentes (25-30ºC), o total de
ovócitos/ ovário, assim como ovócitos de qualidade boa e intermediária (0,8;
117
0,1 e 0,3 – meses quentes e 0,9; 0,1 e 0,4 – meses moderados) foram
significativamente menores do que nos meses frios (< 25ºC) (1,0; 0,2 e 0,5).
No entanto, nas vacas, verificou-se influência da época do ano no número
de ovócitos desnudos (p= 0,037), expandidos (p= 0,013) e na recuperação total
de ovócitos (p= 0,024), sendo estes valores superiores nas estações da
primavera e verão, conforme consta na tabela 17.
Tabela 17. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a época do ano em vacas.
Época do ano
Variável
Primavera/ Verão
(n= 75)
Outono/ Inverno
(n= 20)
p
GI 6,0 [3,0; 9,0] 5,0 [2,5; 9,0] 0,68
GII 6,0 [3,0; 10,0] 5,0 [1,5; 6,5] 0,10
GIII 2,0 [0,0; 5,0] 2,0 [0,0; 3,5] 0,75
DESN 0,0 [0,0; 1,0] 0,0 [0,0; 0,0] 0,037
EXP 3,0 [1,0; 6,0] 1,5 [0,5; 2,5] 0,013
TOT RECUP 21,0 [12,0; 29,0] 16,0 [9,0; 20,5] 0,024
GI (grau I), GII (grau II), GIII (grau III), DESN (desnudo), EXP (expandido) e TOT RECUP
(número total de ovócitos recuperados).
Os achados indicaram que, em meses de temperaturas mais elevadas, a
qualidade ovocitária foi inferiorizada. Houve um aumento na recuperação de
estruturas, porém a utilização destas (desnudos e expandidos) não é
recomendada nos processos de produção in vitro de embriões. Outros
experimentos também indicaram que animais de raças zebuínas também são
susceptíveis aos efeitos deletérios do calor na reprodução.
A sensibilidade de ovócitos bovinos ao estresse térmico tem sido
documentada em estudos in vivo e in vitro. Estudos sazonais têm mostrado que
a qualidade dos ovócitos e o índice de desenvolvimento embrionário
deterioraram no verão, em comparação com o inverno (ROCHA et al., 1998;
ZERON et al., 2001).
118
Rocha et al. (1998) obtiveram maior porcentagem de ovócitos normais
(75,9%) a partir de aspirações realizadas no inverno em comparação com as
do verão (41,0%) em fêmeas Bos taurus taurus.
De acordo com Ferraz et al. (2005), os efeitos do calor sobre a fertilidade
parecem ter sido estendidos para o outono. De acordo com os autores, apesar
das particularidades fisiológicas e da adaptação do Bos taurus indicus em
ambientes tropicais, verificaram-se quedas na qualidade ovocitária e taxa de
produção embrionária após os meses de verão, sugerindo um possível efeito
negativo de temperaturas elevadas sobre os resultados de aspiração folicular e
FIV em vacas Nelore.
Para Calegari (2005), maior número de ovócitos foi aspirado, por via
transvaginal, durante a estação fria (outono/ inverno) do que a estação quente
(primavera/ verão) na mesma raça.
Quando se comparou as búfalas gestantes (n= 33) com as não gestantes
(n= 53) verificou-se que esta última categoria de búfalas apresentou maior
número de ovócitos GI (37 vs. 148, respectivamente; p= 0,007) e recuperados
(194 vs. 520, respectivamente; p= 0,001). O período de gestação, além de
apresentar diferença nesses dois itens com relação às fêmeas não prenhes,
também diferiu na freqüência de ovócitos desnudos. A proporção de GI foi
maior nos animais não gestantes do que em todas as fases da gestação (p=
0,048). Já as proporções de desnudos (p= 0,025) e total recuperado (p= 0,013)
foram distintas somente entre não gestantes e período inicial (Tabela 18).
119
Tabela 18. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo o período de gestação das búfalas.
Período de gestação
Variável
Não gestante
(n= 53)
Inicial
(n= 13)
Médio
(n= 10)
Final
(n= 10) p
GI 2,0[0,0;5,0]a 1,0[0,0;1,3]b
0,5[0,0;1,0]b 0,0[0,0;2,0]b 0,048
GII 2,0[0,0;4,3] 2,0[1,0;4,0] 2,0[1,0;2,0] 1,5[0,0;3,0] 0,64
GIII 0,0[0,0;1,3] 0,0[0,0;0,3] 0,0[0,0;1,0] 0,5[0,0;2,0] 0,51
DESN 1,0[0,0;3,0]a 0,0[0,0;0,0]b
2,0[0,0;3,0]a 0,0[0,0;2,0]ab
0,025
EXP 1,0[0,0;2,3] 1,0[0,0;1,3] 0,0[0,0;1,0] 1,5[0,0;2,0] 0,32
TOT
RECUP
9,0[5,0;12,3]a
5,0[3,8;6,5]b
5,0[4,0;8,0]ab
6,0[4,0;7,0]ab
0,013
GI (grau I), GII (grau II), GIII (grau III), DESN (desnudo), EXP (expandido) e TOT RECUP
(número total de ovócitos recuperados). Letras minúsculas comparam períodos. Períodos
seguidos de pelo menos uma letra em comum não diferem significativamente.
Na comparação dos índices de vacas gestantes e não gestantes não se
constatou diferenças com relação à recuperação e qualidade ovocitária. A
mesma constatação foi observada para os períodos gestacionais. Os dados
estão de acordo com o trabalho de Dominguez (1995) em que a prenhez não
afetou a qualidade ovocitária e a proporção de ovócitos viáveis, apesar dos
autores comunicarem que as vacas prenhes mostraram menos folículos
médios e grandes, em comparação às vacas cíclicas, mas o desenvolvimento
de folículos pequenos não foi impedido durante essa fase.
Das búfalas estudadas neste experimento, 62 (72,1%) apresentavam CL e
24 (27,9%) não apresentavam CL no ovário, no momento da aspiração
folicular. Os dados supracitados foram avaliados pelo teste de Mann-Whitney e
constatou-se que, a presença de CL reduziu a taxa de recuperação de ovócitos
desnudos (p= 0,027) e o número total de ovócitos aspirados (p= 0,028),
conforme demonstrado na tabela 19. Esse evento ocorreu porque as fêmeas
não gestantes, que possuíam menos CL e com menor freqüência, tinham mais
folículos superficiais nos ovários e conseqüentemente, mais ovócitos
recuperados.
120
Tabela 19. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis GI, GII, GIII, DESN, EXP e
TOT RECUP segundo a presença do CL em búfalas.
Presença do CL
Variável Sim (n= 62) Não (n= 24)
p
GI 1,0 [0,0; 3,0] 3,0 [0,0; 5,0] 0,07
GII 2,0 [1,0; 4,0] 1,0 [0,0; 4,0] 0,24
GIII 0,0 [0,0; 1,0] 0,0 [0,0; 1,5] 1,00
DESN 0,0 [0,0; 2,0] 2,0 [0,0; 4,0] 0,027
EXP 0,5 [0,0; 2,0] 1,0 [0,0; 3,0] 0,49
TOT RECUP 6,0 [4,0; 10,0] 10,0 [5,5; 13,5] 0,028
GI (grau I), GII (grau II), GIII (grau III), DESN (desnudo), EXP (expandido), TOT RECUP
(número total de ovócitos recuperados) e CL (corpo lúteo).
No estudo de Das et al. (1996), a presença de CL não teve efeito na
recuperação de ovócitos bubalinos após slicing e punção folicular. No entanto,
ovários com CL tiveram um número significativamente menor de ovócitos após
a aspiração dos folículos (1,2 com CL; 2,0 sem CL), corroborando com os
resultados do presente experimento. Quando o CL está presente, o
desenvolvimento folicular é restrito, porque as células luteínicas ocupam uma
grande porção do ovário (GASPARRINI, 2002).
Em búfalas de pântano, Tasripoo & Kamonpatana (1997) relataram, para
ovários com CL, 5,9 (CCOs compacto), 37,0 (parcialmente compacto), 43,9
(expandidos) e 13,3% (ovócitos desnudos) e para ovários sem CL 7,1 (CCOs
compacto), 34,4 (parcialmente compacto), 47,2 (expandidos) e 11,2% (ovócitos
desnudos). Ressalta-se a elevada recuperação de CCOs expandidos, na
presença ou ausência de CL, comparada à desse experimento (14,6%).
No entanto, Manjunatha et al. (2007a) verificaram que, em ovários de
búfalas não gestantes que continham CL e folículos pequenos, a recuperação
de ovócitos grau A foi muito elevada (33,6%). Quando o ovário apresentava
corpo hemorrágico e nenhum folículo dominante, a porcentagem foi maior
ainda (37,2%).
Das vacas avaliadas, 87 (91,6%) apresentavam CL e apenas 8 (8,4%) não
continham CL nos ovários, no momento da aspiração folicular. A presença do
CL não interferiu nas variáveis (GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e número
121
total de CCOs recuperado). No entanto, seria necessário estudar um número
maior de animais sem CL para concluir se a presença da estrutura luteal
influencia a qualidade e recuperação ovocitária. Resultados conflitantes são
descritos na literatura. Segundo Savio et al. (1988), ovários que continham CL
possuíam mais folículos superficiais e CCOs mais competentes.
Hazeleger et al. (1995) não identificaram efeito do CL no número de CCOs
encontrado. Em vacas da raça Nelore, Torres-Júnior et al. (2006) verificaram
que a presença de CL, no momento da aspiração folicular por via transvaginal,
diminuiu o número de folículos viáveis, apesar de ter mantido similaridade no
total de estruturas recuperado.
Em 69,8 e 70,5% das búfalas e vacas abatidas (n= 60 e 67,
respectivamente) observou-se folículos ≥ 7/ 6 mm nos ovários e em 30,2 e
29,5% % (n= 26) não. A presença desse tipo de folículo no ovário não interferiu
na incidência de CCOs GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e no total de
ovócitos aspirados. Em contradição, Manjunatha et al. (2007a) relataram que
em ovários com folículo dominante e na presença de um CL maduro ou em
regressão, a recuperação de estruturas grau A foi prejudicada (19,4 e 18,6%,
respectivamente).
Em 70,5% das vacas (n= 67) verificou-se folículos ≥ 6 mm nos ovários e
em 29,5% (n= 28) não. A presença de tais folículos no ovário não interferiu na
incidência de CCOs GI, GII, GIII, desnudos, expandidos e no total aspirado.
Nenhum efeito da presença de folículos grandes ou da interação deles com o
CL foi identificado na morfologia dos CCOs (HAZELEGER et al., 1995). Em
contradição, Hageman (1995) e Shen & Lee (1999) reportaram que ovócitos
viáveis foram aspirados de folículos antrais pequenos na ausência do folículo
dominante. Já Torres-Júnior et al. (2006) demonstraram que a codominância
de folículos (presença de 2 ou mais folículos com diâmetro > 9 mm) prejudicou
significativamente o número de folículos visualizados, ovócitos recuperados e
viáveis em vacas da raça Nelore.
122
6.5. Maturação Nuclear Ovocitária in vitro
Os CCOs graus 1 e 2 de 75 búfalas (n= 396) e 93 vacas (n= 1.234) foram
maturados in vitro (Figuras 30 e 33) e destes, 382 (96,5%) e 1.026 (83,1%)
foram avaliados e classificados conforme a configuração nuclear.
Os valores obtidos de VG, QVG, MI, MII (Figuras 31 e 34) e DEG/NI para
búfalas e vacas foram, respectivamente, 1,0% (n= 4) e 1,9 % (n= 19); 1,8% (n=
7) e 0,6% (n= 6); 21,7% (n= 83) e 16,9% (n= 173); 63,4% (n= 242) e 67,8% (n=
696); 11,5% (n= 44) e 12,9% (n= 132).
Dois ovócitos bubalinos (0,5%) se dividiram de forma partenogenética
(Figura 32).
As médias/ animal obtidas para búfalas e vacas foram, respectivamente,
0,1 e 0,2 (VG); 0,1 e 0,1 (QVG); 1,1 e 1,9 (MI); 3,2 e 7,5 (MII); 0,6 e 1,4 (DEG/
NI) e 5,1 e 11,0 (número total de ovócitos corados).
Foi constatada uma correlação significativa entre ovócitos recuperados e
corados, tanto nas búfalas (r= 0,83; p< 0,0001), quanto nas vacas (r= 0,79; p<
0,0001).
Nas búfalas, foi averiguada uma correlação positiva entre CCOs grau I (r=
0,73; p< 0,0001) com o número de ovócitos corados, porém o mesmo não foi
observado para CCOs grau II (r= 0,53; p< 0,0001). Já nas fêmeas bovinas, foi
detectada correlação positiva entre CCOs grau I (r= 0,71; p< 0,0001) e grau II
(r= 0,67; p< 0,0001) com o número de ovócitos corados. Nas búfalas, também
se esperava encontrar correlação positiva entre CCOs grau II e o número total
de ovócitos corados, uma vez que esta espécie apresentou maior recuperação
desta categoria de CCOs e somente os considerados graus 1 e 2 foram
maturados.
Kamonpatana & Chuangsoongneon (1994), em búfalas de pântano, e
Ganguli et al. (1998), em búfalas de rio, estudaram vários tempos de
maturação nuclear e, para o tempo de 24 horas, 72 e 57% dos ovócitos
alcançaram o estágio de MII.
Purohit et al. (2005) conseguiram 74,7% de metáfase II, quando
suplementaram o meio com FSH, LH e estradiol, mesmo na ausência do SFB.
Os resultados de Gasparrini et al. (2006) foram expressivos: 92,8% (controle,
123
meio B 199) e 92,5% (com adição de 50 µM de cisteamina). Em ambas
pesquisas, foram utilizados ovários de búfalas de rio e o tempo de maturação
empregado foi de 22 a 24 horas.
Em diversos trabalhos, os índices de maturação nuclear de ovócitos
bubalinos cultivados em estufa a 5% de CO
2
em ar,
alta umidade e temperatura
de 38,5ºC, por 22 a 24 horas, se assemelharam aos índices de bovinos,
chegando a 80-90% (SANTOS et al., 2002; RAVINDRANATHA et al., 2003;
NANDI et al., 2004; GASPARRINI et al., 2006; MANJUNATHA et al., 2007b;
GASPARRINI et al., 2008).
Nas fêmeas bovinas, a taxa de maturação nuclear alcançada no presente
estudo foi inferior aos índices divulgados na maioria dos trabalhos (vacas
européias: de MATOS et al., 1995, com e sem adição de cisteamina; BEKER et
al., 2002; GASPARRINI, 2002/ vacas zebuínas: WATANABE et al., 1995;
ALVES et al., 2001, meio com 10 µg/mL de FSH; CORDEIRO et al., 2006;
LEME et al., 2006; SANDRI et al., 2006; QUETGLAS et al., 2006). No entanto,
foi superior às porcentagens obtidas em animais de origem indiana por Alves et
al. (2001), quando suplementaram o meio com 20 e 40 µg/mL de FSH e Leal et
al. (2006), e em animais de origem européia por Beker et al. (2002), utilizando
TCM-199 adicionado de estradiol.
Os resultados inferiores obtidos no presente estudo (63,4%/ búfalas e
67,8%/ vacas) podem ser decorrentes da prolongada seca que prevaleceu no
período em que se procedeu a maioria das colheitas de sangue e ovários. Os
meses caracterizados por maior pluviosidade, temperaturas mais elevadas e
maior comprimento do dia favorecem a produção de forrageiras, tanto em
quantidade, quanto em qualidade. As concentrações circulantes de insulina,
apresentadas posteriormente na tese, foram inferiores às dosadas por outros
autores, indicando que os animais avaliados se alimentaram de uma dieta
menos nutritiva, em comparação com os animais europeus. Apesar disso, não
houve uma correlação significativa entre as concentrações plasmáticas de
insulina e as porcentagens de MII, segundo o teste de correlação de
Spearman. No entanto, a qualidade da forrageira pode afetar a produção de
hormônios esteróides. Segundo Holt et al. (1995), forragens novas possuem
maior valor nutritivo e conteúdo de
β-caroteno, que apresenta mecanismos de
124
ligação nas células luteais, influenciando a atividade luteal e a
esteroidogênese.
Ainda com relação à espécie bubalina, o que se notou é que existem
grupos de pesquisa sólidos que trabalham com maturação e produção de
embriões in vitro há muitos anos e que possuem a técnica estabelecida, com
resultados estáveis. Em adição, credita-se maior responsabilidade do baixo
resultado ao tempo decorrido entre a colheita dos ovários e a aspiração dos
folículos, que em algumas rotinas foi de até 7 horas. Nesse período
prolongado, a viabilidade dos ovócitos foi afetada, uma vez que, para manter a
integridade dos mesmos, o tempo de transporte não deveria ser superior a três
horas.
Comparando-se as duas espécies, as taxas de maturação nuclear foram
inferiores na fêmea bubalina, principalmente quanto aos percentuais de MI e
MII, nas mesmas condições laboratoriais (Tabela 20). Diversos pesquisadores
previamente descreveram resultados superiores para a fêmea bovina
(Gasparrini, 2002; Neglia et al., 2003; Ohashi et al., 2003).
Tabela 20. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e
TOT COR segundo a espécie animal.
Espécie animal
Variável Búfalas (n= 85) Vacas (n= 95)
P
VG 0,0 [0,0; 0,0] 0,0 [0,0; 0,0] 0,15
QVG 0,0 [0,0; 0,0] 0,0 [0,0; 0,0] 0,74
MI 1,0 [0,0; 1,0] 1,0 [1,0; 3,0] 0,001
MII 3,0 [1,0; 4,0] 7,0 [3,8; 11,0] <0,001
DEG/ NI 0,0 [0,0; 1,0] 0,0 [0,0; 2,0] 0,09
TOT COR 4,5 [2,0; 7,0] 10,0 [6,0; 15,0] <0,001
VG (vesícula germinativa), QVG (quebra da vesícula germinativa), MI (metáfase I), MII
(metáfase II), DEG/ NI (degenerado/ não identificado) e TOT COR (número total de ovócitos
corados).
Uma informação importante e esperada foi que a proporção de ovócitos
bubalinos que atingiu a metáfase II foi correlacionada positivamente com a
qualidade ovocitária, pois demonstrou uma correlação positiva (r= 0,69; p<
0,0001) entre MII e GI; assim como, entre MII e número total de ovócitos
125
recuperados (r= 0,76; p< 0,0001) e corados (0,89; p< 0,0001), visto que a
maioria dos ovócitos submetidos à MIV atingiu a MII. Apesar disso, em búfalas
de pântano, os CCOs expandidos resultaram em elevada taxa de maturação
(TASRISPOO & KAMONPATANA, 1997).
A proporção de ovócitos bovinos que atingiu a metáfase II também foi
influenciada pela qualidade ovocitária; porém, diferentemente do que ocorreu
para as búfalas, a referida proporção foi correlacionada com CCOs grau II (r=
0,73; P< 0,0001) e não com CCOs grau I (r= 0,54; p< 0,0001). A partir desse
resultado podemos concluir que, para as condições de execução do presente
experimento, os ovócitos grau II apresentaram competência suficiente para
progredirem e alcançarem a metáfase da segunda divisão meiótica, tornando-
se viável sua utilização para a produção de embriões in vitro. Também houve
correlação entre MII e o número total de CCOs recuperados (r= 0,72; p<
0,0001) e corados (0,85; p< 0,0001), visto que a maior parte dos ovócitos
submetida à MIV atingiu a MII. As correlações estão representadas na tabela
21.
Tabela 21. Matriz de correlações de Spearman referentes às variáveis
analisadas (GI, GII, GIII, DESN, EXP, TOT RECUP, VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI
e TOT COR) nas vacas.
Variáveis VG QVG MI MII
DEG/
NI
TOT
COR
GI -0,02 0,09 0,41* 0,54* 0,41* 0,71*
GII 0,24* 0,19 0,23* 0,73* 0,26* 0,67*
GIII 0,12 0,08 0,12 0,27* -0,01 0,19
DESN 0,15 0,09 0,07 0,09 0,08 0,10
EXP 0,18 0,28* 0,16 0,29* 0,13 0,35*
TOT RECUP 0,17 0,22* 0,37* 0,72* 0,40* 0,79*
*significativo (p< 0,05). GI (grau I), GII (grau II), GIII (grau III), DESN (desnudos), EXP
(expandidos), TOT RECUP (número total de ovócitos recuperados), VG (vesícula germinativa),
QVG (quebra da vesícula germinativa), MI (metáfase I), MII (metáfase II), DEG/ NI
(degenerado/ não identificado) e TOT COR (número total de ovócitos corados).
126
Em ambas espécies, a configuração nuclear não sofreu interferência das
estações climáticas, porque foram cultivados apenas os ovócitos de boa
qualidade (GI e GII), cujas recuperações foram homogêneas durante o ano.
Existem pesquisadores que não acreditam que condições ambientais
externas afetam a fertilização e o desenvolvimento embrionário in vitro (NANDI
et al., 2001). Entretanto, Mishra et al. (2007) avaliaram o efeito da temperatura
ambiente nas taxas de clivagem de ovócitos bubalinos fertilizados in vitro e
ativados quimicamente. Nas duas técnicas, a clivagem foi severamente
prejudicada em uma temperatura ambiente > 40ºC. Apesar de não terem
analisado a maturação nuclear, provavelmente ela estaria baixa, pois segundo
os autores, a temperatura elevada danificou o desenvolvimento da
competência ovocitária in vitro. Foi reportado que a temperatura ambiente
alterou as propriedades bioquímicas da membrana, influenciando a
funcionalidade do ovócito e a fertilização (ZERON et al., 2001).
Em bovinos, os trabalhos avaliaram o efeito da estação climática sob as
taxas de produção embrionária e não sob a maturação nuclear. Rocha et al.
(1998) presenciaram, durante os meses de verão, drástico declínio na
capacidade de desenvolvimento de ovócitos de vacas taurinas, procedentes de
ovários de abatedouro. No entanto, o mesmo efeito não foi observado para
ovócitos de vacas zebuínas. Al-Katani et al. (2002) verificaram diferenças
significativas nas temperaturas retais de vacas Holandesas durante o verão
(39,8ºC) e inverno (38,7ºC). Segundo os autores, os danos aos ovócitos
causados pelo calor procederam em redução da fertilidade, consistindo em
baixa performance nos procedimentos de produção laboratorial de embriões.
Em vacas zebuínas, Ferraz et al. (2005) também identificaram desempenho
reduzido em programas de aspiração folicular e FIV. Apesar disso, parece que
as vacas taurinas são mais sensíveis do que as zebuínas aos detrimentos
causados pelo calor.
Na espécie bubalina, a maturação nuclear foi influenciada pelo estado
reprodutivo e período gestacional; porém na espécie bovina este
acontecimento não foi verificado. As búfalas “vazias” apresentaram maior taxa
de MII do que as fêmeas gestantes (p< 0,001), bem como maior número de
ovócitos corados (p< 0,001), já que o número de ovócitos colhidos também foi
maior nesta categoria de búfalas, como mostrado anteriormente (Tabela 22).
127
Os valores foram semelhantes entre fêmeas não gestantes e nas fases inicial e
final da gestação, sendo diferentes no período intermediário (p= 0,002 e p=
0,006, respectivamente), como verificado na tabela 23.
Tabela 22. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/ NI e
TOT COR segundo o estado reprodutivo das búfalas.
Estado reprodutivo
Variável
Não gestante
(n= 53)
Gestante
(n= 33)
p
VG 0,0 [0,0; 0,0] 0,0 [0,0; 0,0] 0,81
QVG 0,0 [0,0; 0,0] 0,0 [0,0; 0,0] 0,75
MI 1,0 [0,0; 1,3] 1,0 [0,0; 1,0] 0,66
MII 4,0 [2,0; 6,3] 1,0 [0,0; 3,0] <0,001
DEG/ NI 0,0 [0,0; 1,0] 0,0 [0,0; 1,0] 0,13
TOT COR 5,0 [3,8; 8,3] 3,0 [2,0; 5,0] <0,001
VG (vesícula germinativa), QVG (quebra da vesícula germinativa), MI (metáfase I), MII
(metáfase II), DEG/ NI (degenerado/ não identificado) e TOT COR (número total de ovócitos
corados).
Tabela 23. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis VG, QVG, MI, MII, DEG/NI e
TOT COR segundo o período de gestação das búfalas.
Período de gestação
Variável
Não
gestante
(n= 53)
Inicial
(n= 13)
Médio
(n= 10)
Final
(n= 10)
p
VG 0,0 [0,0;0,0]
0,0 [0,0;0,0] 0,0 [0,0;0,0]
0,0 [0,0;0,0] 0,74
QVG 0,0 [0,0;0,0]
0,0 [0,0;0,0] 0,0 [0,0;0,0]
0,0 [0,0;0,0] 0,49
MI 1,0 [0,0;1,3]
0,0 [0,0;1,3] 1,0 [1,0;1,3]
0,5 [0,0;1,0] 0,34
MII 4,0[2,0;6,3]a
1,0[0,8;4,0]ab
1,0[0,0;3,0]b
1,5[1,0;3,5]ab
0,002
DEG/ NI 0,0 [0,0;1,0]
0,0 [0,0;0,0] 0,0 [0,0;1,0]
0,5 [0,0;1,0] 0,22
TOT COR 5,0[3,8;8,3]a
3,0[1,0;5,3]ab
2,0[2,0;4,3]b
3,0[2,0;4,0]ab
0,006
VG (vesícula germinativa), QVG (quebra da vesícula germinativa), MI (metáfase I), MII
(metáfase II), DEG/ NI (degenerado/ não identificado) e TOT COR (número total de ovócitos
corados). Letras minúsculas comparam períodos. Períodos seguidos de pelo menos uma letra
em comum não diferem significativamente.
128
As presenças de CL e de folículos ≥ 7/ 6 mm não influenciaram a
configuração nuclear ovocitária em búfalas e vacas.
O artigo de Tasripoo & Kamonpatana (1997) apontou que a maturação
nuclear foi menos eficiente na presença do CL (variou de 69,1 a 92,2%, nos
diversos grupos considerados) do que na ausência (variou de 0 a 59,6%).
Para Manjunatha et al. (2007a) a presença do folículo dominante exerceu
um efeito negativo no subseqüente desenvolvimento de embriões in vitro. Os
autores não avaliaram a maturação, somente a clivagem e a formação de
blastocistos.
Para Torres-Júnior et al. (2006), as taxas de clivagem de ovócitos
provenientes de fêmeas da raça Gir com e sem CL foram similares, porém a
produção de blastocistos foi maior quando o CL estava ausente. Os mesmos
autores estudaram a influência da presença de folículos > 9 mm, obtendo-se
uma maior clivagem neste grupo, enquanto que a produção de blastocistos foi
similar entre os grupos avaliados (com e sem folículos > 9 mm). Chian et al.
(2002) constataram que, a competência de ovócitos bovinos (derivados de
folículos pequenos) em se desenvolverem in vitro não foi afetada pela presença
do folículo dominante, nem pela fase da foliculogênese. Nos resultados
previamente obtidos por Leal et al. (2006) em vacas zebus, a maturação
nuclear foi superior no grupo com folículo dominante (46,8%) do que no grupo
sem folículo dominante (31,7%).
129
Figura 30. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de búfalas
após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento
40x).
Figura 31. Fotografia de ovócito de búfala (aumento 400x), no estágio de
Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido
equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e
emissão, respectivamente).
30
31
130
Figura 32. Fotografia de zigoto bubalino partenoto (aumento 100x), visualizado
em microscópio invertido equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro
350 e 461 nm, excitação e emissão, respectivamente).
Figura 33. Fotografia de complexos cumulus oophorus expandidos de vacas
após 22 a 24 horas de incubação observados em estereomicroscópio (aumento
40x).
32
33
131
Figura 34. Fotografia de ovócito de vaca (aumento 400x), no estágio de
Metáfase II, corado com Hoechst 33342 visualizado em microscópio invertido
equipado com luz epifluorescente ultravioleta (filtro 350 e 461 nm, excitação e
emissão, respectivamente).
6.6. Concentração Plasmática de Progesterona e Insulina
6.6.1. Concentração Plasmática de Progesterona
A concentração plasmática média de P
4
nas búfalas foi de 3,3 ± 2,7 ng/mL
(n= 84) e nas vacas de 5,4 ± 4,0 ng/mL (n= 95). A concentração média de P
4
foi maior nas búfalas (4,7 ± 2,1 ng/mL; n= 33) e nas vacas (8,5 ± 2,8 ng/mL; n=
36) gestantes do que nas fêmeas “vazias” (2,4 ± 2,6 ng/mL - n= 51 búfalas e
3,6 ± 3,5 ng/mL - n= 59 vacas), pois todas as fêmeas gestantes continham CL,
glândula endócrina transitória que sintetiza e secreta a progesterona, hormônio
fundamental na manutenção da gestação. As concentrações sangüíneas deste
hormônio estão apresentadas na tabela 24.
Tabela 24. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas.
Estado Reprodutivo
Variável Espécie Não gestante Gestante p
Bubalina 1,1 [0,5; 4,1] 4,4 [3,6; 5,9] <0,001
P
4
p (ng/mL)
Bovina 3,3 [0,5; 5,9] 8,9 [5,7; 10,4]
<0,001
34
132
As concentrações médias de P
4
nos períodos inicial, médio e final da
gestação nas búfalas e vacas foram, respectivamente, 5,5 ± 2,7 e 8,9 ± 3,2
ng/mL; 4,6 ± 1,3 e 8,0 ± 2,4 ng/mL; 3,9 ± 1,6 e 8,2 ± 1,6 ng/mL. Na tabela 25
observa-se que não houve diferença significativa da concentração de P
4
entre
búfalas “vazias” e no período final de gestação. Já nas vacas, as
concentrações deste hormônio foram maiores em todos os períodos
gestacionais.
Tabela 25. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo o período de gestação das búfalas.
Período de gestação
Variável
Espécie
Não
gestante
Inicial Médio Final p
Bubalina
1,1[0,5;4,1]b
5,5[4,0;6,8]a
4,8[3,3;5,1]a
4,0[3,5;4,4]ab
<0,001
P
4
p
(ng/mL)
Bovina 3,3[0,5;5,9]b
9,1[5,4;11,2]a
7,6[5,7;10,2]a
8,1[6,8;9,5]a
<0,001
Letras minúsculas comparam períodos. Períodos seguidos de pelo menos uma letra em
comum não diferem significativamente.
Como era esperado, o nível de P
4
foi superior (p< 0,001) nos animais que
apresentavam CL nos ovários (n= 62/ búfalas e n= 87/ vacas), do que aqueles
que não continham CL (n= 24/ búfalas e n= 8/ vacas). Os dados estão
demonstrados na tabela abaixo.
Tabela 26. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo a presença de corpo lúteo (CL) em
búfalas e vacas.
Presença de CL
Variável Espécie Sim Não p
Bubalina 4,2 [2,5; 5,8] 0,6 [0,4; 1,0] <0,001
P
4
p (ng/mL)
Bovina
5,5 [3,2; 8,3] 0,2 [0,0; 0,3] <0,001
A secreção e a concentração plasmática de progesterona apresentam
variação cíclica durante o ciclo estral e refletem a funcionalidade do CL durante
as fases de crescimento, manutenção e regressão (BORGES et al., 2003).
133
Aspectos endocrinológicos do ciclo estral de búfalas foram descritos por
Perera (1991). Referindo-se ao perfil plasmático de P
4
ao longo do ciclo estral,
traçado através de radioimunoensaio, este autor descreveu que concentrações
basais foram observadas na fase folicular, sendo que a primeira elevação
substancial na concentração ocorreu entre os dias 5 e 6, daí seguiu-se
progressiva elevação na concentração sangüínea até o dia 15 do ciclo estral,
após o qual verificou-se queda abrupta nos níveis sangüíneos entre os dias 16
e 17.
Os resultados do presente estudo coincidiram com os obtidos por Batra et
al. (1979), trabalhando com búfalas de rio. A concentração basal de
progesterona foi de 0,5 a 1,0 ng/mL (sem CL), enquanto que a concentração
máxima de P
4
, inerente ao diestro (com CL), variou de 3,0 a 6,0 ng/mL.
Em búfalas de pântano, os valores obtidos para esse esteróide foram
inferiores. As concentrações plasmáticas médias de progesterona em fêmeas
com e sem CL nos ovários foram, respectivamente, 1,49 ng/mL (n = 31) e 0,14
ng/mL (n = 14) (JAINUDEEN et al., 1983).
Em fêmeas bovinas, concentrações abaixo de 1,0 ng/mL são verificadas no
estro, elevando-se até o décimo dia, quando alcançam valores máximos de 4,5
ng/mL em vacas de raças zebuínas (ADEYEMO & HEATH, 1980) e 16,0 ng/mL
em vacas da raça Holandesa (BADINGA et al., 1994).
Em vacas “vazias” da raça Holandesa, Badinga et al. (1992) relataram
concentrações circulantes de P
4
de 0,9 ng/mL (no dia do estro) e 7,4 ng/mL (12
dias após o estro). Na mesma raça, sete dias após a detecção da ovulação, as
concentrações do hormônio foram 3,0 e 1,0 ng/mL para novilhas e vacas,
respectivamente (SARTORI et al., 2002).
Os dados conflitantes dos dois últimos artigos podem ser explicados por
um novo conceito relatado por Sartori et al. (2002) e Wiltbank et al. (2006).
Segundo eles, uma grande ingestão de matéria seca, observada
principalmente nas vacas com alta produção de leite, aumenta o fluxo de
sangue para o fígado, resultando em baixas concentrações circulantes de
hormônios esteróides, por aumentar o metabolismo dos mesmos. Apesar da
literatura relatar valores inferiores de progesterona plasmática em vacas
zebuínas, em comparação com as taurinas, nas fêmeas taurinas com elevada
134
ingestão de matéria seca, os níveis circulantes de progesterona são muito
baixos.
Em vacas e novilhas da raça Nelore, Ereno et al. (2007) registraram 4,2 e
2,8 ng/mL de progesterona plasmática, no terço final de gestação. Contudo,
Silva et al. (2002) não determinaram diferenças nas concentrações deste
hormônio para os dois estados reprodutivos (2,9 ± 0,1 ng/mL - gestante e 2,9 ±
0,1 ng/mL - não gestante) na mesma raça. Porém deve-se ressaltar que o valor
obtido para as vacas “vazias” foi elevado.
Com relação à classificação do CL e a concentração de progesterona
plasmática, foram consideradas apenas as fêmeas que possuíam um CL, para
ter maior acurácia no resultado. Uma búfala apresentou CL no estágio I, 22, 26
e 4 búfalas apresentaram CL nos estágios II, III e IV, respectivamente. A
concentração plasmática média de P
4
foi de 5,6 (CL I); 5,4 ± 2,6 (CL II); 4,7 ±
1,6 (CL III) e 0,5 ± 0,5 (CL IV) ng/mL. Uma vaca apresentou CL I, 35 vacas
apresentaram CL II, 33 CL III e nenhum animal apresentou CL no estágio IV
exclusivamente, apenas em associação a outros CL nos ovários. A
concentração plasmática média de P
4
foi de 0,02 (CL I); 6,3 ± 4,2 (CL II) e 6,4 ±
3,3 (CL III) ng/mL. Em ambas espécies, a concentração do hormônio foi
semelhante entre os estágios II e III (p≥ 0,05; teste “t” de Student). No entanto,
o número de amostras foi insuficiente para comparar esses dados com os
resultados dos CL nos estágios I e IV, uma vez que estes CL eram mais
freqüentes em associação à CL em estágios diferentes.
Nas búfalas, a época do ano interferiu na concentração sangüínea de P
4
,
sendo superior no outono e inverno (p< 0,001; Tabela 27). Porém, nas vacas,
as estações climáticas não influenciaram o nível plasmático do hormônio
(Tabela 27). Deve-se lembrar que, na referida época do ano, as búfalas
apresentaram maior número de CL nos ovários (p< 0,001) enquanto que, nas
vacas, o número de CL foi semelhante nas estações analisadas.
135
Tabela 27. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de
progesterona (P
4
p) (ng/mL) segundo a época do ano em búfalas e vacas.
Época do ano
Variável Espécie (n)
Primavera/
Verão (n)
Outono/
Inverno (n)
p
Bubalina (84)
1,0 [0,5; 4,2]
(50)
4,6 [3,6; 6,3]
(34)
<0,001
P
4
p (ng/mL)
Bovina (95)
5,5 [2,3; 8,3]
(75)
4,0 [1,6; 6,9]
(20)
0,21
Na espécie Bubalus bubalis, Rao & Pandey (1982) registraram diferenças
(p< 0,01) entre os meses quentes e frios, com referência às concentrações de
progesterona plasmática no estro e fase luteal do ciclo, sendo os valores mais
altos registrados nas estações frias, igualmente ao verificado nos achados do
presente estudo.
6.6.2. Concentração Plasmática de Insulina
A concentração plasmática média de insulina nas búfalas foi de 3,3 ± 4,5
µUI/mL (n= 84) e nas vacas de 4,9 ± 5,0 µUI/mL (n= 95). Ao contrário da
progesterona, a concentração média de insulina foi maior nas búfalas (4,2 ± 5,5
µUI/mL; n= 51) e nas vacas (5,9 ± 5,8 µUI/mL; n= 59) não gestantes do que
nas fêmeas gestantes (2,1 ± 1,3 µUI/mL - n= 33 búfalas e 3,4 ± 2,8 µUI/mL - n=
36 vacas). Os valores estão representados na tabela 28.
Tabela 28. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração plasmática de insulina
(µUI/mL) segundo o estado reprodutivo das búfalas e vacas.
Estado Reprodutivo
Variável Espécie Não gestante Gestante p
Bubalina 2,1 [1,4; 4,2] 1,5 [1,2; 2,4] 0,016 Insulina
(µUI/mL)
Bovina 3,1 [2,1; 6,9] 2,4 [1,4; 4,3] 0,028
Quanto ao período de gestação, a concentração plasmática desse
hormônio foi inferior na fase final da gestação em ambas espécies. Os valores
136
médios obtidos em búfalas e vacas foram: 2,0 ± 1,2 e 4,2 ± 3,1 µUI/mL (período
inicial); 2,6 ± 1,6 e 2,6 ± 1,8 µUI/mL (período médio) e 1,7 ± 1,0 e 1,3 ± 0,1
µUI/mL (período final), respectivamente. As concentrações de insulina segundo
o período de gestação estão apresentadas na tabela 29.
Tabela 29. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] concentração plasmática de insulina
(µUI/mL) segundo o período de gestação das búfalas e vacas.
Período de gestação
Variável
Espécie
Não
gestante
Inicial Médio Final p
Bubalina
2,1[1,4;4,2]a
1,5[1,2;2,1]ab
2,2[1,3;3,1]ab
1,3[1,2;1,5]b
0,023
Insulina
(µUI/mL)
Bovina 3,1[2,1;6,9]a
3,2[1,8;5,7]ab
2,4[1,4;2,8]ab
1,4[1,2;1,5]b
0,007
Letras minúsculas comparam períodos. Períodos seguidos de pelo menos uma letra em
comum não diferem significativamente.
Pela análise dos dados foi verificado que o nível circulante de insulina, em
búfalas e vacas, não foi influenciado pelas estações climáticas, indicando que a
qualidade das forrageiras se manteve estável durante o ano.
Tendo em vista que no período final da gestação há um aumento dos
requerimentos energéticos para o crescimento final do feto e a preparação do
parto; assim como, um aumento da concentração de glicose nos líquidos fetais
e uma diminuição da ingestão de matéria seca no periparto, estes eventos
associados podem ter tido ação na insulina circulante das fêmeas na fase final
da gestação.
A insulina circulante é freqüentemente avaliada em grupos experimentais
que receberam dietas modificadas. Nesse sentido, esse hormônio também foi
comparado em búfalas submetidas a dietas diferentes. Animais alimentados
com dietas ricas em energia apresentaram maiores concentrações de insulina
circulante (7,5 ± 0,6 mmol/L) do que aqueles que se alimentaram de dieta
pobre em energia (3,9 ± 0,2 mmol/L) (D’OCCHIO et al., 2007). O mesmo
modelo experimental foi adotado nas vacas cruzadas Brahman x Shorthorm,
sendo que aquelas submetidas à dieta melhorada apresentaram maior
concentração plasmática de insulina do que as outras (6,5 ± 1,3 e 3,6 ± 0,3
µUI/mL, respectivamente).
137
Deve-se ressaltar que os valores obtidos no presente estudo, em todas as
categorias de búfalas e vacas avaliadas, foram inferiores aos dosados por
D’Occhio et al. (2007) em animais que receberam as dietas mais
desfavoráveis. Esta observação indica que, de forma geral, os animais criados
em sistema extensivo no Brasil apresentam uma alimentação aquém da
oferecida aos animais oriundos dos países mais ricos, e este fato deve ser
considerado ao se comparar os dados.
Em fêmeas bovinas, a concentração de insulina é principalmente estudada
com relação ao fornecimento de dietas com níveis energéticos diferentes,
durante o balanço energético negativo, que acomete vacas grande produtoras
de leite no período pós-parto.
Landau et al. (2000) estudaram o nível de insulina plasmática durante as
fases folicular e luteal do ciclo estral em vacas. Entretanto, os valores médios
não diferiram nas duas ocasiões (0,3 ± 0,0 ng/mL, fase folicular) e (0,4 ± 0,1
ng/mL, fase luteal).
Alguns pesquisadores relataram que a insulina apresenta um efeito
benéfico na fertilidade (BUTLER, 2000; GONG et al., 2002; GUTIERREZ et al.,
2007; D’OCCHIO et al., 2007); porém, na presente pesquisa, não foi verificada
correlação entre esse hormônio e a competência ovocitária. Isso pode ser
decorrente da utilização de vacas azebuadas, sendo que a maioria dos
trabalhos avaliou vacas de raças européias. Este aspecto é reforçado pelo
experimento de Martins et al. (2008) que determinaram as concentrações
séricas hormonais em vacas azebuadas submetidas à baixa e alta ingestão
alimentar. Os autores concluíram que nesta subespécie a diferença de ingestão
das dietas entre os grupos de animais não foi suficiente para alterar a função
ovariana ou as concentrações séricas de hormônios reprodutivos e
metabólicos, sendo que as inter-relações glicose-insulina-IGF-I não ficaram
bem definidas. Para D’ Occhio et al. (2007), são necessárias mais pesquisas
para constatar a ação da insulina no número e na qualidade dos ovócitos
recuperados.
138
6.7. Concentração Intrafolicular de Progesterona, Estradiol
e IGF-I
A concentração intrafolicular média de P
4
foi de 207,6 ± 194,5 (n= 40) e
239,8 ± 133,7 (n= 40) ng/mL para folículos < 7/ 6mm e de 76,3 ± 171,1 (n= 40)
e 104,0 ± 120,1 ng/mL (n= 40) para folículos ≥ 7/ 6 mm, em búfalas e vacas,
respectivamente (Tabela 30).
Tabela 30. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de
progesterona (P
4
) (ng/mL) em folículos < e ≥ 7/ 6 mm em búfalas e vacas.
Tamanho do folículo
Variável Espécie < 7/ 6 mm ≥ 7/ 6 mm p
Bubalina 146,4 [33,2; 357,7] 19,5 [14,6; 33,4]
<0,001
P
4
(ng/mL)
Bovina 206,9[131,4;304,6] 51,4 [37,8;106,5]
<0,001
Poucas informações acerca das concentrações hormonais de folículos
ovarianos de búfalas são descritas na literatura. Trabalhos que determinaram
constituintes bioquímicos foram mais facilmente encontrados (JINDAL et al.,
1997).
Os resultados do presente estudo corroboram com os descritos por
Badinga et al. (1992), trabalhando com vacas Holandesas. Na primeira onda de
crescimento folicular, os folículos subordinados apresentaram mais
progesterona intrafolicular (387,5 ± 32,4 ng/mL) do que os folículos dominantes
(69,8 ± 25,2 ng/mL). Com relação à morfologia dos CCOs, nos folículos que
continham CCOs com alto potencial de desenvolvimento, a concentração de
progesterona (27,5 ng/mL) foi inferior do que em folículos com reduzido
potencial de desenvolvimento (72,7 ng/mL) (HAZELEGER et al., 1995).
Com relação ao estradiol, as concentrações médias foram de 2,1 ± 8,9 (n=
39) e 1,5 ± 6,1 (n= 40) ng/mL para os folículos < e ≥ 7mm, respectivamente.
Não se verificou diferença significativa quando os dados foram avaliados pelo
teste de Mann-Whitney (Tabela 31). Esperava-se obter maior concentração de
E
2
no fluido de folículos ≥ 7 mm; porém o que se observou, foi uma variação
grande nos valores, indicando a dificuldade que ainda existe na reprodução de
139
resultados satisfatórios na dosagem de estradiol por radioimunoensaio,
utilizando-se kits comerciais.
Tabela 31. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de estradiol
(E
2
) (ng/mL) em folículos < e ≥ 7 mm em búfalas.
Tamanho do folículo
Variável < 7 mm (n= 39) ≥ 7 mm (n= 40) p
E
2
(ng/mL) 0,3 [0,1; 0,6] 0,3 [0,1; 0,7] 0,87
A maioria dos autores determinou que o nível de E
2
no líquido folicular foi
superior nos folículos maiores (BANDINGA et al., 1992; FORTUNE, 1994;
KHALID & HARESIN, 1996; SHIDAIFAT et al., 2001). Em vacas, o folículo
dominante apresentou maior concentração de estradiol em seu fluido do que os
folículos subordinados da mesma onda. No dia 3 do ciclo estral, antes de um
dos folículos ser significativamente maior do que os outros, o nível de estradiol
do fluido folicular recrutado foi baixo (FORTUNE, 1994). Entretanto, no dia 5,
um folículo tornou-se morfologicamente dominante e apresentou uma elevada
concentração de estradiol (983,2 ± 78,2 ng/mL), enquanto que os folículos
subordinados possuíram níveis muito menores (BADINGA et al., 1992).
Em ovelhas, Khalid & Haresin (1996) determinaram que a concentração de
estradiol foi superior nos folículos com diâmetro maior (121,7 vs. 19,6 ng/mL,
diâmetros de 5,3 e 4,1 mm, respectivamente). Na mesma espécie, Shidaifat et
al. (2001), ao classificarem os folículos em pequenos (< 3 mm), médios (3-6
mm) e grandes (> 6 mm), verificaram que folículos grandes continham elevada
concentração de estradiol (p< 0,01) comparada às concentrações de folículos
pequenos e médios.
Ireland & Roche (1982) observaram uma relação positiva entre as
concentrações de progesterona e estradiol com os diâmetros foliculares,
variando de 5 a 20 mm. Com o crescimento folicular, existe um acréscimo na
produção de E
2
e decréscimo na secreção de P
4
. Esse evento foi confirmado
por Stewart et al. (1996). Segundo os autores, as concentrações de P
4
e E
2
foram, respectivamente, 81,3 ± 130,9 e 1,8 ± 2,6 ng/mL (folículos < 6mm); 60,3
± 155,5 e 12,4 ± 26,6 ng/mL (folículos
≥ 6 mm).
140
O IGF-I diferiu entre os folículos (p= 0,002/ búfalas e p= 0,015/ vacas),
sendo superior nos folículos ≥ 7/ 6 mm (290,4 ± 177 e 165,6 ± 166,5 ng/mL;
búfalas e vacas) em comparação aos folículos < 7/ 6 mm (187,7 ± 153,6 e 80,7
± 98,0 ng/mL; búfalas e vacas), conforme demonstrado na tabela 32.
Tabela 32. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] da concentração intrafolicular de IGF-I
(ng/mL) em folículos < e ≥ 7 mm em búfalas.
Tamanho do folículo
Variável Espécie
< 7/ 6 mm
(n)
≥ 7/ 6 mm
(n)
p
Bubalina
116,5 [74,3;315,8]
(40)
234,7[124,3;448,6]
(40)
0,002
IGF-I
(ng/mL)
Bovina
43,2 [18,0; 121,4]
(40)
98,0 [27,7; 295,3]
(40)
0,015
A dominância folicular foi relacionada a altas concentrações de IGF-I no
fluido folicular (WEBB et al., 1999). Frente ao exposto, é esperado encontrar
níveis superiores de IGF-I nos folículos maiores, assim como foi notificado em
vacas (LANDAU et al., 2000; MELO et al., 2005) e ovelhas (SPICER et al.,
1995).
A concentração superior de IGF-I, oriunda dos folículos maiores, foi
fisiologicamente explicada na literatura. Durante o desenvolvimento folicular em
bovinos, modificações nos níveis intrafoliculares de IGF-I foram decorrentes de
alterações induzidas por hormônios nas células da granulosa. Nesta espécie,
as concentrações de IGF-I podem aumentar com o crescimento dos folículos
(HASHIZUME et al., 2000). De forma semelhante, o fluido folicular de ovelhas
apresentou maiores níveis de IGF-I nos folículos grandes (SPICER et al.,
1995). Acredita-se que a concentração mais elevada de IGF-I foi decorrente do
maior número de células da granulosa presentes nos folículos grandes
(SPICER & CHAMBERLAIN, 2000). No entanto, para Stewart et al. (1996), os
níveis de IGF-I não foram diferentes entre os folículos < 6 mm (99,4 ± 120,2
ng/mL) e folículos ≥ 6 mm (73,7 ± 120,4 ng/mL) em vacas.
141
Spicer & Geisert (1992) identificaram que o status reprodutivo da vaca
(prenhe ou não) não afetou (p> 0,10) as concentrações de progesterona e IGF-
I do fluido folicular.
A tabela 33 ilustra as concentrações médias de progesterona e insulina
plasmáticas, IGF-I e progesterona de folículos pequenos e grandes nas duas
espécies estudadas. Conforme está evidenciado, as búfalas apresentaram
maior concentração intrafolicular de IGF-I nas duas categorias de folículos
avaliadas. A concentração de progesterona no fluido de folículos pequenos foi
semelhante entre as duas espécies. Nas outras dosagens, os valores obtidos
para as vacas foram superiores.
Tabela 33. Mediana [1
0
e 3
0
quartis] das variáveis P
4
p, INSp, IGF-I Fol < 7/ 6
mm, IGF-I Fol ≥ 7/ 6 mm, P
4
Fol < 7/ 6 mm e P
4
Fol ≥ 7 /6 mm, segundo a
espécie animal.
Espécie animal
Variável Búfalas (n= 85) Vacas (n= 95)
p
P
4
p 3,3 [0,6; 5,3] 5,2 [2,2; 8,0] <0,001
INSp 1,6 [1,3; 3,6] 3,0 [1,8; 6,4] <0,001
IGF-I Fol < 7/6 mm 106,4 [73,6; 322,2] 43,2 [18,0; 121,4] <0,001
IGF-I Fol ≥ 7/6 mm 225,5 [124,1; 472,5]
98,0 [27,7; 295,3] <0,001
P
4
Fol < 7/6 mm 153,6 [34,8; 366,3] 206,9 [131,4; 304,6]
0,14
P
4
Fol ≥ 7/6 mm 21,3 [14,9; 34,0] 51,4 [37,8; 106,5] <0,001
P
4
p (concentração plasmática de progesterona), INSp (concentração plasmática de insulina),
IGF-I Fol < 7/ 6 mm (concentração intrafolicular de IGF-I em folículos < do que 7 mm em
búfalas e 6 mm em vacas), IGF-I Fol ≥ 7/ 6 mm (concentração intrafolicular de IGF-I em
folículos ≥ do que 7 mm em búfalas e 6 mm em vacas), P
4
Fol < 7/ 6 mm (concentração
intrafolicular de progesterona em folículos < do que 7 mm em búfalas e 6 mm em vacas) e P
4
Fol ≥ 7/ 6 mm (concentração intrafolicular de progesterona em folículos ≥ do que 7 mm em
búfalas e 6 mm em vacas).
Os dados indicaram que as características endócrinas e de produção
folicular de hormônios podem ser diferentes nas espécies. No entanto, esta
disparidade não significa que uma espécie é mais eficiente do que a outra na
atividade reprodutiva, pois em condições adequadas de nutrição e manejo,
ambas fêmeas são capazes de alcançar índices reprodutivos e produtivos
satisfatórios.
142
7. CONCLUSÕES
Morfometria do Ovário
Em ambas espécies, o formato ovariano predominante é ovóide;
Nas búfalas, os ovários são, em sua maioria, rosados e nas vacas,
amarelados;
As dimensões ovarianas (peso, comprimento, largura e altura) são
menores na espécie bubalina em comparação à espécie bovina.
Morfometria dos Folículos Ovarianos
A análise histológica dos folículos ovarianos demonstrou que os
diâmetros folicular e ovocitário, assim como o número de células que
circundam o ovócito aumentam de acordo com o estágio de
desenvolvimento folicular, em ambas espécies estudadas;
Os formatos dos folículos, dos ovócitos e dos núcleos ovocitários nas
diferentes categorias foliculares (pré-antrais e antrais) são ovais.
Características Ultra-estruturais dos Folículos Ovarianos
Os grânulos mitocondriais não estão presentes nas mitocôndrias
localizadas no citoplasma dos ovócitos bubalinos;
Os folículos secundários bubalinos possuem junções específicas
comunicantes (gap junctions) e de aderência (zonas de aderência)
entre as células da granulosa e o ovócito;
Existem junções do tipo gap entre as células da granulosa e o
ovócito do folículo primário bovino;
Nas vacas, as mitocôndrias circulares são abundantes no citoplasma
dos ovócitos provenientes dos folículos nos estágios iniciais de
desenvolvimento e continuam predominantes nos estágios mais
avançados de desenvolvimento folicular nas búfalas;
Na espécie bubalina, as células da granulosa nos estágios mais
tardios de desenvolvimento folicular apresentam características
citoplasmáticas diferenciadas.
143
Recuperação, Qualidade do Ovócito e Maturação Ovocitária in vitro
As búfalas gestantes apresentam menos folículos superficiais nos
ovários, baixa recuperação de CCOs e menor porcentagem de
metáfase II após a MIV, quando comparadas às fêmeas não
gestantes. Nas vacas, o status reprodutivo não interfere nessas
variáveis;
Ovários bubalinos que possuem CL contém menor número de
folículos superficiais. No entanto, ovários bovinos com CL
apresentam número de folículos superficiais semelhante aos ovários
sem esta estrutura;
A recuperação de CCOs é inferior nas búfalas que possuem CL nos
ovários. Nas vacas, a presença do CL não infuencia a recuperação
de CCOs;
Nas vacas, a recuperação de CCOs desnudos, expandidos e o
número total é inferior no outono/ inverno. As estações climáticas não
apresentam este efeito nas fêmeas bubalinas;
Os CCOs bovinos grau II apresentam competência suficiente para
progredirem e alcançarem o estágio de metáfase da segunda divisão
meiótica;
Nas búfalas, os índices de recuperação de todas as categorias de
CCOs são inferiores aos obtidos para as vacas;
A porcentagem de ovócitos que atinge a metáfase II após a MIV é
menor nas búfalas do que nas vacas.
Concentrações Plasmáticas de Progesterona e Insulina
Em ambas espécies, a concentração plasmática de progesterona é
superior nas fêmeas gestantes; no entanto, a concentração de
insulina circulante é maior nas fêmeas não gestantes.
Concentrações Intrafoliculares de Progesterona, Estradiol e IGF-I
O fluido intrafolicular dos folículos < 7 mm (búfalas) e < 6 mm (vacas)
possui mais progesterona e menos IGF-I do que os folículos ≥ 7/ 6
mm;
144
Nas búfalas, os folículos < 7 e ≥ 7 mm apresentam concentrações
semelhantes de estradiol.
As informações obtidas no presente trabalho são importantes porque
determinaram características biométricas, morfológicas e fisiológicas próprias
das espécies estudadas. No entanto, as diferenças existentes não implicam em
fertilidade reduzida na espécie bubalina, principalmente quando estas fêmeas
são criadas em condições adequadas de manejo e alimentação.
145
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J.H.M., CAMARGO, L.S.A., RAMOS, A.A., FOLHADELLA, I.M., POLISSENI, J.,
FREITAS, C., CLEMENTE, C.A.A., SÁ FILHO, M.F., SOUZA, A.H.,
BARUSELLI, P.S. Efeito da codominância de folículos no momento da
aspiração folicular sobre a recuperação e competência in vitro de oócitos Bos
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58.
179
ANEXO I
Cisteamina: 30070, Fluka BioChemica
®
DMPBS Flush: Nutricell Nutrientes Celulares Ltda.
®
Estradiol: E0130, Sigma
®
FSH: Folltropin, Vetrepharm
®
Hialuronidase tipo II: H 2126, Sigma
®
Hialuronidase tipo V: H 6254, Sigma
®
Hoescht 33342: B2261, Sigma
®
LH: Lutropin-V, Vetrepharm
®
Penicilina/ Estreptomicina: 15140-122, Gibco
®
Piruvato de sódio: P2256, Sigma
®
Sulfato de gentamicina: G3632, Sigma
®
TCM 199 com HEPES: 12340-030, Gibco
®
TCM 199: 11150-059, Gibco
®
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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