( PDF ) Estudo longitudinal sobre similaridade, transmissão, e estabilidade de colonização de Estreptococcus mutans em famílias brasileiras

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

CASSIA MARIA FISCHER RUBIRA

Estudo longitudinal sobre similaridade, transmissão,

e estabilidade de colonização de Estreptococcus

mutans em famílias brasileiras

BAURU

2007

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CASSIA MARIA FISCHER RUBIRA

Estudo longitudinal sobre similaridade, transmissão,

e estabilidade de colonização de Estreptococcus

mutans em famílias brasileiras

v.1

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de

Bauru, da Universidade de São Paulo, como parte

dos requisitos para obtenção do título de Doutor em

Odontologia.

Área de concentração: Estomatologia

Orientadora: Prof

Odila Pereira da Silva Rosa

Co-Orientador: Prof. Dr. Walter A. Bretz

BAURU

2007

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Rubira, Cassia Maria Fischer

R825e Estudo longitudinal sobre similaridade, transmissão, e

estabilidade de colonização de Estreptococcus mutans em

famílias brasileiras / Cassia Maria Fischer Rubira.-- Bauru,

2007.

112 p.

Tese. (Doutorado) - Faculdade de Odontologia de

Bauru. Universidade de São Paulo.

Orientadora: Profª Drª Odila Pereira da Silva Rosa

Co-Orientador: Prof Dr Walter A. Bretz

Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e

científicos, a reprodução total ou parcial desta tese, por

processos fotocopiadores e outros meios eletrônicos.

Assinatura:

Comitê de Ética: Forsyth Institute IRB (Boston, MA, USA)

Protocolo nº: 6-11

Data: August 7, 2007

DEDICATÓRIA

À minha filha, Isabella, pela compreensão

e ajuda. Aos meus pais, Gabriel e Myrthes

que sempre me incentivaram para estudar,

aos quais devo, em grande parte, o que

hoje sou. Às minhas irmãs, Izabel e Cecília,

pelas palavras positivas. Aos meus

sobrinhos, Pedro, Miguel, Juliana e

Eduardo. À minha avó Izabel. Ao José

Augusto. Ao Wilson. Enfim, as pessoas que

por mim, depositaram sua confiança.

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Prof Dra Odila Pereira da Silva Rosa, pela

confiança e a certeza de que eu não a decepcionaria. Ao Prof Dr Walter Bretz,

pela confiança em dobro, a minha eterna gratidão. Aos meus dois

orientadores, espero ter cumprido parte de um belíssimo trabalho realizado

no Projeto Pittsburgh.

Á todos os meus professores desta casa e do curso de doutorado

em Estomatologia, que contribuíram na minha formação como pesquisadora

e educadora. Em especial, ao Prof Dr José Humberto Damante pela a

amizade e paciência, à Profª Drª Ana Lucia Álvares Capelozza pela a alegria e

o carinho, ao Prof Dr Luiz Eduardo Montenegro Chinellato pela atenção e a

serenidade, aos três meus sinceros agradecimentos e eterna gratidão.

Aos demais professores da Cirurgia e da Estomatologia: Profs. Drs.

Paulo Sérgio Perri de Carvalho, Eduardo Sant’Ana, Osny Ferreira Júnior,

Júlio de Araújo Gurgel.

À Profa Dra Maria Fidela de Lima Navarro e ao Prof. Dr. José

Carlos Pereira pelo apoio.

Ao Prof. Dr. José Roberto Pereira Lauris pelas inúmeras

orientações quanto à análise estatística.

Aos funcionários da Estomatologia e da Cirurgia, Josieli, Elza,

Luciana, Camila, Fernanda, Roberto, Roque e Walderez. Em especial à

Marília Gião, minha companheira.

I also thank Dr Anne Tanner and my Forsyth’s friends, Eleni,

Jennifer, Charles, Mohamed and Lila.

Aos amigos de turma de Doutorado, Luís Fernando, Eduardo,

Flávio, Cláudio e Fernando. Aos colegas de Pós-Graduação, Renato, Marcelo,

Etiene, Carla, Zanda, Melissa, Josiane, Tadeu, Renata, Daniele, Gustavo,

Letícia, Marta, Ellen, Manoela, Camila, Marcelo, Gabriel, Ana Raquel,

Adilson, Angélica e o Augusto.

À secretaria de pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Bauru. Aos

funcionários do Serviço de Biblioteca e Documentação “Prof Dr Antônio

Gabriel Atta”.

“For all those times you stood by me

For all the truth that you made me see

For all the joy you brought to my life

For all the wrong that you made right

For every dream you made come true

For all the love I found in you

I'll be forever thankful”

Diane Warren

RESUMO

O objetivo deste estudo foi investigar longitudinalmente a transmissão de

Streptococcus mutans em um grupo de famílias brasileiras de baixa renda. Um

critério de inclusão importante foi o de todos os adultos conviverem na mesma casa

com a criança. Participaram da pesquisa 14 mães, pais e crianças e 8 avós.

Amostras de saliva das crianças foram coletadas em quatro visitas durante 22

meses, para pesquisa de S.mutans. Foram positivas apenas 8 crianças, que tiveram

os seus isolados e os isolados de suas famílias identificados pelo método de

hibridização DNA-DNA. Um total de 506 isolados de S.mutans foi genotipado pelo

método de AP-PCR, usando o primer OPA-02. Foram detectados 20 genótipos

diferentes nas 8 famílias, variando de 1 a 5 nos adultos e 1-2 nas crianças. Todas as

mães e alguns pais e avós compartilharam genótipos com as crianças. Em todas as

famílias foram encontrados genótipos homólogos nos adultos. Alguns genótipos

foram estáveis, e outros, se perderam, mas o compartilhamento pode favorecer a

contínua reinfecção. Três crianças desenvolveram cárie no período. O encontro de

genótipos de cada membro da família na criança e o compartilhar de genótipos nos

adultos, sugerem uma reavaliação de modelos preventivos antimicrobianos

focalizados apenas na figura materna.

Palavras-chave: Streptococcus mutans; AP-PCR; Transmissão

ABSTRACT

The objective of this study was to investigate in a longitudinal study the transmission

of Streptococcus mutans in Brazilian families of a low socioeconomic status. An

important entry criterion for the study was to include all members of a household in

the study. The study cohort was comprised of 14 mothers, fathers and children and 8

grandmothers. Saliva samples were collected for S. mutans analysis in 4 visits during

22 months. Only eight children were positive for S. mutans by employing DNA-DNA

hybridization that was also applied to household members. A total of 506 isolates of

S. mutans were genotyped by AP-PCR with the primer OPA-02. Twenty genotypes

were detected in 8 families ranging from 1 to 5 in the adults and 1-2 in the children.

All mothers and some fathers and grandmothers shared similar genotypes with the

children. In all families homologous genotypes were encountered among adults.

Some genotypes were stable, and others were lost although sharing a similar

environment may favor additional transmission episodes. Three children developed

decay during the study period. The fact that children shared genotypes from all

household members suggest that reevaluation of preventive methods aimed at

suppressing S. mutans infections should include additional family members and not

only the mothers.

Key words: Streptococcus mutans; AP-PCR; Transmission

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Ciclos do termociclador, programado segundo SAARELA et

al 1996

Figura 2 – Exemplo de um Checkerboard usado para detectar 8 espécies

bacterianas em isolados de algumas crianças. As linhas verticais

contêm as sondas das espécies indicadas abaixo na figura. As

linhas horizontais possuem as amostras dos isolados das

crianças. As duas últimas linhas horizontais estão os controles

padrões 10

e 10

UFC/ml

Figura 3 – Fotografia do gel de agarose, onde os produtos de reação de

amplificação com o iniciador arbitrário de isolados de S.mutans

da família 2 foram submetidos à corrida eletroforética. Linha 1 –

peso molecular (M) utilizado foi DNA 1 kpb; linhas 1 a 7 –

isolados da criança (linhas 2 e 3, V2; linhas 4 e 5, V3; linhas 6 e

7, V4); linhas 8 a 11 – isolados da mãe (linha 8, V1; linha 9, V2;

linhas 10 e 11, V4); linhas 12 a 15 – isolados do pai (linhas 12 e

13, V1; linhas 14 e 15, V2); Linhas 16 a 19 – isolados da

agregada (linhas 16 e 17, V1; linhas 18 e 19, V2)

Figura 4 – Transmissão intrafamilial indicado pela similaridade dos

genótipos da Tabela 8

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Características clínicas e escores de EM das 14 Famílias 50

Tabela 2 – Médias e desvios-padrão das características clínicas e escores

de EM dos adultos das 14 famílias

Tabela 3 – Número de dentes irrompidos, ceos e escores de EM nas 14

crianças

Tabela 4 – Correlação entre o número de dentes e o momento de

detecção (MD) inicial de EM pelo teste de Spearman*

Tabela 5 – Comparação dos índices CPOS e escores de EM dos pais de

crianças com e sem cárie pelo teste de Mann Whitney*

Tabela 6 – Hábitos de risco (n=4) dos adultos das famílias de crianças

com e sem cárie

Tabela 7 – Total de isolados de Streptococcus .mutans genotipados nos

membros das 8 famílias

Tabela 8 – Distribuição dos genótipos dos Streptococcus mutans

identificados durante as visitas

Tabela 9 – Estabilidade dos genótipos nos membros das 7 famílias 59

Tabela 10 – Transmissão dos genótipos das 7 famílias 60

Tabela 11 – Encontro de genótipos em um ou associação de membros das

8 famílias

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AP-PCR – Arbitrarily primed Polymerase Chain Reaction (Arbitrarily primed

Polymerase Chain Reaction)

BHI - Brain Heart Infusion

Checkerboard DNA-DNA Hybridization – Painel de hibridização DNA-DNA

CPOS – número de superfícies cariadas, perdidas e obturadas nos dentes

DNA Fingerprinting – Impressão Digital Genômica do DNA

EM – Estreptococos mutans

IG – índice gengival

L - Lactobacillus

RAPD – Random amplification of polymorphic DNA (Polimorfismo no comprimento

de DNA amplificado ao acaso)

p – nível de significância

pb – pares de base

PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase)

Primer – oligonucleotídeos

REA – restriction enzyme analysis (Análise com enzimas de restrição)

RFLP – Restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo no comprimento de

fragmentos de restrição do DNA)

r.p.m – rotações por minuto

SB-20 – Agar sacarose bacitracina

UFC – unidade formadora de colônia

UPGMA – unweighted pair-group method using arithmetic averages (análise das

medias aritméticas de grupos não-ponderados)

LISTA DE SÍMBOLOS

cm - centímetros

µl - microlitro

ml – mililitro

mg - micrograma

ng - nanograma

mM - milimolar

µg/M - micro

± - desvio-padrão

U/ml – Unidade por mililitro

º.C – grau Celsius

pH - potencial hidrogeniônico'

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 26

2 REVISÃO DA LITERATURA 29

3 PROPOSISÃO 38

MATERIAL E MÉTODOS

4.1 População

4.2 Exame clínico e Questionário

4.3 Exame bacteriológico e isolamento de EM da saliva

4.4 Identificação dos estreptococos mutans

4.5 Genotipagem dos Streptococcus mutans por AP-PCR

4.6 Análise Estatística

RESULTADOS

5.1 Dados clínicos e quantificações de EM

5.2 Identificação e genotipagem dos estreptococos mutans

6 DISCUSSÃO 63

7 CONCLUSÕES 71

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73

ANEXO 1 85

ANEXO 2 93

ANEXO 3 105

1. Introdução

Introdução____________________________________________________________

1 INTRODUÇÃO

Os estreptococos mutans (EM) constituem um grupo de cocos Gram

positivos bioquìmica, antigenica e geneticamente heterogêneo, do qual fazem parte,

entre outros, Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus, os principais

responsáveis pela cárie dental humana (LOESCHE, 1986).

O requisito básico para a aquisição e estabelecimento desses

microrganismos é a irrupção dos primeiros dentes decíduos, uma vez que

necessitam de superfícies não descamativas para se implantar (BERKOWITZ,

JORDAN, WHITE, 1975; CARLSSON, GRAHNEN, JONSSON, 1975), tendo sido

observado que, quanto mais precocemente ocorrer a colonização oral por EM, maior

o risco de desenvolvimento de cárie na dentição decídua (ALALUUSUA,

RENKONEN, 1983; KOHLER et al., 1988; FUJIWARA et al., 1991). Por essa razão

existe uma preocupação quanto ao momento da aquisição inicial e a fonte desses

microrganismos.

A colonização pelos EM ocorre num período definido por CAUFIELD et

al. (1993) como “janela da infectividade”, dos 19 aos 31 meses de vida. Esse período

pode variar, conforme o autor, sendo mais precoce (MATTOS-GRANER et al., 1998;

KLEIN et al., 2004), ou mais tardio (EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998).

REDMO EMANUELSSON, THORNQVIST, 2001 sugeriram que a criança que não

for colonizada até os três anos pode permanecer livre por anos.

A mãe parece ser a principal fonte de EM para a infecção dos filhos,

pois na maioria das vezes é sua principal cuidadora (BERKOWITZ, JONES, 1975;

LI, CAUFIELD, 1995; ALALUUSUA et al., 1996; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL,

1998; REDMO EMANUELSSON, WANG, 1998). Dados experimentais já

demonstraram que mães com altas concentrações de EM salivares tendem a ter

crianças altamente infectadas, ocorrendo o inverso com mães com baixas

concentrações (KOHLER, BRATTHALL, 1978; KOHLER, BRATTHALL, KRASSE,

____________________________________________________________ Introdução

1983; CAUFIELD, CUTTER, DASANAYAKE, 1993). Essas observações tornaram-se

a base de estudos que buscam interferir com a transmissão de EM de mãe para filho

diminuindo os níveis salivares de EM nas mães (KOHLER et al., 1982; KOHLER,

BRATTHALL, KRASSE, 1983; TENOVUO et al., 1992; CAUFIELD, CUTTER,

DASANAYAKE, 1993; KOHLER, ANDRÉEN, 1994). Entretanto, existem outras

fontes de infecção (BERKOWITZ et al., 1975; 1980; CAUFIELD, WALKER, 1989;

CAUFIELD, CUTTER, DASANAYAKE, 1993; LI, CAUFIELD, 1993; REDMO

EMANUELSSON, WANG, 1998; SPOLIDORIO et al., 1993; KLEIN et al., 2004;

ERSIN et al., 2004; HAMES-KOCABAS et al., 2006).

Para identificar corretamente a fonte de infecção e o efeito de medidas

preventivas, é preciso saber reconhecer o S.mutans que se pretende eliminar. Nessa

tarefa foram usados vários métodos, como testes bioquímicos, bacteriocinotipagem

e sorotipagem (MASUDA et al., 1979), mas as modernas técnicas moleculares

aprimoraram a identificação e quantificação dos microrganismos, permitindo aos

pesquisadores melhor compreensão sobre a composição da microbiota bucal

(SOCRANSKY et al., 2004). A técnica de hibridização DNA-DNA, por exemplo,

permite a determinação simultânea da presença e da quantidade de espécies

bacterianas em amostras clínicas múltiplas ou únicas (SIQUEIRA et al., 2001). Uma

técnica que vem sendo largamente utilizada na identificação é a AP-PCR, reação em

cadeia da polimerase com primers arbitrários. Trata-se de técnica relativamente fácil

e rápida de executar, comparada à técnicas mais elaboradas para as quais é

necessário o conhecimento prévio da seqüência de DNA da bactéria alvo (SAARELA

et al., 1996).

No Brasil, AZEVEDO, ZELANTE (1994), usando bacteriocinotipagem, e

SPOLIDORIO et al. (2003), com AP-PCR, realizaram estudos transversais com

famílias, tendo observado o compartilhamento de genótipos homólogos de crianças

e seus familiares. Estudo longitudinal completo, pesquisando similaridade,

estabilidade e diversidade genotípica, foi realizado por KLEIN et al. (2004), em pares

de mães e filhos que ficavam em creches. Pela importância do tema, no que diz

respeito a medidas preventivas, são necessárias informações longitudinais

adicionais sobre a aquisição, estabilidade e compartilhamento de genótipos, em

famílias de baixa renda cujos primogênitos sejam cuidados em casa, no período de

aquisição inicial.

2. Revisão de Literatura

____________________________________________________ Revisão de Literatura

2. REVISÃO DE LITERATURA

O início e desenvolvimento da cárie dental dependem da quantidade e

qualidade do biofilme, presença de carboidratos (composição, freqüência e

quantidade) e da resistência da superfície do dente à adesão dos EM. O aumento do

nível de EM e lactobacilos está intimamente associado à ingestão de carboidratos,

pois como organismos acidúricos, sobrevivem ao aumento da acidez na placa

quando comparados aos demais organismos menos ácido-resistentes.

Conseqüentemente à elevação do número de EM e lactobacilos, aumenta a

probabilidade de infecção dos dentes vizinhos, especialmente em presença de

sacarose, que favorece a adesão inicial dos EM à superfície dos dentes (VAN

HOUTE, 1993). Outros fatores como a saliva, exposição ao flúor, higiene bucal,

idade, influência familiar, condição sócio-econômica e susceptibilidade do indivíduo

são coadjuvantes no desenvolvimento da cárie, podendo modular a qualidade e

quantidade do biofilme e aumentar ou diminuir a resistência das estruturas dentais

(LOESCHE, 1986; ALALUUSUA et al., 1994).

Os EM constituem um grupo heterogêneo de microrganismos

classificados em 7 espécies e 8 sorotipos: S. cricetus (sorotipo a), S.mutans

(sorotipos c ,e , f), S.sobrinus (sorotipos d, g), S.macacae (sorotipo c), S.downei

(sorotipo h) e S. ferus (sorotipo c). O sorotipo k foi identificado mais recentemente

(NAKANO et al., 2004) e parece sobreviver mais tempo na circulação sanguínea

humana. No homem, os EM prevalentes são os Streptococcus mutans, com o

sorotipo c correspondendo de 70 a 100% dos isolados, seguidos do Streptococcus

sobrinus (LOESCHE, 1986).

A infância é um importante período para o futuro da saúde bucal no

indivíduo, daí o interesse em determinar o momento, o estabelecimento e a fonte de

transmissão dos EM na boca. Durante este período os dentes decíduos irrompem e

os microorganismos os colonizam. No primeiro ano de vida, os EM podem ser ou

Revisão de Literatura_____________________________________________________

não detectados ou estar provisoriamente presentes na boca de infantes

(CARLSSON et al.,1970; 1975; BERKOWITZ et al., 1975; 1980; MASUDA et al.,

1979; ALALUUSUA, RENKONEN, 1983; FUJIWARA et al., 1991). Inicialmente, as

crianças abrigam baixos níveis de EM no biofilme e a colonização é transitória

(MASUDA et al., 1979; DAVEY, ROGERS, 1984; ALALUUSUA et al., 1996).

O período de aquisição dos EM é um dos fatores chave para melhor

entendimento da evolução e do desenvolvimento do processo da cárie, pois quanto

mais precocemente a criança for por eles colonizada, maior a chance de

desenvolvimento da doença (KOHLER et al., 1978; 1988; ALALUUSUA,

RENKONEN, 1983). Contudo, os limites do período de aquisição continuam

indefinidos, em face das diferenças reais entre populações ou métodos de

amostragem e de detecção. MASUDA et al. (1979) sugerem que o período de

aquisição inicial ocorra entre os 13 e os 31 meses de idade da criança. CAUFIELD,

CUTTER, DASANAYAKE, em 1993, criaram a hipótese da “Janela de Infectividade”

para EM, segundo a qual a aquisição tem lugar entre os 19 e 31 meses de idade.

KARN et al.(1998) apontam o período dos 8 aos 15 meses, enquanto

TEDJOSASONGKO, KOZAI (2002) relatam uma variação maior no período de

aquisição, dos 8 aos 52 meses. Em média, a aquisição inicial é observada aos 26

meses e pelo menos nos primeiros 5 anos de vida (CAUFIELD, CUTTER,

DASANAYAKE, 1993; LI, CAUFIELD, 1995). Em crianças brasileiras, a aquisição

inicial ocorre mais precocemente, aos 15,4 ± 2,12 meses para S.mutans, e 17,63 ±

3,56 meses para S.sobrinus (KLEIN et al., 2004).

A detecção de EM aumenta com a idade e com o número de dentes e

áreas retentivas em suas superfícies (CARLSSON et al., 1975; MASUDA et al.,

1979; ALALUUSUA, RENKONEN, 1983; KLEIN et al., 2004). A presença de

superfícies não-descamativas parece ser essencial para a colonização (CARLSSON

et al., 1969; 1970; BERKOWITZ, JORDAN, WHITE, 1975; BERKOWITZ, TURNER,

GREEN 1980). Entretanto, há evidências de que os EM podem ser encontrados

antes da erupção dos dentes (MILGROM et al., 2000). TANNER et al. (2002)

detectaram EM na língua de 33 % de bebês edêntulos, com forte relação com a

presença da espécie no adulto.

Conforme demonstrado por KOHLER et al. (1978; 1988), a transmissão

de EM se dá através de objetos contaminados por saliva. Em seu estudo, a infecção

ocorreu pelo compartilhamento de utensílios como copo, colher que o adulto,

____________________________________________________ Revisão de Literatura

principalmente a mãe, levava à boca, em questão de horas. Daí a conclusão de que

a fonte natural para a infecção da criança é o indivíduo com quem tem mais contato.

Os autores demonstraram também que a chance da criança se infectar é baixa

quando o cuidador principal (mãe ou outro) abrigar nível inferior a 100.000

S.mutans/ml na saliva.

VAN HOUTE, GREEN (1974) sugeriram que a transmissão de

bactérias entre indivíduos deve-se essencialmente a fatores de afinidade bacteriana

e ao número de UFC (unidades formadoras de colônias) disponíveis para a

aderência, o que inclui, por exemplo, a freqüência de transferência, fatores do

hospedeiro que interferem na aderência ou crescimento bacteriano, sobrevivência

bacteriana durante a transferência, e tipo de dieta do hospedeiro. Esses fatores,

biológicos, bem como os relacionados a hábitos e estilo de vida podem ser

diferentes em diferentes populações e países.

A identificação individual das cepas de EM isoladas das crianças é

essencial para determinar a fonte de infecção. Para tanto, a comparação entre

cepas de crianças e conviventes tem sido realizada com base em características

fenotípicas, usando métodos como a bacteriocinotipagem (BERKOWITZ, JORDAN,

WHITE, 1975; MASUDA et al.,1979; DAVEY, ROGERS, 1984; AZEVEDO,

ZELANTE, 1994; GRONROOS et al., 1998) e a sorotipagem (BERKOWITZ et al.,

1975; MASUDA et al., 1979; LI et al., 2001), bem como em características

genotípicas, investigadas através da determinação de plasmídios em EM

(CAUFIELD et al., 1988), ou de técnicas que analisam os modelos das bandas de

digeridos do DNA cromossômico por endonucleases de restrição, ou impressão

digital de DNA cromossômico - CDF (chromosomal DNA fingerprinting) (CAUFIELD,

WALKER, 1989; KULKARNI, CHAN, SANDHAM, 1989; LI, CAUFIELD, 1995; 1998;

REDMO EMANUELSSON, WANG, 1998; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998;

KOZAI et al., 1999; EMANUELSSON, THORNQUIST, 2001; TEDJOSASONGKO,

KOZAI, 2002; LINDQUIST, EMILSON, 2004); ou estudam o polimorfismo de

comprimento dos fragmentos de restrição - RFLP (restriction fragment length

polymorphism) (MATTOS-GRANER et al. 2001); ou fazem a ribotipagem (SAARELA

et al., 1993; ALALUUSUA et al., 1994;1996; GRONROOS et al., 1998), ou ainda, a

reação em cadeia da polimerase com iniciadores (“primers”) arbitrários – AP-PCR

(arbitrarily primed–polymerase chain reaction) (SAARELA et al., 1996; LI,

CAUFIELD, 1998; LI et al., 2001; SPOLIDORIO et al., 2003; ERSIN et al., 2004;

Revisão de Literatura_____________________________________________________

KLEIN et al., 2004, LI et al., 2005). Sem dúvida, os métodos baseados nas

características genotípicas são mais acurados.

Dentre as técnicas de genotipagem, destaca-se a AP-PCR. Trata-se de

um método rápido, com economia de tempo e de recursos laboratoriais, que pode

ser usado na identificação genômica polimórfica nos estudos epidemiológicos e

taxonômicos (WELSH, MACCLELLAND, 1990; LI, CAUFIELD, 1998). Na

comparação entre técnicas, os resultados da AP-PCR correlacionaram-se bem com

a ribotipagem, indicando tratar-se de método adequado quando se investiga grande

número de isolados de EM (SAARELA et al., 1996).

LI; CAUFIELD (1998) também encontraram excelente concordância

entre o fingerprinting de DNA cromossômico e AP-PCR. No estudo de 14 isolados de

S.mutans por AP-PCR e fingerprinting de DNA cromossômico, esta última mostrou

maior capacidade de distinção entre os padrões genotípicos do que técnica de AP-

PCR, mas o nível de discriminação desta comparou-se favoravelmente com o

fingerprinting de DNA. Na avaliação da similaridade intrafamilial, a técnica de AP-

PCR apresentou resultado semelhante ao do fingerprinting de DNA, quando da

comparação dos isolados de 5 pares de mãe-filho com padrões genotípicos

idênticos, 5 pares mãe-filho com padrões não idênticos e de 5 pais, demonstrando

que a AP-PCR pode distinguir homogeneidade e heterogeneidade de genótipos de

EM em famílias. Na comparação entre as duas técnicas, o alto valor de kappa

(κ=0.867, p<0,001) indicou excelente concordância entre ambas. Quanto à

reprodutibilidade, a AP-PCR demonstrou ser uma técnica precisa, com bom

desempenho. Em poucos casos a AP-PCR pareceu menos capaz que o

fingerprinting em discriminar 40 cepas de S.mutans. Por essa razão, os autores

sugerem, em casos de aparente homologia usando AP-PCR, confirmá-la com um

segundo primer ou pelo fingerprinting de DNA cromossômico.

De 40 primers estudados na AP-PCR, o primer OPA-02 (OPERON

Technologies Inc.), com 10 nucleotídeos – 5´-TGCCGAGCTG e 70% de bases G+C

foi o que exibiu o maior potencial discriminador para S.mutans (LI, CAUFIELD,

1998). A capacidade da AP-PCR com OPA-02 diferenciar S.mutans de S.sobrinus foi

comparável à do CDF (LI et al., 2001). SAARELA et al. (1996) empregaram o primer

OPA-05, na AP-PCR para S.mutans, e o OPA-13, para o S.sobrinus. De modo geral,

os autores que estudam similaridade empregam um primer, como o OPA-02 (LI et

al., 2005), o OPA-05 (ERSIN et al., 2004), o OPA-13 (SPOLIDORIO et al., 2003), ou

____________________________________________________ Revisão de Literatura

dois primers, como o OPA-02 e OPA-13 (KLEIN et al., 2004). No Brasil, estudo

transversal com 22 famílias e outro longitudinal, com 16 pares de mães e filhos,

confirmaram que a AP-PCR é um método altamente eficiente para diferenciar clones

de S.mutans nas famílias (SPOLIDORIO et al., 2003), bem como para estudar a

transmissão vertical, diversidade genotípica e a estabilidade dos genótipos em

crianças de creche, acompanhadas por 20 meses, e suas mães (KLEIN et al., 2004).

Independentemente do método, as pesquisas apontaram as mães

como principal fonte de infecção por EM para os filhos, levando alguns autores a

sugerir que o atraso da infecção inicial delas originadas seria importante para a

prevenção da cárie nas crianças (ALALUUSUA, RENKONEN, 1983; KOHLER et al.,

1983). No entanto, quando se pesquisa a porcentagem de pares de mães e filhos

que compartilham genótipos observa-se grande variação entre os autores,

encontrando-se desde altas porcentagens, em autores como LI, CAUFIELD, 1995;

KLEIN et al., 2004 e ERSIN et al., 2004, até baixas porcentagens, conforme

EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998, e KOZAI et al.,1999 e, em decorrência,

conclusões contraditórias. Assim, LI, CAUFIELD (1995), por exemplo, observaram

relação entre o desenvolvimento de cárie e a similaridade dos S.mutans de mães e

filhos quanto ao gênero e a raça, com maior fidelidade de transmissão de mãe para

filha (88%) do que de mãe para filho (53%). Entretanto, os meninos com genótipos

idênticos aos maternos tiveram 13 vezes maior probabilidade de desenvolver cárie

aos 3 anos do que as meninas. Outros autores, porém, não detectaram influência

significante do gênero das crianças sobre a fidelidade de transmissão (LI et al.,

2000). Portanto, a abrangência das medidas preventivas pode ir além da intervenção

apenas nas mães.

CAUFIELD (1997) observaram que crianças amamentadas no peito

adquirem EM com fidelidade significantemente maior que aquelas não amamentadas

dessa forma. Discutem que as crianças amamentadas no peito têm uma interação

mais intensa com suas mães, favorecendo a transferência das bactérias orais. Mas,

que, além disso, o leite materno contém imunoglobulinas que podem desempenhar

um papel em orientar quais bactérias indígenas podem colonizar. Junto com os

fatores imunológicos transferidos pela placenta, pode ser que esses fatores

desempenhem um papel para levar o bebê a selecionar preferencialmente aqueles

microrganismos indígenas vindos da mãe, enquanto exclui aqueles vindos do pai e

de outras fontes.

Revisão de Literatura_____________________________________________________

Embora a homologia dos genótipos de S.mutans seja mais comum

entre mães e filhos, os pais e indivíduos estranhos à família podem ser fonte

importante de transmissão (EMANUELSSON, THORNQUIST, 2001), mas não existe

um modelo válido para todas as famílias ou populações. Há relatos tanto de isolados

semelhantes entre pais e filhos na China (REDMO EMANUELSSON, WANG, 1998),

no Japão (KOZAI et al.,1999; TEDJOSASONGKO, KOZAI, 2002) e Brasil

(SPOLIDORIO et al., 2003), como ausência de transmissão pai-filho, nos Estados

Unidos (LI, CAUFIELD, 1995) e Suécia (EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998);

transmissão entre esposos no Canadá (KULKARNI et al., 1989), na China (REDMO

EMANUELSSON, WANG, 1998), na Finlândia (SAARELA et al., 1993) e Turquia

(ERSIN et al., 2004), ou compartilhamento pai-mãe-filho na China (REDMO

EMANUELSSON, WANG, 1998), no Brasil (SPOLIDORIO et al., 2003) e na Turquia

(ERSIN et al., 2004). A existência de genótipos não encontrados na família já foi

relatada por alguns (KULKARNI et al., 1989; KOZAI et al., 1999;

TEDJOSASONGKO, KOZAI, 2002; LINDQUIST, EMILSON, 2004;). Há ainda relatos

de cepas idênticas de S.mutans em crianças de creches (MATTOS GRANER et

al.,2001; TEDJOSASONGKO, KOZAI, 2002; LIU et al., 2007), não encontradas por

outros (KLEIN et al., 2004).

Quanto ao número de genótipos, crianças na faixa de 0-3 anos exibem de 1 a 5

genótipos distintos de EM (CAUFIELD, WALKER, 1989; EMANUELSSON, LI,

BRATTHALL, 1998; GRONROOS et al., 1998; KOZAI et al., 1999; MATTOS

GRANER et al.,2001; SPOLIDORIO et al., 2003; KLEIN et al., 2004), enquanto o

número de genótipos abrigados pelas mães pode ser igual (REDMO

EMANUELSSON, WANG, 1998) ou maior (LI, CAUFIELD, 1995; ALALUUSUA et al.,

1996; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998; LINDQUIST, EMILSON, 2004) que

o encontrado nos filhos. Em geral, os isolados pesquisados provêm da saliva, mas a

colonização pode ser sítio-específica . Quando da amostragem de vários sítios

(saliva sublingual, dorso da língua, mucosa dos rebordos maxilares e mandibulares e

biofilme, quando havia dentes) em crianças, tanto o número de isolados (saliva –

194 e biofilme – 272), como o número de genótipos de S.mutans detectados (saliva

– 29 e biofilme – 35) foi maior na placa (KLEIN et al., 2004). Numa comparação do

total de genótipos detectados na saliva, biofilme de esmalte sem cárie e de lesão

cariosa, feita por GRONRÖOS, ALALUUSUA (2000), 80% apareceram na saliva.

LEMBO (2005) detectou porcentagem ainda menor (62,7%). Significa dizer que a

____________________________________________________ Revisão de Literatura

amostragem de saliva é bem eficiente para o isolamento de cepas de EM mas

necessariamente não revela todos os genótipos. Ao se fazer análise qualitativa, é

necessário amostrar múltiplos sítios da dentição (GRONROOS; ALALUUSUA, 2000).

Os adultos geralmente são colonizados por múltiplos genótipos, havendo

estabilidade da colonização por longo tempo (CAUFIELD, WALKER, 1989;

GRONROOS et al., 1995, 1998; EMANUELSSON, THORNQUIST, 2000; REDMO

EMANUELSSON et al. 2003; NAPIMOGA et al., 2004).

A estabilidade da infecção por S.mutans já foi demonstrada por até 25

anos (LI, CAUFIELD, 1995). No entanto, as mesmas flutuações, que ocorrem nos

níveis salivares de EM, são observadas no número de genótipos encontrados ao

longo do tempo em crianças (ALALUUSUA et al., 1994; REDMO EMANUELSSON et

al. 2003) e em crianças e seus pais (CAUFIELD, WALKER, 1989; KULKARNI et al.,

1989). Em relação à aquisição inicial, a estabilidade que se detecta na colonização

de EM não é tão verdadeira quando se estudam os genótipos: 6 de 15 genótipos

inicialmente detectados em 10 crianças suecas permaneceram, os outros 9

desapareceram, significando colonização transitória ou níveis abaixo do nível de

detecção (LINDQUIST, EMILSON, 2004). Em 50% das crianças brasileiras

acompanhadas por KLEIN et al. (2004), de 30 genótipos detectados na aquisição

inicial e coletas confirmatórias subseqüentes, 19 (63,3%) foram transitórios e 11

(36,7%), estáveis. Oito desses 11 genótipos estáveis foram transmitidos pelas mães.

O estudo demonstrou aumento na diversidade genotípica de S.mutans com o passar

do tempo, persistência dos genótipos adquiridos inicialmente, normalmente os

transmitidos pela mãe, perda de alguns, e aquisição de novos genótipos.

Na Suécia, EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, (1998) encontraram grande

diversidade genotípica em 18% das crianças que, individualmente, apresentaram de

1 a 3 genótipos de S.mutans. A reavaliação do mesmo grupo de 11 famílias, feita

com um intervalo de 2 a 3 anos (EMANUELSSON, THORNQUIST, 2000) , com a

idade das crianças variando dos 5 aos 8 anos, demonstrou que 9 das 11 crianças

apresentaram de 1 a 2 genótipos semelhantes, e que as duas crianças restantes

perderam os genótipos do estudo anterior e ganharam dois novos. Os 21 adultos

mantiveram de um a dois genótipos idênticos encontrados na primeira vez.

Entretanto, nove deles perderam um genótipo, e 8 ganharam de 1 a 2 novos

genótipos. Em 2001, o reexame de 13 crianças não-colonizadas no estudo de 1998

mostrou que 10 permaneceram negativas para S.mutans. Das 3 crianças restantes

Revisão de Literatura_____________________________________________________

positivas para S.mutans, uma apresentou genótipo semelhante ao da mãe, outra

apresentou genótipo semelhante ao do pai e a terceira criança apresentou genótipos

diferentes de seus pais. Nenhum dos pais compartilhou genótipos idênticos entre si,

mas todos os seis adultos mantiveram pelo menos 1 genótipo da primeira visita

(REDMO EMANUELSSON, THORNQUIST, 2001).

3. Proposição

Revisão de Literatura_____________________________________________________

3. PROPOSIÇÃO

Membros de 14 famílias brasileiras de baixa renda, com primogênitos

de 7 meses de idade no início, tiveram amostras de saliva coletadas e cultivadas

longitudinalmente até os 30 meses de vida da criança, para isolamento de

estreptococos mutans, com vistas a verificar:

1 - a transmissibilidade dos S. mutans dos adultos para as crianças;

2 - a similaridade dos genótipos entre membros da mesma família;

3 - a estabilidade e variação dos genótipos ao longo do tempo.

4. Material e Métodos

Material e Métodos_____________________________________________________

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 População

A população em estudo derivou-se de um grupo maior de mães e filhos

do projeto “Prevenção da transmissão de estreptococos mutans de mães para filhos”

realizado na Faculdade de Odontologia de Bauru – USP em conjunto com a

Universidade de Pittsburgh, aprovado pelos Comitês de Ética das duas

Universidades e pelo Conselho Nacional de Ética do Ministério da Saúde (Anexo 1).

Os critérios utilizados para inclusão das mães no projeto foram: ser

primíparas; apresentar níveis altos (≥ 10

UFC/ml) de estreptococcus mutans

(EM/ml), pelo teste simplificado Strip mutans

(Orion Diagnostica, Helsinki,

Finlândia), quando a criança tinha dois meses e meio de vida; mais de 20 dentes

presentes e ausência de doença sistêmica ou ingestão de medicamentos. No caso

da sub-amostra (NOCE, 2005), a residência do pai na mesma casa, foi um critério

adicional e o início do estudo coincidiu com os 7 meses da criança. A presença de

outro adulto na casa não foi um critério para participar mas se presente uma

agregada (tia ou avó), esta era convidada a entrar. Somente as mães, por fazerem

parte do grupo controle do projeto, receberam tratamento odontológico desde a

seleção.

Participaram do estudo 14 famílias, classificadas pela renda como de

baixo nível sócio-econômico (GRACIANO, LEHFELD, NEVES FILHO, 1996),

residentes em áreas de concentrações sub-ótimas de flúor (0,60 a 0,79 mg F/L) em

Bauru.

A média de idade dos adultos foi 20,9±4,9 anos, para as mães;

23,6±3,4 anos, para os pais e 41,6±11,5 anos para as agregadas. Todos os

participantes receberam informação detalhada sobre o estudo (Anexo 2), assinando

um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).

______________________________________________________ Material e Métodos

4.2 Exame clínico e Questionário

Para definir a prevalência e a atividade de cárie nos adultos, foi

determinado o índice CPOS, segundo os critérios da OMS, através de exames

clínico e radiográfico na visita 1 (V1), ocorrida aos 7 meses de vida da criança,

repetindo-se o exame clínico 4-5 meses depois (V2). Nessas mesmas visitas foram

determinados os níveis de EM na saliva, para estabelecer a intensidade da infecção,

e isolamento de colônias de EM, para estabelecer as vias de transmissão adulto-

criança, e não o inverso, quando a criança fosse colonizada. Com vistas a

determinar a estabilidade de infecção dos isolados, foi feita nova colheita de saliva

ao final do estudo (V4), somente das mães. Ainda na visita 1, foi avaliado o índice de

sangramento papilar (LOESCHE, 1979) de boca toda, posteriormente adaptado ao

índice gengival (IG) de LOE (1967); aplicado questionário simplificado sobre saúde e

levantadas as condições sócio-econômicas e escolaridade dos pais. Em todas as

visitas foram investigados o uso de antibióticos nos últimos 3 meses, hábitos de risco

para transmissão de EM e hábitos de higiene bucal e dieta dos bebês.

As crianças foram examinadas quanto ao número de dentes e cárie

dental, pelo índice ceos, e os níveis salivares de EM em saliva não-estimulada em 4

visitas, quando contavam com 7-8 meses (V1), 11-12 meses (V2), 17-19 meses (V3)

e 29-30 meses (V4).

4.3 Exame bacteriológico e isolamento de EM da saliva

As amostras de saliva dos adultos foram obtidas após mastigação de

goma de parafina e mantidas em gelo até o processamento, dentro de 30-60

minutos. As amostras dos bebês foram colhidas do assoalho da boca, à medida que

a saliva se formava, com uma cânula fina acoplada a uma seringa estéril, transferida

para tubos eppendorf estéreis e mantida em gelo até o processamento. Após

homogeneização durante 60 segundos em agitador “vortex” (Leucotron

, Sta.Rita do

Sapucaí, MG, Brasil), e diluição seriada em tampão fosfato de potássio 0,05M, pH

Material e Métodos_____________________________________________________

7,1, alíquotas de 50 μl foram semeadas com bastões de vidro em L em placas de

agar SB-20, seletivo para EM, contendo 20% de sacarose e 0,2 U/ml de bacitracina

(DAVEY; ROGERS, 1984), e incubadas em jarras de anaerobiose (Difco, Detroit, MI,

USA), por 48 horas a 37º.C. Com o emprego de microscópio estereoscópico (Wild,

Heerbrurgg, Suíça) as contagens de unidades formadoras de colônias (UFC) foram

feitas baseado na morfologia típica de EM (DAVEY E ROGERS, 1984 e AZEVEDO,

ZELANTE, 1994). A seguir, até 20 colônias representativas de EM de cada placa

foram passadas para caldo BHI (Difco) e incubadas por 24 horas a 37º.C. Uma vez

observada a pureza da cultura, 500 µl foram adicionados a 500 µl de caldo BHI com

20% de glicerol e feita a estocagem à - 86º.C, para posterior identificação definitiva e

genotipagem.

4.4 Identificação dos estreptococos mutans

Os estudos de identificação e similaridade dos EM foram executados

na Universidade de Pittsburgh (PA, EUA) e no Instituto Forsyth (Boston, MA, EUA)

sob a co-orientação do Prof. Dr. Walter A. Bretz e assessoria da Dra. Anne Tanner.

Inicialmente, as amostras foram descongeladas, homogeneizadas no

vortex por 60 segundos e alíquotas de 10 µl foram inoculadas em placas de ágar

sangue e incubadas por 48 horas em câmara de anaerobiose (Anexo 3) (

Innovative

Technology Inc.,

Newburyport, MA, EUA) a 37° C. Observadas a morfologia e

pureza, os isolados removidos de meia placa de ágar sangue foram conservados em

100 µl de solução TE (50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6) e mantidos a - 20° C

até sua identificação pelo método de hibridização DNA-DNA checkerboard

(SOCRANSKY et al,2004) e genotipagem por reação em cadeia da polimerase com

iniciadores arbitrários (AP-PCR).

Hibridização DNA-DNA checkerboard. Alíquotas de 20µl da

suspensão descongelada dos isolados foram adicionadas a tubos

eppendorf

contendo 55µl de T

E (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6). A seguir, foram

adicionados mais 50 µl NaOH a 0,5 M, as suspensões foram fervidas em banho-

______________________________________________________ Material e Métodos

maria por 10 minutos e neutralizadas pela adição de 400 µl de acetato de amônia a

5M filtrado. O DNA liberado foi depositado em uma das canaletas do Minislot 90

(Immunetics, Cambridge, MA, EUA) (Anexo 3), e depois concentrado em uma

membrana de nylon (15 x 15cm) com carga positiva (Roche, Indianápolis, IN, EUA).

O Minislot 90 permite a deposição de 84 amostras diferentes em canaletas

individuais, e de 6 canaletas para os controles representados por um “pool” de

bactérias, com 10

e 10

UFC/ml, dentre as quais encontram-se 10 espécies de

bactérias Gram positivas – Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii,

Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus

oralis, Streptococcus mutans (2) e Streptococcus sobrinus (2).

Após remoção da membrana do Minislot 90, o DNA foi fixado à mesma

por luz ultravioleta (Stralinker® 1800, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), seguido da

secagem da membrana a 80º C por 10 minutos e sua armazenagem a 4° C até os

processos de pré-hibridização e hibridização.

As membranas foram pré-hibridizadas a 42º C por 1 hora, em uma

solução contendo 50% formamida, 2 x SSC (standard saline citrate - 1 x SSC =

150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, pH 7,0), 1% de caseína (Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO, USA), 5x de reagente de Denhardt’s (Fischer Scientific,

Pittsburgh, PA, EUA), 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de

levedura (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, EUA).

As sondas de DNA genômico total para as espécies acima citadas

foram preparadas pela marcação de 1 ng e 10 ng de DNA de cada espécie com

digoxigenina (Random primer digoxigenin labeling kit, Boehringer Manheim,

Indianapolis, IN, USA), de acordo com FEINBERG E VOGELSTEIN (1983). As

sondas foram desnaturadas a 100º C por 5 minutos em cada tampão de hibridização

que continha a sonda, e mantidas no gelo.

Para a hibridização, a membrana foi posicionada no Miniblotter

(Immunetics) (Anexo 3) de forma que as linhas de DNA ficassem perpendiculares

aos canais de hibridização. Em cada canal, foi adicionada uma sonda de DNA

(20ng/ml) em 160 μl da solução de hibridização composta de 45% de formamida, 5 X

SSC, 1 X de reagente de Denhardt’s, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/ml

de RNA de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de

caseína (Sigma). A hibridização ocorreu por uma noite a 42º.C.

Material e Métodos_____________________________________________________

Após a hibridização, as membranas foram removidas do Miniblotter e

lavadas duas vezes (25 minutos cada uma) no aparelho Disk Wisk (Schleicher e

Schuell, Keene, NH, USA) (Anexo 3) a 68° C em solução tampão composta de 1%

de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na

HPO

, a fim de remover as sondas que não

foram hibridizadas completamente.

Para a detecção dos híbridos, as membranas foram bloqueadas por

imersão durante 1 hora numa solução contendo 1% de ácido maléico, 3 M de NaCl,

0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, pH 8,0, sob agitação. A

seguir, as membranas foram incubadas numa solução com anticorpos anti-

digoxigenina conjugados a fosfatase alcalina diluída a 1:10.000 por 30 minutos em

agitador.

As membranas foram depois lavadas 4 vezes, por 10 minutos, em

solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween

20, pH 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução de 0,1 M de Tris HCl, 0,1M de

NaCl, 50 mM de MgCl2, pH 9,5.

Para que os híbridos fossem visualizados, as membranas foram

transferidas para uma película plástica e incubadas a noite toda em temperatura

ambiente em uma solução reveladora à base de fosfato e uma substância

quimioluminescente (Gene Images™ ECF™ Detection Kit - GE Healthcare UK Ltd,

Buckinghamshire, England, UK) sendo feita a sua leitura através do escâner de

fluorescência (Molecular Dynamics Inc, Sunnyvale, CA, EUA) (Anexo 3).

4.5 Genotipagem dos Streptococcus mutans por AP-PCR

Extração do DNA. Para os isolados identificados como S.mutans, o

protocolo de extração de DNA, para a AP-PCR, foi adaptado do manual de extração

do DNeasy Tissue Kit (Anexo 3)(QIAGEN, Valencia, CA, EUA).

Os isolados mantidos em 100 µl de solução TE foram descongelados,

centrifugados por 10 minutos, a 10.000 x g e o sobrenadante descartado. Ao

sedimento foram adicionados 160 µl de solução tampão enzimático (20 mM Tris-HCl,

______________________________________________________ Material e Métodos

pH 8.0; 2 mM EDTA; 1.2% Triton

X-100), 20 µl de lisozima (180 mg/ml, Difco) e 20

µl de acromopeptidase (2.500 U/ml, Difco) seguidos de incubação em banho-maria

por 1 hora a 37°C.

A seguir, foram adicionados ao tubo 25 µl de Proteinase K e 200 µl de

solução tampão AL, ambas fornecidas pelo kit, e incubação por uma noite a 55°C.

Após essa incubação, foram adicionados à suspensão 200 µl de etanol (96%), com

agitação delicada até a mistura ficar homogênea. Nesta fase observava-se a

precipitação do DNA na solução. Toda a mistura foi então transferida para uma

coluna (DNeasy spin column), com um filtro (DNeasy membrane) e um orifício

(Anexo 3), encaixada em um tubo coletor, e centrifugada a 10.000 x g por 1 minuto,

com descarte do tubo coletor. A coluna foi então adaptada a um novo tubo coletor,

adicionada de 500 µl da solução AW1 (kit) e centrifugada a 9.000 x g por 1 minuto.

Após o descarte, novo tubo coletor foi recolocado, no qual foram adicionados 500 µl

de solução AW2 (kit) e feita a centrifugação a 14.000 x g por 3 minutos. Descartado

o último tubo coletor, a coluna foi colocada num novo tubo eppendorf de 1.5 ml e,

sobre o filtro, colocados 100 µl de solução AE para extração do DNA preso ao

mesmo. Após um período de incubação de 1 minuto a temperatura ambiente, foi

feita a centrifugação a 10.000 x g por 1 minuto e a eliminação da coluna, com a

amostra de DNA sendo então mantida no eppendorf em freezer a -20º.C.

A concentração de DNA de cada amostra foi determinada em

espectrofotômetro (NanoDrop® ND-1000, Atkinson, NH, USA).

Genotipagem por AP-PCR. A amplificação por AP-PCR foi feita num

volume de 50 µl de reação de PCR contendo 25 µl de solução para PCR Choice™

Taq Mastermix DNA polymerase (Denville Scientific Inc. Metuchen, NJ, USA), com

2,5U de Taq DNA Polymerase, 20 mM Tric-HCl (pH 9,0), 3,0 mM MgCl

, 20 mMKCl,

16 mM (NH

)SO

, 0,1% Triton X-100, dNTP mix (1,5mM MgCl

); 0,4 mM de primer

OPA-02 (oligonucleotídeo 5’ – TGCCGAGCTG – 3’ - Invitrogen Co. Carlsbad, CA,

USA); 2 µl de amostra de DNA (média de 170 ng/µl) e 22 µl de água destilada

UltraPure DNAase/RNAase-free (Invitrogen).

A amplificação do AP-PCR no termociclador (PTC 200 Thermal Cycler,

GMI Ramsey, Minnesota, EUA) (Anexo 3) seguiu o protocolo de Saarela et al.

Material e Métodos_____________________________________________________

(1996), com 35 ciclos nas temperaturas de 94°C durante 1 minuto; 36° por 2

minutos e 72°C durante 2 minutos . A desnaturação inicial foi feita a 94º.C por 5

minutos, e a extensão final a 72º.C por 5 minutos (Figura 1). Um controle negativo

sem amostra de DNA foi incluído a cada reação de AP-PCR. Os controles positivos

foram representados por 3 amostras de S.mutans de membros de famílias diferentes

e uma amostra de S.sobrinus.

94°C 94°C 72°C 72°C

5’ 1’ 36°C 2’ 5’ 4°C

2’ ∞

Figura 1 - Ciclos do termociclador, programado segundo SAARELA et al 1996

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforose (Model B2

EasyCast™ Mini Gel Electrophoresis System, Thermo Fisher Scientific, Portsmouth,

NH) (Anexo 3) em agarose gel (Seakem

LE Agarose, Cambrex Bio Science

Rockland, Inc, Rockland, ME, EUA) a 1,2% em tampão 5 x TBE (Tris-Borato-EDTA)

em corrida a 70V (Power Pac 3000, RIO-RAD, Hercules, CA, USA) (Anexo 3) por

duas horas e trinta minutos em tampão 0.5 x TBE. Um marcador padrão de peso

molecular de 1 kbp (250 a 10.000 pares de base - Promega Co., Madison, WI, EUA)

foi adicionado a cada gel. Após a corrida, o gel foi corado com brometo de etídio a

0,25% (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, EUA), visualizado, fotografado por luz

ultravioleta (Multimage Light Cabinet, Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, EUA)

(Anexo 3) e suas imagens salvadas no formato TIFF.

Os padrões de banda gerados no gel de cada isolado da mesma

família foram analisados lado a lado, visualmente, e uma matriz de 0 e 1 foi

construída baseada na ausência (0) e presença (1) das bandas marcadas. Os

padrões dos genótipos foram considerados similares quando a maioria das bandas

era idêntica em alcance entre 250 e 1500 bp.

______________________________________________________ Material e Métodos

4.6 Análise Estatística

As variáveis do Índice gengival, o índice CPO-S e o nível de EM na saliva

dos adultos foram comparados através do teste de Mann Whitney. As variáveis EM

na saliva e hábitos de risco dos adultos, o tempo de amamentação, e a renda

familiar foram comparadas com a presença e ausência de cárie na criança pelo teste

de Mann Whitney. A relação entre a presença de cárie nas crianças e o tipo de parto

(normal ou cesariana) ou a presença de açúcar em sua dieta foi pesquisada pelo

teste exato de Fisher, e, com a raça, pelo teste Qui-quadrado.

Foi utilizado o teste de Spearman determinar a correlação entre o tempo de

aquisição inicial dos EM na saliva nas crianças e o número de dentes e nível de EM

na saliva nas quatro visitas. O valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente

significante.

5. Resultados

___________________________________________________________ Resultados

5. RESULTADOS

5.1 Dados clínicos e quantificações de EM

Na tabela 1 estão representados a idade, número de dentes e os

valores médios dos índices CPOS e gengival (IG), bem como os escores médios de

EM quantificados nas salivas dos adultos das 14 famílias nas visitas 1 e 2, enquanto

na tabela 2, as médias e desvios-padrão desses indicadores. Feita a comparação

dos indicadores clínicos entre mães, pais e agregadas pelo teste de Mann Whitney,

não se observou diferença significante entre mães e pais para o índice CPO-S

(p=0,285). Todavia, a comparação de ambos com as agregadas resultou significante

para as mães (p=0,010) e os pais (p=0,002), face ao alto número de extrações nas

agregadas. Não se observou diferença estatisticamente significante entre mães, pais

e agregadas para o IG (p>0,05).

O escore médio de EM na saliva das mães foi bem mais elevado que o

dos pais e agregadas, pelo teste de Mann Whitney, resultando em p=0,027 na

comparação entre os primeiros, e p=0,008 entre mães e agregadas. Não houve

diferença quando comparados os escores de EM na saliva dos pais e agregadas

(p=0,238).

Resultados_____________________________________________________________

Tabela 1 – Características clínicas e escores de EM das 14 Famílias

Família Idade nº dentes IG CPO-S EM*

1 Mãe 16 25 0,85 22 4

Pai 23 30 1,52 21 2

Avó 43 15 1,09 87 2

Mãe 18 28 1,31 12 4

Pai 25 26 0,64 24 2

Avó 49 24 0,35 47 1

3 Mãe 19 27 1,25 33 3

Pai 20 25 0,70 23 2

Mãe 23 28 1,61 20 4

Pai 24 30 1,15 34 2

Avó 51 22 1,00 59 1

Mãe 21 28 0,61 24 4

Pai 20 31 1,68 19 3

6 Mãe 25 31 1,03 13 2

Pai 22 32 1,43 15 2

Avó 44 31 1,32 24 1

7 Mãe 19 27 0,96 24 3

Pai 20 28 1,00 5 2

8 Mãe 18 28 1,42 9 1

Pai 25 30 1,33 17 1

9 Mãe 19 26 1,27 46 1

Pai 24 31 1,14 8 2

10 Mãe 17 27 0,58 9 2

Pai 18 29 1,08 8 1

Avó 36 18 0,86 62 2

11 Mãe 35 30 0,93 47 2

Pai 26 28 1,00 1 0

Tia 16 28 1,27 10 2

12 Mãe 23 25 1,25 42 4

Pai 31 30 1,53 20 4

13 Mãe 23 27 1,50 51 4

Pai 27 27 1,17 43 2

Avó 51 10 1,12 92 1

14 Mãe 17 28 1,77 14 4

Pai 25 26 1,05 39 2

Avó 43 0 128 2

* Escores EM/ml de saliva: 1 - <10

; 2 - ≥ 10

< 5x10

; 3 - ≥5x10

<10

; 4 - ≥10

Famílias onde as crianças apresentaram cárie aos 30 meses

___________________________________________________________ Resultados

Tabela 2 – Médias e desvios-padrão das características clínicas e escores de EM dos adultos das 14

famílias

Integrante Idade

nº dentes IG CPOS EM

Mãe

20,93

± 4,89

27,50

± 1,65

1,17

± 0,30

25,50

± 14,96

3,00

± 1,17

Pai

23,57

± 3,41

28,78

± 2,15

1,17

± 0,30

19,57

± 12,24

1,92

± 0,91

Agregada

41,62

± 11,51

18,50

± 10,11

1,00

± 0,33

63,37

± 38,40

1,50

± 0,53

A Tabela 3 apresenta o número de dentes irrompidos, índice ceos e

escores de EM na saliva das crianças nas quatro visitas. Uma criança não

compareceu na visita 4 (# 7). Na V4, todas as crianças apresentavam dentição

completa sendo que apenas três desenvolveram cárie, uma do gênero masculino (#

4) e duas do gênero feminino (# 2 e 5). Além dessas, outras sete apresentaram EM,

restando apenas três crianças (# 3, 6 e 13) sem EM na última visita.

Resultados_____________________________________________________________

Tabela 3 – Número de dentes irrompidos, ceos e escores de EM nas 14 crianças

nº dentes ceos Escores de EM/ml

Criança

(Gênero)

V1 V2 V3 V4 V4 V1 V2 V3 V4

1 (F) 0 4 7 20 0 0 0 4 1

◊

(F)

0 4 10 20

0 1 4 2

3 (M) 0 5 10 20 0 0 0 0 0

◊

(M)

0 5 12 20

1 0 4 2

◊

(F)

0 8 13 20

0 0 0 3

6 (F) 0 8 12 20 0 0 0 0 0

7(F) 0 2 7 * * 0 1 0 *

8 (M) 0 6 12 20 0 0 0 0 2

9 (M) 0 6 11 20 0 0 0 0 1

10 (M) 0 4 6 20 0 0 0 0 1

11 (F) 0 2 7 20 0 0 0 0 1

12 (F) 0 8 12 20 0 0 0 0 1

13 (F) 0 5 12 20 0 0 0 0 0

14 (F) 0 2 12 20 0 0 0 0 1

* - Não compareceu à avaliação

◊

- Crianças com cárie

O teste de Spearman não mostrou correlação entre o maior ou menor

número de dentes e o momento de detecção inicial dos EM nas crianças (Tabela 4).

Tabela 4 – Correlação entre o número de dentes e o momento de detecção (MD) inicial de EM

pelo teste de Spearman*

r p

nº dentes V2 x MD

14 0,253 0,382

nº dentes V3 x MD

14 0,274 0,341

*Significante: p< 0,05

___________________________________________________________ Resultados

Com base na ausência ou presença de cárie, as crianças foram

divididas em dois grupos que foram, então, comparados relativamente a algumas

variáveis já associadas com essa condição. A comparação entre os valores médios

de CPOS e EM na saliva das mães e pais das crianças com e sem cárie pelo teste

de Mann Whitney não revelou diferença estatisticamente significante (p>0,05)

(Tabela 5).

Tabela 5 – Comparação dos índices CPOS e escores de EM dos pais de

crianças com e sem cárie pelo teste de Mann Whitney*

CPOS EM/ml

Crianças (n)

Mãe Pai Mãe Pai

Média 18,67 25,67 4,00 2,33

Com cárie

(3)

DP 6,11 7,64 0 0,57

Média 28,00 19,20 2,70 1,80

Sem cárie

(10)

DP 17,05 12,94 1,25 1,03

p 0,573

0,370

0,160

0,370

*Significante: p< 0,05

Resultados_____________________________________________________________

Os dois grupos de crianças não diferiram significantemente quanto a

variáveis como tempo de amamentação (teste de Mann Whitney), gênero, uso de

açúcar ou forma de nascimento - parto normal ou cesariana (teste exato de Fisher)

ou raça (teste do Qui-quadrado). No entanto, a comparação dos escores de EM na

saliva na última visita mostrou que as crianças com cárie apresentaram maior escore

de EM, pelo teste de Mann Whitney (p=0,013). As médias e desvios-padrão dos

escores de EM na saliva de crianças com e sem cárie foram, respectivamente, 2,33

± 0,57 e 0,70 ± 0,67.

A tabela 6 indica o número de hábitos de risco: compartilhar colher;

assoprar colher; dormir na mesma cama e beijar a criança na boca, dos familiares de

crianças dos dois grupos. A comparação entre eles pelo teste de Mann Whitney não

revelou diferença estatisticamente significante (p>0,05).

Tabela 6 - Hábitos de risco (n=4) dos adultos das famílias de crianças com e sem cárie

Crianças Família Mãe Pai Agregada

2 4/4 2/2 2/2

Com cárie

4 1/4 1/4 1/4

5 3/4 4/4 -

Média e DP

2,66

± 1,52

2,33

± 1,52

1,5

± 0,70

1 3/4 4/4 3/4

3 1/4 3/4 -

6 0 2/4 2/4

7 0 3/4 -

8 3/4 3/4 -

Sem cárie

9 2/4 1/4 -

10 4/4 3/4 0

11 2/4 1/4 0

12 1/4 2/4 -

13 4/4 2/4 2/4

14 2/4 3/4 0

Média e DP

2,2

± 1,31

2,4

± 0,96

1,16

± 1,32

p* 0,69

0,93

0,85

*Significante: p< 0,05

___________________________________________________________ Resultados

5.2 Identificação e genotipagem dos estreptococos mutans

Identificação. Do total de 565 isolados pesquisados, 551 (97,5%) foram

identificados como estreptococos mutans, sendo 506 Streptococcus mutans, 45

Streptococcus sobrinus e 14 não foram identificados. Para a genotipagem foram

selecionadas apenas 8 famílias por apresentarem EM em todos os membros, como

ilustração, a Figura 2 mostra o resultado da identificação dos EM por hibridização

DNA-DNA de algumas crianças.

Figura 2 – Exemplo de um Checkerboard usado para detectar 8 espécies bacterianas em isolados

de algumas crianças. As linhas verticais contêm as sondas das espécies indicadas

abaixo na figura. As linhas horizontais possuem as amostras dos isolados das crianças.

As duas últimas linhas horizontais estão os controles padrões 10

e 10

UFC/ml.

548_1_4th 2 2606_3_4th 2 2584_7_3rd 2

548_1_4th 20 2606_3_4th 20 2584_7_3rd 20

548_2_4th 2 2606_4_4th 2 2584_8_3rd 2

2548_2_4th 20 2606_4_4th 20 2584_8_3rd 20

548_3_4th 2 2606_5_4th 2 2584_9_3rd 2

2548_3_4th 20 2606_5_4th 20 2584_9_3rd 20

548_4_4th 2 2606_6_4th 2 2584_10_3rd 2

2548_4_4th 20 2606_6_4th 20 2584_10_3rd 20

548_5_4th 2 2606_7_4th 2 2638_1_4th 2

548_5_4th 20 2606_7_4th 20 2638_1_4th 20

548_6_4th 2 2606_8_4th 2 2638_2_4th 2

548_6_4th 20 2606_8_4th 20 2638_2_4th 20

548_7_4th 2 2606_9_4th 2 2638_3_4th 2

548_7_4th 20 2606_9_4th 20 2638_3_4th 20

548_8_4th 2 2606_10_4th 2 2638_4_4th 2

548_8_4th 20 2606_10_4th 20 2638_4_4th 20

548_9_4th 2 2584_1_3rd 2 2638_5_4th 2

548_9_4th 20 2584_1_3rd 20 2638_5_4th 20

2548_10_4th 2 2584_2_3rd 2 2638_6_4th 2

548_10_4th 20 2584_2_3rd 20 2638_6_4th 20

2584_1_4th 2 2584_3_3rd 2 2638_7_4th 2

584_1_4th 20 2584_3_3rd 20 2638_7_4th 20

2584_2_4th 2 2584_4_3rd 2 2638_8_4th 2

584_2_4th 20 2584_4_3rd 20 2638_8_4th 20

606_1_4th 2 2584_5_3rd 2 2638_9_4th 2

606_1_4th 20 2584_5_3rd 20 2638_9_4th 20

606_2_4th 2 2584_6_3rd 2 2638_10_4th 2

606_2_4th 20 2584_6_3rd 2638_10_4th #

ixed 10

mixed 10

ixed 10

mixed 10

A. isrealii

A. naeslundii

S. gordonii

S. mitis

S. sanguinis

S. oralis

S. mutans

S. sobrinus

A. isrealii

A. naeslundii

S. gordonii

S. mitis

S. sanguinis

S. oralis

S. mutans

S. sobrinus

A. isrealii

A. naeslundii

S. gordonii

S. mitis

S. sanguinis

S. oralis

S. mutans

S. sobrinus

Resultados_____________________________________________________________

Genotipagem. A tabela 7 mostra o total de isolados de S.mutans

examinados nas 8 famílias. As reações com o iniciador OPA-02 dos 506 isolados de

S.mutans geraram até 15 bandas, com peso variando entre 250 e 2500 pb. (Figura

3). A análise dos géis com os produtos do iniciador OPA-02 foi realizada por

comparação visual. O total de genótipos detectados foi 20, com um máximo de 4

genótipos nos adultos e máximo de 2 nas crianças.

Tabela 7 – Total de isolados de Streptococcus .mutans genotipados nos membros das 8 famílias

Família Mãe Pai Agregada Criança Total

1 23 16 19 20 78

2 12 20 19 30 81

4 30 19 21 12 82

5 28 20

10 58

7** 20 10

10 40

8 28 20

10 58

10 23 12 24 6 65

12 20 18

6 44

Total 184 135 83 104 506

NT – Não tem; ** Não compareceu à visita 4

___________________________________________________________ Resultados

Na amostra total foram detectados 20 genótipos.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Figura 3 – Fotografia do gel de agarose, onde os produtos de reação de amplificação com o iniciador

arbitrário de isolados de S.mutans da família 2 foram submetidos à corrida eletroforética. Linha 1 –

peso molecular (M) utilizado foi DNA 1 kpb; linhas 1 a 7 – isolados da criança (linhas 2 e 3, V2; linhas

4 e 5, V3; linhas 6 e 7, V4); linhas 8 a 11 – isolados da mãe (linha 8, V1; linha 9, V2; linhas 10 e 11,

V4); linhas 12 a 15 – isolados do pai (linhas 12 e 13, V1; linhas 14 e 15, V2); Linhas 16 a 19 –

isolados da agregada (linhas 16 e 17, V1; linhas 18 e 19, V2)

Resultados_____________________________________________________________

A tabela 8 apresenta a distribuição dos genótipos de S.mutans nos

membros das famílias longitudinalmente. As letras maiúsculas codificam os

genótipos adquiridos intrafamilial, não havendo similaridade interfamilial.

Tabela 8 – Distribuição dos genótipos dos Streptococcus mutans identificados durante as visitas

Família Mãe Pai Agregado Criança

V1 V2 V4 V1 V2 V1 V2 V1 V2 V3 V4

1 AB B AB A A A AB ¤ ¤ A A

2 A B AB ABC ABC ABC ABC ¤ AB A AB**

4 AC AC ABC ABC AB ABC ABC ¤ ¤ AB AB**

5 AB AB AB AB AB - - ¤ ¤ ¤ A**

7 AD ABC * CD * - - ¤ AB ¤ *

8 AB AB A A AB - - ¤ ¤ ¤ A

10 ABC AB C BD BC B BCDE ¤ ¤ ¤ A

12 ABC BC(FG) * AB (FG) AC (F) - - ¤ ¤ ¤ A

- sem agregada; f – faltou a visita; ¤ cultura negativa para EM

** crianças que apresentaram cárie na última visita; as letras maiúsculas indicam genótipos idênticos

dentro da família; Letras F, G representam genótipos de Streptococcus sobrinus compartilhados na

Família 12.

Convencionando como estável o genótipo detectado em pelo menos

duas ocasiões, em todas as famílias foram encontrados genótipos compartilhados

estavelmente pelos adultos, exceto na família 12, sendo que a família 7 ficou

prejudicada pelas faltas de seus membros. Entre adultos e crianças somente nas

famílias 1, 2 e 4. Necessitando comprovação longitudinal, quer seja por serem

isolados na última visita ou por serem perdidos em visita posterior, alguns genótipos

sugerem transmissão possível ou transitória entre adultos (famílias 1,4,8,10,12) e

entre adultos e crianças (famílias 5, 8, 10, 12). Apenas um genótipo, o E, da

agregada da família 10, entre os 20 detectados, não foi compartilhado (Tabelas 9 e

10)

___________________________________________________________ Resultados

Tabela 9 – Estabilidade dos genótipos nos membros das 7 famílias

Família Genótipos

Total de

genótipos

Membros A B C D E

E E - - -

E - - - -

E N - - -

E - - - -

E E - - -

E E E - -

E E - - -

E N E - -

E E P - -

E E E - -

E E - - -

N - - - -

E P - - -

E N - - -

N - - - -

E E N - -

- E N P

- E N N N

N - - -

P E E - -

3 P

E P N -

N - - - -

E – estável; N – novo; P – perdido

Resultados_____________________________________________________________

Tabela 10 - Transmissão dos genótipos das 7 famílias

FAMÍLIAS

TIPO 1 2 4 5 8 10 12

ESTÁVEL

Adulto x Adulto

A ABC ABC AB A B -

Adulto x Criança

A AB AB - - - -

POSSÍVEL OU TRANSITÓRIA

Adulto x Adulto

B - BC - AB CD ABC

Adulto x Criança

- - - A A A A

SEM TRANSMISSÃO

Agregada

- - - - - E -

A tabela 11 retrata a distribuição dos genótipos em membros isolados

ou associação de 2 ou mais integrantes.

Tabela 11 – Encontro de genótipos em um ou associação de membros das 8 famílias

Famílias

Membros

1 2

* 7* 8* 10 12*

Total de

Famílias

- - - - - - - - 0

M x P

- - - B C,D B - B,C,F,G 4

M x A

B - - - - - - - 1

M x C

- - - - A,B - A - 2

P x A

- C - - - - D - 2

P x C

- - - - - - - - 0

A x C

- - - - - - - - 0

M x P x A

- - C - - - B,C - 2

M x P x C

- - - A - A - A 3

P x A x C

- - - - - - - - 0

M x P x A x C

A A,B A,B - - - - - 3

M – Mãe; P – Pai; A – Agregada; C – Criança; * Família sem agregada;

crianças com cárie

___________________________________________________________ Resultados

A Figura 4 representa as fontes de transmissão dos Streptococcus

mutans entre os indivíduos da mesma família, quando a criança está envolvida. A

criança compartilhou genótipos com a mãe e o pai em três famílias (modelo I –

famílias 5, 8 e 12); com a mãe, o pai e a agregada em três famílias (modelo II –

famílias 1, 2 e 4); somente com a mãe, que por sua vez compartilhava outros

genótipos com o pai (modelo III – família 7) e somente com a mãe, que

compartilhava outro genótipo só com o pai e outros dois com o pai e a agregada

(modelo IV – família 10).

I II

III IV

Famílias

1, 2, 4

Famílias

5, 8, 12

Família

Criança

Mãe

Pai

gregada

Legenda

Figura 4 - Transmissão intrafamilial indicado pela similaridade dos genótipos da Tabela 8

Nas oito crianças, que tiveram S. mutans identificados e genotipados,

foram encontrados genótipos similares aos maternos em 100%, similares aos

genótipos paternos em 75% (6/8) e em 75% (3/4) das agregadas. Todas as mães

compartilhavam genótipos com todos os membros da família (Tabela 8).

Não houve correlação entre o número de genótipos e a presença de

cárie, pelo teste de Spearman (p>0,05).

A criança da família 5 apresentou Streptococcus sobrinus apenas na

Visita 3. Esses isolados não foram genotipados devido à ausência da subespécie

nas visitas subseqüentes e nos adultos. Os adultos da Família 12 apresentaram e

compartilhavam S. sobrinus, entretanto, este não foi encontrado na criança.

6. Discussão

_____________________________________________________________ Discussão

6. DISCUSSÃO

Os estudos de transmissão de EM para crianças geralmente envolvem

pares de mães e filhos, pelo fato óbvio de maior contato entre eles. Em

conseqüência, as medidas preventivas para reduzir a colonização por EM e o

desenvolvimento de cárie nas crianças concentram-se na figura materna. Estudos

clássicos de KOEHLER et al. (1984) e TENOVUO et al. (1992) demonstraram que o

tratamento com gel de clorexidina de mães altamente infectadas por EM reduzia

tanto a colonização, como o desenvolvimento de cárie em seus filhos. Analisando a

literatura posterior, porém, BRAMBILLA (2004) concluiu que aplicações tópicas de

agentes antibacterianos podem reduzir a transmissão de EM de hospedeiro para

hospedeiro, mas que isso não resulta necessariamente em menos cárie, daí o

interesse em examinar o papel dos demais membros da família nesse quadro.

O exame clínico dos membros das famílias deste estudo revelou,

especialmente nas mães e pais, índice CPO-S relativamente alto e leve

sangramento gengival (< 2,0), compatíveis com a idade da população. Todavia, a

presença de superfícies com cárie aberta em todos os membros indica a dificuldade

dessas famílias buscarem tratamento, seja pela condição sócio-econômica, seja pela

desinformação, fato que assume importância considerável quando se constata que

esse grupo faz parte de um universo de 79,9% da população brasileira que recebem

até cinco salários mínimos por mês (IBGE, 2005), e que 50% das mães tinham

apenas o ensino fundamental. PERES et al. (2000) apontam a baixa renda familiar

como o principal fator de risco para a cárie, e uma revisão dos recentes modelos

multifatoriais de avaliação de risco informa que variáveis sócio-demográficas são

Discussão_____________________________________________________________

muito importantes para modelos de previsão para crianças pequenas e adultos mais

velhos (POWELL, 1998).

Lesões de cárie não tratadas são uma fonte de EM. Baixos níveis sócio-econômicos

(WAN et al., 2001) e de escolaridade da família, como os vistos neste grupo, têm

sido relacionados com a colonização precoce e altos níveis de EM na saliva das

crianças (KOHLER, ANDREEN, JONSSON, 1984). Significativamente, a colonização

por EM foi observada em todas as famílias, com prevalência de 100% nas mães e

agregadas e de 90% nos pais. Todavia, tem sido sugerido que o maior risco de

infecção nas crianças esteja relacionado com níveis salivares altos de EM nas mães

(KOHLER, BRATTHALL, KRASSE, 1983; ROETERS et al., 1995; BRAMBILLA et al.,

1998; SPOLIDORIO et al., 2003). Escores médios de EM ≥ 10

UFC/ml de saliva

foram observados em 12 das 14 mães. Esses níveis são compatíveis com maior

risco de transmissão da infecção para as crianças (KOHLER, BRATTHALL, 1978).

Mas não apenas isso: essas mães apresentaram escores de EM significantemente

maiores que os dos pais e agregadas, continuando, com raras exceções, como um

grupo de alto risco de cárie para elas mesmas, e de alto risco para a transmissão de

EM como já o eram no momento da seleção da amostra. Outra observação, que se

faz no grupo, é a de que altos níveis de EM nas mães não implicam,

necessariamente, em automática colonização dos filhos, conforme visto no caso da

mãe da família 13 e já constatado por outros (KOHLER; BRATTHALL, 1978;

EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998).

Posto que houvesse vários aspectos comuns entre essas famílias, a

colonização pelos EM e o desenvolvimento de cárie em seus primogênitos foram

heterogêneos, em conformidade com a complexidade dos eventos da transmissão,

que incluem não apenas o número de microrganismos disponíveis para aderir, mas

também sua afinidade pelo hospedeiro, a freqüência de transferência, fatores do

hospedeiro que interferem na aderência ou crescimento bacteriano, sobrevivência

bacteriana durante a transferência, tipo de dieta do hospedeiro (VAN HOUTE,

GREEN,1974), o tipo de parto (LI et al., 2005) ou a duração e intensidade da

amamentação (LI, WANG, CAUFIELD, 2000).

Nas quatro visitas, respectivamente uma, duas, três e dez crianças

mostraram-se positivas para EM, confirmando que o número de crianças

colonizadas aumenta com a idade (KOHLER; BRATTHALL, KRASSE, 1983).

Todavia, nenhuma diferença foi encontrada entre o momento de detecção e o

_____________________________________________________________ Discussão

número de dentes nessas crianças, contrariando outros autores (CARLSSON,

GRAHNEN, JONSSON, 1975; MASUDA et al., 1979; ALALUUSUA, RENKONEN,

1983; KLEIN et al., 2004). É preciso, porém, exercer extrema cautela na leitura dos

resultados estatísticos quanto a todos os aspectos pesquisados, em face do

pequeno tamanho da amostra.

A colonização de 21% das crianças pelos EM aos 19 meses de idade,

e de 82%, aos 29-30 meses de idade, corrobora o conceito da “primeira janela da

infectividade”, apregoado por CAUFIELD, CUTTER, DASANAYAKE. (1993). Nesse

grupo especial, não houve a aquisição mais precoce relatada para as crianças

brasileiras por KLEIN et al.(2004)

Os EM podem ser detectados na boca antes da irrupção dos dentes

(MILGROM et al., 2000; TANNER et al., 2002), o que foi aqui constatado, com a

observação de três crianças positivas para EM (# 2, 4 e 7), antes de um ano de

idade, com níveis variando de 280 a 600 UFC/ml de saliva, geralmente considerados

como de colonização transitória (CARLSSON et al., 1970; 1975; BERKOWITZ et al.,

1975; 1980; MASUDA et al., 1979; ALALUUSUA, RENKONEN, 1983; DAVEY,

ROGERS, 1984; FUJIWARA et al., 1991; ALALUUSUA et al., 1996). Todavia, duas

dessas crianças foram densamente colonizadas por EM na visita 3, e mantiveram a

colonização na visita 4. Coincidentemente, ambas exibiram cárie dental aos 30

meses de idade, uma indicação de que as crianças colonizadas mais precocemente

podem apresentar maior suscetibilidade à cárie dental (ALALUUSUA, RENKONEN,

1983; KOHLER, BRATTHALL, 1978; KOHLER ET AL, 1988), e que, certamente

nesses dois casos a infecção não foi transitória. Essa observação torna-se ainda

mais grave, quando a literatura aponta que com a colonização precoce é maior a

probabilidade de desenvolvimento de cáries nos anos seguintes (KOHLER et al.,

1988; THIBODEAU, SULLIVAN, 1995). A outra criança que apresentou cárie (# 5) só

veio a exibir altos níveis de EM (704.000 UFC/ml de saliva) na visita 4. Todavia, essa

criança teve irrupção mais precoce dos seus dentes (13 dentes na visita 3) quando

comparada com a das demais. A presença de cárie apenas nas crianças

colonizadas confirma também a assertiva de que a doença é mais freqüente em

crianças colonizadas do que nas não colonizadas por EM (ALALUUSUA,

RENKONEN, 1983; FUJIWARA et al, 1991).

A explicação para a presença de cárie ou sua ausência não pôde ser

atribuída aos níveis de cárie ou de EM das mães, que não diferiram

Discussão_____________________________________________________________

significantemente, conquanto quase todas preenchessem o quesito de > 10

EM/ml

de saliva. Pelo menos em parte, porém, a explicação estaria nos níveis de EM

significantemente maiores das crianças com cárie na última visita, confirmando

estudo de MATTOS-GRANER et al. (1998). Nenhuma das outras variáveis

pesquisadas (gênero, raça, tempo de amamentação, uso de açúcar, tipo de parto,

número de hábitos de risco) apontou qualquer diferença entre os dois grupos.

Diferentes estudos, usando técnicas como a bacteriocinotipagem (BERKOWITZ,

JORDAN, 1975; MASUDA et al., 1979; DAVEY, ROGERS, 1984; AZEVEDO,

ZELANTE, 1994; GRONROOS et al., 1998), ou sorotipagem (BERKOWITZ et al.,

1975; MASUDA et al., 1979; LI et al., 2001) apontaram a mãe como a principal fonte

de infecção de EM para os filhos. O primeiro estudo de genotipagem a sugerir que

as bactérias são transmitidas verticalmente de mãe para filho, mostrando em três

pares de mãe e filho que todas as crianças adquiriram um genótipo idêntico ao

materno, foi realizado por CAUFIELD, WALKER (1989), que demonstraram ainda a

estabilidade de colonização em um dos pares, com o reisolamento de genótipos

após intervalo de três anos. Estudos mais abrangentes (CAUFIELD, CUTTER,

DASANAYAKE, 1993; LI, CAUFIELD, 1995) confirmaram a fidelidade de

transmissão. Cepas de EM coincidentes com as das mães foram detectadas em

mais de 70% dos pares de mães e filhos estudados por LI, CAUFIELD (1995), para

os quais, a fidelidade de transmissão poderia ser ainda maior, se o número de

isolados fosse maior. Essa freqüência de similaridade varia, porém, entre as

populações, onde as práticas culturais podem influenciar o grau de contato entre as

crianças, os pais e outros indivíduos (LI, CAUFIELD, 1995; REDMO-

EMANUELSSON, WANG, 1998; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998; KLEIN et

al., 2004).

Para CAUFIELD (1997), a criança deve adquirir vários microrganismos

indígenas de sua mãe, que são complementares aos fatores imunes transferidos

passivamente. Dessa forma, crianças adotadas logo após o nascimento poderiam ter

diferente suscetibilidade a doenças infecciosas, inclusive cárie, devido às diferenças

na aquisição da microbiota indígena de suas mães. FIGUEIREDO et al. (2000),

investigando pares de mães e filhos adotivos, observaram genótipos homólogos em

apenas 19% dos filhos. Oitenta e um por cento dos mesmos foram colonizados por

EM diferentes dos das mães e muitos não apresentavam lesões cariosas e, se as

possuíssem, estavam presentes em menos de 25% das superfícies dentárias.

_____________________________________________________________ Discussão

Genótipos idênticos aos maternos foram encontrados em 100% das

crianças cujos isolados foram genotipados neste estudo, sendo a mãe, portanto, a

principal fonte de infecção da amostra. Coincidência alta (81%) de genótipos de

S.mutans em pares de mães e filhos foi verificada também em outra pesquisa feita

no Brasil (KLEIN et al., 2004). Essa fidelidade genotípica entre mães e filhos parece

estar relacionada com a freqüência de contato e com o nível de S.mutans.

Enquanto o encontro de cepas similares de EM em mães e filhos indica

uma linha materna para a transmissão, a pesquisa de genótipos similares entre pais

e filhos ou pais e mães mostra resultados negativos (Li, Caufield, 1995; 1998;

EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998; REDMO EMANUELSSON,

THORNQUIST, 2001), ou positivos (KULKARNI et al., 1989; SAARELA et al., 1993;

REDMO EMANUELSSON, WANG, 1998; KOZAI et al., 1999; TEDJOSASONGKO,

KOZAI, 2002; SPOLIDORIO et al., 2003; ERSIN et al., 2004). No estudo feito com

onze famílias chinesas, REDMO EMANUELSSON, WANG (1998) encontraram

genótipos idênticos entre mães e filhos, pais e filhos e também entre esposos, com

maior similaridade entre mães e filhos. Sem mencionar o total de genótipos

detectados nos 374 isolados de membros de vinte e duas famílias brasileiras, nem a

similaridade dos genótipos nos adultos, SPOLIDORIO et al. (2003) encontraram 12

bebês (54,5%) com genótipos de S.mutans similares aos maternos, 3 (14%) com

genótipos homólogos aos paternos e 7(32%) com genótipos homólogos aos dos

irmãos. Esse compartilhamento de cepas de S.mutans em famílias brasileiras, já fora

observado através de bacteriocinotipagem por AZEVEDO, ZELANTE, em 1994.

Neste estudo, num total de 506 isolados, foram detectados 20

genótipos diferentes com ampla difusão dos mesmos entre os membros das

famílias, reflexo provavelmente da maior proximidade das pessoas e do

compartilhamento de utensílios que se pode prever em lares de famílias de baixa

renda. Conforme observado nos modelos da Figura 4, além dos genótipos

homólogos aos da mãe, as crianças compartilharam genótipos com os pais e

agregadas, que por sua vez compartilhavam-nos com as mães. É interessante esse

compartilhamento de genótipos com as agregadas. No Japão, não foi observada

transmissão por cuidadoras outras que as mães (TEDJOSASONGKO E KOZAI,

2002). Convencionalmente, foi estipulado que o encontro do genótipo em duas

ocasiões sucessivas ou não, seria indicação de colonização estável, e a perda ou

aquisição recente, como indicação de colonização transitória ou possível, dada a

Discussão_____________________________________________________________

impossibilidade de determiná-la, em face do término do trabalho. O fato de os

genótipos serem encontrados em todas as famílias antes de sua detecção na

criança dá suporte à transmissão com direção única Adulto – Criança. O não

encontro de genótipos alheios à família comprova que essas crianças cuidadas em

casa não abrigam cepas provenientes de fontes alternativas desconhecidas,

conforme visto por outros autores (KULKARNI et al., 1989; KOZAI et al., 1999; LI,

CAUFIELD, 1995; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998; TEDJOSASONGKO,

KOZAI, 2002; LINDQUIST, EMILSON, 2004), ou conhecidas, como creches

(MATTOS GRANER et al.2001; TEDJOSASONGKO, KOZAI, 2002; LIU et al., 2007).

De modo geral, crianças de até três anos podem abrigar de 1 a 4 genótipos

(CAUFIELD, WALKER, 1989; GRONROOS et al., 1998; REDMO EMANUELSSON,

WANG, 1998; EMANUELSSON, LI, BRATTHALL, 1998; KOZAI et al., 1999;

MATTOS GRANER et al., 2001; KLEIN et al., 2004), e os adultos são colonizados

por múltiplos clones de EM, verificando-se estabilidade da colonização por longo

tempo (CAUFIELD, WALKER, 1989; GRONROOS et al., 1995; 1998;

EMANUELSSON, THORNQUIST, 2000; REDMO EMANUELSSON et al. 2003;

NAPIMOGA et al., 2004). Nesse estudo, o número de genótipos entre os adultos

variou de 1 a 5 e entre as crianças de 1 a 2 conforme a literatura, observando-se

estabilidade de alguns e flutuação no encontro de outros genótipos. O fato da

maioria das crianças apresentar S.mutans apenas na última visita, impediu que se

visualizasse o aumento na diversidade de genótipos nas mesmas, verificado por

KLEIN et al.(2004).

Nem todos os genótipos, mesmos os maternos se implantaram nas

crianças. ALALUUSUA et al. (1996) apontam as possíveis explicações para as

crianças apresentarem menos genótipos que suas mães: o maior número de

oportunidades de transmissão para as mães ao longo dos anos; maior número de

fontes de infecção dos membros de suas famílias e seus companheiros, que as

crianças de hoje, uma vez que a prevalência de cárie diminuiu; um reflexo, talvez, do

maior nível de EM em sua infância.

Em crianças com cárie, nenhuma associação significante foi observada

entre a diversidade genotípica do microrganismo e a idade, número de dentes

irrompidos, níveis de EM, ou prevalência de cárie (MATTOS-GRANER et al., 2001),

mas a presença de múltiplos genótipos já foi associada à alta atividade de cárie

(ALALUUSUA et al., 1996; LIU et al., 2007). Duas das três crianças com cárie aqui

_____________________________________________________________ Discussão

estudadas apresentaram dois genótipos. Além delas, apenas uma criança (# 7), da

qual não foi feita a avaliação final de cárie, por não comparecer, apresentou dois

genótipos na visita 2. As demais exibiram um único genótipo.

O estudo da diversidade genética é limitado pelo custo do

processamento laboratorial, o que dificulta a pesquisa de maior número de isolados

que favorece maior detecção de genótipos. Para aumentar a precisão dos

resultados, o número de isolados examinados em cada família, embora o número

utilizado seja compatível com o pesquisado por outros autores, deveria ser maior,

bem como se poderia acrescentar o exame de isolados da placa, visto que

genótipos de S.mutans podem colonizar seletivamente sítios específicos dos dentes

(GRONROOS, ALALUUSUA, 2000; REDMO EMANUELSSON et al., 2003; KLEIN et

al., 2004). O exame da saliva sozinha, como tem sido feito pela maioria dos autores,

é suficiente para estudar os genótipos mais prevalentes, e, portanto, os mais aptos,

e talvez, mais virulentos.

As famílias das três crianças com cárie exibiram compartilhamento de

genótipos entre todos os membros (modelos I e II, da Figura 4). As mães, como

fonte principal de transmissão, têm sido alvo de medidas preventivas que visam

retardar a reaquisição de EM e diminuir a prevalência de cárie nas crianças. Este

trabalho demonstra, a partir da avaliação de um grupo pequeno, que em famílias de

baixa renda, cujas condições de moradia não são ideais, é freqüente a difusão de

genótipos das mães para outros membros. Dessa forma, a explicação pelo

insucesso de alguns dos programas preventivos de redução de cárie nas crianças,

com medidas aplicadas exclusivamente nas mães, poderia estar na facilidade de

reinfecção, pela intensa transmissão intrafamiliar. Para atingir o objetivo, os

programas que preconizam o uso intensivo de antimicrobianos em mães de famílias

de baixa renda, deveriam se estender aos demais familiares.

7 Conclusões

____________________________________________________________ Conclusões

7. CONCLUSÕES

Em famílias de baixa renda, cujos primogênitos são cuidados em casa

pela mãe, pai e eventual agregada, são encontrados genótipos homólogos em todos

os membros. Mesmo sendo a mãe a principal fonte de infecção para a criança, há

também a transmissão de genótipos que são compartilhados pelos adultos, o que

deve favorecer a reinfecção por esses genótipos, quando de uma eventual perda.

Não foram encontrados genótipos de origem extrafamilial.

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