( PDF ) Estudo imunoistoquímico comparativo entre seis anticorpos anti-HER2 em arrays de carcinomas mamários. Correlação com hibridação in situ cromogênica e avaliação interobservador

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLÓGICA E MEDICINA LEGAL

ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO COMPARATIVO

ENTRE SEIS ANTICORPOS ANTI-HER2 EM

ARRAYS

DE CARCINOMAS MAMÁRIOS: CORRELAÇÃO COM

HIBRIDAÇÃO

IN SITU

CROMOGÊNICA E AVALIAÇÃO

INTEROBSERVADOR

CRISTIANA BUZELIN NUNES

BELO HORIZONTE

2007

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Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Nunes, Cristiana Buzelin.

N972e Estudo imunoistoquímico comparativo entre seis anticorpos anti-her2 em

arrays de carcinomas mamários [manuscrito] : correlação com hibridação in

situ cromogênica e avaliação interobservador / Cristiana Buzelin Nunes. –

2007.

97 f. : il. color., tabs.

Orientadora: Profa. Dra. Helenice Gobbi.

Área de concentração: Patologia Médica.

Linha de pesquisa: Patologia Mamária.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade

de Medicina.

Bibliografia: f. 82-89.

Anexos: f. 90-97.

1. Mamas – Câncer – Teses. 2. Imunohistoquímica – Teses. 3. Neoplasias

mamárias – Teses. 4. Hibridação – Teses. 5. Patologia – Teses. l. Gobbi, Helenice.

II. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. III. Título.

NLM: WP 870

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CRISTIANA BUZELIN NUNES

ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO COMPARATIVO ENTRE SEIS ANTICORPOS

ANTI-HER2 EM ARRAYS DE CARCINOMAS MAMÁRIOS: CORRELAÇÃO COM

HIBRIDAÇÃO IN SITU CROMOGÊNICA E AVALIAÇÃO INTEROBSERVADOR

Dissertação apresentada ao curso de Pós-

Graduação em Patologia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal de Minas

Gerais, como requisito parcial à obtenção de grau

de Mestre em Patologia.

Área de concentração: Patologia Médica

Orientadora: Profa. Dra. Helenice Gobbi

BELO HORIZONTE

FACULDADE DE MEDICINA DA UFMG

2007

APOIO FINANCEIRO: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES)

iii

“… quem forma se forma e re-forma ao

formar e quem é formado forma-se e

forma ao ser formado.”

Paulo Freire

Ao meu pai, Dr.Anísio Nunes

AGRADECIMENTOS

Meu eterno agradecimento:

À minha orientadora, Profa. Dra. Helenice Gobbi, pela oportunidade e confiança,

pela amizade, dedicação, incentivo e acompanhamento constantes, e

principalmente, pelo exemplo de ética e trabalho.

Ao meu marido Fernando Diniz Mendes, pela paciência, amor, apoio e

compreensão.

Aos meus pais, Anísio Nunes e Eliana Buzelin Nunes pelo suporte, confiança,

incentivo e principalmente pelos ensinamentos e amor na minha educação.

Aos meus irmãos, Maurício, Patrícia e Raquel, pela presença, carinho e incentivo.

À Dra. Anna Christina Lanna da Matta Machado Rodrigues, pela amizade,

compreensão e equilíbrio.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Patologia Mamária: Luciene Tafuri, Rafael

Rocha, Vanessa Schaber, Gislene Rocha, Fernanda Sanches, Flávio Nepomuceno e

Marina Alvarenga, pela amizade, convivência, momentos de alegria e pelo auxílio na

parte técnica e no levantamento dos materiais.

A todos os professores do curso de Pós-Graduação em Patologia pelos

ensinamentos que foram complementares e fundamentais à minha formação e

crescimento pessoal e profissional.

A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Patologia pela amizade e

companheirismo e momentos agradáveis que passamos juntos.

Ao Dr. Agostinho Pinto Gouvêa, pelo auxílio no material e bibliografia, pelos valiosos

conselhos e pela amizade.

Ao Dr. Jorge Sérgio Reis Filho pela disponibilidade e realização do CISH.

Aos professores, residentes e funcionários do Departamento de Anatomia Patológica

da Faculdade de Medicina da UFMG, especialmente, Lourdinha e Ailton, pelo apoio,

atenção e presença constantes.

Aos médicos e funcionários do Instituto Moacyr Junqueira e do Laboratório da Santa

Casa de Belo Horizonte pela confiança e apoio.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BRCA gene do câncer de mama (Breast cancer gene)

CAP Colégio americano de patologistas

CISH Hibridação in situ cromogênica

CMF ciclofosfamida, metotrexate e 5-fluorouracil

EGF Fator de crescimento epidérmico

EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico

FDA Food and Drug Administration

FISH Hibridação in situ fluorescente

Her1 Receptor 1 do fator de crescimento epidérmico

Her2 (c-erB-b2) Receptor 2 do fator de crescimento epidérmico

Her3 Receptor 3 do fator de crescimento epidérmico

Her4 Receptor 4 do fator de crescimento epidérmico

IIQ Imunoistoquímica

INCA Instituto Nacional do Câncer

MMab Anticorpo monoclonal de camundongo

MTTB Multi-tissue tumor block

PCR Reação em cadeia da polimerase

RabMab Anticorpo monoclonal de coelho

RE Receptor de estrógeno

RP Receptor de progesterona

SOE Sem outra especificação

TMA Microarranjo de tecidos (tissue microarray)

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

viii

LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS

FIGURA 1 Sistema de escore recomendado no Manual do HercepTest™

(Dako,1999): coloração de membrana......................................................................39

FIGURA 2 Ilustrações do guia CISH, ZYMED, 2005. (a): CISH não amplificado (1 a

5 pontos nucleares); (b), amplificado (mais de 6 pontos nucleares ou

aglomerados)..............................................................................................................39

FIGURA 1 (artigo 1) Her2 overexpression and gene amplification in the same case

of invasive breast cancer (X400). A, HercepTest; B, CB11; C, SP3; D,

CISH...........................................................................................................................53

FIGURA 1 (artigo 2) Caso 23 corado pelos anticorpos SP3 (A) e CB11 (B),

avaliado com escore 3+ por todos os observadores

(400X).........................................................................................................................72

FIGURA 2 (artigo 2)

Caso 22 corado pelo anticorpo CB11 (A) e caso 4 corado pelo

HercepTest (B), ambos analisados com escores variáveis (1+, 2+ ou 3+) pelos

observadores (400X)..................................................................................................72

QUADRO 1 Categorias de fatores prognósticos em câncer de mama segundo a

conferência de consenso de 1999 do Colégio Americano de Patologistas...............17

QUADRO 2 Categorias prognósticas dos tipos histológicos dos carcinomas

mamários invasores (segundo ELSTON & ELLIS, 1998)...........................................18

QUADRO 3 Sistema de graduação histológica dos tumores da mama segundo

ELSTON & ELLIS, 1998*............................................................................................19

QUADRO 4 Sistema de escore recomendado no Manual do HercepTest

(Dako,1999): coloração de membrana......................................................................38

QUADRO 5 Determinação do estado do gene Her2 através do CISH proposto pela

Zymed.........................................................................................................................38

TABELA 1 Anticorpos, fabricantes, diluições e tipo de recuperação antigênica

utilizados nas reações imunoistoquímicas.................................................................37

TABELA 1 (artigo 1) Antibodies clones, types, sources, dilutions and antigen

retrieval methods used……………………………………………………………………..49

TABELA 2 (artigo 1) Comparison between the Her2 overexpression using six

different antibodies in 84 breast cancers…………………………………………...……51

TABELA 3 (artigo 1) Semiquantitative IHC scores against amplification of HER2

gene by CISH……………………………………………………………………………….52

TABELA 4 (artigo 1) Sensitivity and specificity of antibodies compared to

CISH………………………………………………………………………………………….52

TABELA 1 (artigo 2) Anticorpos, fabricantes, diluições e tipo de recuperação

antigênica utilizados nas reações imunoistoquímicas................................................70

TABELA 2 (artigo 2) Valores de Kappa da avaliação da concordância

interobservador na interpretação da reação imunoistoquímica do Her2 usando cinco

diferentes anticorpos analisando os resultados em três

grupos.........................................................................................................................74

RESUMO

OBJETIVOS: Comparar o novo anticorpo monoclonal de coelho com anticorpos

monoclonais de camundongo e policlonais de coelho para avaliação do Her2 empregando

arrays de carcinomas mamários correlacionando os resultados com a reação de hibridação

in situ cromogênica (CISH) e avaliar a concordância interobservador na interpretação das

reações. MATERIAL E MÉTODOS: Cortes seqüenciais de arrays contendo 84 carcinomas

mamários foram submetidos à técnica imunoistoquímica empregando-se o SP3

(NeoMarkers), anticorpos policlonais de coelho HercepTest e A0485 (Dako), anticorpos

monoclonais de camundongo CB11 (Novpcastra e CellMarque) e 4D5 (Genentech), e ao

CISH (kit HER2 Spot-Light da Zymed). As reações foram realizadas em duplicata e

avaliadas duplo cego empregando-se o sistema de graduação do HercepTest™ para as

reações imunoistoquímicas e o guia de interpretação do HER2 da Zymed para o CISH. Para

a avaliação da concordância interobservador, uma lâmina corada por cada anticorpo foi

submetida à avaliação individual por cinco observadores, e os resultados separados em três

análises: I (0; 1+; 2+; 3+); II (0 e 1+; 2+ e 3+) e III (0 e 1+; 2+; 3+), e aplicado o teste

estatístico de Kappa. RESULTADOS: No estudo comparativo entre os anticorpos, a melhor

concordância foi entre SP3 e HercepTest (kappa=0,74). Os anticorpos SP3, A0485 e

HercepTest detectaram todos os casos amplificados pelo CISH. Cinco casos não–

amplificados (13%) receberam escore 3+ utilizando SP3, 2 casos (5,3%), utilizando

HercepTest, e 10 casos (26,3%) utilizando A0485. Três casos amplificados (6,5%) foram

negativos pelo CB11 e 1 caso (2,2%) foi negativo para o 4D5. A concordância

interobservador foi boa quando os casos foram avaliados na análise I (0; 1+; 2+; 3+).

Quando foram avaliados na análise II (0 e 1+, 2+ e 3+), a concordância interobservador foi

boa nos casos corados por SP3 e CB11, e muito boa nos casos corados por A0485,

HercepTest e 4D5. Na análise III (0 e 1+; 2+; 3+), foi observada concordância

interobservador moderada para o os casos corados pelo anticorpo CB11, e boa para os

casos corados pelos outros anticorpos. CONCLUSÕES: O novo anticorpo SP3 é mais

sensível do que os anticorpos monoclonais CB11 e 4D5 para a detecção de Her2. Os

anticorpos HercepTest, CB11 e 4D5 mostram maior especificidade do que o SP3. A

concordância interobservador foi considerada entre moderada e muito boa nos casos

corados pelos cinco anticorpos. A menor concordância interobservador ocorreu nos casos

de marcação fraca (1+) e moderada (2+).

Palavras-chave: imunoistoquímica, Her2, RabMab, arrays de tecido, câncer de mama,

hibridação in situ cromogênica, concordância interobservador.

ABSTRACT

AIMS: We compared the novel rabbit monoclonal antibody SP3 with mouse monoclonal and

rabbit polyclonal antibodies using tissue microarrays (TMA) of breast carcinomas correlating

the results with chromogenic in situ hybridization (CISH). MATERIALS AND METHODS:

Serial sections from TMAs containing 84 breast carcinomas were submitted to CISH (Zymed

HER2 Spot-Light kit) and immunohistochemistry, using SP3 (NeoMarkers), rabbit

polyclonal antibodies A0485 and HercepTest (Dako), mouse monoclonal antibodies CB11

(Novocastra and CellMarque), and 4D5 (Genentech). All tests were performed in duplicate

and sections were double-blindly evaluated using the HercepTest™ scoring system and

Zymed HER2 interpretation guide for CISH. For the interobserver agreement evaluation, one

slide from each antibody was independently scored by five observers and results evaluated

considering three analysis: I (0; 1+; 2+; 3+); II (0 and 1+; 2+ and 3+) and III (0 and 1+; 2+;

3+). Kappa statistics was applied for data analysis. RESULTS: From antibodies comparison,

the best concordance was observed between SP3 and HercepTest (kappa=0.74). SP3,

A0485, and HercepTest detected all HER2 amplified cases. There were 5 non-amplified

cases (13%) scored as 3+ using SP3, 2 cases (5.3%) using HercepTest, and 10 (26.3%)

cases using A0485. Three amplified cases (6.5%) were negative for CB11 and 1 case (2.2%)

was negative for 4D5. There was a good rate of interobserver agreement when four scores

were considered (0; 1+; 2+; 3+). When the scores were considered in two categories (0 and

1+; 2+ and 3+), a substantial rate of interobserver agreement was considered for cases

stained for SP3 and CB11, and almost perfect for cases stained for A0485, HercepTest and

4D5. For analysis III (0 and 1+; 2+; 3+), a moderate rate of interobserver agreement was

considered for cases stained for CB11, and a substantial rate for other antibodies.

CONCLUSIONS: The novel SP3 is more sensitive than monoclonal antibodies CB11 and

4D5 for Her2 assessment. However, HercepTest, CB11 and 4D5 show higher specificity than

SP3. The overall interobserver agreement was considered moderate to substantial in the

evaluation of cases stained for the five antibodies. The lowest rate of agreement was

obtained in the evaluation of cases scored as weak (1+) and moderate (2+).

Keywords: immunohistochemistry, Her2, RabMab, tissue microarrays, breast cancer ,

Chromogenic in situ hybridization, interobserver agreement.

xii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................14

1.1 Câncer de mama.................................................................................................14

1.2 Fatores prognósticos e preditivos do carcinoma mamário...........................15

1.2.1 Fatores clínicos.................................................................................................15

1.2.2 Fatores morfológicos e moleculares.................................................................16

1.3 Her2......................................................................................................................20

1.3.1 Her2 e imunoistoquímica...................................................................................23

1.3.2 HER2 e hibridação in situ..................................................................................26

1.3.3 Her2 e variação interobservador.......................................................................27

1.4 Microarranjo de tecidos (tissue microarray, TMA)..........................................29

1.4.1 Construção do TMA...........................................................................................30

1.4.2 TMA e câncer de mama....................................................................................32

2 OBJETIVOS............................................................................................................34

3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................35

4 RESULTADOS........................................................................................................40

4.1 Artigo 1 - The novel rabbit monoclonal antibody against Her2: an

immunohistochemical and CISH comparative analysis in breast cancer

……………………………………………………………………...………………………...41

xiii

4.2 Artigo 2 - Concordância interobservador na interpretação imunoistoquímica

da superexpressão do Her2 detectada por cinco diferentes anticorpos em

arrays de carcinomas mamários.............................................................................61

5 CONCLUSÕES ......................................................................................................79

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................80

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................82

ANEXOS.....................................................................................................................90

1 - INTRODUÇÃO

1.1 - CÂNCER DE MAMA

O câncer de mama é o tumor maligno mais temido pelas mulheres, devido à sua alta

freqüência e pelos efeitos psicológicos que afetam a percepção da sexualidade

feminina e a própria imagem pessoal. É uma das principais causas de morte em

mulheres nos países ocidentais e as estatísticas indicam aumento de sua freqüência

tanto nos países desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento. O avanço

nos métodos de detecção, através de imagem tem permitido seu diagnóstico

precoce e uma intervenção terapêutica progressivamente menos mutiladora. Em

alguns lugares do mundo (América do Norte, Europa Ocidental e Austrália), a

mortalidade por câncer de mama está começando a diminuir, provavelmente devido

à ação combinada de diagnóstico precoce e terapias adjuvantes mais eficazes

(JATOI & MILLER, 2003; VERONESI et al, 2006).

No Brasil, o câncer de mama é o segundo câncer mais incidente em mulheres, e a

maior causa de morte em mulheres por câncer, com 48.930 casos estimados para

2006, segundo a Estimativa de Incidência de Câncer no Brasil do Instituto Nacional

do Câncer (INCA BRASIL, 2006). A mortalidade por câncer de mama depende de

fatores do tumor e do paciente que interferem na sua evolução (SHAIRER, 2004).

Consideram-se fatores prognósticos em câncer de mama as características clínicas

das pacientes e os aspectos patológicos e biológicos dos tumores que permitem

prever a evolução clínica da doença ou sobrevida das pacientes no momento do

diagnóstico inicial. Fatores preditivos, em contraste, são características clínicas,

patológicas e biológicas que são utilizadas para estimar a probabilidade de resposta

a um tipo particular de terapia adjuvante, por exemplo: a pesquisa de receptores de

estrógeno determinando a terapêutica hormonal adjuvante (ALLRED et al., 1998).

Vários marcadores prognósticos têm também valor preditivo. Um marcador

prognóstico para ter validade deve ser validado tecnicamente, ter significado

estatístico validado por testes clínicos e influenciar na decisão clínica. (ALLRED et

al., 1998; FITZGIBBONS et al., 2000; SCHMITT, 1999).

1.2 - FATORES PROGNÓSTICOS E PREDITIVOS DO CARCINOMA MAMÁRIO

1.2.1 - FATORES CLÍNICOS:

a) Idade

O fator idade tem sido considerado indicador de prognóstico adverso. Mulheres

jovens (idade igual ou inferior a 35 anos) mostram tumores com grau histológico

mais elevado, metástases axilares mais frequentes, elevado índice proliferativo e

maior angiogênese tumoral. Além disso, há maior risco de recidiva e metástase à

distância. (McPHERSON et al., 2000).

b) Status do gene BRCA1

Carcinoma de mama em mulheres com mutação do gene BRCA1 estão associados

com pior índice de sobrevida se não receberem terapia adjuvante (GOFFIN et al.,

2003).

c) Gravidez

O carcinoma de mama diagnosticado na gravidez ou lactação está associado com

prognóstico desfavorável. Entretanto, não se sabe se este prognóstico mais

agressivo relaciona-se com a gestação em si ou com outros fatores como a idade da

paciente e diagnóstico em estágios mais avançados na gravidez (TAVASSOLI &

DEVILEE, 2003).

d) Diagnóstico precoce

Os tumores diagnosticados precocemente através de mamografia geralmente são

menores do que os detectados clinicamente, não apresentam metástases axilares, e

incluem uma freqüência maior de subtipos histologicamente mais favoráveis

(TAVASSOLI & DEVILEE, 2003).

1.2.2 - FATORES MORFOLÓGICOS E MOLECULARES:

Em 1999 uma reunião de consenso no Colégio Americano de Patologistas (CAP)

estratificou os fatores prognósticos do câncer de mama em três categorias

especificadas no Quadro 1 (FITZGIBBONS, et al., 2000). A categoria I inclui os

fatores já validados como importantes no prognóstico e úteis na conduta clínica dos

pacientes. Na categoria II foram englobados os fatores prognósticos que têm sido

intensamente estudados do ponto de vista da biologia e da clínica, mas que ainda

precisam ser validados em estudos estatísticos consistentes. A categoria III inclui

todos os outros fatores ainda não suficientemente estudados para demonstrar seu

valor prognóstico.

O tipo e grau histológicos dos tumores têm seu valor bem estabelecido e foram

incluídos na categoria I do CAP. Estudos de longos seguimentos mostram que

alguns tipos especiais cursam com melhor prognóstico (por exemplo: tubular,

cribriforme) enquanto outros indicam prognóstico desfavorável (por exemplo: ductal

SOE, apócrino) (PAGE et al., 1998). As categorias prognósticas dos tipos

histológicos dos carcinomas mamários invasores encontram-se listadas no Quadro

2. Elston e Ellis (1991) propuseram uma classificação prognóstica dos carcinomas

de mama (Quadro 3).

QUADRO 1 – Categorias de fatores prognósticos em câncer de mama segundo

a conferência de consenso de 1999 do Colégio Americano de Patologistas

Categoria Fatores prognósticos

Estadiamento (TNM)

Grau histológico

Tipo histológico

Número de mitoses

Receptores hormonais

HER-2/neu (c-erbB-2)

p53

Invasão vascular linfática ou sangüínea

Marcadores de proliferação celular: MIB-1

Análise de DNA: fração de fase S

III

Análise de ploidia de DNA

Angiogênese tumoral

EGFR

TGF-α

bcl-2

PS2

Catepsina D

FITZGIBBONS, et al., 2000.

QUADRO 2 – Categorias prognósticas dos tipos histológicos dos carcinomas

mamários invasores (segundo ELSTON & ELLIS, 1998)

Categorias prognósticas Tipos histológicos

Tumores de prognóstico excelente Carcinoma tubular

Carcinoma cribriforme

Carcinoma mucinoso (colóide)

Carcinoma túbulo-lobular

Tumores de prognóstico bom Carcinoma lobular clássico

Carcinoma variante mucinoso

Tumores de prognóstico intermediário Carcinoma medular

Carcinoma variante lobular

Carcinoma variante medular

Tumores de prognóstico desfavorável Carcinoma micropapilar

Carcinoma apócrino

Carcinoma ductal SOE

QUADRO 3 – Sistema de graduação histológica dos tumores da mama

segundo ELSTON & ELLIS, 1991*

Formação

tubular

Pontuação 1: > 75% da área tumoral

Pontuação 2: entre 10-75% da área tumoral

Pontuação 3: < 10% da área tumoral

Atipia nuclear

Pontuação 1: tamanho nuclear semelhante à célula ductal

normal (2-3 vezes o tamanho de uma

hemácia)

Pontuação 2: núcleos de tamanho intermediário

Pontuação 3: núcleos grandes e pleomórficos,

geralmente com nucléolos proeminentes

Índice mitótico **

Pontuação 1: 1 mitose por campo de grande aumento

Pontuação 2: 2 mitoses por campo de grande aumento

Pontuação 3: 3 ou mais mitoses por campo de grande

Aumento

*Modificado da classificação de BLOOM & RICHARDSON (1957)

**Para microscópios com objetivas de grande aumento em que o campo visual

possua um diâmetro de 0,48mm, o índice mitótico deve ser corrigido como a seguir

(ELSTON & ELLIS, 1998).

1. Até 6 mitoses por 10 campos microscópicos de grande aumento

2. 7-12 mitoses por 10 campos microscópicos de grande aumento

3. Mais de 12 mitoses por 10 campos microscópicos de grande aumento

O grau histológico pode também ter valor preditivo no que diz respeito à resposta à

quimioterapia. Tumores de alto grau em geral apresentam melhor resposta a

determinados quimioterápicos quando comparados com tumores de baixo grau

histológico (PINDER et al., 1998).

Até o momento, os únicos fatores preditivos avaliados por imunoistooquímica e

amplamente validados para uso clínico rotineiro são os receptores hormonais para

estrógeno (RE) e progesterona (RP) (FITZGGIBONS et al., 2000; TAVASSOLI &

DEVILEE, 2003). Nos últimos anos, o Her2 tem ganhado importância progressiva

como fator preditivo de resposta ao Trastuzumab. No entanto, sua pesquisa através

de IIQ ainda tem controvérsias e será discutido a seguir.

1.3 – Her2

O proto-oncogene HER-2/neu é o análogo humano do gene neu identificado em

neuroblastomas de camundongos, no início da década de 80, e é conhecido como

neu, HER2, e c-erbB-2. Ele está localizado na banda q21 do cromossoma 17 e

codifica uma glicoproteína transmembranar de 185kD. Esta proteína possui uma

seqüência de aminoácidos com atividade tirosinoquinase intracelular semelhante ao

receptor de crescimento epidérmico e atua como um receptor de fatores de

crescimento. Ela é um membro da família dos receptores do fator de crescimento

epidérmico (EGF), a qual inclui o receptor do fator de crescimento epidérmico

(EGFR/Her1), Her2, Her3 e Her4. A ligação de um fator de crescimento a um dos

receptores da família resulta na formação de dímeros (hetero ou homodímeros). A

dimerização é seguida de fosforilação do domínio intracelular do receptor, dando

origem a uma cascata de transdução de sinais e consequente ativação do gene, o

qual tem importante função no crescimento celular e manutenção do estado de

transformação das células. Além disso, ele está envolvido na diferenciação, adesão

e motilidade celular, tendo sido demonstrada correlação entre a amplificação do

HER2 e agressividade biológica nos carcinomas mamários. Embora a proteína Her2

forme heterodímeros com outros membros da família após ligação dos mesmos aos

fatores de crescimento, não existe nenhum ligante conhecido para o Her2, que é

considerado um receptor órfão. Quando superexpresso, o Her2 pode sofrer

homodimerização espontânea, fato que pode ser clinicamente relevante nos tumores

com superexpressão desta proteína de superfície (SCHNITT, 2001; STERN, 2000).

A superexpressão protéica de Her2 na mama tem sido relatada em 40-60% dos

carcinomas intraductais e em 20-30% dos carcinomas invasores (variando de 5-

55%, média de 26%). Nos carcinomas mamários, a superexpressão protéica está

associada à amplificação gênica em 90% dos casos (BÁNKFALVI, et al., 2000).

Nos trabalhos pioneiros de Slamon et al. (1987), o Her2 foi apontado como fator

prognóstico independente no câncer de mama, mas estudos posteriores mostraram

a sua associação com outros fatores prognósticos, entre eles comprometimento

linfonodal, tamanho tumoral, alto grau histológico, elevado índice proliferativo e

ausência de expressão de receptores hormonais, mostrando sua importância

prognóstica em análise univariada, mas que perde seu significado em análise

multivariada. Entretanto, a superexpressão do Her2 continua sendo associada a

tumores de comportamento biológico agressivo, principalmente em pacientes com

carcinoma de mama linfonodo-positivo (GOBBI et al., 2000; SCHNITT, 2001). No

entanto, em pacientes linfonodo negativo esta associação ainda é pouco definida

(GOUVEA et al., 2006). Estudos que associam achados histológicos e

superexpressão do Her2 mostram maior correlação de superexpressão de Her2 com

carcinomas ductais invasores SOE grau histológico III. Carcinomas lobulares

invasores, carcinomas de tipos especiais e carcinoma ductal invasor SOE grau

histológico I apresentam superexpressão de Her2 em cerca de 1,4% dos casos

(LOPEZ-GUERREIRO et al., 2003).

Há evidências consistentes de que a superexpressão do Her2 seja preditiva de

sensibilidade a antraciclinas. Tumores que superexpressam Her2 são menos

responsivos à ciclofosfamida, metotrexate e 5-fluorouracil (CMF) e ao tamoxifeno do

que tumores sem superexpressão do Her2 (MILES, 2001; PICCART et al., 2000). A

substituição do tamoxifeno por inibidores da aromatase em pacientes Her2 e

receptor de estrógeno positivos tem mostrado resultados clínicos mais promissores

(OSBORNE et al., 2003).

Recentemente, a detecção do Her2 se tornou ainda mais importante após a

aprovação pelo Food and Drug Administration (FDA) do Trastuzumab (Herceptin®,

Genentech Corporation, EUA), que associado à quimioterapia, pode diminuir a

progressão tumoral do carcinoma mamário invasor (MILES et al., 2001; PRITCHARD

et al., 2006). Existe uma crescente demanda clínica para detecção precisa do status

do Her2 em carcinomas mamários invasores. Apesar de existir uma variedade de

métodos diferentes para detectar o status do Her2, os dois testes mais utilizados na

prática de rotina são a imunoistoquímica (IIQ) para detecção de superexpressão

protéica e a hibridação in situ fluorescente (FISH) ou cromogênica (CISH) para

detecção de amplificação gênica (ROSS & FLETCHER, 1999). Existem atualmente

três testes aprovados pelo FDA para avaliação do Her2 com finalidade clínica:

HercepTest™(Dako), PathVysion™(Vysis) e Inform™(Oncor/Ventana). Entretanto,

nenhum teste foi aprovado para todos os propósitos clínicos (acesso prognóstico,

resposta preditiva à quimioterapia e determinação de adequabilidade ao tratamento

com Herceptin).

Os primeiros estudos do Her2 utilizavam as técnicas de Southern e Western blotting

para detecção de amplificação gênica e superexpressão protéica. Estes métodos

não são adequados para rotina diagnóstica e foram substituídos pela IIQ e pelo

FISH (JACOBS et al., 1999). A determinação de amplificação do HER2 através de

real-time PCR tem sido comparada ao FISH e à IIQ, mostrando tratar-se de método

sensível e específico, com resultados comparáveis ao FISH, e potencial de

categorizar os tumores com superexpressão duvidosa à IIQ (BENOHR et al., 2005;

NISTOR et al., 2006). Já a dosagem sérica da concentração de Her2 não pode

substituir a IIQ ou o FISH para avaliar Her2. Também não pode ser usada como

marcador tumoral em câncer de mama primário, devido à baixa prevalência da

elevação de Her2 sérico (KONG et al., 2006).

1.3.1 – Her2 E IMUNOISTOQUÍMICA (IIQ)

A reação de imunoistoquímica continua sendo o teste de rotina mais atrativo para a

avaliação do Her2, devido ao menor custo, facilidade técnica e relevância biológica.

A IIQ detecta a superexpressão protéica do Her2 localizada na membrana

citoplasmática da célula tumoral. Problemas com a variabilidade da coloração

imunoistoquímica têm sido reportados, especialmente diferenças na sensibilidade e

especificidade entre os vários anticorpos comerciais disponíveis, variação da

interpretação das reações e artefatos de técnica (HANNA et al., 1999).

A técnica imunoistoquímica envolve as etapas pré-analítica (como preparar o tecido),

analítica (fases técnicas do ensaio imunoistoquímico) e pós-analítica (interpretação e

quantificação dos resultados). Todas as etapas são importantes e ainda há grande

variação nas metodologias empregadas pelos diferentes laboratórios. Como

resultado, a padronização do método é variável. Trabalhos europeus e americanos

mostram grande variação nos resultados da avaliação do Her2. Os problemas

relacionados à fase analítica ou de processamento da reação são os principais

responsáveis por baixas avaliações nos programas externos de controle de

qualidade (HAMMOND, et al., 2003; RHODES, et al., 2002; SEIDAL et al., 2001;

WICK et al., 2002). A escolha do anticorpo primário é um dos fatores importantes

nesta etapa. Embora amplamente empregados na rotina clínica e em estudos

randomizados, ainda não há uma recomendação na literatura ou definição por

comitês de consenso ou associações de especialistas quais os anticorpos seriam

mais específicos e sensíveis para avaliação do Her2 (BILOUS, et al. 2003;

GOUVÊA, 2003). No entanto, a escolha dos anticorpos primários tem importância

fundamental no resultado final dos testes imunoistoquímicos que poderão influenciar

resultados de ensaios clínicos para testes de medicamentos, ou influenciar decisões

terapêuticas no tratamento de cada paciente, individualmente.

Nos últimos trinta anos, houve um interesse crescente em anticorpos monoclonais

de camundongos (MMabs) em relação aos anticorpos policlonais pelas suas

propriedades de uniformidade, purificação e disponibilidade. Já os anticorpos

policlonais são direcionados contra diferentes epítopos ou seqüências diferentes de

aminoácidos de um epítopo de um dado antígeno, levando a uma maior afinidade

que os MMabs. Entre diversos animais, os coelhos são conhecidos por produzirem

altos títulos de anticorpos com alta afinidade. Na teoria, anticorpos monoclonais de

coelho (RabMabs) combinariam as melhores propriedades dos MMabs e os atributos

mais desejáveis dos anticorpos de coelhos, havendo uma busca de diversos grupos

em gerar RabMabs (ROSSI et al., 2005).

Atualmente, os anticorpos mais empregados para avaliação imunoistoquímica do

Her2 são os anticorpos policlonais de coelho HercepTest™ e A0485, e os anticorpos

monoclonais de camundongo (MMabs) CB-11 e Tab250, sendo estes últimos

considerados mais específicos e com melhor correlação com a amplificação gênica

pela técnica do FISH (GOUVÊA, et al., 2004, GOUVÊA, et al., 2006; SAPINO et al.,

2003; THOMSON et al., 2001; TSUDA et al., 2002). Mais recentemente, surgiu uma

nova geração de anticorpos monoclonais produzidos em coelhos (RabMabs).

Segundo os fabricantes os RabMabs poderiam potencialmente substituir os MMabs

clássicos pela alta afinidade, sensibilidade e especificidade. Além disso, eles podem

ser usados com maior diluição e podem dispensar a etapa de reativação antigênica,

levando a menor custo de cada teste e otimizando os tempos de reação (ROSSI et

al. 2005; HUANG et al., 2005).

1.3.2 – HER2 E HIBRIDAÇÃO IN SITU

Embora ainda não esteja definido qual é o teste padrão-ouro (“gold standard”) para o

Her2, a amplificação gênica pela técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH)

tem mostrado boa correlação com a superexpressão protéica demonstrada pela IIQ,

mas é uma técnica de custo elevado, e requer equipamento e técnica

especializados. A hibridação in situ cromogênica (CISH) do oncogene HER2 é um

método de hibridação in situ desenvolvido recentemente que utiliza um probe com

sequência única de DNA marcada com digoxigenina, e incubações seqüenciais com

fluoresceína antidigoxigenina, peroxidase antifluoresceína e diaminobenzidina. O

CISH, aprovado pela European Commission, apresenta as vantagens técnicas da

IIQ com a reprodutibilidade do FISH, possui alta concordância com o FISH e custo

inferior ao FISH. A interpretação do CISH é feita em microscópio óptico de luz

comum, é mais rápida do que no FISH e permite avaliação simultânea das cópias

genéticas, células tumorais e morfologia do tecido estudado na mesma lâmina, que é

contracorada com hematoxilina. As lâminas coradas pelo CISH podem ainda ser

arquivadas em arquivos usuais e o produto da reação é permanente. (ARNOULD et

al., 2003; BHARGAVA et al., 2005; BILOUS et al., 2006; GUPTA et al., 2003;

LORING et al., 2005; PENAULT-LLORCA & CAYRE, 2004; TANNER et al., 2000).

Uma grande vantagem do CISH e da IIQ como tecnologia in situ é a habilidade de

combinar diagnóstico molecular com exame histológico no mesmo tecido,

diferenciando carcinoma invasor de não invasor. Uma estratégia combinatória

utilizando IIQ e CISH forneceria informação compreensível e válida sobre a

concentração da proteína e a amplificação do gene HER2 para auxiliar decisões

clínicas (ZHAO et al., 2002).

Os estudos comparativos entre CISH e FISH mostram ser o CISH uma alternativa ao

FISH como teste secundário para esclarecer os casos 2+ à IIQ. Estudos de

avaliação interobservador mostram alta reprodutibilidade na interpretação dos

resultados com CISH. E ainda, devido à facilidade técnica e custo relativamente

baixo da reação, o uso combinado de IIQ e CISH deve ser considerado ao invés de

FISH no rastreamento primário da amplificação do oncogene Her2 (GONG et al.,

2005; HANNA et al., 2006; TANNER et al., 2000). O CISH também é uma técnica

útil na determinação do status do oncogene HER2 em material de citologia (LIN et

al., 2005; SARTELET et al., 2006).

1.3.3 – Her2 E VARIAÇÃO INTEROBSERVADOR

Através da imunoistoquímica a expressão da proteína Her2 na membrana é avaliada

de forma semiquantitativa (escala de 4 pontos), levando a uma variação na

interpretação do status do Her2. Esta pode estar relacionada a fatores múltiplos pré-

analíticos e analíticos como tempo de fixação, anticorpo primário e metodologia

utilizados, e variação interobservador na graduação das lâminas coradas. Mesmo

para um patologista treinado, a distinção nítida entre categorias nominais é difícil e

geralmente arbitrária, sendo demonstrada uma falta de reprodutibilidade significativa

na determinação clínica da expressão do Her2, principalmente das categorias

intermediárias (1+ e 2+) (PAIK et al., 2002).

A IIQ para Her2 é um bom teste para rastreamento inicial dos casos extremos de

superexpressão, ou seja, 0 e 3+. Os resultados iniciais 1+ e 2+ podem sofrer com

variabilidade interobservador, além de possível discordância com o FISH ou CISH. A

técnica FISH deveria ser indicada nos casos classificados como 2+ pela IIQ antes de

se recomendar a terapia anti-Her2 (trastuzumab). (CARLSON et al., 2006; DOLAN &

SNOVER, 2005; DOWSETT, et al, 2003; GOUVÊA, 2003; GOUVÊA et al., 2006;

LAN et al., 2005).

THOMSON et al. (2001) analisaram a variação interobservador na graduação das

reações IIQ para Her2 utilizando critérios bem definidos. Observaram que a variação

interobservador foi atribuída à heterogeneidade da coloração, artefatos de borda,

artefatos de retração do estroma, coloração inespecífica do epitélio e estroma,

coloração citoplasmática, colorações pseudomembranosas e os erros de

observação. Outros autores mostraram que a análise utilizando imagens

digitalizadas pode diminuir a variação interobservador (BLOOM & HARRINGTON,

2004; HATANAKA, et al., 2001). Há ainda equipamentos automatizados disponíveis

comercialmente, desenvolvidos para a leitura da reação IIQ do Her2, com a intenção

de reduzir a variação interobservador e aumentar a correlação com o FISH (WANG,

et al., 2001). No entanto, a análise automatizada não distingue a positividade entre

os componentes in situ e invasor.

A variação das técnicas empregadas pelos laboratórios também é importante. A

utilização de anticorpos mono e policlonais diferentes, protocolos de reativação

antigênica e de amplificação das reações de IIQ diferentes, associados à não

uniformidade na interpretação dos resultados geram grande variabilidade nos

resultados entre vários laboratórios (PRESS et al., 2005).

1.4 - MICROARRANJO DE TECIDOS (TISSUE MICROARRAY, TMA)

O advento de estudos moleculares baseados no genoma de doenças levou à

identificação de centenas de moléculas potencialmente associadas com o processo

de doença. Surgiu então, a necessidade de analisar melhor estas moléculas em

amostras de tecido para elucidar sua importância como biomarcadores ou alvos

fisiológicos de prevenção baseados em drogas ou tratamentos específicos. O TMA

tem sido considerado uma etapa necessária à consolidação do conhecimento

adquirido através do mapeamento genético dos estudos realizados com a técnica de

“cDNA Microarrays”. Esta técnica determina quais as dezenas ou centenas de genes

estão superexpressos ou hipoexpressos em um tumor e que poderiam ser

responsabilizados por alguma particularidade biológica, tais como o rápido

crescimento, o potencial de recorrência local ou de metástase à distância, ou ainda,

resistência à quimioterapia (SAUTER et al., 2002).

A técnica de tissue microarray (TMA) permite a análise retrospectiva em larga escala

da expressão protéica dos tumores através da imunoistoquímica, sendo possível

conhecer a expressão de uma determinada proteína em até 1000 casos diferentes

em apenas uma lâmina histológica. O TMA apresenta acurácia comprovada que

justifica seu emprego com amplas vantagens de custo e tempo para os estudos

retrospectivos de grandes centros ou estudos cooperativos com grandes bancos de

dados (BUBENDORF, et al., 2001; MILANES – YEARSLEY, et al., 2002; SAPINO et

al., 2006).

Em 1986, Battifora et al. desenvolveram a técnica do sausage ou multi-tissue tumor

block (MTTB), onde tecidos diferentes eram processados juntos em um mesmo

bloco de parafina de modo aleatório e não ordenado. Esses blocos eram utilizados

para teste de novos anticorpos e como controle de qualidade das reações

imunoistoquímicas. Kononen et al. (1998), aprimoraram a técnica de Battifora:

cilindros de amostras eram retiradas de tecidos de blocos de parafina pré-existentes

e reembebidos em um novo bloco de forma ordenada, com coordenadas pré-

estabelecidas, tamanhos e formas regulares. Havia um maior número e melhor

preservação das amostras e dos blocos, permitindo o estudo de um grande número

de casos analisando-se apenas uma ou poucas lâminas. Essa técnica adicionou a

vantagem de todas as amostras serem processadas em um mesmo momento e em

condições idênticas. Ainda, preserva o material remanescente para outras pesquisas

ou necessidades diagnósticas.

1.4.1- CONSTRUÇÃO DO TMA

Para a construção do TMA o patologista estuda as lâminas originais e seleciona as

áreas de interesse que representem o tumor. A seguir as áreas selecionadas são

identificadas nos blocos de parafina arquivados (bloco doador) e um cilindro de

tecido (que pode variar de 0,6mm a 2,0mm de diâmetro e 3 a 4 mm de comprimento)

é retirado desta área com uma agulha acoplada a um equipamento de precisão.

Este cilindro é então introduzido em um novo bloco (bloco receptor), previamente

preparado com orifícios cilíndricos vazios. Os cilindros dos vários casos são

sucessivamente adicionados ao bloco receptor, manualmente ou com a ajuda de

aparelhos específicos, e a posição de cada caso é identificada em uma planilha com

referências de coluna e linha (eixos X e Y). Ao fim, obtém-se um bloco receptor que

pode conter até 1000 amostras diferentes. Deste bloco são obtidos cortes

histológicos seqüenciais numerados em lâminas tratadas com adesivo que permitem

a realização de reações IIQ, FISH ou CISH. É importante registrar o conjunto de

fatores histológicos relevantes e, eventualmente, prognósticos dos tumores

selecionados (idade do paciente, grau e diferenciação histológicos, grau nuclear,

margens, invasão vascular, etc.) e reclassificar as doenças quando necessário. Este

deve ser feito em arquivo ou planilha permanente para armazenar todas as

informações referentes a cada um dos cilindros que irão compor o TMA, com suas

coordenadas X e Y no bloco receptor (TROTER, DEMETRICK & CIEZAR, 2002).

A leitura das lâminas dos TMA pode ser feita em microscopia óptica convencional

pelo patologista, seguindo a planilha previamente preparada com as coordenadas X

e Y, anotando os resultados encontrados em papel ou diretamente na base de

dados do computador. Vários grupos desenvolveram métodos de arquivo digital de

imagens com softwares de captura de imagens, interpretação e armazenamento

automatizado dos dados, permitindo rápida correlação entre os dados armazenados

previamente e os resultados obtidos, revisão das imagens, quando necessário,

estudos comparativos de reprodutibilidade, etc. (LIU et al., 2002; MANLEY et al.,

2001).

1.4.2 – TMA E CÂNCER DE MAMA

Os estudos para validação do método TMA no carcinoma da mama demonstraram

ser possível atingir 98% de concordância com as reações nos cortes histológicos

usuais para marcadores imunoistoquímicos como o receptor de estrógeno e Her2,

utilizando-se três amostras de 0,6mm de diâmetro de cada caso. Quando se

utilizaram apenas duas amostras a concordância obtida foi de 94% (CAMP et al.,

2000; DE MARZO & FEDOR, 2004). Apesar da amostragem de mais de uma área

nos carcinomas de mama ser importante para que nos TMA esteja representada

toda a heterogeneidade destes tumores, estudos recentes mostraram alta

concordância entre uma amostra de 0,6mm ou 2,0mm e os cortes habituais do bloco

doador, e que a heterogeneidade intratumoral não altera o status do Her2 utilizando

as técnicas IIQ, CISH e FISH (HENRIKSEN et al., 2006; LORING et al., 2005;

SELVARAJAN et al., 2006; ZHANG et al., 2003).

Atualmente o TMA tem sido amplamente utilizado para testes de validação

diagnóstica interlaboratoriais, principalmente FISH, CISH E IIQ para a detecção do

status do Her2 em grande número de casos, com padronização de protocolos das

reações (DIAZ et al., 2004; KAV et al., 2004; SAEZ et al., 2006) e para estudos

comparativos entre testes diagnósticos diferentes para amplificação gênica e

superexpressão protéica do Her2 (ZHANG et al., 2003).

Há ainda descrição de equipamentos alternativos para construção de TMA

empregando mini-retíficas ou outros equipamentos com bons resultados para

avaliação de fatores prognósticos em câncer de mama (DATTA et al., 2005; ROCHA

et al., 2006)

A partir desta revisão da literatura abordando o Her2 como fator preditivo no câncer

de mama, as diferentes formas de avaliar a superexpressão protéica e amplificação

gênica, e dando continuidade à linha de pesquisa do Laboratório de Patologia

Mamária da FM-UFMG, formulamos as seguintes perguntas:

1. O novo anticorpo anti-Her2 SP3 é mais sensível do que os anticorpos mono e

policlonais já conhecidos e utilizados na rotina dos laboratórios de

imunoistoquímica?

2. Qual anticorpo anti-Her2 utilizado na imunoistoquímica tem a melhor

correlação com a amplificação gênica detectada pelo CISH?

3. Qual a variação interobservador na interpretação das reações

imunoistoquímicas para os anticorpos anti-Her2?

2 - OBJETIVOS

1. Comparar através de IIQ o novo anticorpo monoclonal de coelho SP3 com

anticorpos policlonais e monoclonais de camundongo para a avaliação do

Her2, empregando arrays de tecido de amostras de carcinomas mamários;

2. Relacionar a superexpressão do Her2 empregando diferentes anticorpos anti-

Her2 com a amplificação gênica detectada através da hibridação in situ

cromogênica;

3. Analisar a variação interobservador na interpretação das reações IIQ em um

subgrupo de casos.

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

Foram selecionados 100 casos de carcinomas de mama analisados no Laboratório

de Patologia Mamária da Faculdade de Medicina da UFMG de 1987 a 2005. Todos

os casos foram revisados quanto ao diagnóstico e graduação histológicos

empregando critérios propostos pelo Colégio Americano de Patologistas (1999),

PAGE et al. (1998) e ELSTON & ELLIS (1991). Casos com artefatos de fixação,

autólise, necrose extensa e core biopsies foram excluídos.

Duas áreas representativas e distintas de cada carcinoma foram marcadas nos

blocos de parafina (blocos doadores). Cilindros de 2,0mm de diâmetro foram

retirados para a confecção do bloco receptor e montagem dos arrays de tecidos.

Foram construídos quatro blocos de arrays contendo 55 cilindros de tumores

mamários cada. Três cilindros de rim ou fígado também foram incluídos para

servirem como iniciadores da leitura. Para a construção dos arrays foi empregado

um equipamento alternativo, não comercial, previamente validado para este fim em

nosso laboratório (ROCHA et al., 2006).

Cada bloco de array foi submetido a cortes histológicos de 4µm, utilizando-se

lâminas silanizadas, que foram numeradas seqüencialmente, corando-se a primeira

e a última pela hematoxilina e eosina. As lâminas dos intervalos foram submetidas

às técnicas de IIQ e CISH em duplicata. O método imunoistoquímico empregado foi

o da estreptavidina-biotina peroxidase (Biogenex), seguindo o protocolo do

Laboratório de Patologia Mamária da UFMG (Anexo 1) e o protocolo do HercepTest

(Anexo 2), empregando-se anticorpos anti-Her2. Os clones, fabricantes, diluições e

tipo de recuperação antigênica empregados encontram-se listados na Tabela 1. A

revelação foi feita com cromógeno diaminobenzidina (liquid DAB - Dako) e a

contracoloração com hematoxilina de Harris. Duas lâminas de cada array foram

também submetidas ao CISH, empregando-se o kit CISH de HER2 SP•T-Light

da Zymed (EUA).

As reações IIQ e CISH foram inicialmente avaliadas manualmente, duplo cego, por

um mesmo patologista (CBN). A IIQ foi interpretada pelo sistema de escore do

HercepTest (Quadro 4, Tabela 1) e o CISH, pelo guia de interpretação da Zymed

(Quadro 5, Tabela 2), sendo a baixa amplificação e a alta amplificação interpretados

em um único grupo chamado de amplificação presente. Os resultados da análise

imunoistoquímica foram comparados ao CISH.

Após a análise inicial, uma lâmina de array corada pela IIQ representativa de cada

anticorpo foi revista por um segundo observador com experiência na interpretação

IIQ do Her2 (HG) sem o conhecimento da leitura inicial feita pelo 1º observador. As

lâminas foram então reavaliadas simultaneamente pelas duas observadoras (CBN e

HG) em um microscópio de dupla observação chegando-se a uma leitura consensual

que foi utilizada como “padrão ouro” na etapa seguinte da análise interobservador.

Estas lâminas de array representativas de cada anticorpo, exceto CB11 (Cell

Marque) foram então distribuídas e avaliadas por cinco diferentes observadores

(VFZ, APG, LSAT, HG) para análise da variação interobservador (total=5 lâminas).

TABELA 1 – Anticorpos, fabricantes, diluições e tipo de recuperação

antigênica utilizados nas reações imunoistoquímicas

Anticorpo Tipo de Anticorpo Fabricante Diluição

Recuperação

antigênica

SP3 Monoclonal, coelho NeoMarkers 1:300

Citrato pH6,0 por

25' em panela a

vapor a 98°C

HercepTest Policlonal, coelho Dako Pronto para uso

Citrato pH6,0 por

40' em banho-maria

a 98°C

A0485 Policlonal, coelho Dako 1:750

Citrato pH6,0 por

25' em panela a

vapor a 98°C

CB11

Monoclonal,

camundongo

Novocastra 1:80 Não realizada

CB11

Monoclonal,

camundongo

Cell Marque Pronto para uso

Citrato pH6,0 por

25' em panela a

vapor a 95°C

4D5

Monoclonal,

camundongo

Genentech 1:250 Tripsina por 5'

QUADRO 4 - Sistema de escore recomendado no Manual do HercepTest™

(Dako,1999): coloração de membrana

Grau de interpretação

Achado microscópico

0 NEGATIVO Não identificada nenhuma coloração na membrana citoplasmática

1+ NEGATIVO

Coloração fraca envolvendo parcialmente a circunferência da membrana

citoplasmática em pelo menos 10% das células neoplásicas

2+ POSITIVO

Coloração fraca, mas bem definida, envolvendo toda a circunferência da

membrana citoplasmática em pelo menos 10% das células neoplásicas

3+ POSITIVO

Coloração forte envolvendo toda a circunferência da membrana citoplasmática em

pelo menos 10% das células neoplásicas

QUADRO 5 - Determinação do estado do gene Her2 através do CISH proposto

pela Zymed

Sem Amplificação

1 a 5 cópias do gene Her2 presentes em cada nú

cleo em mais de 50% das células

neoplásicas

Amplificação Baixa

6 a 10 cópias ou pequenos aglomerados do gene Her2 presentes em cada núcleo

em mais de 50% das células neoplásicas

Amplificação Alta

Mais de 10 cópias ou aglomerados do gene Her2 presentes em cada núcleo em

mais de 50% das células neoplásicas

FIGURA 1 – Sistema de escore recomendado no Manual do HercepTest™

(Dako,1999): coloração de membrana

FIGURA 2 – Ilustrações do guia CISH, ZYMED, 2005. (a): CISH não amplificado

(1 a 5 pontos nucleares); (b), amplificado (mais de 6 pontos nucleares ou

aglomerados)

2+ 3+

a b

4 - RESULTADOS

Dos 100 casos estudados, 84 casos foram correlacionados com o CISH com

representação de pelo menos um cilindro de cada caso em todos os testes: IIQ e

CISH. Os outros 16 casos foram excluídos por perda de discos durante as reações

ou por não haver representação tumoral nos discos.

Os resultados e a discussão obtidos a partir do estudo imunoistoquímico

comparativo entre o novo anticorpo monoclonal de coelho SP3, anticorpos

policlonais e MMabs, sua correlação com hibridação in situ cromogênica, e

avaliação interobservador usando arrays de tecido, serão apresentados como artigos

científicos submetidos a periódicos indexados.

Cada artigo foi estruturado com base nas normas do periódico a que foi submetido.

Após a apresentação dos artigos, seguir-se-ão as conclusões que atendem aos

objetivos propostos no início deste trabalho, considerações finais e referências

bibliográficas referentes à introdução geral.

4.1 - Artigo I - The novel rabbit monoclonal antibody against Her2: an

immunohistochemical and CISH comparative analysis in breast cancer

Submetido para publicação no Histopathology (ISSN: 0309-0167)

The novel rabbit monoclonal antibody against Her2: an immunohistochemical

and CISH comparative analysis in breast cancer

Cristiana Buzelin Nunes

, Rafael Malagoli Rocha

, Jorge Sergio Reis-Filho

Maryou B Lambros

, Gislene Fátima Silva Rocha

, Fernanda Squarcio Fernandes

Sanches

, Flavio Nepomuceno Oliveira

, Helenice Gobbi

Affiliations:

1- Department of Anatomic Pathology, Federal University of Minas Gerais, Belo

Horizonte, MG, Brazil.

2- The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, Institute of Cancer Research,

London, England.

Corresponding author: Cristiana Buzelin Nunes, MD

Avenida Alfredo Balena 190, sala 5000 Belo Horizonte, MG Brazil

CEP 30130-100

cristianabnunes@gmail.com Tel: (55) (31) 32487118 Fax: (55) (31) 32262591

Supported by grants from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de minas

Gerais (FAPEMIG) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq)

Keywords: Rabbit monoclonal antibody, IHC, CISH, HER2, breast cancer, TMA

Running title: Her2 IIQ and CISH comparison

ABSTRACT

Aims: We compared the sensitivity and specificity new rabbit monoclonal antibody

SP3 with those of mouse monoclonal and rabbit polyclonal antibodies to detect

HER2 amplification as defined by chromogenic in situ hybridization (CISH).

Methods and Results: Serial sections from tissue microarrays (TMAs) containing 84

breast carcinomas were submitted to CISH (Zymed HER2 Spot-Light kit) and

immunohistochemistry, using NeoMarkers SP3 (rabbit monoclonal), DAKO A0485

and DAKO HercepTest (polyclonal), Novocastra CB11, Cell Marque CB11, and

Genentech 4D5 (monoclonal). All tests were performed in duplicate and the slides

were double-blindly evaluated. ‘Sensitivity’ and ‘specificity’ of the antibodies were

calculated with CISH as the ’gold standard’. CISH identified HER2 gene amplification

in 54.8% of the tumours. The best concordance was between SP3 and HercepTest

(kappa=0.74). SP3, A0485 and HercepTest detected all HER2 amplified cases.

There were 5 non-amplified cases (13%) scored as 3+ using SP3, 2 cases (5.3%)

using HercepTest, and 10 cases (26.3%) using A0485. Three amplified cases (6.5%)

were negative for CB11 and 1 case (2.2%) was negative for 4D5.

Conclusions: RabMab SP3 is more ‘sensitive’ than mouse monoclonal antibodies,for

Her2 assessment. HercepTest, CB11 and 4D5 show higher ‘specificity’ than SP3 for

the identification of HER2 gene amplification.

Word-count: 196

INTRODUCTION

None of the recent developments in the understanding of the molecular events

underlying breast cancer tumourigenesis has had a greater immediate impact on

breast cancer patient management than the identification of the HER2 oncogene in

breast cancer

1-4

. HER2 gene amplification or protein overexpression is seen in

approximately 20 to 30% of invasive breast cancers in humans, most commonly in

high grade invasive ductal carcinomas. Her2 overexpression has been reported to be

associated with other adverse prognostic factors such as positive lymph nodes,

larger tumour size, high histological grade, high proliferation rate, and lack of

expression of oestrogen and progesterone receptors

5-7

Recent results from clinical trials have demonstrated that trastuzumab after adjuvant

chemotherapy significantly improves disease-free survival among women with Her2-

positive breast cancer

1-3

. These results have led to licensing of trastuzumab for the

management of patients with early stage breast cancer patients with Her2 positive

tumours. Therefore, accurate, consistent, and reliable methods for evaluation of Her2

have become increasingly important. Different techniques have been used to assess

the Her2 status in biopsies and surgical specimens, but currently the most frequently

used methods are immunohistochemistry (IHC) to asses Her2 protein overexpression

and in situ hybridisation to assess HER2 gene amplification.

IHC is relatively easy to perform, has a short turnaround time and relatively low cost.

Immunohistochemical analysis is frequently influenced by technical considerations,

such as fixation procedures affecting the quality of antigen epitopes in the formalin

fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples and methodological differences (IHC

protocols)

. Selection of specific antibodies and scoring methods are very important

parameters for the accurate evaluation of protein expression

9, 10

Immunohistochemical Her2 scoring is arbitrary depending on the proportion and the

intensity of cell membrane staining and has been demonstrated inter and

intraobserver variations on determination of Her2 overexpression, especially on

intermediate categories

The generation of rabbit monoclonal antibodies (RabMabs) represents a novel

category of immunoreagents that conjugate the best properties of both mouse

monoclonal antibodies (Mabs) and rabbit antisera. When compared with the

corresponding Mabs, the RabMabs seem to offer increased sensitivity with no loss of

specificity. In routine use they permit higher working dilutions without antigen retrieval

leading to significant improvement in laboratory efficiency, contributing to achieve

better standardization and acceptable reproducibility

12-14

. Ricardo et al.

compared

SP3 with CB11, having CISH as the gold standard in breast cancer tissue

microarrays and showed a high specificity and a moderate sensitivity of SP3.

Overexpression of the Her2 protein generally (around 95%) results from HER2 gene

amplification. Concordance between IHC and in situ hybridisation is excellent for

cases that are either completely negative or strongly positive by IHC

. It is now

thought that Her2 determination is most efficient using IHC as the method of choice,

with in situ hybridisation being performed for cancer with indeterminate results (2+

score)

17, 18

Several in situ hybridisation techniques are available. Fluorescence in situ

hybridisation (FISH) is thought to be an accurate technique for quantitative evaluation

of HER2 gene status in breast cancer cells. FISH methodology requires a

fluorescence microscopy equipped with high quality immersion objectives and

fluorescence filters. As the fluorescence signals can fade within several weeks, the

hybridisation results must be recorded with digital cameras. Therefore, analyses and

recording of FISH data is expensive and time consuming. Most important, tissue

section morphology is not optimal in FISH on FFPE, a particular problem in

distinguishing invasive breast cancer and intraductal carcinoma. To overcome these

practical limitations, chromogenic in situ hybridisation (CISH) has been recently

introduced, in which the DNA probe is detected using a simple IHC-like peroxidase

reaction. CISH is faster to analyse than FISH, does not require any equipment other

than those used in routine histopathology laboratories, and allows for a simultaneous

analysis of gene copy number and histological features of the lesions

19-21

. There is a

high level of concordance between CISH and FISH

22-24

. In case of low-level

amplification, some authors suggest that CISH chromosome 17 probe should be

used, or FISH is recommended for confirmation

25-27

Tissue microarrays (TMAs) have been successfully used to study protein expression

by immunohistochemistry, with a high concordance rate between standard full and

TMA breast cancer sections for Her2

20, 28-30

The aim of this study was to asses on a breast cancer tissue microarray the

‘sensitivity’ and ‘specificity’ of the novel rabbit monoclonal antibody SP3 and five

other anti-Her2 antibodies, using HER2 gene status as defined by CISH as the ‘gold

standard’.

MATERIALS AND METHODS

Paraffin embedded tissue samples from 84 breast invasive and intraductal

carcinomas examined between 1987 and 2005 were selected from the archived files

of the Laboratory of Mammary Pathology, School of Medicine, Federal University of

Minas Gerais, Brazil. All cases were previously tested for therapeutic management

using the CB11 mouse monoclonal antibody (Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK)

and blocks were available for TMA construction. We selected 45 cases previously

scored as 2+ and 3+, and 39 cases scored as 0 and 1+. Haematoxylin and eosin

(H&E) stained slides of the corresponding samples were reviewed and tumours were

classified and graded based on College of American of Pathology (1999), Page et al.

(1998) and Elston & Ellis (1991) criteria

31-33

Two representative areas of each tumour were identified and marked on H&E stained

slides and the corresponding paraffin embedded tissue blocks were obtained for the

construction of the TMA block. Four tissue microarray blocks were constructed by

sampling two cores (2.0mm diameter) from each donator block. Sequential 4.0µm

thick sections from the TMA blocks were mounted on silane-coated glass slides and

dried for 30 minutes at 37ºC. The first and the last slide were stained for H&E. The

interval slides were subsequently submitted to IHC and CISH.

Immunohistochemistry

IHC staining was performed following a standard protocol. Six different antibodies

were tested on two slides from each array: one RabMab (SP3: NeoMarkers), two

rabbit polyclonal antibodies (A0485, HercepTest: Dako) and three Mabs (CB11:

Novocastra and Cell Marque; 4D5: Genentech). Antibodies, dilutions and antigen

retrieval methods are summarized in Table 1. The immunohistochemistry protocol

was previously tested and validated in our laboratory

. The Dako HercepTest™ kit

was used according to the manufacturer’s instructions. Tissue sections were

deparaffinised followed by endogenous peroxidase activity blocking by 20 minute

incubation in 0.3% hydrogen peroxide. Depending on the primary antibody, no pre-

treatment, enzyme treatment with trypsin (Sygma, St. Louis, USA), or heat (steamer,

20 minutes at 95°C) induced antigen-retrieval in ci trate buffer (10mM, pH 6.0), was

used (Table 1). The water bath was employed for HercepTest, following the

manufacturer’s instructions (Dako). For the NCL-CB11 antibody no pre-treatment

was used, given that previous studies of our laboratory showed better performance of

this antibody with no antigen retrieval

. The use of a steamer for heat induced

epitope retrieval is reported to have an excellent performance for several antibodies

18, 34, 35

. Non-specific binding sites were blocked by 10% normal goat serum. Primary

antibodies were applied on the sections and incubated for 90 minutes at room

temperature. We used a streptavidin-biotin-peroxidase complex technique (SAB-

Biogenex®, San Ramon, USA), and visualization with 3,3’-diaminobenzidine

tetrahydrochloride chromogen solution (liquid DAB, DAKO, Carpinteria, USA).

Sections were counterstained with haematoxylin, and cover slipped. All

immunostainings were performed manually and run with known positive and negative

tumour controls previously tested by FISH. HercepTest™ immunostaining run with

the kit control.

The immunostained sections were blindly evaluated without knowledge of the results

of CISH analysis, using the HercepTest™ scoring system (0, no staining or

membrane staining is observed in less than 10% of tumour cells; 1+, faint/barely

perceptible membrane staining is detected in more than 10% of the tumour cells, and

only part of the membrane is stained; 2+, weak to moderate complete membrane

staining is observed in more than 10% of the tumour cells; 3+, strong complete

membrane staining is observed in more than 10% of the tumour cells). Cases

interpreted as 0 or 1+ were considered negative and those interpreted as 2+ and 3+

were considered weakly and strongly positive, respectively

. When cytoplasmic

immunostaining was detected, it was considered not to be specific and, therefore, not

incorporated into the final scoring.

Table 1 - Antibodies clones, types, sources, dilutions and antigen retrieval

methods used

Clone Type of antibody Source Dilution Antigen

retrieval/time

SP3 Rabbit Monoclonal NeoMarkers,

Fremont, USA

1:300 Steamer/25 min

HercepTest Rabbit Polyclonal Dako, Carpinteria,

USA

Prediluted Water bath/40min

A0485 Rabbit Polyclonal Dako, Carpinteria,

USA

1:750 Steamer/25 min

NCL-CB11 Mouse Monoclonal

Novocastra,

Newcastle-upon-

Tyne, UK

1:80 No pre-treatment

CM-CB11 Mouse Monoclonal Cell Marque, Santa

Barbara, USA

Prediluted Steamer/25 min

4D5 Mouse Monoclonal

Genentech, South

San Francisco,

USA

1:250 Trypsin/5min

CISH

CISH was performed at The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, Institute

of Breast Cancer Research, London; England (J.S.R-F., M.B.L.). The

Zymed HER2

Spot-Light kit (Zymed, South San Francisco, USA) was used according to the

manufacturer’s instructions. CISH was evaluated using the Zymed HER2 CISH

interpretation guidelines. At least 30, non-equivocal and non-overlapping neoplastic

cells were counted per case. Non-amplified cases were defined as those with one to

five signals per nucleus in >50% of tumour cells; amplification was defined as i) more

than 5 gene copies per nucleus in >50% of tumour cells, ii) when a small or large

gene copy clusters were found in >50% of tumour cells

Statistics

Statistical analysis was performed and confidence intervals (CI) were calculated

using EpiÍnfo version 6.04. The Kappa test was applied to compare the RabMab SP3

Her2 overexpression with the other antibodies. CISH test was used as the ’gold

standard’, and overall ‘sensitivity’ and ‘specificity’ were calculated for each antibody

staining, considering 3+ cases as positive, 2+ cases as borderline (indeterminate or

equivocal), and 0 and 1+ as negative.

RESULTS

IHC

Her2 protein high overexpression (3+) was clearly seen using 10X or 20X objectives

in tissue sections that were counterstained with haematoxylin. Her2 protein weak

overexpression (2+) was distinguishable using 40X objective. Lack of Her2 protein

overexpression was distinguished using 20X and 40X objectives.

In a series of 84 breast cancers, the detection of Her2 protein overexpression was

more prevalent with the polyclonal antibodies A0485 (66 cases, 78.6%), HercepTest

(51 cases, 60.8%) and the RabMab SP3 (61 cases, 72.6%) than with the monoclonal

antibodies CB11 (45 cases, 53.5%) and 4D5 (47 cases, 55.9%). There was a 96.7%

concordance between 2+ and 3+ results obtained with SP3 and A0485 antibodies.

The concordance between 2+ and 3+ results obtained with SP3 and HercepTest,

SP3 and 4D5, and SP3 and CB11 antibodies were 83.6%, 77% and 73.8%

respectively (Table 2). The concordance (unweighted Kappa scores) between SP3

and HercepTest, A0485, 4D5 and both CB11 was 0.74, 0.71, 0.65 and 0.61,

respectively.

Table 2 - Comparison between the Her2 overexpression using six different

antibodies in 84 breast cancers

Her2 antibodies

IHC score SP3 A0485 HercepTest

NCL-CB11 CM-CB11 4D5

0 14 (16.7%) 10 (11.9%) 27 (32.1%) 37 (44.0%) 32 (38.1%) 33 (39.3%)

1+ 9 (10.7%) 8 (9.5%) 6 (7.1%) 2 (2.4%) 7 (8.3%) 4 (4.8%)

2+ 13 (15.5%) 10 (11.9%) 5 (6.0%) 6 (7.1%) 7 (8.3%) 7 (8.3%)

3+ 48 (57.1%) 56 (66.7%) 46 (54.8%) 39 (45.2%) 38 (45.2%) 40 (47.6%)

NCL, Novocastra; CM, Cell Marque

IHC and CISH

CISH staining results were analysed using a 40X objective in tissue sections

counterstained with light haematoxylin. CISH identified HER2 gene amplification in

46 tumours (54.8%).

The correlations between HER2 gene amplification and protein overexpression are

summarized in Table 3.

‘Sensitivity’ and ‘specificity’ of the antibodies are summarized in table 4 and were

calculated considering 3+ cases as positive, 2+ cases as borderline (indeterminate or

equivocal), and 0 and 1+ cases were considered negative. SP3 and A0485 were

more ‘sensitive’ and 4D5 and CB11 were more ‘specific’, and HercepTest was 100%

‘sensitive’ and 94.1% ‘specific’.

We have defined ‘sensitivity’ and ‘specificity ‘according to the decision trees

proposed by HER2 assessment. In other words, the most ‘sensitive’ antibody would

be the one that identifies all patients that would be eligible to trastuzumab therapy

and the most ‘specific’, the antibody that identifies as negative (0/1+) cases that are

not amplified (would receive no therapy

Table 3 - Semiquantitative IHC scores against amplification of HER2 gene by

CISH

IHC

SP3 A0485 HercepTest NCL-CB11 CM-CB11 4D5

CISH

0/1+ 2+ 3+ 0/1+ 2+ 3+ 0/1+ 2+ 3+ 0/1+ 2+ 3+ 0/1+ 2+ 3+ 0/1+ 2+ 3+

Total

10 5

10 10

4 2

1 1

36 0

0 3 43 0 0 46 0 2 44

5 38

6 37

7 38 46

Total

23 13 48 18 10 56 32 6 46 39 6 39 39 7 38 37 7 40 84

IHC, immunohistochemistry; CISH, chromogenic in situ hybridisation; NCL, Novocastra; CM, Cell

Marque; NA, no amplification (1-5 signals per nucleus); A, amplification (>5 signals per nucleus),

discordant cases are highlighted

Table 4 – ‘Sensitivity’ and ‘specificity’ of antibodies compared to CISH

Antibodies ‘Sensitivity’ 95% CI ‘Specificity’ 95% CI

SP3 100.0 89.8-100.0 82.1 62.4-93.2

A0485 100.0 90.4-100.0 64.3 44.1-80.7

HercepTest 100.0 90.4-100.0 94.1 78.9-99.0

NCL-CB11 92.7 79.0-98.1 97.3 84.2-99.9

CM-CB11 92.5 78.5-98.0 97.3 84.2-99.9

4D5 97.4 84.9-99.9 94.7 80.9-99.1

CISH, chromogenic in situ hybridisation; NCL, Novocastra; CM, Cell Marque

Figure 1. Her2 overexpression and gene amplification in the same case of

invasive breast cancer (X400). A, HercepTest; B, CB11; C, SP3; D, CISH.

DISCUSSION

Accurate testing for Her2 aims to ensure that every patient who might benefit from

trastuzumab receives appropriate treatment and that costly and potentially

cardiotoxic trastuzumab treatment

is not given to patients with non-overexpressing

tumours. Inconsistencies in the sensitivity of IHC Her2 testing have been attributed

to the use of different antibodies, differences in tissue fixation and IHC reagents,

antigen retrieval methods, and interobserver variability

. The HercepTest kit has

overcome some of these problems by using standardized methodology and reagents

and by the inclusion of cell line controls. Nonetheless, the reported sensitivity varies

between different centres and HercepTest kit is significantly more expensive than

other commercially available antibodies. Despite the commercially variety of IHC

C D

A B

antibodies available, there is no consensus about the best antibody for Her2

testing

In this study we tested the novel RabMab antibody SP3 and monoclonal and

polyclonal antibodies against Her2 and correlated the results with those of HER2

gene status assessment by CISH using a breast cancer TMA. We also included the

4D5 antibody, which is a component of trastuzumab and not commercially available.

TMA has the advantage to process all tissue samples at the same time and

conditions such as room temperature and humidity and also reduces costs and time.

All tumours included should have the same pre-analytical and analytical treatment to

have an optimal study. In our study we used tumours with different time of fixation to

build our TMAs, which should bring difficulties on the adjustment of digestion time on

each sample and on immunohistochemical tests.

CISH has been validated in many reports compared to FISH, with a high

concordance rate. CISH is reported to have the same accuracy of FISH when a high

level amplification is detected, and 93-99% of agreement when low level amplification

is detected

. CISH is also accepted for HER2 gene amplification by the American

Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists Guidelines,

based on European, Canadian and Australian studies

. CISH permits simultaneous

evaluation of gene copies, tumour cell and tissue morphology on the same slide

9, 21-

. The current HER2 CISH is based on single-colour detection, without centromere

17 correction. Despite the fact that some authors consider the chromosome 17 copy

correction to be essential

42-44

, there is no international consensus as to which

system should be used. Wang et al. observed the highest correlation with Her2

protein overexpression and HER2 gene dosage and the lowest correlation with

aneusomy 17. For clinical assessment of HER2 status, aneusomy 17 was not a

significant factor for IHC-FISH discordance in most cases

. Polysomy 17 might be

involved with the prediction of response to trastuzumab, but it should not play a major

role. Most importantly, in a recent trial for docetaxel or vinorelbine with or without

trastuzumab, single probe CISH was successfully used as part of the entry criteria

The incidence of Her2 overexpression in invasive breast cancer is reported to range

from 20% to 30%

4, 16, 46

. Our series included Her2 previously tested tumours, most of

them diagnosed as ductal high grade invasive carcinoma. The Her2 overexpression

in the present study ranged from 45.2% (CB11) to 66.7% (A0485). HER2 gene

amplification was observed in 54.8% of cases. When compared with other antibodies,

the highest concordance rate was with HercepTest followed by A0485, both

polyclonal antibodies. The better performance of Dako HercepTest versus A0485

(same antibody clone) may be related to the different detection systems and other

reagents provided within the HercepTest™ kit. Ricardo et al. showed a high level of

agreement between SP3, CB11 and CISH, with 99.1% of specificity and 52.3% of

sensitivity, and they had 31.1% of amplified cases

When we compared IHC with CISH results, SP3 displayed an optimal ‘sensitivity’,

similar to that obtained with anti-Her2 polyclonal antibodies (i.e. HercepTest and

A0485). They identified all cases with HER2 amplification using the current guidelines

for Her2 assessment. However, 2 (5.2%) HercepTest, 5 (13.1%) SP3 and 10 (26.3%)

A0485 non-amplified cases were scored as 3+. Based on the concept of oncogene

addiction and the requirement of genomic changes, there is a growing belief that only

HER2 amplified cases respond to trastuzumab; hence it is yet to be determined if

these patients would actually benefit from trastuzumab or Her2 small molecule

tyrosine kinase inhibitors.

Although less ‘sensitive’, both MMab (CB11 and 4D5) showed more ‘specificity’ than

RabMab SP3. Polyclonal antibodies are known to be more sensitive and monoclonal

antibodies, more specific. MMab membrane staining favours the presence of gene

amplification

40, 46

; however, we observed 3/46 (6.5%) of HER2 CISH amplified cases

with no CB11 immunoreactivity. The upper limit of 5% false-negative should be

considered high in view of the curative potential of traztuzumab treatment in the

adjuvant setting

. Therefore, these antibodies should be used with caution.

Sapino et al. suggests a double IHC staining for MMab, and a double scoring system

for Her2 overexpression with six score values (0/1+ and 2+ negative; 3+, 4+, 5+ and

6+ positive) obtained by summating the individual scoring values from each MMab. In

their study they observed all double scoring negative cases were non-amplified and

all cases scored 6+ were amplified by CISH, using MMabs directed against different

Her2 domains: CB11 and TAB250

. SP3 is directed against the extracellular

domain of Her2 and CB11 is directed against the intracytoplasmic domain of the

protein, and SP3 showed a high ‘sensitivity’ and CB11, a high ‘specificity’.

What would be the ideal antibody for Her2 testing? The most ‘sensitive’ antibodies

(i.e. Herceptest, SP3, A0485) detect all HER2 CISH amplified cases and ensure that

patients with amplified tumours receive the most appropriate treatment. However

these antibodies also have a downside, given that up to 26.3% of patients with non-

amplified tumours show Her2 3+ positivity and would receive a rather expensive and

cardiotoxic treatment. On the other hand, the most ‘specific’ antibodies (i.e. CB11

and 4D5) have a remarkably low prevalence of false positives, however owing to their

suboptimal ‘sensitivity’, up to 10% of the patients with amplified tumours would be

denied anti-Her2 therapy. Based on these findings, we suggest that HercepTest

(100% ‘sensitivity’ and 94.1% ‘specificity’) and SP3 (as a second option with 100%

‘sensitivity’ and 82.1% of ‘specificity’) should be used for first trial of Her2

overexpression and that all 2+ cases should be FISH or CISH tested, according with

the UK guidelines and the American Society of Clinical Oncology/College of

American Pathologists recommendations for Her2 Testing in breast cancer

41, 48

In conclusion, RabMab SP3 is more ‘sensitive’ than mouse monoclonal antibodies,for

Her2 assessment. HercepTest, CB11 and 4D5 show higher ‘specificity’ than SP3 for

the identification of HER2 gene amplification.

ACKNOWLEGMENT: The authors thank David L. Page, MD (Department of

Pathology, Vanderbilt University, Nashville, TN) for providing the antibody 4D5.

REFERENCES

1. Joensuu H, Kellokumpu-Lehtinen PL, Bono P et al. Adjuvant docetaxel or

vinorelbine with or without trastuzumab for breast cancer. N. Engl. J. Med.

2006;354;809-820.

2. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B et al. Trastuzumab after

adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med.

2005;353;1659-1672.

3. Romond EH, Perez EA, Bryant J et al. Trastuzumab plus adjuvant

chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med.

2005;353;1673-1684.

4. Schnitt SJ. Breast cancer in the 21st century: neu opportunities and neu

challenges. Mod. Pathol. 2001;14;213-218.

5. Dandachi N, Dietze O, Hauser-Kronberger C. Chromogenic in situ

hybridization: a novel approach to a practical and sensitive method for the

detection of HER2 oncogene in archival human breast carcinoma. Lab.

Invest. 2002;82;1007-1014.

6. Ross JS, Fletcher JA. HER-2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast

cancer. Am. J. Clin. Pathol. 1999;112;S53-67.

7. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL.

Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification

of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235;177-182.

8. Wang S, Saboorian MH, Frenkel E, Hynan L, Gokaslan ST, Ashfaq R.

Laboratory assessment of the status of Her-2/neu protein and oncogene in

breast cancer specimens: comparison of immunohistochemistry assay with

fluorescence in situ hybridisation assays. J. Clin. Pathol. 2000;53;374-381.

9. Hanna W, Kahn HJ, Trudeau M. Evaluation of HER-2/neu (erbB-2) status

in breast cancer: from bench to bedside. Mod. Pathol. 1999;12;827-834.

10. Mitchell MS, Press MF. The role of immunohistochemistry and

fluorescence in situ hybridization for HER2/neu in assessing the prognosis

of breast cancer. Semin. Oncol. 1999;26;108-116.

11. Paik S, Bryant J, Tan-Chiu E et al. Real-world performance of HER2

testing--National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project experience.

J. Natl. Cancer Inst. 2002;94;852-854.

12. Cheuk W, Wong KO, Wong CS, Chan JK. Consistent immunostaining for

cyclin D1 can be achieved on a routine basis using a newly available rabbit

monoclonal antibody. Am. J. Surg. Pathol. 2004;28;801-807.

13. Reis-Filho JS, Savage K, Lambros MB et al. Cyclin D1 protein

overexpression and CCND1 amplification in breast carcinomas: an

immunohistochemical and chromogenic in situ hybridisation analysis. Mod.

Pathol. 2006;19;999-1009.

14. Rossi S, Laurino L, Furlanetto A et al. Rabbit monoclonal antibodies: a

comparative study between a novel category of immunoreagents and the

corresponding mouse monoclonal antibodies. Am. J. Clin. Pathol.

2005;124;295-302.

15. Ricardo S, Milanezi F, Carvalho S, Leitao D, Schmitt F. HER2 Evaluation

through the novel rabbit monoclonal antibody SP3 and CISH in tissue

microarrays of invasive breast carcinomas. J. Clin. Pathol. 2006.

16. Bankfalvi A, Simon R, Brandt B et al. Comparative methodological analysis

of erbB-2/HER-2 gene dosage, chromosomal copy number and protein

overexpression in breast carcinoma tissues for diagnostic use.

Histopathology. 2000;37;411-419.

17. Carlson RW, Moench SJ, Hammond ME et al. HER2 testing in breast

cancer: NCCN Task Force report and recommendations. J Natl Compr

Canc Netw. 2006;4 Suppl 3:S1-22; quiz S23-4.

18. Gouvea AP, Milanezi F, Olson SJ, Leitao D, Schmitt FC, Gobbi H.

Selecting antibodies to detect HER2 overexpression by

immunohistochemistry in invasive mammary carcinomas. Appl.

Immunohistochem. Mol. Morphol. 2006;14;103-108.

19. Lambros MB, Simpson PT, Jones C et al. Unlocking pathology archives for

molecular genetic studies: a reliable method to generate probes for

chromogenic and fluorescent in situ hybridization. Lab. Invest.

2006;86;398-408.

20. Loring P, Cummins R, O'Grady A, Kay EW. HER2 positivity in breast

carcinoma: a comparison of chromogenic in situ hybridization with

fluorescence in situ hybridization in tissue microarrays, with targeted

evaluation of intratumoral heterogeneity by in situ hybridization. Appl.

Immunohistochem. Mol. Morphol. 2005;13;194-200.

21. Zhao J, Wu R, Au A, Marquez A, Yu Y, Shi Z. Determination of HER2 gene

amplification by chromogenic in situ hybridization (CISH) in archival breast

carcinoma. Mod. Pathol. 2002;15;657-665.

22. Bhargava R, Lal P, Chen B. Chromogenic in situ hybridization for the

detection of HER-2/neu gene amplification in breast cancer with an

emphasis on tumors with borderline and low-level amplification: does it

measure up to fluorescence in situ hybridization? Am. J. Clin. Pathol.

2005;123;237-243.

23. Bilous M, Morey A, Armes J, Cummings M, Francis G. Chromogenic in situ

hybridisation testing for HER2 gene amplification in breast cancer

produces highly reproducible results concordant with fluorescence in situ

hybridisation and immunohistochemistry. Pathology. 2006;38;120-124.

24. Hanna WM, Kwok K. Chromogenic in-situ hybridization: a viable alternative

to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm. Mod.

Pathol. 2006;19;481-487.

25. Gong Y, Gilcrease M, Sneige N. Reliability of chromogenic in situ

hybridization for detecting HER-2 gene status in breast cancer: comparison

with fluorescence in situ hybridization and assessment of interobserver

reproducibility. Mod. Pathol. 2005;18;1015-1021.

26. Kounelis S, Kapranos N, Malamos N, Kouri-Bairaktari E. Evaluation of

HER2 gene status in breast cancer by chromogenic in situ hybridization:

comparison with immunohistochemistry. Anticancer Res. 2005;25;939-46.

27. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A et al. Chromogenic in situ hybridization: a

practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-

2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am. J.

Pathol. 2000;157;1467-1472.

28. Camp RL, Charette LA, Rimm DL. Validation of tissue microarray

technology in breast carcinoma. Lab. Invest. 2000;80;1943-1949.

29. Saez A, Andreu FJ, Segui MA et al. HER-2 gene amplification by

chromogenic in situ hybridisation (CISH) compared with fluorescence in

situ hybridisation (FISH) in breast cancer-A study of two hundred cases.

Breast. 2006;15;519-527.

30. Selvarajan S, Tan SY, Sii LH, Tan PH. c-erbB-2 (HER-2/neu)

immunohistochemistry in invasive breast cancer: is there concordance

between standard sections and tissue microarrays? Pathology.

2006;38;316-320.

31. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D et al. Prognostic factors in breast

cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999.

Arch Pathol Lab. Med. 2000;124;966-978.

32. Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of

prognosis in breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 1998;51;195-208.

33. Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The

value of histological grade in breast cancer: experience from a large study

with long-term follow-up. Histopathology. 1991;19;403-410.

34. Gobbi H, Arteaga CL, Jensen RA et al. Loss of expression of transforming

growth factor beta type II receptor correlates with high tumour grade in

human breast in-situ and invasive carcinomas. Histopathology.

2000;36;168-177.

35. Gobbi H, Dupont WD, Simpson JF et al. Transforming growth factor-beta

and breast cancer risk in women with mammary epithelial hyperplasia. J

Natl. Cancer Inst. 1999;91;2096-2101.

36. DAKO. DAKO HercepTest A manual for interpretation. Carpinteria: DAKO;

1999:manual guideline.

37. Zymed®. Spot-Light® CISH™ Probes and CISH™ Detection. South San

Francisco; 2005.

38. Hayes DF, Picard MH. Heart of darkness: The downside of trastuzumab. J.

Clin. Oncol. 2006;24;4056-4058.

39. Press MF, Slamon DJ, Flom KJ, Park J, Zhou JY, Bernstein L. Evaluation

of HER-2/neu gene amplification and overexpression: comparison of

frequently used assay methods in a molecularly characterized cohort of

breast cancer specimens. J. Clin. Oncol. 2002;20;3095-3105.

40. Thomson TA, Hayes MM, Spinelli JJ et al. HER-2/neu in breast cancer:

interobserver variability and performance of immunohistochemistry with 4

antibodies compared with fluorescent in situ hybridization. Mod. Pathol.

2001;14;1079-1086.

41. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz J.N et al. American Society of Clinical

Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations

for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer.

J. Clin. Oncol. 2006.

42. Bartlett JM, Going JJ, Mallon EA et al. Evaluating HER2 amplification and

overexpression in breast cancer. J. Pathol. 2001;195;422-428.

43. Farabegoli F, Ceccarelli C, Santini D et al. c-erbB-2 over-expression in

amplified and non-amplified breast carcinoma samples. Int. J. Cancer.

1999;84;273-277.

44. McCormick SR, Lillemoe TJ, Beneke J, Schrauth J, Reinartz J. HER2

assessment by immunohistochemical analysis and fluorescence in situ

hybridization: comparison of HercepTest and PathVysion commercial

assays. Am. J. Clin. Pathol. 2002;117;935-943.

45. Wang S, Hossein Saboorian M, Frenkel EP et al. Aneusomy 17 in breast

cancer: its role in HER-2/neu protein expression and implication for clinical

assessment of HER-2/neu status. Mod. Pathol. 2002;15;137-45.

46. Jimenez RE, Wallis T, Tabasczka P, Visscher DW. Determination of Her-

2/Neu status in breast carcinoma: comparative analysis of

immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization. Mod. Pathol.

2000;13;37-45.

47. Sapino A, Marchio C, Senetta R et al. Routine assessment of prognostic

factors in breast cancer using a multicore tissue microarray procedure.

Virchows Arch. 2006;449;288-296.

48. Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M et al. Best Practice No 176: Updated

recommendations for HER2 testing in the UK. J. Clin. Pathol. 2004;57;233-

237.

4.2 - Artigo 2 - Concordância interobservador na interpretação

imunoistoquímica da superexpressão do Her2 detectada por cinco diferentes

anticorpos em arrays de carcinomas mamários

Submetido para publicação no Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

(ISSN 1676-2444)

Concordância interobservador na interpretação imunoistoquímica da

superexpressão do Her2 detectada por cinco diferentes anticorpos em arrays

de carcinomas mamários

Interobserver agreement in scoring immunohistochemical overexpression of

Her2 detected by five different antibodies on tissue microarrays of breast

carcinomas

Cristiana Buzelin Nunes 1; Rafael Malagoli Rocha 2; Agostinho Pinto Gouvêa 3;

Luciene Simões de Assis Tafuri 4; Vanessa Fortes Zschaber Marinho 5; Marina

Alvarenga Rezende 6; Helenice Gobbi 7.

1. Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Patologia na Universidade

Federal de Minas Gerais (UFMG), Departamento de Anatomia Patológica e

Medicina Legal da Faculdade de Medicina

2. Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Patologia na UFMG

3. Doutor em Patologia pela UFMG, Médico-Patologista do Hospital das Clínicas

da UFMG

4. Doutora em Patologia pela UFMG, Professora de Patologia Geral da

Fundação Mineira de Educação e Cultura

5. Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Patologia na UFMG

6. Estudante de Graduação em Medicina, Faculdade de Ciências Médicas de

Minas Gerais

7. Professora Associada, Doutora em Patologia do Departamento de Anatomia

Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG

Trabalho realizado no Laboratório de Patologia Mamária do Departamento de

Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da Universidade

Federal de Minas Gerais (FM/UFMG),

Autora para correspondência:

Cristiana Buzelin Nunes

Departamento de Anatomia Patológica

Faculdade de Medicina da UFMG Avenida Alfredo Balena, 190, sala 5000

30130100 Belo Horizonte, MG

Email: [email protected]

Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.

RESUMO

Objetivo: Estudar a concordância interobservador na interpretação da

superexpressão imunoistoquímica para a proteína Her2 empregando diferentes

anticorpos em arrays de carcinomas mamários.

Material e método: Foi construído um array contendo dois cilindros (2,0mm de

diâmetro cada) de 25 carcinomas mamários. Cortes histológicos seriados do array

foram submetidos à imunoistoquímica utilizando-se cinco anticorpos anti-Her2: SP3

(NeoMarkers), HercepTest e A0485 (Dako), CB11 (Novocastra) e 4D5 (Genentech).

Uma lâmina corada por cada anticorpo (total=5 lâminas) foi submetida à avaliação

individual por cinco observadores seguindo o sistema de escore proposto no

HercepTest™. Para a avaliação interobservador os resultados foram interpretados

em três diferentes análises: I (0; 1+; 2+; 3+); II (0 e 1+; 2+ e 3+) e III (0 e 1+; 2+; 3+)

e aplicado o teste estatístico de Kappa.

Resultados: A concordância interobservador foi boa quando os casos foram

avaliados em quatro categorias (0; 1+; 2+; 3+). Quando foram avaliados em duas

categorias (0 e 1+; 2+ e 3+), a concordância interobservador foi boa para os casos

corados por SP3 e CB11, e muito boa para os casos corados por A0485, HercepTest

e 4D5. Na análise III (0 e 1+; 2+; 3+), a concordância interobservador foi

considerada moderada para os casos corados por CB11, e boa para os casos

corados pelos outros anticorpos.

Conclusão: A concordância interobservador foi considerada entre moderada e muito

boa na avaliação dos cinco anticorpos. A menor concordância interobservador

ocorreu nos casos com marcação fraca (1+) e moderada (2+). A experiência dos

observadores influenciou nas taxas de concordância.

Palavras-chave: concordância interobservador, imunoistoquímica, Her2, c-erbB-2,

carcinomas mamários.

Total: 249 palavras

ABSTRACT

Aim: To examine interobserver agreement in immunohistochemical evaluation of

Her2 overexpression using five different antibodies on breast cancer arrays.

Material and method: One array was built with 2 cores (2.0mm diameter each) from

25 breast carcinomas. Serial sections from the array were submitted to

immunohistochemistry using five anti-Her2 antibodies: SP3 (NeoMarkers),

HercepTest and A0485 (Dako), CB11 (Novocastra), and 4D5 (Genentech). One slide

immunostained for each antibody (total=5 slides) were independently scored by five

observers following HercepTest™ scoring system. Interobserver agreement was

evaluated in three different analysis: I (0; 1+; 2+; 3+); II (0 and 1+; 2+ and 3+) and III

(0 and 1+; 2+; 3+), and the Kappa statistics was applied.

Results: There was a good rate of interobserver agreement when the four scores

where considered (0; 1+; 2+; 3+). When the scores where considered in two

categories (0 and 1+; 2+ and 3+) the interobserver agreement rate was considered

substantial for cases stained for SP3 and CB11, and almost perfect for cases stained

for A0485, HercepTest and 4D5. For group III evaluation (0 and 1+; 2+; 3+), a

moderate rate of interobserver agreement was considered for cases stained for

CB11, and a substantial rate for other antibodies.

Conclusion: The overall interobserver agreement was considered moderate to

substantia in the evaluation of cases stained for the five antibodies. The lowest rate

of agreement was obtained in the evaluation of the cases scored as weak (1+) and

moderate (2+). The observers experience altered the concordance rates.

Keywords: interobserver agreement, immunohistochemical, Her2, c-erbB-2, breast

cancer.

Word count: 245 words

INTRODUÇÃO

A proteína Her2, um receptor de atividade tirosina-quinase, encontra-se

superexpressa em cerca de 30% dos carcinomas ductais invasores, e a

superexpressão protéica está geralmente associada à amplificação gênica (1). A

amplificação/superexpressão de Her2 está associada a tumores mamários de

comportamento biológico agressivo, principalmente em pacientes com linfonodo-

positivo (23). No entanto, em pacientes linfonodo-negativos esta associação ainda é

pouco definida (8). Os trabalhos pioneiros de Slamon et al. (1987) apontaram o Her2

como fator prognóstico independente no câncer de mama (24). Estudos posteriores

mostraram a sua associação com outros fatores prognósticos, entre eles

comprometimento linfonodal, tamanho tumoral, alto grau histológico, elevado índice

proliferativo e ausência de expressão de receptores hormonais (4, 19).

Tumores que superexpressam Her2 são menos responsivos a ciclofosfamida,

metotrexate, 5-fluorouracil (CMF) e ao tamoxifeno, e mais responsivos às

antraciclinas do que tumores sem superexpressão de Her2 (13, 16). A detecção do

Her2 se tornou mais importante após a aprovação do trastuzumab, que associado à

quimioterapia, pode diminuir a progressão tumoral do carcinoma mamário invasor

(13). Existe, então, uma grande demanda clínica para detecção precisa do status do

Her2 em carcinomas mamários invasores. Apesar de existir uma variedade de

métodos diferentes para detectar o status do Her2, os dois testes recomendados na

prática clínica são a imunoistoquímica (IIQ) para detecção de superexpressão

protéica e a hibridação in situ para detecção de amplificação gênica (29). A reação

imunoistoquímica é o teste de rotina mais atrativo para a avaliação do Her2 em

carcinomas mamários devido ao menor custo, facilidade técnica e relevância

biológica. A IIQ detecta a superexpressão protéica do Her2 localizada na membrana

citoplasmática da célula tumoral. Há vários anticorpos mono e policlonais disponíveis

comercialmente para o uso em IIQ com diferenças na sensibilidade e especificidade

podendo resultar em variação na qualidade final das reações (8, 9).

Assim, a escolha do anticorpo primário tem importância fundamental no resultado

final do teste imunoistoquímico que poderá influenciar decisões terapêuticas no

tratamento de cada paciente individualmente. Não há na literatura definição sobre

quais anticorpos seriam mais específicos e sensíveis para a avaliação do Her2

através de IIQ (2, 8).

A forma mais utilizada para avaliar a superexpressão da proteína Her2 na membrana

detectada por IIQ é semiquantitativa e não automatizada, empregando um sistema

de escore proposto no HercepTest™ (3). Este sistema avalia a proporção de células

com membrana corada e a intensidade da reação gerando uma escala de quatro

pontos que varia de zero (“0”) a três (“3”). O emprego desta escala tem variações de

interpretação que dependem da qualidade técnica da reação, do tipo de anticorpo

empregado e da experiência do examinador. Mesmo para um patologista treinado, a

distinção nítida entre categorias nominais é difícil e geralmente arbitrária, e tem sido

demonstrada falta de reprodutibilidade na determinação da superexpressão do Her2,

principalmente das categorias intermediárias (1+ e 2+) (14).

Estudos de comparação do teste imunoistoquímico para detecção de

superexpressão do Her2 entre laboratórios mostram maior índice de concordância

entre laboratórios de referência, destacando a importância do treinamento com maior

volume de casos analisados e experiência do patologista (6, 15).

Há estudos que abordaram variações na técnica imunoistoquímica para

determinação do Her2, principalmente comparando diferentes anticorpos mono e

policlonais (20, 22, 28), incluindo trabalhos de nosso grupo (8, 9). No entanto há

poucos estudos sobre a variação interobservador na análise da reação IIQ para

Her2 (10, 11, 24, 26, 27).

No presente trabalho, decidimos estudar a variação na interpretação da reação

imunoistoquímica para Her2 empregando diferentes anticorpos em array de

carcinomas mamários.

MATERIAL E MÉTODO

Foram selecionados 25 carcinomas mamários diagnosticados no Laboratório de

Patologia Mamária da Faculdade de Medicina da UFMG. A partir da revisão das

lâminas originais foram selecionados os blocos de parafina contendo amostras

representativas dos tumores. Dois cilindros de 2,0mm de diâmetro foram obtidos de

cada bloco doador construindo-se um array com 50 amostras de carcinomas. Foram

incluídos ainda três cilindros de fígado (cilindros iniciadores de leitura) e dois

cilindros de tumores previamente testados utilizados como controles negativo e

positivo, totalizando 55 cilindros. O array foi construído utilizando um equipamento

alternativo não comercial desenvolvido e validado no próprio laboratório (18). O

bloco do array foi submetido a cortes histológicos seriados de 4µm, colhendo-se as

secções em lâminas silanizadas, que foram numeradas seqüencialmente. A primeira

e a última lâmina foram coradas pela hematoxilina e eosina. As lâminas dos

intervalos foram coradas pela IIQ utilizando cinco diferentes anticorpos. Os

anticorpos utilizados, suas diluições e métodos de reativação antigênica estão

listados na Tabela 1. Para o HercepTest foi empregado o respectivo kit seguindo-se

as instruções do fabricante. Para os demais anticorpos o método empregado foi o da

estreptavidina-biotina peroxidase (Biogenex®, San Ramon, EUA). Dependendo do

anticorpo primário, nenhum pré-tratamento, tratamento com tripsina (Sygma, St.

Louis, EUA), ou com solução de citrato em calor úmido (10mM, pH 6,0), foram

utilizados para reativação antigênica (Tabela 1). A revelação foi feita com

diaminobenzidina (Liquid DAB, Dako, Carpinteria, EUA) e a contra-coloração, com

hematoxilina de Harris. Os protocolos de reação foram previamente padronizados e

validados no laboratório para uso em pesquisa (7, 8) e rotina clínica.

Cinco lâminas do array de câncer de mama coradas pelos SP3, HercepTest, A0485,

CB11 e 4D5 foram distribuídas a cinco observadores (C.B.N., A.P.G., V.F.Z.M.,

L.S.A.T. e H.G.). Todos os observadores tinham experiência prévia na avaliação do

Her2 por imunoistoquímica variando de 4 a 10 anos. As lâminas foram codificadas

por um dos pesquisadores (M.A.R.) e analisadas individualmente e em separado

pelos observadores, sem o conhecimento do tipo de anticorpo e do resultado da

leitura das reações feitas pelos demais colegas. Todos os observadores receberam

uma planilha contendo campos correspondentes à disposição dos discos de tumores

no array, para cada uma das cinco lâminas. Eles preencheram as planilhas de

acordo com sua interpretação do estudo imunoistoquímico de cada um dos cinco

anticorpos, empregando o sistema de escore do HercepTest™ (3).

Para a avaliação da concordância interobservador, os resultados foram interpretados

em três diferentes análises. Na análise I, os resultados foram considerados

separadamente em quatro categorias (0; 1+; 2+ e 3+). Na análise II, os casos foram

analisados em duas categorias agrupando-se os casos classificados como 0 e 1+

em conjunto (casos negativos), e os casos 2+ e 3+ em conjunto (casos positivos),

como se faz na interpretação do HercepTest. Na análise III, os casos foram

considerados em três categorias sendo os casos 0 e 1+ considerados negativos, os

casos 2+ indeterminados, e os casos 3+ considerados positivos.

Tabela 1 – Anticorpos, fabricantes, diluições e tipo de recuperação antigênica

utilizados nas reações imunoistoquímicas

Anticorpo Tipo de Anticorpo Fabricante Diluição

Recuperação

antigênica

SP3 Monoclonal, coelho NeoMarkers, EUA 1:300

Citrato pH 6,0 por

25' em panela a

vapor a 98°C

HercepTest Policlonal, coelho Dako, EUA Pronto para uso

Citrato por 40' em

banho-maria a

98°C

A0485 Policlonal, coelho Dako, EUA 1:750

Citrato pH 6,0 por

25' em panela a

vapor a 98°C

CB11

Monoclonal,

camundongo

Novocastra, RU 1:80 Não realizada

4D5

Monoclonal,

camundongo

Genentech, EUA 1:250 Tripsina por 5'

EUA=Estados Unidos da América; RU=Reino Unido

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação da concordância interobservador na leitura das reações foi realizada

utilizando-se o teste estatístico de kappa (κ). Os valores de κ foram divididos em

intervalos para avaliar o grau de concordância segundo os critérios de Landis e Koch

(12). O grau de concordância foi considerado baixo quando o valor do kappa foi

entre 0,00 e 0,20; razoável, entre 0,21 e 0,40; moderado, entre 0,41 e 0,60; bom,

entre 0,61 e 0,80 e muito bom, entre 0,80 e 1,00.

RESULTADOS

Os resultados da concordância entre os cinco observadores para cada anticorpo em

cada um dos três grupos analisados estão sumarizados na Tabela 2 e ilustrados nas

Figuras 1 e 2.

A concordância geral entre os cinco observadores para avaliação de cada anticorpo

nas três diferentes análises foi considerada de moderada a muito boa (kappa=0,596

a 0,872). A melhor concordância foi observada quando os resultados foram

agrupados em 0 e 1+; 2+ e 3+ (análise II) para as lâminas coradas pelos cinco

anticorpos. A concordância interobservador foi muito boa nesta análise, para as

lâminas coradas pelos anticorpos A0485, Herceptest e 4D5 (kappa=0,872; 0,858 e

0,855, respectivamente). A menor concordância entre os observadores foi obtida

quando as reações foram analisadas em quatro categorias 0; 1+; 2+; 3+ (análise I)

nas lâminas coradas pelo SP3, A0485 e HercepTest (Kappa= 0,641; 0,609 e 0,658,

respectivamente). A menor concordância interobservador foi obtida quando os casos

2+ foram analisados separadamente (análise III) nas lâminas coradas pelo 4D5

(kappa=0,621) e CB11 (kappa=0,596), e foi interpretada como moderada nas

lâminas coradas pelo CB11. Os casos corados pelos anticorpos policlonais

(HercepTest e A0485) e pelo RabMab SP3 mostraram marcação das reações mais

forte; porém o A0485 mostrou maior coloração citoplasmática inespecífica,. Os

casos corados pelos anticorpos monoclonais de camundongo, mostraram marcação

mais fraca do que o RabMab SP3.

Quando avaliada a concordância interobservador entre os três observadores

(C.B.N., A.P.G., H.G.) com maior experiência na avaliação imunoistoquímica do

Her2 (maior que quatro anos), o valor de kappa variou de 0,765 a 0,972 nos três

diferentes análises.

Tabela 2 - Valores de Kappa da avaliação da concordância interobservador na

interpretação da reação imunoistoquímica do Her2 usando cinco diferentes

anticorpos analisando os resultados em três grupos

Valor de Kappa (Intervalo de confiança)

Anticorpo

Grupo I

(0; 1+; 2+; 3+)

Grupo II

(0 e 1+; 2+ e 3+)

Grupo III

(0 e 1+; 2+; 3+)

SP3 0,641 (0,567-0,716) 0,771 (0,653-0,888)

0,701 (0,609-0,793)

A0485 0,609 (0,540-0,679) 0,872 (0,764-0,980)

0,708 (0,791-0,625)

HercepTest 0,658 (0,585-0,731) 0,858 (0,751-0,964)

0,706 (0,620-0,677)

CB11 0,611 (0,541-0,680) 0,747 (0,641-0,853)

0,596 (0,516-0,677)

4D5 0,636 (0,575-0,696) 0,855 (0,764-0,945)

0,621 (0,621-0,765)

Figura 1 - Caso 23 corado pelos anticorpos SP3 (A) e CB11 (B), avaliado com escore 3+

por todos os observadores (400X)

Figura 2 - Caso 22 corado pelo anticorpo CB11 (A) e caso 4 corado pelo HercepTest (B),

ambos analisados com escores variáveis (1+, 2+ ou 3+) pelos observadores (400X)

DISCUSSÃO

A detecção correta do Her2 assegura que pacientes com tumores que

superexpressam Her2 recebam tratamento adequado, e que um tratamento com

trastuzumab, de custo elevado e potencialmente tóxico, não seja indicado a

pacientes com tumores sem superexpressão da proteína Her2. Dificuldades na

consistência da avaliação IIQ do Her2 têm sido atribuídas ao uso de anticorpos

diferentes, e às diferenças nas fases pré-analítica e analítica da reação (17, 28).

Recentemente surgiu uma nova geração de anticorpos monoclonais de coelhos

(RabMabs), cujos fabricantes relatam ter alta afinidade, sensibilidade e

especificidade, com marcação bem definida na imunoistoquímica (21). Em nosso

trabalho, estudamos a concordância interobservador em lâminas coradas por

anticorpos monoclonais de camundongo, anticorpos policlonais e incluímos o novo

anticorpo monoclonal de coelho, SP3.

O sistema de escore mais empregado e aceito na avaliação das reações IIQ para

Her2 é o proposto pelo HercepTest™. Neste sistema os casos 0 e 1+ são

considerados negativos enquanto os 2+ e 3+ são considerados positivos fraco (2+) e

forte (3+). No entanto, mais recentemente as recomendações para a avaliação do

Her2 do Colégio Americano de Patologistas/Sociedade Americana de Oncologia

Clínica (29) e a atualização das normas do programa de qualidade do Reino Unido

(5), propõem que todos os casos avaliados como 2+ na imunoistoquímica devem ser

considerados como indeterminados. Estes casos devem ser reavaliados por testes

mais específicos, tais como a hibridação in situ fluorescente, para definição de

tratamento (5, 29). Assim, resolvemos analisar os resultados dos nossos casos

avaliados pelos diferentes observadores de três formas, considerando na primeira as

categorias em separado, e agrupadas como no HercepTest™, e como sugerido nos

novos guias de recomendações dos Estados Unidos e Reino Unido. Também nestes

guias de recomendações, os laboratórios e patologistas que realizam as reações

para Her2, devem ter protocolos de reações validados, utilizar procedimentos

qualificados, e participar de testes de acreditação, proficiência e competência. Em

nosso trabalho empregamos protocolos de reação previamente padronizados e bem

estabelecidos em nosso laboratório há dez anos, considerado como controle da fase

analítica da reação (7, 8). No presente trabalho procuramos avaliar a variação

interobservador na interpretação das reações, que é considerada a fase pós-

analítica da reação imunoistoquímica.

A avaliação da superexpressão da proteína Her2 nas lâminas coradas pelos cinco

anticorpos mostrou níveis de concordância interobservador satisfatórios

(kappa=0,596 a 0,872). A análise dos resultados em três grupos mostrou melhor

concordância quando agrupamos os casos em negativos (0 e 1+) e positivos (2+ e

3+). A maior concordância interobservador ocorreu na análise dos casos fortemente

positivos (3+) e totalmente negativos (0). Semelhante ao descrito por outros autores,

há maior dificuldade na descriminação das categorias intermediárias (1+ e 2+),

justificando a adoção de critérios propostos mais recentemente de se considerar os

casos 2+ como indeterminados (10, 25, 27).

A literatura tem ressaltado a importância da experiência com o método para a

análise do Her2 (fase pós-analítica). Em nosso estudo, a maior concordância da

análise entre observadores (kappa= 0,765 a 0,972) foi observada entre os

analisadores com maior experiência com o método (mais de quatro anos).

Notamos uma concordância maior nas lâminas coradas pelos anticorpos policlonais

(kappa=0,609 a 0,872), com marcação mais forte, devido ao reconhecimento de

múltiplos epítopos. O novo anticorpo monoclonal de coelho SP3 mostrou marcação

intermediária entre os anticorpos policlonais e monoclonais de camundongo

(kappa=0,641 a 0,771), estando de acordo com os relatos dos fabricantes (20) .

CONCLUSÃO

A concordância geral entre os observadores foi considerada entre moderada e muito

boa nos cinco anticorpos anti-Her2. A menor concordância interobservador ocorreu

nos casos com marcação fraca (1+) a moderada (2+). A experiência dos

observadores influenciou nas taxas de concordância.

REFERÊNCIAS

1. Bankfalvi, A. et al. Comparative methodological analysis of erbB-2/HER-2

gene dosage, chromosomal copy number and protein overexpression in

breast carcinoma tissues for diagnostic use. Histopathology, 37(5): 411-9,

2000.

2. Bilous, M. et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national

testing guidelines. Mod Pathol, 16(2): 173-82, 2003.

3. DAKO

HercepTest

. A manual for interpretation. Carpinteria, 1999.

4. Dandachi, N.; Dietze, O.; Hauser-Kronberger, C. Chromogenic in situ

hybridization: a novel approach to a practical and sensitive method for the

detection of HER2 oncogene in archival human breast carcinoma. Lab Invest,

82(8): 1007-14, 2002.

5. Ellis, I. O. et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2

testing in the UK. J Clin Pathol, 57(3): 233-7. 2004.

6. Fitzgibbons, P. L. et al. Interlaboratory comparison of immunohistochemical

testing for HER2: results of the 2004 and 2005 College of American

Pathologists HER2 Immunohistochemistry Tissue Microarray Survey. Arch

Pathol Lab Med, 130(10): 1440-5, 2006.

7. Gouvea, A. P. et al. Her-2/neu Immunoreactivity in Invasive Mammary

Carcinomas: a Comparative Study Using Monoclonal and Polyclonal

Antibodies Including the Herceptest. Jornal Brasl Patologia. 40(1): 47-52,

2004.

8. Gouvea, A. P. et al. Selecting antibodies to detect HER2 overexpression by

immunohistochemistry in invasive mammary carcinomas. Appl

Immunohistochem Mol Morphol,14(1): 103-8, 2006.

9. Hanna, W.; Kahn, H. J.; Trudeau, M. Evaluation of HER-2/neu (erbB-2) status

in breast cancer: from bench to bedside. Mod Pathol, 12(8): 827-34, 1999.

10. Hoang, M. P.et al. HER-2/neu gene amplification compared with HER-2/neu

protein overexpression and interobserver reproducibility in invasive breast

carcinoma. Am J Clin Pathol, 113(6): 852-9, 2000.

11. Lacroix-Triki, M. et al. High inter-observer agreement in immunohistochemical

evaluation of HER-2/neu expression in breast cancer: A multicentre GEFPICS

study. Eur J Cancer, 42(17): 2946-53, 2006.

12. Landis, J. R.; Koch, G. G. The measurement of observer agreement for

categorical data. Biometrics, 33(1): 159-74, 1977.

13. Miles, D. W. Update on HER-2 as a target for cancer therapy: herceptin in the

clinical setting. Breast Cancer Res, 3(6): 380-4, 2001.

14. Paik, S. et al. Real-world performance of HER2 testing--National Surgical

Adjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl Cancer Inst,94(11): 852-

4, 2002.

15. Perez, E. A. et al. HER2 testing by local, central, and reference laboratories in

specimens from the North Central Cancer Treatment Group N9831 intergroup

adjuvant trial. J Clin Oncol, 24(19): 3032-8, 2006.

16. Piccart, M. J.; Di Leo A.; Hamilton, A. HER2. a 'predictive factor' ready to use

in the daily management of breast cancer patients? Eur J Cancer,36(14):

1755-61, 2000.

17. Press, M. F. et al. Evaluation of HER-2/neu gene amplification and

overexpression: comparison of frequently used assay methods in a

molecularly characterized cohort of breast cancer specimens. J Clin Oncol,

20(14): 3095-105, 2002.

18. Rocha, R. M. et al. Construção de arrays de tecido com equipamento

alternativo e de baixo custo para estudo imunoistoquímico de tumores

mamários. J Bras Patol Med Lab, 42(6): 477-482, 2006.

19. Ross, J. S.; Fletcher, J. A. HER-2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast

cancer. Am J Clin Pathol, 112(1 Suppl 1): S53-67, 1999.

20. Rossi, S. et al. Rabbit monoclonal antibodies: a comparative study between a

novel category of immunoreagents and the corresponding mouse monoclonal

antibodies. Am J Clin Pathol, 124(2): 295-302, 2005.

21. Sales, A. O.; Rodrigues, S. J. P.; Bacchi, C. E. Estudo comparativo entre os

métodos LSAB

+ e Herceptest

para a detecção de HER-2/neu em

carcinoma de mama. J. Bras. Patol. Med. Lab., , vol.40, no.4, p.265-271, Ago.

2004

22. Sampatanukul, P. et al. A two-phase study model for the standardization of

HER2 immunohistochemical assay on invasive ductal carcinoma of the breast.

J Med Assoc Thai, 88(11): 1680-8, 2005.

23. Schnitt, S.J. Breast cancer in the 21st century: neu opportunities and neu

challenges. Mod Pathol, 14(3): 213-8, 2001.

24. Slamon, D. J. et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival

with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science, 235(4785): 177-82,

1987.

25. Thomson, T. A. et al. HER-2/neu in breast cancer: interobserver variability and

performance of immunohistochemistry with 4 antibodies compared with

fluorescent in situ hybridization. Mod Pathol, 14(11): 1079-86, 2001.

26. Tsuda, H. et al. Concordance in judgments among c-erbB-2 (HER2/neu)

overexpression detected by two immunohistochemical tests and gene

amplification detected by Southern blot hybridization in breast carcinoma.

Pathol Int, 51(1): 26-32, 2001.

27. Tsuda, H. et al. Evaluation of interobserver agreement in scoring

immunohistochemical results of HER-2/neu (c-erbB-2) expression detected by

HercepTest, Nichirei polyclonal antibody, CB11 and TAB250 in breast

carcinoma. Pathol Int, 52(2): 126-34, 2002.

28. Vincent-Salomon, A. et al. Re: HER2 testing in the real world. J Natl Cancer

Inst, 95(8): 628; author reply 628-9. 2003.

29. Wolff, A. C. et al. American Society of Clinical Oncology/College of American

Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth

Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer. J Clin Oncol, 2006.

5 - CONCLUSÕES

1. A concordância entre o novo anticorpo monoclonal de coelho SP3 e os outros

anticorpos foi boa, sendo maior para os anticorpos policlonais HercepTest e

A0485;

2. A relação entre a superexpressão do Her2 e o CISH mostrou maior

sensibilidade para o novo anticorpo monoclonal de coelho SP3 e para os

anticorpos policlonais A0485 e HercepTest. Os anticorpos CB11 e 4D5

mostraram maior especificidade do que os anticorpos SP3, A0485 e

HercepTest.

3. A concordância geral entre os observadores foi considerada entre moderada

e muito boa na avaliação dos casos corados pelos cinco anticorpos anti-Her2.

A menor concordância interobservador ocorreu nos casos com marcação

fraca (1+) e moderada (2+). A experiência dos observadores influenciou nas

taxas de concordância.

6 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste trabalho avaliamos seis diferentes anticorpos no estudo imunoistoquímico da

proteína Her2 em carcinomas mamários, incluindo o novo anticorpo monoclonal de

coelho SP3 e realizamos hibridação in situ cromogênica (CISH) nos mesmos casos,

para avaliação da amplificação do gene HER2.. Realizamos ainda, avaliação da

concordância interobservador de uma amostra das reações imunoistoquímicas.

Utilizamos uma nova técnica de estudo dos casos, o tissue microarray (TMA), na

qual conseguimos analisar retrospectivamente grande quantidade de tumores em

pequena amostra de tecido, com economia de tempo e material, além da vantagem

das lâminas serem processadas ao mesmo tempo, em condições semelhantes,

importante para estudos comparativos. Achamos esta técnica relativamente fácil de

ser realizada, sem dificuldades na avaliação histológica das lâminas. Verificamos

que o anticorpo SP3 mostrou boa concordância com os outros anticorpos,

principalmente com os anticorpos policlonais A0485 e HercepTest. Quando

comparado ao CISH, o anticorpo SP3 mostrou-se mais sensível do que os

anticorpos monoclonais de camundongo (CB11 e 4D5). Estes foram mais

específicos do que o SP3, A0485 e HercepTest. Assim, identificamos dois grupos de

anticorpos: um grupo mais sensível e outro mais específico, ambos mostrando casos

equívocos, falso-positivos e falso-negativos, respectivamente. A escolha de um

destes anticorpos é importante e deve ser utilizada com critério e conhecimento da

existência de casos equívocos, e cada paciente deve ser estudada iindividualmente,

junto com o quadro clínico e oncológico, na definição de seu tratamento. A

concordância interobservador na análise das lâminas coradas pela imunoistoquímica

foi considerada de moderada a muito boa, mostrando que existe reprodutibilidade no

estudo imunoistoquímico para a avaliação da superexpressão do Her2, e que a

experiência do examinador é importante na análise.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLRED, D. C. et al. Prognostic and predictive factors in breast cancer by

immunohistochemical analysis. Mod Pathol, v.11, n.2, p.155-68, Feb.1998.

ARNOULD, L. et al. Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH)

and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer, v.88,

n.10, p.1587-91, May 19, 2003.

BANKFALVI, A. et al. Comparative methodological analysis of erbB-2/HER-2

gene dosage, chromosomal copy number and protein overexpression in breast

carcinoma tissues for diagnostic use. Histopathology, v.37, n.5, p.411-9, Nov.

2000.

BATTIFORA, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for

immunohistochemical antibody testing. Lab Invest, v.55, n.2, p.244-8, Aug. 1986.

BENOHR, P. et al. Her-2/neu expression in breast cancer--A comparison of

different diagnostic methods. Anticancer Res, v.25, n.3Bp.1895-900, May-Jun.

2005.

BHARGAVA, R.; LAL P.; CHEN B. Chromogenic in situ hybridization for the

detection of HER-2/neu gene amplification in breast cancer with an emphasis on

tumors with borderline and low-level amplification: does it measure up to

fluorescence in situ hybridization? Am J Clin Pathol, v.123, n.2, p.237-43, Feb.

2005.

BILOUS, M. et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national

testing guidelines. Mod Pathol, v.16, n.2, p.173-82, Feb. 2003.

BILOUS, M. et al. Chromogenic in situ hybridisation testing for HER2 gene

amplification in breast cancer produces highly reproducible results concordant

with fluorescence in situ hybridisation and immunohistochemistry. Pathology,

v.38, n.2, p.120-4, Apr. 2006.

BLOOM, K.; HARRINGTON, D. Enhanced accuracy and reliability of HER-2/neu

immunohistochemical scoring using digital microscopy. Am J Clin Pathol, v.121,

p. 620-30, 2004.

BLOOM, H. J.; RICHARDSON W. W. Histological grading and prognosis in breast

cancer; a study of 1409 cases of which 359 have been followed for 15 years. Br J

Cancer, v.11, n.3, p.359-77, Sep. 1957.

BUBENDORF, L. et al. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized

pathology archives for high-throughput in situ studies. J Pathol, v.195, n.1, p.72-9,

Sep. 2001.

CAMP, R. L.; CHARETTE, L. A.; RIMM D.L. et al. Validation of tissue microarray

technology in breast carcinoma. Lab Invest, v.80, n.12, p.1943-9, Dec. 2000.

CARLSON, R. W. et al. HER2 testing in breast cancer: NCCN Task Force report

and recommendations. J Natl Compr Canc Netw, v.4 Suppl 3, p.S1-22; quiz S23-

4, Jul. 2006.

DAKO

HercepTest

. A manual for interpretation. Carpinteria, 1999.

DATTA, M. W. et al. A simple inexpensive method for the production of tissue

microarrays from needle biopsy specimens: examples with prostate cancer. Appl

Immunohistochem Mol Morphol, v.13, n.1, p.96-103, Mar. 2005.

DE MARZO, A. M.; FEDOR, H. Molecular analysis of tissues using gene

expression arrays and tissue microarrays. Short Course #47. United States and

Canadian Academy of Pathology, 93

Annual Meeting, 2004.

DIAZ, L. K. et al. The use of TMA for interlaboratory validation of FISH testing for

detection of HER2 gene amplification in breast cancer. J Histochem Cytochem,

v.52, n.4p.501-7, Apr. 2004.

DOLAN, M.; SNOVER, D. Comparison of immunohistochemical and fluorescence

in situ hybridization assessment of HER-2 status in routine practice. Am J Clin

Pathol, v.123, n.5, p.766-70, May. 2005.

DOWSETT, M. et al. Correlation between immunohistochemistry (HercepTest)

and fluorescence in situ hybridization (FISH) for HER-2 in 426 breast carcinomas

from 37 centres. J Pathol, v.199, n.4, p.418-23, Apr. 2003.

ELSTON, C. W.; ELLIS, I. O. Pathological prognostic factors in breast cancer. I.

The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study

with long-term follow-up. Histopathology, v.19, n.5, p.403-10, Nov. 1991.

ELSTON, C. W.; ELLIS, I. O. Assessment of histologic grade. In: ELSTON CW &

ELLIS IO eds. Systemic Pathology 3

Ed. Vol. 13, 365-84, Churchil-Livinstone.

Edinburgh, Scotland, UK. 1998.

FITZGIBBONS, P. L. et al. Prognostic factors in breast cancer. College of

American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med, v.124,

n.7, p.966-78, Jul. 2000.

GOBBI, H. et al. Loss of expression of transforming growth factor beta type II

receptor correlates with high tumour grade in human breast in-situ and invasive

carcinomas. Histopathology, v.36, n.2, p.168-77, Feb. 2000.

GOFFIN, J. R. et al. Impact of germline BRCA1 mutations and overexpression of

p53 on prognosis and response to treatment following breast carcinoma: 10-year

follow up data. Cancer, v.97, n.3, p.527-36, Feb. 1 2003.

GONG, Y.; GILCREASE, M.; SNEIGE, N. Reliability of chromogenic in situ

hybridization for detecting HER-2 gene status in breast cancer: comparison with

fluorescence in situ hybridization and assessment of interobserver reproducibility.

Mod Pathol, v.18, n.8, p.1015-21, Aug. 2005.

GOUVÊA, A. Detecção imuno-histoquímica do HER-2/neu em carcinomas

mamários invasivos utilizando diferentes anticorpos e sua relação com a

hibridação in situ fluorescente com as características clínicas e outros fatores

prognósticos. 2003. 107f. Tese (Doutorado em Patologia) – Programa de Pós-

Graduação da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais,

Belo Horizonte.

GOUVEA, A. P. et al. Her-2/neu Immunoreactivity in Invasive Mammary

Carcinomas: a Comparative Study Using Monoclonal and Polyclonal Antibodies

Including the Herceptest. Jornal Brasl Patologia, v.40, n.1, p. 47-52, Jan. 2004.

GOUVEA, A. P. et al. Selecting antibodies to detect HER2 overexpression by

immunohistochemistry in invasive mammary carcinomas. Appl Immunohistochem

Mol Morphol, v.14, n.1, p.103-8, Mar. 2006.

GUPTA, D. et al. Comparison of fluorescence and chromogenic in situ

hybridization for detection of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Am J Clin

Pathol, v.119, n.3, p.381-7, Mar. 2003.

HAMMOND, M. E. et al. Standard reference material for Her2 testing: report of a

National Institute of Standards and Technology-sponsored Consensus Workshop.

Appl Immunohistochem Mol Morphol, v.11, n.2, p.103-6, Jun. 2003.

HANNA, W.; KAHN, H. J.; TRUDEAU, M. et al. Evaluation of HER-2/neu (erbB-2)

status in breast cancer: from bench to bedside. Mod Pathol, v.12, n.8, p.827-34,

Aug. 1999.

HANNA, W. M.; KWOK, K. Chromogenic in-situ hybridization: a viable alternative

to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm. Mod Pathol,

v.19, n.4, p.481-7, Apr. 2006.

HATANAKA, Y. et al. Quantitative immunohistochemical evaluation of HER2/neu

expression with HercepTestTM in breast carcinoma by image analysis. Pathol Int,

v.51, n.1, p.33-6, Jan. 2001.

HENRIKSEN, K. L. et al. Semi-quantitative scoring of potentially predictive

markers for endocrine treatment of breast cancer: A comparison between whole

sections and tissue microarrays. J Clin Pathol, 14, Jun. 2006.

HUANG, Z. et al. Development of new rabbit monoclonal antibody to estrogen

receptor: immunohistochemical assessment on formalin-fixed, paraffin-embedded

tissue sections. Appl Immunohistochem Mol Morphol, v.13, n.1, p.91-5, Mar.

2005.

HUANG, Z. et al. Development of new rabbit monoclonal antibody to

progesterone receptor (Clone SP2): no heat pretreatment but effective for paraffin

section immunohistochemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol, v.14, n.2,

p.229-33, Jun. 2006.

INCA BRASIL. www.inca.gov.br.

JACOBS, T. W. et al. Comparison of fluorescence in situ hybridization and

immunohistochemistry for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. J Clin

Oncol, v.17, n.7, p.1974-82, Jul. 1999.

JATOI, I.; MILLER, A. B. Why is breast-cancer mortality declining? Lancet Oncol,

v.4, n.4, p.251-4, Apr. 2003.

KAY, E. et al. Use of tissue microarray for interlaboratory validation of HER2

immunocytochemical and FISH testing. J Clin Pathol, v.57, n.11, p.1140-4, Nov.

2004.

KONG, S. Y. et al. Serum HER-2 concentration in patients with primary breast

cancer. J Clin Pathol, v.59, n.4, p.373-6, Apr. 2006.

KONONEN, J. et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of

tumor specimens. Nat Med, v.4, n.7, p.844-7, Jul. 1998.

LAN, C. et al. erb-b2 amplification by fluorescence in situ hybridization in breast

cancer specimens read as 2+ in immunohistochemical analysis. Am J Clin Pathol,

v.124, n.1, p.97-102, Jul. 2005.

LIN, F.; SHEN, T.; PRICHARD, J. W. Detection of Her-2/neu oncogene in breast

carcinoma by chromogenic in situ hybridization in cytologic specimens. Diagn

Cytopathol, v.33, n.6, p.376-80, Dec. 2005.

LIU, C. L. et al. Software tools for high-throughput analysis and archiving of

immunohistochemistry staining data obtained with tissue microarrays. Am J

Pathol, v.161, n.5, p.1557-65, Nov. 2002.

LOPEZ-GUERRERO, J. A. et al. Histological tumor grade correlates with HER2/c-

erB-2 status in invasive breast cancer: a comparative analysis between

immunohistochemical (CB11 clone and Herceptest), FISH and differential PCR

procedures. Arkh Patol, v.65, n.1, p.50-5, Jan-Feb. 2003.

LORING, P. et al. HER2 positivity in breast carcinoma: a comparison of

chromogenic in situ hybridization with fluorescence in situ hybridization in tissue

microarrays, with targeted evaluation of intratumoral heterogeneity by in situ

hybridization. Appl Immunohistochem Mol Morphol, v.13, n.2, p.194-200, Jun.

2005.

MANLEY, S. et al. Relational database structure to manage high-density tissue

microarray data and images for pathology studies focusing on clinical outcome:

the prostate specialized program of research excellence model. Am J Pathol,

v.159, n.3, p.837-43, Sep. 2001.

McPHERSON, K.; STEEL, C. M.; DIXON, J. M. ABC of breast diseases. Breast

cancer-epidemiology, risk factors, and genetics. BMJ, v.321, p. 624-28, 2000.

MILANES-YEARSLEY, M. et al. Tissue micro-array: a cost and time-effective

method for correlative studies by regional and national cancer study groups. Mod

Pathol, v.15, n.12, p.1366-73, Dec. 2002.

MILES, D. W. Update on HER-2 as a target for cancer therapy: herceptin in the

clinical setting. Breast Cancer Res, v.3, n.6, p.380-4. 2001.

NISTOR, A. et al. Real-time PCR complements immunohistochemistry in the

determination of HER-2/neu status in breast cancer. BMC Clin Pathol, v.6, n.1 18,

p.2, Jan. 2006.

OSBORNE, C. K. et al. Role of the estrogen receptor coactivator AIB1 (SRC-3)

and HER-2/neu in tamoxifen resistance in breast cancer. J Natl Cancer Inst, v.95,

n.5, p.353-61, Mar. 5 2003.

PAGE, D. L.; JENSEN, R. A.; SIMPSON, J. F. Routinely available indicators of

prognosis in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, v.51, n.3, p.195-208. 1998.

PAIK, S. et al. Real-world performance of HER2 testing--National Surgical

Adjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl Cancer Inst, v.94, n.11,

p.852-4, Jun. 5. 2002.

PENAULT-LLORCA, F.; CAYRE, A. [Assessment of HER2 status in breast

cancer]. Bull Cancer, v.91 Suppl 4, p.S211-5, Dec 1. 2004.

PICCART, M. J.; DI LEO, A.; HAMILTON, A. HER2. a 'predictive factor' ready to

use in the daily management of breast cancer patients? Eur J Cancer, v.36, n.14,

p.1755-61, Sep. 2000.

PINDER, S. E. et al. The importance of the histologic grade of invasive breast

carcinoma and response to chemotherapy. Cancer, v.83, n.8, p.1529-39, Oct 15.

1998.

PRESS, M. F. et al. Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target: an

assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large,

prospective, randomized clinical trials. Clin Cancer Res, v.11, n.18, p.6598-607,

Sep 15. 2005.

PRITCHARD, K. I. et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant

chemotherapy. N Engl J Med, v.354, n.20, p.2103-11, May 18. 2006.

RHODES, A. et al. Evaluation of HER-2/neu immunohistochemical assay

sensitivity and scoring on formalin-fixed and paraffin-processed cell lines and

breast tumors: a comparative study involving results from laboratories in 21

countries. Am J Clin Pathol, v.118, n.3, p.408-17, Sep. 2002.

ROCHA, R. M. et al. Construção de arrays de tecido com equipamento alternativo

e de baixo custo para estudo imunoistoquímico de tumores mamários. J Bras

Patol Med Lab, v.42, n.6, p.477-482, dezembro. 2006.

ROSS, J. S.; FLETCHER, J. A. HER-2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast

cancer. Am J Clin Pathol, v.112, n.1 Suppl 1 p.S53-67, Jul, 1999.

ROSSI, S. et al. Rabbit monoclonal antibodies: a comparative study between a

novel category of immunoreagents and the corresponding mouse monoclonal

antibodies. Am J Clin Pathol, v.124, n.2, p.295-302, Aug. 2005.

SAEZ, A. et al. HER-2 gene amplification by chromogenic in situ hybridisation

(CISH) compared with fluorescence in situ hybridisation (FISH) in breast cancer-A

study of two hundred cases. Breast, v.15, n.4, p.519-27, Aug. 2006.

SAPINO, A. et al. Which breast carcinomas need HER-2/neu gene study after

immunohistochemical analysis? Results of combined use of antibodies against

different c-erbB2 protein domains. Histopathology, v.43, n.4, p.354-62, Oct. 2003.

SAPINO, A. et al. Routine assessment of prognostic factors in breast cancer

using a multicore tissue microarray procedure. Virchows Arch, v.449, n.3, p.288-

96, Sep. 2006.

SARTELET, H. et al. Comparison of liquid based cytology and histology for the

evaluation of HER-2 status using immunostaining and CISH in breast carcinoma.

J Clin Pathol, v.58, n.8, p.864-71, Aug. 2005.

SAUTER, G.; MIRLACHER, M. Tissue microarrays for predictive molecular

pathology. J Clin Pathol, v.55, n.8, p.575-6, Aug. 2002.

SCHAIRER, C. et al. Probabilities of death from breast cancer and other causes

among female breast cancer patients. J Natl Cancer Inst, v.96, n.17, p.1311-21,

Sep 1. 2004.

SCHNITT, S. J. Breast cancer in the 21st century: neu opportunities and neu

challenges. Mod Pathol, v.14, n.3, p.213-8, Mar. 2001.

SCHMITT, F. C. Marcadores prognósticos em carcinoma mamário. In: ALVES,

V. A. F.; BACCHI, C. E.; VASSALO, J. Manual de imuno-histoquímica. Sociedade

Brasileira de Patologia, São Paulo, 30-46. 1999.

SEIDAL, T.; BALATON, A. J.; BATTIFORA, H. Interpretation and quantification of

immunostains. Am J Surg Pathol, v.25, n.9, p.1204-7, Sep. 2001.

SELVARAJAN, S. et al. c-erbB-2 (HER-2/neu) immunohistochemistry in invasive

breast cancer: is there concordance between standard sections and tissue

microarrays? Pathology, v.38, n.4, p.316-20, Aug. 2006.

SLAMON, D. J. et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival

with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science, v.235, n.4785, p.177-82,

Jan 9. 1987.

STERN, D. F. Tyrosine kinase signalling in breast cancer – ErbB family receptor

tyrosine kinases. Breast Cancer Res, v.2, p.176-83, 2000.

TANNER, M. et al. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for

fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in

archival breast cancer samples. Am J Pathol, v.157, n.5, p.1467-72, Nov. 2000.

TAVASSOLI, F.A., DEVILEE, P. (eds.) World Health Organization Classification

of Tumours. Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and Female Genital

Organs. IARC Press, Lyon, 2003.

THOMSON, T. A. et al. HER-2/neu in breast cancer: interobserver variability and

performance of immunohistochemistry with 4 antibodies compared with

fluorescent in situ hybridization. Mod Pathol, v.14, n.11, p.1079-86, Nov. 2001.

TROTTER, M. J.; DEMETRICK, D. J.; CIEZAR, S. D. Mapping tissue microarrays:

a simplified method for microarray navigation and a data management. Abstract

#1440. United States and Canadian Academy of Pathology, 91

Annual Meeting,

Chicago IL, 2002.

TSUDA, H. et al. Evaluation of interobserver agreement in scoring

immunohistochemical results of HER-2/neu (c-erbB-2) expression detected by

HercepTest, Nichirei polyclonal antibody, CB11 and TAB250 in breast carcinoma.

Pathol Int, v.52, n.2, p.126-34, Feb. 2002.

VERONESI, U. et al. Breast cancer. Lancet, v.365, n.9472, p.1727-41, May 14-

20, 2005.

WANG, S. et al. Automated cellular imaging system (ACIS)-assisted quantitation

of immunohistochemical assay achieves high accuracy in comparison with

fluorescence in situ hybridization assay as the standard. Am J Clin Pathol, v. 116,

p. 495-503, 2001.

WICK, M. R.; SWANSON, P. E. Editorial: Targeted controls in clinical

immunohistochemistry; a useful approach to quality assurance. Am J Clin Pathol.

v.117, p. 7, 2002.

ZHANG, D. et al. Reliability of tissue microarrays in detecting protein expression

and gene amplification in breast cancer. Mod Pathol, v. 16, n. 1, p. 79-84, Jan.

2003.

ZHAO, J. et al. Determination of HER2 gene amplification by chromogenic in situ

hybridization (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol, v.15, n.6, p.657-

65, Jun. 2002.

ZYMED. Zymed® Spot-Light® CISH™ Probes and CISH™ Detection. South San

Francisco 2005.

Fonte consultada não citada no texto:

SOUZA, M. S. L. Guia para redação e apresentação de monografias, dissertações e

teses. 3.ed. Belo Horizonte: Coopmed, 2005. 170p.

ANEXOS

ANEXO A - PROTOCOLO PARA IMUNOHISTOQUÍMICA

PROTOCOLO IHQ DA STREPTO-AVIDINA-BIOTINA-PEROXIDASE

Padronização adotada pelo Laboratório de Patologia Mamária da Faculdade de Medicina/UFMG

Desparafinizar:

1-Imergir as lâminas em 1 xilol - 20 min. 

2- Imergir as lâminas em álcool absoluto- mergulhar 10X

Bloqueio da peroxidase endógena:

1- Imergir as lâminas em solução recém-preparada de peróxido de hidrogênio:

Peróxido de hidrogênio 30% P.A.- 20 ml + Álcool metílico-180 ml por 20

minutos

2- Lavar as lâminas em água destilada- mergulhar

3- Imergir as lâminas em tampão PBS- 5 minutos

Reativação antigênica:

1- Ligar o steamer (panela a vapor) e pré-aqueça por 10 minutos

2- Imergir as lâminas em tampão citrato pH=6 pré-aquecido no microondas

3- Colocar a cuba com as lâminas no steamer por 25 minutos

4- Deixar as lâminas resfriando em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos

5- Depois de frias, imergir as lâminas em tampão PBS por 5 minutos

Bloqueio com soro normal de cabra:

1- Pingar o soro de cabra nos cortes e incubar em câmara úmida por 20

minutos

Anticorpo primário:

1- Escorrer o soro se cabra (não lavar), secar ao redor dos cortes e pingar +/-

50µl do anticorpo primário diluído sobre cada corte,

2- Incubar em câmara úmida em temperatura ambiente por 90 minutos.

3- Lavar as lâminas uma a uma com o PBS da pisseta e imergi-las em 3

banhos de 5

minutos

Anticorpo secundário:

1- Secar ao redor dos cortes e pingar uma gota do anticorpo secundário

biotinilado (amarelo) sobre cada corte,

2- Incubar em câmara úmida por 20 minutos

3- Lavar as lâminas uma a uma com o PBS da pisseta e imergi-las em 3 banhos

de 5 minutos

Streptavidina biotina peroxidase:

1- Secar ao redor dos cortes e pingar uma gota de streptavidina biotina

peroxidase (vermelho) sobre cada corte

2- Incubar em câmara úmida por 20 minutos

3- Lavar as lâminas uma a uma com o PBS da pisseta e imergi-las 2 banhos de

5 minutos

Revelação da reação:

1- Preparar a solução de DAB momentos antes do uso: 1 gota do cromógeno

para cada ml de substrato

2- Secar ao redor dos cortes e pingar cerca de 50µl da solução de DAB até

revelar o controle da reação

1- À medida que as lâminas são reveladas, coloque-as em um recipiente com

água para parar a revelação

2- Lavar as lâminas em água corrente por 5 minutos

Contracoloração:

1- Mergulhar rapidamente as lâminas na hematoxilina de Harris

2- Lavar as lâminas em água corrente por 7 minutos

Desidratação, diafanização e montagem:

1- Imergir as lâminas em álcool absoluto- 3 minutos em cada cuba

2- Imergir as lâminas em xilol: 10X em cada uma das 2 cubas

3- Manter as lâminas na 2ª cuba de xilol enquanto realiza a montagem com

lamínula e Enthelan®.

ANEXO B - PRODUÇÕES CIENTÍFICAS RELACIONADAS AO TRABALHO DE

DISSERTAÇÃO

Apresentações em Congressos e Encontros

Tema livre apresentado como pôster em Encontro de Pós -graduação

Estudo imunoistoquímico comparativo entre o novo anticorpo monoclonal de coelho

e anticorpos clássicos para detecção de Her2 e sua correlação com hibridização in

situ cromogênica em arrays de tecido de câncer de mama. Nunes CB, Rocha RM,

Reis-Filho JS, Rocha GSF, Sanches FSF, Oliveira FN, Gobbi H. I Encontro Nacional

de Pós-Graduação em Patologia, São Paulo, 09-11 de Novembro de 2006

Tema livre aceito para apresentação como pôster em Congresso Internacional

Immunohistochemical Comparison between New Rabbit Monoclonal Antibody (SP3)

and Classical Antibodies Against HER2: Correlation with Chrommogenic In Situ

Hibridization in Breast Câncer Tissue Microarrays. NUNES CB, ROCHA RM,

ROCHA GFS, SANCHES FSF, ANDRADE VP, OLIVEIRA FN, HERAS A, GOBBI H.

2007 United States and Canadian Academy of Pathology Annual Meeting, San

Diego, California, 24 a 30 de Março de 2007.

Artigos completos enviados para publicação em periódicos internacional e

nacional indexados ao Index Medicus

The novel rabbit monoclonal antibody against Her2: an immunohistochemical and

CISH comparative analysis in breast cancer. NUNES CB, ROCHA RM, REIS-FILHO

JS, LAMBROS MB, ROCHA GFS, SANCHES FSF, OLIVEIRA FN, GOBBI H.

Submetido à publicação no Histopathology.

Concordância interobservador na interpretação imunoistoquímica da superexpressão

do Her2 detectada por cinco diferentes anticorpos em arrays de carcinomas

mamários. NUNES CB; ROCHA RM; GOUVÊA AP; TAFURI LSA; MARINHO VFZ;

REZENDE MA; GOBBI H.

Submetido à publicação no Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial.

ANEXO C – CARTAS DE SUBMISSÃO DOS ARTIGOS, ACEITE E CERTIFICADO

DE RESUMOS CIENTÍFICOS

From:

Histopeds@oxon.blackwellpublishing.com

To:

cristian[email protected]

Cc:

Subject:

Histopathology - Manuscript ID HISTOP-12-06-0694

Body:

@@date to be populated upon sending@@

Dear Mrs. Cristiana Nunes,

Your manuscript entitled "The novel rabbit monoclonal antibody

against Her2: an immunohistochemical and CISH comparative analysis

in breast cancer" has been successfully submitted online and is

presently being given full consideration for publication in

Histopathology.

Your manuscript ID is HISTOP-12-06-0694.

Please mention the above manuscript ID in all future correspondence

or when calling the office for questions. If there are any changes in

your street address or e-mail address, please log in to Manuscript

Central at http://mc.manuscriptcentral.com/histop and edit your user

information as appropriate.

You can also view the status of your manuscript at any time by

checking your Author Center after logging in to

http://mc.manuscriptcentral.com/histop .

Thank you for submitting your manuscript to Histopathology.

Yours sincerely,

Mr Justin Gillett

Editorial Assistant

Histopathology

http://mc.manuscriptcentral.com/histop

Date

Sent:

27-Dec-2006

JBP/ML-AP-2007/261 - Recebimento de Artigo

Caixa de entrada

[email protected]

para mim

mostrar detalhes 1 Fev (19 horas atrás)

Prezado(a) Dr(a). Cristiana Buzelin Nunes,

É com satisfação que recebemos o artigo “CONCORDÂNCIA INTEROBSERVADOR NA

INTERPRETAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DA SUPEREXPRESSÃO DO HER2 DETECTA

DA POR

CINCO DIFERENTES ANTICORPOS EM ARRAYS DE CARCINOMAS MAMÁRIOS” aqui

cadastrado sob o código AP2007/261.

Informamos que o mesmo será enviado para análise pelo nosso Corpo Editorial, cujo parecer ser-lhe-

á enviado tão breve quanto possível.

Atenciosamente,

Dr. Washington Luís Conrado dos Santos

Editor - Patologia JBP

United States and Canadian Academy of Pathology

November 21, 2006

Presenting Author: Helenice Gobbi

Abstract #: 1604

Title: Immunohistochemical Comparison between New Rabbit Monoclonal Antibody (SP3) and Classical Antibodies Against

HER2: Correlation with Chromogenic

In Situ Hybridization in Breast Cancer Tissue Microarrays

Poster Session II − Monday Afternoon − Poster #226

Congratulations! The abstract listed above has been accepted for poster presentation during the 2007 USCAP Annual Meeting,

March 24−30 in San Diego, CA.

All presenters are required to pay the General Registration Fee for the meeting. You may register online through the

USCAP web site −

www.uscap.org − or call the Academy office to request a form (706/733−7550).

Please place the poster on the board with the Poster Number shown above in the poster display area between 12:30 pm − 1:00

pm. Posters are only displayed

for half days. You must remove your poster between 4:30 pm − 5:00 pm (or it may be discarded). Authors should be with their

posters during the break period.

EXCITING NEW OPPORTUNITY for 2007 Posters − Call4Posters

and Posters2View

PROGRAMS

The United States and Canadian Academy of Pathology has arranged with Marathon Multimedia to provide you with the

opportunity to create your poster entirely

online using the Call4Posters

service. In addition to this, you have the option to have your poster shipped directly to the

meeting for on−site pick−up. This

optional service is an easy and convenient way for you to prepare your poster for the annual meeting! You are not required to

use this poster service; however,

we hope you will find it a convenient and simple way to produce a professional poster at a reasonable price. You can access the

program through the USCAP

website (www.uscap.org).

Additionally, the USCAP is offering a FREE poster upload service for inclusion on a Posters2View

Online Program. If you

choose to electronically submit your

poster (whether or not it was created online), it will be available on the USCAP website for viewing and will remain available

after the meeting. This will greatly

increase your poster's exposure and will allow viewers to access your graphs and photos throughout the year. We hope that you

will take advantage of this

exciting new opportunity!

Specific Instructions:

1. Poster board surface is 3'10" tall by 5'10" wide. You are limited to this surface.

A header which includes the Title, Authors and Affiliations should be mounted at the top of the board. A copy of the abstract, in

large type, should be

posted in the upper left hand corner of the poster board.

All presenters are expected to disclose to the audience any commercial/financial relationship which may have a direct bearing

on the subject of the

presentation and which may be perceived as a real or apparent conflict of interest.

All illustrations, charts, graphs, and printed material should be legible from a distance of 3 feet or more. Keep illustrative material

simple. Photographs

(including light & electron micrographs) show up better if they are mat finished. Avoid heavy backing material which is difficult to

attach to the board.

5. Bring push pins for mounting material on the poster board.

Sincerely,

United States and Canadian Academy of Pathology

Fred G. Silva, M.D., Executive Director

Jeffrrey L. Myers, M.D., Education Committee Chairman

ANEXO D – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA

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