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CRISTINA MAYUMI SASAKI
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ALELOPÁTICAS E
ANTIMICROBIANAS DAS PARTES AÉREAS DE Pterocaulon lorentzii Malme
(ASTERACEAE)
CURITIBA
2008
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CRISTINA MAYUMI SASAKI
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ALELOPÁTICAS E
ANTIMICROBIANAS DAS PARTES AÉREAS DE Pterocaulon lorentzii Malme
(ASTERACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas do Setor de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial para a obtenção do
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel
Co-orientadora: Profª Drª Marilis Dallarmi Miguel
CURITIBA
2008
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"Nada assenta melhor ao corpo que o
crescimento do espírito.”
(Provérbio Chinês)
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Paraná
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Ao Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel pela orientação, ensinamentos, confiança,
constante presença e acima de tudo pela amizade.
À Profª. Drª. Marilis Dallarmi Miguel, pela co-orientação, acompanhamento e
revisão do trabalho.
Ao Botânico Gert Hatschbach e Biólogo Osmar do Santos Ribas pelas
informações, identificação e depósito do exemplar da espécie em estudo.
À Profª. Drª. Ana Luísa Lacava Lordello, do Departamento de Química da
UFPR, pela contribuição na obtenção dos espectros de RMN
1
H e RMN
13
C.
Ao Laboratório de RMN da Universidade Estadual de Maringá pelos espectros
de ressonância magnética nuclear.
Ao Dr. João Luis de Souza Carvalho, pela trituração do material vegetal e pelo
companheirismo.
Ao Laboratório de Controle de Qualidade II da UFPR, representado pela Profª.
Wanda N. Abrahão e Geni Peruzzo, pela cooperação na avaliação da atividade
antimicrobiana.
Ao Laboratório de Farmacotécnica e à Msc. Josiane de Fátima Gaspari Dias
pela orientação na avaliação da atividade alelopática.
Ao funcionário da UFPR Paulo Sérgio Diniz pela contribuição com o
desenvolvimento do trabalho.
À Doutoranda Cláudia Alexandra Andrade pela amizade e companheirismo.
À Farmacêutica Karina Bora pela intensa contribuição a este trabalho.
A todos os funcionários e professores do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, que de formas diversas contribuíram para este
trabalho.
A todos os colegas do mestrado pela amizade, em especial à minha amiga
Flávia Raphaela Nass pela amizade incondicional.
À minha família, pelo apoio, insentivo e suporte.
Ao meu noivo, Key, pelo companheirismo, compreensão e incessante apoio.
E à Deus.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................
17
2 OBJETIVOS..................................................................................................
19
2.1 OBJETIVOS GERAIS................................................................................. 19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................... 19
3 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................
20
3.1 ASPECTOS BOTÂNICOS.......................................................................... 20
3.1.1 Taxonomia............................................................................................... 20
3.1.2 Morfologia................................................................................................ 22
3.1.2.1 Gênero Pterocaulon..............................................................................
22
3.1.2.2 Pterocaulon lorentzii Malme .................................................................
22
3.1.3 Aspectos Etnofarmacológicos..................................................................
25
3.1.4 Atividade Antimicrobiana......................................................................... 25
3.1.5 Atividade Antiviral.................................................................................... 26
3.1.6 Atividade Citotóxica................................................................................. 26
3.1.7 Atividade Inseticida.................................................................................. 26
3.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA...........................................................................
27
3.2.1 Cumarinas................................................................................................
27
3.2.2 Flavonóides..............................................................................................
30
3.2.3 Triterpenos...............................................................................................
33
3.3 COMPOSTOS IDENTIFICADOS EM ESPÉCIES DO GÊNERO
Pterocaulon.......................................................................................................
34
4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
38
4.1 MATERIAL VEGETAL................................................................................ 38
4.2 ESTUDOS FITOQUÍMICOS....................................................................... 38
4.2.1 Ensaio Sistemático de Análise em Fitoquímica....................................... 38
4.2.1.1. Preparo do extrato hidroalcoólico a 20%............................................. 39
4.2.1.2. Preparo do extrato aquoso a 20%....................................................... 39
4.2.1.3. Pesquisa de alcalóides........................................................................ 39
4.2.1.4. Pesquisa de ácidos orgânicos............................................................. 40
4.2.1.5. Pesquisa de fenóis.............................................................................. 40
4.2.1.6. Pesquisa de flavonóides...................................................................... 40
4.2.1.7. Pesquisa de cumarinas........................................................................
40
4.2.1.8. Pesquisa de antraquinonas................................................................. 41
4.2.1.9. Pesquisa de esteróis e triterpenos.......................................................
41
4.2.1.10. Pesquisa de heterosídeos antociânicos............................................ 41
4.2.1.11. Pesquisa de heterosídeos saponínicos............................................. 42
4.2.1.12. Pesquisa de heterosídeos cianogenéticos........................................ 42
4.2.1.13. Pesquisa de gomas, taninos e mucilagens........................................
42
4.2.1.14. Pesquisa de taninos...........................................................................
42
4.2.1.15. Pesquisa de aminogrupos................................................................. 43
4.2.1.16. Pesquisa de ácidos voláteis...............................................................
43
4.2.1.17. Pesquisa de ácidos fixos................................................................... 43
4.2.2 Determinação do Teor de Sólidos........................................................... 44
4.2.3 Extração de Óleo Essencial.....................................................................
45
4.2.4 Obtenção do Extrato em Aparelho de Soxhlet Modificado...................... 45
4.2.5 Obtenção das Frações.............................................................................
46
4.2.6 Obtenção do Resíduo Seco.....................................................................
47
4.2.7 Isolamento das Substâncias.................................................................... 47
4.2.7.1 Cromatografia líquida em coluna.......................................................... 47
4.2.7.2 Cromatografia em camada delgada..................................................... 48
4.2.8 Elucidação Estrutural.............................................................................. 48
4.2.8.1 Espectroscopia de absorção no ultravioleta......................................... 48
4.2.8.2 Espectroscopia de absorção em infravermelho....................................
48
4.2.8.3 Espectroscopia de ressonância nuclear magnética de
1
H e
13
C.......... 49
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA......................................
49
4.3.1 Método da Concentração Mínima Inibitória (CMI)................................... 49
4.3.1.1 Prepado do inoculo............................................................................... 50
4.3.1.2 Preparo das amostras e do teste..........................................................
50
4.3.2 Método de Autobiografia..........................................................................
50
4.3.2.1 Preparo do inoculo................................................................................
51
4.3.2.2 Preparo das amostras e do teste..........................................................
51
4.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ALELOPÁTICA................................................. 52
4.4.1 Germinação............................................................................................. 53
4.4.2 Crescimento............................................................................................ 55
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................
56
5.1 ESTUDO FITOQUÍMICO........................................................................... 56
5.1.1 Ensaio Sistemático de Análise em Fitoquímica....................................... 56
5.1.2 Determminação de Teor de Sólidos 57
5.1.3 Óleo Essencial......................................................................................... 57
5.1.4 Análise Cromatográfica............................................................................
57
5.1.4.1 Fração hexano...................................................................................... 58
5.1.4.1.1 Análise dos cristais 3-o-acetil-pseudotaraxasterol............................ 58
5.1.4.1.2 Análise dos cristais de taraxasterol e pseudotaraxasterol.................
66
5.1.4.1.3 Análise dos cristais de undecan-1-ol................................................. 72
5.1.4.1.4 Análise dos cristais do dodecilciclohexano........................................
78
5.1.4.2 Fração clorofórmio................................................................................ 83
5.1.4.3 Fração acetato de etila......................................................................... 98
5.1.5 Atividade Antimicrobiana......................................................................... 101
5.1.5.1 Método da Concentração Mínima Inibitória (CMI)................................ 101
5.1.5.2 Método de Autobiografia.......................................................................
102
5.1.6 Atividade Alelopática ...............................................................................
105
5.1.6.1 Avaliação da germinação......................................................................
105
5.1.6.2 Avaliação do crescimento..................................................................... 106
CONCLUSÃO ..................................................................................................
110
REFERÊNCIAS................................................................................................
111
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
REGIÕES ONDE SE ENCONTRA O GÊNERO Pterocaulon...............
21
FIGURA 2 -
REGIÕES ONDE SE ENCONTRA A ESPÉCIE Pterocaulon lorentzii
MALME.................................................................................................. 23
FIGURA 3 -
FOTOGRAFIA DE Pterocaulon lorentzii Malme NO MUNICÍPIO DE
PIÇARRAS, ESTADO DE SANTA CATARINA..................................... 24
FIGURA 4 - FOTOGRAFIA DE DETALHE DA INFLORESCÊNCIA DE
Pterocaulon lorentzii Malme .................................................................
24
FIGURA 5 - METABOLISMO DAS CUMARINAS..................................................... 28
FIGURA 6 - ESTRUTURA QUÍMICA DA ESCOPOLETINA..................................... 29
FIGURA 7 - BIOSSÍNTESE DOS FLAVONÓIDES................................................... 31
FIGURA 8 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS QUERCETINA E
MEDICARPINA...................................................................................... 32
FIGURA 9 -
BIOSSÍNTESE DE TRITERPENOS PENTACÍCLICOS................
33
FIGURA 10 - ESTRUTURA QUÍMICA DO TARAXASTEROL.................................... 34
FIGURA 11 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DE PURPURENOL E PURPURASOL...... 35
FIGURA 12 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DE SABANDINOL E SABANDINONA……
36
FIGURA 13 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS (1) E (2).................... 36
FIGURA 14 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DO CRISOSFENOL.................................. 37
FIGURA 15 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DAS CUMARINAS (3), (4) E (5)................ 37
FIGURA 16 - APARELHO DE SOXHLET MODIFICADO........................................... 45
FIGURA 17 - APARELHO DE SOXHLET ADAPTADO PARA PARTIÇÃO
LÍQUIDO-LÍQUIDO................................................................................ 46
FIGURA 18 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DO 3-O-
ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL..................................................... 59
FIGURA 19 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL...................................................................
61
FIGURA 20 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL................................................................... 63
FIGURA 21 - ESPECTRO DE RMN DE DEPT E
13
C DO 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL................................................................... 64
FIGURA 22 - ESTRUTURA QUÍMICA DO 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL 65
FIGURA 23 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DA MISTURA DE TARAXASTEROL E
PSEUDOTARAXASTEROL................................................................... 67
FIGURA 24 - ESPECTRO DE RMN DE DEPT E
13
C DA MISTURA DE
TARAXASTEROL E PSEUDOTARAXASTEROL..................................
69
FIGURA 25 - ESPECTRO DEPT 135° DE RMN DA MISTURA DE
TARAXASTEROL E PSEUDOTARAXASTEROL..................................
70
FIGURA 26 - EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA MISTURA DE
TARAXASTEROL E PSEUDOTARAXASTEROL..................................
71
FIGURA 27 - IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DA COMPOSIÇÃO DE
TRITERPENOS PRESENTES NOS CRISTAIS DE FH2...................... 72
FIGURA 28 -
ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO UNDECAN-1-OL...........................
73
FIGURA 29 -
EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO UNDECAN-1-OL
74
FIGURA 30 -
ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO UNDECAN-1-OL..........................
76
FIGURA 31 -
EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO
UNDECAN-1-OL DE δ 14 – δ 29 ppm E δ 29 – δ 33 ppm...........
77
FIGURA 32 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO PALMÍTICO E PROPOSTA
PARA SUBSTÂNCIA FH3..................................................................... 78
FIGURA 33 -
ESPECTRO DE RMN DO DODECILCICLOHEXANO......................
79
FIGURA 34 -
EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN
1
H DO
DODECILCICLOHEXANO..........................................................
80
FIGURA 35 -
ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO DODECILCICLOHEXANO........
81
FIGURA 36 -
ESPECTROS DE EXPANSÃO DE RMN DE
13
C DO
DODECILCICLOHEXANO DE δHM..............ANO
FIGURA 50 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DA
QUERCETINA....................................................................................... 98
FIGURA 51 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DA QUERCETINA.................................. 99
FIGURA 52 - ESTRUTURA QUÍMICA DA QUERCETINA.......................................... 100
FIGURA 53 -
INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM
BIOAUTOGRAFIA ADAPTADA DOS EXTRATOS TOTAL E
HEXÂNICO E 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL.............
101
FIGURA 54 - INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM BIOAUTOGRAFIA
ADAPTADA DO EXTRATO TOTAL, FRAÇÃO HEXÂNICA E 3-O-
ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL...............................................
103
FIGURA 55 -
INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM
BIOAUTOGRAFIA ADAPTADA DOS EXTRATOS TOTAL E
HEXÂNICO E 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL.............
104
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS APLICADAS NAS
CROMATOPLACAS PARA ANÁLISE DE AUTOBIOGRAFIA..................
51
TABELA 2 -
MARCHA SISTEMÁTICA FITOQUÍMICA DE Pterocaulon lorentzii
Malme....................................................................................................... 56
TABELA 3 - RENDIMENTO DAS FRAÇÕESESTRAÍDAS POR SOXHLET................ 58
TABELA 4 - DADOS DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RNM DE
13
C (δ EM
PPM, CDCL
3
) PARA COMPARAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 3-O-
ACETIL-TARAXASTEROL (HEEMANN, 2002) E
PSEUDOTARAXASTEROL (MAHATO et al., 1994) ENCONTRADOS
NA LITERATURA COM FH1.................................................................... 62
TABELA 5 - DADOS DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RNM DE
13
C (δ EM
PPM, CDCL
3
) PARA PSEUDOTARAXASTEROL E TARAXASTEROL
ISOLADOS COMPARADOS COM OS DA LITERATURA (MAHATO et
al., 1994)...................................................................................................
68
TABELA 6 - DADOS DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE
13
C (δ EM
PPM, CDCL
3
) PARA A SUBSTÂNCIA FH3 COMPARADO COM O
ÁCIDO PALMÍTICO DA LITERATURA (MONTRUCHIO, 2001).............. 75
TABELA 7 - DESLOCAMENTO QUÍMICO DE RMN
13
C DA SUBSTÂNCIA FC1
COMPARADO AOS DADOS DE SABANDINOL DA LITERATURA
(HEEMANN, 2002)...................................................................................
88
TABELA 8 - RESULTADOS DO TESTE DE AUTOBIOGRAFIA..................................
102
TABELA 9 - TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NOS ÍNDICES DE
GERMINAÇÃO DE Lactuca sativa NO ENSAIO ALELOPÁTICO COM
EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DAS PARTES AÉREAS DE
Pterocaulon lorentzii Malme.....................................................................
105
TABELA 10 - TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NA AVALIAÇÃO DO
CRESCIMENTO DA RADÍCULA E HIPOCÓTILO DE Lactuca sativa
NO ENSAIO ALELOPÁTICO COM EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS DAS PARTES AÉREAS DE Pterocaulon lorentzii
Malme....................................................................................................... 107
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 -
MÉDIAS DE GERMINAÇÃO DE Lactuca sativa SUBMETIDA A
ENSAIO ALELOPÁTICO COM OS EXTRATOS ET, EA, EH E AS
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS FH1, FC1 E FC2..........................................
106
GRÁFICO 2 -
MÉDIAS DE CRESCIMENTO DA RADÍCULA DE Lactuca sativa
SUBMETIDA A ENSAIO ALELOPÁTICO COM OS EXTRATOS ET,
EA, EH E AS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS FH1, FC1 E FC2................... 108
GRÁFICO 3 -
MÉDIAS DE CRESCIMENTO DO HIPOCÓTILO DE Lactuca sativa
SUBMETIDA A ENSAIO ALELOPÁTICO COM OS EXTRATOS ET,
EA, EH E AS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS FH1, FC1 E FC2....................
108
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ATCC American Type Culture Colection
AlCl
3
Cloreto de Alumínio
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CDCl
3
Clorofórmio Deuterado
CG Cromatografia gasosa
CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a Espectrofotômetro de Massa
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
°C Grau Celsius
D.C. De Candolle
E M Espectrômetro de Massa
HCl Ácido Clorídrico
HPLC Hight Performance Liquid Cromatography
IV Infravermelho
µL Microlitro
mmHg Milímetros de Mercúrio
N Normal
NEU Reativo 2-aminoetilbutirato
nm Nanômetros
P A Para Análise
pH Potencial Hidrogeniônico
RNM
1
H Ressonância Nuclear Magnética de Hidrogênio
RNM
13
C Ressonância Nuclear Magnética de Carbono 13
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
UV Ultravioleta
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo contribuir para o estudo fitoquímico,
alelopático e das propriedades antimicrobianas das partes aéreas de
Pterocaulon lorentzii Malme. A extração e o particionamento foram realizados
em aparelho de Soxhlet modificado. A análise dos extratos permitiu o
isolamento das seguintes substâncias: 3-O-acetil-pseudotaraxasterol
(triterpeno); mistura de taraxasterol e pseudotaraxasterol (triterpeno);
sabandinol (cumarina); quercetina (flavonol); undecan-1-ol (álcool graxo) e
tridecilciclohexano (hidrocarboneto). Composição esta reportada pela primeira
vez na espécie. O estudo antimicrobiano revelou que os extratos da planta
apresentam potencial inibitório para a germinação de Lactuca sativa, porém,
suas substâncias isoladas não o possuem. As propriedades atimicrobianas da
espécie em estudo concentram-se no extrato total, na fração hexano e na
substância isolada 3-O-acetil-pseudotaraxastero, que inibem o crescimento de
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.
Palavras-chave: Asteraceae; Pterocaulon; Triterpenos; Cumarinas; Atividade
Antimicrobiana; Atividade Alelopática.
ABSTRACT
The objective of this project is to contribute to the studies of phytochemical,
allelopathic and antimicrobin properties of this species’ aerial part. The
extraction and partition were accomplished by using a modified Soxhlet
apparatus. The analysis of the extracts allowed the isolation of the following
substances: 3-O-acetil-pseudotaraxasterol (triterpene); mix of taraxasterol and
pseudotaraxasterol (triterpene); sabandinol (coumarin); quercetin (flavonol);
undecan-1-ol (fatty alcohol) and trydecylcyclohexane (hydrocarbon). For the
first time this composition is reported scientifically in this species. The
allelopathic study denoted that the extracts of the plant have potential to inhibit
Lactuca sativa germination, however the isolated substances do not result in
the same inhibition as well. The antibiotic properties of P. lorentzii Malme are
concentrated on the total extract, hexane faction and on the 3-O-acetil-
pseudotaraxasterol which inhibit the growth of Staphylococcus aureus and
Pseudomonas aeruginosa.
Keywords: Asteraceae; Pterocaulon; Triterpenes; Cumarins; Antibiotic
Activities; Alelopatic Activities.
1 INTRODUÇÃO
A busca por novos medicamentos tem impulsionado a pesquisa científica de
plantas medicinais para obtenção de novos fármacos. Isto tem motivado diversos
grupos de pesquisa a direcionar esforços para o desenvolvimento de novas técnicas
para identificação e purificação de compostos químicos.
Neste sentido, o estudo sistemático dos metabólitos secundários que ocorrem
em determinada família ou gênero, conhecido como quimiotaxonomia, juntamente
com as observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma relevante para a divulgação das propriedades terapêuticas dos
vegetais. Isto mantém em voga a prática do consumo de fitoterápicos e torna válidas
as informações que foram sendo acumuladas durante séculos (NUNES JUNIOR,
1988; STEIN, 2005).
A biodiversidade da pouco explorada flora brasileira mostra grandes fontes de
obtenção de ativos, no que se trata de fitoterápicos. Essa realidade pode ser
observada na cultura popular em que estas plantas são usadas para o tratamento
das mais diversas enfermidades, principalmente nos países em ascensão sócio-
econômica.
Os vegetais têm sido considerados reservatórios potenciais de fármacos e a
partir do isolamento e da identificação estrutural das substâncias ativas vegetais, é
possível recriá-los por síntese total em laboratório, ou utilizar a substância isolada
como material de partida para a criação de estruturas químicas diferentes obtidas
por procedimentos de modelagem molecular (HEEMANN, 2002).
As espécies da família Asteraceae produzem freqüentemente poliacetilenos,
óleos essenciais e terpenos, sendo que a larga ocorrência de lactonas
sesquiterpênicas é a característica química mais marcante da família. São
conhecidas mais de 2500 (dois mil e quinhentos) lactonas, a maioria isolada de
Asteraceae. Muitas apresentam atividade antitumoral, mas nenhuma com emprego
clínico. Apresentam também atividades antibacteriana, antifúngica, anti-helmíntica,
antiinflamatória e antipirética. Muitas são conhecidas por causarem dermatite,
enquanto outras inibem a penetração da cercária de Schistosoma mansoni. A
presença de óleos essenciais e lactonas sesquiterpênicas poderia ser responsável
18
pelo uso popular contra dores, febres, indigestão e doenças infecciosas
(STEFANELLO, 1993).
As partes aéreas de Pterocaulon purpurascens Malme e de Pterocaulon
virgatum (L.) DC. são utilizadas na medicina popular argentina devido suas
propriedades digestivas, emenagogas, inseticidas e como agente contra picada de
cobras. Além destas características, as partes aéreas do Pterocaulon polystachium
são empregadas como repelentes de insetos e seu decocto é usado em casos de
insolação (DEBENEDETTI, 1992; DEBENEDETTI, 1994a).
MONGELLI et al., 2000 realizaram estudos sobre a citotoxicidade e atividades
de interação com DNA de extratos de plantas medicinais utilizadas na Argentina. Os
estudos demonstraram que o Pterocaulon polystachium possui atividade em células
de carcinoma epidermóide oral humano e DNA, sugerindo a presença de compostos
que interagem com o material genético.
No levantamento bibliográfico realizado até o momento, não foram
encontradas descrições sobre a espécie Pterocaulon lorentzii Malme, planta
encontrada na biodiversidade do território nacional, o que justifica a importância do
trabalho proposto.
Considerando o estudo realizado sobre outras espécies deste gênero,
verifica-se concentração significativa de alguns compostos químicos de grande
interesse farmacológico e industrial. Dentre eles cumarinas, esteróides e
flavonóides.
O estudo da espécie Pterocaulon lorentzii Malme visa à identificação e
quantificação destas substâncias presentes e conseqüentemente sua ação
farmacológica, tendo em vista ser uma espécie empregada na medicina popular.
A pesquisa científica de plantas medicinais empregadas na terapêutica possui
caráter multi e interdisciplinar, sendo este aspecto fundamental para o
desenvolvimento de estudos mais elaborados e de maior rigor técnico-científico, de
modo a atender as exigências da legislação referente ao desenvolvimento e registro
de fitoterápicos (HEEMANN, 2002).
19
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Contribuir para o conhecimento sistemático dos metabólitos secundários de
Pterocaulon lorentzii Malme, Asteraceae.
2. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Coletar e identificar botanicamente a espécie;
Isolar e identificar os principais metabólitos de P. lorentzii por meio de
técnicas cromatográficas e recristalização;
Determinação da estrutura química de compostos isolados utilizando técnicas
espectroscópicas em UV, IV, RMN H
1
e C
13
;
Avaliar a atividade alelopática dos extrato, frações e substâncias isoladas;
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extrato, frações e substâncias isoladas.
20
3 REVISÃO DE LITERATURA
A principal contribuição da fitoquímica enquanto ciência, neste último século
foi a orientação dos estudos para a determinação de novas estruturas dos
metabólitos secundários e suas possíveis funções nas plantas, esclarecendo os
mecanismos de biossíntese e desenvolvendo a quimiotaxonomia (YUNES;
CECHINEL FILHO, 2001).
Um importante método de pesquisa de fármacos é a química combinatória
que se fundamentou teoricamente na síntese de proteínas com funções especiais a
partir de alguns poucos aminoácidos. Entretanto, este método ainda está longe de
alcançar as combinações químicas que a evolução biológica e a seleção natural
realizaram durante milhões de anos de forma realmente inigualável (YUNES;
CECHINEL FILHO, 2001).
Os compostos oriundos de fontes vegetais estrututralmente definidos são
facilmente identificados a partir de seus extratos por métodos de screening (análise
detalhada e precisa). Alguns métodos exigem determinado grau de pureza dos
compostos ou preparo prévio das amostras (YUNES; CECHINEL FILHO, 2001).
Entre eles podemos citar a análise por Ressonância Nuclear Magnética (RMN),
Espectrometria de Massa e Cromatografia, métodos estes que procuram diminuir
cada vez mais o tempo de isolamento e determinação estrutural dos compostos
naturais ativos.
3.1 ASPECTOS BOTÂNICOS
3.1.1 Taxonomia
A família Compositae ou Asteraceae compreende cerca de 1.100 (mil e cem)
gêneros, com aproximadamente 23.000 (vinte e três mil) espécies distribuídas em 03
(três) subfamílias: Barnadesioideae, Cichorioideae e Asteroideae, com ampla
distribuição e bem representadas em regiões tropicais, subtropicais e temperadas
(BARROSO, 1991; JOLY, 1991).
21
Esta família é cosmopolita e encontrada em grande concentração de espécies
em regiões de climas variados. Também são abundantes em regiões montanhosas.
Algumas espécies são verdadeiramente aquáticas, mas a maioria é encontrada mais
em regiões áridas do que nas florestas tropicais úmidas.
A tribo Inuleae congrega 180 (cento e oitenta) gêneros, com cerca de 2100
(duas mil e cem) espécies, das quais poucas foram detalhadamente investigadas
quanto à composição química. Sendo que os tipos de compostos mais encontrados
são lactonas sesquiterpênicas, lactonas diterpênicas, flavonóides, poliacetilenos
simples e acetilenos mono- e di-tiofênicos (FRIGHETTO, 1983).
Dentre os gêneros citados, o gênero Pterocaulon é constituído de 18 (dezoito)
espécies, das quais 12 (doze) são americanas e encontram-se espalhadas desde o
sul dos Estados Unidos até o centro da Argentina, sendo estas pouco exploradas
quimicamente até o momento (CABRERA e RAGONESE, 1978).
MABBERLEY (1987), afirma que o gênero em estudo possui 18 (dezoito)
espécies na América, sudeste da Ásia até Austrália (Figura 1).
FIGURA 1 – REGIÕES ONDE SE ENCONTRA O GÊNERO Pterocaulon
No estado do Paraná foram identificados na década de 60 quatro espécies de
Pterocaulon como o P. alopecuroideum (Lamarck) DC., P. angustifolium DC., P.
interruptum DC. e P. rugosum (Vahl.) Malme (ANGELY, 1965).
Regiões frias
da América
Ásia
Austrália
Nova Caledônia
22
3.1.2 Morfologia
3.1.2.1 Gênero Pterocaulon
O gênero Pterocaulon é constituído de ervas, arbustos, árvores baixas ou
médias, não é raro trepadeiras perenes, com indumento variado, não secretor ou
glanduloso, com abundantes princípios ativos muito diversificados, incluindo inulina,
alcalóides, com ou sem sistema de canais lactíferos e condutos ou depósitos,
esquizolisígenos de resina, freqüentemente com floema ou canais vasculares em
uma medula (SALINAS, 1992).
As espécies apresentam invólucro comprimido, formado por poucas séries de
brácteas linear-lanceoladas, sendo as exteriores gradualmente menores, caducas
com as flores. Receptáculo pequeno, hisurto ou glabro. Flores dimorfas: as
marginais pluriseriadas, femininas, com corolas filiformes truncadas ou com 2 a 3
dentes no ápice; as centrais são poucas, hermafroditas ou masculinas por
esterilidade do gineceu, com corola tubulosa estreita, pentadenteada no limbo.
Folhas alternadas inteiras ou dentadas, decurrrentes resultando em caule alado.
Capítulos pequenos sésseis, dispostos em glomérulos terminais ou em espigas mais
ou menos densas (CABRERA, 1963).
3.1.2.2 Pterocaulon lorentzii Malme
Pouco se sabe sobre a espécie Pterocaulon lorentzii Malme (Asteraceae). De
acordo com o Missouri Botanical Garden, os primeiros registros da espécie datam de
1901. E, segundo esta mesma entidade, a espécie em estudo foi encontrada em
diversas regiões da América do Sul como mostra figura 2.
23
FIGURA 2 – REGIÕES ONDE SE ENCONTRA A ESPÉCIE Pterocaulon lorentzii
MALME
FONTE: MOBOT, 2006.
De acordo com informações da Secretaria de Minérios da Argentina, esta
espécie em estudo é chamada popularmente como ‘Yerba infiel’ ou ‘Tuyá’. E de
acordo com O Museu Botânico Municipal de Curitiba ‘Calção de Velho’ é o nome
dado à espécie na região sul do Brasil, onde também seu decocto é popularmente
utilizado em banhos de acento para aliviar os sintomas de hemorróidas.
Como descrito na morfologia do gênero, a espécie Pterocaulon lorentzii
Malme segue as mesmas características morfoanatômicas (Figura 3 e 4).
24
FIGURA 3 – FOTOGRAFIA DE Pterocaulon lorentzii Malme NO MUNICÍPIO DE
PIÇARRAS, ESTADO DE SANTA CATARINA
FONTE: MIGUEL, 2006.
FIGURA 4 – FOTOGRAFIA DE DETALHE DA INFLORESCÊNCIA DE Pterocaulon
lorentzii Malme
FONTE: MIGUEL, 2006
25
3.1.3 Aspectos Etnofarmacológicos
Na Argentina, como em muitos países sulamericanos, as partes aéreas de
Pterocaulon purpurascens Malme e de Pterocaulon virgatum (L.) DC. são utilizadas
na medicina popular devido a suas propriedades digestivas, emenagogas,
inseticidas e como agente contra picada de cobras. As partes aéreas do Pterocaulon
polystachium são empregadas como repelentes de insetos e seu decocto é usado
em casos de insolação (DEBENEDETTI, 1992; DEBENEDETTI, 1994a).
Estudos revelaram que as partes aéreas de Pterocaulon sphacelatum
(JOHNS, 1968), P. virgatum (DEBENEDETTI, 1981; BOHLMANN, 1981), P. lanatum
(MAGALHÃES, 1981), P. balanseae (MAGALHÃES, 1981), P. allopecuroides
(NUNES Jr., 1988), P. interruptum (HEEMANN, 2002) são compostas por uma série
de substâncias entre as quais várias cumarinas, flavonóides e terpenos, como o
taraxasterol. Em P. virgatum (BOHLMANN, 1981) foram encontrados constituintes
poliacetilênicos, compostos fisiologicamente ativos contra vários organismos, como
algumas fitoalexinas, tóxicas a fungos (NUNES Jr., 1988).
Espécies como P. sphacelatum (Labill.) Benth e P. serrulatum (Montr.)
Guillaumin têm sido usadas na medicina tradicional pelo povo nativo de diferentes
partes da Austrália no tratamento de infecções respiratórias, resfriados, febres, dores
de cabeça e doenças de pele (SEMPLE, 1999)
3.1.4 Atividade Antimicrobiana
A tradicional antibioticoterapia está caminhando para uma crise de ineficácia
devido à resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos, o que aumenta
consideravelmente a procura por novas e eficazes substâncias com esta atividade. A
investigação química de extratos de plantas e produtos naturais para atividade
antimicrobiana tem demonstrado que plantas superiores representam uma fonte
potencial de novos agentes antinfecciosos (STEIN, 2005 ; HEEMANN, 2006).
Estudos preliminares revelaram que a espécie Pterocaulon lorenztzii Malme
apresenta atividade antibiótica. Entretanto, ensaios mais detalhados e estudos mais
profundos deverão ser realizados para a verificação desta propriedade.
26
3.1.5 Atividade Antiviral
O extrato etanólico bruto das partes aéreas verdes da espécie Pterocaulon
sphacelatum (Labill.) Benth. & Hook f. ex F. Muell, indicadas na medicina tradicional
australiana para uso em resfriados, infecções respiratórias, feridas de pele e
doenças oculares, apresentou um flavonóide (crisosfenol) com alta capacidade de
inibição do polivírus tipo 1, representante da família Picornaviridae, família de RNA
vírus, nos quais são incluídos os rinovírus, principal causa de resfriados (SEMPLE et
al., 1999).
3.1.6 Atividade Citotóxica
Por meio de ensaio biológico com extrato diclorometano das partes aéreas de
P. polystachyum, MONGELLI (2000) e colaboradores detectaram atividade citotóxica
desta espécie pela inibição do crescimento de células tumorais. Fator este que
indica a presença de compostos que apresentam interação com o citoesqueleto das
células em estudo.
3.1.7 Atividade Inseticida
O uso popular de plantas aromáticas para afastar insetos vem de longa data.
Assim como, o uso de extratos vegetais no controle de insetos em hortas
domésticas. Estes métodos alternativos significam redução do uso de agrotóxicos,
menor agressão ao meio ambiente e conseqüente melhor equilíbrio do ecossistema.
Estudos relatados por CICCIA, COUSSIO e MONGELLI em 2000, mostram que
espécies do gênero Pterocaulon, como P. polystachyum, apresentam constituição
fitoquímica capaz de inibir a multiplicação das larvas do mosquito Aedes aegypti,
justificando o uso popular destas plantas.
27
3.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
A constituição química das espécies vegetais são sintetizadas e degradadas
por inúmeras reações anabólicas e catabólicas que compõem o metabolismo
vegetal. Este por sua vez pode ser dividido em primário, que reúne os processos de
formação de constituintes essenciais à vida e comuns aos vegetais em geral, e o
secundário, que se caracteriza pela produção e acumulação de substâncias não
comuns a todas as espécies, mas que são específicas formando elementos
diferenciados de um determinado metabolismo.
Neste conjunto de substâncias, os metabólitos secundários mais conhecidos
e estudados são os alcalóides, terpenos, flavonóides, cumarinas, lactonas, entre
outras (DI STASI, 1995).
3.2.1 Cumarinas
As cumarinas são moléculas simples que constituem uma importante classe
de substâncias naturais com expressiva atividade farmacológica (ASIRI, 2003).
Constituem uma classe de metabólitos secundários derivados do ácido cinâmico,
amplamente distribuídos no reino vegetal, podendo também ser encontrados em
fungos e bactérias.
A partir do ácido cinâmico, o ácido p-cumárico sofre um ataque na hidroxila na
posição para formando uma dienona. Em seguida ocorre uma lactonização na
posição b da dienona e subseqüente desidratação da lactona produzindo o
umbeliferono, conforme a figura seguinte (Figura 5).
28
FIGURA 5 – BIOSSÍNTESE DAS CUMARINAS
COOH
ÁCIDO CINÂMICO
OH
O
OH
OH
O
O
OH
O
O
OH
OH
H
O
O
OH
ÁCIDO para-CUMÁRICO
DIENONA
LACTONA
UMBELIFERONO
+OH
+H
TIROSINA 5%
FENILALANINA 95%
NH
2
COOH
FONTE: SILVA, 1978
A esses compostos atribui-se uma grande variedade de atividades biológicas,
como a antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória, antiespasmódica, antitumoral e
antioxidante, as quais podem estar relacionadas com a inibição da atividade de
enzimas, por exemplo, daquelas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico.
São amplamente distribuídas no reino vegetal e representam uma classe de
lactonas, com ação antipirética e inibidora da carcinogênese. Algumas cumarinas
como a escopoletina (Figura 6) são antiarrítmicas, vasodilatadoras, hipotensoras,
espasmolíticas e simpatolíticas (DI STASI, 1995).
29
FIGURA 6 – ESTRUTURA QUÍMICA DA ESCOPOLETINA
O
OH
CH3O
O
ESCOPOLETINA
Mais de 1.300 (mil e trezentas) cumarinas já foram isoladas de fontes
naturais, sendo que suas propriedades farmacológicas, bioquímicas e aplicações
terapêuticas dependem de seus padrões de substituição (EVANS, 1996).
As cumarinas livres, solúveis em álcool, são extraídas com solventes
orgânicos como o éter. As formas heterosídicas são ligeiramente solúveis em água.
Numerosas cumarinas são arrastadas por vapor d’água. Para sua purificação pode-
se atuar sobre as propriedades da lactona, como abertura e solubilização em meio
alcalino, fechamento do ciclo em meio ácido.
As cumarinas apresentam espectro UV característico, influído fortemente pela
natureza e posição dos substituintes, que se modificam profundamente em meio
alcalino. Sob a ação da luz UV, as cumarinas apresentam fluorescência variável, de
azul a amarela e a púrpura, ressaltada em presença de amoníaco.
O reconhecimento destes compostos é feito facilmente pelo método de CCD,
revelado sob luz UV e reativos como NEU (2-aminoetilbutirato). Podem ser avaliadas
por CLAE, CG-EM, e RMN de H
1
e C
13
. É possível ainda visualizar as manchas da
CCD por densitometria (BRUNETON, 1991).
30
3.2.2 Flavonóides
São, entre os compostos naturais, os mais disseminados em plantas,
registrando-se mais de 2000 (dois mil), tanto em estado livre como na forma de
glicosídeos. Os flavonóides têm por função descrita na medicina humana, serem
compostos antimicrobianos, inseticidas, antioxidantes, agentes alelopáticos e
inibidores de enzimas, largamente empregados na medicina atual. Além disso, são
31
FIGURA 7 – BIOSSÍNTESE DOS FLAVONÓIDES
OH
O
OH
OH
R
CHALCONA
AURONA
O
O
OH
OH
OH
R
H
O
O
OH
OH
OH
R
O
O
OH
OH
OH
FLAVONA
FLAVANONA
ISOFLAVONA
DIIDROFLAVONOL
FLAVONOL
O
OH
OH
FLAVAN-4-OL
FLAVAN-3-OL
FLAVAN-3,4-DIOL
O
+
OH
3-DESOXIANTOCIANIDINA
O
+
OH
OH
OH
R
OH
R
ANTOCIANIDINA
PROANTOCIANIDINA A
ANTOCIANIDINA-3-O-GLUCISÍDEO
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
R
H
OH
H
O
O
OH
OH
OH
R
OH
O
OH
OH
OH
OH
R
H
OH
H
H
O
OH
OH
OH
R
H
OH
H
O
OH
OCH
3
OH
O
OH
CH
3
OH
OH
OH
OH
OH
O
+
O
OH
OH
R
OH
R
Glu
FONTE: MANN, 1995
32
FIGURA 8 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS QUERCETINA E
MEDICARPINA
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
QUERCETINA
MEDICARPINA
O
O
OH
OCH
3
H
H
H
H
Junto com a vitamina C, a quercetina demonstrou efeitos sinérgicos na função
antioxidativa. O ácido ascórbico age como um redutor da oxidação da quercetina, de
maneira que combinados, a vitamina C permite uma sobrevivência maior do
flavonóide para cumprir suas funções antioxidativas. Por outro lado, a quercetina
protege a vitamina E da oxidação, com a qual também apresenta efeitos sinérgicos.
A ação antiinflamatória de muitos flavonóides está no seu mecanismo
antioxidante, como o da quercetina sobre a peroxidação lipídica, as enzimas
implicadas no metabolismo do ácido araquidônico. No mecanismo antioxidante sobre
a da quercetina, está envolvida a via do ácido araquidônico o qual implica uma
atividade antiinflamatória paralela (SILVA, 2002).
Além das atividades farmacológicas destacadas, os flavonóides são usados
também na produção de odores e sabores de alimentos e bebidas de origem vegetal
(DI STASI, 1995).
33
3.2.3 Triterpenos
Os triterpenos ocorrem significativamente no reino vegetal. Apresentam uma
grande diversidade quanto ao esqueleto e funcionalização que é
predominantemente oxigenada (Figura 9). Consistem grandemente de compostos
cuja estrutura é policíclica podendo ser tetracíclicos ou pentacíclicos que contém no
máximo um ou duas ligações duplas respectivamente. Exemplo dessas substâncias
são o Lupeol, a α-amirina, a β-amirina e a fridelina (OLEA; ROQUE, 1990).
FIGURA 9 – BIOSSÍNTESE DE TRITERPENOS PENTACÍCLICOS
+
ESQ U ALEN O
intermediário
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
CH
3
CH
3
H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
+
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
CH
3
CH
3
+
via
α - A m irin a
β - A m irin a
CH
3
O
C H
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
H+
Conform aç ão
cad eira-c adeira-c adeira-barc o
e outros triterpenos pentacíclicos
FON TE : M ANN , 1995
34
O taraxasterol (Figura 10) é um monoidroxi triterpeno encontrado em raízes
de Cynara cardunculus L.. Sua distribuição nas plantas não é muito expressiva, mas
possui atividade biológica muito interessante, valioso agente preventivo contra a
carcinogênese. Além disso, possui atividade antiinfamatória, antimicribiana e
antilipidêmica (GALLOVÁ, 2005).
FIGURA 10 – ESTRUTURA QUÍMICA DO TARAXASTEROL
CH
2
CH
3
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
TARAXASTEROL
3.3 COMPOSTOS IDENTIFICADOS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Pterocaulon
Estudos realizados por diversos autores revelam que grande parte das
espécies do gênero em questão apresenta em sua composição cumarinas,
flavonóides, terpenos e poliacetilenos.
Em 1968, JOHNS e colaboradores, isolaram a 6,7-dimetoxi-cumarina de
Pterocaulon sphacelatum. MARTINO e colaboradores, 1979, isolaram ácidos
cafeoilquínicos do extrato metanólico a 25% (vinte e cinco por cento) particionado
com éter de petróleo, clorofórmio e éter etílico de Pterocaulon virgatum e Pluchea
sagittalis.
Em 1999, DEBENEDETTI e colaboradores isolaram de espécies do gênero
Pterocaulon substâncias como ácido caféico, ácido clorogênico, ácido isoclorogênico
e ácido 3,4-dicafeoilquínico.
35
No estudo de P. purpurascens foram isoladas 02 (duas) cumarinas, a 4,6,7,8-
tetraoxigenada, denominada purpurenol e a trioxigenada denominada purpurasol (
DEBENEDETTI, 1992) (Figura 11).
FIGURA 11 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DE PURPURENOL E PURPURASOL
O
O
O
OMe
MeO
O
CH
3
OHCH
3
O
O
O
OMe
O
CH
3
OHCH
3
PURPURENOL PURPURASOL
Em MAGALHÃES et al. (1981), apresenta-se o isolamento de 08 (oito)
cumarinas do extrato etéreo das partes aéreas das espécies Pterocaulon balansae e
Pterocaulon lanatum. Foram isoladas, do extrato clorofórmico, 02 (duas) cumarinas
denominadas sabandinol e sabandinona por DEBENEDETTI et al., em 1981 (Figura
12).
A cumarina sabandinol, havia sido anteriormente isolada e caracterizada da
espécie Ruta pinnata (Rutaceae) em 1973 por GONZÁLEZ et al. apud HEEMANN,
2002. Estas mesmas estruturas identificadas na espécie P. virgatum por
DEBENEDETTI et al., em 1981, foram corrigidas por estes mesmos pesquizadores
em 1997.
36
FIGURA 12 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DE SABANDINOL E SABANDINONA
O
O
O
O
O
OH
OH
CH
3
CH
3
O
O
O
O
O
CH
3
O
CH
3
SABANDINOL SABANDINONA
Em 1997, DEBENEDETTI e colaboradores isolaram e identificaram da
espécie Pterocaulon virgatum (L.) DC. 02 (duas) novas cumarinas 5,6,7-
trioxigenadas a 5-(3-metil-2-buteniloxi)-6,7-metilenodioxicumarina) (1) e 5-metoxi-
6,7-metilenodioxicumarina (2) (Figura 13).
FIGURA 13 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS (1) E (2)
O
O
O
O
O
CH
3
CH
3
OMe
O
O
O
O
(1) (2)
No estudo do extrato bruto das partes aéreas verdes de P. sphacelatum,
SEMPLE (1999) e colaboradores isolaram e elucidaram a estrutura do flavonóide
crisosfenol, responsável pela atividade antiviral (Figura 14). Além disso, isolaram a
cumarina 6,7,8-trimetoxicumarina.
37
FIGURA 14 - ESTRUTURA QUÍMICA DO CRISOSFENOL
O
O
OH
OH
CH3O
OCH
3
OCH
3
OH
CRISOSFENOL
Em 2006, DOMINICK e colaboradores isolaram outros 03 (três) novas
trioxicumarinas (5-(2-hidroxi-3-metoxi-3-metilbutoxi)-6,7-metilenodioxicumarina (3);
5-(2-hidroxi-3-metil-3-buteniloxi)-6,7-metilenodioxicumarina (4); e 5-hidroxi-6,7-
metilenodioxicumarina) (5) (Figura 15).
FIGURA 15 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DAS CUMARINAS (3), (4) E (5)
O
O
O
O
O
OH
CH
3
CH
3
OMe
O
O
O
O
O
OH
CH
3
CH
2
OH
O
O
O
O
(3) (4) (5)
38
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
As partes aéreas de Pterocaulon lorentzii Malme foram coletadas nos meses
de janeiro de 2005, 2006 e 2007 no município de Piçarras, litoral de Santa Catarina.
A determinação botânica foi feita no herbário do Museu Botânico Municipal da
cidade de Curitiba, Estado do Paraná pelo biólogo Osmar do Santos Ribas. As
exsicatas depositadas neste local estão registradas sob o número 323448.
4.2 ESTUDOS FITOQUÍMICOS
Na investigação fitoquímica, as partes aéreas coletadas são submetidas à
seleção visual, excluindo-se material orgânico estranho e partes não sadias,
atacadas por insetos, fungos ou oxidadas. Em seguida fragmentadas e secas em
temperatura ambiente e à sombra. Após a secagem o material é armazenado em
recipiente apropriado e protegido da luz e umidade.
4.2.1 Ensaio Sistemático de Análise em Fitoquímica
Este ensaio analisa todas as características qualitativas dos princiais grupos
químicos que contituem os princípios ativos das drogas vegetais, utilizando em cada
caso reações de coloração e ou precipitação.
O ensaio sistemático de análise em fitoquímica foi realizado de acordo com
MOREIRA (1979) pelo método de maceração, extrato aquoso a 20% (vinte por
cento) e extrato hidroalcoólico a 20% (vinte por cento) do vegetal em estudo. A partir
desses extratos foi determinado o resíduo seco e a presença dos seguintes grupos
químicos:
• Extrato hidroalcoólico: glicosídeos flavônicos, alcalóides, esteróides e/ou
triterpenos, aminogrupos, glicosídeos cumarínicos e glicosídeos
antraquinônicos.
39
• Extrato aquoso: glicosídeos antociânicos, saponinas, glicosídeos
cianogenéticos taninos condensados e hidrolisáveis, aminogrupos e
flavonóides.
4.2.1.1. Preparo do extrato hidroalcoólico a 20%
A extração foi realizada por maceração de 40 g das partes aéreas de
Pterocaulon lorentzii Malme seco e triturado em 200 mL de álcool etílico a 70%
(setenta por cento) em banho-maria a 70º C por 90 minutos. Após 24 (vinte e quatro)
horas o macerado foi filtrado por meio de papel de filtro e volume completado com o
mesmo solvente até 200 mL. O extrato foi mantido sob refrigeração até a realização
dos ensaios fitoquímicos.
4.2.1.2. Preparo do extrato aquoso a 20%
Extração realizada em banho-maria a 70°C por 90 minutos de 40 g das partes
aéreas de Pterocaulon lorentzii Malme seco e triturado em 200 mL de água
destilada. Após 24 (vinte e quatro) horas o macerado foi filtrado por meio de papel
de filtro e volume completado com água destilada até 200 mL e mantido sob
refrigeração até a realização dos ensaios fitoquímicos.
4.2.1.3. Pesquisa de alcalóides
Esta pesquisa foi realizada utilizando-se os reativos gerais de alcalóides
(Mayer, Dragendorff, Bouchardart e Berthrand) da seguinte forma: levar à secura 50
mL de extrato hidroalcoólico em banho-maria a 70%, seguido de dissolução do
resíduo em 1 mL de etanol e 20 mL de ácido clorídrico a 1%. Transferir o extrato
clorídrico em 5 tubos de ensaio (1 mL em cada tubo) e adicionar em cada um os
reativos mantendo o quinto tubo como branco. O aparecimento de precipitado indica
reação positiva. Para contra-prova, 15 mL do extrato hidroalcoólico devem ser
transferidos para um funil de separação e alcalinizados com hidróxido de amônio até
40
pH 10. Efetuar extração com a mistura éter/clorofórmio (3:1) e submeter o extrato às
mesmas reações de alcalóides.
4.2.1.4. Pesquisa de ácidos orgânicos
O excedente da solução etérea da pesquisa de alcalóides foi levado à
secura e redissolvido em 5 mL de água destilada. O pH ácido desta solução indica a
presença de ácidos orgânicos.
4.2.1.5. Pesquisa de fenóis
Utilizar 2 mL da solução obtida na pesquisa de ácidos orgânicos adicionando
2 gotas de solução aquosa de cloreto férrico 1%. O desenvolvimento de coloração
confirma a presença de fenóis.
4.2.1.6. Pesquisa de flavonóides
Os flavonóides foram pesquisados pela reação de Shinoda, ou reação de
cianidina, com o extrato alcoólico total e com os extratos seletivos.
Em um tubo de ensaio transferir 5 mL de extrato hidroalcoólico e adicionar 200 mg
de limalha de magnésio e 1 mL de ácido clorídrico fumegante pelas paredes do tubo.
A formação de cor alaranjada indica presença de flavonóis.
4.2.1.7. Pesquisa de cumarinas
Transferir para um béquer 30 mL de extrato hidroalcoólico e acidificar até pH
1, concentrar em banho-maria a 60°C até 10 mL. Adicionar ao resíduo 5 mL de água
deionizada e extrair em funil de separação com éter etílico em 3 porções de 10 mL.
Reduzir o volume do extrato orgânico para 5 mL em banho-maria a 60°C. Colocar 3
gotas do extrato etéreo em 2 pontos de um papel de filtro previamente marcado,
deixar secar e adicionar 1 gota de hidróxido de sódio 1N em cada mancha. Cobrir
41
uma das manchas com moeda e observar sob luz UV de ondas longas. A
fluorescência azul ou verde-amarelada indica reação positiva.
4.2.1.8. Pesquisa de antraquinonas
Foi levado à fervura 20 mL do extrato alcoólico por 15 minutos sob refluxo
adicionando 3 mL de ácido sulfúrico 10%. Após o resfriamento transferir para um
funil de separação junto com 30 mL de água destilada e extrair 3 (três) vezes com 10
mL de tolueno. O extrato toluênico é concentrado a 10 mL e transferido para um
tubo de ensaio. Agitar com 10 mL de solução reagente de hidróxido de sódio. O
aparecimento de coloração rósea ou avermelhada indica a presença de
hidroxiantraquinonas e naftoquinonas
4.2.1.9. Pesquisa de esteróis e triterpenos
Foram evaporados 20 mL do extrato alcoólico e extrair com 3 (três) vezes
sucessivas de 5 mL de diclorometano. Concentrar os extratos obtidos a um volume
de 3 mL e transferir para um tubo de ensaio, onde foram adicionados 2 mL de
anidrido acético. Cautelosamente adicionar 3 gotas de ácido sulfúrico. O
desenvolvimento de coloração azul passando a verde demonstra a presença de
esteróides e /ou triterpenos
.
4.2.1.10. Pesquisa de heterosídeos antociânicos
Foram separados 3 porções de 5 mL do extrato aquoso em 3 tubos de ensaio
e neutralizá-los com solução de hidróxido de potássio 5% até obter os pHs 5,5 (pH
do extrato aquoso), 7,0 (neutro) e 9,5 (básico). Mudança na coloração das porções
neutralizadas indica presença de heterosídeos antociânicos.
42
4.2.1.11. Pesquisa de heterosídeos saponínicos
Agitar os 3 tubos obtidos no ensaio de heterosídeos
43
gotas de cloreto férrico 1%, houver formação de precipitado escuro ou azul, indica a
presença de taninos hidrolisáveis.
4.2.1.15. Pesquisa de aminogrupos
Concentrar 10 mL de extrato aquoso à metade sob temperatura de 50°C. Em
um papel de filtro, depositar 5 gotas deste extrato concentrado e após secas,
nebulizar com solução butanólica de ninhidrina. Aquecer em estufa a 90-100°C por
15 minutos. Se houver o aparecimento de cor azul-violácea indica a presença de
aminogrupos.
4.2.1.16. Pesquisa de ácidos voláteis
Acidificar 10 mL do extrato aquoso com ácido sulfúrico 1N e ferver em um
tubo de ensaio em banho-maria. Com papel indicativo de pH medir a acidez dos
vapores. A coloração ácida indica a presença de ácidos voláteis.
4.2.1.17. Pesquisa de ácidos fixos
Transferir 20 mL de extrato para um balão de destilação juntamente com 2 mL
de solução aquosa de hidróxido de sódio 1N. Levar o conteúdo ao refluxo por 30
minuto, resfriar e acidular com ácido sulfúrico 1N e extrair 3 vezes com 10 mL de
éter etílico. Reunir os extratos etéreos, filtrar e levar à secura. Aquecer o resíduo
durante 10 minutos a 100°C e após, adicionar 5 mL de solução de hidróxido de
amônio 1N, filtrar novamente e transferir para um papel de filtro 3 gotas de modo a
obter uma mancha de 1 cm de diâmetro. Secar o papel em estufa a 100°C por 10
minutos e então tratá-lo com o Reagente de Nessler. O desenvolvimento de
coloração indica a presença de ácidos fixos.
44
4.2.2 Determinação do Teor de Sólidos
A partir da concentração do extrato total 1 mL deste foi colocado em placa de
petri para determinação do eor de sólidos. Foram feitas cinco repetições levando as
placas previamente pesadas à estufa. O teor foi determinado quando a massa da
placa passou a ser constante nas pesagens. Com estes valores foi calculado teor de
sólidos em relação à quantidade de material vegetal utilizado.
4.2.3 Extração de Óleo Essencial
Foram submetidos à hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger, modificado
por WASICKY (1963) 150 g de material seco, fragmentado e estabilizado, e anotado
o rendimento bruto de óleo extraído após o funcionamento ininterrupto do aparelho
por um período de 6 horas.
4.2.4 Obtenção do Extrato em Aparelho de Soxhlet Modificado
As amostras de planta seca, estabilizada e moída foram pesadas e extraídas
em aparelho de Soxhlet modificado segundo CARVALHO, 2001 (Figura 16).
A um aparelho de Soxhlet são conectados a um condensador de bolas e a um balão
de fundo chato com capacidade de 3 L contendo pérolas de vidro. A este sistema é
adicionado álcool etílico 96°GL até aproximadamente 1500 mL. Todo o sistema é
levado ao aquecimento em manta aquecedora e deixado em refluxo por 6 horas, de
modo que o extrato alcoólico seja obtido por extração a frio em meio solvatado
(CARVALHO, 2001).
Para a utilização deste equipamento, procedeu-se da seguinte forma: a placa
porosa foi cuidadosamente posicionada sobre os suportes de vidro do aparelho e
sobre ela foi colocado algodão para conter o material vegetal. Sobre este foi
colocado cerca de 2 kg de material vegetal seco, estabilizado e fragmentado e 1000
mL de etanol 96°GL para maceração. O líquido extrator contido no balão era
aquecido e evaporava, condensando a 60°C no condensador de bolas. Desta
maneira, o solvente condensado atravessa a massa vegetal, permitindo a extração.
45
No momento em que o menisco do extrato no canal lateral do Soxhlet atingisse o
ponto de refluxo, o extrato era descarregado no balão por sifonamento e o processo
era repetido até inúmeras vezes até se completarem as 6 horas.
Este procedimento previne a degradação térmica de substâncias no balão,
uma vez que a quantidade de líquido extrator é constante no sistema e é capaz de
solvatar os compostos presentes.
FIGURA 16 – APARELHO DE SOXHLET MODIFICADO
FONTE: MIGUEL, 2006
As porções foram reunidas e concentradas em evaporador rotativo até 300
mL, formando assim o extrato bruto usado para a obtenção das frações por partição
líquido-líquido com solventes de diferentes polaridades, na seguinte ordem: n-
hexano, clorofórmio e acetato de etila. Todos os solventes usados foram de padrões
analíticos (PA).
46
4.2.5 Obtenção das Frações
A partição líquido-líquido deu-se em ordem crescente de polaridade (do
solvente menos polar para o mais polar) utilizando aparelho de Soxhlet modificado,
segundo CARVALHO, 2001 (Figura 17). O aparelho foi conectado a um
condensador de bolas e a um balão de fundo chato de capacidade para 150 mL,
com pérolas de vidro. Todo o sistema foi levado ao aquecimento em chapa
aquecedora e deixado em refluxo contínuo por 6 horas.
FIGURA 17 – APARELHO DE SOXHLET ADAPTADO PARA PARTIÇÃO LÍQUIDO-
LÍQUIDO
FONTE: DAVET, 2005.
Para a extração com solventes mais densos que o extrato bruto foi necessário
utilizar cartucho de vidro e funil adaptado até a base do cartucho em aparelho de
Soxhlet convencional. Neste caso, o solvente contido no balão é aquecido e
evaporado e, após condensação, goteja dentro do funil, passando por dentro do
cartucho. Assim, o extrato particionado de baixo para cima, promove o arraste de
substâncias por afinidade. Duas aberturas na parte superior do cartucho permitem a
saída do solvente (depois da extração), que irá preencher o espaço entre o cartucho
e as paredes do Soxhlet até que o menisco alcance o ponto de refluxo do canal
lateral do aparelho e o solvente com as substâncias extraídas sejam descarregadas
47
sobre o conteúdo do balão. Dessa forma, todo o extrato é concentrado no balão,
visto que o líquido extrator evapora puro para ser condensado e repetir a extração.
Cada processo de partição dura 6 horas. Em casos de solventes mais
densos, o aparelho de Soxhlet é modificado de modo a impedir o refluxo do solvente
para o balão. A dilatação do canal lateral do Soxhlet é retirada e o canal é alargado
na porção superior. Desta forma, quando o menisco atinge a curva do canal, não há
refluxo, mas gotejamento constante. Nas duas situações, a partição se dá
lentamente, com o máximo de contato possível.
Todas as frações são levadas à secura em evaporador rotativo a 40°C e 600
mmHg e os resíduos solubilizados em 100 mL de metanol tendo em vista sua grande
capacidade de solvatação e por permitir a precipitação de diversas substâncias. É
realizado o resíduo seco para cada fração.
4.2.6 Obtenção do Resíduo Seco
Os resíduos secos das frações e do extrato bruto são obtidos da seguinte
forma: 10 mL de cada fração e do extrato bruto são pipetados em pipeta volumétrica
e transferidos para placas de Petri previamente taradas. A placa é deixada em estufa
a 105°C até peso constante (aproximadamente 1,5 horas). A diferença de massa
entre a placa cheia e vazia fornece a quantidade de resíduo em 10 mL de fração.
4.2.7 Isolamento das Substâncias
4.2.7.1 Cromatografia líquida em coluna
O processamento das frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e
metanólica é feito pela redissolução de cada fração concentrada em metanol e
incorporada a 6 g de Sílica-gel 60 - Merck
®
- Art. 7734 – com tamanho de partícula
0,063-0,2mm, 70-230 mesh ASTM (cerca de uma vez o seu peso seco) para a
formação da pastilha de sílica. Essa pastilha é submetida à cromatografia líquida em
coluna de 30cm de altura por 3 cm de diâmetro, empacotada com 30 g de Sílica-gel
48
60 (0,063-0,200mm) Merck
®
. A amostra é eluída em sistema de solventes com
gradiente de polaridade crescente, sendo utilizados hexano, acetato de etila e
metanol. O controle de eluição é feito com lâmpada de luz UV à 360 nm. As
características das frações recolhidas são observadas por cromatografia em camada
delgada, utilizando-se cromatoplacas de Sílica-gel 60 F
254
Merck
®
e visualizadas
com lâmpada UV nos comprimentos de onda de 360 nm. As frações semelhantes
são reunidas redissolvendo-as em clorofórmio e metanol.
4.2.7.2 Cromatografia em camada delgada
Para as análises por cromatografia em camada delgada são utilizadas placas
de Sílica-gel 60 F
254
Merck
®
e a visualização em lâmpada UV nos comprimentos de
onda de 360 nm.
As fases móveis ainda estão sendo testadas para melhor visualização dos
compostos, como flavonóides, cumarinas e esteróides. O principal reativo utilizado
na revelação de flavonóides é o Reativo de NEU (2-aminoetilbutirato).
4.2.8 Elucidação Estrutural
4.2.8.1 Espectroscopia de absorção no ultravioleta
As substâncias isoladas são submetidas à análise de luz ultravioleta próximo
e os espectros registrados em espectrofotômetro Shimadzu UV 1601 no intervalo de
200 a 500 nm.
4.2.8.2 Espectroscopia de absorção em infravermelho
Os espectros de infravermelho são obtidos com amostras preparadas em
pastilhas de brometo de potássio anidro (KBr) comprimidas em equipamento Bomem
49
– Hartmann & Braum MB-Serie do Departamento de Química da Universidade
Federal do Paraná.
4.2.8.3 Espectroscopia de ressonância nuclear magnética de
1
H e
13
C
A espectrometria de RMN
1
H em equipamento AC 300 Bruker® a 300 MHz, a
espectroscopias de RMN
13
C e 175 MHz DEPT (Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer ou Intensificação do Sinal sem Distorção por Transferência de
Polarização) foram realizado no Laboratório de RMN do Departamento de Química
da Universidade Estadual de Maringá.
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
No teste para o potencial antimicrobiano são empregados os Métodos de
Bioautografia, adaptado das modificações propostas por Romeiro (2001), e Método
da Concentração Minima Inibitória (CMI), de acordo com KONEMAN et al. (1993)
buscando-se detectar e identificar substâncias bioativas.
Para ambos os testes são utilizadas cepas comerciais dos microorganismos
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Escherichia coli (ATCC 8739) todas da
marca NewProve®.
As amostras utilizadas foram o Extrato Total (ET), Fração Acetato de Etila
(FA), Fração Clorofórmio (FC), Fração Hexânico (FH), Substâncias isoladas FH1,
FC1 e FC2.
4.3.1 Método da Concentração Mínima Inibitória (CMI)
Utilizou-se o método de diluição em caldo para a determinação da CMI dos
extratos e das substâncias isoladas das partes aéreas de Pterocaulon lorentzii
Malme. Para este estudo foram inoculados microorganismos em meios de cultura
com amostras a serem testadas em diversas diluições. Após tempo necessário para
incubação em temperatura adequada, foram efetuadas as leituras das
50
concentrações inibitórias mínimas procurando o primeiro tubo sem crescimento do
microorganismo.
4.3.1.1 Prepado do inoculo
As cepas bacterianas em teste foram repicadas em caldo tríptico de soja
(Casoy) e incubadas à 35°C por 24 horas. Após este período os tubos os
microorganismos contidos em 10 mL de caldo foram comparados à turbidez do tubo
0,5 da escala Mac Farland.
Em seguida 2 mL deste caldo foram diluídos em 100 mL de solução estéril de
Tween 80 a 2% em água destilada.
4.3.1.2 Preparo das amostras e do teste
Para cada amostra foram preparados nove tudos, do primeiro ao sétimo foram
feitas diluições nas seguintes proporções: 1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64. Cada
tubo recebeu 1 mL da suspensão de bactérias. O oitavo tubo foi usado como
controle positivo em que foi colocado apenas a suspensão de bactérias e o meio
sem a amostra teste. E o tubo nove foi usado pra controle negativo em que não foi
colocado a suspensão de bactérias, apenas o meio e a amostra. Este procedimento
foi realizado em duplicata e em fluxo laminar. Os tubos foram incubados em estufa à
35°C durante 24 horas. Decorrido este período procedeu-se a leitura dos tubos.
4.3.2 Método de Autobiografia
O método de autobiografia consiste em fundir meio semi-sólido de cultura,
adicionando a ele células de um organismo-teste e, antes da solidificação, atomizar
a superfície de um cromatograma, incubando-o a seguir em câmara úmida,
previamente esterilizada por autoclave. O organismo crescerá em toda superfície do
meio, menos nos locais onde existir uma mancha correspondente a uma substância
com atividade antimicrobiana (ROMEIRO, 2001).
51
4.3.2.1 Preparo do inoculo
As suspensões bacterianas são padronizadas em solução salina segundo a
escala 0,5 de MacFarland, (Bier, 1994).
4.3.2.2 Preparo das amostras e do teste
Em câmara de fluxo laminar, aplica-se 15 µL da amostra em placa de Sílica-
gel 60 F
254
Merck
®
utilizada em CCD de dimensões 2,5 x 5,0 cm. Realiza-se a
cromatografia com fase móvel Acetato de Etila/ Acetona/ Água (25/8/2) específica
para as amostras. As cromatoplacas são secas em est
52
Como controles positivos de inibição do crescimento bacteriano são utilizados
discos de gentamicina 10 µg e, como controle negativo foram incubadas placas
corridas em branco, sem amostra. Para o controle da esterilidade do meio e das
placas foi incubada uma cromatoplaca e o meio Mueller-Hinton sem o inóculo).
Todas as placas são incubadas a 35°C e analisadas após 24 horas. As
substâncias cromatograficamente separadas que exibirem atividade antibacteriana
serão reconhecidas nos bioautogramas por meio da formação dos halos de inibição
ao redor de suas bandas. O teste é realizado em duplicata.
4.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ALELOPÁTICA
A alelopatia procura determinar o efeito de uma planta doadora sobre uma
planta receptora (MALHEIROS; PERES, 2001). No presente trabalho, buscou-se
determinar possível atividade alelopática do Extrato Total (ET), Fração Acetato de
Etila (FA), Fração Hexânica (FH), as substâncias Taraxasterol (T), Quercetina (Q) e
Sabandinol (S) isoladas das partes aéreas de P. lorentzii sobre sementes de Lactuca
sativa (conhecida como alface, cultivar Babá de verão, da empresa Isla sob código
026, com 99% de germinação detectada através de teste padrão de germinação).
Paralelamente ao ensaio da atividade alelopática da espécie em estudo, fez-se
ensaio utilizando água destilada e metanol, para posterior verificação de possível
influência do solvente (metanol) empregado no preparo e na diluição das amostras
utilizadas no ensaio alelopático (DIAS, 2005).
A escolha da semente de L. sativa foi feita por apresentar germinação rápida
e uniforme (DIETZ; WINTERHALTER, 1996), ser pequena, possuir grande superfície
de contato, sendo sensível ao meio que a rodeia e não requerer nenhuma
manipulação além do contato no meio (MALHEIROS; PERES, 2001).
Foram preparadas 7 soluções dos extratos brutos etanólicos e respectivas
frações citadas anteriormente em concentrações decrescentes (0,8 mg, 0,4 mg, 0,2
mg, 0,1 mg, em 2 mL de metanol) em duplicata. Para o preparo destas soluções
utilizou-se uma solução-mãe preparada com extratos e frações secas a 50 ºC em
banho-maria e diluídas em metanol na proporção 1 mg/mL. Com intuito de obter
dissolução completa da amostra a ser analisada, escolheu-se metanol como
53
solvente.
Para as caixas gerbox foram recortados papel de filtro (Whatman nº. 6) e
embebidos com as soluções preparadas com as devidas concentrações e colocados
em estufa a 60ºC por 24 horas para total evaporação do solvente. Em câmara de
fluxo laminar, os papéis de filtro previamente secos foram colocados nos gerbox e
umedecidos com 3 mL de água destilada. A água destilada foi utilizada em
quantidade segundo KRZYZANOWSKI, VIEIRA, FRANÇA NETO (1999), ou seja, de
duas a três vezes o peso do papel. Após preparo das caixas gerbox, colocou-se 10
sementes de Lactuca sativa em cada caixa em quatro repetições.
Os gerbox foram protegidos da luz com papel alumínio e colocados em
germinador de câmara à temperatura de 20 ºC.
Para cada concentração prepararam-se duas caixas, uma para estudo da
germinação e outra para estudo do crescimento. O ensaio de crescimento é utilizado
por ser geralmente mais sensível ao ensaio de germinação (MALHEIROS; PERES,
2001).
Para controle utilizou-se água destilada sob as mesmas condições do
ensaio.
Para análise estatística empregou-se o programa SISVAR (FERREIRA,
2000). A verificação das diferenças de médias estatisticamente significantes foi
realizada por meio do teste de Scott-Knott em nível de 5% de probabilidade. O teste
de Scott-Knott foi escolhido por ser claro, objetivo e isento de ambigüidades
(presentes na maioria dos testes de comparações múltiplas). O tratamento foi
considerado efetivo quando todas as repetições estiveram no mesmo grupo de
médias (DIAS, 2005)
4.4.1 Germinação
Na análise da germinação é necessário observar não somente as condições
adequadas do desenvolvimento do eixo embrionário, mas deve-se ter em mente as
fases que ocorrem antes da retomada do desenvolvimento, que se iniciam com a
colocação da semente em substrato adequado e absorção de umidade (CARVALHO
e NAKAGAWA, 1988). A primeira fase se caracteriza pelo aumento da taxa de
respiração, início da degradação de substâncias de reserva como carboidratos,
54
proteínas e lipídios e a transformação destas substâncias em outras de menor
tamanho para facilitar o transporte. Num segundo momento ocorre o transporte das
substâncias transformadas, diminuição da absorção de água e crescimento lento da
intensidade respiratória. A partir de um teor de umidade (50 a 60% para as
cotiledonares), a semente retorna à intensa absorção de água e respiração,
iniciando-se crescimento visível do eixo embrionário e a terceira fase. Substâncias
desdobradas na primeira fase e transportadas na segunda fase são reorganizadas
em substâncias complexas que, na terceira fase permitem o crescimento do eixo
embrionário.
Desta forma, qualquer alteração ocorrida na germinação influenciada por uma
outra planta, pode ser decorrente da interferência em todas as fases da germinação
ou especificamente em uma fase.
Durante a germinação fez-se leitura diária no mesmo horário abrindo as
caixas em fluxo laminar. As sementes que germinaram foram retiradas diariamente
até o sétimo dia. As sementes foram consideradas germinadas conforme descrito
por DE FEO, DE SIMONE e SENATORE (2002) e ADEGAS, VOLL e PRETE (2003),
55
4.4.2 Crescimento
A avaliação do crescimento é feita pela mensuração das radículas e dos
hipocótilos de Lactuca sativa, verificação da presença de folíolos após tratamento
com diferentes amostras e comparar os resultados aos obtidos com controle. O
hipocótilo e a radícula são originados a partir do eixo embrionário que é a parte vital
da semente, este contém tecido meristemático em suas duas extremidades,
apresentando condições de crescimento para dois sentidos, o das raízes (radícula) e
o do caule (hipocótilo), originando plântula com condições de fixação ao solo e de
fotossintetisar substâncias necessárias (CARVALHO; NAKAGAWA, 1983).
A mitose e o crescimento das células dá seguimento ao crescimento do eixo
embrionário. Aumentando-se inicialmente o teor de água, as células sofrem certa
expansão com posterior formação de novas células. Os processos de divisão celular
e de expansão dependem da energia de moléculas simples (resultantes da
degradação), de substâncias complexas armazenadas nos tecidos de sustentação,
de substâncias estruturais e das novas células. Estes processos envolvem sínteses,
tais como de enzimas, lipídios, proteínas e componentes das paredes celulares
(CARVALHO; NAKAGAWA, 1988).
Alterações ocorridas no crescimento da radícula e do hipocótilo de Lactuca
sativa podem ser oriundas do processo de germinação ou dos processos envolvidos
na fase do crescimento do eixo embrionário. A leitura do crescimento foi realizada
apenas ao último dia de experimento com abertura das caixas e retirada das
plântulas uma a uma (com auxílio de uma pinça) para medir em papel milimetrado o
comprimento da radícula e do hipocótilo.
Os resultados das leituras de crescimento foram submetidos ao Teste de
Scott-Knott para comparação das médias que também foram comparadas em
porcentagem, considerando-se o tratamento controle com água destilada 100%.
56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se pelas análises cromatográficas preliminares que as frações da
espécie em estudo apresentam substâncias com perfil cromatográfico de esteróides,
cumarinas e flavonóides, característica observada nas demais espécies do gênero
Pterocaulon.
5.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS
5.1.1 Ensaio Sistemático de Análise em Fitoquímica
Os resultados do Ensaio Sistemático de Análise em Fitoquímica podem ser
observados no Tabela 2:
TABELA 2 – ENSAIO SISTEMÁTICO DE ANÁLISE EM FITOQUÍMICA DE
Pterocaulon lorentzii MALME
REAÇÃO
(+) (-) (+) (-) (+) (-)
PESQUISA
EXTRATO
ALCOÓLICO
20%
EXTRATO
AQUOSO
20%
1 2 3
ÁCIDOS ORGÂNICOS X + + +
ALCALÓIDES X - - -
FENÓIS X + + +
FLAVONÓIDES X ++ +++ ++
CUMARINAS X +++ +++ +++
ANTRAQUINONAS X - -
ESTERÓIS E TRITERPENOS X ++ ++ ++
HETEROSÍDEOS ANTOCIÂNICOS X + + +
HETEROSÍDEOS SAPONÍNICOS X + ++ ++
HETEROSÍDEOS CIANOGENÉTICOS X - - -
GOMAS, TANINOS E MUCILAGENS X - - -
TANINOS X + ++ +
AMINOGRUPOS X + + +
ÁCIDOS VOLÁTEIS X - - -
ÁCIDOS FIXOS X + - +
Observações - Resultado Negativo
+ Resultado Fracamente Positivo
++ Resultado Positivo
+++ Resultado Fortemente Positivo
57
5.1.2 Determminação de Teor de Sólidos
O teor de sólidos obtido para o extrato total foi de 30, 25%.
5.1.3 Óleo Essencial
Pelo processo de hidrodestilação da espécie Pterocaulon lorentzii Malme, não
foi recolhido material suficiente para sua análise. Observa-se desse modo que a
espécie não apresenta como característica a presença de óleo essencial, sendo
necessária uma quantidade grande de material para possibilitar sua extração.
5.1.4 Análise Cromatográfica
Conforme os resultados da análise preliminar, as partes aéreas de
Pterocaulon lorentzii Malme apresentam uma variedade de substâncias, mas são
mais expressivas as cumarinas, os flavonóides e os esteróides, o que confirma os
dados indicativos apresentados na literatura para o gênero Pterocaulon. Estes
resultados também conferem com as razões pelas quais a espécie é utilizada na
medicina popular, no uso antiinflamatório e antimicrobiano.
O extrato bruto das partes aéreas de Pterocaulon lorentzii Malme, foi obtido a
partir de 2263 g de material estabilizado e moído. Após a filtração, obteve-se a
porção sólida (sedimentada) e a porção solúvel. Da porção sólida foram obtidas as
frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e metanol. O rendimento é mostrado
na tabela 3.
58
TABELA 3 – RENDIMENTO DAS FRAÇÕES EXTRAÍDAS POR SOXHLET
FRAÇÕES EXTRAÍDAS RENDIMENTO EM (g) RENDIMENTO EM (%)
Hexânica 0,89 0,28
Clorofórmica 5,49 6,54
Acetato de Etila 13,05 6,10
Alcoólica 125,46 23,67
Total 144,89 36,59
5.1.4.1 Fração hexano
A partir da fração hexano da porção sedimentada foi realizada a
cromatografia líquida em coluna com eluente hexano/acetato de etila com um
gradiente de 5% (cinco por cento). Foram recolhidas 29 frações de
aproximadamente 15 mL cada. Estas foram reunidas de acordo com semelhanças
observadas na análise em CCD.
Com a concentração destas frações, houve a aparecimento de cristalizações
entre as frações recolhidas. A averiguação destes cristaaçra.618(s)0.348877(t)-1.805377.999]TJ-309.12 -1.80416(C)2.50313(C)2.50313(D)J-309.12 -23.5943(m)o.61075(e)-3.61075(s)0t1.7494(f)-1.80538(r)-o.61075(e)-u6.3753(e)-3..4606( )-301.593(e)-3.61075( )277.9(c)]TTJ-336 -20.3.60831(p)-3.60831(r)-1.80538(e)-3.60831(s)0.349487(e)-n.76221(a)-3.60831(ç)03.60831(a)-3.6008367 dequatrosubtânciasqde40.348877(,)-1.88083679-64 Td[(a)-3.60831(u)ó.60831(b)-3.60831714-1.88083679-p.80416(q)-3.1.568(d)- 0 Td[(r)13.2232(i)-f.60831(t)18.5593(i)-17.8331(s)03.60831(a)-3.60831(ç)0.36083494
59
em 2988; 2936 e 2856 cm
-1
características de metilas e metilenos alifáticos. E outra
absorção muito intensa em 1724 cm
-1
que caracteriza a presença de carbonila
(Figura 18).
FIGURA 18 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DO 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL
61
FIGURA 19 – ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL
62
c) Espectro de RMN de
13
C do 3-O-Acetil-pseudotaraxasterol
Os deslocamentos químicos atribuídos pelos espectros de
13
C na freqüência
de 75 MHz em CDCl
3
, estão indicados na Tabela 4 e Figura 20 e 21.
TABELA 4 – DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RNM DE
13
C PARA
COMPARAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 3-O-ACETIL-TARAXASTEROL (HEEMANN,
2002) E PSEUDOTARAXASTEROL (MAHATO et al., 1994) COM O 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL
Carbonos 3-O-acetil-taraxasterol Pseudotaraxasterol FH1
literatura literatura experimental
1 38.4 38,8 38,6
2 23.7 27,4 23,9
3 80.9 79,0 81,2
4 37.8 38,8 38,0
5 55.4 55,3 55,6
6 18.2 18,3 18,3
7 34,0 34,3 34,5
8 40.6 41,1 41,3
9 50.4 50,4 50,5
10 37.0 37,1 37,2
11 21.4 21,6 21,5
12 26.1 27,6 27,9
13 39.1 39,2 39,4
14 42.3 42,3 42,4
15 26.6 27,0 27,2
16 38.3 36,6 36,9
17 34.5 34,4 34,4
18 48.6 48,8 48,9
19 39.3 36,6 36,5
20 154.6 138,8 140,1
21 25.6 118,9 119,1
22 38.8 42,2 42,5
23 27.9 28,8 28,2
24 16.3 15,4 16,5
25 16.5 16,3 16,7
26 15.9 16,1 16,2
27 14.7 14,8 14,9
28 19.5 17,7 17,9
29 25.5 22,5 22,7
30 107.1 21,7 21,8
O-CO-CH
3
171,0 - 171,3
63
FIGURA 20 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL
64
FIGURA 21 - ESPECTRO DE RMN DE DEPT E
13
C DO 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL
65
Os dados comparativos entre o 3-O-acetil-taraxasterol, o pseudotaraxasterol e
a substância FH1 mostra que na substância isolada os deslocamentos químicos dos
carbonos 1 ao 3 são correspondentes aos mesmos carbonos do 3-O-acetil-
taraxasterol, somando a este fato, δ 171,3 evidencia a presença de um grupamento
éster. A presença dos carbonos oleníficos com sinais δ 140,1 (C20) e δ 119,1 (C21)
são compatíveis com o esqueleto do pseudotaraxasterol.
As observações espectrais e as referências da literatura (MAHATO et al.,
1994) mostram que a substância FH1 corresponde ao triterpeno 3-O-Acetil-
pseudotaraxasterol (Figura 22).
FIGURA 22 – ESTRUTURA QUÍMICA DO 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL
10
5
1
4
2
3
8
7
9
6
13
14
12
11 17
16
18
15
21
22
20
19
CH
3
CH
3
29
O
CH
3
23
CH
3
24
CH
3
25
CH
3
27
CH
3
26
CH
3
O
CH
3
28
3-0-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL
66
5.1.4.1.2 Análise dos cristais de taraxasterol e pseudotaraxasterol
A análise dos cristais da mistura de taraxasterol e pseudotaraxasterol revelou
a presença de dois triterpenos.
a) Espectro de RMN de
1
H
A mistura de taraxasterol e pseudotaraxasterol apresentou em seu espectro
de RMN
1
H (300 MHz em CDCl
3
) uma grande quantidade de sinais entre δ 0,70 e δ
1,75, referntes a grupos metílicos e um multipleto entre δ 3,12 e δ 3,22 referentes
aos hidrogênios hidroximetínicos, considerando que o triterpeno pseudotaraxasterol
tem uma hidroxila em β na posição 3. Os hidrogênios olefínicos também são
observados, aparecendo como dubleto entre δ 4,55 e δ 4,66. A freqüência utilizada
foi de 300 MHz em CDCl
3.
(Figura 23).
Os hidrogênios olefínicos também são observados, aparecendo como dubleto
entre δ 4,55 e δ 4,66.
67
FIGURA 23 – ESPECTRO DE RMN DE
1
H DA MISTURA DE TARAXASTEROL E
PSEUDOTARAXASTEROL
68
b) Espectro de RMN de
13
C
Os deslocamentos químicos atribuídos pelos espectros de
13
C na freqüência
de 300 MHz em CDCl
3
, estão indicados na Tabela 5 e Figura 24 e 25.
TABELA 5 – DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE
13
C PARA
PSEUDOTARAXASTEROL E TARAXASTEROL ISOLADOS COMPARADOS COM
OS DA LITERATURA (MAHATO et al., 1994)
Carbonos Pseudotaraxasterol Taraxasterol
literatura experimental literatura experimental
1 38,8 38,9 38,8 38,9
2 27,4 27,6 27,4 27,6
3 79,0 79,2 79,0 79,2
4 38,8 38,9 38,8 38,9
5 55,3 55,4 55,4 55,4
6 18,3 19,5 18,3 19,5
7 34,3 34,4 34,1 34,4
8 41,1 41,2 40,9 40,2
9 50,4 50,6 50,5 50,6
10 37,1 37,3 37,1 37,3
11 21,6 21,8 21,4 21,8
12 27,6 27,8 26,6 27,8
13 39,2 39,4 39,2 39,4
14 42,3 42,3 42,0 42,3
15 27,0 27,2 26,6 27,2
16 36,6 36,5 38,3 38,9
17 34,4 34,4 34,5 34,6
18 48,8 48,8 48,7 48,5
19 36,6 36,9 39,4 39,4
20 138,8 140,1 154,6 151,2
21 118,9 119,1 25,6 22,7
22 42,2 42,4 38,9 38,9
23 28,8 29,9 28,8 29,9
24 15,4 15,6 15,4 15,6
25 16,3 16,6 16,8 16,5
26 16,1 16,2 15,9 15,7
27 14,8 14,9 14,8 14,9
28 17,7 17,9 19,5 19,5
29 22,5 22,7 25,5 25,3
30 21,7 21,8 107,7 109,5
69
No espectro de RMN
13
C a presença dos carbonos olefínicos foi facilmente
identificada com os sinais δ 140,1 (C20) e δ 119,1 (C21) para o pseudotaraxasterol e
δ 151,2 (C20) e δ 22,7 (C21) para o taraxasterol (MAHATO et al., 1994).
FIGURA 24 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DA MISTURA DE TARAXASTEROL E
PSEUDOTARAXASTEROL
70
FIGURA 25 - ESPECTRO DEPT 135° DE RMN DA MISTURA DE TARAXASTEROL
E PSEUDOTARAXASTEROL
71
A presença dos sinais δ 140,1 (C20) e δ 119,1 (C21), e δ 151,2 (C20) e δ
109,1 (C30) mostra claramente a mistura entre dois triterpenos distintos, um com a
dupla endocíclica (pseudotaraxasterol) e outro com a dupla exocíclica (taraxasterol)
(Figura 26).
FIGURA 26 - EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR DE
13
C DA MISTURA DE TARAXASTEROL E
PSEUDOTARAXASTEROL
72
Com as evidências mostradas pode-se atribuir à mistura de triterpenos de FH2 como
sendo as substâncias Taraxasterol e Pseudotaraxasterol (Figura 27).
FIGURA 27 – IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DA COMPOSIÇÃO DE
TRITERPENOS PRESENTES NOS CRISTAIS DE FH2
10
5
1
4
2
3
8
7
9
6
13
14
12
11 17
16
18
15
21
22
20
19
CH
2
CH
3
29
OH
CH
3
23
CH
3
24
CH
3
25
CH
3
27
CH
3
26 CH
3
28
TARAXASTEROL
10
5
1
4
2
3
8
7
9
6
13
14
12
11 17
16
18
15
21
22
20
19
CH
3
CH
3
29
OH
CH
3
23
CH
3
24
CH
3
25
CH
3
27
CH
3
26 CH
3
28
PSEUDOTARAXASTEROL
5.1.4.1.3 Análise dos cristais de undecan-1-ol
A análise dos cristais de undecan-1-ol mostrou os seguintes dados:
a) Espectro de RMN de
1
H
O espectro de RMN de
1
H foi obtido em CDCl
3
a 300 MHz. Este registrou
deslocamentos apenas na região conpreendida entre 0,8 e 2,4 ppm. Um triplete
centrado em 0,85 ppm indica a absorção de um próton metílico e um sinal de alta
intensidade em 1,23 ppm indica a absorção de prótons de (n) grupamentos CH
2
,
formando uma cadeia saturada.
A presença de um multiplete centrado em 1,54 ppm indica a absorção de um
hidrogênio situado no carbono α em relação ao grupo OH (Figura 28 e 29).
73
FIGURA 28 – ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO UNDECAN-1-OL
74
FIGURA 29 – EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN DE
1
H D0 UNDECAN-1-OL
75
b) Espectro de RMN de
13
C
Os deslocamentos químicos atribuídos pelos espectros de
13
C na freqüência
de 75 MHz em CDCl
3
, estão indicados na Tabela 6 e Figura 30 e 31. A proposta
para esta estrutura é de um álcool graxo de cadeia saturada. Para fins comparativos
foi utilizada a referência de MONTRUCHIO (2001) que isolou o ácido palmítico
(Figura 32) que se assemelha à substância FH3 pela longa cadeia saturada com
adição de um grupamento no carbono α.
TABELA 6 – DADOS DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RNM DE
13
C (δ EM
PPM, CDCL
3
) PARA O UNDECAN-1-OL COMPARADO COM O ÁCIDO PALMÍTICO
DA LITERATURA (MONTRUCHIO, 2001)
Tipo C
Ácido
Palmítico
Undecan-1-ol C Tipo
CH
3
1 14,13 14,35 1 CH
3
CH
2
– posição α em
relação ao CH
3
2 22,70 22,93 2
CH
2
– posição α em
relação ao CH
3
CH
3
- posição β em
relação ao CH
3
3 31,92 32,17 3
CH
3
- posição β em
relação ao CH
3
CH
2
4 – 13 29,05 – 29,68 29,60 – 29,93 4 – 8 CH
2
CH
3
- posição β em
relação ao COOH
14 24,66 25,97 9
CH
3
- posição β em
relação ao OH
CH
3
- posição α em
relação ao COOH
15 34,05 33,04 10
CH
3
- posição α em
relação ao OH
C = O 16 180,17 63,7 11 C – OH
76
FIGURA 30 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO UNDECAN-1-OL
77
FIGURA 31 – EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE
13
C D0 UNDECAN-1-OL
DE δ 14 - δ 29 ppm E δ 29 – δ 33 ppm
78
Para confirmação da estrutuda química da substância FH3 ainda será feito a
análise em CG. Para o momento propomos a estrutura do undecan-1-ol com cadeia
linear saturada com grupamento hidroxila em C α.
FIGURA 32 – ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO PALMÍTICO E PROPOSTA PARA
SUBSTÂNCIA FH3
CH
3
O
OH
ÁCIDO PALMÍTICO
CH
3
OH
UNDECAN-1-OL
5.1.4.1.4 Análise dos cristais do dodecilciclohexano
A análise dos cristais do dodecilciclohexano mostrou os seguintes dados:
a) Espectro de RMN de
1
H
O espectro de RMN de
1
H foi obtido em CDCl
3
a 300 MHz. Este registrou
deslocamentos entre δ 0,76 e δ 0,81 indicando a presença de CH
3
, e deslocamentos
de δ 0,92 a δ 1,16 indicando absorção de hidrogênios metílicos. (Figuras 33 e 34)
79
FIGURA 33 – ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO DODECILCICLOHEXANO
80
FIGURA 34 – EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN
1
H DO
DODECILCICLOHEXANO
81
b) Espectro de RMN de
13
C
Analisando os espectros de RMN
13
C (75 MHz, CDCl
3
) do dodecilciclohexano
podemos observar o sinal de CH
3
em δ 14,2, uma série de sinais de CH
2
entre δ
29,2 e δ29,8 correspondendo aos carbonos metilênicos (Figuras 35 e 36)
FIGURA 35 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO DODECILCICLOHEXANO
82
FIGURA 36 – ESPECTROS DE EXPANSÃO DE RMN DE
13
C DO
DODECILCICLOHEXANO DE δ14 – δ 25 ppm E δ 29 – δ 37 ppm
83
Com os dados observados nos espectros, podemos propor a seguinte
estrutura química pra a substância FH4 (Figura 37).
FIGURA 37 – ESTRUTURA QUÍMICA PROPOSTA PARA A SUBSTÂNCIA FH4
CH
3
DODECILCICLOHEXANO
5.1.4.2 Fração clorofórmio
Da cromatografia líquida em coluna realizada com esta fração foram
recolhidas 167 subfrações de aproximadamente 15 mL cada. Características
semelhantes visualizadas através da cromatografia em camada delgada (CCD)
levou à reunião das subfrações 50 a 80, de cuja posterior cristalização foram
isolados 1,4332 g de um cristal branco identificado como sabandinol.
a) Espectro de absorção no infravermelho do sabandinol
De acordo com SILVERSTEIN; BASSLER e MORRIL (1994), O espectro
mostra absorção característica de hidroxila em 3400 cm
-1
; características de
carbonila em 1620 cm
-1
, 1450 cm
-1
, 1250 cm
-1
e outras absorções em 2990 cm
-1
e
1700 cm
-1
(Figura 38).
84
FIGURA 38 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DO
SABANDINOL
85
b) Espectro de RMN de
1
H do sabandinol
O espectro de ressonância magnética nuclear de
1
H foi obtido a uma
freqüência de 300MHz em CDCl
3
e apresenta δ, em ppm, 7,96 (1H, d), 6,57 (1H, s),
6,23 (1H, d) 6,06 (2H, s), 4,51 (1H, dd), 4,37(1H, dd), 3,82 (1H, dd), 1,31 (3H, s),
1,23 (3H, s) (Figura 39).
86
FIGURA 39 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO SABANDINOL
87
FIGURA 40 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DO SABANDINOL EXPANDIDO DE δ1 –
δ 8 ppm E δ 6 – δ 8 ppm
88
c) Espectro de RMN de
13
C do sabandinol
No espectro de RMN de
13
C (PND, DEPT) (Figuras 40 e 41), os
deslocamentos químicos obtidos na freqüência de 75 MHz em CDCl
3
apresentaram-
se da seguinte forma (Tabela 7):
TABELA 7 – DESLOCAMENTO QUÍMICO DE RMN
13
C DO SABANDINOL
COMPARADO AOS DADOS DA LITERATURA (HEEMANN, 2002 E
DEBENEDETTI, 1997)
CARBONO SABANDINOL
HEEMANN, 2002
DEBENEDETTI, 1997
Experimental
2 160,70 161,18 161,7
3 111,47 112,14 112,3
4 139,18 138.58 139,8
4a 107,15 106,97 107,2
5 135,28 136,77 136,9
6 132,41 132,23 132,6
7 151,73 151,52 151,8
8 92,22 93,14 93,3
8a 152,81 152,43 152,7
O-CH
2
-O 102,32 102,06 102,3
1’ 75,15 73,76 73,9
2’ 77,37 71,61 77,2
3’ 71,35 76,46 71,8
4’ 27,31 26,72 27.0
3’-CH
3
25,56 24,82 25,0
Os espectros de HMQC (Figuras 42 a 45) mostram os acoplamentos entre
carbonos e hidrogêncios da estrutura do Sabandinol. Nos espectros de COSY
89
(Figuras 46 a 48) temos os acoplamentos entre hidrogênio da estrutura do
sabandinol.
FIGURA 41 - ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO SABANDINOL
90
FIGURA 42 - DEPT DO ESPECTRO DE RMN DE
13
C DO SABANDINOL
91
FIGURA 43 – MAPAS DE CONTORNO DO HMQC DO SABANDINOL
92
FIGURA 44 – EXPANSÃO DO HMQC DO SABANDINOL
93
FIGURA 45 – EXPANSÃO DO HMQC DO SABANDINOL
94
FIGURA 46- EXPANSÃO DO HMQC DO SABANDINOL
95
FIGURA 47 – EXPECTROS COSY DO SABANDINOL
96
FIGURA 48 – EXPANSÕES DO EXPECTRO COSY DO SABANDINOL
97
FIGURA 49 – EXPANSÕES DO EXPECTRO COSY DO SABANDINOL
98
De acordo com os estudos feitos por DEBENEDETTI et al em 1997 e os
espectros obtidos pela análise do composto FC, propõem-se a estrutura da cumarina
Sabandinol (Figura 50).
FIGURA 50 – ESTRUTURA QUÍMICA DO SABANDINOL
4a
8a
5
8
6
7
4
3
2
O
1
O
O
O
O
1'
2'
3'
OH
OH
CH
3
CH
3
4'
SABANDINOL
5.1.4.3 Fração acetato de etila
Das 138 subfrações recolhidas na cromatografia líquida realizada com esta
fração, foram reunidas as de número 81 à 112, e destas foi feita uma coluna de
Sephadex com eluição de fase móvel metanol e água numa proporção de 70:30.
Das frações recolhidas foram isolados 0,4783 g de um precipitado amarelo chamado
inicialmente de FA1 identificada então como quercetina.
a) Espectro de absorção no infravermelho da quercetina
De acordo com SILVERSTEIN; BASSLER; e MORRIL (1994), O espectro
apresentou uma banda larga de absorção em 3409 cm
-1
relativo à presença de
hidroxila, outra banda larga de absorção em 1663 cm
-1
, indicativo da presença de
carbonila conjugada e em 1611 cm
-1
característica de insaturação (Figura 51).
99
FIGURA 51 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO DA
QUERCETINA
100
b) Espectro de RMN de
1
H da quercetina
Os espectros de RMN da quercetina foram obtidos a uma freqüência de 75
MHz em acetona. É possível observar que á várias absorções na região do próton
aromático, em 6,27 (1H, d), 6,53 (1H, d), 7,00 (1H, d), 7,70 (1H, dd), 7,83 (1H, d)
(Figura 51).
FIGURA 52 - ESPECTRO DE RMN DE
1
H DA QUERCETINA
101
De acordo análises de CCD da quercetina com padrões e com os dados
espectrais e literários, como MIGUEL, 1996, propõem-se a estrutura do flavonóide
quercetina (Figura 53) para a substância FC2.
FIGURA 53 – ESTRUTURA QUÍMICA DA QUERCETINA
9
10
8
5
7
6
2
3
O
1
4
1'
2'
6'
3'
5'
4'
OH
OH
OH
OH
OH
O
QUERCETINA
5.1.5 Atividade Antimicrobiana
5.1.5.1 Método da Concentração Mínima Inibitória (CMI)
Neste método o conteúdo de todos os tubos, exceto os controles negativos,
turvaram, indicando que nas concentrações testadas os extratos e substâncias
aplicadas não inibiram o crescimento bacteriano. Esta técnica foi realizada duas
vezes e em duplicata.
102
5.1.5.2 Método de Autobiografia
Os resultados da atividade antimicrobiana pelo método de autobiografia estão
representados na tabela 8.
TABELA 8 – RESULTADOS DO TESTE DE AUTOBIOGRAFIA
Microrganismo
Amostra
Staphylococcus
aureus
(ATCC 6538)
Staphylococcus
epidermidis
(ATCC 12228)
Pseudomonas
aeruginosa
(ATCC 9027)
Escherichia
coli
(ATCC 8739)
ET X - X -
FA - - - -
FH X - X -
FC - - - -
3-o-acetil-
pseudotaraxasterol
X - X -
Sabandinol - - - -
Quercetina - - - -
O teste foi positivo para os microrganismos S. aureus e P. aeruginosa frente
aos extratos ET e FH e ao 3-o-acetil-pseudotaraxasterol . A concentração das
substâncias em pontos específicos da cromatoplaca permite a visualização dos
halos de inibição formados. Podemos dizer assim que estes microrganismos têm seu
crescimento influenciado pela presença de tais amostras. As demais bactérias
testadas neste método não são sensíveis a estas amostras nas concentrações
aplicadas.
Os halos de inibição formados estão indicados na figura 54. Os controles
positivos (Gentamicina10 µg) estão evidenciados por um círculo.
103
FIGURA 54 - INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM BIOAUTOGRAFIA
ADAPTADA DOS EXTRATOS TOTAL E HEXÂNICO E 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL
104
Nesta técnica os discos de antibiótico foram utilizados apenas como controle
positivo de inibição do crescimento dos microorganismos. Os halos de inibição
formandos pelas substâncias testadas são irregulares, o que não permite a
mensuração quantitativa da inibição promovida.
Segue abaixo a figura 55 mostrando o halo de inibição do crescimento de
Staphylococcus aureus causada pelos extratos total (ET), fração hexânico (FH) e
pela 3-0-acetil-pseudotaraxasterol.
FIGURA 55 - INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM BIOAUTOGRAFIA
ADAPTADA DOS EXTRATOS TOTAL E HEXÂNICO E 3-O-ACETIL-
PSEUDOTARAXASTEROL
Staphylococcus aureus - Halo de
inibição pelo ET, EH e FH1 (setas)
ET
F
H
FH1
105
5.1.6 Atividade Alelopática
5.1.6.1 Avaliação da germinação
As diferenças estatísticas mostradas na Tabela 9 e Gráfico 1 revelam
influência significativa do extrato ET, fração acetato de etila FA e hexânica FH sobre
a germinação das sementes de Lactuca sativa em relação aos controles água e
metanol. Nos extratos ET e EH pode-se observar que a inibição aumenta com a
maior concentração de extrato aplicado. Já as substâncias isoladas não
apresentaram inibição à germinação. Este fato pode ser devido à associação de
todas as substâncias presentes nos extratos que podem sinergicamente promover
essa inibição.
TABELA 9 – TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NOS ÍNDICES DE
GERMINAÇÃO DE Lactuca sativa NO ENSAIO ALELOPÁTICO COM EXTRATOS E
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DAS PARTES AÉREAS DE Pterocaulon lorentzii Malme
CONCENTRAÇÃO
AMOSTRA
0,8 mg 0,4 mg 0,2 mg 0,1 mg
CONTROLE
METANOL
CONTROLE
ÁGUA
EXT. TOTAL 2,080 a1 2,750 a1 2,875 a1 2,875 a1 4,250 a3 4,375 a3
EXT. ACET. DE
ETILA
3,000 a1 2,707 a1 3,500 a2 2,582 a2 4,250 a3 4,375 a3
EXT.
HEXÂNICO
2,875 a1 3,250 a1 3,500 a2 3,500 a2 4,250 a3 4,375 a3
FH1 0,854 a1 1,332 a1 0,978 a1 0,583 a1 1,395 a1 1 a1
FC1 0,833 a1 0,937 a1 0 a1 0,750 a1 1,395 a1 1 a1
FC2 0,854 a1 0,833 a1 0,750 a1 0,916 a1 1,395 a1 1 a1
Pode se observar que há diferenças estatísticas pela variação da letra (a1),
(a2) e (a3). Esta variação pode ser melhor observada pelo gráfico 1.
106
GRÁFICO 1 – MÉDIAS DE GERMINAÇ ÃO DE Lactuca sativa SUBMETIDA A
ENSAIO ALELOPÁTICO COM O EXTRATO ET, FRAÇÕES FA, FH E AS
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL, SABANDINOL E
QUERCETINA
GERMINAÇÃO
0
1
2
3
4
5
0,8 0,4 0,2 0,1 CONTROLE
M ETANOL
CONTROLE
ÁGUA
Concentração (mg)
MÉDIAS
ET
FA
FH
2-o-pseudo-taraxasterol
Sabandinol
Quercetina
5.1.6.2 Avaliação do crescimento
De acordo com a tabela 10, estatísticamente, não ocorreu inibição do
crescimento da radícula nem hipocótilo de Lactuca sativa ao utilizarmos os Extratos
Total, Acetato de Etila, Hexânico, e as substâncias isoladas FH1, FC1 e FC2. A
espécie em teste teve crescimento muito semelhante aos controles água e metanol
que apresentaram crescimento considerado normal para a espécie.
Podemos concluir desta forma que os extratos ET, FA e FH exercem influência
somente sobre a germinação de Lactuca sativa, porém não as substâncias isoladas.
107
TABELA 10 – TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NA AVALIAÇÃO DO
CRESCIMENTO DA RADÍCULA E HIPOCÓTILO DE Lactuca sativa NO ENSAIO
ALELOPÁTICO COM EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DAS PARTES
AÉREAS DE Pterocaulon lorentzii Malme
(1) Médias seguidas pela mesma letra na mesma linha não diferem estatísitcamente
entre si.
Radícula
Média (mm)
Hipocótilo
Média (mm)
Tratamento Repetição
ET EA EH FH1 FC1 FC2 ET EA EH FH1 FC1 FC2
0,8 mg 1 37,8 a1 29,8 a1 26,4 a1 2,6 a1 3,6 a2 3,8 a2 38,0 a1 49,4 a1 32,4 a1 2,4 a1 1,2 a1 0,6 a1
2 24,4 a1 29,0 a1 28,8 a1 2,6 a1 2,6 a1 3,8 a2 27,6 a1 44,4 a1 34,0 a1 1,8 a1 2,0 a1 2,2 a1
3 27,2 a1 27,2 a1 27,4 a1 3,2 a2 2,6 a1 3,0 a2 33,0 a1 35,4 a1 38,8 a1 2,2 a1 0,8 a1 2,0 a1
4 36,6 a1 27,8 a1 31,2 a1 2,4 a1 3,6 a2 3,4 a2 41,0 a1 44,4 a1 35,6 a1 2,8 a1 2,4 a1 2,6 a1
0,4 1 24,4 a1 21,0 a1 29,4 a1 3,2 a2 2,6 a1 2,6 a1 35,6 a1 32,6 a1 32,2 a1 1,2 a1 2,2 a1 1,8 a1
2 22,4 a1 32,4 a1 30,4 a1 2,2 a1 2,8 a2 1,2 a1 36,0 a1 33,6 a1 36,3 a1 1,2 a1 2,2 a1 1,2 a1
3 25,6 a1 35,6 a1 22,0 a1 2,0 a1 2,6 a1 2,0 a1 39,0 a1 37,0 a1 31,4 a1 4,2 a1 1,0 a1 1,8 a1
4 32,6 a1 35,2 a1 32,6 a1 2,8 a2 3,0 a2 2,4 a1 41,6 a1 38,6 a1 32,2 a1 0,6 a1 0,8 a1 2,0 a1
0,2 1 27,4 a1 30,8 a1 29,6 a1 2,4 a1 3,4 a2 3,8 a2 41,4 a1 42,6 a1 38,6 a1 1,2 a1 1,0 a1 2,4 a1
2 16,8 a1 26,4 a1 35,2 a1 1,6 a1 3,2 a2 2,8 a2 29,2 a1 45,4 a1 41,4 a1 2,0 a1 1,0 a1 2,2 a1
3 22,4 a1 28,4 a1 27,4 a1 1,6 a1 2,8 a2 3,0 a2 39,0 a1 43,2 a1 32,2 a1 3,6 a1 2,4 a1 1,2 a1
4 19,2 a1 28,6 a1 18,0 a1 3,4 a2 4,0 a2 3,8 a2 34,4 a1 34,0 a1 32,8 a1 3,2 a1 1,2 a1 2,0 a1
0,1 1 37,0 a1 30,8 a1 32,0 a1 3,8 a2 3,6 a2 3,5 a2 33,8 a1 41,2 a1 45,2 a1 1,6 a1 1,8 a1 1,8 a1
2 24,2 a1 26,4 a1 26,2 a1 0,8 a1 2,8 a2 3,2 a2 37,8 a1 35,6 a1 40,1 a1 1,2 a1 2,0 a1 1,4 a1
3 30,2 a1 28,4 a1 28,8 a1 1,0 a1 3,0 a2 2,8 a2 34,8 a1 40,6 a1 40,8 a1 1,6 a1 4,0 a1 3,8 a1
4 26,4 a1 28,6 a1 25,0 a1 3,0 a2 3,2 a2 3,2 a2 34,0 a1 29,2 36,2 a1 7,0 a1 2,4 a1 2,4 a1
Controle
água
1 23,8 a1 23,8 a1 23,8 a1 3,0 a2 3,0 a2 3,0 a2 44,8 a1 44,8 a1 44,8 a1 0,8 a1 0,8 a1 0,8 a1
2 26,6 a1 26,6 a1 26,6 a1 3,4 a2 3,4 a2 3,4 a2 40,2 a1 40,2 a1 40,2 a1 2,8 a1 2,8 a1 2,8 a1
3 27,0 a1 27,0 a1 27,0 a1 4,6 a2 4,6 a2 4,6 a2 43,0 a1 43,0 a1 43,0 a1 4,4 a1 4,4 a1 4,4 a1
4 30,0 a1 30,0 a1 30,0 a1 3,8 a2 3,8 a2 3,8 a2 45,6 a1 45,6 a1 45,6 a1 3,2 a1 3,2 a1 3,2 a1
Controle
Metanol
1 20,8 a1 20,8 a1 20,8 a1 3,8 a2 3,8 a2 3,8 a2 33,4 a1 33,4 a1 33,4 a1 2,0 a1 2,0 a1 2,0 a1
2 31,8 a1 31,8 a1 31,8 a1 3,6 a2 3,6 a2 3,6 a2 42,2 a1 42,2 a1 42,2 a1 2,2 a1 2,2 a1 2,2 a1
3 25,8 a1 25,8 a1 25,8 a1 3,2 a2 3,2 a2 3,2 a2 36,0 a1 36,0 a1 36,0 a1 2,2 a1 2,2 a1 2,2 a1
4 31,8 a1 31,8 a1 31,8 a1 3,4 a2 3,4 a2 3,4 a2 33,6 a1 33,6 a1 33,6 a1 4,2 a1 4,2 a1 4,2 a1
108
A relação estatística pode ser observada no gráfico 2 e 3 que mostra
ausência de variação significativa dos valores obtidos.
GRÁFICO 2 – MÉDIAS DE CRESCIMENTO DA RADÍCULA DE Lactuca sativa
SUBMETIDA A ENSAIO ALELOPÁTICO COM OS EXTRATOS ET, EA, EH E AS
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL, SABANDINOL E
QUERCETINA
RADÍCULA
0
10
20
30
40
50
0
,
8
0
,
4
0
,
2
0
,
1
C
O
N
T
RO
L
E
ÁGUA
C
O
N
TR
O
L
E METAN
O
L
TRATAMENTO (m g)
MÉDIA
ET
EA
FH
3-o-pseudo-taraxasterol
Sabandinol
Quercetina
109
GRÁFICO 2 – MÉDIAS DE CRESCIMENTO DO HIPOCÓTILO DE Lactuca sativa
SUBMETIDA A ENSAIO ALELOPÁTICO COM OS EXTRATOS ET, EA, EH E AS
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS 3-O-ACETIL-PSEUDOTARAXASTEROL, SABANDINOL E
QUERCETINA
HIPOCÓTILO
0
10
20
30
40
50
0,8
0,4
0,2
0,1
C
ONTRO
L
E
Á
GUA
C
O
NTROLE
M
ETA
NOL
TRATAMENTO (mg)
MÉDIA
ET
FA
FH
3-o-pseudo-taraxasterol
Sabandinol
Quercetina
110
CONCLUSÃO
Considerando os objetivos propostos no trabalho que propunham o estudo
fitoquímico, alelopático e das propriedades antimicrobianas de Pterocaulon lorentzii
Malme, é possível fazer as seguintes considerações:
1 – A análise fitoquímica preliminar apontou a presença de cumarinas, flavonóides e
triterpenos comum entre espécies de Pterocaulon. Foram isoladas e identificadas
sete substâncias: 3-O-acetil-pseudotaraxasterol (triterpeno); mistura de taraxasterol
e pseudotaraxasterol (triterpeno); sabandinol (cumarina); quercetina (flavonol);
undecan-1-ol (álcool graxo) e um hidrocarboneto. Composição esta primeiramente
relatada para a espécie Pterocaulon lorentzii Malme.
2 – A atividade antimicrobiana foi identificada apenas pelo método de autobiografia.
Os extratos total e hexânico assim como o 3-O-acetil-pseudotaraxasterol isolado
inibiram o crescimento dos microrganismos Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa. Este estudo pode ser continuado com outras técnicas e outras
concentrações das demais amostras testadas.
3 - O ensaio alelopático revelou significativa influência dos extratos ET, EA, EH, EC
sobre a germinação de Lactuca sativa, porém após a germinação não houve
influência dos extratos sobre o crescimento. Entretanto não se pode afirmar que as
sementes germinadas seriam plantas adultas saudáveis. As substâncias isoladas
não influenciaram na germinação nem no crescimento de Lactuca sativa. Para este
comportamento pode-se levar em consideração a complexa composição dos
extratos vegetais e o sinergismo que as substâncias em conjunto podem exercem.
A soma destes resultados obtidos abre espaço para a continuação deste
trabalho em busca da farmacologia das substâncias identificadas e suas aplicações
tendo em vista o seu uso popular e o fato de ser uma espécie medicinal sem estudo
111
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