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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE Pavonia distinguenda A.ST.- HILL. et NAUDIN E
Dorstenia brasiliensis LAM.
TESE DE DOUTORADO
CLÁUDIA MARASCIULO GARCIA
Santa Maria, RS
2007
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ii
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DE
Pavonia distinguenda A.ST.- HILL. et NAUDIN E Dorstenia
brasiliensis LAM.
por
Cláudia Marasciulo Garcia
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química do Centro de Ciências Naturais e Exatas da Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial
para obtenção do título de
Doutor em Química
Orientador: Prof. Dr. Ademir Farias Morel
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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iii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Tese de Doutorado
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DE
Pavonia distinguenda A.ST.- HILL. et NAUDIN E
Dorstenia brasiliensis LAM.
elaborada por
Cláudia Marasciulo Garcia
como requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Química
Comissão Examinadora:
_______________________________________
Ademir Farias Morel, Dr. – UFSM
(Presidente/Orientador)
_______________________________________
Alana Neto Zoch, Drª. – UPF
_______________________________________
Eliane Maria Zanchet, Drª. – UFSM
_______________________________________
Marco Aurélio Mostardeiro, Dr- UNIJUÍ
_______________________________________
Margareth Linde Athayde, Drª - UFSM
Santa Maria,2007.
iv
Dedico aos meus pais, José Cláudio e Lylis, ao meu irmão Leonel
pelo seu amor, carinho, paciência e incentivo.
As minhas filhas, Luana e Gabrielle, fonte de inspiração e
iluminação.
Ao meu namorado Edison, pelo seu amor, compreensão e apoio nos
momentos mais difíceis.
Ao Prof. Dr. Ademir Farias Morel, pela sua orientação, paciência e
amizade.
v
Aos amigos por compartilhar das alegrias e pelos incentivos nos
momentos mais difíceis deste trabalho.
Aos colegas e amigos do laboratório: Adriana Obregon, Adriana
Zago, Anderson, Andréia, Carolina, Caroline, Gilvan, Graciela,
Helena, Juliano, Sandro, Vanessa, Welington (in memorian), pela
amizade, auxílio e companheirismo durante estes anos.
A bolsista, Susiane, pela sua amizade e dedicação demonstrada na
busca de novos resultados.
Aos professores, Dr. João Ernesto de Carvalho, coordenador da
Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de
Pesquisa Química, Biológica e Agrícola (CPQBA) da Universidade de
Campinas (UNICAMP) e seus colaboradores, e a professora Drª. Eliane
Maria Zanchet do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFSM,
pela colaboração na realização de algumas etapas deste trabalho.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Química da
UFSM, em especial aos funcionários Ademir Sartóri e Valéria Velasque,
pela atenção dispensada.
A todos que de alguma forma colaboraram para a realização deste
trabalho.
vi
De tudo ficaram três coisas:
a certeza de que estava sempre começando,
a certeza de que preciso continuar e
a certeza de que seria interrompido antes de terminar.
Fazer da interrupção um caminho novo,
fazer da queda um passo de dança,
do medo, uma escada,
do sonho uma ponte,
da procura, um encontro.
Fernando Pessoa
vii
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Química
Universidade Federal de Santa Maria
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Pavonia distinguenda
A.ST.- HILL. et NAUDIN E Dorstenia brasiliensis LAM.
AUTOR: CLÁUDIA MARASCIULO GARCIA
ORIENTADOR: PROF. DR. ADEMIR FARIAS MOREL
Santa Maria, 2007.
Das partes aéreas de Pavonia distinguenda Saint Hilaire e Naudin foram isolados os
flavonóides glicosilados tilirosídeo e astragalina, β-sitosterol livre, lupeol, taraxerol, germanicol e. das
raízes de Dorstenia brasiliensis Lam., psolareno, bergapteno, umbeliferona, e sacarose os quais
foram identificados pela aplicação de técnicas de RMN 1D e 2D, CG-EM. O extrato bruto de P.
distinguenda apresentou um índice de citotoxicidade para larvas de Artemia salina Leach com DL
50
em 6,2 µg/mL, demonstrando potencial atividade antitumoral e/ou, inseticida. Nos testes de toxicidade
aguda dose única, via intraperitoneal, apresentou DL
50
em 1004,9 mg/kg, (limites de confiança em
731,8 e 1422,7 mg/kg), e para administração via oral, uma DL
50
em 3002,1 mg/kg (limites de
confiança inferior e superior, respectivamente, em 2864,4 e 3153,1 mg/kg). O extrato bruto, as
frações hexânica, diclorometano, acetato de etila, butanólica, e o flavonóide tilirosídeo testados frente
a nove diferentes linhagens de células tumorais humanas mostraram-se citostáticos e/ou citocidas em
algumas das concentrações, porém nenhuma das amostras mostrou-se com elevada especificidade
frente a um único tipo de célula tumoral. Em relação à atividade antimicrobiana dos extratos, frações
e compostos isolados destas duas plantas, pelos métodos de bioautografia, difusão em ágar e
microdiluição em caldo, frente a bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos, observou-se que
estes mostraram-se ativos contra as bactérias utilizadas, somente nas concentrações acima de 50
µg, não sendo ativos contra nenhum dos fungos testados. O extrato bruto de P. distinguenda
apresentou atividade analgésica significativa, nas doses de 30 mg/kg pelo método das contorções
induzidas por ácido acético, e no método da placa quente nas doses de 30 e 100 mg/kg. Com relação
à atividade antioxidante, o extrato bruto, as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e o
flavonóide tilirosídeo apresentaram-se como bons trapeadores do radical livre DPPH, nas
concentrações acima de 6,25 µg.O flavonóide tilirosídeo apresentou discreta inibição na atividade da
enzima AChE.
Palavras-chave: Pavonia distinguenda A.ST.- HILL. et NAUDIN; Dorstenia brasiliensis;
viii
ABSTRACT
Doctor Degree Study
Chemistry Post Graduation Program
Federal University of Santa Maria
PHYTOCHEMICAL INVESTIGATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF Pavonia distinguenda
A.ST.-HILL. & NAUDIN and. Dorstenia brasiliensis LAM.
Author: CLÁUDIA MARASCIULO GARCIA
Guidance: Prof. Dr. ADEMIR FARIAS MOREL
Santa Maria, 2007
From the aerial parts of Pavonia distinguenda the glycosilated flavonoids, tirosilide and
astragalina glycolilated flavonoids were isolated, among free β-sitosterol, lupeol, taraxerol, germanicol
and from the roots of Dorstenia brasiliensis Lam, psolaren, bergapten and umbeliferone that were
identified by the appliance of NMR 1D and 2D GC-MS techniques. The crude extract of P
distinguenda presented a citotoxity index to Artemia salina Leach larvae with LD50 in 6.2 µg/mL,
showing potential antitumoural and/or insecticide activity. In the intraperitoneal single dose acute
toxicity tests it presented LD50 in 1004.9 mg/kg (confidence limits in 731.8 and 1422.7 mg/kg) and to
oral administration one LD50 in 3002.1 mg/kg (lower and upper confidence limits respectively, in
2864.4 and 3153.1 mg/kg).The crude extract, the hexanic, dichloromethane, ethyl acetate, and
buthanolic fractions and the tiroliside tested on nine different human tumour cell lines showed
moderately cytostatic and/or cytocide in some concentrations, but no one of the samples showed high
specificity to a single one type of tumour cell. Relating to the antimicrobial activity of the extracts,
fractions and isolated compounds from these two plants , using the bioauthography method, diffusion
and microdilution method against Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungi one observed that
they proved to be very active against the used bacteria only in the concentrations above 50 µg, with
no activity against anyone of the tested fungi. The crude extract of P distinguenda presented a
significant analgesic activity, of 30 mg/kg doses using the contortion method induced by acetic acid
and in the hot plate method in the 30 and 100 mg/kg/dose. Relating to the antioxidant activity the
crude extract, the hexanic fraction ,dichloromethane ,ethyl acetate and tirosilide showed themselves
as trapping of the free radical DPPH, only in the concentrations above 6.25µg. The tiroliside
presented a discrete inhibition on the AChE enzyme activity.
Key words:Pavonia distinguenda A. ST.-HIL et NAUDIN ;Dorstenia brasiliensis
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição geográfica da Pavonia hastata
no
Continente Americano....................................................................
05
Figura 2 Pavophylline, C
47
H
76
O
16
, saponina isolada da espécie Pavonia
zeylanica.........................................................................................
06
Figura 3 Foto de Pavonia distinguenda....................................................... 07
Figura 4 Pavonia distinguenda.................................................................... 07
Figura 5 Distribuição geográfica da Dorstenia brasiliensis no Continente
Americano......................................................................................
09
Figura 6 Dorstenia brasiliensis Lam (planta)................................................ 10
Figura 7 Dorstenia brasiliensis Lam (inflorescência).................................... 11
Figura 8 Dorstenia brasiliensis Lam (desenho)............................................ 11
Figura 9 Dorstenia brasiliensis Lam (Foto autora)........................................
11
Figura 10
Terpenóides encontrados nas espécies estudadas....................... 19
Figura 11
Estrutura do β– sitosterol livre........................................................ 20
Figura 12
Estrutura básica dos flavonóides....................................................
21
Figura 13
Estrutura dos flavonóides Quercetina(1), canferol(2),
Miricetina(3)....................................................................................
22
Figura 14
Estruturas(1) Psoraleno e (2). Bergapteno.................................... 27
Figura 15
Estrutura da umbeliferona.............................................................. 28
Figura 16
Síntese química da umbeliferona................................................... 29
Figura 17
Fluxograma do Fracionamento do extrato bruto de Pavonia
distinguenda St. Hil. et Naudin..................................................
45
Figura 18
Fluxograma da obtenção dos extratos de Dorstenia brasiliensis
Lam.................................................................................................
47
Figura 19
Estrutura do Tilirosídeo.................................................................. 50
Figura 20
Estrutura do Astragalina................................................................. 52
x
Figura 21
Estrutura do Germanicol.................................................................
53
Figura 22
Estrutura do β-sitosterol................................................................. 54
Figura 23
Estrutura do Taraxerol....................................................................
55
Figura 24
Estrutura do Lupeol........................................................................ 56
Figura 25
Estrutura da furanocumarina umbeliferona.................................... 58
Figura 26
Estrutura do Psoraleno...................................................................
59
Figura 27
Estrutura do Bergapteno................................................................ 60
Figura 28
Estrutura da Sacarose....................................................................
61
Figura 29
Representação esquemática da reação do radical livre DPPH
com a molécula doadora de H, dando origem a sua forma
reduzida, DPPH– H........................................................................
74
Figura 30
Esquema de uma placa de 96 compartimentos corada com SRB,
onde A, B, C, D e E representam as amostras colocadas em
triplicata nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e
250µg/ml........................................................................................
78
Figura 31
Estrutura do quimioterápico Doxorrubicina.................................... 80
Figura 32
Estrutura do Tilirosídeo.................................................................. 86
Figura 33
Espectro de RMN de
1
H Do A– 51, em DMSO– d
6
, 400.13
MHz................................................................................................
86
Figura 34
Espectro de RMN de
1
H do Metabólito A– 51, em DMSO– d
6
,
400.13 MHz – expansão ente 6,0 – 8,0 ppm...............................
87
Figura 35
Espectro de RMN de
13
C de Metabólito A– 51, em DMSO– d
6
,
100.32 MHz...................................................................................
.
88
Figura 36
Espectro de RMN de
13
C de Metabólito em DMSO– d
6
, 100.32
MHz – em expansão entre 155 – 168ppm...................................
89
Figura 37
Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H –
1
H do
Metabólito A– 51 DMSO– d
6
, 100.32 MHz.....................................
90
Figura 38
Expansão do espectro RMN de 2D, COSY, correlação
1
H –
1
H
do Metabólito A– 51 DMSO– d
6
, 100.32 MHz................................
91
xi
Figura 39
Espectro de DEPT 135 do Metabólito A– 51 DMSO– d
6
, 100.32
MHz................................................................................................
92
Figura 40
Espectro bidimensional
1
H –
13
C HMQC, do Metabólito A– 51 em
DMSO– d
6
, 400.13 MHz.................................................................
93
Figura 41
Expansão do Espectro bidimensional
1
H –
13
C HMQC, do
Metabólito A– 51 em DMSO– d
6
, 400.32 MHz – expansão 3,0 –
4,5 ppm...........................................................................................
94
Figura 42
Espectros bidimensionais
1
H –
13
C HMBC, do Metabólito A– 51
em DMSO– d
6
, 400.13 MHz...........................................................
95
Figura 43
Expansão do Espectro bidimensionais
1
H –
13
C HMBC, do
Metabólito A– 51 em DMSO– d
6
, 400.13 MHz...............................
96
Figura 44
Cromatografia em papel do Metabólito A– 51, após hidrólise,
frente à diferentes açúcares...........................................................
97
Figura 45
Espectro de massa MS do flavonóide Tilirosídeo.......................... 98
Figura 46
Estrutura do flavonóide astragalina................................................ 101
Figura 47
Espectro de RMN de
1
H do Metabólito A– 52, em CD
3
OD,
400.13 MHz....................................................................................
102
Figura 48
Espectro de RMN de
13
C do Metabólito A– 52, em CD
3
OD,
100.32 MHz....................................................................................
103
Figura 49
Espectro de DEPT 135º do metabólito A– 52, em CD
3
OD,
100.32 MHz....................................................................................
104
Figura 50
Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H–
1
H do
metabólito A– 52 em CD
3
OD, 100.32 MHz....................................
105
Figura 51
Espectro de RMN de 2D, HMQC, correlação
1
H–
13
C do
metabólito A– 52 em CD
3
OD, 400.13 MHz ...................................
106
Figura 52
Reação de hidrólise básica seletiva do grupo éster do tilirosídeo
originando astragalina....................................................................
107
Figura 53
Estrutura do β-sitosterol livre..........................................................
110
Figura 54
Espectro de
1
H de β– sitosterol em CDCl
3
a 400.13 MHz..............
111
xii
Figura 55
Espectro de RMN
13
C do β– sitosterol em CDCl
3
a 100,32
MHz................................................................................................
112
Figura 56
Estrutura do taraxerol..................................................................... 113
Figura 57
Espectro de RMN de
1
H Do Taraxerol, em CDCl
3
, 400.13 MHz
...............................
113
Figura 58
Espectro de RMN de
13
C de Taraxerol, em CDCl
3
, 100.32 MHz... 114
Figura 59
Espectro DPT 135° de Taraxerol, em CDCl
3
, 100.32 MHz............ 115
Figura 60
Estrutura do lupeol......................................................................... 117
Figura 61
Espectro de RMN
1
H, a 400, 13 MHz, do Lupeol em CDCl
3...............
118
Figura 62
Espectro de RMN
13
C do Lupeol, em CDCl
3
, a 100,32 MHz..........
119
Figura 63
Espectro de RMN DEPT 135º do Lupeol, em CDCl
3
, a 100,32
MHz................................................................................................
120
Figura 64
Análise cromatográfica de CG do óleo incolor aromático obtido
do extrato hexânico de Dorstenia brasileinsis................................
123
Figura 65
Espectro de RMN de
1
H do sólido amarelo, em CDCL
3
a 400,13
MHz................................................................................................
125
Figura 66
Espectro de massa do sólido amarelo........................................... 125
Figura 67
Espectro de RMN
1H
da mistura psoraleno: bergapteno (3:1) em
CDCl
3
a 400,13 MHz.....................................................................
127
Figura 68
Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H –
1
H da mistura
de psoraleno: bergapteno(3:1) em CDCl
3
a 100,32
MHz................................................................................................
128
Figura 69
Espectro de RMN
13
C da mistura psoraleno: bergapteno (3:1) em
CDCl
3
a 100,32 MHz.....................................................................
129
Figura 70
Espectro de bidimensional, HMQC,
1
H–
13
C da mistura
psoraleno:bergapteno (3:1) em CDCl
3
a 400,13 MHz...................
130
Figura 71
Esquema de biossíntese das cumarinas, bergapteno, psoraleno
e Umbeliferona...............................................................................
131
Figura 72
Espectro de CG– EM da mistura psoraleno:bergapteno................
132
Figura 73
Espectro de CG– EM do psoraleno................................................
133
xiii
Figura 74
Espectro de CG– EM do bergapteno............................................. 133
Figura 75
Estrutura da sacarose.................................................................... 135
Figura 76
Espectro de RMN de
1
H, a 400,13 MHz e em D
2
O, da sacarose.. 136
Figura 77
Espectro de RMN de
13
C 100,32 MHz e em D
2
O, da sacarose.... 136
Figura 78
Tanque contendo os nauplios de Artemia salina (1) e naupli
os
isolados(2)......................................................................................
138
Figura 79
Camundongos em caixas com água e ração(1) e em caixas
“open field”(2) após receber doses dos extratos de Pavonia
distinguenda A. St. Hil. et Naudin...................................................
139
Figura 80
Efeito antinociceptivo do EB de Pavonia distinguenda sobre a
latência no teste da placa quente(i.p.)...........................................
145
Figura 81
Efeito antinociceptivo pelo método da placa quente, latência x
tempo de tratamento(v.o.).............................................................
147
Figura 82
Screening da atividade antioxidante do extrato bruto de Pavonia
(1), fração hexânica(2) e padrão quercetina(3)..............................
152
Figura 83
Curva concentração– resposta da Doxorrubicina sobre as
linhagens celulares, relacionando a porcentagem de crescimento
da célula e a concentração da droga utilizada...............................
153
Figura 84
Curva concentração– resposta do Extrato Bruto Metanólico
sobre as linhagens celulares, relacionando a porcentagem de
crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.....
154
Figura 85
Curva concentração– resposta da fração hexânica sobre as
linhagens celulares, relacionando a porcentagem de crescimento
das células e a concentração de extrato utilizado..........................
155
Figura 86
Curva concentração– resposta da fração acetato de etila sobre
as linhagens celulares, relacionando a porcentagem de
crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.....
156
Figura 87
Curva concentração– resposta da fração butanólica sobre as
linhagens celulares, relacionando a porcentagem de crescimento
das células e a concentração de extrato utilizado..........................
156
xiv
Figura 88
Curva concentração– resposta da fração diclorometano sobre as
linhagens celulares, relacionando a porcentagem de crescimento
das células e a concentração de extrato utilizado..........................
157
Figura 89
Curva concentração– resposta do flavonóide tilirosideo (A– 51)
sobre as linhagens celulares, relacionando a porcentagem de
crescimento das células e a concentração de extrato utilizado...
158
Figura 90
Resultado do efeito inibitório do tilirosideo sobre a AchE.............. 161
Figura 91
Teste de bioautografia da substância A– 51.................................. 165
Figura 92
Difusão em ágar com discos de papel do flavonóide A– 51.......... 166
[
xv
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 Usos populares de Dorstenia brasiliensis Lam.................................... 12
Tabela 1 Substâncias isoladas de espécies de Dorstenia segundo ABEGAZ et
al.2002..................................................................................................
13
Tabela 2 Atividades farmacológicas estudadas em espécies do Gênero
Dorstenia..............................................................................................
17
Tabela 3 Sistemas de solventes usados em cromatografia................................ 43
Tabela 4 Frações obtidas a partir do extrato bruto de Pavonia distinguenda
A.St.- Hill. et Naudin................................................................
................................
44
Tabela 5 Extratos obtidos a partir do extrato bruto de Dorstenia brasiliensis
Lam.................................................................................................
..........................
47
Tabela 6 Microrganismos Indicadores ................................................................
.....................
66
Tabela 7 Fórmula do Ágar simples ................................................................
..........................
67
Tabela 8 Fórmula do Ágar sabouraud ................................................................
.....................
67
Tabela 9 Fórmula do caldo de caseína– soja ................................
................................
68
Tabela 10 Fórmula do Ágar Müeller– Hinton ................................
................................
69
Tabela 11 Linhagens celulares utilizadas nos ensaios antiproliferativo
................................
76
Tabela 12 Densidade de inoculação das células................................
................................
77
Tabela 13 Dados espectrais de RMN de
13
C em DMSO – d
6
a 100.32 MHz da
substância A – 51 e tilirosídeo da literatura (DMSO – d
6
22,63 MHz)
.......................
98
Tabela 14 Dados espectrais de RMN de
1
H em DMSO – d
6
a 400.13 MHz da
substância A – 51 e tilirosídeo da literatura (DMSO – d
6
) Metabólito
codificado como A– 52 ................................................................
.............................
100
Tabela 15 Dados espectrais de RMN de
13
C em CD
3
OD a 100.32 MHz da
substância A – 52 e astragalina da literatura ................................
...........................
107
Tabela 16 Dados espectrais de RMN de
1
H em CD
3
OD a 400.13 MHz da
substância A – 52 e astragalina da literatura ................................
..........................
109
xvi
Tabela 17 Dados de RMN de
13
C do Taraxerol ................................
................................
115
Tabela 18 Dados de RMN de
13
C de Lupeol................................
................................
120
Tabela 19 Dados espectrais de RMN de
13
C CDCl
3
a 100, 32 MHz da mistura
de psoraleno: bergapteno (3:1) ................................
................................
124
Tabela 20 Dados espectrais de RMN de
1
H CDCl
3
a 400, 13 MHz da mistura de
psoraleno: bergapteno (3:1) ................................................................
.....................
134
Tabela 21 Mortalidade em camundongos, via intraperitoneal do extrato aquoso
de Pavonia distinguenda................................................................
...........................
140
Tabela 22 Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia distinguenda A.St.- Hill et
Naudin administrado por via v.o. sobre as contorções induzidas pelo
ácido acético................................................................
................................
142
Tabela 23 Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia distinguenda A.St.- Hill et
Naudin administrado por via i.p. sobre as contorções induzidas pelo
ácido acético................................................................
................................
143
Tabela 24 Efeito antinociceptivo do EB de Pavonia distinguenda sobre a
latência no teste da placa quente(i.p.) ................................
................................
144
Tabela 25 Efeito antinociceptivo do EB de Pavonia sobre a latência no teste da
placa quente(v.o.) ................................................................
................................
146
Tabela 26 Efeito do EB de Dorstenia administrado por via oral sobre o teste da
placa– quente ................................................................
................................
148
Tabela 27 Efeito do extrato bruto de Dorstenia administrado por via
Intraperitoneal................................................................
................................
148
Tabela 28 Atividades antioxidantes como trapeadores do radical livre DPPH
...........................
151
Tabela 29 Atividade antitumoral do extrato bruto, frações e tilirosídeo (A– 51)
.........................
159
Tabela 30 Resultado do ensaio preliminar do tilirosídeo sobre a atividade da
enzima AchE..................................................................................
160
Tabela 31 Resultado do ensaio definitivo do tilirosídeo sobre a atividade da
enzima AchE..................................................................................
...........................
161
Tabela 32 Resultados experimentais obtidos em bioautografia
................................
163
Tabela 33 Resultados experimentais obtidos em bioautografia
................................
164
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
δ Deslocamento químico
λ Comprimento de onda
µg Micro grama
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC Americam Type Culture Collection
atm Atmosfera
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CG Cromatografia gasosa
CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a Espectrofotômetro de
Massa
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COO Carboxila
COSY Correlated spectroscopy
CP Cromatografia em papel
CPP Cromatografia em placa preparativa
d Dubleto
dd Duplo dubleto
EBT Extrato bruto
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
F.H.A Fração Hidroalcoólica
FAE Fração acetato de etila
FD Fração diclorometano
FDA Food and Drug Administration
xviii
FH Fração hexânica
FHAR Fração Hidroalcoólica Remanescente
FNH Fração neutra hexânica
FNM Fração neutra metanólica
HMQC Heteronuclear multiple-quantum correlation
Hz Hertz
IV Espectroscopia no Infravermelho
J Constante de acoplamento
m Multipleto
m/v Massa por volume
MANOVA Análise Multivariada da Variância
MAO Mono-amino oxidase
mg Miligramas
MIC Minimal Inhibitory Concentration
N Normal
N° Número
NA Não ativa
NCI National Câncer Institute
NPPN Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais
o
C Graus Celcius
OMS Organização Mundial de Saúde
Pág. Página
Pl. Planta
ppm Parte por milhão
Pt Platina
P-valor Valor do Teste P Estatístico
Rf Fator de retenção
RMN Ressonância magnética nuclear
RP Fase Reversa (Reversed Phase)
xix
RPMI Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura)
RR Retenção Relativa
s Singleto
s.c. Subcutânia
SFB Soro Fetal Bovino Inativado
SNC Sistema Nervoso Central
t Tripleto
TMS Tetrametilsilano
TR Tempo de Retenção
TSA Trypticase Soy Agar
UFSM Universidade Federal de Santa Maria
UI Unidades Internacionais
UV Ultravioleta
v/v Volume por volume
µg/mL micrograma(s) por mililitro(s)
nm nanômetros
DMSO d6 Dimetilsulfóxido deuterado
MHz Mega Hertz
H Hidrogênio
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
14
C Carbono 14
xx
SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO ....................................................................................................01
1.1 OBJETIVOS....................................................................................................03
1.1.1 Objetivo geral ...............................................................................................03
1.1.2 Objetivos específicos....................................................................................03
II REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................04
2.1 Família Malvaceae .........................................................................................04
2.1.1 Gênero Pavonia e a espécie P. Distinguenda A.St.- Hill. et Naudin.............04
2.2 Família Moraceae ..........................................................................................08
2.2.1 Gênero Dorstenia .........................................................................................09
2.2.2 Aspectos fitoquímicos do gênero Dorstenia .................................................13
2.3 Aspectos Químicos e Farmacológicos das Espécies Estudadas.............18
2.3.1 Terpenóides .................................................................................................18
2.3.2 Esteróides ....................................................................................................19
2.3.3 Flavonóides..................................................................................................21
2.3.4 Cumarinas....................................................................................................25
2.4.Considerações Sobre os Métodos Físico-Químicos Utilizados
para Determinação Estrutural ...........................................................................29
2.4.1 Técnicas utilizadas para determinação estrutural dos metabólitos...............29
2.5 Considerações Sobre os Principais Ensaios Biológicos Realizados
em Plantas ...........................................................................................................30
2.5.1 Atividade antimicrobiana ..............................................................................30
2.5.2 Toxicidade aguda .........................................................................................32
2.5.3 Atividade analgésica ....................................................................................33
2.5.4 Atividade antioxidante .................................................................................34
2.5.5 Atividade antitumoral....................................................................................36
2.5.6 Atividade anticolinesterásica ........................................................................38
III PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................40
xxi
3.1 Instrumentos Utilizados................................................................................40
3.1.1 Espectrômetro de ressonância magnética nuclear.......................................40
3.1.2 Espectrômetro de Massa .............................................................................40
3.1.3 Aparelho de ponto de fusão .........................................................................41
3.1.4 Polarímetro...................................................................................................41
3.2 Materiais e Métodos Cromatográficos.........................................................42
3.2.1 Cromatografia em coluna .............................................................................42
3.2.2 Cromatografia em placa preparativa (CPP)..................................................42
3.2.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD).................................................42
3.2.4 Cromatografia em papel (CCDP) .................................................................43
3.2.5 Cromatografia gasosa (CG) .........................................................................43
3.3 Coleta e Identificação Do Material ...............................................................44
3.4 Extração e Fracionamento............................................................................44
3.4.1 Obtenção do extrato bruto metanólico de Pavonia distinguenda A.St.-
Hill. et Naudin........................................................................................................44
3.4.2 Fracionamento do extrato bruto de Pavonia distinguenda A.St.- Hil.
et Naudin...............................................................................................................45
3.4.3 Obtenção do extrato bruto aquoso de Pavonia distinguenda A.St.- Hill.
et Naudin para os ensaios biológicos................................................. ...................46
3.4.4 Obtenção dos extratos de Dorstenis brasiliensis Lam..................................46
3.5 Isolamento dos Metabólitos .........................................................................48
3.5.1 Metabólitos de Pavonia distinguenda A.St.- Hill. et Naudin..........................48
3.5.1.1 Fração acetato de etila..............................................................................48
3.5.1.1.1 Tilirosídeo ...............................................................................................49
3.5.1.1.2 Astragalina .............................................................................................51
3.5.1.2 Fração Hexânica .......................................................................................52
3.5.1.2.1 Germanicol .............................................................................................53
3.5.1.2.2 β-sitosterol..............................................................................................54
3.5.1.2.3 Taraxerol ................................................................................................55
3.5.1.2.4 Lupeol.....................................................................................................56
3.5.1.3 Fração Diclorometano ...............................................................................56
3.5.1.4 Fração Butanólica.......................................................................................57
3.5.2 Metabólitos de Dorstenia brasiliensis Lam. ..................................................57
xxii
3.5.2.1 Extrato Hexânico .......................................................................................57
3.5.2.1.1 Umbeliferona...........................................................................................58
3.5.2.1.2 Mistura compostos (psoraleno :bergapteno 3:1).....................................59
3.5.2.1.2.1 Psoraleno.............................................................................................59
3.5.2.1.2.2 Bergapteno...........................................................................................60
3.5.2.3 Extrato metanólico......................................................................................60
3.5.2.3.1 Sacarose ................................................................................................61
3.6 Atividades Farmacológicas ou Testes Biológicos dos Extratos, Frações
e de Alguns dos Metabólitos Puros Isolados ...................................................61
3.6.1 Citotoxicidade...............................................................................................61
3.6.2 Toxicidade aguda .........................................................................................62
3.6.3 Trânsito intestinal ........................................................................................62
3.6.4 Avaliação da atividade antinociceptiva.........................................................63
3.6.4.1 Animais.......................................................................................................63
3.6.4.2 Ensaios.......................................................................................................63
3.6.4.2.1Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético......................63
3.6.4.2.2Técnica do teste da placa quente............................................................64
3.6.4.3 Análise estatística.......................................................................................64
3.6.5 Atividade antimicrobiana in vitro...................................................................65
3.6.5.1 Microrganismos empregados nos ensaios microbiológicos.......................65
3.6.5.2 Substâncias empregadas como padrões nos ensaios microbiológicos.....66
3.6.5.3 Meios de cultura ........................................................................................66
3.6.5.3.1 Manutenção dos microrganismos indicadores .......................................66
3.6.5.3.2 Preparo dos inóculos bacterianos e fúngicos .........................................68
3.6.5.3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana ...................................................68
3.6.5.3.4 Preparo das suspensões bacterianas (inóculo)......................................69
3.6.5.4 Método de bioautografia............................................................................70
3.6.5.5 Método de difusão em discos de papel .....................................................71
3.6.5.5.1 Inoculação das placas de teste ..............................................................71
3.6.5.5.2 Aplicação de discos a placas de Ágar inoculadas..................................72
3.6.5.6 Método de microdiluição em microplacas..................................................72
3.6.6 Atividade antioxidante ..................................................................................73
3.6.6.1 Método do radical livre DPPH ...................................................................73
3.6.7 Atividade antitumoral ...................................................................................75
xxiii
3.6.7.1 Células........................................................................................................75
3.6.7.2 Plaqueamento de Células .........................................................................76
3.6.7.3 Diluição e aplicação das amostras ............................................................78
3.6.7.4 Ensaio de SRB (Sulforrodamina B) ...........................................................79
3.6.8 Atividade sobre a AChE ...............................................................................80
3.6.8.1 Preparo dos reagentes..............................................................................80
3.6.8.1.1Preparo da solução tampão fosfato monobásico......................................80
3.6.8.1.2 Preparo da solução tampão fosfato dibásico...........................................81
3.6.8.1.3 Preparo da solução de DTNB..................................................................81
3.6.8.1.4 Preparo do sistema segundo ELLMANN.................................................81
3.6.8.1.5 Preparo do substrato de AChE ...............................................................82
3.6.8.2 Ensaio in vitro............................................................................................82
3.6.8.3 Análise estatística.......................................................................................83
IV RESULTADOS E DISCUSSÕES .....................................................................84
4.1 Estudo Fitoquímico Das Plantas...................................................................84
4.1.1 Pavonia distinguenda....................................................................................84
4.1.1 1 Isolamento e elucidação estrutural............................................................84
4.1.1.1.1Fração acetato de etila.............................................................................85
4.1.1.1.1.1 Tilirosídeo............................................................................................85
4.1.1.1.1.2 Astragalina ........................................................................................101
4.1.1.1.2 Fração hexânica....................................................................................109
4.1.1.1.2.1 Germanicol.........................................................................................109
4.1.1.1.2.2 β-Sitosterol ........................................................................................110
4.1.1.1.2.3 Taraxerol ..........................................................................................112
4.1.1.1.2.4 Lupeol
...............................................................................................117
4.1.1.1.3 Fração diclorometano...........................................................................122
4.1.1.1.4 Fração butanólica..................................................................................122
4.1.2 Dorstenia brasiliensis Lam. ........................................................................122
4.1.2.1 Metabólitos isolados...............................................................................123
4.2 Resultados Das Atividades Farmacológicas Ou dos Testes Biológicos137
4.2.1 Toxicidade com Artemia salina ..................................................................137
4.2.1.1 Resultados obtidos para P. distinguenda ................................................137
xxiv
4.2.2 Toxicidade aguda em camundongos..........................................................138
4.2.2.1 Resultados obtidos para P. distinguenda ................................................138
4.2.3 Trânsito intestinal ....................................................................................140
4.2.3.1 Resultados obtidos para P. distinguenda ................................................140
4.2.4 Atividade analgésica.................................................................................141
4.2.4.1 Resultados obtidos para P. distinguenda ................................................142
4.2.4.1.1 Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético ..................142
4.2.4.1.2 Técnica do teste da placa quente.........................................................144
4.2.4.2 Resultados obtidos para D.. brasiliensis..................................................148
4.2.5 Atividade antioxidante ................................................................................148
4.2.5.1 Resultados obtidos para P. distinguenda e seus constituintes isolados..148
4.2.6 Atividade antitumoral .................................................................................152
4.2.6.1 Resultados obtidos para P. distinguenda e o isolado A-51 .....................152
4.2.6.1.1 Atividade Antiproliferativa da Doxorrubicina (Controle) ........................152
4.2.6.1.2 Atividade Antiproliferativa do extrato bruto e frações hexânica, dicloro-
metano, acetato de etila e butanólica de Pavonia distinguenda , juntamente com
a substância pura A-51 isolada da fração acetato de etila ..................................153
4.2.7 Atividade sobre a AChE .............................................................................159
4.2.7.1 Resultados obtidos para o isolado A-51, obtido de P. distinguenda........159
4.2.8 Atividade antimicrobiana ...........................................................................162
4.2.8.1 Resultados obtidos para P. distinguenda ................................................162
4.2.8.1.1 Bioautografia(quantidade de substância ativa).....................................162
4.2.8.1.2 Difusão em ágar com discos de papel..................................................165
4.2.8.1.3 Concentração Inibitória Mínima............................................................167
CONCLUSÃO .....................................................................................................168
REFERÊNCIAS...................................................................................................170
1
I INTRODUÇÃO
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas por povos de várias civilizações
há mais de cinco mil anos. Chineses, indianos e africanos utilizavam plantas para a
cura de uma variedade de doenças. No Brasil, 20 % da população consome 63 %
dos medicamentos alopáticos, o restante encontra nos produtos de origem natural,
especialmente nas plantas, uma fonte alternativa de medicação.
Outro aspecto a ser ressaltado é a quantidade de plantas existentes no
planeta, sendo que a maioria é desconhecida sob o ponto de vista científico, sendo
que de 250 a 500 mil espécies, somente cerca de 5% têm sido estudadas
fitoquimicamente e uma porcentagem menor avaliadas sob os aspectos biológicos
(SIMÕES., 2002). Grande parte das plantas nativas brasileiras ainda não tem
estudos para permitir a elaboração de monografias completas e modernas. Muitas
espécies são usadas empiricamente, sem respaldo cientifico quanto à eficácia e
segurança, o que demonstra que em um país como o Brasil, com enorme
biodiversidade, existe uma enorme lacuna entre a oferta de plantas e as poucas
pesquisas (FOGLIO, 2006)
Para determinação do potencial de uma planta, é necessário, primeiramente,
resgatar informações, sejam estas populares ou científicas, identificar as espécies e
sua disponibilidade para pesquisa, levando em consideração a preservação natural
destas no meio ambiente. O valor econômico da preservação de plantas medicinais
inclui diversos benefícios sociais, tais como atividades ligadas ao plantio,
processamento e comercialização, melhores condições de assistência à saúde, além
da possibilidade da substituição de fármacos importados, do surgimento de modelos
para a síntese de novos fármacos e ainda permitir a conservação dos recursos
genéticos como fonte potencial para doenças ainda desconhecidas (ELISABETSKY,
1987; RATES, 2001).
O estudo de uma nova droga de origem vegetal deve ser multidisciplinar,
envolvendo ciências básicas como botânica, química, farmacologia, incluindo a
toxicologia, sendo também de fundamental importância, o emprego da tecnologia
farmacêutica no desenvolvimento de um novo fármaco, incluindo os de origem
vegetal (PETROVICK, 1997). Nesse sentido, o grupo do Núcleo de Pesquisas de
2
Produtos Naturais (NPPN), cujo coordenador é o Professor Dr. Ademir Farias Morel,
vem contribuindo não somente para a fitoquímica clássica, que compreende as
etapas de isolamento, elucidação estrutural e identificação dos constituintes mais
importantes do vegetal, mas também com estudos que permitam avaliar e analisar
conjuntamente frações ou substâncias bioativas destas plantas. A avaliação da
atividade biológica inclui a investigação da atividade farmacológica e toxicológica
das substâncias isoladas, de frações obtidas ou extratos totais da droga vegetal.
Neste estudo, trabalhamos com duas espécies de plantas medicinais
utilizadas na medicina popular do Rio Grande do Sul, e de grandes incidências em
vários países de clima tropical e subtropical. Pavonia distinguenda trata-se de uma
planta de pequeno porte, pertencente à família Malvaceae, encontrada na região sul
do Brasil e em países de clima tropical e subtropical, conhecida popularmente como
erva de ovelha e usada na medicina popular, principalmente para tumores de
próstata e como antibacteriano. Dorstenia brasiliensis Lam da família Moraceae é
uma espécie nativa no sul do Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai; comum em
campos pedregosos, e conhecida popularmente como figueirilha, carapiá, caapiá,
contra-erva. É uma erva pequena, com cheiro característico de figo, usada
popularmente como anticonceptiva, antidesintérica, antipirética, antileucorréica,
antiofídica, anti-reumática, sudorífera, diurética, emética, estimulante digestivo,
fluidificadora do aparelho respiratório, purgativa e tônica (ABEGAZ., 2002).
De acordo com revisão bibliográfica realizada, sobre o gênero Pavonia,
poucos estudos foram publicados até então, sendo que a maioria destes descreve
novas espécies encontradas no mundo, como na Índia, Etiópia, Paquistão, México e
Brasil (TAWARI; MINOCHA, 1980). Já para o gênero Dorstenia, apresentam-se
descritos vários trabalhos em relação aos constituintes químicos, nos quais são
relatados, o isolamento e elucidação estrutural e avaliação biológica de várias
espécies (ABEGAZ, 2002).
Considerando a ampla variedade de compostos que as plantas metabolizam e
as variações qualitativas e quantitativas destes, decorrentes de alterações no
ambiente, clima, e stresse bem como de estímulos físicos e químicos, achou-se
pertinente estudar estas duas espécies de nossa região, visando contribuir com
dados fitoquímicos e farmacológicos.
3
1.1 Objetivo
1.1.1 Objetivo geral
Estudo fitoquímico e farmacológico de Pavonia distinguenda A.St.- Hil
et Naudin, e Dorstenia brasiliensis Lam., plantas medicinais do Rio Grande do Sul.
1.1.2 Objetivos específicos
- Isolar constituintes químicos da planta, a partir dos extratos brutos e frações
de Pavonia distinguenda, e Dorstenia brasiliensis através de métodos
cromatográficos.
- Elucidação estrutural dos metabólitos isolados, através de métodos físicos
como espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H e
13
C uni e
bidimensionais (COSY; NOESY; HMQC; HMBC) e espectroscopia de massa.
- Realizar um screening biológico dos extratos brutos, frações e substâncias
puras obtidas, utilizando-se testes de citotoxicidade, toxicidade aguda, atividade
antimicrobiana in vitro, atividade analgésica, antioxidante, antitumoral e efeito
inibitório sobre AChE .
4
II REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Família Malvaceae
A família das Malvaceas é constituída de 252 gêneros e cerca de 2330
espécies espalhadas pelo mundo, com destaque na América do Sul.
São ervas, subarbustos, arbustos, lianas e árvores, com canais mucilaginosos
e indumento constituído, normalmente, de pêlos ramificados ou escamosos. As
folhas são alternas, simples (normalmente lobada e palminérvea) ou composta
palmada, inteira ou serreada. Possue estípulas. A flor isolada e axilar, quando
inflorescência, determinada ou, às vezes, indeterminada. A flor é hermafrodita ou
assexuada, actinomorfa, dotada de calículo (marcante) ou epicálice (invólucro de
brácteas). O cálice tem 5 sépalas, corola de 5 pétalas distintas ou ausentes. Os
estames são em número de 5 ou mais, às vezes, monoadelfos, formando uma
coluna estaminal (andróforo), com anteras mono ou bitecas rimosas; às vezes, com
estaminódios, pólen com exina espinhosa. O ovário, geralmente é súpero
(KRAPOVICKAS, 1999).
Em espécies da família das Malvaceas são encontrados diversos tipos de
flavonóides, os quais possuem importantes atividades farmacológicas (KINAST,
2002).
2.1.1 Gênero Pavonia e espécie P.distinguenda
O gênero Pavonia da família das Malváceas apresenta aproximadamente 250
espécies, entre árvores de pequeno porte, arbustos e herbáceas, distribuídas em
regiões de clima temperado e tropical, principalmente no continente americano
(Figura 1).
5
Figura 1 – Distribuição geográfica de espécies de Pavonia no Continente Americano
Fonte: http://stri.discoverlife.org/mp/20m?kind=Pavonia
Dentre as várias espécies do gênero, foram encontrados na literatura estudos
botânicos e agronômicos, entretanto, com relação aos constituintes químicos,
atividades biológicas e toxicidade destas plantas, poucos estudos são descritos na
literatura.
Fryxell (2000) em sua monografia sobre espécies neotropicais do gênero
Pavonia, publicada no seriado Flora Neotropica como Monograph 76, diferencia
algumas das espécies mais comuns destas, todas de flores amarelas.
Madrigal e Smith (1970) isolaram do óleo da semente de Pavonia septium, o
ácido ciclopenóico. Tawari e Minocha (1980) isolaram da espécie Pavonia zeylanica
L., usada popularmente no Norte da Índia como vermífuga e purgativa, uma
saponina, a pavofillina (Figura 2).
6
Figura 2 – Pavofilina, C
47
H
76
O
16
, saponina isolada da espécie Pavonia zeylanica
Segundo estudo feito por Vahitha et al. (2002), Pavonia zeylanica L.,
apresenta efeito larvicida comprovado contra mosquitos, reduzindo o uso de
inseticidas sintéticos em plantações.
A espécie P. distinguenda (Figuras 3 e 4) trata-se de uma planta de pequeno
porte, com flores róseas, pertencente à família Malvaceae, encontrada na região sul
do Brasil e em países de clima tropical e subtropical. É conhecida popularmente
como erva de ovelha e usada na medicina popular, principalmente em tumores de
próstata e como antibacteriano.
Segundo Hooker e Jacson (1946) em publicação no Index Kewensis a
espécie distinguenda, tem como sinônimo sagittata e conforme Stewart (2006),
Pavonia urbaniana Gürke é sinônimo de Pavonia distinguenda A. St.- Hill. et Naudin,
e Pavonia urbaniana var tomentosa-velutina Gürke também é sinônimo de Pavonia
distinguenda.
C O O H
O
O
H
H
H
H
H
O H
O H
C H 2 O H
O
O
H
H
OH
OH
Me
H
H
H
O
O
H
OH
OH H
H
H
H O 2 H C
C O O H
O
O
H
H
H
H
H
O H
O H
C H 2 O H
O
O
H
H
OH
OH
Me
H
H
H
O
O
H
OH
OH H
H
H
H O 2 H C
7
Figura 3 – Foto de Pavonia distinguenda fresca coletada em Santana do Livramento, RS.
Fonte: Foto da planta coletada pela autora da pesquisa.
Figura 4 – Pavonia distinguenda Fonte: http://images.google.com.br/images?hl=pt-
R&q=Pavonia+distinguenda&btnG=Pesquisar+imagens.&gbv=2
8
De acordo com revisão bibliográfica realizada a espécie apresenta poucos
estudos publicados embora seja de grande uso popular na região sul do Brasil.
O Centro de Referência em Informação Ambiental (CRIA), associado à
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), assim como o
Conselho Estadual do Meio Ambiente (CONSEMA), do estado do Rio Grande do
Sul, citam esta espécie Pavonia como vulnerável à extinção nestas regiões,
confirmando, a grande valia de seus estudos fitoquímicos e biológicos.
2.2 Família Moraceae
As plantas da família Moraceae são predominantemente arbóreas ou
arbustivas, sendo raras as herbáceas. Caracterizam-se por apresentar folhas
inteiras, dispostas alternadamente, simples ou, raramente, compostas, sempre
protegidas no botão por duas estípulas (JOLY, 1975). Freqüentemente, apresentam
as paredes celulares, especialmente da epiderme ou tricomas, mineralizadas com
carbonato de cálcio ou sílica; estômatos anomocíticos; presença de estípulas,
porém, algumas vezes, em número reduzido, como ocorre no gênero Dorstenia
(CRONQUIST, 1981).
As flores são muito pequenas, de sexo separado, reunidas em densas
inflorescências, protegidas por séries de elementos do perianto (em número de 2 a
6). Flores masculinas com estames isômeros e opostos aos segmentos do perianto.
Flores femininas com perianto rudimentar ou ausente, constituídas por um ovário
súpero composto de 2 carpelos e um só lóculo (dos 2 carpelos, muitas vezes só um
se desenvolve) com um só óvulo, estigmas 2, estiletes 2 (JOLY, 1975). Fruto
drupáceo, com exocarpo descendente, com sementes perenes, o receptáculo
comum freqüentemente amadurece com os ovários, formando um sicônio carnudo.
As sementes possuem embrião reto ou, mais freqüentemente, curvado, os
cotilédones freqüentemente desiguais, algumas vezes um dos cotilédones encontra-
se totalmente suprimido; endosperma carnudo e oleoso (CRONQUIST, 1981). A
família é composta de cerca de 60 gêneros, com mais de 1000 espécies, e se
encontra bem representada no Brasil, tanto por espécies nativas, quanto por
cultivadas. É freqüente, de um modo geral, nas regiões tropicais e subtropicais de
9
todo o mundo, sendo menos comum em climas temperados. Os gêneros mais
numerosos da família são Ficus, com cerca de 600 espécies; Dorstenia, com
aproximadamente 170 espécies, e Cecropia, com cerca de 50 espécies (JOLY,
1975; CRONQUIST, 1981). Entre os gêneros nativos no Brasil, destacam-se Ficus,
Brosimum, Dorstenia e Cecropia (JOLY, 1975).
2.2.1 Gênero Dorstenia
O gênero Dorstenia, é representado por aproximadamente 170
espécies em todo o mundo (Figura 5). Segundo Abegaz et al. (2002), o gênero
Dorstenia possui muitas plantas que são utilizadas como antiofídicas, antiinfecciosas
e anti-reumáticas, na terapia medicamentosa à base de plantas medicinais, em
muitos países da África e Américas do Sul e Central.
Figura 5 – Distribuição geográfica da Dorstenia brasiliensis no Continente Americano
Fonte: http://stri.discoverlife.org/mp/20m?kind= map of Dorstenia brasiliensis
Conhecida popularmente como caiapiá, carapá, figueirilha, contra-erva,
chupa-chupa, conta-de-cobra, bezoar, liga-liga, liga-osso, tarope, tiu, torus herb, é
10
um exemplo de erva na família e se caracteriza pelas inflorescências disciformes
(resultantes da fusão dos pedúnculos) com flores sésseis inseridas no lado superior
(JOLY, 1975).
Várias espécies de Dorstenia são utilizadas na medicina humana,
principalmente contra doenças de pele, por causa da presença de cumarinas,
compostos biologicamente ativos. A ocorrência de furanocumarinas tem sido
amplamente demonstrada na família Moraceae. Estudos de identificação e
quantificação de furanocumarinas em espécies de Dorstenia, tem sido realizados,
amplamente no Brasil, por causa de suas propriedades medicinais contra doenças
de pele (CARDOSO, 2002).
Figuras 6 – Dorstenia brasiliensis Lam Fonte: CONTRAYERVA (Dorstenia brasiliensis) Pictures.
http://www.rain-tree.com/Plant-Images/contrayerva-pic.htm
11
Figuras 7 – Flores de Dorstenia brasiliensis Lam Fonte: CONTRAYERVA (Dorstenia brasiliensis)
Pictures. http://www.rain-tree.com/Plant-Images/contrayerva-pic.htm
Figura 8 – Dorstenia brasiliensis Lam Fonte: CONTRAYERVA (Dorstenia brasiliensis) Pictures.
http://www.rain-tree.com/Plant-Images/contrayerva-pic.htm
Figura 9 – Dorstenia brasiliensis Lam (Foto da Autora)
12
Popularmente são utilizadas as raízes, pequenos tubérculos subterrâneos.
Estes se extraem com álcool ou água fervida e têm efeitos estimulantes e tônicos.
Encontra-se mais freqüentemente o relato do uso do pó da raiz, diluído em água
fervida, como antitérmico em casos de temperatura não muito alta e diarréias em
geral.
Além destes, Ruppel, 1991, relata alguns usos na medicina popular, como os
que se encontram listados no Quadro 1.
PAÍSES USOS NA MEDICINA POPULAR
Argentina diaforético, diurético, emético, emenagogo e tônico; para febre
Brasil anti-séptico, diurético, diaforético, emético, emenagogo, purgativo,
estimulante, estomáquico e tônico; para anemia, constipação, cistite,
diarréia, desinteria, para infecções, febre, gastrite, leucorréia,
malária, reumatismo, problemas de pele, picada de cobra, febre
tifóide, desordens uterinas
México Febre, inflamação, picada de cobra, dor de dente, tumores; como
diaforético, estimulante, tônico
Caribe bronquites, desinteria, dispepsia, febre, picada de cobra, dor de
dente, cólicas uterinas; analgésico
Venezuela Como antídoto, diaforético; para diarréia, desinteria, febre
Outros lugares diaforético, estimulante; para tosse, gastrite
Quadro 1 – Usos populares de Dorstenia brasiliensis Lam
As espécies do gênero Dorstenia conhecidas como carapiá apresentam
alguns princípios tóxicos, entre eles cita-se a capacidade de potencializar os efeitos
de medicamentos anticoagulantes(RUPPEL, 1991).
O infuso em doses maiores que a normal, pode provocar sintomas de
intoxicação como vômitos, ardor no estômago, diarréia e até a morte. Talvez este
fato justifique a repulsa dos animais herbívoros por estas plantas (RUPPEL, 1991).
13
2.2.2 Aspectos fitoquímicos do gênero Dorstenia
De acordo com trabalho de revisão publicado por Abegaz (2002), o gênero
Dorstenia é reconhecido como uma rica fonte de cumarinas prenil e geranil
substituídas, chalconas, flavonas, flavanonas, triterpenos, esteróides, entre outros.
Na tabela 1 estão expostas algumas substâncias já isoladas e identificadas de
espécies do gênero Dorstenia.
Tabela 1 - Substâncias isoladas de espécies de Dorstenia segundo Abegaz (2002):
ESPÉCIE
DE DORSTENIA
SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
D. brasiliensis
psoraleno, bergapteno
(BAUER e NOLL ,1986)
Ácido dorstenico A e B
(triterpênos)
Isopimarena(diterpeno) e seis cumarinas
(UCHIYAMA, 2002)
D. heringeri
Ácidos graxos
Furanocumarinas simples
Furanocumarinas monoterpenicas
(VILEGAS, 1997)
D. bahiensis
D. bryonlifolia
D. carantae
D. cayapiaa
D.heringeri
Triterpenos pentaciclicos esteróides
Furanocumarinas
(VILEGAS, 1992)
D. contrajerva
diidrofuranocumarina((2S*,1’S*)-2,3-diidro-2-(1’-hidroxi-1’-
acetiloximetiletil)-7H-furo[3,2-g][1]benzopirano-7-ona)
(TOVAR, 1998)
α-l-ramnopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosil-bergaptol
Catequina e epicatequina
14
(CÁCERES, 2001)
Siriogenina
*primeiro registro de estirenos naturais*
(CASAGRANDE, 2001)
D. psilurus
Derivados fenilpropanoides,
6,8-diprenil-3’[O],4’-(2,2- dimetilpirano)-3,5,7-triidroxiflavona ;
3,6-diprenil-8-(2-hidroxi-3-metilbut-3-enil)-5,7,2’,4’-tetrahidroxiflavona
(NGADJUI, 1998)
Psoraleno
dorsilurins A e B (flavonas) e um derivado benzofurano
dorsilurins C, D, E
(NGADJUI, 1999)
D pointtisefolia
Butirospermol (triterpeno)
Pointtisefolins A e B(flavonóides geranilados)
Lincoflavona F(flavona)
Isobavachalcona, Isobavacromeno
(chalconas)
luteína(carotenóide)
(TSOPMO, 1998)
dorspointtisefolina(flavona)
4’-metoxiflavona
4-hidroxiloncocarpina
4-metoxi-loncocarpina
4’-hidroxiisoloncocarpina
chalconas geranil e prenil substituídas
Pointtisefolactona (dihidro-4-prenilcumarina)
Diidrocumarina -4-fosfo-substituída
(NGADJUI, 1999)
D. tubicina psoraleno
Continuação da Tabela 1
15
D. asaroides
D. vitifolia
bergapteno
pimpinelina
isopimpinelina
(CARDOSO, 2002)
D. excentrica
D. lindeniana
Diasteroisomero do prandiol, a furanocumarina (2’S,1’’S; 4-[3-(4,5-dihidro-
5,5- dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3,2-g][1]benzopirano-7-ona)
Psoraleno, dímero do psoraleno,
7-hidroxi-cumarina
(ROJAS, 1999)
D. drakena bergapteno
(ROJAS, 1999)
D. gigas
dorstegina I, II
Derivado benzofurano
(FRANKE, 2001)
Dorstenia sp. Dorstenina(Análogo do psoraleno)
(LOPES, 2001)
D. propenens
psoraleno
bergapteno
β-sitosterol e seus derivados
D-glicopiranosídeos
(ABEGAZ, 2002)
D. manii
dorsmanina A
dorsmanina B flavonoides
dorsmanina C prenilados
dorsmanina D
canflavin B ( geranilado)
(NGADJUI, 1998)
dorsmanis E, F, G, H
(NGADJUI, 1999)
dorsmanins I, J
epi-dorsmanis F e G
e treze flavonóides 4-hidroxiloncocarpina; 4-metoxiloncocarpina; 6-
prenilcrisoeriol; 6,8-diprenileriodictiol; gancaonin P e “dorsmanins” A-H
(NGADJUI, 2000)
Continuação da Tabela 1
16
D. kameruniana
Dois novos flavonóides
apigenina
Duas chalconas
(ABEGAZ, 1998)
D. barteri
dorstenona(flavonóide)
4,2’,4’-triidroxi-3’-prenilchalcona;
4,2’,4’-triidroxi-3,3’-diprenilchalcona,
5,7,4’-triidroxi-8-prenilflavona
(TSOPMO, 1999)
D. prorepens
5,3’-(3,7-dimetil-2,6-octadienil)-3, 4,2’,4’-tetrahidroxichalcona
(chalcona digeranilada)
*único exemplo encontrado na literatura.
(ABEGAZ, 2002)
D. zenkeri
3’,4’-(3-hidroxi-2,2-dimetilidropirano)-4,2’-diidroxichalcona;
4,2’,4’- triidroxichalcona;
4,2’,4’-triidroxi-3’-prenilchalcona,
e uma bichalcona, além dos compostos p-hidroxibenzaldeído e dorsmanin
A (ABEGAZ, 2002)
D. dinklagi
dinklgins A, B, C (flavonoides prenilados)
6-prenilapigenina
4- hidroxiloncocarpina
estipulina
5,4’-dihidroxi-6’’,6’’-dimetilcromano-(7,6,2’’,3’’)-flavona
(NGADJUI, 2002)
D. barnimiana
6-metoxi-5-vinilbenzofurano;
4,6-dimetoxi-5-vinilbenzofurano
2,4-dimetoxiestireno
* primeiros exemplos de ocorrência natural de estirenos*
(WOLDU, 1988)
Continuação da Tabela 1
17
Os dados farmacológicos sobre o gênero Dorstenia são escassos, mas sabe-
se que todas as espécies do gênero conhecidas como carapiá, são dotadas de
qualidades medicinais.
Na tabela 2 são expostos alguns estudos realizados avaliando propriedades
farmacológicas de espécies de Dorstenia.
Tabela 2 - Atividades farmacológicas estudadas de algumas espécies de Dorstenia
ATIVIDADE
FARMACOLÓGICA
ESPÉCIE
DE
DORSTENIA
REFERÊNCIA
Atividade fototóxica utilizando
bactéria gram-negativa E. coli
5 espécies de Dorstenia apresentaram
compostos fotossensibilizantes potentes
(psoraleno e bergapteno)
SWAIN e
DOWNUM
(1990)
Atividade analgésica e/ou
antiinflamatória
D. brasiliensis nas doses de 1-2g/kg
apresentaram atividade analgésica e
antiinflamatória.
RUPPELT (1991)
Atividade Leshimanicida
D.multiradiata foi ativa nas concentrações
de 50 µg/ml contra Leshimania visceral
isolada
IWU.( 1992)
Atividade anti-hipertensiva
D.psilurus apresentou efeito anti-
hipertensivo em ratos hiperinsulinêmicos
e hipertensos, além de diminuir os níveis
de colesterol e insulina
DIMO (2001)
Atividade antioxidante
Espécies africanas se mostraram bons
antioxidantes.
CROFT(1998)
Atividade citotóxica
As propriedades citotóxicas de espécies
africanas de Dorstenia, foram avaliadas
apresentando valores de ED
50
<4mg/ml
em várias linhagens de células.
ABEGAZ (2002)
Atividade citotóxica
Avaliação da citotoxicidade dos ácidos
dorstenicos A e B (triterpenos) de D.
brasiliesnis contra células leucêmicas
L=1210 e HL=60
UCHIYANA (2002)
18
Além dos estudos expostos na tabela 2, Vilegas, 1997, relatam serem os
compostos terpênicos encontrados nestas espécies os principais responsáveis por
seus usos populares como antiofídicos.
2.3 Aspectos químicos e farmacológicos das classes de substâncias
encontradas nas espécies estudadas
Inúmeras classes de diferentes produtos naturais têm sido empregadas
estrategicamente para a síntese de diferentes substâncias bioativas, ou
responsáveis por certa atividade biológica.
A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de alguns de
seus constituintes, tais como flavonóides, alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos,
taninos, ligninas, cumarinas etc., tem sido objeto de incessantes estudos, nos quais
já foram comprovadas as ações farmacológicas através de testes pré-clínicos com
animais. Muitas destas substâncias têm grandes possibilidades de futuramente
virem a ser aproveitadas como agentes medicinais.
2.3.1 Terpenóides
Os terpenos são originados da via do acetato-mevalonato a partir de uma
unidade isopreno. A classificação dos terpenos é feita de acordo com a quantidade
de unidades isopreno em hemiterpenóides, C5; monoterpenóides, C10;
sesquiterpenóides, C15; diterpenóides, C20; triterpenóides, C30; e carotenóides,
C40. Eles apresentam funções variadas nos vegetais. Os monoterpenos são
constituintes dos óleos voláteis, atuando na atração de polinizadores. Os
sesquiterpenos, em geral, apresentam funções protetoras contra fungos e bactérias,
enquanto muitos diterpenóides dão origem aos hormônios de crescimento vegetal.
Os triterpenóides e seus derivados, os esteróides, apresentam uma gama de
funções. Muitos têm funções de proteção contra herbívoros, alguns são
antimitóticos, e outros atuam na germinação das sementes e na inibição do
crescimento da raiz (VICKERY e VICKERY, 1981; HARBONE e BAXTER, 1999).
19
Estes têm bastante propriedades medicinais, com grandes potencialidades
em atividades biológicas: são antiinflamatórios, antibacterianos, fungicídas,
antivirais, analgésicos, cardiovasculares, antitumorais.
Devido à sua grande diversidade, o seu estudo tem sido de grande interesse
na tentativa de novas e reais aplicabilidades farmacológicas.
Investigadores da Universidade do Wisconsin, Departmento de Dermatologia,
verificaram, em ensaios realizados in vitro, que o tratamento de células de carcinoma
da próstata, sensíveis a androgenio, com o triterpeno lupeol (Figura 10-1), existente
em vários frutos e vegetais, originava um elevado número de células mortas
(apoptose). Concluíram, assim, que o lupeol pode ser um agente muito efetivo no
combate ao câncer da próstata (MOHAMMAD, 2005).
Segundo Duke (1997), o taraxerol (Figura 10-2) apresenta relatos sobre suas
atividades anti-secretória e antiulcerativa; o germanicol(Figura 10-3) não apresenta
atividades biológicas relatadas.
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 4
1 5
1 6
1 7
1 3
1 8
2 3
2 4
2 5
2 6
2 7
2 8
1 9
2 1
2 2
2 0
2 9
3 0
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 4
1 5
1 6
1 7
1 3
1 8
1 9
2 0
2 1
2 2
2 3
2 4
2 5
2 6
2 7
2 8
2 9
3 0
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 3
1 4
1 5
1 6
1 7
1 8
1 9
2 0
2 1
2 2
2 3
2 4
2 5
2 6
2 7
2 8
2 9
3 0
1. Lupeol 2. Taraxerol 3. Germanicol
Figura 10 – Terpenóides encontrados nas espécies estudadas
2.3.2 Esteróides
Grupo de compostos policíclicos bastante relacionados bioquimicamente com
os terpenos incluem o colesterol, numerosos hormônios, precursores de certas
vitaminas, ácidos biliares, álcoois (esteróis), certas drogas e venenos naturais.
Os esteróides têm como núcleo comum, um sistema fundido reduzido de anel
20
com 17 átomos de carbono, o ciclopentanoperidrofenantreno. A maioria dos
esteróides também tem dois grupos metilas e uma cadeia lateral alifática ligada ao
núcleo. São componentes essenciais às membranas das células, e podem ser
produzidos por animais e plantas. Os fitosteróis são esteróis oriundos dos óleos
vegetais e apresentam grande similaridade estrutural com o colesterol. São
compostos com 28 ou 29 carbonos, diferindo do colesterol (27 carbonos) pela
presença de um grupo metila ou etila adicional na cadeia carbônica. Dentre os mais
conhecidos, o β-sitosterol, que apresenta uma insaturação em sua estrutura, similar
ao colesterol. Quando essa dupla ligação não está presente ou é desfeita
artificialmente, temos o análogo β -sitostanol. Os estanóis são os esteróis saturados
e podem ser extraídos dos alimentos ou produzidos artificialmente por meio de
hidrogenação, sendo menos abundantes nos alimentos in natura do que os esteróis.
(MARTINS, 2004)
No ano de 2000, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou os usos
terapêuticos dos ésteres de esterol ou estanol vegetal na redução do risco de
doenças cardiovasculares.
Drogas esteroidais possuem uma vasta gama de aplicações e são usadas
como antiinflamatórios, anticancerígenos, tratamento de desordens por deficiência
hormonal, como contraceptivos orais e agentes anabólicos.
O β-sitosterol livre, ocorre naturalmente (Figura 11) e é usado como droga
reguladora de lipídeos no tratamento de hiperlipidemias. Também é usado em
hiperplasia benigna de próstata (MIETTINEN e GYLLING, 1999).
Figura 11 – β-sitosterol livre
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
21
2.3.3 Flavonóides
Os flavonóides são compostos polifenólicos que apresentam estrutura
química de 15 átomos de carbono, ou seja, 2 anéis de benzeno (anéis A e B) ligados
por um grupo pirano (anel C), conforme mostra a figura 12, cuja representação da
fórmula é C6 -C3 -C6 (HERRMANN, 1976).
O
A
B
C
8
7
6
5
4
3
6 '
5 '
4 '
3 '
2 '
Figura 12: Estrutura básica dos flavonóides
A estrutura química dos flavonóides favorece sua ação antioxidante. Os
hidrogênios dos grupos hidroxilas adjacentes (orto-difenóis), localizados em várias
posições dos anéis A, B e C, as duplas ligações dos anéis benzênicos e a dupla
ligação da função oxo (-C=O) de algumas moléculas de flavonóides fornecem a
esses compostos alta atividade antioxidante (HRAZDINA, BORZEL e ROBINSON,
1970; RICE-EVANS, 1996). Os fenóis em geral são altamente sensíveis à oxidação
enzimática e não-enzimática (HRAZDINA, BORZEL e ROBINSON, 1970).
Os flavonóides constituem um grupo de substâncias naturais que possuem
atividades biológicas bastante diversificadas Dentre os metabólitos secundários de
importância farmacológica, os flavonóides se destacam por apresentarem
propriedades antioxidantes, antimutagênica, anticarcinogênica, antiinflamatória e
antimicrobiana (FERGUSON, 2001).
Existem mais de 5000 substâncias identificadas e derivadas de plantas que
são reconhecidas como flavonóides. Nos vegetais, seriam os responsáveis pela sua
cor e teriam a função de proteger a planta da ação do oxigênio da atmosfera. Por
analogia, espera-se uma ação semelhante no organismo humano, ao proteger as
células do corpo, principalmente as dos vasos, das agressões e degenerações
22
decorrentes da ação dos radicais ácidos sobre os tecidos (SIMÕES, 2002).
Estudos sobre sua ação antioxidante, envolvendo não só os compostos
flavonoídicos, como também os seus precursores biossintéticos, já foram bastante
difundidos (RICHARDSON et al., 1974; PRATT e BIRAC, 1979; RIOS et al., 1992).
Os flavonóides quercetina, canferol (Figura 13-1 e 13-2) têm-se mostrado ativos
como agentes antiinflamatórios, atuando na inibição da biossíntese de eicosanóides
envolvidos em processos inflamatórios via atividade antiradicalar e antiperoxidante
(LARSON, 1988).
Hoje existe uma grande discussão em relação à doença de Alzheimer,
causada pela presença de radicais livres, através do acúmulo de β-amilóide. A
liberação dessa proteína conduz, por fragmentação, à formação de radicais livres,
que modificam as membranas dos neurônios (HENSLEY, 1994).
O
A
B
C
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
A
B
C
OH
OH
OH
OH
O
O
A
B
C
OH
OH
OH
OH
OH
O
1
2
3
Figura 13: Estrutura dos flavonóides Quercetina(1), Canferol (2), Miricetina(3)
Pratt e Birac (1979) estudaram os efeitos da quercetina, quercetrina,
miricetina (Figura 13-3), miricetina-3-monoglucosídeo, quercetina 3-monoglucosídeo,
quercetina 3-triglicosídeo extraídos de sementes de diversas plantas como
antioxidantes por meio da determinação da atividade antioxidante, utilizando
seqüestro de radicais livres do DPPH e fazendo determinações espectrométricas a
217 mm, enquanto Rios et al. (1992) testaram os efeitos de cinco flavonóides
glicosilados de Sideritis javalambrensis como inibidores da peroxidação de lipídeos
nos microssomas.
23
Richardson (1974) testaram o efeito de flavonas e derivados de flavonas
como antioxidantes em amostras de leite e comprovaram a eficácia de suas ações.
Com base nos estudos realizados até então, surgem três requisitos na
estrutura química dos flavonóides, possivelmente responsáveis pela atividade de
neutralização de radicais exercida por esta classe de compostos, sendo eles:
1. presença do grupo orto-diidroxi ou grupo catecol no anel B, o que
confere uma maior estabilidade à forma radicalar, pois contribui para
uma deslocalização dos elétrons;
2. ligação dupla conjugada com a função 4-oxo, aumenta a
deslocalização eletrônica a partir do anel B;
3. grupos hidroxilas nas posições 3 e 5 com função oxo, que promove a
deslocalização eletrônica do grupo 4-oxo para esses dois substituintes.
A atividade antioxidante de um flavonóide é, então, determinada pelo anel B,
enquanto a estrutura base restante tem apenas uma pequena influência. Isto se
verifica devido a uma maior capacidade eletrodoadora deste anel, havendo uma
maior influência da restante estrutura base com o decréscimo da atividade
antioxidante do anel B. O arranjo espacial dos substituintes presentes na molécula
torna-se um fator que contribui também com bastante peso para a atividade
antioxidante destes compostos ( SILVA, 2002).
Dependendo da substituição e do nível de oxidação do anel C, os flavonóides
podem ser divididos em diferentes classes:
1. flavanóis: possuem um grupo hidroxilo na posição 3;
2. flavonóis: possuem um grupo carbonilo na posição 4, um grupo
hidroxilo na posição 3 e uma ligação dupla entre as posições 2,3;
3. flavonas: possuem um grupo carbonila na posição 4 e ligação dupla
entre 2,3;
4. antocianidinas: possuem um grupo hidroxilo na posição 3, e duas
ligações duplas, uma entre o átomo de O e o carbono 2 e outra entre
os carbonos 3 e 4;
5. flavononas: possuem um grupo carbonilo na posição 4.
24
Dentro da mesma classe, os flavonóides diferem na substituição dos anéis A
e B. Estes se encontram na natureza sob a forma de glicosídeos, os quais se
formam através da união de resíduos de D-glicose à posição 3 ou à posição 7 destes
flavonóides, sendo a primeira substituição a mais freqüente. Outros resíduos de
açúcares também podem ser encontrados ligados a este tipo de compostos: D-
galactose, a L-ramnose, a L-arabinose, a D-xilose e o ácido D-glicorônico
(MARTINEZ, 2002).
A presença destes flavonóides em uma droga vegetal não necessariamente
explica as propriedades farmacológicas desta, entretanto, aos flavonóides são
atribuídas várias propriedades farmacológicas, incluindo atividades inibidoras de
enzimas (hidrolases, ciclooxigenases, fosfatase alcalina, cAMP fosfodiesterases,
ATP-ases, liases, hidroxilases, transferases, oxidoredutases quinases),
antiinflamatória, anticancerígena, antibacterial, antiviral, cofator da vitamina C,
hipocolesterolêmica, reduzindo, assim, o risco de doenças cardiovasculares e um
dos principais mecanismos de ação propostos é a inibição das enzimas, envolvidas
no metabolismo final do araquidonato (SILVA,2002)
Sabe-se também que alguns flavonóides inibem a agregação plaquetária, com ação
vasodilatadora (naringenina, eriodictiol e luteolina), e com ação antiarrítmica,
algumas chalconas têm ação antimicótica e antibacteriana (SILVA,2002).
A 3-ramnosilquercetina apresenta atividade antidiarréica, as
isoflavanquinonas apresentam potente atividade resistenciatória e antialérgica,
alguns flavononoes com atividade antiespasmolítica, isoflavonas e flavanonas têm
ação antimicótica, isoflavanos são antimicrobianos e flavanos apresentam atividade
leishmanicida.(FORMICA, 1995)
O glicosídeo acilado, o canferol-3-O-(6”-O-ρ-cumaroil)-β-D-glicopiranose,
identificado como sendo o flavonóide tilirosídeo foi isolado previamente de Tília
argenta (CHARI; JORDAN e WAGNER, 1978), também extraído como composto
majoritário do extrato etanólico das partes aéreas de Cróton gnaphalii Baill
(LENCINA, 2001), e em outras espécies como Pteridium aquilinum, Rosa spp, Tília
sp. , apresenta como atividade biológicas já avaliadas, as atividades anti HIV,
diaforético e protisticida.
A astragalina, um dos flavonóides mais encontrados em espécies
vegetais, vem chamando a atenção dos pesquisadores pelos benefícios que traz à
saúde e por suas atividades biológicas, incluindo efeitos antioxidantes (KOVGANKO
25
et al., 2002, anti-HIV (SHINAZI.,1997) efeito antialérgico (MATSUMOTO et al.,
2002). Além disso, a astragalina é responsável pela coloração de alguns vegetais
usados como suplementos nutricionais (SIMÕES, 2002).
2.3.4 Cumarinas
Constituem uma classe de metabólitos secundários derivados do ácido
cinâmico, por ciclização lateral do ácido o-cumárico, amplamente distribuídos no
reino vegetal, podendo também ser encontrados em fungos e bactérias. A esses
compostos atribui-se uma grande variedade de atividades biológicas, como a
antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória, antiespasmódica, antitumoral e
antioxidante, as quais podem estar relacionadas com a inibição da atividade de
enzimas, por exemplo, daquelas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico,
e com a sua atividade “scavenger” de espécies reativas de oxigênio (ROS). Vários
estudos têm sido realizados para o entendimento do mecanismo de ação dessas
drogas, o que pode levar ao desenvolvimento de medicamentos para o tratamento e
profilaxia de doenças, além de ser útil na indústria alimentícia e cosmética (DI-
STASI, 1994).
Cumarinas também apresentam atividade antimicrobiana, como a hortiolona
isolada de Pilocarpus spicatus St. Hill. que inibe o crescimento de Bacillus subtilis,
B. antharacis, B. mycoides, Micrococcus citreus e Sarcina lutea, com concentrações
inibitórias mínimas de 20-30 mg/mL (MELLO, et al,. 1979).
As furanocumarinas, compostos aromáticos derivados das cumarinas por
adição de um grupo furano, têm muitos efeitos biológicos conhecidos, entre os quais
ação como antibióticos, drogas antitumorais e na repigmentação da pele em
doenças como vitiligo. De acordo com a posição em que ocorre esta fusão as
furanocumarinas podem apresentar estrutura linear ou angular. Como exemplos de
furanocumarinas lineares, podem ser citados o bergapteno e o psoraleno. As
furanocumarinas possuem ação fotossensibilizante, aumentando a pigmentação da
pele, justificando-se assim seu emprego nos tratamentos específicos do vitiligo e
discromias. Os principais efeitos tóxicos do tratamento com furanocumarinas são o
fotoenvelhecimento e o câncer de pele, o que justifica cada vez mais uma
26
compreensão e estudo da atividade fotobiológica destes compostos, visando uma
avaliação dos possíveis riscos e benefícios do seu emprego fotoquimioterápico.
Alguns desses compostos são também suspeitos de induzir carcinogênese química.
O mecanismo de ação citotóxica das furanocumarinas é bastante simples,
envolvendo intercalação no DNA, enquanto outras famílias de drogas possuem
mecanismo de ação multimodal.
Os psoralenos, produtos provenientes de plantas, atualmente preparados em
laboratório, são compostos fotossensibilizadores, usados em fotomedicina, há vários
anos, para o tratamento de doenças de pele como psoríase. Alguns estudos indicam
que também podem ser usados para tratamento de linfomas das células T, na
prevenção da rejeição de órgãos transplantados e, ainda no tratamento de outras
doenças. Foram desenvolvidos estudos clínicos entre 1975 e 1980, com 2000
pacientes, nos Estados Unidos, e cerca de 3000 na Europa. Estas investigações
confirmaram um grau de eficácia elevado na terapia PUVA (psoraleno + UVA) para o
tratamento da psoríase, quando administradas em doses adequadas de psoraleno e
radiação (PATHAK, 1992).
Atualmente, o tratamento PUVA, é utilizado em outras doenças além da
psoríase, tais como, dermatite atópica e da mão e outros eczemas, linfoma cutâneo
de célula T (conhecido como micose fungóide), pitiríase liquenóide, pustulose
plantar, vitiligo, esclerose sistemática, artrite reumatóide e lúpus eritematoso
sistêmico, entre outras (LEDO, 2000; PATHAK, 1992). Os análogos angulares dos
psoralenos, as angelicinas, obtidos também de plantas são conhecidas pelas suas
propriedades antifúngicas (SADARI, 1999). Não obstante, os psoralenos têm
também propriedades farmacológicas, na ausência de radiação, como no tratamento
da depressão e da esclerose múltipla, por bloquearem os canais de potássio
(MIOLO, 1999).
Fora da área clínica, os psoralenos são utilizados em estudos de biologia
molecular, como reagentes fotoquímicos para a investigação da estrutura dos ácidos
nucléicos e, na agricultura, no combate a pragas (LLANO, 2003; MAL, 1998; SONG,
1979; STEVENSON, 2003). O interesse gerado por este tipo de compostos é bem
demonstrado pela aposta que grupos de diversos países, como Itália, EUA,
Austrália, Alemanha, Egito, Rússia, Polônia, Hungria, Inglaterra, Espanha, França,
Suécia, Holanda, Brasil e Portugal entre outros, têm feito na investigação sobre a
síntese e as propriedades de psoralenos e análogos com propriedades terapêuticas
27
superiores ( OLIVEIRA, 2005).
O psoraleno não substituído é um composto aromático tricíclico em que um
anel furano está fundido com uma cumarina e, por isso é, muitas vezes, designado
furanocumarina. A atribuição do nome dos psoralenos substituídos obedece, muitas
vezes, à numeração indicada na fórmula da estrutura que serve de base a vários dos
nomes atribuídos aos psoralenos utilizados ao nível clínico, como por exemplo 8-
MOP (8-metoxipsoraleno). Segundo as normas da IUPAC, o nome do psoraleno é
7H-furo{3,2-g}cromen-7-ona(=7H-furo{3,2-g}{1}benzopiran-7-ona) e atende à
numeração que se encontra indicada na estrutura (Figura 14-1). O 5-
metoxipsoraleno (bergapteno, figura 14-2), fortemente melanogênico, pode ser útil,
no vitiligo e outras enfermidades por fotossensibilidade; entretanto, seu uso não está
aprovado nos Estados Unidos. (BAUGHMAN 1998).
Figura 14 – Estruturas do psoraleno(1)e bergapteno(2)
A numeração atribuída a este sistema tricíclico obedece, entre outras, à regra
de que os átomos de carbono, incluindo os quaternários, devem ter a numeração
mais baixa possível. Assim, por exemplo, são referidos e utilizados, na medicina,
além do 8-MOP, também chamado, ao nível clínico, metoxsaleno, o 5-MOP,
conhecido como bergapteno e o 4,5’,8-trimetilpsoraleno (TMP), chamado de
trioxsaleno ( GIA; et al.,1993).
Propriedades biológicas de psoralenos, análogos e derivados:
• podem gerar oxigênio singleto e outras espécies reativas de oxigênio;
• provocam a oxidação de aminoácidos, lipídios, ADN, etc.;
• formam diaductos através de ligações cruzadas covalentes com o ADN;
• podem formar apenas monoaductos com o ADN, dependendo da estrutura
O
O O
H
H
O
O O
M e O
H
1
2
1
2
345
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
1
2
345
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
11
O
O O
H
H
O
O O
M e O
H
1
2
1
2
345
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
1
2
345
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
11
28
e do comprimento de onda da radiação;
• ligam-se preferencialmente a seqüências ricas em A-T;
• provocam a formação de ligações cruzadas ADN-proteína;
• estabelecem ligações com lipídios, com ARN e com componentes
importantes das membranas celulares;
• inibem a síntese de ácidos nucléicos, proteínas, enzimas (topoisomerase
II) e o funcionamento de outros componentes celulares como ribossomas
e lissossomas;
• têm diferentes solubilidades em água;
• absorvem a comprimentos de onda diferentes e com intensidades
variadas;
• atuam após ativação de radiação UVA, mas também na ausência de luz.
A umbeliferona, ou 7-hidroxi-cumarina (Figura 15) é uma cumarina muito
comum em plantas da família das Umbeliferae, encontrando-se, por exemplo, na
cenoura e nos coentros. É um composto que absorve intensamente a luz UV nos
comprimentos de onda de 300, 305 e 325 nm. É devido a esta propriedade que é
utilizada em cremes e loções como protetor solar.
Figura 15 – Estrutura da umbeliferona
Atualmente a umbeliferona utilizada no mercado é produzida por síntese.
Existem vários processos um dos quais se apresenta a seguir (Figura 16):
O O
O H
1
2
3
45
6
7
8
9
10
O O
O H
1
2
3
45
6
7
8
9
10
29
O H
O H
OO H
Á c i d o m á l i c o
H 2 S O 4 , 1 2 0 °
- C O 2 , - H 2 O
OO
OH
H
Á c i d o f o r m i l a c é t i c o
g e r a d o i n s i t u
OH
OH
r e s o r c i n o l
+
H 2 S O 4 , 1 2 0 °
O
OOH
u m b e l i f e r o n a
Figura 16 – Síntese química da umbeliferona
2.4. Considerações sobre os métodos físico-químicos utilizados para
determinação estrutural
2.4.1 Técnicas utilizadas para determinação estrutural dos metabólitos
Para a determinação de suas estruturas, as principais ferramentas atualmente
utilizadas são: espectrometria de massas (EM) e a espectroscopia RMN. Técnicas
auxiliares como a espectroscopia no IV e UV, juntamente com reações de
degradações químicas, também podem ser utilizadas.
A utilização da técnica de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
de
1
H e
13
C é indispensável nas determinações estruturais de substâncias naturais.
Estas já demonstraram ser valiosas para identificação e determinação da estrutura
de várias classes de substâncias encontradas em plantas, bem como, para definir a
configuração relativa destas, principalmente após o surgimento das técnicas
bidimensionais (2D) homonucleares e heteronucleares, tais como: COSY, NOESY,
HMQC e HMBC e outros.
Além de informações sobre a fórmula constitucional, as análises de RMN
também fornecem valiosas informações quanto a aspectos estereoquímicos e
conformacionais.
A aplicação da difração de Raios-X também é um método auxiliar de grande
importância na elucidação estrutural, principalmente em análises conformacionais e
configuracionais. Um dos problemas encontrados para a utilização desta ferramenta
é a dificuldade em se obter cristais ideais. Normalmente, são substâncias amorfas,
ou que formam cristais em forma de agulhas muito finos e pequenos para a
30
cristalografia.
2.5 Considerações sobre os principais ensaios biológicos realizados
A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como seus
mecanismos de ação vem sendo um dos maiores desafios para a química, química
farmacêutica, bioquímica e a farmacologia. As plantas contêm inúmeros constituintes
e seus extratos, quando testados, podem apresentar efeitos sinérgicos entre os
diferentes princípios ativos, devido à presença de compostos de classes ou
estruturas diferentes, contribuindo para a mesma atividade. No estudo da atividade
biológica de extratos vegetais, é importante a seleção de bioensaios para a detecção
do efeito específico. Os sistemas de ensaio devem ser simples, sensíveis e
reprodutíveis.
Os bioensaios podem envolver organismos inferiores (microorganismos e
microcrustáceos, entre outros), ensaios bioquímicos visando alvos moleculares
(enzimas e receptores) e cultura de células animais ou humanas.
2.5.1 Atividade antimicrobiana
O Brasil dispõe de uma grande variedade de plantas medicinais que estão
sendo utilizadas, a grande maioria sem qualquer comprovação científica quanto a
sua eficácia. Este fato faz com que haja grande interesse na pesquisa para se
verificar a presença de atividade farmacológica nestas plantas.
Neste sentido, um dos primeiros testes executados é a determinação da
atividade antimicrobiana. Este teste é importante, pois existe um consenso entre os
farmacólogos que estudam produtos naturais de que as substâncias que
apresentam atividade antimicrobiana têm grande probabilidade de possuir outras
atividades farmacológicas (GIESBRECHT, 1980).
Nas últimas décadas, o uso irracional de antimicrobianos determinou o
surgimento de cepas de microrganismos multirresistentes, impulsionando a
31
comunidade científica à pesquisa nas áreas da química, farmacologia e
microbiologia para descoberta de novos agentes antimicrobianos (CECHINEL FILHO
et al.; 2000; MACIEL; et al., 2002; SOUZA; et al., 2003). Linhas de pesquisas têm
sido desenvolvidas por diversos pesquisadores, baseadas nas propriedades
antinfecciosas e antiinflamatórias de muitas plantas de utilização consagrada pela
medicina popular e poderão contribuir inovadoramente na terapêutica antimicrobiana
(YAMAMOTO e OGAWA, 2002; HOLETZ et al., 2002; ZACCHINO et al., 2003).
No Brasil, as pesquisas sobre substâncias antimicrobianas de origem vegetal
tiveram início com Cardoso e Santos (1948) que avaliaram extratos de 100
diferentes plantas, indicadas em terapêutica como antiinflamatórias ou cicatrizantes.
Destas, apenas cinco extratos apresentaram atividade inibitória contra
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e Proteus X-19.
A partir do ano de 1950 foram isolados os primeiros compostos de espécies
vegetais: o diterpeno biflorinina, e o triterpeno maitenina. Flavonóides com
propriedades antimicrobianas efetivas contra Staphylococcus aureus resistente a
meticilina (MRSA) foram isolados, como a primina, a miconidina, lapachol e
derivados, a plumbagina, a xantoxilina, filantidina, luteolina, mirecetina (XU e LEE,
2001; ZACCHINO, 2003).
As plantas possuem várias vias metabólicas secundárias que dão origem a
diversos compostos como alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos,
cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos que, por vezes, são específicos de
determinadas famílias, gêneros ou espécies, e cujas funções, até pouco tempo,
eram desconhecidas (SIMÕES., 2003, SOUZA., 2003). Com os avanços das
pesquisas, foram atribuídas às referidas substâncias, importâncias relevantes nos
mecanismos de defesa das plantas contra seus predadores, sejam fungos,
bactérias, vírus, parasitas, insetos, moluscos ou animais superiores (LIMA, 2001;
NIERO et al., 2003). Além disso, em determinadas circunstâncias, algumas plantas
superiores podem formar substâncias de natureza antimicrobiana, denominadas
fitoalexinas. Estas são produzidas como resposta imediata a agressões por fungos,
bactérias, vírus ou nematóides, ou em função de determinados estímulos, como
radiações, agentes químicos e outras injúrias (GNANAMANICKAM, 1981; LIMA,
1996; YUNES e CALIXTO, 2001).
A atividade antimicrobiana pode ser determinada pela concentração mínima
inibitória (CIM) ante um determinado microorganismo. Vários outros métodos foram
32
propostos para verificar a atividade antimicrobiana de substâncias. Os métodos de
estrias no ágar, difusão em ágar, diluição em ágar e diluição em meio líquido são
alguns dos mais utilizados. O valor da CIM depende do método empregado
(GIESBRECHT, 1980; HENSLEY, 1994; RECIO, 1989; SAXENA, HANCOCK;
TOWERS, 1994). Algumas amostras quando adicionadas ao meio de cultura
resultam em turvação do sistema. O teste necessita então de um recurso
complementar. Por este motivo neste estudo optou-se por utilizar três metodologias
diferentes, difusão em ágar com discos, bioautografia e CIM.
2.5.2 Toxicidade aguda
Entende-se por agente tóxico uma substância química capaz de causar dano
a um sistema biológico, alterando seriamente sua função ou levando-o à morte
(ZANINI e OGA, 1994). Alterações patológicas resultantes do uso dessas
substâncias caracterizam a intoxicação. Esse efeito correlaciona-se com as
condições às quais o organismo é exposto como, por exemplo, dose, tempo de
tratamento, nível de stress, etc. Assim, a manifestação do efeito tóxico depende das
condições internas do organismo, além das condições ambientais nas quais o
organismo está inserido.
A determinação da toxicidade aguda de uma substância é extremamente
importante, principalmente considerando o uso indevido pela população. Um grande
número de plantas têm sido utilizado pela população em razão dos seus efeitos
terapêuticos. A grande maioria dos estudos realizados com espécies brasileiras
aborda aspectos botânicos e químicos. Poucos estudos têm avaliado o efeito tóxico.
Esse estudo é uma avaliação estimativa e preliminar das propriedades tóxicas
de uma substância-teste, fornecendo informações acerca dos riscos para a saúde,
resultantes de uma exposição de curta duração via escolhida. Por definição,
toxicidade aguda é o efeito nefasto que se produz dentro de um curto período de
tempo e que resulta da administração de uma dose única, ou de várias doses de
uma substância em um período de 24 horas. Dose letal mediana ou DL
50
é um valor
estatisticamente derivado da administração de uma dose única de uma substância
que pode provocar a morte de 50% dos animais da experiência. A dose é expressa
33
em grama ou miligrama por quilo de peso corporal do animal (BRITO, 1994).
Os experimentos são realizados normalmente, utilizando-se camundongos
como animais de laboratório. Entretanto, as normas éticas internacionais
recomendam o uso criterioso de animais de laboratório e o desenvolvimento de
métodos experimentais alternativos. Com base nestes critérios o ensaio da
letalidade de organismos simples, como o microcrustáceo marinho Artemia salina
Leach, permite a avaliação da toxicidade geral e é considerado um bioensaio
preliminar no estudo de extratos e metabólitos especiais com potencial atividade
biológica.
Utilizando-se a concentração letal média (CL
50
), é possível determinar e
avaliar a atividade biológica (toxicidade) de um determinado composto ou extrato
natural (BRITO, 1994).
2.5.3 Atividade analgésica
A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor como uma
experiência sensorial e emocional desagradável, associada com dano tecidual real
ou potencial, ou descrita em termos de tal lesão ( DICKENSON e BESSON, 1997).
Entretanto, a dor é uma experiência complexa que não envolve apenas a
transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas também cognitivo e emocional
processado pelo cérebro (JULIUS e BASBAUM, 2001).
Os receptores da dor na pele e em outros tecidos estão presentes em
terminações nervosas livres sensíveis a estímulos dolorosos. A atividade no
nociceptor e a via nociceptiva e outros processos neurofisiológicos induzidos pelo
estímulo doloroso é chamado de nocicepção ( DICKENSON e BESSON, 1997).
Os estímulos nocivos tais como calor, frio, compressão intensa ou
substâncias químicas endógenas ou exógenas, potencialmente nocivas, ativam as
terminações nervosas livres e periféricas de fibras aferentes sensoriais, chamadas
de nociceptores.
Conforme descreve Pietrovski (2004), existem vários métodos de avaliação
da atividade antinoniceptiva em camundongos, entre eles; testes das contorções
abdominais induzidas pela injeção intraperitoneal de ácido acético, nocicepção
34
induzida pela injeção plantar de formalina, nonicepção induzida pela injeção
intraplantar de glutamato, teste da placa quente.
O teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético, embora
consista em um modelo mais simples e pouco específico, permite avaliar a atividade
antinociceptiva de várias substâncias que atuem tanto em nível central quanto
periférico. As contorções abdominais consistem na contração da musculatura
abdominal juntamente com a extensão de uma das patas posteriores (COLLIER et
al., 1968 ; BENTHEY et al., 1981). Já o teste da placa quente é um modelo de dor
muito sensível para drogas que atuem centralmente como a morfina e seus
derivados, onde o tempo em segundos que o animal leva para lamber, morder ou
levantar as patas dianteiras sobre a placa previamente aquecida, é cronometrado e
considerado como indicativo de efeito nociceptivo( EDDY e LEIMBACK, 1953).
2.5.4 Atividade antioxidante
Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de
lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações em cadeia
de oxidação. A atividade antioxidante de compostos fenólicos é principalmente
devida às suas propriedades de óxido-redução, as quais podem desempenhar um
importante papel na absorção e neutralização de radicais livres, quelando o oxigênio
triplete e singlete ou decompondo peróxidos. Em geral, existem duas categorias
básicas de antioxidantes: os naturais e os sintéticos (SIMÃO, 1985; FENNEMA,
1993; BRENNA e PAGLIARINI, 2001; WANG e ZHENG, 2001). Diversos estudos
têm demonstrado que o consumo de substâncias antioxidantes na dieta diária pode
produzir uma ação protetora efetiva contra os processos oxidativos que naturalmente
ocorrem no organismo. Foi descoberto que uma série de doenças, entre as quais
câncer, arteriosclerose, diabetes, artrite, malária, AIDS e doenças do coração,
podem estar ligadas aos danos causados por formas de oxigênio extremamente
reativas denominadas de "substâncias reativas oxigenadas" ou simplesmente ROS.
Estas substâncias também estão ligadas com processos responsáveis pelo
envelhecimento do corpo (BRENNA e PAGLIARINI, 2001; YILDIRIM, MAVI; KARA,
2001). Os mecanismos endógenos de defesa (ou mediadores de redox tais como
35
superóxido dismutase, catalase, peroxidase e metaloproteínas) podem ser auxiliados
favoravelmente com a introdução de antioxidantes por meio da dieta (BRENNA e
PAGLIARINI, 2001; YILDIRIM, MAVI; KARA, 2001). As ROS's são, na verdade, as
várias formas de oxigênio ativado (singlete), entre as quais se incluem os
denominados radicais livres. Nos organismos vivos as várias formas de ROS's
podem ser constituídos de diversas maneiras. Por exemplo, nas fontes exógenas
produtoras de radicais livres incluem-se a fumaça do tabaco, radiações ionizantes,
solventes orgânicos e pesticidas (YILDIRIM, MAVI e KARA, 2001).
A partir do início dos anos 80, o interesse em encontrar antioxidantes naturais
para o emprego em produtos alimentícios, ou para uso farmacêutico e cosmético
tem aumentado consideravelmente, com o intuito de substituir antioxidantes
sintéticos os quais têm sido restringidos devido ao seu potencial de carcinogênese,
bem como pela comprovação de diversos outros males, como aumento do peso do
fígado e significativo aumento do retículo endoplasmático (SIMÃO, 1985; WANG e
ZHENG, 2001; MELO; GUERRA, 2002; YILDIRIM, MAVI e KARA, 2001).
As evidências científicas permitem afirmar que a propriedade antioxidante das
plantas deve-se, principalmente, a seus compostos fenólicos. A maioria destes
compostos, com exceção do tocoferol, possuem grupos funcionais ativos na posição
orto enquanto que nos antioxidantes sintéticos, com exceção dos galatos, esses
grupos encontram-se na posição para, sem que haja mudança na ação (POKORNÝ,
1991).
Diversas pesquisas à nível nacional e internacional sobre propriedade
antioxidante de vegetais foram realizadas nos últimos 20 anos, em decorrência da
busca de um estilo de vida mais saudável e da constatação de que certas plantas
apresentam substâncias biologicamente ativas que trazem benefícios à saúde ou
efeitos fisiológicos desejáveis (PARK; KOO e CARVALHO, 1997).
Observa-se ainda, que a maioria das investigações realizadas restringiu-se à
verificação da atividade antioxidante sem, contudo, isolar e identificar o composto
ativo. Existem vários métodos para investigar a atividade antioxidante de compostos,
entretanto, o modelo para avaliação da atividade antioxidante utilizando DPPH ( 2,2-
difenil-1-picriolhidrazila) é baseada na capacidade do radical livre estável à
temperatura ambiente de reagir com substâncias doadoras de H, incluindo
compostos fenólicos (ROGINSKY e LISSI, 2005). É um método amplamente
utilizado e relativamente, rápido quando comparado a outras técnicas (SANCHEZ-
36
MORENO et al., 1998; MENSOR et al., 2001). O consumo de DPPH é, portanto, um
índicio para estimar a capacidade antioxidante na captura de radicais livres
presentes no meio. A alteração na coloração violeta do radical livre DPPH para
amarelo caracteriza a formação da molécula estável DPPH-H.
2.5.5 Atividade antitumoral
Desde quando se demonstrou que a vitamina C desempenhava um papel
importante como inibidor da formação de compostos carcinogênicos do tipo alquil-
nitroso, muitas pesquisas têm se direcionado no sentido de se identificar substâncias
que podem inibir o desenvolvimento de tumores cancerosos. Estas substâncias
interferem em uma ou mais etapas do processo de formação de tumores
(MADJAROF, 2004).
Um trabalho pioneiro realizado por Wattenberg (1979), trata da identificação
de enzimas que metabolizam hidrocarbonetos que podem causar câncer, como é o
caso do benzopireno existente nos inseticidas. As enzimas ficam ativadas quando
nos alimentamos de vegetais crucíferos como a couve, o repolho, o nabo, o brócolis
e a couve-flor. Estas enzimas são ativadas também pelas flavonas, algumas
naturais, como a tangeretina e a nobiletina, e outras sintéticas, como a beta-
naftoflavona. Quando se coloca beta-naftoflavona na alimentação de cobaias de
laboratório, ocorre a inibição quase completa da formação de adenoma pulmonar, o
que comprova que esta flavona é um potente ativador de enzimas inibidoras de
câncer. Posteriormente, foram identificadas três substâncias da classe dos indóis
que são capazes de induzir a atividade das enzimas dos cromossomos. Estes indóis,
como os isotiocianatos, também ocorrem em vegetais crucíferos e inibem a
formação de tumores de mama e de neoplasia, quimicamente induzida, no estômago
de cobaias. Outras substâncias que têm ação inibidora de tumores: cumarina, alfa-
angelicalactona, ácido cafêico, ácido ferúlico e ácido hidroxi-cinâmico. Estas
substâncias estão presentes em muitas plantas.
Já foram identificadas muitas substâncias inibidoras do câncer. Estas
substâncias, que pertencem a vinte diferentes classes de compostos orgânicos, têm
potencial capacidade de prevenção de vários tipos de câncer.
37
As substâncias que têm atividade anticâncer podem ser divididas nas
seguintes categorias:
1. substâncias que evitam a formação de câncer, através de outras
substâncias, chamadas precursores.
2. substâncias que são agentes bloqueadores do câncer.
3. substâncias que são supressoras de câncer.
4. substâncias que inibem a progressão do câncer.
Muitos esforços têm sido direcionados no sentido de entender o mecanismo
de ação destas substâncias inibidoras do câncer. Os resultados obtidos até agora
incentivam as pesquisas para a produção de novas substâncias sintéticas e a
realização de testes com produtos naturais, como as vitaminas, os minerais e os
fitoquímicos. Muitos estudos epidemiológicos vêm sendo realizados nos últimos
anos e novas substâncias que atuam como inibidores da formação de tumores foram
identificadas.
Com o aprimoramento da metodologia de cultura de células foi possível, no
final da década de 80, o desenvolvimento de diversas linhagens celulares, oriundas
de tumores humanos, possibilitando a existência de uma metodologia para triagem
in vitro. Com esse objetivo, o Nacional Câncer Institute (NCI/EUA) desenvolveu um
painel de células cancerígenas que atualmente conta com 60 linhagens oriundas de
oito tipos de tumores sólidos (pulmão, melanoma, mama, rim, cólon, próstata, ovário,
cérebro) e do sistema hematopoético (leucemia). Tal metodologia permite a
avaliação de drogas nos diversos tipos de células neoplásicas, com maior
especificidade (BOYD, 1989).
Testes in vitro utilizando-se cultura de células tumorais são extremamente
importantes na pesquisa de anticancerígenos, visando a procura de novas
moléculas que inibam o crescimento destas células. Testes de toxicidade realizados
com células KB (Células de carcinoma da epiderme humana) e Vero (células da
epiderme de rim de macaco verde africano) conduziu ao isolamento de uma série de
acetogeninas citotóxicas, tornando-se um exemplo do emprego de testes biológicos,
utilizando cultura de células para a descoberta de novos compostos antitumorais
(QUEIROZ et al., 1999).
38
2.5.6 Atividade anticolinesterásica
Atualmente, há uma busca de novos inibidores em extratos de plantas, com
especial interesse no isolamento e na identificação de novos inibidores da AChE.
A diversidade estrutural dos IAChEs conhecidos e a possibilidade de se
explorar modos de ação distintos têm estimulado o estudo fitoquímico de várias
espécies vegetais e de microorganismos que possam fornecer novos modelos de
substâncias anticolinesterásicas. Neste sentido, vários exemplares da biodiversidade
têm sido estudados em decorrência de sua utilização popular ou de dados
etnobotânicos. Um dos exemplos mais difundidos como fitomedicamentos são os
extratos de Ginkgo.
Atualmente, a Ginkco é, talvez, o extrato vegetal mais difundido
especificamente para aumento da função cognitiva, sendo seu uso prevalente
especialmente na Europa onde, recentemente, o "German Bundesgesundheit
Association" aprovou sua utilização para tratamento de demência (GOLD; CAHILL e
WENK, 2002).
Aparentemente, muitos dos efeitos protetores do SNC associados ao uso
crônico de extratos de Ginkgo estão relacionados à presença de constituintes
terpênicos e flavonóides com propriedades antioxidantes e antiinflamatórias.
A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa de grande
impacto sócio-econômico, que atinge primeiramente a memória e, posteriormente, a
capacidade de raciocínio e a comunicação. O quadro de sinais e sintomas dessa
doença está associado à redução de neurotransmissores cerebrais, como
acetilcolina, noradrenalina e serotonina. O tratamento para o Mal de Alzheimer é
sintomático e consiste justamente na tentativa de restauração da função colinérgica.
Dessa forma, a elevação do nível da acetilcolina pode se mostrar útil para amenizar
a deficiência da aprendizagem, um dos sinais da doença (MICHAELIS, 2003;
GOOCH e STENNETT, 1996).
Inibidores da acetilcolinesterase são amplamente usados no tratamento da
doença, procedimento que se baseia na hipótese colinérgica. A galantamina, um
alcalóide isolado de plantas da família Amaryllidaceae, apresenta uma longa ação
seletiva, reversível e competitiva para inibir a acetilcolinesterase. A galantamina é
considerada mais efetiva no tratamento da doença de Alzheimer que a fisostigmina e
39
a tacrina, que são as substâncias atualmente utilizadas. Esses medicamentos estão
disponíveis no mercado a um preço relativamente oneroso, o que torna a busca de
novos inibidores de origem vegetal uma alternativa interessante, na medida em que
estes seriam economicamente mais viáveis (MICHAELIS, 2003; GOOCH e
STENNETT, 1996).
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes químicos de plantas, animais e microorganismos levou ao
desenvolvimento de numerosas técnicas de ensaios químicos e bioquímicos para
monitoramento e seleção de extratos, frações de extratos e substâncias puras
bio/farmacologicamente úteis.
O bioensaio para busca de inibidores da AChE pode ser realizado através do
modelo de Ellman(1961), modificado por Rhee et al. (2001), onde por visualização
em placa de CCD , é indicativo de inibição (TREVISAN; et al., 2003) . Entretanto, a
forma mais difundida e barata é o diagnóstico que consiste na determinação da
atividade colinesterásica por métodos clássicos como o desenvolvido por Ellman et
al., 1961.
40
III PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Instrumentos Utilizados
3.1.1 Espectrômero de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN de
1
H e
13
C das substâncias isoladas neste estudo
foram obtidos em espectrômetro Bruker DPX 200 e espectrômetro Bruker DPX 400,
do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Maria, que operam
a 200.13 MHz para
1
H e 50.32 MHz para
13
C e 400.13 MHz para
1
H e 100.62 MHZ
13
C, respectivamente, em tubos de 5 mm.
Utilizaram-se como solvente clorofórmio deuterado (CDCl
3
), dimetilsulfóxido
(DMSO-d
6
), metanol-d
4
(CD
3
OD-d
4
), acetona-d
6
(C3D
6
O-d
6
) e água-d
2
(D
2
O-d
2
). Os
deslocamentos químicos (δ) foram apresentados em ppm (partes por milhão) e as
constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Utilizou-se como referencia interna o
TMS (δ=0,00) para os espectros de hidrogênio e CDCl
3
(δ=77,0), DMSO-d
6
(δ=39,5),
CD
3
OD (δ=49,0) D
2
O (δ=4,60) para os espectros de
13
C. Os espectros 1D e 2D
foram obtidos e processados com o software XwinNmr 1.3.
Os espectros 2D Homonuclear (COSY) e Heteronuclear (HMQC) foram
realizados conforme os parâmetros de aquisição fornecidos pelo aparelho e
processados pelo software XwinNmr 1.3 da marca Bruker.
3.1.2 Espectrômetro de Massas
Para obtenção dos espectros de massas foi utilizado um aparelho Autospec-
Micromass-EBE ou Q-Tof-Ultima API – Micromass, do Departamento de Química, da
Universidade de Campinas, SP.
41
3.1.3 Aparelho de Ponto de Fusão
Para obtenção do ponto de fusão das substâncias isoladas foi utilizado um
aparelho MQAPF-301 Digital da Micro Química, com termômetro não aferido, do
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, do Departamento de Química da
Universidade Federal de Santa Maria, RS.
3.1.4 Polarímetro
A rotação ótica [α] das substâncias isoladas foi realizada em polarímetro
Perkin Elmer 341 automático com lâmpada de mercúrio com precisão de 0,05 graus,
em cubeta de 10 dm de comprimento, utilizando metanol como solvente. Os
experimentos foram realizados nos laboratórios do Núcleo de Pesquisa de Produtos
Naturais, do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Maria,
RS e Laboratório de Química Orgânica
*
da Universidade Franciscana, Santa Maria,
RS.
3.2 Materiais e Métodos Cromatográficos
3.2.1 Cromatografia em Coluna
A cromatografia em coluna (CC) foi realizada utilizando como suporte sólido
sílica gel (30-70 Mesh, Merck) e eluída com misturas de solventes (gradientes),
conforme Tabela 3. Este método foi utilizado para realizar uma primeira separação
dos componentes das frações. Posteriormente foram realizadas cromatografia em
placa preparativa (CPP) e/ou nova cromatografia em coluna com a finalidade de
isolar os componentes das frações.
42
3.2.2 Cromatografia em Placa Preparativa (CPP)
As placas preparativas foram obtidas pela deposição, em placa de vidro de
20x20 cm
2
, de uma camada de 0,75 mm de sílica gel 60 GF
254
(Merck) em água.
3.2.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A técnica de cromatografia em camada delgada do tipo ascendente foi
realizada em cromatoplacas comerciais de sílica gel 60 GF
254
e utilizada a título de
acompanhamento das cromatografias em coluna e avaliação do grau de pureza das
substâncias isoladas.
A detecção dos componentes sucedeu-se através da irradiação por luz UV
(λ= 254 e 365 nm, em aparelho Spectroline), como reagente utilizou-se solução
aquosa de cloreto férrico e solução de ácido sulfúrico-etanol (10:90 v/v), seguido de
aquecimento.
Os solventes e reagentes utilizados foram produtos comerciais analiticamente
puros das marcas Merck, Vetec e Synth. Foram também empregados solventes
destilados, utilizando técnicas específicas de purificação.
Na tabela 3 é mostrada uma relação dos principais sistemas de solventes
utilizados em cromatografia.
43
Tabela 3 – Sistemas de solventes usados em cromatografia
1. Hexano 100%
2. Hexano: Acetato de Etila 98:2
3. Hexano: Acetato de Etila 95:5
4. Hexano: Acetato de Etila 90:10
5. Hexano: Acetato de Etila 85:15
6. Hexano: Acetato de Etila 80:20
7. Acetato: Clorofórmio 85:15
8. Acetato: Clorofórmio 90:10
9. Clorofórmio 100%
10. Clorofórmio: Metanol 99,5: 0,5
11. Clorofórmio: Metanol 99:1
12. Clorofórmio: Metanol 97:3
13. Clorofórmio: Metanol 95:5
14. Clorofórmio: Metanol 90:10
15. Clorofórmio: Metanol 85:15
16. Clorofórmio: Metanol 80:20
17. Clorofórmio: Metanol 75:25
18. Clorofórmio: Metanol 70:30
19. Clorofórmio: Metanol 60:40
20. Clorofórmio: Metanol 50:50
21. Metanol 100%
3.2.4 Cromatografia em Camada Delgada em Papel (CP)
A técnica de cromatografia em papel do tipo ascendente foi realizada em
papel cromatográfico WHATMAN número 3, e como eluente utilizou-se butanol-
piridina-água (9:5:4), e diferentes tipos de açúcares padrões, como: glicose, sorbose,
ribose, sacarose, frutose.
3.2.5 Cromatografia Gasosa(CG)
Os cromatogramas foram obtidos em cromatógrafos a gás Varian 3800 e CP
3800 equipados com detector de ionização de chama (DIC) injetor “SPLIT –
44
SPLITLESS”, pertencentes ao Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais, do
Departamento de Química da UFSM.
3.3 Coleta e Identificação do Material
O material vegetal da espécie Pavonia distinguenda A. St.- Hill. et Naudin foi
coletado nos meses de setembro e novembro de 2002, e de Dorstenia brasiliensis
Lam., nos meses de julho e agosto de 2005, ambas no município de Santana do
Livramento, no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. A identificação das mesmas foi
realizada pelo Biólogo Gilberto Dolejal Zaneti, do Departamento de Farmácia
Industrial da UFSM, onde encontram-se registradas as exsicatas de Pavonia
distinguenda A. St.- Hill. et Naudin ( HDFI 134) e de Dorstenia brasiliensis Lam.
( HDFI 135).
3.4 Extração e Fracionamento
3.4.1 Obtenção do Extrato Bruto Metanólico de Pavonia distinguenda
As partes aéreas de Pavonia distinguenda foram secas em estufa de ar seco
circulante a temperatura de 40°C e moídas em Moinho Wiley (450g). Em seguida
foram realizadas sucessivas extrações pelo processo de maceração com metanol.
Após a filtração e remoção do solvente sob vácuo, foram obtidos 66,31 g de extrato
bruto, correspondendo a um rendimento de 14,74% em relação à planta seca. Este
foi ressuspendido em água e extraído sucessivamente com solventes(3 L) de
polaridades crescentes (hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol),
conforme mostra a Figura 17.
45
Maceração com MeOH e evaporação do solvente
Suspensão em água e partição sucessiva
Hexano Butanol
Diclorometano Acetato etila
F
Figura 17 – Fluxograma do Fracionamento do extrato bruto de Pavonia distinguenda
3.4.2 Fracionamento do Extrato Bruto de Pavonia distinguenda
Tabela 4 – Frações obtidas a partir do extrato bruto de Pavonia distinguenda
Rendimento
(%)
Frações
Massa (g)
EBT Pl. seca
Compostos isolados
e/ou
identificados
Hexânica 13,09 19,7 2,9 Lupeol, β-sitosterol livre,
taraxerol, germanicol
Diclorometano 6,75 10,1 1,5 Lupeol , tilirosídeo
Acetato de etila 7,69 11,4 1,7 Tilirosídeo,
Astragalina
Butanólica 15,65 23,6 3,5 açúcar
Resíduo aquoso 23,23 35,0 5,2 -
Fração
Hexânica
13,09g
19,7%
Planta seca e moída
(450g)
Fração
Diclorometano
6,75g
10,2%
Fração
Acetato de etila
7,69g
11,4%
Extrato metanólico
bruto (66,31g)
Fração
Butanólica
15,65g
23,6%
Maceração
46
As frações assim obtidas foram analisadas em CDD, lâmpadas de UV (254 e
365nm), reveladas em reagentes de Dragendorff, solução aquosa de cloreto férrico,
vanilina sulfúrica e ácido sulfúrico-etanol (90:10), seguido de aquecimento quando
necessário. Este procedimento teve a finalidade de selecionar as melhores frações a
serem inicialmente trabalhadas.
3.4.3 Obtenção do extrato bruto aquoso de Pavonia distinguenda para os ensaios
biológicos de toxicidade aguda e trânsito intestinal
As partes aéreas de Pavonia distinguenda foram secas em estufa de ar seco
circulante a temperatura de 40°C e moídas em Moinho Wiley (50g). Foi realizado um
infuso a 5% (50g planta em 1000ml de água fervente) por 30 minutos. Logo após
este foi filtrado em Büchner e o liquido extrator evaporado em rotavapor. O resíduo
obtido foi seco por 48h em estufa à 40ºC. Obteve-se como extrato seco 7,5g de um
pó fino, correspondendo a um rendimento de 15% em relação à planta seca.
3.4.4 Obtenção dos extratos de Dorstenia brasiliensis Lam.
As raízes de Dorstenia brasiliensis Lam., foram secas em estufa de ar seco
circulante a 40°C e moídas em Moinho Wiley (62,82g), logo após foram extraídas à
quente em aparelho de Soxhlet, com hexano, acetato de etila, acetona e metanol,
conforme Figura 18.
47
hexano
acetato
Extração à quente acetona
em Soxhlet
metanol
Figura 18 – Fluxograma da obtenção dos extratos de Dorstenia brasiliensis
Tabela 5 – Extratos obtidas a partir do extrato bruto de Dorstenia brasiliensis
Extratos
Massa (g)
Rendimento (%)
EBT
Compostos isolados
e/ou
identificados
Hexânico 2,8 4,4 Mistura de compostos oleosos,
psolareno, bergapteno,
umbeliferona
Acetato de etila 0,9 1,4 Psolareno, bergapteno,
umbeliferona
Acetônico 1,6 2,5 Bergapteno, umbeliferona
Metanólico 4,9 7,8 Sacarose
Planta
seca e moída (raízes)
62,82g
Extrato Hexânico
2,8g
Extrato Acetato de Etila
0,9g
Extrato Acetônico
1,6g
Extrato Metanólico
4,9g
48
Os extratos assim obtidos foram analisados em CDD, lâmpadas de UV (254 e
365nm), reveladas em reagente de Dragendorff, solução aquosa de cloreto férrico, e
ácido sulfúrico-etanol (90:10), seguido de aquecimento quando necessário. Este
procedimento teve a finalidade de selecionar as melhores frações a serem
inicialmente trabalhadas, através de manchas mais visíveis e de mais fácil
separação.
3.5 Isolamento dos Metabólitos
3.5.1 Metabólitos de Pavonia distinguenda
3.5.1.1 Fração Acetato de Etila
A fração acetato de etila foi inicialmente selecionada para início deste
trabalho, por apresentar um perfil cromatográfico muito semelhante à fração
diclorometano, mas com um conteúdo maior de constituintes que reagiam
positivamente com solução aquosa de cloreto férrico. Para isso, a fração foi
previamente analisada em CCD, em vários sistemas de solventes e observada sob
Lâmpada de UV (254 e 365nm). As CCDs foram reveladas com ácido sulfúrico-
etanol (10:90v/v), seguido de aquecimento e com uma solução aquosa de cloreto
férrico.
Após revelação, esta fração apresentou várias machas com Rfs muito
próximos, de difícil separação, devido a sua complexidade. Desta fração, 5g foram
submetidas à CC, utilizando-se como suporte sólido sílica-gel (30-70 Mesh, Merk), e
como eluentes, n-hexano- acetato de etila (gradiente) e posteriormente acetato de
etila-metanol (gradiente). Obteve-se 71 frações, que foram reunidas individualmente
por CCD de acordo com suas semelhanças. Foram isolados dois constituintes
principais, identificados como os flavonóides tilirosídeo(A-51) e astragalina(A-52).
As frações restantes (59-71) da coluna de sílica, eluídas com uma mistura
polar de acetato de etila/metanol (95:5→ 80:20), foram constituídas de uma mistura
49
polar de difícil separação. A formação de espuma no balão quando da adição de
água, sugere a presença de saponinas. Estas frações não foram analisadas.
As frações da coluna cromatográfica de nº 1-47 não foram analisadas por
serem misturas complexas de difícil separação.
3.5.1.1.1Tilirosídeo (A-51/ Figura 19 e 32)
As frações 48 a 52, eluidas com n-hexano-acetato de etila (2:8) e acetato de
etila (100%), foram reunidas, por mostrarem o mesmo componente principal em
CCD. Esta fração, quando ressuspensa em acetona, formou instantaneamente um
precipitado amarelo-claro. O precipitado foi filtrado e seco sob vácuo (237,0 mg).
Após ser analisado por CCD, observou-se apenas uma mancha, que revelou
positivamente sob lâmpada UV (254 nm), com ácido sulfúrico-etanol(90:10), seguido
de aquecimento, e com solução aquosa de cloreto férrico. Com este último formou
uma mancha de coloração marrom escura, característica de compostos fenólicos.
Esta substância foi posteriormente submetida às análises de EM e de RMN de
1
H e
13
C, para elucidação estrutural. Os dados obtidos estão delineados a seguir:
a) Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, δ ( ppm ): 3,26 (1H, m, H-4”); 3,39
(3 H, m, H-2”, H-3”, H-5”); 4,28 e 4,03 (2H, m, J 1,8 H-6”); 5,49 (1H, δ, J 7,5 Hz, H-
1”); 6,10(1H, δ, J 16Hz, H-8’”); 6,15 (1H, s, H-6); 6,38 (1H, s, H-8); 6,79 (2H. δ, J 8,8
Hz, H-3’, H-5’); 6,85 (2H, δ, J 8,8 Hz, H-3’”, H-5’”); 7,34 (2H, d, J8, 5Hz, H-2’”, H-6’”);
7,37 (1H, d, J16 Hz, H-7’”); 8,0 (2H, d, J8,8Hz, H-2’, H-6’).
b) Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.62 MHz δ( ppm ): 156,8 (C-2); 133,6(C-3);
177,8(C-4); 161,6(C-5); 99,1(C-6); 164,8(C-7); 94,2(C-8); 156,9(C-9)104,3(C-10);
121,2(C-1’); 130,6(C-2’”); 116,3(C-3’); 160,5(C-4’); 116,3 (C-5’); 130,6 (C-6‘”);
101,5(C-1”); 74,7(C-2”); 76,7 (C-3”); 70,4 (C-4”); 74,6(C-5”), 63,4 (C-6”); 125,4(C-1’”);
131,3(C-2’); 115,7(C-3’”); 160,3 (C-4’”); 115,7 (C-5’”); 131,3 (C-6’); 145,1 (C-7’”);
114,1 (C-8’”); 166,6 (C-9’”).
c) Pf: 215-216°C
d) Rf: 0,75 (acetato de etila 100%)
50
e) [α]
D
= -50 (c 0,14, MeOH)
f) EM = m/z 594 daltons
Figura 19: estrutura do tilirosideo
Para confirmação da unidade glicosídica presente, procedeu-se as reações
de hidrólise ácida e alcalina do flavonóide tilirosídeo (A-51), como descrito a seguir:
a)Hidrólise ácida do Tilirosídeo(A-51)
Colocou-se 30mg de substância em um balão de 25mL. Adicionou-se uma
solução de HCl 2 M em metanol (10mL). Deixou-se em refluxo por 10h, sob
agitação. Após, evaporou-se a pressão reduzida até secura. Ressuspendeu-se o
resíduo em água destilada (2mL) e extraiu-se com acetato de etila (fase A). A fase
aquosa (B), foi neutralizada com NaOH diluido, e o solvente evaporado a secura. O
resíduo, contendo o açúcar, foi novamente solubilizado em água e utilizado para
comparação em CP ( cromatografia em papel) utilizando-se glicose, sorbose, ribose,
sacarose, frutose como açúcares padrões. Como sistema eluente utilizou-se butanol-
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3'"
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3'"
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
51
piridina-água (9:5:4).
b)Hidrólise alcalina do Tilirosídeo(A-51)
Em um balão de 25 mL, colocou-se 40 mg da substância dissolvida em 5 mL
de metanol. Adicionou-se, lentamente, 1mL de uma solução de metóxido de sódio
(MeOH+ Na) e deixou-se a reação sob agitação , a temperatura ambiente, por 30
minutos. Após este tempo, observou-se que parte da reação havia ocorrido,
restando ainda reagente sem sofrer hidrólise. Adicionou-se mais 1mL da solução de
metóxido de sódio e deixou-se agitando por mais 30 minutos. O acompanhamento
da reação por CCD, mostrou a total hidrólise básica do flavonóide. O excesso de
metóxido de sódio foi neutralizado pela adição de CH
3
OH:HCl aprox. 1,6 M. O
solvente foi evaporado, e o resíduo dissolvido em metanol seco. O resíduo insolúvel,
possivelmente NaCl, foi filtrado e a fase orgânica novamente evaporada e analisada
através de CCD, RMN de
1
H e de
13
C.
3.5.1.1.2 Astragalina ( A-52/ Figura 20 e 56)
As frações 54-58 (acetato de etila: metanol 9,5:0,5), apresentaram o mesmo
Rf em CCD (mistura de componentes) sendo que o componente principal deu teste
positivo com solução aquosa de cloreto férrico
.
As frações foram reunidas ( 45,0 mg)
e a nova fração submetida a uma nova coluna cromatográfica, desta vez recheada
com fase reversa C-18 (10 g). Utilizou-se como sistema eluente metanol/ H
2
O
(70:30, 80:20, 100:0), obtendo-se 10 frações. A fração 3, eluida no sistema MeOH/
água 80:20), apresentou uma substância principal, que reagia positivamente com
solução aquosa de cloreto férrico. A fração foi evaporada, resultando em um resíduo
amarelo (17 mg), com uma pequena impureza (CCD), apenas visível com revelação
com ácido sulfúrico-etanol (10:90), seguido de aquecimento. Após cristalização e
recristalização em uma mistura acetona/metanol, obteve-se um produto mais
purificado (12 mg), que foi submetido às análises de RMN de
1
H e
13
C, para
52
elucidação estrutural. Os dados obtidos estão delineados a seguir:
a) RMN de
1
H a 400,13 MHz, em metanol-d
6
: δ (ppm): 4,8-3,3 (6 H, m, H-2”, H-3”,
H-4”, H-5”, H-6”, glicose); 5,16 (1H,d , J= 7, 2 Hz, H-1”); 6,20 (1H, sl, H-6); 6,40 (1H,
sl, H-8); 6,60 (2H. δ, J=8, 2 Hz, H-3’, H-5’); 8,04 (2H, d, J=8, 2 Hz, H-2’, H-6’);
b) RMN de
13
C a 100, 62 MHz, em metanol-d
6
: δ (ppm) = 166,0 (C-7); 162,9 (C-
5);161,6 (C-4’), 159,2 (C-9), 158,4 (C-2), 132,3 (C-2’,6’), 116,0 (C-3’,5’), 99,9 (C-6),
94,8 (C-8), 104,3 (C-1’’), 78,4-71,4 (4C-glicose), 62,5 (C-6’’).
c) Rf: 0,70 (acetato de etila-metanol 98:2)
d) Pf: 177,0-178,8
o
C
e) [α]
D
= -14,88 (c 0,14 MeOH)
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
Figura 20: Estrutura de astragalina
3.5.1.2 Fração Hexânica:
A fração hexânica (13,09g) ao ser ressuspensa em hexano apresentou um
precipitado branco. Este foi filtrado, lavado com acetona e posteriormente analisado
em CCD em vários sistemas de solventes e observado sob lâmpada de UV (254 e
365 nm). As CCDs foram reveladas com ácido sulfúrico-etanol (10:90 v/v), seguido
53
de aquecimento, observando-se uma mancha com Rf 0,62 em hexano-
diclorometano (90:10). Foi determinado seu ponto de fusão (218-220ºC) e através
de comparação com dados da literatura (GIACOMELLI, 2005) foi possível identificar
este metabólito como sendo o triterpeno germanicol (Figura 21).
Figura 21: Estrutura do germanicol
O restante da fração foi analisada e observado sob Lâmpada de UV (254 e
365nm). As CCDs foram reveladas com ácido sulfúrico-etanol (10:90), seguido de
aquecimento e com uma solução aquosa de cloreto férrico, Dragendorff e vanilina
sulfúrica, separadamente.
Parte desta fração (7g) foram submetidas à CC, utilizando-se como suporte
sólido sílica-gel (30-70 Mesh, Mecrk), e como eluentes, n-hexano- acetato de etila
(gradiente) e posteriormente acetato de etila-metanol (gradiente). Foram obtidas 58
frações. Estas foram reunidas de acordo com suas semelhanças, após análise por
CCD. As frações 7-15 foram reunidas, e submetidas novamente à cromatografia em
coluna de sílica gel utilizando-se com fase móvel hexano : CH
2
Cl
2
(5 : 95). Obteve-
se desta um sólido branco, o qual foi analisado por CCD, detectando-se a presença
de uma impureza. Para purificação, foi realizada uma cromatografia em placa
preparativa eluida (3x) com fase móvel {CHCl
3
: MeOH (95:05)}. O metabólito foi
identificado como sendo o esteróide β-sitosterol ( Figura 22).
Das frações 34-47 reunidas, dois outros constituintes foram isolados e
2727
54
O H
1
2
3
4
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28
29
identificados. Um deles, identificado como sendo o triterpenóide taraxerol (17mg),
isolado como um sólido branco, após eluição com fase móvel acetato de etila :
MeOH (90 : 10). O outro componente, identificado como Lupeol (40mg), isolado
como um sólido branco, com fase móvel hexano : Acetato de etila (95 : 5).
Estes metabólitos foram purificados e analisados através de RMN de
1
H e de
13
C para confirmação de suas estrutura. Os dados obtidos estão delineados a seguir.
As demais frações não foram trabalhadas.
3.5.1.2.1 β-sitosterol (figura 22)
Figura 22: Estrutura do β-sitosterol
a) Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, CDCl
3
: δ (ppm): 3,51 (1H, m, H-3),
0,68, 0,80, 0,84, 0,86, 0,96, 1,0 (3H, CH
3
-18, -19, -21, -27, -29), 5,34 (1H, d, H-6),
0,91-2,31 (m, outros hidrogênios).
b) Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.62 MHz, CDCl
3
: δ (ppm): 37,3 (C-1), 31,5
(C-2), 71,7 (C-3), 42,3 (C-4), 140,8 (C-5), 121,7 (C-6), 31,9 (C-7), 31,7 (C-8), 50,1
(C-9), 36,5 (C-10), 21,1 (C-11), 39,8 (C-12), 42,3 (C-13), 56,8 (C-14), 24,3 (C-15),
28,2 (C-16), 56,1 (C-17), 11,8 (C-18), 18,8 (C-19), 36,1 (C-20), 19,0 (C-21), 34,0 (C-
22), 26,1 (C-23), 45,9 (C-24), 29,2 (C-25), 19,8 (C-26), 19,4 (C-27), 23,1 (C-28), 12,0
(C-29).
55
c) Pf: 138-140 °C
d) Rf: 0,65 (CHCl
3
-MeOH 95:05)
3.5.1.2.2 Taraxerol(figura 23)
Figura 23: Estrutura do taraxerol
a) Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, CDCl
3
:
δ (ppm): 3,19 (1H, J= 9,3, H-3), 0,77 (1H, H-5), 2,04 (1H, m, H-7), 1,03 (1H, J= 4,3,
H-9), 5,53 (1H, dd, J= 3,0, 5,1, H-15), 1,64/1,89 (1H, dd, J= 3,0, 5,1, H-15), 1,64/1,89
(2H, dd, J= 2,4, 12,2, H-16), 0,80, 0,82, 0,90, 0,91, 0,92, 0,95, 0,97, 1,09 (3H, S,
CH
3
-23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30), 1,22-1,66 (m, outros hidrogênios).
b) Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.62 MHz, CDCl
3
:
δ (ppm): 37,7 (C-1), 27,1 (C-2), 79,0 (C-3), 38,9 (C-4), 55,5 (C-5), 18,8 (C-6), 35,1
(C-7), 38,7 (C-8), 48,9 (C-9), 37,7 (C-10), 17,5 (C-11), 35,1 (C-12), 37,5 (C-13),
158,1 (C-14), 116,8 (C-15), 36,9 (C-16), 38,0 (C-17), 49,3 (C-18), 40,9 (C-19), 28,8
(C-20), 33,7 (C-21), 33,1 (C-22), 28,0 (C-23), 15,4 (C-24), 15,4 (C-25), 29,9 (C-26),
25,9 (C-27), 29,9 (C-28), 33,3 (C-29), 21,5 (C-30).
c)Pf: 279-281 °C
d)Rf: 0,57 (CH
2
Cl
2
-MeOH 90:10)
3.5.1.2.3 Lupeol(Figura 24)
O H
1
2
3
4
5
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23 24
25 26
27
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29
30
56
Figura 24: Estrutura do Lupeol
a)Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, CDCl
3
:
δ (ppm):3,16 (1H, dd, J= 4,9, 5,0, H-3), 1,89 (1H, m, H-13), 2,35 (1H, m, H-19), 0,73,
0,76, 0,80, 0,91, 0,94, 0,95, 1,01,1,65 (3H, s, CH
3
-23, -24, -25, -26, -27, -28, -30),
4,53/4,65 (2H, s, H-29, -29’), 0,64-1,62 (m, outros hidrogênios).
b) Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.62 MHz, CDCl
3
:
δ (ppm): 38,8 (C-1), 27,4 (C-2), 78,9 (C-3), 38,8 (C-4), 55,2 (C-5), 18,1 (C-6), 34,3
(C-7), 40,8 (C-8), 50,4 (C-9), 37,2 (C-10), 20,9 (C-11), 25,2 (C-12), 37,9 (C-13), 42,8
(C-14), 27,4 (C-15), 35,5 (C-16), 42,9 (C-17), 48,3 (C-18), 47,9 (C-19), 150,8 (C-20),
29,6 (C-21), 40,0 (C-22), 27,9 (C-23), 15,4 (C-24), 16,0 (C-25), 15,4 (C-26), 15,4 (C-
27), 18,3 (C-28), 109,3 (C-29), 19,2 (C-30).
c)Pf: 216-217 °C
d)Rf: 0,42 (Hexano-acetato de etila 90:10)
3.5.1.3 Fração Diclorometano
A fração diclorometano foi previamente analisada em CCD, em vários
sistemas de solventes e observada sob lâmpada de UV (254 e 365nm). As CCDs
foram reveladas com ácido sulfúrico-etanol (10:90), seguido de aquecimento, e com
solução aquosa de cloreto férrico. Após revelação das placas foi possível, através de
comparação com substâncias já purificadas, identificar a presença do triterpeno
O H
1
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28
29
30
57
lupeol, em placa eluida em hexano:diclorometano (1:1) e revelada com ácido
sulfúrico-etanol, seguida de aquecimento. Também foi identificado nesta fração a
presença do flavonóide tilirosídeo (A-51), em placa eluida em clorofórmio:metanol
(9:2) e revelada com solução aquosa de cloreto férrico.
Esta fração apresentou um perfil cromatográfico muito semelhante a fração
acetato de etila, porém com grande quantidade de clorofila, motivo pelo qual optou-
se por não mais trabalhar com esta fração, utilizando-a para ensaios biológicos.
3.5.1.4 Fração Butanólica
Foi feita uma CC com 2g da fração butanólica, utilizando-se uma coluna
Sephadex LH-20, e como eluentes água-metanol (gradiente). As frações coletadas
foram analisadas por CCD em vários sistemas de solventes e observadas sob
lâmpada de UV (254 e 365nm). As CCDs foram reveladas com ácido sulfúrico-
etanol (10:90), seguido de aquecimento, e com solução aquosa de cloreto férrico.
Após revelação das placas, optou-se por não mais trabalhar com estas frações,
sendo estas guardadas em frascos fechados, contendo acetona. Após algum tempo
observou-se em um dos frascos formação de cristais incolores. Não foi feita, até o
momento, a identificação destes metabólitos.
3.5.2 Metabólitos de Dorstenia brasiliensis Lam.
3.5.2.1 Extrato Hexânico
O extrato hexânico, na forma de um resíduo oleoso incolor, foi previamente
analisado em CCD, em vários sistemas de solventes e observados sob lâmpada de
UV (254 e 365nm). As CCDs foram reveladas com ácido sulfúrico-etanol (10:90),
seguido de aquecimento.
Após revelação, o resíduo oleoso apresentou várias machas com Rfs muito
58
próximos, de difícil separação, devido a sua complexidade. Este foi então submetido
à CC, utilizando-se como suporte sólido sílica-gel (30-70 Mesh, Merck), e como
eluentes, n-hexano-acetato de etila (gradiente). Foram obtidas 28 frações, reunidas
individualmente por CCD de acordo com suas semelhanças.
As frações 2-5 reunidas constituíam uma mistura oleosa incolor a qual foi
novamente analisada por CCD observando-se uma única mancha. Posteriormente
analisada por CG (Figura 64), verificou-se tratar-se de uma mistura complexa de
difícil separação, não mais trabalhada.
3.5.2.1.1 Umbeliferona (Figura 25)
As frações 8-10 foram analisadas por CCD em vários sistemas e observou-se
a presença de três substâncias principais com fluorescência bem evidente. Estas
foram reunidas (1,5 g) e submetidas a CC utilizando-se como suporte sólido sílica-
gel (30-70 Mesh, Merck), e como eluentes, n-hexano- acetona (gradiente), obtendo-
se 20 outras frações (100mL cada), que foram novamente analisadas por CCD e
reunidas por similaridade, resultando em um composto amarelo-claro cristalino
(160mg). Este foi analisado por RMN de
1
H e
13
C, EM e difração de raios-X. Apesar
dos espectros de massas e de RMN não serem conclusivos, um cristal obtido foi
analisado por difração de RX, identificando metabólito conhecido como umbeliferona
( figura 25), de fórmula molecular C
9
H
6
O
3
.
Figura 25 - Estrutura da furanocumarina umbeliferona
O O
O H
1
2
3
45
6
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8
9
10
O O
O H
1
2
3
45
6
7
8
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10
59
3.5.2.1.2 2 Psoraleno e Bergapteno (Figuras 26 e 27 respectivamente) LORENÇO,
2001; BAUER e NOLL,1986.
Das frações 11-14, do óleo incolor aromático obtido do extrato hexânico de
Dorstenia brasiliensis Lam., obteve-se uma mistura cristalina aromática, que
absorvia fortemente sob luz UV. Através de análise dos espectros de RMN de
1
H e
13
C, EM e CG, foi possível verificar a presença de duas substâncias com Rfs muito
próximos quando analisadas por CCD. Análises posteriores identificaram as duas
substâncias como sendo as furanocumarinas psoraleno(figura 26) e bergapteno
(figura 27). Os dados obtidos estão delineados a seguir.
3.5.2.1.2.2.1 Psoraleno
Figura 26 – Estrutura do Psoraleno
a) Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, CDCl
3
, δ (ppm) : 6,30 (3H, d, J 9,5
Hz, H-3); 6,95 (3H, d, J 2,3 Hz, H-3’); 7,37 (3H, s, H-8); 7,61 (3H, s, H-5); 7,63 (3H,
d, J 2,3 Hz, H-2’); 7,73 (3H, d, J 9,5 Hz, H-4).
b) Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.32 MHz δ (ppm ): 160,9 (C-2); 112,8 (C-3);
144,0(C-4); 119,8 (C-5); 125,2(C-6); 156,3(C-7); 99,7(C-8); 151,9(C-9); 114,6(C-10);
146,8(C-2’); 106,3(C-3’).
c) Pf: 162 - 164°C(*BAUER e NOLL, 1986)
d) EM = m/z 186 daltons ppm
60
3.5.2.1.2.2.2 Bergapteno
Figura 27 – Estrutura do Bergapteno
a)Dados de RMN de
1
H em ppm a 400.13 MHz, CDCl
3
, δ (ppm): 6,18 (1H, d, J 9,8
Hz, H-3); 6,95 (1H, d, J 2,2 Hz, H-3’); 7,02 (1H, s, H-8); 7,53 (1H, d, J 2,2 Hz, H-2’);
8,06 (1H, d, J 9,8 Hz, H-4); 4,26 (3H, s, OMe).
b)Dados de RMN de
13
C em ppm a 100.32 MHz, CDCl
3
, δ (ppm): 161,1 (C-2); 112,5
(C-3); 144,7(C-4); 110,9 (C-5); 126,4(C-6); 148,2(C-7); 93,6(C-8); 152,6(C-9);
115,3(C-10); 59,9 (C-11); 146,4(C-2’); 104,9(C-3’).
c)Pf: 189 - 192°C(BAUER e NOLL, 1986)
e)EM = m/z 216 daltons
5.2.2.3 Extrato metanólico
O extrato metanólico, após filtração e evaporação do solvente em
rotaevaporador, resultou em 4,9 g de um resíduo, o qual foi novamente dissolvido
em metanol e resfriado em refrigerador. Obteve-se deste processo, um precipitado, o
qual foi filtrado, lavado com metanol e posteriormente com acetona, formando um
precipitado branco, solúvel em água. Este foi analisado por CCD sob luz UV.
Analisando-se através de cromatografia em camada delgada em papel,
utilizando-se o sistema n-butanol-piridina-água (9:5:4) como eluente, e vários
açúcares como padrões, foi possível identificar sacarose. Através da análise dos
61
espectros de RMN de
1
H e
13
C, medidos em D
2
O e comparação com dados da
literatura, foi possível confirmar a estrutura como sendo realmente a sacarose
( NAVIA., 1995 ; MACINDOE., 2000). Os dados obtidos encontram-se delineados a
seguir.
3.5.2.3.1 Sacarose (Figura 28)
Figura 28: Estrutura da sacarose
a) Pf: 169-170°C (BARBOSA-FILHO et al.,2000)
b) [α]
D
= +66, 53(BARBOSA-FILHO et al.,2000)
c) Rf: 0,35 (n-Butanol-piridina-água / 9:5:4)
3.6 Atividades Farmacológicas ou Testes Biológicos dos Extratos, Frações e
de alguns dos Metabólitos puros Isolados
3.6.1 Citotoxicidade
O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina (TAS) (MEYER et al., 1982 ;
MCLAUGHLIN, et al., 1991) foi realizado com o extrato metanólico de Pavonia
distinguenda e testados inicialmente, nas concentrações de 10, 100, 1000 µg/mL, e
após teste preliminar nas concentrações de 10 a 1µg/ml . Após a eclosão dos ovos
62
de Artemia salina, 10 nauplios foram transferidos para tubos de ensaios contendo 5
mL de água salina (38 g/L). Passado 24 horas fez-se a leitura observando-se o
número de sobreviventes. Para a determinação da CL
50
utilizou-se o teste de FINEY
(1971), e cada avaliação foi repetida pelo menos três vezes até verificação da
atividade do extrato.
3.6.2 Toxicidade aguda
O estudo da toxicidade aguda do extrato aquoso de P. distinguenda,
(preparado conforme descrito no item 3.4.3), foi realizado segundo Brito (1993). O
experimento foi realizado em grupos de dez camundongos Swiss de ambos os sexos
(5 machos e 5 fêmeas), pesando entre 25 e 35 g. Os camundongos foram tratados
com o extrato aquoso da planta, por administração oral, dose única, nas doses de
1250 mg/kg, 2500mg/kg, 5000mg/kg; por administração intraperitoneal única, nas
doses de 125mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg, 1000mg/kg, 2000mg/kg; e com água
destilada os grupos controle em ambas as vias. Os animais receberam ração e água
somente 3 horas após a administração dos extratos e foram sendo observados nos
primeiros 30, 60, 120, 240 e 360 minutos e a cada 24 horas, durante 14 dias
consecutivos. Foram observados parâmetros como: número de mortes, tremores ou
convulsões, lacrimejamento e salivação, micção e defecação, piloereção, ptose
palpebral e efeitos sobre a respiração, movimentos e tônus muscular.
Para determinar a dose letal média (DL
50
) e limites de confiança foi utilizado o
método de probitos com auxílio do programa estatístico DL
50
segundo Rodrigues
(1991).
3.6.3 Trânsito intestinal
A medida da velocidade do trânsito intestinal serve para a pesquisa de
compostos inibitórios ou estimulatórios da atividade peristáltica.
63
No modelo do carvão ativado
1
, a velocidade do trânsito intestinal é medida em
centímetros pelo deslocamento deste marcador no intestino seccionado após um
tempo pré-determinado da sua administração oral (gavagem), dos extratos aquosos
da planta (preparado conforme descrito no item 3.4.3)nas concentrações de
500mg/kg e 1000mg/kg, em comparação com um controle (solução de atropina).
São utilizados camundongos machos ou fêmeas entre 25 e 35g.
Os resultados são expressos em relação ao comprimento total do intestino
delgado, e os dados obtidos avaliados estatisticamente pela análise da variância
(ANOVA).
3.6.4 Avaliação da atividade antinociceptiva
3.6.4.1 Animais:
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, 20-30g, fornecidos pelo
Biotério Central da Universidade Federal de Santa Maria. Os animais foram
mantidos com água e ração ad libitum em uma sala apropriada, sob luz natural e
temperatura ambiente, por um período mínimo de três dias antes do experimento.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com normas propostas
pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) (ZIMMERMANN, 1983).
3.6.4.2 Ensaios da atividade antinociceptiva
3.6.4.2.1 Contorções abdominais induzida por ácido acético
Neste teste as contorções abdominais foram induzidas pela injeção
intraperitoneal de ácido acético (0,6%), de acordo com os procedimentos descritos
1
Método de Stickney e Northup (1959).
64
previamente (SANTOS, 1995). Os animais foram pré-tratados intraperitonealmente
ou por via oral (30 minutos ou 1 hora antes) com diferentes doses ( 10 , 30 e 100
mg/kg ou 100, 300 e 1000 mg/kg) do extrato. Os animais controle receberam e
mesmo volume de solução salina (0,9%)e de indometacina 10mg/kg. Os animais
foram colocados separados sob funil de vidro e o número de contorções abdominais
foi contado por um período de 20 minutos. A atividade antinociceptiva foi expressa
como a redução do número de contorções abdominais entre os animais controle e os
camundongos pré-tratados com extrato bruto.
3.6.4.2.2 Técnica do teste da placa quente
Neste teste, os camundongos foram adaptados ao ambiente 24 horas antes
do teste. Antes de iniciar os experimentos, os animais foram colocados na placa
quente não-funcional por um minuto para habituação. Para a realização do
experimento, os animais foram colocados sobre a placa quente, com temperatura de
56°C e o cronômetro foi acionado para marcar o tempo que o animal levou para
lamber a pata traseira (HUNSKAAR., 1985). Quando isto ocorreu, o cronômetro foi
desligado o tempo de latência para tal comportamento registrado. Cada
camundongo atuou como seu próprio controle. Após a medida de latência inicial
foram administrados os extratos (doses de 10, 30 e 100 mg/kg via i.p. e 100, 300 e
1000 via oral), morfina (9 mg/kg, via s.c.), veículo ou salina e novamente realizadas
as medidas na placa quente. O tempo de corte foi 30 segundos.
Animais que não responderam (não lamberam a pata traseira) dentro de 30
segundos, foram substituídos.
3.6.4.3 Análise estatística
Valores foram expressos como média ± S.E.M. A análise estatística dos
resultados foi feito pelo teste ANOVA seguido por TUKEY. Valores com p < 0,05
foram considerados significantes.
65
3.6.5 Atividade antimicrobiana in vitro
Diversos métodos laboratoriais podem ser empregados para predizer a
sensibilidade in vitro de bactérias aos agentes antimicrobianos. Muitos laboratórios
de microbiologia clínica usam, de forma rotineira, o método de disco-difusão em ágar
para testar patógenos comuns de crescimento rápido e certas bactérias fastidiosas.
Os testes baseados apenas na presença ou ausência de um halo de inibição,
sem consideração do tamanho do halo, não são aceitáveis, por este motivo optamos
no presente trabalho por determinar a atividade antimicrobiana dos extratos, frações
e substâncias puras por três diferentes metodologias. Só podem ser obtidos
resultados confiáveis com testes que usam o princípio de metodologia padronizada e
medidas do diâmetro do halo de inibição correlacionados às concentrações
inibitórias mínimas (CIMs) com cepas reconhecidamente sensíveis e resistentes a
diversos agentes antimicrobianos.
A atividade antimicrobiana dos extratos brutos e frações e das substâncias
isoladas foram avaliados pelos métodos de difusão em discos e bioautografia, frente
a microorganismos Gram-positivos, Gram-negativos e fungos. Os resultados foram
expressos em mm dos halos de inibição para o método de difusão em discos, e
presença ou ausência de zona de inibição quando se referir ao método de
bioautografia. As amostras foram avaliadas frente aos microorganismos sempre
levando em consideração a atividade de um antimicrobiano padrão com CIM
conhecido.
Foram determinados, CIMs para os extratos brutos, frações e substâncias
puras isoladas, por método da microdiluição, sendo esta a menor concentração em
µg/mL capaz de inibir o crescimento dos microorganismos. Os resultados foram
expressos como a menor concentração em que o tubo permaneceu límpido.
3.6.5.1 Microrganismos empregados nos ensaios microbiológicos
Para a verificação da atividade antimicrobiana dos extratos, frações e
substâncias isoladas na forma pura foram utilizadas as cepas padrão de ATCC
66
(American Type Culture Colection) constituídas por microrganismos Gram-positivos,
Gram-negativos e fungos conforme Tabela 6.
Tabela 6 – Microrganismos Indicadores
Características Microrganismos ATCC
Staphylococcus aureus 6538p
Gram - positivo Staphylococcus epidermidis 12228
Bacillus subtilis 6633
Escherichia coli 25792
Gram-negativo Klebsiella pneumoniae 10031
Pseudomonas aeruginosa 27853
Salmonella setubal 19796
Fungos Candida albicans 10231
Sacharomyces cerevisiae
Cryptococcus neoformans
2601
28952
Candida dubliniensis Isolado clínico SM-26
3.6.5.2 Substâncias empregadas como padrões nos ensaios microbiológicos
Os padrões de antibióticos, amoxicilina para bactérias, potência (978.9
µg/mg) e nistatina para fungos, potência (2464.38 UI/mg), utilizados como referência
nos ensaios de determinação da atividade antimicrobiana são padrões primários
USP e foram preparados conforme FDA, 1991.
3.6.5.3 Meios de cultura
3.6.5.3.1 Manutenção dos microrganismos indicadores
Com a finalidade de preservá-las, as cepas dos microrganismos indicadores
foram repicadas a cada 15 dias em tubos de ensaios contendo de 5-8 mL de Ágar
67
simples para bactérias e Ágar Sabouraud para fungos, sendo os mesmos incubados
a 37 °C de 24-48 horas. A seguir, eram retirados da estufa e mantidos à temperatura
ambiente, para estudos subseqüentes.
Tabela 7 – Fórmula do Ágar simples
Caldo nutriente 8,0 g
Ágar – ágar 15,0 g
Água destilada 1.000,0 mL
Após a dissolução em água destilada, o meio foi distribuído em volumes de
5,0 mL em tubos de ensaio 16x150 mm, tamponados com algodão e esterilizados
em autoclave a 120 °C durante 15 minutos . Após a esterilização, os tubos foram
mantidos inclinados até a solidificação do meio.
Tabela 8 – Fórmula do Ágar sabouraud
Peptona 10,0 g
Dextrose 40,0 g
Ágar – ágar 15,0 g
Água destilada 1.000,0 mL
Reidratou-se 65,0 g do meio em 1.000,0 mL de água destilada e aquecida
até a fusão do ágar. Em seguida 5,0 mL foram distribuídos em tubos 16x150 mm e
esterilizados em autoclave a 120 °C por 20 minutos. Após os tubos foram mantidos
inclinados até a sua solidificação.
68
3.6.5.3.2 Preparo dos inóculos bacterianos e fúngicos
Para a obtenção dos mesmos, as culturas bacterianas e fúngicas
provenientes dos meios de manutenção foram semeadas em caldo de Caseína-Soja.
Tabela 9 – Fórmula do caldo de caseína-soja
Caseína tratada por suco pancreático 17,0 g
Farinha de soja por digestão papaínica 3,0 g
Dextrose 2,5 g
Fosfato de potássio dibásico 2,5 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Água destilada 1.000,0 mL
3.6.5.3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
Dentre os muitos meios disponíveis, o NCCLS (2000) considera o ágar
Müeller-Hinton o melhor para testes rotineiros de sensibilidade contra bactérias não
fastidiosas, pelas seguintes razões.
• Demonstra reprodutibilidade aceitável entre os diferentes lotes nos testes
de sensibilidade.
• Contém baixo teor de inibidores de sulfonamida, trimetoprima e
tetraciclina.
• Permite crescimento satisfatório dos patógenos não fastidiosos.
• Existe um grande acervo de dados e experiência relativos a testes de
sensibilidade realizados com esse meio.
Para a determinação da atividade das amostras em estudo (extratos, frações,
69
substâncias puras), foram utilizados os seguintes meios de culturas:
Tabela 10 - Fórmula do Ágar Müeller-Hinton
- Infuso de carne 300,0 g
- Caseína hidrolisada 17,5 g
- Amido 1,5 g
- Ágar-ágar 17,0 g
- Água destilada 1.000,0 mL
De acordo com instruções do fabricante, reidratou-se 38,0 g em água
destilada, esterilizando em seguida em autoclave a 120 °C por 15 minutos.
3.6.5.3.4 Preparo das suspensões bacterianas (inóculo)
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, culturas de microrganismos
indicadores mantidos inclinados em ágar simples foram transferidas para tubos
contendo 5,0 mL de uma solução salina estéril e padronizada pela escala de
MacFarland (0,5 mL de cloreto de bário 0,048 mol/L 99,5 mL de ácido sulfúrico a
1,0%). Obteve-se, assim um inóculo contendo aproximadamente 10
5
UFC. mL
-1
(Unidades Formadoras de Colônias / mL), equivalente a metade da escala 1 de
MacFarland, e denominada de “suspensão concentrada”, utilizada para a elaboração
da camada semeada, quando adicionada ao meio de cultura, na proporção de 0,5%.
70
3.6.5.3.5 Método de bioautografia
Este é um método qualitativo aplicado à detecção de compostos
antimicrobianos, em misturas de composição complexa e mesmo desconhecida. O
ensaio de determinação da atividade antimicrobiana pelo método de bioautografia foi
realizado de acordo com Rahalison, Hamburger e Hostettmann (1991), com algumas
modificações.
Para a realização deste, foram utilizadas placas de Petri de 10x100
mm de diâmetro, onde foram depositadas as cromatoplacas com as amostras a
serem analisadas. Em seguida, foram adicionados 10 mL do meio de cultura
inoculado com o microrganismo indicador sobre as cromatoplacas. Após a
solidificação do meio, as placas foram incubadas na posição invertida por 16 a 24
horas para bactérias a 35 °C e a 27 °C por 48 horas para fungos. Decorrido o
período de incubação, as cromatoplacas foram reveladas com uma solução aquosa
de sal de tetrazóleo (5 mg / mL), e incubados por um período entre 2 a 4 horas a 35
°C.
Para a determinação da quantidade de substância ativa, foram testadas as
concentrações de 100,0, 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; e 3,12 µg, enquanto que para o
extrato bruto e as frações foram testadas as concentrações de 100,0; 50,0; 25,0;
12,5 ,6,25 e 3,12µg contra bactérias Gram-positivas S. aureus, S. epidermidis e B.
subtilius; Gram-negativas E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e S. setubal e
fungos C. albicans, S. cerevisiae, C. neoformans e C. dubliniensis. Os
microrganismos usados para os ensaios antimicrobianos foram conservados no
Laboratório de Microbiologia do Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais (NPPN)
do Departamento de Química da UFSM.
Após a aplicação das amostras em cromatoplacas, estas foram depositadas
em placas de petri estéreis, sobre as quais foi adicionado o meio de cultura
inoculado com o microrganismo indicador, conforme descrito no item 3.6.5.1
A menor concentração da substância, na qual houve o aparecimento de halos
de inibição, após a revelação com o sal de tetrazóleo, foi considerada a quantidade
de substância ativa da substância em estudo.
71
3.6.5.3.6 Método de difusão em discos de papel
Para analisar a atividade antimicrobiana dos extratos vegetais, utilizou-se
metodologia descrita segundo Carvalho et al. (2002), os quais utilizaram o teste de
atividade antimicrobiana através do método de difusão em disco de papel (tipo 3
com 6 mm de diâmetro) no meio gelosado Müller Hinton. As suspensões dos
microrganismos-teste foram semeadas na superfície do meio, em placas de Petri,
com o auxílio de alça de Drigalsky (100 µL/placa). Foram utilizados discos de 6 mm
de diâmetro, embebidos com 20 µL de uma solução a 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e
3,125mg/mL dos extratos em estudo. As placas foram incubadas a 35°C durante 24
horas. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mm
pela média aritmética do diâmetro dos halos de inibição formado ao redor dos discos
nas 3 repetições. O teste controle foi realizado também com os discos embebidos
com o agente diluente dos extratos e com os antimicrobianos padrões. Em Vargas et
al. (2004) o teste microbiológico de sensibilidade, foi realizado utilizando-se uma alça
de Drigalski para a semeadura de 0,1 mL da suspensão bacteriana contendo
aproximadamente 1 x 10
6
bactérias/mL por placa, realizando-se duas repetições por
tratamento. As placas foram incubadas a 37°C por 24 a 72 horas, dependendo da
espécie bacteriana testada. Os isolados foram considerados sensíveis ao extrato,
quando não ocorreu crescimento bacteriano nas placas após 72 horas de incubação
a 37°C.
3.6.5.3.5.6.1 Inoculação das placas de teste
1) Em condições ideais, mergulha-se um swab de algodão estéril na
suspensão ajustada, até 15 minutos após ajustar a turbidez da suspensão de
inóculo. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede
interna do tubo, acima do nível do líquido. Isso ajudará a retirar qualquer excesso de
inóculo no swab.
2) A superfície seca da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando
o swab em toda a superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando
72
outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de
assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Como passo final, passa-se um swab
na margem da placa de ágar.
3) A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos, embora
nunca mais de 15 minutos, de maneira a permitir que qualquer excesso de umidade
seja absorvido antes de se aplicar os discos impregnados de droga.
3.6.5.3.6.2 Aplicação de discos a placas de Ágar inoculadas
1) Um conjunto predeterminado de discos contendo os extratos a serem
testados é colocado na superfície de uma placa de ágar semeada. Cada disco deve
ser pressionado de encontro à placa, de maneira a assegurar contato completo com
a superfície de ágar. Independentemente de serem aplicados individualmente ou
com dispensador, os discos devem ser distribuídos por igual, de maneira que a
distância de centro para centro não exceda 24 mm. Em geral, deve-se colocar 12
discos, no máximo, numa placa de 150 mm, ou cinco discos numa placa de 100 mm.
Uma vez que algumas drogas se difundem quase instantaneamente, o disco não
deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a superfície de ágar. Em vez
disso, coloque um novo disco em outra parte da placa.
2) As placas devem ser invertidas e colocadas numa estufa, a 35° C, até 15
minutos após a aplicação dos discos.
3.6.5.7 Método de microdiluição em microplacas
A efetividade antimicrobiana de uma substância é freqüentemente descrita em
termos de sua Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é um ensaio quantitativo
aplicado a avaliação da potência da atividade antimicrobiana de misturas ou
substâncias puras. Este método é realizado em microdiluição (100-500 µL) e avalia o
comportamento dos microrganismos frente a concentrações crescentes dos
compostos antimicrobianos em meio de cultura líquido.
Para a determinação da CIM pelo método de microdiluição, empregou-se a
73
técnica descrita pelo NCCLS (2000). Os ensaios foram realizados em placas estéreis
de 96 micropoços, onde se efetuou uma série de diluições das amostras em meio
caldo caseína de soja e sabouraud, contendo 2% do surfactante Tween 80, iniciando
da concentração de 20 mg/mL de amostra. Os poços foram inoculados com a
suspensão microbiana, na concentração de 1x10
6
células viáveis, com intensa
homogeneização e as placas foram incubadas por 24 horas a 35 °C para bactérias e
por 48 horas a 25 °C para fungos. Após o período de incubação, observou-se o
crescimento microbiano, indicado pelo aparecimento de turvação, possibilitando
assim, a verificação da CIM.
As culturas que não apresentaram crescimento nos poços foram usadas para
inocular placas de Petri contendo meio ágar onde foram determinados a
Concentração Bactericida ou Fungicida Mínima (CBM/CFM), sendo consideradas
como: a menor concentração da substância onde não ocorre crescimento
microbiano. Testes em branco foram efetuados simultaneamente e as amostras
foram realizadas em triplicata.
3.6.6 Atividade antioxidante
3.6.6.1 Método do radical livre DPPH
O ensaio emprega o radical estável 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) o qual
tem recebido grande destaque por ser de fácil realização e de baixo custo
(MENSOR, 2001).
A molécula de DPPH é caracterizada como um radical livre estável em
virtude da deslocalização de um elétron disponível na parte central da molécula,
assim a molécula não se dimeriza, como ocorre com muitos outros radicais. Esta
deslocalização também dá origem a uma coloração violeta intensa, caracterizada por
uma banda de absorção, em solução alcoólica, centrada em 520 nm.
Quando uma solução de DPPH é misturada com uma substância que pode
doar um átomo de hidrogênio, isto dá origem a sua forma reduzida com perda da
coloração violeta característica, permanecendo apenas um resíduo de cor amarelo
74
pálido.
A reação primária que ocorre é representada no esquema, a seguir (Figura
29).
DDPH molécula doadora DPPH
radical livre forma reduzida
Figura 29 – Representação esquemática da reação do radical livre DPPH com a molécula doadora
de H, dando origem a sua forma reduzida, DPPH-H.
A redução do radical DPPH permite estimar a atividade antioxidante em
termos da habilidade da substância ou misturas de compostos como doador de
elétrons (H) ou trapeador de radicais livres.
As soluções das amostras nas concentrações de 0,36; 0,60; 1,20; 2,50; 3,12;
5,00; 6,25; 10,00; 12,50; 20,00; 25,00; 40,00; 50,00 e 100,00 µg/µl foram aplicadas
com microseringa em cromatoplacas, utilizando como antioxidantes padrão a
quercetina, na concentração de 2 µg/µL.
Após a aplicação das placas, uma solução metanólica de DPPH (2mg/mL) foi
borrifada sobre as cromatoplacas, deixando-as em repouso por cerca de 1hora. Aos
poucos a coloração violácea foi diminuindo, com a formação de manchas amarelas
sobre o fundo violeta.
N
NO
2
NO
2
O
2
N N
N
NO
2
NO
2
O
2
N N
H
R
H
75
3.6.6.2 Preparo da solução de DPPH
A solução do radical DPPH foi preparada na concentração de 2mg/mL, em
metanol.
3.6.7 Atividade antitumoral
3
3.6.7.1 Células
As linhagens celulares utilizadas neste trabalho são originárias de neoplasias
humanas e foram cedidas pelo NATIONAL CANCER INSTITUTE (NCI) dos EUA.
Estas linhagens foram enviadas congeladas para o laboratório do CPQBA, e o
primeiro passo realizado foi o descongelamento das células. Todos os
procedimentos abaixo foram realizados sob condições estéreis (Fluxo Laminar
Veco®, Classe IIB2). Para descongelamento das células, o criotubo que continha as
células foi mantido à temperatura ambiente, e seu conteúdo transferido para um tubo
de centrifuga de 15 mL. O volume foi completado para 10 mL com meio de cultura
RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB). O tubo foi centrifugado a
4º C e 2000 rpm por 4 minutos.
O sobrenadante foi aspirado e o “pellet celular” ressuspendido
cuidadosamente para evitar a formação de grumos, com 5 mL de RPMI/SFB. A
solução celular foi transferida para frascos de manutenção de 25cm
2
(T25) com 5 mL
de RPMI-1640 /SFB e incubada a 37ºC em atmosfera de 5 % de CO
2
em ambiente
úmido (MADJAROF, C., 2004). Estas linhagens podem ser observadas nasTabelas
11 e 12 (Páginas 76 e 77 respectivamente).
3
Realizado pelo grupo de pesquisa do professor Dr. João Ernesto de Carvalho, coordenador da
Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisa Química, Biológica e
Agrícola (CPQBA) da Universidade de Campinas – UNICAMP.
76
3.6.7.2 Plaqueamento de Células
A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada nas 9 linhagens
tumorais humanas apresentadas na Tabela 11.
Tabela 11- Tipos de culturas das linhagens de células usadas.
No primeiro dia de experimento, foi feito o plaqueamento de células nas
placas de 96 compartimentos. Cada linhagem celular foi inoculada em uma placa,
totalizando 9 placas.
Em uma outra placa, a placa controle (T
0
), foram inoculadas todas as
linhagens celulares. Para células aderidas, cujo crescimento ocorre em
monocamada, foi necessário a tripsinização, ou seja, o desprendimento das mesmas
do frasco através de ação enzimática.
Após a aspiração do meio de cultura, foram adicionados 0,5 mL de tampão de
Hank’s banhando toda a monocamada celular por 10 vezes consecutivas. Este
líquido foi aspirado e então adicionado 0,5 ml de tripsina a 37ºC. O frasco foi
Tipo celular Nome Tipo e cultura
Leucemia K-562 Suspensão
Ovário OVCAR-03 Aderida
Renal 786-0 Aderida
Próstata PCO-3 Aderida
Cólon HT-29 Aderida
Pulmão NCI-460 Aderida
Mama MCF-7 Aderida
Mama resistente NCI - ADR Aderida
Melanoma UACC - 62 Aderida
77
incubado de 25 a 30 segundos sendo logo em seguida banhado com 5ml de meio
RPMI/SFB/gentamicina. A partir deste ponto, as células se apresentam em
suspensão. A linhagem K-562 (leucemia) não precisa passar por esta etapa, pois já
se encontra em suspensão. Os frascos foram agitados delicadamente e uma
alíquota foi retirada e colocada na Câmara de Newbauer para contagem do número
de células.
De acordo com a densidade de inoculação de cada linhagem (determinadas
pelo NCI) (Tabela 12), foi calculada a quantidade de meio necessária para diluição
das células a serem inoculadas. Esta diluição foi feita em tubos estéreis de 50ml.
Foram inoculadas 100µl de solução celular na placas de 96 compartimentos e estas
foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO
2
em ambiente
úmido (MADJAROF, 2004).
Tabela 12 – Densidade de inoculação das células
Linhagens Densidade de inoculação
K-562 6x 10
4
OVCAR-03 7x 10
4
786-0 5x 10
4
PCO-3 4,5x 10
4
HT-29 5x 10
4
NCI-460 4x 10
4
MCF-7 6x 10
4
NCI - ADR 5x 10
4
UACC - 62 4x 10
4
78
3.6.7.3 Diluição e aplicação das amostras
Os extratos e frações (amostras) foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO)
na concentração de 0,1 g/ml resultando em soluções estoques. Para a adição nas
placas, as amostras foram diluídas pelo menos 400 vezes em
RPMI/SFB/gentamicina. As amostras (100µl) foram adicionadas nas placas de 96
compartimentos, exceto na T
0
(Placa controle), nas concentrações 0,25; 2,5; 25;
250µg/ml (Figura 30). Neste momento, foi realizada a fixação da placa T
0
, com a
adição de 50 µl de ácido tricloroacético a 50% (TCA) determinando assim, a
quantidade de células presentes no momento em que as amostras foram colocadas.
Figura 30 – Esquema de uma placa de 96 compartimentos corada com sulforrodamina B, onde as
amostras foram colocadas em triplicata nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250µg/ml.(MADJAROF,
C., 2004).
As demais placas foram incubadas por 48 horas. Após este período, o
experimento foi interrompido para a fixação das placas com a adição de 50 µl de
ácido tricloroacético a 50% (TCA) para as células aderidas e 80% para as células em
suspensão. Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por uma
hora a 4ºC e então submetidas a quatro lavagens consecutivas com água corrente
79
para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários, sendo
mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa (MADJAROF, 2004).
3.6.7.4 Ensaio de SRB (Sulforrodamina B)
Esse ensaio avalia a inibição de crescimento por um método colorimétrico que
estima indiretamente o número de células presentes corando o total de proteína
celular utilizando o corante SRB (SKEHAN, 1990).
As placas foram coradas pela adição de 50µl de SRB (corante protéico) a 0,4
% (peso/volume) dissolvido em ácido acético a 1 %. Estas foram incubadas a 4 ºC,
por 30 minutos e então lavadas por 4 vezes consecutivas com uma solução de ácido
acético 1% e secas em temperatura ambiente. O corante ligado às proteínas
celulares foi solubilizado por adição de 150µl de Trizma Base (10µmol/L). A leitura
espectrofotométrica da absorbância foi feita em um leitor de microplacas (Molecular
Devices Versa Max Microplate Reader).
Foram calculadas as médias das absorbâncias em ELISA (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay) descontadas de seus respectivos brancos foi determinada a
inibição de crescimento (IG) de cada amostra testada.
Finalmente, também foi possível subtrair o resultado obtido de 100%,
obtendo-se então a porcentagem de inibição de crescimento (IC).
As amostras foram consideradas ativas quando apresentaram inibição de
crescimento maior que 50% e ainda, de forma dose dependente.
Com os dados obtidos, foram construídos gráficos relacionando a
porcentagem de inibição de crescimento com a concentração da substância teste.
Como controle positivo foi padronizado o quimioterápico doxorrubicina (Figura 31).
80
Figura 31: Estrutura do quimioterápico doxorrubicina
3.6.8 Atividade sobre a AChE
O estudo da atividade do flavonóide glicosilado tilirosídeo(A-51), isolado de
Pavonia distinguenda A.St.-Hill. et Naudin, sobre a enzima AChE, nas concentrações
de 100, 200, 300 e 400 µmol/L, foi realizado pelo Procedimento geral para
determinação da atividade específica da enzima acetilcolinesterase (ELLMAN,
1961).
3.6.8.1 Preparo dos reagentes
Os tampões fosfatos de potássio mono e dibásico 100mmol/L foram
preparados de acordo as especificações.
3.6.8.1.1 Preparo da solução tampão fosfato monobásico (KH
2
PO
4
/P.M.= 136,09
g/mol)
Para preparar 200ml desta solução pesou-se 2, 7218g (100mmol/L) e diluí-se
em 200mL de água destilada.
O tampão fosfato de potássio monobásico foi utilizado para acidificar o pH do
81
tampão fosfato dibásico.
3.6.8.1.2 Preparo da solução tampão fosfato dibásico ( K
2
HPO
4
/P.M.= 174,18
g/mol)
Para preparar-se 1000ml desta solução pesou-se 17,418g (100mmol/L) e
dilui-se em 1000mL de água destilada
Preparou-se duas soluções, uma com pH 7,5 e outra com pH 7,0 para
posterior utilização no preparo dos reagentes, no decorrer do teste.
3.6.8.1.3 Preparo da solução de DTNB (ácido 5,5’-Ditiobis-2-nitrobenzoico/ P.M.=
396,35 g/mol)
Pesou-se 0,7927g de DTNB, em um béquer de 200mL e adicionou-se 0,06g
de bicarbonato de sódio, adicionou-se 180 mL de tampão fosfato de potássio pH 7,0
até total dissolução. Transferiu-se a mistura para balão volumétrico de 200mL e
completou-se o volume com tampão pH 7,0. A solução foi mantida em frasco âmbar
e armazenada em geladeira até o momento do uso.
3.6.8.1 4. Preparo do sistema (ou reagente de cor) para determinação da AChE
segundo Ellman, 1961.
Esse sistema foi preparado numa proporção de 1:4 de solução DTNB e
tampão fosfato de potássio 7,5 respectivamente. Para 200 mL de solução de DTNB
juntou-se 800 mL de tampão pH 7,5 (em balão volumétrico de 1000 mL), transferiu-
se o sistema preparado para um frasco âmbar e esse foi mantido em geladeira.
82
3.6.8.1.5 Preparo do substrato de AChE 8 mM (C
7
H
16
NOS.I - P.M.= 289,2g)
Pesou-se 0,231 g de AChE( Sigma) em um béquer, acrescentou-se 80 mL de
água destilada, transferiu-se essa mistura para um balão volumétrico de 100mL,
completou-se o volume. Armazenou-se a 0ºC em frasco âmbar fechado, e cobriu-se
o frasco com papel alumínio (fotossensível).
3.6.8.2 Ensaio in vitro
4
Para determinação da atividade da AChE (in vitro) seguiu-se em cada tubo o
procedimento como descrito a seguir.
1°- 1000 µl de SISTEMA (reagente de cor)
2° - 50 µl da droga a ser testada
3°- 100 µl da enzima (obtida da estrutura cerebral c/ proteína já conhecida)
4°- 650 µl de água destilada
5°- pré-incubação a 25°c por 2 minutos
6°- 200 µl de Substrato (Acetiltiocolina)
7°- Agita rápido
8°- Transfere para a cubeta de leitura do espectro
2
O espectrofotômetro programado anteriormente para fazer 4 leituras de
absorbância por 2 minutos (de 30 em 30 segundos). O volume final de solução dos
tubos deve sempre totalizar 2000 µl.
A solução do composto a ser testado, deve conter uma concentração 40X
maior que a concentração final que se deseja na reação, pois quando se adiciona
um volume de 50µl da solução do composto, num volume de 2000µl, dilui-se a
4
Realizado pela Farmacêutica Adriana D.C.Obregon, no Laboratório de Bioquímica da UFSM.
83
concentração do composto 40X.
3.6.8.3 Análise estatística
Após realização das leituras, os dados experimentais foram analisados
estatisticamente por ANOVA, utilizando o programa statistica 7.0.
84
IV RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Estudo Fitoquímico das Plantas
4.1.1 Pavonia distinguenda
O estudo desta espécie teve como principal objetivo a comprovação de seu
uso popular como sendo uma alternativa para problemas da próstata, principalmente
contra tumores. No sul do Brasil, principalmente na fronteira oeste do estado do Rio
Grande do Sul, a planta tem sido muito utilizada pela população local para esta
finalidade. Para isso, a planta foi coletada em uma região de grande uso popular, e
tratada como o convencional para um estudo de seus constituintes químicos e das
possíveis propriedades medicinais. Inicialmente a planta foi extraída com um
solvente polar, neste caso o metanol, e o extrato bruto fracionado conforme descrito
na parte experimental.
4.1.1.1 Isolamento e elucidação estrutural
As substâncias foram isoladas por cromatografia em coluna (CC) realizada
com sílica gel 30-70 Mesh (Merck), e eluída por solventes puros ou sistemas de
gradientes; sendo posteriormente realizadas cromatografia em placa preparativa
para isolamento e cromatografia em camada delgada para identificação dos
compostos através de substâncias puras como padrões de referência.
As estruturas destas substâncias foram elucidadas a partir dos dados obtidos
por análises espectroscópicas de RMN de
1
H e
13
C e experimento de DEPT 135°, e
comparação com os registros na literatura para essas substâncias, que foram
fundamentais para a confirmação de suas estruturas.
85
4.1.1.1.1 Fração acetato de etila
4.1.1.1.1.1 Tilirosídeo(A-51/ Figuras 19 e 32)
Este metabólito foi identificado tanto na fração acetato de etila como na fração
diclorometano. Como o mesmo se encontrava mais concentrado na fração acetato
de etila e por ser a mesma uma fração com menos componentes que a fração
diclorometano, optou-se por isolá-lo desta fração. Para isso, 5 g do extrato acetato
de etila foram submetidas a uma separação através de coluna cromatográfica em
sílica gel, conforme descrito na parte experimental. Obteve-se desta forma uma
substância na forma de um sólido amarelo (237 mg). Em CCD, apresentou teste
positivo para flavonóides, na presença de solução aquosa de cloreto férrico.
Apresentou ponto de fusão de 215-216
o
C e [α]
D
: –50
o
(c 0,12 , MeOH). Análise de
seu espectro de massas de alta resolução, juntamente com os de
1
H e de
13
C,
sugere a fórmula molecular C
30
H
26
O
13
para este metabólito.
O espectro de RMN de
1
H (400MHz, DMSO-d
6
) desta substância (Fig.33)
mostra que a estrutura é composta por 26 hidrogênios, sendo 10 destes, entre δ
6,15- 8,0 ppm, parte de 3 anéis aromáticos. Dois destes hidrogênios fazem parte de
um anel, e se encontram em uma relação meta (J=1,80 Hz), enquanto os demais
oito hidrogênios se encontram divididos em dois outros anéis aromáticos, em uma
posição orto (J = 8,80 e 8,90 Hz), dois a dois. O espectro mostra dois hidrogenios
olefínicos, em δ= 6,10 e 7,37 ppm, que se encontram em uma relação trans (d, J=
16,0 Hz). Além disso, na região do espectro entre δ= 3,27-5,49 ppm, observa-se
cinco hidrogênios metínicos carbinólicos e dois metilênicos, sugerindo uma unidade
glicosídica na estrutura.
86
Figura 32 – Estrutura do tilirosídeo
Figura 33 – Espectro de RMN de
1
H do tilirosídeo(A-51), em DMSO-d
6
, 400.13 MHz
2’,6’
2’”
6’”
7’”
3’” 5’”
3’,5’
8 6
8’” 1”
6”
2” 3” 5”
4”
2’,6’
2’”
6’”
7’”
3’” 5’”
3’,5’
8 6
8’” 1”
6”
2” 3” 5”
4”
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3' "
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3' "
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
87
Figura 34 – Espectro de RMN de
1
H do tilirosídeo(A-51), em DMSO-d
6
, 400.13 MHz - (expansão entre
6,0 – 8,0 ppm)
O espectro de
13
C deste metabólito (Figura 35) mostra que a estrutura do
mesmo é composta por 26 sinais, correspondentes a 30 carbonos, já que os sinais
mais intensos do espectro correspondem a dois carbonos cada. O espectro sugere
ainda que a estrutura possui duas carbonilas, sendo uma delas de um éster. Desses
sinais, 22 carbonos correspondem a carbonos na região de aromáticos (δ entre 100-
167 ppm) enquanto que seis, em campo mais alto (δ entre 60-102 ppm),
correspondem a carbonos alifáticos ligados a oxigênio, característicos de um
sistema glicosídico.
2’ 6’ 7’”
2’” 6’”
3’” 5’”
3’ 5’
8 6
8’”
2’ 6’ 7’”
2’” 6’”
3’” 5’”
3’ 5’
8 6
8’”
88
Figura 35 – Espectro de RMN de
13
C do tilirosídeo(A-51), em DMSO-d
6
, 100.32 MHz
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3'"
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3'"
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
89
Figura 36 – Espectro de RMN de
13
C do tilirosídeo em DMSO-d
6
, 100.32 MHz -em expansão entre
155 - 168ppm
O espectro COSY (Figura 37) mostra que a estrutura é formada por cinco
sistema de spins. O primeiro sistema é formado pelos hidrogênios aromáticos que
ressonam em δ 6,15 e 6,38 ppm, com J = 1,80 Hz (anel A da aglicona).
Os hidrogênios que ressonam em δ 6,79 ppm (2H, J= 8,80 Hz) e 7,34 ppm
(2H, J= 8,80 Hz) formam o segundo sistema de spins(anel B), enquanto que o
terceiro sistema é formado pelos hidrogênios que ressonam em 6,85 ppm (2H, J=
8,80 Hz) e 8,00 ppm (2H, J= 8,80 Hz). O quarto sistema é formado por dois
hidrogênios olefínicos, que se encontram em posição trans, e que aparecem no
espectro em δ 6,10 ppm (1H, J= 16,0 Hz) e em 7,37 ppm (1H, J= 16,0 Hz). O quinto
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3' "
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
6"
2'"
3' "
4'"
5'"
6'"
8'"
7'"
1'"
8
2"
9’’”
90
sistema de spins é formado pelos hidrogênios do açúcar da estrutura. Devido à
sobreposição de três hidrogênios, foi difícil identificar inequivocamente todos os
deslocamentos químicos desta unidade. Clara é a posição do hidrogênio anomérico,
que ressona em δ 5,49 ppm, na forma de um dubleto (J= 7,0 Hz, H 1
’’
). Este mostra
um cruzamento com um sinal em δ 3,39 ppm (sinal sobreposto, H-2
’’
), que por sua
vez mostra um cruzamento com um sinal em d 3,39 (sinal sobreposto, H-3
’’
). Este
último mostra um cruzamento com o sinal em δ 3,26 (sinal sobreposto, H-4
’’
). O sinal
em δ 3,39 é bem caracterizado como sendo H-5
’’
, por apresentar cruzamento com os
hidrogênios diastereotópicos H-6
’’
em δ 4,03 e 4,28 ppm.
Figura 37 – Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H –
1
H do tilirosíde(A-51) DMSO-d
6
, 100.32
MHz
2’ 6’
2’”
6’”
7’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2’ 6’
7’”
2’”
6’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2468
2
4
6
8
2’ 6’
2’”
6’”
7’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2’ 6’
7’”
2’”
6’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2’ 6’
2’”
6’”
7’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2’ 6’
7’”
2’”
6’”
3’” 5’”’
8 6
8’”’
1’”’
6’’
2”3”5”
4”
2468
2
4
6
8
91
Figura 38 – Expansão do espectro RMN de 2D, COSY, correlação
1
H –
1
H do tilirosídeo( A-51)
DMSO-d
6
, 100.32 MHz
Com o auxílio do espectro DEPT 135 (Figura 39), observa-se que a estrutura
é composta por apenas um carbono metilênico, 17 carbonos metínicos, dos quais 10
são aromáticos, e de 12 carbonos não hidrogenados (ausência no espectro).
2’6’
2’ 6’
2”’6’”
2”’6’”
7’”
7’”
3’5’
3’5’
3”’5”’
3”’5”’
8
8
6
6
8’”
8’”
1”
1”
2’6’
2’ 6’
2”’6’”
2”’6’”
7’”
7’”
3’5’
3’5’
3”’5”’
3”’5”’
8
8
6
6
8’”
8’”
1”
1”
92
Figura 39 – Espectro de DEPT 135 do tilirosídeo( A-51) DMSO-d
6
, 100.32 MHz
Os espectros bidimensionais
1
H-
13
C (HMQC, HMBC), foram úteis para definir
a conectividade da molécula.
Através do espectro HMQC (Figura 40), observa-se a correlação dos
carbonos hidrogenados com seus respectivos hidrogênios. Neste espectro, observa-
se a correlação do sinal em δ 63,4 ppm com dois sinais em de 4,03 e 4,28 ppm, dos
hidrogênios diastereotópicos metilênicos, comprovando a quiralidade da molécula.
Além disso, o espectro mostra a posição correta dos carbonos não hidrogenados.
6”6”6”6”
93
Figura 40 – Espectro bidimensional
1
H –
13
C HMQC, do tilirosídeo( A-51) em DMSO-d
6
, 400.13 MHz
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
10
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
10
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
7’”
7’”
2’6’
2’6’
2’”6’”
2’”6’”
1”
1”
6
”
6”
345678
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
10
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
10
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
7’”
7’”
2’6’
2’6’
2’”6’”
2’”6’”
1”
1”
6
”
6”
345678
94
Figura 41 – Expansão do Espectro bidimensional
1
H –
13
C HMQC, do tilirosídeo( A-51) em
DMSO-d
6
, 400.32 MHz - expansão 3,0 – 4,5 ppm
O espectro HMBC realmente foi a ferramenta mais informativa quanto a
conectividade dos átomos na molécula. Neste experimento (Figura 42), identificamos
a conectividade do sistema glicosídico ao sistema aglicona da estrutura, através do
cruzamento do sinal do hidrogênio anomérico em δ
δδ
δ 5,49 com o carbono do sistema
C6-C3-C6 da aglicona que ressona em δ 133,5 ppm (C-3). A estrutura da aglicona
foi completa, através da atribuição dos hidrogênios que aparecem em 6,85 ppm (2H,
J= 8,80 Hz) e 8,0 ppm (2H, J= 8,80 Hz), que apresentam correlação com o carbono
não hidrogenado em 156,8 ppm atribuído a C-2 ( anel C). Uma correlação importante
foi a verificada entre os hidrogênios metilênicos diastereotópicos da unidade
glicosídica com a carbonila que ressona em δ 166,6 ppm, sugerindo uma ligação
6”
6”
6”
6”
95
éster nesta posição. Além disso, os dois hidrogênios olefínicos em 6,10 ppm e 7,37
ppm (J= 16,0 Hz), mostram cruzamento com a mesma carbonila. Um dos
hidrogênios olefínicos mostra correlação com os hidrogênios aromáticos que
absorvem em δ 7,34 ppm. Estes últimos se correlacionam com o carbono que
ressona em δ 160,5, característico de um carbono fenólico.
Figura 42 - Espectros bidimensionais
1
H –
13
C HMBC, do tilirosídeo( A-51) em
DMSO-d
6
, 400.13 MHz
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 '"
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 '"
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
2’6’ 7’” 2’”6’”
8 1”
2
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 '"
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 '"
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
2’6’ 7’” 2’”6’”
8 1”
2
96
Figura 43– Expansão do Espectro bidimensionais
1
H –
13
C HMBC, do tiirosídeo( A-51) em
DMSO-d
6
, 400.13 MHz
Através desta análise, pode-se sugerir que a estrutura trata-se de um
flavonóide glicosilado, cuja aglicona trata-se do flavonol canferol, substituído em C-3
com um glicosídeo, esterificado com o ácido cumárico. Portanto, o composto foi
inicialmente identificado como sendo o canferol-3-O-(6”-O-trans-p-cumaroil)- β-D-
glicopiranose, conhecido na literatura como tilirosídeo, PF entre 264 e 266°C, e
rotação óptica de -59,72° (MeOH)(LENCINA, 2001). Este composto foi isolado
previamente de Tília argenta (CHARI; JORDAN e WAGNER, 1978), sendo, no
entanto, uma substância inédita para o gênero e espécie em estudo.
Entretanto, na literatura ocorrem divergências quanto aos valores de rotação
ótica para o tilirosídeo. Segundo Lencina, 2001 este foi estabelecido
em -59,72°(MeOH) e em Chapman e Hall/CRC, 2002, são encontrados valores de
4’
4’”
2 / 9
7’”
2’ 6’
2’” 6’”
7’” 3’” 5’” 3’ 5’ 8
4’
4’”
2 / 9
7’”
2’ 6’
2’” 6’”
7’” 3’” 5’” 3’ 5’ 8
97
+69,9°(MeOH). Sendo que os valores encontrados em nossos experimentos são de -
50° (MeOH), achou-se pertinente identificar a unidade glicosídica, submetendo o
flavonóide a uma hidrólise ácida, conforme descrito na parte experimental, e a fase
aquosa submetida a uma análise através de cromatografia em papel utilizando
vários açucares como referências, inclusive a glicose (ver Figura 44), o produto de
hidrólise não correspondeu a nenhum dos padrões utilizados, o que sugeriu
inicialmente que o glicosídeo da estrutura poderia não ser glicose, mas
possivelmente um dos seus diastereoisômeros. Outra possibilidade é que a hidrólise
ácida realizada não libere a parte glisosídica de seu éster, ou que forme outro
produto de hidrólise com um Rf diferente da glicose.
Figura 44 –
Para uma melhor confirmação da estrutura proposta, utilizou-se da
espectroscopia de massas de alta resolução (Figura 45), onde o espectro de massas
deste composto, conforme a pode ser visto na Figura 45, mostra um íon molecular a
m/z = 594 daltons, confirmando a estrutura proposta. Os dados de
1
H,
13
C RMN
encontram-se expostos nas Tabelas 13 e 14;
Cromatografia em papel do tilirosídeo, após hidrólise, frente à diferentes
açúcares:1 – Sorbose, 2 – Ribose, 3 – Açúcar obtido da reação, 4 –
Açúcar da Dorstenia , 5 – Sacarose, 6 – Glicose, 7 – Mistura Glicose+
produto da reação, 8- Sacarose + açúcar da Dorstenia.
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
98
Figura 45 – Espectro de massa MS
Tabela 13 – Dados espectrais de RMN de
13
C em DMSO – d
6
a 100.32 MHz da
substância A – 51 e tilirosídeo da literatura (DMSO – d
6
22,63 MHz)
Carbono Tilirosídeo da literatura A - 51
2 156,3
3
156,8
3 133,1 133,6
4 177,4 177,8
5 161,1 161,6
6 98,7 99,13
7 164,1 164,8
8 93,2 94,2
9 156,4 156,9
3
As absorções podem ser intercambiáveis (CHARI; JORDAN e WAGNER, 1978).
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
O
O
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
6 "
2 ' "
3 ' "
4 ' "
5 ' "
6 ' "
8 ' "
7 ' "
1 ' "
8
2 "
A
C
B
99
Continuação da tabela 13
10 103,9 104,3
1’ 120,0 121,2
2’ 130,0 130,6
3’ 115,7 116,3
4’ 159,9 160,5
5’ 115,7 116,3
6’ 130,0 130,6
1’’ 101,1 101,5
2’’ 74,2 74,7
3’’ 76,3 76,7
4’’ 70,0 70,4
5’’ 74,2 74,6
6’’ 63,0 63,4
1’’’ 124,9 125,4
2’’’ 130,7 131,3
3’’’ 115,0 115,7
4’’’ 159,7 160,3
5’’’ 115,0 115,7
6’’’ 130,7 131,3
7’’’ 144,5 145,1
8’’’ 113,7 114,1
9’’’ 166,0 166,6
100
Tabela 14 – Dados espectrais de RMN de
1
H em DMSO – d
6
a 400.13 MHz da
substância A – 51 e tilirosídeo da literatura (DMSO – d
6
)
Posição Sinais Tilirosídeo da literatura
A - 51
5 OH 16,77 12,48
6 CH 6,15 6,15
8 CH 6,30 6,38
2’ CH 7,31 8,00
3’ CH 6,79 6,79
5’ CH 6,79 6,79
6’ CH 7,31 8,00
1’’ CH 5,23 5,49
2’’ OH 3,48 3,39
3’’ OH 3,48 3,39
4’’ OH 3,30 3,26
5’’ CH 3,48 3,39
6’’ CH
2
4,32 4,03 / 4,28
1’’’ OH 9,43 10,12
2’’’ CH 8,00 7,34
3’’’ CH 6,81 6,85
5’’’ CH 6,81 6,85
6’’’ CH 8,00 7,34
7’’’ CH 7,42 7,37
8’’’ CH 6,07 6,09
101
4.1.7 Astragalina (Figura 46)
Este metabólito foi isolado de uma fração de Rf inferior ao do metabólito
anterior, da mesma coluna. Foi isolado na forma de um sólido amarelo, de Pf 177 a
178, 8 ºC e [α]
D
–14,88 (c 0,14, MeOH), após recristalização em metanol/acetona
(25,0 mg). Em análise prévia por CCD, apresentou teste positivo para flavonóides
quando na presença de solução aquosa de cloreto férrico. Análise de seus espectros
de
1
H e de
13
C sugere a fórmula molecular C
21
H
26
O
11
para este metabólito.
A estrutura proposta para este flavonóide foi possível através da análise dos
espectros de
1
H e de
13
C, cujos dados sugerem uma estrutura semelhantes ao do
tilirosídeo, com a ausência dos sinais da unidade cumaroil. Estes dados foram
comparados com os valores da literatura, juntamente com os dados de Pf e de
rotação ótica. Embora a literatura descreva a rotação ótica da astragalina como +
16,9 (c, 0,62 MeOH) e o nosso composto tenha dado – 14,88, sugere-se que o
metabólito por nós isolado trata-se do flavonóide conhecido por astragalina (Figura
46), ou um flavonóide semelhante a ele. Este já foi isolado anteriormente de outras
plantas mas é o primeiro registro deste flavonóide no gênero.
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
Figura 46 – Estrutura do flavonóide astragalina
102
O espectro de RMN de
1
H deste metabólito, obtido em CD
3
OD, a 400MHz
(Figura 47) mostra sinais para seis hidrogênios aromáticos na região entre δ 6,20-8,1
ppm, e sete hidrogênios alifáticos, entre δ 3,3-5,2 ppm. Dois desses hidrogênios
fazem parte de um anel (A), e se encontram em uma relação meta, aparecendo na
forma de um singleto largo (sl), enquanto os demais quatro hidrogênios se
encontram numa posição orto (J = 8,2), dois a dois. Além disso, na região do
espectro entre δ= 3,20-5,20 ppm, observa-se cinco hidrogênios metínicos
carbinólicos e dois metilênicos, sugerindo uma unidade glicosídica na estrutura. O
hidrogênio anomérico da unidade glicosídica absorve em δ 5,16 ppm, na forma de
um dubleto (J=7,2 Hz).
Figura 47 – Espectro de RMN de
1
H da astragalina( A-52), em CD
3
OD, 400.13 MHz
103
O espectro de
13
C deste metabólito (Figura 48) mostra que a estrutura é
formada por 21 carbonos, considerando-se que os sinais mais intensos em δ 132,3 e
116,0 ppm, correspondem cada, a dois carbonos. O espectro DEPT 135 (Figura 49)
mostra que dos 21 carbonos, apenas um corresponde a um carbono metilênico, 11
são carbonos ligados a um hidrogênio e os demais são carbonos não hidrogenados.
Figura 48– Espectro de RMN de
13
C da astragalina( A-52)em CD
3
OD, 100.32 MHz
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
8
2"
CH2OH
A C
B
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
3
4
5
6
7
10
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
3"
OH
4"
5"
8
2"
CH2OH
A C
B
104
Figura 49 – Espectro de DEPT 135º da astragalina( A-52)em CD
3
OD, 100.32 MHz
O experimento COSY (Figura 50) mostra que a estrutura apresenta apenas 3
sistema de spins. O primeiro sistema mostra dois hidrogênios aromáticos, em δ 6,40
e 6,20 ppm, em relação meta, do anel A da estrutura. O segundo sistema mostra
uma relação orto entre dois pares equivalentes de hidrogênios, que absorvem em δ
6,60 e 8,04 ppm, do anel B da estrutura. O terceiro sistema de spins é observado
entre os cruzamentos dos hidrogênios que fazem parte da unidade glicosídica da
estrutura.
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
105
Figura 50 – Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H-
1
H da astragalina( A-52)em CD
3
OD,
100.32 MHz
O espectro que mostra o experimento HMQC (Figura 51) foi útil para mostrar
a conectividade entre os hidrogênios e seus respectivos carbonos.
6”
6”
2”
2
”
6”
6”
2”
2
”
106
Figura 51– Espectro de RMN de 2D, HMQC, correlação
1
H-
13
C da astragalina( A-52) em CD
3
OD,
400.13 MHz
Para comprovar a estrutura de ambos flavonóides, e verificar a biossíntese de
ambos nesta espécie, objetivamos a transformação de um flavonóide no outro, ou
através da esterificação da astragalina com o ácido cumárico, o que originaria o
tilirosídeo, ou pela hidrólise básica seletiva do grupo éster do tilirosídeo originando a
astragalina. Como não possuíamos o ácido cumárico para realizar a esterificação,
optamos pela hidrólise básica do éster, conforme mostra figura 52.
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
6”
4”2”
3”
5”
6 8
1’
6”
2”8 6
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
3
4
5
6
7
1 0
9
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
1 "
3 "
OH
4 "
5 "
8
2 "
C H 2 O H
A C
B
6”
4”2”
3”
5”
6 8
1’
6”
2”8 6
107
O
O H O
O H
O
O H
O
O
O H
O H
O H
O H
O
t i l i r o s i d e o
M e O H / N a
M e O
O
OH O
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
a s t r a g al i n a
C H 2 O H
+
OH
O
MeO
Figura 52 – Reação de hidrólise básica seletiva do grupo éster do tilirosídeo originando astragalina
Para isto, preparou-se uma solução de metóxido de sódio, utilizando-se
metanol seco e sódio metálico. Tratou-se o tilirosídeo natural com esta solução, e
após 60 minutos de agitação a temperatura ambiente, observou-se a total
transformação do substrato em um produto de menor Rf. O excesso de metóxido de
sódio foi neutralizado com uma mistura MeOH/HCl
g
(para evitar meio aquoso), e o
resíduo, após evaporação, foi novamente diluído em metanol anidro. Observou-se a
formação de um resíduo insolúvel (NaCl), que foi filtrado, e o solvente evaporado.
Comparação deste resíduo com o flavonóide isolado (astragalina) em CCD, em
vários sistemas de solventes, mostrou que se tratavam da mesma substância.
Portanto, pode-se propor que a astragalina seja um intermediário na biossíntese do
tilirosídeo, ou vice-versa. Além disso, desta maneira comprovamos ambas as
estruturas. Os dados
13
C e
1
H RMN encontram-se expostos nas Tabelas 15 e 16
respectivamente.
Tabela 15 – Dados espectrais de RMN de
13
C em CD
3
OD a 100.32 MHz da
substância A – 52 e astragalina da literatura
Carbono astragalina da literatura* A - 52
2 158,5 158,4
3 135,4 135,5
4 179,5 179,0
108
Continuação da tabela 15
5 163,1 162,9
6 99,9 99,9
7 166,0 166,0
8 94,7 94,8
9 159,1 159,2
10 105,8 105,2
1’ 122,8 122,6
2’ 132,3 132,3
3’ 116,1 116,0
4’ 161,6 161,6
5’ 116,1 116,0
6’ 132,3 132,3
1’’ 104,1 104,3
2’’ 75,7 75,6
3’’ 78,4 78,3
4’’ 71,4 71,3
5’’ 78,0 77,9
6’’ 62,6 62,5
*CORNELIUS et al., 2004.
109
Tabela 16 – Dados espectrais de RMN de
1
H em CD
3
OD a 400.13 MHz da
substância A – 52 e astragalina da literatura
Posição Sinais astragalina da
literatura* (DMSO- d
6
)
A - 52
6 CH 6,20 6,20
8 CH 6,87 6,40
2’ CH 8,05 8,04
3’ CH 6,93 6,60
5’ CH 6,93 6,60
6’ CH 8,05 8,04
1’’ CH 5,23 5,16
2’’ OH 3,48 3,35
3’’ OH 3,48 3,35
4’’ OH 3,30 3,32
5’’ OH 3,48 3,35
6’’ CH
2
4,32 4,82
*CORNELIUS et al., 2004.
4.1.1.3 Fração hexânica
4.1.1.3.1 Germanicol
Este metabólito apresentou-se como um precipitado branco (10mg), extraído
da fração hexânica, após lavagem desta, com acetona e filtração em funil de
Büchner. A análise por CCD utilizando-se hexano:diclorometano (90:10) como
eluente, mostrou uma mancha com Rf 0,62. Por apresentar um contaminante de
110
Rf muito próximo e de difícil separação, optou-se por primeiramente tentar identificar
o metabólito através de CCD por comparação com outras substâncias puras
autênticas disponíveis no laboratório. Através desta análise comparativa, foi possível
identifica-lo como sendo o triterpeno germanicol. Por ser uma substância conhecida,
optou-se por não realizar experimentos de de RMN de
1
H e
13
C para comprovar sua
estrutura.
4.1.1.3.2 β-Sitosterol
Este metabólito foi obtido da fração hexânica (frações 7-15), após submissão
a uma separação em coluna cromatográfica utilizando-se gel de sílica como suporte
sólido. O sólido branco obtido das frações 7-15 da coluna (15 mg) foi purificado
através de placas preparativas de gel de sílica { CHCl
3
-MeOH (95:05)} (10mg).
Como se trata de um metabólito comum em plantas, foi facilmente identificado por
análise de seus espectros de RMN (Fig. 54, 55), comparação com dados da
literatura (AKIHISA,1982) e por comparação em CCD com uma amostra autêntica de
β-sitosterol. Outros métodos de identificação não foram necessários por ser uma
substância muito comum.
Figura 53 – Estrutura do β-sitosterol
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
111
Figura 54 – Espectro de
1
H de β-sitosterol em CDCl
3
a 400.13 MHz.
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
112
Figura 55 – Espectro de RMN
13
C do β-sitosterol em CDCl
3
a 100,32 MHz.
4.1.1.3.3 Taraxerol
Este metabólito foi isolado como um sólido branco (17 mg), da fração
hexânica, através de placa preparativa, utilizado como sistema eluente
hexano/acetato de etila (90:10). A estrutura foi confirmada através da análise dos
métodos espectroscópicos e por dados da literatura, e por comparação de uma
amostra autêntica do triterpeno denominado taraxerol.
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
113
Figura 56 – Estrutura do taraxerol
O espectro de RMN de
1
H (Figura 57) apresentou sinais em 0,80, 0,82, 0,90,
0,91, 0,92, 0,95, 0,97, 1,09 ppm (singletos), atribuídos aos grupos metílicos Me-23, -
24, -25, -26, -27, -28, -29, -30. O duplo dubleto em 5,53 ppm (1H, dd, H-15) sugeriu
à presença de uma ligação dupla endocíclica na estrutura. O dubleto em 3,19 ppm
(1H, d, H-3) relativo ao hidrogênio carbinólico H-3. No mesmo espectro, observam-
se vários sinais entre 1,66-1,22 ppm, que foram atribuídos aos grupos metilênicos e
metínicos do composto taraxerol.
Figura 57 – Espectro de RMN de
1
H do taraxerol, em CDCl
3
, 400.13 MHz
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
114
No espectro de RMN
13
C (Figura 58) observaram-se vinte e sete sinais de
carbono, sendo três carbonos sobrepostos, o que corresponde a 30 carbonos no
total caracterizando um esqueleto triterpênico para este metabólito. Os sinais em
158,1 (C-14) e 116,8 ppm (C-15) correspondem os carbonos da dupla ligação.
Figura 58– Espectro de RMN de
13
C do taraxerol, em CDCl
3
, 100.32 MHz
O espectro DEPT 135° (Figura 59) mostrou apenas vinte sinais de carbonos,
o que corresponde a vinte e três sinais devido a sobreposição de três sinais de
carbono, sendo, portanto, onze primários ou terciários (amplitude positiva), com
sinais sobrepostos do C-24 e 25, C-26 e 28) e nove secundários (amplitude
negativa) com dois carbonos sobrepostos (C-7 e C-12), concluindo-se que temos 7
carbonos desidrogenados na estrutura , pois são os carbonos que desaparecem no
DEPT 135°. Com base nestes dados e registros na literatura foi possível sugerir a
estrutura ao triterpeno Taraxerol, composto isolado pela primeira vez nesta espécie.
Os deslocamentos químicos de todos os carbonos presentes na estrutura e a
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
115
comparação destes com os dados da literatura, podem ser visualizados na Tabela.
Figura 59 – Espectro DPT 135° de taraxerol, em CDCl
3
, 100.32 MHz
Tabela 17 – Dados de RMN de
13
C do taraxerol
Posição δ
δδ
δ
13
C (ppm) taraxerol δ
δδ
δ
13
C (ppm) taraxerol da literatura*
1 37,7 38,1
2 27,1 27,3
3 79,0 79,2
4 38,9 39,1
5 55,5 55,7
6 18,8 18,2
7 35,1 35,3
8 38,7 38,9
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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13
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15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
116
9 48,9 48,9
10 37,7 37,9
11 17,5 17,7
12 35,1 35,4
13 37,5 37,9
14 158,1 158,1
15 116,8 117,0
16 36,9 36,9
17 38,0 38,1
18 49,3 49,4
19 40,9 41,4
20 28,8 29,0
21 33,7 33,9
22 33,1 33,2
23 28,0 28,1
24 15,4 15,6
25 15,4 15,6
26 29,9 30,1
27 25,9 26,0
28 29,9 30,0
29 33,3 33,5
30 21,5 21,5
* SAKURI.; YAGUCHI, e INOUE, T.; 1987.
Foi feita cromatografia em camada delgada da fração diclorometano (FD),
utilizando-se diclorometano: acetato de etila 20% como fase móvel, onde foi
identificado um composto o lupeol isolado também na fração hexânica e o tilirosídeo
(A-51) também isolado da fração acetato de etila.
Devido a fração diclorometano ser muito semelhante cromatograficamente à
Continuação da Tabela 17
117
fração acetato de etila, esta não foi trabalhada.
4.1.1.3.4 Lupeol (ARATANECHEMUGE, et al., 2004)
Este metabólito foi obtido na forma de um sólido branco (40 mg) através de
cromatografia em placa preparativa em hexano-acetato de etila (90:10) da fração
hexânica. A mesma substância (15 mg) também foi isolada da fração diclorometano
através de cromatografia em camada delgada preparativa utilizando-se
diclorometano: acetato de etila 10% como sistema eluente. A estrutura deste
composto foi determinada por métodos espectroscópicos e por comparações com
dados da literatura, e por comparação com uma amostra autêntica do triterpeno
lupeol.
Figura 60 – Estrutura do lupeol
O espectro de RMN de
1
H (Figura 61), é característico de compostos
triterpênicos. Na região entre 0,70 e 1,80 ppm observa-se sinais referentes aos sete
grupos metílicos presentes na estrutura, a 0,73, 0,76, 0,80, 0,91, 0,95, 1,11 e 1,65
ppm.
Os hidrogênios da dupla ligação presentes na estrutura são identificados
pelos sinais em 4,53 e 4,65 ppm. O hidrogênio ligado ao átomo do carbono quiral (C-
3), tem um deslocamento químico de 3,18 ppm e aparece na forma de um duplo
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
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18
17
19
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22
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28
29
30
O H
1
2
3
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9
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22
24
23
25
26
27
28
29
30
118
dubleto (1H, J=8 e 12 Hz), pois acopla com os hidrogênios diasterotópicos em C-2.
Figura 61 – Espectro de RMN
1
H, a 400, 13 MHz, do lupeol em CDCl
3
A atribuição de sinais de RMN de
13
C foi realizada através de técnicas de
ressonância de carbono totalmente desacoplado (Figura 62) e DEPT 135º (Figura
63) e em conjunto com comparações de dados da literatura.
Analisando-se o espectro de carbono (
13
C), verifica-se a presença de 26
carbonos, sendo quatro sinais sobrepostos, que são as metilas 24, 26 e 27 com
deslocamento químico em 15,4 ppm, o carbono 1 e 4 em 38,8 ppm, os carbonos 2 e
15 em 27,4 ppm, confirmando a presença dos trinta carbonos.
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
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23
25
26
27
28
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30
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
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12
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20
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24
23
25
26
27
28
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30
O H
1
2
3
4 5 6
7
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9
10
11
12
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14
15
16
18
17
19
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21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4 5 6
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8
9
10
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12
13
14
15
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18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
119
Figura 62 – Espectro de RMN
13
C do lupeol, em CDCl
3
, a 100,32 MHz
O espectro de DEPT 135º (Figura 63) possibilitou a identificação de treze
sinais referentes a carbonos metínicos (CH) e metílicos (CH
3
) com amplitude
positiva, onze sinais com amplitude negativa referente a carbonos metilênicos (CH
2
),
sugerindo desta maneira que o metabólito possua seis carbonos quaternários, pois
estes não aparecem no espectro de DEPT 135º.
OH
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
OH
1
2
3
4 5 6
7
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9
10
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12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
OH
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
OH
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
120
Figura 63 – Espectro de RMN DEPT 135º do lupeol, em CDCl
3
, a 100,32 MHz
Tabela 18 – Dados de RMN de
13
C de lupeol
Posição δ
δδ
δ
13
C (ppm) lupeol
em CDCl
3
δ
δδ
δ
13
C (ppm) lupeol da literatura*
em CD
2
OD
1 38,1 38,7
2 27,4 27,4
3 78,9 79,0
4 38,8 38,8
5 55,2 55,3
6 18,1 18,3
7 34,3 34,3
8 40,8 40,8
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
O H
1
2
3
4 5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
18
17
19
20
21
22
24
23
25
26
27
28
29
30
121
9 50,4 50,4
10 37,2 37,1
11 21,9 20,9
12 25,2 25,1
13 37,9 38,1
14 42,8 42,8
15 27,4 27,4
16 35,5 35,6
17 42,9 42,9
18 48,3 48,3
19 47,9 47,9
20 150,8 150,9
21 29,6 29,8
22 40,0 39,9
23 27,9 27,0
24 15,2 15,4
25 16,0 16,1
26 15,4 15,9
27 15,3 14,5
28 18,3 17,9
29 109,3 109,3
30 19,2 19,3
*ARATANECHEMUGE,Y. Et al., 2004.
Continuação da Tabela 18
122
4.1.1.4 Fração diclorometano
Uma análise através de CCD desta fração, utilizando-se diclorometano:
acetato de etila 20% como fase móvel, identificou-se lupeol, isolado também na
fração hexânica, e o tilirosídeo, também isolado da fração acetato de etila. Devido a
esta fração apresentar metabólitos já isolados das frações discutidas anteriormente,
a mesma não foi submetida a uma separação cromatográfica, apenas utilizada para
os testes de atividade biológica.
4.1.1.5 Fração butanólica
Esta fração foi analisada por CCD, e posteriormente submetida a uma
cromatografia em coluna em fase reversa, devido a ser uma fração muito polar e de
difícil separação. A fração dissolvida em metanol, originou cristais grandes incolores,
bem característico de açúcares que não foi identificado.
4.1.2 Dorstenia brasiliensis
A escolha por esta espécie de planta teve como finalidade o estudo de uma
planta comum em nossa região e muito utilizada na medicina popular para uma série
de enfermidades. Apesar de ser uma planta bem estudada em várias partes do
mundo, nosso objetivo foi de estudar a espécie de nossa região, e analisar as
possíveis modificações climáticas e de solo, que possam originar metabólitos
diferentes das espécies estudadas em outras regiões. Além disso, tentar validar o
uso popular da mesma através de análises farmacológicas de seus extratos e de
alguns de seus metabólitos isolados. Como a parte da planta mais utilizada
popularmente são as raízes, optou-se por esta parte da planta para este estudo.
Para isso, a planta foi coletada e trabalhada conforme descrito na parte
experimental.
123
4.1.2.1 Metabólitos isolados
O extrato hexânico (2,0 g), na forma oleosa incolor, foi submetido a uma
coluna cromatográfica de sílica gel, utilizando-se n-hexano e acetato de etila, na
forma gradiente. Obteve-se uma fração (frações 2-5), eluído com n-hexano, na forma
de um óleo incolor, aromático, que se apresentava homogêneo, apenas uma
mancha em CCD. A amostra foi submetida a uma análise cromatográfica, utilizando-
se cromatografia em fase gasosa (CG) (Figura 64). Desta maneira, comprovou-se
tratar de uma mistura de componentes, de difícil separação. Após estes resultados,
esta fração não foi mais trabalhada.
Figura 64 – Análise cromatográfica de CG do óleo incolor aromático obtido do extrato hexânico de
Dorstenia brasiliensis
124
As frações superiores (8-10), eluídas com n-Hexano-acetona (95:5), foram
reunidas por suas similaridades, e constavam de 3 componentes principais, sendo o
de menor polaridade a mesma mistura isolada anteriormente da fração hexânica.
Esta fração (1,5g) foi submetida a uma coluna cromatográfica, utilizando-se hexano-
acetona , gradiente, como sistema eluente. Obteve-se 20 frações (100 mL cada),
que foram recolhidas conforme similaridade em CCD. A fração de menor polaridade,
eluída com hexano (600mg) foi descartada. A segunda fração {frações 5-6, eluídas
com n-hexano-acetona (98:2)}, constituída de um componente principal (16,0 mg),
resultou em um composto amarelo cristalino. Recristalização deste composto com
acetona resultou em um sólido amarelo cristalino (6mg). Pela pequena quantidade
obtida, optou-se por realizar uma análise estrutural por RMN sem uma outra
purificação. O espectro de RMN de
1
H obtido (Figura 65) forneceu poucas
informações quanto à estrutura. O espectro de RMN de
13
C, por apresentar poucos
sinais e muito ruído, foi descartado para análise. O espectro de massas deste
composto, conforme a Figura 66 mostra um íon molecular a m/z= 347daltons. Pela
dificuldade de se propor uma estrutura com os dados em mão, e porque o composto
formou alguns cristais quando deixado evaporar em acetona, optou-se por realizar
uma análise por difração de raios-X. O cristal analisado mostrou a estrutura de uma
cumarina, muito comum, conhecida como umbeliferona. Como esta cumarina
apresenta uma massa molecular de 162 daltons, muito inferior ao íon molecular
observado através do espectro de massas, sugeriu-se a umbeliferona como um dos
componentes químicos desta espécie. A estrutura do componente principal ainda
não foi determinada.
125
Figura 65 – Espectro de RMN de
1
H do sólido amarelo, em CDCL
3
a 400,13 MHz
Figura 66 – Espectro de massa do sólido amarelo
126
As próximas frações da coluna (10-14), eluídas com n-hexano-acetona 10%,
apresentavam um componente principal de mesmo Rf. As frações juntas e
evaporadas forneceram 315,0 mg de uma amostra cristalina, aromática, que
absorvia fortemente sob luz UV. Observou-se um pequeno contaminante, com o
mesmo Rf, que se apresentava fosforescente quando submetido à luz UV a 354nm.
Nas várias tentativas de cristalização em acetona, ou através de separação em
placas preparativas, o contaminante continuava na amostra. Mesmo assim, decidiu-
se realizar as analises através de RMN de
1
H e de
13
C.
O espectro de RMN de
1
H, a 400 MHz e em CDCl
3
(Figura 67), mostra
claramente que a amostra é composta por dois constituintes, numa proporção de
3:1. Observa-se no espectro, que um dos componentes apresenta uma metoxila,
que aparece no espectro em 4,26 ppm, e que o outro componente não apresenta
metoxila em sua estrutura. Analisando-se as integrações dos hidrogênios, conclui-se
que esta metoxila pertence ao componente minoritário, já que a integração para
cada hidrogênio do componente majoritário corresponde a 3 (1H), e a integração
desta metila é igualmente 3 (3H). Observa-se que a estrutura dos dois componentes
é semelhante, com a diferença na metoxila. As estruturas apresentam hidrogênios
aromáticos, e dois sistemas de spins. O espectro mostra dois hidrogênios que
ressonam em δ 7,73 e 6,30, ambos na forma de dubletos , com uma constante de
acoplamento de 9,5 Hz. Estes hidrogênios apresentam um cruzamento no espectro
COSY (Figura 68), e se encontram em uma relação orto de um anel de seis
membros. Outros dois hidrogênios, que mostram correlação no espectro COSY,
aparecem em δ 7,63 e 6,95 ppm, ambos com constante de acoplamento de 2,3 Hz,
característico de uma relação orto de um sistema furano. Além disso, dois
hidrogênios absorvem como singletos isolados em δ 7,61 e 7,37 ppm. Pela
integração (aprox. 3), conclui-se que todos estes hidrogênios pertencem a um dos
componentes da mistura. Os demais sinais do espectro, todos com integração para
um hidrogênio, com exceção do singleto a δ 4,26 ppm, cuja integração sugere 3
hidrogênios, pertencem ao segundo componente da mistura. O hidrogênio que
ressona em δ 8,06 ppm mostra uma correlação no espectro COSY com o hidrogênio
que absorve em δ 6,18 ppm, ambos com um J= 9,8 Hz. O hidrogênio que absorve
em δ 7,53 se correlaciona, no espectro COSY, com outro que absorve em δ 6,95,
ambos com um J= 2,2Hz. Além disso, em δ7,02 observa-se um singleto
127
correspondente a um hidrogênio. A diferença nas duas estruturas esta na falta de
um hidrogênio singleto no composto minoritário, e no lugar deste, aparece uma
metoxila.
Figura 67 – Espectro de RMN de
1
H, a 400,13 MHz e em CDCl
3
da mistura 3:1 de psoraleno e
bergapteno
128
Figura 68 – Espectro de RMN de 2D, COSY, correlação
1
H -
1
H da mistura de psoraleno:
bergapteno (3:1) em CDCl
3
a 100,32 MHz
129
O espectro de
13
C (Figura 69) mostra claramente que a amostra é composta
por duas substâncias de estruturas muito próximas. Neste espectro, o sinal que se
observa em δ 59, 9 ppm, corresponde a metoxila do componente minoritário, e os
sinais em δ161,1 e 160,9 ppm, correspondem as duas carbonilas lactônicas dos dois
compostos.
O espectro HMQC (Figura 70), mostrou a correlação dos hidrogênios que
absorvem em δ 7,73, 7,63 , 7,61, 7,37 , 6,77 e 6,30 com seus respectivos carbonos
do componente principal em δ 144,0, 146,8, 119,8, 99,7, 106,3 e 124,8 ppm,
respectivamente. O mesmo espectro mostra a correlação dos hidrogênios em δ 8,15,
7,58, 7,27, 7,02 e 6,22 com os respectivos carbonos do componente minoritário em δ
139,2, 144,7, 93,6, 104,9 e 115,3, respectivamente.
Figura 69 – Espectro de RMN
13
C da mistura psoraleno: bergapteno (3:1) em CDCl
3
a 100,32 MHz
130
Figura 70 – Espectro de bidimensional, HMQC,
1
H-
13
C da mistura psoraleno: bergapteno (3:1) em
CDCl
3
a 400,13 MHz
131
Uma análise desta amostra através de CG/EM mostra claramente a mistura
de duas substâncias (Figura 72), cujos espectros de massas mostram um íon
molecular m/z = 186 daltons para o componente principal (Figura 73) e m/z= 216
daltons para o componente minoritário (Figura 74). A biblioteca do aparelho sugere
tratar-se dos compostos conhecidos como psoraleno e bergapteno. Os resultados
obtidos através dos espectros de RMN concordam com esta sugestão. Portanto, os
três compostos isolados desta espécie de planta tratam-se de 3 cumarinas, já
isoladas anteriormente da espécie.
Conforme pode ser visualizado no esquema (Figura 71), as cumarinas
bergapteno e psoraleno utilizam a cumarina umbeliferona para sua biossíntese, por
isso é normal encontrá-las em uma mesma fonte.
Figura 71 – Esquema de biossíntese das cumarinas, bergapteno, psoraleno e umbeliferona
132
Figura 72: Cromatograma da mistura de psoraleno+bergapteno
133
Figura 73: Espectro de CG-EM do psoraleno
Figura 74 – Espectro de CG-EM do bergapteno
50
102
130
158
186
50
102
130
158
186
89
145
173
216
89
145
173
216
134
Tabela 19 – Dados espectrais de RMN de
13
C CDCl
3
a 100, 32 MHz da mistura de
psoraleno: bergapteno (3:1)
psoraleno bergapteno Carbono
Literatura * Experimental Literatura * experimental
2 160,8 160,9 160,8 161,1
3 113,4 112,8 113,4 112,5
4 143,5 144,0 143,5 144,7
5 119,4 119,8 111,7 110,9
6 125,4 125,2 126,4 126,4
7 156,1 156,3 147,8 148,2
8 100,2 99,7 93,7 93,6
9 151,5 151,9 152,7 152,6
10 114,9 114,6 115,9 115,3
11 - - 61,2 59,9
2’ 146,0 146,8 146,0 146,4
3’ 105,9 106,3 105,9 104,9
•
••
• LOURENÇO, 2001.
Tabela 20 – Dados espectrais de RMN de
1
H CDCl
3
a 400, 13 MHz da mistura de psoraleno:
bergapteno (3:1)
psoraleno bergapteno H Sinal
Literatura Experimental Literatura experimental
3 CH 6,34 6,30 6,23 6,18
4 CH 7,71 7,73 8,11 8,06
5 CH 7,67 7,61 - -
8 CH 7,43 7,37 7,08 7,02
11 OCH
3
- - 4,24 4,26
2’ CH 7,66 7,63 7,57 7,53
3’ CH 6,91 6,95 7,00 6,95
* LOURENÇO, 2001.
A análise em CCD das frações mais polares, acetato de etila e acetona,
mostrou que em ambas, as duas cumarinas eram os constituintes principais. A
fração acetato de etila (500 mg) foi trabalhada como exposto anteriormente para a
fração hexânica, de onde se obteve a mesma mistura de cumarinas, só que desta
vez, numa proporção próxima de 1:1. Como as duas substâncias eram bem
135
conhecidas, decidiu-se pelo não isolamento das mesmas da fração acetona. Da
fração acetona e acetato foram isolados compostos mais polares que não serão
discutidos neste trabalho por não terem suas estruturas elucidadas.
O extrato metanólico obtido (4,9g), quando redissolvido em metanol e
resfriado em refrigerador, formou um precipitado, que foi filtrado, lavado com
metanol e posteriormente com acetona. Desta forma obteve-se um precipitado
branco, solúvel em água, invisível sob luz UV. A análise deste precipitado em
cromatografia em camada delgada em papel (Figura 44), utilizando-se o sistema n-
Butanol-piridina-H
2
O (9:5:4) como sistema eluente, e vários açúcares como padrões,
foi identificado como sendo sacarose(Figura 45).
Os espectros de RMN de
1
H e de
13
C desta substância, medidos em D
2
O.
Figura 75 - Estrutura da Sacarose
A sacarose ou 1-0-(β-D-frutofuranosil)-α-D-glicopiranose é composta por
frutose e glicose unidas por uma ligação glicosídica (Figura 75), sendo classificada
por um poliol, com oito grupos OH reagentes, três primários ( 6, 1', 6') e cinco
secundários ( 2, 3, 4, 3' e 4'). As OH primárias são mais reativas apenas nas reações
em que fatores estéricos sejam importantes (MACINDOE, 1996), sendo a OH da
posição 2 a mais ácida dentre todas e,consequentemente a mais reativa (NAVIA et
al., 1995).
Como trata-se de um dissacarídeo muito comum em plantas, não foram
necessários métodos complementares para sua identificação. Os espectros de
1
H e
13
C (Figuras 76 e 77) mostram 12 sinais correspondentes da sacarose(NAVIA, 1995;
MACINDOE, 1996).
136
Figura 76 - Espectro de RMN de
1
H, a 400,13 MHz e em D
2
O, da sacarose
Figura 77 -- Espectro de RMN de
13
C 100,32 MHz e em D
2
O, da sacarose
A sacarose é o dissacarídeo mais encontrado na natureza, inclusive na
espécie Dorstenia brasiliensis (BARBOSA-FILHO,2000). Sacarose (C
12
H
22
O
11
)
existe em duas formas cristalinas, a sacarose A normal e estável com PF 184-185°
obtida da cristalização a partir de água e uma sacarose B metaestável com PF 169-
170°, obtida por recristalização a partir de metanol. É um dissacarídeo não redutor
137
com [α]
D
+66.53
o
(H
2
O) o qual por hidrólise com ácidos muito diluídos, resinas de
troca catiônica ou a enzima invertase, fornece proporções equimolares de D-glicose
e D-frutose. O hidrolisado é levo-rotatório ([α]
D
– 28.20°); consequentemente o
processo se tornou conhecido como “inversão”, e o produto como “açúcar invertido”.
Acetilação da sacarose leva a um octa-acetato, demonstrando a presença das oito
hidroxilas na molécula, com [α]
D
+59.6º (CHCl
3
) e existindo em duas formas
cristalinas diferentes com PF 69-70° e 75º respectivamente (BARBOSA-
FILHO,2000).
4.2 Resultados das Atividades Farmacológicas e/ou dos Testes Biológicos
O uso tradicional de diversas plantas medicinais baseado em conhecimentos
populares, aliado à crença de que, por ser natural não causa reações adversas, fez
com que poucas plantas medicinais fossem avaliadas através de estudos pré-
clínicos e clínicos, a fim de comprovar sua eficácia e segurança. Além disto, sabe-se
que muitas plantas medicinais apresentam substâncias que podem desencadear
reações adversas, seja por seus próprios componentes, seja pela presença de
contaminantes ou adulterantes presentes nas preparações, exigindo um rigoroso
controle de qualidade desde o cultivo, coleta da planta, extração de seus
constituintes, até a elaboração do medicamento final.
4.2.1 Toxicidade com Artemia salina
4.2.1.1 Resultados obtidos para P. distinguenda
Diversos trabalhos correlacionam a toxicidade sobre Artemia salina com
atividade antifúngica, antimicrobiana, entre outras. McLaughlin e col.(1991), tem
utilizado este bioenaio na avaliação prévia de extratos de plantas conhecidas como
antitumorais. Também é utilizada como indicador de toxicidade de substâncias
químicas, pesticidas, poluentes e outros. Utilizando-se a concentração letal média
138
(CL
50
) é possível determinar e avaliar a atividade biológica (toxicidade) de um certo
composto ou extrato natural.
Segundo Meyer (1982), os extratos são considerados ativos quando CL
50
<
1000 ppm.
O ensaio realizado com o extrato metanólico de Pavonia distinguenda
demonstrou um índice de citoxicidade para larvas de Artemia salina, visto que a CL
50
do extrato foi determinada em 6,16 µg/mL. Segundo critérios estabelecidos por
Meyer (1982) o resultado obtido demonstra que esta planta possui um potencial
antitumoral e/ou atividade inseticida, e um execelente indicador de toxicidade além
de constituir um teste simples e de baixo custo.
Figura 78 – Tanque (1) contendo os nauplios de Artemia salina e nauplios isolados (2)
– (www.aquaplant.cl/.../artemia/img/artemia2.jpg)
4.2.2 Toxicidade aguda em camundongos
4.2.2.1 Resultados obtidos para P. distinguenda
É um teste usado com drogas e substâncias químicas para estudos
experimentais de seus efeitos danosos. Inclui estudos para determinar a margem de
segurança ou as reações que acompanham a administração de vários níveis de
1 2
139
dosagem.
A avaliação da toxicidade aguda dose única via intraperitoneal, do extrato
aquoso, demonstrou nas doses de 2000 mg/kg, 1000mg/kg, 500mg/kg, 250mg/kg,
125mg/kg, efeitos tóxicos, onde foram observadas alterações com relação ao
comportamento do grupo controle nas doses mais elevadas, como altas
percentagens de mortes (Tabela 21), contorções bem evidentes logo após
administração persistindo por algum tempo, apatia, ptose palpebral, aumento da
defecação chegando a aparecer secreção intestinal. A intensidade destes sintomas
foi diretamente proporcional à dose. A DL
50
foi determinada em 1004.9mg/kg, com
limites de confiança em 731,8 e 1422,7 mg/kg.
O extrato aquoso, de Pavonia distinguenda (partes aéreas), nas doses de
5000mg/kg, 2500mg/kg e 1250mg/kg por via oral em camundongos, não apresentou
sinais de toxicidade, com DL
50
em 3002,14 mg/kg e limites de confiança inferior e
superior, respectivamente, em 2864,39 e 3153,10mg/kg.
1 2
Figura 79 – Camundongos em caixas com água e ração(1) e em caixas “open field”(2) após receber
doses dos extratos de Pavonia distinguenda .
A maior toxicidade via intraperitoneal em relação a via oral, deve-se
provavelmente a existência de substâncias tóxicas que não são absorvidas por via
oral, conforme Almeida (1995)
Os logaritmos das doses foram calculados e a percentagem de mortes foram
transformadas em probitos segundo Carlini (1973).
140
Tabela 21 – Mortalidade em camundongos, via intraperitoneal do extrato aquoso de
Pavonia distinguenda
Dose mg/kg Nº animais Nº de mortos % de mortes
controle 10 0 0
125 10 0 0
250 10 0 0
500 10 01 10
1000 10 05 50
2000 10 09 90
4.2.3 Trânsito intestinal
4.2.3.1 Resultados obtidos para P. distinguenda
Devido aos efeitos de aumento da defecação com evidente eliminação de
secreção intestinal, observados nos testes de toxicidade aguda via intraperitoneal
em camundongos, e ao não conhecimento dos componentes químicos, fez-se o
seguinte teste para avaliar o efeito do extrato sobre a motilidade intestinal, pois
sabe-se que algumas substâncias contidas em plantas, como por exemplo,
antraquinonas, alteram a motilidade intestinal, o que resulta em aumento da
freqüência das evacuações, reduzindo, portanto a absorção de fluidos pela parede
intestinal. Estimulam, ainda, a formação de muco e ativam a secreção de cloretos, o
que resulta em um aumento da secreção de fluido. Além de causar certa toxicidade
em doses elevadas, podem também prejudicar a absorção de outras drogas, causar
um desequilíbrio eletrolítico, entre outros danos relacionados.
Como não existem estudos químicos da espécie, achou-se pertinente a
141
realização do teste de motilidade, pois os efeitos observados anteriormente
poderiam ser devido a presença de substâncias tóxicas, que agem diretamente no
sistema gastrintestinal, no SNC, ou então pelo estresse dos animais. O teste foi
realizado em camundongos machos e fêmeas, utilizando-se como controle atropina
(1mg/ml) e água destilada por via oral e como marcador, o carvão ativado. O extrato
bruto aquoso de Pavonia distinguenda, foi testado nas concentrações de 500mg/kg
e 1000mg/kg. Nestas concentrações e com esta metodologia, não alterou
significativamente o trânsito intestinal.
Com base nos dados experimentais obtidos, conclui-se que os efeitos
observados nos testes de toxicidade aguda via intraperitoneal, podem ser
decorrentes de estresse ou de outras substâncias presentes, que em doses
elevadas interfiram na motilidade e secreções intestinais.
O trato gastrintestinal possui uma atividade autônoma e responde aos
estímulos do lúmen momento a momento, e é sabido que a atividade do sistema
nervoso central influencia nas funções do intestino. Recentes avanços nas
pesquisas demonstram claramente a existência das interações mútuas e recíprocas
entre esses dois órgãos. Acredita-se que esses fenômenos de interação cérebro e
intestinos desempenham um grande papel nas patogêneses, como por exemplo,
ocorre na Síndrome do Cólon Irritável (IBS) que é o modelo de distúrbio funcional. O
estresse psicossocial é conhecido por exacerbar esses sintomas. Drossman et al.
(2000) relataram que o estresse afeta a função intestinal em 84% dos pacientes que
sofriam de IBS ou induzia a dor abdominal em 69% desses pacientes.
4.2.4 Atividade analgésica
Dois modelos experimentais de nocicepção foram usados para examinar o
efeito analgésico do extrato bruto de P. distinguenda e Dorstenia brasiliensis,
envolvendo tanto estímulos nociceptivos químicos (ácido acético), quanto térmico
(placa aquecida). Os extratos das plantas e os solventes foram dados por gavagem
(via oral) e injetados via intraperitoneal, 1h antes dos estímulos químicos ou
térmicos. Os controles positivos, morfina ou indometacina, foram usados para
comparar as respostas farmacológicas dos extratos.
142
4.2.4.1 Resultados obtidos para P. distinguenda
4.2.4.1.1 Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético
Os resultados obtidos pelo método de contorção abdominal induzido por ácido
acético, nas doses de 100, 300 e 1000 mg/kg, do extrato bruto metanólico de
Pavonia distinguenda via oral estão expostos na tabela 22.
Tabela 22 – Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia distinguenda administrado
por via oral sobre as contorções induzidas pelo ácido acético
Grupo
Dose(mg/kg) Número contorções % inibição
Veículo
-
44,57 + 3,45
-
Indometacina 10
10,71 + 2,49 **
75,97
EBM Pavonia distinguenda 100
38,25 + 3,65
14,18
EBM Pavonia distinguenda 300
24,09 + 4,50*
54,05
EBM Pavonia distinguenda 1000 38,33 + 4,37
14,00
Valores expressos como média + S.E.M. para 8 animais em cada grupo, p< 0,05, ** p < 0,01.
Conforme dados exposto na tabela 22, foi possível observar que o extrato
bruto metanólico por via oral, não apresentou uma atividade analgésica
dose/dependente, entretanto, na dose de 300mg/kg foi capaz de diminuir
significativamente o número de contorções (54%) em comparação ao controle
143
(veículo).
Os resultados obtidos pelo método de contorção abdominal induzido por ácido
acético, nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg, do extrato bruto metanólico de Pavonia
distinguenda, via intraperitoneal estão expostos na tabela 23.
Tabela 23 – Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia distinguenda administrado
por via intraperitoneal sobre as contorções induzidas pelo ácido acético
Grupo
Dose(mg/kg) Número contorções % inibição
Veículo - 49,55 + 4,14
-
Indometacina 10 10,71 + 2,49 **
78,38
EBM Pavonia distinguenda 10 32,11 + 5,55
35,19
EBM Pavonia distinguenda 30 29,22 + 5,89*
58,97
EBM Pavonia distinguenda 100
28,12 + 3,80* 56,75
Valores expressos como média + S.E.M. para 8 animais em cada grupo, p< 0,05, ** p< 0,01.
Conforme dados obtidos experimentalmente, expostos na tabela 23 acima, o
extrato bruto metanólico pela administração via intraperitoneal, apresentou melhores
resultados que os obtidos pela via oral, e estes nas doses de 30 e 100 mg/kg, foram
significantivos em relação ao grupo controle (veículo). Os resultados obtidos
mostram que os efeitos não são dose dependentes. O modelo da indução por ácido
acético serve para avaliar substâncias que atuam tanto em nível central quanto
periférico (COLLIER, 1968 ; BENTLEY, 1981).
144
È importante salientar que sempre que qualquer tecido estiver lesado, o
organismo reage para desencadear o estímulo doloroso como um mecanismo de
proteção (GUYTON, 2002). Entretanto a dor é uma experiência complexa que não
envolve apenas a transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas também
cognitivo e emocional processado pelo cérebro.
4.2.4.1.2 Técnica do teste da placa quente
Os resultados obtidos pelo método da placa quente, nas doses de 10, 30 e
100 mg/kg, do extrato bruto metanólico de Pavonia distinguenda via intraperitoneal,
estão expostos na tabela 24 e figura 80.
Tabela 24 – Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia distinguenda via i.p. sobre a
latência no teste da placa quente
Grupo
Dose
(mg/kg)
Medida inicial
1h
2h
4h
6h
Veículo - 10,8 ± 1,9* 12,8 ± 2,03* 13,3 ± 1,7* 12,5 ± 1,6* 10,5 ± 1,6*
morfina
9 10,6 ± 0,8*
27 ± 1,64
26 ± 2,2
25 ± 1,25
25,5 ± 1,31
EBM
P.
distinguenda
10 10,35 ± 0,9*
15,7 ± 2,65*
13,91 ± 2,9*
15,25 ± 1,8*
12,7 ± 3,02*
EBM
P.
distinguenda
30 8,76 ± 0,54*
14,1 ± 2,70* 13,58 ± 3,3*
17,44 ± 2,9*
12,6 ± 2,10*
EBM
P.
distinguenda
100 11,5 ± 1,47* 15,18 ± 2,13*
17,5 ± 2,7* 17,7 ± 2,18* 19,4 ± 3,75*
Valores expressos como média ± S.E.M. para 8 animais em cada grupo.* Diferença significativa em
relação ao grupo morfina 1h, para p< 0,05.
Latência
145
Figura 80 – Efeito antinociceptivo do EB de Pavonia distinguenda sobre a latência no teste da placa
quente.
Os resultados obtidos pelo método da placa quente, nas doses de 100, 300 e
1000 mg/kg, do extrato bruto metanólico de Pavonia distinguenda, via oral, estão
expostos na tabela 25 e figura 81.
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
EB Pavonia 10 mg/kg
EB Pavonia 30 mg/kg
EB Pavonia 100 mg/kg
Morfina 9 mg/kg
Latência (s)
Tempo após tratamento (h)
146
Tabela 25 – Efeito antinociceptivo do EBM de Pavonia v.o. sobre a latência no teste
da placa quente.
Grupo
Dose
(mg/kg)
Medida inicial
1h
2h
4h
6h
Veículo - 10,3 ±0,9* 14,8 ± 3,03* 14,3 ± 2,4* 12,5 ± 2,6* 11,5 ± 1,8*
morfina
9
10,6 ± 0,8*
27 ± 1,64
26 ± 2,2
25 ± 1,25
25,5 ± 1,31
EBM
P.
distinguenda
100
8,0 ± 0,9*
13,2 ± 3,34*
17,7 ± 3,0
12,2 ± 1,7*
14,6 ±3,67*
EBM
P.
distinguenda
300
8,05 ± 1,13*
17,0 ± 2,49* 12,88 ± 3,2*
15,68 ±3,229*
11,9 ± 3,51*
EBM
P.
distinguenda
1000
10,3 ± 1,40* 18,8 ± 2,05 16,1 ± 2,0* 12,7 ± 1,28* 14,2 ± 1,60*
NOTA: Valores expressos como média ± S.E.M. para 8 animais em cada grupo.* Diferença
significativa em relação ao grupo morfina 1h, para p< 0,05.
Latência
147
Figura 81 – Efeito antinociceptivo pelo método da placa quente, latência x tempo de tratamento
Conforme dados expostos nas tabelas 24 e 25 e figuras 80 e 81, os extratos
brutos metanólicos, nas concentrações testadas e pelo método da placa quente, não
apresentaram atividade analgésica equivalente à atividade do padrão morfina,
entretanto, foram observados pequenos aumentos nos tempos de latência com a
administração desses extratos por ambas as vias utilizadas. O estímulo térmico do
teste da placa quente é utilizado para avaliar a atividade analgésica mediada por
mecanismos centrais. É um modelo animal que avalia a atividade de fármacos
opióides, mas outras drogas com atividade central, tais como sedativos e hipnóticas
mostram atividade neste modelo.
Os resultados obtidos nos modelos utilizados para testar a atividade
analgésica do extrato bruto de P. distinguenda, mostram que este não apresenta
uma atividade analgésica comparável aos padrões morfina e indometacina.
Entretanto, sabe-se que os extratos brutos normalmente são constituídos de
uma infinidade de substâncias ativas, e de impurezas que dificultam a execução e a
exatidão dos experimentos. Como as substãncias que constituem este ainda não
foram totalmente estudadas, sugere-se que estudos posteriores sejam realizados,
com seus constituintes isolados e purificados.
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
#
#
EB Pavonia 100 mg/kg
EB Pavonia 300 mg/kg
EB Pavonia 1000 mg/kg
Morfina 9 mg/kg
Latência (s)
Tempo após tratamento (h)
148
4.2.4.2 Resultados obtidos para D. brasiliensis
Para espécie Dorstenia brasiliensis foi realizado inicialmente o modelo
experimental da placa quente por ser este de mais fácil execução, e maior
sensibilidade. Como os resultados obtidos, conforme mostram as tabelas 26 e 27,
foram insatisfatórios em relação a atividade analgésica, optou-se pela não realização
do outro modelo experimental, já que o comitê de ética internacional recomenda o
uso criterioso de animais de laboratório.
Tabela 26 – Efeito do EB de Dorstenia administrado por via oral sobre o teste da
placa-quente
Grupo Dose Latência MI Latência 1h Latência 2h
Morfina 9 mg/kg 10,3 ± 1,32 26.2 ± 2,2* 24 ± 2,05*
EB Dorstenia 100 mg/kg 7,93 ± 0,96 12,47 ± 1,74 15,4 ± 1,51
EB Dorstenia 300 mg/kg 9,53 ± 1,02 13,48 ± 2,33 15,65± 2,04
EB Dorstenia 1000 mg/kg 10,88 ± 1,06 12,86 ± 1,85 14,14 ± 1,92
*Diferença significativa em relação a MI, para p <0,05
Tabela 27 – Efeito do extrato bruto de Dorstenia administrado por via intraperitoneal
sobre o teste da placa quente.
Grupo Dose Latência MI Latência 1h Latência 2h
Morfina 9 mg/kg 10,3 ± 1,32 26.2 ± 2,2* 24 ± 2,05*
EB Dorstenia 100 mg/kg 9,08 ± 0,95 16,18± 2,05 13,4 ± 2,02
EB Dorstenia 30 mg/kg 8,26 ± 1,39 15,43 ± 1,6 12,8 ± 1,67
EB Dorstenia 10 mg/kg 8,92 ± 1,33 14,7 ± 1,71 10,98 ± 1,41
* Diferença significativa em relação a medida inicial (MI), para p<0,05.
Valores expressos como média ± S.E.M. para 8 animais em cada grupo.
149
Estudos complementares devem ser realizados na tentativa de se conhecer
os seus constituintes químicos e relacioná-los com as atividades farmacológicas,
assim como, possíveis interações de seus constituintes e/ou variações na sua
constituição decorrentes de fatores ambientais. Segundo estudo realizado por
Ruppelt (1991), a infusão da planta seca e fresca demonstrou atividade analgésica
e/ou antiinflamatória por administração via oral.
4.2.5 Atividade antioxidante
4.2.5.1 Resultados obtidos para P. distinguenda e seus constituintes isolados
A eficácia da ação antioxidante dos componentes bioativos depende de sua
estrutura química e da concentração (MENSOR, 2001). Dentre os diferentes
métodos existentes destacam-se o ensaio do DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil) onde o
antioxidante reage com o radical DPPH, convertendo-o em sua forma reduzida (1,1-
difenil-2-picrilhidrazina). Nesta reação, a solução metanólica de DPPH, inicialmente
de coloração violeta, torna-se amarelada e o grau deste descoramento indica a
habilidade do antioxidante em seqüestrar o radical livre.
A capacidade de seqüestrar o radical DPPH, expressa em concentração de
inibição, exibida pelos compostos em estudo, encontra-se na tabela 28. Com base
nestes dados, evidencia-se que os compostos ativos destes atuam como doador de
hidrogênio ao radical, entretanto esta ação é diferenciada entre os compostos.
As amostras testadas foram os extratos brutos, as frações hexânicas,
diclorometano, acetato de etila e n-butanólicas, o flavonóide glicosilado, A-51, assim
como, os terpenos, lupeol e taraxerol e o esteróide β-sitosterol livre, isolados de
Pavonia distinguenda. Como antioxidante padrão foi utilizado o flavonóide
quercetina, sendo aplicada juntamente com as amostras, na concentração de 2
µg/µL. Este padrão foi utilizado por ser um agente antioxidante 5 vezes superior às
vitaminas E e C (MARTINEZ-FLORES, 2002).
São observadas certas características na estrutura química dos flavonóides
possivelmente responsáveis pela atividade de neutralização de radicais exercida por
150
esta classe de compostos. Presença do grupo orto-diidroxi ou grupo catecol no anel
B, o que confere uma maior estabilidade à forma radicalar, pois contribui para uma
deslocalização dos elétrons. Ligação dupla conjugada com a função 4-oxo, aumenta
a deslocalização eletrônica a partir do anel B; grupos hidroxilo nas posições 3 e 5
com função oxo, que promove a deslocalização eletrônica do grupo 4-oxo para
esses dois substituintes (RICE-EVANS, 1996).
O flavonóide tilirosídeo (A-51) não foi ativo como trapeador do radical livre
DPPH, provavelmente por características de sua estrutura química, não sendo um
bom doador de hidrogênio a este radical.
A atividade antioxidante de um flavonóide é, então, determinada pelo anel B,
enquanto o restante da estrutura base tem apenas uma pequena influência. Isto
verifica-se devido a uma maior capacidade eletrodoadora deste anel, havendo uma
maior influência da restante estrutura base com o decréscimo da atividade
antioxidante do anel B. O arranjo espacial dos substituintes presentes na molécula
torna-se um fator que contribui também com bastante peso para a atividade
antioxidante destes compostos. Em termos gerais, o fator que determina o caráter
antioxidante de um dado flavonóide será a estabilidade redox do radical formado a
partir do flavonóide original (RICE-EVANS, 1996).
As substâncias, β-sistosterol livre, taraxerol, lupeol também não foram ativos
como trapeadores do radical livre DPPH
O extrato bruto MeOH ( Figura 82-1) e F. hexânica(Figura 82-2) apresentaram
boa atividade antioxidante determinada em 6,25µg , e as frações acetato de etila ,
diclorometano apresentaram atividade antioxidante baixa, determinada em 20µg,
conforme dados expostos na tabela 28 . A capacidade dessas amostras atuarem
como trapeadores do radical livre DPPH, deve-se provavelmente pela presença de
substãncias ainda não identificadas ou pela associação de substâncias presentes.
151
Tabela 28 – Atividades antioxidantes como trapeadores do radical livre DPPH
Concentração
em µg
EBT FH FD FAcEt Flav.A-51
0,36 NA NA NA NA NA
0,60 NA NA NA NA NA
1,20 NA NA NA NA NA
2,50 NA NA NA NA NA
3,12 NA NA NA NA NA
5,00 NA NA NA NA NA
6,25 A A NA NA NA
10,0 A A A NA NA
12,50 A A A A A
20,00 A A A A A
25,00 A A A A A
40,00 A A A A A
50,00 A A A A A
100,00 A A A A A
A= ativo NA=não ativo
152
Figura 82 – Screening da atividade antioxidante do extrato bruto de Pavonia (1), fração hexânica(2) e
padrão quercetina(3).
4.2.6 Atividade antitumoral
O gráfico concentração-resposta é uma das formas onde melhor se visualiza
a atividade antiproliferativa das amostras testadas. Com esse tipo de gráfico é
possível verificar se a substância em questão possui efeito citostático (acima do
ponto zero e abaixo de 50%), efeito citocida (abaixo do ponto zero) e/ou perfil
concentração-dependente. O ponto zero do eixo das ordenadas representa a placa
controle inicial (T0), valor que é comparado com a média da absorbância do controle
final (T) que representa 100% de crescimento celular (após 48 horas de incubação e
na ausência das amostras testadas).
Foram avaliados os perfis de sensibilidade das linhagens celulares ao extrato
metanólico bruto, frações hexânica, diclorometano, acetato de etila, butanólica e o
tilirosídeo isolados de P. distinguenda.
4.2.6.1 Resultados obtidos para P. distinguenda e o flavonóide tilirosídeo(A-51)
4.2.6.1.1 Atividade Antiproliferativa da Doxorrubicina (Controle)
A figura 83 representa a curva concentração-resposta da doxorrubicina, droga
1
2
1
2
3
6,26
6,26
10,00
10,00
12,50
12,5020,00
20,00
25,00
25,0040,00
40,00
2,00
6,26
6,26
10,00
10,00
12,50
12,5020,00
20,00
25,00
25,0040,00
40,00
2,00
153
utilizada como controle positivo, sobre as linhagens celulares, que apresentou
atividade citostática para algumas das linhagens celulares nas concentrações acima
de 2,5µg/ml com exceção da linhagem de mama resistente (NCI.ADR). Na
concentração de 250µg/ml foi citocida para melanoma (UACC) e renal (786.0).
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 - Doxorrubicina
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 83 - Curva concentração-resposta da doxorrubicina sobre as linhagens celulares, relacionando
a porcentagem de crescimento da célula e a concentração da droga utilizada.
4.2.6.1.2 Atividade Antiproliferativa do extrato bruto e frações hexânica,
diclorometano, acetato de etila e butanólica de Pavonia distinguenda, juntamente
com a substância pura tilirosídeo isolada da fração acetato de etila
A figura 84 representa a curva concentração-resposta do Extrato Bruto
Metanólico sobre as linhagens celulares, relacionando a porcentagem de
crescimento das células e a concentração de extrato utilizado. A análise desta curva
demonstrou que este extrato bruto apresenta atividade citostática, inibição do
crescimento (abaixo de 50%), em algumas linhagens celulares como ovário
(OVCAR) na concentração de 25µg/ml, e cólon (HT.29), leucemia (K.562) na
concentração de concentração de 250µg/ml. Na concentração de 250µg/ml, ocorreu
154
citotoxicidade das linhagens mama resistente (NCI-ADR), mama (MCF.7) renal
(C786.0), ovário (OVCAR) pulmão (NCI.460) e UACC-62(melanoma).
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 - Extrato Bruto- Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 84 - Curva concentração-resposta do extrato bruto metanólico sobre as linhagens celulares,
relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.
A figura 85 representa a curva concentração-resposta da fração hexânica
sobre as linhagens celulares. A análise desta curva demonstrou que a fração
hexânica apresenta atividade citostática, inibição do crescimento (abaixo de 50%),
na concentração de 25µg/ml, para as linhagens celulares de ovário (OVCAR) e
mama resistente (NCI-ADR); e na concentração de de 250µg/ml para as linhagens
de próstata (PCO-3) e leucemia (K.562). Ocorreu citotoxicidade das linhagens mama
(MCF.7) renal (786.0), ovário (OVCAR) pulmão (NCI.460), melanoma (UACC) e
cólon (HT-29) somente na concentração de 250µg/ml.
155
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 -Fração Butanólica Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 85 - Curva concentração-resposta da fração hexânica sobre as linhagens celulares,
relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.
As figuras 86 e 87 representam as curvas resposta das frações acetato de
etila e butanólica sobre as linhagens celulares, relacionando a porcentagem de
crescimento das células e a concentração de amostra utilizado. Com base nos
resultados observados pode-se concluir que essas duas frações não apresentaram
atividade citostática, inibição do crescimento (abaixo de 50%), e citocida nas
concentrações testadas em nenhuma das linhagens celulares utilizadas.
Fração Hexânica de Pavonia
156
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 -Fração Acetato de Etila Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 86 - Curva concentração-resposta da fração acetato de etila sobre as linhagens celulares,
relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 -Fração Acetato de Butanolica Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 87 - Curva concentração-resposta da fração butanólica sobre as linhagens celulares,
relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.
Fração Butanólica
de Pavonia
157
A figura 88 representa a curva concentração-resposta da fração
diclorometano sobre as linhagens celulares. A análise desta curva demonstrou que
esta fração apresenta atividade citostática, inibição do crescimento (abaixo de 50%),
para as linhagens celulares de ovário (OVCAR) , próstata (PCO-3), mama resistente
(NCI-ADR) na concentração de 25µg/ml, e na concentração de 250µg/ml para
leucemia(K-562). Ocorreu citotoxicidade das linhagens de próstata (PCO-
3),
ovário(OVCAR-03), mama (MCF.7), mama resistente (NCI-ADR), renal (786.0),
pulmão (NCI.460), melanoma (UACC) e cólon(HT-29), na concentração de
250µg/ml.
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 - Fração Dicloro - Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 88 - Curva concentração-resposta da fração diclorometano sobre as linhagens celulares,
relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de extrato utilizado.
A figura 89 representa a curva concentração-resposta do flavonóide
glicosilado tilirosídeo (A-51) sobre as linhagens celulares, relacionando a
porcentagem de crescimento das células e a concentração de tilirosídeo utilizado. A
análise desta curva demonstrou que este apresenta atividade citostática, inibição do
crescimento (abaixo de 50%), para as linhagens celulares de ovário (OVCAR), na
concentração de 25µg/ml, e na concentração de 250µg/ml sobre renal (786.0), cólon
158
(HT-29) e leucemia (K.562). Ocorreu citotoxicidade na concentração de 250µg/ml ,
das linhagens de próstata (PCO-3), mama (MCF.7), mama resistente (NCI-ADR),
ovário (OVCAR) e melanoma (UACC).
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Ensaio 050912 - Astragalin - Pavonia
250
252,5
0,25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
Porcentagem de Crescimento
Concentração (µg/mL)
Figura 89 - Curva concentração-resposta do flavonóide glicosilado tilirosídeo(A-51) sobre as
linhagens celulares, relacionando a porcentagem de crescimento das células e a concentração de
extrato utilizado.
A Tabela 29 (Pág. 159), mostra os resultados obtidos para a atividade
antiproliferativa das amostras testadas, frente as difrentes linhagens de células, onde
melhor se visualiza as concentrações citostáticas e citocidas destas. Com base nos
dados experimentais sugere-se que os extratos, frações e o flavonóide tilirosídeo
apresentam uma boa atividade antitumoral frente as linhagens de células testadas,
porém, devido a complexidade da composição destes e a natureza química do
flavonóide em questão estes não foram específicos e seletivos, quanto a um único
tipo celular.
Tilirosídeo
159
Tabela 29 – Atividade antitumoral do extrato bruto, frações e do flavonóide tilirosídeo
Linhagens celulares EBT FH FD FAE FB tilirosídeo
l
l
e
e
u
u
c
c
e
e
m
m
i
i
a
a
(
(
k
k
-
-
5
5
6
6
2
2
)
)
250* 250* 250* NA NA 250*
p
p
r
r
ó
ó
s
s
t
t
a
a
t
t
a
a
(
(
P
P
C
C
O
O
-
-
3
3
)
)
250** 250* 25* NA NA 250**
r
r
i
i
m
m
(
(
7
7
8
8
6
6
-
-
0
0
)
)
250** 250** 250** NA NA 250*
m
m
a
a
m
m
a
a
(
(
M
M
C
C
F
F
-
-
7
7
)
)
250** 250** 25* NA NA 250**
(
(
N
N
C
C
I
I
-
-
A
A
D
D
R
R
)
)
m
m
a
a
m
m
a
a
r
r
e
e
s
s
i
i
s
s
t
t
e
e
n
n
t
t
e
e
250** 25* 25* NA NA 250**
o
o
v
v
á
á
r
r
i
i
o
o
(
(
O
O
V
V
C
C
A
A
R
R
-
-
0
0
3
3
)
)
25* 25* 25* NA NA 25*/250**
c
c
ó
ó
l
l
o
o
n
n
(
(
H
H
T
T
-
-
2
2
9
9
)
)
250* 250** 250** NA NA 250*
p
p
u
u
l
l
m
m
ã
ã
o
o
(
(
N
N
C
C
L
L
-
-
4
4
6
6
0
0
)
)
250** 250** 250** NA NA 250*
M
M
e
e
l
l
a
a
n
n
o
o
m
m
a
a
(
(
U
U
A
A
C
C
C
C
-
-
6
6
2
2
)
)
250** 250** 250** NA NA 250*
*citostática **citocida NA= não ativo
4.2.7 Atividade sobre a AChE
4.2.7.1 Resultados obtidos para o isolado tilirosídeo, obtido de P. distinguenda
A diversidade estrutural dos IAChEs conhecidos e a possibilidade de se
explorar modos de ação distintos têm estimulado o estudo fitoquímico de várias
espécies vegetais e de microorganismos, que possam fornecer novos modelos de
substâncias anticolinesterásicas. Neste sentido, vários exemplares da biodiversidade
têm sido estudados em decorrência de sua utilização popular ou de dados
etnobotânicos. Um dos exemplos mais difundidos como fitomedicamentos são os
extratos de Ginkgo. Aparentemente, muitos dos efeitos protetores do SNC
associados ao uso crônico de extratos de Ginkgo estão relacionados à presença de
constituintes terpênicos e flavonóides com propriedades antioxidantes e
160
antiinflamatórias.
Em teste preliminar realizado para evidenciar o efeito do flavonóide glicosilado
tilirosídeo, sobre a atividade da enzima AChE, utilizou-se como concentração no
meio de reação 500 e 100 µM respectivamente, conforme dados expostos na tabela
30.
Tabela 30 – Resultado do ensaio preliminar do tilirosídeo sobre a atividade da
enzima AChE
Controle EtOH Composto 100 µM Composto 500 µ
µµ
µM
21.06 18.90 zero
16.70 15.63 zero
18.44 17.34 zero
19.92 17.76 zero
Na concentração de 100 µM, houve leitura com discreta inibição na atividade
da enzima AChE (média do controle EtOH = 19,03 e media dos testes de 100 µM=
17,40). Na concentração de 500 µM, não houve leitura, ou seja a atividade da AChE
foi zero. Inicialmente, achou-se tratar-se de um inibidor irreversível, porem observou-
se que o flavonóide tilirosídeo(A-51) em meio aquoso tende a aderir-se às paredes
da cubeta impedindo deste modo a passagem total da luz.
Posteriormente testaram-se as concentrações de 400, 300, 200 e 100 µM,
conforme dados expostos na tabela 31.
161
Tabela 31 – Resultado do ensaio definitivo do tilirosídeo sobre a atividade da enzima
AChE
Controle MeOH Composto 100
µM
Composto 200
µM
Composto 300
µM
Composto 400
µM
19.74 18.97 19.11 18.41 16.10
18.97 19.48 18.07 17.68 15.97
20.04 19.88 18.56 19.72 16.34
19.45 18.69 18.96 17.58 17.23
Em todas as concentrações testadas, houve leitura com discreta inibição na
atividade da enzima AChE.
MeOH 100 200 300 400uM
Concentração
0
6
12
18
24
umolesASCh/h/mg
Efeito Inibitório sobre a AChE
**
*
Figura 90 – Resultado do efeito inibitório do tilirosídeo sobre a AChE
4
5
O programa estatístico utilizado na análise dos dados foi o statistica 7.0. Os dados foram tratados
por análise de variância de uma via segundo Anova (Anova one-way)Segundo Anova–Manova a
significância estatística da maior concentração (400uM) foi: [F(4,15)=15.19;p<0.001]
162
A figura 90 mostra os resultados do ensaio definitivo, após tratamento
estatístico
5
dos dados:
Embora exista uma grande diversidade estrutural e modo de ação distintos
entre os IAChEs conhecidos, provindos de plantas ( GOLD, CAHILL, WENK, 2000),
sugere-se que características relacionadas à estrutura química, são provavelmente
as responsáveis pelo efeito sobre a enzima AChE, o que explica a ausência de
atividade do flavonóide tilirosídeo.
4.2.8 Atividade antimicrobiana
4.2.8.1 Resultados obtidos para P. distinguenda
Na determinação da atividade antimicrobiana frente a bactérias gram-
positivas S.aureus ATCC 6538p, S. epidermidis ATCC 12228, M. luteus ATCC 9341,
B.subtillis ATCC 6633, gram-negativas K. pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 10536, Salmonella setubal ATCC 19796, e
fungos S.cerevisae ATCC 2601, C.albicans ATCC 10231, C. dibliniensis SM-26,
C.neoformans ATCC 28952 o extrato bruto, as frações hexânica, diclorometano,
acetato de etila e n-butanólica, assim como, os compostos delas isolados, nas
concentrações 100, 50, 25, 12,5,6,26 e 3,125 µg/aplicação apresentaram os
seguintes resultados:
4.2.8.1.1 Bioautografia
163
Tabela 32 – Resultados experimentais obtidos em bioautografia (quantidade de
substãncia ativa).
µ
µµ
µg/aplicação
Microorganismos indicadores
EBT FH FD FAET FB
S.aureus ATCC 6538p
50 100 100 50 100
S. epidermidis ATCC 12228
100 100 100 100 100
M. luteus ATCC 9341
NA NA NA NA NA
B.subtillis ATCC 6633
100 100 NA 100 NA
K. pneumoniae ATCC 10031
100 50 NA 100 NA
P. aeruginosa ATCC 27853
100 NA NA 100 NA
E. coli ATCC 10536
100 NA 100 50 100
S. setubal ATCC 19796
100 100 100 100 NA
S.cerevisae ATCC 2601
NA NA NA NA NA
C.albicans ATCC 10231
NA NA NA NA NA
C. dubliniensis SM-26
NA NA NA NA NA
C.neoformans ATCC 28952
NA NA NA NA NA
*NA=não ativo
164
Tabela 33 – Resultados experimentais obtidos em bioautografia (quantidade de
substância ativa).
µ
µµ
µg/aplicação
Microorganismos indicadores
lupeol
β
ββ
β-sitosterol taraxerol
Tilirosideo
S.aureus ATCC 6538p
NA NA NA 50
S. epidermidis ATCC 12228
NA NA NA 50
M. luteus ATCC 9341
NA NA NA 100
B.subtillis ATCC 6633
NA NA NA 100
K. pneumoniae ATCC 10031
NA NA NA 100
P. aeruginosa ATCC 27853
NA NA NA 100
E. coli ATCC 10536
NA NA NA 50
S. setubal ATCC 19796
NA NA NA 50
S.cerevisae ATCC 2601
NA NA NA NA
C.albicans ATCC 10231
NA NA NA NA
C. dubliniensis SM-26
NA NA NA NA
C.neoformans ATCC 28952
NA NA NA NA
Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos pela média
aritmética das três repetições em ativo ou não ativo nas respectivas concentrações,
onde o halo de inibição foi ≥ a 6 mm.
165
Figura 91 – Teste de bioautografia do flavonóide tilirosídeo(A-51), S.aureus(1), Klebsiella
pneumoniae(2), Salmonella setubal(3), S.epidermidis(4).
4.2.8.1 2 Difusão em ágar com discos de papel
Pelo método de difusão em ágar com discos de papel, o:extrato bruto, as
frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e n-butanólica de Pavonia
distinguenda mostraram-se ativas contra as bactérias gram-positivas S.aureus ATCC
6538p, S. epidermidis ATCC 12228, B.subtillis ATCC 6633 e gram-negativas K.
pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC
10536, Salmonella setubal ATCC 19796, somente nas concentrações maiores ou
iguais a 50 e 100 µg/µL. Nas concentrações testadas as amostras não se mostraram
ativas contra os fungos S.cerevisae ATCC 2601, C.albicans ATCC 10231, C.
dibliniensis SM-26, C.neoformans ATCC 28952.
O flavonóide glicosilado denominado tilirosídeo, nas concentrações de 100,0;
50,0; 25,0; 12,5, 6,25 e 3,12µg/20 µL , mostrou-se ativo contra as bactérias gram-
positivas S.aureus ATCC 6538p, S. epidermidis ATCC 12228, B.subtillis ATCC 6633
1 2
3 4
166
e gram-negativas K. pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, E. coli ATCC 10536, Salmonella setubal ATCC 19796, somente nas
concentrações de 50 e 100 µg/20µL, e não foi ativo contra nenhum dos fungos
testados. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos pela
média aritmética das três repetições em ativo ou não ativo nas respectivas
concentrações, onde o halo de inibição foi ≥ a 8 mm.
Figura 92 – Difusão em ágar com discos de papel do flavonóide A-51 Escherichia coli(1), Klebsiella
pneumoniae(2), Bacillus subtilis(3), S.aureus (4).
1 2
3 4
167
4.2.8.1.3 CIM (Concentração Inibitória Mínima)
Na determinação da concentração inibitória mínima, ou melhor, quantidade de
substância ativa, pelo método da microdiluição em microplacas, frente a bactérias
gram-positivas S.aureus ATCC 6538p, S. epidermidis ATCC 12228, M. luteus ATCC
9341, B.subtillis ATCC 6633, gram-negativas K. pneumoniae ATCC 10031,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 10536, Salmonella setubal
ATCC 19796, e fungos S.cerevisae ATCC 2601, C.albicans ATCC 10231, C.
dibliniensis SM-26, C.neoformans ATCC 28952 o extrato bruto e frações hexânica,
diclorometano, acetato de etila e n-butanólica de Pavonia distinguenda, somente
inibiram o crescimento das bactérias testadas nas concentrações acima de 300µg, e
não inibiram o crescimento de nenhum dos fungos utilizados. Este resultado deve-se
provavelmente a pouca solubilidade no meio de cultura utilizado.
A atividade antimicrobiana das amostras testadas foi avaliada em três
protocolos experimentais. Estas quando submetidas aos métodos de bioautografia e
difusão em discos, promoveram a inibição dos microorganismos utilizados de
maneira semelhante, ou melhor, a atividade observada foi confirmada em ambos os
métodos. Pela determinação da CIM pelo método da microdiluição, a atividade
apresentou um perfil diferenciado devido a baixa solubilidade das amostras no meio
de cultura utilizado.
168
CONCLUSÕES
Após avaliação fitoquímica e biológica realizada com as espécies
P.distinguenda e Dorstenia brasiliensis pode-se concluir que:
1) A investigação química da espécie P. distinguenda possibilitou a identificação
de seis metabólitos: β-sitosterol, lupeol, taraxerol, germanicol e os flavonóides
glicosilados tilirosídeo (A – 51) e astragalina (A – 52).
2) Em relação à espécie Dorstenia brasiliensis, isolou-se três metabólitos:
psoraleno, bergapteno e umbeliferona.
3) Na avaliação da atividade antimicrobiana da espécie P.distinguenda pelos
métodos de bioautografia e difusão em disco, pode-se observar que todas as
amostras testadas mostraram-se ativas somente contra bactérias e nas
concentrações maiores ou iguais 50 µg.
4) Na determinação da concentração inibitória mínima (CIM), pelo método de
microdiluição, somente as concentrações maiores ou iguais 300 µg inibiram o
crescimento das bactérias testadas.
5) Nenhuma das amostras, nas concentrações testadas, foram ativadas contra
os fungos utilizados, por nenhuma das metodologias.
6) O extrato metanólico de P. distinguenda demonstrou um índice de
citotoxicidade para larvas de Artemia salina, com CL
50
= 6,16µg/µl, demonstrando
que esta planta possui um potencial antitumoral e/ou inseticida.
7) A determinação da CL
50
do extrato aquoso de P.distinguenda, através da
toxidade aguda via oral e intraperitoneal em camundongos, demonstrou que esta
planta não apresenta qualquer indício de toxicidade aguda em doses menores ou
iguais a 1422,7 mg/Kg.
8) Pode-se concluir através do teste do transito intestinal que o extrato aquoso
de P.distinguenda não altera significativamente o trânsito intestinal.
9) Nos estudos da atividade analgésica pelos métodos das contorções
induzidas pelo ácido acético e placa quente, do extrato de P. distinguenda, pode-se
concluir que estes apresentaram efeito significativo em algumas das concentrações
testadas, comparando-se com os veículos utilizados, porém este efeito não foi dose-
169
dependente.
10) Somente o extrato bruto e a fração hexânica de P. distinguenda mostraram-
se bons trapeadores do radical livre DPPH, quando comparados ao padrão
quercetina.
11) O flavonóide glicosado A- 51, isolado de P. distinguenda, apresentou discreta
inibição da atividade da enzima AChE.
12) O extrato bruto, as frações hexânicas e diclorometano, assim como o
flavonóide tilirosídeo(A-51), mostraram-se com potencial ação antitumoral contra
todas as linhagens de células testadas. O extrato bruto, a fração hexânica e a fração
diclorometano, mostraram-se mais ativas que o flavonóide A-51, pois este monstrou-
se ativo contra a maioria das linhagens somente nas concentrações de 250 µg,
enquanto o extrato bruto, as funções hexânica e diclorometano mostraram-se
citostáticos em concentrações de 25 µg e 250 µg, e citocidas em 250µg. Concluindo-
se assim que a combinação de outros metabólitos contidos no extrato bruto e nas
frações mais apolares, colaboram para uma melhor atividade antitumoral.
O EBT, FH, FD e o tilirosídeo mostraram-se com ação seletiva sobre algumas
linhagens de células tumorais, como OVCAR – 03 (ovário).
13) Pavonia distinguenda, aparentemente destituída de toxicidade aguda e rica
em flavonóides e outros metabólitos de emprego medicinal, constitui-se em potencial
fonte de princípios ativos e/ou medicamentos fitoterápicos.
14) Dorstenia brasiliensis, com sua composição química rica em furanocumarinas
constitui-se em fonte potencial de matéria-prima para medicamentos contra doenças
de pele como psoríase e vitiligo.
170
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