( PDF ) Estudo fitoquímico de Helietta puberula (Rutaceae), Simarouba versicolor (Simaroubaceae) e busca de um processo de microencapsulação de compostos ativos, visando o controle de formigas cortadeiras

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo Fitoquímico de Helietta puberula (Rutaceae),

Simarouba versicolor (Simaroubaceae) e Busca de um

Processo de Microencapsulação de Compostos Ativos,

Visando o Controle de Formigas Cortadeiras

Simone Yasue Simote*

Orientador: Prof. Dr. João Batista Fernandes

*bolsista FAPESP

SÃO CARLOS – SP

2006

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Química como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

DOUTOR EM QUÍMICA, na área de

concentração QUÍMICA ORGÂNICA

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária/UFSCar

S611ef

Simote, Simone Yasue.

Estudo fitoquímico de Helietta puberula (Rutaceae),

Simarouba versicolor (Simaroubaceae) e busca de um

processo de microencapsulação de compostos ativos

visando o controle de formigas cortadeiras / Simone Yasue

Simote. -- São Carlos : UFSCar, 2006.

200 p.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,

2006.

1. Produtos naturais. 2. Formigas cortadeiras. 3. Helietta

puberula. 4. Simarouba versicolor. I. Título.

CDD: 5547.3 (20

)

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“A ciência no futuro terá que estar preparada para fornecer

respostas para questões ligadas ao funcionamento da natureza,

condição essencial para o futuro da vida no nosso planeta"

O. R. Gottlieb

Dedico este trabalho aos meus pais Ossamu e Toshie, aos meus irmãos Márcia e

Gilberto e a minha sobrinha Bianca, que sempre me incentivaram em minha

formação pessoal e profissional e por serem a alegria do meu viver...

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. João Batista Fernandes, pela orientação e amizade

Aos professores do Laboratório de Produtos Naturais da UFSCar, Dra. Maria Fátima das

Graças Fernandes da Silva, Dr. Paulo Cezar Vieira e Dr. Edson Rodrigues Filho, pelos

ensinamentos e colaboração

Às alunas Roberta N. A. Almeida, Maria Fernanda Gomes Villalba Penãflor e Cinthia

Zavan do Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) – Rio Claro – SP, pela realização

dos ensaios no controle de formigas cortadeiras

Aos professores Dr. Odair Corrêa Bueno, Dr. Fernando Carlos Pagnocca e Dr. Maurício

Bacci Junior do CEIS, pela colaboração

Aos amigos e professores dos laboratórios de Síntese, de HPLC, de RMN e da Inorgânica,

pela ajuda, amizade e companheirismo

Aos professores Dr. Edson Leite e Dr. Orlando Fatibello pela colaboração na realização dos

experimentos relacionados às microcápsulas

Aos professores, secretárias, amigos e funcionários do DQ/UFSCar, pelos ensinamentos,

convivência e amizade

Aos amigos da Turma de Química 98 da UFSCar pela amizade

Ao Sebastião, pelo carinho, companheirismo, atenção e paciência

Aos amigos conquistados no Laboratório de Produtos Naturais da UFSCar, desde novembro

de 1999 a junho de 2006, obrigada pelos ensinamentos, brincadeiras, brigas, companheirismo,

amizade... Enfim, por tudo... Impossível nomeá-los sem cometer falhas...

Aos meus pais, Ossamu e Toshie, que sempre incentivaram seus filhos a estudarem, mas

respeitaram a decisão de cada um deles em traçar seus próprios caminhos...

Aos meus irmãos, Márcia e Gilberto e ao meu cunhado Milton pelo carinho, apoio e

incentivo

À minha sobrinha Bianca, por me fazer sentir criança a cada encontro...

À FAPESP, pela bolsa concedida

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e

tornaram minha vida em São Carlos sempre alegre

MUITO OBRIGADA

Resumo

ESTUDO FITOQUÍMICO DE Helietta puberula (RUTACEAE), Simarouba

versicolor (SIMAROUBACEAE) E BUSCA DE UM PROCESSO DE

MICROENCAPSULAÇÃO DE COMPOSTOS ATIVOS, VISANDO O

CONTROLE DE FORMIGAS CORTADEIRAS – Este trabalho apresenta o

estudo fitoquímico de duas plantas: Helietta puberula (Rutaceae) e Simarouba

versicolor (Simaroubaceae), biomonitorado através de ensaios em três modelos

biológicos: formigas cortadeiras (Atta sexdens rubropilosa), seu fungo

simbionte (Leucoagaricus gongylophorus) e enzimas pectinases. Os ensaios

biológicos de extratos e frações mostraram que as plantas selecionadas são

promissoras no controle de formigas cortadeiras. O estudo fitoquímico dos

extratos e frações ativas levou a identificação de 34 substâncias de diferentes

classes: esteróides (sitosterol, estigmasterol, sitostenona, estigmastenona,

campestenona e 3

-O-3

-D-glucopiranosil sitosterol); triterpenos do tipo

tirucalano (22S,3

-diidroxitirucala-7,24-dien-23-ona); esqualeno (eurileno) e

lupânico (lupeol e lupenona); alcalóides do tipo quinolônico (N-metil-4-metóxi-

2-quinolona, furoquinolínicos (dictamina, γ-fagarina, kokusaginina, maculina,

flindersiamina), acridônico (arborinina); cantinônicos (4,5-dimetóxicantin-6-ona

e 5-metóxicantin-6-ona) e do tipo

-carbonílicos (7-hidroxi-1-etil

-carbolina e

7-hidroxi-1,1’-propionato de metila

-carbolina); flavonóides (flavona,

isosakuranetina e da 5,7,3’,4’,5’-pentametóxiflavona) e do estilbeno; de

cumarinas (7-hidróxicumarina, 6,7-dimetóxicumarina, 6-hidróxi-7,8-

dimetóxicumarina, 3’-(1’,1’-dimetilalil)-isoescopoletina, metileter-

graveliferona); quassinóides (glaucarubolona e glaucarubinona) e de dois

derivados do ácido cinâmico (3,4,5-trimetoxicinamato de metila e 3,4-

dimetoxicinamato de geranila). Dentre essas substâncias, os alcalóides do tipo

furoquinolínicos e cantinônicos, a flavona e os quassinóides, apresentaram

inibição de até 100% no crescimento do fungo L. gongylophorus e sobrevivência

média de 7 dias num experimento de 23 dias nos ensaios com A. sexdens

rubropilosa. O estudo da quitosana como matriz no processo de

microencapsulação, visando a estabilidade do princípio ativo, a redução na

toxicidade em mamíferos e proteção ao homem e ao meio ambiente, mostrou-se

muito promissora, necessitando-se ainda um estudo mais aprofundado para

redução no tamanho das cápsulas para futuramente vir a ser utilizada para

microencapsulamento de substâncias ativas.

Resumo

Abstract

PHYTOCHEMICAL INVESTIGATION OF Helietta puberula (RUTACEAE),

Simarouba versicolor (SIMAROUBACEAE) AND SEARCH OF

MICROENCAPSULATION TECHNICAL OF THE ACTIVES COMPOUNDS

FOR THE CONTROL OF LEAF-CUTTING ANTS - This work involved the

bioassay-guided study of Helietta puberula (Rutaceae) e Simarouba versicolor

(Simaroubaceae). The biossays were carried out with leaf-cutting ants Atta

sexdens rubropilosa, antifungal activity against the symbiotic fungus

Leucoagaricus gongylophorus and inhibition of the enzymatic activity of

pectinases. The results obtained with extracts and fractions showed that the

selected plants were promising source of compounds in the control against leaf-

cutting ants. The phytochemical investigation of active extracts and fractions

allowed the isolation of 31 compounds of differences types such as: steroids (

sitosterol, stigmasterol, sitostenone, stigmastenone, campestenone and 3

-O-3

D-glucopyranosil sitosterol); triterpenes of the tirucalane type (22S,3

dihydroxytirucal-7,24-dien-23-one), esqualene (eurilene) and lupanic (lupeol

and lupenone); quinoline alkaloids (N-metil-4-methoxy-2-quinolone),

furoquinolinic alkaloids (dictamine, γ-fagarine, kokusaginine, maculine,

flindersiamine), acridonic alkaloids (arborinine); canthinonic alkaloids (4,5-

dimethoxycanthin-6-one and 5-methoxycanthin-6-one) and of the

-carboline

types of alkaloids (7-hidroxy-ethyl

-carboline and 7-hidroxy-1,1’-propyonate of

methyl

-carboline); flavonoids (flavone, isosakuranetine and 5,7,3’,4’,5’-

pentamethoxyflavone); one stilbene (22); coumarins (7-hidroxycoumarin, 6,7-

dimethoxycoumarin, 6-hydroxy-7,8-dimethoxycoumarin, 3’-(1’,1’-

dimethylalyl)-isoescopoletin, methylether-graveliferone); quassinoids

(glaucarubolone and glaucarubinone) and two cinnamic acids derivatives

(methyl 3,4,5-trimethoxycinnamate and geranyl 3,4-dimethoxycinnamate).

Among these substances, furoquinoline and canthinonic alkaloids, flavone and

the quassinoids were active against the L. gongylophorus fungus; inhibiting

100% of its grownth and also showed inhibition against leaf-cutting ants

survivel biossay. The study of chitosan as matriz on the microencapsulation

process; to the encapsulation of the bioactive compound, reduction of the

mammalian toxicity, protection Humans and also the environment; showed very

promising results, but more study is necessary mainly to reduce the size of the

particle

vii

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES

Diâmetro

Deslocamento químico

h Altura

Constante de acoplamento

m/z

Relação massa/carga

acetona-d

Acetona deuterada

AcO

Acetato

AcOEt Acetato de Etila

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CG/EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

COSY Correlated spectroscopy

CRV Cromatografia rápida sob vácuo

Dubleto

Duplo-dubleto

ddd

Duplo-duplo-dubleto

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Dubleto largo

Dose Letal

DMSO Dimetil sulfóxido

Duplo-tripleto

ESI Electrospray

Hex Hexano

HMBC Heteronuclear multiple quantum correlation

HSQC Heteronuclear single quantum correlation

Hz Hertz

viii

IV Infravermelho

Lit. Dados da literatura

Multipleto

Me Metila

MEV Microscopia Eletrônica por Varredura

MHz Mega hertz

MS Mass spectrometry

OMe Metoxila

p. Página

P.F. Ponto de fusão

PENDANT

Polarization Enhancement Nurtured During Attached

Nucleus Testing

Pyr-d

Piridina deuterada

Quadroquadupleto

QTS Quitosana

RMN Ressonância magnética nuclear

RMN

C Ressonância magnética nuclear de carbono

RMN

H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

Singleto

Sobrevivência mediana

Singleto largo

Tripleto

Tripleto largo

TMS Tetrametil-silano

UR Umidade relativa

UV Ultravioleta

LISTA DE TABELAS

TABELA 3.1 – Dados de coleta de Simarouba versicolor e Helietta

puberula.....................................................................

TABELA 3.2 – Extratos obtidos.......................................................... 19

TABELA 3.3 – Frações dos extratos metanólicos............................... 21

TABELA 4.1 – Dados de RMN

H de 2 (200 MHz, CDCl

)............... 57

TABELA 4.2 – Dados de RMN

H e de RMN

C de 4........................ 66

TABELA 4.3 – Dados de RMN

H e

C do triterpeno 5.................... 69

TABELA 4.4 – Dados de RMN

C dos triterpenos 6 e 7.................... 75

TABELA 4.5 – Dados de RMN

H de 8............................................... 80

TABELA 4.6 – Dados de RMN

C dos alcalóides 9 – 13.................. 88

TABELA 4.7 – Dados de RMN

H dos alcalóides 9 – 13................... 89

TABELA 4.8 – Dados de RMN

H e

C do alcalóide 14................... 91

TABELA 4.9 – Dados de RMN

H dos alcalóides 15 e 16................. 99

TABELA 4.10 – Dados de RMN

C de 15 e 16................................... 100

TABELA 4.11 – Correlações

H –

C de 15 e 16 a J

e J

observadas

no experimento de HMBC (400MHz, CDCl

)...........

100

TABELA 4.12 – Dados de RMN

H de 17 e 18.................................... 107

TABELA 4.13 – Correlações

H-

H de 18 observadas nos

experimentos de COSY (400 MHz, CDCl

)..............

107

TABELA 4.14 – Correlações

H –

C a J

, J

e J

de 18 observadas

no experimento de HSQC e HMBC (400 MHz,

CDCl

)........................................................................

108

TABELA 4.15 – Dados de RMN

H e RMN

C das flavanonas 19 e

20................................................................................

116

TABELA 4.16 – Dados de HSQC e HMBC para a flavanona 20......... 117

TABELA 4.17 – Dados de RMN

H da flavona 21................................ 119

TABELA 4.18 – Dados de RMN

H e RMN

C de 22........................... 127

TABELA 4.19 – Dados de HMBC J

, J

e J

de 22............................... 127

TABELA 4.20 – Dados de RMN

H das cumarinas 23-25.................... 134

TABELA 4.21 – Dados de RMN

H e RMN

C das cumarinas 26 e 27 145

TABELA 4.22 – Dados de HSQC e HMBC para as cumarinas 26 e

27................................................................................

145

TABELA 4.23 – Dados de RMN

H de 28............................................ 153

TABELA 4.24 – Dados de RMN

C de 28........................................... 153

TABELA 4.25 – Dados de COSY

H-

H de 28..................................... 154

TABELA 4.26 – Correlações de

H –

C a J

de 28 observadas no

experimento de HSQC...............................................

154

TABELA 4.27 – Correlações de

H –

C a J

, J

e J

de 28

observadas no experimento de HSQC........................

155

TABELA 4.28 – Dados de RMN

H e RMN

C da substância 29......... 161

TABELA 4.29 – Correlações

H –

C de 29 observadas no

experimento de HSQC...............................................

162

TABELA 4.30 – Correlações

H –

C com J

e J

de 29 observadas

no experimento de HMBC.........................................

163

TABELA 4.31 – Dados de RMN

H e RMN

C de 30......................... 169

TABELA 4.32 – Dados de RMN

H de 31............................................. 171

TABELA 5.1 – Efeito dos extratos de S. versicolor e H. puberula

nos ensaios por ingestão em operárias de Atta

sexdens rubropilosa....................................................

180

TABELA 5.2 – Efeito das partições obtidas dos extratos

metanólicos de H. puberula e S. versicolor nos

ensaios por ingestão em formigas cortadeiras...........

184

TABELA 5.3 – Efeito das partições obtidas dos extratos

metanólicos de H. puberula e S. versicolor sobre o

fungo simbionte..........................................................

187

TABELA 5.4 – Efeito dos extratos brutos de S. versicolor e H.

puberula sobre a atividade de pectinase..................... 188

TABELA 5.5 – Atividade das partições obtidas dos extratos

metanólicos de H. puberula e S. versicolor sobre a

enzima pectinase........................................................

189

TABELA 5.6 – Efeito das substâncias puras nos ensaios por

ingestão utilizando-se formigas cortadeiras, nos

ensaios com o fungo simbionte e com as enzimas

pectinases..................................................................

191

LISTA DE ESQUEMAS

ESQUEMA 4.1 –

Proposta de Fragmentação do

-sitosterol............

ESQUEMA 4.2 – Proposta biogenética para a formação do

triterpeno 5...........................................................

ESQUEMA 4.3 – Proposta biogenética para a formação dos

triterpenos 4, 6 e 7................................................

ESQUEMA 4.4 – Proposta de fragmentação para o alcalóide 17

(ES+).....................................................................

104

ESQUEMA 4.5 – Proposta biogenética para a formação do

alcalóide 14..........................................................

109

ESQUEMA 4.6 – Proposta biogenética para a formação dos

alcalóides 8 a 13....................................................

109

ESQUEMA 4.7 – Proposta biogenética para a formação dos

alcalóides 15 ao 18...............................................

110

ESQUEMA 4.8 – Proposta biogenética para a formação dos

flavonóides 19 – 21...............................................

126

ESQUEMA 4.9 – Proposta de fragmentação para a cumarina 23...... 133

ESQUEMA 4.10 – Proposta de fragmentação para a cumarina 24...... 133

ESQUEMA 4.11 – Proposta de fragmentação para a cumarina 25...... 134

ESQUEMA 4.12 – Proposta de fragmentação para a cumarina 26...... 139

ESQUEMA 4.13– Proposta de fragmentação para a cumarina 27...... 144

ESQUEMA 4.14 – Proposta biogenética para as cumarinas 23-27..... 146

ESQUEMA 4.15 – Proposta de fragmentação para o quassinóide 29. 164

ESQUEMA 4.16 – Proposta biogenética para os quassinóides 28 e

29...........................................................................

165

ESQUEMA 4.17 – Proposta biogenética para formação do anel A

dos quassinóides 28 e 29.......................................

166

ESQUEMA 4.18 – Proposta biogenética para as substâncias 30 e

31...........................................................................

170

iii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1 – Simbiose entre as formigas cortadeiras e o fungo L.

gongylophorus............................................................

FIGURA 1.2 – Estrutura da quitina.................................................... 6

FIGURA 1.3 – Estrutura da quitosana................................................ 6

FIGURA 1.4 – Reticulação da quitosana com glutaraldeído.............. 8

FIGURA 1.5 – Substâncias isoladas de Simarouba versicolor........... 10

FIGURA 1.6 – Substâncias isoladas de Helietta puberula................. 12

FIGURA 4.1 – Espectro de RMN

H da mistura 1A + 1B (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.2 – Espectro de massas da mistura 1A e 1B (EIS = 70

e.V).............................................................................

FIGURA 4.3 – Espectro de RMN

H de 2 (CDCl

, 200 MHz)........... 56

FIGURA 4.4 – Espectro de RMN

C de 2 (CDCl

, 50 MHz)............ 57

FIGURA 4.5 – Espectros de massas de 2A, 2B e 2C (ESI = 70 eV).. 58

FIGURA 4.6 – Espectro de RMN

H de 3 (Pyr-d

, 200 MHz)........... 59

FIGURA 4.7 – Espectro de RMN

C de 3 (Pyr-d

, 50 MHz)............ 59

FIGURA 4.8 – Espectro de RMN

H de 4 (CDCl

, 400 MHz)........... 62

FIGURA 4.9 – Espectro de RMN

C de 4 (CDCl

, 50 MHz)............ 63

FIGURA 4.10 – Ampliação do Mapa de contorno de HMBC de 4

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.11 – Ampliação do espectro de COSY

H-

H de 4

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.12 – Mapa de contorno de HSQC de 4 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

FIGURA 4.13 – Ampliação do mapa de contorno de HMBC de 4

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.14 – Mapa de contorno de HMBC de 4 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

FIGURA 4.15 – Espectro de RMN

H do triterpeno 5 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.16 – Espectro de RMN

C do triterpeno 5 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.17 – Espectro de RMN

H do triterpeno 6 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.18 – Espectro de RMN

H do triterpeno 7 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.19 – Espectro de RMN

C do triterpeno 6 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.20 – Espectro de PENDANT do triterpeno 6 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.21 – Espectro de RMN

C do triterpeno 7 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.22 – Espectro de DEPT 135º do triterpeno 7 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.23 – Espectro de RMN

H do alcalóide 8 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.24 – Espectro de RMN

C do alcalóide 8 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.25 – Espectro de RMN

H do alcalóide 9 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.26 – Espectro de RMN

C do alcalóide 9 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.27 – Espectro de RMN

H do alcalóide 10 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.28 – Espectro de RMN

C do alcalóide 10 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.29 – Espectro de RMN

H do alcalóide 11 (CDCl

200MHz).................................................................... 85

FIGURA 4.30 – Espectro de RMN

C do alcalóide 11 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.31 – Espectro de RMN

H do alcalóide 12 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.32 – Espectro de RMN

C do alcalóide 12 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.33 – Espectro de RMN

H do alcalóide 13 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.34 – Espectro de RMN

C do alcalóide 13 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.35 – Espectro de RMN

H do alcalóide 14 (CDCl

200MHz)....................................................................

FIGURA 4.36 – Espectro de RMN

C do alcalóide 14 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.37 – Espectro de RMN

H do alcalóide 15 (CDCl

400MHz)....................................................................

FIGURA 4.38 – Espectro de RMN

H do alcalóide 16 (CDCl

400MHz)....................................................................

FIGURA 4.39 – Espectro de COSY

H-

H de 15 (CDCl

, 400MHz).. 95

FIGURA 4.40 – Espectro de COSY

H-

H de 16 (CDCl

, 400MHz).. 96

FIGURA 4.41 – Espectro de RMN

C do alcalóide 15 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.42 – Espectro de RMN

C do alcalóide 16 (CDCl

50MHz)......................................................................

FIGURA 4.43 – Mapa de contorno de HSQC do alcalóide 15

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.44 – Mapa de contorno de HMBC do alcalóide 15

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.45 – Mapa de contorno de HSQC do alcalóide 16

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.46 – Mapa de contorno de HMBC do alcalóide 16

(CDCl

, 400 MHz).....................................................

FIGURA 4.47 – Espectro de RMN

H do alcalóide 17 (CDCl

400MHz)....................................................................

102

FIGURA 4.48 – Espectro de RMN

H do alcalóide 18 (CDCl

400MHz)....................................................................

102

FIGURA 4.49 – Espectro de massas (ES+) de 17................................ 103

FIGURA 4.50 – Espectro de COSY

H-

H de 18 (CDCl

, 400MHz).. 104

FIGURA 4.51 – Ampliação do espectro de COSY

H-

H de 18

(CDCl

, 400MHz)......................................................

105

FIGURA 4.52 – Mapa de contorno de HSQC de 18 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

106

FIGURA 4.53 – Mapa de contorno de HMBC de 18 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

107

FIGURA 4.54 – Espectro de RMN

H do flavonóide 19 (CDCl

200MHz)....................................................................

112

FIGURA 4.55 – Espectro de RMN

H do flavonóide 20 (CDCl

200MHz)....................................................................

112

FIGURA 4.56 – Espectro de RMN

C do flavonóide 19 (CDCl

50MHz)......................................................................

113

FIGURA 4.57 – Mapa de contorno de HMBC de 20 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

114

FIGURA 4.58 – Mapa de contorno de HSQC de 20 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

115

FIGURA 4.59 – Espectro de RMN

H do flavonóide 21 (CDCl

200MHz)....................................................................

118

FIGURA 4.60 – Espectro de RMN

C do flavonóide 21 (CDCl

vii

50MHz)...................................................................... 118

FIGURA 4.61 – Espectro de RMN

H de 22 (CDCl

, 400 MHz)......... 121

FIGURA 4.62 – Espectro de COSY

H-

H de 22 (CDCl

, 400 MHz). 122

FIGURA 4.63 – Espectro de RMN

C de 22 (CDCl

, 100 MHz)......... 122

FIGURA 4.64 – Mapa de contorno de HSQC de 22

(CDCl

, 400

MHz

)..........................................................................

123

FIGURA 4.65 – Mapa de contorno de HMBC de 22

(CDCl

, 400

MHz

)..........................................................................

125

FIGURA 4.66 – Espectro de RMN

H da cumarina 23 (CH

OD,

200MHz)....................................................................

131

FIGURA 4.67 – Espectro de RMN

H da cumarina 24 (CDCl

200MHz)....................................................................

132

FIGURA 4.68 – Espectro de RMN

H da cumarina 25 (CH

OD,

200MHz)....................................................................

132

FIGURA 4.69 – Espectro de massas (EIS = 70 e.V.) da cumarina 23.. 133

FIGURA 4.70 – Espectro de massas (EIS = 70 e.V.) da cumarina 24.. 133

FIGURA 4.71 – Espectro de massas (EIS = 70 e.V.) da cumarina 25.. 134

FIGURA 4.72 – Espectro de RMN

H da cumarina 26 (CDCl

400MHz)....................................................................

137

FIGURA 4.73 – Mapa de contorno do experimento de COSY de 26

(CDCl

, 400MHz)......................................................

137

FIGURA 4.74 – Espectro de HMBC da cumarina 26 (CDCl

400MHz)....................................................................

138

FIGURA 4.75 – Espectro de Massas (EI = 70 e. V.) da cumarina 26.. 138

FIGURA 4.76 – Espectro de RMN

C da cumarina 26 (CDCl

40MHz)......................................................................

139

FIGURA 4.77 – Espectro de HSQC da cumarina 26 (CDCl

400MHz)....................................................................

140

FIGURA 4.78 – Espectro de RMN

H da cumarina 27 (CDCl

, 400

viii

MHz).......................................................................... 142

FIGURA 4.79 – Espectro de HMBC da cumarina 27 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

142

FIGURA 4.80 – Espectro de HSQC da cumarina 27 (CDCl

, 400

MHz)..........................................................................

143

FIGURA 4.81 – Espectro de RMN

C da cumarina 27 ....................... 143

FIGURA 4.82 – Espectro de massas (ESI) da cumarina 27................. 144

FIGURA 4.83 – Esqueletos básicos de quassinóides............................ 147

FIGURA 4.84 – Tipos de estruturas do anel A..................................... 148

FIGURA 4.85 – Espectro de RMN

C de 28 (Pyr-d

, 50 MHz).......... 150

FIGURA 4.86 – Espectro de RMN

H de 28 (Pyr-d

, 400 MHz)......... 151

FIGURA 4.87 – Espectro de COSY

H-

H de 28 (Pyr-d

, 400

MHz)..........................................................................

151

FIGURA 4.88 – Mapa de contorno de HSQC de 28 (Pyr-d

, 400

MHz)..........................................................................

152

FIGURA 4.89 – Mapa de contorno de HMBC de 28 (Pyr-d

, 400

MHz)..........................................................................

152

FIGURA 4.90 – Espectro de RMN

C do quassinóide 29 (Pyr-d

50MHz)......................................................................

156

FIGURA 4.91 – Espectro de RMN

H do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)....................................................................

157

FIGURA 4.92 – Espectro de COSY H

-H

do quassinóide 29 (Pyr-

, 400MHz)...............................................................

158

FIGURA 4.93 – Mapa de contorno de HSQC do quassinóide 29 ....... 158

FIGURA 4.94 – Espectro de HSQC do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)....................................................................

159

FIGURA 4.95 – Espectro de HMBC do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)....................................................................

160

FIGURA 4.96 – Espectro de massas (ES-) da substância 29............... 163

FIGURA 4.97 – Espectro de RMN

H de 30 (CDCl

, 200 MHz)......... 167

FIGURA 4.98 – Espectro de RMN

H de 31 (CDCl

, 200 MHz)......... 168

FIGURA 4.99 – Espectro de RMN

C de 30 (CDCl

, 50 MHz).......... 168

FIGURA 4.100 – Curva da titulação condutimétrica da quitosana........ 173

FIGURA 4.101 – Espectro de RMN

C da quitosana (D

O/HCl 1%

v/v, 100 MHz)............................................................

174

FIGURA 4.102 – Imagens de MEV das microesferas de quitosana

com aumento de 50x..................................................

176

FIGURA 4.103 – Imagens de MEV das microesferas de quitosana

com aumento de 3000x..............................................

177

FIGURA 5.1 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras,

utilizando os extratos hexânicos das folhas, galhos e

caule de S. versicolor.................................................

181

FIGURA 5.2 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras,

utilizando os extratos diclorometânicos das folhas,

galhos e caule de S. versicolor...................................

181

FIGURA 5.3 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras,

utilizando os extratos metanólicos das folhas, galhos

e caule de S. versicolor...............................................

182

FIGURA 5.4 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras,

utilizando os extratos hexânicos das folhas, galhos e

caule de H. puberula..................................................

182

FIGURA 5.5 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras

utilizando os extratos diclorometânicos das folhas,

galhos e caule de H. puberula....................................

183

FIGURA 5.6 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras,

utilizando os extratos metanólicos das folhas, galhos

e caule de H. puberula................................................

183

FIGURA 5.7 – Efeito dos extratos de S. versicolor sobre o

desenvolvimento do fungo simbionte........................ 186

FIGURA 5.8 – Efeito dos extratos de H. puberula sobre o

desenvolvimento do fungo simbionte........................

186

LISTA DE FLUXOGRAMA

FLUXOGRAMA 3.1 – Obtenção dos extratos de S. versicolor e H.

puberula.........................................................

FLUXOGRAMA 3.2 – Metodologia utilizada na partição de

extratos..........................................................

FLUXOGRAMA 3.3 – Fracionamento do extrato HPGH.................. 23

FLUXOGRAMA 3.4 – Fracionamento do extrato HPGD.................. 25

FLUXOGRAMA 3.5 – Fracionamento do extrato HPFH.................. 26

FLUXOGRAMA 3.6 – Fracionamento do extrato HPFD................... 28

FLUXOGRAMA 3.7 – Fracionamento da fração HPCMH................ 30

FLUXOGRAMA 3.8 – Fracionamento da fração SVCMD............... 32

FLUXOGRAMA 3.9 – Fracionamento da fração SVFMD............... 34

FLUXOGRAMA 3.10 – Fracionamento da fração SVGMD............... 35

SUMÁRIO

1 – Introdução.......................................................................................... 1

1.1 – Formigas Cortadeiras................................................................ 1

1.2 – Métodos de Controle................................................................ 3

1.2.1 – Microencapsulação....................................................... 5

1.3 – Plantas Estudadas..................................................................... 9

1.3.1 – Família Simaroubaceae............................................... 9

1.3.2 – Família Rutaceae......................................................... 11

2 – Objetivos............................................................................................ 13

3 – Procedimento Experimental.............................................................. 15

3.1 – Materiais e Métodos................................................................. 15

3.2 – Equipamentos........................................................................... 16

3.3 – Coleta e Identificação do Material Botânico............................ 17

3.4 – Obtenção dos Extratos.............................................................. 17

3.5 – Obtenção das Frações............................................................... 20

3.6 – Isolamento dos Constituintes Químicos de H. puberula.......... 22

3.6.1 – Estudo Fitoquímico de HPGH..................................... 22

3.6.2 – Estudo Fitoquímico de HPGD..................................... 24

3.6.3 – Estudo Fitoquímico de HPFH...................................... 26

3.6.4 – Estudo Fitoquímico de HPFD...................................... 27

3.6.5 – Estudo Fitoquímico de HPCMH.................................. 29

3.7 – Isolamento dos Constituintes Químicos de S. versicolor......... 31

3.7.1 – Estudo Fitoquímico de SVCMD.................................. 31

3.7.2 – Estudo Fitoquímico de SVFMD................................... 33

3.7.3 – Estudo Fitoquímico de SVGMD.................................. 35

3.8 – Metodologia dos Ensaios Biológicos....................................... 36

3.8.1 – Ensaios Biológicos com as Formigas Cortadeiras....... 36

3.8.2 – Ensaios Biológicos com o Fungo Simbionte................ 37

xii

3.8.3 – Ensaios Biológicos com as Enzimas............................ 38

3.9 – Caracterização da quitosana (QTS).......................................... 39

3.9.1 – Grau de desacetilação (% GD)..................................... 39

3.9.2 – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono .............. 39

3.9.3 – Preparação das microesferas de quitosana................... 39

3.9.4 – Reticulação das microesferas de quitosana.................. 40

3.9.5 – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).............. 40

3.9.6 – Análise de porosimetria................................................ 40

4 – Resultados e Discussões.................................................................... 43

4.1 – Substâncias Isoladas................................................................. 43

4.2 – Esteróides................................................................................. 52

4.2.1 – Identificação estrutural do sitosterol (1A) e

estigmasterol (1B)......................................................... 52

4.2.2 – Identificação estrutural da sitostenona (2A),

estigmastenona (2B), campestenona (2C) e do

-O-3

-D-glucopiranosilsitosterol (3).......................

4.3 – Triterpenos................................................................................ 60

4.3.1 – Identificação estrutural do 22S,3

diidroxitirucala-7,24-dien-23-ona (4)...........................

4.3.2 – Identificação estrutural do triterpeno eurileno (5)........ 67

4.3.3 – Identificação estrutural dos triterpenos lupeol

(6) e lupenona (7)......................................................... 70

4.4 – Alcalóides................................................................................. 78

4.4.1 – Identificação estrutural do alcalóide N-metil-4-

metóxi-2-quinolona (8)................................................. 78

4.4.2 – Identificação estrutural dos alcalóides

furoquinolínicos 9 – 13................................................ 80

4.4.3 – Identificação estrutural do alcalóide 14....................... 89

4.4.4 – Identificação estrutural dos alcalóides 15 e 16............ 92

xiii

4.4.5 – Identificação estrutural dos alcalóides 17 e 18............ 101

4.5 – Flavonóides.............................................................................. 111

4.5.1 – Identificação estrutural dos flavonóides 19 -21........... 111

4.5.2 – Determinação estrutural do estilbeno 22................... 119

4.6 – Cumarinas ................................................................................ 128

4.6.1 – Identificação estrutural das cumarinas 23 - 27 ............ 129

4.7 – Quassinóides............................................................................. 147

4.7.1 – Identificação estrutural do quassinóide 28................... 149

4.7.2 – Identificação estrutural do quassinóide 29 .................. 155

4.8 – Identificação estrutural dos derivados do ácido cinâmico

30 e 31...................................................................................... 166

4.9 – Caracterização da quitosana..................................................... 172

4.9.1 – Grau de desacetilação da quitosana (% GD)................ 172

4.9.2 – RMN

C da quitosana................................................... 174

4.9.3 – Porosimetria de mercúrio............................................. 175

4.9.4 – Espectroscopia Eletrônica por Varredura (MEV)........ 175

5 – Atividades biológicas........................................................................ 179

5.1 – Ensaios por ingestão em operárias de Atta sexdens

rubropilosa............................................................................. 179

5.2 – Atividade inibitória sobre o fungo simbionte........................... 185

5.3 – Atividade inibitória nos ensaios com a enzima pectinase........ 187

5.4 – Atividade das substâncias isoladas nos ensaios por ingestão

em formigas cortadeiras, no fungo simbionte e nas enzimas

pectinases.................................................................................. 190

6 – Conclusões......................................................................................... 193

7 – Referências bibliográficas................................................................. 195

INTRODUÇÃO

Introdução

1 – Introdução

1.1 – Formigas Cortadeiras

As formigas são pertencentes à classe Insecta, ordem Hymenoptera,

família Formicidae, subfamília Myrmicinae, tribo Attini e são consideradas

formigas cortadeiras todas as espécies do gênero Atta, popularmente conhecidas

como saúvas; do gênero Acromyrmex, conhecidas como quenquéns e também

algumas dos gêneros Trachymyrmex, Sericomyrmex e Apterostigma, porém, o

ninho destes três últimos gêneros são muito pequenos e o dano causado são

insignificantes (JUSTI-JUNIOR et al., 1996).

Conhecidas pelo poder de destruição de um grande número de

espécies vegetais e pelo prejuízo econômico causado à agricultura, estas

formigas (BERTI FILHO et al., 1992) encontram-se distribuídas desde o sul dos

Estados Unidos até a região central da Argentina, não ocorrendo nas regiões

transandinas da América do Sul e em algumas ilhas das Antilhas (FARJI-

BRENNER e RUGGIERO, 1994).

Na América do Sul, o Brasil é o país que possui o maior número de

espécies de saúvas, seguido da Argentina e do Paraguai. Na agricultura e

silvicultura brasileira, a subespécie Atta sexdens rubropilosa, conhecida como

“saúva-limão”, é considerada uma praga de grande importância, pois causa

sérios prejuízos às espécies de Eucalyptus e Pinus (BOARETTO & FORTI,

1997).

As formigas cortadeiras são caracterizadas por manterem uma

relação de simbiose com um fungo existente em seu ninho. Em 1986, SINGER

caracterizou esse fungo como sendo Leucoagaricus gongylophorus,

nomenclatura esta, confirmada por FISHER e colaboradores em 1994.

Vários estudos relatam a relação de simbiose existente entre as

formigas cortadeiras e o seu fungo simbionte L. gongylophorus. RODIONOVA

e BEZBORODOV, 1997, relataram que as formigas alimentam a cultura fúngica

Introdução

com substrato vegetal, que é composto por polímeros complexos que

representam 70 a 90% do seu peso seco.

As pectinas representam um terço do peso seco do tecido vegetal de

dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas, desempenhando funções de agente

hidratante e de material cimentador para a rede de fibras de celulose (SAKAI et

al., 1993; THARKUR et al., 1997) sendo necessário um complexo enzimático

para promover a degradação da pectina no tecido vegetal. Enzimas que

degradam os polissacarídeos vegetais em açúcares redutores foram detectadas

no fungo simbionte (SIQUEIRA et al., 1998; SILVA, 1999) e também

encontradas no líquido fecal de A. colombica tonsipes (MARTIN et al., 1975) e

A. sexdens rupropilosa (SIQUEIRA, 1997; SILVA, 1999). Sendo assim, as

formigas utilizam o fungo simbionte para promover esse processo de

degradação, uma vez que não são capazes de degradar a pectina diretamente,

tornando-se as pectinases, um bom alvo no controle das formigas. A FIGURA

1.1 representa resumidamente a associação simbiótica entre as formigas

cortadeiras e o fungo L. gongylophorus.

FIGURA 1.1 – Simbiose entre as formigas cortadeiras e o fungo L.

gongylophorus

Introdução

1.2 – Métodos de Controle

Os prejuízos causados pelas formigas cortadeiras são consideráveis

e, embora tenham preferência por determinadas espécies de plantas, quase todas

as culturas são atacadas e danificadas pelas formigas. Elas cortam as folhas e

ramos tenros, podendo destruir completamente as plantas e em sistemas

tropicais, chegam a consumir até 17% da produção florestal (CHERRETT,

1986).

Em ecossistemas naturais as formigas cortadeiras não atacam todas

as espécies disponíveis com igual freqüência e estão em equilíbrio com outras

espécies de insetos (HOWARD & WIEMER, 1986). Uma vez que as formigas

são originárias das matas nativas, a substituição destas matas por grandes áreas

de monoculturas favorece a multiplicação, podendo vir a se constituir em

pragas, devido a fatores como: abundância de recursos alimentares, escassez de

inimigos naturais, menor competição, entre outros (BENTO & DELLA LÚCIA,

1993). Sabendo-se que a ação das formigas cortadeiras também apresenta

aspectos positivos ao meio ambiente, pois elas podam a vegetação estimulando o

crescimento de algumas plantas, decompõem rapidamente o material vegetal e

reviram e arejam o solo (Haines, 1978 apud SCHNEIDER, 2000), o combate a

esses insetos não seria uma alternativa adequada, e sim o seu controle.

As formigas cortadeiras podem ser controladas através de métodos

mecânicos, culturais, biológicos e químicos. O controle mecânico manual

praticamente não é utilizado, em virtude de ser de viabilidade restrita a pequenas

áreas e em ninhos com até 4 meses de idade.

O controle biológico é uma área promissora de pesquisa, mas

atualmente está clara a necessidade de mais conhecimentos biológicos básicos

para que estratégias de controle possam ser de fato aplicadas com segurança,

principalmente em relação ao ecossistema.

Métodos químicos para controle de formigas cortadeiras são os

mais freqüentemente utilizados, sendo o produto químico tóxico aplicado

Introdução

diretamente nos ninhos, nas formulações pó, líquido, gases ou iscas granuladas

(BOARETTO & FORTI, 1997).

Atualmente o emprego de iscas granuladas tem sido o método mais

empregado, pois oferece maior segurança ao operador, dispensa mão-de-obra e

equipamentos especializados e permite o tratamento de formigueiros em locais

de difícil acesso (LOECK & NAKANO, 1984). Compreendem um substrato

atrativo em mistura com um princípio ativo tóxico, em pastilhas. O inseticida é

geralmente dissolvido em óleo de soja refinado e, posteriormente, incorporado

ao substrato. O substrato atrativo efetivo e amplamente utilizado é a polpa

cítrica desidratada. A polpa cítrica parece ser apropriada para utilização como

substrato para o desenvolvimento do fungo simbionte, apresentando-se

levemente ácida, alto conteúdo de carboidrato, contendo ainda nitrogênio e

grande variedade de vitaminas e microelementos (BOARETTO & FORTI,

1997).

A inexistência de inseticidas de origem natural que fossem mais

seletivos e menos prejudiciais ao meio ambiente, fizeram com que o Grupo de

Produtos Naturais do Departamento de Química da UFSCar em conjunto com o

Centro de Insetos Sociais (CEIS) da UNESP – Rio Claro, estudassem plantas

potencialmente tóxica a essas formigas. Através de estudos realizados pelo

grupo, LEITE, 2000 e GAMBOA, 2001, verificaram que substâncias como os

ácidos graxos de cadeia curta (C6 – C12), as lignanas sesamina e sesamolina

inibem em 80% o crescimento do fungo simbionte, a concentração de 100µg/ml.

Em dados mais recentes, LEITE, 2005, verificou que o limonóide fotogedunina

à concentração de 25µg/mL, inibe em 100% o crescimento do fungo simbionte,

sendo que este mesmo limonóide, apresenta S

de 9 dias, tendo um controle de

24 dias. Dentre as substâncias testadas, o alcalóide ricinina, foi o mais ativo

frente às formigas cortadeiras, porém, apresenta efeito tóxico a mamíferos.

Introdução

1.2.1 – Microencapsulação

Nos anos 80, a microencapsulação começou a se firmar como uma

tecnologia de compartimentalização das substâncias diversas, possibilitando a

manutenção ou o isolamento de agente ativo no interior das microesferas ou das

microcápsulas cujas dimensões variam de nanômetros a alguns milímetros de

diâmetros. Devido ao seu avanço promissor, os cientistas das áreas tecnológicas

estão usando o processo de microencapsulação nas aplicações industriais de

alimentos, de produtos de cosméticos, no setor de agricultura entre outros

(OLIVEIRA et al., 1992; DONBROW, 1991; ANDREO FILHO & OLIVEIRA,

1999).

A técnica de microencapsulamento de substâncias ativas em iscas

inseticidas tem sido muito utilizada tanto na agricultura, quanto no uso

doméstico, por melhorarem a eficácia residual, possuírem estabilidade do

princípio ativo contra a degradação no ambiente e principalmente por reduzirem

a toxicidade para mamíferos (OHTSUBO, 1991). Baseado nestes relatos, esta

técnica foi considerada adequada para ser utilizada com substâncias ativas.

A utilização de quitosana, polímero obtido através da desacetilação

da quitina, no processo de encapsulamento de substâncias vem sendo uma

técnica muito promissora. Após décadas sem esclarecer a estrutura e caracterizar

a quitina, foi somente na metade dos anos 70 que o Professor Ricardo

MUZZARELLI desvendou esse mito, esclarecendo algumas propriedades desta

molécula. Desde então, pesquisadores se interessaram pelo estudo e pela

descoberta de outras fontes desse composto natural.

A quitina é um dos maiores polímeros naturais, encontrada em

vários animais marinhos e insetos (MATHUR and NARAUG, 1990

). É um

polímero de peso molecular relativamente alto (1,6 x 10

) e constituído

principalmente de unidades de β(1Æ 4)-2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose

(FIGURA 1.2).

Introdução

FIGURA 1.2 – Estrutura da quitina

Quando o grau de N-acetilação é inferior a 50% a quitina apresenta-

se solúvel em soluções ácidas diluídas e é chamada de quitosana (KAZUHIRO

et al., 1987). Na natureza a quitina se encontra em diferentes formas, como

microfibrilas nos tegumentos de crustáceos e insetos, cristalina hidratada,

polimérica e γ-quitina (MATHUR and NARAUG, 1990

A quitosana β(1Æ 4)-2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose obtida por

N-desacetilação (FIGURA 1.3) é um polímero biodegradável (ANDREO

FILHO & OLIVEIRA, 1999) e quase atóxico, com DL

em camundongos de

16g/kg (LEITE & TELAROLLI JUNIOR, 1997). Devido a fácil degradação e

por que os produtos gerados não são tóxicos, a quitosana tem atraído a atenção

como excipiente para liberação controlada de fármacos, mas o seu uso tem sido

limitado por causa de sua insolubilidade em água e em alguns solventes

orgânicos, tais como acetona, DMF, entre outros.

FIGURA 1.3 – Estrutura da quitosana

A presença de grupos amino confere a quitosana solubilidade em

solventes orgânicos e inorgânicos, diluídos na faixa específica de pH até

NHCOCH

Introdução

aproximadamente 6,0 e mais versatilidade química do que a celulose, assim

aumentando o seu campo de atuação.

De acordo com ASAKO e colaboradores, 1991, a estrutura

molecular e as propriedades da quitosana são largamente afetadas pelo grau de

desacetilação existindo várias técnicas para isso, como por exemplo, a titulação

coloidal por condutometria, a análise elementar, absorção na região do

infravermelho e a espectroscopia em RMN.

A quitosana, devido à presença de grupos amino livres na sua

estrutura, pode reagir com glutaraldeído para formar ligações intermoleculares

ou reticuladas através das bases de Schiff resultantes, obtendo um formato de

redes. As ligações covalentes entre os grupos amino e os aldeídos terminais

extremos do agente reticulante são irreversíveis e resistentes a pH e temperatura.

A razão para o uso do agente reticulante bifuncional glutaraldeído (1-5

pentanodiol) é para inibir a solubilização através da formação de bases de Schiff

com os grupos amino livres da unidade glucosamina do polímero, FIGURA 1.4.

A reticulação ocasiona um aumento da resistência biológica, química e

mecânica.

Introdução

NHCOCH

FIGURA 1.4 – Reticulação da quitosana com o glutaraldeído

Introdução

1.3 – Plantas Estudadas

1.3.1 – Família Simaroubaceae

A família Simaroubaceae é composta de 32 gêneros, constituindo

cerca de 250 espécies de arbustos e árvores distribuídos por todo o trópico. Ela

tem sido empregada na construção, devido à qualidade de suas madeiras, e

também muito utilizada na medicina folclórica (VIEIRA, 1995).

Nos últimos anos, aumentou-se o número de estudos com essa

família, devido relatos de suas propriedades antimalárica, antiinflamatória,

antileucêmica e atividades antivirais (MORETI, et al. 1995).

No Brasil, a família Simaroubaceae é representada pelos gêneros

Quassia e Picrolemma, na região Amazônica; Castela e Picrasma, no sul do país;

e Simaba, Simarouba e Picrolemma os quais estão presentes por todas as partes

do Brasil (HALL et al. 1983).

Espécies do gênero Simarouba, além de possuirem todas as

atividades acima mencionadas, possuem atividade inseticida (POLONSKY,

1985), motivo pelo qual, uma das plantas escolhidas para estudos, foi Simarouba

versicolor.

Na FIGURA 1.5, estão representadas algumas substâncias isoladas

de S. versicolor e seus derivados.

Introdução

FIGURA 1.5 – Substâncias isoladas de S. versicolor (ARRIAGA et al., 2002)

Z = O, R= OH; glaucarubinona

Z =

α OH, R = OH; glaucarubina

Z =

α OH, R = OAc; 2’-acetilglaucarubina

epilupeol

11-acetilamarolida

kaenferol

eurilieno

tirucal-7, 24-dien-3-ona

ocotilona

nilocitina

Z = O, R = H; bourjutinolona A

Z =

-OH

R = H

;

3-e

isa

elina A

-OH, R = H; 21;, 23epóxi-21

, 24-

25trihidroxitirucal-7-en-3-ona

α-OH, R = H; 21,23-epoxi-21α, 24,25

trihidroxitirucal-7-en-3-ona

OH O

AcO

OOH

OAc O

Introdução

1.3.2 – Família Rutaceae

Possuindo cerca de 150 gêneros, com 1500 espécies amplamente

distribuídas nas regiões tropicais e temperadas do globo terrestre, sendo mais

abundantes na América tropical, sul da África e Austrália, a família Rutaceae

constitui o maior grupo de plantas da ordem Rutales (WATERMAN &

GRUNDON, 1983). No Brasil existem cerca de 200 espécies, já descritas.

A família Rutaceae é muito conhecida pela presença de uma ampla

diversidade de metabólitos secundários, entre eles, podem-se destacar os

alcalóides, especialmente os derivados do ácido antranílico, as cumarinas, as

lignanas, os flavonóides, os terpenóides e os limonóides (WATERMAN, 1999).

Muitos desse metabólitos possuem variadas atividades biológicas,

de grande importância farmacológica (WATERMAN e GRUNDON, 1983),

despertando o interesse cada vez maior na investigação fitoquímica dessa

família.

Os gêneros da família Rutaceae já foram classificados de acordo

com suas características morfológicas e químicas (SILVA et al. 1988), sendo

que, segundo este último, em cada subfamília (e em cada tribo) foram agrupados

os gêneros que apresentam diferenciação de cumarinas, alcalóides e limonóides.

Existem ainda controvérsias sobre o posicionamento taxonômico de alguns

gêneros, estimulando o estudo de espécies ainda não investigadas.

O gênero Helietta tem distribuição neotropical, sendo encontrado

no México, Texas, Cuba, Venezuela, Colômbia, Peru, Paraguai, norte da

Argentina e no Brasil (PIRANI, 1998). A maioria das espécies de Helietta são

pequenas árvores ou arbustos perenes e ramificados. Existem poucos estudos a

respeito desse gênero, sendo a espécie mais estudada H. apiculata, apresentando

vários alcalóides do tipo furoquinolinos, que demonstraram atividade biológica

no sistema nervoso central (GOLOUBKOVA et al., 1998), algumas substâncias

isoladas de plantas deste gênero estão representados na FIGURA 1.6.

Introdução

FIGURA 1.6 – Substâncias isoladas de Helietta (GOLOUBKOVA et al., 1998)

maculosina

OCH

helietina

helietidina

OCH

flindersiamina

OBJETIVOS

Objetivos

2 – Objetivos

Os principais objetivos deste trabalho foram:

- estudo fitoquímico de Helietta puberula (Rutaceae);

- estudo fitoquímico de Simarouba versicolor (Simaroubaceae);

- realização de ensaios biológicos com extratos brutos, frações e substâncias

puras, frente às formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa, ao seu fungo

simbionte e às enzimas pectinases;

- desenvolvimento de microcápsulas a partir de quitosana, para

microencapsulação de substâncias ativas visando sua aplicação no controle de

formigas cortadeiras.

Objetivos

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Procedimento Experimental

3 – Procedimento Experimental

3.1 – Materiais e Métodos

Suportes para cromatografia em coluna (CC):

• Sílica gel 60 (70-230 mesh)

• Sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

• Sephadex LH-20

Solventes para cromatografia:

• solventes comerciais destilados no DQ-UFSCar.

Cromatografia em coluna:

• colunas de tamanhos variados, dependendo das quantidades a serem

cromatografadas.

Cromatografia em camada delgada:

• folhas de alumínio (com sílica gel 60 F

254

, φ = 0,2 mm) - Merck.

Reveladores:

• Radiação na região do UV (254 e 360 nm)

• reagente de Dragendorff

• vanilina em ácido sulfúrico.

Cromatografia em camada delgada preparativa:

• placas preparativas (20 x 20cm) de sílica gel 60 com indicador

254

Solventes para obtenção de espectros de RMN:

• deuterados: CDCl

, MeOD e Pyr-d

Procedimento Experimental

Materiais diversos utilizados para obtenção das microcásulas:

• quitosa

• ácido acético glacial

• glutaraldeído

3.2 – Equipamentos

Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear:

• Brüker ARX 200 MHz e Brüker DRX 400 MHz

CG-EM

• GC-17A Shimadzu, GCMS-QP5000 Shimadzu

Coluna DB-5 (30 m x 0,25 mm) - Ionização por impacto eletrônico à 70

e.V.

Condutivímetro:

• Micronal B330 – equipado com célula condutimétrica Digimed

DMC-010

Porosímetro:

• Micromeritics mod. Porosizer 9320

Microscópico Eletrônico por Varredura

• ZEISS – Mod. DSM940 A

Bomba Peristáltica:

• Amershan Biosciences – Mod. Pump P-1

Procedimento Experimental

3.3 – Coleta e Identificação do Material Botânico

Todas as partes vegetais de Simarouba versicolor e Helietta

puberula foram coletadas pelo grupo de Produtos Naturais da UFSCar,

juntamente com o professor Dr. José Rubens Pirani, do Departamento de

Botânica da USP – São Paulo, que foi o responsável pela identificação das

mesmas, TABELA 3.1.

TABELA 3.1 – Dados de coleta de Simarouba versicolor e Helietta puberula

Planta Partes Vegetais

(g)

Local e Data

da Coleta

Código

de Identificação

Folhas (2.186,1)

Galhos (759,0)

Simarouba

versicolor

Caule (3.475,6)

Prata – Minas

Gerais

20/01/2001

4756

Folhas (810,0)

Galhos (902,0)

Helietta puberula

Caule (4.200,0)

Corumbá – Mato

Grosso do Sul

25/01/2001

4844

3.4 – Obtenção dos Extratos

As diversas partes vegetais foram secas, separadamente, em estufa

de ar a 45º C e pulverizadas em moinho do tipo Willey. A extração do material

moído foi realizada por maceração nos solventes hexano, diclorometano e

metanol, à temperatura ambiente, durante cinco dias, por três vezes obtendo-se

os extratos conforme representado no FLUXOGRAMA 3.1. Foram obtidos no

total 18 extratos (TABELA 3.2), todos eles foram enviados para ensaios

Procedimento Experimental

biológicos nas formigas cortadeiras, no fungo simbionte e nas enzimas

pectinases (item 3.8, p. 36).

FLUXOGRAMA 3.1 – Obtenção dos extratos de S. versicolor e H. puberula

Material vegetal

seco e moído

Percolação com

solvente por 5 dias

Filtração

Concentração do

solvente

EXTRATO

“Torta”

Procedimento Experimental

TABELA 3.2 – Extratos obtidos

Planta Parte Vegetal código Massas dos Extratos (g)

Folhas

SVFH

SVFD

SVFM

17,900

20,000

30,000

Galhos

SVGH

SVGD

SVGM

2,7680

3,400

18,800

Simarouba versicolor

Caule

SVCH

SVCD

SVCM

9,500

9,400

35,000

Folhas

HPFH

HPFD

HPFM

8,631

20,600

25,000

Helietta puberula

Galhos

HPGH

HPGD

HPGM

5,664

10,000

25,800

Caule

HPCH

HPCD

HPCM

20,240

21,000

80,000

HP = Helietta puberula; SV = Simarouba versicolor; G = galhos; C = caule; F = folhas; H = hexano; D =

diclorometano; M = metanol

Procedimento Experimental

3.5 – Obtenção das Frações

Os extratos metanólicos das folhas, galhos e caule de H. puberula e

S. versicolor foram fracionados através de uma partição líquido-líquido,

FLUXOGRAMA 3.2, originando 4 partições de cada extrato. As frações obtidas

e suas respectivas massas estão representadas na TABELA 3.3. Já, os extratos

HPGH, HPGD, HPFH e HPFD de H. puberula foram fracionados utilizando-se

diferentes métodos cromatográficos.

FLUXOGRAMA 3.2 – Metodologia utilizada na partição de extratos

EXTRATO

1) Suspensão em 400 mL de MeOH:H

O (1:3)

)

ação

m H

x 1

Extração com CH

: 3 x 150 mL

FRAÇÃO

DiCl

Extração com AcOEt: 3 x 150 mL

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLIC

FRAÇÃO

AcOE

FRAÇÃO

HEXANO

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLIC

Procedimento Experimental

TABELA 3.3 –Frações dos extratos metanólicos

Espécie Parte

vegetal

Massas dos

extratos

código Massas das partições código

H. puberula

folhas

25,00g

HPFM

Hexânico 3,4670 g

Diclorometânico 3,0650 g

acetato de etila 1,3100 g

hidroalcoólico 5,4500 g

HPFMH

HPFMD

HPFMA

HPFMHid

H. puberula

caule

80,00g

HPCM

Hexânico 15,000 g

Diclorometânico 21,465 g

acetato de etila 1,2450 g

hidroalcoólico 7,1436 g

HPCMH

HPCMD

HPCMA

HPCMHid

H. puberula

galhos

25,80g

HPGM

Hexânico 1,900 g

Diclorometânico 4,7505 g

acetato de etila 1,4149 g

hidroalcoólico0,6795 g

HPGMH

HPGMD

HPGMA

HPGMHid

S. versicolor

folhas

30,00g

SVFM

Hexânico 4,00g

Diclorometânico 9,00g

acetato de etila 15,00g

hidroalcoólico 12,00g

SVFMH

SVFMD

SVFMA

SVFM Hid

S. versicolor

caule

35,00g

SVCM

Hexânico 1,34g

Diclorometânico 9,00g

acetato de etila 4,00g

hidroalcoólico 13,00g

SVCMH

SVCMD

SVCMA

SVCMHid

S. versicolor

galhos

18,80g

SVGM

Hexânico 0,92g

Diclorometânico 1,44g

acetato de etila 4,00g

hidroalcoólico 6,00g

SVGMH

SVGMD

SVGMA

SVGMHid

HP = Helietta puberula; SV = Simarouba versicolor; G = galhos; C = caule; F = folhas; H = hexano; D =

diclorometano; M = metanol; A = acetato de etila; Hid = hidroalcoolico

Procedimento Experimental

3.6 – Isolamento dos Constituintes Químicos de H. puberula

3.6.1 – Estudo Fitoquímico de HPGH

O estudo da fração hexânica dos galhos de H. puberula permitiu o

isolamento das substâncias 1, 7, 9, 10, 12 e 30, que foram caracterizadas através

de EM e RMN 1 e 2D. O estudo fitoquímico foi realizado utilizando diversas

técnicas cromatográficas, o FLUXOGRAMA 3.3 mostra resumidamente como

este estudo foi realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.3 – Fracionamento do Extrato HPGH

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 4,5 x 25 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

HPGH

6644

HPGH-2

39,0

HPGH-3

7,9

HPGH-4

370,0

HPGH-5

294,0

HPGH-6

1800

HPGH6.2

145,0 m

HPGH6.3

500,0 m

HPGH6.4

123,0 m

HPGH6.5

55,0 m

HPGH6.7

25,5 m

HPGH6.6

395

8 m

HPGH-7

1900

HPGH6.6.2

89,0 m

HPGH7.5

135,3 m

HPGH-8

790

HPGH6.15

28,4 mg

HPGH6.6.4

103,0 m

HPGH6.65

140,0 m

HPGH6.6.3

3.1 mg

HPGH7.1

50,7 m

HPGH7.7.2

51,2 m

HPGH7.7.3

91,2 m

HPGH7.7.4

91,2 m

HPGH7.7.6

30,4 m

HPGH7.7.7

71,8 m

HPGH7.7.5

120

3 m

HPGH7.7.5.1

20,3 m

HPGH7.7.5.3

49,4 m

HPGH7.7.5.4

58,3 m

HPGH7.7.5.2

15,3 mg

HPGH-8

790

HPGH8.2

38,8 m

HPGH8.4

37,5 m

HPGH8.9

15,0 m

HPGH8.3

0 m

HPGH8.5

6 m

HPGH8.3.2

0,7 m

HPGH8.3.4

10,2 m

HPGH8.3.3

1,5 mg

HPGH8.5.1

2,2 m

HPGH8.5.3

1,8 mg

HPGH8.5.2

0,7 m

HPGH8.5.4

4,2 m

HPGH8.10

179,0 m

HPGH7.2

129,0 m

HPGH7.3

115,0 m

HPGH7.4

155,0 m

HPGH7.6

715,0 m

HPGH-1

10,3 mg

HPGH6.6.1

42,0 m

HPGH7.7

815

0 m

HPGH7.7.1

30,7 m

HPGH8.6

75,9 m

HPGH8.7

33,6 m

HPGH8.8

89,0 m

HPGH8.1

70,0 m

HPGH8.3.1

2,0 m

Procedimento Experimental

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 1,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh): florisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- eluição isocrática: hex: dicl: AcOEt (5:3:2)

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 2,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- eluição isocrática: hex: dicl: AcOEt (4:2:2)

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

= i

= c

3.6.2 – Estudo Fitoquímico de HPGD

O estudo do extrato diclorometânico dos galhos de H. puberula

levou ao isolamento das substâncias 1, 9 e 31 que tiveram suas estruturas

identificadas por EM e RMN

H e RMN

C. O FLUXOGRAMA 3.4 apresenta

de forma resumida, como este estudo foi realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.4 – Fracionamento do Extrato HPGD

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 5,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 5,0 x 20,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção em camada delgada preparativa:

- placa de vidro (h x h = 25,0 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica gel 60, com indicador UV

254

(230-400 mesh)

- eluição isocrática: hex: dicl: AcOEt (5:3:2)

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 31,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

HPGD

HPGD2

139,0 m

HPGD4

562,0 m

HPGD3

223,0 m

HPGD7

13,9 m

HPGD5

560,0 m

HPGD6

321,6 m

HPGD8

5517

0 m

HPGD8.2

370,0 m

HPGD8.4

310,0 m

HPGD8.3

160,0 m

HPGD8.7

3900,0 m

HPGD8.5

120,0 m

HPGD8.1

5040,0

HPGD8.6

0 m

HPGD8.6.2

12,0 m

HPGD8.6.4

18,5 m

HPGD8.6.5

20,1 m

HPGD8.6.1

6,0 m

HPGD8.6.6

4,4 m

HPGD8.6.3

3,1 mg

HPGD9

2509

0 m

HPGD9.2

31,5 m

HPGD9.3

237,8 m

HPGD9.4

1,07 m

HPGD9.1

120,7 m

HPGD9.5

208,1 m

HPGD9.6

380,0 mg

HPGD9.6.2

18,5 m

HPGD9.6.3

21,9 m

HPGD9.6.1

39,4 m

HPGD9.6.5

113,0 m

HPGD9.6.4

27,3 mg

HPGD1

15,8 mg

Procedimento Experimental

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 2,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- eluição isocrática: hex: dicl: AcOEt (4:2:2)

3.6.3 – Estudo Fitoquímico de HPFH

Do estudo fitoquímico do extrato hexânico das folhas de H.

puberula foi possível isolar e identificar através de EM e RMN

H e RMN

C as

substâncias 2, 6, 8, 10 e 11, mostrado resumidamente no FLUXOGRAMA 3.5.

FLUXOGRAMA 3.5 – Fracionamento do Extrato HPFH

iii

HPFH

HPFH1

1100,0

HPFH4

2600,0m

HPFH3

1325

0 m

HPFH2

3050

0 m

HPFH2.5

413,5 m

HPFH2.2

236,0 m

HPFH2.3

546

5 m

HPFH2.3.1

101,2 m

HPFH2.3.5

125,5 m

HPFH2.3.2

28,3 m

HPFH2.3.3

1 m

HPFH2.3.4

76,5 m

HPFH2.3.3.1

8,1 m

HPFH2.3.3.4

4,1 m

HPFH2.3.3.2

11,2 mg

HPFH2.3.3.3

7,4 mg

HPFH4.2

174,2 m

HPFH4.3

95,2 m

HPFH4.6

313,0 m

HPFH4.7

214,0 m

HPFH4.5.1

3,5 m

HPFH4.5.2

1,3 m

HPFH4.5

6 m

HPFH4.4

72,7 m

HPFH4.5.3

5,5 mg

HPFH4.5.4

2.5 mg

HPFH4.8

30 m

HPFH4.8.1

17,3 m

HPFH4.8.2

21,2 m

HPFH4.8.4

9,3 m

HPFH4.8.5

12,1 m

HPFH4.8.3

17,3 mg

HPFH2.4

721,8 m

iii

HPFH2.1

306,0 m

HPFH4.1

110,9 m

Procedimento Experimental

iii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

iii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

iii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 20 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

iii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 1,5 x 20 cm)

- fase estacionária: fluorisil

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

iii

= b

iii

, f

iii

= d

iii

, g

iii

= c

iii

3.6.4 – Estudo Fitoquímico de HPFD

As substâncias 11, 13, 14 e 30 foram obtidas através do estudo

fitoquímico do extrato diclorometânico das folhas de H. puberula. Essas

substâncias foram identificadas através de RMN

H e RMN

C. O

FLUXOGRAMA 3.6 mostra de forma resumida como este estudo foi realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.6 – Fracionamento do Extrato HPFD

HPFD4.5.4.1

7,5 m

HPFD

HPFD1

1565,0 mg

HPFD3

1363

0 m

HPFD4

10013

0 m

HPFD2

358,0 mg

HPFD3.2

36,0 mg

HPFD3.5

143,5 mg

HPFD3.3

77,0 mg

HPFD3.4

78,8 mg

HPFD3.6

112,5 mg

HPFD3.7

510,0 mg

HPFD3.9

80,0 mg

HPFD3.8

0 m

HPFD3.8.5

19,0 m

HPFD3.8.3

11,0 m

HPFD3.8.4

5,5 m

HPFD3.8.1

13,2 m

HPFD4.5

130

0 m

HPFD4.1

1030,3 mg

HPFD4.2

480,5 mg

HPFD4.3

230,0 mg

HPFD4.4

95,5 mg

HPFD4.6

900

3 m

HPFD4.5.1

23,0 m

HPFD4.5.3

21,3 m

HPFD4.5.2

18,1 mg

HPFD4.5.4

6 m

HPFD4.5.4.3

24,0 mg

HPFD4.5.4.2

8,3 m

HPFD4.5.4.4

5,3 m

HPFD4.5.4.5

2,5 m

HPFD4.5.4.3

37.7 m

HPFD4.5.4.1

3,5 m

HPFD4.5.4.2

2,3 m

HPFD4.5.4.4

5,3 m

HPFD4.6.1

81,5 mg

HPFD4.6.2

310,0 mg

HPFD4.6.4

98,8 mg

HPFD4.6.6

60,8 mg

HPFD4.6.3

93,8 mg

HPFD4.6.5

1 m

HPFD4.6.5.1

3,8 mg

HPFD4.6.5.2

7,3 mg

HPFD4.6.5.4

1,5 mg

HPFD4.6.5.5

6,5

HPFD4.6.5.3

9 m

HPFD4.6.5.6

7,1 m

HPFD4.6.5.3.1

0,9 mg

HPFD4.6.5.3.3

1,7 mg

HPFD4.6.5.3.4

5,4 mg

HPFD4.6.5.3.2

1,2 mg

HPFD3.8.2

12,1 mg

HPFD3.1

20,0 mg

HPFD4.7

5300,0 mg

Procedimento Experimental

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 4,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 20 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia circular por adsorção:

- placa de vidro (φ = 26,0 cm)

- fase estacionária: sílica gel (375 mesh, PF 254, 1mm)

- eluição isocrática: Hex:dicl:MeOH (4:2:0,5)

= e

= g

= i

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção em camada delgada preparativa:

- placa de vidro (h x h = 25,0 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica gel 60, com indicador UV

254

(230-400 mesh)

- eluição isocrática: hex: dicl: AcOEt (5:3:2)

3.6.5 – Estudo Fitoquímico de HPCMH

A fração hexânica do extrato metanólico dos caules de H. puberula

foi estudada fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas.

Deste estudo foi possível isolar as substâncias 22, 26 e 27. O FLUXOGRAMA

3.7 mostra de forma resumida como este estudo foi realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.7 – Fracionamento da fração HPCMH

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 31,0 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 30,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

: cromatografia circular por adsorção :

- placa de vidro (φ = 26,0 cm)

- fase estacionária: sílica gel (375 mesh, PF 254, 1mm)

- eluição isocrática: Hex:dicl:MeOH (5:3:1)

= cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 40,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

HPCMH

3,0g

HPCMH2

30,7 mg

HPCMH5

28,7 mg

HPCMH3

41,4 mg

HPCMH4

70,2 mg

HPCMH6

17,7 mg

HPCMH10

35,7 mg

HPCMH9

19,7 mg

HPCMH7

43mg

HPCMH7.7

7,4 mg

HPCMH7.8.2

1,2 mg

HPCMH7.8.3

2,6 mg

HPCMH7.8.5

1,3 mg

HPCMH7.8.6

2,5 mg

HPCMH7.87

2,2 mg

HPCMH7.8.8.

8,3 mg

HPCMH7.2

2,4

HPCMH7.5

2,5 mg

HPCMH7.6

3,7 mg

HPCMH7.9

9,7 mg

HPCMH11

42,5 mg

HPCMH11.1

7,9 mg

HPCMH11.3

5,6 mg

HPCMH11.4

6,6 mg

HPCMH11.5

8,9 mg

HPCMH11.2

11,2 mg

HPCMH11.2.1

2,7 mg

HPCMH11.3

1,5 mg

HPCMH11.4

1,6 mg

HPCMH11.2.2

7,3 mg

HPCMH7.4

2,3 mg

HPCMH7.3

4,1 mg

HPCMH7.8.4

9,3 mg

HPCMH7.8

26 mg

HPCMH8

18, 1mg

HPCMH1

50,0 mg

HPCMH7.8.1

0,9 mg

HPCMH7.1

1,8 mg

Procedimento Experimental

: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE):

- coluna polimérica Asahipak

- eluição isocrática: MeOH 100%

- fluxo: 3,5 mL/min

- detector UV 245, 365 nm

3.7 – Isolamento dos Constituintes Químicos de S. versicolor

3.7.1 – Estudo Fitoquímico de SVCMD

A fração diclorometânica do extrato metanólico do caule de S.

versicolor foi estudada fitoquimicamente utilizando-se diversas técnicas

cromatográficas. Deste estudo foram isoladas as substâncias 5, 17, 18, 23, 24, 25

e 28. O FLUXOGRAMA 3.8 mostra resumidamente como este estudo foi

realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.8 – Fracionamento da fração SVCMD

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,5 x 35,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por adsorção

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 20 cm)

- fase estacionária: sílica do tipo “flash” (230-400 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 40,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

SVCMD

9,0g

SVCMD1

1700,0 mg

SVCMD3

263,78

SVCMD2

2000 mg

SVCMD4

617,0 mg

SVCMD5

208,1 mg

SVCMD6

2400,0 mg

SVCMD2.1

213,3 mg

SVCMD2.4

617,0 mg

SVCMD2.3

312,9 mg

SVCMD2.3.1

14,4 mg

SVCMD2.2

0,9 mg

SVCMD2.3.2

32,7 mg

SVCMD2.3.4

79,8 mg

SVCMD2.3.5

9,8 mg

SVCMD2.3.3

5,0 mg

SVCMD2.3.3.1

1,4 mg

SVCMD2.3.3.3

1,5 mg

SVCMD6.1

213,5 mg

SVCMD6.2

312,0 mg

SVCMD6.4

275,4 mg

SVCMD2.3.3.2

1,2 mg

SVCMD6.5

617,0 mg

SVCMD6.2.1

21,3 mg

SVCMD6.2.3

97,0 mg

SVCMD6.2.4

61,7 mg

SVCMD6.2.2

1,3 mg

SVCMD6.2.3.1

22,3 mg

SVCMD6.2.3.3

38,2 mg

SVCMD6.2.3.5

17,0 mg

SVCMD6.2.3.4

9,3 mg

SVCMD6.2.3.2

21,2 mg

SVCMD6.3

7,3 mg

SVCMD6.4.1

32,2 mg

SVCMD6.4.2

38,2 mg

SVCMD6.4.4

97,0 mg

SVCMD6.4.3

11,3 mg

Procedimento Experimental

= cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE):

- coluna polimérica Asahipak

- eluição isocrática: MeOH 100%

- fluxo: 4,0 mL/min

- detector UV 245, 365 nm

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 4,5 x 50,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 30,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

= h

= f

3.7.2 – Estudo Fitoquímico de SVFMD

Da fração diclorometânica do extrato metanólico das folhas de S.

versicolor foi isolada as substâncias 19-21, utilizando-se cromatografia por

adsorção e exclusão. O FLUXOGRAMA 3.9 mostra resumidamente como este

estudo foi realizado.

Procedimento Experimental

FLUXOGRAMA 3.9 – Fracionamento da fração SVFMD

vii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 4,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

vii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh): fluorisil (1:1)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

vii

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

vii

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 2,5 x 30,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH 100%

SVFMD

9,0g

SVFMD1

541,0mg

SVFMD2.3

8,4 mg

SVFMD5

2.300,0 mg

SVFMD3

612,3mg

SVFMD4

324,0mg

SVFMD2.4

141,3mg

SVFMD2.5

541,0mg

SVFMD2.2

37,0mg

SVFMD6

1400,0 mg

SVFMD4.1

14,0mg

SVFMD4.4

324,0mg

SVFMD4.6

52,0mg

SVFMD4.2

1,4 mg

SVFMD4.5

62,0mg

SVFMD4.3

26,1mg

SVFMD4.3.1

8,2mg

SVFMD4.3.4

6,0mg

SVFMD4.3.3

9,8 mg

SVFMD4.3.2

9,4mg

vii

SVFMD2

1500,0 mg

vii

SVFMD2.1

41,8mg

Procedimento Experimental

3.7.3 – Estudo Fitoquímico de SVGMD

Da fração diclorometânica do extrato metanólico dos galhos de S.

versicolor foi isolada as substâncias 1, 2, 3, 4, 6, 15, 16 e 29, utilizando-se

basicamente cromatografia por adsorção e exclusão. O FLUXOGRAMA 3.10

mostra resumidamente como este estudo foi realizado.

FLUXOGRAMA 3.10 – Fracionamento da fração SVGMD

viii

SVGMD

9,0g

SVGMD1

17,4 mg

SVGMD3

94,0 mg

SVGMD2

85,0 mg

SVGMD2.5

9,9 mg

SVGMD2.3

11,2 mg

SVGMD2.1

13,7 mg

SVGMD2.2

23,4 mg

SVGMD2.4

26,8 mg

SVGMD2.1.3

25,9 mg

SVGMD2.1.2

6,0 mg

SVGMD2.2.1

2,8 mg

SVGMD2.4.1

6,2 mg

SVGMD2.4.2

7,2 mg

SVGMD2.4.4

4,8 mg

SVGMD2.4.3

4,2 mg

SVGMD2.1.2

6,0 mg

SVGMD3.1

4,6 mg

SVGMD3.3

17,7 mg

SVGMD3.4

21,0 mg

SVGMD3.6

9,2 mg

SVGMD3.7

3,4 mg

SVGMD3.2

3,8 mg

SVGMD3.5

30,7 mg

SVGMD3.5.1

2,5 mg

SVGMD3.5.2

2,8 mg

SVGMD3.5.4

6,3 mg

SVGMD3.5.3

9,1 mg

viii

SVGMD3.5.5

9 mg

SVGMD2.1.1

5,2 mg

SVGMD4

61,9 mg

Procedimento Experimental

viii

: cromatografia por adsorção:

- coluna de vidro (φ x h = 4,5 x 25,0 cm)

- fase estacionária: sílica comum (70-230 mesh)

- gradiente de eluição: hex 100%, hex:dicl (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), dicl 100%, dicl:AcOEt (4:1/ 3:1/ 2:1/ 1:1), AcOEt

100%, MeOH 100%

viii

: cromatografia circular por adsorção :

- placa de vidro (φ = 26,0 cm)

- fase estacionária: sílica gel (375 mesh, PF 254, 1mm)

- eluição isocrática: Hex:dicl:MeOH (5:3:1)

viii

= d

viii

= e

viii

= b

viii

: cromatografia por exclusão:

- coluna de vidro (φ x h = 3,0 x 30,0 cm)

- fase estacionária: Sephadex LH-20

- eluição isocrática: MeOH: dicl (9:1)

viii

= cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE):

- coluna polimérica Asahipak

- eluição isocrática: MeOH:dicl (8:2)

- fluxo: 3,5 mL/min

- detector UV 245, 365 nm

3.8 – Metodologia dos Ensaios Biológicos

3.8.1 – Ensaios Biológicos com as Formigas Cortadeiras

Os ensaios por ingestão com as operárias de Atta sexdens

rubropilosa foram realizados no Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS)

UNESP - Rio Claro/SP, pela aluna Maria Fernanda Gomes Villalba Penãflor,

sob a orientação do Prof. Dr. Odair Corrêa Bueno.

Neste ensaio as operárias de Atta sexdens rubropilosa foram

retiradas aleatoriamente de formigueiros mantidos em laboratório. Para

manutenção das formigas isoladas do formigueiro foi utilizada uma dieta sólida

constituída por: 5% de glicose, 1% de peptona bacteriológica, 0,1% de extrato

de levedura e 1,5% de ágar bacteriológico e 100 mL de água destilada. Após a

mistura destes componentes, a dieta foi levada ao forno de microondas por

aproximadamente 4 minutos e logo em seguida, autoclavada a 120

e 1 atm por

15 minutos. A dieta ainda líquida foi entornada em placas de Petri de 10 cm de

diâmetro, que após resfriamento e solidificação foram embrulhadas em papel

Procedimento Experimental

filme e mantidas em geladeira, sendo utilizadas nos dias subseqüentes durante o

período do experimento. Foi estipulado um período máximo de 25 dias para a

realização dos experimentos de toxicidade.

A dieta para manutenção das formigas (controle) ou a dieta

acrescida do substrato a ser testado (tratamentos) foi colocada em papel

alumínio na quantidade aproximada de 0,4 a 0,5 g/placa. A cada 24 horas a dieta

foi renovada. O material a ser testado foi pesado, dissolvido no mesmo solvente

em que ocorreu sua extração e incorporado na dieta (BUENO et al, 1997).

As formigas foram distribuídas em lotes de 50 operárias para cada

tratamento, divididas em grupos de dez formigas e mantidas em 5 placas de

Petri. Essas placas foram colocadas em estufa com temperatura de 25

C e

umidade relativa acima de 70% e examinadas diariamente para retirada e

anotação do número de formigas mortas.

A análise estatística foi realizada através do teste não paramétrico

log-rank (p < 0,05), utilizando-se o software Graph-Pad, aplicativo Prisma 3.0.

3.8.2 – Ensaios Biológicos com o Fungo Simbionte

Os ensaios com o fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus

foram realizados no Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) - UNESP - Rio

Claro/SP, pela aluna Roberta N. A. Almeida, sob a orientação do Prof. Dr.

Fernando Carlos Pagnocca.

O fungo foi isolado de um ninho de formigas cortadeiras Atta

sexdens rubropilosa e mantido em condições de laboratório por passagens

mensais no meio de cultura constituído por dextrose (10 g/L), cloreto de sódio (5

g/L), peptona (5 g/L), extrato de malte (10 g/L) e ágar (17 g/L); sendo que o pH

do meio foi mantido em 6,0 ± 0,2.

As amostras submetidas aos ensaios foram preparadas e

adicionadas ao meio de cultura, segundo a metodologia descrita por

PAGNOCCA et al. (1990). Para cada amostra foram preparadas de 8 a 10

Procedimento Experimental

réplicas de tubos de cultura (massa fúngica), havendo um número idêntico de

réplicas para o solvente e para o controle geral. Após o tempo de incubação de

30 dias, a 25 ± 2 °C, foram realizadas a observação visual do crescimento do

micélio, comparando-se a massa fúngica do controle com a massa fúngica da

amostra.

3.8.3 – Ensaios Biológicos com as Enzimas

Os ensaios frente às pectinases presentes no líquido fecal e nos

ninho de A. sexdens rubropilosa foram realizados no Centro de Estudos de

Insetos Sociais (CEIS) – UNESP – Rio Claro/SP pela aluna Cínthia Zavan sob a

orientação do Prof. Dr. Maurício Bacci Júnior.

Neste ensaio, 4µL de uma solução em DMSO (50 µg/µL) da

amostra a ser testada foram adicionadas ao meio reacional (300 µL) constituído

por 150 µL de pectina cítrica a 2g.100mL

-1

(Sigma P-9135) em 50 mmol/L de

tampão citrato-fosfato (pH = 5); 75 µL de líquido fecal (contendo pectinases)

diluído 500 vezes e 71 µL de água ultra-pura. Como controle foi preparada a

mesma mistura reacional sem a adição da amostra a ser testada. As misturas

reacionais foram incubadas a 37º C sob agitação por 30 minutos, sendo que

alíquotas de 50 µL foram coletadas nos tempos de incubação zero e final. Estas

alíquotas foram adicionadas a 100 µL de reagente ADNS (ácido

dinitrosalisílico) (MILLER, 1959) e 100 µL de água. A mistura resultante foi

fervida por 5 minutos, centrifugada por 3 minutos e o sobrenadante foi utilizado

para determinação da densidade ótica (DO) a 540 nm. As diferenças de DO no

tempo zero e final foram calculadas para os experimentos com a amostra testada

(Do

) e para o controle (Do

). a atividade inibitória pectinásica foi calculada

através da fórmula I = 1 – (T C

-1

), onde T e C correspondem, respectivamente, à

atividade pectinásica medida na presença e na ausência da amostra testada. Os

Procedimento Experimental

resultados das densidades óticas foram submetidos ao teste estatístico Mann-

Whitney (SIEGL, 1956).

3.9 – Caracterização da quitosana (QTS)

3.9.1 – Grau de desacetilação (% GD)

O grau de desacetilação (% GD) ou porcentagem de grupos aminos

livres foi determinado por titulação condutimétrica com auxílio de um

condutivímetro Micronal (modelo B330) e uma célula condutimétrica Digimed

DMC-010.

Uma amostra de 200 mg de quitosana foi agitada em 40 mL de

solução de ácido clorídrico 0,05 mol.L

-1

por 18 horas. Após a dissolução do

polímero, a titulação foi conduzida com adição de NaOH 0,15 mol.L

-1

temperatura de 25,0 ºC (SANTOS et al, 2003). A titulação condutimétrica foi

realizada em triplicata.

3.9.2 – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN

O espectro de RMN

C foi obtido em um espectrômetro BRUKER

DRX400. O espectro foi obtido a partir de um procedimento descrito por

SIGNINI E CAMPANA-FILHO, onde, aproximadamente 8 mg de amostra de

quitosana são solubilizadas em 1 mL de solução de HCl/D

O 1 % (v/v), durante

24 horas formando uma solução viscosa. Uma alíquota dessa solução foi

colocada em tubo de 5 mm de diâmetro para análise.

3.9.3 – Preparação das microesferas de quitosana.

Aproximadamente 4,0 g de quitosana foi dissolvida em 100,0 mL de ácido

acético 5 %. A solução polimérica de quitosana foi gotejada com auxílio de uma

bomba peristáltica de marca Amershan Biosciences – Mod. Pump P-1, sobre

uma solução de NaOH 2 mol.L

-1

(método de inversão de fases). As microesferas

Procedimento Experimental

formadas foram deixadas durante 60 minutos numa solução de NaOH 2mol L

-1

sob agitação para completar a precipitação, posteriormente lavadas com água

destilada até alcançar o meio neutro. O mesmo procedimento foi realizado

incorporando-se uma flavona comercial, que após seca, a substância incorporada

foi extraída com clorofórmio deuterado e realizado experimento de RMN

3.9.4 – Reticulação das microesferas de quitosana.

As microesferas de quitosana, aproximadamente 4,0 g foram

colocadas em contato com uma solução de glutaraldeído 2,5 % cuja proporção

foi de 1,5 mL por grama de microesferas. A mistura reacional foi mantida

durante 24 horas, sob temperatura ambiente, para completar a reação de

reticulação. Após esse tempo de permanência, o material foi filtrado com uma

peneira, cujo diâmetro médio foi inferior a um milímetro, e lavado com água

destilada para retirar o excesso do agente reticulante.

3.9.5 – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As microesferas de quitosana foram caracterizadas por microscopia

de varredura em relação ao tamanho médio e a morfologia das partículas. As

amostras foram colocadas em estabes, recobertas de ouro e micrografadas num

microscópio eletrônico de varredura Zeiss – modelo DSM940A, do Laboratório

Interdisciplinar e Cerâmica (LIEC) do Departamento de Química da UFSCar.

3.9.6 – Análise de porosimetria

A análise de porosimetria foi realizada utilizando-se um

porosímetro da marca Micrometrics (USA) – modelo Porosizer 9320 do LIEC

do Departamento de Química da UFSCar. Onde aproximadamente 0,5 g de

microesferas de quitosana foram colocadas em uma câmara fechada ligada a um

capilar graduado e um volume de mercúrio foi injetado sob pressão,

preenchendo-a. A variação da pressão do sistema foi observada através do

Procedimento Experimental

capilar graduado pela variação do volume de mercúrio injetado. Desta maneira,

pode-se aplicar a equação de Young-Laplace que correlaciona a pressão e o

diâmetro possibilitando a determinação do tamanho médio dos poros, equação 1.

D = -4γ cós θ

Onde: D = diâmetro (m)

= tensão superficial (N/m)

θ = ângulo de contato superficial entre o mercúrio

P = pressão

Procedimento Experimental

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Resultados e Discussões

4 – Resultados e Discussões

4.1 – Substâncias Isoladas

Esteróides

1A 1B

2A 2B 2C

sitosterol (1A) e estigmasterol (1B) (em mistura)

m = 43,5 mg

procedência: galhos de H. puberula e de S. versicolor

isolamento: p. 22, 24 e 35

identificação: p. 52

sitostenona (2A), estigmastenona (2B) e campestenona (2C) (em mistura)

m = 13,4 mg

procedência: galhos de H. puberula e de S. versicolor

isolamento: p. 26 e 35

identificação: p. 55

referência: JOSHI et al., 1974

Resultados e Discussões

Triterpenos

-O-3

-D-glucopiranosil sitosterol

m = 7,2 mg

procedência: galhos de S. versicolor

isolamento: p. 35

identificação: p. 55

referência: SANTOS, 2005

OAc O

22S,3

-diidroxitirucala-7,24-dien-23-ona

m = 4,2 mg

procedência: galhos de S. versicolor

isolamento: p. 35

identificação: p. 60

referência: LIANG et al., 1989

eurileno

m = 21,2 mg

procedência: caule de S. versicolor

isolamento: p.31

identificação: p. 67

referência: ARRIAGA

et al

., 2002

Resultados e Discussões

Alcalóides

23 24

aaaaaaaaaaaaaaaa

OCH

lupeol

m = 17,2 mg

procedência: folhas de H. puberula e galhos

de S. versicolor

isolamento: p. 26 e 35

identificação: p. 70

referência: ARRUDA, 1990

N-metil-4-metóxi-2-quinolona

m = 17,3 mg

procedência: folhas de H. puberula

isolamento: p. 26

identificação: p. 78

referência: NAYAR et al., 1971

lupenona

m = 28,4 mg

procedência: galhos de H. puberula

isolamento: p. 22

identificação: p. 70

referência: MAHATO et al., 1994

23 24

Resultados e Discussões

OCH

28a

dictamina

m = 28,8 mg

procedência: galhos de H. puberula

isolamento: p. 22 e 24

identificação: p. 80

referência: PAULINI et al., 1989

OCH

28a

δ-fagarina

m = 7,8 mg

procedência: folhas e galhos de H. puberula

isolamento: p. 22 e 26

identificação: p. 80

referência: PAULINI et al., 1989

OCH

28a

kokusaginina

m = 37,1 mg

procedência: folhas de H. puberula

isolamento: p. 26 e 27

identificação: p. 80

referência: PAULINI et al., 1989

maculina

m = 15,3 mg

procedência: galhos de H. puberula

isolamento: p. 22

identificação: p. 80

referência: PAULINI et al., 1989

OCH

28a

Resultados e Discussões

OCH

28a

flindersiamina

m = 24,0 mg

procedência: folhas de H. puberula

isolamento: p. 27

identificação: p. 80

referência: PAULINI et al., 1989

OCH

4,5-dimetóxicantin-6-ona

m = 11,2 mg

procedência: galhos de S. versicolor

isolamento: p. 35

identificação: p. 92

referência: RODRIGUES-FILHO, 1992

5-metóxicantin-6-ona

m = 9,1 mg

procedência: galhos de S. versicolor

isolamento: p. 35

identificação: p. 92

referência: VIEIRA, 1995

OCH

arborinina

m = 1,2 mg

procedência: folhas de H. puberula

isolamento: p. 27

identificação: p. 89

referência: JANUÁRIO, 1995

BERGENTHAL et al., 1978

Resultados e Discussões

Flavonóides

OCH

7-hidróxi-1-etil

-carbolina

m = 0,9 mg

procedência: caule de S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 101

7-hidróxi-1,1’-propionato de metila

carbolina

m = 1,3 mg

procedência: caule de S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 101

OOH

OCH

isosakuranetina

m = 1,4 mg

procedência: folhas de S. versicolor

isolamento: p. 33

identificação: p. 111

referência: VASCONCELOS et al., 1998

flavanona

m = 8,4 mg

procedência: folhas de S. versicolor

isolamento: p. 33

identificação: p. 111

referência: PELTER et al., 1976

Resultados e Discussões

OOCH

OCH

5,7,3’,4’,5’-pentametóxiflavona

m = 9,8 mg

procedência: folhas de S. versicolor

isolamento: p. 33

identificação: p. 111

referência: FRASER & LEWIS, 1974

estilbeno 22

m = 7,3 mg

procedência: caule de H. puberula

isolamento: p. 29

identificação: p. 119

OOHO

7-hidroxicumarina

m = 9,3 mg

procedência: caule de S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 129

referência: KONG et al., 1995

6,7-dimetoxicumarina

m = 9,3 mg

procedência: caule de S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 129

referência: MAFEZOLI, 2001

OOH

OCH

1'''

Resultados e Discussões

Quassinóides

OOH

OCH

6-hidroxi-7,8-dimetoxicumarina

m = 1,2 mg

procedência: caule de

S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 129

referência: AHLUWALIA

et al., 1978

OOH

1''

3''

5''

2''

4''

3’-(1’,1’-dimetilalil)-isoescopoletina

m = 9,3 mg

procedência: caule de

H. puberula

isolamento: p.29

identificação: p. 129

referência: BERGENTHAL

et al., 1978

metileter-graveliferona

m =8,3 mg

procedência: caule de

H. puberula

isolamento: p. 29

identificação: p. 129

referência: BERGENTHAL

et al., 1978

glaucarubolona

m = 11,3 mg

procedência: caule de

S. versicolor

isolamento: p. 31

identificação: p. 149

referência: VIEIRA, 1995

Resultados e Discussões

Derivados do Ácido Cinâmico

OMe

MeO

OMe

MeO

3,4,5-trimetóxicinamato de metila

m = 18,1 mg

procedência: folhas de

H. puberula

isolamento: p. 22 e 27

identificação: p. 166

3,4-dimetóxicinamato de geranila

m = 3,1 mg

procedência: folhas de

H. puberula

isolamento: p. 24

identificação: p. 166

10 15

glaucarubinona

m = 9,0 mg

procedência: galhos de

S. versicolor

isolamento: p. 35

identificação: p. 155

referência: WATERMAN

et al., 1984

Resultados e Discussões

4.2 – Esteróides

Os esteróides são triterpenos modificados contendo o sistema de

anéis tetracíclicos do lanosterol, mas sem a presença das metilas nas posições C-

4 e C-14. Originados das frações lipídicas de vegetais e animais o sitosterol e o

estigmasterol são os esteróides mais freqüentemente encontrados no reino

vegetal (DEWICK, 2001). Quase sempre esses esteróides encontram-se em

mistura devido às suas semelhanças estruturais ocasionando dificuldades em

suas separações, então, na maioria das vezes, suas identificações são realizadas

em misturas através de CG/EM.

4.2.1 – Identificação estrutural do sitosterol (1A) e estigmasterol

(1B)

1A 1B

Os esteróides sitosterol e estigmasterol foram obtidos em mistura

nos extratos hexânico e diclorometânico dos galhos de H. puberula e da fração

diclorometânica do extrato metanólico dos galhos de S. versicolor (p. 22, 24 e

35) e caracterizados por RMN

H e EM.

Os sinais na região de

0,68 – 2,41, observados no espectro de

RMN

H (FIGURA 4.1) foram atribuídos aos hidrogênios metílicos, metilênicos

e metínicos do esqueleto esteroidal. O dubleto largo em

5.34 e um multipleto

3,55 foram atribuídos aos hidrogênios H-6 e H-3, respectivamente. Os

Resultados e Discussões

sinais em

5,07 (dd, J = 15,0 e 8,9 Hz) e

5,14 (dd, J = 15,0 e 8,9 Hz), foram

atribuídos aos hidrogênios vinílicos da cadeia lateral do estigmasterol.

A presença da mistura do sitosterol 1A e do estigmasterol 1B foi

confirmada por CG-EM, cujos picos do íon molecular em m/z 414 e 412

conferiram com as fórmulas moleculares C

O e C

O, respectivamente

(FIGURA 4.2). O ESQUEMA 4.1 apresenta propostas de fragmentação do

sitosterol.

FIGURA 4.1 – Espectro de RMN

H da mistura 1A + 1B (CDCl

, 200MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.2 – Espectro de massas de 1A e 1B (ESI = 70 eV)

ESQUEMA 4.1 – Proposta de Fragmentação do sitosterol

m/z = 414 (15 %)

m/z = 329 (16 %)

m/z = 381 (7 %)

m/z = 273 (2 %)

m/z = 255 (16 %)

m/z = 396 (13 %)

m/z = 145 (48 %)

m/z = 121 (30 %)

m/z = 91 (51%)

m/z = 55 (100 %)

m/z = 105 (50%)

retro DielsAlder

Resultados e Discussões

4.2.2 – Identificação da mistura sitostenona (2A), estigmastenona

(2B) e campestenona (2B) e do 3

-O-

-D-glucopiranosilsitosterol

(3)

Os esteróides sitostenona (2A), estimastenona (2B) e campestenona

(2C) foram obtidos em mistura do extrato hexânico das folhas de H. puberula e

da fração diclorometânica do extrato metanólico dos galhos de S. versicolor (p.

25 e 35), deste último, também foi isolado o esteróide 3

-O-

-D-

glucopiranosilsitosterol 3, (p. 35), ambos apresentaram-se como sólido branco

amorfo.

Os espectros de RMN

H da mistura 2A + 2B + 2C e 3 (FIGURAS

4.3 e 4.6, respectivamente) apresentaram sinais semelhantes aos descritos

anteriormente para a mistura 1A e 1B, ou seja, um conjunto de sinais na região

mais blindada do espectro em

2,4 - 0,7 referentes aos hidrogênios metílicos,

metilênicos e metínicos do núcleo esteroidal.

No espectro de RMN

H da mistura 2A e 2B foi observado um sinal

na região de hidrogênios olefínicos em

5,72 (sl, 1H), o qual foi atribuído ao H-

2A 2B 2C

Resultados e Discussões

4 e a ausência do hidrogênio carbinólico em C-3 sugeriu uma oxidação nessa

posição. O sinal em

199,7 referente a carbono carbonílico, observado no

espectro de RMN

C de 2 (FIGURA 4.4) indicou ser uma carbonila. A

comparação com dados da literatura (JOSHI, et al., 1974), (TABELA 4.1),

confirmou ser a sitostenona a substância 2A. Ainda no espectro de RMN

(FIGURA 4.3), a presença de um multipleto em

5,20 referentes a hidrogênios

olefínicos, indicou que provavelmente a sitostenona encontrava-se em mistura.

Esses dados foram comprovados pelo do espectro de ESI (FIGURA 4.5), onde

pode-se observar a presença da sitostenona 2A (m/z 412), da estigmastenona 2B

(m/z 410) e da campestenona 2C (m/z 398).

FIGURA 4.3 – Espectro de RMN

H de 2 (CDCl

, 200 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.4 – Espectro de RMN

C de 2 (CDCl

, 50 MHz).

TABELA 4.1 – Dados de RMN

H de 2 (200 MHz, CDCl

)

H Sitostenona 2

(200 MHz, CDCl

)

JOSHI, et al., 1974

(80MHz, CDCl

)

4 5,72 (sl) 5,80 (sl)

18 0,71 (3H, s) 0,70 (3H, s)

19 1,18 (3H, s) 1,20 (3H, s)

21 1,14 (3H, d) 1,09 (3H, d)

26 0,78 (3H, d) 0,78 (3H, d)

27 0,88 (3H, d) 0,88 (3H, d)

29 0,83 (3H, t) 0,80 (3H, d)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.5 – Espectros de massas de 2A, 2B e 2C (ESI = 70 eV)

No espectro de RMN

H de 3 (FIGURA 4.6) pôde-se observar um

acúmulo de sinais na região dos hidrogênios carbinólicos sugerindo a presença

de um açúcar na estrutura.

O espectro de RMN

C 3 (FIGURA 4.7) apresentou cinco sinais

referentes a carbonos carbinólicos entre

71,5 – 78,4, um sinal em

102,4

referente ao carbono anomérico em C-1’ e um carbono metilênico em 62,7

caracterizando uma glicose ligada ao esqueleto esteroidal.

Resultados e Discussões

FIGURA 4.6 – Espectro de RMN

H de 3 (Pyr-d

, 200 MHz)

FIGURA 4.7 – Espectro de RMN

C de 3 (Pyr-d

, 50 MHz)

Resultados e Discussões

4.3 – Triterpenos

4.3.1 – Identificação estrutural do 22S,3

-diidroxitirucala-7,24-

dien-23-ona (4)

O triterpeno 4, cristais em forma de agulha, proveniente da fração

diclorometânica do extrato metanólico dos galhos de S. versicolor (p. 35), foi

caracterizado por RMN de 1 e 2 D e comparados com dados da literatura

(LIANG et al., 1989) como sendo o triterpeno 22S,3

-diidroxitirucala-7,24-

dien-23-ona.

O espectro de RMN

H de 4 (FIGURA 4.8) apresentou oito sinais de

metilas em

0,64 (d, J = 6,6 Hz, 3H),

0,77 (s, 3H),

0,87 (s, 3H),

0,92 (s,

3H),

0,94 (s, 3H),

1,03 (d, 3H, J = 0,64 Hz),

1,97 (d, J = 1,0 Hz, 3H) e

2,22 (d, J = 1,0 Hz, 3H) e um sinal em

5,27 (dd, J = 4 e 2,5 Hz, 1H) referente

ao hidrogênio olefínico H-7. Estes dados juntamente com os 30 sinais de

carbono observados no espectro de RMN

C, (FIGURA 4.9), indicaram se tratar

de um triterpeno do tipo tirucalano a substância 4, classe esta, muito comum em

plantas da família Simaroubaceae.

A posição da dupla ligação entre os C-7 e C-8 foi confirmada

através das correlações do sinal

5,27 com os sinais referentes a C-5 (

44,6),

C-9 (

48,7) e C-14 (

51,4), no mapa de contorno de HMBC (FIGURA 4.10).

O sinal em

5,27, também apresentou correlação no espectro de COSY

H-

45º (FIGURA 4.11) com o multipleto em

2,00, que foi atribuído a H-6 (m,

2H).

Resultados e Discussões

Através da análise do mapa de contorno de HSQC (FIGURA 4.12)

foi possível realizar todas as atribuições dos carbonos hidrogenados de 4 e as

correlações observadas no mapa de contorno de HMBC (FIGURA 4.13)

permitiram fazer as atribuições dos sinais referentes aos hidrogênios das metilas:

Me-18 (

0,87), Me-19 (

0,77), Me-28 (

0,92), Me-29 (

0,94) e Me-30 (

1,03).

A cadeia lateral foi definida pela presença do dubleto em

4,17 (d,

J = 1,6 Hz, 1H), do septupleto em

6,08 (J = 1,2 Hz, 1H) e de dois dubletos em

2,22 e

1,97 (J = 1,0 Hz). O sinal em

6,08 apresentou correlação no

espectro de HMBC (FIGURA 4.14) com os sinais dos carbonos metílicos C-26

(

28,1) e C-27 (

21,3), do carbono carbonílico em

201,4 e do carbono

olefínico em

159,3 e o sinal do dubleto em

4,17, correlaciou-se com os sinais

do carbono carbinólico em

201,4, da metila C-21 (

11,9), do carbono em

39,5 e do carbono em

49,0 definidos através do espectro de HSQC (FIGURA

4.12) como sendo o C-20 e C-17, respectivamente. Portanto os sinais em

6,08

4,17, foram definidos como sendo H-24 e H-22, respectivamente.

HO H

Resultados e Discussões

Foram observados, ainda no espectro de HMBC (FIGURA 4.14) as

correlações dos sinais das metilas vinílicas Me-26,

2,22 (d, J = 1,0 Hz, 3H) e

Me-27,

1,97 (d, J = 1,0 Hz, 3H) com os sinais em

119,2 e

159,3 referentes

aos carbonos olefínicos C-24 e C-25, respectivamente. A estereoquímica da

cadeia lateral foi baseada em comparação com dados da literatura (PAULA,

1996 e LIANG et al., 1989) (TABELA 4.2), cujo autor definiu a estereoquímica

através de experimento utilizando éster de Mosher, sendo caracterizado como o

22S,3

-diidroxitirucala-7,24-dien-23-ona, o triterpeno 4.

FIGURA 4.8 – Espectro de RMN

H de 4 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.9 – Espectro de RMN

C de 4 (CDCl

, 100 MHz)

FIGURA 4.10 – Mapa de contorno de HMBC de 4 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.11 – Ampliação do espectro de COSY

H-

H de 4 (CDCl

, 400

MHz)

FIGURA 4.12 – Mapa de contorno de HSQC de 4 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.13 – Ampliação do mapa de contorno de HMBC de 4 (CDCl

, 400

MHz)

FIGURA 4.14 – Mapa de contorno de HMBC de 4 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

TABELA 4.2 – Dados de RMN

H e de RMN

C de 4

H/C Triterpeno 4

(400MHz, CDCl

)

LIANG et al., 1989

(400MHz, CDCl

)

Triterpeno 4

(100MHz, CDCl

)

LIANG et al.,1989

(100MHz, CDCl

)

1 1,50 (m) - 31,2 31,5

1,60

e 1,94

(m) 1,59

e 1,94

(m)

25,4 25,6

3 3,46 (t, 1H, J = 2,6 Hz) 3,47 sl 76.9 76,9

4 - - 37,4 37,6

5 1,80 (m) - 44,6 44,8

6 1,97 (m) e 2,04 (m) 1,94 e 2,04 (m) 23,9 24,2

7 5,27 (dd, 1H, J = 4 e 2,5 Hz) 5,28 (m) 117,9 118,2

8 - - 146,0 146,2

9 2,43 (m) - 48,7 48,9

10 - - 34,0 34,9

11 1,60 (m) - 17,9 18,2

12 1,57 (m) e 1,80 (m) - 33,6 33,8

13 - - 43,3 43,5

14 - - 51,4 51,7

15 1,57 (m) e 1,80 (m) - 34,0 34,2

16 1,44 (m) - 28,0 28,3

17 2,03 (m) - 49,0 49,3

18 0,87 (s, 3H) 0,88 (s) 21,9 22,2

19 0,77 (s, 3H) 0,78 (s) 13,0 13,2

20 1,90 (m) 1,85 (m) 39,5 39,8

21 0,64 (d, 1H, J = 6,6 Hz) 0,64 (d, J = 6,8) 11,9 12,2

22 4,17 (d, 1H, J = 1,6 Hz) 4,17 sl 78,9 79,1

23 - - 201,4 201,7

24 6,08 (sept, 1H, J = 1,0 Hz) 6,08 sl 119,2 119,4

25 - - 159,3 159,7

26 2,22 (d, 3H, J = 1,0 Hz) 2,22 (s, J = 0,8 Hz) 28,0 28,4

27 1,97 (d, 3H, J = 1,0 Hz) 1,97 (s, J = 0,8 Hz) 21,3 21,6

28 0,92 (s, 3H) 0,92 (s) 27,8 28,1

29 0,94 (s, 3H) 0,94 (s) 21,8 22,1

30 1,03 (d, 3H, J = 0,64 Hz) 1,03 (s) 27,4 27,7

Resultados e Discussões

4.3.2 – Identificação estrutural do triterpeno eurileno (5)

O triterpeno 5 foi isolado da fração diclorometânica do extrato

metanólico do caule de S. versicolor (p. 31) como cristais transparentes. Sua

determinação estrutural foi realizada através de RMN

H, RMN

C e comparada

com dados da literatura (ARRIAGA et.al., 2002).

No espectro de RMN

H de 5 (FIGURA 4.15) foi observado um

sinal em

5.10, região de hidrogênios olefínicos (t, J = 7,0 Hz, 2H) atribuídos

aos hidrogênos H-3 e H-22; um duplo dubleto em

4,87 (dd, J = 8,3 e 8,1 Hz,

2H) referentes aos hidrogênios H-11 e H-14, característico de hidrogênios

acetilcarbinólicos e um multipleto em

3,68 (m, 2H) referentes aos hidrogênios

carbinólicos H-7 e H-18.

Na região mais blindada do espectro de RMN

H foi observado um

singleto em

2,07 típico de hidrogênios metílicos de grupos acetilas; dois

singletos em 1,68

(s, 6H) e 1,61

(s, 6H) atribuídos aos hidrogênios metílicos

H-1 (3H) / H-24 (3H) e H-25 (3H) / H-30 (3H). Os hidrogênios metílicos H-26 e

H-29 sofreram um acoplamento em “W” com os hidrogênios carbinólicos H-7 e

H-18, respectivamente, resultando em dois dubletos cada (d, J =3,1 Hz, 3H),

cujos sinais coaleceram apresentando-se como um tripleto em

1,17.

No espectro de RMN

C, (FIGURA 4.16) pode-se observar os

sinais em

171,0 e

170,8, referentes aos carbonos carbonílicos C-31 e C-33,

dos grupos acetilas; em 131,6

correspondente aos carbonos olefínicos

totalmente substituídos C-2 e C-23; em

124,6 referente aos carbonos metínicos

C-3 e C-22 e os sinais dos carbonos carbinólicos C-18 e C-7, em

86,6 e

84,4,

respectivamente.

OAc

Resultados e Discussões

O triterpeno 5 teve seus dados de RMN

C comparados com a

literatura (ARRIAGA et al., 2002 e ITOKAWA et al., 1991) (TABELA 4.3), e

foi identificado como sendo o triterpeno eurileno, já isolado anteriormente de

Simaroubaceae.

FIGURA 4.15 – Espectro de RMN

H do triterpeno 5 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.16 – Espectro de RMN

C do triterpeno 5 (CDCl

, 50MHz)

Resultados e Discussões

TABELA 4.3 – Dados de RMN

H e

C do triterpeno 5

C Triterpeno 5

(100MHz, CDCl

)

ARRIAGA et al., 2002

(100MHz, CDCl

)

1/24 25,7 25,6

2/23 131,6 131,5

3/22 124,5 124,4

4/21 21,2 22,0

5 37,3 37,2

6 72,0 71,9

7 86,6 86,5

8 25,6 25,6

9 34,9 34,8

10 83,6 83,6

11 78,1 78,0

12 27,0 26,9

13 26,9 26,7

14 77,0 77,5

15 83,8 83,8

16 34,2 34,1

17 25,6 25,5

18 84,4 84,3

19 72,7 72,6

20 37,6 37,4

25/30 17,6 17,6

26 24,2 24,1

27 22,8 22,7

28 22,5 22,5

29 24,0 24,0

Aço 170,9 170,9

Aço 170,8 170,8

Me-AcO 21,2 21,2

Me-AcO 21,1 21,1

Resultados e Discussões

4.3.3 – Identificação estrutural dos triterpenos lupeol (6) e

lupenona (7)

6 7

O triterpeno 6 foi isolado do extrato hexânico das folhas de H.

puberula e da fração diclorometânica do extrato metanólico dos galhos de S.

versicolor (p. 26 e 35), já o triterpeno 7 foi isolado da fração hexânica dos

galhos de H. puberula (p. 22). Ambos foram identificados através de

experimentos de RMN

H, RMN

C, PENDANT e DEPT 135 º.

Os espectros de RMN

H tanto de 6 como de 7 (FIGURAS 4.17 e

4.18, respectivamente) mostraram a presença de seis singletos na região entre

0,70 – 1,07, referentes aos hidrogênios metílicos ligados a carbonos terciários e

um singleto em aproximadamente

1,68, que corresponde aos hidrogênios

metílicos ligado a um carbono insaturado. Esses dados, juntamente com os

sinais em

4,57 (dd, J = 2,4 e 1,2 Hz) e em

4,69 (d, J = 2,1 Hz), sugeriram a

natureza dos triterpenos 6 e 7 como tendo o esqueleto do tipo lupânico.

O sinal em 3,20

(dd, J = 10,0 e 4,8 Hz) observado no espectro de

RMN

H de 6 (FIGURA 4.17) indicou a presença de um hidrogênio carbinólico,

sugerindo um grupo hidroxila em C-3.

No espectro de RMN

C de 6 (FIGURA 4.19) pode-se observar 30

sinais para carbonos, sendo 7 metílicos, 11 metilênicos, 6 metínicos, 5 carbonos

quaternários e um carbono olefínico totalmente substituído. Esses sinais foram

confirmados no experimento de PENDANT (FIGURA 4.20). As análises desses

dados indicaram ser o lupeol o triterpeno 6.

23 24

Resultados e Discussões

A ausência do hidrogênio carbinólico no espectro de RMN

H do

triterpeno 7, (FIGURA 4.18) e a presença de um sinal de carbono carbonílico

em δ 218,1 no espectro de RMN

C (FIGURA 4.21) sugeriram ser a lupenona a

substância (7), cujos dados de RMN

C juntamente com os dados de DEPT

135º, (FIGURA 4.22) mostraram a presença de 7 sinais de carbono metílico, 11

carbonos metilênicos, 5 carbonos metínicos, carbonos quaternários, um carbono

carbonílico e um carbono olefínico totalmente substituído. Os triterpenos 6 e 7

tiveram seus dados comparados com os da literatura (TABELA 4.4).

FIGURA 4.17 – Espectro de RMN

H do triterpeno 6 (CDCl

, 200MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.18 – Espectro de RMN

H do triterpeno 7 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.19 – Espectro de RMN

C do triterpeno 6 (CDCl

, 50MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.20 – Espectro de PENDANT do triterpeno 6 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.21 – Espectro de RMN

C do triterpeno 7 (CDCl

, 50MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.22 – Espectro de DEPT 135º do triterpeno 7 (CDCl

, 200MHz)

Resultados e Discussões

TABELA 4.4 – Dados de RMN

C dos triterpenos 6 e 7

ARRUDA, 1990

(200 MHz, CDCl

)

MAHATO et al., 1994

(200 MHz, CDCl

)

1 38,7 38,7 39,6 39,7

2 27,4 27,4 33,6 34,2

3 78,9 78,9 218,1 217,0

4 38,8 38,8 47,3 47,4

5 55,3 55,3 54,8 55,0

6 18,3 18,3 21,0 20,0

7 34,3 34,2 33,6 33,7

8 40,8 40,8 40,8 40,1

9 50,4 50,4 49,7 50,0

10 37,1 37,1 36,9 37,0

11 20,9 20,9 21,5 21,5

12 25,1 25,1 25,2 25,3

13 38,0 38,0 38,2 38,8

14 42,8 42,8 43,0 43,0

15 27,4 27,4 27,4 28,0

16 35,6 35,5 35,5 35,6

17 43,0 43,0 42,9 43,0

18 48,3 48,2 48,2 48,4

19 47,9 47,9 47,9 48,0

20 150,9 150,9 150,8 150,8

21 29,8 29,8 29,9 30,0

22 40,0 40,0 40,0 40,0

23 28,0 28,0 26,7 26,7

24 15,3 15,4 21,0 21,0

25 16,1 16,1 15,9 15,9

26 16,0 15,9 15,7 15,9

27 14,5 14,5 14,5 14,5

28 18,1 18,1 17,9 18,0

29 109,3 109,3 109,4 109,4

30 19,3 19,3 16,0 19,4

Resultados e Discussões

Os triterpenos são substâncias contendo 30 átomos de carbonos.

Podem ser formados através da junção de duas unidades de farnesilpirofosfato,

formando o esqualeno, cuja ciclização resulta em diferentes tipos de esqueletos,

sendo conhecidos mais de 4000 triterpenos naturais (DEWICK, 2001). O

ESQUEMA 4.2, representa uma rota biogenética do triterpeno 5 e no

ESQUEMA 4.3 a dos triterpenos 4, 6 e 7.

ESQUEMA 4.2: Proposta biogenética para a formação do triterpeno 5 (adaptada

de DEWICK, 2001)

OPP

farnesil PP

cátion alílico

OPP

HOPP

preesqualeno PP

[O]

OH OH

HOH

CoAS

OAc

eurileno

(5)

SCoA

Resultados e Discussões

ESQUEMA 4.3: Proposta biogenética para a formação dos triterpenos 4, 6 e 7

(adaptada de DEWICK, 2001)

[O]

damarenil cátion

eufol (20R)

tirucalol (20S)

bacharenil cátion

lupeol

(6)

[O]

lupenona

(7)

22S,3α-diidroxitirucala-7,24-dien-23-ona

(4)

Resultados e Discussões

4.4 – Alcalóides

4.4.1 – Identificação estrutural do Alcalóide N-metil-4-metóxi-2-

quinolona (8)

O alcalóide 8 foi isolado do extrato hexânico das folhas de H.

puberula (p. 26) cuja caracterização foi realizada por RMN

H e

C e

comparação com a literatura (NAYAR et al., 1971).

O espectro de RMN

H de 8 (FIGURA 4.23) apresentou quatro

sinais relativos a hidrogênios aromáticos em

7,97 (dd, J = 8,0 e 1,5 Hz),

7,60 (ddd, J = 8,6, 7,0 e 1,5 Hz),

7,33 (dl, J = 8,6Hz) e

7,29 (ddd, J = 8,0,

7,0 e 1,0 Hz). As multiplicidades destes sinais indicaram a presença de um anel

aromático orto dissubstituído na estrutura de 8. A presença do sinal em

6,04

(s, 1H) indicou se tratar de um alcalóide 4-R-2-quinolônico, pois esse sinal é

típico do H-3, nesse tipo de estrutura. Foram observados também os sinais em

3,95 (s, 3H) e

3,67 (s, 3H), sendo estes, referentes às metilas ligadas a

heteroátomos.

O espectro de RMN

C de 8 (FIGURA 4.24) mostrou a presença de

onze sinais, quatro referentes a carbonos aromáticos, sendo o sinal em

164,0

referente a uma carbonila de sistema

insaturado; cinco carbonos metínicos e

dois de carbonos metílicos. A presença do carbono metílico em

29,0, indicou

que a metila encontrava-se diretamente ligada ao nitrogênio, pois se estivesse

diretamente ligada ao oxigênio esta, estaria mais desblindada.

aaaaaaaaaaaaaaaa

OCH

Resultados e Discussões

A análise dos dados espectroscópicos e comparação com dados da

literatura (NAYAR et al., 1971) indicaram ser o alcalóide 8 a N-metil-4-metóxi-

2-quinolona (TABELA 4.5).

FIGURA 4.23 – Espectro de RMN

H do alcalóide 8 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.24 – Espectro de RMN

C do alcalóide 8 (CDCl

, 50MHz)

1.07 1.03 1.021.00

7.1860

7.1911

7.2266

7.2306

7.2620

7.2679

7.5405

7.5483

7.5761

7.5837

7.5910

7.6189

7.6267

7.9471

7.9547

7.9871

7.9944

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

3.26 3.211.07 1.071.031.00

3.6739

3.9497

6.0410

7.1911

7.2266

7.2306

7.2620

7.2679

7.5405

7.5483

7.5761

7.5837

7.5910

7.6267

7.9471

7.9547

7.9871

7.9944

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30

29.0

55.8

76.4

77.0

77.6

96.5

114.0

116.5

121.6

123.3

131.2

139.6

162.7

164.0

Resultados e Discussões

TABELA 4.5 – Dados de RMN

H de 8

H/C Alcaloide 8

(CDCl

, 200MHz)

NAYAR et al., 1971

(CDCl

, 200MHz)

Alcaloide 8

(CDCl

, 50MHz)

2 - - 164,0

3 6,04 (s, 1H) 6,01 (s, 1H) 96,5

4 - - 162,7

4a - - 116,5

7,97

(dd, J = 8-,0 e 1,5 Hz, 1H)

8,00 123,3

7,29

(ddd, J = 8,0, 7,0 e 1 Hz, 1H)

7,35 121,6

7,60

(dd, J = 8,6, 7,0 e 1,5 Hz, 1H)

7,55 131,2

7,33

(dl, J = 8,6 Hz, 1H)

7,35 114,0

8a - - 139,6

N-CH

3,67

(s, 1H) 3,69

(s, 1H)

29,0

O-CH

3,95

(s, 1H) 3,99

(s, 1H)

55,8

4.4.2 – Identificação estrutural dos Alcalóides furoquinolínicos (9)

– (13)

Os alcalóides do tipo furoquinolínicos são muito comuns em várias

espécies de Rutaceae (MESTER, 1983). Os alcalóides 9, 10 e 12 foram isolados

dos galhos de H. puberula (p. 22 e 24) e das folhas desta mesma planta foram

isolados os alcalóides 10, 11 e 13 (p. 26 e 27). Estes tipos de alcalóides

apresentam características bastante peculiares em seus espectros de RMN

facilitando sua caracterização: um singleto em aproximadamente

4,40 relativo

a metoxila em C-4 e dois dubletos (J = 2,8 Hz) próximo a

7,65 e

7,10

referente aos hidrogênios furânicos H-2’ e H-3’.

9 10 11

12 13

OCH

Resultados e Discussões

Os espectros de RMN

H dos alcalóides 9 – 13 (FIGURAS 4.25;

4.27; 4.29 e 4.31 respectivamente) apresentaram um sinal próximo a

4,40 (s,

3H) e dois sinais próximos a

7,65 (d, J = 2,8 Hz) e

7,10 (d, J = 2,8 Hz)

indicando a presença dos hidrogênios H-2’ e H-3’ respectivamente, do núcleo

furoquinolínico nas estruturas desses alcalóides.

Foram observados também no espectro de RMN

H de 9 (FIGURA

4.23) quatro sinais referentes aos hidrogênios aromáticos. Nos alcalóides

furoquinolícos H-5 é sempre o mais desblindado devido ao efeito de compressão

estérica da metoxila em C-4, desta forma, o sinal em

8,30 (dd, J = 8,3 e 1,2

Hz) foi atribuído a H-5; para H-6, por acoplar com duas constantes orto com H-

5 e H-7, e uma constante meta com H-8, foi atribuído o sinal em

7,45 (ddd, J =

8,3; 7,0 e 1,5 Hz); o sinal em

7,70 (ddd, J = 8,5; 7,0 e 1,2 Hz) foi atribuído ao

H-7 e em

8,0 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz) ao hidrogênio H-8; esses dados sugeriram

que a substância 9 era um alcalóide furoquinolínico não substituído denominado

dictamina.

No espectro de RMN

C do alcalóide 9 (FIGURA 4.26) foram

observados doze sinais de carbonos, sendo cinco sinais referentes a carbonos

aromáticos, seis a carbonos metínicos e um de carbono metílico (TABELA 4.6).

Estes dados, comparados com os da literatura (PUSSET et al., 1990),

confirmaram a estrutura de 9, como sendo o alcalóide dictamina (TABELA 4.6).

A substância 10 apresentou no seu espectro de RMN

H (FIGURA

4.27) os sinais dos hidrogênios furânicos 2’ e 3’ em

7,66 (d, J = 2,8 Hz) e

7,08 (d, J = 2,8 Hz) e da metoxila em C-4 em

4,46.

O sinal desblindado em

7,86 (dd, J = 8,5 e 1,2 Hz) foi atribuído

ao hidrogênio H-5. Devido as constantes de acoplamento, esse sinal indicou a

presença de H-6 e H-7. O sinal em

7,37 (t, J = 8,5 Hz) foi atribuído ao

hidrogênio H-6, por acoplar com duas constantes orto com os núcleos dos

hidrogênios H-5 e H-7. Já para H-7 foi atribuído o sinal em

7,05 (dd, J = 8,5 e

1,2 Hz), por acoplar com uma constante orto com H-6 e uma constante meta

Resultados e Discussões

com H-5. Observou-se ainda no espectro de RMN

H um singleto em

4,09 (s,

3H) referente à metoxila situada em C-8.

Esses dados juntamente com os dados do espectro de RMN

(FIGURA 4.28) e comparação com a literatura (JACQUES PUSSET at al.,

1990) (TABELA 4.6) indicaram ser a substância 10, o alcalóide

-fagarina.

O espectro de RMN

H da substância 11 (FIGURA 4.29) apresentou

um sinal em

4,43, relativo à metoxila em C-4 e dois dubletos (J = 2,8 Hz) em

7,56 e

7,03, referentes aos hidrogênios furânicos H-2’ e H-3’, indicando se

tratar de um alcalóide furoquinolínico. Observou-se ainda, dois singletos em

7,47 (s, 1H) e

7,33 (s, 1H) na região aromática, que foram atribuídos aos

hidrogênios H-5 e H-8, respectivamente; a presença do grupo doador de elétrons

(metoxila) em orto fez com que o sinal referente a H-5 ficasse mais blindado,

que no alcalóide 9. Foram observados também, dois singletos em

4,03 (s, 3H)

4,02 (s, 3H) referentes a grupos metoxilas, que provavelmente estariam na

posição C-6 e C-7.

No espectro de RMN

C (FIGURA 4.30) foram observados 13

sinais, que somados aos dados anteriores e em comparação com a literatura

(PUSSET, et al., 1990) levaram ao alcalóide kokusaginina como sendo a

substância 11 (TABELA 4.6).

A substância 12 apresentou no seu espectro de RMN

H (FIGURA

4.31), além dos sinais característicos do núcleo de alcalóides furoquinolínicos,

sinais muito parecidos com o da substância 11, ou seja, dois singletos em

7,50

(s, 1H) e

7,30 (s, 1H), atribuídos aos hidrogênios H-5 e H-8, respectivamente.

A ausência dos grupos metoxilas e a presença de um singleto em

6,09

integrando para dois hidrogênios, indicaram na molécula um grupo

metilenodioxi na posição C-6 e C-7, esses dados foram confirmados através do

carbono metilênico em

102,5 observado no espectro de RMN

C (FIGURA

4.32) e comparação com a literatura (PUSSET, et al., 1990) (TABELA 4.6)

como sendo o alcalóide maculina.

Resultados e Discussões

A substância 13 apresentou no seu espectro de RMN

H (FIGURA

4.33) os mesmos sinais que foram observados para o alcalóide 12: os

hidrogênios do anel furano em

7,59 (d, J = 2,8 Hz, 1H) e

7,03 (d, J = 2,8 Hz,

1H); a metoxila em C-4 em

4,41 (s, 3H) e um singleto integrando para dois

hidrogênios em

6,09 (s, 2H) referente aos hidrogênios do grupo metilenodióxi.

A presença de um hidrogênio aromático em

7,28 (s, 1H) e uma metoxila em

4,27 (s, 3H), sugeriu que uma das posições, C-5 ou C-8, estaria substituída.

Baseados em estudos de RMN

H (ROBERTSON, 1963) e de síntese orgânica

(AYAFOR et al., 1984) foi verificado que o grupo metoxílico estaria ligado a C-

8. O composto 13 é relatado como sendo o alcalóide flindersiamina, que vem

sendo isolado em espécies de Rutaceae desde 1957 (OKUGUM e AYAFOR,

1977). Os dados de RMN

C (FIGURA 4.34) em comparação com a literatura

(PAULINI et al., 1989) reforçam a estrutura do alcalóide 13 (TABELA 4.6).

FIGURA 4.25 – Espectro de RMN

H do alcalóide 9 (CDCl

, 200MHz)

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

1.25 1.031.00 0.98 0.96

4.4486

7.0723

7.0863

7.2697

7.4505

7.4854

7.4916

7.6219

7.6360

7.6482

7.6560

7.6906

7.6985

7.9918

7.9942

8.0370

8.0397

8.2527

8.2579

8.2952

8.3000

Resultados e Discussões

FIGURA 4.26 – Espectro de RMN

C do alcalóide 9 (CDCl

, 50MHz)

FIGURA 4.27 – Espectro de RMN

H do alcalóide 10 (CDCl

, 200MHz)

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

Chloroform-d

167.2

156.8

145.6

143.5

129.6

127.8

123.7

122.3

118.7

104.7

103.4

77.0

59.0

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

3.063.052.061.161.00 0.98

Chloroform-d

4.0907

4.4603

7.0467

7.0521

7.0853

7.0991

7.3268

7.3692

7.4079

7.6515

7.6655

7.8343

7.8402

7.8770

7.8829

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0

ppm

2.061.161.00 0.98

Chloroform-d

7.0467

7.0521

7.0853

7.0991

7.3268

7.3692

7.4079

7.6515

7.6655

7.8343

7.8402

7.8770

7.8829

Resultados e Discussões

FIGURA 4.28 – Espectro de RMN

C do alcalóide 10 (CDCl

, 50MHz)

FIGURA 4.29 – Espectro de RMN

H do alcalóide 11 (CDCl

, 200MHz)

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

ppm

6.013.001.07 0.97 0.92

Chloroform-d

7.5717

7.5579

7.4714

7.3327

7.0434

7.0296

4.4295

4.0280

4.0215

170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50

ppm

Chloroform-d

163.188

156.894

154.551

143.865

136.974

123.412

119.668

114.079

107.761

104.500

103.885

77.639

77.000

76.369

58.989

55.941

Resultados e Discussões

FIGURA 4.30 – Espectro de RMN

C do alcalóide 11 (CDCl

, 50MHz)

FIGURA 4.31 – Espectro de RMN

H do alcalóide 12 (CDCl

, 200MHz)

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

3.092.031.08 1.06 1.00

4.4062

6.0873

7.0204

7.0342

7.2699

7.3053

7.5073

7.5584

7.5722

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

ppm

Chloroform-d

163.1

155.5

152.6

147.8

142.6

142.4

113.0

106.8

104.5

102.2

100.3

58.8

56.0

Resultados e Discussões

FIGURA 4.32 – Espectro de RMN

C do alcalóide 12 (CDCl

, 50MHz)

FIGURA 4.33 – Espectro de RMN

H do alcalóide 13 (CDCl

, 200MHz)

Chloroform-d

58.9

77.0

98.0

100.1

101.6

102.5

104.4

114.3

142.5

143.8

146.0

150.7

155.9

163.1

Resultados e Discussões

FIGURA 4.34 – Espectro de RMN

C do alcalóide 13 (CDCl

, 50MHz)

TABELA 4.6 – Dados de RMN

C dos alcalóides 9 – 13

C 9* Lit.

10* Lit.

10 11* Lit.

11 12* Lit.

12 13* Lit.

2’ 143,5 143,6 143,9 143,9 142,4 142,4 142,5 142,6 143,0 143,0

3’ 104,7 104,7 104,5 104,5 104,5 104,6 104,4 104,5 104,4 104,3

2 164,0 163,8 163,2 163,2 163,1 163,0 163,1 163,1 162,5 162,6

3 118,7 118,8 119,7 119,7 113,0 112,9 114,3 114,4 115,0 115,0

4 156,8 156,9 156,9 156,9 155,5 155,6 155,9 156,0 156,2 156,1

4a 103,4 103,6 103,9 103,9 102,2 102,2 100,1 101,6 103,0 103,0

5 122,3 122,4 123,4 114,1 100,3 100,1 101,6 102,5 92,5 93,4

6 123,7 123,8 123,4 123,5 147,8 147,8 146,0 146,1 146,8 146,7

7 129,6 129,7 107,8 107,8 152,6 152,6 150,7 150,8 138,1 138,0

8 127,8 127,8 154,5 154,6 106,8 106,7 102,5 104,5 137,5 137,7

8a 145,6 145,6 137,0 137,5 142,7 142,5 143,8 143,9 135,9 136,0

4-OCH

59,0 59,0 59,0 59,0 58,8 58,8 58,9 58,9 59,0 58,9

6-OCH

- - - - 56,0 56,0 - - - -

7-OCH

- - - - 56,0 55,9 - - - -

8-OCH

- - 55,9 56,0 - - - - 60,6 60,6

2” - - - - - - 98,0 98,0 101,6 101,5

Lit.

: PAULINI et al., 1989 (CDCl

, 100MHz)

*: (CDCl

, 50MHz)

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60

ppm

Chloroform-d

162.5

156.2

146.8

143.1

138.1

137.5

135.9

115.0

104.3

103.0

101.6

92.4

60.6

59.0

Resultados e Discussões

TABELA 4.7 – Dados de RMN

H dos alcalóides 9 – 13

H alcalóide 9 alcalóide 10 alcalóide 11 alcalóide 12 alcalóide 13

2’ 7,64 (d, J = 2,8 Hz) 7,66 (d, J = 2,8 Hz) 7,56 (d, J = 2,8 Hz) 7,56 (d, J = 2,8

Hz)

7,59 (d, J = 2,8

Hz)

3’ 7,08 (d, J = 2,8 Hz) 7,08 (d, J = 2,8 Hz) 7,03 (d, J = 2,8 Hz) 7,03 (d, J = 2,8

Hz)

7,03 (d, J = 2,8

Hz)

5 8,30 (dd, J = 8,3 e 1,2

Hz)

7,86 (dd, J = 8,5 e 1,2

Hz)

7,47 (s) 7,50 (s) 7,28 (s)

6 7,45 (ddd, J = 8,3;

7,0 e 1,5 Hz)

7,37 (t, J = 8,8 Hz) - - -

7 7,70 (ddd, J = 8,5;

7,0 e 1,2 Hz)

7,05 (dd, J = 8,5 e 1,2

Hz)

- - -

8 8,0 (dd, J = 8,5 e 1,5

Hz)

- 7,33 (s) 7,30 (s) -

2’’ - - - 6,09 (s) 6,09 (s)

4-OCH

4,44 (s) 4,46 (s) 4,43 (s) 4,40 (s) 4,41

6-OCH

- - 4,03 (s) - -

7-OCH

8-OCH

4,09 (s)

4,02 (s)

4,27

4.4.3 – Identificação estrutural do Alcalóide 14

O alcalóide 14 foi isolado do extrato diclorometânico das folhas de

H. puberula (p. 27) e foi caracterizado por RMN

H, RMN

C e comparação com

a literatura (JANUÁRIO, 1995).

O espectro de RMN

H de 14 (FIGURA 4.35) apresentou quatro

sinais na região de hidrogênios aromáticos, evidenciando um anel orto

dissubstituído:

8,37 (dd, J = 8,1 e 1,4 Hz),

7,68 (ddd, J = 8,7, 7,0 e 1,4 Hz),

7,46 (dl, J = 8,7 Hz) e

7,26 (ddd, J = 8,1, 7,0 e 0,8 Hz), que foram atribuídos

aos hidrogênios H-8, H-6, H-5 e H-7, respectivamente. Observou-se ainda no

espectro dois sinais de metoxilas em

3,92 (s, 3H) e

4,00 (s, 3H); um sinal de

N-Me em

3,78 (s, 3H) e um singleto em

6,21 (1H), característico do

hidrogênio H-4 de alcalóides acridônicos substituídos em C-2, C-3 e C-4. A

presença de um singleto em

14,75 é característico do hidrogênio da hidroxila

OCH

Resultados e Discussões

quando esta encontra-se quelada com o oxigênio do grupo carboxílico,

confirmando a presença da hidroxila na posição C-1.

Através das informações descritas anteriormente, o alcalóide 14 foi

caracterizado como a sendo a arborinina. A comparação dos valores de RMN

(FIGURA 4.36) com os da literatura (BERGENTHAL et al., 1978) (TABELA

4.8) confirma a estrutura proposta.

FIGURA 4.35 – Espectro de RMN

H do alcalóide 14 (CDCl

, 200MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.36 – Espectro de RMN

C do alcalóide 14 (CDCl

, 50MHz)

TABELA 4.8 – Dados de RMN

H e

C do alcalóide 14

H/C Alcaloide 14 Alcaloide 14

(CDCl

, 50 MHz)

BERGENTHAL et al., 1979

(CDCl

, 50 MHz)

1 - 155,7 155,8

2 - 129,9 130,2

3 - 159,1 159,3

4 6,21 (s) 86,7 86,7

5 7,46 (dl, J = 8,7 Hz) 114,5 114,5

6 7,68 (ddd, J = 8,7, 7,0 e 1,4

Hz)

133,7 133,9

7 7,26 (ddd, J = 8,1, 7,0 e 0,8

Hz)

121,2 121,4

8 8,37 (dd, J = 8,1 e 1,4 Hz) 126,0 126,6

9 - 180,4 180,8

11 - 140,1 140,5

12 - 105,3 105,8

13 - 120,3 120,7

14 - 141,6 142,0

N-CH

3,78 (s, 3H) 33,8 34,1

2-OCH

3,92* (s, 3H) 60,6 60,8

3-OCH

4,00* (s, 3H) 55,8 56,0

* = valores intercambiáveis

Resultados e Discussões

4.4.4– Identificação estrutural dos Alcalóides 15 e 16

Mais de trinta e cinco alcalóides do tipo cantin-6-ona tem sido

isolados de trinta e seis espécies de plantas, sendo vinte e nove desses alcalóides

isolados de espécies da família Simaroubaceae, portanto, estes compostos

formam um importante grupo do ponto de vista quimiotaxonômico (OHMOTO

e KOIKE, 1989).

Os alcalóides 15 e 16 foram isolados do caule da fração

diclorometânica do extrato metanólico de S. versicolor (p. 35). Suas estruturas

foram elucidadas através de RMN

C, COSY, HMBC e HSQC.

15 16

Os alcalóides cantinônicos são de fácil identificação. Por serem

altamente conjugados, possuem coloração às vezes fosforescente e forte

absorção na luz UV. Possuem características estruturais que tornam seus

espectros particulares, que são os dois dubletos em aproximadamente

7,95 e

8,86, ambos com J = 5,0 Hz, referentes aos hidrogênios H-1 e H-2 do anel

piridínico (anel B).

Os espectros de hidrogênio dos alcalóides 15 e 16 (FIGURAS 4.37

e 4.38) além de apresentarem os dois dubletos referentes aos hidrogênios H-1 e

H-2 em aproximadamente

8,80 e

7,80, apresentaram em comum, sinais de

quatro hidrogênios aromáticos em

8,11 (ddd, J = 7,8, 1,2 e 0,8 Hz) que foi

atribuído ao hidrogênio H-8 por acoplar com H-9 com uma constante orto, em

meta com H-10 e com uma constante para com H-11. Para o H-9 foi atribuído o

sinal em

7,52 (ddd, J = 7,8, 7,6 e 1,00 Hz) por acoplar com uma constante orto

OCH

Resultados e Discussões

com H-8 e H-10 e acoplar com uma constante meta com H-11. O sinal em

7,71 (ddd, J = 8,0, 7,0 e 0,8 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-10 por acoplar

com duas constantes grandes com H-9 e H-11 e uma constante pequena com H-

8, conseqüentemente o sinal em

8,67 (td, J = 8,0 e 1,00 Hz) foi atribuído ao

H-11. Esses dados foram confirmados no espectro de COSY

H-

H dos

alcalóides 15 e 16 (FIGURAS 4.39 e 4.40), sugerindo para estas estruturas, um

anel aromático orto dissubstituído (TABELA 4.9).

Foi observado também no espectro de RMN

H de 16 (FIGURA

4.38) um sinal em

7,21 (s, 1H), indicando que apenas um dos carbonos, C-4 ou

C-5, estaria substituído e que provavelmente o substituinte desta posição seria

um grupo metoxila, evidenciado pela presença de um singleto em

4,09. Já no

espectro de RMN

H de 15 (FIGURA 4.37) os sinais em

4,09 e

4,48, ambos

integrando para três hidrogênios e a ausência do singleto em

7,21, presente na

estrutura de 16, evidenciaram dois grupos metoxilas nas posições C-4 e C-5.

Esses dados foram confirmados através dos sinais dos carbonos metílicos em

61,5 e

61,3 obsevados no espectro de RMN

C de 15 (FIGURA 4.41). Foram

observados também um carbono carbonílico em

158,4 e treze sinas de

carbonos aromáticos, sendo sete deles, totalmente substituído . Já o espectro de

RMN

C de 16 (FIGURA 4.40) apresentou somente um sinal de carbono

metílico em

56,9, um carbono carbonílico em

155,4 e treze sinas de carbonos

aromáticos sendo seis deles totalmente substituído. Os sinais de carbono

metílicos em aproximadamente 61,0

em ambos os espectros indicaram que as

metilas estavam ligadas diretamente ao oxigênio.

Os experimentos de HSQC e HMBC de 15 (FIGURAS 4.43 e 4.44)

permitiram atribuir todos os sinais de carbono e hidrogênios na molécula

(TABELA 4.11). Para o alcalóide 16 os experimentos de HSQC e HMBC

(FIGURAS 4.45 e 4.46), além de permitirem as atribuições dos sinais dos

carbonos e hidrogênios, confirmaram a posição da metoxila em C-5, através das

correlações entre o sinal em

7,21com os sinais em

127,6,

137,0 e

154,6

Resultados e Discussões

referentes aos carbonos C-15, C-16 e C-6, respectivamente, este sinal, foi

atribuído ao hidrogênio H-4; identificando assim o alcalóide 15 como 4,5-

dimetóxicantin-6-ona e o alcalóide 16 como sendo o 5-metóxicantin-6-ona, já

descritos anteriormente na literatura (RODRIGUES-FILHO, 1992 e VIEIRA,

1995).

FIGURA 4.37 – Espectro de RMN

H do alcalóide 15 (CDCl

, 400MHz)

7,21

OCH

8,71

8,09

7,70

7,84

4,06

8,76

7,56

125,8

127,6

154,6

146,0

125,3

122,6

137,0

117,6

130,6

113,8

139,1

110,0

129,4

155,4

56,9

OCH

8,67

8,11

7,52

7,95

4,09

8,86

4,48

7,71

125,3

128,6

152,9

145,3

124,8

122,5

133,5

117,0

130,8

115,6

139,2

146,0

130,1

158,4

61,4

61,5

Resultados e Discussões

FIGURA 4.38 – Espectro de RMN

H do alcalóide 16 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 4.39 – Espectro de COSY

H-

H de 15 (CDCl

, 400MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.40 – Espectro de COSY

H-

H de 16 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 4.41 – Espectro de RMN

C do alcalóide 15 (CDCl

, 50MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.42 – Espectro de RMN

C do alcalóide 16 (CDCl

, 50MHz)

FIGURA 4.43 – Mapa de contorno de HSQC do alcalóide 15 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.44 – Mapa de contorno de HMBC do alcalóide 15 (CDCl

, 400

MHz)

FIGURA 4.45 – Mapa de contorno de HSQC do alcalóide 16 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

FIGURA 4.46 – Mapa de contorno de HMBC do alcalóide 16 (CDCl

, 400

MHz)

TABELA 4.9 – Dados de RMN

H dos alcalóides 15 e 16

(CDCl

, 400 MHz)

(RODRIGUES-FILHO, 1992)

(CDCl

, 200 MHz)

(CDCl

, 400 MHz)

(VIEIRA, 1995)

(CDCl

, 400 MHz)

1 7,95(d, J = 5,0 Hz) 7,89(d, J = 5,1 Hz) 7,84(d, J = 5,1 Hz) 7,83(d, J = 5,1Hz)

2 8,86 (d, J = 5,0 Hz) 8,81 (d, J = 5,1 Hz) 8,76 (d, J = 5,1 Hz) 8,76 (d, J = 5,1Hz)

4 --- --- 7,21 (s) 7,12 (s)

8 8,11 (ddd, J = 7,8, 1,2 e 0,8

Hz)

8,04 (dd, J = 8,0 e 1,3 Hz) 8,09 (dt, J = 8,0 e 1,0 Hz) 8,11 (d, J = 7,6 Hz)

9 7,52 (ddd, J = 7,8, 7,6 e

1,00 Hz)

7,47 (dt, J = 8,0 e 1,0 Hz) 7,70 (td, J = 8,10 e 1,20 Hz) 7,70 (t, J = 7,6 Hz)

10 7,71 (ddd, J = 8,0, 7,0 e 0,8

Hz)

7,67 (dt, J = 8,0 e 1,3 Hz) 7,56 (td, J = 7,80 e 1,20 Hz) 7,53 (t, J = 7,6 Hz)

11 8,67 (td, J = 8,0 e 1,00 Hz) 8,60 (dd, J = 8,0 e 1,0 Hz) 8,71 (d, J = 8,10 Hz) 8,71 (d, J = 7,6 Hz)

4-OCH

4,48, s 4,67, s --- ---

5- OCH

4,09, s 4,08, s 4,06, s 4,07, s

Resultados e Discussões

100

TABELA 4.10 – Dados de RMN

C de 15 e 16

(15)

(OHMOTO & KOIKE, 1989)

(16) (VIEIRA, 1995)

(CDCl

, 400 MHz)

1 115,6 114,9 113,8 113,7

2 145,3 144,5 146,0 145,8

4 146,0 142,0 110,0 109,8

5 152,9 152,1 154,6 154,4

6 158,4 157,4 155,4 155,2

8 117,0 116,2 117,6 117,4

9 130,8 130,0 130,6 130,5

10 125,3 125,6 125,8 125,7

11 122,5 121,8 122,6 122,6

12 124,8 124,0 125,3 125,1

13 139,2 138,2 139,1 138,9

14 130,1 129,1 129,4 129,2

15 128,6 127,6 127,6 127,3

16 133,5 132,7 137,0 136,7

4-OCH

61,5 61,2 - -

5-OCH

61,3 61,0 56,9 56,9

TABELA 4.11 – Correlações

H –

C de 15 e 16 a J

e J

observadas no

experimento de HMBC (400MHz, CDCl

)

15 H

15 C

16 H

16 C

1 7,95 128,0 e 145,4 7,84 129,4

2 8,86 115,0 e 130 8,76 113,8, 129,4 e

136,9

4 - - 7,21 127,6 e 136,9

8 8,11 130,0, 130,9 e 139,7 8,70 125,8 e 125,3

9 7,52 117,1 e 124 7,70 122,6 e 139,1

10 7,71 122,0 e 139,3 7,56 117,5 e 125,3

11 8,67 124,0 e 125,4 8,10 130,6 e 139,1

4-OCH

4,48 152,0 - -

5-OCH

4,10 140 e 155,0 4,06 154,6 e 110

Resultados e Discussões

101

4.4.5– Identificação estrutural dos Alcalóides 17 e 18

Os alcalóides

-carbolínicos quando substituídos apenas na posição

1 podem ser facilmente identificados através dos deslocamentos químicos dos

hidrogênios H-3 e H-4,

8,15 – 8,55 e

7,80 – 8,35, respectivamente, e com J

= 5,0 a 6,0 Hz. Substituintes com efeito doador eletrônico na posição 1

provocam um deslocamento do sinal de H-4 para região mais blindada, já os

substituintes com efeito receptor eletrônico tem efeito oposto (VIEIRA, 1995).

17 18

Os alcalóides

-cantinônicos 17 e 18 foram isolados da fração

diclorometânica do extrato metanólico do caule de S. versicolor (p. 31) e

tiveram suas estruturas elucidadas através de RMN de 1 e 2 D e espectrometria

de massas.

O espectro de RMN

H de 17 (FIGURA 4.47) apresentou dois

dubletos em

7,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H) e

6,78 (d, J = 8,5 Hz, 1H), indicando

um acoplamento orto, que foram atribuídos aos H-5 e H-6, respectivamente. A

presença de um singleto em

6,94 (s, 1H) indicou tratar-se de um anel

aromático trissubstituído e esse sinal foi atribuído ao hidrogênio H-8. Os

mesmos sinais, também puderam ser observados no espectro de RMN

H de 18

(FIGURA 4.48), que também apresenta um anel aromático trissubstituído, tendo

sido observado também um acoplamento em meta entre os hidrogênios H-8 e H-

OCH

Resultados e Discussões

102

FIGURA 4.47 – Espectro de RMN

H do alcalóide 17 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 4.48 – Espectro de RMN

H do alcalóide 18 (CDCl

, 400MHz)

Resultados e Discussões

103

Os espectros, tanto do alcalóide 17 como o de 18, apresentaram

dois dubletos, sendo em

8,10 (d, J = 4,8 Hz, 1H) e

7,82 (d, J = 4,8 Hz, 1H)

para 17 e

8,38 (d, J = 5,3 Hz, 1H) e

7,84 (d, J = 5,3 Hz, 1H) para o alcalóide

18, que foram atribuídos aos hidrogênios do anel piridínico H-3 e H-4. Como os

sinais referentes aos hidrogênios H-4 em ambos as estruturas encontraram-se

blindados e a ausência do sinal referente a H-1 evidenciaram que a posição C-1

estaria substituída por um grupo doador de elétrons.

No espectro de RMN

H de 17 (FIGURA 4.47) observou-se um

quadrupleto em

3,14 (q, J = 7,3 Hz, 2H), e um tripleto em

1,40 (t, J = 7,3

Hz, 3H) sugerindo ser uma etila o substituinte na posição C-1. O espectro de

massas ES+ do alcalóide 17 (FIGURA 4.49) apresentou m/z 213,3, indicando

que possivelmente o alcalóide 17 possui uma hidroxila, (TABELA 4.12). Uma

proposta de fragmentação para este alcalóide foi representada no ESQUEMA

4.4.

FIGURA 4.49 – Espectro de massas (ES+) de 17

071004

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

m/z

100

simoneSVCH12526filhos212_5eV 38 (0.461) Daughters of 213ES+

2.11e6

213.4

simoneSVCH12526filhos212_10eV 23 (0.290) Daughters of 213ES+

1.52e6

213.4

simoneSVCH12526filhos212_15eV 32 (0.393) Daughters of 213ES+

1.76e6

213.4

198.4

simoneSVCH12526filhos212_20eV 33 (0.405) Daughters of 213ES+

1.00e6

213.4

198.4

simoneSVCH12526filhos212_25eV 53 (0.633) Daughters of 213ES+

9.51e5

198.4

213.4

simoneSVCH12526filhos212_30eV 28 (0.347) Daughters of 213ES+

8.57e5

198.4

170.3

213.3

simoneSVCH12526filhos212_35eV 33 (0.405) Daughters of 213ES+

4.01e5

198.4

170.3

Resultados e Discussões

104

ESQUEMA 4.4 – Proposta de fragmentação para o alcalóide 17 (ES+)

O espectro de COSY

H-

H de 18 (FIGURA 4.50) confirmou as

atribuições dadas aos hidrogênios aromáticos e aos do anel piridínico. Na

ampliação do espectro de COSY

H-

H de 18 (FIGURA 4.51) foi observado o

acoplamento entre os hidrogênios em

2,97 (t, J = 6,7 Hz) e

3,44 (t, J = 6,7

Hz) (TABELA 4.13).

FIGURA 4.50 – Espectro de COSY

H-

H de 18 (CDCl

, 400MHz)

HO H

m/z 213,4

HO H

m/z 198,4

-CH

HO H

m/z 198,4

NHO

m/z 170,3

- CH

Resultados e Discussões

105

FIGURA 4.51 – Ampliação do espectro de COSY

H-

H de 18 (CDCl

400MHz)

Os experimentos de HSQC (FIGURA 4.52) e HMBC (FIGURA

4.53) contribuíram para as atribuições dos sinais de hidrogênios e carbonos do

alcalóide 18, permitindo verificar as correlações do sinal em

2,97, referente

aos hidrogênios H-2’, com os dos sinais dos carbonos em

175,0;

143,0 e

28,8, atribuídos aos C-3’; C-1 e C-1’. Para sinal em

3,44, referente aos

hidrogênios H-1’, foram observados as correlações no espectro de HMBC com

os sinais em

135,0;

143,0 e

175,0, referentes aos C-12; C-1 e C-3’ e

finalmente para o sinal dos hidrogênios do grupo metoxila em

3,66, foi

verificado a correlação com o sinal em

175,0, sinal este, referente ao carbono

carbonílico C-3’. A partir dessas correlações, foi verificado que a metoxila

encontrava-se no C-3’ e provavelmente o grupo hidroxila em C-7 e que o

substituinte em C-1 seria o éster propionoato de metila (TABELA 4.14).

Resultados e Discussões

106

FIGURA 4.52 – Mapa de contorno de HSQC de 18 (CDCl

, 400 MHz)

OCH

8,12

7,56

7,84

120,0

7,30

141,5

8,38

3,44

2,97

3,66

175,0

32,8

121,7

28,8

52,0

140,0

143,0

128,4

135,0

113,3

Resultados e Discussões

107

FIGURA 4.53 – Mapa de contorno de HMBC de 18 (CDCl

, 400 MHz)

TABELA 4.12 – Dados de RMN

H de 17 e 18

17 18

3 8,10 (d, J = 4,8 Hz) 8,38 (d, J = 5,3 Hz)

4 7,82 (d, J = 4,8 Hz) 7,84 (d, J = 5,3 Hz)

5 7,94 (d, J = 8,5 Hz) 8,12 (d, J = 7,8 Hz)

6 6,78 (d, J = 8,5 Hz) 7,30 (d, J = 7,8 e 1,0 Hz)

8 6,94 s 7,56 (d, J = 1,0 Hz)

1’ 3,14 (q, J = 7,3 Hz) 3,44 (t, J = 6,7 Hz)

2’ 1,40 (t, J = 7,3 Hz) 2,97 (t, J = 6,7 Hz)

N-H 9,0 sl 8,8 sl

3’OCH

--- 3,66, s

TABELA 4.13 – Correlações

H-

H de 18 observadas nos experimentos de

COSY (400 MHz, CDCl

)

(18)

3 7,84

4 8,38

5 7,30

6 8,12 e 7,56

8 7,30

1’ 2,97

2’ 3,44

Resultados e Discussões

108

TABELA 4.14 – Correlações

H –

C a J

, J

e J

de 18 observadas no

experimento de HSQC e HMBC (400 MHz, CDCl

)

HSQC HMBC

H (δ) C (δ) H (δ) C (δ)

8,38 140,0 8,38 113,3 e 129,5

8,12 121,7 8,12 128,4 e 141,5

7,84 113,3 7,84 135

7,56 111,9 7,56 ----

7,30 120,0 7,30 111,9

3,66 52,0 3,66 175

3,44 28,8 3,44 175, 135,0 e 143,0

2,97 32,8 2,97 175, 143 e 28,8

Os alcalóides são bases orgânicas nitrogenadas presentes

principalmente em plantas, mas também, há ocorrências em microorganismos,

insetos e anfíbios. Sua basicidade é conferida pela presença de um ou mais

átomos de nitrogênio em anéis heterocíclicos (CORDELL, 1981).

Os alcalóides derivados da fenilalanina/tirosina, do triptofano, do

ácido antranílico, derivados da histidina e alcalóides de origem não definidas,

como os carbazóis, são os de maiores ocorrência na família Rutaceae, sendo os

derivados do ácido antranílico considerados marcadores quimiotaxonômicos

desta família (WATERMAN, 1999).

Nos ESQUEMAS 4.5 e 46 estão representados propostas

biossintéticas para a formação dos alcalóides derivados do ácido antranílico,

substâncias 8 a 14 e no ESQUEMA 4.7, proposta biossintética para a formação

dos alcalóides derivados do triptofano, substâncias 15 a 18.

Resultados e Discussões

109

ESQUEMA 4.5: Proposta biogenética para a formação do alcalóide 14

(adaptada de DEWICK, 2001)

ESQUEMA 4.6: Proposta biogenética para a formação dos alcalóides 8 a 13

(adaptada de DEWICK, 2001)

SCoA

ACoS

- H

[O]

SAM

OCH

arborinina

(14)

-CO

2 malonil-CoA

SCoA

antranoloil-CoA

SCoA

OCH

[O]

OCH

dictamina

(9)

[O]

4-hidroxi-2-quinolon

OPP

SAM

OCH

SAM

4-metoxi-2-quinolona

SAM

N-metil-4-metoxi-2-quinolon

(8)

OCH

[O]

NADPH

OCH

[O]

OCH

maculina

(12)

OCH

flindersiamina

(13)

OCH

SAM

OCH

kokusaginina

(11)

[O]

OCH

SAM

OCH

γ−fagarina

(10)

SAM

Resultados e Discussões

110

ESQUEMA 4.7: Proposta biogenética para a formação dos alcalóides 15 ao 18

(adaptada de DEWICK, 2001)

HO O

ácido 2-oxoglutárico

formação de uma base

de Schiff usando um aldeído

tautomerismo

para reestabelecer a

aromaticidade

[O]

(17) R = CH

(18) R =

OCH

OHO

SAM

OCH

SAM

OCH

5-metoxicantin-6-ona

(16)

4,5-dimetoxicantin-6-ona

(15)

[O]

Resultados e Discussões

111

4.5 – Flavonóides

4.5.1 – Identificação estrutural dos flavonóides 19 - 21

Os flavonóides 19-21 foram isolados da fração diclorometânica do

extrato metanólico das folhas de H. puberula (p. 33) e foram identificados

através de RMN

H, RMN

C, HSQC e HMBC e comparados com dados da

literatura (PELTER et al., 1976, VASCONCELOS et al., 1998 e FRASER &

LEWIS, 1974).

19 20 21

Analisando os espectros de RMN

H de 19 e 20 (FIGURAS 4.54 e

4.55) observaram-se sinais em

3,10 (dd, J = 3,0 e 17,1 Hz),

2,78 (dd, J =

13,0 e 17,1 Hz) e em

5,37 (dd, J = 3,0 e 13,0 Hz) atribuídos, respectivamente,

aos hidrogênios H-3a, H-3b e H-2 do anel C de flavonóide e estes sinais são

típicos de uma flavanona.

A presença de nove sinais de hidrogênios na região aromática do

espectro de RMN

H de 19 em conjunto com a análise do espectro de RMN

(FIGURA 4.56), onde foi verificada a presença de um carbono carbonílico em

191,9 e doze sinais de carbonos aromáticos, sendo três deles totalmente

substituído, indicaram a ausência de substituintes nos anéis A e B, sugerindo ser

a substância 19 a flavanona. Os dados de RMN

H e

C de 19 foram comparados

com a literatura (PELTER et al., 1976), (TABELA 4.15) confirmando sua

identificação.

OOCH

OCH

OOH

OCH

Resultados e Discussões

112

FIGURA 4.54 – Espectro de RMN

H do flavonóide 19 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.55 – Espectro de RMN

H do flavonóide 20 (CDCl

, 200MHz)

Resultados e Discussões

113

FIGURA 4.56 – Espectro de RMN

C do flavonóide 19 (CDCl

, 50MHz)

Já para a substância 20 foi observado no espectro de RMN

(FIGURA 4.55) um sinal em

12,1 (s, 1H) característico de hidrogênio de

hidroxila quando esta se encontra quelada, posicionada em C-5. Os dubletos em

6,96 (d, J = 8,8 Hz, 2H) e

7,38 (d, J = 8,8 Hz, 2H,) foram atribuídos aos

hidrogênios H-3’, H-5’ e H-2’, H-6’ que são quimicamente equivalentes devido

a livre rotação do anel B. No espectro de HMBC de 20, (FIGURA 4.57) foi

observado a correlação do sinal em

3,84, referente aos hidrogênios do grupo

metoxila, com o sinal em

160,0; o qual também está correlacionado ao sinal

7,38, correspondente aos hidrogênios H-2’ e H-6’. Esses dados indicaram

que o grupo metoxila encontrava-se em C-4’. Os sinais em

5,99 (sl, 1H) e

5,98 (sl, 1H) foram atribuídos aos hidrogênios H-6 e H-8, respectivamente.

Resultados e Discussões

114

Através dos experimentos de HSQC (FIGURA 4.58) e HMBC

(FIGURA 4.57), podem-se atribuir todos os carbonos da substância 20

(TABELA 4.16) que em comparação com a literatura (VASCONCELOS et al.,

1998) (TABELA 4.15) mostrou se tratar da flavanona Isosakuranetina.

FIGURA 4.57 – Mapa de contorno de HMBC de 20 (CDCl

, 400 MHz)

OCH

3,84

130,8

130,0

114,0

160,0

5,99

5,98

2,79

5,36

7,38

6,95

12,1

6,95

164,2

79,7

97,2

96,0

56,0

164,5

44,0

Resultados e Discussões

115

FIGURA 4.58 – Mapa de contorno de HSQC de 20 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

116

TABELA 4.15 – Dados de RMN

H e RMN

C das flavanonas 19 e 20

H/C 19

(CDCl

200MHz)

(CDCl

50MHz)

PELTER

et al.,

1976

(CDCl

, 50MHz)

VASCONCELOS,

et al., 1998

(CDCl

50MHz)

VASCONCELOS,

et al., 1998

2 5,48 (dd, J =

3,2 e 13,0

Hz)

79,6 79,5 5,37 (dd, J = 3,0 e

13,0 Hz)

5,36 (dd, J = 3,1 e

13,0 Hz)

79,7 78,9

3a 2,91 (dd, J =

3,2 e 16,8

Hz)

44,6 44,6 3,10 (dd, J = 13,0 e

17,1 Hz)

3,10 (dd, J = 13,5

e 17,2 Hz)

44,0 43,1

3b 2,09 (

dd, J =

16,9 e 13,0

Hz)

44,6 44,6 2,78 (

dd, J = 3,0 e

17,1 Hz)

2,79 (dd, J = 3,5 e

17,2 Hz)

44,0 43,1

4 - 191,9 191,6 - - 195,6 196,1

5 7,93 (

dd, J =

1,6 e 8,0 Hz)

127,0 126,9 - - 164,2 164,3

6 7,46 (

m) 121,6 121,5 5,99 (sl) 6,00 (d, J = 2,3

Hz)

96,0 96,7

7 7,06 (

ddd, J

= 1,6, 7,0 e

8,6 Hz)

136,1 136,0 - - 164,5 164,9

8 7,52 (

dd, J =

1,7 e 8,6 Hz)

118,1 118,0 5,98 (sl) 5,98 (d, J = 2,3

Hz)

97,2 95,5

9 - 161,5 161,3 - - 163,9 163,2

10 - 120,9 120,8 - - 103,1 103,0

1’ - 138,7 138,6 - - 130,8 130,3

2’ 7,50 (

m) 126,1 126,0 7,38 (d, J = 8,8 Hz) 7,38 (d, J = 8,7

Hz)

130,0 127,7

3’ 7,40 (

m) 128,8 128,7 6,96 (d, J = 8,8 Hz) 6,95 (d, J = 8,7

Hz)

114,0 114,2

4’ 7,35 (

m) 128,0 128,0 - - 160,0 160,0

5’ 7,40 (

m) 128,8 128,7 6,96 (d, J = 8,8 Hz) 6,95 (d, J = 8,7

Hz)

114,0 114,2

6’ 7,50 (

m) 126,1 126,0 7,38 (d, J = 8,8 Hz) 7,38 (d, J = 8,7

Hz)

130,0 127,7

4’-OCH

- - - 3,84 (s) 3,84 (s) 56,0 55,4

Resultados e Discussões

117

TABELA 4.16 – Dados de HSQC e HMBC para a flavanona 20

H 20

e J

2 5,37 79,7 -

3a 3,10 44,0 195,6

3b 2,78 44,0 79,7

4-OMe 3,84 56,0 160,0

5-OH 12,1 - 97,2, 103,8 e 164,5

6 5,99 96,0 -

8 5,98 97,2 -

3’ e 5’ 6,96 114,0 130,8

2’ e 6’ 7,38 130,0 79,7, 130,0 e 160,0

O flavonóide 21 apresentou no espectro de RMN

H (FIGURA 4.59)

dois dubletos com constante de acoplamento meta (J = 2,3 Hz) em

6,57 e

6,40, indicando um anel A tetrasubstituído e esses deslocamentos foram

atribuídos aos hidrogênios H-8 e H-6, sendo H-6 o mais blindado devido ao

efeito de blindagem exercido pelos substituintes em C-5 e C-7.

O anel B pode ser caracterizado pelo singleto em

7,08 (2H),

correspondente aos hidrogênios H-6’ e H-2’, cuja equivalência é ocasionada

pela livre rotação deste anel. A presença de um singleto em

6,63, sinal

característico do hidrogênio H-3 em flavonas, e cinco metoxilas na região entre

3,92 e

3,97, indicam que, possivelmente trata-se de uma flavona

pentametoxilada.

No espectro de RMN

C de 21 (FIGURA 4.60) notou-se a presença

de cinco carbonos metílicos, cinco carbonos metínicos em

56,2,

56,4 (3C) e

61,0; um carbono carbonílico em

177,4 e quatorze carbonos aromáticos,

sendo oito deles totalmente substituído.

A análise do conjunto de dados em comparação com a literatura

(FRASER & LEWIS, 1974) indicaram ser a flavona 21 a 5,7,3’,4’,5’-

pentametóxiflavona (TABELA 4.17).

Resultados e Discussões

118

FIGURA 4.59 – Espectro de RMN

H do flavonóide 21 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.60 – Espectro de RMN

C do flavonóide 21 (CDCl

, 50MHz)

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

16.142.00 1.000.99

TMS

7.2645

7.0842

6.6330

6.5805

6.5689

6.4037

6.3921

3.9725

3.9569

3.9336

3.9228

7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2

2.00 1.000.990.99

7.2645

7.0842

6.6330

6.5805

6.5689

6.4037

6.3921

4.35 4.30 4.25 4.20 4.15 4.10 4.05 4. 00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3. 60 3.55 3.50

15.00

3.9725

3.9569

3.9336

3.9228

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60

Chloroform-d

177.4

164.0

160.8

160.4

159.8

153.6

140.8

127.0

109.3

108.9

103.6

96.2

92.9

61.0

56.4

Resultados e Discussões

119

TABELA 4.17 – Dados de RMN

H da flavona 21

H/C 21

(CDCl

, 200 MHz)

FRASER &

LEWIS, 1974

(CDCl

, 50 MHz)

FRASER &

LEWIS, 1974

2 - - 160,4 160,5

3 6,63 (s) 6,62 (s) 108,9 108,9

4 - - 177,4 177,5

5 - - 160,8 161,0

6 6,40 (d, J = 2,3Hz) 6,39 (d, J = 2,3Hz) 96,2 96,2

7 - - 164,0 164,1

8 6,57 (d, J = 2,3Hz) 6,57(d, J = 2,3Hz) 92,9 92,9

9 - - 159,8 159,9

10 - - 109,3 109,3

1’ - - 127,0 126,8

2’ 7,08 (s) 7,09 (s) 103,6 103,5

3’ - - 153,6 153,6

4’ - - 140,8 140,9

5’ - - 153,6 153,6

6’ 7,08 (s) 7,09 (s) 103,6 103,5

OCH

3,92 (s) 3,92 (s) 56,4 55,8

OCH

3,93 (s) 3,93 (s) 56,4 56,4

OCH

3,96 (s) 3,95 (s) 56,4 56,4

OCH

3,96 (s) 3,95 (s) 56,4 56,4

4’-OCH

3,97 (s) 3,96 (s) 61,0 61,0

4.5.2 – Determinação estrutural da substância 22

A substância 22 foi isolada da fração hexânica do extrato

metanólico do caule de H. puberula (p. 29). Através da análise de RMN de 1 e 2

D foi proposto um estilbeno, como sendo a substância 22.

O espectro de RMN

H de 22 (FIGURA 4.61) (TABELA 4.18)

apresentou sinais relativos a cinco hidrogênios na região aromática em

7,92 (s,

J = 1,4 Hz, 1H);

7,49 (d, J = 1,4 Hz, 1H);

7,43 (dd, J = 1,6 e 8,0 Hz, 1H);

7,34 (d, J = 1,6 Hz, 1H) e

6,89 (d, J = 8,0 Hz, 1H). Esses dados indicaram na

molécula dois anéis aromáticos, sendo um deles tetrasubstituído e o outro

Resultados e Discussões

120

trisubstituído, cujas correlações foram confirmadas no espectro de COSY

(FIGURA 4.62).

O sinal em

6,90 (s, 1H) correlacionou-se no mapa de contorno de

HSQC (FIGURA 4.64) com o carbono em

100,7, indicando que possivelmente

se tratava de um hidrogênio ligado a um carbono sp

. Observou-se ainda no

espectro de RMN de hidrogênio (FIGURA 4.61), um sinal em

6,03 (s, 2H)

característico de hidrogênios de carbono do grupo metilenodióxi e dois sinais de

hidrogênios de grupos metoxilicos em

4,08 e

3,95, sendo que este último

encontrava-se ligado ao carbono em

52,2, característico de carbono de

metoxila de grupo éster.

A análise do mapa de contorno de HSQC de 22 (FIGURA 4.64)

permitiu atribuir os valores de deslocamento químico dos carbonos ligados a

esses hidrogênios.

7,43

7,49

7,92

6,89

7,34

7,43

7,49

115,8

107,4

7,92

108,7

6,89

119,5

105,6

7,34

101,4

6,03

100,7

6,90

52,2

3,95

4,08

56,2

Resultados e Discussões

121

Através do espectro de RMN

C (FIGURA 4.63) pode-se observar

a presença de 18 carbonos, sendo um referente ao carbono do grupo

metilenodioxi

101,4, dois de grupos metílicos (

52,2 e 56,2), um carbono

carboxílico em

167,3, dois carbonos que através das correlações observadas no

mapa de contorno de HMBC (FIGURA 4.65) indicaram se tratar de carbonos

(

100,7 e

157,2) e doze carbonos aromáticos sendo seis deles totalmente

substituídos.

FIGURA 4.61 – Espectro de RMN

H de 22 (CDCl

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

122

FIGURA 4.62 – Espectro de COSY

H-

H de 22 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 4.63 – Espectro de RMN

C de 22 (CDCl

, 100 MHz)

Resultados e Discussões

123

FIGURA 4.64 – Mapa de contorno de HSQC de 22

(CDCl

, 400 MHz).

Através do mapa de contorno de HMBC (FIGURA 4.65) foi

possível fazer as correlações do sinal do hidrogênio em

6,89 com os sinais

124,0 e

148,3, que foram atribuídos aos carbonos C-1’ e C-3’,

respectivamente. O hidrogênio em

7,43 apresentou correlação com os

carbonos em

105,6;

148,2 e

157,2, atribuídos aos carbonos C-2’; C-4’ e C-

2. A correlação do hidrogênio em

7,34 com os carbonos em

119,5;

148,3 e

157,2 confirmaram a posição do carbono C-6’; C-4’ e C-2.

O carbono em

157,2 foi definido como sendo o carbono olefínico

C-2, devido o mesmo também estar correlacionando-se no mapa de contorno de

HMBC (FIGURA 4.65) com o hidrogênio em

6,90, estando dessa forma,

7,34

105,6

148,2

119,5

7,43

119,5

105,6

148,2

6,89

124,0

148,3

108,7

Resultados e Discussões

124

ligado ao C-1’. A correlação do hidrogênio em

6,03 com os carbonos em

148,3 e

148,3, indicaram o grupo metilenodióxi nas posições C-4’ e C-3’.

Ainda no mapa de contorno de HMBC (FIGURA 4.65), observou-

se a correlação do hidrogênio em

7,49 com os carbonos em

146,5 (C-9);

115,8 (C-5);

144,8 (C-8) e

167,3 (C-1’’’) e o sinal do hidrogênio em

7,92

com os carbonos em

100,7 (C-3);

107,4 (C-7);

146,5 (C-9) e

167, 3 (C-

1”’), sendo o sinal em

167,3 já atribuído para o carbono carboxílico do grupo

éster, indicando que possivelmente este seria o substituinte em C-6. A

correlação dos hidrogênios da metila em

4,08 com o carbono aromático em

144,8, permitiu que se definisse uma das metoxilas como sendo o substituinte da

posição C-8. A correlação do sinal do hidrogênio em

7,92 com o carbono em

100,7, fez com que fosse ligado as duas partes determinadas da molécula.

Possivelmente as posições C-9 e C-2 estariam ligadas através de um éter.

Unindo as partes identificadas da molécula, foi possível propor um

estilbeno, como sendo a substância 22.

6,90

7,34

7,43

157,2

6,03

148,2

148,3

7,49

107,4

146,5

OCH

167,3

115,8

7,92

146,5

107,4

OCH

1'''

Resultados e Discussões

125

FIGURA 4.65 – Mapa de contorno de HMBC de 22 (CDCl

, 400 MHz)

Flavonóides são heterosídeos com quinze carbonos em seu

esqueleto básico, sendo substâncias fenólicas do tipo C

-C

. Podendo ser

coloridos ou incolores e concentram-se mais na parte aérea das plantas,

ocorrendo em menor proporção nas raízes e rizomas.

Os flavonóides têm origem biossintética mista, ou seja, parte do seu

esqueleto deriva do caminho do acetato e a outra parte deriva do caminho do

chiquimato, mais precisamente do ácido p-cumarico.

No ESQUEMA 4.8, está representado uma proposta biogenética

para a formação dos flavonóides 19, 20 e 21 e para o estilbeno 22.

Resultados e Discussões

126

ESQUEMA 4.8: Proposta biogenética para a formação dos flavonóides 19 – 21

e para o estilbeno 22 (adaptado de DEWICK, 2001)

4-hidroxicinamoil-CoA

CoAS

SCoA

3 Malonil-CoA

NADH

flavanona

(19)

OCH

-H

SAM

[O]

OCH

[O]

OCH

SAM

OCH

5,7,3',4',5'-pentametóxiflavona

(21)

isosakuranetina

-H

3 Malonil-CoA

SCoA

resveratrol

CoAS

4-hidroxicinamoil-CoA

[O]

SAM

OCH

[O]

OCH

Resultados e Discussões

127

TABELA 4.18 – Dados de RMN

H e RMN

C de 22

H/C

C (δ) H (δ)

1’ 124,0 -

2’ 105,6 7,34 (d, 1H, J=1,6Hz)

3’ 148,3 -

4’ 148,2 -

5’ 108,7 6,89 (d, 1H, J=8,0 Hz)

6’ 119,5 7,43 (dd, 1H, J=8,0 e 1,6Hz)

2 157,2 -

3 100,7 6,90 (s, 1H)

4 130,7 -

5 115,8 7,92 (d, 1H, J=1,4 Hz)

6 126,0 7,49 (d, 1H, J=1,4Hz)

7 107,4 -

8 144,8 -

9 146,5 -

1’’’ 167,3 -

1” 101,4 6,03 (s, 2H)

5’-OMe 56,2 4,08 (s, 3H)

1’’’-OMe 52,2 3,95 (s, 3H)

TABELA 4.19 – Dados de HMBC J

, J

e J

de 22

H (δ) C (δ)

7,92 100,7; 107,4; 146,5 e 167,3

7,49 115,9; 144,8; 146,5 e 167,3

7,43 105,6; 148,2 e 157,2

7,34 119,5; 148,2 e 157,2

6,90 130,7; 146,5 e 157,2

6,89 124,0 e 148,2

6,03 148,2 e 148,3

4,08 144,8

3,95 167,3

Resultados e Discussões

128

4.6 – Cumarinas

Quando analisadas por CCDA e expostas à luz ultravioleta (254

nm), as cumarinas apresentam uma fluorescência azulada tornando uma forte

característica dessa classe de compostos.

As cumarinas apresentam características bastante comuns em seus

espectros de RMN

H, facilitando sua caracterização. Quando não estão

substituídas nas posições C-3 e C-4 apresentam dois dubletos em

aproximadamente 6,30 e 7,60

(J = 9,5 – 10 Hz), atribuídos aos hidrogênios H-

3 e H-4, característico de hidrogênios de ligação dupla cis conjugada com grupo

lactônico e com o anel aromático.

O hidrogênio H-4 encontra-se sempre mais desblindado que o H-3

devido à contribuição da estrutura de ressonância na qual se verifica uma

deficiência eletrônica sobre o carbono a que este se encontra ligado. Quando há

substituintes oxigenados na posição C-5, o sinal do dubleto correspondente ao

hidrogênio H-4, que normalmente aparece em 7,60

, encontra-se desblindado

acima de 8,00

. Este fato se deve ao efeito de anisotropia da ligação C-O da

posição C-5 e do efeito de compressão estérica.

Das cumarinas isoladas neste trabalho nenhuma apresentou

substituição em C-5.

Resultados e Discussões

129

4.6.1 – Identificação estrutural das cumarinas 23 – 27

As cumarinas 23-25 foram isoladas da fração diclorometânica do

extrato metanólico do caule de S. versicolor (p. 31) e as cumarinas 26 e 27 da

fração hexânica do extrato metanólico do caule de H. puberula (p. 29) e tiveram

suas caracterizações realizadas através de experimentos de RMN de 1, 2 D e

EM.

Na análise dos espectros de RMN

H de 23-25 (FIGURAS 4.66,

4.67 e 4.68) foi observado os sinais em

6,17 (J = 9,5 Hz) e

7,84 (J = 9,5 Hz)

que foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-3 e H-4 de um esqueleto

cumarínico.

A cumarina 23 apresentou também um dubleto em

7,44 (J = 8,5

Hz) que foi atribuído ao hidrogênio H-5 que acopla com uma constante grande

em orto com H-6; um duplo dubleto em

6,79 (J = 8,5 e 2,3 Hz) referente ao

hidrogênio H-6 que acopla em orto com H-5 e em meta com H-8 e um dubleto

6,70 (J = 2,3 Hz) referente ao hidrogênio H-8 que acopla com uma

constante pequena em meta com H-6. Esses dados sugeriram como sendo a

cumarina 23, uma cumarina simples sem substituições, denominada 7-

hidróxicumarina (TABELA 4.20). O espectro de massas da 7-hidróxicumarina

(FIGURA 4.69) confirmou a fórmula molecular C

através do pico do íon

OHO O

OCH

CO O

OOH

1''

3''

5''

2''

4''

23 24 25

26 27

Resultados e Discussões

130

molecular m/z 162 e possíveis fragmentações (ESQUEMA 4.9). Os dados de

RMN

H foram comparados com os dados da literatura (KONG et al., 1995).

No espectro de RMN

H da cumarina 24 (FIGURA 4.67) além dos

sinais dos hidrogênios olefínicos do esqueleto cumarínico referente aos

hidrogênios H-3 e H-4, foi observado um singleto em

6,85 integrando para

dois hidrogênios sugerindo a existência de dois hidrogênios aromáticos na

molécula que só poderiam ser atribuídos aos hidrogênios H-5 e H-8, por não

fazerem nenhum tipo de acoplamento entre si, indicando também que as

posições C-6 e C-7 estariam substituídas. Os sinais em

3,96 e

3,93,

integrando para três hidrogênios cada um, indicaram que possivelmente as

substituições das posições C-6 e C-7 seriam por grupos metoxilas.

O espectro de massas da cumarina 24 (FIGURA 4.70) observou-se

o pico do íon molecular m/z 206, o ESQUEMA 4.10, sugere possíveis

fragmentações para essa cumarina, que juntamente com os dados da literatura

(MAFEZOLI, 2001) confirmaram a estrutura proposta como sendo a 6,7-

dimetóxicumarina (C

) (TABELA 4.20).

O espectro de RMN

H da cumarina 25 (FIGURA 4.68) mostrou-se

bem característico de cumarinas simples, apresentando dois dubletos em

6,20

(d, J = 9,4 Hz) e

7,85 (d, J = 9,4 Hz) referentes aos hidrogênios da dupla

ligação conjugada a carbonila lactônica H-3 e H-4, respectivamente. A presença

de um singleto em

6,90 foi atribuída ao hidrogênio H-5, indicando que o anel

aromático encontra-se substituído nas posições C-6, C-7 e C-8. Os singletos em

3,95 e

3,90, típicos de metoxilas, sugeriram serem estas, juntamente com um

grupo hidroxila, os substituintes do anel aromático.

O espectro de massas da cumarina 25 (FIGURA 4.71) exibiu o pico

do íon molecular m/z 222, confirmando os substituintes propostos para a

estrutura de 23. O pico em m/z 207 [M-15], cuja intensidade é de 18 %, sugere

que na posição 6, provavelmente se encontra o grupo hidroxila, pois se nessa

posição houvesse uma metoxila, este pico apresentaria intensidade maior, uma

Resultados e Discussões

131

vez que seria estabilizado pelo oxigênio do anel lactônico, e isso não é

observado no espectro (ESQUEMA 4.11). Esses dados juntamente com a

medida do ponto de fusão de 25 (pf = 191 ºC), permitiram identificar a cumarina

25 como sendo a arscontina, diferenciando-a dos seus isômeros isofraxidina (pf

= 148-149 ºC) e isofraxidina (pf = 196-197 ºC) (AHLUWALIA et al., 1978)

(TABELA 4.20).

FIGURA 4.66 – Espectro de RMN

H da cumarina 23 (CH

OD, 200MHz)

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

Methanol-d4

7.8641

7.8165

7.4664

7.4239

6.8110

6.7994

6.7683

6.7569

6.7085

6.6977

6.1967

6.1494

5.4778

OCH

CO O O

CO O

OCH

OH O

Arscontina Isofraxidina Fraxidina

Resultados e Discussões

132

FIGURA 4.67 – Espectro de RMN

H da cumarina 24 (CDCl

, 200MHz)

FIGURA 4.68 – Espectro de RMN

H da cumarina 25 (CH

OD, 200MHz)

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

6.092.191.36 1.00

Chloroform-d

3.9326

3.9626

6.2772

6.3245

6.8639

7.6088

7.6561

Resultados e Discussões

133

FIGURA 4.69 – Espectro de massas (ESI = 70 eV) da cumarina 23

ESQUEMA 4.9: Proposta de fragmentação da cumarina 23

FIGURA 4.70 – Espectro de massas (ESI = 70 eV)

da cumarina 24

ESQUEMA 4.10: Proposta de fragmentação da cumarina 24

OOHO

m/z 162

CHO

m/z 134

m/z 105

m/z 191

m/z 206

m/z 163

m/z 148

m/z 135

m/z 120

m/z 92

Resultados e Discussões

134

FIGURA 4.71 – Espectro de massas (ESI = 70 eV)

da cumarina 25

ESQUEMA 4.11: Proposta de fragmentação para a cumarina 25

TABELA 4.20 – Dados de RMN

H das cumarinas 23-25

(CH

OD, 200 MHz)

KONG et al., 1996

(DMSO, 400 MHz)

(CDCl

, 200 MHz)

MAFEZOLI, 2001

(CDCl

, 200 MHz)

(CH

OD, 200

MHz)

AHLUWALIA

., 1978

3 6,17 (d, J = 9,5 Hz) 6,10 (d, J = 9,5 Hz) 6,30 (d, J = 9,5 Hz) 6,30 (d, J = 9,5 Hz) 6,20 (d, J = 9,4

Hz)

6,19 (d, J = 9,5 Hz)

4 7,84 (d, J = 9,5 Hz) 7,79 (d, J = 9,5 Hz) 7,60 (d, J = 9,5 Hz) 7,63 (d, J = 9,5 Hz) 7,85 (d, J = 9,4

Hz)

7,84 (d, J = 9,5 Hz)

5 7,44 (

d, J = 8,5 Hz) 7,42 (d, J = 8,4 Hz) 6,86 (s) 6,86 (s) 6,90 (s) 6,90 (s)

6 6,79 (

dd, J = 8,5 e

2,3 Hz)

6,77 (dd, J = 8,4 e

2,2 Hz)

- - - -

8 6,70 (

d, J = 2.3 Hz) 6,71 (d, J = 2,2 Hz) 6,86 (s) 6,85 (s) - -

6-OCH

- - 3,95 (s) 3,96(s) - -

7-OCH

- - 3,93 (s) 3,93 (s) 3,95 (s) 3,94 (s)

8-OCH

- - - - 3,90 (s) 3,90 (s)

OCH

CO O

OCH

m/z 222 (46,5%)

m/z 207 (18,5%)

m/z 194 (14,1%)

OCH

m/z 179 (19,4%)

Resultados e Discussões

135

No espectro de RMN

H da cumarina 26 (FIGURA 4.72) não foram

observados os dubletos correspondentes aos hidrogênios olefínicos H-3 e H-4 do

esqueleto cumarínico. O singleto em

7,49 (s, 1H) foi atribuído ao hidrogênio

H-4, indicando uma substituição na posição C-3, que foi confirmada pela

presença dos sinais em

1,47 (s, 6H), do duplo dubleto em

5,06 (dd, 2H, J =

11,0 e 17,1 Hz) e do sinal em

6,18 (dd,1H, J = 11,0 e 17,1 Hz) que juntamente

com os dados de COSY (FIGURA 4.73) e HMBC (FIGURA 4.74) pode-se

observar a correlação do sinal em

5,06 com os sinais em

40,4 e

145,1,

referentes aos carbonos C-1’ e C-2’, respectivamente. Observou-se também a

correlação do hidrogênio em

6,18 com os carbonos metílicos C-5’ e C-6’ (

26,0) e com o carbono C-1’(

40,4) e dos hidrogênios metílicos em

1,48 com

os sinais em

132,0,

40,4 e

145,1, atribuídos aos carbonos C-3, C-1’ e C-2’

respectivamente, confirmando ser uma prenila rearranjada o substituinte em C-3.

A correlação do sinal de hidrogênio em 7,49

com os dos carbonos

111,8,

40,4,

148,8 e

160,2, atribuídos aos carbonos C-5, C-1’, C-8a e

C-2, confirmaram este hidrogênio na posição C-4.

A correlação do sinal em

3,91 referente a metoxila, com o sinal

149,3 indicaram que possivelmente a metoxila encontrava-se em C-7.

Esses dados, associados com o espectro de massas (FIGURA 4.75) onde foi

observado o pico do íon molecular m/z 260, indicaram ser a hidroxila o outro

6,18

26,0

145,1

40,4

5,06

132,0

26,0

132,0

40,4

145,1

1,48

Resultados e Discussões

136

substituinte. A presença do pico m/z 245 com intensidade relativa de 33 %,

indicam que o grupo hidroxila se encontra em C-6 e reafirmaram a metoxila na

posição C-7, pois caso contrário, esse pico apresentaria intensidade acima de 50

%, pois estaria estabilizando por ressonância o íon obtido ESQUEMA 4.12.

Os singletos em

6,86 (s, 1H) e

6,83 (s, 1H) foram atribuídos aos

hidrogênios H-8 e H-5, através das correlações observadas no mapa de contorno

de HMBC (FIGURA 4.73).

No espectro de RMN

C, (FIGURA 4.76) pode-se observar a

presença dos sinais em

40,4,

145,1,

111,8 e

26,0 referentes aos carbonos

do grupo prenila C-1’, C-2’, C-3’, C-4’ e C-5’, respectivamente.

Através dos espectros de HMBC e HSQC (FIGURA 4.74 e 4.77)

pode-se atribuir os valores de deslocamento químicos de todos os carbonos da

substância 26, sendo esta identificada como sendo a cumarina 3-(1’, 1’-

dimetilalil)-isoescopoletina.

6,83

6,86

5,06

6,18

7,49

1,48

3,91

1,48

5,06

132,0112,0

102,4

137,7

160,2

149,3

111,8

145,6

148,8

145,1

26,0

111,8

40,4

Resultados e Discussões

137

FIGURA 4.72 – Espectro de RMN

H da cumarina 26 (CDCl

, 400MHz).

FIGURA 4.73 – Mapa de contorno do experimento de COSY de 26 (CDCl

400MHz)

Resultados e Discussões

138

FIGURA 4.74 – Mapa de contorno de HMBC da cumarina 26 (CDCl

400MHz)

FIGURA 4.75 – Espectro de massas (ESI = 70 eV)

da cumarina 26

Resultados e Discussões

139

ESQUEMA 4.12: Proposta de fragmentação para a cumarina 26

FIGURA 4.76 – Espectro de RMN

C da cumarina 26 (CDCl

, 40MHz)

m/z 245 (33%)

OOO

m/z 69 (100%)

m/z 260 (26,5%)

OOO

m/z 217 (65%)

Resultados e Discussões

140

FIGURA 4.77 – Mapa de contorno de HSQC da cumarina 26 (CDCl

, 400MHz)

O espectro de RMN

H da substância 27 (FIGURA 4.78) apresentou

sinais similares aos relatados anteriormente para a cumarina 26, ou seja, um

sinal em

7,46 (s, 1H) referente ao hidrogênio H-4; um conjunto de sinais em

1,46 (s, 6H),

5,07 (dd, J = 11,0 e 17,1 Hz, 2H) e do sinal em

6,22 (dd, J =

11,0 e 17,1 Hz, 1H) correspondente aos hidrogênios H-4’/H-5’, H-2’ e H-3’

correspondentes ao grupo prenila, quando esta se encontra rearranjada e os

singletos em

6,71 e

6,15, dos hidrogênios H-5 e H-8, respectivamente e o

sinal em

3,91 (s, 3H), referente a uma metoxila.

Pode-se observar ainda no espectro de RMN

H a presença de um

tripleto largo

3,55 (tl, 2H) que mostrou correlação no espectro de HMBC

(FIGURA 4.79) com os sinais em

115,5;

120,9;

132,9 e

143,6 referentes

aos carbonos C-6, C-2”, C-3” e C-7, respectivamente, sendo este sinal atribuído

Resultados e Discussões

141

ao hidrogênio H-1”. Os singletos em

1,85 e

1,68 são característicos de

metilas, quando estas se encontram ligadas a carbono olefínico. Estes sinais

mostraram correlações com os carbonos em

120,9 (C-2”) e

132,9 (C-3”) no

espectro de HMBC, sendo que a metila em

1,85 correlacionou-se também com

o sinal em

22,2 (C-1”). Esses dados indicaram se tratar de um grupo prenila

que de acordo com as correlações observadas no espectro de HMBC, estaria na

posição C-6. A correlação do sinal em

3,91 com o carbono em

143,6 (C-7)

confirmaram as posições dos substituintes da cumarina 27.

Através do espectro de HMBC, HSQC e RMN

C (FIGURA 4.79,

4.80 e 4.81) foi possível atribuir todos os valores dos carbonos e hidrogênios. Os

dados de RMN

C foram comparados com a literatura (BERGENTHAL et al.,

1978) confirmando a proposta estrutural. No espectro de massas da cumarina 27

(FIGURA 4.82), pode-se observar o pico do íon molecular em m/z 312

confirmando a estrutura proposta para cumarina 27 (ESQUEMA 4.13).

OOH

7,47

1,85

3,55

5,28

1,68

1,46

3,91

6,22

5,07

1,46

6,15

6,71

147,5

115,5

145,8

105,1

22,2

145,8

138,7

143,6

111,7

40,3

160,2

131,7

146,5

26,0

132,9

56,3

120,9

17,9

25,8

Resultados e Discussões

142

FIGURA 4.78 – Espectro de RMN

H da cumarina 27 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 4.79 – Mapa de contorno de HMBC da cumarina 27 (CDCl

, 400

MHz)

Resultados e Discussões

143

FIGURA 4.80 – Mapa de contorno de HSQC da cumarina 27 (CDCl

, 400

MHz)

FIGURA 4.81 – Espectro de RMN

C da cumarina 27 (CDCl

, 40 MHz)

Resultados e Discussões

144

FIGURA 4.82 – Espectro de massas (ESI = 70 eV)

da cumarina 27

ESQUEMA 4.13: Proposta de fragmentação para a cumarina 27

OOH

m/z 312

OOH

=CH

m/z 285

OOH

m/z 285

OOH

m/z 285

m/z 257

m/z 229

Resultados e Discussões

145

TABELA 4.21 – Dados de RMN

H e RMN

C das cumarinas 26 e 27

H/C

(CDC

, 400MHz)

(CDC

, 50MHz)

(CDC

, 400MHz)

(CDC

, 50MHz)

Lit

2 - 160,2 - 160,2 160,2

3 - 132,0 - 131,7 131,5

4 7,49 (

s) 137,7 7,47 (s) 138,7 137,9

4a - 145,6 - 145,5 145,7

5 6,83 (

s) 111,8 6,71 (s) 105,1 105,3

6 - 112,0 - 115,5 115,7

7 - 149,3 - 143,6 143,6

8 6,86 (

s) 102,4 6,15 (s) 146,5 146,5

8a - 148,8 - 147,5 147,7

1’ - 40,4 - 40,3 40,4

2’ 6,18 (2H,

dd, J = 11,0

e 17,1 Hz)

145,1 6,22 (1H, dd, J = 11,0 e

17,1 Hz)

145,8 145,8

3’ 5,06 (2H,

dd, J = 11,0 e

17,1 Hz)

111,8 5,07 (2H, dd, J = 11,0 e

17,1 Hz)

111,9 111,9

4’ 1,48 (3H,

s) 26,0 1,46 (3H, s) 26,0 26,2

5’ 1,48 (3H,

s) 26,0 1,46 (3H, s) 26,0 26,2

1’’ - - 3,55 (2H,

d, J = 7,0 Hz) 22,2 21,8

2’’ - - 5,27 (1H,

t, J = 7,0 Hz) 120,9 121,0

3’’ - - - 132,9 133,0

4’’ - - 1,85 (3H,

s) 17,9 17,7

5’’ - - 1,68 (3H,

s) 25,8 25,8

Lit

: BERGENTHAL et al., 1978

TABELA 4.22 – Dados de HSQC e HMBC para as cumarinas 26 e 27

H/C 26 H 26 C J

26 C J

e J

27 H 27 C J

27 C J

e J

4 7,49 137,7 40,4, 111,8, 148,8 e 160,2 7,47 138,7 40,3, 105,1, 147,5 e 160,2

5 6,83 102,4 137,7 e 149,3 6,71 105,1 138,7, 143,6, 145,5 e 147,5

8 6,86 111,8 145,6 e 112,1 6,15 146,5 143,6 e 145,8

2’ 6,16 145,1 26,0 e 40,4 6,22 145,8 -

3’ 5,05 111,8 40,4 e 145,1 5,07 111,9 40,3

4’ 1,46 26,0 40,4, 26,0, 132,0 e 145,1 1,48 26,0 131,7 e 145,8

5’ 1,46 26,0 40,4, 26,0, 132,0 e 145,1 1,48 26,0 131,8 e 145,8

1’’ - - - 3,55 22,2 115,4, 120,9, 132,9 e 145,0

2’’ - - - 5,27 120,9 -

4’’ - - - 1,85 17,9 120,9 e 132,9

5’’ - - - 1,67 25,8 120,9 e 132,9

Resultados e Discussões

146

As cumarinas são substâncias de ampla ocorrência na ordem

Rutales. Geralmente as cumarinas desta ordem são oxigenadas na posição C-7 e

têm sua origem no ácido trans-p-cumárico que através de diversas

transformações leva à formação da 7-hidróxicumarina, que vem a ser a estrutura

mais simples das cumarinas. No ESQUEMA 4.14, está representada uma

proposta biogenética para formação das cumarinas isoladas.

ESQUEMA 4.14: Proposta biogenética para as cumarinas 23-27 (adaptada de

DEWICK, 2001)

Glicosilação

ácido cinâmico

ácido p-cinâmico

GliO

isomerização da

dupla ligação

GliO O

Gli

OPP

OOO

OOHO

[O]

GliO OH

Glicosilação

GliO O Gli

OOGliO

7-hidroxicumarina

(23)

OOHO

OOO

[O]

OOH

6,7-dimetoxicumarina

(24)

SAM

OOH

OCH

OOHO

[O]

OOHO

[O]

6-hidróxi-7,8-dimetoxicumarina

(25)

SAM

OOH

3-(1',1'-dimetilalil)-isoescopoleti

(26)

SAM

OOHO

OPP

OOHO

SAM

OOHO

metiletergraveliferona

(27)

Resultados e Discussões

147

4.7 – Quassinóides

Os quassinóides são considerados triterpenóides degradados devido

a sua biossíntese que apresenta como precursor os triterpenos tirucalol e eufol

que sofrem degradações oxidativas que levam a formação destas substâncias.

Várias evidências, além de experimentos com o precursor mevalonato marcado,

comprovam a sua biogênese (MORON e POLONSKY, 1968).

Podendo ser divididos em grupos de acordo com os seus esqueletos

básicos (FIGURA 4.83), a grande maioria dos quassinóides são substâncias C

tendo o esqueleto básico o esqueleto a. O anel A em quassinóides pode

apresentar estruturas variadas (FIGURA 4.84), sendo as estruturas V, VI e VII

as mais raras. O anel C pode possuir em C-8 uma metila ou um grupo

hidroximetil (C-30) que forma uma ponte éter com C-11 ou C-13. O anel D

pode ter uma hidroxila em C-15 que geralmente é esterificada com vários ácidos

graxos pequenos.

a(C

) b (C

) c(C

)

d (C

) e (C

)

FIGURA 4.83 – Esqueletos básicos de quassinóides.

Resultados e Discussões

148

FIGURA 4.84 – Tipos de estruturas do anel A.

O anel B e D, podem ser caracterizados pela funcionalização no

carbono C-15, determinada pelo deslocamento químico de C-16, ou seja, se C-

16 for aproximadamente

173 é um grande indício que exista um grupo

hidroxila livre no C-15; quando a hidroxila se encontra esterificada, o sinal para

C-16 é de aproximadamente em

167 devido ao efeito γ. A configuração

para

os substituintes em C-15 foi estabelecida com base na constante de acoplamento

na faixa de 10-14 Hz, resultante do acoplamento de H-14 com H-15, em

aproximadamente

5,0 para hidroxilas livres e

5,9 quando a hidroxila se

encontra esterificada.

A configuração

para o oxigênio em C-7 foi determinada com base

no sinal do próton carbinólico H-7 que aparece como um tripleto com constante

de 2,0 Hz, indicando ângulos de 30º com os hidrogênios na posição C-6.

I II III IV

V VI VII

Resultados e Discussões

149

4.7.1 – Identificação estrutural do quassinóide 28

O quassinóide 28 foi isolado do caule da fração diclorometânica do

extrato metanólico de S. versicolor (p. 31) e foi identificado através de RMN de

1 e 2D.

(28)

O tipo a para o anel A do quassinóide 28 foi identificado pelos

deslocamentos químicos, característicos dos carbonos C-1, C-2, C-3 e C-4 que

foram os sinais em

80,4,

197,4,

126,1 e

162,5, respectivamente, no

espectro de RMN

C de 28 (FIGURA 4.85).

A indicação que o grupo metila C-30 no esqueleto do quassinóide

sofreu uma oxidação para formar um anel tetraidrofurâno no carbono C-11 ou

C-13, pôde ser constatada pela presença de dois dubletos bastante característico

no espectro de RMN

H (FIGURA 4.86) referentes aos hidrogênios H-30a e H-

30b, em aproximadamente

4,15 e

3,89, com J = 8,0 Hz (TABELA 4.23).

O espectro de RMN

C mostrou a presença de vinte sinais de

carbono, indicando um esqueleto do tipo C

(TABELA 4.24).

A formação do anel tetraidrofurano do tipo C-30-O-C11 com

formação do hemicetal em C-11 pôde ser caracterizado pela presença do sinal

110,9, relativo ao carbono C-11, pois caso contrário, quando o anel é do

tipo C-30-O-C-13, apareceria um sinal de carbono quaternário em

aproximadamente

80,0, e o sinal em

110,0 não apareceria.

No espectro de COSY 45º (FIGURA 4.87) a correlação do

hidrogênio

3,89 com

4,15 e

2,73, referentes aos H-30b e H-13; juntamente

10 15

Resultados e Discussões

150

com o singleto em

3,34 correspondente a H-9, reforçam a proposta para o anel

tetraidrofurânico formado pela ponte C-30-O-C-11 (TABELA 4.25).

A funcionalização e a configuração

de C-15 foram determinadas

pelo deslocamento de C-16 em

174,1 juntamente com o sinal em

5,51

dubleto com J = 11,0 Hz, referente ao acoplamento axial-axial do hidrogênio H-

15 com o H-14.

Aparecem ainda no espectro de RMN

H, dois singletos em

1,58 e

1,76 referentes as metilas em 19 e 29 respectivamente, e um dubleto largo em

1,73 referente a metila 18. As correlações dos hidrogênios e carbonos foram

feitas através de experimentos de HSQC e HMBC (FIGURAS 4.88 e 4.89,

TABELAS 4.26 e 4.27).

FIGURA 4.85 – Espectro de RMN

C de 28 (Pyr-d

, 50 MHz)

80,5

110,9

47,5

45,8

45,6

78,2

26,7

42,4

162,5

126,1

197,4

49,7

68,0

33,0

84,5 16,3

174,2

22,3

10,7

71,5

4,34

2,73

5,51

1,73

1,58

3,89

4,15

2,19

2,03

3,15

4,13

6,10

4,71

1,76

3,34

2,37

Resultados e Discussões

151

FIGURA 4.86 – Espectro de RMN

H de 28 (Pyr-d

, 400 MHz)

FIGURA 4.87 – Espectro de COSY

H-

H de 28 (Pyr-d

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

152

FIGURA 4.88 – Mapa de contorno de HSQC de 28 (Pyr-d

, 400 MHz)

FIGURA 4.89 – Mapa de contorno de HMBC de 28 (Pyr-d

, 400 MHz)

Resultados e Discussões

153

TABELA 4.23 – Dados de RMN

H de 28

(Pyr-d

, 400MHz)

VIEIRA, 1995

(CDCl

, 200MHz)

1 4,13 (s, 1H) 4,10 (s)

3 6,10 (m) 6,17 (s)

5 3,15 (

dl, J = 12Hz) 2,88 (dl)

6a 2,19 (

dt) 2,29 (m)

6b 2,03 (

tl, J = 2,9 Hz) 1,96 (m)

7 4,71 (

t) 4,56(sl)

9 3,34 (

s) 2,70 (s)

12 4,34 (

s) 3,60 (dl)

13 2,73 (

m) 2,46 (m)

14 2,37 (

dd,J = 6,3 e 11,0 Hz) -

15 5,51(

d, J = 11,0 Hz) 4,66 (d)

18-OCH

1,73 (dl) 1,28

19-OCH

1,58 (s) 1,20

29-OCH

1,76 (s) 2,03

30a 3,89 (

d, J = 8,0 Hz) 3,71(d, J = 8,8 Hz)

30b 4,15 (

d, J = 8,0 Hz) 3,94 (d, J = 8,8 Hz)

TABELA 4.24 – Dados de RMN

C de 28

(Pyr-d

, 50MHz)

VIEIRA, 1995

(CDCl

, 100MHz)

1 80,5 83,1

2 197,4 196,2

3 126,1 124,4

4 162,5 164,4

5 42,4 45,0

6 26,7 25,5

7 78,2 78,1

8 45,6 46,9

9 45,8 41,8

10 47,5 45,1

11 110,9 109,1

12 84,5 79,4

13 33,0 31,7

14 49,7 47,9

15 68,0 66,5

16 174,2 173,7

18 16,3 14,9

19 10,7 9,9

29 22,3 22,9

30 71,5 71,2

Resultados e Discussões

154

TABELA 4.25 – Dados de COSY

H-

H de 28

1 6,10

3 4,13

5 2,03 e 6,10

6a 2,03 e 4,70

6b 2,19 e 3,15

7 2,19

9 ---

12 ---

13 2,37 e 4,13

14 2,73 e 5,51

15 2,37

18-OCH

2,73

19-OCH

---

29-OCH

6,10

30a 4,15 e 2,73

30b 3,89

TABELA 4.26 – Correlações de

H –

C a J

de 28 observadas no experimento

de HSQC

HSQC

H (

δ) C (δ)

1 4,13 80,5

3 6,10 126,1

5 3,15 42,4

6a 2,19 26,3

6b 2,03 26,3

7 4,70 78,2

9 3,34 45,6

12 4,34 84,5

13 2,73 33,0

14 2,37 49,7

15 5,51 68,0

18 1,73 16,3

19 1,58 10,7

29 1,76 22,3

30a 3,89 71,5

30b 4,15 71,5

Resultados e Discussões

155

TABELA 4.27 – Correlações de

H –

C a J

, J

e J

de 28 observadas no

experimento de HSQC

HMBC

H (

δ) C (δ)

1 4,13 42,4 e 126,1

3 6,10 22,3, 42,4 e 80,5

5 3,15 26,3, 10,7 e 45,8

6a 2,19 45,6 e 78,2

6b 2,03 42,4 e 45,6

7 4,70 42,4 e 45,6

9 3,34 10,7, 45,6, 71,5, e 84,5

12 4,34 16,3 e 45,8

13 2,73 16,3 e 68,0

14 2,37 33,0, 45,8 e 78,2

15 5,51 33,0 e 49,7

18 1,73 33,0 e 49,7

19 1,58 47,5 e 80,5

29 1,76 42,4

30a 3,89 49,7

30b 4,15 49,7 e 78,2

4.7.2 – Identificação do quassinóide 29

O quassinóide 29 foi obtido da fração diclorometânica do extrato

metanólico do caule de S. versicolor (p. 35). Sua identificação estrutural foi

realizada através de RMN

1 e 2 D e espectroscopia de massas.

(29)

No espectro de RMN

C (FIGURA 4.90) a presença dos sinais em

84,9,

198,0,

126,7 e

163,0, referentes aos C-1, C-2, C-3 e C-4

10 15

Resultados e Discussões

156

respectivamente, conferem o tipo a para o anel A do quassinóide 29 conforme

discutido anteriormente para o quassinóide 2.

Os dois dubletos em

3,9 e

4,20 (d, J = 8,8 Hz) (FIGURA 4.91)

são característicos dos hidrogênios H-30a e H-30b, quando a metila C-30 sofre

oxidação resultando na formação de um éter. A presença do sinal em

111,2

referente a um carbono carbinólico indica que o éter formado é do tipo C-30-O-

C-11, ou seja, a formação do hemicetal ocorre no C-11, caracterizando o anel C.

FIGURA 4.90 – Espectro de RMN

C do quassinóide 29 (Pyr-d

50MHz)

Resultados e Discussões

157

FIGURA 4.91 – Espectro de RMN

H do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)

Através do experimento de COSY H

-H

(FIGURA 4.92) pôde-se

observar os acoplamentos do sinal em

1,27 (H-4’) em com os sinais em

2,05

2,20 referentes aos hidrogênios H-3’a e H-3’b respectivamente. Observou-se

ainda, o acoplamento do hidrogênio em

2,05 com o hidrogênio em

3,10 e o

sinal do hidrogênio em

2,20 acoplando com o sinal em

4,86. Os sinais, tanto

2,05 quanto em

2,20 integram para 2H cada um, conclui-se que os H-6a e

H-6b possuem os mesmos deslocamentos químicos que H-3’a e H-3’b. Esses

dados foram confirmados através do mapa de contorno de HSQC (FIGURA

4.93) onde foi observado a correlação dos hidrogênios H-3’a e H-3’b com o

carbono

38,4 e H-6a e H-6b com o carbono em

26,4.

10 15

Resultados e Discussões

158

FIGURA 4.92 –

Espectro de COSY H

-H

do quassinóide 29 (Pyr-d

, 400MHz)

FIGURA 4.93 – Mapa de contorno de HSQC do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)

A análise do mapa de contorno do espectro de HSQC (FIGURA

4.94) em conjunto com os dados observados no mapa de contorno do espectro

Resultados e Discussões

159

de HMBC (FIGURA 4.95) e dados da literatura (WATERMAN et al., 1984),

permitiu que fossem atribuídos os deslocamentos químicos de todos os carbonos

e hidrogênios do quassinóide 29 (TABELAS 4.28, 4.29 e 4.30).

O espectro de massas de 29 (FIGURA 4.96) obtido por electrospray

modo negativo, mostrou os picos em m/z 493,5, 375,4, 345,4, 301,4 e 117,2,

cujas fragmentações foi proposta no ESQUEMA 4.15, confirmando ser a

glaucarubinona a substância 29.

FIGURA 4.94 – Mapa de contorno de HSQC do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz)

176,0

126,7

41,1

46,0

33,3

42,7

71,5

80,5

111,2

42,7

163,0

198,0

11,3

16,3

84,9

22,9

168,7

26,4

48,6

80,3

34,4

8,9

26,5

75,8

2,20

4,86

3,40

1,45

2,05 2,20

6,60

6,11

1,57

4,05

2,05

1,74

3,10

2,60

1,27

1,40

2,60

4,21

3,90

4,20

Resultados e Discussões

160

FIGURA 4.95 – Mapa de contorno de HMBC do quassinóide 29 (Pyr-d

400MHz).

Resultados e Discussões

161

TABELA 4.28 – Dados de RMN

H e RMN

C da substância 29

H/C (29) WATERMAN et al., 1984 (29) WATERMAN et al., 1984

1 4,21 (s) 4,24 (s) 84,9 82,6

2 - - 198,0 196,8

3 6,11(q,

J = 1,4Hz) 6,12 (q, J = 2Hz) 126,7 124,8

4 - - 163,0 162,3

5 3,10 (d,

J = 12Hz) 3,11 (dd, J = 10 e 2 Hz) 42,7 43,9

6a 2,05 (m) n.a. 26,4 24,7

6b 2,20 (m) n.a. 26,4 24,7

7 4,86 (m) 4,83 (s) 80,5 77,4

8 - - 48,6 46,8

9 3,40 (s) 3,46 (s) 41,1 41,1

10 - - 46,0 44,5

11 - - 111,2 108,9

12 4,05 (sl) 4,06 (sl) 80,3 78,4

13 2,63 (m) - 33,3 31,4

14 2,60 (m) 2,10 (m) 42,7 44,5

15 6,6 (d,

J = 11,2z) 6,50 (d, J = 12 Hz) 71,5 69,8

16 - - 168,7 166,8

18 1,40 (d,

J = 8Hz) 1,43 (d, J = 8Hz) 16,3 14,8

19 1,57 (sl) 1,58 (s) 11,3 9,9

29 1,74 (s) 1,74 (s) 22,9 22,1

30a 4,20 (d,

J = 9,1Hz) 3,86 (d, J = 9Hz) 71,9 70,0

30b 3,90 (d,

J = 9,1Hz) 3,67 (d, J = 9,1Hz) 71,9 70,0

1’ - - 176,8 174,4

2’ - - 75,8 73,9

3’a 2,20 (m) n.a. 34,4 32,5

3’b 2,05 (m) n.a. 34,4 32,5

4’ 1,27 (t,

J = 7,1Hz) 1,26 (t, J = 7Hz) 8,9 7,6

5’ 1,45 (s) 1,43 (s) 26,5 24,7

Resultados e Discussões

162

TABELA 4.29 – Correlações

H –

C de 29 observadas no experimento de

HSQC

H (

δ) C (δ)

1 4,21 84,9

3 6,11 126,7

5 3,10 38,7

6a 2,05 26,4

6b 2,20 26,4

7 4,86 80,5

9 3,40 46,0

12 4,05 80,3

13 2,63 33,3

14 2,61 42,7

15 6,6 71,5

18 1,40 16,3

19 1,57 11,3

29 1,74 22,9

30a 4,20 71,9

30b 3,90 71,9

3’a 2,20 34,4

3’b 2,05 34,4

4’ 1,27 8,9

5’ 1,74 26,5

Resultados e Discussões

163

TABELA 4.30 – Correlações

H –

C com J

e J

de 29 observadas no

experimento de HMBC

H/C

H (

) C (

)

1 4,21 198,0, 42,7 e 126,7

3 6,11 22,9, 42,7 e 84,9

5 3,10 163,0

6a 2,05 80,5, 42,7 e 46,8

6b 2,20 80,5, 42,7 e 46,8

7 4,86 42,7 e 46,0

9 3,40 11,3, 48,6, 46,8, 71,9 e 84,9

12 4,05 46,0 e 111,2

13 2,63 46,1, 48,6, 71,9 e 80,3

14 2,61 33,3, 46,0, 168,0 e 176,0

15 6,6 33,3, 168,0 e 176,7

18 1,40 80,3, 33,3, e 42,7

19 1,57 42,7, 46,0 e 84,9

29 1,74 42,7, 126,7 e 163,0

30a 4,20 46,0 e 111,2

30b 3,90 11,3, 46,0 e 80,3

3’a 2,20 8,9, 46,0 e 75,8

3’b 2,05 8,9, 26,5 e 75,8

4’ 1,27 34,4, 75,8 e 176,8

5’ 1,74 34,4, 75,8 e 176,8

FIGURA 4.96 – Espectro de massas (ES-) da substância 29

Resultados e Discussões

164

ESQUEMA 4.15: Proposta de fragmentação para o quassinóide 29

Resultados e Discussões

165

ESQUEMA 4.16: Proposta biogenética para os quassinóides 28 e 29 (adaptada

de DEWICK, 2001)

tirucalol

isomerização da

dupla

butiospernol

HO OH

Baeyer Villeger

hidrólise

HO OH

[O]

HO O O

[H]

Resultados e Discussões

166

ESQUEMA 4.17: Proposta biogenética para formação do anel A dos

quassinóides 28 e 29 (adaptada de DEWICK, 2001)

4.8 – Identificação dos Derivados do Ácido cinâmico 30 e 31

(30) (31)

A substância 30 foi isolada dos galhos do extrato hexânico de H.

puberula e das folhas do extrato diclorometânico (p. 22 e 27) e a 31 do extrato

diclorometano dos galhos de H. puberula (p. 24).

OCH

[O]

glaucarubolona

(28)

[O]

glaucarubinona

(29)

aminoacido

Resultados e Discussões

167

Os espectros de RMN

H de 30 e 31 (FIGURA 4.97 e 4.98)

apresentaram dois dubletos em aproximadamente

7.60 (J = 16 Hz) e em

6.30

(J = 16 Hz), esses sinais foram atribuídos aos hidrogênios H-7 e H-8,

respectivamente. As constantes de acoplamento de 16 Hz, sugeriram um

acoplamento de hidrogênios em posição trans, sendo H-7, o mais desblindado

devido ao efeito hiperconjugativo dos elétrons da dupla ligação com os da

carbonila.

Ainda no espectro de RMN

H de 30 (FIGURA 4.97) o singleto em

6.74 integrando para dois hidrogênios, foi atribuído aos hidrogênios H-2 e H-

6, que possuem o mesmo deslocamento químico por serem quimicamente

equivalentes.

O espectro também indicou a presença de quatro metoxilas duas em

3.87, uma em

3.86 e outra em

3.79, que juntamente com o sinal em

52,2

observado no espectro de RMN

C de 30 (FIGURA 4.99) indicou que uma das

metoxilas pertence a um grupo éster, o carbono carbonílico em

167,8

confirmou esse grupo na estrutura de 30, que foi comparado com dados da

literatura como sendo o 3,4,5-trimetoxicinamato de metila (MIYASE et al.,

1983) (TABELA 4.31).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

ppm

6.272.02 1.000.99

3.79

3.87

6.30

6.38

6.74

7.27

7.56

7.64

Resultados e Discussões

168

FIGURA 4.97 – Espectro de RMN

H de 30 (CDCl

, 200 MHz)

FIGURA 4.98 – Espectro de RMN

H de 31 (CDCl3, 200 MHz)

FIGURA 4.99 – Espectro de RMN

C de 30 (CDCl3, 50 MHz)

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

ppm

8.686.12 4.481.931.74 1.15 1.081.00 0.930.85

0.819

0.846

0.879

1.253

1.592

1.662

1.732

2.080

3.795

3.897

4.637

4.669

5.070

5.466

5.498

5.525

6.265

6.344

6.835

6.875

7.050

7.091

7.270

7.594

7.673

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

ppm

Chloroform-d

52.12

56.65

61.40

105.83

117.53

130.37

140.72

145.31

153.94

167.82

178.14

Resultados e Discussões

169

TABELA 4.31 – Dados de RMN

H e RMN

C de 30

H/C

(CDCl

, 200MHz)

MIYASE

et al., 1983

(CDCl

, 200MHz)

(CDCl

, 50MHz)

6.40

d (J = 16 Hz)

6.33 d (J = 16 Hz)

167,8

117,5

7 7.60 d (J = 16 Hz) 7.61 d (J = 16 Hz) 146,3

1 - - 130,4

2 e 6 6.74 (

s) 6.74 (s) 105,8

3 e 5 - - 153,9

9-OCH

3,79 (s) 3,81 (s) 52,12

3-OCH

3,87 (s) 3,89 (s) 56,6

4-OCH

3,86 (s) 3,87 (s) 61,4

5-OCH

3,87 (s) 3,89 (s) 56,6

O espectro de RMN

H de 31 (FIGURA 4.98) além de apresentar os

dois dubletos em

7.64 (J = 16 Hz) e em

6.30 (J = 16 Hz) referentes aos

hidrogênios H-7 e H-8, respectivamente, apresentou também, dois dubletos em

7.07 (J = 8,0 Hz) e em

6.85 (J = 8,0 Hz) e um singleto em

7.05

caracterizando os hidrogênios de um anel aromático tri-substituído, que foram

atribuídos aos hidrogênios H-6, H-5 e H-2, respectivamente.

Pode-se observar a presença de duas metoxilas em

3.90 e

3.80,

que provavelmente seriam os substituintes em C-3 e C-4.

Os sinais em

5.50 (t, J = 6,4 Hz, 1H) e em

4.65 (d, J = 6,4 Hz,

2H) foram atribuídos aos hidrogênios H-11 e H-10 que acoplam entre si dando

um tripleto e um dubleto, respectivamente.

Os sinais dos hidrogênios H-12 e H-14 aparecem como um

multipleto em

2.08. O tripleto largo em

5.07 foi atribuído a H-15. Os

Resultados e Discussões

170

singletos em

1.73,

1.66 e

1.59 foram atribuídos aos hidrogênios das metilas

sobre dupla ligação: H-18, H-19 e H-17, respectivamente (TABELA 4.32).

As substâncias 30 e 31 foram definidas como sendo ésteres

derivado do ácido cinâmico, proveniente do metabolismo de carboidratos via

ácido chiquímico, que sofreram algumas modificações biogenéticas,

sumarizadas no ESQUEMA 4.18.

ESQUEMA 4.18: Proposta biogenética para as substâncias 30 e 31 (adaptada de

DEWICK, 2001)

Antranilato

sintetase

-HOP

HOOC CH

COCOOH

Ácido prefênico

Transaminação

Fenilalanina

PAL

Ácido cinâmico

OMe

MeO

OMe

[O]

PPO

COOH

ácido chiquímico

EPSP sintetase

COOH

OCOOH

-HOP

COOH

Ácido corísmic

COOH

OCOOH

-CO

-H

[O]

SAM

3,4,5-trimetóxicinamato de metila

(30)

3,4-dimetóxicinamato de geranila

(31)

Resultados e Discussões

171

TABELA 4.32 – Dados de RMN

H de 31

8 6.30 (d, J = 16 Hz)

7 7.64 (d, J = 16 Hz)

2 7.05 (

5 6.85 (

d, J = 8,0 Hz)

6 7.07 (

d, J = 8,0 Hz)

3-OCH

3,90 (s)

4-OCH

3,80 (s)

1’ 4.65 (

d, J = 6,4 Hz)

2’ 5.50 (

t, J = 6,4 Hz)

4’ e 5’ 2.08 (

6’ 5.07 (

8’-CH

1.59 (s)*

10’-CH

1.66 (s)*

9’-CH

1,73 (s)*

*valores intercambiáveis

Resultados e Discussões

172

4.9 - Caracterização da quitosana

4.9.1 – Grau de desacetilação da quitosana (% GD)

O grau de desacetilação da quitosana foi verificado através de uma

titulação condutimétrica, realizada em triplicata, onde a uma solução de

quitosana acidificada com HCl em excesso foi adicionada NaOH. A FIGURA

4.100 representa o protótipo da curva de titulação, sendo que, a curva apresentou

dois pontos de inflexão, onde o primeiro representa o ponto de equivalência do

excesso de ácido forte e o segundo, a forma ácida do polímero. A diferença entre

esses pontos corresponde ao volume de base utilizada para neutralizar os grupos

aminos livres. A reação ocorrida nessa titulação pôde ser representada pelas

seguintes equações:

2 HCl

HCl Cl

excesso

HCl + NaOH

NaCl + H

+ NaOH

+ H

O + Na

O grau médio de desacetilação (% GD) foi calculado segundo a

equação:

% GD = M x (V

- V

) x 161 x 100

Resultados e Discussões

173

Sendo:

M = molaridade da solução de NaOH

= volume de NaOH utilizado para neutralizar o excesso de HCl

= volume de NaOH utilizado para neutralizar a quitosana protonada

W = massa da amostra utilizada para a titulação

FIGURA 4.100 – Curva da titulação condutimétrica da quitosana.

Foi obtido para a quitosana testada % GD = 66,7 %, significando

que em 200 mg da amostra de quitosana, 66,7 % delas estão com os grupos

aminos livres, ou seja, que 33,3 % dos grupos aminos se encontram acetilados,

sendo este a % GA.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Vol de NaOH (mL)

condutância (mS)

Resultados e Discussões

174

4.9.2 – RMN

C da quitosana

Através do experimento de RMN

C da quitosana (FIGURA 4.101)

pôde-se observar a presença do carbono anomérico C-1 em aproximadamente

98,0. Os sinais em

60,1 e

70,5 foram atribuídos aos carbonos C-6 e C-3,

respectivamente, sendo o sinal em

60,1, característico de carbono de álcool

primário. Os sinais em

76,5,

75,0 e

56,0 foram atribuídos aos carbonos C-

4, C-5 e C-2, respectivamente.

Os sinais com deslocamento químico em 180,1

e 22,5

estão

relacionados ao carbono carbonílico e ao carbono metilíco, sugerindo que a

quitosana não se encontra totalmente desacetilada.

FIGURA 4.101 – Espectro de RMN

C da quitosana (D

O/HCl 1% v/v, 100

MHz)

Resultados e Discussões

175

Após a preparação das microesferas de quitosana através do

processo de coacervação de fases, foi realizada análise da porosimetria das

partículas formadas e posteriormente experimento de MEV para verificar a

morfologia das mesmas.

Uma vez verificado que as partículas formadas possuiam poros, o

mesmo procedimento para a obtenção das microesferas foi realizado

incorporando uma flavona comercial no processo de coacervação de fases no

qual foi verificado através de experimento de RMN

H que a mesma não teve sua

estrutura modificada.

4.9.3 – Porosimetria de Mercúrio

A análise de volume acumulado por grama de microesfera em

função da distribuição do tamanho dos poros revelou que o tamanho médio dos

poros é de 1.063 A. A existência de poros facilitará a entrada e posteriormente a

liberação da substância ativa.

4.9.4 – Espectroscopia Eletrônica por Varredura (MEV)

A FIGURA 4.102 ilustra a fotomicrografada por microscopia

eletrônica de varredura com aumento de 50x , mostrando um diâmetro médio de

1,43 (+- 0,20) mm, que foi determinado a partir da média de três esferas,

utilizando-se as medidas dos diâmetros nos eixos vertical e horizontal de cada

esfera.

NHCOCH

Resultados e Discussões

176

FIGURA 4.102 – Imagens de MEV das esferas de quitosana com aumento de

50x

Observou-se a presença de poros na superfície da esfera de

quitosana (FIGURA 4.103) fotomicrografada com aumento de 3.000x. A

presença destes poros, no processo de microencapsulamento das substâncias, é

de extrema importância, pois indica que a substância pode ser incorporada às

esferas e ser facilmente liberada posteriormente.

Resultados e Discussões

177

FIGURA 4.103 – Imagens de MEV das esferas de quitosana com aumento de

3000x

O uso do agente reticulante bifuncional glutaraldeído serviu para

inibir a solubilização através da formação de bases de Schiff com os grupos

amino livres da unidade glucosamina do polímero. A reticulação das esferas de

quitosana com glutaraldeído fez com que elas ganhassem uma camada protetora,

dando maior resistência às esferas, conforme mencionado no Item 1.2.1.

O trabalho realizado permitiu a obtenção de esferas com

propriedades adequadas para o processo de microencapsulamento, porém o

tamanho das partículas obtidas não atingiu o esperado, ou seja, não foram

obtidas microcápsulas (100 a 1000µm). Como o diâmetro das partículas é

dependente do processo utilizado, faz-se necessário à utilização de uma nova

metodologia para obtenção de partículas menores.

Resultados e Discussões

178

ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Atividades Biológicas

179

5 – Atividades Biológicas

5.1 - Ensaios por ingestão em operárias de Atta sexdens

rubropilosa

Analisando os resultados obtidos das atividades dos extratos de H.

puberula e S. versicolor nos ensaios por ingestão em formigas cortadeiras

(TABELA 5.1), observou-se que, com exceção dos extratos hexânico das folhas

(SVFH), do caule (SVCH) e dos galhos (SVGH) os demais extratos de S.

versicolor apresentaram atividade inseticida significativa nos ensaios com as

operárias de Atta sexdens rubropilosa. Estes resultados podem ser facilmente

visualizados nos gráficos de curva de sobrevivência das formigas cortadeiras

representados nas FIGURAS 5.1, 5.2 e 5.3, que foram agrupadas com o intuito

de se comparar os mesmos extratos (hexânico, diclorometânico e metanólico),

mas de partes diferentes da planta.

Todos os extratos de H. puberula apresentaram atividade inseticida

significativa nos ensaios realizados com A. sexdens rubropilosa, onde,

comparando-se as curvas referentes aos extratos ensaiados, diferenciaram-se da

curva referente ao controle, como apresentados nas FIGURAS 5.4, 5.5 e 5.6.

Atividades Biológicas

180

TABELA 5.1 – Efeito dos extratos de S. versicolor e H. puberula nos ensaios

por ingestão em operárias de Atta sexdens rubropilosa

Parte Vegetal Extrato

controle

SVFH 16 16

SVFD 10

Folhas SVFM 7

HPFH 4

HPFD 6

HPFM 16

SVGH 14 16

SVGD 7

Galhos SVGM 8

HPGH 6

HPGD 7

HPGM 5

SVCH 15 16

SVCD 9

SVCM 6

Caule HPCH 4

HPCD 6

HPCM 16

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D =

diclorometano; M = metanol

= sobrevivência mediana/dias

Concentração: 2 mg/mL

diferença significativa de acordo com o teste estatístico log-rank (p<0,05)

Atividades Biológicas

181

FIGURA 5.1 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, utilizando os

extratos hexânicos das folhas, galhos e caule de S. versicolor

FIGURA 5.2 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, utilizando os

extratos diclorometânicos das folhas, galhos e caule de S. versicolor

Atividades Biológicas

182

FIGURA 5.3 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, utilizando os

extratos metanólicos das folhas, galhos e caule de S. versicolor

FIGURA 5.4 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, utilizando os

extratos hexânicos das folhas, galhos e caule de H. puberula

Atividades Biológicas

183

FIGURA 5.5 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras utilizando os

extratos diclorometânicos das folhas, galhos e caule de H. puberula

FIGURA 5.6 – Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, utilizando os

extratos metanólicos das folhas, galhos e caule de H. puberula

As frações obtidas através do particionamento dos extratos

metanólicos de H. puberula e S. versicolor foram submetidas a ensaios por

ingestão utilizando-se formigas cortadeiras. Os resultados referentes às partições

Atividades Biológicas

184

dos extratos estão apresentados na TABELA 5.2. Os resultados foram analisados

estatísticamente utilizando-se o teste log-rank (p < 0,05).

TABELA 5.2 – Efeito das partições obtidas dos extratos metanólicos de H.

puberula e S. versicolor nos ensaios por ingestão em formigas cortadeiras

Planta Parte vegetal Fração Código S

Hexânica HPCMH 11

Diclorometânica HPCMD 9

Acetato de etila HPCMA 17

caule

hidroalcoólico HPCMHid 17

Hexânica HPFMH 11

Diclorometânica HPFMD 7

Acetato de etila HPFMA 15

folhas

hidroalcoólico HPFMHid 17

Hexânica HPGMH 13

Diclorometânica HPGMD 10

Acetato de etila HPGMA 15

H. puberula

galhos

hidroalcoólico HPGMHid 15

Hexânica SVCMH 10

Diclorometânica SVCMD 4

Acetato de etila SVCMA 4

caule

hidroalcoólico SVCMHid 10

Hexânica SVFMH 16

Diclorometânica SVFMD 4

Acetato de etila SVFMA 9

folhas

hidroalcoólico SVFMHid 18

Hexânica SVGMH 11

Diclorometânica SVGMD 3

Acetato de etila SVGMA 7

S. versicolor

galhos

hidroalcoólico SVGMHid 9

*controle = 18 dias

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D =

diclorometano; M = metanol; A = acetato de eltila; Hid = hidroalcoolico

= sobrevivência mediana/dias

Concentração: 2 mg/mL

diferença significativa de acordo com o teste estatístico log-rank (p<0,05)

Atividades Biológicas

185

5.2 – Atividade inibitória sobre o fungo simbionte Leucoagaricus

gongylophorus

Os extratos brutos de S. versicolor e H. puberula foram utilizados

para ensaios in vitro em relação ao cresciemento do fungo simbionte das

formigas cortadeiras. Todos os extratos foram ensaiados a concentração de 1000

µg/mL.

Na FIGURA 5.7, observou-se que, com exceção dos extratos

SVFH, SVGH e SVCD, todos os demais extratos apresentaram atividade

inibitória significativa no fungo L. gongylophorus, sendo os extratos SVFD,

SVFM, SVCH e SVCM, os mais ativos, apresentando 100 % de inibição.

Na FIGURA 5.8 observou-se que os extratos HPFH, HPFD, HPFM,

HPGH, HPGD, HPGM e HPCM de H. puberula foram os mais ativos, inibindo

100 % do desenvolvimento do fungo simbionte.

As frações HPCMH, SVCMHid, SVCMD, SVFMD, SVGMD,

SVGMA e SVGMHid obtidas dos particionamentos dos extratos metanólicos de

H. puberula e S. versicolor inibiram em 100 % o crescimento do fungo

simbionte (TABELA 5.3) .

Atividades Biológicas

186

FIGURA 5.7 – Efeito dos extratos de S. versicolor sobre o desenvolvimento do

fungo simbionte [1000µg/mL]

FIGURA 5.8 – Efeito dos extratos de H. puberula sobre o desenvolvimento do

fungo simbionte [1000µg/mL]

100

% Inibição

SVFH SVFD SVFM SVGH SVGD SVGM SVCH SVCD SVC M

Extratos

100

% de Inibição

HPFH HPFM HPGD HPCH HPCM

Extratos

Atividades Biológicas

187

TABELA 5.3 – Efeito das partições obtidas dos extratos metanólicos de H.

puberula e S. versicolor sobre o fungo simbionte

Planta Parte vegetal Fração Código % inibição

Hexânica HPCMH 100

Diclorometânica HPCMD 40

Acetato de etila HPCMA 80

caule

hidroalcoólico HPCMHid 60

Hexânica HPFMH 80

Diclorometânica HPFMD 80

Acetato de etila HPFMA 40

folhas

hidroalcoólico HPFMHid 20

Hexânica HPGMH 60

Diclorometânica HPGMD 20

Acetato de etila HPGMA 20

H. puberula

galhos

hidroalcoólico HPGMHid 40

Hexânica SVCMH 20

Diclorometânica SVCMD 100

Acetato de etila SVCMA 60

caule

hidroalcoólico SVCMHid 100

Hexânica SVFMH 0

Diclorometânica SVFMD 100

Acetato de etila SVFMA 80

folhas

hidroalcoólico SVFMHid 0

Hexânica SVGMH 40

Diclorometânica SVGMD 100

Acetato de etila SVGMA 100

S. versicolor

galhos

hidroalcoólico SVGMHid 100

*concentração utilizada: 500 µg.mL

-1

*controle com e sem solvente: 0 % de inibição

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D =

diclorometano; M = metanol; A = acetato de eltila; Hid = hidroalcoolico

5.3 – Atividade inibitória frente às pectinases

Os extratos de S. versicolor e H. puberula foram submetidos a

ensaios in vitro utilizando-se enzimas pectinases. Essas enzimas existem nas

formigas cortadeiras e no seu fungo simbionte e são polissacaridases fúngicas

necessárias para a degradação de polissacarídeos a mono e dissacarídeos que são

parte da alimentação das formigas. Os resultados obtidos para os extratos, estão

Atividades Biológicas

188

representados na TABELA 5.4, onde os extratos diclorometânico dos galhos de

S. versicolor (SVGD), os extratos hexânicos dos galhos e caules de H. puberula

(HPGH e HPCH), foram os que apresentaram melhores resultados, inibindo em

96, 92 e 83 % a ativividade enzimática. Segundo o teste estatístico Mann

Whitney, o extrato metanólico dos galhos de S. versicolor (SVGM) também

pode ser considerado significativo. As frações provenientes dos extratos

metanólicos de H. puberula não apresentaram bons resultados, mas as frações

SVCMA, SVCMHid, SVFMHid, SVGMD, SVGMA e SVGMHid de S.

versicolor, mostraram bons resultados.

TABELA 5.4 – Efeito dos extratos brutos de S. versicolor e H. puberula sobre a

atividade de pectinase

Parte Vegetal Extrato Efeito

(%)

SVFH -

SVFD -

Folhas SVFM -

HPFH -

HPFD -

HPFM -

SVGH -

SVGD 96

Galhos SVGM 37*

HPGH 92

HPGD -

HPGM -

SVCH -

SVCD -

SVCM -

Caule HPCH 83

HPCD -

HPCM -

(*) extrato que apresentou inibição estatisticamente significativa segundo o teste Mann Whitney (95 %)

-: não apresentaram efeito significativo

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D = diclorometano; M

= metanol

Atividades Biológicas

189

TABELA 5.5 – Atividade das partições obtidas dos extratos metanólicos de H.

puberula e S. versicolor sobre a enzima pectinase

Planta Parte vegetal Partição Código % Efeito

Hexânica HPCMH 82

Diclorometânica HPCMD 85

Acetato de etila HPCMA 94

caule

hidroalcoólico HPCMHid 86

Hexânica HPFMH 89

Diclorometânica HPFMD -

Acetato de etila HPFMA 98

folhas

hidroalcoólico HPFMHid -

Hexânica HPGMH -

Diclorometânica HPGMD 90

Acetato de etila HPGMA 97

H. puberula

galhos

hidroalcoólico HPGMHid 98

Hexânica SVCMH 72

Diclorometânica SVCMD 72

Acetato de etila SVCMA 20*

caule

hidroalcoólico SVCMHid 15*

Hexânica SVFMH 88

Diclorometânica SVFMD 83

Acetato de etila SVFMA 40

folhas

hidroalcoólico SVFMHid 29*

Hexânica SVGMH 94

Diclorometânica SVGMD 31*

Acetato de etila SVGMA 6*

S. versicolor

galhos

hidroalcoólico SVGMHid 6*

(*) frações que apresentaram inibição significativa segundo o teste Mann Whitney (95 %) (p < 0,05)

-: não apresentaram efeito significativo

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D = diclorometano; M

= metanol; A = acetato de eltila; Hid = hidroalcoolico

Atividades Biológicas

190

5.4 – Atividade das substâncias isoladas nos ensaios por ingestão

em formigas cortadeiras, no fungo simbionte e nas enzimas

pectinases

As substâncias puras isoladas em maiores quantidades foram

submetidas aos ensaios biológicos por ingestão utilizando as formigas

cortadeiras, o fungo L. gongylophorus e as enzimas pectinases (TABELA 5.6).

Dentre as substâncias testadas, verificou-se que os esteróides 1 e 2, triterpenos 6

e 7 e as cumarinas 23, 24, 26 e 27 não apresentaram efeito significativo nos

modelos biológicos testados.

Os alcalóides do tipo furoquinolínicos 9 e 12, apresentaram inibição

de 100 % no crescimento do fungo simbionte . Já os alcalóides 10, 11 e 13

apresentaram inibição de 80 % no crescimento dos mesmos. Analisando-se as

estruturas dessas substâncias 9 – 13, observou-se que os alcalóides não

substituídos na posição C-8 são um pouco mais ativos para inibição do fungo.

Os alcalóides 11 e 12, também apresentaram bons resultados no ensaio com

formigas cortadeiras, ocasionando uma sobrevivência mediana de 7 e 9 dias,

respectivamente, num experimento de 23 dias (controle). As substâncias 9 e 13

também inibiram significativamente a atividade enzimática das pectinases.

Sendo no geral, os alcalóides do tipo furoquinolínicos muito promissores para

serem utilizados em iscas granuladas, uma vez que são muito comuns na família

Rutaceae.

Os alcalóides do tipo cantin-6-ona 15 e 16 também encontrados

com certa facilidade na família Simaroubaceae, apresentaram bons resultados

nos ensaios por ingestão com as formigas cortadeiras e no ensaio com o fungo L.

gongylophorus, ocasionando 100% de inibição no crescimento do fungo

simbionte.

Os quassinóides 28 e 29 também apresentaram sobrevivência média

de 10 dias, num experimento de 23 dias no controle de formigas cortadeiras,

Atividades Biológicas

191

sendo que o quassinóide 29 apresentou 80 % de inibição no crescimento do

fungo simbionte.

A flavanona apresentou 80 % de inibição no desenvolvimento do

fungo simbionte, esta substância já havia sido anteriormente testada por um

aluno do grupo apresentando o mesmo resultado.

Foi observado que o triterpeno 5 provocou uma atividade

estimulante no crescimento do fungo simbionte.

As demais substâncias testadas não apresentaram resultados

satisfatórios nos modelos biológicos selecionados.

TABELA 5.6 – Efeito das substâncias puras nos ensaios por ingestão utilizando-

se formigas cortadeiras, nos ensaios com o fungo simbionte e com as enzimas

pectinases

substâncias

Extratos

provenientes

** % inibição

fungo

simbionte*

% Efeito

enzimático

(0,7mg/mL)

Sitosterol (1) HPGD/SVGMD/HPGH 23 0 ♦

Sitostenona (2) SVGMD/HPFH 23 0 ♦

Eurileno (5) SVCMD - # ♦

Lupeol (6) HPFH 23 20 ♦

Lupenona (7) HPGH 16 0 ♦

N-metil-4-metóxi-2-quinolona (8) HPFH - 80 96

Dictamina (9) HPGH 10

100 100

-fagarina (10)

HPGH 19 80 ♦

Kokusaginina (11) HPFD 7

80 ♦

Maculina (12) HPGH 9

100 ♦

Flindersiamina (13) HPFD 18 80 94

4,5-dimetóxicantin-6-ona (15) SVGMD 14

100 ♦

5-metóxicantin-6-ona (16) SVGMD 7

100 ♦

7-hidróxicumarina (23) SVCMD - 0 ♦

6,7-dimetóxicumarina (24) SVCMD - 0 ♦

Glaucarubolona (28) SVGMD 10

80 ♦

Glaucarubinona (29) SVCMD 10

80 ♦

Flavanona (19) SVFMD - 80 ♦

5,7,3’,4’,5’-pentametóxiflavona

(21)

SVFMD - 0 ♦

3-(1’,1’-dimetilalil)cumarina (26) HPCMH - 0 ♦

Metileter-graveliferona (27) HPCMH - 0 ♦

*Controle positivo: 0% e Controle negativo (anfotericina ®) 10µg/mL: 20% concentração das substâncias puras.: 10µg/mL

**S

controle: 23 dias

-: substâncias não testadas

diferença significativa de acordo com o teste estatístico log-rank (p<0,05)

Atividades Biológicas

192

# = ocasionou ativação no crescimento do fungo simbionte

♦ = não apresentaram resultados significativos

SV = Simarouba versicolor; HP = Helietta puberula,; C = caule; G = galhos; F = folhas; H = hexano; D = diclorometano; M

= metanol; A = acetato de eltila; Hid = hidroalcoolico

CONCLUSÕES

Conclusões

193

6 – Conclusões

O estudo fitoquímico de H. puberula (Rutaceae) e S. versicolor

(Simaroubaceae), biomonitorado por ensaios biológicos nas formigas cortadeiras

(Atta sexdens rubropilosa), no fungo simbionte (Leucoagaricus gongylophorus)

e nas enzimas pectinases, permitiu o isolamento de 31 metabólitos secundários

como os alcalóides do tipo furoquinolícos, acridônico, cantinônicos e

carbolinicos; cumarinas; triterpenos; esteróides; flavonóides; derivados do ácido

cinâmico e de quassinóides.

A ocorrência de quassinóides, triterpenos, flavonóides e alcalóides

do tipo cantinônicos e

-carbolinicos em S. versicolor, já havia sido descrita em

outros estudos com plantas da família Simaroubaceae sendo esta, uma

característica marcante da mesma. Já o estudo fitoquímico realizado para H.

puberula vem a contribuir para o conhecimento do gênero Helietta, pois poucos

relatos existem na literatura sobre esta espécie. As substâncias como os

alcalóides, cumarinas, esteróides e triterpenos, isoladas de H. puberula estão

dentro do perfil químico da família Rutaceae.

Em concordância com as expectativas iniciais deste trabalho, os

resultados dos ensaios biológicos com extratos e frações mostraram que as

plantas selecionadas são bastante promissoras como fontes de compostos com

potencial para novos estudos direcionados ao controle de formigas cortadeiras,

pois com exceção dos extratos hexânico das folhas e do extrato hexânico do

caule, os demais extratos de S. versicolor apresentaram atividade significativa

frente às operárias de Atta sexdens rubropilosa e todos os extratos de H.

puberula foram ativos frente às mesmas. Em relação aos extratos brutos de S.

versicolor, com exceção dos extratos hexânico das folhas e galhos e do extrato

diclorometânico do caule, os demais extratos inibiram totalmente o crescimento

do fungo L. gongylophorus. Os extratos hexânico, diclorometânico e metanólico

das folhas e dos galhos e o extrato metanólico do caule de H. puberula inibiram

Conclusões

194

em 100 % o desenvolvimento do fungo simbionte. Quanto ao efeito sobre a

atividade enzimática, somente os extratos hexânico dos galhos e do caule de H.

puberula e diclorometânico dos galhos de S. versicolor inibiram as enzimas

pectinases.

Das substâncias isoladas das duas espécies estudadas, os alcalóides

do tipo furoquinolínicos (9 – 13) e cantinônicos (15 e 16) e os quassinóides (28

e 29) foram os que apresentaram resultados mais promissores frente aos

modelos biológicos selecionados, podendo futuramente serem objetos de

estudos adicionais, para uma eventual utilização em iscas granuladas, pois são

bastante comuns em suas famílias.

A atividade estimulante do crescimento do fungo L. gongylophorus,

promovida pelo triterpeno 5, é um resultado muito interessante, pois há a

possibilidade de utilizar esse tipo de substância para reduzir o tempo utilizado

para realização dos ensaios biológicos com o fungo simbionte.

Os resultados obtidos com a quitosana como matriz no processo de

microencapsulamento de substâncias tóxicas, mostraram-se muito promissores,

pois para sua decomposição e conseqüentemente liberação do material

encapsulado ela requer meio ácido e elevada umidade, condições essas,

presentes no interior do formigueiro, cujo pH varia em torno de 4 – 6 e possui

umidade relativa de 90%, tornando-se muito viável a utilização dessa matriz.

Sendo a quitosana uma substância de fácil obtenção, fácil manuseio e

principalmente de baixo custo, torna-se viável um aprofundamento neste estudo

com a finalidade de se obter partículas menores do que as obtidas deste trabalho.

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Referências Bibliográficas

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