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CAMILA KLOCKER COSTA
ESTUDO FITOQUÍMICO DE Bixa orellana L., BIXACEAE E
APLICAÇÃO DE SEU ÓLEO EM FORMULAÇÃO COSMÉTICA
Dissertação apresentada como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Setor de Ciências da Saúde, Universidade
Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel
Co-orientadora: Profª. Drª Marilis D. Miguel
CURITIBA
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Paraná;
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas;
Ao Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel, pela amizade, confiança, pelos ensinamentos e
constante presença em todos os momentos;
À Prof.ª Drª Marilis Dalarmi Miguel, pela co-orientação;
À Profª Drª Sandra Zanin, e seu esposo Pedro Zanin, por todo carinho e pelas
contribuições para melhoria desse trabalho;
À Profª Maria Rita Sierakowski e ao Prof. Márcio Chimelli, pelas análises reológicas;
À Profª Drª Ana Luisa Lacava Lordello, do Departamento de Química da UFPR, pela
ajuda na obtenção dos espectros de RMN;
Ao Lauro Mera de Souza, do Departamento de Bioquímica da UFPR, pela análise de
cromatografia gasosa;
Ao botânico Gert Hatschbach, pela identificação e depósito do exemplar da espécie
em estudo;
Ao Instituto Ambiental do Paraná (IAP), no município de Morretes, na pessoa de Luiz
Adão, pelo auxílio na coleta dos frutos;
Ao colega Thiago Alessandre da Silva, pelos espectros de absorção no
infravermelho;
ii
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À Silmara Costa da Cruz Almeida e Carmen Etsuko Kataoka Higaskino, do Instituto
Tecnológico do Paraná (TECPAR), pelo auxílio nos testes antimicrobianos;
À Cosmética Farmácia de Manipulação, pelo apoio para realização desse mestrado;
A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, que de alguma forma contribuíram para esse trabalho;
A todos os colegas de mestrado pela amizade, em especial à Cláudia Alexandra de
Andrade, Miryan Soares Negri e Janaína Fernanda Packer;
Em especial, a minha família, pelo apoio em todas as minhas decisões;
Ao meu marido, meu constante incentivador.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. vii
LISTA DE GRÁFICOS .......................................................................................... x
LISTA DE QUADROS .......................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ............................................................................................ xii
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS …………………………….. xiii
RESUMO .............................................................................................................. xvi
ABSTRACT .......................................................................................................... xvii
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 5
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 5
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 5
3 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................. 6
3.1 Bixa orellana Linné. ......................................................................................... 6
3.1.1 Família Bixacea ............................................................................................ 7
3.1.2 Aspectos Botânicos ...................................................................................... 8
3.1.3 Origem e Aspectos Agronômicos ................................................................. 11
3.1.4 Componentes Químicos ............................................................................... 15
3.1.4.1 Bixina e norbixina ...................................................................................... 17
3.1.5 Usos e Ações Farmacológicas ..................................................................... 20
3.2 ANTIOXIDANTES .......................................................................................... 23
3.2.1 Radicais Livres ............................................................................................. 23
3.2.2 Carotenóides ................................................................................................ 28
3.2.3 Tocoferóis e Tocotrienóis ............................................................................. 31
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 33
4.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL ............................................................... 33
4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ....................................................................... 33
4.2.1 Fragmentação das Sementes ...................................................................... 33
4.2.2 Extração em Soxhlet .................................................................................... 33
iv
4.2.3 Identificação do Cristal ................................................................................. 34
4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS …..………………………................................ 35
4.3.1 Reologia ....................................................................................................... 35
4.3.2 Solubilidade .................................................................................................. 35
4.3.3 Densidade .................................................................................................... 35
4.3.4 Espalhabilidade ............................................................................................ 35
4.3.5 Análise em Espectroscopia de Ultravioleta .................................................. 36
4.3.6 Análise em Espectroscopia de Infravermelho .............................................. 37
4.4 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS ……………………………………. 37
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA……………………………… 37
4.5.1 Método de Difusão em Ágar ........................................................................ 38
4.5.1.1 Preparo da amostra .................................................................................. 38
4.5.1.2 Preparo dos discos de papel ..................................................................... 38
4.5.1.3 Preparo dos meios de cultura ................................................................... 39
4.5.1.4 Preparo do inóculo .................................................................................... 39
4.5.1.5 Preparo do teste ........................................................................................ 39
4.5.2 Método da Concentração Mínima Inibitória ................................................. 40
4.5.2.1 Preparo do inóculo .................................................................................... 40
4.5.2.2 Preparo do teste ........................................................................................ 40
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ……………………………....... 41
4.6.1 Formação do Complexo Fosfomolibdênico .................................................. 41
4.6.2 Redução do Radical DPPH .......................................................................... 42
4.6.3 Pesquisa de Tocotrienol e Tocoferol ............................................................ 43
4.6.4 Isolamento e Identificação do Composto Antioxidante “X”........................... 43
4.7 DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO COSMÉTICA ............................. 44
5 RESULTADOS ................................................................................................. 45
5.1 FRAGMENTAÇÃO DAS SEMENTES ............................................................. 45
5.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ....................................................................... 45
5.2.1 Identificação do Cristal ................................................................................. 46
5.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ……………………………............................... 53
5.3.1 Reologia ....................................................................................................... 53
5.3.2 Solubilidade .................................................................................................. 57
v
5.3.3 Densidade .................................................................................................... 57
5.3.4 Espalhabilidade ............................................................................................ 57
5.3.5 Análise em Espectroscopia de Ultravioleta .................................................. 58
5.3.6 Análise em Espectroscopia de Infravermelho .............................................. 60
5.4 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS ……………………………………. 61
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA …………………………….. 63
5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ……………………………....... 64
5.6.1 Formação do Complexo Fosfomolibdênico .................................................. 64
5.6.2 Redução do Radical DPPH .......................................................................... 66
5.6.2.1 Análise qualitativa ..................................................................................... 66
5.6.2.2 Análise quantitativa ................................................................................... 67
5.6.3 Pesquisa de Tocotrienol e Tocoferol ........................................................... 67
5.6.4 Isolamento e Identificação do Composto Antioxidante “X”........................... 69
5.7 DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO COSMÉTICA ............................. 79
5.7.1 Composição ................................................................................................. 80
5.7.2 Reologia ....................................................................................................... 81
5.7.3 Espalhabilidade ............................................................................................ 82
5.7.4 pH ................................................................................................................. 82
5.7.5 Microfotografias ............................................................................................ 83
6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 85
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 87
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS GERAIS DA
FAMÍLIA BIXACEAE ................................................................
8
FIGURA 2 – ASPECTO DA ÁRVORE DE Bixa orellana ............................... 9
FIGURA 3 – FLOR E FRUTO DE Bixa orellana ............................................ 9
FIGURA 4 – FRUTO BIVALVAR CONTENDO AS SEMENTES DE Bixa
orellana .....................................................................................
10
FIGURA 5 – (A) SEMENTE INTEIRA E (B) SECÇÃO LONGITUDINAL DA
SEMENTE DE Bixa orellana .....................................................
11
FIGURA 6 – (A) SECÇÃO TRANSVERSAL E (B) ENDOSPERMA DA
SEMENTE DE Bixa orellana .....................................................
11
FIGURA 7 – ASPECTO DA FOLHA DE Bixa orellana COM OIDIO ............. 14
FIGURA 8 – ASPECTO DA FOLHA DE Bixa orellana COM
CERCOSPORIOSE ..................................................................
15
FIGURA 9 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DA BIXINA E NORBIXINA ............ 18
FIGURA 10 – BIOSSÍNTESE DA BIXINA ....................................................... 19
FIGURA 11 – FORMAÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO ...... 24
FIGURA 12 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DO LICOPENO, β CAROTENO E
LUTEINA ........... .......................................................................
29
FIGURA 13 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS TOCOFERÓIS E
TOCOTRIENÓIS ......................................................................
31
FIGURA 14 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE IV DO CRISTAL EM KBr .... 46
FIGURA 15 – ESPECTRO DE RMN
1
H DO CRISTAL (300MHz, DMSO) ….. 48
FIGURA 16 – ESPECTRO DE RMN
13
C DO CRISTAL (75MHz, DMSO) …... 49
FIGURA 17 – ESPECTRO DE RMN
13
C (DEPT) DO CRISTAL (75MHz,
DMSO) ……………………………………………………………...
50
FIGURA 18 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL
1
H -
1
H (COSY)
DO CRISTAL (300MHz, DMSO) …………………………………
51
FIGURA 19 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL
1
H -
13
C
vii
(HMQC) DO CRISTAL (DMSO) ……………………………….… 52
FIGURA 20 – COMPORTAMENTO REOLÓGICO DO ÓLEO ……………….. 56
FIGURA 21 – ESPALHABILIDADE DO ÓLEO DE Bixa orellana .................... 57
FIGURA 22 – ESPALHABILIDADE DO ÓLEO DE AMÊNDOAS .................... 58
FIGURA 23 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE UV DO ÓLEO ..................... 59
FIGURA 24 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE IV DO ÓLEO EM KBr ...…. 60
FIGURA 25 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS ÁCIDOS LINOLÉICO E α
LINOLÊNICO ………………………………………………………
62
FIGURA 26 – FORMAÇÃO DO COMPLEXO FOSFOMOLIBDÊNICO ........... 65
FIGURA 27 – REDUÇÃO DO RADICAL DPPH .............................................. 66
FIGURA 28 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO ÓLEO
UTILIZANDO VITAMINA C COMO PADRÃO ..........................
66
FIGURA 29 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO ÓLEO DE
UTILIZANDO PADRÃO COMERCIAL DE TOCOTRIENOL /
TOCOFEROL............................................................................
68
FIGURA 30 – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA DO
ÓLEO MARCANDO TOCOTRIENOL / TOCOFEROL .............
69
FIGURA 31 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA
REVELAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES DO
ÓLEO ........................................................................................
69
FIGURA 32 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE FRAÇÕES
SUBSEQÜENTES OBTIDAS DA CROMATOGRAFIA EM
COLUNA ...................................................................................
70
FIGURA 33 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO
COMPOSTO “X” ISOLADO ......................................................
71
FIGURA 34 – ESPECTRO DE RMN
1
H DO COMPOSTO “X” (300MHz,
CDCl
3
) ………………………………….....……………………………………..
73
FIGURA 35 – ESPECTRO DE RMN
13
C DO COMPOSTO “X” (75MHz,
CDCl
3
) …………………………………………………………………………..
74
FIGURA 36 – ESPECTRO DE RMN
13
C (DEPT) DO COMPOSTO “X”
(75MHz, CDCl
3
) ………………………………………….…………………..
75
FIGURA 37 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL
1
H -
1
H (COSY)
viii
DO COMPOSTO “X” (300MHz, CDCl
3
) …………………………….. 76
FIGURA 38 –
MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL
1
H -
13
C
(HMQC) DO COMPOSTO “X” (CDCl
3
) ……………………………...
77
FIGURA 39 – COMPORTAMENTO REOLÓGICO DAS FÓRMULAS 1 E 2 .. 81
FIGURA 40 – ESPALHABILIDADE DAS FÓRMULAS 1 E 2 .......................... 82
FIGURA 41 – MICROFOTOGRAFIAS DA FÓRMULA 1 ................................ 83
FIGURA 42 – MICROFOTOGRAFIAS DA FÓRMULA 2 ................................ 83
ix
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 – COMPORTAMENTO NEWTONIANO ...................................... 55
GRÁFICO 2 – COMPORTAMENTO NÃO-NEWTONIANO ............................. 55
GRÁFICO 3 – ATIVIDADES ANTIOXIDANTES RELATIVAS
DETERMINADAS PELO MÉTODO FOSFOMOLIBDÊNICO ...
64
x
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – MECANISMO DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ........................ 25
QUADRO 2 – EQUAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DA
ESPALHABILIDADE ..............................................................
36
QUADRO 3 – EQUAÇÃO PARA CÁLCULO DE FPS PELO MÉTODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO .................................................
36
QUADRO 4 – CÁLCULO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE RELATIVA
PELO MÉTODO FOSFOMOLIBDÊNICO ..............................
41
QUADRO 5 – CÁLCULO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO
MÉTODO DPPH ....................................................................
42
QUADRO 6 – EQUAÇÃO DO FLUXO DE NEWTON ................................... 54
QUADRO 7 – LEI DAS POTÊNCIAS ............................................................ 55
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – ENQUADRAMENTO TAXONÔMICO ....................................... 7
TABELA 2 – COMPOSIÇÃO DO
Ó
LEO ESSENCIAL DE SEMENTES DE
Bixa orellana .............................................................................
16
TABELA 3 – DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RMN
1
H E DE
13
C DO
CRISTAL E CORRELAÇÃO HMQC .........................................
53
TABELA 4 – TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO ................................. 62
TABELA 5 – COMPARAÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE
RMN
1
H,
13
C E CORRELAÇÃO HMQC E COSY DO
COMPOSTO “X” COM DADOS DE LITERATURA ..................
78
TABELA 6 – FÓRMULAS DE GLOSS LABIAL ............................................. 80
xii
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ºC – graus Celsius
C – carbono
cm – centímetro
cP – centi Poise
g – grama
H – hidrogênio
Hz – hertz
M – molar
mg – miligrama
MHz – megahertz
min – minutos
mL – mililitros
mm – milímetro
nm – nanômetros
® – marca registrada
η
– viscosidade
λ – comprimento de onda
λ
máx
– comprimento de onda máximo
γ – taxa de cisalhamento
μg – microgramas
μL – microlitro
μm – micrômetro
μM – micromols
T – tensão de cisalhamento
AA – atividade antioxidante
AAL – ácido α-linolênico
AAR – atividade antioxidante relativa
xiii
ABIHPEC – Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal
Abs – absorbância
ADH – ácido docosahexaenóico
AEP – ácidos eicosapentaenóico
AGE – ácido graxo essencial
AGS – ácido graxo saturado
AGMI – ácido graxo monoinsaturado
AGPI – ácido graxo poliinsaturado
AL – ácido linoléico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ARA – ácido aracdônico
ATCC –
American Type Culture Collection
BHA – butil hidroxianisol
BHT – butil hidroxitolueno
CCD – cromatografia em camada delgada
CDCl
3
– clorofórmio deuterado
CG-EM – cromatografia gasosa associada ao espectro de massa
CI –
Color Index
CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência
CMI – concentração mínima inibitória
COSY –
Correlated Spectroscopy
DEPT –
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
DPPH – 1,1-difenil-2-picril-hidrazil
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EROs – espécies reativas de oxigênio
FAO – Food and Agriculture Organization
FPS – fator de proteção solar
HDL –
high density protein
IAP – Instituto Ambiental do Paraná
IV – Infravermelho
xiv
KBr – brometo de potássio
NBT – azul de nitrotetrazólio
OE – óxido de etileno
OMS – Organização Mundial da Saúde
pH – potencial hidrogeniônico
p/p – peso / peso
qsp – quantidade suficiente para
Rf – tempo de retenção
RMN
1
H – ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN
13
C – ressonância magnética nuclear de carbono 13
TECPAR – Instituto Tecnológico do Paraná
TMS – tetrametilsilano
UFC – unidades formadoras de colônia
UV – raios ultravioleta
UVB – raios ultravioleta B
xv
RESUMO
Bixa orellana é uma planta nativa do Brasil, desenvolvendo-se também em outras
regiões da América do Sul e Central. É cultivada em países tropicais como Peru,
México, Equador, Indonésia, Índia, Quênia e leste da África. Por meio de suas
sementes produz-se um dos corantes mais utilizados mundialmente, principalmente
em produtos alimentícios, mas também nas indústrias têxteis e cosméticos. O
objetivo desse trabalho foi contribuir para o estudo fitoquímico de B. orellana, e
agregar valor ao seu óleo desenvolvendo uma formulação cosmética. A extração foi
realizada em Soxhlet, sendo a fração hexânica constituída pelo óleo, e da fração
clorofórmica obteve-se a bixina, apocarotenóide majoritário de B. orellana e principal
constituinte do seu corante. Algumas análises foram realizadas no óleo, dentre elas
solubilidade, densidade, espalhabilidade, espectroscopia de absorção de ultravioleta
e infravermelho. Também foi avaliada sua reologia, atividade antioxidante e
antimicrobiana. Dentre os ácidos graxos identificados estão o linoléico, oléico, e
também o ácido aracdônico. O fator de proteção solar do óleo foi determinado por
espectrofotometria, obtendo-se um valor 6. Pelos ensaios de difusão em ágar e
concentração mínima inibitória, não foi possível observar ação antimicrobiana do
óleo para as cepas testadas. Em relação aos compostos antioxidantes, foi
pesquisada a presença de tocoferóis e tocotrienóis, os quais foram identificados por
cromatografia líquida de alta eficiência. Por RMN
1
H e
13
C também foi identificado o
composto δ tocotrienol. Duas fórmulas labiais foram propostas, e nelas realizaram-se
os ensaios reológicos, espalhabilidade e pH. Suas estabilidades foram avaliadas por
meio de microfotografias.
Palavras-chave: Bixa orellana, óleo, atividade antioxidante, fator de proteção solar,
tocotrienol
xvi
ABSTRACT
Bixa orellana is a native plant of Brazil, also growing in other areas of South and
Central America. It is cultivated at tropical countries like Peru, Mexico, Ecuador,
Indonesia, India, Kenya and east of Africa. Through its seed, one of the colors more
globally used is produced, mainly in nutritious products, but also in the textile and
cosmetic industries. The objective of that research was to contribute for the
phytochemistry study of B. orellana, and to join value to it oil developing a cosmetic
formulation. The extraction was accomplished in Soxhlet, being the hexane fraction
constituted by the oil, and of the chlorophorm fraction it was obtained the bixina,
majority apocarotenoid of B. orellana and main representative of its color. Some
analyses were accomplished in the oil, among them solubility, density, spreading,
absorption spectral of ultraviolet and infrared. Its was also evaluated its rheological,
antioxidant and antibacterial activity. Among the fat acids identified it is the linoleic,
oleic, and also the aracdonic acid. The solar protection factor of the oil has been
determined by spectrometrical method, being obtained a value of six. For the
diffusion rehearsals in agar and minimum inhibitory concentration, it was not possible
to observe antibacterial action of the oil for the tested stumps. In relation to the
antioxidant compositions, it has been researched the tocopherols and tocotrienols
presence, which were identified for high performance liquid chromatography. For
NMR
1
H and
13
C was also identified the compound δ tocotrienol. Two labial formulas
have been proposed, and in them they took place the rheological rehearsals,
spreading, pH and their homogeneity have been appraised through
microphotographs.
Key words: Bixa orellana, oil, antioxidant activity, solar protection factor, tocotrienol
xvii
1 INTRODUÇÃO
A utilização de compostos naturais de origem mineral, animal ou vegetal em
produtos alimentícios, cosméticos e medicamentos vem de longa data. Há milênios
se têm registros escritos de antigas civilizações egípcias e chinesas que faziam o
uso desses produtos. Nos dias atuais, tem-se visto um retorno à procura por
produtos chamados “naturais”, que na verdade nunca deixaram de existir. Basta
analisar a composição de muitos medicamentos, já que quase 50% destes, em uso
clínico, apresentam compostos de origem natural em sua fórmula. Além disso, não
somente as plantas, mas também seus subprodutos estão sendo largamente
utilizados como conservantes, aromatizantes e corantes em diversas preparações
cosméticas e alimentícias (PERECIN; BOVI; MAIA, 2002).
Somente 14% dos recursos vegetais que estão disponíveis são conhecidos
adequadamente. O Brasil é o país com a maior biodiversidade do planeta, pois das
250 mil espécies existentes, aproximadamente 55 mil estão aqui, e destas apenas
2% são conhecidas (BABY et al., 2005). Dentro deste contexto, torna-se importante
um estudo mais detalhado de algumas espécies nativas popularmente conhecidas,
como é o caso de Bixa orellana, mais conhecida no Brasil como urucum.
Bixa orellana é uma planta nativa do Brasil, desenvolvendo-se também em
outras regiões da América do Sul e Central. É cultivada em países tropicais como
Peru, México, Equador, Indonésia, Índia, Quênia e leste da África (ELIAS et al.,
2002).
No Brasil, as melhores sementes eram provenientes do Pará e Amazonas.
Mas de acordo com FURTADO (2003), os principais cultivares estão em São Paulo,
onde se encontram sementes com maior teor de bixina, o principal constituinte do
corante. Há também cultivos nos estados do Paraná e Rondônia.
Por meio da semente dessa planta, produz-se um dos corantes mais
utilizados mundialmente, principalmente em produtos alimentícios, mas também nas
indústrias têxteis, de tintas e cosméticos. Seu uso tem sido estimulado em razão da
proibição do uso de corantes sintéticos nas indústrias de alimentos e cosméticos,
sendo um dos poucos aceitos pela Organização Mundial da Saúde (OMS), pois além
de não ser tóxico, parece não alterar o valor dos alimentos (BASTOS et al., 1999).
Outro dado interessante é que 70% de todo o corante natural consumido no mundo
2
é originado do urucum (AGRICULTURA DA PARAÍBA GERA RIQUEZA PARA
EXPORTADORES, 2005).
No mercado brasileiro de sementes de B. orellana, cerca de 60% destas são
destinadas à produção e comércio de colorífico, 25% para exportação in natura e
15% para fabricação de corantes. Segundo CARVALHO (1999), em 1999 o Brasil
forneceu cerca de 40% da produção mundial de sementes, exportando
principalmente para Estados Unidos, Inglaterra, França e Japão.
Ainda em 1999, o Brasil chegou a produzir de 10 mil a 12 mil toneladas de
sementes. Em 2001, o consumo de colorífico somente na região Nordeste, em razão
de sua culinária, foi em média de 1,6 mil toneladas (FRANCO, [2002?]). De acordo
com GIULIANO, ROSATI e BRAMLEY (2003), a América Latina produzia em 2003
cerca de 60% da produção total mundial de urucum, seguida da África e da Ásia.
No Brasil, em 2005, somente a Paraíba foi responsável por 15,4% da
produção nacional, o que é um valor significante, considerando que o Brasil, nesse
mesmo ano, forneceu 85% do total de frutos colhidos no mundo. Porém, a Paraíba
quase não exporta as sementes da planta, pois os produtores não possuem
cooperativas nem uma forma de organização para isso. As vendas são feitas para
“atravessadores”, pessoas que revendem as sementes para indústrias de extração
de bixina dos Estados Unidos e Europa por um preço que pode ser até 50 vezes
maior que o valor da compra (AGRICULTURA..., 2005).
Atualmente, no Brasil, muitas indústrias atuam no comércio de corantes,
destacando-se a Christian Hansen, IFF, Firace, Quest, Biacon, Adicon, Liotécnica,
dentre outras. Do total dessas empresas, aproximadamente 54% produzem corantes
naturais e 12% corantes artificiais. Dentre os naturais, o proveniente de B. orellana
é, sem dúvida, o mais produzido e utilizado (FRANCO, [2002?]).
A aplicação desse corante em produtos cosméticos já foi legalmente permitida
em uma resolução normativa publicada em 1978 pela Câmara Técnica de
Cosméticos do Conselho Nacional de Saúde, que o classifica como corante orgânico
natural possível de ser aplicado em produtos para uso na cavidade oral, nos lábios e
como corante para uso externo que pode ter contato prolongado com a pele e
cabelos (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1978). Em 2000, a resolução nº 79
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) determinou que esse mesmo
3
corante é permitido para todos os produtos de higiene pessoal, cosméticos e
perfumes (ANVISA, 2000).
De acordo com a Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal
(ABIHPEC), em 2004 o mercado mundial de cosméticos cresceu 9,4% em dólares,
enquanto que o Brasil chegou a 24,3%, atingindo a sexta posição mundial, logo após
os Estados Unidos, Japão, França, Alemanha e Inglaterra. No Brasil, estima-se que
o faturamento de produtos de higiene pessoal, perfumaria e cosméticos em 2005 foi
14,5% maior em relação a 2004, e para 2006 esperava-se atingir mais de R$ 16
bilhões, que corresponde a um crescimento de 10%. Além do mercado interno, as
exportações do setor cresceram 22,8% em 2005, devido principalmente à alta
qualidade dos produtos e também à diversidade de matérias-primas encontradas
aqui (SILVA, 2006).
Uma parceria interessante que envolve a aplicação cosmética de subprodutos
de B. orellana acontece desde 1993 entre a tribo indígena Yawanawa, do Acre, e a
indústria multinacional de cosméticos Aveda, dos Estados Unidos. Os indígenas
exportam em média quatro toneladas de sementes por ano para a multinacional, que
pagava, em 2005, R$ 25 mil pelo produto. A indústria possui uma linha de
cosméticos para maquiagem denominada “Uruku”, que contém substâncias
extraídas da semente dessa planta na sua composição (KALIL, 2005).
Tendo em vista o crescimento do setor cosmético, a pesquisa de novas
matérias-primas naturais vem sendo bastante valorizada, em especial quando se
trata da utilização de plantas amazônicas.
A biodiversidade amazônica é vista com muito interesse, sobretudo no
mercado internacional, em razão da riqueza de constituintes das plantas brasileiras.
Além disso, os produtos cosméticos fabricados com ativos amazônicos são
considerados competitivos no mercado externo, pois possuem qualidade e têm valor
adequado para esse setor. Com isso, os ingredientes amazônicos, aos poucos,
estão se incorporando em linhas de cosméticos internacionais. A imagem do Brasil
com o tempo está sendo relacionada a outros valores, muitas vezes não mais sendo
lembrado como um país que desmata e queima suas florestas, sem devolver à
natureza o que lhe foi tirado, mas passa a ser reconhecido como exportador de
ativos que, além do apelo por serem exóticos, têm eficácia comprovada e são
extraídos de maneira responsável (FRANQUILINO, 2006).
4
Portanto, a proposta desse trabalho é estudar não somente o corante de B.
orellana, já bastante explorado, mas principalmente o óleo obtido de suas sementes,
cujas pesquisas, embora escassas, já trazem informações que justificam sua
aplicação em formulações cosméticas.
5
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Contribuir para o estudo fitoquímico de Bixa orellana L. Bixaceae, e aplicar
seu óleo em formulação cosmética.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Extrair o óleo de B. orellana a partir de sementes por Soxhlet;
• Determinar as propriedades físico-químicas como solubilidade, densidade,
espalhabilidade, e reologia do óleo, bem como analisá-lo em espectroscopia de
ultravioleta e infravermelho;
• Calcular o fator de proteção solar espectrofotométrico do óleo;
• Identificar seus ácidos graxos;
• Pesquisar sua atividade antimicrobiana;
• Pesquisar sua atividade antioxidante;
• Desenvolver uma fórmula cosmética.
6
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Bixa orellana Linné.
Bixa orellana Linné., é um arbusto que foi assim denominado como uma
forma de homenagem ao primeiro botânico e explorador que o estudou, Francisco
de Orellana. O nome popular urucum provém do vocábulo tupi uru-ku, que significa
amarelo. Tem-se conhecimento que os índios do Brasil, do México, Peru e Porto
Rico, onde essa espécie é conhecida como achiote, untavam-se com seu óleo e
sementes para participar de ritos cerimoniais, além de usar essa mistura como
camuflagem, que os protegia de picadas de insetos e do sol (ALONSO, 2004).
Muitos aborígines também utilizavam seu corante para tingirem objetos de cerâmica
e outros vasos de uso doméstico (CORRÊA; PENNA, 1984).
Os primeiros registros escritos sobre essa planta datam de 1500, na Carta
de Pero Vaz de Caminha ao Rei D. Manoel, quando do descobrimento do Brasil.
Nessa carta, são feitas várias menções sobre diversas espécies vegetais que aqui
existiam, porém a única espécie sobre a qual a identificação não havia dúvidas era o
urucum. Caminha descrevia essa planta como “... uns ouriços verdes, de árvores
que, na cor, queriam parecer de castanheiros, embora mais e mais pequenos, e
eram cheios duns grãos vermelhos pequenos, que, esmagados entre os dedos,
faziam tintura vermelha, de que eles andavam tintos. E quanto mais se molhavam,
tanto mais vermelhos ficavam” (FILGUEIRAS; PEIXOTO, 2002).
Além de urucum, B. orellana apresenta outros nomes populares no Brasil
como açafroeira da terra e açafroa, principalmente na Bahia. A sinonímia estrangeira
é bem vasta, podendo-se citar bija e achiote, no Peru, Cuba e Porto Rico; axiotl, no
México; urucu, na Bolívia; annatto e annatto tree, na Inglaterra; onotto e onotillo,na
Venezuela; roucou ou rocouyer, na França; e orleansbaum, na Alemanha (CORRÊA;
PENNA, 1984).
As partes utilizadas da planta são principalmente as sementes, mas também
raízes e folhas. Das sementes obtém-se o corante vermelho citado em documentos
históricos, usado inicialmente pelos indígenas como tinta corporal, e que atualmente
tem grande importância na indústria alimentícia e cosmética (ALONSO, 2004).
7
3.1.1 Família Bixacea
De acordo com ENGLER
1
, citado por JOLY (1998), e CRONQUIST (1981), a
família Bixaceae é enquadrada taxonomicamente como mostra a tabela 1.
TABELA 1 – ENQUADRAMENTO TAXONÔMICO
ENGLER CRONQUIST
Divisão Angiospermae -
Classe Dicotyledoneae Magnoliopsida
Subclasse Archichlamydeae Caryophyllidae
Ordem Violales Violales
Família Bixaceae Bixaceae
Gênero
Bixa Bixa
Espécie
B. orellana B. orellana
FONTES: JOLY, Aylthon Brandão. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. 8. ed. São Paulo:
Nacional, 1987. p. 482-485;
CRONQUIST, A.J. An Integrated System of Classification of Flowering Plants. New
York: Columbia University, 1981.
Segundo BARROSO (1978) e JOLY (1987), a família Bixaceae é
representada por um único gênero, Bixa L., nativa da América tropical e
extensamente cultivada.
CORRÊA e PENA (1984), citam algumas espécies do gênero Bixa, como B.
acuminata Bojer., B. americana Poiret., B. orellana Noronha., B. platycarpa Ruiz., B.
tinctoria Salisb. e B. urucurana Wild.
Além destas, há ainda B. arbórea Huber., B. excelsa Gleason & Krukoff., B.
odorata Ruiz., B. orellana var. leiocarpa Kuntze., B. orellana var. urucurana Willd., B.
sphaerocarpa Triana. e B. upatensis Ram. (PLANTAMED, 2005).
As espécies apresentam árvores com folhas alternas, inteiras, e com
estípulas
2
pequenas. As flores são vistosas, pentâmeras e com muitos estames
3
. A
corola
4
contém geralmente cinco pétalas róseas ou lilás, e carnosas. O ovário é
unilocular, formado de dois carpelos
5
. O fruto é seco, bilobado, contendo sementes,
ovóides, com tegumento externo carnoso e de pigmentação vermelha (JOLY, 1987).
Algumas características morfológicas da família Bixaceae são representadas
na figura 1.
1
ENGLER, A.; PRANTI, K. Die natürlichen Pflanzenfamilien, III, 6, 1895.
2
Apêndice da base do pecíolo da folha
3
Órgão masculino da flor
4
Conjunto de pétalas da flor
5
Faz parte do gineceu, órgão feminino da flor
8
FIGURA 1 – CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS GERAIS DA FAMÍLIA
BIXACEAE
1. aspecto geral de ramo florífero; 2. flor cortada
longitudinalmente; 3. antera vista de frente; 4. antera
(porção terminal do estame) vista por trás; 5. detalhe
do gineceu; 6. corte transversal ao ovário; 7. frutos; 8.
fruto cortado longitudinalmente; 9. diagrama floral de
Bixa orellana.
FONTE: JOLY (1987), 485
3.1.2 Aspectos Botânicos
De acordo com REVILLA (2001), B. orellana é uma árvore pequena ou
arbusto com folhagens de três a cinco metros de altura, podendo alcançar 10
metros. O tronco é curto e tem de 20 a 30 cm de diâmetro, casca cinza escuro com
lenticelas
6
em filas verticais. As folhas são alternadas, de 10 a 20 cm de
comprimento e 5 a 10 cm de largura, pontiagudas, de cor verde em ambas as faces
e com pecíolo alargado. A figura 2 apresenta o aspecto da árvore B. orellana.
Conforme mostra a figura 3, as flores podem ser brancas ou rosadas, com 5
pétalas largas e redondas; os estames são numerosos podendo apresentar cor
branca ou amarelada. O fruto tem formato de cápsula deiscente
7
, bivalvar, coberta
externamente com apêndices flexíveis vermelhos, verdes ou pardos (REVILLA,
2001).
6
Pequenos pontos de ruptura no caule, atuando como órgãos de arejamento.
7
Órgãos vegetais que se abrem espontaneamente por suturas quando chega a maturação
9
FIGURA 2 - ASPECTO DA ÁRVORE DE Bixa orellana
FONTE: A autora
FIGURA 3 - FLOR E FRUTO DE Bixa orellana
FONTE: www.flickr.com
Segundo OLIVEIRA, AKISUE e AKISUE M. (1996), as sementes medem de
0,3 a 0,5 cm de comprimento por 0,2 a 0,3 cm de diâmetro, e o formato varia de
piramidal a quase cônico. A quantidade de sementes por cápsula varia conforme o
autor: para ALONSO (2004), cada cápsula pode conter de 30 a 40 sementes em
média, enquanto que para INGRAM e FRANCIS (1969) pode-se encontrar de 10 a
15. A figura 4 mostra o aspecto do fruto bivalvar contendo as sementes.
10
FIGURA 4 – FRUTO BIVALVAR CONTENDO AS SEMENTES DE Bixa orellana
FONTE: A autora
Ainda conforme OLIVEIRA, AKISUE e AKISUE M. (1996), a superfície das
sementes é quase lisa, apresentando uma depressão em suas faces, sendo
percorrida longitudinalmente por um sulco profundo. Apresenta coloração vermelha,
e na extremidade afilada há uma região mais clara, denominada de hilo. Na
extremidade contrária ao hilo existe uma pequena depressão com um ponto escuro
no centro, região conhecida como coroa. O embrião pode ser visto através de uma
secção longitudinal da semente, e por um corte transversal pode-se observar um
tegumento fino, endosperma volumoso e os dois cotilédones do embrião em forma
de lâminas relativamente finas. A semente é quase totalmente envolvida por um arilo
aderido ao tegumento, como mostra a figura 5.
Um corte transversal dessa semente permite observar microscopicamente
um arilo formado por células retangulares e alongadas tangencialmente, que estão
repletas de substâncias alaranjadas. Logo abaixo, encontra-se a região paliçádica
com paredes espessadas. A próxima é a camada mamilonar, que possui um
contorno hexagonal e lúmen pequeno, quando vistas de face. Em seguida, encontra-
se a camada obliterada com células “amassadas”, e a camada colunar, que
apresenta células com um espessamento que dá um aspecto de uma série de
colunas. Por fim, a camada com espessamento em “U”. O tegumento constitui-se
das camadas abaixo do arilo e o endosperma apresenta amido e gotículas de óleo
(OLIVEIRA, AKISUE, AKISUE M., 1996). A figura 6 mostra algumas dessas
características microscópicas.
11
FIGURA 5 – (A) SEMENTE INTEIRA E (B) SECÇÃO LONGITUDINAL DA
SEMENTE DE Bixa orellana
A B
FONTE: OLIVEIRA (1996), 235
(A) 1 – região do hilo; 2 – região da coroa; 3 – sulco longitudinal
(B) 1 – região da coroa; 2 – arilo; 3 – tegumento; 4 – endosperma; 5 – cotilédone; 6 – radícula
FIGURA 6 – (A) SECÇÃO TRANSVERSAL E (B) ENDOSPERMA DA SEMENTE DE
Bixa orellana
A B
FONTE: OLIVEIRA (1996), 236
(A) 1- arilo; 2 – camada paliçádica; 3 – camada mamilonar; 4 – camada obliterada; 5 – camada
colunar; 6 – camada com espessamento em U; 7 – endosperma
(B) endosperma com amido e gotículas de óleo
3.1.3 Origem e Aspectos Agronômicos
Bixa orellana é uma planta nativa do Brasil, desenvolvendo-se também em
outras regiões da América do Sul e Central. É cultivada em países tropicais como
12
Peru, México, Equador, Indonésia, Índia, Quênia e leste da África (ELIAS et al.,
2002). Segundo ALONSO (2004), os cultivos têm se estendido bastante para as
áreas tropicais, pois é uma espécie pouco exigente com o solo na qual se
desenvolve, crescendo favoravelmente no solo pouco enriquecido da Amazônia.
Já de acordo com ELIAS et al. (2002), esta espécie desenvolve-se melhor
em solos ricos em nutrientes e com pH de 5,5 a 6,0. Como esse tipo de solo
enriquecido é difícil de ser encontrado naturalmente, torna-se importante sua
fertilização orgânica e mineral.
REBOUÇAS et al. (2006) relatam que o urucuzeiro é uma planta exigente do
ponto de vista nutricional, sendo necessária na fase inicial de crescimento a adição
de alguns nutrientes como cálcio, nitrogênio, potássio, ferro e manganês. Tendo em
vista que a qualidade das sementes está diretamente relacionada com o teor de
bixina produzida, esses cuidados no cultivo são de extrema importância. Ainda de
acordo com os autores, para as sementes serem classificadas para exportação, o
teor de bixina deve ser superior a 2,5%, o que ainda não acontece na média das
sementes nacionais.
De acordo com REVILLA (2001), o clima propício para o cultivo de B.
orellana é o tropical, com temperaturas entre 24 ºC e 30 ºC. Com relação ao solo, a
planta não se desenvolve em áreas encharcadas, e recomendam-se solos pesados
com abundante matéria orgânica, boa agregação e permeabilidade. Costuma-se
efetuar a plantação no início de temporadas chuvosas. A propagação é feita
mediante sementes, mantendo as mudas em sacos plásticos durante três meses,
até quando a planta alcançar 20 a 25 cm de altura. A colheita pode ser feita com
tesouras podadoras ou manualmente. As folhas podem ser colhidas após 9 meses e
os frutos após 16 meses da semeação, quando estiverem maduros, o que pode ser
identificado pela coloração mais escura e consistência mais dura do fruto.
Segundo SATYANARAYANA, PRABHAKAR e RAO (2003), a colheita de
sementes deve ser feita após o terceiro ano da plantação, durante um período de 10
a 12 anos. A concentração dos pigmentos variam de 5% nos frutos de formato
esférico, 3 a 3,5% no formato cônico, e 1,5 a 2% nos frutos ovais. Os frutos
aparecem cerca de 30 dias após a florescência. O rendimento das sementes varia
de região para região, pois dependem da variedade da planta, solo e clima, mas
pode-se ter uma média de 300 a 900 quilos por hectare.
13
Ainda de acordo com os mesmos autores, após a colheita dos frutos, estes
devem ser secos o mais rápido possível para prevenir germinação das sementes ou
contaminação por fungos e bolores. A secagem ao sol pode levar de 3 a 10 dias. O
método tradicional para obtenção das sementes é bater os frutos com um bastão
contra o chão. Outra forma é utilizar peneiras ou ventilação, mas tendo o cuidado
para evitar abrasão intensa e conseqüente perda do pigmento. Imediatamente após
limpas, as sementes devem ser cuidadosamente embaladas para evitar
contaminação e degradação do pigmento quando exposto à luz.
De acordo com BONFIM et al. (2006), as sementes não devem ser secas
diretamente ao sol, em terreiros ou lonas, pois pode provocar perda na qualidade e
quantidade de pigmentos. Da mesma forma, para manter a integridade das
sementes, sua retirada deve ser realizada em máquinas apropriadas, denominadas
descachopadoras. A condição adequada para colheita dos frutos geralmente
encontra-se aos 130 dias após a abertura das flores.
Segundo SOLARZANO (1991), B. orellana apresenta uma grande
variabilidade, desde árvores com caules verdes, flores brancas e frutos amarelos ou
verdes, até árvores com caules vermelhos, flores rosas e frutos de cor púrpura.
Levando em consideração essas características, o autor agrupa as variedades
segundo a forma e cor dos frutos, a quantidade de cerdas e o conteúdo de bixina.
Dessa forma, existem as variedades com frutos esféricos, frutos amarelos,
alaranjados, verdes, com muitos pêlos ou glabras.
De acordo com a Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola (EBDA,
2002), dentre as inúmeras variedades conhecidas, ainda existe a variedade bico de
pato, que foi a primeira introduzida na Bahia, e a peruana paulista, desenvolvida
pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA). A variedade
peruana paulista, conforme FRANCO e SILVA ([2002?]), é a mais produzida no
Brasil, apresentando a maior quantidade de bixina.
FRANCO et al. (2002), descrevem algumas pragas e doenças que podem
atacar o urucuzeiro. Dentre elas estão as formigas cortadeiras (Atta sp), trips
(Selenothrips sp), o percevejo (Leptoglossus sp), cochonilhas (Pinnaspis sp),
caruncho do urucum (inseto da ordem Coleóptera e família Bruchidae), chupão dos
frutos (hemíptero da família Coreideae), ácaros e o bezourinho (Capsus sp). O
percevejo, o chupão dos frutos e o caruncho são os que atacam diretamente os
14
frutos, causando danos às sementes e prejudicando a sua comercialização. Dentre
as doenças, a principal é a causada pelo fungo oidio bixa (Oidium sp), pertencente à
subdivisão Ascomycotina, família Erysiphaceae. A doença se manifesta pelo
aparecimento de bolores brancos nas folhas e nos pêlos dos frutos da variedade
bico de pato, como mostra a figura 7. Um ataque intenso nas folhas pode interferir
nas funções metabólicas normais da planta, provocando deficiência no seu
desenvolvimento.
FIGURA 7 - ASPECTO DA FOLHA DE Bixa orellana COM OIDIO
FONTE: FRANCO et al (2002), 45
Outro agente causador de doença no urucuzeiro é a espécie Rhizoctonia
solani, que provoca uma desintegração do colo das mudas, que caem por perderem
sua sustentação. A doença atinge a planta somente no estágio de mudas, as quais
irão conter o agente causador, que também se encontra nas sementes. Caso não
haja controle, as perdas podem chegar à totalidade da plantação.
A cescosporiose, causada por Cescospora bixae Allesch e Noack, afeta
apenas folhas maduras, e se não houver controle, as folhas secam e caem. Os
sintomas são manchas irregulares de cor marrom avermelhada a marrom escura,
que são circundadas por um halo amarelo, conforme a figura 8.
Além dessas doenças foliares, há ainda a podridão da raiz, causada pelo
fungo Pythium sp, que provoca pequenas lesões necróticas de cor marrom escuro.
Nas partes aéreas, aparecem manchas amarelas generalizadas, e que quando
atingem um estágio avançado, causam a morte da planta (FRANCO et al., 2002)
15
FIGURA 8 - ASPECTO DA FOLHA DE Bixa orellana COM CERCOSPORIOSE
FONTE: FRANCO et al. (2002), 46
3.1.4 Componentes Químicos
Os constituintes químicos de B. orellana são muitos, podendo-se citar alguns
grupos de substâncias. Dentre os flavonóides, destacam-se o glucosídeo de
apigenina, bisulfato de apigenina e hipoaletina (ALONSO, 2004). Há também ácido
gálico, ácido alfitólico, óleo essencial, diterpenos (geraniol, geranil), além de
vestígios de alcalóides. Dentre os carotenóides estão a bixina e a norbixina, que são
os compostos de maior importância comercial, já que compõem a maioria do
pigmento vermelho extraído das sementes. Além destes, ainda há orelina, mono e
sesquiterpenos, dentre outros carotenóides minoritários (REVILLA, 2001).
PINO e CORREA (2003), identificaram alguns componentes do óleo
essencial das sementes de B. orellana por meio de cromatografia gasosa associada
à espectroscopia de massa (CG-EM), que se encontram listados com suas
respectivas concentrações na tabela 2.
Os componentes majoritários identificados são o acetato de (Z-E)-farnesil,
acetato de ocidentalol, espatulenol e ishwarano.
Conforme GALINDO-CUSPINERA, LUBRA e RANKIN (2002), os
sesquiterpenos correspondem ao maior grupo de compostos voláteis presentes na
planta, constituindo 38% de todos os constituintes voláteis encontrados em extratos
oleosos e 89% em extratos aquosos. O β-humuleno está presente em maior
quantidade, seguido pelo γ-elemeno e espatulenol. Juntamente com alguns
monoterpenos, os sesquiterpenos são descritos como tendo propriedades
antimicrobianas. Alguns constituintes possíveis responsáveis por essa característica
são β-humuleno, α e β-pineno, β-felandreno, α-terpineol e cariofileno, também
16
encontrados nas frações voláteis, o que sugere atividade antimicrobiana dessa
planta.
TABELA 2 – COMPOSIÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE SEMENTES DE
Bixa orellana
Componente % Componente %
Α-tujeno 1.0 Viridifloreno 1.1
Α-pineno 2.8 α-selineno 3.1
Β-pineno 2.5 β-bisaboleno 1.0
mirceno 0.2 7-epi-α-selineno 0.5
p-cimeno 0.1 cis-calameneno 0.5
limoneno 0.3 δ-cadineno 0.7
p-cimoneno 0.3 α-calacoreno 0.3
crisantenona 2.9 espatulenol 9.6
piperitona 0.5 β-copaen-4-α-ol
(1)
0.3
eucarvona 2.3 Humuleno epoxido II 0.4
Δ-elemeno 0.3 acetato de ocidentalol 9.7
Α-cubebeno 0.1 acetato de (E)-nerolidol 7.3
Α-ylangeno 0.4 (E,E)-farnesol 6.2
Β-elemeno 0.3 (E,Z)-farnesol 2.7
longifoleno 0.5 14-hidroxi-α-muuroleno 0.8
Z- β-farneseno 1.5 acetato de (Z,E)-farnesil 11.6
ishwarano 9.1 acetato de (E,E)-farnesil 0.4
valenceno 0.7
FONTE: PINO e CORREA, 2003
(1)
Tentativa de identificação
De acordo com SATYANARAYANA, PRABHAKAR e RAO (2003), os
componentes presentes no óleo essencial obtido de sementes secas e frescas de B.
orellana incluem principalmente hidrocarbonetos (66,5%) e sesquiterpenos
oxigenados (12%). Esses autores também identificaram o α-pineno (9,3%), β-pineno
(4,8%), α-elemeno (3,3%), ishwarano (30,7%), valenceno (2,7%) e amorfeno (0,2%).
KANJILAL e SINGH (1995) citam um rendimento aproximado de 0,07% de óleo
essencial das sementes.
COELHO et al. (2003) relatam a presença de um óleo essencial rico em
geranilgeraniol, que representa cerca de 1% das sementes secas. De acordo com
STRINGHETA (2006), o urucum é a fonte mais abundante desse composto.
Segundo ALONSO (2004), considerando 100 g de sementes secas de B.
orellana encontra-se de 13 a 17% de proteínas (compostas por aminoácidos como
triptofano, lisina, isoleucina, metionina, fenilalanina e treonina); altas concentrações
de fósforo e quase ausência de cálcio. Em 100 g de planta fresca encontram-se 0,3g
17
de lipídeos, 14 g de carboidratos, 0,5 g de fibras, 7 mg de cálcio, 10 mg de fósforo,
0,8 mg de ferro, 0,9 μg de carotenos e 2 mg de ácido ascórbico. As sementes
apresentam, além de pentoses, pectinas, proteínas, taninos, alto teor de ácidos
graxos poliinsaturados e pequena quantidade de ácido linoléico e oléico. RANJANA
et al. (1983) estudaram o óleo das sementes dessa planta, e demonstraram haver
presença considerável de ácidos graxos insaturados.
FREGA, MOZZON e BOCCI (1998) identificaram nas sementes de B.
orellana tocotrienóis, que são potentes antioxidantes e previnem a oxidação do óleo
no interior da semente. Enquanto o óleo possui quantidades pequenas de tocoferol,
apresenta concentrações maiores de δ-tocotrienóis, além de traços de β-tocotrienol.
Nesse estudo foram quantificados 140 mg de tocotrienóis por 100 g de sementes
secas (ou 5,2% p/p do extrato lipídico), determinado por CG/MS, e 147 mg por 100 g
de sementes (ou 5,5% p/p do extrato lipídico), determinado por cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE). Segundo o autor, nenhuma espécie vegetal parece
apresentar concentração semelhante de δ-tocotrienóis.
SATYANARAYANA, PRABHAKAR e RAO (2003) citam outros carotenóides
presentes em pequenas quantidades na planta, como β,β-caroteno, criptoxantina,
luteina, zeaxantina, metilbixina e o apocarotenóide metil(9Z)-8’-oxo-6,8’-
diapocarotenoide-6-oato.
MERCADANTE, STECK e PFANDER (1997) isolaram e identificaram os
seguintes carotenóides a partir de extratos das sementes: metil(all-E)-8’-apo-β-
caroteno-8’-oato, metil(7Z,9Z,9’Z)-apo-6’-licopenoato, metil(9’Z)-apo-6’-licopenoato,
metil(9’Z)-apo-8’-licopenoato, metil(all-E)-apo-8’-licopenoato e metil(all-E)-apo-6'-
licopenoato.
3.1.4.1 Bixina e norbixina
A bixina é um apocarotenóide com 25 carbonos que constitui, em média,
2,5% das sementes secas de B. orellana. Removendo-se o grupo metil éster da
bixina, tem-se a norbixina, um ácido dicarboxílico (EVANS, 1992), de acordo com a
figura 9.
Um apocarotenóide é originado pela clivagem oxidativa dos carotenos, pois
cada dupla ligação é susceptível à oxidação. Essa ruptura realiza-se por meio de
18
enzimas que atuam em pontos específicos da molécula, gerando dois novos
carotenos (OLIVEIRA, 2005).
FIGURA 9 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DA BIXINA E NORBIXINA
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OCH
3
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OH
BIXINA
NORBIXINA
De acordo com SATYANARAYANA, PRABHAKAR e RAO (2003), a bixina
(monometiléster do ácido dicarboxílico norbixina) é o principal componente colorido
de B. orellana (mais de 80% dos carotenóides totais), e devido à intensa insaturação
está sujeita também à isomerização. O isômero cis (metil-hidrogênio 9’-cis-
6,6’diapocaroteno 6,6’dioato) é o que está presente em maior quantidade na planta,
e quando submetido a altas temperaturas se converte na forma trans, mais estável
(GALINDO-CUSPINERA;LUBRA; RANKIN, 2002).
A cis-bixina é solúvel na maioria dos solventes orgânicos polares, onde
apresenta uma coloração mais alaranjada, porém insolúvel em óleos vegetais,
podendo se converter rapidamente em trans isômeros devido a sua instabilidade. A
trans-bixina tem propriedades semelhantes ao isômero cis, porém apresenta
coloração vermelha em solução e é solúvel em óleo vegetal. Os isômeros cis-bixina,
trans-bixina, cis-norbixina e trans-norbixina diferem em algumas características
físicas, e as estruturas trans não estão presentes naturalmente na planta
(SATYANARAYANA, PRABHAKAR; RAO 2003).
No mecanismo da biossíntese da bixina sugere-se a ação de enzimas como
dioxigenases, aldeído desidrogenases e metiltransferases que participam de uma
série de reações que se processam a partir de um precursor de 40 carbonos.
Acredita-se que esse precursor seja o licopeno, uma vez que já se identificaram
19
traços de derivados dessa molécula acumulados na planta (BOUVIER; DOGBO;
CAMARA, 2003). O caminho proposto para biossíntese da bixina é apresentado na
figura 10.
FIGURA 10 – BIOSSÍNTESE DA BIXINA
LICOPENO
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
O
O
H
BIXINA ALDEÍDO
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OH
NORBIXINA
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OCH
3
BIXINA
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
3
CO
O
O
OCH
3
BIXINA DIMETIL ESTER
A degradação dos carotenóides de B. orellana pode ocorre após a exposição
dos corantes à luz, temperaturas elevadas ou na presença de dióxido de enxofre
(SATYANARAYANA, PRABHAKAR; RAO 2003). Os produtos alimentícios
produzidos com o corante extraído das sementes, segundo SCOTTER et al. (1994),
20
devem ser armazenados em condições controladas a fim de evitar processos de
degradação e isomerização dos componentes. De acordo com KANJILAL e SINGH
(1995), o armazenamento das sementes em condições ambientes provocou uma
perda de 40 a 50% no conteúdo de bixina, enquanto que em refrigeração essa perda
reduziu-se para 20 a 25%.
A bixina é indexada no Color Index como CI 75120, e pela Comunidade
Econômica Européia como EEC E160b e CI Natural Color 4 (OLIVEIRA, 2005).
3.1.5 Usos e Ações Farmacológicas
Desde o começo do século XX, trabalhos científicos já citavam os mais
diversos usos de B. orellana. AIYAR (1922) justifica seu estudo em razão de seu
largo emprego na indústria de laticínios. Já INGRAM e FRANCIS (1969), relatam
que países como Estados Unidos, Dinamarca, Holanda e Nova Zelândia utilizavam
essa planta como corante de produtos como margarinas, sorvetes e pães; latino-
americanos usavam como condimento; indígenas do Brasil aplicavam na pele para
repelir insetos; e nas Filipinas, os usos eram mais diversificados, como a fabricação
de ceras para pisos, polidores de sapatos e móveis, esmaltes, tinturas, cosméticos,
e aplicação nas indústrias de couro e tecidos.
Em razão de ser produzido com baixo custo e devido à ausência de
toxicidade, o corante produzido a partir das sementes de B. orellana tem se tornado
cada vez mais atrativo e conveniente, em substituição aos corantes sintéticos
(STRINGHETA, 2006). A demanda por corantes naturais vem crescendo na medida
em que se provam a nocividade dos sintéticos, e por essa razão, o corante do
urucum é um dos poucos permitidos pela Food and Agriculture Organization (FAO)
para aplicação em alimentos (BARBOSA FILHO et al., 1998).
Como corante alimentício, é vastamente aplicado em laticínios, como
queijos, margarina e manteiga. No setor de embutidos, a principal utilização é na
salsicha, onde se aplica o corante líquido hidrossolúvel norbixina. Há ainda usos nas
indústrias de sorvetes, confeitaria e massas (LIMA, 2001).
MIRANDA (2006) ressalta ainda a importância do colorífico como
condimento, pois atende a alguns requisitos necessários para essa aplicação, tais
21
como ser natural, ser facilmente encontrado para compra, ter alta capacidade de
corar e ser inócuo.
Considerando a larga aplicação na indústria alimentícia, diversos trabalhos
tratam da toxicidade desse corante, e sua inocuidade está comprovada por meio de
ensaios de toxicidade e mutagenicidade, mesmo em elevadas concentrações
(PAUMGARTTEN et al., 2002; BAUTISTA et al., 2004; AGNER et al., 2004;
MIRANDA, 2006; BARBOSA FILHO, 2006). Entretanto, SILVA (2000) realizou
ensaios in vitro com a bixina, e não descartou uma possível ação carcinogênica
desse composto.
GLÓRIA (2006) relata ainda, além da utilização em alimentos, a aplicação do
corante em cosméticos, principalmente para proteção da pele dos efeitos nocivos
dos raios solares, e também a adição das sementes em ração animal, devido a seu
alto valor nutritivo e como fonte de pigmento.
De acordo com FLEISCHER et al. (2003) e ALONSO (2004), o extrato
etanólico das folhas do urucum apresentam atividade antimicrobiana contra
microorganismos como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Candida
albicans, porém em proporções diferentes. O extrato etanólico das sementes
também foi estudado, entretanto não parece apresentar atividade considerável.
Ainda em relação ao efeito antimicrobiano, COELHO et al. (2003), afirmam
que extratos obtidos dos frutos, das raízes e das folhas apresentam resultados
positivos. Em contraposição, extrato das sementes não demonstrou o mesmo efeito.
Foram testadas as atividades antimicrobianas de tinturas de raiz, fruto, folha, flor e
caule frente a bactérias e leveduras. Nenhuma das amostras mostrou resultado
positivo em relação a leveduras. Considerando todas as tinturas testadas, a da folha
foi a que demonstrou maior atividade antimicrobiana, pois inibiu o crescimento de
todas as bactérias testadas no estudo, sendo que os maiores halos de inibição
observados foram para Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp, Serratia
marcescens, Enterobacter aerogenes, Chromobacterium violaceum e Proteus sp.
Entretanto, GARCIA et al. (2003) estudaram a ação antifúngica de nove
espécies de plantas, dentre elas B. orellana, e comprovaram a leve atividade de um
extrato metanólico de folhas contra Trychophyton mentagrophytes e Trychophyton
rubrum. Nesse mesmo trabalho, os autores citam outro estudo que mostrou
atividade contra Cryptococcus neoformans e Microsporum gypseum. Já ZOLLO et al.
22
(1998), afirmam que o óleo essencial de folhas de B. orellana não apresenta
atividade considerável contra Microsporum gypseum, bem como contra
Aureobasidium pullulans, Candida albicans, Aspergillus flavus e Trichoderma viride,
pois não possui em sua constituição conteúdo considerável de compostos
antifúngicos, como por exemplo, o linalol, γ-terpineno, ρ-cimeno e eugenol.
O efeito hipoglicemiante também tem sido bastante estudado, de acordo com
ALONSO (2004). Além disso, as pró-vitaminas A ou carotenos das sementes
conferem uma ação antioxidante contra radicais livres e radiação solar. Extratos
aquosos de raízes da planta demonstraram efeito de inibição da atividade secretora
gástrica, hipotensão arterial e até leve sedação. Extratos aquosos e etanólicos de
sementes e folhas parecem inibir a proliferação de células de um tipo de linfoma
denominado Molt4. Somente o extrato aquoso de sementes provocou uma
diminuição da atividade motora e o estímulo da diurese, porém sem sinais de
toxicidade. Outras ações já estudadas são contração uterina, atividade
antiinflamatória, cicatrizante tópico, neutralização do veneno de Bothrops atrox,
eliminando a hemorragia característica da efermidade, e na fitocosmética, o extrato
oleoso, de 2 a 6%, pode ser usado como protetor solar ou bronzeador.
LIMA et al. (2001), estudaram o efeito no metabolismo lipídico causado pelos
carotenóides bixina e norbixina, juntamente com a quercetina, um flavonóide
também presente no urucum. Concluíram que a bixina foi a substância que melhor
apresentou efeito na redução do colesterol-HDL, bem como na manutenção dos
níveis dessa lipoproteína. A norbixina e a associação de bixina e quercetina também
demonstraram resultados positivos, sugerindo que estas substâncias poderão ser
utilizadas futuramente em medicamentos para prevenção de doenças cardíacas.
HARDER (2005) demonstrou a redução dos níveis de colesterol nos ovos de
poedeiras alimentadas com ração enriquecida com sementes da planta. Além disso,
as gemas apresentaram-se com coloração mais amarela, e os teores de ferro e
carotenóides tiveram um acréscimo em relação ao grupo controle.
Outros usos populares incluem as ações antiemética, antidiarréica, antídoto
contra cianuretos, para dores renais, malária, queimaduras, asma, como cicatrizante,
expectorante, digestivo e diurético (ALONSO, 2004).
23
CORRÊA (1984), cita o uso do da raiz de urucum para problemas digestivos,
o pó de sementes como afrodisíaco e a decocção das folhas para combater vômitos
na gravidez.
3.2 ANTIOXIDANTES
3.2.1 Radicais Livres
De acordo com GUERRA FILHO e FANAN (1994):
Os radicais livres são moléculas que perderam um elétron de sua camada mais externa,
ficando com outro desemparelhado. Por razões quânticas, esta molécula tende a
emparelhar este elétron com outro de alguma outra molécula; por isto os radicais livres se
tornam tão reativos. A reatividade varia com a estrutura química, temperatura e
concentração de suas moléculas no meio de reação. Geralmente apresentam-se em
concentrações de nanogramas (parte por bilhão).
A molécula iniciadora do processo de formação de radicais livres é o
oxigênio por sua facilidade em reagir. Ao final da respiração aeróbica o oxigênio
reduz-se à água, e nessa fase metabólica originam-se espécies altamente reativas,
como o superóxido (O
2
-
), radical hidroperóxido (HO
2
•
) e o radical hidroxila (OH
•
)
Essas espécies são especialmente importantes nos processos de peroxidação
lipídica nas membranas celulares (GUERRA FILHO; FANAN, 1994).
A formação dessas espécies reativas de oxigênio (ERO) pode ser
demonstrada pela figura 11.
O oxigênio molecular em seu estado fundamental, ao absorver energia, pode
se converter para o estado singlete excitado (
1
O
2
). Tanto essa forma singlete como a
forma fundamental do oxigênio, ao absorver um elétron, podem se converter em
superóxido (O
2
-
). Numa segunda etapa de redução, o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
é formado a partir do superóxido, pela absorção de mais um elétron e de 2 H
+
. Essa
espécie, após receber um terceiro elétron do processo e mais 1 H
+
, reduz-se ao
radical hidroxila (
•
OH), o qual ao absorver o quarto elétron e 1 H
+
, forma finalmente a
molécula da água (H
2
O). As espécies HO
2
•
e HO
2
-
, que correspondem às bases
24
FIGURA 11 – FORMAÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
FONTE: VOEGELI et al. (1992), 49.
conjugadas do peróxido de hidrogênio, por apresentarem valores extremos de pKa,
embora reativas, são fisiologicamente irrelevantes (VOEGELI et al., 1992).
Cinco tipos de reações podem desencadear a formação de radicais livres na
célula. A primeira delas, a homólise unimolecular, ocorre em moléculas como o
oxigênio, quando algumas ligações são rompidas gerando uma divisão igual de
elétrons para ambos os radicais formados (O
2
↔ O
•
+ O
•
). A radiólise é resultado da
exposição à energia solar principalmente a raios ultravioleta B (UVB), o que pode
causar danos no DNA celular pela ação dos radicais livres formados com as base
púricas e pirimídicas, provocando mutações gênicas. A fotólise é ocasionada pela
luz e provoca alterações nas ligações químicas de moléculas, e o que se origina é
um oxigênio singlete, iniciador do processo oxidativo. Outra reação é a
desencadeada por pirólise, quando fontes como poluentes, óxidos de nitrogênio e
enxofre gerados por combustão industrial formam radicais livres na atmosfera. E
finalmente as radiações ionizantes, como raios X e cósmicos, que liberam um ou
mais elétrons de uma biomolécula, formando um radical extremamente instável, e
que é responsável por 10% de toda lesão do DNA causada por agentes não
biológicos (GUERRA FILHO; FANAN, 1994).
25
A peroxidação lipídica, evento importante dos sistemas biológicos mediados
por radicais livres, é um processo de reações subseqüentes, que apresenta uma
fase de iniciação, propagação e término, conforme o quadro 1.
QUADRO 1 – MECANISMO DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
1. LH ---------------------- L
•
INICIAÇÃO
2. L
•
+ O
2
----------------- LOO
•
LOO
•
+ LH ------------ LOOH + L
•
3. R
•
+ AOH -------------- RH + AO
•
TÉRMINO
LH: Lipídeo insaturado LOO
•
: Radical peroxila
L
•
: Radical lipídico R
•
: L
•
ou LOO
•
LOOH: Hidroperóxido lipídico AOH: Antioxidante
PROPAGA
Ç
ÃO
FONTE: DI MAMBRO; MARQUELE; FONSECA (2005), 76
Nesse mecanismo de peroxidação estão envolvidos os antioxidantes, os
quais como definido por VOEGELI et al. (1992): “... são substâncias que retardam ou
evitam de forma significativa a oxidação de um substrato”. Eles podem ser divididos
em eliminadores das EROs, agentes redutores, enzimas antioxidantes ou quelantes
de metais de transição.
Os eliminadores são convertidos, após reação com a ERO, em novos
radicais de baixa reatividade. Os agentes redutores (como, por exemplo, o ácido
ascórbico) são doadores de elétrons e previnem a oxidação de biomoléculas, e são
especialmente predominantes nos espaços intracelulares. A superóxido dismutase,
catalase e glutation peroxidase são importantes enzimas antioxidantes, que agem
rapidamente sobre as EROs impedindo a formação de radicais livres. E por fim os
quelantes, que atuam pela ligação a metais de transição, os quais são promotores
de reações de radicais livres (VOEGELI et al., 1992).
Como já citado por GUERRA FILHO e FANAN (1994), as EROs alteram a
maior parte das moléculas biológicas como os ácidos nucléicos, ácido hialurônico,
colágeno, enzimas e principalmente os ácidos graxos insaturados. A peroxidação
26
lipídica provoca a destruição da célula e como conseqüência a morte celular, e com
isso atribui-se aos radicais livres a causa de muitas doenças, como o câncer e o mal
de Alzheimer, além de atuarem no processo de envelhecimento. O dano causado
pelas EROs é denominado estresse oxidativo. O sistema biológico, contudo,
apresenta processos enzimáticos e não enzimáticos que são a primeira defesa do
organismo contra os radicais livres (VOEGELI et al., 1992).
Ainda de acordo com GUERRA FILHO e FANAN (1994), os mecanismos
naturais de neutralização dos radicais livres são conduzidos pelas enzimas
superóxido dismutase, catalase e glutation peroxidase, além de outras moléculas
como as vitaminas A, D e C e seus respectivos derivados.
A superóxido dismutase está presente na forma de duas isoenzimas. Uma
localiza-se no citoplasma e contém cobre e zinco; a outra apresenta magnésio em
sua estrutura e é mitocondrial. Essa enzima é considerada como protetora da
longevidade, pois é essencial para todos os organismos que necessitam de oxigênio
para sobreviver. Atua sobre os radicais superóxido e hidroperóxido pela conversão
destes em peróxido de hidrogênio e oxigênio, conforme as reações: 2O
2
-
+ 2H
+
'
H
2
O
2
+ O
2
e HO
2
•
+ H
+
' H
2
O
2.
As catalases, ao contrário, agem sobre outra espécie reativa, o peróxido de
hidrogênio, convertendo-o em duas moléculas de água e uma de oxigênio. Essa
enzima está presente nos peroxissomos e catalisa a reação de conversão do
peróxido de hidrogênio de forma muito rápida, quase que concomitantemente à
formação dessa molécula.
Já a glutation peroxidase é um complexo de várias enzimas que dependem
de selênio para atuarem sobre a redução do peróxido de hidrogênio, de radicais
hidroperóxidos e de ácidos graxos peroxidados (ESTEVE; KRIESTEN, 1990).
De acordo com ESTEVE e KRIESTEN (1990), existem diversas teorias
sobre os mecanismos do envelhecimento, que vão desde fatores genéticos até
ambientais. Para o autor, a teoria que atribui aos radicais livres a causa do
envelhecimento é a que melhor se ajusta aos fatos reais de que se tem
conhecimento. A neutralização desses radicais, portanto, evita a alteração dos
lipídeos de membrana e conseqüentemente modificações ou morte celular.
27
Levando-se em consideração essas informações, a cosmética dispõe de
alguns ativos que possuem poder antioxidante e de prevenção do envelhecimento
cutâneo. Dentre eles, três vitaminas apresentam grande capacidade neutralizante de
radicais livres: A, C e E. A vitamina A favorece o metabolismo cutâneo correto e
mantém a pele em bom estado. A vitamina C, que se constitui do ácido ascórbico
hidrossolúvel e seus derivados lipossolúveis, evita processos peroxidativos e age
sinergicamente com a vitamina E para formação de fibras colágenas do tecido
conjuntivo. Já a vitamina E ou tocoferol atua de um modo peculiar por se intercalar
entre os lipídeos da camada mais externa da epiderme formando uma barreira
protetora (GUERRA FILHO; FANAN, 1994; ESTEVE; KRIESTEN, 1990).
Além das vitaminas, outras substâncias como os flavonóides oriundos de
extratos vegetais também são potentes antioxidantes. Como exemplo, pode-se citar
os flavonóides de Centella asiatica e de Gingko biloba (GUERRA FILHO; FANAN,
1994).
De acordo com DI MAMBRO, MARQUELE e FONSECA (2005), existe
atualmente uma tendência em se usar extratos vegetais como antioxidantes por
serem de origem natural. Nesses casos, porém, um fator importante a se considerar
é se os ativos antioxidantes do extrato continuarão apresentando essa atividade
após serem incorporados em uma formulação de uso tópico. Os métodos in vitro
para avaliar a capacidade antioxidante dos extratos vegetais baseiam-se na
habilidade do antioxidante em seqüestrar radicais livres ou inibir a peroxidação
lipídica, e em razão da complexidade de compostos nos extratos, sugere-se avaliar
a propriedade anti-radicais livres por dois ou mais métodos.
MARTÍNEZ-TOMÉ et al. (2001) apresentam um estudo comparativo da
atividade antioxidante de condimentos como colorau (Bixa orellana), páprica
(Capsicum annum), cominho (Cuminum cyminum), orégano (Origanum vulgare) e
açafrão (Crocus sativus) contra antioxidantes sintéticos, como butil hidroxianisol
(BHA), butil hidroxitolueno (BHT) e propil galato. Foram realizados cinco ensaios
diferentes, e a conclusão foi que essas especiarias apresentam boas atividades
antioxidantes, sendo que em alguns testes sua ação se sobrepõe às substâncias
sintéticas. Isso sugere uma vantagem na substituição de compostos sintéticos por
naturais em alimentos, uma vez que além de fornecerem cor e aroma, esses
28
condimentos também irão auxiliar na melhor conservação dos alimentos contra
oxidação.
Um exemplo de método in vitro para a avaliação da capacidade antioxidante
é a redução do NBT (azul de nitro tetrazólio) ou citocromo C pelo superóxido, que é
fornecido pelo sistema xantina-xantina oxidase. Outros ensaios in vitro baseam-se
no seqüestro do radical hidroxila tendo como substrato a desoxirribose; análise da
capacidade doadora de H
+
para o radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil); inibição
da peroxidação lipídica e inibição da redução de quimioluminescência.
Um dos métodos mais adequados para avaliar a capacidade antioxidante em
formulações cosméticas é o DPPH, que é um radical estável em solução e que
reage com compostos capazes de doar elétrons. Para essa análise utiliza-se uma
solução alcoólica de DPPH, que absorve no comprimento de onda próximo de
517nm, e à medida que seu elétron deixa de ser desemparelhado, a absorção
decresce e ocorre a mudança de coloração frente às moléculas antioxidantes
testadas (DI MAMBRO; MARQUELE; FONSECA, 2005). Após o equilíbrio da reação
mede-se a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do DPPH (SILVA;
BORGES; FERREIRA, 1999).
As vantagens desse método são: avaliar uma grande quantidade de
amostras em um período curto de tempo e rapidamente; é um método sensível que
detecta pequenas concentrações do ativo testado; permite avaliar antioxidantes
lipofílicos, já que o solvente do processo é metanol ou etanol. Em contrapartida, o
pH do meio reacional, que é em torno de 5,5, é diferente do pH fisiológico, o que se
constitui numa desvantagem pela dificuldade de transferir os resultados para as
condições in vivo (DI MAMBRO; MARQUELE; FONSECA, 2005).
3.2.2 Carotenóides
Os carotenóides são o grupo mais importante de cromógenos, ou seja,
substâncias que apresentam cores e por essa razão são amplamente utilizados
como corantes (COSTA, 1975).
Folhas, raízes e sementes de plantas são fontes naturais de carotenóides,
que fornecem a cor e auxiliam na flavorização de produtos alimentícios (GALINDO-
CUSPINERA, 2002). Também podem estar presentes em bactérias, fungos, algas, e
29
até mesmo em animais. Nestes, o tecido adiposo e o leite devem sua cor
ligeiramente amarelada a estes pigmentos carotenóides, embora sua proveniência
seja vegetal (COSTA, 1975).
Segundo ROBBERS, SPEEDIE e TYLER (1997), os carotenóides são
tetraterpenóides com 40 átomos de carbonos, que se caracterizam por
apresentarem muitas cores, partindo do amarelo, passando por laranja, vermelho,
até púrpura.
O elemento fundamental da estrutura dos carotenóides é uma grande cadeia
de oito unidades de isopreno, que pode permanecer linear (como por exemplo na
estrutura do licopeno) ou então ciclizar-se em uma ou ambas as extremidades (β
caroteno). Geralmente são hidrocarbonetos, mas por oxidação podem originar as
xantofilas, como, por exemplo, a luteina (BRUNETON, 1991). As estruturas destes
carotenóides está ilustrada na figura 12.
FIGURA 12 –ESTRUTURAS QUÍMICAS DO LICOPENO, β CAROTENO E LUTEINA
LICOPENO
β CAROTENO
LUTEINA
A cadeia carbônica com duplas ligações alternadas fornece um grupo
cromóforo, que confere a cor dessas estruturas (ROOBERS; SPEEDIE; TYLER,
1997). A insaturação molecular explica a existência de isômeros cis e trans, embora
nos compostos de origem natural a tendência é o aparecimento da forma trans
(COSTA, 1975).
Os mais importantes hidrocarbonetos são os α, β e γ carotenos, que são
precursores da vitamina A. O mais comum nas plantas superiores e de maior
30
interesse é o β caroteno, por possuir dois núcleos β-ionona ligados por uma cadeia
poliênica, e que por hidrólise fornece duas moléculas de vitamina A, enquanto que
os outros carotenos originam somente uma molécula (COSTA, 1975).
Existem também outros carotenóides com menos de 40 átomos de carbono,
que é o caso da bixina, uma estrutura oxigenada com 24 carbonos na cadeia central
(COSTA, 1975). Os carotenóides estão amplamente distribuídos pela natureza,
sendo que nas plantas e microorganismos atuam como agentes fotoprotetores,
como pigmentos fotossintéticos, além de agirem sobre a estabilidade das
membranas (ROBBERS, SPEEDIE; TYLER, 1997). HAILA, LIEVONEN e
HEINONEN (1996), também atribuem aos carotenóides o poder de evitar a oxidação
dos óleos nas estruturas vegetais, embora existam algumas contradições em
relação a certos carotenóides estudados. Nos animais fornecem a vitamina A e
outros retinóides, além de prevenirem doenças como o câncer, provavelmente em
função da propriedade antioxidante e de retardo da lesão oxidativa celular
(ROBBERS, SPEEDIE; TYLER, 1997). O interesse farmacêutico nesses compostos
está principalmente na utilização como corantes naturais, uma vez que não são
tóxicos (BRUNETON, 1991).
Em relação ao poder antioxidante, HAILA, LIEVONEN e HEINONEN (1996)
fizeram uma comparação dessa atividade entre a luteína, licopeno, bixina e γ-
tocoferol na autoxidação de triglicerídeos. Por meio de uma análise da perda de
coloração alaranjada dos carotenóides, concluiu-se que a luteína e o licopeno são
pró-oxidantes, enquanto que a bixina e γ-tocoferol inibem efetivamente a formação
de peróxidos resultantes de um processo oxidativo. Porém, a combinação do γ
tocoferol com os carotenóides inibe o efeito pró-oxidante destes e também retarda a
perda de coloração alaranjada. Além do mais, a combinação da luteína com o γ-
tocoferol é mais eficiente na ação antioxidante quando comparada ao γ-tocoferol
sozinho. Com esse estudo, sugere-se que o efeito pró-oxidante dos carotenóides (e
conseqüente perda da coloração característica) deve ser considerado quando são
utilizados como corantes em produtos alimentícios.
Outro estudo analisa o efeito antioxidante do β caroteno, da bixina e da
norbixina em uma emulsão óleo em água e em óleo de oliva. A norbixina foi o único
carotenóide que inibiu a deterioração oxidativa em ambos os sistemas lipídicos,
possuindo ação semelhante ao γ-tocoferol (KIOKIAS; GORDON, 2003).
31
3.2.3 Tocoferóis e Tocotrienóis
Os tocoferóis e tocotrienóis são conhecidos pelo poder de inibição dos
processos de oxidação de lipídios em alimentos e sistemas biológicos
(VASCONCELLOS, 2005).
Os tocoferóis estão presentes em óleo vegetais e nas partes verdes das
plantas, enquanto que os tocotrienóis podem ser encontrados nas sementes e
cereais, como trigo, milho e arroz, e também em frutos oleaginosos como côco e
algumas espécies de palmeiras.
As denominações α, β, γ e δ dependerão dos radicais ligados à estrutura
base dos tocoferóis e tocotrienóis, conforme mostra a figura 13 (VASCONCELOS,
2005).
FIGURA 13 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS TOCOFERÓIS E TOCOTRIENÓIS
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
O
OH
2
1
CH
3
CH
3
R
R
α-tocoferol: R
1
= R
2
= CH
3
β-tocoferol: R
1
= CH
3
; R
2
= H
γ-tocoferol: R
1
= H; R
2
= CH
3
δ-tocoferol: R
1
= R
2
= H
O
O
H
R
2
R
1
CH
3
4
.
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
6
TOCOFEROL
α-tocotrienol: R
1
= R
2
= CH
3
β-tocotrienol: R
1
= CH
3
; R
2
= H
γ-tocotrienol: R
1
= H; R
2
= CH
3
δ-tocotrienol: R
1
= R
2
= H
TOCOTRIENOL
FONTE: VASCONCELOS, 2005
De acordo com FREGA, MOZZON e BOCCI (1998), é raro encontrar δ
tocotrienol na natureza, estando presente em poucas espécies, dentre elas
Amaranthus sp, o farelo de arroz, a cevada, nas sementes de espécies da família
Apiaceae e do urucum.
Esses compostos são importantes não somente para os sistemas biológicos
e alimentos, mas também para impedir a auto-oxidação do óleo nas sementes
32
vegetais. Enquanto existem muitos estudos in vitro e in vivo comprovando a
atividade antioxidante dos tocoferóis, os estudos com os tocotrienóis são escassos,
provavelmente em razão da dificuldade de encontrá-los (FREGA; MOZZON; BOCCI,
1998). A ação antioxidante desses dois compostos se deve principalmente a sua
capacidade em doar seus hidrogênios fenólicos aos radicais livres, e com isso
impedir a oxidação dos lipídeos (VASCONCELLOS, 2005).
Muita importância tem se dado aos tocotrienóis por possuírem atividades
biológicas importantes. Há estudos que sugerem a inibição do crescimento de
células cancerígenas em glândulas mamárias e redução do risco de doenças
cardíacas por essas moléculas, que podem também prevenir outras patologias que
se originam de estresse oxidativo (VASCONCELLOS, 2005; FREGA; MOZZON;
BOCCI, 1998).
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL
Os frutos de Bixa orellana L. foram coletados no Instituto Ambiental do
Paraná (IAP), no município de Morretes, nos meses de junho e julho de 2005.
A identificação foi realizada pelo botânico Gert Hatschbach, do Museu
Botânico Municipal da Prefeitura de Curitiba, e uma exsicata da planta encontra-se
depositada nesse local sob o número 305810.
4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
4.2.1 Fragmentação das Sementes
As sementes foram removidas manualmente dos frutos, e colocadas para
secar em estufa a 40 ºC.
Posteriormente o material foi moído através de um moinho de martelo, a fim
de aumentar a superfície de contato com o solvente no momento da extração
(SONAGLIO et al, 1999).
4.2.2 Extração em Soxhlet
O processo de extração em Soxhlet requer o emprego de um cartucho de
papel ao qual é adicionado o material vegetal. O cartucho é colocado no interior do
aparelho e, em seguida, acrescenta-se o solvente, que cobre o material e é recebido
em um balão anexado ao Soxhlet. Todo o sistema é conectado a um condensador
de bolas e assim inicia-se o processo de aquecimento para extração contínua,
quando o solvente condensa e percola pelo cartucho, para então refluxar
novamente. Nesse trabalho, foi feita uma modificação no processo, pois não se
utilizou o cartucho em razão da grande quantidade de sementes, e para melhorar a
difusão e contato do solvente com o material.
34
Para a extração utilizou-se um gradiente de polaridade crescente,
constituído respectivamente por hexano, clorofórmio e acetato de etila. O tempo de
cada extração foi de seis horas (FALKENBERG; SANTOS; SIMÕES, 1999).
Após a primeira extração com hexano, todo o equipamento foi limpo e seco,
e o marco residual foi novamente colocado em Soxhlet, sendo realizadas mais duas
extrações, com clorofórmio e acetato de etila, nas mesmas condições experimentais.
Em seguida, o líquido extraído foi filtrado para remoção de qualquer
impureza e então concentrado em rotoevaporador para eliminação do solvente.
Os rendimentos foram obtidos considerando-se o peso inicial das sementes
secas e moídas. O armazenamento foi feito em frascos de vidro âmbar, cobertos
com papel alumínio e em refrigeração para evitar oxidação e/ou rancificação.
A fração hexânica foi denominada de óleo, por ser assim constituída,
enquanto que os demais extratos foram tratados como fração clorofórmica e acetato
de etila.
4.2.3 Identificação do Cristal
Durante a extração clorofórmica obteve-se cristais de coloração vermelho-
púrpura.
O ponto de fusão desses cristais foi realizado adicionando uma fração desse
material a um capilar de vidro, que foi devidamente acondicionado em um aparelho
de aquecimento automático, juntamente com um termômetro. A temperatura foi
marcada quando a substância começou a fundir.
Também foi realizada uma análise em espectroscopia de infravermelho (IV),
em equipamento modelo Excalibur, Series FTS 3500GX e programa para leitura Bio-
Rad Merlin. A varredura foi feita de 400 a 4000cm
-1
, leitura de transmitância e
detector DTGS. A amostra foi pastilhada com brometo de potássio (KBr).
A ressonância magnética nuclear de hidrogênio 1 (RMN
1
H) e de carbono 13
(RMN
13
C) foi executada na Universidade Estadual de Maringá (UEM), em
equipamento Espectrofotomer RMN – Varian, modelo Gemini. Os espectros de RMN
1
H e
13
C foram realizados a 300MHz e 75MHz, respectivamente, com
dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente e padrão interno de referência.
35
4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
4.3.1 Reologia
O comportamento reológico do óleo foi determinado em equipamento
Brookfield, modelo RVDV III – plus (+), com cone coaxial (spindle) SC 4-21, a uma
temperatura de 26°C.
4.3.2 Solubilidade
A solubilidade do óleo foi determinada em etanol a 90%. Para isso, em um
tubo de ensaio contendo 0,1 mL de óleo foram adicionadas frações de 0,1 mL de
etanol. Após cada adição, agitava-se o tubo para verificar se o material havia sido
solubilizado. Esse ensaio visa determinar em quantas partes de etanol a 90% o óleo
em estudo é solúvel.
4.3.3 Densidade
A densidade foi medida coletando-se 5,9µL de óleo com uma pipeta
volumétrica, e essa quantidade pesada em uma balança eletrônica. A relação da
massa pelo volume forneceu a densidade absoluta.
4.3.4 Espalhabilidade
Esse teste baseia-se na resistência ao movimento forçado.
Uma placa molde circular de vidro, com diâmetro de 20 cm e 0,2 mm de
espessura, e com um orifício central de 1,2 cm de diâmetro, foi colocada sobre uma
placa de vidro de 20 X 20 cm. Sob essas placas posicionou-se uma folha de papel
milimetrado e a amostra foi introduzida no orifício da placa molde, nivelando-se com
uma espátula. A placa molde foi cuidadosamente retirada e sobre a amostra foi
colocada uma placa de acrílico de peso 205,8 g. Após um minuto calculou-se a
superfície abrangida pelo óleo através da medição do diâmetro em duas posições
opostas, para posterior cálculo do diâmetro médio (ZANIN et al., 2001).
36
A espalhabilidade, determinada a 25 °C, foi calculada pela equação
representada no quadro 2.
QUADRO 2 – EQUAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DA ESPALHABILIDADE
Sendo Ei a espalhabilidade da amostra para o peso i, em mm
2
, e d é o
diâmetro médio, em milímetros.
4.3.5 Análise em Espectroscopia de Ultravioleta
O óleo foi submetido à espectroscopia de absorção no ultravioleta (UV), a
fim de verificar o comprimento de onda máximo (λ
máx
) absorvido e também calcular o
fator de proteção solar (FPS) pelo método espectrofotométrico, descrito por
MANSUR et al. (1986) e representado pela equação no quadro 3.
QUADRO 3 – EQUAÇÃO PARA CÁLCULO DE FPS PELO MÉTODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO
320
FPS espectrofotométrico = FC . Σ EE (λ) . I (λ) . abs (λ)
290
FC = fator de correção (=10)
EE
(λ) = efeito eritemogênico da radiação de comprimento de onda (λ)
I (λ) = intensidade do sol no comprimento de onda (λ)
abs (λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância da solução do filtro
solar no comprimento de onda
(λ)
Ei = d
2
x π
4
As constantes EE e I são pré-definidas por MANSUR et al (1986).
A análise foi realizada em Espectrofotômetro de UV da marca Shimadzu,
modelo UV-1601 PC. A concentração do óleo foi de 0,2 µL/mL de metanol e a
análise realizada em triplicata.
37
4.3.6 Análise em Espectroscopia de Infravermelho
O equipamento utilizado para essa análise foi do modelo Excalibur, Series
FTS 3500GX, e programa para leitura Bio-Rad Merlin. A varredura foi feita de 400 a
4000cm
-1
, leitura de transmitância e detector DTGS. As amostras foram pastilhadas
com brometo de potássio (KBr).
4.4 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS
Para determinação dos ácidos graxos, o óleo em estudo foi esterificado com
anidrido acético. A análise foi determinada por CG-EM da marca Varian, modelo
Saturno 2000R, em coluna capilar OV-225, com as seguintes condições de análise
foram: temperatura inicial de 50 ºC, com elevação do aquecimento de 40 ºC por
minuto, até 220 ºC, que foi mantido durante 30 minutos; temperatura do injetor de
250 °C.
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A atividade antimicrobiana do óleo foi realizada no Instituto de Tecnologia do
Paraná (TECPAR), pelo método de difusão em ágar e concentração mínima
inibitória (CMI), de acordo com KONEMAN et al. (1993). Os microorganismos
utilizados foram Escherichia coli (ATCC 11229), Klebsiela pneumoniae (ATCC
13883), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853),
Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus pyogenes (ATCC
19615).
Os ensaios foram realizados em condições assépticas em câmara de fluxo
laminar. Para isso, todo material utilizado, como pipetas, placas de Petri e tubos de
ensaio, foram autoclavados a 120 ºC por 15 minutos. Também foram utilizadas
suspensões padronizadas das amostras a serem testadas, tendo o cloranfenicol e
cefalotina como controle positivo e o etanol, diluente das amostras, como controle
negativo. Os discos de papel, inclusive com os antibióticos, foram adquiridos da
empresa Newprov.
38
Para o ensaio de difusão em ágar, caso a amostra apresente ação inibitória
sobre os patógenos, um halo de não-crescimento ao redor do disco será formado,
havendo no restante do meio o crescimento das colônias. Para o segundo método, a
concentração mínima inibitória será aquela correspondente ao primeiro tubo da série
com as amostras que não apresentar crescimento, caracterizado pela não turvação
do meio (considerando que o primeiro tubo terá a menor, e o último tubo terá a maior
concentração de amostra).
O ensaio de CMI é mais adequado para a amostra em questão, que se
caracteriza por ser lipofílica. Porém, uma adaptação ao método de difusão em ágar
foi realizada a fim de facilitar a difusão da amostra para o meio hidrofílico. Para isso,
utilizou-se o surfactante monoleato de sorbitano 20 OE (oxido de etileno), Tween
®
80, para diluir a mostra juntamente com o etanol.
As séries foram realizadas em triplicada para cada microorganismo.
4.5.1 Método de Difusão em Ágar
4.5.1.1 Preparo da amostra
O óleo foi diluído em etanol e Tween
®
80 (4:1) nas concentrações de 1000,
500, 250 e 125 µg. Para isso, preparou-se uma solução base de 250mg / 5ml, e
diluições subseqüentes foram feitas para obtenção das quatro concentrações
avaliadas.
4.5.1.2 Preparo dos discos de papel
Os discos de papel estéreis foram identificados, colocados em uma placa de
Petri estéril, e impregnados com as diluições pré-determinadas com o auxílio de uma
micropipeta. Posteriormente, foram deixados em estufa a 35 ºC por 24 horas para
total secura do solvente. Discos com etanol e com Tween
®
80 foram utilizados como
controle negativo. Os discos de cloranfenicol e cefalotina apresentavam 30µg
dessas substâncias.
39
4.5.1.3 Preparo dos meios de cultura
O meio utilizado para esse experimento é o ágar Muller-Hinton, que após o
preparo, foi autoclavado a 120 ºC por 15 minutos e deixado resfriar até 50 ºC. Nessa
temperatura e em fluxo laminar, 60 mL do meio foram distribuídos em cada placa de
Petri estéril, e deixados em repouso para solidificação. Posteriormente essas placas
foram fechadas e reservadas.
4.5.1.4 Preparo do inóculo
As cepas utilizadas para o estudo foram repicadas em tubos de ensaio com
ágar Muller-Hinton 24 horas antes do teste.
Com o auxílio de uma alça e em câmara de fluxo laminar, as colônias de cada
bactéria foram diluídas em tubos de ensaio contendo solução salina estéril.
O parâmetro de turbidez foi comparado ao tubo 5 da escala de Mac Farland,
preparado segundo BIER (1980). Utilizando um espectrofotômetro de UV da marca
Shimadzu, modelo UV-1601 PC, em 650 nm, a concentração microbiana foi ajustada
de forma que as absorbâncias das suspensões bacterianas apresentassem o
mesmo valor do tubo 5, o que corresponde a 1,5.10
9
UFC/mL.
4.5.1.5 Preparo do teste
Para cada placa com o microorganismo, foram distribuídos seis discos de
papel, sendo quatro deles embebidos com as diluições do óleo nas concentrações
de 1000 µg, 500 µg, 250 µg e 125 µg, um impregnado com etanol para controle
negativo e o outro com cloranfenicol, para controle positivo. Separadamente em
outra placa, foram colocados um disco com Tween
®
80 e outro com a cefalotina, a
fim de evitar a proximidade deles com os demais discos, dificultando a visualização
dos halos.
Esse mesmo procedimento foi feito para cada bactéria testada, e realizados
em triplicata, tanto para as placas com a amostra quanto para as placas de controle
positivo/negativo.
40
Uma placa contendo somente o meio de cultura, sem nenhuma bactéria
inoculada, foi utilizada como controle de esterilidade, na qual foi colocada um disco
de cada diluição e de cada controle.
As placas foram incubadas em estufa a 35ºC e as leituras dos halos de
inibição foram feitas após 24 horas e 48 horas (KONEMAN et al, 1993).
4.5.2 Método da Concentração Mínima Inibitória
4.5.2.1 Preparo do inóculo
Para o preparo do inóculo, utilizou-se as mesmas suspensões microbianas
em meio salino com 1,5.10
9
UFC/mL, obtidas do ensaio de difusão em ágar. Destas,
transferiu-se 0,2 mL de cada para um frasco previamente autoclavado com 100mL
de Tween
®
80 e então desses frascos foi retirado 1 mL para colocar nos tubos de
ensaio controle e com as amostras.
4.5.2.2 Preparo do teste
Por esse método obteve-se uma série de oito tubos de ensaio contendo meio
de cultura, aos quais foram adicionadas quantidades de 1000 μg, 500 μg, 250 μg,
125 μg, 62,5 μg e 31,25 μg do óleo. O primeiro tubo não continha a amostra e serviu
como controle positivo de crescimento, enquanto que o último representava o
controle negativo, ou seja, somente com a amostra.
O meio de cultura utilizado foi o Caldo Casoy, previamente autoclavado a
120ºC por 15 minutos e deixado resfriar totalmente antes de começar o experimento.
Dentro do fluxo laminar foram colocadas as amostras nas concentrações pré-
determinadas dentro dos meios e por fim inoculadas as suspensões de
microorganismos. A incubação ocorreu a 35 ºC por 18 a 20 horas.
Ao final do período, os tubos foram analisados quanto ao crescimento dos
microorganismos, verificando a turvação do meio. A concentração correspondente
ao primeiro tubo da série que estivesse límpido, ou seja, sem crescimento, seria
considerada a concentração mínima inibitória. Ela representa que, nessa
concentração, é capaz de impedir o crescimento do microorganismo analisado.
41
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A atividade antioxidante foi determinada por dois métodos. O primeiro baseia-
se na formação de um complexo fosfomolibdênico e o outro é caracterizado pela
capacidade da amostra em reduzir o radical DPPH. Ambos utilizam leituras
espectrofotométricas na região do UV para apresentar os resultados.
4.6.1 Formação do Complexo Fosfomolibdênico
Esse ensaio baseia-se na técnica descrita por PRIETO, PINEDA e AGUILAR
(1999). A reação para formação do complexo requer o preparo de um reativo que
consiste de uma solução com fosfato de sódio 0,1M (28 mL), molibdato de amônio
0,03M (12 mL) e ácido sulfúrico 3M (20 mL), sendo o volume completado com água
para 100 mL. Esse reativo foi preparado no momento do uso. Soluções padrões de
vitamina C e rutina, bem como a amostra de óleo a ser testada, devem estar na
concentração de 200 µg/mL em metanol (BIANCO, 2003).
Em um tubo de ensaio, retirou-se uma alíquota de 0,1 mL da amostra, e
adicionou-se 1 mL de reativo. O mesmo foi feito para os padrões. Um branco foi
constituído de 0,1 mL de metanol e 1 mL de reativo. A análise foi realizada em
triplicata, com os tubos hermeticamente fechados. Posteriormente, manteve-se a
série de tubos em banho-maria a 95°C por 90 minutos. Após atingirem a
temperatura ambiente, a leitura das absorbâncias (Abs) foi realizada em
espectrofotômetro de UV da marca Shimadzu, modelo UV-1601 PC, em 695 nm. Os
resultados foram expressos em atividade antioxidante relativa (AAR%) do óleo em
relação à vitamina C e rutina, conforme as equações do quadro 4.
QUADRO 4 – CÁLCULO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE RELATIVA PELO
MÉTODO FOSFOMOLIBDÊNICO
AAR% EM RELAÇÃO À VITAMINA C
Abs
(amostra)
– Abs
(branco)
x 100
Abs
(vitamina C)
– Abs
(branco)
AAR% EM RELAÇÃO À RUTINA
Abs
(amostra)
– Abs
(branco)
x 100
Abs
(rutina)
– Abs
(branco)
42
4.6.2 Redução do Radical DPPH
Esse ensaio foi realizado de forma qualitativa e quantitativa.
A técnica qualitativa descrita por CONFORTI et al. (2002), CAVIN et al.
(1998) e ARBOS (2004) baseia-se na análise da amostra por meio de cromatografia
em camada delgada (CCD), seguida da revelação por uma solução de DPPH.
Após selecionar a fase móvel hexano:acetato de etila:ácido fórmico (85:20:3)
e de promover a migração ascendente da amostra na cromatoplaca de sílica gel SG-
60 Merck
®
, a revelação foi feita com uma solução de DPPH a 0,2% em metanol. A
análise foi realizada após 30 minutos sob luz natural a fim de verificar a presença de
manchas amarelas contra um fundo púrpura, que indicam a presença de compostos
antioxidantes na amostra. Como padrão, optou-se pela aplicação de vitamina C. O
óleo foi diluído em metanol na concentração de 10 mg/mL.
A metodologia para o ensaio quantitativo foi adaptada e baseada nas
técnicas descritas por MORENO et al. (2000), CHOI et al. (2002), ARBOS (2004), LU
e FOO (2001), ADELMANN (2005) e BIANCO (2004).
De acordo com SILVA (1999) e CAVIN et al. (1998), a avaliação da
capacidade antioxidante quantitativa terá como base a redução do radical DPPH
medida em espectrofotometria de UV visível.
A solução de DPPH foi preparada minutos antes do ensaio a 1mM em etanol
absoluto, e armazenada sob refrigeração (BLOIS, 1958). Soluções estoque de óleo
(3,0 mL) nas concentrações de 6,25 µg/mL a 75 µg/mL foram adicionadas de 0,1 mL
da solução de DPPH e deixadas reagir em repouso por 30 minutos na temperatura
ambiente e na ausência total da luz. As mesmas soluções amostra (3,0 mL) sem
reagir com DPPH constituíram o branco da reação.
A vitamina C foi preparada em etanol nas concentrações 6,25 µM, 12,5 µM e
25 µM, e a rutina a 3,125 µM, 6,25 µM e 12,5 µM.
Após os 30 minutos, mediu-se a Abs das soluções em 517 nm. Todas as
etapas foram feitas em triplicata. A porcentagem da atividade antioxidante (AA%) foi
medida através da fórmula no quadro 5.
QUADRO 5 – CÁLCULO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DPPH
AA% = 100 – (Abs amostra – Abs branco)
Abs controle positivo
43
Para o controle positivo foi medida a absorbância da solução de DPPH.
Os valores da concentração necessária para exercer 50% da atividade
antioxidante (IC
50
) foram calculados no gráfico onde a abcissa representa a
concentração da amostra de óleo e a ordenada é a média da AA% das 3 amostras
de cada concentração. A equação da reta desse gráfico, do tipo y = ax + b, serviu
de base para determinação do valor de IC
50
.
4.6.3 Pesquisa de Tocotrienol e Tocoferol
Realizou-se uma CCD do óleo e de um padrão de tocotrienol e tocoferol, o
composto Tocotrimax
® 8
para pesquisar essas substâncias na amostra. As
condições experimentais foram as mesmas do item 4.6.2.
Para confirmar a presença de tocotrienol e tocoferol no óleo, foi realizada uma
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em equipamento Merck Elite
Lachrom, detectores DAD L2450 Elite LaChrom, coluna C18 Merck ODS 5 μm (250
mm X 4 mm d.i.) de fase reversa, à temperatura de 25°C e sistema de separação
isocrático. A fase móvel era composta de 90% de acetonitrila e 10% de fase ácida
(ácido sulfúrico 0,05M e ácido fosfórico a 1%). O fluxo foi de 2 mL/min e a faixa
espectral de 200 a 500 nm.
4.6.4 Isolamento e Identificação do Composto Antioxidante “X”
Na tentativa de isolar e identificar o composto antioxidante “X”, indicado na
figura 28, uma cromatografia em coluna, seguida de uma preparativa foi realizada.
Aproximadamente 11mL do óleo foram incorporados em 20 g de Sílica Gel
SG-60 Merck
®
para formação da pastilha de sílica. Essa mistura foi levada a banho-
maria para total secura até obter um pó fino e seco. Posteriormente, a pastilha foi
depositada no topo da coluna (30 X 3cm) empacotada com 30 g de Sílica Gel SG-60
Merck
®
e eluida com sistema de solventes na forma de gradiente de polaridade
crescente, sendo utilizado hexano, acetato de etila e metanol.
8
Matéria-prima obtida da Galena Química e Farmacêutica Ltda.
44
Algumas frações obtidas da coluna que apresentaram perfil semelhante por
CCD, foram submetidas a cromatografia preparativa em Sílica Gel SG-60 Merck
®
de
20 X 7 cm. Para isso, dissolveu-se 10 mg de amostra em 1mL de clorofórmio, que foi
aplicado por toda a extensão da placa. A fase móvel utilizada foi a mesma do item
4.6.2.
A revelação foi feita com a solução de DPPH 0,2% somente em uma pequena
faixa de uma das extremidades da placa, permitindo a visualização da região onde
se encontrava a substância antioxidante.
A identificação do composto isolado foi realizada por RMN
1
H e
13
C. As
análises foram executadas na Universidade Estadual de Maringá (UEM), em
equipamento Espectrofotomer RMN – Varian, modelo Gemini. Os espectros de RMN
1
H e
13
C foram realizados a 300MHz e 75MHz, respectivamente, com clorofórmio
deuterado (CDCl
3
). O padrão de referência de escala para a RMN
1
H foi o TMS,
enquanto que para a RMN
13
C, teve-se como base os deslocamentos químicos do
CDCl
3
.
4.7 DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO COSMÉTICA
Optou-se pelo desenvolvimento de um gloss labial, e como veículo principal
foi selecionado o Versagel ME 750
®
, obtido a partir do poliisobuteno hidrogenado,
sendo composto também de copolímeros de etileno, propileno, butileno e estireno.
Foram realizados ensaios reológicos, de espalhabilidade e pH.
Microfotografias foram feitas para análise da homogeneidade, em razão do tamanho
e formato das gotículas, posto que não se conduzirão testes de estabilidade.
A reologia foi realizada em Viscosímetro Rotativo da marca Rheotest, tipo
RV, com spindle S2. A temperatura de análise foi de 25°C.
A espalhabilidade foi medida da mesma forma executada com o óleo puro e
o pH determinado com fitas medidoras da Merck
®
.
As microfotografias foram realizadas em um microscópio óptico biocular
fotônico da marca Olympus bx 40, câmera Sony e sistema de imagem proplus 3.0.
45
5 RESULTADOS
5.1 FRAGMENTAÇÃO DAS SEMENTES
O teor de umidade encontrado (média de três amostras) foi de 12,42% e o
tamanho das partículas apresentou-se em torno de 0,5 a 2,0 mm.
5.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
Muitos métodos para obtenção de extratos vegetais podem ser
empregados, mas a escolha dependerá de alguns fatores como o tipo e volume de
solvente a ser utilizado, a quantidade de droga disponível, a temperatura do
processo de extração, bem como a duração desse processo. Um dos métodos mais
utilizados e eficientes é a extração com solventes orgânicos em equipamento
Soxhlet, que consiste no emprego de um volume não muito grande de solvente, que
fica continuamente em contato com o material vegetal, sob aquecimento, e, portanto,
promove uma maior interação entre sólido-líquido (PAIVA et al., 2004).
Partiu-se de 836,70g de material. O rendimento da extração do óleo por
essa técnica foi de 5,04%, em um período de 6 horas.
MATOS et al (1992) realizaram a extração de óleo fixo de algumas
oleaginosas, dentre elas B. orellana, nas mesmas condições experimentais, porém
por um período de 2 horas. O rendimento foi de 2,30%, que parece ser um resultado
coerente com o encontrado, uma vez que o período de extração nesse trabalho foi
superior.
Na fração clorofórmica, ainda no momento da extração, já se detectava a
presença de cristais no fundo do balão. Após o término do processo, essa fração foi
filtrada em funil de Buchner, recolhendo-se cerca de 30 g de cristais, que
correspondem a 3,6% de rendimento, e que se apresentaram brilhantes e de cor
vermelho-púrpura. Esses cristais foram lavados com clorofórmio gelado para
remoção de impurezas, secos, armazenados em um frasco âmbar e conservados
sob refrigeração.
De acordo com SILVA (2000) e BARBOSA FILHO et al. (1998), esses
cristais correspondem à bixina, principal constituinte do corante.
46
Um fator que pôde ser visto durante as extrações foi a descoloração das
sementes durante o processo. Após a extração com hexano, as sementes ainda
permaneciam bastante vermelhas, e a fração hexânica apresentava coloração
vermelho-alaranjada. Já a fração clorofórmica era de cor vermelho intensa e as
sementes após a extração estavam praticamente desprovidas de cor. A fração
acetato de etila apresentava uma forte cor amarela. Isso demonstra que o corante
vermelho característico do urucum saiu em maior proporção com o clorofórmio do
que com o hexano e acetato de etila.
A fração acetato de etila foi a que obteve menor rendimento e não foi
utilizada para o trabalho, assim como a fração clorofórmica. A maior ênfase,
portanto, foi dada para o óleo, caracterizado por meio de várias análises.
5.2.1 Identificação do Cristal
Os cristais obtidos da fração clorofórmica apresentaram ponto de fusão de
195 ºC, que corresponde ao valor encontrado por SILVA (2000) para a bixina.
O espectro de IV, apresentado na figura 14, mostrou uma banda do
grupamento hidroxila em 3143,96 cm
-1
, as metilas e metilenos alifáticos em 2947,22
e 2881,64 cm
-1
, e a carbonila em 1716,64 cm
-1
. Esses grupamentos também estão
presentes na estrutura química do corante bixina.
FIGURA 14 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE IV DO CRISTAL EM KBr
4000 3000 2000 1000
Wavenumber (cm-1)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1573.91
1614.42
2881.64
2947.22
%Transmittance
964.41
1008.77
1425.39
1288.45
1716.64
3032.09
3143.96
1159.22
47
O espectro de RMN de ¹H para a amostra analisada, representado na figura
15, apresentou sinais de deslocamento químico entre 1,91 -1,96 ppm que
correspondem a próton das metilas ligadas aos carbonos vinílicos, um singlete em
3,68 ppm que corresponde a metoxila do grupamento éster e também dois pares de
dubletes em 5,79 / 7,23 e 5,90 / 7,85 ppm atribuídos respectivamente a Hα / Hβ aos
grupos carboxílicos do ácido livre e do éster. Também apresentou multipletos entre
6,41 a 6,90 ppm.
O espectro de RMN de ¹³C mostrado na figura 16 apresentou sinais de
deslocamento químico em 167,7 e 166,9 ppm referentes aos carbonos das
carbonilas de ácido e éster, respectivamente. Também apresentou sinal de
deslocamento em 51,4 ppm referente ao carbono da metoxila do éster. Na região de
120 a 148,2 ppm observou-se multiplicidade de sinais correspondentes aos
carbonos sp
2
da cadeia vinílica e na região entre 12 -20 ppm os sinais de
deslocamento de carbonos das metilas ligadas aos carbonos vinílicos (figura 17).
No mapa de correlação bidimensional de sinais de deslocamento de ¹H - ¹H
(COSY) observou-se a correlação dos dubletos em 5,79 / 7,23 e 5,90 / 7,85,
conforme mostra a figura 18.
No mapa de correlação bidimensional ¹H - ¹³C (HMQC), visto na figura 19,
observou-se a correlação dos sinais de H em 1,91 -196 ppm e C das metilas, a
correlação do sinal de H em 3,68 ppm e C em 51,4 ppm referente a carbono da
metoxila do éster. Também se pôde visualizar a correlação dos dubletos de H em
5,79 e 5,90 ppm com os C em 117,2 e 117,6 ppm e os dubletos de H em 7,23 e 7,85
ppm com C em 148,2 e 139,9 ppm, respectivamente.
48
FIGURA 15 – ESPECTRO DE RMN
1
H DO CRISTAL (300MHz, DMSO)
49
FIGURA 16 – ESPECTRO DE RMN
13
C DO CRISTAL (75MHz, DMSO)
50
FIGURA 17 – ESPECTRO DE RMN
13
C (DEPT) DO CRISTAL (75MHz, DMSO)
51
FIGURA 18 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL ¹H - ¹H (COSY) DO
CRISTAL (300MHz, DMSO)
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OCH
3
52
FIGURA 19 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL ¹H - ¹³C (HMQC) DO
CRISTAL (DMSO)
C
C
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
O
O
OCH
3
Dessa forma, a análise dos dados de RMN de ¹H, ¹³C, COSY, DEPT e HMQC
e dados de literatura (COSTA; CHAVES, 2005; OLIVEIRA, 2005) permitiram
caracterizar o cristal obtido como sendo o corante bixina*, conforme tabela 3.
53
TABELA 3 – DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE ¹H E DE ¹³C DO
CRISTAL E CORRELAÇÃO HMQC.
CARBONO* ¹³C ª ¹³C
b
HMQC
b
¹H - ¹³C
1 167,9 167,8
2 117,3 117,2 5,79
3 131,2 131,2
4 148,2 148,2 7,23
5 131,4 131,4
6 140,6 140,6
7 138,0 138,0
8 139,0 139,1
9 134,6 134,5
10 133,4 133,4
11 131,3 131,3
12 134,7 134,7
13 - 136,7
14 136,7 136,7
15 123,1 123,1
16 124,8 124,8
17 140,0 139,9 7,85
18 141,5 141,4
19 117,7 117,6 5,90
20 166,9 166,9
21 51,4 51,4 3,68
22 19,9 19,9 1,91 – 1,96
23 13,9 12,6 1,91 – 1,96
24 12,7 12,5 1,91 – 1,96
25 12,6 12,4 1,91 – 1,96
ª OLIVEIRA J.S. Purificação de compostos de urucum por
processo adsortivo, Florianópolis, 2005, 185f. Tese (Doutorado
em Engª Química) , UFSC.
b
Medidas feitas observando-se o núcleo de ¹H a 300 MHz e
¹³C a 75 MHz, DMSO, ppm.
H
3
COOC
COOH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
*
5.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
5.3.1 Reologia
Os dados reológicos são muito importantes industrialmente porque permitem
determinar a funcionalidade dos componentes para o desenvolvimento de produtos,
fazer o controle de qualidade do produto final e determinar sua vida de prateleira,
54
definir os equipamentos que serão utilizados na fabricação, escolher a embalagem
mais adequada para aquele produto, além de permitir a avaliação da sua textura
pela correlação com dados sensoriais. De um batom labial, por exemplo, espera-se
que permita a liberação da cor facilmente para os lábios, mas que também
mantenha o seu formato original, mesmo em altas temperaturas. Esse
comportamento é determinado pelas características reológicas do material (LABA,
1993).
O estudo do fluxo que considera a viscosidade de um material denomina-se
reologia, sendo que o comportamento reológico pode ser classificado como
newtoniano ou não-newtoniano, dependendo dos tipos de fluxo e deformação da
matéria.
Os comportamentos newtonianos ocorrem quando uma força atua sobre a
superfície de um corpo ou sistemas líquidos, sólidos ou semi-sólidos, ocasionando a
deformação destes. Tal deformação corresponde a um deslocamento do fluxo do
sistema. Para esse caso, pode-se aplicar a equação do fluxo de Newton,
demonstrada no quadro 6.
QUADRO 6 – EQUAÇÃO DO FLUXO DE NEWTON
Τ = η γ
Segundo essa lei, a tensão de cisalhamento (Τ) é diretamente proporcional à
velocidade ou taxa de cisalhamento (γ). O coeficiente η é uma variável de
resistência do material de escoamento e é designado viscosidade dinâmica, tendo
como unidade o Pascal.
Líquidos puros, como a água, apresentam esse comportamento, que pode
ser representado pelo gráfico 1 (ALMEIDA e BAHIA, 2002).
A viscosidade em um sistema newtoniano constitui uma constante em uma
dada temperatura, independente da taxa de cisalhamento, o que já não acontece
nos comportamentos não-newtonianos. Nestes, a viscosidade não é constante e
depende, além da temperatura, de outros fatores como o tempo de repouso, a
concentração, temperatura e pressão.
55
GRÁFICO 1 – COMPORTAMENTO NEWTONIANO
Viscosidade (η)
Taxa de cisalhamento (γ)
Nos sistemas não-newtonianos o comportamento do fluido não é mais
descrito pela equação de Newton, mas por um modelo representado pela Lei das
Potências apresentada no quadro 7.
QUADRO 7 – LEI DAS POTÊNCIAS
Τ = κ γ
n
Onde κ é o coeficiente de consistência e tem as unidades de viscosidade, n
é o índice de escoamento (adimensional) e que caracteriza o desvio em relação ao
comportamento newtoniano.
Uma subclassificação do sistema não-newtoniano é o comportamento
pseudoplástico. Plotando-se um gráfico do comportamento de um fluido
pseudoplástico, não existirá mais uma reta, como no sistema newtoniano, mas sim
uma curva, que mostrará que a viscosidade decresce com o aumento da taxa de
cisalhamento, conforme o gráfico 2. Esse caso é característico de sistemas coloidais
(ALMEIDA e BAHIA, 2002).
GRÁFICO 2 – COMPORTAMENTO NÃO-NEWTONIANO
Viscosidade (η)
Taxa de cisalhamento (γ)
56
As considerações feitas acima visam contribuir para o melhor entendimento
do comportamento reológico do óleo de B. orellana, representado na figura 20.
FIGURA 20 – COMPORTAMENTO REOLÓGICO DO ÓLEO
Como pode ser observado, o óleo em estudo possui diferentes velocidades e
uma larga taxa de cisalhamento em diferentes viscosidades, mostrando um
comportamento newtoniano e não newtoniano. Observa-se entre 10 e 30 seg
-1
que a
viscosidade diminui progressivamente à medida que a velocidade de cisalhamento
aumenta, caracterizando um comportamento pseudoplástico. Esse tipo de material
flui sofrendo afinamento por cisalhamento, o que confere a ele especial
espalhabilidade.
Essa característica é particularmente importante nesse trabalho, pois à
medida que existe uma tensão sobre uma formulação contendo esse óleo, muito
possivelmente ela irá deslizar de forma rápida sobre a pele até atingir um
determinado valor em que a viscosidade mantém-se uniforme, iniciando um
comportamento newtoniano, representado no gráfico a partir de 50 seg
-1
. Dentro
desse sistema, que faz com que a fórmula se distribua por meio de uma camada
fina, permite-se uma absorção homogênea, fornecendo um aspecto agradável e
sedoso ao toque.
57
5.3.2 Solubilidade
Baseado na técnica proposta, o óleo apresentou-se solúvel no etanol 90% na
proporção 1:1, sendo esse resultado importante para análises de qualidade do óleo
em estudo.
5.3.3 Densidade
A densidade é uma propriedade física importante e pode ser utilizada para
distinguir um material puro de um impuro. Ela também pode ser utilizada na
identificação e no controle de qualidade de um determinado produto industrial, bem
como ser relacionada com a concentração de soluções.
Para determinação da densidade do óleo foram feitas oito medições e o
resultado obtido foi 0,95 g/mL, a uma temperatura de 25ºC. Comparando com
referência consultada
9
, cuja especificação é de 0,95 a 0,99 g/mL, a densidade
encontrada está de acordo com o estabelecido.
5.3.4 Espalhabilidade
As medidas foram realizadas em triplicata e o resultado obtido para o óleo foi
uma área de 6.500,59 mm
2
. A figura 21 mostra seu comportamento sob a placa após
o tempo de um minuto.
FIGURA 21 – ESPALHABILIDADE DO ÓLEO DE Bixa orellana
9
Distriol Comércio de Insumos Ltda.
58
O mesmo procedimento foi realizado com óleo de amêndoas, conforme figura
22, para fins de comparação, uma vez que é um óleo muito utilizado em formulações
cosméticas. Esse óleo foi colorido artificialmente para melhor visualização.
FIGURA 22 – ESPALHABILIDADE DO ÓLEO DE AMÊNDOAS
O óleo de amêndoas forneceu uma área de 6.644,24 mm
2
. Considerando que
quanto maior ela for, mais facilmente um produto se espalha sobre uma superfície,
nota-se que ambos os óleos são bastante semelhantes nesse parâmetro. Portanto,
esse resultado indica que o óleo de B. orellana é um produto que quando aplicado
sobre uma superfície tem facilidade em se espalhar, característica essa bastante
importante ao se propor uma formulação cosmética que o utilize em sua
composição.
5.3.5 Análise em Espectroscopia de Ultravioleta
A figura 23 apresenta a varredura em espectrofotômetro de UV do óleo de B.
orellana, nos comprimentos de onda de 200 a 600 nm.
Como pode-se notar, o λ
máx
foi em 424 nm, seguido de um segundo pico em
297,5 nm.
Outros comprimentos de onda foram marcados a fim de aplicar o método de
MANSUR et al. (1986) para determinação espectrofotométrica do FPS do óleo.
59
FIGURA 23 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE UV DO ÓLEO
λ
máx
Dentre várias técnicas in vitro para determinação de FPS, a
espectrofotométrica é uma das mais aplicáveis por ser um processo simples, rápido,
barato e sem riscos, que fornece um resultado confiável em alguns minutos. Trata-
se de uma análise que permite uma previsão do fator de proteção antes de se
realizarem os testes em humanos, reduzindo os riscos para esses últimos. De fato,
esse método ignora alguns fatores que interferem diretamente no FPS, como a
capacidade de aderência, penetração e distribuição do produto na pele. Contudo,
LOWE e BREEDING (1983) demonstraram boa correlação entre a
espectrofotometria e os testes em humanos.
De acordo com MANSUR et al. (1986), por meio de uma análise em
espectrofotômetro pode-se determinar o FPS de protetores solares. Estudos
realizados com o óleo indicam que ele apresenta uma atividade anti-radicais livres
que impede os danos causados pela radiação UV sobre os queratinócitos da pele.
10
De acordo com a técnica, para substâncias de caráter lipofílico deve-se
utilizar éter como solvente. Entretanto, uma adaptação foi necessária, pois em razão
da rápida volatilidade do éter, as medidas também foram realizadas usando metanol.
A amostra foi totalmente solubilizada nos dois solventes.
10
Dados obtidos da literatura técnica do fornecedor, Croda.
60
O FPS obtido para as análises que utilizaram éter foi de 8, enquanto que com
o metanol foi 6. Com o metanol, os valores de absorbância obtidos mantiveram-se
constantes durante as três análises, o que não aconteceu quanto se utilizou o éter.
Essa diferença ocorreu provavelmente em razão do éter ser muito volátil, e
com isso o resultado obtido com esse solvente não pode ser considerado totalmente
correto. De acordo com MANSUR et al. (1986), a precisão do método para
substâncias oleosas diminui um pouco justamente em razão da volatilidade do éter,
que provoca uma concentração do produto. Dessa forma, o resultado mais confiável
parece ser o da amostra com metanol, e, portanto, pode-se considerar que, pelo
método espectrofotométrico, o óleo de B. orellana apresenta um FPS igual a 6.
5.3.6 Análise em Espectroscopia de Infravermelho
A radiação infravermelha corresponde à parte do espectro eletromagnético
situada entre as regiões do visível e das microondas. Para análise de substâncias
orgânicas faz-se geralmente uma varredura de 4000 a 666 cm
-1
(SILVERSTEIN et
al, 1994). Essa análise contribui, juntamente com outros ensaios, para identificação
de compostos químicos e descobrimento de novas estruturas.
O espectro de absorção de IV do óleo de B. orellana encontra-se na figura
24.
FIGURA 24 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE IV DO ÓLEO EM KBr
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Transmittance
1161.14
1446.61
1743.65
2841.14
2902.86
2943.37
3088.03
4000 3000 2000 1000
Wavenumber (cm-1)
61
Analisando-se o espectro nota-se a presença de uma banda larga em
3088,03 cm
-1
, de deformação axial do grupamento hidroxila. Em seguida tem-se as
absorções em 2943,37, 2902,86 e 2841,14 cm
-1
das metilas e metilenos alifáticos. A
banda característica da carbonila encontra-se em 1743,85 cm
-1
. Esses grupamentos
identificados estão presentes na estrutura química dos corantes bixina e norbixina.
5.4 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS
Os ácidos graxos são moléculas lineares que podem ter de 4 a 22 carbonos
em sua estrutura. São classificados como saturados (AGS), monoinsaturados
(AGMI) ou poliinsaturados (AGPI). Com exceção dos AGS e AGMI, os AGPI, em
especial o linoléico (AL) e o α-linolênico (AAL), não são sintetizados endogenamente
pelos seres humanos e são chamados de ácidos graxos essenciais (AGE). Esses
ácidos têm grande importância farmacológica, pois participam de reações
inflamatórias, estão relacionados à resistência imunológica, distúrbios metabólicos,
processos trombóticos e doenças neoplásicas. Em contraposição, são alvos
preferenciais da peroxidação lipídica devido às suas insaturações, resultando em
radicais livres danosos aos tecidos (HIRAYAMA et al., 2006). De acordo com
TINOCO et al. (2007), a carência de AGE especialmente nos humanos pode originar
alterações no crescimento, na pele, distúrbios imunológicos, neurológicos, além de
sérios transtornos comportamentais.
Os ácidos linoléico (18:2, n-6) e α-linolênico (18:3, n-3), representados na
figura 25, pertencem às famílias n-6 (ômega 6) e n-3 (ômega 3), que abrangem
ácidos graxos que apresentam a primeira insaturação no sexto e terceiro carbonos
respectivamente, enumerados a partir do grupo metil terminal. Eles são obtidos pela
dieta e produzem no organismo outros AGPIs (pela ação de enzimas alongases e
dessaturases), que desempenham importantes funções na estrutura das membranas
celulares e nos processos metabólicos. As alongases agem adicionando dois
átomos de carbono à parte inicial da cadeia, enquanto que as dessaturases oxidam
dois carbonos, originando uma dupla ligação. Dentre esses AGPIs, destaca-se o
ácido aracdônico (20:4 n-6, ARA), originado a partir do AL, e os ácidos
eicosapentaenóico (20:5 n-3, AEP) e docosahexaenóico (22:6 n-3, ADH), ambos
originados do AAL (MARTIN et al., 2006).
62
FIGURA 25 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS ÁCIDOS LINOLÉICO E α-
LINOLÊNICO
OH
O
.
1
2
3
4
5
67
8
910
11
12
13
14
15
16
17
1
8
HO
O
.
1
2
3
4
5
6
7
8
910
11
12
13
14
15
16
17
18
ÁCIDO LINOLÉICO
ÁCIDO α-LINOLÊNICO
FONTE: MARTIN et al. (2006), 763
No reino vegetal é bastante comum a síntese do AL, ocorrendo também a sua
conversão para AAL pela ação de uma dessaturase (TINOCO et al., 2007).
No óleo em estudo, além do AL, também foram encontrados AGS, AGM e
AGPI, conforme tabela 4, que também apresenta suas respectivas concentrações.
TABELA 4 – TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO
COMPONENTE
FÓRMULA
MOLECULAR
CONCENTRAÇÃO
(%)
CONC DA LITERATURA
(%)
(1)
Ácido Linoléico (C 18:2) C
18
H
32
O
2
19,5 19,4
Ácido Palmítico (C16:0) C
16
H
32
O
2
15,5 19,3
Ácido Oléico (C18:1) C
16
H
34
O
2
8,1 15,5
Ácido Esteárico (C18:0) C
18
H
36
O
2
7,1 13,0
Ác Aracdônico (C20:4) C
20
H
32
O
2
2,4 -
(1) MATOS, F. J. A.; ALENCAR, J. W.; CRAVEIRO, A. A.; MACHADO, I. L. Ácidos graxos e algumas
oleaginosas tropicais em ocorrência no nordeste do Brasil. Química Nova, v. 15, n. 3, p. 181-185,
1992.
Os ácidos graxos listados correspondem aos de maior concentração no óleo.
Primeiramente está o AL, com aproximadamente 19%, seguido do ácido palmítico.
Os ácidos oléico e esteárico também estão em quantidades significativas. As
concentrações foram comparadas com os resultados encontrados por MATOS et al.
(1992), que utilizaram a mesma forma de extração do óleo de B. orellana e
identificação dos ácidos graxos. Algumas diferenças podem ser notadas, pois
existem diversas variedades da espécie. Além disso, a época em que os frutos
63
foram colhidos pode não ter sido a mesma, o que também interfere nas quantidades
de seus componentes. O ARA foi identificado na amostra testada, porém não foi
citado em nenhuma literatura consultada.
O ARA é bastante importante nos sistemas biológicos, pois é precursor dos
eicosanóides, como prostaglandinas e tromboxanos, que são produzidos pelos
tecidos em situações de inflamação, infecção, lesão tecidual, modulação do sistema
imune e agregação plaquetária (HIRAYAMA et al., 2006). Esse ácido também está
intimamente relacionado com o desenvolvimento do cérebro e da retina durante o
período gestacional e nos primeiros anos de vida, pois os fosfolipídeos associados
aos neurônios são altamente enriquecidos com ele, o que tem sugerido sua
participação na transmissão sináptica (MARTIN, et al., 2006). Além disso, de acordo
com TINOCO et al. (2007), o ARA é essencial pela sua função de sinalização e
divisão celular.
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Na técnica de difusão em ágar, notou-se que as regiões logo ao redor dos
discos contendo as amostras de óleo apresentaram-se bastante pigmentados, com a
coloração característica do urucum, o que dificultava a visualização de um possível
halo de inibição bacteriana. Mesmo assim, não pareceu ter havido algum tipo de
inibição de crescimento até a concentração de 1mg. Portanto, não se fez necessário
testar concentrações maiores, pois a pesquisa de novas substâncias
antimicrobianas é interessante a partir do momento que se prova sua ação em
concentrações na ordem de micro e pico gramas. Além disso, a coloração vermelha
seria acentuada, dificultando ainda mais a análise correta dos resultados.
Também não se pode dizer que não houve a migração do óleo para o ágar,
pois este foi solubilizado com Tween
®
80, responsável pela difusão no meio. Caso
esse fato não tivesse ocorrido, não seria notada a presença da coloração vermelha
ao redor dos discos. Os controles positivo, negativo e de esterilidade comportaram-
se conforme esperado, ou seja, o controle negativo não inibiu o crescimento, o
positivo formou halo de inibição e o de esterilidade não mostrou crescimento
microbiano.
64
Em relação a técnica da CMI, todos os tubos contendo amostra turvaram,
indicando que nas concentrações testadas, o óleo também não inibiu crescimento
bacteriano.
Portanto, não se evidenciou atividade antimicrobiana do óleo pelas duas
técnicas utilizadas. Além disso, alguns trabalhos que tratam dessa atividade com B.
orellana mostram resultados positivos somente com outras partes da planta
(COELHO et al., 2003; GARCIA et al., 2003).
5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
5.6.1 Formação do Complexo Fosfomolibdênico
Esse método é considerado simples, de baixo custo e usado para comparar
a capacidade antioxidante de diversos extratos. De acordo com PRIETO, PINEDA e
AGUILAR (1999), a determinação quantitativa baseia-se na redução do molibdênio
(VI) para molibdênio (V) pela amostra analisada, com subseqüente formação de um
complexo verde fosfomolibdênico (V) em pH ácido, que é determinado
espectrofotométricamente por UV a 695 nm.
O gráfico 3 apresenta os valores da atividade antioxidante relativa do óleo
frente aos padrões utilizados.
GRÁFICO 3 – ATIVIDADES ANTIOXIDANTES RELATIVAS DETERMINADAS PELO
MÉTODO FOSFOMOLIBDÊNICO
0
20
40
60
80
100
ÓLEO
VIT C
RUT
REGIÃO
3
REGIÃO
2
REGIÃO
1
65
Considera-se que a vitamina C apresenta atividade de 100% por ser uma
substância de potente ação antioxidante (PRIETTO, 1999). Já a rutina, embora
também apresente essa atividade, obteve uma AAR de aproximadamente 29% em
relação à vitamina C, conforme indicado na região 3 do gráfico. O óleo, por sua vez,
quando comparado à vitamina C, possui uma AAR de 21,5% (região 1) e de 73,7%
em relação à rutina (região 2).
Se compararmos a atividade da rutina e do óleo em relação à vitamina C
(regiões 3 e 1, respectivamente), nota-se que ambos apresentam resultados
semelhantes, o pode também ser visualizado pela alteração de cor das soluções
após os 90 minutos de reação. Mesmo durante a realização do ensaio, pode-se
notar a mudança da cor inicial levemente amarelada para a cor verde/azulada,
característica da formação do complexo fosfomolibdênico. Quanto mais intensa a
coloração, maior a atividade antioxidante do composto. A figura 26 mostra as
colorações finais.
FIGURA 26 – FORMAÇÃO DO COMPLEXO FOSFOMOLIBDÊNICO
1 – vitamina C
2 – rutina
3 – óleo
4 - branco
1 2
3
4
Após o resfriamento dos tubos, pode-se notar a forte coloração no tubo 1,
como esperado em razão da potente ação antioxidante da vitamina C, seguida de
um azul menos intenso no tubo 2 contendo rutina. O óleo testado (tubo 3)
apresentou uma cor semelhante a esse flavonóide, porém com tonalidade levemente
inferior.
Nesse aspecto, pode-se concluir que o óleo apresenta atividade
antioxidante, a qual está muito próxima da ação da rutina.
66
5.6.2 Redução do Radical DPPH
5.6.2.1 Análise qualitativa
O DPPH é um radical estável que, quando em contato com uma substância
antioxidante doadora de hidrogênio, pode ser reduzido em meio alcoólico, formando
difenil picrilhidrazina de acordo com a representação da figura 27.
FIGURA 27 – REDUÇÃO DO RADICAL DPPH
NN
O
2
N
NO
2
O
2
N
.
NN
O
2
N
NO
2
O
2
N
H
+ RH
+ R.
FONTE: ADELMANN, 2004
Essa redução é acompanhada em comprimentos de onda de 517 a 520 nm
pela diminuição da absorbância, uma vez que ocorre uma mudança na coloração
violeta (característica do radical) para amarela enquanto a reação se processa. A
intensidade da coloração é proporcional à concentração da substância com potencial
antioxidante (HIRATA, 2004).
A figura 28 apresenta a cromatoplaca após revelação com DPPH.
FIGURA 28 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO ÓLEO UTILIZANDO
VITAMINA C COMO PADRÃO
1 – vitamina C
2 – óleo
1 2
67
Como pôde ser observado nas indicações, pelo menos três manchas
amarelas apareceram após a revelação, indicando a presença de compostos
antioxidantes no óleo em estudo. A fase móvel escolhida foi adequada para a
análise, uma vez que permitiu uma boa resolução e conseqüente separação de
diversas substâncias. Embora essa fase não tenha sido apropriada para a vitamina
C, pode-se notar que mesmo não ascendendo na cromatoplaca, sua mancha
correspondente apresentou-se amarela, confirmando a redução do DPPH.
5.6.2.2 Análise quantitativa
Várias formas de apresentação de resultados são permitidas quando se utiliza
o ensaio quantitativo com DPPH. Nesse trabalho, o resultado foi expresso pelo valor
de IC
50
, ou seja, a porcentagem de amostra necessária para reduzir em 50% a
concentração inicial de DPPH. Quanto menor for esse valor, maior é a capacidade
antioxidante da substância.
A equação da reta obtida do gráfico AA% versus concentração da amostra foi:
y = 27,877x + 5,9183
Considerando que o valor de y é 50, tem-se como resultado 1,58 mg/mL. Isso
significa que para reduzir 50% da concentração inicial de DPPH, é necessária uma
concentração de óleo de aproximadamente 1,6 mg/mL.
O mesmo procedimento realizado com a amostra foi feito com dois padrões, a
vitamina C e a rutina, e os valores de IC
50
encontrados foram de 0,49 μg/mL e 4,14
μg/mL, respectivamente. Se compararmos esses valores com o resultado da
amostra, nota-se que o óleo, ainda que apresente atividade antioxidante
considerável conforme mostrou o ensaio qualitativo, apresenta-se menos potente do
que os padrões testados.
5.6.3 Pesquisa de Tocotrienol e Tocoferol
Na tentativa de identificar quais são os compostos antioxidantes do óleo e
sabendo-se da presença de tocotrienóis na sua composição (FREGA; MOZZON;
BOCCI, 1998), foi realizada uma CCD utilizando como padrão o composto
68
Tocotrimax
®
, conforme mostra a figura 29. Essa matéria-prima é obtida do farelo de
arroz e contém no mínimo 7% de tocoferóis e 8% de tocotrienóis.
FIGURA 29 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO ÓLEO UTILIZANDO
PADRÃO COMERCIAL DE TOCOTRIENOL/TOCOFEROL
A
B
A
B
1 – óleo
2 – Tocotrimax
®
1
2
Tomando-se como base os valores de Rf calculados, tanto para as
substâncias presentes na amostra quanto para o padrão, sugere-se a presença de
tocotrienol e/ou tocoferol no óleo. No entanto, essa técnica não permite fornecer
resultado confirmatório.
A confirmação da presença desses compostos foi obtida por CLAE. Tanto o
padrão Tocotrimax
®
quanto a amostra foram preparados na concentração de 1
mg/mL e injetados 20 µL. Por comparação e sob as mesmas condições
experimentais, identificou-se a presença dos tocotrienóis e tocoferóis no óleo, nos
tempos de retenção de aproximadamente 3 e 3,4 min, como mostra o cromatograma
da figura 30. Nota-se a presença de maior quantidade de tocotrienol em relação ao
tocoferol no óleo em estudo.
69
FIGURA 30 – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA DO ÓLEO
MARCANDO TOCOTRIENOL E TOCOFEROL
5.6.4 Isolamento e Identificação do Composto Antioxidante “X”
A figura 31 mostra uma CCD realizada nas mesmas condições experimentais
do item 5.6.3. Pode-se visualizar que dentre as várias manchas claras, a indicada
pela letra “X” (Rf = 0,47) está presente em maior concentração.
FIGURA 31 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA REVELAÇÃO DE
COMPOSTOS ANTIOXIDANTES NO ÓLEO
X
Uma cromatografia em coluna foi realizada com o intuito de separar esse
composto. Assim, após a eluição completa, obteve-se frações de aproximadamente
70
10mL, que foram colocadas em banho-maria a 40 ºC até a evaporação total do
solvente. A cada duas frações foram feitas CCDs usando uma solução de DPPH
para revelação com a intenção de verificar a semelhança de conteúdo. A
visualização das cromatoplacas foi feita em lâmpada UV a 360nm. Em seguida, as
frações semelhantes foram reunidas, dissolvendo-se os resíduos em clorofórmio.
A figura 32 apresenta algumas CCDs realizadas em frações subseqüentes,
mostrando, nas indicações, a separação do composto pesquisado.
FIGURA 32 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE FRAÇÕES
SUBSEQÜENTES OBTIDAS DA CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Como nas cromatoplacas acima havia outro composto além da substância
pesquisada, foi realizada nova cromatografia em coluna somente com essas
frações. Para esse ensaio, foi utilizada uma coluna a vácuo, na qual a pastilha foi
eluida com a mesma fase móvel hexano:acetato de etila:ácido fórmico (85:20:3). As
CCDs das primeiras dez frações obtidas já indicavam a presença isolada do
composto em questão. As frações semelhantes foram reunidas e o solvente foi
evaporado.
Para purificar o composto “X”, realizou-se uma cromatografia preparativa
removendo-se a sílica da região da cromatoplaca onde a substância estava
localizada. A exposição da cromatoplaca sob a lâmpada UV auxiliou para melhor
demarcação da região a ser raspada. Para separar a sílica do composto, o resíduo
raspado foi solubilizado em clorofórmio e filtrado em funil sinterizado G3.
Após evaporação do solvente realizou-se nova CCD, e o resultado pode ser
visto na figura 33, que apresenta o composto antioxidante “X” isolado (Rf = 0,47).
71
FIGURA 33 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DO COMPOSTO “X”
ISOLADO
Esse composto foi submetido à análise em RMN
1
H e
13
C.
No espectro de RMN de ¹H da figura 34, na região aromática em torno de 7
ppm, observou-se um dubleto em 6,37 ppm e um dubleto em 6,47 ppm,
correspondendo aos hidrogênios H5 e H7, respectivamente. Observou-se também
sinal de um grupo metílico ligado ao anel aromático em 2,12 ppm atribuído ao
carbono C8. A ausência de outros sinais na região aromática evidenciou a presença
de hidrogênio substituído no carbono C6 atribuído ao grupo hidroxila (OH).
Notou-se também, na região alifática do espectro de RMN entre 0,6 – 2,8
ppm, sinais de prótons em 1,70 – 1,84 ppm (multipleto) e 2,69 ppm (tripleto)
atribuídos aos hidrogênios H3 e H4, respectivamente. Outro sinal em 1,25 ppm
identificou o grupo metila no carbono C2, enquanto os outros grupos metilas da
cadeia alifática mostraram sinais entre 0,8 -0,9 ppm.
O espectro de RMN de ¹³C e DEPT representados nas figuras 35 e 36,
respectivamente, apresentaram sinais de deslocamento químico entre 115 a 148
ppm referentes aos carbonos do anel aromático C5, C6, C7, C8, C9 e C10, e aos
carbonos vinílicos C3’, C4’, C7’, C8’, C11’ e C12’. Também apresentaram sinais de
deslocamento químico entre 14,1 a 26,0 ppm referentes aos carbonos metílicos
(CH
3
) da estrutura.
No espectro bidimensional COSY (¹H -¹H), apresentado na figura 37, notou-se
a correlação dos prótons de H3’, H7’ e H11’ com H2’, H6’, H10’. Também foram
observados os grupos metílicos ligados às duplas ligações, assim como a correlação
de sinais de prótons dos hidrogênios H3 e H4.
72
No mapa de correlação bidimensional HMQC (¹H -¹³C) da figura 38 observou-
se as correlações de hidrogênio em 6,37
ppm com sinal de carbono em 112,7 ppm e
6,47 ppm com 115,8 ppm atribuídos aos carbonos C5 e C7, respectivamente. Notou-
se também as correlações de hidrogênio em 1,25 ppm com sinal de carbono em
24,2 e 31,5 ppm atribuídos a C2’ e C1’, respectivamente, localizando a metila em
C2. O sinal de H em 5,05 – 5,15 ppm correlacionou-se com os sinais de carbono em
124,6; 124,5 e 124,4 ppm, atribuídos respectivamente aos C3’, C7’ e C11’.
O sinal de H em 2,69 (t) ppm e 1,70-1,84 (m) correlacionaram-se com sinal de
carbono em 22,7 e 31,5 ppm atribuídos aos carbonos C4 e C3, respectivamente. O
sinal de H em 1,94 – 2,09 (m) ppm correlacionaram-se com sinais de carbono em
26,9; 39,93 e 39,9 ppm, localizando os carbonos C2’, C6’ e C10’, respectivamente.
Os sinais de H em 2,12 ppm está correlacionado com sinal de carbono em 22,7 ppm
atribuído ao carbono C2, localizando o grupo metila em C8 e o sinal de H em 1,68
ppm está correlacionado com sinal de carbono em 25,9 ppm, atribuído ao carbono
12’-CH
3
, localizando o grupo metila em C12’.
73
FIGURA 34 – ESPECTRO DE RMN
1
H DO COMPOSTO “X” (300MHz, CDCl
3
)
74
FIGURA 35 – ESPECTRO DE RMN
13
C DO COMPOSTO “X” (75MHz, CDCl
3
)
75
FIGURA 36 – ESPECTRO DE RMN
13
C (DEPT) DO COMPOSTO “X” (75MHz,
CDCl
3
)
76
FIGURA 37 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL ¹H - ¹H (COSY) DO
COMPOSTO “X” (300MHz, CDCl
3
)
77
FIGURA 38 – MAPA DE CORRELAÇÃO BIDIMENSIONAL ¹H - ¹³C (HMQC) DO
COMPOSTO “X” (CDCl
3
)
A análise dos espectros de RMN de ¹H, ¹³C, DEPT, COSY e HMQC,
comparados com dados de literatura, permitiu estabelecer a substância analisada
como sendo o δ tocotrienol, conforme tabela 5.
78
TABELA 5 – COMPARAÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DE RMN DE ¹H,
¹³C E CORRELAÇÃO HMQC E COSY DO COMPOSTO “X” COM
DADOS DE LITERATURA
CARBONO* ¹³Cª ¹³C
b
¹Hª ¹H
c
¹H
d
COSY
(¹H - ¹H)
HMQC
(¹H- ³C)
2 75,5 74,6
3 32,1 32,4 1,70 – 1,84 m 1,6 – 1,8 m 1,75 m H
4
31,5
4 26,9 25,7 2,69 t 2,63 t 2,69 t H
3
22,7
5 112,7 114,9 6,37 d 6,31 d 6,37 d 112,7
6 146,2 144,4
7 115,8 119,5 6,47 d 6,41 d 6,47 d 115,8
8 127,6 122,2
9 147,9 145,5
10 121,4 122,2
1’ 31,5 31,9 1,48 – 1,56 m
2’ 24,2 24,5 1,94 -2,09 m 1,90 – 2,20
m
H
3’
26,9
3’ 124,6 124,0 5,05 – 5,15 m 124,5
4’ 135,3 135,2
5’ 39,93 37,4 1,48 – 1,56 m
6’ 26,8 25,7 1,94 -2,09 m 1,90 – 2,20
m
H
7’
39,93
7’ 124,5 124,0 5,05 – 5,15 m 5,04 m 124,6
8’ 135,2 135,2
9’ 39,9 37,5 1,48 – 1,56 m
10’ 26,8 25,7 1,94 -2,09 m 1,90 – 2,20
m
H
11’
39,9
11’ 124,4 124,1 5,05 – 5,15 m 124,4
12’ 131,5 131,0
12’ – Me 17,9 17,0 1,68 s 1,60 s 17,9; 25,9
12’ – Me 25,9 26,0 1,59 s 1,52 s
8’ – Me 14,3 14,1 1,59 s 1,52 s
4’ – Me 16,0 14,0 1,59 s 1,52 s
2 – Me 22,7 23,5 1,25 s 1,18 s 1,25 s 24,2; 31,5
8 – Me 16,1 11,8 2,12 s 2,06 s 2,12 s 22,7
n – Me 0,8 – 0,9 m 0,8 – 0,9 m 14,3
ª Os dados do espectro de RMN de ¹H e ¹³C foram realizados a 300 MHz e 75 MHz,
respectivamente, CDCl
3
, TMS, ppm.
b
CARVALHO, M.G. de; et al. Triterpenos isolados de Eschweilera longipes Miers (Lecythidaceae).
Química Nova, v.21, n.6, 1998.
c
SILVA, D.H.S. Constituintes químicos de Iryanthera sagotiana e Iryanthera lacifolia. São Paulo,
1997. 147 p. Tese(Doutorado) –Instituto de Química, USP.
d
STROHSCHEIN, S. et al. Separation and identification of tocotrienol isomers by HPLC – MS and
HPLC – NMR coupling. Analytical Chemistry, v. 71, n. 6, 1999.
O.
.
.
.
.
OH
.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
10'
11'
12'
*
79
5.7 DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO COSMÉTICA
A escolha de desenvolver um produto labial baseou-se nas características
identificadas no óleo de B. orellana. Somente o fato de ser um óleo vegetal já faz
dessa matéria-prima um produto para hidratação labial, pois forma uma película que
impede a perda de água transepidérmica (FONSECA; PRISTA, 1984). Além disso, a
presença dos pigmentos de cor vermelho-alaranjado fornecerão a cor ao produto,
dispensando a utilização de corantes sintéticos, que já tem seu uso sendo
restringido nos últimos tempos. As substâncias antioxidantes irão auxiliar na
prevenção do envelhecimento celular e sua capacidade de absorver radiação
ultravioleta auxiliará na proteção solar.
Segundo PEYREFITTE, MARTINI e CHIVOT (1998): “O batom tem como
objetivo modificar o aspecto normal dos lábios dando-lhe uma tez diferente, um
reflexo mais ou menos brilhante, um brilho mais ou menos vivo”. É um símbolo da
sensualidade feminina, sendo o mais consumido em relação aos esmaltes e
sombras.
Ainda de acordo com esses autores, um batom é composto principalmente de
um veículo gorduroso no qual estão dispersos os corantes. Existem diversos tipos
de batons, alguns mais gordurosos que coram e brilham intensamente nos lábios,
outros foscos, ou até hipoalergênicos. Nesse trabalho, desenvolveu-se um brilho
para os lábios, ou gloss labial, que são mais transparentes e utilizados não para
colorir, mas para modificar levemente a cor natural dos lábios.
O Versagel
®
apresenta excelente transparência, estabilidade térmica e é
compatível com a maioria dos ingredientes cosméticos lipossolúveis, pois é
altamente apolar. Sua propriedade de suspensão de partículas finas, como óxido de
zinco, óxido de ferro e pigmentos, faz com que seja bastante aplicado
industrialmente na produção de maquiagens.
Do ponto de vista reológico, o Versagel
®
é considerado termodinamicamente
reversível. Quando submetido a aquecimento, ocorre um decréscimo de
viscosidade, porém nunca chega à viscosidade zero, mesmo em altas temperaturas.
Quando resfriado, volta a seu estado original sem perda de suas propriedades. Por
80
apresentar-se originalmente com uma consistência geleificada, promove maior
oclusividade na região labial, ocasionando maior hidratação.
11
Duas fórmulas de gloss labial foram propostas: a primeira com uma
consistência quase líquida (fórmula 1), que permite acondicioná-la em uma
embalagem roll-on; e a outra com maior consistência (fórmula 2), isto é, que não
escorre quando se verte o frasco que a contém. Essa diferenciação foi sugerida
para dar a opção de dois tipos de aplicação do produto, uma vez que a fórmula mais
consistente poderá ser aplicada com o auxílio de uma espátula ou de um pincel
apropriado, enquanto que a forma mais líquida será embalada em frasco roll-on e
aplicada diretamente sobre os lábios.
5.7.1 Composição
Os componentes das fórmulas desenvolvidas encontram-se na tabela 6.
TABELA 6 – FÓRMULAS DE GLOSS LABIAL
CONCENTRAÇÕES (%)
MATÉRIA –PRIMA
FÓRMULA 1 FÓRMULA 2
Versagel
®
35 94
DC 1404 30 1
Vaselina líquida 30 -
Vit E oleosa 2 2
Óleo de B. orellana 22
Aroma líquido qsp qsp
Mica bronze 0,5 0,5
O óleo foi utilizado a 2% por ser uma concentração usual de óleos vegetais
em cosméticos. Além disso, concentrações maiores influenciariam na coloração do
produto, que seria muito mais intensa e esteticamente desagradável.
A fórmula 1 apresentou uma consistência mais fluida em razão da presença
da vaselina líquida e do silicone DC 1404 (ciclometicone/dimeticone) em alta
concentração, que além de hidratantes, favorecem a melhor espalhabilidade do
produto sobre os lábios. A vitamina E oleosa atua como antioxidante e hidratante, e
11
Dados obtidos da literatura técnica do fornecedor, Opção Fênix Distribuidora de Insumos
Ltda.
81
a mica fornece um brilho por ser constituída de minúsculas partículas que ficam
suspensas no produto. Sugere-se uma embalagem roll-on para esse produto.
Já na fórmula 2, o gloss tem aspecto geleificado, podendo ser armazenado
em pequenos potes, e retirado com a ajuda de uma espátula ou com um pincel
apropriado.
Não se faz necessária a adição de conservantes nas formulações, pois o
veículo é constituído essencialmente de substâncias oleosas.
O aroma escolhido deve ser lipofílico. Na formulação 1 optou-se pelo aroma
de chocolate e na fórmula 2, de canela.
5.7.2 Reologia
A reologia das fórmulas 1 e 2 encontram-se na figura 39.
0
50
0
5
10
15
20
0 50 100 150 200
taxa de cisalhamento (s-1)
viscosidade (cP)
FIGURA 39 – COMPORTAMENTO REOLÓGICO DAS FÓRMULAS 1 E 2
100
50
00
50
0 50 100 150 200
taxa de cisalhamento (s
-1
)
viscosidade (cP)
2
FÓRMULA 1 FÓRMULA 2
2
1
O comportamento reológico de ambas as fórmulas é bastante semelhante.
Embora a fórmula 1 seja mais fluida, ela também inicia seu fluxo com um
comportamento pseudoplástico, ou seja, há uma diminuição da viscosidade com o
aumento da taxa de cisalhamento.
Próximo aos 50 s
-1
, as fórmulas começam a se comportar de forma
newtoniana, indicando que formarão um filme fino sobre a região labial, e
82
conseqüentemente irão proporcionar boa hidratação e facilidade na absorção de
ativos que eventualmente serão incorporados a elas.
Importante ressaltar que nesses gráficos não se está analisando valores de
viscosidade, mas sim a curva obtida. A escala do gráfico referente à formula 1
possui viscosidades diferentes aos da fórmula 2, pois é coerente que a primeira
tenha valores maiores por ser uma fórmula mais fluida.
5.7.3 Espalhabilidade
O teste de espalhabilidade das fórmulas 1 e 2 podem ser visualizados na
figura 40.
FIGURA 40 – ESPALHABILIDADE DAS FÓRMULAS 1 E 2
FÓRMULA 1
FÓRMULA 2
Como pode ser observado, a fórmula 1 apresentou uma área de 754,4 mm
2
,
enquanto que a fórmula 2 atingiu apenas 314 mm
2
.
Dessa forma, pode-se dizer que a espalhabilidade da fórmula 1 é maior e
conseqüentemente torna-se mais fácil aplicá-la do que a formulação 2.
5.7.4 pH
A medida de pH em produtos dermatológicos é essencial, pois eles não
devem alterar o pH cutâneo normal, que se encontra entre 4 e 6,5. Além disso, o pH
83
também interfere na conservação e estabilidade das formulações. Bons produtos
são aqueles em que esse fator não se altera com o tempo, mesmo em longos
períodos de armazenagem (PEYREFITTE; MARTINI; CHIVOT, 1998).
Dessa forma, o pH determinado em ambas as formulações foi de 5,5,
estando, portanto, dentro do padrão permitido.
5.7.5 Microfotografias
Algumas microfotografias foram realizadas com o objetivo de analisar a
homogeneidade das fórmulas desenvolvidas. As figuras 41 e 42 apresentam esses
resultados.
FIGURA 41 – MICROFOTOGRAFIAS DA FÓRMULA 1
FIGURA 42 – MICROFOTOGRAFIAS DA FÓRMULA 2
Analisando-se as microfotografias da fórmula 1, nota-se a presença de
glóbulos grandes, de formato disforme e de diversos tamanhos. Em contrapartida, a
84
fórmula 2 apresenta-se muito mais homogênea, com glóbulos pequenos, com
formatos semelhantes, e distribuição uniforme.
Essas características indicam uma melhor estabilidade da fórmula 2, que
estará menos sujeita a separação de fases e desintegração do produto.
A irregularidade na fórmula 1 pode ser explicada em razão das diferenças de
densidade dos seus constituintes, que não permitem a mistura perfeita entre eles.
Além disso, sabe-se que o grau de hidrofobicidade pode diferir entre os compostos
oleosos. Um óleo pode ser mais ou menos hidrofóbico que outro, embora ambos
sejam substâncias lipofílicas. Talvez por essas razões existam glóbulos grandes que
não se homogeneizaram com os demais constituintes oleosos da fórmula.
Considerando que na fórmula 2 não há vaselina e a concentração do silicone
é baixa, há uma indicação que esses dois compostos são determinantes para a não
homogeneidade do sistema formado.
As partículas de coloração marrons-avermelhadas presentes em ambas as
formulações podem ser impurezas do próprio óleo de B.orellana, ou partículas de
mica dispersas no sistema.
85
6 CONCLUSÕES
O óleo de B. orellana foi extraído com bom rendimento por Soxhlet, assim
como cristais de coloração vermelho-púrpura foram obtidos durante a extração
clorofórmica. Embora não fosse objetivo inicial do trabalho, mas em razão da grande
quantidade obtida, caracterizou-se esse cristal como sendo o corante bixina, pelas
análises de ponto de fusão, espectroscopia de IV e RMN
1
H e
13
C.
O comportamento reológico do óleo mostrou que ele se apresenta com boas
propriedades para a aplicação cutânea, indicando uma distribuição de forma
homogênea e uniforme, em uma camada fina, fornecendo um aspecto sedoso ao
toque.
Quando comparado com o óleo de amêndoas na análise de espalhabilidade,
o óleo de B. orellana mostrou-se bastante semelhante, ou seja, sua viscosidade
permite que sua aplicação sobre uma superfície seja fácil, sem oferecer resistência
ao movimento.
Pelo método espectrofotométrico, foi determinado um FPS 6 para o óleo. Já
se conhecia a propriedade de absorção de radiação UV desse produto, mas nesse
trabalho pôde-se determinar seu fator de proteção in vitro, ainda que não seja
conclusivo, visto que são necessários testes in vivo para confirmação desse valor.
A espectroscopia de IV permitiu caracterizar grupamentos químicos como
hidroxilas, metilas, metilenos alifáticos e carbonilas do óleo em estudo. Em relação
aos ácidos graxos, pôde-se determinar a presença de ácidos graxos insaturados,
como linoléico e oléico, além do ácido aracdônico, que ainda não havia sido relatado
nas literaturas consultadas.
A atividade antimicrobiana não foi identificada pelos métodos de difusão em
ágar e CMI frente às cepas testadas. Embora não se possa excluir essa atividade no
óleo, visto que somente oito cepas foram avaliadas, a maioria dos trabalhos sobre
ação antimicrobiana de B. orellana trazem resultados positivos somente para outras
partes da planta, como folhas e frutos.
Em relação à ação antioxidante, pelo ensaio fosfomolibdênico, o óleo
apresentou atividade antioxidante semelhante à rutina. As análises cromatográficas
realizadas permitiram a visualização de diversos compostos com essa atividade,
especialmente os tocotrienóis e tocoferóis, identificados por CLAE. O composto “X”
86
corresponde, de acordo com os dados de RMN
1
H e
13
C, à substância δ tocotrienol,
confirmando informações de literatura que relatam que B. orellana é uma das
plantas com maior quantidade dessa substância.
A formulação cosmética sugerida para aplicação do óleo foi um gloss labial,
visto que: é um óleo que apresenta boa espalhabilidade; fornece cor ao produto,
evitando assim o uso de corantes sintéticos; é hidratante por formar um filme
oclusivo; tem propriedades anti-radicais livres e fator de proteção solar. Dessa
forma, conseguiu-se agregar valor ao óleo estudado, aproveitando suas
propriedades identificadas. Duas fórmulas foram propostas, uma mais fluida e outra
mais consistente. Ambas apresentaram-se com boas características para aplicação
e bastantes semelhantes do ponto de vista reológico. Em relação à espalhabilidade,
a fórmula mais fluida é aplicada com mais facilidade em razão de sua baixa
viscosidade. Em contrapartida, apresenta-se pouco homogênea, pois as
microfotografias da fórmula mais viscosa permitiram visualizar glóbulos menores,
com formatos uniformes e mais bem distribuídos.
87
REFERÊNCIAS
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