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Luciana Vieira Carvalho
ESTUDO EXPERIMENTAL DO EFEITO ADJUVANTE
DA SÍLICA NANOESTRUTURADA SBA-15
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Luciana Vieira Carvalho
ESTUDO EXPERIMENTAL DO EFEITO ADJUVANTE
DA SÍLICA NANOESTRUTURADA SBA-15
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Imunologia.
São Paulo
2007
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Luciana Vieira Carvalho
ESTUDO EXPERIMENTAL DO EFEITO ADJUVANTE
DA SÍLICA NANOESTRUTURADA SBA-15
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Imunologia.
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Dr. Osvaldo Augusto Sant’Anna
São Paulo
2007
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Sergio e Solange, pelo carinho
e incentivo imprescindível para a realização de
todos os meus projetos.
Aos meus irmãos Junior, Christiano e Henrique
pela amizade, companheirismo, principalmente
nos momentos mais difíceis.
A minha avó Aparecida que não esteve presente
fisicamente, mas que sempre torceu pelas minhas
conquistas.
Ao meu orientador Dr. Osvaldo Augusto Sant’Anna
por me apresentar a beleza das Ciências e do
Conhecimento essencias para a minha formação.
A minha amiga Eliana por todas as sugestões
positivas para a finalização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Osvaldo Augusto Sant’Anna pelo ensino constante e precioso, pela
confiança, incentivo e amizade. Meu eterno agradecimento e admiração.
Aos Drs. Lucildes P. Mercuri e Jivaldo Matos do Instituto de Química da USP e
Dra. Márcia C. A. Fantini do Instituto de Física da USP pela colaboração, auxílio na
interpretação físico-química e fornecimento da sílica SBA-15, objeto central desta
dissertação.
A Dra. Wafa Hanna Koury Cabrera e Dr. Orlando Garcia Ribeiro Filho pelo
fornecimento dos camundongos da Seleção III e IVA, pelas análises de toxicidade da
SBA-15 e pelo auxílio constante.
A Dra. Denise Vilarinho Tambourgi pela oportunidade de realização deste
trabalho no Laboratório de Imunoquímica – IBu e pelas sugestões positivas.
A Eliana Blini Marengo, Karina Scaramuzzi, Alessandra Commodoro, Flavia
Afonso Lima, Melissa Ingrid Junta, Vanessa Carmona, Juliana Maia Nucci pelo apoio e
acima de tudo pela amizade e companheirismo tanto nos momentos mais difíceis
quanto nos mais alegres.
Ao técnico do Biotério Edson Luiz da Silva e a técnica Márcia Franco pelo
inestimável auxílio, apoio e amizade.
A todo o pessoal do Laboratório de Bacteriologia pela convivência, amizade e
pelo carinho durante o período que passei neste laboratório.
Aos colegas e funcionários do Laboratório de Imunoquímica pelo convívio,
amizade e apoio, enfim, por fazerem com que tudo se tornasse mais fácil e por
torcerem para que tudo corresse bem.
Aos colegas e funcionários do Departamento de Imunologia pela convivência e
amizade.
Aos meus pais por cada palavra, beijo, abraço que me serviram de inspiração e
estímulo. Muito obrigada por TUDO o que fizeram e fazem por mim, por estarem
sempre ao meu lado, me apoiando nos momentos difíceis e comemorando com as
minhas conquistas.
A minha tia Suelly Carvalho pela amizade e inestimável apoio. Meu eterno
agradecimento!
A Patrícia Carneiro pela amizade, incentivo, por fazer com que eu enxergasse as
coisas de uma maneira mais simples e não deixando que eu perdesse a esperança.
Aos funcionários da Biblioteca que contribuíram na elaboração, na revisão textual
e no apoio e suporte de informática destas diretrizes.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo
apoio financeiro.
Ao Laboratório Cristália pela confiança e colaboração determinada e efetiva; que
compreendeu o princípio fundamental desse estudo e decidiu–se parceira no apoio aos
conhecimentos que vem sendo gerados.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Imunoquímica do Instituto Butantan, pelo
Programa de Pós-graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo.
Apoio Financeiro: FAPESP
RESUMO
CARVALHO, L. V. ESTUDO EXPERIMENTAL DO EFEITO ADJUVANTE DA SÍLICA
NANOESTRUTURADA SBA-15. 2007. 81 f. Dissertação [Mestrado em Imunologia] –
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Estudou–se o potencial adjuvante e o efeito da modulação da resposta imune pela
sílica ordenada nanoestruturada SBA–15 em camundongos BALB/c e nos
geneticamente selecionados para a máxima [H
IVA
] ou mínima [L
IVA
] produção de
anticorpos. Os animais foram imunizados por diferentes vias com antígenos
encapsulados/adsorvidos em SBA–15, ou em hidróxido de alumínio [Al(OH)
3
], ou em
Adjuvante Incompleto de Freund [AIF]. Analisou-se a cinética de produção de IgG total
e seus isótipos IgG
1
e IgG
2a
por ELISA. Os resultados revelaram que a SBA–15 induziu
resposta semelhante ou superior àquelas com AIF ou Al(OH)
3.
Além disso, foi eficaz na
instalação de memória, não interferindo qualitativamente na resposta imune, havendo
produção de ambos IgG
1
e IgG
2a
. A SBA–15 mostrou-se efetiva e não tóxica
melhorando a imunogenicidade dos antígenos, sendo capaz de corrigir a resposta de
indivíduos constitutiva ou eventualmente maus respondedores. Portanto, quando do
emprego em vacinações de populações naturais, poderá induzir proteção de maneira
mais homogênea e eficiente.
Palavras-chave: Adjuvante. Sílica SBA–15. Antígeno. Imunogenicidade. Anticorpos.
Memória. Camundongos High e Low.
ABSTRACT
CARVALHO, L. V. EXPERIMENTAL STUDIES OF THE ADJUVANT EFFECT OF THE
NANOSTRUCTURED SBA–15 SILICA. 2007. 81 f. [Master Thesis in Immunology] -
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
The adjuvant potential and the possible modulation effect of the immuneresponsiveness
of the nanostructured ordered SBA–15 silica were studied in BALB/c mouse or in the
genetically selected high [H
IVA
] or low [L
IVA
] antibody responder lines. Mice were
immunized by different routes with antigens adsorbed/encapsulated in SBA–15, in
aluminum hydroxide [Al(OH)
3
], or in Incomplete of Freund Adjuvant [IFA]. Total IgG
antibodies and IgG
1
and IgG
2a
isotypes were titrated by ELISA. The SBA–15 silica
induced similar or higher immune response than IFA or Al(OH)
3
. Moreover, an efficient
immunological memory was established without affecting the quality of responsiveness,
promoting the production of both IgG
1
and IgG
2a
. SBA–15 was effective and non toxic
enhancing the immunogenicity of the antigens. This silica was efficient in modulate the
responsiveness of the genetically low responder individuals, and this attribute could be
usefulness for vaccine delivery, improving the homogeneity of natural populations.
Keywords: Adjuvant. SBA–15 silica. Antigen. Immunogenicity. Antibodies.
Immunological memory. High and Low responder mice.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Microscopia eletrônica de transmissão [TEM] de SBA-
15.........................................................................................................
22
Figura 2.
Esquema utilizado para purificação da proteína recombinante Int1
β
-
cromatografia de afinidade em coluna de níquel.................................
35
Figura 3.
SDS–PAGE 15% - Perfil eletroforético dos extratos totais
evidenciando a expressão da proteína Int1βr.....................................
45
Figura 4.
Eletroforese em gel de SDS-PAGE 15% da proteína solúvel Int1βr
após purificação utilizando cromatografia de afinidade em coluna de
níquel...................................................................................................
46
Figura 5.
Média dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos
BALB/c imunizados pela via subcutânea com SBA–15 em PBS;
Int1βr solúvel; SBA-15 + Int1βr; Int1βr em SBA-15............................
48
Figura 6.
Média dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos
BALB/c imunizados pela via oral.........................................................
50
Figura 7.
Média dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos
BALB/c imunizados pela via intraperitoneal........................................
51
Figura 8.
Média dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos
BALB/c imunizados pela via subcutânea.............................................
52
Figura 9.
Comparação da média dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por
camundongos BALB/c imunizados pela VO; IP; SC...........................
53
Figura 10.
Porcentagem de BSA (A) ou Int1
β
r
(B) encapsulada
e/ou adsorvida
a SBA-15.............................................................................................
55/56
Figura 11.
Efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
imunizados com
10µg ou 100µg de BSA pela via oral...................................................
58
Figura 12.
Efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
imunizados com 0,1; 1;
10µg de BSA pela via intramuscular....................................................
59
Figura 13.
Média dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
imunizados pela via oral.......................................................................
62
Figura 14.
Comparação dos títulos de IgG produzidos por camundongos L
IVA
e
H
IVA
imunizados com 10µg de BSA em SBA-15 ou em Al(OH)
3
pela
via oral..................................................................................................
63
Figura 15.
Média dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
imunizados pela via intramuscular.......................................................
64
Figura 16.
Comparação dos títulos de IgG produzidos por camundongos L
IVA
e
H
IVA
imunizados com 10µg de BSA em SBA-15 ou em AIF
pela via
intramuscular........................................................................................ 65
Figura 17.
Título de IgG
1
e IgG
2a
anti-Int1βr produzidos por camundongos
BALB/c imunizados pela via intraperitoneal (A) e subcutânea (B)......
68
Figura 18.
Título de IgG
1
e IgG
2a
anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
imunizados pela via oral (A) e intramuscular (B).................................
69
Figura 19.
Média ± SD do peso corporal de camundongos Swiss inoculados ou
não com 250µg de SBA-15 pela via intramuscular..............................
71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Representação do esquema de imunização utilizado neste
estudo.....................................................................................................
42
Tabela 2 -
Média dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos LIVA
imunizados pela via oral..........................................................................
59
Tabela 3 -
Média dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos LIVA
imunizados pela via intramuscular..........................................................
60
Tabela 4 -
Relação peso corporal/peso do baço(g) dos camundongos Swiss
inoculados ou não pela via intramuscular com 250µg de SBA-15..........
71
LISTA DE ABREVIATURAS
θ
Temperatura
λ
Comprimento de onda
ACF Adjuvante completo de Freund
AIF Adjuvante incompleto de Freund
Al(OH)
3
Hidróxido de alumínio
APC Célula apresentadora de antígeno
BSA Soroalbumina bovina
CD95L Fas ligante
CTL Linfócito T citotóxico
D.O. Densidade ótica
DC Célula dendrítica
ELISA Ensaio imunoenzimático
Fc Cadeia pesada da imunoglobulina
IFN-γ
Interferon gama
IgG Imunoglobulina G
IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5
IL-10 Interleucina 10
IL-13 Interleucina 13
IM Via intramuscular
Int1
β
r Intimina 1
β
recombinante
IP Via intraperitoneal
IPTG
Isopropil-tio-β-D-galactosídeo
kDa Quilodalton
LB Caldo de crescimento bacteriano Luria-Bertani
LPS Lipopolissacarídeo bacteriano
Mφ Macrófagos
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MHCI Complexo principal de histocompatibilidade de classe I
MHCII Complexo principal de histocompatibilidade de Classe II
nm Nanômetro
OPD Orto-dihidrocloreto de fenilediamina
OSCMS Sílica mesoporosa altamenente ordenada
PAMP Padrão molecular expresso na superfície de patógeno
PBS Tampão salina-fosfato
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
rpm Rotação por minuto
SiO
2
Óxido de sílica
SC Via subcutânea
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-Page Gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio
TCD4
+
Linfócito T auxiliar CD4
+
TCR Receptor de antígeno do linfócito T
TEM Microscopia eletrônica de transmissão
TEMED N, N, N’, N’ - Tetrametilenodiamina
TEOS Tetraetil-ortosilicato
T
H
Linfócito T auxiliar
T
H
1 Linfócito T auxiliar do tipo 1
T
H
2 Linfócito T auxiliar do tipo 2
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
VO Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................
20
1.1 Adjuvantes..........................................................................................................
20
1.2 Sílicas Mesoporosas Altamente Ordenadas......................................................
22
1.3 Camundongos Geneticamente Selecionados....................................................
24
1.4 Desenvolvimento da Resposta Imune................................................................
26
1.5 Memória Imunológica.........................................................................................
30
2 OBJETIVO............................................................................................................
32
3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................
33
3.1 Sílicas Mesoporosas Altamente Ordenadas......................................................
33
3.2 Antígenos...........................................................................................................
33
3.2.1 Obtenção e Purificação da Proteína Recombinante Int1
β
..............................
34
3.3 Eletroforese em Gel de SDS−Poliacrilamida......................................................
36
3.4 Dosagem de Proteínas.......................................................................................
37
3.5 Animais...............................................................................................................
37
3.6 Preparo do Complexo Imunogênico...................................................................
38
3.7 Esquemas de Imunização..................................................................................
38
3.7.1 Imunizações pela Via Oral (VO)......................................................................
38
3.7.2 Imunizações pela Via Intramuscular (IM)........................................................
39
3.7.3 Imunizações pela Via Intraperitoneal (IP)........................................................
40
3.7.4 Imunizações pela Via Subcutânea(SC)...........................................................
41
3.8 Determinações dos Títulos de Anticorpos IgG e seus Isótipos IgG
1
e IgG
2a
Anti–Int1
β
r ou Anti–BSA por ELISA........................................................................
42
3.9 Análise do Potencial de Encapsulação/Adsorção do Antígeno pela SBA–15....
43
3.10 Análise da Toxicidade da Sílica SBA-15..........................................................
44
3.11 Análise Estatística............................................................................................
44
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................
45
4.1 Expressão e Purificação da Proteína Recombinante Int1β................................
45
4.2 Verificação do Possível Efeito Adjuvante da Sílica SBA–15.............................
47
4.3 Estudo do Efeito Adjuvante da Sílica SBA-15 em Imunizações com Int1βr por
diferentes vias: VO, IP e SC.....................................................................................
49
4.4 Verificação do Potencial de Encapsulação/Adsorção da sílica SBA–15............
54
4.5 Efeito dose-resposta...........................................................................................
57
4.6 Análise da Modulação da Resposta Induzida pela SBA-15...............................
61
4.6.1 Imunização pela Via Oral................................................................................
61
4.6.2 Imunização pela Via Intramuscular.................................................................
63
4.7 Análise da Influência da SBA-15 na Produção de Isótipos de IgG....................
67
4.8 Análise da Toxicidade da SBA-15......................................................................
70
5 CONCLUSÕES.....................................................................................................
73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................
75
1 INTRODUÇÃO
1.1 Adjuvantes
Adjuvantes são substâncias que, quando adicionadas a um determinado
imunógeno, potencializam sua imunogenicidade amplificando e/ou melhorando a
duração da resposta imune específica (EDELMAN; TACKET, 1990); também têm sido
utilizados para modular a resposta imune em indivíduos constitutiva ou eventualmente
maus respondedores, tais como idosos, imunossuprimidos, e aqueles sob condições
ambientais adversas de subnutrição e de insalubridade. Pode-se destacar ainda, a
importância de alguns adjuvantes na proteção e liberação direcionada de antígenos
administrados nos tecidos mucosos e na modulação de respostas inapropriadas
(DEGEN; JANSEN; SCHIJNS, 2003; McCLUSKIE; WEERATNA, 2001; EDELMAN,
2002). Nos últimos anos, devido ao desenvolvimento de vacinas utilizando proteínas
recombinantes ou peptídeos sintéticos, os adjuvantes têm recebido atenção especial,
pois estes antígenos são pouco imunogênicos e requerem a adição destas substâncias
para que haja indução de resposta imune eficaz (GUPTA et al., 1993).
Quimicamente os adjuvantes constituem um grupo de compostos heterogêneos
do ponto de vista estrutural e funcional e, devido a essa diversidade podem agir através
de mecanismos diversos que incluem: a liberação lenta e/ou controlada do antígeno
prolongando o período de estímulo; proteção do antígeno contra proteólise; estímulo da
atividade de células apresentadoras de antígenos [APC] tais como macrófagos, células
dendríticas [DC] e linfócitos B; ativação e/ou modulação de células imunocompetentes
como os linfócitos T, além de induzirem sinais inflamatórios peculiares (DEGEN;
JANSEN; SCHIJNS, 2003; McCLUSKIE; WEERATNA, 2001; EDELMAN, 2002).
A hiperativação da resposta imune induzida por adjuvantes pode vir
acompanhada de reações adversas devido à estimulação não intencional de diferentes
mecanismos do sistema imunológico, ou refletem reações farmacológicas indesejáveis
(CHEDID, 1985).
Embora muitas substâncias, como os Adjuvantes Incompleto e Completo de
Freund [AIF e ACF, respectivamente], produtos naturais ou sintéticos derivados de
bactérias [LPS e Lipídio A] (ULRICH et al., 1990; ALVING et al., 1993), Microesferas e
Lipossomos (DA COSTA et al., 2002a, 2002b), sejam conhecidos ou estejam em
desenvolvimento, os únicos licenciados para uso em humanos são os derivados de
hidróxido alumínio [Al(OH)
3
]. No entanto, estes adjuvantes não induzem resposta
imunológica muito elevada e, em geral, esta resposta é qualitativamente direcionada
quanto à classe de linfócitos T auxiliares [T
H
], com predominância na produção de
determinado isótipo de IgG (HADJIPETRTOU-KOUROUNAKIS; MÖLLER, 1984).
Reações locais adversas como eritema, nódulos subcutâneos, hipersensibilidade de
contato, além de inflamação granulomatosa têm sido relatados após emprego destes
adjuvantes (ERODOHAZI; NEWMAN, 1971; COLLIER; POLAKOFF; MORTIMER, 1979;
CLEMMENSEN; KNUDSEN, 1980; FROST et al., 1985; STRAW et al., 1985).
Diante desses relatos, e pela importância das vacinações para a saúde pública,
justificam–se plenamente estudos sobre estratégias racionais para o desenvolvimento
de novos adjuvantes, passíveis de emprego em humanos, que sejam seguros e
eficientes na melhora da imunogenicidade de antígenos, e possibilitem o aumento na
duração da resposta; além da indução e instalação mais efetiva de memória
imunológica.
1.2 Sílicas Mesoporosas Altamente Ordenadas
As sílicas mesoporosas são partículas de SiO
2
com estrutura porosa altamente
organizada que, devido às propriedades de superfície e seus potenciais de aplicação
em diferentes áreas, têm despertado grande interesse à comunidade científica e em
segmentos tecnológicos. Estes materiais são capazes de interagir com átomos, íons e
moléculas, não apenas em sua superfície, como também interiormente, possuindo
grande aplicabilidade em processos de troca de íons, adsorção, catálises entre outros
(KRESGE et al., 1992; YANG; COOMBS; OZIN, 1997). Dentre as sílicas mesoporosas,
a SBA-15, adquiriu importância nas áreas de nanotecnologia e nanobiotecnologia. Este
material apresenta estrutura hexagonal com poros altamente ordenados e interligados,
paredes relativamente espessas [3,1 – 6,4nm] e notável estabilidade térmica,
hidrotérmica e mecânica (Figura 1) (ZHAO et al., 1998a, 1998b; MATOS et al., 2001).
C
B A
Figura 1 – Microscopia eletrônica de transmissão [TEM] de SBA-15. Tamanho dos poros: 3,1 -
6,4nm.
Outros tipos de sílica, denominadas Ordered Silica with Cage-like Mesoporous
Structure [OSCMS], que possuem estruturas tridimensionais únicas e conectividade
entre seus poros também vêm sendo estudadas (HUO et al., 1994; HUO et al., 1995).
Dentre essas outras OSCMS podem-se destacar as sílicas com as seguintes formas
geométricas: cúbica Pm3n [SBA-1], a hexagonal P6
3
/mmc [SBA-2 e SBA-12], a cúbica
de corpo centrado Im3m [SBA-16] (HUO et al., 1994; HUO et al., 1995; ZHAO et al.,
1998b), e a cúbica de face centrada Fm3m [FDU–1] (revista por MATOS et al., 2003). A
aplicabilidade destes materiais porosos está diretamente relacionada aos seus
tamanhos, formas e volumes dos espaços internos (DAVIS, 2002).
Vários estudos vêm sendo realizados utilizando estas sílicas como veículos de
diferentes substâncias para diversos fins. No entanto, não havia sido avaliada a
capacidade destas sílicas em encapsular, portar, proteger e apresentar antígenos ao
sistema imunológico.
Trabalhos desenvolvidos há mais de duas décadas, demonstraram que a
administração de sílicas coloidais afeta a atividade das enzimas contidas no lisossomo
dos macrófagos, alterando muitas das suas funções catabólicas, como o efeito
bactericida. A hipótese vigente era de que, conseqüentemente, qualquer efeito de
bloqueio de funções dos macrófagos supostamente propiciaria ou facilitaria a atuação
de outras células mais eficazes para a apresentação de antígenos e, portanto, para a
ativação e desenvolvimento da resposta imune, melhorando consistentemente a
produção de anticorpos (ALLISON; HARINGTON; BIRBECK, 1966; BECKER;
RUDBACH, 1979; GERY; LEPE-ZUNIGA, 1984; KAMPSCHMIDT; WORTHINGTON;
MESECHER, 1986; LOTZOVA; CUDKOWICZ, 1974; VOGEL; ENGLISH; O’BRIEN,
1982).
Com base nos resultados descritos acima e, nas propriedades físicas e
estruturais da sílica SBA-15 surgiu o interesse de investigar a viabilidade do emprego
desta OSCMS como adjuvante e a sua capacidade de carregar e liberar diferentes
antígenos às células imunocompetentes, potencializando a resposta imunológica.
Saliente–se que atualmente se sabe que os linfócitos B e, em especial as células
dendríticas, são mais eficazes quanto à apresentação antigênica do que os
macrófagos.
Assim, num primeiro estudo, avaliaram–se os seus efeitos benéficos e maléficos
in vivo através da comparação das respostas humorais de linhagens de camundongos
apresentando características imunobiológicas distintas como, por exemplo, a
funcionalidade de seus macrófagos.
1.3 Camundongos Geneticamente Selecionados
Linhagens de camundongos geneticamente selecionados para a produção
máxima [High – H] ou mínima [Low – L] de anticorpos a diferentes imunógenos naturais,
foram obtidas por cruzamentos seletivos bidirecionais, evitando-se a consangüinidade,
a partir de populações geneticamente heterogêneas. Oito seleções foram realizadas e,
em cada uma dessas, as linhagens H e L divergiram progressivamente de geração a
geração, e as separações máximas interlinhagens [limites de seleção] foram
alcançadas entre as gerações F
7
e F
16
dos diferentes processos seletivos. Atingindo o
limite de seleção, a continuidade dos cruzamentos seletivos não altera as diferenças
interlinhagens, indicando homozigose dos alelos h nas linhagens H e dos alelos l nas L
(BIOZZI et al., 1979).
Durante os processos seletivos, diferentes grupos de genes foram afetados,
possivelmente em função da complexidade do imunógeno selecionador e do esquema
de imunização utilizado durante a seleção (BIOZZI et al., 1979; CABRERA et al., 1982;
BIOZZI et al., 1982; SANT’ANNA et al., 1982). Conseqüentemente, os fenótipos de
respostas máxima ou mínima de anticorpos resultaram de modificações em diferentes
etapas dos processos imunoreguladores, interferindo na potencialidade de diferentes
células imunocompetentes. Desta forma, as diferenças fenotípicas existentes entre os
camundongos H e L das Seleções Genéticas I, II e IV-A, obtidos segundo a resposta
primária a eritrócitos heterólogos devem-se, principalmente, à alta atividade catabólica
dos macrófagos nos camundongos L
I
, L
II
e L
IVA
(CABRERA et al., 1982; BIOZZI et al.,
1984). Entretanto, nos camundongos H e L das Seleções III e IV, obtidos segundo a
resposta secundária contra antígenos flagelares e somáticos de Salmonellae, as
diferenças nas respostas de anticorpos devem–se, essencialmente, às modificações
genéticas intrínsecas na potencialidade dos linfócitos (FERREIRA; GENNARI; REIS,
1985).
Gennari et al. (1987) demonstraram que a administração de partículas de sílica
coloidal, durante quatro dias consecutivos previamente à imunização de camundongos
L
IVA
com eritrócitos de carneiro, antígeno altamente imunogênico, modulou a resposta
humoral, promovendo aumento dos títulos de anticorpos e diminuindo
significativamente as diferenças interlinhagens H
IVA
– L
IVA
durante todo o período pós–
imunização analisado [cerca de 40 dias]; no entanto, não houve interferência nas
cinéticas de produção de anticorpos dos camundongos H e L da Seleção III, animais
que não diferem quanto às atividades macrofágicas. Estes resultados estão
correlacionados com os trabalhos citados no item 1.2 (ALLISON; HARINGTON;
BIRBECK, 1996; BECKER; RUDBACH, 1979; GERY; LEPE-ZUNIGA, 1984;
KAMPSCHMIDT; WORTHINGTON; MESECHER, 1986; LOTZOVA; CUDKOWICZ,
1974; VOGEL; ENGLISH; O’BRIEN, 1982), nos quais se verificou que a fagocitose de
partículas de sílica coloidal altera funções catabólicas dos macrófagos, permitindo que
células mais eficazes atuem na apresentação e ativação do sistema imune,
potencializando a resposta de anticorpo desenvolvida nos L
IVA.
A partir das análises de respostas desenvolvidas pelos camundongos H e L das
Seleções III e IVA evidenciou–se os efeitos da administração da sílica mesoporosa
SBA-15 como veículo de antígenos, promovendo aumento da imunogenicidade, e
desenvolvimento de respostas imunes quantitativamente eficientes e duradouras.
1.4 Desenvolvimento da Resposta Imune
Vale lembrar que a resposta imunológica encerra um processo pleiotrópico que,
para fins de entendimento, é analisada em seus segmentos. Portanto, deve–se ter em
mente os fenômenos gerais que regem as imunidades. A ativação, supressão e
regulação que se desenvolvem no decurso da resposta imune, que envolvem o
discernimento do próprio e não próprio e de memória, dependem de sinais transmitidos
por receptores presentes nas membranas das células, ou por moléculas secretadas
pelos vários tipos celulares que compõem o sistema. Os linfócitos B, precursores dos
plasmócitos secretores de anticorpos, podem reconhecer antígenos na sua
conformação nativa por ligação direta às imunoglobulinas expressas nas suas
superfícies. Porém, os receptores de antígenos dos linfócitos T [TCR] reconhecem os
antígenos processados e ligados às moléculas do Complexo Principal de
Histocompatibilidade [MHC] expressas na superfície das células apresentadoras de
antígenos (GERMAIN; MARGULIES, 1993).
Há duas classes de proteínas ligantes de peptídeos: as moléculas de MHC
classes I e II, capazes de estimular os linfócitos T citotóxicos [CTL] e os linfócitos T
auxiliares [T
H
], respectivamente. Antígenos intracelulares são degradados por
proteassomas no citosol e os peptídeos derivados ligam-se às moléculas de classe I
para serem reconhecidos pelos CTL, os quais, uma vez ativados, podem eliminar
diretamente as células–alvo. Antígenos extracelulares, por sua vez, são internalizados
pelas células apresentadoras de antígenos [APC] e transportados para compartimentos
ácidos vesiculares [endossoma / lisossoma] onde são degradados por proteinases
gerando fragmentos peptídicos que são apresentados pelas moléculas de MHC de
classe II aos linfócitos T
H
, que regulam a resposta imune (GERMAIN; MARGULIES,
1993; YORK; ROCK, 1996; WOLF; PLOEG, 1995). Entretanto, a via clássica de
apresentação antigênica restrita ao MHC não é exclusiva. Alguns antígenos endógenos
podem ser apresentados pela via endógena restrita ao MHC de classe II enquanto,
alguns antígenos exógenos, são capazes de induzir resposta citotóxica restrita aos de
classe I (MATOUSEK; NEDRUD; HARDING, 1996; JONDAL; SCHIRMBECK;
REIMANN, 1996).
As APC – macrófagos [Mφ], células dendríticas [DC] e linfócitos B – através do
complexo MHC/peptídeos, moléculas co–estimulatórias, e produção de citocinas, são
essenciais para a ativação e regulação da resposta mediada por linfócitos T. Estas
células se diferenciam, tanto pela forma de captação e natureza do antígeno por elas
apresentado, como pela expressão de moléculas co–estimulatórias e de classe II, assim
como na distribuição nos tecidos linfóides secundários. Células fagocíticas que
reconhecem os microrganismos e antígenos particulados através de receptores
específicos para padrões moleculares expressos na superfície dos patógenos [PAMP],
Mφ localizados em vários tecidos do organismo, após estímulo via receptor passam a
expressar moléculas co-estimulatórias e MHC de classe II, podendo agir como APC. As
células B, presentes nos folículos linfóides, capturam e internalizam antígenos solúveis
após sua ligação direta às imunoglobulinas de superfície, sendo induzidas a expressar
moléculas co-estimulatórias, passando a ter função de APC (JANEWAY et al., 2001).
As DC são altamente eficientes na apresentação dos antígenos aos linfócitos T e
possuem duas formas distintas de ativação: DC imaturas ou maduras. As primeiras se
localizam na maioria dos tecidos não linfóides e são altamente eficazes na captura e
processamento dos antígenos; durante a infecção e/ou inflamação, migram para os
órgãos linfóides, onde se tornam maduras aumentando a expressão de moléculas co-
estimulatórias, com potencialidade de ativar os linfócitos T antígeno – específicos.
Desta forma, as DC são consideradas sentinelas móveis do sistema imune com
capacidade de iniciar e manter a resposta imune adaptativa efetora (BANCHEREAU;
STEINMAN, 1998).
Sendo a captura do antígeno pelas APC uma etapa importante na indução da
resposta, as pesquisas e o desenvolvimento de sistemas carreadores de antígenos,
que protegem e liberam o antígeno diretamente para as APC, em especial células
dendríticas, têm recebido atenção especial (ARDAVIN, 2003; BANCHEREAU;
STEINMAN, 1998). Peptídeos sintéticos, proteínas nativas solúveis e/ou recombinantes
possuem baixa imunogenicidade, pois não são capazes de ativar as APC. Assim, para
que possam induzir a maturação das APC levando a uma estimulação efetiva do
sistema imune, estes imunógenos, precisam ser administrados em combinação com
adjuvantes, que potencializam o processamento e apresentação dos antígenos aos
linfócitos T, ativando-os eficientemente (AICHELE et al., 1995).
Após ativação, os linfócitos T
H,
podem se diferenciar em células T auxiliares do
tipo 1 [T
H
1] ou em tipo 2 [T
H
2]; no entanto, a polarização dos linfócitos T
H
é complexa e
inclui fatores genéticos e ambientais como dose do antígeno, natureza do agente
infeccioso, duração do estímulo antigênico, e das citocinas expressas no local onde as
APC acham–se expostas (MOSMANN; COFFMAN, 1989a; MOSMANN; SAD, 1996b;
O’GARRA, 1998;). As sub–populações de linfócitos T
H
podem regular uma a outra: uma
vez uma dominante, dificilmente reverte–se a resposta para a outra sub–população.
Estímulos que induzem a diferenciação dos linfócitos T
H
em T
H
1, irão gerar uma
resposta com mecanismos citotóxicos apropriados para eliminar infecções contra
patógenos intracelulares, caracterizada pela expressão de Interferon-γ [IFN-γ], Fator de
Necrose Tumoral-α [TNF-α], ativação de macrófagos, além da expressão de receptores
para a porção Fc de IgG (MOSMANN; COFFMAN, 1989a; TRINCHIERI, 1995).
Entretanto, estímulos que induzem a diferenciação dos linfócitos T
H
em T
H
2,
desenvolverão uma resposta mediada por anticorpos e pela expressão das
Interleucinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que oferece proteção contra patógenos
extracelulares, exotoxinas bacterianas e helmintos (MOSMANN; COFFMAN, 1989a;
KELLEHER; MAROOF; KNIGHT, 1999).
Muitos dos adjuvantes existentes e comumente utilizados nos protocolos de
vacinação exercem uma forte influência no tipo da resposta imune a determinado
antígeno quanto à classe de T
H
bem como na predominância de expressão de
determinado isótipo de IgG (HADJIPETRTOU-KOUROUNAKIS; MÖLLER, 1984). O
estudo de novos adjuvantes que não interfiram no direcionamento da resposta imune é
de grande valia para o desenvolvimento de vacinas contra patógenos intracelulares,
uma vez que os adjuvantes licenciados para uso em humanos são direcionadores de
resposta e efetivos apenas na proteção contra patógenos extracelulares.
1.5 Memória Imunológica
A memória imunológica pode ser constatada quando o sistema imune responde
mais rápido e efetivamente a um dado antígeno refletindo a existência de populações
de linfócitos antígeno – específicas clonalmente expandidas; esta resposta difere
quantitativa e qualitativamente de uma resposta primária e, as características como
afinidade e avidez dos anticorpos produzidos na resposta secundária, e nas
subseqüentes, diferem dos produzidos após um estímulo primário. Podem–se destacar,
ainda, diferenças na taxa de proliferação e distribuição das células efetoras, no padrão
de citocinas secretadas, na expressão de proteínas efetoras, como granzimas B,
perforinas, Fas ligante [CD95L]. No entanto, a magnitude desta resposta depende de
muitas variáveis incluindo intervalos entre as imunizações, níveis de anticorpos
circulantes durante segunda imunização, grau de imunogenicidade do antígeno, etc.
(JANEWAY et al., 2001). A resposta secundária é mediada por populações distintas de
células B e T de memória e/ou vida-longa, como também por plasmócitos. As B de
memória são células que, durante o processo de diferenciação, sofreram hipermutação
somática e alteração de isótipos de imunoglobulinas; este processo inicia-se na fase
final da resposta primária, bem antes do antígeno ser eliminado e, completa-se nos
centros germinativos. Células TCD4
+
induzem sinais essenciais e irreversíveis para a
diferenciação dos linfócitos B virgens em B de memória que, após reencontro com o
antígeno, dividem-se em alta taxa e diferenciam-se em plasmócitos produtores de
anticorpos (GRAY; SIEPMANN; WOHLLEBEN, 1994a; GRAY; DULLFORCE;
JAINANDUNSING, 1994b). Já os linfócitos T de memória são representados por
populações dinâmicas que expressam um fenótipo ativo e diferenciam-se dos T
efetores quanto à expressão de moléculas de superfície e quanto aos sinais essenciais
para sua ativação (LINTON; HARBERTSON; BRADLEY, 2000). Após imunização, as
células T reativas diferenciam-se em efetoras, sendo que uma pequena fração persiste
com o fenótipo de T de memória (SALLUSTO et al., 1999). Ainda é muito discutido se a
sobrevivência e função destas células de memória são independentes da presença do
antígeno ou dependentes de estímulos persistentes que podem ser provenientes de
antígenos residuais ou da exposição subseqüente ao mesmo (AHMED; GRAY, 1996;
ZINKERNAGEL, 2002). De acordo com Goldsby, Kindt e Osborne (2000), uma vez que
o sistema imune tenha reconhecido e respondido efetivamente a um antígeno há
memória imunológica, o que faz da apresentação antigênica um passo essencial para a
indução de imunidade duradoura. Assim, a resposta imune efetiva e duradoura às
vacinas, a partir de proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos, por exemplo, pode
depender diretamente da adição de adjuvantes, que induzam a maturação das APC,
levando à estimulação efetiva do sistema imune.
2 OBJETIVO
► O objetivo desse estudo foi o de avaliar a ação adjuvante e a possível modulação da
resposta imune da sílica nanoestruturada SBA−15.
Esse estudo experimental abordou as relações [sílica] – [antígeno], vias distintas de
administração, analisando-se as cinéticas de produção de isótipos de IgG de
camundongos geneticamente selecionados segundo a resposta máxima e mínima de
anticorpos da Seleção Genética IVA, Linhagens H
IVA
e L
IVA
respectivamente, e de
camundongos isogênicos BALB/c; comparando-as às respostas dos indivíduos
imunizados com antígeno em Adjuvante Incompleto de Freund ou em Al(OH)
3
.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Sílicas Mesoporosas Altamente Ordenadas
A sílica SBA–15 foi sintetizada pelos Drs. Lucildes P. Mercuri e Jivaldo R. Matos
do Instituto de Química da Universidade de São Paulo – USP e as análises físico–
químicas vêm sendo realizadas pela Dra. Márcia C. A. Fantini do Instituto de Física –
USP. As amostras de SBA–15 foram sintetizadas utilizando um copolímero tribloco, o
poli-(óxido de etileno) – poli-(óxido de propileno)-poli-(óxido de etileno) [Pluronic P123,
EO
20
PO
70
EO
20,
PM= 5800 – BASF], o tetraetil-ortosilicato [TEOS] foi adquirido da Fluka;
o ácido hidroclorídrico, foi adquirido da Fisher Scientific Co. Todos os reagentes foram
utilizados segundo protocolo de instrução. A caracterização da síntese e a adsorção
das amostras foram seguidas conforme descrito por Matos et al. (2001).
3.2 Antígenos
Para a realização dos experimentos utilizou–se antígenos de natureza e
estruturas diversas como a proteína recombinante intimina 1β [Int1βr] de 16,5kDa, que
é expressa na superfície externa da Escherichia coli [item 3.2.1], e a Soro Albumina
Bovina [BSA] de ~ 66kDa obtida da Fisher Scientific Co.
3.2.1 Obtenção e Purificação da Proteína Recombinante Int1
β
Os clones possuindo os genes eae que codificam o subtipo de intimina
recombinante 1β − pertencem ao Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan. A
proteína Int1
β
r [16,5kDa] foi expressa segundo o protocolo recomendado pelo
fabricante do kit “QIAexpress Kit Type IV” Qiagen, EUA utilizado para a clonagem. A
partir de 2-3µL de uma colônia isolada de E. coli [M15] que contém o gene repressor
lacI, inserido no plasmídio pREP4 que promove o bloqueio do promotor T5 reprimindo a
transcrição da proteína recombinante no vetor pQE30, foi preparado pré–inóculo
utilizando 10mL de meio Luria-Bertani [LB] contendo os antibióticos de seleção
Canamicina [25µg/mL] e Ampicilina [100µg/mL] e incubando a 37ºC, por 16 horas, sob
agitação de 300rpm em shaker Innova 4300 [New Brunswick Scientific]. Após este
período, 5mL do pré-inóculo foi adicionado a 100mL de meio LB contendo os
antibióticos Canamicina [25µg/mL] e Ampicilina [100µg/mL] e o crescimento [fase
logarítmica de crescimento] foi monitorado através da leitura de absorbância em
espectrofotômetro a λ 600nm até D.O. de 0,6 a 0,8.
A expressão da proteína recombinante foi induzida mediante a adição de IPTG
[isopropil-tio-β-D-galactosídeo] [Gibco, BRL] em concentração final de 1mM, seguido de
incubação a 30°C por 4 horas, sob agitação a 220rpm. As bactérias foram coletadas
após centrifugação 5000 x g por 5 minutos a 4°C, e mantidas congeladas até a etapa
da purificação, descrita a seguir.
Após a confirmação da expressão por eletroforese em gel de SDS-PAGE
[item 3.3], o precipitado foi ressuspendido em tampão de lise [NaH
2
PO
4
50mM; NaCl
300mM; imidazol 10mM; pH8,0] e as células em suspensão foram rompidas utilizando-
se o sonicador [60Hz, 2 ciclos de 60 segundos] [Tomy-Seiko, Japan]. Durante todo o
processo as células foram mantidas em banho de gelo. O lisado obtido foi centrifugado
a 10.000 x g por 30 minutos e o sobrenadante, recuperado.
A proteína recombinante, solúvel na forma nativa, foi submetida à purificação
através de cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Após aplicação do extrato
celular, a coluna foi lavada em tampão NaH
2
PO
4
50mM; NaCl 300mM; imidazol 20mM;
pH8,0 para remoção das proteínas contaminantes. A proteína Int1
β
r, ligada à matriz
[Ni-6xHis-proteína], foi eluída em tampão NaH
2
PO
4
50mM; NaCl 300mM; imidazol
250mM; pH8,0 e dosada em mg/mL pelo método de Bradford, acrescida de 0,5mM do
inibidor de protease PMSF [fluoreto de fenilmetilsulfonil] [Sigma] e armazenada a –
20ºC. Alíquotas foram coletadas durante todo processo de purificação para posterior
análise por SDS-PAGE [item 3.3].
Figura 2 - Esquema utilizado para purificação da proteína recombinante Int1
β
- cromatografia
de afinidade em coluna de níquel.
3.3 Eletroforese em Gel de SDS−Poliacrilamida
As eletroforeses em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio [SDS-
PAGE] foram realizadas em condições de desnaturação, conforme descrito por Laemmli
(1970), utilizando–se placas de vidro de 8 x 10cm. Os géis de separações de 15%
foram preparados na proporção acrilamida/bisacrilamida de 36:0,96 em tampão Tris−
HCl 0,4M, pH8,8 contendo SDS 0,1%, TEMED 0,15% e persulfato de amônio 0,05%. O
gel superior para concentração das amostras foi preparado com
acrilamida/bisacrilamida 45:1,2 na concentração final de 3% em tampão Tris−HCl 0,1M,
pH6,8 contendo SDS 0,1%, TEMED 0,05%, e persulfato de amônio 0,05%. As amostras
foram eluídas na proporção 1:2 em tampão Tris−HCl 0,125M, pH6,8 contendo SDS 4%,
sacarose 8%, β−mercaptoetanol a 2% e azul de bromofenol a 0,02%. As amostras
foram aquecidas a 95°C durante 5 minutos e aplicadas em volume máximo de 15µL. O
tampão de corrida foi Tris-Glicina [Tris base 3%; glicina 14%; SDS 1%].
As corridas foram desenvolvidas a temperatura [θ] ambiente e a duração foi de
aproximadamente 2 horas, sob corrente de 100V. A seguir, o gel foi retirado do suporte
e submetido à coloração com azul de Coomassie R-250 0,25%.
Utilizaram-se como padrões de massas moleculares: BSA [66kDa], gama-
globulina humana [cadeia pesada 50kDa e cadeia leve 23,5kDa], ovalbumina [43kDa] e
ribonuclease [13,7kDa].
3.4 Dosagem de Proteínas
A dosagem de proteínas foi feita pelo método de Bradford (1976), utilizando o
reagente de ensaio protéico [Bio Rad Laboratories], que contém o corante azul
Coomassie, diluído 1:4 em água Milli-Q. A BSA foi utilizada como proteína padrão de
referência. A concentração protéica foi estimada a λ 595nm em espectofotômetro.
3.5 Animais
Realizaram-se experimentos com camundongos isogênicos BALB/c, fêmeas com
2 – 3 meses de idade, provenientes do Biotério Central do Instituto Butantan. Estes
camundongos, obtidos por cruzamentos consangüíneos e de perfil genético conhecido,
representam um único indivíduo, portanto a variabilidade encontrada deve–se
exclusivamente a fatores ambientais. Utilizaram-se ainda camundongos H
IVA
e L
IVA
(CABRERA et al., 1982), machos e/ou fêmeas de 2 a 3 meses de idade, provenientes
do Laboratório de Imunogenética do Instituto Butantan, gentilmente fornecidos pela Dra.
Wafa H. K. Cabrera. Os animais H
IVA
e L
IVA
diferem fenotipicamente quanto à resposta
de anticorpos devido à atividade catabólica de seus macrófagos.
No decurso das imunizações, os animais foram sangrados através do plexo
venoso retro–orbital e os anti–soros foram estocados a –20°C para posterior avaliação
da cinética de produção de anticorpos IgG total e seus isótipos IgG
1
e IgG
2a
anti- Int1
β
r
ou anti-BSA, pela técnica de ELISA descrita no item 3.8. Todos os procedimentos
realizados estão de acordo com os critérios das Comissões de Ética em
Experimentação Animal do Instituto Butantan e do Instituto de Ciências Biomédicas da
USP.
3.6 Preparo do Complexo Imunogênico
Os antígenos Int1
β
r ou BSA foram diluídos em solução salina-fosfato [PBS]
pH7,4 adicionando–se lentamente v/v aos adjuvantes SBA-15; hidróxido de alumínio
[Al(OH)
3
]; ou emulsificada em Adjuvante Incompleto de Freund [AIF] [Sigma Chemical
Co.] até completa homogeneização. A sílica SBA-15 em pó foi misturada a PBS com 24
horas de antecedência e, devido à baixa solubilidade, procederam–se agitações
eventuais. O Al(OH)
3
[30g de AlNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O / 360mL H
2
Od / 150mL de NaOH 1N]
também foi diluído em PBS para atingir a concentração final desejada.
3.7 Esquemas de Imunização
Para avaliação da ação adjuvante e da possível modulação da resposta imune
induzida pela SBA-15, imunizaram-se com Int1
β
r ou BSA camundongos BALB/c, H
IVA
e
L
IVA
por diferentes vias, conforme descrito nos itens a seguir.
3.7.1 Imunizações pela Via Oral (VO)
CAMUNDONGOS BALB/c [3 animais/grupo] – administrou-se Int1
β
r [5µg/animal]
encapsulada/adsorvida em 50µg de SBA-15 (v/v), ou adsorvida em 50µg Al(OH)
3
(v/v),
em volume final de 200µL. A proporção Int1
β
r:SBA-15 ou Al(OH)
3
utilizada foi de 1:10.
Vale ressaltar que a concentração mínima imunogênica de Int1
β
r é de 5µg/animal
(JUNTA, 2005).
Para analisar a resposta secundária, realizou-se imunização no 200° dia com
5µg Int1
β
r:50µg Al(OH)
3
.
CAMUNDONGOS H
IVA
– 3 animais/grupo foram imunizados com 10µg de BSA diluída
em PBS em volume final de 200µL [grupo controle]. Outros grupos de animais
[n=3/grupo] receberam BSA [10µg/animal] encapsulada/adsorvida em 250µg de SBA-15
(v/v), ou adsorvida em 250µg Al(OH)
3
(v/v), em volume final de 200µL. Neste
experimento, a proporção utilizada de BSA:SBA-15 ou Al(OH)
3
foi de 1:25, seguindo–se
as avaliações sobre a melhor relação de encapsulação e/ou adsorção de SBA–15 e
BSA.
CAMUNDONGOS L
IVA
– 4 animais/grupo foram imunizados com 100µg/animal de BSA
diluída em PBS em volume final de 200µL [grupo controle]. Outros grupos de animais
[n=4/grupo] receberam diferentes concentrações de BSA [10µg ou 100µg/animal] numa
proporção BSA:SBA–15 ou Al(OH)
3
de 1:25 (v/v), em volume final de 200µL.
Para analisar a resposta secundária, no 110° dia, administrou-se pela via
subcutânea 10µg BSA:250µg SBA–15.
3.7.2 Imunizações pela Via Intramuscular (IM)
CAMUNDONGOS H
IVA
- [n=3/grupo] foram imunizados com 10µg/animal de BSA
diluída em PBS em volume final de 200µL [grupo controle]. Outros grupos de 3 animais
cada receberam BSA [10µg/animal] encapsulada/adsorvida em 250µg de SBA-15 (v/v),
ou emulsificada em Adjuvante Incompleto de Freund [AIF] (v/v), em volume final de
200µL. Neste experimento, a proporção BSA:SBA–15 foi de 1:25.
CAMUNDONGOS L
IVA
–
[n=5/grupo] foram imunizados com 10µg/animal de BSA
diluída em PBS em volume final de 200µL [grupo controle]. Outros grupos de animais
[n=4-5/grupo] receberam diferentes concentrações de BSA [0,1, 1 ou 10µg/animal]
encapsulada/adsorvida numa proporção BSA:SBA–15 de 1:25 (v/v) ou emulsificada em
AIF (v/v), em volume final de 200µL.
Para analisar a resposta secundária, no 110° dia, administrou-se pela via
subcutânea 10µg BSA:250µg SBA–15.
3.7.3 Imunizações pela Via Intraperitoneal (IP)
CAMUNDONGOS BALB/c – 3 animais/grupo foram imunizados com 5µg/animal de
Int1
β
r encapsulada/adsorvida em 50µg de SBA-15 (v/v), ou adsorvida em 50µg Al(OH)
3
(v/v), ou emulsificada em AIF (v/v), em volume final de 200µL. A proporção Int1
β
r:SBA-
15 ou Al(OH)
3
foi de 1:10.
Para analisar a resposta secundária, administrou-se no 200° dia 5µg Int1
β
r:50µg
Al(OH)
3
pela via subcutânea.
3.7.4 Imunizações pela Via Subcutânea (SC)
CAMUNDONGOS BALB/c [n=3/grupo] - administrou-se Int1
β
r [5µg/animal] numa
proporção Int1
β
r:SBA–15 ou Al(OH)
3
de 1:10 (v/v), ou emulsificada em AIF (v/v), em
volume final de 200µL.
Para analisar a resposta secundária, realizou-se imunização no 200° dia com
5µg Int1
β
r:50µg Al(OH)
3
.
Os esquemas de imunização descritos nos itens acima estão representados na
tabela abaixo (Tabela1).
Tabela 1 – Representação do esquema de imunização utilizado neste estudo.
Grupos de Animais
(n/grupo)
Antígeno Adjuvante
SBA-15
BALB/c (n=3)
Int1
β
r
Al(OH)
3
PBS
SBA-15
H
IVA
(n=3) BSA
Al(OH)
3
PBS
SBA-15
VO
L
IVA
(n=4) BSA
Al(OH)
3
PBS
SBA-15
H
IVA
(n=3)
BSA
AIF
PBS
SBA-15
IM
L
IVA
(n=4/5)
BSA
AIF
SBA-15
Al(OH)
3
IP
BALB/c (n=3)
Int1
β
r
AIF
SBA-15
Al(OH)
3
SC
BALB/c (n=3)
Int1
β
r
AIF
3.8 Determinações dos Títulos de Anticorpos IgG e seus Isótipos IgG
1
e IgG
2a
Anti–Int1
β
r ou Anti-BSA por ELISA
Os títulos de anticorpos IgG e isótipos IgG
1
e IgG
2a
anti–Int1
β
r ou anti–BSA
foram determinados pelo teste de ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay]
(ENGVALL; PERLMAN, 1971). Realizaram-se dosagens em microplacas com
propriedade de alta ligação com 96 poços [COSTAR], sensibilizadas com 10µg/mL
Int1
β
r ou com 10µg/mL de BSA diluídas em tampão Carbonato-Bicarbonato por 18
horas a 4ºC. Após este período inicial de incubação, as placas foram lavadas 3 vezes
com tampão PBS contendo Tween [PBS-T] a 0,05%. As placas foram bloqueadas com
0,01% de gelatina–PBS–T por 1 hora a θ ambiente. A seguir, as amostras foram
distribuídas e diluídas em série em PBS-T, e incubadas durante 1 hora a θ ambiente; as
placas foram lavadas 3 vezes em PBS-T e 50µL do anticorpo anti-IgG marcado com
peroxidase [Promega] diluído 1:2500 em PBS-T; 50µL do anticorpo anti–IgG
1
marcado
com peroxidase [Promega] diluído 1:1000 em PBS-T ou anti–IgG
2a
diluído 1:1000 em
PBS-T foram adicionados e as placas incubadas durante 1 hora a θ ambiente. Seguiu-
se lavagem 3 vezes em PBS-T, e 100µL do tampão substrato [20mg OPD diluído em
40mL de tampão citrato/ fosfato/ H
2
O
2
0,3%] foi adicionado; as placas foram mantidas
no escuro até a reação ser revelada. A reação foi interrompida com 50µL/poço de ácido
cítrico a 0,2M. A leitura foi feita em λ 450nm utilizando-se um leitor de ELISA [Multiskan
– Labsystems]. Os títulos foram calculados desprezando–se 20% do valor da
absorbância da diluição de saturação e expressos em log
2
.
3.9 Análise do Potencial de Encapsulação/Adsorção do Antígeno pela SBA–15
O potencial de encapsulação da sílica SBA-15 foi determinado in vitro utilizando-
se diferentes proporções [1:5; 1:10; 1:25; 1:30] de Int1
β
r:SBA-15 ou BSA:SBA–15 (v/v)
diluída em PBS em volume final de 1mL. As proteínas não encapsuladas foram
removidas por centrifugação a 400 x g por 3 minutos a 25°C e determinou-se a
concentração em mg/mL de Int1
β
r ou BSA presente no sobrenadante pelo método de
Warburg−Christian através da leitura em λ 260nm e 280nm em espectrofotômetro.
Como controle, utilizou-se solução de SBA–15; Int1
β
r ou BSA em PBS nas mesmas
concentrações citadas acima, em volume final de 1mL.
3.10 Análise da Toxicidade da Sílica SBA-15
Para analisar o possível efeito tóxico da sílica SBA-15 comparou-se,
mensalmente, o peso de camundongos geneticamente heterogêneos Swiss, machos
com 2 a 3 meses de idade, inoculados pela via intramuscular com 250µg de SBA-15 em
volume final de 100µL - grupo tratado (n=15) - com o de camundongos Swiss não
tratados - grupo controle (n=5). Durante o período de análise, verificaram-se sinais
clínicos, dentre estes o desenvolvimento de nódulos além da análise macroscópica dos
órgãos dos camundongos quando do sacrifício. Ao final do experimento analisou-se o
peso do baço e estabeleceram-se a relação peso corporal/peso do baço de alguns
camundongos de ambos os grupos experimentais.
3.11 Análise Estatística
Em cada experimento calculou–se a média [x] e o desvio padrão [SD] e, a
significância das diferenças entre as médias foi estabelecida através do teste t de
Student considerando─se a probabilidade mínima de p ≤ 0,05.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Expressão e Purificação da Proteína Recombinante Int1β
A proteína recombinante His−intimina 1β foi expressa após indução do promotor
T5 do pQE30 pela adição de IPTG ao meio de cultura contendo as amostras
bacterianas recombinantes em fase log de crescimento. Antes da adição de IPTG, e ao
final do período de indução, retiraram-se alíquotas da cultura para controle negativo e
confirmação da expressão da proteína por SDS−PAGE. Pela Figura 3, vê-se que, antes
da adição do IPTG não houve expressão da proteína [canaleta 2], porém, após 5 horas
de indução, observou−se banda de massa molecular estimada em 16,5kDa referente à
proteína Int1βr [canaleta 3].
kDa
1 2
3
13,7
23,5
66
50
43
16,5kDa
Figura 3 - SDS–PAGE 15% - Perfil eletroforético dos extratos totais evidenciando a expressão
da proteína Int1βr de 16,5kDa antes [canaleta 2] e após a adição de IPTG
[canaleta 3]. Padrão de massa molecular [canaleta 1].
A proteína recombinante Int1β foi purificada na forma nativa por cromatografia de
afinidade através da interação dos resíduos de 6xHis, presentes na região N−Terminal
desta proteína, com o níquel [Ni−NTA] ligado à matriz de Sepharose CL−6B [Amersham
Biosciences]. Todas as amostras apresentaram excelente padrão de purificação e,
conforme Figura 4, após purificação houve apenas a presença da banda que se refere
à proteína Int1βr com tamanho estimado em 16,5kDa.
kDa
2
Int1
β
r 16,5kDa
13,7
1
23,5
66
50
43
Figura 4 - Eletroforese em gel de SDS-PAGE 15% da proteína solúvel Int1βr após purificação
utilizando cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Canaleta 1 - PM: Padrão
de massa molecular; Canaleta 2 - Int1βr
A Int1β é um dos subtipos de proteínas expressas na membrana externa das E.
coli enteropatogênicas [EPEC] e E. coli enterohemorrágicas [EHEC], sendo responsável
pela adesão íntima dessas bactérias às células epiteliais do intestino (FRANKEL et al.,
1998). Conforme descrito por Donnenberg, Kaper e Finlay (1993), a principal região
imunogênica da intimina compreende a porção variável da região carboxi – terminal que
é denominada Int280; a proteína Int1βr de 16,5kDa expressa, purificada e utilizada
neste estudo compreende a porção variável da Int280. Além da sua alta
imunogenicidade, vários estudos vêm sendo realizados testando a possibilidade de
utilizar este subtipo de intimina como eventual antígeno na formulação de vacinas para
espécies enteropatogênica e enterohemorrágica, que estão entre os mais importantes
patógenos causadores de diarréia na infância.
Em estudos anteriores realizados no Laboratório de Bacteriologia do Instituto
Butantan, determinou-se a dose imunogênica da Int1βr de 5µg/animal, que foi mantida
nos protocolos de imunizações deste trabalho (JUNTA, 2005).
4.2 Verificação do Possível Efeito Adjuvante da Sílica SBA–15
Com a finalidade de determinar o possível efeito adjuvante da sílica SBA-15
realizaram-se experimentos utilizando-se a proteína Int1βr, encapsulada ou não à SBA-
15. Grupos de camundongos BALB/c [n=3] foram inoculados com 5µg de Int1βr em
PBS (ж); 5µg de Int1βr e 50µg de SBA-15 em PBS [antígeno não
encapsulado/adsorvido à sílica] (Ο); ou 5µg de Int1βr encapsulada/adsorvida em 50µg
de SBA-15 em PBS (
■
) (v/v). Todos os animais receberam 200µL das soluções acima.
Após 30 dias da primeira inoculação, administrou-se pela via subcutânea 5µg de Int1βr
em Al(OH)
3
em volume final de 200µL (Figura 5).
Por meio da Figura 5 pode-se observar que, a Int1βr, assim como a maioria dos
antígenos protéicos recombinantes, é pouco imunogênica quando administrada na
forma solúvel sendo, muitas vezes, incapaz de ativar as APC e os linfócitos T, além de
possuir meia-vida curta in vivo. Verificou-se ainda que, a administração da Int1βr não
encapsulada/adsorvida à SBA-15 [administrada separadamente], não ativou
efetivamente o sistema imune. Entretanto, quando a Int1βr está encapsulada/adsorvida
à SBA-15 houve uma modulação positiva na resposta imune desenvolvida contra Int1βr;
com uma diferença entre os níveis de IgG de ~ 7 log
2
comparativamente à Int1βr solúvel
e, quando comparada com a Int1βr + SBA-15 esta diferença é ~ 5 log
2
. A indução da
memória, visualizada através do aumento dos títulos após segunda imunização, só
ocorreu no grupo imunizado com Int1βr encapsulada em SBA-15 (Figura 5).
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias de Sangria
IgG anti-Int 1
β
r (título-log
2
)
p < 0,05
p < 0,05
Figura 5 - Média
±
SD dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos BALB/c
[n=3/grupo] imunizados pela via subcutânea com Int1βr solúvel (ж); SBA-15 + Int1βr
[antígeno administrado independentemente da SBA-15] (Ο); Int1βr em SBA-15 (■).
Anticorpos foram dosados pelo método de ELISA nos 14º, 25º e 60º dias da resposta
imune. SD – desvio padrão
Esses resultados indicam o possível efeito adjuvante da sílica SBA-15,
diretamente relacionado à sua estrutura de poros e às suas propriedades intrínsecas
que permitem a encapsulação e/ou adsorção do antígeno. Na superfície externa e
interna da SBA-15 há grupamentos hidroxilanos [SiOH] e siloxanos [SiO] que
possibilitam a interação SBA-15:antígeno e/ou a encapsulação do antígeno. Mais ainda,
esses dados evidenciam que a encapsulação do antígeno preserva a conformação dos
seus epítopos, provavelmente não sofrendo ação de enzimas proteolíticas; há a
possibilidade de que haja liberação lenta e diretamente para as células
imunocompetentes.
4.3 Estudo do Efeito Adjuvante da Sílica SBA-15 em Imunizações com Int1βr por
diferentes vias: VO, IP e SC
Para verificar a ação adjuvante da sílica SBA-15, realizaram-se experimentos
envolvendo diferentes vias de imunização.
Camundongos isogênicos BALB/c [n=3/grupo] receberam pela via oral 5µg de
Int1βr encapsulada/adsorvida em SBA-15 (■) ou adsorvida em Al(OH)3 (▲). Realizou-
se sangria pelo plexo retro-orbital nos 25º, 80º, 150º, 190º dias da resposta primária e,
conforme Figura 6, não houve diferença significativa nos títulos induzidos pela SBA-15
ou Al(OH)3 neste período.
Para análise da resposta secundária, no 200º dia administrou-se, nos dois
grupos 5µg de Int1βr em Al(OH)
3
pela via subcutânea. Pela Figura 6 pode-se verificar
que no 210° dia houve, nos dois grupos, aumento nos títulos de IgG anti-Int1βr
comparativamente aos níveis pré-existentes no 190º dia da resposta primária. Porém, a
SBA-15 demonstrou-se mais eficiente que o Al(OH)
3
nesta sensibilização secundária,
pois houve um aumento de cerca de 8 vezes nos títulos deste grupo que mantiveram-se
elevados por mais de 20 dias. Já, os níveis de IgG dos camundongos que receberam
Int1βr em Al(OH)
3
começaram a decair após o 10° dia desta segunda imunização e, no
20º dia da resposta secundária há uma diferença de ~ 3 log
2
entre o grupo com SBA-15
e o com Al(OH)
3.
In t1
β
r- VO
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias de Sangria
anti-Int1
β
IgG (título-log
2
)
n.s.
p < 0,05
Figura 6 - Média
±
SD dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos BALB/c
[n=3/grupo] imunizados pela via oral com 5µg de Int1βr em SBA-15 (■); ou em
Al(OH)
3
(▲). Anticorpos foram detectados pelo método de ELISA nos 25º, 80º, 150º
e 190º dias da primeira imunização. No 200º dia realizou-se segunda imunização e
nos 210º e 220º dias os anti-soros foram analisados [n.s. – não significante;
* p < 0,05; SD – desvio padrão].
Avaliando-se a cinética de anticorpo anti-Int1βr produzidos por camundongos
isogênicos BALB/c [n=3/grupo] imunizados pela via intraperitoneal com 5µg de Int1βr
em SBA-15 (
■
); ou em Al(OH)
3
(
▲
); ou em AIF ( ); no período de 25 a 190 dias, a
SBA-15 foi tão eficiente quanto o Al(OH)
3
ou AIF na indução da resposta imune não
havendo diferença estatisticamente significativa entre estes grupos (Figura 7).
Com a finalidade de analisar a resposta secundária, no 200º dia, todos os
grupos, receberam 5µg de Int1βr em Al(OH)
3
pela via subcutânea. Como mostra a
Figura 7, no 210° houve aumento nos títulos comparativamente aos obtidos no 190º dia
da resposta primária, no entanto, apenas para o grupo com AIF este aumento foi
estatisticamente significativo com uma diferença de ~ 4 log
2
.
Int1
β
r
−
IP
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias de Sangria
anti- Int1
β
IgG (título-log
2
)
n.s.
p < 0,05
Figura 7 - Média
±
SD dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos BALB/c
[n=3/grupo] imunizados pela via intraperitoneal com 5µg de Int1βr em SBA -15 (■);
ou em Al(OH)
3
(▲); ou em AIF ( ). Anticorpos foram detectados pelo método de
ELISA nos 25º, 80º, 150º e 190º dias da primeira imunização. No 200º dia realizou-
se segunda imunização nos 210º e 220º dias os anti-soros foram analisados [n.s. –
não significante; * p < 0,05; SD – desvio padrão].
Para verificar a produção de anticorpos anti-Int1βr induzidos pela via subcutânea,
administrou-se em camundongos isogênicos BALB/c [n=3/grupo] 5µg de Int1βr em
SBA-15 (
■
); ou em Al(OH)
3
(
▲
); ou em AIF ( ). Do 25° ao 190° dias não houve
diferença estatisticamente significativa entre os títulos induzidos pela SBA-15 quando
comparados com o Al(OH)
3
ou com o AIF (Figura 8).
No 200º dia realizou-se uma segunda imunização pela via subcutânea com 5µg
de Int1βr em Al(OH)
3
. Observou-se no 210° dia, um aumento de 2 vezes nos níveis de
anticorpos dos animais que receberam antígeno em SBA-15 ou em Al(OH)
3
(Figura 8).
No entanto, não foi possível realizar análise estatística do grupo com AIF, pois neste
período, ao final do experimento, restou apenas um camundongo.
Int1
β
r- SC
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias de Sangria
anti-Int1
β
IgG (título-log
2
)
n.s.
p < 0,05
Figura 8 - Média
±
SD dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por camundongos BALB/c
[n=3/grupo] imunizados pela via subcutânea com 5µg de Int1βr em SBA -15 (■); ou
em Al(OH)
3
(▲); ou em AIF ( ). Anticorpos foram detectados pelo método de ELISA
nos 25º, 80º, 150º e 190º dias da primeira imunização. No 200º dia realizou-se
segunda imunização e nos 210º e 220º dias os anti-soros foram analisados
[n.s. –
não significante; * p < 0,05; SD – desvio padrão].
Fica evidente por meio das Figuras 6, 7 e 8, que a sílica mesoporosa SBA-15 foi
tão eficiente quanto o AIF e o Al(OH)
3
no desenvolvimento da resposta imune contra
Int1βr, quando administrada pelas vias oral, intraperitoneal e subcutânea. A SBA-15
induziu níveis de anticorpos elevados e duradouros; foi eficaz na instalação da memória
imunológica, aumentando cerca de 4 a 8 vezes os níveis de anticorpos após segunda
imunização.
Voltando à Figura 6, fica claro que SBA-15 foi mais eficiente que o Al(OH)
3
na
sensibilização secundária da resposta imune; os títulos de IgG anti-Int1βr induzidos
pela SBA-15 mantiveram-se elevados por mais de 20 dias após segunda imunização,
enquanto os induzidos pelo Al(OH)
3
diminuíram drasticamente após 10 dias. Os altos
níveis de anticorpos obtidos durante a resposta secundária pelo grupo que recebeu o
antígeno em SBA-15 pela via oral podem estar relacionados ao processo de síntese da
SBA-15, que ocorre em pH ácido. Assim, quando a SBA-15 é administrada pela via oral
e percorre o trato gastrointestinal, passando pelo suco gástrico que apresenta pH
extremamente ácido [pH ~ 2], provavelmente mantém-se estável e protege o antígeno
encapsulado da ação de proteases e de outras condições adversas características do
trato gastrointestinal. Devido a esta possível estabilidade, o imunógeno mantém sua
imunogenicidade, ativando efetivamente o sistema imune. Antígenos peptídicos
administrados livremente nos tecidos mucosos freqüentemente sofrem degradação por
enzimas presentes no lúmen, reduzindo a imunogenicidade e prejudicando a absorção,
tornando-se incapazes de induzir resposta imune protetora (FLORENCE, 1997).
A administração da sílica SBA-15 por diferentes vias [VO, IP e SC] não interferiu
na sua capacidade de carrear, proteger e liberar o imunógeno para o sistema
imunológico. Não há diferença significativa na resposta de anticorpos induzida quando
da adição da SBA-15 pelas diferentes vias (Figura 9).
Int1
β
r
VO, IP, SC
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias de Sangria
IgG anti-
Int1
β
r(título-log
2
)
Figura 9 - Comparação da média
±
SD dos títulos de IgG anti-Int1βr produzidos por
camundongos BALB/c [n=3/grupo] imunizados com 5µg de Int1βr em SBA –15
pela VO (
∇
); IP (
); SC (ж). Anticorpos dosados nos 25º, 80º, 150º e 190º dias da
resposta primária e nos 10º e 21º dias da resposta secundária pelo método de
ELISA. SD – desvio padrão
Um fator favorável à utilização da SBA-15 é a não indução de efeitos colaterais
e, estudos em andamento com cultura de macrófagos, demonstram que a sílica SBA-15
é atóxica e ainda aumenta em cerca de 20% a atividade fagocítica destas células.
Nas vias de imunizações estudadas, observa-se grande desvio-padrão entre os
grupos de animais imunizados com SBA-15, o que provavelmente pode estar
relacionado com a não uniformidade do tamanho das partículas utilizadas nestes
experimentos. Estudos em andamento no Departamento de Cristalografia do Instituto
de Física da USP têm o objetivo de obterem–se suspensões de partículas de tamanho
uniforme. Assim, poder–se–á minimizar as variações e evitar a não reprodutibilidade
derivada do uso de diferentes preparações de SBA–15:imunógeno em diferentes
imunizações.
É válido ressaltar que, em todos os protocolos descritos nas Figuras 5, 6, 7 e 8,
observou–se a indução da resposta secundária nos diferentes grupos experimentais,
após segunda imunização do antígeno em Al(OH)
3
pela via subcutânea. Optou-se pelo
esquema descrito acima devido à necessidade de verificar a biodistribuição da SBA-15;
no entanto, na seqüência dos estudos vários esquemas de imunização serão
analisados.
4.4 Verificação do Potencial de Encapsulação/Adsorção da Sílica SBA–15
Para verificar o potencial de encapsulação/adsorção da sílica SBA–15
realizaram-se experimento in vitro utilizando diferentes proporções [1:5; 1:10; 1:25]
BSA:SBA-15 diluídos em PBS conforme descrito no item 3.9 de MATERIAL E
MÉTODOS.
Como pode ser observado na Figura 10 A, quanto maior a proporção de SBA–
15, maior a porcentagem de antígeno encapsulado/adsorvido. No ensaio realizado com
Soro Albumina Bovina, uma proteína de cerca de 66kDa, na proporção BSA:SBA-15 de
1:5, 27,5% do antígeno foi encapsulado e/ou adsorvido pela sílica, na proporção 1:10,
65,5%, e na proporção 1:25, cerca de 91% do antígeno estava encapsulado/adsorvido.
Neste estudo não se testou maiores concentrações de sílica.
0 10 20 30
0
25
50
75
100
Proporção SBA-15
%
encapsulação/adsorção
de BSA
Figura 10A - Porcentagem de BSA encapsulada e/ou adsorvida em diferentes proporções de
SBA-15. Proporção BSA:SBA-15: 1:5; 1:10; 1:25.
Logo após a imunização, o grau de encapsulação/adsorção do antígeno
modifica-se devido à interação com os componentes dos fluídos intersticiais. Sugere-se,
que o antígeno encapsulado pela SBA-15 fique protegido por um período de tempo, que
é suficiente para o seu reconhecimento pelas APC e ativação efetiva do sistema imune.
Devido a existência de estudos relatando a direta relação entre a porcentagem
de antígeno encapsulado e sua liberação contínua e direcionada com o
desenvolvimento da imunidade específica efetora, nos experimentos que visaram
analisar a capacidade da sílica SBA-15 em modular positivamente a resposta imune de
camundongos geneticamente modificados para a máxima e mínima resposta de
anticorpos, H
IVA
e L
IVA
respectivamente, a proporção BSA:SBA-15 utilizada foi de 1:25.
Nos experimentos ilustrados anteriormente nas Figuras 5, 6, 7 e 8 a proporção
Int1βr:SBA-15 utilizada foi de 1:10. Porém, após verificar a correlação entre proporção
de SBA-15 com potencial de encapsulação/adsorção do antígeno, realizou-se ensaio in
vitro com diferentes proporções [1:10; 1:25; 1:30] de Int1
β
r:SBA-15 diluída em PBS
conforme descrito no item 3.9 de MATERIAL E MÉTODOS. Por meio da Figura 10 B
observou-se que para a Int1
β
r, uma proteína de massa molecular de 16,5kDa, cerca de
100% do antígeno foi encapsulado/adsorvido nas proporções 1:25 e 1:30 de
Int1
β
r:SBA-15; já para a proporção 1:10, a porcentagem foi cerca de 82%. A partir dos
resultados obtidos neste ensaio pode-se concluir que a melhor proporção Int1
β
r:SBA-15
a ser utilizada nas futuras imunizações será de 1:25.
0 10 20 30 40
0
25
50
75
100
Proporção de SBA-15
%
encapsulação/adsorção
de Int1
β
r
Figura 10B - Porcentagem de Int1
β
r encapsulada e/ou adsorvida em diferentes proporções de
SBA-15. Proporção Int1
β
r:SBA-15: 1:10; 1:25; 1:30.
Estes resultados demonstraram que, o potencial de encapsulação/adsorção da
SBA-15 pode variar de acordo com as características físico-químicas e massa
molecular do imunógeno a ela encapsulado. Assim é necessário verificar o potencial de
encapsulação/adsorção, [SBA-15]:[antígeno], para cada antígeno a ser testado.
4.5 Efeito Dose-Resposta
No item 4.4 determinou-se que na proporção 1:25 de [BSA]:[SBA-15] cerca de
91% do antígeno encontrou-se encapsulado e/ou adsorvido à SBA-15. Sabendo-se da
relação direta entre a porcentagem de antígeno encapsulado e sua liberação contínua e
direcionada com o desenvolvimento da resposta imune, a proporção BSA:SBA-15
utilizada nestes próximos experimentos foi de 1:25.
Para análise do efeito dose-resposta, administrou-se em camundongos L
IVA
[n=4-
5/grupo] diferentes concentrações de BSA pela via oral ou intramuscular. A Figura 11
mostra o efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
imunizados pela via oral com
10µg ou 100µg de BSA encapsulada/adsorvida em SBA-15 (
■
) ou adsorvida em
Al(OH)
3
(
▲
).
BSA - VO
1 10 100 1000
0
2
4
6
8
10
12
14
16
SBA-15
Al(OH)
3
µ
g/mL
IgG a nti-BS A(título-log2)
Figura 11 – Efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
[n=4-5/grupo] imunizados com 10µg ou
100µg de BSA em SBA-15 (■) ou em Al(OH)
3
(▲) pela via oral. Proporção
BSA:SBA-15 ou BSA: Al(OH)
3
de 1:25
Conforme demonstrado na tabela abaixo, não houve diferença estatisticamente
significativa entre a resposta imune desenvolvida nos camundongos L
IVA
imunizados
pela via oral com diferentes concentrações de BSA em SBA-15; ou em Al(OH)
3
, exceto
no 14° dia da resposta primária dos camundongos L
IVA
que receberam o antígeno em
SBA-15. Neste dia, houve uma diferença de ~ 3 log
2
entre o grupo imunizado com 10µg
de BSA em SBA-15 e o imunizado com 100µg de BSA em SBA-15 (Tabela 2).
Tabela 2 – Média
±
SD dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
[n=4-
5/grupo] imunizados pela via oral com 10µg ou 100µg BSA em SBA-15; ou em
Al(OH)
3
.
SBA-15
x
±
SD
Al(OH)
3
x
±
SD
Dias sangria
L
IVA
10µg BSA 100µg BSA 10µg BSA 100µg BSA
14 d RP
10,0
±
1,4 12,8
±
1,0 7,0
±
0,8 8,8
±
5,5
50 d RP
7,9
±
0,5 7,8
±
1,0 7,5
±
0,4 7,9
±
0,6
90 d RP
6,5
±
0,7 7,1
±
0,5 6,6
±
1,1 6,3
±
1,0
10 d RS
7,1
±
1,4 7,8
±
0,65 6,3
±
0,9 9, 7
±
3,1
30 d RS
9,0
±
2,4 11,8
±
0,5 7,9
±
0,6 8,8
±
0,4
*88*
RP – Resposta Primária; RS – Resposta Secundária
A Figura 12 ilustra o efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
que receberam
pela via intramuscular 0,1µg; 1µg ou 10µg de BSA em SBA-15 (■) ou em AIF (¡).
BSA - IM
0.01 0.1 1 10 100
0
2
4
6
8
10
12
14
16
SBA-15
AIF
µ
g/mL
IgG a nti-BS A(título-log2)
Figura 12 –
Efeito dose-resposta dos camundongos L
IVA
[n=4-5/grupo] imunizados com 0,1µg;
1µg ou 10µg de BSA em SBA-15 (■) ou em AIF (¡) pela via intramuscular.
Proporção BSA:SBA-15 de 1:25.
Por meio da Tabela 3 verifica–se que as concentrações de 0,1 – 1 – ou 10µg de
BSA em AIF não interferiram nas cinéticas de anticorpos, pois, no período de 14 a 140
dias não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Comparando-se
os títulos de anticorpos dos animais imunizados com 0,1µg de BSA:SBA-15 com os que
receberam 1µg de BSA:SBA-15, apenas no 10° dia da resposta secundária houve uma
diferença de ~ 1,7 log
2
. Fica evidente o efeito dose–resposta, sendo que os
camundongos imunizados com 10µg de BSA:SBA-15 produziram do 14° ao 140° dias,
títulos de anticorpos cerca de 4 a 16 vezes superiores aos dos que receberam 1µg de
BSA:SBA-15 (Tabela 3).
Tabela 3 –
Média
±
SD dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
[n=4-5/grupo] imunizados pela via intramuscular com 0,1µg; 1µg ou 10µg BSA em
SBA-15; ou em AIF.
SBA-15
x
±
SD
AIF
x
±
SD
Dias
sangria
L
IVA
0,1µg BSA 1µg BSA 10µg BSA 0,1µg BSA 1µg BSA 10µg BSA
14 d RP
8,4
±
0,8 8,3
±
1,5 12,1
±
0,9 8,8
±
2,2 10,0
±
2,0 11,1
±
1,0
50 d RP
6,9
±
0,8 6,9
±
1,1 10,1
±
1,9 7,4
±
0,9 8,5
±
2,8 10,8
±
2,2
90 d RP
6,6
±
0,7 6,2
±
0,8 8,4
±
1,6 7,1
±
0,8 8,0
±
3,5 9,5
±
2,4
10 d RS
6,4
±
0,2 8,1
±
1,2 12,3
±
0,6 7,7
±
1,7 10,7
±
1,3 10,5
±
2,6
30 d RS
9,2
±
1,2 9,9
±
1,0 12,3
±
0,6 10,7
±
0,3 10,2
±
1,0 12,5
±
0,7
*
RP – Resposta Primária; RS – Resposta Secundária.
Como apresentado nas Figuras 11 e 12 e nas Tabelas 2 e 3, pelas duas vias de
imunização, não houve correlação entre as concentrações de antígeno e os títulos de
anticorpos. Assim, seguiu–se o estudo de cinética de anticorpos dos camundongos
imunizados com 10µg de BSA nos diferentes adjuvantes.
4.6 Análise da Modulação da Resposta Induzida pela SBA-15
4.6.1 Imunização pela Via Oral
Para verificação da cinética de anticorpos, imunizou-se pela via oral
camundongos L
IVA
[n=4/grupo] com 10µg de BSA encapsulada/adsorvida em SBA-15
(
■
) ou adsorvida em Al(OH)
3
(
▲
). Realizou-se sangria pelo plexo retro-orbital nos 14º,
50º, 90º dias da resposta primária e, conforme ilustrado na Figura 13 apenas no 14° dia
houve uma diferença estatisticamente significativa entre os títulos de IgG dos
camundongos imunizados com o antígeno em SBA-15 ou em Al(OH)
3
. Os animais com
SBA-15 produziram títulos de anticorpos 8 vezes superiores aos com Al(OH)
3
.
Para análise da resposta secundária, após 110 dias da primeira imunização,
administrou–se nos dois grupos 10µg de BSA em SBA-15 pela via subcutânea. No 120°
dia, apenas o grupo com SBA-15 teve títulos aumentados, porém, não
significantemente distintos dos níveis pré–existentes no 90° dia da resposta primária.
No 140° dia houve um aumento de 4 vezes nos títulos de IgG anti-BSA dos dois grupos
experimentais comparativamente aos obtidos no 120° dia (Figura 13). Este resultado
evidencia, mais uma vez, que a SBA-15 é eficaz na sensibilização para a resposta
secundária, induzindo níveis elevados e duradouros mesmo quando da administração
do imunógeno por via oral.
VO - L
IVA
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
0
2
4
6
8
10
12
14
16
10µg BSA:SBA-15
10µg BSA:Al(OH)
3
p < 0,05 n.s
Dias de Sangria
IgG anti-BSA (título-log2)
Figura 13 – Média
±
SD dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
[n=4/grupo] imunizados pela via oral com 10µg BSA em SBA-15 (■); ou em Al(OH)
3
(▲). Anticorpos foram detectados pelo método de ELISA nos 14º, 50º, 90º dias da
primeira imunização. No 110º dia realizou-se segunda imunização com BSA em
SBA-15 e nos 120º e 140° dias os anti-soros foram analisados [n.s. – não
significante; * p < 0,05; SD – desvio padrão].
Com o objetivo de verificar a capacidade da SBA-15 em modular positivamente a
resposta humoral, comparou-se a resposta induzida em camundongos L
IVA
e H
IVA
imunizados pela via oral com 10µg de BSA encapsulada/adsorvida em SBA-15; ou
adsorvida em Al(OH)
3
; a SBA–15 foi capaz de modular positivamente a resposta dos
camundongos geneticamente selecionados para a má resposta [L
IVA
], que passaram a
produzir títulos de anticorpos semelhantes aos dos bons respondedores [H
IVA
]. Por
outro lado, no 14° dia os níveis de anticorpos dos L
IVA
imunizados com 10µg de BSA em
Al(OH)
3
foram 16 vezes inferiores aos dos H
IVA
e,
no 50° dia, essa diferença entre L
IVA
e
H
IVA
caiu para ~ 0,8 log
2
.
No período analisado não houve diferença estatisticamente
significativa entre a cinética de IgG anti-BSA dos camundongos H
IVA
imunizados com
10µg de BSA em SBA-15 ou em Al(OH)
3
(Figura 14).
L
IV A
/H
IV A
- V O
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
SBA-15
Al(O H)
3
14dRP
50dRP 14dRP 50dRP
*
*
*
IgG anti-BSA (título-log2)
Figura 14 – Comparação dos títulos de IgG produzidos por camundongos L
IVA
[n=4/grupo] e
H
IVA
[n=3/grupo] imunizados com 10µg de BSA em SBA-15 ou em Al(OH)
3
pela via
oral. Anticorpos anti–BSA foram dosados pelo método de ELISA nos 14º e 50° dias
após imunização [* p < 0,05; ** p <0,001].
4.6.2 Imunização pela Via Intramuscular
Camundongos L
IVA
[n=4/grupo] foram imunizados pela via intramuscular com
10µg de BSA encapsulado/adsorvido em SBA-15 (■); ou emulsificado em AIF (¡); ou
em PBS (▼). Conforme Figura 15, entre o 14° e o 90° dias, não houve diferença na
cinética de IgG anti-BSA do grupo com SBA-15 ou com AIF, sendo a SBA-15 tão
eficiente quanto o AIF na indução da resposta humoral.
Para análise da resposta secundária, por volta do 100º dia administrou-se, nos
dois grupos 10µg de BSA em SBA-15 pela via subcutânea. No 10° dia observou-se um
aumento de cerca de 16 vezes nos títulos dos animais que receberam o antígeno em
SBA-15, enquanto que no grupo com AIF não houve diferença nos níveis de anticorpos
quando comparados aos obtidos no 90° dia da resposta primária. Assim como na
resposta primária, não houve diferença entre esses grupos durante a resposta
secundária (Figura 15).
Verifica-se na Figura 15 a capacidade dos adjuvantes, SBA-15 e AIF,
potencializarem a resposta imunológica. Do 14° ao 140° dias, o grupo com SBA-15
produziu títulos 8 vezes superiores relativamente àqueles que receberam 10µg de BSA
em PBS. Já, para os camundongos com AIF esta diferença foi detectada apenas nos
50° e 140° dias.
IM - L
IVA
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
0
2
4
6
8
10
12
14
16
10
µ
g BSA:SBA-15
10
µ
g BSA:AIF
10
µ
g BSA:PBS
n.s
p < 0,05
Dias de Sangria
IgG anti-BSA (título-log2)
Figura 15 – Média
±
SD dos títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
[n=4/grupo] imunizados pela via intramuscular com 10µg BSA em SBA-15 (■); ou
em AIF
(
¡
); ou em PBS (▼). Anticorpos foram detectados pelo método de ELISA
nos 14º, 50º, 90º dias da primeira imunização. No 110º dia realizou-se segunda
imunização e os anti-soros foram analisados nos 120º e 140° dias [n.s. – não
significante; * p < 0,05; SD – desvio padrão].
Com a finalidade de analisar a capacidade da SBA-15 em modular positivamente a
resposta, comparou-se os níveis de anticorpos produzidos pelos camundongos L
IVA
e
H
IVA
que receberam 10µg de BSA em SBA-15; ou em AIF pela via intramuscular e,
conforme Figura 16, ambos adjuvantes foram capazes de eliminar as diferenças
fenotípicas interlinhagens. No 14° dia observa-se uma diferença de ~ 1,3 log
2
entre os
títulos dos camundongos H
IVA
imunizados com SBA-15 e os com AIF; no 50° dia não
houve diferença entre esses grupos (Figura 16).
L
IVA
/H
IVA
- IM
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
L
IVA
H
IVA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
SBA-15 AIF
14dRP
14dRP
50dRP 50dRP
IgG anti-BSA (título-log2)
Figura 16 – Comparação dos títulos de IgG produzidos por camundongos L
IVA
[n=4/grupo] e
H
IVA
[n=3/grupo] imunizados com BSA em SBA-15 ou em AIF
pela via
intramuscular. Anticorpos anti–BSA foram dosados pelo método de ELISA nos 14º
e 50° dias após imunização.
Pela análise dos resultados das Figuras 14 e 16 conclui-se que, tanto pela via
oral quanto pela via intramuscular, a SBA-15 modulou positivamente a resposta dos
camundongos L
IVA
, que passaram a produzir níveis de IgG anti-BSA similares aos
camundongos H
IVA
. O AIF também foi capaz de eliminar as diferenças interlinhagens;
no entanto, vale ressaltar que este adjuvante induz uma ativação múltipla e variável no
sistema imune gerando efeitos colaterais que incluem reações locais, sistêmicas, e
possível carcinogênese (CHEDID, 1985). O Al(OH)
3
, licenciado para uso em humanos,
não foi capaz de modular a resposta dos animais maus respondedores que,
comparativamente aos H
IVA
, continuaram produzindo títulos de IgG cerca de 2 a 16
vezes inferiores. Desta forma, os dados das Figuras 14 e 16 corroboram os obtidos por
Gennari et al. (1987). Como citado no item 1.3, a diferença existente entre os
camundongos H e L da seleção IV-A, deve-se à alta atividade catabólica dos
macrófagos nos camundongos L. Assim, a quantidade diminuta de antígenos expressos
na superfície dos macrófagos gera uma ativação não efetiva dos linfócitos T e,
conseqüentemente, baixa resposta de anticorpos. Por outro lado, o estímulo
imunogênico persistente, presente nos camundongos H destas seleções, gera uma
resposta de anticorpos alta e duradoura (BIOZZI, et al., 1984). Baseando-se em
estudos que demonstraram que a fagocitose de partículas de sílica por macrófagos
afeta a função catabólica destas células, esses resultados sugerem que a SBA-15
exerça alguma modificação nessa atividade dos macrófagos dos camundongos L
IVA
permitindo que outras células, mais eficazes na apresentação do antígeno ao linfócito
T, participem da ativação e desenvolvimento da resposta imunológica. As células
dendríticas são ativadoras potentes dos linfócitos T. Assim, quando a ativação do
sistema imune ocorre via DC, ocorre resposta mais eficiente. Baseado nestas
informações acredita-se que a modulação da resposta exercida pela SBA-15 nos
camundongos L
IVA
esteja relacionada a uma apresentação efetiva, provavelmente pela
ativação mais eficiente dos macrófagos ou via DC e/ou linfócitos B, do antígeno
encapsulado e/ou adsorvido pela SBA-15.
Vale ressaltar que, assim como não houve diferença entre as respostas imunes
induzidas pela Int1βr em SBA-15 quando administrada por diferentes vias de
imunização, os títulos de IgG anti-BSA produzidos por camundongos H
IVA
que
receberam o antígeno em SBA-15 pela via oral ou intramuscular foram semelhantes.
Entretanto, nos 14° e 120° dias, a administração do antígeno em camundongos L
IVA
pela via intramuscular induziu níveis de IgG anti-BSA 4 e 32 vezes superiores,
respectivamente, aos dos imunizados pela via oral. A apresentação antigênica pode ser
uma possível explicação para esta diferença observada; os antígenos administrados
pela via oral estão mais expostos a ação de proteases e ambientes com condições
desnaturantes em comparação aos antígenos imunizados pela via intramuscular. A
existência de diferenças entre essas vias logo após a imunização, corrobora essa
atividade.
4.7 Análise da Influência da SBA-15 na Produção de Isótipos de IgG
Para verificar se a SBA-15 interferia qualitativamente na resposta imune,
analisou-se a produção dos isótipos de IgG, IgG
1
e IgG
2a
, durante as respostas primária
e secundária de diferentes linhagens de camundongos [BALB/c ou L
IVA
] imunizados
com antígenos de natureza distintas por diferentes vias.
Conforme Figura 17 A e B, camundongos BALB/c [n=3/grupo] imunizados com
Int1βr encapsulada/adsorvida à SBA-15 pela via intraperitoneal e subcutânea,
respectivamente, produziram no 25º dia da resposta primária e no 10º e/ou 21º dia da
resposta secundária, ambos isótipos de IgG; indicando que a SBA-15 não influencia
qualitativamente a resposta imune quanto à determinada classe de linfócito T
H
.
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
IgG
2a
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Resposta 1o.
Resposta 2o.
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
/ IgG
2a
anti-Int1
β
r
(título-log
2
)
A
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
IgG
2a
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Resposta 1o.
Resposta 2o.
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
/ IgG
2a
anti-Int1
β
r
(título-log
2
)
B
Figura 17 – Título
±
SD de IgG
1
e IgG
2a
anti-Int1βr produzidos por camundongos BALB/c
[n=3/grupo] imunizados com 5µg de Int1βr em SBA-15 pela via intraperitoneal (A)
e subcutânea (B). Anticorpos detectados pelo método de ELISA no 25º dia da
resposta primária e no 10º e/ou 21º dia da resposta secundária. SD – desvio
padrão
Verificaram-se os títulos de IgG
1
e IgG
2a
de camundongos L
IVA
[n=4/grupo]
imunizados com 10µg de BSA em SBA-15 pela via oral (Figura 18A) ou intramuscular
(Figura 18B). Observa-se na Figura 18A e 18B que, na via oral ou intramuscular
respectivamente, no 50° dia da resposta primária e no 30° dia da resposta secundária
não houve diferença na produção de IgG
1
e IgG
2a
anti-BSA, ou seja, os camundongos
L
IVA
imunizados com SBA-15 produziram indistintamente os dois isótipos de
imunoglobulina independente da via de administração.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
Resposta 1o.
Resposta 2o.
IgG
2a
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
/ IgG
2a
anti-BSA(título-log2)
A
IgG
1
IgG
2a
IgG
1
IgG
2a
0
2
4
6
8
10
12
14
16
IgG
1
IgG
2a
Resposta 1o. Resposta 2o.
IgG
1
/ IgG
2a
anti-BSA(título-log2)
B
Figura 18 - Título ± SD de IgG
1
e IgG
2a
anti-BSA produzidos por camundongos L
IVA
[n=4/grupo]
imunizados com 10µg BSA em SBA-15 pela via oral (A) ou
intramuscular (B). Anticorpos detectados por ELISA no 50º dia da resposta
primária e no 30º dia da resposta secundária. SD – desvio padrão
Como visto no item 1.4, o mecanismo de apresentação antigênica pelas APC,
pode ocorrer por duas vias, pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade [MHC] de
classe I ou classe II, dependendo da natureza e dose do antígeno, via de imunização e
do adjuvante utilizado para potencializar a resposta. Diferentes complexos antigênicos
[antígeno + adjuvante] poderão ser processados e apresentados a uma específica sub–
população de linfócitos T
H
, T
H
1 ou T
H
2, induzindo a produção dos isótipos IgG
2a
e IgG
1
,
respectivamente (MOSMANN; COFFMAN, 1989a). Sabendo-se da distinta distribuição
quantitativa das APC nos diversos tecidos, as diferentes vias de imunização poderiam,
juntamente com o adjuvante, modularem qualitativamente as respostas de IgG. No
entanto, verifica–se que a SBA-15 não interferiu seletivamente na produção dos isótipos
de IgG, pois antígenos de natureza distinta [Int1βr e BSA] em SBA-15 administrados
por diferentes vias, induziram, sem predominância, a produção dos isótipos IgG
1
e
IgG
2a.
Vale relembrar que a finalidade do adjuvante é potencializar, sem interferir, a
resposta imune específica sendo assim eficaz na proteção contra diferentes patógenos.
Os adjuvantes licenciados para uso em humanos, preferencialmente, induzem
polarização da resposta imune para T
H
2 não conferindo proteção quando a imunidade
protetora é dependente da ativação de linfócitos T
H
1.
4.8 Análise da Toxicidade da SBA-15
Com a finalidade de verificar o possível efeito tóxico da sílica SBA-15
compararam-se, mensalmente, o peso dos camundongos Swiss inoculados, quando
com três meses de idade, ou não com 250µg de SBA-15 pela via intramuscular. Pela
Figura 19 verifica-se que durante o período de análise [agosto de 2005 a maio de
2006], não houve diferença significativa no peso dos animais do grupo tratado quando
comparada com o do grupo controle; nesse período, houve aumento equivalente de
peso nos dois grupos. Apenas 2 camundongos do grupo tratado e 2 do grupo controle
morreram e nenhuma alteração morfológica foi observada por meio da análise
macroscópica dos órgãos destes animais.
Ag. Set. Out. Nov. Dez. Jan. Fev. Mar. Abr. Mai.
0
10
20
30
40
50
60
70
Tratado
Controle
Período de Análise
Massa Corpórea (g)
Figura 19 - Média ± SD do peso corporal de camundongos Swiss inoculados (grupo tratado; n=15)
ou não (grupo controle; n=5) pela via intramuscular com 250µg de SBA-15. Período de
análise: agosto de 2005 a maio 2006. SD – desvio padrão.
Em maio de 2006, após pesados, os camundongos de ambos os grupos foram
sacrificados por deslocamento cervical para medida do peso do baço e estabeleceu-se
a relação peso total/peso do baço. Por meio da Tabela 2 observa-se que não houve
diferença significante entre a relação peso total/peso do baço entre os grupos indicando
que a sílica SBA-15 não possui efeito tóxico.
Tabela 4 - Relação peso corporal/peso do baço(g) dos camundongos Swiss inoculados ou não
pela via intramuscular com 250µg de SBA-15.
Swiss
Relação
peso total/peso do baço(g)
19/05/06
Tratados (n=7)
X ± SD
0,0040 ± 0,0005
Controle (n=3)
X ± SD
0,0087 ± 0,0052
A escolha por camundongos machos foi aleatória; devido a relatos de
desenvolvimento de nódulos carcinogênicos relacionados com a produção de
hormônios femininos serão realizados outros estudos de carcinogênese e toxicidade
utilizando fêmeas.
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