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ANDRÉ CÉSAR DA SILVA
ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO IN VITRO DA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DO ROEDOR PROECHIMYS GUYANNENSIS: UMA
ESPÉCIE ANIMAL RESISTENTE AOS MODELOS EXPERIMENTAIS
DE EPILEPSIA
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO
2005
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ANDRÉ CÉSAR DA SILVA
ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO IN VITRO DA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DO ROEDOR PROECHIMYS GUYANNENSIS: UMA
ESPÉCIE ANIMAL RESISTENTE AOS MODELOS EXPERIMENTAIS
DE EPILEPSIA
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Margareth Rose Priel
SÃO PAULO
2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe de Departamento:
Profa. Dra. Débora Amado Scerni
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro
ANDRÉ CÉSAR DA SILVA
ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO IN VITRO DA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DO ROEDOR PROECHIMYS GUYANNENSIS: UMA
ESPÉCIE ANIMAL RESISTENTE AOS MODELOS EXPERIMENTAIS
DE EPILEPSIA
PRESIDENTE DA BANCA
Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa
Prof. Dr. Carlos Fernando de Mello
Prof. Dr. Fernando Cendes
Profa. Dra. Débora Amado Scerni
SUPLENTES
Prof. Dr. Alexandre Valotta da Silva
Prof. Dr. Fulvio Alexandre Scorza
Aprovada em: / /
Esta tese foi realizada na disciplina de Neurologia Experimental, Departamento de
Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, durante o curso de pós-graduação em neurologia. Auxílio
financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES, FADA e PRONEX. André César da Silva é
bolsista CNPq.
DEDICO ESTA TESE:
Em especial a minha amada esposa Thaís que nunca deixou de me incentivar,
principalmente nos momentos difíceis,
A minha querida mãe Aurea (Mamãe), que sempre me guiou corretamente pelos
caminhos sinuosos da vida,
Ao meu irmão Rogério, que apesar da distância sempre torceu por mim,
A todos meus familiares.
AGRADECIMENTOS
Ao professor Esper Abrão Cavalheiro pela sua brilhante capacidade de orientar e
ensinar o verdadeiro objetivo da ciência.
A professora Margareth Rose Priel não só pela sua abrangente co-orientação,
mas também pelos seus conselhos de vida.
Ao professor Emilio Garrido Sanabria por ter acreditado na minha vontade de fazer
pesquisa.
Aos meus amigos do laboratório. Em especial ao Leo, Leandro, Filipe e Alexandre,
pelo companherismo e incentivos nos momentos difíceis.
As professoras Débora Amado Scerni, Maria José Fernandes, Maria da Graça
Naffah Mazzacoratti e aos professores Ricardo Mario Arida e Fulvio Alexandre
Scorza que sempre estiveram dispostos para qualquer ajuda.
Aos funcionários do laboratório de Neurologia Experimental, em especial, ao
Marco Aurélio Gonzaga.
SUMÁRIO
página
1
. DEDICATÓRIA................................................................................vi
2. AGRADECIMENTOS.......................................................................vii
3. LISTA DE FIGURAS........................................................................ix
4. LISTA DE TABELAS........................................................................x
5. LISTA DE ABREVIATURAS............................................................xi
6. RESUMO..........................................................................................xii
7. INTRODUÇÃO..................................................................................1
8. OBJETIVOS....................................................................................19
9. MATERIAL E MÉTODOS................................................................20
10. RESULTADOS..............................................................................28
11. DISCUSSÃO..................................................................................39
12. CONCLUSÕES..............................................................................49
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................50
14. ABSTRACT....................................................................................86
LISTA DE FIGURAS
página
Figura 1:
Representação da circuitaria tri-sináptica do hipocampo com
suas principais células.
4
Figura 2: Proechimys guyannensis.
18
Figura 3: Comparação dos cérebros: P. guyannensis versus rato Wistar.
18
Figura 4: Respostas extracelulares típicas de CA1.
22
Figura 5: Foto ilustrativa do equipamento de eletrofisiologia.
22
Figura 6: média das curvas de entrada/saída da espécie PG e ratos Wistar
e respostas ortodrômicas típicas do stratum piramidale de CA1 nas
diferentes espécies.
28
Figura 7: Traçados representativos dos potenciais pós-sinápticos
excitatórios invertidos
29
Figura 8: Limiar para o aparecimento da população de espículas em
diferentes concentrações de potássio ou bicuculina
30
Figura 9: Respostas extracelulares frente ao protocolo do potássio alto
31
Figura 10: Efeitos da Inibição GABAérgica na espécie PG e no rato Wistar
32
Figura 11: Respostas extracelulares frente ao protocolo do 0 magnésio na
espécie P. guyannensis.
34
Figura 12: Análise eletrofisiológica da plasticidade sináptica de CA1 em
ratos Wistar e P. guyannensis
35
Figura 13: Registros intracelulares representativos de neurônios da
espécie P. guyannnensis mostrando suas principais propriedades
intrínsecas.
37
Figura 14: Gráfico mostrando os subtipos de neurônios encontrados em
CA1 de ambas espécies.
38
LISTA DE TABELAS
página
Tabela 1: Porcentagem dos grupos animais que obtiveram atividade
espontânea em diferentes concentrações de potássio ou bicuculina.
31
Tabela 2: Análise comparativa das principais propriedades intrínsecas das
células Piramidais de CA1 nas duas espécies.
36
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-
metilisoxazol-4-i propiônico
BAL Burster alto limiar
BBL Burster baixo limiar
CA Cornu Ammonis
EAF Estímulo de alta freqüência
ELT Epilepsia do Lobo Temporal
GABA Ácido y-aminobutírico
GD Giro Dentado
IC intracelular
I
Ca
Correntes de cálcio
I
K
Correntes de potássio
I
Na
Correntes de sódio
LCRa Líquido Cefalorraquiano Artificial
LTP Long-term potentiation
NB Não-burster
NMDA N-metil-D-aspartato
PA Potencial de ação
PE População de espículas
PDS Paroxymal Depolarizing Shift
PG Proechimys guyannensis
PILO Pilocarpina
PMR Potencial de membrana em repouso
PPD Potencial pós-sináptico despolarizante
PPE Potencial pós-sináptico excitatório
PPH Potencial pós-sináptico hiperpolarizante
SE status epilepticus
Proechimys guyannensis (PG), conhecido no Brasil popularmente como
Casiragua, é uma espécie comum na região Amazônica e pertence à sub-ordem
Hystricomorpha, família Echimyidae, gênero Proechimys. Esses animais têm sido
extensivamente estudados em relação a sua ecologia e sua evolução, porém seu
cérebro foi pobremente investigado. Em estudo realizado em nosso laboratório, o
PG demonstrou uma grande resistência ao desenvolvimento de modelos
experimentais de epilepsia. O status epilepticus (SE) induzido por pilocarpina teve
uma curta duração na espécie PG, raramente excedendo 2 horas. De 48 PGs que
evoluíram para o SE somente 2 apresentaram crises espontâneas e recorrentes.
No modelo de epilepsia induzido por ácido caínico, nenhum dos animais
sobreviventes apresentou crises espontâneas durante um longo período de
observação (mais de 120 dias). De 43 animais submetidos ao modelo do
abrasamento amigdaliano, apenas 3 animais atingiram o estadio 5 da escala de
Racine. Estes achados indicam que os PGs podem ter mecanismos endógenos
anticonvulsivantes representando um modelo de resistência a tratamentos
epileptogênicos.
Considerando a resistência desta espécie aos três modelos de epilepisa do
lobo temporal in vivo supracitados, pareceu-nos interessante o estudo
eletrofisiológico de sua circuitaria hipocampal, através de protocolos de indução de
hiperexcitabilidade, como também a aplicação do protocolo da LTP (Long-term
potentiation), para uma melhor elucidação de seu funcionamento básico e a
identificação de possíveis alvos celulares responsáveis por este comportamento.
Respostas extracelulares ortodrômicas típicas de CA1 (população de
espículas: PE) foram encontradas na espécie PG com as mesmas características
já descritas em trabalhos originais com ratos Wistar. O limiar para o aparecimento
da população de espículas em presença de líquido cefalorraquiano artificial normal
e frente ao protocolo de elevação do potássio extracelular foi maior na espécie
PG, sendo significantemente maior com o protocolo de inibição GABAérgica
(bicuculina). Nossos resultados mostraram que a espécie PG foi menos
susceptível ao bloqueio da inibição, pois observamos apenas uma espícula
subseqüente após o PE, e a ausência de atividade espontânea, atividade esta que
esteve presente em todas as fatias de ratos Wistar. Corroborando com este
resultado, o registro intracelular também apresentou um limiar de disparo de
potencial de ação maior em relação aos Wistar. Apesar da ocorrência do
fenômeno de LTP, este mostrou ser menos expressivo na espécie PG. Nos
experimentos de retirada do íon Mg
2+
do líquido cefalorraquiano artificial a espécie
PG apresentou respostas semelhantes às encontradas no rato Wistar, a não ser
pela a ausência de atividade espontânea.
Frente a esses resultados, podemos concluir que a espécie PG apresenta
uma circuitaria funcionalmente diferente da encontrada nos ratos Wistar,
possivelmente devido a uma diferente distribuição e densidade dos receptores
glutamatérgicos e GABAérgicos. Adicionalmente, nossos dados permitem sugerir
a que a cinética das correntes iônicas possa ser diferente no PG, o que poderia
explicar sua resistência e proteção contra a epileptogênese.
César da Silva, André
Estudo eletrofisiológico in vitro da formação hipocampal do roedor
Proechimys guyannensis: uma espécie animal resistente aos modelos
experimentais de epilepsia / André César da Silva – São Paulo, 2005.
P:100
Tese (Doutorado – Ciências) – Universidade Federal de São Paulo, Escola
Paulista de Medicina.
Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em
Neurologia/Neurociências.
Título em inglês: In vitro electrophysiological study of the hippocampal formation of
Proechimys guyanensis: an animal specie resistant to experimental models of
epilepsy.
Descritores: 1. Epilepsia. 2. Eletrofisiologia in vitro. 3. Hipocampo. 4. Plasticidade
neuronal.
Neuroplasticidade é uma propriedade do tecido nervoso que se caracteriza
pela ocorrência de mudanças reversíveis (plasticidade funcional) e de longo prazo.
Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno podem ser ativados por estímulos
naturais ou artificiais, internos ou externos. Os efeitos plásticos podem levar a
mudanças positivas ou negativas durante o desenvolvimento celular e seus
mecanismos estão baseados na modulação da transmissão do sinal entre as
sinapses (TROJAN & POKORNY, 1999). Durante um longo tempo, a plasticidade
neuronal foi vista apenas como uma propriedade das células neurais associadas
ao estabelecimento das conexões e formação dos circuitos neurais durante o
desenvolvimento e que, portanto, não estaria presente após a maturação do
sistema nervoso. Esta idéia foi desafiada por observações experimentais de
Steward, Cotman e Lynch (1974; 1976), ao mostrarem que neurônios adultos,
privados de suas conexões sinápticas, podiam, em alguns casos, serem
reinervados pelos sistemas aferentes próximos com o brotamento de novas
conexões. Entretanto, os fenômenos envolvidos no processo de modificação tanto
fisiológica quanto patológica da circuitaria cerebral ainda são pouco
compreendidos. Além da idade, outros fatores, tanto fisiológicos como a
intensidade do estímulo, quanto patológicos como o tipo de agressão ou ainda a
região lesada, parecem contribuir para a ocorrência em maior ou menor grau
desse fenômeno. Do ponto de vista fisiológico, inúmeros estudos têm relacionado
a formação de memória explícita de longa duração à ocorrência de fenômenos
plásticos em diferentes regiões hipocampais. A participação do lobo temporal e em
especial do hipocampo no processo de formação de memória remonta os
trabalhos pioneiros de Penfield (1958, apud KANDEL, 2000) e de Milner e Scoville
(1966, apud KANDEL, 2000). Particularmente, Milner e Scoville (1966)
demonstraram, através de um estudo de caso, que a remoção bilateral do
hipocampo resulta em perda da formação de memória de longo prazo, sem
comprometimento das memórias previamente adquiridas. Além disso, Bliss e
Lomo (1973) demonstraram que as vias hipocampais são consideravelmente
sensíveis à história prévia de atividade, resultando em alterações permanentes. A
base celular desse processo é conhecida como potenciação duradoura ou de
longo prazo (PLP- LTP long-term potentiation), e na sua fase tardia (late LTP)
requer a síntese de novas proteínas que promoverão novas conexões sinápticas.
Por outro lado, estudos demonstram que o hipocampo apresenta uma maior
vulnerabilidade a agressões quando comparado a outras estruturas cerebrais. Isto
pode ser conseqüência de suas características celulares, com a expressão
diferencial de receptores e proteínas (MELLO E COVOLLAN, 1998), bem como de
sua circuitaria. O aumento na concentração de cálcio intracelular tem sido
apontado como o provável responsável pela lesão de neurônios seletivamente
vulneráveis (MELDRUM, 1986). Esse mecanismo excitotóxico tem sido sugerido
como a base fisiopatológica de inúmeros quadros neurológicos, como o acidente
vascular cerebral, e a lesão após o estado de mal epiléptico (status epilepticus-
SE).
Cicuitaria básica do hipocampo
O hipocampo pode ser divido em fascia dentata (giro dentado) e hipocampo
propriamente dito (cornu Ammonis). Por sua vez, tendo como base as diferenças
na morfologia celular e conexões regionais, o hipocampo, pode ser subdividido,
em região superior e inferior (RAMÓN Y CAJAL, 1911). Usando uma terminologia
descrita por Lorente de Nó (1934) pode-se, de igual forma, dividir o cornus
Ammonis (CA) em quatro diferentes regiões, CA1-CA4 (LORENTE DE NÓ, 1934).
Essas áreas podem dividir-se, por sua vez, em subáreas a, b, c (ex.:CA1a, CA1b,
CA1c). Com exceção da área CA4 que tem natureza polimórfica, o resto das áreas
apresenta um mesmo padrão básico de organização. As células principais dessas
áreas são de forma piramidal, e se dispõem de forma compacta numa camada
denominada stratum piramidale, as terminações dendríticas e arborizações
axonais constituem outras camadas bem definidas. De forma geral, encontram-se
as seguintes camadas: (1) O alveus que contém algumas aferências ao
hipocampo, e cuja estimulação elétrica pode ativar antidromicamente esses
neurônios (ANDERSEN et al, 1964). (2) stratum oriens, entre o alveus e a camada
piramidal, que contém os dendritos basais das células principais além de algumas
células em cesto. (3) stratum piramidale ou camada piramidal, que contém o soma
das células piramidais principais do hipocampo, (4) o stratum radiatum e o stratum
lacunosum/moleculare formados, respectivamente, por segmentos proximais e
distais das arborizações dendríticas apicais. Além disso, essas camadas são
também formadas por terminações nervosas e fibras axonais em CA2, CA3, CA4
que formam o sistema da via colateral de Schaffer (LORENTE DE NÓ, 1934),
principal fonte de sinapses excitatórias dos neurônios de CA1. Nessas camadas
hipocampais, ricas em terminações dendríticas, encontram-se também
interneurônios, que realizam contato com as células piramidais (fundamentalmente
excitatórias) que, por sua vez, realizam contatos sinápticos com interneurônios
locais, fundamentalmente células em cesto, participando na formação de circuitos
locais inibitórios tipo “Renshaw” (O`KEEFE, 1978). Em condições normais, as
células granulares do giro dentado (GD) recebem sinais excitatórios (ex.
glutamatérgicos) provenientes do córtex entorrinal (camada II), através da via
perfurante. As células entorrinais da camada II e III projetam, também, parte de
seus axônios às áreas CA3 e CA2. Por sua vez, as células granulares do GD
projetam seus axônios, denominados originalmente por Ramón y Cajal (1911) de
fibras musgosas, principalmente para a área CA3 e CA2 (algumas fibras
continuam até CA1). Os neurônios piramidais de CA3 projetam seus axônios
(constituindo a via colateral de Schaffer) para a área CA1 onde formam sinapses
excitatórias (ANDERSEN et al 1971; 1980). Os axônios das células piramidais da
CA1 se organizam no alveus ou em fibras comissurais que se projetam
lateralmente. A informação neural é transmitida a partir de CA1 ao subiculum,
assim como em outras áreas, constituindo uma saída da informação pré-
processada no hipocampo. Os circuitos descritos acima formam o que muitos
conhecem como via tri-sináptica hipocampal (figura 1), sendo que as principais
sinapses são glutamatérgicas (ANDERSEN et al., 1971).
VP
VCS
GD
CA1
FM
CA3
Figura 1: Representação da circuitaria tri-sináptica do hipocampo com suas
principais células. CA1,3 (Cornus Ammonis), VCS (Via Colateral de
Schaffer);FM (Fibras Musgosas);GD (giro dentado); VP (Via Perfurante)
Estudo das propriedades intrínsecas
As propriedades intrínsecas dos neurônios hipocampais são determinadas
pela distribuição seletiva de diferentes canais iônicos, como também pelas
propriedades da membrana neuronal. Os íons passam através de canais (poros
formados por proteínas) na membrana célula. Estes canais possuem propriedades
específicas que garantem sua seletividade iônica, ativação e desativação, assim
como sua condutância para cada íon que passa seletivamente por estes canais. A
composição eletroquímica dos canais garante o potencial da membrana em
repouso, assim como o grau de excitabilidade aos estímulos externos. O fluxo de
íons através destes canais gera correntes microscópicas de diferentes
intensidades e duração, de acordo com cada canal. Existem normalmente
correntes de sódio (I
Na
), de potássio (I
K
) e diferentes correntes de cálcio (I
Ca
).
Estas últimas têm sido bem estudadas na epileptologia devido ao influxo de cálcio
para o interior dos neurônios, participando de diversos processos de transdução
de sinais, ativação de enzimas e inclusive de fenômenos de transcrição de genes
no núcleo das células, o qual pode estar associado aos fenômenos responsáveis
pela plasticidade neuronal. Existem outras correntes importantes no
funcionamento elétrico destes neurônios: corrente de K
+
passiva (I
L
), retificadora
tardia (I
DR
), corrente de K
+
tipo A (I
A
), corrente de K
+
de curta duração dependente
de voltagem e de cálcio (I
CT
), corrente persistente muscarínica (I
M
) e corrente de
K
+
de longa duração dependente de calcio (I
AHP
) ou corrente ativada após
despolarização.
Os canais iônicos podem ser ativados por ligantes, no caso dos receptores
glutamatérgicos do tipo NMDA, AMPA, cainato ou metabotrópicos, caracterizando
o potencial excitatório sináptico, e também dos receptores GABAérgicos do tipo
GABA
A
e GABA
B,
os quais determinam o componente inibitório da resposta
sináptica. Nos últimos anos têm-se estudado as propriedades da membrana
celular, na tentativa de descobrir diferenças entre um tecido sadio e um tecido
epiléptico. Muitos trabalhos de eletrofisiologia in vitro em tecido epiléptico crônico
ex vivo (hipocampal ou neocortical) obtidos de pacientes submetidos à cirurgia de
epilepsia não têm evidenciado alterações significativas nesses parâmetros,
levando à hipótese de que elas não participam de forma crítica na epileptogênese
(SCHWARTZKROIN, 1994). Entretanto, trabalhos recentes têm demonstrado
alterações específicas em determinadas correntes iônicas em neurônios de
pacientes epilépticos (MODY, 1998), apontando outros caminhos a serem
estudados.
Estudo da Potenciação de Longo Prazo
Uma maneira eficaz de estudar circuitarias e ainda fenômenos plásticos é
através do protocolo da LTP (long-term potentiation ; potenciação de longo prazo).
A LTP corresponde a um aumento da resposta sináptica de longa duração após
um estímulo de alta freqüência (TEYLER et al, 1987). Em CA1 esta potenciação
pode ser induzida in vitro por estimulação elétrica (200Hz) das fibras colaterais de
Schaffer. A ativação de um pequeno grupo de fibras com um estímulo simples
(estímulo-teste), com freqüência de 0,05 Hz, produz uma resposta extracelular
robusta (potencial pós-sináptico excitatório). Esta resposta é mantida com estes
estímulos por, aproximadamente, 30 min com intervalos de 15s. Quando a
resposta se torna estável, é dado, então, um estímulo de alta freqüência que
produz um aumento da resposta que pode durar várias horas, in vitro, ou dias, em
experimentos in vivo. Esta resposta tem sido associada aos mecanismos
celulares e moleculares de formação e consolidação da memória, ocorrendo
principalmente pela ativação de receptores do tipo NMDA (N-metil-D-aspartato)
(BASHIR et al.,1991; BAUDRY et al., 1986; CONTZEN et al., 1994).
Epilepsia do Lobo Temporal
Entre as mais enigmáticas doenças do sistema nervoso central encontra-se
a epilepsia, em particular, a do Lobo Temporal (ELT), doença crônica que afeta
mais de 1% da população mundial (FERNANDES & SANDER, 1997). As crises
epilépticas na ELT são geralmente parciais simples ou complexas e podem
generalizar-se secundariamente. Um fato marcante na ELT é a sua grande
refratariedade ao tratamento medicamentoso. Uma percentagem considerável de
pacientes portadores de ELT não consegue melhorar ou ficar livre de crises,
mesmo usando a farmacoterapia antiepiléptica moderna (MUKAHIRA et al, 1998;
OJEMANN, 1997; ENGEL, 1992). Este fato tem levado os centros de pesquisa a
investirem maciçamente no estudo deste tipo de epilepsia, para a melhor
compreensão dos seus mecanismos celulares, os quais ainda permanecem em
fase de elucidação.
Patologia Hipocampal na Epilepsia do Lobo Temporal
Em 1825, Bouchet e Cazauvieilh descreveram alguns detalhes
patognomônicos na avaliação anátomo-patológica da ELT mediante análise feita
do material obtido da autópsia de 14 pacientes epilépticos (crises parciais)
(BOUCHET,1825). A patologia principal envolveria o sistema límbico,
fundamentalmente o hipocampo, indicando que essa estrutura poderia ser a mais
comprometida. Esses dados foram confirmados mais tarde por Sommer (1880).
Uma revisão minuciosa dos estudos post-mortem em cérebros de pacientes
epilépticos revelou uma atrofia hipocampal assimétrica com acentuada gliose
associada à epilepsia (SOMMER, 1880). Estudos mais recentes demonstraram
uma associação direta entre perda de neurônios hipocampais e epilepsia parcial
complexa (BROWN & BABB, 1983; BABB et al. 1984; MOURITZE-DAM, 1982).
Um outro achado da ELT é a gliose (NIQUET et al., 1995; REPRESA et al., 1995;
WOLF et al. 1997) assim como a reorganização da circuitaria sináptica em
estruturas límbicas envolvidas na epileptogênese crônica. Esta reoganização
sináptica foi verificada em hipocampo humano epiléptico nos estudos de Babb et
al. (1991) onde foi demonstrado o brotamento das fibras musgosas (sprouting),
resultando em uma excitação monossináptica recorrente das células granulares do
giro dentado, o que contribuiria para a gênese de crises. Esses aspectos, em seu
conjunto, definem o termo anátomo-patológico de esclerose mesial na ELT.
Realmente, um avanço significativo no entendimento dos mecanismos básicos da
ELT só foi possível nas últimas décadas, com a utilização de técnicas mais
refinadas de eletrofisiologia, bioquímica e biologia molecular no estudo do tecido
epiléptico. De igual forma, o desenvolvimento de diversos modelos experimentais
com crises parciais simples e/ou complexas, espontâneas e recorrentes, trouxe
nova luz para a compreensão dos mecanismos básicos da epileptogênese na
ELT.
Modelos Experimentais de Epilepsia
Tanto modelos in vitro como in vivo de epilepsia têm sido de grande valia
para o entendimento dos mecanismos envolvidos na gênese desta patologia. Os
modelos in vivo podem ser agudos ou crônicos. Os modelos experimentais são,
também, freqüentemente conhecidos pelo tipo de síndrome ou crise epiléptica que
produzem, sendo por este critério, classificados como focais - para estudo do foco
epileptogênico cortical ou límbico, e generalizados – relevantes no estudo das
epilepsias generalizadas por complexos espícula-onda. Entre os modelos de
atividade epileptiforme generalizada, ressalta-se o da epilepsia generalizada de
ausência que revolucionou o entendimento dos mecanismos básicos das
descargas de complexos espícula-onda (COENEN et al,1992). No grupo dos
modelos focais, destacam-se os trabalhos clássicos de aplicação de tópica de
penicilina em córtex de gato, que permitiram a descrição e o estudo das descargas
paroxísticas da membrana (paroxymal depolarizing shift ou PDS)
(GOLDENSOHN,1963; MATSUMOTO,1964). Um outro grupo de modelos de
natureza focal que têm atraído a atenção nos últimos anos são aqueles que
produzem a epilepsia do lobo temporal mesial (LOTHMAN et al, 1995) com foco
epileptogênico em estruturas límbicas, fundamentalmente o hipocampo. Em
alguns modelos, a atividade epileptiforme é gerada em determinadas estruturas do
sistema nervoso. De forma particular, aqueles que reproduzem a ELT humana são
considerados muito úteis, e diversos trabalhos in vivo e in vitro têm demonstrado
uma epileptogenicidade similar à encontrada em tecido epiléptico humano quando
estudado ex vivo. Pesquisas realizadas nesses modelos de ELT fornecem
diversos dados comportamentais eletrencefalográficos, assim como apontam a
presença de lesões hipocampais compatíveis com a esclerose mesial em
humanos (AVANZINI et al, 1997; ENGLE, 1996; ISOKAWA, 1997; LOTHMAN et
al., 1995). Diversos estudos realizados in vitro com tecidos de animais com ELT
experimental têm demonstrado a existência de atividade epileptiforme evocada e
alterações dos mecanismos inibitórios ou excitatórios. Dentre os modelos de
Epilepsia parcial gostaríamos de destacar o da pilocarpina, o do ácido caínico e o
do abrasamento (kindling).
A pilocarpina (PILO) é um agonista colinérgico muscarínico, cuja aplicação
sistêmica ou intramigdaliana induz o surgimento de uma atividade epiléptica de
longa duração seguida de dano cerebral (TURSKI et al. 1983). O modelo consta
de três fases bem estabelecidas: fase aguda, após a injeção sistêmica da PILO,
caracterizada por status epilepticus (SE) duradouro; fase silenciosa, período no
qual o animal não apresenta manifestações comportamentais ou eletrográficas de
crise epiléptica; fase crônica, após a primeira crise espontânea, caracterizada por
crise epilépticas espontâneas e recorrentes (crises parciais de origem límbica com
ou sem generalização secundária). Esta última fase perdura por toda a vida do
animal. Fisiopatologicamente, o efeito epileptogênico agudo da pilocarpina, é
similar ao observado pela utilização de outros agentes colinérgicos, depende da
facilitação das descargas tipo burst em neurônios hipocampais por meio do
bloqueio de correntes iônicas de potássio, o que depende da ativação muscarínica
(BERNARDO et al., 1981). Esse mecanismo explica a ativação de um grande
número de neurônios hipocampais durante o SE induzido pela pilocarpina levando,
geralmente, à ativação secundária do sistema glutamatérgico e a uma
excitotoxicidade (mediada justamente pela ativação do sistema glutamatérgico) no
hipocampo e em outras estruturas (CAVALHEIRO,1995). Esse dano neuronal
excitotóxico agudo, associado a outras alterações moleculares (MARCINKIEWICZ
et al., 1997; MELLO et al., 1996; SCHIMIDTTKASTER et al., 1996), ainda não
muito bem compreendidas, leva a diferentes tipos de morte neuronal (FUJIKAWA,
1996), ativação do mecanismo de reogarnização sináptica (MELLO et al., 1992),
sinaptogênese e neoneurogênese (PARENT et al., 1997) no giro dentado, assim
como mudanças nas propriedades eletrofisiológicas neuronais (ISOKAWA, 1996)
e em circuitos inibitórios (HOUSER et al., 1996). Essas mudanças alteram a
circuitaria hipocampal e provocam uma condição permanente de epileptogênese.
O dano neuronal induzido pela aplicação de ácido caínico seja ela sistêmica
(BEN-ARI et al., 1981; NITECKA et al., 1986; SPERK et al., 1983) ou local (BEN-
ARI et al., 1978, 1980; CAVALHEIRO et al., 1983) é mediado por mecanismos
excitotóxicos induzidos por ativação de determinados receptores para
aminoácidos excitatórios (COYLE, 1987; FORCHETTI et al., 1981). Em muitos
casos, e depois de um período agudo de SE decorrente diretamente da aplicação
do ácido caínico, é possível observar crises parciais espontâneas e recorrentes
típicas da ELT. Porém, tais crises podem não aparecer ou ter uma expressão
limitada, desaparecendo após alguns meses (CAVALHEIRO et al., 1982;
TREMBLAY et al., 1984). Embora haja limitação no modelo do ácido caínico, ele
tem sido amplamente utilizado nos últimos anos, sendo considerado um bom
modelo de ELT.
A possibilidade de se induzir manifestações epilépticas por meio de
estimulação elétrica repetida em diferentes regiões cerebrais é um fato conhecido
desde o século XIX, fundamentada pelos trabalhos originais de FRITSCH e
HITZIG (1870), e LUCIANI (1878). Estudos de estimulação elétrica e mudanças
eletrográficas mostraram que a pós-descarga epileptiforme induzida persistia após
o término da estimulação (ADRIAN,1936; AVANZINI,1997). Embora esse
fenômeno de pós-descarga eletricamente evocada seja auto-limitado, ele possui
características de fenômeno epiléptico agudo que depende das propriedades da
estimulação elétrica (AJMONE,1972). Esse modelo foi profundamente investigado
por Goddard (1967) e foi denominado de kindling (“abrasamento”), referindo-se à
propriedade do cérebro de gerar atividade epileptiforme em resposta a estímulos
elétricos repetidos. O modelo de abrasamento elétrico passou a ser um método de
indução de epilepsia experimental muito popular e tem sido utilizado amplamente
ao longo dos últimos vinte anos. Consiste na estimulação elétrica repetitiva diária
de estruturas cerebrais específicas, fundamentalmente estruturas do sistema
límbico (hipocampo, amígdala, córtices entorrinal e piriforme), as quais parecem
apresentar maior sensibilidade para o desenvolvimento da atividade epileptiforme
evocada durante o processo de abrasamento (GODDARD et al.,1969; RACINE et
al., 1972). Pulsos quadrados de 1 segundo de duração, com freqüência variando
entre 60-100 Hz e intensidade supralimiar por volta de 100 µA induzem,
inicialmente, mudanças comportamentais imperceptíveis nos animais. A repetição
das estimulações provoca, progressivamente, alterações eletrencefalográficas e
comportamentais de natureza epileptiforme (RACINE, 1972; 1973), principalmente
movimentos mastigatórios e orofaciais, como algumas pós-descargas no EEG
compatíveis com crises parciais focais (RACINE, 1973). Essas crises, inicialmente
focais, podem se propagar para outras estruturas anatomicamente
interconectadas. A evolução do processo de abrasamento segue um padrão
característico bem-definido e estudado por diferentes pesquisadores (RACINE et
al., 1978; RACINE, 1975). Além disso, estudos demonstraram que ocorria na
formação hipocampal um brotamento axonal das células musgosas em direção à
camada supragranular do giro dentado (sprouting), onde normalmente não são
encontradas (SUTULA, et al., 1988). Este brotamento foi posteriormente
observado em vários modelos crônicos de epilepsia e sempre associado à
geração de crises. Experimentos utilizando o modelo do abrasamento (kindling)
têm indicado que a excitação repetida de grupos de neurônios resulta em
mecanismos similares àqueles observados durante a potenciação de longo prazo
(PLP; LTP) (ADAMS et al., 1997; BEN-ARI et al., 1988; BLUMCKE et al., 1996;
SUTULA et al., 1996). Muitas similaridades existem nos mecanismos do kindling e
da LTP. Ambos necessitam de estimulações de alta freqüência, transmissão
glutamatérgica, e um aumento do cálcio intracelular. Ainda, mudanças na
expressão gênica, da síntese de proteínas, da morfologia e da atividade de
receptores metabotrópicos do glutamato têm sido implicadas na LTP e no kindling
(MCEACHERN, 1999; TEYLER, et al., 2001). Embora a LTP seja considerado um
modelo de aprendizado e memória esta pode também ter um importante papel no
desenvolvimento da epilepsia.
Modelos in vitro se tornaram viáveis após o desenvolvimento da técnica de
fatias cerebrais (brain slices). Após a retirada do tecido, as fatias preparadas e
colocadas em líquido cefalorraquiano oxigenado mantêm-se viáveis por várias
horas, permitindo o estudo eletrofisiológico. Alguns protocolos têm sido utilizados
resultando na indução de hiperexcitabilidade com o aparecimento de breves surtos
de atividade epileptiforme similares aos eventos interictais observados em
portadores de epilepsia. Classicamente, os protocolos de exposição a altas
concentrações de potássio, de aplicação de antagonistas GABAérgicos como a
bicuculina ou de redução da concentração de magnésio, são os mais utilizados.
Uma das teorias para o aumento da susceptibilidade a crises em modelo de
epilepsia em ratos seria um decréscimo na eficácia dos mecanismos que
tamponam as variações das concentrações extracelulares de K
+
(DUDEK, 1994).
Estudos sugerem que o aumento do potássio extracelular seja a causa da geração
de algumas descargas em “burst”. A Injeção intraventricular de KCl pode gerar
crises em ratos (ZUCKERMANN et al, 1968). Além disso, a atividade epileptiforme
produzida por drogas convulsivantes ou estimulação tetânica foi facilitada pelo
aumento do potássio extracelular em experimentos in vivo e in vitro (HABLITZ,
1981; IZQUIERDO et al 1970; OGATA et al, 1976; OLIVER et al, 1978; PIREDDA
et al, 1985). A alteração das concentrações de KCl no líquido cefalorraquiano
artificial (LCRa) perfundido em fatias cerebrais tem sido de grande utilidade para
estudos de excitabilidade neuronal.
O uso de antagonistas GABAérgicos tem sido associado ao aparecimento
de despolarizações paroxísticas em neurônios piramidais hipocampais e corticais.
Inicialmente, a bicuculina promove uma diminuição dos potenciais pós-sinápticos
inibitórios mediados por GABA com um aumento dos potenciais excitatórios. Em
longo prazo, observa-se a ocorrência de surtos de atividade evocada ou
espontânea. Esses dados sugerem que a redução da inibição GABAérgica leva a
interação entre os neurônios piramidais gerando despolarizações paroxísticas que
podem ser equivalente às espículas interictais (TASKER E DUDEK, 1991). Essa
atividade acontece devido a diminuição da eficiência da condutância de Cl
–
através dos receptores GABA
A
(KRNJEVIC, 1983).
O protocolo do 0 Mg
2+
, consiste na retirada do sulfato de magnésio
do
LCRa, o que resultará em uma diminuição drástica das concentrações deste íon
no meio extracelular (80 µM) (MODY et al, 1987). Observa-se que a redução
desse íon resulta em aumento da excitabillidade por facilitar a atividade do
receptor glutamatérgico NMDA, uma vez que o magnésio, bloqueia o canal deste
receptor. Esse protocolo tem sido largamente usado e demonstrou ser um potente
indutor da atividade epileptiforme. Um dos mecanismos que causam danos
neurais na formação hipocampal e que possivelmente é desencadeante de crises
é a excitoxicidade por glutamato. Com a liberação excessiva de glutamato há uma
hiperativação de receptores do tipo NMDA provocando uma entrada excessiva de
íons cálcio na célula pós-sináptica podendo causar danos à estas células. A
retirada do íon magnésio do meio extracelular tem sido utilizada para estudos de
excitabilidade neuronal, pois este íon participa na regulação da carga de superfície
da membrana, além de bloquear correntes de influxo de cálcio em membranas
pré- e pós-sinápticas.
Proechimys guyannensis
Proechimys guyannensis (PG), conhecido no Brasil popularmente como
Casiragua (figura 2), é comum na região Amazônica. Pertence à família
Echimyidae – sub-ordem Hystricomorpha, gênero Proechimys (ALHO, 1982;
EMMONS, 1990). Um aspecto interessante nessa espécie é seu alto grau de
maturidade ao nascer, contrastando com a maioria das espécies
convencionalmente usadas em laboratório. Os animais adultos acasalam-se em
sistema monogâmico, os filhotes nascem com pêlos, olhos abertos, e com grande
facilidade de se movimentar, apresentando ao nascer de 15 a 20g de peso. Aos
30 dias de idade atingem um peso de 79,3±11,1g, na idade adulta chegam a pesar
em média 131± 17,9g (VALE, 1992). Os pêlos são espinhosos, brilhosos, de
coloração castanho-avermelhado ou castanho-alaranjado, mesclado com dorso
preto e ventre claro. As orelhas são pequenas e redondas, e os olhos pequenos e
escuros. Dentre as principais características ligadas à biologia reprodutiva,
observamos um período de gestação média de 54,5 ± 2,6 dias, com um intervalo
médio de 67,4 ± 4,9 dias entre parições, apresentando atividade reprodutiva
durante todo o ano, com uma prolificidade média de 3,5 (FLEMING, 1971; ALHO,
1982; EMMONS, 1990; VALE, 1992). O Proechimys guyannensis, é
reconhecidamente um reservatório da febre por arbovírus tipo C, da febre
hemorrágica argentina, da febre hemorrágica boliviana, da leishmaniose cutânea e
da estrongiloidíase, doenças que atingem populações humanas e animais nas
áreas tropicais da América Latina (MORALES & CARRENO, 1976; ACHA &
SZYFRES, 1977; BOWDRE, 1986; CARVALHO NETO, 1987; FRESSE &
SAAVEDRA, 1991). No seu habitat, estes animais são bastante agressivos e seu
manuseio pode resultar em mordeduras graves (EISENBERG & ISAAC, 1963).
Porém, quando criados em cativeiro, são de fácil manejo. Entretanto, sua
contenção deve ser feita segurando seu corpo, pois sua cauda é de fácil ruptura
devido a facilidade de fratura na quinta vértebra caudal ou ao processo de
autotomia pelo qual o animal perde a cauda provavelmente na tentativa de se
proteger contra predadores. (FLEMING, 1971; ALHO, 1982; GARDNER &
EMMONS, 1984; BOWDRE, 1986; EISENBERG, 1989; EMMONS, 1990).
Esses animais têm sido extensivamente estudados em relação a sua
ecologia e sua evolução, porém seu cérebro foi pobremente investigado. Estudos
histológicos mostraram que o PG possui uma grande formação hipocampal
associada a grandes estruturas do lobo temporal como, por exemplo, o complexo
amigdalóide. Apesar disso, a formação hipocampal do PG permite a identificação
das mesmas subdivisões citoarquitetônicas clássicas (CA1, CA2, CA3 do corno de
Ammon e giro denteado) como aquelas observadas no rato Wistar (SWANSON,
1992) (figura 3).
Em estudo realizado em nosso laboratório, o PG demonstrou uma grande
resistência ao desenvolvimento de modelos experimentais de epilepsia. Nos
modelos da pilocarpina e do ácido caínico, doses mais baixas do que as utilizadas
em ratos Wistar foram suficientes para induzir status epilepticus (SE) na espécie
PG. O status epilepticus induzido por pilocarpina teve uma curta duração na
espécie PG, raramente excedendo 2 horas, contrastando com os ratos Wistar
onde o SE durou de 8 a 12 horas. De 61 animais injetados com pilocarpina, 48
apresentaram SE e só 2 apresentaram algumas crises espontâneas após o
período silencioso, de 60 e 66 dias. A aplicação de ácido caínico na espécie PG
resultou em um SE eletrográfico auto-sustentado que se estendeu por até 72
horas. Nenhum dos animais sobreviventes apresentou crises espontâneas durante
um longo período de observação (mais de 120 dias). De 43 animais submetidos
ao modelo do abrasamento amigdaliano, apenas 3 animais atingiram o estadio 5
da escala de Racine. Além disso, os PGs necessitaram de um número
significantemente maior de estímulos para a mudança de um estadio para o outro
em relação aos ratos Wistar. Estes achados indicam que os PGs podem ter
mecanismos endógenos anticonvulsivantes representando um modelo de
resistência a tratamentos epileptogênicos (CARVALHO, 2000).
Considerando a resistência desta espécie aos três modelos de epilepsia do
lobo temporal in vivo supracitados, pareceu-nos interessante o estudo
eletrofisiológico de sua circuitaria hipocampal, assim como da aplicação do
protocolo da LTP, para uma melhor elucidação de seu funcionamento básico e a
identificação de possíveis alvos celulares responsáveis por este comportamento.
Figura 2: Proechimys guyannensis
A B
C D
A B
C D
Figura 3: Comparação dos cérebros: P. guyannensis (direita)
versus rato Wistar (esquerda). (A) vista superior (B) vista lateral
(C) vista frontal (D) vista inferior.
O objetivo desse trabalho foi a caracterização dos diferentes circuitos
hipocampais em animais machos adultos da espécie Proechimys guyannensis
usando técnicas de eletrofisiologia in vitro e comparar os resultados com os
obtidos em ratos Wistar (Rattus novergicus). Os principais aspectos estudados
foram:
1. Resposta excitatória glutamatérgica mediada pelo receptor do tipo NMDA,
através do protocolo de ausência de magnésio no líquor artificial.
2. Resposta inibitória mediada pelo receptor de GABA
A
, frente ao protocolo de
adição de antagonista (bicuculina) no líquor artificial
3. Nível de excitabilidade em fatias hipocampais de PG frente ao protocolo de
potássio alto.
4. Propriedades intrínsecas neuronais.
5. Estudo da potenciação de longo prazo (PLP; LTP long-term potentiation).
Foram utilizados animais Wistar machos, adultos, pesando entre 250 e
300g provenientes do biotério central da Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina, e roedores Proechimys guyannensis, machos,
adultos, pesando entre 150 e 185g, oriundos do Biotério Central do Instituto
Evandro Chagas – Fundação Nacional de Saúde – MS – Belém – Pará. Ambos os
animais foram mantidos no Biotério da Disciplina de Neurologia Experimental,
Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de São
Paulo – UNIFESP/EPM. Os animais permaneceram em caixas forradas com
serragem autoclavada, e mantidos em temperatura ambiente de 21º ±2ºC, com
alternância de luz a cada 12 horas e com livre acesso à água e comida.
Eletrofisiologia in vitro da área CA1 hipocampal
Foram feitas fatias hipocampais de PG e ratos Wistar adultos machos. Para
este fim os animais foram anestesiados profundamente com tiopental sódico (75
mg/kg i.p.; Abbot) e, posteriormente, decapitados mediante o uso de guilhotina.
Rapidamente, o cérebro foi retirado, submerso em líquido cefalorraquiano artificial
(LCRa) à 0.5
0
C e oxigenado com uma mistura gasosa de 95% O
2
e 5% CO
2 .
Os
hemisférios foram separados e fixados na plataforma do vibrátomo manual. Fatias
sagitais de tecido, contendo o hipocampo, foram cortadas a 400 μm, dissecadas
manualmente com agulhas próprias de dissecção em meio iluminado com luz fria.
Após 30 minutos de incubação, 2-3 fatias foram colocadas na câmara de registro
(especial para fatias cerebrais) (“slice chamber”) (figura 5B), com perfusão
contínua de LCRa oxigenado com a mistura gasosa. A temperatura na câmara foi
mantida a 35
o
C por meio de um termorregulador acoplado à mesma. As fatias
foram continuamente perfundidas com LCRa normal contendo (em mM): NaCl
124; KCl, 3.5; NaH
2
PO
4
, 1.25; MgSO
4
, 2; CaCl
2
, 2; NaHCO
3
26 e D-glicose, 10.
Potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (cPPEs) foram obtidos na camada
dendrítica apical de CA1 do hipocampo (stratum radiatum) (figura 4A). Potenciais
de campo registrados na camada piramidal foram considerados como população
de espículas (PE) (“population spike”) (figura 4B). Esse potencial eletrofisiológico
é um indicativo do número de células piramidais que atingem o limiar de disparo,
sincronicamente, após estimulação ortodrômica ou antidrômica. Estes potenciais
extracelulares foram obtidos através de micropipetas de borosilicato preenchidas
com uma solução a 1M de NaCl com uma resistência de 4-6MΩ e foram evocados
por estimulação elétrica nas fibras aferentes de CA1 (via colateral de Shaffer)
usando um microeletrodo bipolar de platina-irídio. Um estímulo-teste foi aplicado
usando uma unidade isoladora e ajustada com pulsos de duração de 20-50μs e 3
a 50V de intensidade para produzir curvas de entrada-saída (I/O-“input -output
curves”). Nos estudos de LTP estes estímulos foram ajustados para causar 65%
da resposta máxima analisada através das curvas de entrada-saída. Um traço
controle foi registrado ao estímulo-teste, por cerca de 30 min., para que se
estabilizasse uma resposta basal. Para induzir o LTP, um estímulo de alta
freqüência (EAF) (200Hz) foi aplicado pelo mesmo eletrodo de estimulação.
Depois do EAF procedeu-se a um novo estímulo-teste e as respostas foram
registradas por 1h. Os sinais eletrofisiológicos foram amplificados através do
sistema AXOCLAMP-2 (Axon, Instruments, inc), digitalizados pelo sistema
DIGIDATA 1200 e gravados no computador pelo programa PCLAMP6 (figura 5A).
A média a cada quatro traços da curva de decaimento dos cPPEs versus tempo
pode ser observada no gráfico abaixo (figura 4A).
Figura 4: Respostas extracelulares típicas de CA1. A – registro representativo de
um potencial pós-sináptico excitatório (PPE): a- artefato de estímulo. b- descarga
das fibras, que corresponde ao número de fibras pré-sinápticas que estão sendo
ativadas. c- PPE. B – População de espículas: a – artefato de estímulo. b- PPE que
aparece invertido.
A
B
3
4
4
1
6
5
5
2
3
2
1
A
B
3
4
4
1
6
5
5
2
3
2
1
População de
espículas
b
a a
b
5ms
2 mV
c
AB
População de
espículas
b
a a
b
5ms
2 mV
c
AB
População de
espículas
b
a a
b
5ms
2 mV
c
AB
População de
espículas
b
a a
b
5ms
2 mV
c
AB
Registro intracelular
Para estudarmos as propriedades intrínsecas neuronais utilizamos a técnica
de registro intracelular (IC). Para isso, uma micropipeta com resistência de 80 MΩ
foi posicionada verticalmente à fatia hipocampal e baixada suavemente com o
auxílio de um micromanipulador de alta precisão (Huxley p-85, Sutter Instruments
Co). Pulsos longos retangulares de 200ms de corrente (0.4 nA), foram aplicados a
intervalos de 2 segundos através da micropipeta de registro. O sinal
eletrofisiológico assim como a mudança na resistência do tecido foram
continuamente monitorados através de um osciloscópio HM-205-3 (HAMEG, 20
MHz ). Este procedimento permite obter informações a respeito da distância entre
a ponta do eletrodo e a célula a ser registrada. Para introduzir o microeletrodo na
célula, foram induzidas pequenas vibrações na ponta do eletrodo utilizando um
circuito elétrico do amplificador Axoclamp – 2B (Axon Instruments, Inc) acoplado à
micropipeta, denominado Buzz, acompanhado por avanço simultâneo do
microeletrodo na direção vertical. Após penetração na célula, o potencial elétrico
(Vm) sofre uma descida brusca aos níveis do potencial de membrana da célula em
questão. Os registros IC, nos diferentes protocolos de estimulação iniciaram-se
10-15 minutos após a penetração. O circuito bridge no amplificador Axoclamp 2 B
Figura 5: Foto ilustrativa do equipamento de eletrofisiologia. A – (1) termorregulador da
câmara de registro, (2) osciloscópio, (3) AXOCLAMP-2B, (4) Master-8, (5) caixas
estimuladoras, (6) microcomputador com interface de digitalização e software para
aquisição e processamento do sinal. B – (1) câmara de registro (tipo interface), (2)
headstage para captação do sinal extracelular, (3) headstage para captação do sinal
intracelular, (4) eletrodo de estímulo, (5) fatia hipocampal posicionada para registro.
foi continuamente conferido e ajustado antes de cada medição do Vm. Isso
permite maior qualidade do sinal e evita mudanças artificiais no potencial de
membrana. Os neurônios foram identificados como células piramidais por
responderem a estimulação do alveus com espículas de curta latência. O método
eletrofisiológico de “fixação de corrente” (current clamp) foi utilizado para o registro
intracelular. Esse procedimento permite a injeção de corrente constante na célula
e o registro das variações do Vm em resposta a corrente injetada (AXON, 1993).
Para garantir uma menor margem de erro, o posicionamento dos eletrodos e
estimuladores foi realizado sob controle de estereomicroscopia (STEMI 200)
(objetiva de 0.4X, lentes de 0.65 a 5, Zeiss) na área a ser estudada, sendo que as
micropipetas foram direcionadas especificamente na camada piramidal da área
CA1. Só foram considerados válidos os registros estáveis por mais de 20 minutos,
com potencial de membrana maior que -55mv, resistência de entrada (R
n
) >
20MΩ, assim como PA com amplitude maior que 70 mV.
Medição das propriedades intrínsecas neuronais
O potencial de membrana em repouso foi medido 30 minutos após
penetração na célula, através do amplificador Axoclamp 2-B (Axon instruments).
Na análise dos parâmetros eletrofisiológicos do Potencial de Ação (PA)
verificamos os seguintes valores: limiar; amplitude; duração; potencial de
membrana no final do PA, potencial de repolarização, valor máximo dos pós-
potenciais de hiperpolarização. As células piramidais de CA1 foram classificadas
em três grupos de acordo com trabalhos anteriores com ratos (AZOUZ et al.,
1993; JENSEN et al., 1994; AZOUZ 1996; JENSEN et al. 1996). Para
classificarmos, observamos a resposta eletrofisiológica quando foram aplicados
pulsos de corrente despolarizante com duração de 200 ms e intensidade
crescente:
• Não-burster* (NB) células que geram PA simples e independentes que
apresentam acomodação como resposta a todos os estímulos de corrente
supralimiar.
• Buster de alto limiar (BAL), células que geram uma resposta em burst
somente em resposta a um estímulo supralimiar de alta intensidade.
• Burster de baixo limiar (BBL) células que respondem com um burst
qualquer estímulo supralimiar.
Este último grupo foi também dividido em 3 diferentes subgrupos de
sensibilidade crescente para gerar respostas em burst.
Grau I – células que disparam uma espícula simples em resposta a um
pulso de corrente despolarizante de curta duração (5ms).
Grau II – células que geram um burst em resposta a um estímulo curto.
Grau III – células que espontaneamente disparam burst de forma rítmica,
recorrente, na ausência de qualquer estímulo exógeno ou de transmissão
sináptica.
O burst de natureza intrínseca neuronal foi suprimido com a hiperpolarização da
membrana (injeção de corrente negativa).
Protocolos de Estimulação
Zero Magnésio (0 Mg
2+
)
As fatias foram banhadas com LCRa sem MgSO
4
durante 1h 40min., de
acordo com o protocolo descrito por Mody (1987). Curvas de entrada e saída
(input/output) das respostas foram feitas antes e após a retirada do íon. Para
verificarmos se a origem da atividade epileptiforme era somente por ativação de
receptores NMDA, adicionamos ao LCRa um antagonista (AP-5 – Tocris -
100µM).
Potássio alto
Utilizamos este protocolo aumentando as concentrações de KCl no banho
das fatias de acordo com trabalhos anteriores (KORN et al., 1987). Entretanto,
utilizamos concentrações mais baixas (5 e 7,5 mM) do que as observadas na
literatura devido a alta ocorrência de depressão alastrante em concentrações
maiores que estas.
Bicuculina
O estudo de inibição GABAérgica foi feito através da adição de bicuculina
10 µM (Sigma) no LCRa como descrito em trabalhos anteriores (CURTIS, 1971).
Em animais da espécie PG que não apresentaram atividade espontânea, a
concentração foi aumentada chegando até 30 µM.
Análise Estatística
A análise estatística para detectar as diferenças nas propriedades intrínsecas
ativas e passivas, parâmetros eletrofisiológicos do PPE e da população de
espículas, entre os grupos foi realizada pelo teste T de Student. Em todos os
testes fixou-se em 0,05 o nível de rejeição da hipótese de nulidade. Todos os
valores foram expressos como média ± desvio padrão. Valores significantes em
gráficos e tabelas foram assinalados com asteriscos.
Ética dos procedimentos experimentais
Os protocolos experimentais utilizados neste trabalho foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo/ Universidade Federal de São
Paulo, processo n. 0959/04.
* “Burst”: “trem,” “ surto” ou “explosão” de vários potenciais de ação ( PA) ou 3-15
espículas, de amplitude decrescente, disparadas em alta freqüência (80-200 Hz)
e que emergem geralmente de uma onda despolarizante lenta (de 20 a 100 ms
de duração) .
1. Registros Extracelulares
1.1. Respostas típicas de CA1
Respostas extracelulares ortodrômicas típicas de CA1 (população de
espículas) foram encontradas na espécie PG (figura 6B) com as mesmas
características já descritas em trabalhos originais com ratos Wistar
(SCHWARTZKROIN, 1975; 1977). A figura 6A mostra uma curva de entrada/saída
com estímulos de 20 a 50V. A amplitude da população de espículas na
estimulação máxima (50V) foi de - 6,10mV ±5,76 (n=16) não havendo diferenças
estatisticamente significantes em relação ao grupo Wistar (- 9,14mV ± 2,91)
(n=12).
Figura 6: A – Gráfico a média das curvas de E/S (entrada/saída) da espécie PG
(vermelho) e ratos Wistar (preto) com estímulos de 20 a 50 V. B – Respostas
ortodrômicas típicas do stratum piramidale de CA1 (população de espículas) nas
diferentes espécies.
P. guyannensis
Wistar
20V 50V25V 30V 40V35V 45V
5
4
3
2
1
8
7
6
9
A
m
p
l
i
t
u
d
e
(
m
V
)
5 ms
2 mV
A
B
P. guyannensis
Wistar
20V 50V25V 30V 40V35V 45V
5
4
3
2
1
8
7
6
9
A
m
p
l
i
t
u
d
e
(
m
V
)
5 ms
2 mV
A
B
O potencial pós-sináptico excitatório (PPE) invertido, característico das
respostas extracelulares, foi similar aos encontrados nos ratos Wistar após
estimulação da via colateral de Schaffer. O mesmo foi evocado com estímulos
baixos (10-25V) e teve amplitude média de -1,43mV ± 0,51 para o PG e -1,22mV
± 0,35 para os Wistar . Por outro lado, a duração do PPE na espécie PG foi
significantemente maior com 34,24± 6,35 ms (n=14) versus 24,23 ±1,69 (n=11)
(figura 7).
O limiar para o aparecimento da população de espículas em presença de
líquido cefalorraquiano artificial normal foi de 24V±5,65 nas fatias de PG e de 17,5
V±5,80 nas de Wistar, não sendo observadas diferenças significantes nesta
condição ou mesmo após exposição a altas concentrações de potássio (5mM;
7,5mM). Entretanto, frente a inibição GABAérgica em presença de bicuculina,
5 ms
2mV
P. guyannensis
Wi st a r
Figura 7: Traçados representativos dos potenciais pós-
sinápticos excitatórios invertidos. Na espécie P.
guyannensis observa-se uma duração
significantemente maior.
observamos uma diferença estatisticamente significante, com um limiar mais alto
no PG quando comparado àquele obtido em Wistar (figura 8).
1.2. Protocolo do Potássio Alto
No protocolo de elevação de potássio do meio extracelular, a espécie PG
não mostrou diferenças no aumento da amplitude da população de espículas na
concentração de 5mM. Entretanto, na concentração de 7,5mM houve um aumento
significante em relação aos ratos Wistar com o aparecimento de poli-espículas
(figura 9B). Um evento relevante foi o aparecimento de atividade espontânea
(figura 9C) em todas as fatias da espécie PG (tabela 1). Tal atividade apresentava
uma freqüência de 0,26 Hz similar à atividade epileptiforme interictal.
Limiar de Disparo
0
5
10
15
20
25
30
35
3,5 mM K 5 mM K 7,5 mM K Bic
P. guyannensis
Wistar
Figura 8: Limiar para o aparecimento da população de espículas
em diferentes concentrações de potássio (3,5; 5; 7,5 mM) ou
bicuculina (10µM).Observa-se uma diferença significante com a
perfusão do antagonista GABAérgico(*) (p<0,005)
*
*
3,5 mM [K
+
]5 mM [K
+
] 7,5 mM [K
+
]
Bicuculina(10μM)
P.guyannensis 0% 0% 100% 7,14%
Wistar 0% 0% 52,38% 100%
Figura 9: Respostas extracelulares frente ao protocolo do potássio alto. A -
Respostas nas concentrações normais de potássio (3,5mM) no LCRa. B - Após
15min. de perfusão de altas concentrações de potássio (7,5 mM) note o aumento do
número de espículas na espécie PG, ao passo que nos ratos Wistar verificamos
apenas um discreto aumento . C - atividade espontânea observada em PG com
perfusão de 7,5 mM de potássio.
2 s
1 mV
50 ms
5 ms
2 mV
Ratos Wistar
Proechimys guyannensis
(A)
LCRa normal
(B)
7,5 mM [K ]
+
(C)
1.3. Efeitos da Inibição GABAérgica ( protocolo da Bicuculina)
O bloqueio de mecanismos inibitórios Gabaérgicos (bicuculina 10 µM) foi
significantemente menor na promoção do aumento de excitabilidade em fatias da
espécie P. guyannensis (figura 10B). O tempo de perfusão de bicuculina foi maior
(30 min.) para que houvesse hiperexcitabilidade, sendo observado somente uma
espícula subseqüente após a população de espículas (figura 10Ab). Ao contrário,
os ratos Wistar mostraram ser extremamente sensíveis, apresentando múltiplas
espículas como já descrito anteriormente (figura 10Ab). Atividade espontânea
esteve presente em 100% (n=13) das fatias hipocampais de ratos Wistar versus
7,14% naquelas da espécie PG (tabela 1). As fatias de PG expostas a maiores
concentrações de bicuculina (até 30 μM) apresentaram, após 15min. de perfusão,
o fenômeno de depressão alastrante, mas ainda assim não foi observada
atividade espontânea.
Tabela 1: Porcentagem dos grupos de animais que obtiveram atividade espontânea em
diferentes concentrações de potássio ou bicuculina (10 μM)
P. guyannensis Wistar
LCRa nor mal
(a)
Bicuculina 10μM
(b)
2 mV
5 ms
A
m
p
l
i
t
u
d
e
d
a
p
o
p
u
l
a
ç
ã
o
d
e
e
s
p
í
c
u
l
a
s
(
%
d
o
c
o
n
t
r
o
l
e
)
Bicuculina
50
100
150
*
P. guy annensis
Wistar
A
B
P. guyannensis Wistar
LCRa nor mal
(a)
Bicuculina 10μM
(b)
2 mV
5 ms
A
m
p
l
i
t
u
d
e
d
a
p
o
p
u
l
a
ç
ã
o
d
e
e
s
p
í
c
u
l
a
s
(
%
d
o
c
o
n
t
r
o
l
e
)
Bicuculina
50
100
150
*
P. guy annensis
Wistar
P. guy annensis
Wistar
A
B
1.4. Respostas glutamatérgicas (protocolos do 0 Mg
2+
)
O efeito da retirada do íon magnésio foi estudado em fatias hipocampais da
espécie P.guyannensis (n=12). Após 1h. e 40 min. de perfusão do LCRa sem
magnésio verificamos uma diminuição no limiar para o aparecimento da população
de espículas além de várias espículas subseqüentes, um sinal característico de
hiperexcitabilidade (figura 11B). Não observamos a ocorrência de atividade
espontânea em nenhum experimento, entretanto, as fatias apresentaram o
fenômeno de depressão alastrante, havendo uma recuperação da resposta 15
min. após o evento. A aplicação de AP-5 (50µM) resultou em um bloqueio total da
atividade epileptiforme em 9 experimentos (n=12) (figura 11C).
As fatias hipocampais dos ratos Wistar apresentaram respostas semelhante às
encontradas na espécie PG, a não ser pela ocorrência de atividade espontânea
em 10 experimentos (n=11). As respostas obtidas no Wistar foram semelhantes
àquelas observadas em estudos anteriores (MODY, 1987)
Figura 10: Efeitos da Inibição GABAérgica na espécie PG e no rato Wistar. A –(a) População
de espículas com LCRa normal em ambas espécies . (b) Note que a espécie PG responde a
bicuculina (10μM) somente com uma espícula subseqüente. B -O gráfico mostra que a
amplitude da população de espículas foi significantemente menor na espécie P. guyannensis
(
*
)
(p
<0
,
05
)
.
1.5 Estudo da potenciação de longo prazo (PLP) LTP.
Figura 11: Respostas extracelulares frente ao protocolo do 0 magnésio na espécie P.
guyannensis. A – resposta em concentrações normais de magnésio. B – Note o
aparecimento de múltiplas espículas após 1h 40 min sem magnésio. C – a
hiperexcitabilidade é totalmente bloqueada após 20min de perfusão de AP-5 (50μM)
.
5 ms
2mV
20 ms
LCRa normal
LCRa sem Magnésio
LCRa sem Magnésio + AP -5
(A)
(B)
(C)
5 ms
2mV
20 ms
LCRa normal
LCRa sem Magnésio
LCRa sem Magnésio + AP -5
(A)
(B)
(C)
Potenciais pós-sinápticos excitatórios utilizados para o estudo de
potenciação a longo prazo foram captados no stratum radiatum após estimulação
das fibras colaterais de Schaffer e apresentaram as mesmas características vistas
em ratos de laboratório, com exceção da duração que foi maior na espécie PG
como observado no PPE invertido. Não encontramos diferenças nas respostas
com estímulo-teste e a intensidade do estímulo foi em média 16V ±2.29.
Entretanto, verificamos que potenciação na espécie PG foi significante menor em
três tempos (2 min, 60 min, 90 min) após o estímulo de alta freqüência (EAF)
(figura 12)
A aplicação do protocolo de potenciação a longo prazo mostrou que este
fenômeno em CA1, apesar de estar presente na espécie PG, é significantemente
menor em comparação àquele observado nos ratos Wistar
0
0,5
1
1,5
2
2,5
- 2min 2min 60 min 90min
Declive normalizado do PPE de campo
(mV/ms)
Wistar
Proechimys
*
*
*
200 Hz
stimulus
0
0,5
1
1,5
2
2,5
- 2min 2min 60 min 90min
Declive normalizado do PPE de campo
(mV/ms)
Wistar
Proechimys
*
*
*
200 Hz
stimulus
Figura 12: Análise eletrofisiológica da plasticidade sináptica de CA1 em ratos Wistar
e P. guyannensis. A comparação entre os grupos revelam uma acentuada redução
na média dos declives de 2, 60 e 90 minutos após o estímulo de alta freqüência em
fatias de Proechimys (barras vermelhas) comparado com os ratos Wistar (barras
azuis). Acima observamos traços representativos dos PPE nos diferentes tempos. *
2. Registros Intracelulares
Propriedades intrínsecas neuronais (ativas e passivas) de células piramidais na
espécie P. guyannensis
Foi feita a análise das propriedades intrínsecas neuronais de CA1 na
espécie P.guyannensis (18 neurônios) e nos ratos Wistar (16 neurônios) (tabela
2). A espécie PG mostrou ser significantemente diferente com relação aos valores
do PA. O potencial de membrana mostrou-se mais eletronegativo chegando, em
média, ao valor de -75,50 mV ± 2,26. O limiar o para disparo do PA foi de -35,72
mV ± 3,35 mostrando que a células necessitam de um nível de despolarização
maior para a ocorrência do PA (figura 13A). Não foi possível detectar diferenças
significantes nos pós-potenciais hiperpolarizantes (figura 13 A e B) ou
despolarizantes.
Após injetarmos pulsos de corrente despolarizante verificamos que 100%
dos neurônios (n=18) da espécie PG comportavam-se, de acordo com a
classificação de Jansen et al, 1994, como não-bursters (NB), gerando PAs simples
e independentes, apresentando acomodação como resposta à estímulos
supralimiares (figura 13C). Nos ratos Wistar (n=16) encontramos 12,5% de
neurônios burst de alto limiar e 87,5% com comportamento não burster (figura 14).
Propriedade intrínseca P.guyannensis Wistar
PMR (mV)
-75,50 ± 2,26 * -65,85 ± 2,45
Limiar de disparo (mV)
-35,72 ± 3,35 * -55,83 ± 2,42
Amplitude do PA (mV)
80,08± 5,46 * 84,66± 4,34
Duração do PA (ms)
2,85 ± 0,49 * 2,41 ± 0,43
PPH rápido (mV)
-47,72 ± 4,02 -50,77 ± 6,55
PPH intermédio (mV)
-2,80 ±0,63 -3,41 ± 0,67
PPD amplitude (mV)
-51,85 ± 8,13 -53,86 ± 8,58
PPD duração (ms)
45,72 ± 7,53 43,75 ±7,34
Tabela 2: Análise comparativa das principais propriedades intrínsecas das células
Piramidais de CA1 nas duas espécies. Dados representados como média ± desvio
padrão. (*) p<0.05. (PA) Potencial de ação (PPH) pós-potencial hiperpolarizante
(PPD) pós-potencial despolarizante.
A
B
b
A
B
b
Figura 13: Registros intracelulares representativos de neurônios da espécie P.
guyannnensis mostrando suas principais propriedades intrínsecas. A. (a) limiar de disparo
(-35,72 mV ± 3,35); (b)amplitude máxima do PA (80,08mV± 5,46); (c) início do PPH
rápido(-47,72 mV ± 4,02); (d) ponto máximo do PPD (-51,85mV± 8,13); (e) final do PPD
(45,72ms ± 7,53). B. (a) pós-potencial hiperpolarizante intermédio após vários disparos de
PA frente a um pulso de corrente despolarizante (diferença entre Potencial de membrana
e “a”= -2,80 mV ± 0,63).C. Mostra um PA simples (neurônio não-burster) frente a um pulso
de corrente despolarizante
P. guyannensis
NB
100%
BAL
0%
BBL
0%
NB
BAL
BBL
Wistar
NB
87%
BAL
13%
BBL
0%
P. guyannensis
NB
100%
BAL
0%
BBL
0%
NB
100%
BAL
0%
BBL
0%
NB
BAL
BBL
NB
BAL
BBL
Wistar
NB
87%
BAL
13%
BBL
0%
NB
87%
BAL
13%
BBL
0%
Nossos resultados mostram que a espécie Proechimys guyannensis
apresenta inúmeras diferenças quer das propriedades intrínsecas neuronais, quer
da relação da neurotransmissão excitatória e inibitória, ou dos mecanismos de
potenciação sináptica quando comparada ao rato Wistar.
A análise dos parâmetros eletrofisiológicos intrínsecos em células de CA1
da espécie P. guyannensis mostrou diferenças significativas nas propriedades
passivas neuronais (potencial de membrana em repouso, limiar de disparo,
Figura 14: Gráfico mostrando os subtipos de neurônios encontrados em CA1 de
ambas espécies. (NB) não- burster; (BAL) burster de alto limiar ( BBL); burster de
baixo limiar.
amplitude do PA, duração do PA). O estudo do limiar de disparo de um único
neurônio (registro intracelular) mostrou ser mais alto na espécie PG. Como
sabemos, o limiar de disparo de um neurônio representa o nível do potencial de
despolarização necessário para a abertura de canais iônicos dependentes de
voltagem, resultando em um potencial de ação. A gênese e a propagação do
potencial de ação tanto nos vertebrados como nos invertebrados resultam da
atividade de correntes de sódio. Os estudos clássicos de Hodgkin e Huxley na
década de 30 demonstraram que potencial de ação se dá por um influxo de
corrente seguido de um efluxo, e que essas correntes fluiriam por canais
dependentes de voltagem presentes na membrana (HODGKIN & HUXLEY, 1939).
Esse mecanismo parece ser universal para todas as espécies animais. Entretanto,
diferenças dos canais iônicos entre as espécies, como por exemplo, no PG,
poderiam trazer conseqüências importantes para a excitabilidade da membrana.
No hipocampo existem basicamente duas correntes de sódio: a corrente rápida de
Na
+
(I
Na.r
) e a corrente persistente (“slow inactivating”) de Na
+
(I
Na.p
). A I
Na.r
registrada em células piramidais de CA1 comporta-se como uma corrente
convencional (voltagem-dependente) tipo “Hodgkin-Huxley”, com um limiar de
ativação de –55 a 60 mV, um tempo de ativação máxima (“time-to-peak”) de
aproximadamente 0.9 ms (SAH, GIBB,GAGE, 1988) e é sensível ao bloqueio por
tetrodotoxina (TTX). Essa corrente foi descrita no soma e nas terminações
dendríticas, não existindo grandes diferenças entre ambas as localizações
(ANDREASEN & LAMBERT, 1995). A função básica da I
Na.r
é a gênese e
propagação do potencial de ação (HILLE,1992). A I
Na.p
está composta por uma
condutância de Na
+
sensível à TTX (FRENCH et al., 1990) e outra resistente
(HOEHN et al, 1993). Essas correntes têm limiar de ativação de aproximadamente
5-10 mV mais positivos em relação ao potencial de membrana em repouso (PMR),
e mantém-se por longo tempo após ser ativada por pulsos despolarizantes
sublimiares, sendo por isso conhecida como corrente sublimiar de Na
+
(“subthreshold Na
+
current” ou “não inativada”) (FRENCH & GAGE, 1985;
ALZHEIMER, SCHWINDT, CRILL, 1993). Potenciais despolarizantes podem ativar
a I
Na.p
influenciando de forma potente a excitabilidade neuronal (MACVICAR,
1985). Ainda persiste a controvérsia se as correntes I
Na
.r e I
Na
.p, são mediadas por
diferentes populações de canais de Na+, com diferentes propriedades na cinética
de abertura/fechamento (“gating”) (MASUKAWA, HANSEN, SHEPHERD, 1991) ou
se por uma mesma população uniforme de canais de Na+ porém, com capacidade
de alternar diferentes modos de funcionamento (ALZHEIMER, SCHWINDT,
CRILL, 1993). Na espécie PG, verificamos que as propriedades elétricas
neuronais (ex. limiar de disparo) comportam-se de maneira distinta, o que talvez
torne suas células menos excitáveis.
Outro resultado relevante em nosso estudo foi quanto ao tipo de disparo
neuronal observado nos neurônios da região CA1 hipocampal na espécie PG,
onde apenas células não burster foram encontradas. Em células hipocampais de
CA1 (AZOUZ, JENSEN, YAARI, 1996; JENSEN, AZOUZ, YAARI, 1996) e nas
neocorticais, a gênese do burst endógeno é mediada por I
Na
.
p
, (LANTHORN,
STORM, ANDERSEN, 1984; ALKADHI & TIAN, 1996 STAFSTROM et al., 1985),
que também tem sido associada à gênese de atividade epileptiforme no
hipocampo (KONNERTH, HEINEMANN, YAARI, 1984; SEGAL, 1994). Trabalhos
sugerem que a I
Na.p
participa na transformação de neurônios hipocampais não
burster em burster em determinadas condições (ex: alto potássio) (JENSEN,
AZOUZ, YAARI, 1992; AZOUZ, JENSEN, YAARI, 1993). Células burst de alto e
baixo limiar, que não foram encontradas na espécie PG, parecem estar em maior
número no tecido epiléptico (SANABRIA, 1999). Trabalhos recentes demonstram
que a I
Na
.
p
, que ocorre nos dendritos, participa da gênese do burst (ANDREASEN
& LAMBERT, 1995) e da amplificação dos pós-potenciais pós-sinápticos
excitatórios (PPE) (LIPOWSKY, GILLESSEN, ALZHEIMER, 1996; SCHWINDT &
CRILL, 1995). Modificações na cinética destas correntes na espécie P.
guyannensis poderiam explicar suas alterações para o limiar de disparo do PA, o
que seria um indicativo adicional de sua baixa epileptogenicidade.
Além disso, o limiar para o aparecimento da população de espículas (PE)
foi maior na espécie PG do que aquele observado em ratos Wistar. Potenciais de
campo extracelulares podem ser captados em diversos pontos de fatias cerebrais
mantidas in vitro. Em fatias de hipocampo, diferentes posições do eletrodo de
registro e estimulação resultam em respostas bem características (SELIG, 1997).
Uma destas respostas, a população de espículas (population spike) (PE) na região
CA1 do hipocampo, corresponde ao número de neurônios piramidais que
disparam potenciais de ação sincronicamente frente à estimulação das fibras
colaterais de Schaffer. Estudos em fatias cerebrais de animais epilépticos
crônicos mostraram uma amplitude menor da PE na região CA1 em relação ao
controle (SANABRIA, 1999). Este achado reforça a idéia que a amplitude do PE
está diretamente ligada à quantidade de células que estão disparando, uma vez
que estes animais têm uma perda significante de neurônios nesta região. As fatias
hipocampais da espécie PG não mostraram diferenças significantes na amplitude
do PE, entretanto, o limiar para o aparecimento desta foi mais alto, sendo
necessário uma intensidade de estímulo maior. Este resultado corrobora aqueles
obtidos com o registro intracelular, onde o limiar para o disparo do potencial de
ação de uma única célula também se mostrou maior em relação ao observado nos
ratos Wistar. Nossos resultados corroboram aqueles obtidos por Carvalho e col.
(2003), em que PG submetidos ao modelo de epilepsia por estimulação elétrica
(modelo do abrasamento – Kindling) apresentaram um alto limiar para as pós-
descargas e uma longa duração destas. Além disso, mostrou que foram
necessárias muito mais estimulações para que a espécie alcançasse o estadio 5
em comparação com os ratos Wistar. Vários estudos têm demonstrado que no
modelo do Kindling o limiar e a duração das pós-descargas podem indicar
susceptibilidade à atividade epiléptica local. Le Gal La Salle (1981) analisou a
relação entre o limiar e duração das pós-descargas, sugerindo que quanto maior o
limiar, mais curta é a duração da pós-descarga. Assim, os resultados observados
por Carvalho (2003) de um limiar mais alto para a estimulação amigdaliana na
espécie PG (comparativamente aos ratos Wistar) poderiam ser justificados pelo
alto limiar para a obtenção de potenciais de ação (PA) e de campo (PE) obtidos
neste trabalho.
O papel do potássio extracelular na geração de descargas epileptiformes
vem sendo bastante discutido (FISHER et al, 1976;HEINEMANN et al,
1977;SOMJEN, 1979). Alguns dos possíveis mecanismos excitatórios resultantes
da elevação do potássio extracelular incluem a redução da força eletromotiva, a
diminuição da ação dos receptores GABAérgicos e o encolhimento do espaço
extracelular devido ao aumento do volume e do número das células gliais
(MCBAIN et al, 1993). Estudos in vitro utilizam o modelo do potássio alto para a
investigação do aumento da excitabilidade neuronal e, uma das vantagens deste
modelo, é a possibilidade de verificar atividade epileptiforme sem manipulações
farmacológicas (ex., antagonistas GABAérgicos). A espécie PG mostrou ser
extremamente sensível à elevação dos níveis de potássio no LCRa, sugerindo que
a dinâmica deste íon, bem como a cinética das correntes, comportam-se de
maneira diferente nesta espécie. Diversas correntes de potássio têm sido
descritas em células hipocampais (STORM, 1990; BROWN et al., 1990). O
comportamento destas correntes difere de acordo com as subunidades dos canais
por onde estas correntes fluem. De uma maneira geral, as principais funções das
correntes de K
+
hipocampais são: ativação rápida para participar na repolarização
após potenciais de ação (STORM, 1987); regulação da excitabilidade neuronal
(SEGAL, et al, 1984); retardo no disparo do potencial de ação induzido após a
despolarização limiar, desde o potencial de membrana em repouso (PMR) (HILLE,
1992); e ainda, a participação na gênese de pós-potenciais hiperpolarizantes
rápidos (PPH
R
) e intermédio (PPH
I
) (STORM, 1988; STORM, 1989). Um outro tipo
de corrente de K
+
, especificamente ativada pelo Ca
2+
intracelular (I
C
), tem sido
identificado em células piramidais do hipocampo (BROWN et al., 1990). Essa
corrente é fortemente ativada durante um potencial de ação simples e contribui
para a repolarização e gênese do PPH
R
(STORM, 1987; SAH & MCLACHLAN,
1992). Nas células piramidais do hipocampo está presente outra corrente K+
dependente de Ca
2+
,
que possui cinética muito mais lenta que a I
C
e participa na
gênese do pós-potencial hiperpolarizante lento (PPH
L
) e PPH
I
) (“slow
afterhyperpolarization” - AHP), pelo que tem sido representada como I
AHP
.
(LANCASTER & ADAMS, 1986). A cinética destas correntes ainda não foi descrita
na espécie PG. Possíveis alterações destas explicariam a susceptibilidade às altas
concentrações de potássio como vimos neste trabalho. Um estudo aprofundado
dos canais de potássio nesta espécie, através de técnicas de patch clamp, será
necessário para elucidar tal comportamento.
A aplicação de bicuculina (10 μM), um potente bloqueador de receptores
GABA
A
em fatias de PG não promoveu o aparecimento de atividade epileptiforme
como a verificada nos ratos Wistar e em outros modelos de crise in vitro
(SCANZIANI, 1994; DUPORT, 1997; STOPPINI, 1997). Como sabemos, o número
e a eficácia das sinapses GABAérgicas devem ser precisamente ajustadas para
que se obtenha um controle adequado da atividade excitatória, e este controle, no
hipocampo, é devido a liberação de GABA por interneurônios (FREUND, et al,
1996). Estudos quantitativos têm demonstrado um aumento ou redução no
número de agrupamentos de receptores GABA
A
provocados pela atividade neural
(MARTY, 2004). Possivelmente, a densidade e a distribuição destes receptores
sejam diferentes na espécie PG promovendo resistência a um bloqueio
GABAérgico. Estudo prévio em nosso laboratório mostrou uma abundância de
corpos celulares GABAérgicos, de diversas formas e tamanhos, com distinta
distribuição por todo hipocampo do PG (FABENE et al., 2001) e poderia ser a
base para os resultados aqui obtidos.
As repostas excitatórias pós-sinápticas mediadas por receptores NMDA,
uma subclasse de receptores de glutamato, mostram ser voltagem-dependentes,
(AULT, 1980; NOWACK, 1984). Uma despolarização da membrana suficiente faz
com que o íon magnésio, que obstrui o canal do receptor durante o repouso, seja
expelido e assim há uma entrada maciça de cálcio pelo canal do receptor. No
protocolo do zero magnésio (Zero Mg
2+
), este íon é retirado do LCRa,
promovendo uma hiperexcitabilidade, principalmente por ativação dos receptores
NMDA. Outros mecanismos foram propostos para o aumento da excitabilidade na
ausência deste íon, como o decréscimo da carga de superfície da membrana
(FRANKENHAEUSER et al, 1959; LLINÁS et al, 1980; MAYER et al, 1984) e,
também, a ativação de correntes de entrada de Ca
2+
(inward currents), uma vez
que o magnésio participa do bloqueio destas. A espécie PG mostrou-se sensível à
retirada do íon, apresentando uma diminuição no limiar para o aparecimento da
população de espículas e uma atividade epileptiforme evocada com estímulos
elétricos. Esta hiperexcitabilidade no PG parece também estar relacionada com
ativação de receptores NMDA, uma vez que ao aplicar um antagonista (AP-5)
destes receptores, houve uma redução desta excitação. Estes resultados são
semelhantes aos encontrados em ratos Wistar (MODY, 1987). Entretanto, não
verificamos na espécie PG o aparecimento de atividade espontânea, tal como
observado nos ratos Wistar. Esse tipo de atividade em CA1 com liquor sem Mg
2+
pode ser gerada por neurônios marca-passo de CA3 sendo esta propagada pelas
colaterais de Schaffer (MODY,1987). Esta atividade síncrona e repetitiva de CA3
representa as verdadeiras descargas interictais, pois consiste na atividade de uma
população de células produzida por um fenômeno intracelular conhecido como
despolarização paroxística da membrana (Paroxymal Depolarization Shift – PDS)
(GOLDENSOHN, 1963; MATSUMOTO, 1964). Em contraste, os eventos
espontâneos de CA1 não são causados por PDSs, mas sim por potenciais pós-
sinápticos excitatórios/ inibitórios. Estudos recentes em nosso laboratório têm
mostrado que no PG ocorre uma grande ativação de interneurônios inibitórios do
Corno de Ammon após a indução de status epilepticus por injeção de pilocarpina
(FABENE et al, 2004), demonstrando um possível mecanismo endógeno que
protegeria o hipocampo de descargas anormais. Em conjunto, esses dados
parecem sugerir que a supressão da atividade espontânea em CA1 na espécie PG
pode estar relacionada com uma intensa ação destes interneurônios GABAérgicos
sobre as sinapses desta região.
Quanto à plasticidade sináptica, nossos estudos demonstram que o PG
apresenta uma menor resposta à aplicação do protocolo da potenciação de longo
prazo. A LTP (long-term potentiation; ou Potenciação de Longo Prazo, PLP)
consiste na estimulação de alta freqüência de sistemas de fibras do hipocampo de
mamíferos resultando no aumento semipermanente da eficácia sináptica. Este
efeito tem sido considerado como um potente substrato para a memória devido a
seu rápido início e extrema persistência. Sua realização em fatias cerebrais tem
mostrado várias vantagens: o tecido pode ser facilmente preparado com uma
rápida recuperação para iniciar o seu registro; tem-se uma ótima visibilidade das
estruturas a serem estudadas; e uma grande área dos sistemas de fibras e
campos sinápticos pode ser registrada/estimulada nas fatias (LYNCH, 1980). Nas
fatias de PG encontramos as mesmas vantagens, sem nenhuma outra dificuldade
técnica. Na LTP dependente de receptores NMDA, os níveis aumentados de cálcio
intracelular nos neurônios de CA1 são essenciais (CHITTAJALLU, 1998; LYNCH,
1983; MALENKA, 1999; MALENKA, 1989). O influxo de cálcio através dos canais
dos receptores NMDA pós-sinápticos promovem o primeiro passo para a indução
da LTP (BASHIR, 1991; COLLINGRIDGE, 1983; HARRIS, 1984). Ao mesmo
tempo, há um influxo de Ca
2+
através de canais de Ca
2+
dependentes de voltagem
de alto limiar (CAVUS, 1996; GROVER, 1998; GROVER, 1990). Ainda, a ativação
de receptores metabotrópicos de glutamato pode levar a uma liberação dos
estoques de cálcio intracelular, podendo agir como um potencializador da LTP
(BASHIR, 1993; WILSCH, 1998). O cálcio, por sua vez, dentro da célula ativará
diversas proteínas cinases dependentes de cálcio que promoverão a manutenção
desta potencialização sináptica. Esta primeira fase da LTP é conhecida como fase
precoce (early LTP) e pode durar vária horas nos experimentos in vitro (BLISS et
al,1993). Uma segunda fase da LTP, conhecida como fase tardia (late LTP),
dependerá da transcrição de novos genes e síntese de novas proteínas (KANDEL,
2001). Na espécie PG verificamos a fase precoce da LTP que, inicialmente,
depende de uma ativação de receptores NMDA, e observamos que este fenômeno
foi menos significante em comparação com aquele observado nos ratos Wistar.
Desta observação, podemos inferir que estes receptores estejam em menor
número nesta espécie promovendo respostas significantemente menores. Esta
idéia contribuiria para a explicação de um mecanismo antiepileptogênico, uma vez
que vários trabalhos têm sugerido um aumento exagerado de receptores pós-
sinápticos glutamatérgicos no tecido epiléptico (SLOVITER, 1991; BABB, 1993;
MATHERN, 1996, 1997). Além desse aumento, aberrações funcionais que
poderiam ser originadas por alterações na composição estrutural dos mesmos
(MORIMOTO et al, 1992; JENSEN, 1997), mudanças nas propriedades biofísicas
dos receptores NMDA e AMPA (KOHR et al, 1993; ISOKAWA, 1991; URBAN et al,
1990), aumento da sensibilidade de neurônios à aplicação de NMDA (MARTIN et
al, 1992) e alterações plásticas nos receptores NMDA e AMPA, têm sido
propostos no curso da ELT experimental (BERNARD et al, 1995).
Portanto, mudanças na distribuição ou mesmo na densidade dos receptores
NMDA e GABA
A
de neurônios da formação hipocampal da espécie PG, poderiam
explicar a menor excitabilidade observada frente aos protocolos de estimulação (0
Mg
2+
, Bicuculina) ou até mesmo sua menor potencialização sináptica frente ao
protocolo da LTP. Um futuro estudo imunohistoquímico nesta espécie será
necessário para observarmos a distribuição e densidade destes receptores,
abrindo luz a um possível mecanismo antiepileptogênico.
Com os nossos resultados podemos concluir que:
• A espécie PG mostrou significantes diferenças nas propriedades intrínsecas
neuronais, como um maior limiar para o potencial de ação. Estas diferenças
podem ser devido a uma cinética diferente de correntes iônicas,
principalmente as de sódio.
• A espécie PG mostrou ser extremamente sensível à elevação dos níveis de
potássio no LCRa, sugerindo que a dinâmica deste íon comporta-se de
maneira diferente nesta espécie, bem como a cinética das correntes
envolvidas .
• A espécie P. guyannensis é menos susceptível ao protocolo de bloqueio
GABAérgico, indicando uma funcionalidade distinta deste sistema daquela
observada nos ratos Wistar.
• A espécie P. guyannensis mostrou um comportamento semelhante aos
ratos Wistar no protocolo 0 Magnésio. Entretanto, não foi observada
atividade espontânea, o que pode estar relacionado com uma distribuição/
densidade de receptores NMDA diferente da observada nos ratos Wistar.
• No protocolo da LTP, estes animais obtiveram uma potencialização
significamente menor, demonstrando que os receptores NMDA comportam-
se diferentemente, uma vez que a participação destes receptores neste
fenômeno é de crucial importância.
Em suma, podemos concluir que a organização da circuitaria hippocampal no PG
é funcionalmente diferente da observada nos ratos Wistar, o que pode explicar sua
resistência e proteção contra a epileptogênese.
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Proechimys guyannensis (PG) or Casiragua, a rodent popularly known in
north region of Brazil (Amazonian Rain Forest), belongs to the Hystricomorpha
suborder, Echimyidae family and Proechimys genre. Although this animal has been
frequently used in ecological studies, little is known about its brain organization.
Our laboratory has demonstrated that PG is very resistant to experimental models
of epilepsy such as the pilocarpine model. The status epilepticus induced by
pilocarpine lasts approximately 2 hours in PG and spontaneous seizures in the
chronic period of the model is not observed. Also, with the protocol of
intrahippocampal kainic acid administration, spontaneous recurrent seizures were
never observed even during a long period of observation (120 days). From 43 PG
animals submitted to amygdala kindling, only 3 reached the stage 5 of Racine.
Altogether, these findings suggest that PG brain could have endogenous
anticonvulsant mechanisms thus constituting a model of resistance to
epileptogenic induction. Based on this aspect, we found interesting to look at the
eletrophysiological in vitro properties of the hippocampal circuitry with protocols of
hiperexcitability and LTP in order to understand the possible underlying
mechanisms for this resistance to epileptogenicity.
Typical evoked orthodromic field potentials (population spikes) were found in
CA1 of PG. These extracellular responses showed the same characteristics widely
reported in other rodent species. However, higher threshold for population spike
(PS) appearance was observed. In agreement with this finding, invasive
intracellular somata recordings showed a higher threshold to action potential firing
when compared to Wistar rats. Our results also showed that PG was less
susceptible to the GABAergic blockade by bicuculine (rare single recurrent spike).
In addition, no spontaneous activity could be recorded. Although the PS
characteristics were similar to those observed in Wistar, no spontaneous activity
was observed in the 0 Mg
2+
protocol. Regarding LTP, although the protocol have
induced successfully a potentiation in extracellular potential recorded in PG, the
response reached an amplitude significantly less expressive than that observed in
Wistar rats
Taken together our results suggest that PG has a hippocampal
circuitry functionally different from Wistar rat. This may be due to a
different distribution and/or density of glutamatergic and GABAergic
receptors or to differences in their currents kinetics.
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