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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
ILIANI BIANCHI
ESTUDO DO VÍRUS INFLUENZA A EM AVES MIGRATÓRIAS E RESIDENTES NO
NORTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL, NO PERÍODO DE 2004-
2007.
Campos dos Goytacazes – RJ
2008
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ILIANI BIANCHI
ESTUDO DO VÍRUS INFLUENZA A EM AVES MIGRATÓRIAS E RESIDENTES NO
NORTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL, NO PERÍODO DE 2004-
2007.
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito
parcial para obtenção do grau de doutor em
Produção Animal, na área de concentração
de Sanidade Animal.
ORIENTADOR: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos
Campos dos Goytacazes - RJ
2008
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ILIANI BIANCHI
ESTUDO DO VÍRUS INFLUENZA A EM AVES MIGRATÓRIAS E RESIDENTES NO
NORTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL, NO PERÍODO DE 2004-
2007.
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito
parcial para obtenção do grau de doutor em
Produção Animal, na área de concentração
de Sanidade Animal.
Aprovada em 26 de março de 2008.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Cláudio de Moraes Andrade (Doutor, Microbiologia) – PESAGRO/RJ
Prof. Claudio Baptista de Carvalho (Doutor, Clínica Veterinária) – UENF
Prof. Ronaldo Novelli (Doutor, Ciências Ambientais) - UENF
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor Microbiologia) – UENF
(Orientador)
À minha mãe, minha irmã e minha sobrinha.
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que é minha fortaleza e esteve ao meu lado durante esses anos;
À minha mãe Carmorina Bonfá, que me ensinou a buscar Deus, a ser firme nas
decisões e buscar sempre o amor;
A Ivânea, uma irmã protetora que me estraga com seus mimos e que me presenteou
com uma florzinha que acaba de nascer Bianca;
Aos meus irmãos Ildefonso, Inácio e Ildeberto, que estão sempre preocupados
querendo saber de tudo o que está acontecendo e que me passam muita segurança;
A uma grande amiga de todas as horas, que amo muito: Giselda;
Aos meus amigos do Grupo de Oração Universitário, Cristiana (Cris), Edenilson
(Denis Pimentinha), Anna Rosa (Anita), Marcos Fabio, Juscelina (Juscy), Liliana
(Lili), Juliana (Xulé), Diogo (Dioguito), Elber (Elbinho), Adilson e outros que não
estão citados aqui, mas que foram fundamentais também para a construção desse
projeto;
Ao professor Carlos Eurico que sempre esteve presente nas inúmeras saídas a
campo, muito obrigada por esses seis anos de orientação;
Ao meu co-orientador professor Novelli pelo grande incentivo e por me ensinar tudo
sobre as aves marinhas;
Ao professor Cláudio Andrade pelos ensinamentos das técnicas virológicas e pelo
grande incentivo e ajuda para realizar essa pesquisa;
Ao professor Cláudio Baptista;
Ao grande amigo e co-orientador professor Leonardo Serafim, obrigada pelo
incentivo de todas as horas;
Aos técnicos do Laboratório de Sanidade Animal, Gina (mais uma incentivadora),
Luciana Lemos e Claudia;
A Luz Alba e Gabrielle pelo acolhimento e ensinamento nas técnicas virológicas;
Aos amigos de pós, Francimar (um dia eu chego lá), André, Inarei, Alessa, Giliana,
Aline e Tiago;
A Etiene, Jovana e meninas da biblioteca, muito obrigada;
A todos que não mencionei o nome, mas foram fundamentais para a execução deste
trabalho;
A CAPES, IBAMA-CEMAVE e UENF.
“Deus perdoa sempre,
o ser humano às vezes,
a natureza nunca.”
RESUMO
Estudo do vírus influenza A em aves migratórias e residentes no Norte do
Estado do Rio de Janeiro, Brasil, no período de 2004-2007.
A influenza aviária é uma doença causada pelo vírus influenza A da família
Orthomyxoviridae e é distribuída mundialmente. Aves silvestres são os reservatórios
naturais do vírus. O objetivo deste estudo foi monitorar a circulação do vírus
influenza A em aves costeiras migratórias e residentes, capturadas em redes
ornitológicas no Norte do Estado do Rio de Janeiro. Paralelamente foi realizada a
biometria e anilhamento de cada ave capturada. As 342 amostras fecais coletadas
foram inoculadas na cavidade alantóide de ovos embrionados de 9 a 11 dias. O
líquido alantóico foi testado para a presença de vírus hemaglutinantes pelo teste de
hemaglutinação. Das 342 amostras analisadas, 39 foram positivas para o teste de
hemaglutinação. Essas amostras foram submetidas ao RT-PCR e todas foram
negativas para o vírus influenza A. Apesar dos resultados negativos é necessário o
monitoramento constante de aves migratórias a fim de realizar uma vigilância
epidemiológica para o vírus influenza.
Palavras Chave: vírus influenza, aves migratórias, aves residentes, teste de
hemaglutinação, RT-PCR.
ABSTRACT
Research of influenza A virus in migratory birds and resident in northem state
of Rio de Janeiro, Brazil in 2004-2007.
Avian influenza is caused by influenza A viruses of the Family Orthomyxoviridae and
is distributed worldwide. Wild birds are known to be natural reservoir for viruses. The
objective of this study is monitoring the circulation on influenza virus in migratory and
resident coastal birds captured in ornithological nets. It was made the biometry and
marked of each captured bird. The 342 collected fecal samples were inoculated into
the allantoic cavity of 9-to-11-day of embryonating chicken egg. Allantoic fluid was
tested for the presence of hemagglutinating viruses by the hemagglutination assay.
Of the 342 analyzed samples, 39 had been positive for the hemagglutination assay.
These samples had been submitted to the RT-PCR and all had been negative for the
virus of influenza A. We did not detect avian influenza A but is need for monitoring
wild birds for presence of influenza A viruses.
Key words: Avian influenza, migratory birds, resident birds, hemagglutination assay,
RT-PCR.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................13
2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................16
2.1. Histórico........................................................................................................16
2.2. Etiologia e propriedade geral dos vírus.....................................................20
2.3. Epizootiologia...............................................................................................20
2.4. Manifestações clínicas.................................................................................23
2.5. Diagnóstico...................................................................................................23
2.6. Prevenção e controle...................................................................................24
2.7. Importância econômica e sanitária.............................................................25
3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................26
3.1. Animais e captura.........................................................................................26
3.2. Local e período de captura..........................................................................29
3.3. Coleta e processamento das fezes.............................................................29
3.4. Isolamento e identificação do vírus............................................................30
3.4.1. Inoculação em ovos embrionados....................................................30
3.4.2. Teste de hemaglutinação...................................................................30
3.4.3. Extração e purificação do RNA viral.................................................31
3.4.4. Amplificação molecular (RT-PCR).....................................................31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................32
4.1. Animais..........................................................................................................32
4.2. Análise das amostras...................................................................................37
5. CONCLUSÃO.......................................................................................................42
6. SUGESTÃO..........................................................................................................43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................43
ÍNDICE DE QUADRO
Quadro 1: Países onde foram notificados casos do vírus da influenza aviária (H5N1)
entre os anos de 2003 a 2008....................................................................................17
Quadro 2: Países onde foram notificados casos do vírus da influenza aviária (H5N1)
no ano de 2007...........................................................................................................18
Quadro 3: Países onde foram notificados do vírus da influenza aviária (H5N1) no
ano de 2008................................................................................................................18
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Vírus influenza em circulação em humanos no Brasil no período de 1995 a
2001............................................................................................................................19
Figura 2. Disseminação do vírus influenza interespécies..........................................21
Figura 3: Redes ornitológicas armadas para capturas de aves no Mangue Carapeba
– Campos dos Goytacazes – RJ (2007).....................................................................27
Figura 4. Base das saídas a campo, Mangue Carapeba, Campos dos Goytacazes –
RJ (2007)....................................................................................................................27
Figura 5. Box individuais para conter as aves. Mangue Carapeba, Campos dos
Goytacazes - RJ (2007)..............................................................................................28
Figura 6: Arenaria interpres, capturada no Mangue Carapeba, Campos dos
Goytacazes – RJ, 2007..............................................................................................33
Figura 7: Charadrius collaris, capturada no Mangue Carapeba, Campos dos
Goytacazes – RJ, 2007..............................................................................................33
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Porcentagem de aves migratórias e residentes capturadas na Região
Norte Fluminense do Estado do Rio de Janeiro, 2004 a 2007...................................34
Gráfico 2: Porcentagem das espécies capturadas na Região Norte Fluminense, nos
anos de 2004 a 2007..................................................................................................36
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Número de aves capturadas nos anos de 2004 a 2007, agrupadas por
espécies e status........................................................................................................35
Tabela 2: Espécies de aves positivas no teste de hemaglutinação com respectivos
títulos hemaglutinantes e status.................................................................................38
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 064/2008
Bianchi, Iliani
Estudo do vírus influenza A em aves migratórias e residentes no
Norte do Estado do Rio de Janeiro, Brasil no período de 2004-2007 /
Iliani Bianchi. – 2008.
51 f. : il.
Orientador: Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos
Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias
Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2008.
Bibliografia: f. 43 – 51.
1. Vírus influenza 2. Ave migratória 3. Ave residente 4. Teste de
hemaglutinação 5. RT-PCR I. Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias
Agropecuárias. II. Título.
CDD – 598.1568
13
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, as informações sanitárias do Office Internacional des
Epizooties (OIE) e do Center for Diseases Control (CDC) vêm relatando a ocorrência,
principalmente nos Estados Unidos da América, de surtos de viroses de importância
tanto para a Medicina Veterinária como para a Saúde Pública, entre elas a Influenza
Aviária, a doença de NewCastle e, mais recentemente, a febre do Oeste do Nilo.
(OLSEN et al., 2000; LANCIOTTI et al., 1999).
Do ponto de vista epidemiológico, sabe-se que as aves migratórias
desempenham papel importante na disseminação dessas viroses, já que elas são
consideradas os principais reservatórios desses vírus na natureza. Essa particularidade
é importante tendo em vista que existem 73 espécies de aves migratórias oriundas do
Hemisfério Norte que se deslocam até a América do Sul (VOOREN, et al., 1999),
representando, dessa forma, um risco em potencial para a introdução desses agentes
no Brasil, principalmente entre os meses de setembro e maio, período de passagem
dessas aves neste território (NOVELLI, 1997; LUNA et al., 2003).
Com relação à influenza aviária, a hipótese atual considera as aves aquáticas,
principalmente da ordem Anseriformes, como principais reservatórios naturais de vírus
influenza A na natureza. Dessas espécies haveria a transmissão para todas as demais
espécies de aves aquáticas (ALEXANDER, 2000; OLSEN et al., 2006; ALEXANDER et
al., 2007).
Em mamíferos, evidências filogenéticas sugerem que todos os vírus influenza A
têm um ancestral aviário (WEBSTER et al., 1992). As pandemias de vírus influenza em
humanos ocorridas em 1957 e 1968 na Ásia e em Hong Kong, respectivamente, foram
originadas pela transferência de genes de vírus aviário para vírus de origem humana
(KAWAOKA et al., 1988), apesar de existir barreira entre espécies, já que, de maneira
geral, os vírus de origem humana não se replicam bem em aves e vice-versa
(HINSHAW et al., 1981). A teoria aceita até 1997 era a de que a replicação e
reagrupamento de genes precisavam de um hospedeiro intermediário susceptível ao
vírus influenza aviário e humano, papel desempenhado pelos suínos. Entretanto, no
14
final da década de 90, vários trabalhos demonstraram as primeiras evidências da
transmissão direta de vírus influenza aviário para humanos (KURTZ et al., 1996;
SUBBARAO e KATZ 2000). Um episódio que chamou particular atenção foi o que
ocorreu em Hong Kong em 1997, onde um vírus influenza aviário altamente patogênico
(HPAIV), H5N1, foi transmitido diretamente de aves para humanos ocasionando a morte
de 6 das 18 pessoas infectadas (CLAAS et al., 1998). Em 2003 novos casos fatais
causados pelo HPAIV H5N1 ocorreram na China (STURM-RAMIREZ et al., 2004) e, no
começo de 2004, 23 das 34 pessoas infectadas pelo HPAIV H5N1 morreram no
continente Asiático (HIEN et al., 2004).
Além do H5N1, outros vírus influenza aviários têm causado surtos em humanos,
como por exemplo, o subtipo H9N2 no sul da China e Hong Kong em 1999 (LIN et al.,
2000). Em 2003 outro HPAIV H7N7 infectou 89 pessoas na Holanda causando a morte
de um veterinário. Depois desse episódio o vírus se espalhou rapidamente para a
Bélgica e Alemanha, onde mais de 30 milhões de aves industriais foram sacrificadas
como medida de controle (FOUCHIER et al., 2004).
Todos esses relatos demonstram claramente que a transmissão zoonótica de
vírus influenza aviário diretamente para humanos pode ocorrer, alertando, dessa forma,
a necessidade de uma vigilância constante da circulação de vírus influenza em aves
silvestres, justificada pelo risco em potencial que alguns desses vírus possam causar
novas pandemias.
A emergência de novas doenças a partir de espécies silvestres é um
acontecimento que requer vigilância permanente, a fim de montar planos estratégicos
para o controle da doença, impedindo que se transforme em uma ameaça para a saúde
pública e para a conservação das espécies (BRENTANO, 2006).
Nas Regiões Norte Fluminense e Baixada Litorânea do Estado do Rio de
Janeiro, existe um complexo de lagoas (Lagoa do Açu, Lagoa de Iquipari, Lagoa Feia,
Lagoa de Cima, entre outras) que são importantes pontos de repouso e alimentação de
várias espécies de aves migratórias, oriundas do Canadá, EUA e Alasca. Além dessas
lagoas, algumas ilhas nas proximidades de Macaé, Cabo Frio e São João da Barra
(Atafona) também são importantes pontos para aves migratórias, como os trinta-réis-de-
bico-amarelo (Sterna eurygnata), trinta-réis-de-bico-vermelho (Sterna hirundinacea) e
15
trinta-réis-boreal (Sterna hirundo). Essa característica peculiar na região favorece a
realização de um programa de vigilância epidemiológica em aves migratórias.
16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Histórico
Quando se fala em influenza não se pode deixar de falar das quatro importantes
pandemias mundiais, a gripe Espanhola entre 1918-1920; a gripe Asiática entre 1957-
60, a de Hong Kong entre 1968-1972 e a gripe Russa ocorrida em 1977-1978 que
afetou principalmente crianças e adolescente (BARROS et al, 2004).
Juntas essas pandemias foram responsáveis pelo óbito de milhões de pessoas,
matando mais que a primeira e a segunda guerra mundial (KOLATA, 2002), e foi a partir
daí que se iniciou o estudo da influenza em busca do conhecimento, controle e
prevenção da doença.
Depois dessas grandes pandemias, ocorreram vários surtos de influenza em
vários países que não tiveram grandes conseqüências, mas no ano de 1997, em Hong
Kong, ocorreu o primeiro caso de transmissão direta de influenza aviária para humanos,
pela estirpe FLU A (H5N1), provocando 18 casos e 6 óbitos (TAM, 2002).
Em abril de 2003 ocorreram importantes surtos de influenza aviária na Holanda e
na Bélgica devido a FLU A (H7N7), que levou a óbito um veterinário e doença leve em
83 pessoas (FOUCHIER et al., 2004).
Em dezembro de 2003, uma criança, em Hong Kong, foi infectada pelo vírus
influenza A (H9N1) manifestando doença leve. No mesmo mês e ano ocorreu um surto
de influenza aviária em humanos pela estirpe A (H5N1) com confirmação de 11 casos e
8 óbitos, esse surto teve início no Vietnã progredindo para a Tailândia (CDC, 2004a;
CDC, 2004b).
Entre os anos de 2003 a 2008, a influenza aviária (H5N1) foi registrada em 61
países (Quadro 1), entre esses, 28 foram no ano de 2007 (Quadro 2) e 12 no primeiro
trimestre do ano de 2008 (Quadro 3).
17
Quadro 1: Países onde foram notificados casos do vírus da influenza aviária (H5N1) entre os
anos de 2003 a 2008.
CONTINENTE PAÍS
Blangadesh Camboja Cazaquistão
China Coréia Hong Kong
Índia Indonésia Japão
Laos Malásia Mongólia
Ásia
Mianmar Paquistão Tailândia
Benin Burkina Faso Camarão
Costa do Marfim Djibuti Gana
Níger Nigéria Suazilândia
África
Sudão Togo
Albânia Alemanha Áustria
Azerbaijão Bósnia Bulgária
Croácia Dinamarca Erzegovinia
Eslováquia Eslovênia Espanha
França Geórgia Grécia
Hungria Itália Inglaterra
Polônia República Tcheca Romênia
Rússia Sérvia e Montenegro Suécia
Europa
Turquia Ucrânia
Afeganistão Arábia Saudita Egito
Irã Iraque Israel
Jordânia Kuwait Palestina
Oriente Médio
Vietnã
FONTE: OIE, 2008.
18
Quadro 2: Países onde foram notificados casos do vírus da influenza aviária (H5N1) no ano de
2007.
CONTINENTE PAÍS
Blangadesh Camboja China
Coréia Hong Kong Índia
Japão Laos Malásia
Ásia
Mianmar Paquistão Tailândia
África Benin Gana Togo
Alemanha França Hungria
Inglaterra Polônia República Tcheca
Europa
Romênia Rússia Turquia
Afeganistão Arábia Saudita Kuwait
Oriente Médio
Vietnã
FONTE: OIE, 2008.
Quadro 3: Países onde foram notificados do vírus da influenza aviária (H5N1) no ano de 2008.
CONTINENTE PAÍS
Ásia China Índia Laos Tailândia
Europa Alemanha Inglaterra Turquia Ucrânia
Oriente Médio Irã Israel Vietnã Egito
FONTE: OIE, 2008.
No continente Americano ocorreram apenas cinco casos de influenza de alta
patogenicidade, três pelo subtipo H5N2 e dois pelo subtipo H7N3. Em 1983-1984,
H5N2 nos EUA; em 1994-1995, H5N2 no México; em 2002 H7N3 no Chile; em 2004,
H5N2 nos EUA e em 2004 H7N3 no Canadá (SENNE et al, 2006). Os três últimos
casos tiveram como precursor um subtipo de baixa patogenicidade, comprovando a
necessidade de notificar a OIE todas as ocorrências dos vírus influenza (SENNE et al,
2006).
19
No Brasil, existem poucos trabalhos publicados sobre a ocorrência de influenza
em aves silvestres, Oliveira Jr et al (2001) demonstraram a presença do subtipo H1N1 e
H3N2 no Estado do Rio de Janeiro.
Em humanos, nos anos de 1992 e 1993 um estudo em Belém do Pará,
encontrou estirpes do subtipo H3N2 e H1N1 (SANTOS et al., 1997). Durante janeiro a
outubro de 2002, foi isolado a estirpe B/Hong Kong/330/2001, nas regiões Sudeste e
Centro-Oeste. Essa estirpe é variante do vírus da influenza B/Victória/02/88, que
ocorreu no Continente Asiático em 1991 (PAIVA et al., 2003).
Entre 1995 e 2001, o projeto VigiGripe, no Brasil, caracterizou 9 diferentes
variantes do vírus influenza A, sendo quatro do subtipo H1N1 e 5 do subtipo H3N2,
sendo que de 1995 a 1999 circulou uma única cepa do tipo B a B/Beijing/184/93. A
partir de 2000 iniciou a circulação da cepa B/Sichuan/379/99 (PROJETO VIGIGRIPE,
2001 citado por FORLEO-NETO et al., 2003). Na figura 1 estão demonstradas as
estirpes circulante no Brasil de 1995 a 2001 em humanos.
1995 1996 1997 1998 1999
2000 2001
Texas/36/91
Bayern/7/95
Johan/82/96*
A/H5N1
New Caledddonia/20///99
Johan/33/94
Wuhan 359/95
Sydney/5/97
Moscow/10/99**
A/H3N2
Panama/2007/99***
Beijing/184/93
B
Sichuan/379/99
* A cepa A/Jonannnnesburg/82/96 apresenta grande proximidade antigênica a cepa A/Bayaern/7/95
** A cepa A/Moscow/10/99 apresenta grande proximidade antigênica a cepa A/Sydney/5/97
***A cepa A/Panamá/2007/99 é analógica a cepa A/Moscow/10/99
Figura 1:
Vírus influenza em circulação em humanos no Brasil no período de 1995 a 2001.
FONTE: FORLEO-NETO et al, 2003.
20
2.2. Etiologia e propriedades gerais do vírus
De acordo com o International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) os
vírus influenza
são classificados na família Orthomyxoviridae, a qual é subdividida em
quatro gêneros, Vírus influenza A, B, C e Thogotovirus. Os vírus influenza são
classificados nos tipos A, B e C de acordo com seu perfil antigênico (FIELDS et al.,
1996).
São vírus envelopados, podendo ser filamentosos ou esféricos, tamanho
variando de 80 a 120nm de diâmetro, apresenta genoma RNA fita simples de
polaridade negativa segmentado e possui duas glicoproteínas de grande importância
que são a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) que classificam o vírus quanto ao
subtipo (FIELDS et al., 1996).
A recombinação gênica entre as estirpes virais ocorre facilmente devido ao seu
genoma segmentado (OLIVEIRA Jr et al., 2001).
O Vírus influenza A possui 17 subtipos da HA E 9 de NA. Esses subtipos
distribuem-se de modo diferente entre as espécies. Admitia-se que apenas o H1, H2 e
H3 acometiam humanos, mas outros subtipos já foram isolados em humanos, o H5, no
sudoeste da Ásia, o H7 e H9 na Europa (BARROS et al., 2004).
2.3. Epizootiologia
O vírus da influenza aviária já foi diagnosticado em cetáceos (HINSHAW et al.,
1986), suínos (CAMPITELLI et al., 1997), cavalos (NEWTON et al., 1999), humanos
(SUBBARAO e KATZ, 2000) e caninos (SONGSERM et al, 2006).
Mancini et al., (2004) demonstraram que animais heterotérmicos (sapos e
serpentes) apresentam receptores para o vírus influenza do tipo A de humano e eqüino
21
e do tipo B, podendo assim atuar como hospedeiros do vírus e ter susceptibilidade à
infecção.
O vírus influenza A ocorre em aves, humanos, suínos, eqüinos e caninos, o tipo
B ocorre apenas em humanos e o tipo C em humanos e suínos. Os vírus influenza A
são os que mais ocorrem no mundo inteiro
.
As aves silvestres são os principais reservatórios do vírus influenza aviária,
devido à característica assintomática nessas aves, sendo, portanto fonte primária de
disseminação da doença (WEBSTER et al., 1992 OLSEN et al, 2006).
Os vírus influenza podem ser classificados também quanto a sua virulência, alta
patogenicidade e baixa patogenicidade (HORIMOTO e KAWAOKA, 2001).
Em silvestre é mais comum o isolamento de vírus de baixa patogenicidade
(ALEXANDER, 2007), porém não se deve dar pouca relevância a esse fato, já que o
vírus sofre muita recombinação gênica, podendo assim surgir novas estirpes. Essa
baixa virulência em aves silvestres favorece a preservação do vírus na natureza por
vários anos, tendo, portanto uma reincidência da mesma estirpe que pode infectar
várias espécies animais (FIELDS et al., 1996), como mostra a figura 2.
Figura 2.
Disseminação do vírus influenza interespécies.
FONTE: Horimoto e Kawaoka, 2001.
Fonte: Horimoto e Kawaoka, 2001Fonte: Horimoto e Kawaoka, 2001
22
Os vírus influenza de alta patogenicidade raramente são isolados em aves
silvestres (SWAYNE e SUAREZ, 2000), ao contrário das aves domésticas, que são
vítimas freqüentes dos subtipos H5 e H7 (ALEXANDER, 2000; OLSEN et al, 2006).
A ocorrência do subtipo do vírus influenza varia entre as aves, em marrecos
predominam os subtipos H3, H4, e H6; em gaivotas e aves costeiras predominam os
subtipos H9 e H13 (SENNE et al, 2006).
A transmissão entre aves ocorre através de secreções respiratórias e fezes,
direta ou indiretamente. As aves silvestres são fontes de contaminação de grande
importância, principalmente para as granjas de aves, pois é muito difícil afugentar as
aves de um local onde existe grande quantidade de alimento.
Em 1918-1920, 1957-1960 e 1968-1972 ocorreram grandes pandemias de
influenza, onde as estirpes virais isoladas tinham genoma recombinante de aves e
humanos. O mundo teme uma nova pandemia, visto que, em Hong Kong em 1997, as
estirpes H5N1 e H9N2 levaram a óbito seis pessoas e foi comprovada a transmissão
direta de vírus influenza aviário para humanos (ZHOU et al., 1999a; HORIMOTO e
KAWAOKA, 2001).
Os suínos participam como hospedeiros intermediários para recombinação
genética entre aves e humanos (WEBSTER et al., 1992)
A recombinação entre influenza de aves, suínos e humanos, foi demonstrada em
plantéis de suínos na Carolina do Norte, Texas, Minnesota e Iowa em 1998. O isolado
da Carolina do Norte resultou da combinação entre H3N2 de humanos e H1N1 de
suínos e os demais de H3N2 de humanos, H1N1 de suínos e genes de vírus de aves
(ZHOU et al., 1999b).
Somente o tipo A causa infecção natural em aves, os isolados de alta virulência
para aves domésticas chegam a causar mortalidade de 100% nas aves . Esses vírus
influenza de alta patogenicidade geralmente são dos subtipos H5 e H7 (ALEXANDER,
2000; ALEXANDER, 2007).
23
2.4. Manifestações clínicas
Nas aves silvestres, a influenza geralmente é subclínica, mas em alguns casos a
doença envolve o sistema nervoso central com mortalidade alta em uma semana
(MARTINS, 2001). As aves também podem desenvolver edema das faces, fraqueza e
morte (NAEEM et al., 1999).
Em perus o índice de mortalidade é altíssimo, pois eles são sensíveis a doenças
que envolvem o trato respiratório e geralmente a transmissão está envolvida com a
presença de aves migratórias nos plantéis de criação (MARTINS, 2001).
Os vírus de baixa patogenicidade levam a uma infecção do trato respiratório e/ou
intestinal. Os de alta patogenicidade causam infecção sistêmica em vários órgãos
sendo responsáveis por alto índice de mortalidade (LEBARBENCHON et al, 2007).
Na Tailândia, um cão se contaminou com o vírus H5N1 depois de ingerir a
carcaça de um pato infectado e após cinco dias apresentou febre alta, dificuldade
respiratória, letargia e foi a óbito. A necropsia revelou quadro de pneumonia severa e
edema pulmonar (SONGSERM et al, 2006).
A influenza humana se caracteriza por doença respiratória aguda que pode durar
poucos dias ou semanas. Em humanos a taxa de morbidade mais alta está entre as
pessoas com menos de 20 anos, mas a taxa de mortalidade mais alta está entre as
pessoas com mais de 65 anos (FIELDS et al., 1996). Uma estirpe do vírus influenza
aviária A/Hong Kong/156/97 (H5N1) foi fatal em crianças, desenvolvendo faringite,
tosse seca e febre (FOUCHIER et al., 2004).
2.5. Diagnóstico
A influenza é uma doença de notificação obrigatória no Brasil e no mundo. O
diagnóstico é feito por isolamento e identificação do vírus através de amostra de swab
oral, retal e soro sanguíneo. O isolamento é feito através de inoculação em ovos
24
embrionados, teste de hemaglutinação e inibição da hemaglutinação. O diagnóstico
também pode ser feito por PCR e ELISA.
A histopatologia não é um teste de diagnóstico para a influenza aviária, já que é
um vírus que não causa efeito patognomônico. As técnicas histológicas que podem ser
empregadas para o vírus influenza aviária estão baseados nas lesões histológicas que
os vírus causam nas células e tecidos do animal infectado.
Keawcharoen et al., (2004) avaliaram a histopatologia de órgãos de dois tigres
(Panthera tigris) e dois leopardos (Panthera pardus) infectados pelo vírus A (H5N1). A
histopatologia com coloração de H&E revelou lesões pulmonares caracterizadas por
perda do epitélio alveolar e bronquiolar, engrossamento da parede do alvéolo, edema
do lúmen alveolar com presença de fibrina, eritrócitos, neutrófilos e macrófagos.
A histopatologia de tecidos de patos e gaivotas revelou necrose neuronal difusa
no cérebro e cerebelo, pancreatite necrosante, adrenalite e necrose multifocal no
miocárdio (BROWN et al, 2006).
Perkins e Swayne, (2001) observaram a patologia da influenza H5N1 em sete
espécies de Gallinaceous. Os sinais clínicos mais freqüentes foram diarréia mucoide,
sintomas neurológicos e apatia. As lesões macroscópicas mais encontradas foram
esplenomegalia, edema e congestão pulmonar, hemorragias nos linfonodos entéricos,
hemorragia nas superfícies serosas e hemorragia nos músculos.
2.6. Prevenção e controle
O Ministério da Agricultura, com colaboração de entidades públicas e particulares
mantém um programa de monitoração permanente das aves nacionais e um controle
rígido das aves importadas.
O controle para a influenza aviária deve ser rígido, não apenas para estirpes de
alta virulência, mas também para as de baixa virulência. Pois uma estirpe de baixa
25
virulência pode sofrer mutações e recombinação dando origem a uma estirpe de alta
patogenicidade (DeJONG et al., 2000).
As aves silvestres devem ser constantemente monitoradas, pois apesar de
apresentarem vírus de baixa patogenicidade, estes infectam aves domésticas,
cetáceos, suínos, cavalos e humanos, podendo evoluir para estirpes de alta
patogenicidade devido a mutações e recombinações gênicas (SWAYNE e SUAREZ,
2000).
2.7. Importância econômica e sanitária
Meltzer et al., (1999) estimaram nos EUA, entre 89.000 a 207.000 óbitos
humanos, 314.000 a 734.000 hospitalizações e 18 a 42 milhões de consultas
ambulatoriais. Essa estimativa mostra o impacto econômico da influenza, os gastos que
um país tem com internações e consultas quando o período de ocorrência da doença é
elevadíssimo e que em pandemias o impacto econômico é bastante considerável.
No Brasil, Brondi et al., (2001) estimaram um aumento de 235.000 internações
humanas por influenza, em uma situação não pandêmica, no período de 1995-2001.
A estirpe A (H5N1) acarretou o sacrifício de aproximadamente um milhão de
aves domésticas em Hong Kong no ano de 1997; levou a morte de seis mil galinhas de
uma única fazenda na Coréia do Sul, em dezembro de 2003 e a morte de 40 mil
galinhas e no abate de mais 30 mil aves no Sul do Vietnã no início do ano de 2007
(WHO, 2004).
A doença causada pelo vírus de alta patogenicidade é restrita a pequenas áreas
geográficas, mas causam altas taxas de mortalidade em aves domesticas e grandes
perdas econômicas (LEBARBENCHON et al., 2007).
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais e captura
Foram coletadas amostras de fezes de aves migratórias e residentes costeiras
totalizando 342 aves. Nas capturas foram utilizadas 14 redes (12 m X 2,5 m) tipo mist-
nets perfazendo um total de 168 metros de rede colocadas em linha reta (Figura 3). A
cada duas horas a equipe fazia a vistoria nas redes e retiravam as aves capturadas
colocando-as individualmente em sacos de tecido 100% algodão onde eram levadas
para o ônibus da UENF, que funcionou como base no campo (Figura 4). Na base as
aves foram colocadas em box individuais (Figura 5), e em seguida manipuladas para
realização da biometria, anilhamento e coleta de material fecal. Logo após esses
procedimentos as aves foram soltas, minimizando assim o estresse da apreensão. A
biometria consiste em dados das aves como peso, medida do comprimento total,
comprimento de bico, comprimento de cauda, envergadura de asa e observação das
mudas das penas e foram feitas de acordo com as normas do Centro Nacional de
Pesquisa para Conservação das Aves Silvestres - CEMAVE.
27
Figura 3:
Redes ornitológicas armadas para capturas de aves no
Mangue Carapeba – Campos dos Goytacazes – RJ (2007).
Figura 4.
Base das saídas a campo, Mangue Carapeba, Campos
dos Goytacazes – RJ (2007).
28
Das 342 aves capturadas, apenas 27 não foram capturadas em rede
ornitológica. Destas, 14 foram Spheniscus magellanicus, 5 Crotophaga ani, 01
Procellaria aequinoctialis, 03 Anas bouchas, 02 Anas bahamensis e 02 Dendrocygna
viduata. Os 14 pingüins (Spheniscus magellanicus) chegaram debilitados no litoral do
Espírito Santo e estavam em tratamento na Organização Consciência Ambiental –
Instituto ORCA, os Crotophaga ani estavam debilitados e foram encontrados no campus
da UENF e a Procellaria aequinoctialis apareceu debilitada na praia de Atafona – São
João da Barra e foi capturada e entregue a nós por agentes do corpo de bombeiros. Já
os marrecos das espécies Anas bouchas, Anas bahamensis e Dendrocygna viduata
foram capturados com puçá em uma propriedade particular no município de São Fidélis.
Figura 5.
Box individuais para conter as aves. Mangue
Carapeba , Campos dos Goytacazes - RJ (2007).
29
3.2. Local e período de capturas
As coletas foram realizadas nos principais pontos de repouso e alimentação das
aves que são: Lagoa de Iquipari (21º44’14.37”S/41º1’29.80”O), e Pontal de Atafona
(21º37’2.80”S/41º0’48.16”O), localizadas no município São João da Barra; Lagoa do
Açu (21º55’11.02”S/40º58’55.70”O) e Mangue Carapeba (22º4’57.59”S/41º7’20.25”O),
localizadas no município de Campos dos Goytacazes, local onde foi realizada a maior
parte das coletas. As capturas foram realizadas entre os meses de setembro a maio,
período em que as aves migratórias chegam nesta região, sendo realizadas em sua
maioria no período noturno (maior rendimento na captura), das 18:00h às 06:00h. Por
essa razão, também foi levada em consideração a fase da lua, preferindo-se lua nova,
por caracterizar noites mais escuras, dificultando a visualização das redes pelas aves.
3.3. Coleta e processamento das fezes
As amostras de fezes coletadas foram colocadas em microtubo com tampão
salina fosfato (PBS) pH 7,2 com 20% glicerol para preservação do material, numeradas,
acondicionadas em gelo e remetidas ao Laboratório de Sanidade Animal –
LSA/CCTA/UENF, onde foram guardadas sob refrigeração a –20 ºC até o
processamento. No laboratório as fezes foram novamente diluídas em PBS pH 7.2,
centrifugadas a 600 x g durante 15 minutos a 4 ºC e coletado o sobrenadante. O
sobrenadante foi tratado com penicilina 500 UI e fungisona 5mg/mL para serem
inoculadas via cavidade alantóide, em ovos embrionados.
30
3.4. Isolamento e identificação de vírus
3.4.1. Inoculação em ovos embrionados
As amostras de fezes previamente processadas foram inoculadas (0,2mL) via
cavidade alantóide, em ovos embrionados, com 9 a 11 dias de incubação. Após as
inoculações, os ovos foram incubados em estufa a 33
o
C por 72 horas. Em seguida, os
ovos inoculados foram resfriados a 4
o
C, a fim de promover uma vasoconstrição,
evitando assim o rompimento de vasos e contaminação do líquido alantóico com
sangue. O líquido alantóico coletado foi fracionado em duas amostras, uma para
realização do teste de hemaglutinação (HA) e outra para extração de RNA
(MANUGUERRA & HANNOUN, 1999).
Os líquidos alantóicos coletados que foram negativos no teste de HA, foram
inoculados em ovos embrionados, o que se chama de “passagem cega” e submetidos
novamente ao teste de HA para confirmação (BRASIL-MAARA, 1994).
Os ovos embrionados utilizados foram provenientes da Granja Tolomei e
estavam livres de anticorpos virais.
3.4.2. Teste de hemaglutinação
Para verificar a presença de atividade hemaglutinante no líquido alantóico foi
realizado o teste de hemaglutinação. Utilizando microplacas com 96 orifícios com fundo
em “U”, adicionou-se 50µL do líquido alantóico em cada poço e diluiu-se em PBS pH
7,2, resultando em diluições 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64 depois adicionou-se 50µL de
hemácias de galinha a 1% (MANUGUERRA & HANNOUM, 1999). As hemácias
utilizadas foram lavadas em PBS e diluídas até obter uma concentração a 1%.
As microplacas foram deixadas em temperatura ambiente (± 25
o
C) e após 60
31
minutos foram feitas as leituras. Foram consideradas positivas as amostras que
formaram rede, indicando a ligação da hemácia ao vírus presente na amostra.
O teste de HA foi realizado em duplicata para cada amostra e em todas as
microplacas realizou-se o controle das hemácias, utilizando apenas PBS pH 7,2 e
hemácia 1%. Como controle positivo foram utilizados amostras de vírus influenza H3N2:
A/England/42/72 e o H3N8: A/Equine/Newarket/1/93 e 2/93.
3.4.3. Extração e purificação do RNA viral
O RNA foi purificado a partir do líquido alantóico de ovos embrionados
inoculados que apresentaram resultado HA positivo da mesma forma que o líquido
alantóico de ovos inoculados com vírus padrão subtipo H3N2: A/England/42/72 e o
H3N8: A/Equine / New Market/ 1/93 e 2/93 utilizado como controle positivo nas reações
de RT-PCR. Todas as extrações foram realizadas através do kit QIAmp
®
Viral RNA Mini
Kit (QIAGEN) obedecendo as recomendações do laboratório fabricante.
3.4.4. Amplificação molecular (RT-PCR)
O protocolo utilizado foi o mesmo adotado como rotina no Laboratório de Vírus
Respiratórios e Sarampo da FIOCRUZ desenvolvido por Ellis e Zambon (2001).
Após a extração o RNA viral foi submetido à transcriptase reversa e o produto
dessa reação (DNA complementar) foi adicionado aos oligonucleotídeos
complementares, dideoxinucleotídeos, ATP e Taq polimerase para amplificação em
termociclador utilizando o seguinte programa: 37 ºC/60 minutos; 95 ºC/ 5 minutos,
mantendo ao final a 10 ºC. Em todas as reações foram utilizadas como controle positivo
amostra padrão (H3N2: A/England/42/72 e o H3N8: A/Equine / New Market/ 1/93 e
2/93), como controle negativo água livre de DNA e RNA. Caso não fossem
32
imediatamente utilizados os produtos (cDNA) foram estocados a –20 ºC para posterior
utilização.
Como região alvo para a identificação viral, foi definida a seqüência codificadora
do gene da matriz viral do vírus influenza A. Os oligonucleotídeos utilizados foram:
primers externos AMP71F 5’-CCGTCA GGCCCCCTCAAAGC-3’; AMP831R 5’-
AGGCGATCAAGAATCCACAA-3’; primers internos: AMP227F 5’-
GTGCCCAGTGAGCGAGGAC-3’; AMP622R 5’-ATCTCCATGGCCTCTGCT-3’.
Na primeira PCR o programa foi de 94ºC/2minutos; seguido de 30 ciclos de 94º
C/1minuto; 68°C/1minuto e trinta segundos; e 72°C/5 minutos mantendo ao final a 15ºC.
Na segunda PCR o programa foi de 94ºC/2minutos; seguido de 30 ciclos de
94ºC/1minuto; 60ºC/1minuto e trinta segundos; e 72ºC/5minutos, mantendo ao final a
15 ºC. Para visualização dos produtos amplificados, o DNA complementar ao RNA viral
foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1,5% em Tris-Borato-EDTA (TBE),
corado com brometo de etídeo. O tamanho da banda esperada foi de 413pb.
Em todas as reações foram colocados paralelamente no gel os controles
positivos (H3N2: A/England/42/72 e o H3N8: A/Equine / New Market/ 1/93 e 2/93) bem
como o lader (1 Kb Plus DNA Ladder Cat. No. 10787-018 – Invitrogen).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Animais
Foram capturadas 342 aves de 23 espécies diferentes, sendo 11 residentes e 12
migratórias (Figura 6 e 7).
33
O número de aves migratórias capturadas, 253, (73,97%) foi maior que o número
de aves residentes, 89, (26,02) como mostra o gráfico 1, concordando com os dados
Figura 6:
Arenaria interpres, capturada no Mangue
Carapeba, Campos dos Goytacazes – RJ, 2007.
Figura 7
: Charadrius collaris, capturada no Mangue
Carapeba, Campos dos Goytacazes – RJ, 2007.
34
encontrados por Araújo et al, (2004b) que capturaram 172 aves silvestres, 111
migratórias e 61 residentes no Parque Nacional da Lagoa dos Peixes – RS e por
Azevedo Junior et al, (2001) que capturaram 2577 aves migratórias e 19 residentes na
Coroa do Avião – PE em dez anos de pesquisa.
73,97
%
26,02
%
Aves migratórias
Aves residentes
As aves migratórias estão distribuídas entre as espécies Charadrius
semipalmatus (113), Calidris fuscicollis (32), Arenaria interpres (32), Tringa flavipes
(28), Actitis macularia (15), Spheniscus magellanicus (14), Numenius phaeopus (06),
Tringa melanoleuca (05), Anas boucha (3), Chordeiles minor (01), Diomedea
chlororhynchos (01), Sterna hirundo (01), Pluvialis squatarola (01), Procellaria
aequinoctialis (01), totalizando 253 aves (Tabela 1).
As aves residentes estão distribuídas entre as espécies Charadrius collaris (73),
Crotophaga ani (05), Anas bahamensis (03), Butorides striatus (02), Dendrocygna
viduata (2), Nycticryphes semicollaris (01), Tito alba (01), Speotyto cunicularia (01) e
Vanellus chilensis, (01) totalizando 89 aves.
Das 342 aves capturadas, sete viviam em cativeiro na cidade de São Fidelis –
RJ, três Anas bouchas, duas Anas bahamensis e duas Dendrocygna viduatas.
Gráfico 1:
Porcentagem de aves migratórias e residentes
capturadas na Região Norte Fluminense do Estado do Rio de
Janeiro, 2004 a 2007.
35
Espécie Quantidade Status
Charadrius semipalmatus
113 Migrante do Hemisfério Norte
Charadrius collaris
73 Residente
Arenaria interpres
32 Migrante do Hemisfério Norte
Calidris fuscicollis
32 Migrante do Hemisfério Norte
Tringa flavipes
28 Migrante do Hemisfério Norte
Actitis macularia 15 Migrante do Hemisfério Norte
Spheniscus magellanicus*
14 Migrante do Hemisfério Sul
Nomenius phaeopus
06 Migrante do Hemisfério Norte
Crotophaga ani*
05 Residente
Tringa melanoleuca
05 Migrante do Hemisfério Norte
Anas bouchas**
03 Exótica do Hemisfério Norte
Anas bahamensis**
03 Residente
Butorides striatus
02 Residente
Dendrocygna viduata**
02 Residente
Vanellus chilensis
01 Residente
Nycticryphes semicollaris
01 Residente
Tito alba
01 Residente
Speotyto cunicularia
01 Residente
Pluvialis squatarola
01 Migrante do Hemisfério Norte
Diomedea chlororhynchos
01 Migrante do Hemisfério Sul
Chordeiles minor
01 Migrante do Hemisfério Norte
Sterna hirundo
01 Migrante do Hemisfério Norte
Procellaria aequinoctialis*
01 Migrante do Hemisfério Sul
TOTAL 342 89 residentes / 253 migratórias
*Aves encontradas debilitadas não capturadas em rede.
** Aves de cativeiro.
Tabela 1:
Número de aves capturadas nos anos de 2004 a 2007, agrupadas por
espécies e status.
36
O gráfico 2 apresenta a freqüência das espécies capturadas neste trabalho.
Charadrius semipalmatus foi a que mais ocorreu em um total de 33,04%, seguido pelas
espécies Charadrius collaris 21,34%, Calidris fuscicollis 9,35%, Arenaria interpres
9,35% Tringa flavipes 8,18%, Actitis macularia 4,38%, Spheniscus magellanicus 4,09%,
Numenius phaeopus 1,75%, Crotophaga ani 1,46%, Tringa melanoleuca 1,46 e 5,55%
são de outras espécies que foram encontradas em número igual ou menor que três.
3
3
,
0
4
%
2
1
,
0
5
%
9
,
3
6
%
9
,
3
6
%
8
,
1
8
%
4
,
3
8
%
4
,
0
9
%
5
,
5
5
%
1
,
4
6
%
1
,
4
6
%
1
,
7
5
%
0
20
40
60
80
100
120
140
Charadrius semipalmatus
Charadrius collaris
Calidris fuscicollis
Arenaria interpres
Tringa flavipes
Actitis macularia
Spheniscus magellanicus
Nomenius phaeopus
Crotophoga ani
Tringa melanoleuca
Outras
Dados de captura de aves observados na literatura demonstram uma grande
variação da quantidade e diversidade de espécies encontradas no Brasil, com 73
espécies catalogadas (VOOREM et al, 1999). Neste trabalho a espécie que ocorreu em
maior quantidade, Charadrius semipalmatus (33,04%, 113/342), não foi a mesma
encontrada por outros autores como Azevedo Júnior et al, (2001), na Coroa do Avião –
PE, onde prevaleceu a espécie Calidris pusilla (71,30%, 1851/2596); Araújo et al, 2003,
no Parque Nacional da Lagoa do Peixe – RS, onde prevaleceu Arenaria interpres (51%,
342/556); Araújo et al, (2004a), em Galinhos – RN, onde prevaleceu a espécie Calidris
Gráfico 2:
Porcentagem das espécies capturadas na Região Norte Fluminense,
nos anos de 2004 a 2007.
37
pusilla (76,23%) e por Araújo et al, (2004b) no Parque Nacional da Lagoa do Peixe –
RS, onde prevaleceu a espécie Sterna hirundo (34,9%, 60/172).
As taxas de Charadrius semipalmatus encontradas por Azevedo Júnior et al,
2001, Araújo et al, (2003), Araújo et al, (2004a) e Araújo et al, 2004b foram de 8,36%
(217/2596); 0,18% (1/556); 1,69% (12/711) e 1,74% (3/172), respectivamente. Pode-se
observar que em nenhum desses trabalhos, diferentemente deste estudo, prevaleceu a
espécie Charadrius semipalmatus. Essa observação provavelmente pode estar
relacionada a algumas características dos sítios de invernada onde foram realizados os
trabalhos de captura, que poderiam favorecer uma maior freqüência de determinada
espécie em detrimento de outra.
4.2. Análise das amostras
Das 342 amostras de fezes inoculadas em ovos embrionados, 39 (11,4%) foram
positivas no teste de hemaglutinação. Dessas, 12 (30,1%) foram da espécie Arenaria
interpres, 07 (17,9%) Charadrius semipalmatus, 06 (15,4%) Actitis macularia, 04
(10,2%) Charadrius collaris, 03 (7,7%) Calidris fuscicolis, 02 (5,1%) Numenius
phaeopus, 01 (2,5%) Crotophaga ani, 01 (2,5%) Anas bahamensis, 01 (2,5%)
Dendrocygna viduata, 01 (2,5%) Tringa melanoleuca e 01 (2,5%) Tito Alba (Tabela 2).
Os títulos hemaglutinantes encontrados variaram de 1:2 a 1:64, esses resultados
estão demonstrados na tabela 2.
38
Espécies Número da
amostra
Titulo do HA Status
Arenaria interpres
169 1:64 Migrante Norte
Arenaria interpres
200 1:2 Migrante Norte
Arenaria interpres
207 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
209 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
214 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
218 1:2 Migrante Norte
Arenaria interpres
219 1:2 Migrante Norte
Arenaria interpres
221 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
222 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
225 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
226 1:8 Migrante Norte
Arenaria interpres
227 1:8 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
177 1:8 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
187 1:16 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus 243 1:8 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
263 1:8 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
284 1:4 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
297 1:64 Migrante Norte
Charadrius semipalmatus
339 1:8 Migrante Norte
Actitis macularia
109 1:2 Migrante Norte
Actitis macularia
208 1:8 Migrante Norte
Actitis macularia
229 1:4 Migrante Norte
Actitis macularia
230 1:32 Migrante Norte
Actitis macularia
318 1:2 Migrante Norte
Actitis macularia
319 1:2 Migrante Norte
Charadrius collaris
197 1:8 Residente
Charadrius collaris
236 1:8 Residente
Charadrius collaris
268 1:8 Residente
Charadrius collaris
312 1:8 Residente
Calidris fuscicolis
108 1:4 Migrante Norte
Tabela 2:
Espécies de aves positivas
no teste de hemaglutinação com
respectivos títulos hemaglutinantes e status.
39
Calidris fuscicolis
110 1:8 Migrante Norte
Calidris fuscicolis
329 1:4 Migrante Norte
Nomenius phaeopus
175 1:4 Migrante Norte
Nomenius phaeopus
215 1:8 Migrante Norte
Crotophaga ani
163 1:64 Residente
Anas bahamensis
193 1:16 Residente
Dendrocygna viduata
196 1:8 Residente
Tringa melanoleuca
202 1:2 Migrante Norte
Tito alba
287 1:8 Residente
As 39 amostras positivas no teste de HA foram analisadas por RT-PCR tendo
como região alvo para amplificação o gene da matriz viral que possibilita a identificação
de todos os subtipos de vírus influenza A. Após análises todas as amostras foram
negativas.
Diante desses resultados começa-se a questionar qual agente, com exceção do
vírus influenza, seria responsável pelos títulos HA encontrados, já que outros agentes
virais como coronavírus, adenovírus aviário e paramixovírus e até mesmo agentes
bacterianos poderiam ser responsáveis por esses resultados.
No Caribe, Douglas et al, (2007) analisaram 168 swabs de aves silvestres,
encontrando 27 amostras positivas no teste de hemaglutinação e destas apenas duas
foram detectados os vírus influenza (H4N3) na espécie Anas discors por RT-PCR. A
hemaglutinação das outras 24 amostras foi atribuída a bactérias hemaglutinantes.
A hipótese de a hemaglutinação ter sido causada por bactérias no presente
trabalho foi descartada, já que, os líquidos alantóicos positivos foram filtrados em
membrana de 0,22 micras e depois novamente submetidos ao teste de HA confirmando
os resultados positivos.
Em seguida, apesar de não fazer parte do objetivo deste trabalho, algumas
amostras HA positivas foram enviadas à PESAGRO/Niterói-RJ para análise por RT-
PCR para diagnóstico do vírus da doença de NewCastle e por Real TIME RT-PCR para
o vírus do Oeste do Nilo, onde todas foram negativas.
40
De acordo com a literatura as taxas de isolamento do vírus influenza em aves
silvestres variam muito de espécie para espécie e até mesmo dentro de uma mesma
espécie em diferentes sítios de nidificação ou invernada. A ordem Anseriformes é a que
apresenta uma maior taxa de isolamento do vírus Influenza A. Em um trabalho de
revisão, Stallknecht et al, (1988) citado por Douglas et al, (2007) observaram uma
diferença nas taxa de isolamento do vírus influenza entre as ordens Anseriformes,
Passeriformes e Charadriiformes, encontrando 15,2%, 2,9% e 2,2%, respectivamente.
Wallensten et al, (2004), na Suíça encontraram uma prevalência de 12% em
Anseriformes, mais especificamente em Anas platyrhynchos.
Lei et al, (2007) em abril de 2006 encontraram uma taxa de isolamento do H5N1
de 3,22% (3/93) em Anseriformes (um Anser indicus e dois Cygnus cygnus) no Lago de
Quingai na China, mesmo tendo ocorrido um surto em maio de 2005, onde o H5N1
matou mais que 6000 aves migratórias.
No Sul da França, Lebarbenchon et al, (2007) encontraram uma taxa de 1,8%
(24/1345) em Anseriformes infectados com o vírus influenza, mas nenhum com H5N1.
Hurt et al, (2006), na Austrália, encontraram uma taxa de 5,78% analisando 173
amostras e apenas 10 foram positivas, cinco Calidris acuminata (H11N9) e cinco
Calidris ruficollis (H4N8).
Kraus et al, (2004) fizeram um levantamento no período de 1976 a 2001 e
observaram uma taxa de isolamento do vírus influenza de 22,2% (2989/13466) em
anseriformes no Canadá e no período de 1985 a 2000, uma taxa de isolamento do vírus
de 14,2% (605/4266) em Charadriiformes no Leste dos EUA.
Avaliando os dados encontrados em cinco anos, de 2001 a 2006, Krauus et al,
(2007) observaram uma taxa de isolamento do vírus influenza de 16,6% em
Anseriformes no Canadá e uma taxa de 5,8% em Charadriiformes nos EUA. O número
de amostras coletadas de Anseriformes foi bem menor que o de Charadriiformes 590 e
1970 respectivamente, mesmo assim a taxa de isolamento do vírus influenza para
Anseriformes foi maior.
Winker et al, (2007) fizeram um levantamento de 1998 a 2004, em um total de
8254 aves na América do Norte e observaram uma taxa de isolamento de 0,061%
(5/8254), onde todos os isolamentos foram de Anseriformes.
41
De Marco et al, (2004), na Itália, também observaram diferentes taxas de
isolamento comparando Anseriformes e Gruiformes e encontraram 3,8% e 1,2%
respectivamente.
Stanislawek et al, (2002), na Nova Zelândia, encontraram uma taxa de
isolamento de 1,87% (6/321) em Anseriformes.
Terregino et al, (2007) encontraram uma taxa de isolamento de 1,2% (48/4083)
em Anseriformes e 0,02% (1/4083) em Charadriiformes (Gallinago gallinago).
Douglas et al, (2007), no Caribe, analisaram 40 swabs cloacal de Anseriformes e
124 de Charadriiformes e encontraram uma taxa de isolamento do vírus influenza de
1,19% (2/168), sendo essas duas amostras em Anseriformes (Anas discors).
No Brasil, Araújo et al, (2004b), no Parque Nacional da Lagoa do Peixe – RS
isolaram o H4 e H2 de pool de aves migratórias não sendo possível determinar qual
espécie envolvida, pois, os autores fizeram análise a partir de pools de fezes de
diferentes espécies.
Em Galinhos – RN, Araújo et al, (2004a) examinaram 388 amostras fecais de
aves, divididas em 22 pools e encontraram 13 pools positivo para influenza para o
subtipo H3, incluindo aves migratórias e residentes, não sendo possível, portanto
determinar a taxa de isolamento por espécie.
No Estado de São Paulo, Soares et al, (2005) isolaram o vírus influenza em três
passeriformes, dois da espécie Elaenia mesoleuca e um Sporophila caerulescens.
Em um estudo realizado no Rio de Janeiro, Oliveira Júnior et al, (2001) isolaram
o H1N1 e H3N2 em aves silvestres e domésticas de cativeiro encontrando uma
prevalência de 17,89% (22/123) e 37,25% (38/102), respectivamente.
Como se pode observar, as taxas de isolamento do vírus influenza são variáveis
nas diferentes espécies. De uma forma geral, as taxas encontradas em Anseriformes
são maiores que em Charadriiformes. No presente trabalho foi capturado apenas um
Anseriforme de vida livre e sete de cativeiro o que pode ter diminuído as chances de
isolamento.
A ausência do vírus influenza nas amostras não significa que no Norte do
Estado do Rio de Janeiro não esteja circulando vírus influenza entre as aves
migratórias e residentes, e sim que nas amostras coletadas não foram isolados os vírus.
42
Como se sabe, o Brasil recebe várias espécies de aves que migram do Norte e
do Sul do Continente Americano através de três importantes rotas, a Rota Americana
do Mississipi, a Rota Americana do Pacifico e a Rota Americana do Atlântico. Apesar
dessas rotas não passarem por locais onde foram isolados os vírus influenza A de alta
patogenicidade, elas se cruzam com rotas como a Rota do leste Asiático e a Rota do
Atlântico Leste, que passam por essas regiões (NUNES, et al 2006), demonstrando
assim a necessidade de ser realizado um monitoramento constante das aves
migratórias costeiras.
5. CONCLUSÃO
•
A região Norte Fluminense, devido às suas características, possui excelentes sítios
de invernada para as aves migratórias oriundas da América do Norte sendo, dessa
forma, um bom lugar para o monitoramento de espécies como a Charadrius
semipalmatus;
• O número de aves migratórias capturadas, 253, (73,97%) foi maior que o número de
aves residentes, 89 (26,02), no período de novembro de 2004 a fevereiro de 2007;
•
A espécie mais capturada foi Charadrius semipalmatus 33,04% (113/342);
• Não foi encontrado nenhum subtipo de Vírus Influenza A em amostras fecais de
aves migratórias e residentes capturadas neste trabalho.
43
6. SUGESTÃO
•
Para elaborar um plano de ação nacional para combater e controlar surtos de vírus
influenza são necessários estudos constantes da epidemiologia do vírus, o que
demonstra a importância do monitoramento constante das aves migratórias que
chegam ao Brasil todos os anos no período de invernada;
• Aumentar o número amostral no próximo período de invernada;
•
Capturar um maior número de Anatídeos de vida livre.
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