( PDF ) Estudo do mecanismo da ação anti-herpética do ácido gálico e do galato de pentila

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Farmácia

JADEL MÜLLER KRATZ

ESTUDO DO MECANISMO DA AÇÃO ANTI-HERPÉTICA DO

ÁCIDO GÁLICO E DO GALATO DE PENTILA

FLORIANÓPOLIS

2007

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JADEL MÜLLER KRATZ

ESTUDO DO MECANISMO DA AÇÃO ANTI-HERPÉTICA DO

ÁCIDO GÁLICO E DO GALATO DE PENTILA

FLORIANÓPOLIS

2007

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-

Graduação em Farmácia da

Univ

ersidade Federal de Santa Catarina,

como requisito parcial para a obtenção

do grau de Mestre em Farmácia.

Área de concentração: Fármaco-

Medicamentos.

Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Maria

Oliveira Simões

Co-

Orientadora: Profª. Drª. Célia Regina

Monte Barardi

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Kratz, Jadel Müller

Estudo do mecanismo da ação anti-

herpética do ácido gálico e do

galato de pentila / Jadel Müller Kratz. Florianópolis, 2007. 79 p.

Dissertação (Mestrado) -

Universidade Federal de Santa Catarina,

Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-

Graduação em Farmácia,

2007.

1. atividade antiviral; 2. Herpes Simplex Vírus tipo 1; 3. mecanismo

de ação; 4. galatos; 5. ácido gálico; 6. galato de pentila

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Aplicada, coordenado

pelas Professoras Drª. Cláudia Maria Oliveira Simões (Departamento de Ciências

Farmacêuticas, CCS) e Drª. Célia Regina Monte Barardi (Departamento de

Microbiologia e Parasitologia, CCB), da Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC), Florianópolis, SC.

Este trabalho recebeu apoio financeiro do CNPq / MCT, Edital Universal 2005-

2007 (projeto número 472748/2004-1), e da CAPES / MEC através da concessão da

bolsa de Mestrado.

Aos meus pais Delso e Jacinta e ao meu irmão Mahil,

pelo apoio e amor incondicionais, e à minha orientadora,

pelo imenso aprendizado.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais e irmão pelo amor, compreensão e pelas palavras de incentivo.

À Professora Cláudia Maria Oliveira Simões pela notável orientação, pelo

aprendizado, pela amizade e pelo incentivo na busca da excelência.

À Professora Célia Regina Monte Barardi pela orientação, atenção e amizade.

Aos amigos Cícero e Rodrigo pela amizade e companheirismo únicos.

Aos amigos do Laboratório de Virologia Aplicada pelo coleguismo e amizade.

Aos Professores Ricardo Nunes e Rosendo Yunes e a Paulo César Leal, por terem

gentilmente cedido os compostos.

À CAPES pela concessão da bolsa e ao CNPq pelo apoio financeiro.

Aos professores, colegas, amigos e alguém especial que, de alguma forma,

estiveram ao meu lado e contribuíram para a realização desta dissertação.

Jadel Müller Kratz

Jadel Müller KratzJadel Müller Kratz

Jadel Müller Kratz

RESUMO

O ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico - AG) é um composto fenólico presente

em muitas plantas. Seus n-alquil ésteres, também conhecidos como galatos, em

especial o galato de propila, octila e dodecila, são amplamente utilizados como

antioxidantes pelas indústrias de alimentos, cosméticos e medicamentos. Os efeitos

inibitórios do ácido gálico e de quinze galatos sobre a replicação do Herpes Simplex

Vírus tipo 1 (HSV-1) foram investigados. Inicialmente, a citotoxicidade e a atividade

anti-HSV-1 em células Vero foram avaliadas através do ensaio colorimétrico com o

brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-difeniltetrazolium (MTT). Após a seleção dos

compostos com atividade superior aos demais, sua atividade antiviral foi confirmada

através do ensaio de redução de placas de lise. Em seguida, após nova seleção,

agora de 2 compostos com atividade superior, o mecanismo da ação anti-herpética

destes compostos foi estudado através de uma série de ensaios que visaram avaliar

a possível interferência dos compostos sobre as diversas etapas da replicação viral.

Dentre as avaliações realizadas estão: a atividade virucida, a influência sobre a

adsorção e penetração dos vírus nas células, a avaliação do possível sinergismo dos

compostos entre si e com o aciclovir, a avaliação da interferência sobre a síntese de

proteínas virais através do ensaio de Western blotting, a avaliação da interferência

sobre a expressão gênica viral através do ensaio de RT-PCR e a avaliação da

interferência sobre a síntese do DNA viral através do ensaio de PCR. Após uma

triagem preliminar, o AG e o galato de pentila (GP) mostraram-se mais ativos e

tiveram o seu mecanismo de ação estudado através de uma série de ensaios, que

visaram determinar em qual(is) etapa(s) da replicação viral eles atuam. O

mecanismo de sua atividade antiviral parece ser mediado, ao menos em parte, pela

redução da infectividade viral (apenas GP), inibição da adsorção e penetração viral

nas células, diminuição dos níveis da proteína do capsídeo viral ICP5, da proteína α

ICP27 e das proteínas do envelope gB, gC, gD e gE, e interferência na síntese da

proteína gD através do bloqueio da síntese de seu mRNA (apenas GP). Embora os

tratamentos concomitantes com AG/GP, AG/aciclovir e GP/aciclovir não tenham

resultado em interação alguma, a interferência destes dois compostos (AG e GP) em

várias etapas da replicação do HSV-1 sugere a importância de estudos adicionais.

Unitermos: atividade antiviral; Herpes Simplex Vírus tipo 1 (HSV-1); mecanismo de

ação; galatos; ácido gálico; galato de pentila.

ABSTRACT

In Vitro Antiherpetic Activity and Mode of Action of Gallic Acid and Pentyl

Gallate.

Gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid - GA) is a phenolic compound present in a

great variety of plants. Its synthetic n-alkyl esters, also known as gallates, especially

propyl, octyl and dodecyl gallates, are vastly employed as antioxidants in food,

cosmetic and pharmaceutical industries. The inhibitory effects of GA and fifteen

gallates on herpes simplex virus type 1 (HSV-1) replication were investigated.

Initially, the cytotoxicity and the anti-HSV-1 activity in Vero cells were evaluated by

the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay. After the

selection of the compounds with the most prominent activities, their antiviral activity

was confirmed by a plaque reduction assay. Then, after a selection of two

compounds with the higher activities, their mechanism of action was studied through

a series of assays in order to identify in which point of the replication process the

compounds were active. Several evaluations were performed: the virucidal activity,

the influence on the attachment and entry of virus into cells, the possible synergism

of compounds with acyclovir, the interference with viral proteins synthesis through a

Western blotting assay, the interference with viral gene expression through a RT-

PCR assay, and the interference with the viral DNA synthesis through a PCR assay.

After a preliminary screening, GA and pentyl gallate (PG) seemed to be the most

active compounds and had their mechanism of action studied through a set of

assays, as an attempt to identify in which point of the viral replication cycle the

impairment occurred. Their mechanism of antiviral activity seem to be mediated, at

least in part, by reduced viral infectivity (only PG), inhibition of virus attachment and

entry to cells, impaired levels of viral capsid protein ICP5, α protein ICP27 and

envelope proteins gB, gC, gD and gE and interference with gD protein synthesis due

to blockage of gD mRNA synthesis (only PG). Although the combination of GA and

PG with acyclovir resulted in no interaction, the detected multiple modes of action of

both compounds suggest that further studies are merited.

Keywords: antiviral activity; Herpes simplex virus type 1 (HSV-1); mechanism of

action; gallates; gallic acid; pentyl gallate.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Diagrama representando a transcrição, tradução e replicação do

DNA dos vírus herpéticos.

Figura 2 – Herpesvírus – microscopia eletrônica de transmissão. 19

Figura 3 – Estrutura básica dos galatos. No ácido gálico, o radical R = H e

nos galatos, R = cadeia alquílica com número variável de carbonos.

Artigo – Figure 1 – Chemical structures of gallic acid and its n-alkyl esters

(gallates).

Artigo – Figure 2 – Effects of 125 µM of gallic acid (GA), methyl gallate

(MG), ethyl gallate (EG), propyl gallate (PrG), butyl gallate (BG), pentyl

gallate (PG) and acyclovir (ACV) on HSV-1 replication in Vero cells

determined by plaque reduction assay.

Artigo – Figure 3 – Kinetics of inhibition of HSV-1 replication by gallic acid

(GA) and pentyl gallate (PG).

Artigo – Figure 4 – Effect of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on

HSV-1 attachment to GMK AH1 cells.

Artigo – Figure 5 – Effect of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on

HSV-1 entry into GMK AH1 cells.

Artigo – Figure 6 – Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate

(PG) on HSV-1 protein synthesis in Vero cells detected by Western blot

analysis.

Artigo – Figure 7 – Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate

(PG) on HSV-1 DNA synthesis in Vero cells detected by PCR.

Artigo – Figure 8 – Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate

(PG) on HSV-1 gene expression in Vero cells detected by RT-PCR.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Vírus herpéticos humanos. 14

Artigo – Table 1 – Anti-HSV-1 effect, cytotoxicity and selectivity indices of

gallates on Vero cells determined by MTT assay.

Artigo – Table 2 – Effects of gallic acid and pentyl gallate on HSV-1 protein

synthesis in GMK AH1 cells determined by ELISA.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO _______________________________________________11

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA_____________________________________13

2.1

ERPES

IMPLEX

ÍRUS TIPO

1 ___________________________________________________ 13

2.2

CIDO GÁLICO E SEUS N

ALQUIL ÉSTERES

___________________________________________ 23

3 OBJETIVOS _________________________________________________26

3.1

OBJETIVO

GERAL____________________________________________________________ 26

3.2

OBJETIVOS

ESPECÍFICOS ____________________________________________________ 26

4 ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO _______________________27

ABSTRACT _________________________________________________________________________ 28

INTRODUCTION ____________________________________________________________________ 29

MATERIALS

AND

METHODS _________________________________________________________ 31

RESULTS ___________________________________________________________________________ 39

DISCUSSION ________________________________________________________________________ 44

ACKNOLEDGMENTS ________________________________________________________________ 47

REFERENCES _______________________________________________________________________ 48

5 DISCUSSÃO _________________________________________________66

6 CONCLUSÕES _______________________________________________70

REFERÊNCIAS ____________________________________________________72

Introdução 11

1 INTRODUÇÃO

A pesquisa de novos fármacos passou por avanços significativos nos últimos

anos, principalmente depois da introdução de modelos biológicos realizados in vitro

e em grande escala, os quais podem avaliar várias amostras, em um curto período

de tempo, permitindo a realização de várias repetições dos experimentos e

propiciando uma análise estatística consistente dos resultados. Os avanços

tecnológicos que contribuíram para a busca de novos compostos referem-se à

descoberta de novos alvos moleculares, impulsionados pelas novas ferramentas de

biologia molecular, e a evolução de novas técnicas de síntese orgânica, resultando

em substâncias ativas mais eficazes e/ou menos tóxicas, que podem ser utilizadas

como protótipos de fármacos com atividades farmacológicas semelhantes às

originais (HOUGHTON, 1996; ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1996; HOUGHTON,

2000; NIELSEN, 2002; NEWMAN; CRAGG, 2003, 2004).

Em contraste com a enorme quantidade de fármacos antibacterianos e

antifúngicos disponíveis, o atual arsenal terapêutico antiviral compreende em torno

de 40 fármacos, sendo a maioria destes utilizados no tratamento de infecções pelo

vírus da imunodeficiência humana (HIV) (DE CLERCQ, 2004, 2005).

Uma das principais razões para a falta de sucesso no desenvolvimento de

fármacos antivirais é a natureza dos vírus, os quais possuem uma estrutura

extremamente simples e um sistema enzimático bastante restrito, sendo totalmente

dependentes dos processos metabólicos celulares para sua multiplicação e

sobrevivência. Assim, agentes que inibem a replicação viral e/ou causam a morte do

vírus, exibem também certo grau de toxicidade às células hospedeiras. O

compromisso com a especificidade pelas células infectadas, a eficácia e um baixo

nível de toxicidade são indispensáveis e, destes problemas, advém a escassez de

medicamentos antivirais (WHITE; FENNER, 1994).

Dentre os inúmeros vírus de importância clínica, destaca-se a família

Herpesviridae, na qual se incluem os Herpes Simplex Vírus tipos 1 e 2 (HSV-1 e

HSV-2), que infectam um grande número de pessoas no mundo todo. Os sintomas

da doença não são sempre aparentes, mesmo durante a infecção primária, e podem

variar desde lesões cutâneas e de mucosas até encefalites ou doenças sistêmicas

envolvendo múltiplos órgãos. A transmissão da infecção de pessoa a pessoa ocorre,

geralmente, pelo contato íntimo e o compartilhamento de fluídos contendo os vírus.

Introdução 12

O HSV-2 causa, principalmente, o herpes genital, que é uma das doenças

sexualmente transmissíveis de maior prevalência no mundo, e que está relacionada

com um aumento na transmissão efetiva do HIV. O HSV-1, apesar de também poder

causar infecções genitais, provoca mais comumente o herpes labial (SCHACKER,

2001; ROIZMAN; KNIPE, 2001; CELUM, 2004; SPEAR et al., 2006).

O composto de escolha para profilaxia e tratamento das infecções causadas

pelos HSV é o aciclovir, que inibe seletivamente a replicação do DNA viral, com

baixa toxicidade às células hospedeiras. Contudo, a resistência dos vírus herpéticos

a este fármaco, a disseminação das cepas resistentes em pacientes, principalmente

os imunocomprometidos, e a decorrente progressão da doença fizeram com que as

infecções herpéticas se tornassem um grave problema de saúde pública (CASSADY;

WHITLEY, 1997; FIELD, 2001; BRADY; BERNSTEIN, 2004), fatos que estimulam

pesquisas para que novas terapias anti-herpéticas sejam encontradas (NIELSEN,

2002).

Diante deste quadro, o Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC vem, há

vários anos, avaliando a citotoxicidade e a potencial atividade antiviral de produtos

naturais e também de compostos sintéticos. Neste âmbito, recentemente, foi

avaliada a atividade anti-HSV-1 de um grupo de substâncias sintéticas, os ésteres

alquílicos do ácido gálico, também conhecidos como galatos, que foram preparados

com base na estrutura de um composto de origem natural, o ácido gálico (ácido

3,4,5-trihidroxibenzóico). Neste trabalho foi estabelecida uma série de relações

estrutura-atividade para estas moléculas, não somente no que diz respeito à ação

anti-herpética, mas também à sua ação antioxidante e sua genotoxicidade (SAVI et

al., 2005).

Embora relações estrutura-atividade já tenham sido propostas, o mecanismo

pelo qual os galatos exercem sua atividade anti-herpética in vitro ainda não havia

sido estudado. Levando em conta este fato, o presente trabalho teve como objetivo

analisar em qual(is) etapa(s) da multiplicação viral os compostos em questão atuam,

avaliando sua possível interferência na adsorção, na penetração, na síntese do DNA

viral, na transcrição gênica e/ou na expressão de proteínas virais, além de sua

atividade virucida e os efeitos da sua provável associação com o aciclovir, que é o

fármaco de escolha para o tratamento de infecções por HSV-1.

Revisão Bibliográfica 13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Herpes Simplex Vírus tipo 1

Vírus são parasitas intracelulares obrigatórios, que necessitam da atividade

metabólica e das organelas da célula hospedeira para produção de energia e

síntese de macromoléculas, ou seja, para sua multiplicação. Eles contêm apenas um

tipo de material genético (RNA ou DNA) e seu material de reserva constitui-se

apenas de proteínas ou glicogênio. Essas entidades infecciosas consistem de um

genoma DNA ou RNA, acondicionado num capsídeo protéico, que pode ou não ser

circundado por uma membrana de revestimento, o envelope. O material nucléico

recoberto por proteína é denominado nucleocapsídeo. O termo vírion serve para

designar partículas virais completas, potencialmente infecciosas, formadas na última

fase da replicação viral. O capsídeo é composto por um número definido de

unidades morfológicas, os capsômeros. A montagem dos vírus é definida pela

natureza das ligações formadas entre os capsômeros individuais, o que confere a

simetria do capsídeo, podendo esta ser helicoidal, icosaédrica ou mista (VOYLES,

1993).

Os vírus são capazes de reconhecer e de penetrar em células-alvo

apropriadas, principalmente, pela especificidade dos receptores existentes na

superfície dessas células hospedeiras e dos próprios vírus. O conjunto de eventos

que vão desde a penetração do genoma viral na célula até a liberação dos vírions, é

chamado de ciclo de multiplicação viral. A forma pela qual o vírus realiza as etapas

do seu ciclo de multiplicação é determinada pela estrutura do genoma [se DNA ou

RNA; se RNA positivo (+) ou negativo (-); segmentado ou não] e da estrutura do

próprio vírion a ser replicado. As principais etapas de multiplicação de um vírus

qualquer podem ser resumidas numa fase inicial, com adsorção do vírus à célula

hospedeira, penetração e desnudamento (decapsidação) da partícula, e uma fase

tardia, que vai desde a síntese macromolecular até a automontagem e liberação dos

vírions (WHITE; FENNER, 1994).

Os vírus herpéticos são altamente disseminados na natureza.

Aproximadamente 100 vírus da família Herpesviridae foram caracterizados, sendo

que existem oito vírus herpéticos humanos (Tabela 1). Além disso, o vírus herpético

Revisão Bibliográfica 14

B de macacos pode também infectar o homem causando encefalite mortal

(ROIZMAN; KNIPE, 2001; DA SILVA, 2000).

Tabela 1: Vírus herpéticos humanos.

Gênero Nome oficial Nome Comum Sigla

Alphaherpesvirinae

Herpes simplex 1

Herpesvírus humano-1

Vírus herpes simples tipo 1

HSV-1

Herpes simplex 2 Herpesvírus humano-2

Vírus herpes simples tipo 2 HSV-2

Varicella zoster Herpesvírus humano-3

Vírus da varicela zoster VZV

Betaherpesvirinae

Cytomegalovírus

Roseolovirus

Herpesvírus humano-5

Herpesvírus humano-6

Herpesvírus humano-7

Citomegalovírus

Vírus herpes humano tipo 6

Vírus herpes humano tipo 7

CMV

HHV-6

HHV-7

Gamaherpesvirinae

Epstein-Barr

Herpesvírus humano-4

Herpesvírus humano-8

Vírus Epstein-Barr

Vírus herpes humano tipo 8

EBV

HHV-8

Fonte: adaptado de DA SILVA (2000).

O HSV-1 pertence à subfamília Alphaherpesvirinae, apresentando

propriedades biológicas de crescimento rápido, lise das células infectadas e

estabelecimento de infecções latentes em gânglios nervosos sensoriais. O fato de o

próprio vírus herpético codificar as principais enzimas necessárias à replicação do

DNA viral, mantendo um grau de virulência suficiente para não ser subjugado pelos

mecanismos de defesa do hospedeiro, faz com que sua sobrevivência em células

neurais constitua um fato bastante provável de ocorrer (WHITE; FENNER, 1994;

LUPI; PEREIRA JR., 2000).

Ao contrário da maioria das outras famílias de vírus, os vírus herpéticos

podem causar infecções líticas, latentes e transformadas. A infecção latente com

subseqüente doença recorrente é uma de suas características. Durante o período da

latência herpética, os vírus são inacessíveis ao sistema imune e aos medicamentos

atualmente disponíveis (ROIZMAN; KNIPE, 2001).

O HSV-1 é composto de quatro componentes distintos. No interior do vírion

está o cerne contendo DNA linear de fita dupla, com aproximadamente 152 kbp. O

genoma é dividido em dois segmentos ligados covalentemente, denominados longo

Revisão Bibliográfica 15

(L) e curto (S), ambos contendo seqüências únicas (U

e U

, respectivamente), que

são flanqueadas por regiões de seqüências repetitivas invertidas. O rearranjo destes

dois componentes dá origem a quatro populações de moléculas de DNA, diferindo

entre si apenas na orientação das seqüências do DNA. Seu genoma é um dos

maiores genomas virais dos vírus herpéticos humanos, codificando cerca de 70 a

200 proteínas (WHITE; FENNER, 1994; BOEHMER; LEHMAN, 1997; SUBAK-

SHARPE; DARGAN, 1998; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

Os demais componentes do vírion envolvem o core. Um capsídeo

icosaédrico de 100nm de diâmetro composto de 162 capsômeros (150 hexâmeros e

12 pentâmeros); uma camada de proteínas amorfa, chamada de tegumento; e um

envelope lipoprotéico de 120-200nm revestido por até 11 tipos de glicoproteínas

virais e diversas proteínas não glicosiladas, lipídios e poliaminas (WHITE; FENNER,

1994; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

Na infecção primária pelos vírus herpéticos ou primo-infecção, o vírus penetra

no corpo por invasão das mucosas ou soluções de descontinuidade da pele. Muitos

indivíduos são infectados já em idade precoce. O vírus sofre, então, replicação nas

células situadas na base do sítio de entrada, podendo ou não produzir lesões

vesiculares (ROIZMAN; KNIPE, 2001; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

O ciclo de multiplicação dos vírus herpéticos consiste em uma seqüência

complexa de eventos. Resumidamente, para iniciar sua infecção, o HSV-1 precisa se

ligar a receptores celulares, fundir seu envelope com a membrana plasmática, e

permitir que o capsídeo seja transportado até os poros da membrana do núcleo da

célula, onde o genoma viral será liberado. Os eventos chave que ocorrem no núcleo

incluem a transcrição, síntese de DNA e proteínas, montagem do capsídeo,

empacotamento do DNA e envelopamento, culminando com a liberação de um novo

vírion potencialmente infeccioso (WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

O contato inicial do HSV com a célula consiste no processo de adsorção. A

ligação do vírion com cadeias de glicosaminoglicanas (GAG) de proteoglicanas da

superfície celular inicia esta etapa. O sulfato de heparana, um dos diversos tipos de

GAG, é preferencial e é considerado o principal receptor de ligação do HSV-1. Duas

glicoproteínas (das onze descritas até o momento) presentes no envelope viral,

denominadas gB e gC, são capazes de se ligar ao sulfato de heparana e mediar a

adsorção viral, além de induzir a resposta imune (SHUKLA; SPEAR, 2001; SPEAR,

2004).

Revisão Bibliográfica 16

Embora a adsorção aumente significativamente a eficiência da infecção

herpética, ela não é absolutamente essencial, ao menos em infecções de células em

cultura, uma vez que as partículas virais podem penetrar na célula-alvo por

encocitose. A ausência de gC reduz a eficiência da infecção em até 10 vezes, ao

passo que, a ausência das duas glicoproteínas envolvidas neste processo impede a

infecção, sendo este fato creditado ao papel que a gB desempenha no processo de

entrada do vírus, descrito a seguir (SHUKLA; SPEAR, 2001; SPEAR, 2004; SPEAR

et al., 2006).

A principal via de penetração do HSV é por fusão na membrana da superfície

celular, mas também pode ocorrer por endocitose. Neste último caso, o capsídeo é

digerido por enzimas lisossomais celulares, enquanto que, no primeiro caso, a fusão

do envelope viral com a membrana celular permitirá que o material genético seja

liberado (WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

Para que ocorra a penetração por fusão, após a adsorção da partícula viral à

superfície celular, é necessário que a glicoproteína gD interaja com um dos seus

diversos receptores de entrada. Estes receptores estão divididos em três classes:

um membro da família dos receptores do fator de necrose tumoral, o HVEM

(mediador de entrada de herpesvírus); as nectinas 1 e 2, membros da superfamília

das imunoglobulinas; e sítios específicos no sulfato de heparana, gerados por certas

3-O-sulfotransferases (SHUKLA; SPEAR, 2001; SPEAR, 2004; SPEAR et al., 2006).

A ligação de gD com um dos receptores resulta na fusão do envelope viral

com a membrana da célula, possibilitando a entrada do nucleocapsídeo e do

tegumento no citoplasma celular. Neste processo estão envolvidas, além da gD e

seus receptores, também a glicoproteína gB e o heterodímero gH-gL (SHUKLA;

SPEAR, 2001; SPEAR, 2004).

Após a penetração, o nucleocapsídeo é transportado até a membrana nuclear

e, através de poros, o DNA viral penetra no núcleo, acompanhado pelas proteínas

do tegumento α-TIF ou VP16 e vhs, que, como muitas outras, além de serem

proteínas estruturais, desempenham importantes papéis no processo de replicação

viral. O α-TIF possui a função de promover a transcrição viral imediata, através da

formação de um complexo multiprotéico com os fatores celulares de transcrição Oct1

e HCF, que se liga a uma região específica do genoma viral. Já a proteína vhs

parece permanecer no citoplasma, onde desempenha a função de degradar RNA

celular e viral, sendo que o último possui vantagem, uma vez que sua produção está

Revisão Bibliográfica 17

altamente induzida (WHITE; FENNER, 1994; MCKNIGHT; KRISTIE; ROIZMAN,

1987; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

A síntese dos produtos gênicos virais, tanto RNA quanto proteínas, é

realizada em três fases seqüenciais (Figura 1): imediata (α), precoce (β), e tardia (γ),

sendo a última ainda subdividida em tardia falsa (γ1) e tardia verdadeira (γ2)

(MCKNIGHT; KRISTIE; ROIZMAN, 1987; BOEHMER; LEHMAN, 1997; WHITLEY;

ROIZMAN, 2001; ROIZMAN; GU; MANDEL, 2005).

Figura 1. Diagrama representando a transcrição, tradução e replicação do DNA dos

vírus herpéticos. Fonte: WHITE; FENNER (1994).

Na fase imediata, cinco genes são expressos, regulados por α-TIF, gerando

os produtos de tradução: ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47, que funcionam como

trans-ativadores da fase seguinte, regulando a expressão gênica viral em nível

transcricional. O pico de síntese destas proteínas α ocorre entre 2-4 horas pós-

infecção, e estas são necessárias para a produção de todas as proteínas virais

codificadas (BOEHMER; LEHMAN, 1997; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

A proteína de célula infectada 4 (ICP4) liga-se diretamente ao DNA tanto em

sítios de alta quanto de baixa afinidade, atuando como repressor ou promotor,

respectivamente, da transcrição de genes virais. Na ausência desta proteína todos

os processos transcricionais pós-α não ocorrem (ROIZMAN; GU; MANDEL, 2005).

Outra α-proteína, ICP0, atua como ativador não específico de diversos genes.

As funções relativas a esta proteína têm, pelo menos, dois papéis importantes:

estabilizar importantes proteínas reguladoras do ciclo celular, obrigando a célula a

Revisão Bibliográfica 18

entrar em fase S (entretanto sem permitir divisão celular), e manter um vigoroso

processo de síntese protéica (WHITLEY; ROIZMAN, 2001; ROIZMAN; GU;

MANDEL, 2005).

A ICP27, por sua vez, também possui diversos papéis. O mais destacado é o

controle do processamento pós-transcricional do RNA. Diferentemente dos genes

celulares, a grande maioria dos genes virais não possui íntrons. Esta proteína

bloqueia o processamento do mRNA, o que acarreta numa diminuição da produção

de proteínas celulares. Adicionalmente, a ICP27 atua como transportadora de RNAs

tardios do núcleo para o citoplasma e, conseqüentemente, regula a expressão de

proteínas da fase tardia ou γ (WHITLEY; ROIZMAN, 2001; LARRALDE et al., 2006;

ROIZMAN; GU; MANDEL, 2005; SMITH; MALIK; CLEMENTS, 2005).

Após a ativação da maquinaria transcricional da célula pelos produtos dos

genes α, inicia-se a síntese de proteínas da fase precoce ou β, que atinge seu pico

entre 5-7 horas pós-infecção. Nesta classe estão incluídas enzimas necessárias

para a replicação do genoma viral, como a DNA polimerase viral, a proteína de

ligação de DNA fita simples ou polipeptídeo de célula infectada 8 (ICP8), DNA

helicase-primase e as demais enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos.

A replicação do DNA viral inicia-se imediatamente após o acúmulo das primeiras

proteínas β, e pode estender-se até 15 horas pós-infecção (BOEHMER; LEHMAN,

1997; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

O programa temporal de expressão gênica alcança sua última fase com o

aparecimento de transcritos da fase tardia ou γ. Com o início da replicação, e

conseqüente acúmulo de DNA viral, ocorre a sinalização para que os genes tardios

sejam transcritos, gerando mais de 30 produtos de transcrição tardios, que codificam

proteínas estruturais do capsídeo e tegumento, e outras proteínas que formarão o

vírion, como as glicoproteínas presentes no envelope viral (BOEHMER; LEHMAN,

1997; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

As proteínas estruturais do capsídeo são transportadas para o núcleo, onde

são reunidas em pró-capsídeos vazios, que posteriormente são preenchidos com

DNA viral associado a poliaminas de caráter básico. Os nucleocapsídeos ligam-se

em porções modificadas da membrana nuclear interna, que contém glicoproteínas

virais, são temporariamente envelopados e liberados no espaço nuclear

intermembranário (Figura 2).

Revisão Bibliográfica 19

Figura 2. Herpesvírus – microscopia eletrônica de transmissão. (a) Três partículas

virais não envelopadas; (b) No núcleo da célula hospedeira / formação do envelope

na membrana nuclear. Fonte: BIENZ (2005).

Posteriormente, os vírions passam para o citoplasma ainda sem o envelope.

No citoplasma são adicionadas as proteínas do tegumento e ocorre a maturação

final, onde o capsídeo e o tegumento fundem-se com vesículas exocíticas, cujas

membranas contêm todas as glicoproteínas virais, formando o envelope. Os vírions

infectivos, agora prontos, podem permanecer na célula associados a estas vesículas

ou serem liberados da célula. Este processo, iniciando na adsorção e culminando na

liberação de uma partícula viral infectiva, leva em torno de 18h (WHITE; FENNER,

1994; WHITLEY; ROIZMAN, 2001; METTENLEITER, 2002).

Após a infecção primária, o vírus pode disseminar-se para células nervosas

adjacentes. Nos neurônios, o nucleocapsídeo é encaminhado para o núcleo,

iniciando a infecção latente. Nesta fase, o genoma viral está reprimido e

parcialmente integrado ao DNA da célula, sendo que apenas algumas regiões bem

específicas do genoma viral são transcritas, as chamadas regiões LAT. O vírus

pode, então, ser ativado por vários estímulos, como estresse, febre, trauma,

mudanças hormonais, radiação ultravioleta, etc, e depois passar retrogradamente

pelo nervo, causando lesões características em sítios específicos da pele e mucosas

(CLEMENTS; TIMBURY; GRIFFITHS, 1990; LUPI; PEREIRA JR., 2000).

As manifestações clínicas primárias e recorrentes podem variar desde

gengivomastites, faringotonsilites e herpes labial até querato-conjuntivites,

Revisão Bibliográfica 20

encefalites e doença disseminada. Após a recuperação da infecção primária, o

indivíduo retém o DNA herpético no gânglio trigêmeo por toda a vida, com no mínimo

50% de chances de sofrer ataques recorrentes de herpes labial, várias vezes no

decorrer da sua existência. Em pacientes imunocomprometidos (submetidos a

transplantes, terapia antineoplásica e indivíduos com AIDS), as infecções latentes

são freqüentemente reativadas (WHITE; FENNER, 1994; WHITLEY; ROIZMAN,

2001). Adicionalmente, este vírus tem sido apontado como um importante fator na

disseminação do HIV, através do recrutamento de células do sistema imune para as

mucosas afetadas, acarretando numa maior disponibilidade das células-alvo do vírus

HIV (SCHACKER, 2001; CELLUM, 2004).

Conforme dito anteriormente, o HSV-1 está associado a infecções orais,

enquanto que o HSV-2 a infecções genitais. Contudo, ambos os vírus podem causar

infecções clinicamente indistinguíveis em vários locais e podem permanecer latentes

no gânglio sensorial, o qual pode ser reativado em infecções recorrentes

sintomáticas ou assintomáticas (BRADY; BERNSTEIN, 2004).

Normalmente, o isolamento do HSV é feito em cultura de tecidos, onde 2-7

dias são necessários para a visualização dos efeitos citopáticos característicos. O

diagnóstico mais rápido para lesões mucocutâneas é a imunofluorescência direta de

fragmentos corados de pele. O uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) para

amplificar o DNA do HSV em fluido cérebro-espinhal é mais rápido e mais sensível

do que a cultura viral, e o diagnóstico pode detectar encefalite herpética, além de

confirmar infecções em outros locais do corpo. Testes sorológicos específicos

podem ser usados para diferenciar infecções por HSV-1 e/ou HSV-2, ou confirmar

casos suspeitos (BRADY; BERNSTEIN, 2004).

As infecções herpéticas estão descritas na literatura médica há séculos,

porém, a terapia anti-herpética começou a ser desenvolvida somente na década de

60. Atualmente, as infecções causadas pelo HSV estão entre as mais comuns na

população e, é estimado que 60-95% das pessoas adultas estejam infectadas. Para

a seleção do tratamento, alguns fatores importantes devem ser considerados, tais

como a imunidade do paciente, o local da infecção e, se a infecção é primária ou

recorrente. Os agentes anti-herpéticos (anti-HSV-1 e anti-HSV-2) atualmente

disponíveis na clínica são:

Revisão Bibliográfica 21

Aciclovir e Valaciclovir: possuem ação seletiva contra os vírus herpéticos,

pois esses induzem a atividade de uma timidina quinase (TQ) nas células que

infectam. Essa enzima catalisa a fosforilação do aciclovir em monofosfato e as

enzimas celulares completam a fosforilação em trifosfato. A atividade destes

fármacos contra os vírus herpéticos está diretamente relacionada à sua capacidade

indutora de TQ. Os vírus HSV-1 e 2 são os indutores de TQ mais ativos e são

facilmente inibidos pelo aciclovir. Para tornar-se ativo, ele precisa ser fosforilado, o

que ocorre somente em células infectadas por vírus herpéticos. O trifosfato de

aciclovir inibe a replicação viral através da competição com o trifosfato de guanosina

pela DNA polimerase viral. Essa enzima incorpora o trifosfato de aciclovir à cadeia

do DNA em formação, uma vez que o aciclovir não possui a hidroxila em 3',

essencial à incorporação dos demais nucleotídeos à cadeia de DNA em formação. O

aciclovir é cem vezes mais seletivo para a DNA polimerase viral do que para a

enzima celular, possuindo, desta forma, toxicidade mínima. O aciclovir não elimina o

vírus do hospedeiro e deve ser usado nas recidivas. A resistência dos vírus

herpéticos ao aciclovir não é uma questão recente, mas a disseminação de cepas

resistentes em pacientes imunocomprometidos e a decorrente progressão da

doença são preocupantes. A resistência pode ser devido à expressão reduzida da

TQ viral nessas cepas, ou à existência de uma TQ não funcional, além de TQ

mutantes capazes de selecionar o substrato nucleosídico do aciclovir. O

desenvolvimento da resistência pode estar relacionado com o uso de altas doses

terapêuticas ou profiláticas do aciclovir, associado à imunossupressão no caso de

pacientes com AIDS. A biodisponibilidade do aciclovir oral é de 10-20%, enquanto

que a do valaciclovir (éster L-valina do aciclovir) é em torno de 50%. A administração

oral do valaciclovir resulta na conversão em aciclovir, no fígado e no intestino, sendo

mais eficiente do que a administração parenteral. Devido à sua maior

biodisponibilidade, o valaciclovir pode ser administrado com menor freqüência,

tornando-se uma opção conveniente para o tratamento oral de infecções herpéticas

em pacientes imunocompetentes. Entretanto, o valaciclovir não é efetivo contra

infecções resistentes ao aciclovir.

Penciclovir e Fanciclovir: possuem mecanismo de ação similar ao do

aciclovir. O trifosfato de penciclovir é cerca de cem vezes menos potente na inibição

da replicação viral do que o aciclovir; entretanto, esse atinge maior concentração

plasmática e tem maior tempo de meia-vida nas células infectadas. O penciclovir só

Revisão Bibliográfica 22

está disponível em cremes para uso tópico, e estudos sobre sua segurança e

eficácia ainda estão em andamento. O fanciclovir, éster diacetil do penciclovir, é bem

absorvido no trato gastrointestinal, e está disponível somente em formas

farmacêuticas orais.

Trifluoridina: o trifosfato de trifluoridina inibe a DNA polimerase celular e

viral, em baixas concentrações; porém, é tóxico no uso sistêmico. Está disponível

como solução nos tratamentos de infecções oculares pelo HSV.

Vidarabina: análogo da adenina, que é fosforilado por quinases celulares à

trifosfato de vidarabina, o qual inibe a DNA polimerase viral e, um pouco menos, a

celular. Está disponível em pomadas para o tratamento de infecções oculares.

Foscarnet: inibe diretamente a DNA polimerase viral e não requer

fosforilação pela TQ do vírus. É ativo contra vírus resistentes ao aciclovir e vírus

deficientes de TQ. A resistência ao foscarnet é rara e surge de mutações do vírus.

Cidofovir: nucleosídeo 5´-monofosfato, que é fosforilado por TQ de células

hospedeiras em um metabólito biologicamente ativo, o qual inibe seletivamente a

replicação viral. Por não ser dependente da TQ viral, pode ser ativo contra vírus

deficientes em TQ. A resistência ao cidofovir é rara e surge de mutações virais. Seu

tempo de meia-vida é longo e, por isso, permite apenas uma dose semanal. Pode

ser usado topicamente ou por via intravenosa no tratamento de HSV resistente ao

aciclovir e ao foscarnet.

Docosanol: inibe a fusão entre a membrana plasmática da célula hospedeira

e o envelope do HSV, bloqueando a entrada do vírus. É disponível em cremes

tópicos no tratamento de herpes labial recorrente.

Brivudina: atua como inibidor da DNA polimerase viral, após fosforilação

intracelular. Pode atuar como um substrato alternativo e, portanto, ser incorporado

pelo DNA viral, reduzindo sua integridade e prejudicando seu funcionamento. Esta

disponível para uso tópico e oral no tratamento de infecções causadas pelo HSV-1.

Ganciclovir: atua na DNA polimerase viral, onde é fosforilado a trifosfato de

ganciclovir, sendo então incorporado como monofosfato de ganciclovir ao DNA viral,

impedindo sua replicação. É encontrado em formas intravenosas, orais e implantes

intra-oculares.

Todas as informações sobre a terapia anti-HSV-1 e anti-HSV-2 aqui

apresentadas encontram-se na literatura consultada (CASSADY; WHITLEY, 1997;

BRADY; BERNSTEIN, 2004; DE CLERCQ, 2004, 2005).

Revisão Bibliográfica 23

2.2 Ácido gálico e seus ésteres n-alquílicos

O ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico - AG) é um composto fenólico

presente em diversas plantas, que pode ser obtido através de hidrólise ácida ou

alcalina de taninos. Seus ésteres n-alquílicos, também conhecidos como galatos, em

especial o galato de propila, octila e dodecila, são utilizados como aditivos

antioxidantes em alimentos, para prevenir mudanças no sabor e no valor nutritivo

devido à oxidação de gorduras insaturadas (Figura 3) (VAN DER HEIJDEN;

JANSSEN; STRIK, 1986; KUBO et al., 2002a; MUNOZ et al., 2002; OW; STUPANS,

2003).

Figura 3. Estrutura básica dos galatos. No ácido gálico, o radical R = H e nos

galatos, R = cadeia alquílica com número variável de carbonos.

Os galatos podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros

antioxidantes, como o hidroxitolueno butilado (BHT). Contudo a sua quantidade deve

permanecer dentro de limites estabelecidos. Nos EUA, o percentual permitido para

esta classe de antioxidantes é de 0,01% em qualquer tipo de alimento, já na

Holanda a quantidade permitida é de 0,01% em óleos e gorduras, como antioxidante

total, e de 0,04 e 0,01% na fração lipídica de biscoitos e sopas, respectivamente.

Este controle acerca da quantidade presente nos alimentos deve-se principalmente

a estudos anteriores a década de 60, onde o perfil toxicológico destas substâncias

foi traçado (para revisão ver VAN DER HEIJDEN; JANSSEN; STRIK, 1986), e aos

diversos relatos de sensibilização e dermatite de contato, em especial ao galato de

propila (BOJS; NICKLASSON; SVENSSON, 1987; POULSEN, 1991; HAUSEN;

BEYER, 1992; MAHENDRAN; QUINLAN; WILKINSON, 2002; MUNOZ et al., 2002)

A ação destes compostos sobre os radicais livres já foi bastante estudada, e

atualmente sabe-se que o tamanho da cadeia alquílica interfere nesta atividade, e

Revisão Bibliográfica 24

que algumas destas moléculas podem agir tanto como antioxidantes como pró-

oxidantes (GUNKEL et al., 1998; KUBO et al., 2002a; YOSHINO et al., 2002; HA;

NIHEI; KUBO, 2004; AZMI et al., 2005). Sua atividade benéfica está relacionada com

a prevenção da formação de radicais superóxido e de ácido úrico através da inibição

da enzima xantina oxidase, além da modulação da atividade da mieloperoxidase e

seqüestro de ácido hipocloroso (KUBO et al., 2002a; MASUOKA; NIHEI; KUBO,

2006; ROSSO et al., 2006). Já a ação pró-oxidante é cobre-dependente, e resulta

em quebras na molécula de DNA e formação de 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina, dano

reconhecidamente provocado por espécies reativas de oxigênio (YOSHINO et al,

2002; AZMI et al., 2005).

Além da atividade antioxidante, diversas outras atividades biológicas já foram

descritas para este grupo de moléculas. As observações feitas variam enormemente

entre si, entretanto, tornou-se inquestionável o fato de que o tamanho da cadeia

alquílica interfere nas atividades biológicas, porém não existe um padrão para tal,

sendo necessária a avaliação de cada caso. Dentre as atividades relatadas estão:

influência sobre enzimas hepáticas (OW; STUPANS, 2003), sobre 5-alfa-redutases

envolvidas no processamento de hormônios como a testosterona (HIIPAKKA et al.,

2002), e sobre a esqualeno epoxidase, enzima relacionada com a biossíntese do

colesterol (ABE; SEKI; NOGUCHI, 2000); atividades antiinflamatória (MURASE et

al., 1999), vaso-relaxante (PAULINO et al., 1999) e neuroprotetora (BASTIANETTO

et al., 2006). Entretanto, grande parte dos esforços na busca por um melhor

entendimento das atividades biológicas destes compostos restringe-se ao âmbito da

sua utilização como agentes antineoplásicos e antiinfeciosos.

Na pesquisa do câncer, Feng e colaboradores (2003) relataram que os

galatos possuem atividade antimutagênica e de inibição de CYP1A, uma enzima do

metabolismo de xenobióticos da família do citocromo p450, enquanto que outros

pesquisadores demonstraram citotoxicidade e indução de apoptose em células

tumorais, modulação da glicoproteína P, envolvida no mecanismo de extrusão de

quimioterápicos, e supressão do gene do vírus tumoral mamário de camundongos

(BAER-DUBOWSKA; GNOJKOSWKI; FENRYCH, 1997; SAEKI et al, 2000; ABE et

al., 2001; GNOJKOSWKI; KRAJKA-KUZNIAK; BAER-DUBOWSKA, 2001; FIUZA et

al., 2004; KITAGAWA et al., 2005; FREY et al., 2006; VELURI et al., 2006)

Em relação à atividade dos galatos contra agentes infecciosos, grande parte

dos estudos tem demonstrado propriedades antibacteriana e antifúngica

(KUBO;

Revisão Bibliográfica 25

XIAO; FUJITA, 2001, 2002; FUJITA; KUBO, 2002a, b; KUBO; FUJITA; NIHEI, 2002;

KUBO et al., 2002b, 2003, 2004; STAPLETON et al., 2004; KREANDER; VUORELA;

TAMMELA, 2005; SHIBATA et al., 2005; HSU; CHANG; CHANG, 2007) e, mais

recentemente e, em menor número, ação antiviral (KANE et al., 1988; AHN et al.,

2000; SAVI et al., 2005; UOZAKI et al., 2006) e tripanocida (ALBINO, 2005).

Primeiramente, Kane e colaboradores (1988) relataram a potente inibição dos

vírus herpéticos tipo 1 e 2 pelo galato de metila, evidenciando a importância da

cadeia carbônica lateral e da presença de três hidroxilas na molécula para

manutenção da atividade. Além disso, demonstraram que a inibição do HSV-2 pelo

galato de metila é 40 e 110 vezes maior que a do ácido gálico e do galato de propila,

respectivamente.

Ahn e colaboradores (2000), em um estudo com diversos compostos fenólicos

com o grupamento galoil, também presente nos galatos, evidenciaram a importância

desta estrutura na atividade destes compostos contra a integrase do HIV-1; no

entanto, o AG apresentou uma fraca atividade em relação aos compostos com mais

de um grupamento galoil avaliados neste estudo.

Mais recentemente, a atividade anti-herpética de diversos galatos foi relatada

em um trabalho que estabeleceu uma série de relações estrutura-atividade para

estas moléculas, não somente no que diz respeito à ação anti-herpética, mas

também à sua ação antioxidante e sua genotoxicidade (SAVI et al., 2005). Ainda

mais recentemente, Uozaki e colaboradores (2006) demonstraram a atividade

antiviral pronunciada do galato de octila contra o HSV-1 e a capacidade deste

composto de acelerar a morte de células infectadas, e, também, sua atividade contra

dois vírus de RNA, o vírus da estomatite vesicular e o poliovírus.

Tendo em vista o potencial deste grupo de compostos na terapia anti-

herpética, o presente trabalho teve como objetivo principal o estudo do mecanismo

pelo qual os galatos inibem a replicação do HSV-1.

Objetivos 26

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

• Estudar a citotoxicidade e o mecanismo da ação anti-herpética in vitro do

ácido gálico e do galato de pentila.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a citotoxicidade e a ação anti-herpética (anti-HSV-1, cepa KOS) do

ácido gálico e 15 galatos em células VERO, através do ensaio colorimétrico do

MTT.

• Confirmar a atividade antiviral dos seis compostos que apresentaram melhor

ação antiviral numa triagem preliminar, através do ensaio de placas de lise e

selecionar os dois compostos com melhor atividade antiviral confirmada

(ácido gálico e galato de pentila).

• Avaliar a possível atividade virucida destes dois compostos.

• Avaliar a possível ação destes compostos na adsorção e penetração viral.

• Avaliar a influência destes compostos na multiplicação viral em função do

tempo, através da sua adição em diferentes períodos pós-infecção.

• Avaliar o possível sinergismo destes compostos com o aciclovir.

• Avaliar a possível interferência destes compostos na síntese do DNA viral,

através da técnica de PCR.

• Avaliar a possível interferência destes compostos na expressão gênica viral,

em diferentes fases da replicação viral, utilizando a técnica de RT-PCR.

• Avaliar a possível interferência destes compostos na expressão de proteínas

virais, em diferentes fases da replicação viral, através do ensaio de Western

Blotting.

• Propor o mecanismo de ação anti-herpética para estes dois compostos.

Artigo submetido para publicação 27

4 ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO 1

Periódico: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 3

Fator de Impacto (JCR 2005): 4,379 4

In Vitro Antiherpetic Activity and Mode of Action of Gallic Acid and Pentyl Gallate 6

Antiviral Activity of Gallic Acid and Pentyl Gallate 7

Jadel Müller Kratz

, Carla Regina Andrighetti-Fröhner

1,3,4

, Deise Juliana Kolling

, Paulo César 9

Leal

, Ricardo José Nunes

, Rosendo Augusto Yunes

, Tomas Bergström

, Edward Trybala

, 10

Célia Regina Monte Barardi

, Cláudia Maria Oliveira Simões

Laboratory of Applied Virology,

Department of Pharmaceutical Sciences,

Department of 13

Microbiology and Parasitology, 14

Laboratory of Synthesis and Structure-Relationship, Department of Chemistry, 15

Universidade Federal de Santa Catarina, UFSC, Campus Universitário Trindade, Florianópolis, 16

SC, Brazil. 17

Department of Clinical Virology, Göteborg University, Göteborg, Sweden. 18

Corresponding author. Mailing address: Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC, 20

Departamento de Ciências Farmacêuticas, CCS, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), 21

Campus Universitário Trindade, Florianópolis, 88040-900, SC, Brasil. 22

Tel.: +55-48-3331-5207; fax: +55-48-3331-9258. 23

E-mail address:

[email protected] (Cláudia M. O. Simões). 24

Artigo submetido para publicação 28

ABSTRACT 25

Gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid - GA) is a phenolic compound present in a great variety 26

of plants. Its synthetic n-alkyl esters, also known as gallates, especially propyl, octyl and dodecyl 27

gallates, are vastly employed as antioxidants by food, cosmetic and pharmaceutical industries. 28

The inhibitory effects of GA and fifteen gallates on herpes simplex virus type 1 (HSV-1) 29

replication were investigated. After a preliminary screening, GA and pentyl gallate (PG) seemed 30

to be the most active compounds and had their mechanism of action studied through a set of 31

assays, which attempted to localize the point in the viral replication cycle where impairment 32

occurred. Their mechanism of antiviral activity seem to be mediated, at least in part, by reduced 33

viral infectivity (only PG), inhibition of virus attachment and entry to cells, impaired levels of 34

viral capsid protein ICP5, α protein ICP27 and envelope proteins gB, gC, gD and gE, as well as 35

by interference with gD protein synthesis due to blockage of gD mRNA synthesis (only PG). 36

Although the combination of GA and PG with acyclovir resulted in no interaction, the detected 37

multiple modes of action of both compounds suggest that further studies are merited. 38

Artigo submetido para publicação 29

INTRODUCTION 47

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is an enveloped DNA virus that causes one of the most 48

common viral infections in humans, leading to a variety of diseases ranging from mild to severe 49

and sometimes life-threatening. Immunocompromised patients are at increased risk of severity 50

and recurrence of HSV-1 infection. In addition, HSV-1 and HSV-2 may facilitate the 51

transmission of human immunodeficiency virus (HIV) (6, 9, 51, 52). 52

The sequentially ordered transcriptional program of HSV-1 is regulated by viral and cellular 53

factors. The vírion-associated factor α-TIF in association with two cellular factors Oct1 and HCF 54

promote expression of the immediate-early (α – IE) mRNAs, encoding the infected-cell proteins 55

ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 and ICP47. After the activation of the transcriptional machinery, early 56

(β – E) genes, such as DNA polimerase and thymidine kinase are expressed followed by viral 57

genome replication and late (γ – L) gene expression, which leads to the production of structural 58

proteins such as glicoprotein B (gB). Inhibition of any of these stages blocks HSV-1 replication 59

and, consequently, is a potential target for antiviral therapy (12, 21, 36, 52). 60

Several nucleoside analogues have been approved for clinical use. Among those, acyclovir is 61

widely used for the systemic treatment of HSV infections. It is a highly selective antiviral agent 62

because it is specifically phosphorylated by viral thymidine kinase in infected cells (12). 63

However, acyclovir-resistant HSV infection in immunocompromised patients such as 64

transplanted patients and patients with AIDS has recently been observed. Therefore, it is 65

desirable to develop new anti-HSV agents in order to substitute or complement acyclovir (8, 12, 66

14). 67

The gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) is a phenolic compound present in a great variety 68

of plants. Its synthetic n-alkyl esters, also known as gallates, especially propyl, octyl and dodecyl 69

Artigo submetido para publicação 30

gallates, are vastly employed as antioxidants by food, cosmetic and pharmaceutical industries 70

(27, 49). 71

Besides the antioxidant activity, other biological activities have been described for this group of 72

molecules. The reports vary enormously, but one aspect has become very perceptible: the 73

variable influence of the alkyl chain on the profile of the biological activities. Among them, it can 74

be cited their influence on hepatic enzymes (34), anti-inflammatory activity (32), neuroprotective 75

effects (4), and mainly anticancer (15, 16, 23, 50), antibacterial and antifungal properties (17, 24, 76

25, 26, 28, 46). 77

There are few reports about the antiviral activity of n-alkyl esters of gallic acid. In 1988, a study 78

described the potent inhibition of HSV-1 and HSV-2 by methyl gallate (20). In 2000, as part of 79

the screening of phenolic compounds against HIV-1 integrase, gallic acid was found to be active 80

(1). More recently, the anti-herpetic activity of several gallates was described by our research 81

group, which proposed various structure-relationships regarding the antiviral, antioxidant and 82

genotoxic effects (38). Furthermore, the pronounced anti-HSV-1 activity of octyl gallate, its 83

ability to induce the death of infected cells, and its inhibitory effect against RNA viruses were 84

also recently demonstrated (48). 85

In the present study, gallic acid and fifteen gallates were screened for anti-HSV-1 activity, 86

followed by the selection of the most promising compounds and the study of their mechanism of 87

antiviral action. 88

Artigo submetido para publicação 31

MATERIALS AND METHODS 94

Compounds. Gallic acid and all the gallates used in this study (Fig. 1) were synthesized as 95

described previously (38). The compounds (50 mM) were dissolved in dimethyl sulphoxide, 96

stored at -20°C protected from light, and further diluted in culture medium prior to use. Acyclovir 97

was purchased from Sigma® (St. Louis, MO, USA). 98

Cells and viruses. African green monkey kidney (Vero) cells (ATCC:CCL 81, Rockville, MD, 99

USA) were grown in minimum essential medium (MEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 100

supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS – Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 101

penicillin (100U/ml), streptomycin (100 µg/ml) and amphotericin B (25 µg/ml). African green 102

monkey kidney (GMK AH1) cells (obtained from Department of Clinical Virology, Göteborg 103

University, Göteborg, Sweden) were grown in Eagle’s minimum essential medium (EMEM, 104

Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) supplemented with 2% newborn calf serum (NCS, Gibco 105

BRL, Grand Island, NY, USA) and 0.05% Primaton RT substance (Kraft Inc., Norwich, CT, 106

USA), penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 µg/ml). The cell cultures were maintained at 107

37°C in a humidified 5% CO

atmosphere. HSV-1 strains, KOS (obtained from Laboratory of 108

Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, University of Rennes, France) and KOS 321, a plaque 109

purified isolate of wild-type strain KOS (19), were propagated in Vero and GMK AH1 cells, 110

respectively. Stock viruses were prepared as described previously (41). After three cycles of 111

freezing/thawing the fluids were titrated on the basis of PFU count as previously described (7) 112

and stored at -80°C until use. 113

Virus purification. Extracellular HSV particles were purified as previously described (22), with 114

some modifications. Briefly, GMK AH1 cells were infected with HSV-1, KOS 321 strain, at a 115

multiplicity of infection (MOI) of 3 PFU per cell. After 1–2 h of incubation at 37°C, 20 µCi/ml of 116

methyl-[

H] thymidine (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) were added and the 117

Artigo submetido para publicação 32

cells were incubated for 48 h at 37°C. All subsequent steps of the procedure were carried out at 118

4°C. The cells and the infectious medium were harvested and centrifuged for 15 min at 1,000xg. 119

The supernatant medium was further clarified by centrifugation for 7 min at 5,000xg, and then 120

centrifuged for 2 h at 22,000xg. The resulting viral pellet was stored overnight at 4°C and 121

resuspended in PBS. The virus suspension was loaded on top of a discontinuous sucrose gradient 122

consisting of 2 ml each of 50, 40 and 30% sucrose in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA at pH 7.4, 123

and centrifuged for 2 h at 20,000 rpm (SW28.1 rotor, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). 124

The 40/50% interphase band was aspirated, diluted in PBS and centrifuged for 90 min at 19,000 125

rpm (SW28.1 rotor). The resulting viral pellet was washed twice with PBS, then dissolved in the 126

same buffer and stored at 4°C. The specific activity (counts per minute [cpm]/PFU) was 1.29 x 127

–2

for HSV-1, KOS 321 strain. 128

Cytotoxicity evaluation. Vero or GMK-AH1 cells were seeded into 96-well microplates 129

(Corning, Corning, NY, USA) at 2.5 x 10

cells per well. After 24h, cells were treated with 130

compounds at 37°C in a humidified 5% CO

atmosphere for 72h at concentrations ranging from 131

7.8 to 1000 µM (ratio 1:2). Cell viability was assessed by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-132

diphenyl tetrazolium bromide] assay (47). Each experiment was repeated three times, and the 133

concentration (CC

) of each compound that inhibited cellular growth to 50% in comparison to 134

untreated controls was estimated by nonlinear regression of concentration-response curves 135

generated from these data. 136

Screening of in vitro anti-HSV-1 effect. Vero cells were seeded into 96-well microplates 137

(Corning, Corning, NY, USA) at 2.5 x 10

cells per well. After 24h, cells were infected with 138

HSV-1 at a MOI of 0.5 at 37°C in a humidified 5% CO

atmosphere and treated for 72h with non 139

cytotoxic concentrations of each compound. Cell, viral and acyclovir (100 µM) controls were run 140

simultaneously. The same method used to evaluate cell viability with MTT was followed. Each 141

Artigo submetido para publicação 33

experiment was repeated three times and the 50% inhibitory concentration (IC

) of each 142

compound was calculated as [(A-B)/(C-B) x 100], where A, B and C indicate the absorbances of 143

the tested compound, virus and cell controls, respectively. 144

Plaque reduction assay. This assay followed the procedures previously described (29) with 145

minor modifications. Acyclovir (10 µM) was used as a positive control. Vero cells were seeded 146

into 24-well microplates (Corning, Corning, NY, USA) at 2.5 x 10

cells per well. After 24h, 147

cells were incubated with 100 PFU of HSV-1. After 1h of adsorption at 37°C, the cells were 148

washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) and overlayed with MEM + 1.5% 149

carboxymethylcellulose (CMC) containing or not different concentrations of the compounds. 150

After 72h at 37°C in a humidified 5% CO

atmosphere, the overlay medium was removed and the 151

cells were fixed and stained with naphtol blue-black (Sigma®, St. Louis, MO, USA). The 152

inhibitory activity (%) of each compound was determined by the following formula: (Number of 153

plaques control – Number of plaques experiment) X 100 / (Number of plaques control). Each 154

experiment was repeated three times, and the concentration that inhibited 50% of plaque 155

formation (IC

) in comparison to untreated controls was estimated by nonlinear regression of 156

concentration-response curves generated from these data. 157

Direct virucidal assay. This assay followed the procedures previously described (41). Gallic 158

acid (GA) and pentyl gallate (PG) at 125 µM were mixed, individually, with an equal volume of 159

HSV-1 suspension for 2h at 37°C. Each mixture was then serially diluted 10-fold and their 160

residual infectivity was determined by plaque reduction method, as described above. 161

Time-of-addition study. This assay followed the procedures described previously (29) with 162

minor modifications. Vero cells were seeded into 24-well microplates (Corning, Corning, NY, 163

USA) at 2.5 x 10

cells per well. After 24h, cells were incubated with HSV-1 at a MOI of 0.1 and 164

125 µM of GA or PG was added into wells either prior to infection (-3h), concomitantly with 165

Artigo submetido para publicação 34

infection (0h) or at intervals of 2, 4, 6, 8, 12, 16 or 24h post-infection. After 25h of infection at 166

37°C in a humidified 5% CO

atmosphere, cells were submitted to three cycles of 167

freezing/thawing and the virus titre of each supernatant was determined by plaque assay, as 168

described above. 169

Inhibition of virus attachment assay. (a) This assay followed the procedures described 170

previously (39) with minor modifications. Vero cells were seeded into 24-well microplates 171

(Corning, Corning, NY, USA) at 2.5 x 10

cells per well. After 24h, cells were incubated with 172

100 PFU of HSV-1 in the presence or absence of different concentrations of GA or PG for 2h at 173

4°C. Then the virus inocula and the compounds were removed, cells were washed three times 174

with PBS and the inhibitory activity of the compounds was determined by the plaque reduction 175

assay, as described above. (b) GMK AH1 cells in 24-well microplates were pre-cooled for 30 176

min at 4 °C. Serial two-fold dilutions of compounds were mixed with purified radiolabelled 177

HSV-1 KOS 321 in PBS supplemented with 1 mM CaCl

and 0.5 mM MgCl

(PBS-A) and were 178

incubated for 15 min at 37°C. Cells were washed with cold PBS-A, the virus-compound mixture 179

was added, and the plates were left for virus adsorption for 2 h at 4°C under moderate agitation. 180

Subsequently, the cells were washed three times with PBS-A and lysed with PBS-A containing 181

5% SDS. The lysates were transferred to scintillation vials for radioactivity quantification. The 182

results are expressed as a percentage of attached viral cpm found with test compound-treated 183

vírions relative to mock-treated controls. Values shown are means of four determinations from 184

two separate experiments. 185

Inhibition of virus entry assay. This assay followed the procedures described previously (40) 186

with minor modifications. Briefly, mixtures of GA or PG (125 µM) and radiolabelled virus in 187

serum-free EMEM were pre-incubated for 15 min at 37°C prior to the addition to GMK AH1 188

cells in 12-well microplates and subsequent incubation for 3 h at 37°C. After twice washing with 189

Artigo submetido para publicação 35

PBS, cells from six wells were harvested for radioactivity quantification as in the virus 190

attachment assay. The remaining cells were incubated with warm citrate-buffered saline (pH 3) 191

for 1 min, then washed twice with PBS and treated with pronase (200 µg/ml; Sigma®, St. Louis, 192

MO, USA) for 15 min at 37°C. The cells were harvested and washed twice with PBS by 193

centrifugation at 250xg for 5 min. Half of the volume of sedimented cells was mixed with 5% 194

SDS and subjected to quantification of radioactivity, whereas the remaining cells were lysed with 195

1% NP40 solution in hypotonic phosphate buffer and centrifuged for 10 min at 800xg to sediment 196

the nuclei. The sedimented fraction was lysed with 5% SDS and subjected to quantification of 197

radioactivity. The results are expressed as a percentage of cpm found with test compound-treated 198

virions relative to mock-treated controls. Values shown are means of four determinations from 199

two separate experiments. 200

Extraction of total cellular DNA and RNA. Vero cells (2.0 x 10

) were seeded into 25 cm

201

culture flasks (Corning, Corning, NY, USA). After 24h, cells were incubated or not with HSV-1 202

at a MOI of 0.1 for 1h at 37°C. Then, cells were washed three times with PBS and incubated in a 203

humidified 5% CO

atmosphere at 37°C in the presence or absence of 125 µM of GA or PG and 204

harvested at various times. For DNA extraction, at 2, 4, 8, and 16h post-infection, cells were 205

lysed with 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5% SDS (w/v), and 100 µg/ml proteinase 206

K, at 37°C for 30 min. The samples were then extracted with an equal volume of phenol-207

chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1), followed by extraction with an equal volume of 208

chloroform (CHCl

). The nucleic acids were precipitated from the aqueous phase using 3 209

volumes of cold 100% isopropanol. The resulting pellets were washed with cold 70% (v/v) 210

ethanol and suspended in 50 µl of Milli-Q water (37). For RNA extraction, 8h post-infection, 1ml 211

of Trizol® reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added to cells and RNA was extracted 212

Artigo submetido para publicação 36

according to the manufacturer instructions. The concentrations of DNA and RNA samples were 213

determined by measuring the optical density at 260/280 nm. 214

Synthesis of first-strand cDNA. For cDNA synthesis, a two-step RT-PCR using the ImProm-215

II® Reverse Transcription System (Promega, Southampton, UK) was performed according to the 216

manufacturer instructions. Aliquots of 5 µg of RNA, 0.06 µg/ml of random primers (Invitrogen, 217

Carlsbad, CA, USA), and 10 U of RNAse OUT® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were used. 218

Annealing and first-strand synthesis were carried out at 25°C for 5 min and at 42°C for 60 min, 219

respectively. 220

PCR. The assay followed the procedures described previously (29) with minor modifications. 221

Briefly, 5 µl of cDNA or total cellular DNA were mixed with 35 pmoles of primers, 1.5 U of Taq 222

polymerase, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.01 mM EDTA, 5% glycerol, 1.5 mM 223

MgCl

, 0.2 mM of each dNTP and water in a total volume of 50 µl. The oligonucleotide primer 224

pairs were as follows: for gB (amplicon, 341 bp), 5’-CTGGTCAGCTTTCGGTACGA-3’ and 3’-225

GTTTGTCGACGTGCTGGAC-5’; for ICP0 (amplicon, 157 bp), 5’-226

TTCGGTCTCCGCCTGAGAGT-3’ and 3’-AGCATACGCCGACCTCCCAG-5’; for ICP27 227

(amplicon, 289 bp), 5’-TTTCTCCAGTGCTACCTGAAGG-3’ and 3’-228

GCTCAGCACCGACGCTCAACT-5’; for gD (amplicon, 222 bp), 5’-229

ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA-3’ and 3’-GTATGGCCTTGCGTGGT GTGTT-5’; 230

for β-actin as PCR control (amplicon, 461 bp), 5’-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3’ and 3’-231

CAGAAACGCCTACAGGTGC-5’ (5, 13, 30). The PCR amplification was carried out at the 232

following settings: denaturing temperature of 94°C for 1 min, annealing temperature of 53°C for 233

1 min, and elongation temperatures of 72°C for 2 min for the first 25 cycles and then 72°C for 10 234

min for final extension. The amplified products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis 235

Artigo submetido para publicação 37

followed by ethidium bromide staining. The size of the amplified products was determined by 236

comparison with standard DNA markers (100 bp, Sigma®, St. Louis, MO, USA). 237

Western blotting analysis. This assay followed the procedures described previously (29) with 238

minor modifications. Vero cells were seeded into 6-well microplates (Corning, Corning, NY, 239

USA) at 6.0 x 10

cells per well. After 24h, cells were incubated or not with HSV-1 at a MOI of 240

0.1 for 1h at 37°C. Then, cells were washed three times with PBS and 125 µM of GA or PG was 241

added. The plates were incubated in a humidified 5% CO

atmosphere at 37°C for 18h. Extracted 242

cellular proteins (~50 µg – Bradford) were dissolved in the dissociation buffer (2% sodium 243

dodecyl sulfate (SDS), 5% β-mercaptoethanol, 0.125 M Tris-HCl, 30% glycerol, 0.8% 244

bromophenol blue, and phenylmethylsulfonyl fluoride (100 µg/ml - PMSF) (Sigma®, St. Louis, 245

MO, USA) and boiled for 5 min. Then proteins were resolved by 10% SDS-PAGE and 246

transferred to Immobilon PVDF® membranes (Millipore®, Billerica, MA, USA). Membranes 247

were blocked overnight with 10% nonfat dry milk in Tris-Base saline buffer (TBS), and then 248

were incubated with the following antibodies: mouse monoclonal antibodies raised against HSV-249

1 γ proteins gD and gC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; [42, 43], 250

respectively); rabbit polyclonal antibody raised against HSV-1 γ protein ICP5 (kindly provided 251

by Dr. G. Cohen and Dr. R. Eisenberg, University of Pennsylvania, Philadelphia); and goat 252

polyclonal antibody raised against HSV-1 α protein ICP27 (Santa Cruz Biotechnology, Santa 253

Cruz, CA, USA). Specific reactive proteins were detected by diaminobenzidine (DAB) 254

colorimetric reaction, after incubation with a rabbit anti-mouse, a swine anti-rabbit or a donkey 255

anti-goat immunoglobulin secondary antibodies, respectively, linked to horseradish peroxidase. 256

ELISA. The assay followed the procedures described previously (33). Briefly, serial two fold 257

dilutions of compounds were mixed with HSV-1 suspension, KOS 321 strain (MOI 0.1) and were 258

Artigo submetido para publicação 38

incubated for 10 min at room temperature. The mixtures were added to GMK AH1 cells in 96-259

well microplates and incubated at 37°C for 24h. Then, cells were washed with PBS and fixed 260

with 0.25% glutaraldehyde in PBS for 10 min at room temperature. Thereafter, cells were washed 261

repeatedly and blocked with 2% BSA in PBS for 30 min at room temperature and incubated with 262

monoclonal antibodies B1C1B4 (anti-gC-1), B11D8 (anti-gB) or B1E6A5 (anti-gE) (42, 43) for 1 263

h at room temperature. After incubation, cells were washed three times with PBS and incubated 264

with alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch 265

Laboratory, Newmarket, Suffolk, UK). Finally, cells were washed three times with PBS and 266

incubated with diethanolamine buffer containing ρ-nitrophenyl phosphate. Absorbance value of 267

the supernatant was measured at 405 nm with background subtraction at 690 nm. Each 268

experiment was repeated three times, and the concentration that inhibited 50% of absorbance 269

(IC

) in comparison to untreated controls was estimated by nonlinear regression of 270

concentration-response curves generated from these data. 271

Drug combination assay. This assay followed the procedures described previously (18) with 272

minor modifications. A plaque reduction assay was performed as described above, and the 273

treatment consisted in GA, PG or acyclovir alone (0.125 x IC

, 0.25 x IC

, 0.5 x IC

, 1 x IC

, 274

2 x IC

), and the mixture of varying concentrations of each compound in a fixed ratio (i.e. 0.5 x 275

of GA + 0.5 x IC

of acyclovir; 0.25 x IC

of GA + 0.25 x IC

of PG). Based on the 276

inhibitory activities, the synergistic or antagonistic antiviral effect among compounds was 277

determined using the software MacSynergy II (kindly provided by Dr. Mark Prichard, University 278

of Michigan), through a three-dimensional analytical method (35). 279

Statistical analysis. Data were presented as means ± standard deviations, and the differences 280

between groups were assessed with Student’s t test or one-way ANOVA + SNK post test. 281

Artigo submetido para publicação 39

RESULTS 282

Cytotoxicity evaluation and screening of in vitro anti-HSV-1 effect. As shown in Table 1, 283

gallic acid and its alkyl esters were evaluated for their cytotoxicity and anti-HSV-1 activity in 284

Vero cells by MTT assay. After 72h of treatment, cytotoxic effects increased along with the 285

number of carbons in the alkyl moiety, reaching maximum effect at carbon number 11 (undecyl 286

gallate), while compounds with a longer alkyl chain were gradually less cytotoxic. Similar results 287

were obtained with GMK-AH1 cells (data not shown). After the determination of cytotoxic 288

concentrations, gallic acid and gallates were screened for their anti-HSV-1 activity, in which, 289

different degrees of antiviral activity were found. While gallates with more than seven carbons in 290

the alkyl moiety had little effects in viral replication, in exception of nonyl and octadecyl gallates, 291

gallic acid and the other gallates showed a concentration-depended response, with IC

values 292

varying from 15.0 to 288.5 µM. Analyzing the results presented in Table 1, we selected six 293

compounds (gallic acid, methyl, ethyl, propyl, butyl and pentyl gallates) which presented a good 294

ratio between cytotoxicity and anti-HSV-1 activity (higher SI values) in order to confirm their 295

antiviral activity by a plaque reduction assay. Octadecyl gallate was excluded due to its low 296

solubility in aqueous media. 297

Gallic acid and pentyl gallate presented higher percentages of HSV-1 inhibition. To confirm 298

and further select the best candidates to have their mechanism of action studied, we performed a 299

plaque reduction assay with the six compounds chosen in the MTT screening. Acyclovir was 300

used as positive control (IC

= 0.43 ± 0.1 µM). After 72h of treatment, the IC

values were 57.1 301

± 2.3 µM for gallic acid, 102.4 ± 2.7 µM for methyl gallate, 112.5 ± 19.7 µM for ethyl gallate, 302

110.8 ± 20.7 µM for propyl gallate, 101.5 ± 26.6 µM for butyl gallate and 45.4 ± 2.5 µM for 303

pentyl gallate. As shown in Fig. 2, at the highest concentration evaluated (125 µM), only gallic 304

Artigo submetido para publicação 40

acid and pentyl gallate thoroughly inhibited HSV-1 replication. Thus the following study was 305

focused on these compounds. 306

Effect of GA and PG on viral infectivity. In order to evaluate the direct virucidal effect of 307

compounds, 3.75 x 10

PFU of HSV-1 were incubated with 125 µM of GA and PG for 2h at 308

37°C. The results demonstrated that GA had no effect on the viral infectivity (data not shown) 309

while PG reduced the virus titre in over 3 log

when compared to virus control, with a 310

percentage of inhibition of 99.9 ± 0.1%. 311

Time-of-addition studies of GA and PG on viral replication. Time course experiments were 312

performed to investigate in which step of the replication process GA and PG inhibited HSV-1 313

replication. 125 µM of each compound were added either prior to infection (-3h), concomitantly 314

with infection (0h) or at intervals of 2, 4, 6, 8, 12, 16 or 24h post-infection, and infected cells 315

were harvested at 25h post-infection. The effect on virus yield was determined by plaque 316

reduction assay. The results showed that GA or PG completely inhibited virus yield when added 317

at 0-8h post-infection, and this activity remained important when compounds were added 12h 318

post-infection (Fig. 3). Delaying the time of adding PG did not critically affect its antiviral 319

activity, since 85.7 ± 0.1% of inhibition is still observed when PG is added 24h post-infection. 320

Nonetheless, when GA was added 16h post-infection its antiviral activity decreased to 60.7 ± 321

1.0% of inhibition and at 24h post-infection no significant reduction in virus yield was observed. 322

These results indicate that GA and PG may affect late stages of HSV-1 replication, even though 323

GA activity is dramatically decreased at 24h post-infection. 324

Also, during the time-of-addition experiments, in order to evaluate the effects of GA and PG on 325

prophylaxis of HSV-1 infection, Vero cells were incubated with each compound for 3h prior to 326

infection. The results indicated that both compounds did not exert any significant effect on the 327

Artigo submetido para publicação 41

number of HSV-1 plaques when compared to untreated controls (data not shown), thus, neither 328

GA nor PG possess in vitro prophylactic effect on HSV-1 infection. 329

Effect of GA and PG on virus attachment and entry. To further elucidate whether GA and PG 330

antiherpetic activity was related to blocking the early events of HSV-1 infection, their effect on 331

virus attachment and entry were investigated. Figure 4 shows the effect of each compound on the 332

attachment of HSV-1 to GMK AH1 cells. Both compounds inhibited virus attachment, although 333

GA presented a superior effect, with an IC

value of 23.9 ± 9.4 µM. PG presented substantial 334

inhibition of virus attachment only at 125 µM, with 51.0 ± 4.6% of inhibition. Since similar 335

results were obtained in the modified plaque reduction assay in Vero cells (data not shown), the 336

pre-treatment of virus with compounds was not required for the inhibition of its attachment to 337

cells, which suggests that the blockage of viral attachment component(s) rather than the 338

disintegration of viral particles by GA and PG was responsible for the observed effects. The entry 339

of HSV-1 into GMK AH1 cells was also investigated. Purified radiolabelled HSV-1 virions were 340

treated with GA or PG for 15 min at 37°C prior to their incubation with cells for 3 h at 37°C. The 341

amount of radiolabelled virus associated with intact cells (Figure 5; attachment), the low pH- and 342

pronase treated cells (Figure 5; entry 1 – cell entry), and the NP40 resistant nuclear fraction 343

(Figure 5; entry 2 – nucleus entry) were quantified, and compared with controls. The decreased 344

amounts of labeled HSV-1 in all these fractions suggest that GA and, in a lesser extension, PG 345

impaired the capability of the virus to attach to cells and to enter into the cell or into the nucleus. 346

However, the reduced cell- and nuclear-entry of HSV-1 might be a consequence of impairment in 347

the virus binding to cells. These results indicate that GA and PG affect early stages of HSV-1 348

replication. 349

Effect of GA and PG on HSV-1 DNA synthesis. We further defined whether GA and PG has 350

any effect on HSV-1 DNA replication, a key event during the complex transcription program of 351

Artigo submetido para publicação 42

the virus. After HSV-1 adsorption, total DNA was extracted at 2, 4, 8 and 16h post-infection and 352

viral DNA was analyzed by PCR using the ICP27 primer pair. As shown in Fig. 6A, HSV-1 353

DNA could not be detected in uninfected Vero cells (lane 1) but its presence was clearly verified 354

in HSV-1 infected cells (lanes 2 to 5). In relation to the effect of compounds, 125 µM of PG did 355

not suppressed viral DNA synthesis in Vero cells (Fig. 6C) since corresponding bands were 356

found in all points of the extraction. Although GA seemed to inhibited HSV-1 DNA synthesis 357

(Fig. 6B), its effect could not be determined since β-actin DNA, the internal control, was also 358

absent. The cause could not be determined, but hypothesis were raised in the discussion section 359

of this work. These results suggested that the antiherpetic activity of compounds is not related to 360

impairment of HSV-1 DNA synthesis in Vero cells. 361

Effect of GA and PG on HSV-1 gene expression in Vero cells. RT-PCR analysis was 362

performed to determine whether inhibition of gene expression caused the impairment of viral 363

protein production in GA and PG-treated cells. After HSV-1 adsorption, total RNA was extracted 364

at 8h post-infection and analyzed by RT-PCR. As show in Fig. 7, while ICP27, gB and gD 365

mRNAs were absent in uninfected Vero cells (lane 1) and present in HSV-1 infected cells (lane 366

2), the treatment with PG (125 µM) suppressed the expression of gD mRNA in the cells (lane 4). 367

Once again, the effect of GA could not be determined since β-actin RNA, the internal control, 368

was also absent. These results suggested that the decrease of gD proteins caused by PG was the 369

result of its impairment of gD mRNA expression in Vero cells. 370

Effect of GA and PG on HSV-1 protein synthesis. We also analyzed whether GA and PG 371

inhibition of HSV-1 replication was related to blocking the synthesis of proteins in Vero and 372

GMK AH1 cells. After cells have been treated with 125 µM of each compound for 18h (1 cycle 373

of HSV-1 replication), the expression of viral γ proteins gD (61 kDa), gC (130 kDa) and ICP5 374

Artigo submetido para publicação 43

(154 kDa) and α protein ICP27 (63 kDa) in Vero cells was determined by Western blotting 375

analysis. As shown in Fig. 8, while uninfected cells (lane 1) did not express these proteins, all of 376

them were detectable in HSV-1 infected Vero cells (lane 2). Treatment with 125 µM of GA (lane 377

3) and PG (lane 4) suppressed the expression of these proteins. Additionally, the effect of 378

compounds on the expression of viral γ proteins gB, gC and gE in GMK AH1 cells was 379

determined by an ELISA-based procedure. As shown in Table 2, both GA and PG presented 380

inhibitory effects, although in different degrees. PG presented IC

values at least 2.5 times lower 381

than GA, revealing its higher inhibitory effect against HSV-1 proteins synthesis. These results 382

suggest that GA and PG inhibit HSV-1 replication, in part, through the blockage of viral proteins 383

synthesis. 384

Combined effect of GA, PG and ACV on viral replication. In order to evaluate the possible 385

synergism among compounds and acyclovir, drug combination assays were performed with 386

combinations of GA, PG and ACV in various concentrations in a fixed ratio. The analyses were 387

done using the software MacSynergy II through a three-dimensional analytical method. Our 388

results demonstrated that the combined treatment with GA/PG, GA/ACV or PG/ACV presented 389

no significant interaction (data not shown). 390

391

392

393

394

395

396

Artigo submetido para publicação 44

DISCUSSION 397

In a previous study from our group, the antiviral activity of GA and its alkyl esters (gallates) 398

against HSV-1, strains KOS and 29R, was described (38). Although structure-relationships 399

regarding the antiviral, antioxidant and genotoxic effects were proposed, the mechanism of the 400

antiherpetic activity was not determined (38). Accordingly, in the present study, extemporaneous 401

preparations (in contrast with our previous study) of GA and 15 gallates were screened for their 402

in vitro anti-HSV-1 activity, and the best candidates had their mechanism of action studied. The 403

extemporaneous preparation was employed to minimize the possible degradation of compounds 404

in aqueous media stock solutions. 405

The screening process initiate with the evaluation of cytotoxic effects of compounds in Vero cells 406

followed by the determination of their antiviral activity by MTT assay. While cytotoxicity 407

increased along with the number of carbons in the alkyl moiety, GA and gallates with as much as 408

five carbons in the alkyl chain presented the optimum anti-HSV-1 activity (higher SI values) 409

among the evaluated compounds, and therefore, their anti-HSV-1 activity was confirmed by a 410

plaque reduction assay, in which, GA and PG were chosen due to their higher percentages of 411

HSV-1 inhibition at 125 µM (Fig. 2). 412

In the present study, we clarified the mechanism of the HSV-1 inhibition of GA and PG. The first 413

step was the evaluation of the interference of compounds on viral infectivity. Even though GA 414

did not present virucidal activity, the treatment with PG for 2h at 37°C reduced the virus titre in 415

99.9 ± 0.1% in a cell-free system. The direct virucidal activity was also found in other gallate 416

derivatives, such as epigallocatechin-3-gallate and octyl gallate (45, 48). 417

The pretreatment of cells with GA and PG did not affect viral multiplication, thus, neither GA 418

nor PG possess in vitro prophylactic effect on HSV-1 infection. However, the addition of GA and 419

PG concomitantly with virus, in specific conditions, revealed that both compounds affect virus 420

Artigo submetido para publicação 45

attachment and entry into cells (Fig. 4 and 5). These observations suggest that GA and PG affect 421

the virus infection process not through the binding to membrane molecules, but possibly 422

detaching viruses that have already bound to cell, perhaps by disturbance of viral glycoproteins 423

(11). 424

We found that GA and PG suppressed ICP27 protein synthesis in Vero cells. Since no inhibition 425

of its mRNA expression was detected, the mechanism by which compounds suppresses ICP27 426

synthesis remains unknown. ICP27 plays important roles in the post-transcription processing of 427

RNA, and acts as a γ RNA transporter from nucleus to cytoplasm, regulating the synthesis of γ 428

proteins (31, 36, 44, 52). Accordingly, we found that the production of gB, gC, gD, gE and ICP5 429

proteins was attenuated in infected cells treated with 125 µM of GA and PG (Fig. 8 and Table 2). 430

These results suggested that the antiviral activity of GA and PG may be in part related to the low 431

levels of viral proteins, however, the protein synthesis impairment cannot be fully understood, 432

since, in despite of ICP27 depletion, the addition of tested compounds 12h post-infection still 433

inhibited HSV-1 replication, and the decreased expression of gD mRNA was detected only in PG 434

treated cells but not in those GA treated (Fig. 7). 435

Additionally, we examined the effect of compounds on the HSV-1 DNA synthesis. While PG 436

presented no effect, GA seemed to inhibited HSV-1 DNA synthesis, although its effect could not 437

be determined since β-actin amplicon, the internal control, was also absent. These results 438

suggested that the antiherpetic activity of compounds is not related to impairment of HSV-1 439

DNA synthesis in Vero cells. In order to find an explanation, the viability of infected Vero cells 440

treated with GA was evaluated by a trypan blue dye exclusion method. The results showed that 441

viability was not substantially affected when compared to untreated infected controls (data not 442

shown). In a further attempt, genotoxicity of GA and PG in Vero cells was evaluated by a 443

Artigo submetido para publicação 46

micronucleus assay, as previously described (2). While PG did not induce genotoxicity, the 444

results showed that concentrations as low as 31.2 µM of GA induced an increase in the number of 445

micronucleated cells when compared to controls (data not shown). Therefore, we believe that 446

DNA damage induced by GA may explain the failure of the amplification of β-actin and/or HSV-447

1 genes, since its ability to induce DNA damage is already described (38, 53). 448

During the course of our studies, Uozaki et al. (48) described the pronounced anti-HSV-1 activity 449

of octyl gallate, its ability to induce the death of infected cells, and its inhibitory effect against 450

RNA viruses. In their study, the antiviral activity and cytotoxicity increased along with the alkyl 451

moiety, reaching its maximum at carbon 12 (dodecyl gallate), although octyl gallate showed a 452

marked antiviral activity with a relatively moderate cytotoxicity. In our study, the cytotoxicity 453

presented a similar profile, although the antiviral activity was found only in gallates with as much 454

as 7 carbons in the alkyl moiety. The discrepancy between the studies may comes from the 455

different way in which antiviral activity was evaluated, as already supposed by the authors, when 456

referring to our previous work (38). 457

The results shown here indicated that GA and PG suppressed HSV-1 replication in Vero and 458

GMK AH1 cells (both African green monkey kidney cells) at multiple stages of virus infection, 459

as also observed in other studies on the antiviral activity of gallate-related compounds (10, 48) or, 460

for instance, tannins (11, 30). 461

From the present results, we hypothesize that the impairment of HSV-1 replication in GA- and 462

PG-treated Vero/GMK AH1 cells, at least in part, was related to (a) reduced viral infectivity 463

(only PG), (b) inhibition of virus attachment and entry to cells, (c) impaired levels of viral capsid 464

protein ICP5, α protein ICP27 and envelope proteins gB, gC, gD and gE, (d) interference with 465

gD protein synthesis due to blockage of gD mRNA synthesis (only PG). Although the 466

Artigo submetido para publicação 47

combination of GA and PG with acyclovir resulted in no interaction, the detected multiple modes 467

of action of both compounds suggest that further studies are merited. 468

469

470

471

472

473

474

475

ACKNOLEDGMENTS 476

477

This study was partially supported by a grant from CNPq/MCT/Brazil (project number 478

472748/2004-1). 479

R. J. Nunes, R. A. Yunes, C. R. M. Barardi and C. M. O. Simões are grateful to CNPq for their 480

research fellowships. J. M. Kratz, C. R. Andrighetti-Fröhner, D. J. Kolling and P. C. Leal 481

acknowledged their graduate and undergraduate research fellowships from CNPq/MCT/Brazil 482

and CAPES/MEC/Brazil. 483

484

485

486

487

488

489

490

Artigo submetido para publicação 48

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648

649

650

651

652

653

654

655

656

Artigo submetido para publicação 55

657

Figure 1. Chemical structures of gallic acid and its n-alkyl esters (gallates). 658

659

660

661

662

663

664

665

666

667

668

Artigo submetido para publicação 56

669

100

GA MG EG PrG BG PG ACV

Inhibition (%)

670

Figure 2. Effects of 125 µM of gallic acid (GA), methyl gallate (MG), ethyl gallate (EG), propyl 671

gallate (PrG), butyl gallate (BG), pentyl gallate (PG) and acyclovir (ACV – 10 µM) on HSV-1 672

replication in Vero cells determined by plaque reduction assay. Each bar represents the mean ± 673

standard deviation of three independent experiments. ANOVA/SNK tests were carried out as 674

described in Materials and Methods. Different letters indicate significant statistical differences 675

among groups (p<0.05). 676

677

678

679

680

681

682

683

684

Artigo submetido para publicação 57

685

100

0 2 4 6 8 12 16 24

Intervals Post-Infection (h)

Inhibition (%)

Gallic acid

Pentyl gallate

686

Figure 3. Kinetics of inhibition of HSV-1 replication by gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG). 687

Vero cells (2.5 x 10

) were infected with HSV-1 at a MOI of 0.1 and GA or PG (125 µM) were 688

added at the indicated times. Cells supernatants were collected at 25h post-infection and HSV-1 689

titers were determined as described in Materials and Methods. Each bar represents the mean ± 690

standard deviation of three independent experiments. * No significant differences between test 691

sample and virus control (Student’s t test; p>0.05). 692

693

694

695

696

697

698

699

Artigo submetido para publicação 58

700

701

Figure 4. Effect of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on HSV-1 attachment to GMK AH1 702

cells. Mixtures of each compound and purified radiolabelled HSV-1 were incubated for 15 min at 703

37°C prior to the addition to cells. After the virus adsorption for 2h at 4°C, cells were washed and 704

then lysed with 5% SDS to quantify radioactivity. The results are expressed as a percentage of the 705

average number of counts per minute (CPM) found with compound-treated virus relative to 706

mock-treated controls. Values shown are the means of four determinations from two separate 707

experiments ± standard deviation. 708

709

710

711

Artigo submetido para publicação 59

712

713

Figure 5. Effect of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on HSV-1 entry into GMK AH1 714

cells. Mixtures of each compound (125 µM) and radiolabelled HSV-1 were incubated for 15 min 715

at 37°C prior to the addition to and incubation with cells for 3 h at 37°C. The cells in some wells 716

were harvested by lysis with SDS and subjected to quantification of radioactivity (attachment 717

column). The cells in remaining wells were washed with citrate-buffered saline (pH 3), then 718

treated with pronase and half of the volume of detached cells were lysed to quantify

H label 719

(entry 1). The remaining cells were treated with 1% NP40 solution to quantify radioactivity in the 720

nuclear fraction (entry 2). The results are expressed as a percentage of the average number of 721

counts per minute (CPM) found with compound-treated virus relative to mock-treated controls. 722

Values shown are the means of four determinations from two separate experiments ± standard 723

deviation. 724

725

Artigo submetido para publicação 60

(A) 1 2 3 4 5

726

HSV-1 DNA 727

β-actin DNA 728

(B) 1 2 3 4

729

HSV-1 DNA 730

β-actin DNA 731

732

HSV-1 DNA 733

β-actin DNA 734

735

Figure 6. Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on HSV-1 DNA 736

synthesis in Vero cells detected by PCR. Vero cells (2 x 10

) were infected with HSV-1 (MOI 737

0.1) or were not infected in the presence or absence of GA or PG. The cells were harvested at 2, 738

4, 8 and 16h post-infection and total DNA was extracted with phenol-chloroform. The PCR was 739

Artigo submetido para publicação 61

done as described in Materials and Methods. Following the reaction, the amplified product was 740

run on a 1% agarose gel.

(A)

DNA extracted from uninfected Vero cells at 16 post-infection (lane 741

1) or from HSV-1 infected cells at 2, 4, 8 and 16h post-infection (lanes 2 to 5, respectively).

(B)

742

DNA extracted at 2, 4, 8 and 16h (lanes 1 to 4, respectively) post-infection from HSV-1 infected 743

Vero cells treated with 125 µM of GA.

(C)

DNA extracted at 2, 4, 8 and 16h (lanes 1 to 4, 744

respectively) post-infection from HSV-1 infected Vero cells treated with 125 µM of PG. 745

746

747

748

749

750

751

752

753

754

755

756

757

758

759

760

761

762

763

Artigo submetido para publicação 62

1 2 3 4

764

ICP27 765

gD 766

gB 767

β-actin 768

769

Figure 7. Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on HSV-1 gene 770

expression in Vero cells detected by RT-PCR. Vero cells (2 x 10

) were infected with HSV-1 771

(MOI 0.1) or were not infected in the presence or absence of GA or PG. The cells were harvested 772

at 8h post-infection and total RNA was extracted with Trizol®. The synthesis of first-strand 773

cDNA and the PCR were done as described in Materials and Methods.

Lane 1

, uninfected Vero 774

cells;

lane 2

, HSV-1 infected Vero cells in the absence of compounds;

lane 3-4

, HSV-1 infected 775

Vero cells treated with 125 µM of AG and PG, respectively. 776

777

778

779

780

781

782

Artigo submetido para publicação 63

ICP27 (63 kDa) 783

1 2 3 4

784

785

gD (61 kDa) 786

1 2 3 4

787

788

gC (130 kDa) 789

1 2 3 4

790

791

ICP5 (154 kDa) 792

1 2 3 4

793

794

Figure 8. Effects of 125 µM of gallic acid (GA) and pentyl gallate (PG) on HSV-1 protein 795

synthesis in Vero cells detected by Western blotting analysis. Vero cells (6 x 10

) were infected 796

with HSV-1 (MOI 0.1) or were not infected in the presence or absence of GA or PG. Lysates 797

(~50 µg of protein) were collected at 18h post-infection and run on an SDS-10% PAGE gel and 798

analyzed by immunoblotting with an anti-ICP27, -gD, -gC-, -ICP5 antibodies.

Lane 1

, uninfected 799

Vero cells;

lane 2

, HSV-1 infected Vero cells;

lane3

, HSV-1 infected Vero cells treated with GA; 800

lane 4

, HSV-1 infected Vero cells treated with PG. 801

802

Artigo submetido para publicação 64

Table 1. Anti-HSV-1 effect, cytotoxicity and selectivity indices of gallates on Vero cells 803

determined by MTT assay. 804

Compound

Cytotoxicity

(µM)

Antiviral Activity

(µM)

Selectivity Index

(SI)

Gallic acid 668.7 ± 54.4 17.1 ± 1.9 39.1

Methyl Gallate >1000 288.5 ± 25.4 >3.5

Ethyl Gallate 893.9 ± 107.2 142.1 ± 0.8 6.3

Propyl Gallate 713.2 ± 153.1 141.2 ± 16.4 5.1

Butyl Gallate 361.6 ± 92.8 67.5 ± 3.5 5.4

Pentyl Gallate 268.7 ± 45.2 29.1 ± 4.1 9.2

Hexyl Gallate 56.6 ± 5.7 37.3 ± 6.1 1.5

Heptyl Gallate 31.1 ± 2.3 16.0 ± 4.2 1.9

Octyl Gallate 17.6 ± 1.6 <50%

Nonyl Gallate 36.5 ± 3.3 15.0 ± 6.3 2.4

Decyl Gallate 17.4 ± 1.0 <50% -

Undecyl Gallate 15.4 ± 1.9 <50% -

Dodecyl Gallate 19.3 ± 2.7 <50% -

Tetradecyl Gallate 35.5 ± 6.7 <50% -

Hexadecyl Gallate 74.8 ± 22.6 <50% -

Octadecyl Gallate >1000 230.5 ± 46.7 >4.3

805

Values represent the mean ± SD for three independent experiments. 806

SI is the ratio of CC

and IC

. 807

Percentage of inhibition <50%, thus the SI values were not calculated. 808

was the concentration that showed 50% cellular cytotoxic effect and IC

was the 809

concentration that inhibited 50% of HSV-1 multiplication. 810

811

Artigo submetido para publicação 65

Table 2. Effects of gallic acid and pentyl gallate on HSV-1 protein synthesis in GMK AH1 cells 812

determined by ELISA. 813

814

Protein

Gallic acid

(µM)

Pentyl gallate

(µM)

gB 22.9 ± 7.4%

65.6 ± 7.2

gC 135.0 ± 33.8 44.7 ± 9.9

gE 127.9 ± 16.8 51.4 ± 11.1

815

Values represent the mean ± SD for three independent experiments. IC

was the concentration 816

that inhibited 50% of absorbance in comparison to untreated controls. 817

% of inhibition < 50%, consequently the IC

value was not calculated. 818

819

820

821

822

823

824

825

826

827

828

829

Discussão 66

5 DISCUSSÃO

Nosso grupo de trabalho, em um estudo anterior, descreveu a atividade

antiviral do ácido gálico (AG) e de seus ésteres n-alquílicos (galatos) contra o HSV-

1, cepas KOS e 29R (SAVI et al., 2005). Embora relações estrutura-atividade

tenham sido propostas no que se refere a sua atividade antiviral, antioxidante e

genotóxica, o seu mecanismo de ação anti-herpética não foi descrito (SAVI et al.,

2005). Tendo em vista este fato, no presente estudo a atividade anti-HSV-1 in vitro

de preparações extemporâneas do AG e de 15 galatos (Figura 1 do artigo) foi

avaliada e os melhores candidatos tiveram seu mecanismo de ação estudado.

Preparações extemporâneas foram utilizadas a fim de minimizar a possível

degradação (oxidação) dos compostos nas soluções-estoque em meio aquoso.

O processo de triagem teve início com a avaliação da citotoxicidade dos

compostos frente a células Vero e foi seguido da avaliação da atividade antiviral,

ambas realizadas através do ensaio colorimétrico do MTT. A citotoxicidade

aumentou em função do número de carbonos na cadeia alquílica, sendo que o AG e

os galatos com até cinco carbonos na cadeia alquílica apresentaram atividade

antiviral promissora (índices de seletividade superiores aos demais) (Tabela 1 do

artigo). Assim, a atividade anti-HSV-1 desses compostos foi confirmada através do

ensaio de redução de placas de lise, no qual o AG e o galato de pentila (GP) foram

selecionados para continuar os estudos, devido aos altos percentuais de inibição da

replicação do HSV-1 na concentração de 125 µM (Figura 2 do artigo).

No presente trabalho, está descrito o mecanismo da ação anti-herpética do

AG e do GP. O primeiro passo foi a avaliação da interferência dos compostos sobre

a infectividade do vírus. Nesta etapa, cada composto foi misturado com o fluído viral

e incubado por 2h a 37ºC. Após o período de incubação, a mistura foi diluída (1:10)

e titulada pelo ensaio de placas de lise. Embora o AG não tenha apresentado

atividade virucida, o tratamento com GP por 2h a 37°C reduziu o título viral em

99.9% na ausência de células. A atividade virucida direta já foi relatada para outros

compostos fenólicos, tais como o galato de 3-epigalocatequina e o galato de octila

(SONG; LEE; SEONG, 2005; UOZAKI et al., 2006).

O pré-tratamento das células com AG ou GP por 3h antes da infecção não

afetou a multiplicação do vírus, portanto, nem o AG nem o GP possuem efeito

Discussão 67

profilático in vitro contra a infecção por HSV-1. Entretanto, a adição de AG e GP

concomitantemente com o vírus, em condições específicas, revelou que ambos os

compostos afetam a adsorção e a penetração dos vírus nas células (Figuras 4 e 5 do

artigo). Estas observações, em conjunto, sugerem que o AG e o GP afetam o

processo de infecção do vírus não através da ligação a moléculas da membrana

celular, mas sim através do desligamento dos vírus que já haviam adsorvido às

células, possivelmente interferindo com as glicoproteínas virais (CHENG et al.,

2004).

Durante os estudos do mecanismo de ação, foi verificado que o AG e o GP

suprimiram a síntese da proteína viral precoce ICP27 em células Vero através do

ensaio de Western blotting. Já que nenhuma inibição da expressão de seu mRNA foi

detectada, o mecanismo pelo qual o AG e GP inibem a síntese desta proteína

continua desconhecido. A ICP27 desempenha importantes papéis no

processamento pós-transcricional do RNA e atua como um transportador de RNAs

tardios do núcleo para o citoplasma, desta forma regulando a expressão de

proteínas virais tardias (WHITLEY; ROIZMAN, 2001; ROIZMAN; GU; MANDEL,

2005; SMITH; MALIK; CLEMENTS, 2005; LARRALDE et al., 2006). Foi também

constatado que a produção das proteínas virais tardias gB, gC, gD, gE e ICP5

estava atenuada em células infectadas e tratadas com 125 µM de cada composto

(Figura 6 e Tabela 2 do artigo).

Estes resultados sugeriram que a atividade antiviral do AG e do GP pode

estar, ainda que em parte, relacionada com os baixos níveis de proteínas virais,

entretanto, a interferência na síntese protéica não pôde ser totalmente esclarecida,

uma vez que, não obstante a depleção da ICP27, a adição dos compostos 12h pós-

infecção ainda inibiu a replicação viral (Figura 3 do artigo), e a expressão reduzida

do mRNA da proteína gD foi detectada apenas nas células tratadas com o GP, e não

nas tratadas com o AG (Figura 8 do artigo).

Adicionalmente, foram avaliados os efeitos dos dois compostos sobre a

síntese do DNA viral (Figura 7 do artigo) através da PCR. Enquanto o GP não

apresentou efeito, o AG pareceu inibir a síntese do DNA viral, entretanto, seu efeito

não pôde ser determinado, pois o produto amplificado do gene da β-actina, o

controle interno da reação de PCR, também estava ausente. Estes resultados

sugeriram que a atividade anti-herpética dos compostos não está relacionada com a

interferência sobre a síntese do DNA do HSV-1. A fim de se encontrar uma

Discussão 68

explicação para o fato, a viabilidade de células Vero infectadas pelo HSV-1 e

tratadas com 125 µM de AG foi avaliada através do ensaio de exclusão do corante

Azul de Trypan. Os resultados mostraram que a viabilidade das células não foi

substancialmente afetada quando comparada com controles infectados, porém não

tratados (dados não mostrados). Em uma tentativa adicional, a genotoxicidade do

AG e do GP frente a células Vero foi avaliada através do ensaio do micronúcleo,

conforme metodologia descrita por Andrighetti-Fröhner e colaboradores (2006). O

GP não foi genotóxico nas condições experimentais utilizadas, entretanto os

resultados mostraram que, em concentrações iguais ou superiores a 31,2 µM de AG,

ocorreu um aumento no número de células micronucleadas quando comparado com

controles não tratados (dados não mostrados). Portanto, acredita-se que o dano ao

DNA causado pelo AG possa explicar a falha na amplificação dos genes da β-actina

e/ou do HSV-1, uma vez que esta capacidade do AG já foi descrita (YOSHINO et al.,

2002; SAVI et al., 2005).

Durante a realização deste estudo, Uozaki e colaboradores (2006)

descreveram a pronunciada atividade anti-HSV-1 do galato de octila, sua habilidade

de induzir a morte de células infectadas, e seus efeitos inibitórios sobre vírus de

RNA (VSV e poliovírus). Foi demonstrado que a citotoxicidade e a atividade antiviral

aumentaram em função do número de carbonos na cadeia alquílica, atingindo seu

máximo com 12 carbonos (galato de dodecila), sendo que o galato de octila

apresentou uma atividade antiviral marcante com uma moderada citotoxicidade.

Nesta dissertação, o perfil da citotoxicidade foi muito semelhante, entretanto a

atividade antiviral foi encontrada nos galatos com até sete carbonos na cadeia

alquílica. Esta discrepância entre os estudos está provavelmente relacionada com as

diferentes formas de avaliação da atividade antiviral, como já foi suposto pelos

próprios autores em seu estudo, quando discutem nosso trabalho anterior (SAVI et

al., 2005).

Os resultados aqui mostrados indicaram que o AG e o GP inibiram a

replicação do HSV-1 em células Vero e GMK AH1 (ambas células de rim de macaco

verde da África) em múltiplos estágios da replicação viral, fato que já foi observado

em outros estudos que avaliaram a atividade antiviral de outros compostos fenólicos

(KUO et al., 2002; CHENG et al., 2003, 2004; UOZAKI et al., 2006).

Discussão 69

A partir destes resultados, formulou-se a hipótese de que a interferência do

AG e do GP sobre a replicação do HSV-1 em células Vero e GMK AH1 esteja, ao

menos em parte, relacionada com:

- a redução da infectividade viral (apenas GP);

- inibição da adsorção e da penetração dos vírus nas células (ambos os

compostos);

- diminuição dos níveis das proteínas virais ICP5, ICP27, gB, gC, gD e gE

(ambos os compostos);

- interferência sobre a síntese da proteína gD, através do bloqueio da

expressão do seu mRNA (apenas GP).

Embora os tratamentos concomitantes com AG/GP, AG/aciclovir e

GP/aciclovir não tenham resultado em interação alguma, a interferência destes dois

compostos (AG e GP) em várias etapas da replicação do HSV-1 sugere a

importância de estudos adicionais.

Conclusões 70

6 CONCLUSÕES

• Das 16 amostras avaliadas, apenas o galato de metila (1C) e de octadecila

(18C) não apresentaram citotoxicidade em células Vero e GMK AH1, nas

concentrações avaliadas pelo ensaio do MTT. Em relação aos demais

compostos, a citotoxicidade aumentou em função do número de carbonos na

cadeia alquílica, atingindo o seu máximo com 11 carbonos (galato de

undecila), enquanto que os compostos com cadeia mais longa foram

gradualmente menos citotóxicos.

• Em relação à triagem da atividade anti-HSV-1 pelo ensaio do MTT, os

compostos com até 7 carbonos na cadeia alquílica apresentaram atividade,

com exceção dos galatos de nonila (9C) e de octadecila (18C), que também

foram ativos, em diferentes níveis. Assim, foram selecionados, para terem sua

atividade antiviral confirmada através do ensaio de redução de placas de lise,

o ácido gálico e os galatos de metila (1C), etila (2C), propila (3C), butila (4C) e

pentila (5C), pois esses apresentaram atividade antiviral superior aos demais.

• Na confirmação da atividade antiviral, através do ensaio de redução de placas

de lise, o ácido gálico e o galato de pentila mostraram-se superiores aos

demais, pois foram os únicos capazes de inibir completamente a replicação

viral na concentração de 125 µM, e, portanto, foram selecionados para o

estudo do seu mecanismo de ação.

• Na avaliação da atividade virucida, apenas o galato de pentila mostrou-se

ativo, reduzindo o título viral em 99,9 % na concentração de 125 µM.

• Na avaliação da interferência dos compostos sobre a adsorção e penetração

viral, ambos os compostos foram ativos, sendo que o ácido gálico apresentou

atividade superior a do galato de pentila.

• Na avaliação da atividade antiviral em função do tempo, ambos os compostos

inibiram completamente a replicação viral quando adicionados até 8h pós-

infecção, entretanto, o ácido gálico perde sua atividade gradualmente nos

intervalos posteriores. Adicionalmente, ambos os compostos não

apresentaram efeito profilático sobre a infecção do HSV-1.

Conclusões 71

• Os tratamentos simultâneos com ácido gálico/galato de pentila, ácido

gálico/aciclovir e galato de pentila/aciclovir não apresentaram sinergismo nem

antagonismo.

• Na avaliação da interferência dos compostos sobre a síntese de proteínas

virais, ambos apresentaram atividade sobre a síntese das proteínas ICP5,

ICP27, gB, gC, gD e gE.

• Na avaliação da interferência dos compostos sobre a expressão gênica viral,

apenas o galato de pentila mostrou-se ativo, inibindo a expressão do mRNA

da glicoproteína viral gD.

• Na avaliação da interferência dos compostos sobre a síntese do DNA viral,

ambos os compostos não apresentaram atividade.

• O mecanismo proposto da ação anti-herpética do AG e do GP é o seguinte:

redução da infectividade viral (apenas GP); inibição da adsorção e penetração

viral nas células (AG e GP); diminuição dos níveis da proteína do capsídeo

viral ICP5, da proteína α ICP27 e das proteínas do envelope gB, gC, gD e gE

(AG e GP); e interferência na síntese da proteína gD, através do bloqueio da

síntese de seu mRNA (apenas GP).

Referências 72

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