( PDF ) Estudo do estresse oxidativo em órgãos de ratos wistar adultos induzidos à intoxicação por malation

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Universidade do Extremo Sul Catarinense

Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais

(MESTRADO)

ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO EM ÓRGÃOS DE

RATOS WISTAR ADULTOS INDUZIDOS À INTOXICAÇÃO POR

MALATION

Fabricio Pagani Possamai

Criciúma

2005

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FABRICIO PAGANI POSSAMAI

ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO EM ÓRGÃOS DE RATOS

WISTAR ADULTOS INDUZIDOS À INTOXICAÇÃO POR

MALATION

Dissertação apresentada como requisito

parcial para a obtenção do grau de mestre

no Programa de Pós-Graduação em

Ciências Ambientais (Mestrado) da

Universidade do Extremo Sul Catarinense,

na área de concentração de Ecologia e

Gestão de Ambientes Alterados.

Professor Orientador: Dr. Felipe Dal Pizzol

Professor Co-orientador: Dr. João Quevedo

Criciúma

2005

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Felix qui potuit rerum

cognoscere causa

Publius Virgilius Maro

Poeta Romano

iii

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador professor Felipe Dal Pizzol pelas diretrizes seguras,

orientação, apoio, confiança e incentivo;

Ao professor João Quevedo pela orientação e empenho em realizar pesquisa

científica de qualidade;

À minha família: Arcir, Madalena, Fernando e Mari Helen, pelo incentivo;

À Fernanda, minha vida, pela colaboração, constante apoio e compreensão;

Às amigas e companheiras de bancada: Jucélia e Fabricia pelo auxílio

durante várias etapas deste trabalho;

Aos amigos do laboratório: Gustavo, Rodrigo, Adalisa, Fabiano e demais

bolsistas pelo enorme esforço e dedicação nas pesquisas desenvolvidas;

À UNESC por tornar este trabalho possível;

Ao Programa de Pós-Graduação pela formação proporcionada;

Aos técnicos dos laboratórios do Bloco da Saúde, vigias, e demais

funcionários que colaboraram e apoiaram neste trabalho;

Ao CNPq pelo apoio à pesquisa;

À Prefeitura Municipal de Içara pelo auxílio na execução deste trabalho;

À todos que, direta ou indiretamente, colaboraram na execução deste

trabalho.

RESUMO

Malation é um inseticida do grupo dos pesticidas organofosforados com fortes

propriedades inseticidas. Eles apresentam efeitos neurotóxicos diretos associados

com a inativação da colinesterase. Possui propriedades mutagênicas,

carcinogênicas e especificidade em órgãos quanto à toxicidade com relação ao

coração, rim e outros órgãos. Os radicais livres são um importante fator de dano em

muitos processos patológicos e toxicológicos. As espécies ativas do oxigênio

(EAO), como peróxido de hidrogênio e superóxido, são produzidos em inúmeras

reações celulares e por várias enzimas, tais como as lipoxigenases e peroxidases.

Os principais componentes celulares susceptíveis ao dano por radicais livres são os

lipídeos (peroxidação de ácidos graxos insaturados nas membranas), proteínas,

carboidratos e ácidos nucléicos. O objetivo do estudo foi avaliar o dano oxidativo do

malation em ratos Wistar, baseado nos resultados da lipoperoxidação dos níveis

das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e grupo carbonil. As análises

demonstraram vários graus de intensidade nos resultados da lipoperoxidação do

TBARS e do grupo carbonil quando comparados com as defesas antioxidantes. As

estruturas mais susceptíveis ao dano oxidativo foram o rim, pulmão e diafragma no

tratamento agudo e o fígado, quadríceps e soro do tratamento crônico. Há

evidências que a exposição ao malation está associado com a evolução do dano

oxidativo, observado nos órgãos estudados.

ABSTRACT

Malathion is an insecticide of the group of organophosphorus pesticides showing

strong insecticidal properties. They show neurotoxic effects directly associated with

cholinesterase inactivation. Possess mutagenic and carcinogenic properties and

show organ-specific toxicity which relation to the heart, kidney and others organs.

Free radical damage is an important factor in many pathological and toxicological

processes. Reactive oxygen species (ROS), hydrogen peroxide and superoxide are

both produced in a number of cellular reactions and by several enzymes such as

lipoxygenases, peroxidases. The main cellular components susceptible to damage

by free radical are lipids (peroxidation of unsaturaded fatty acids in membranes),

proteins, carbohydrates and nucleic acids. The aim of study was the evaluation of

oxidative damage of malathion on Wistar rats basead on the results of lipid

peroxidation the level thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and group

carbonyl. The analysis showed various degrees of intensity on the results of lipid

peroxidation the TBARS and group carbonyls, when compared with the antioxidant

defense. The most sensitive structures to the oxidative damage were the kidney,

lung and diaphragm of the acute treatment and the liver, quadriceps and serum of

the chronic treatment. There is evidence that exposure to malathion was associated

the evaluation of oxidative damage observed in organs studied.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... vii

LISTA DE TABELAS ........................................................................................... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .............................................................. xi

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO ...........................................................................

1 ORGANOFOSFORADOS ................................................................................ 1

1.1 Identificação do malation .............................................................................. 3

1.2 Farmacologia do malation .............................................................................

1.3 Toxicidade do malation ................................................................................. 6

1.4 Imunotoxicidade e genotoxicidade do malation ............................................ 8

2 RADICAIS LIVRES .......................................................................................... 9

3 ESTRESSE OXIDATIVO ................................................................................. 12

3.1 Lipoperoxidação ............................................................................................

3.2 Dano nas proteínas .......................................................................................

3.3 Dano no fígado ............................................................................................. 15

3.4 Dano no pulmão ............................................................................................

3.5 Dano no rim .................................................................................................. 16

3.6 Dano no DNA ................................................................................................ 17

3.7 Dano no SNC ................................................................................................ 17

4 DEFESAS ANTIOXIDANTES .......................................................................... 18

4.1 Superóxido dismutase .................................................................................. 19

4.2 Catalase ........................................................................................................ 19

4.3 Glutationa peroxidase ................................................................................... 20

4.4 Outros antioxidantes ..................................................................................... 21

5 OBJETIVOS ..................................................................................................... 22

5.1 Objetivo geral ................................................................................................ 22

5.1 Objetivo específico ........................................................................................

CAPÍTULO II – ARTIGO .....................................................................................

CAPÍTULO III – DISCUSSÃO GERAL ...............................................................

CAPÍTULO IV – CONCLUSÕES ........................................................................

CAPÍTULO V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................

vii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO

Figura 1. Representação estrutural do malation ..............................................

Figura 2. Biotransformação do malation ...........................................................

Figura 3. Evoluções adaptativas ao surgimento de O

.....................................

Figura 4. Lipoperoxidação de lipídeos pela reação de radicais livres ..............

Figura 5. Oxidantes do metabolismo normal ....................................................

Figura 6. Representação da formação de OH

através das reações de Haber-

Weiss/ Fenton ...................................................................................................

Figura 7. Estresse oxidativo .............................................................................

Figura 8. Principais alterações celulares geradas pelo estresse oxidativo ......

Figura 9. Reação de detoxificação de EAO promovida pela SOD ...................

Figura 10. Reação de detoxificação de EAO promovida pela CAT ..................

Figura 11. Reação de detoxificação de EAO promovida pela GPx ..................

Figura 12. Mecanismo de defesa antioxidante .................................................

CAPÍTULO II – ARTIGO

Figura 1. Oxidative parameters after chronic O. P. poisoning in liver. A –

Oxidative damage. Rats were submitted to chronic treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the liver was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05). B – Antioxidant enzymes. Rats

were submitted to chronic treatment in doses the malathion 25, 50, 100, 150

mg/Kg and control. Immediately after treatment animals were sacrificed and

the liver was isolated for determination of catalase and SOD as described

under “Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5

for each group). * different from control (p<0,05). ** different from control

(p<0,001) ……………………………………………………………………………..

Figura 2. Oxidative parameters after chronic O. P. poisoning in lung. A –

Oxidative damage. Rats were submitted to chronic treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

viii

animals were sacrificed and the lung was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05). ** different from control

(p<0,001). B – Antioxidant enzymes. Rats were submitted to chronic

treatment in doses the malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control.

Immediately after treatment animals were sacrificed and the lung was isolated

for determination of catalase and SOD as described under “Materials and

Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for each group). *

different from control (p<0,05) ……………………………………………………...

Figura 3. Oxidative parameters after acute O. P. poisoning in diaphragm. A –

Oxidative damage. Rats were submitted to acute treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the diaphragm was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05). B – Antioxidant enzymes. Rats

were submitted to acute treatment in doses the malathion 25, 50, 100, 150

mg/Kg and control. Immediately after treatment animals were sacrificed and

the diaphragm was isolated for determination of catalase and SOD as

described under “Materials and Methods”. Values are expressed as

means±S.E.M.(n=5 for each group). * different from control (p<0,05) …………

Figura 4. Oxidative parameters after chronic O. P. poisoning in diaphragm.

Oxidative damage. Rats were submitted to chronic treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the diaphragm was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05). ** different from control

(p<0,001) ……………………………………………………………………………...

Figura 5. Oxidative parameters after acute O. P. poisoning in quadriceps. A –

Oxidative damage. Rats were submitted to acute treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the quadriceps was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05). ** different from control

(p<0,001). B – Antioxidant enzymes. Rats were submitted to acute treatment

in doses the malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after

treatment animals were sacrificed and the quadriceps was isolated for

determination of catalase and SOD as described under “Materials and

Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for each group). *

different from control (p<0,05) ……………………………………………………...

Figura 6. Oxidative parameters after chronic O. P. poisoning in quadriceps.

Oxidative damage. Rats were submitted to chronic treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the quadriceps was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05) …………………………………….

Figura 7. Oxidative parameters after chronic O. P. poisoning in serum.

Oxidative damage. Rats were submitted to chronic treatment in doses the

malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after treatment

animals were sacrificed and the serum was isolated for determination of

thiobarbituric acid reactive species and protein carbonyl as described under

“Materials and Methods”. Values are expressed as means±S.E.M.(n=5 for

each group). * different from control (p<0,05) ...................................................

Figure 8. Pearson correlation coefficient of TBARS after chronic O. P.

poisoning in serum and liver. Rats were submitted to chronic treatment in

doses the malathion 25, 50, 100, 150 mg/Kg and control. Immediately after

treatment animals were sacrificed and the serum and liver was isolated for

determination of thiobarbituric acid reactive species as described under

“Materials and Methods”. Variations of MDA equivalents in serum and liver in

different malathion doses were correlated (r

= 0,859, p<0,05) ………………...

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sintomatologia na intoxicação aguda devido à exposição ao

malation .............................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACh

- Acetilcolina

AChE

- Acetilcolinesterase

ATP - Adenosina trifosfato

CAT - Catalase

- Dose letal para 50% de um grupo de animais

DNA - Ácido desoxirribonucleico

- Elétron

EAN - Espécies ativas do nitrogênio

EAO - Espécies ativas de oxigênio

- Íon ferroso

- Íon férrico

GPx - Glutationa peroxidase

GR - Glutationa redutase

GSH - Glutationa reduzida

GSSG - Glutationa oxidada

GST - Glutationa-S-transferase

- Próton

O - Água

- Peróxido de hidrogênio

HNE - 4-hidroxi 2-trans nonenal

LPO - Lipoperoxidação

MDA - Malondialdeído

- Óxido nítrico

- Oxigênio molecular

-·

- Radical superóxido

- Ozônio

OF - Organofosforados

- Ânion hidroxila

OH· - Radical hidroxil

ONNOO

- peroxinitrito

RL - Radicais livres

scavenger

qualquer substância capaz de “limpar” radicais livres de sistemas

químicos / biológicos

xii

SNC - Sistema nervoso central

SOD - Superóxido dismutase

TBA - Ácido tiobarbitúrico

TBARS - Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO

1 ORGANOFOSFORADOS

Para proporcionar um constante aumento na produção de alimentos para o

mercado interno e externo, a agricultura tem feito um grande esforço através da

mecanização ou do controle de pragas. Com o advento dos agroquímicos

sintéticos, no início do século passado, a humanidade se deparou com as suas

conseqüências ao meio ambiente e ao homem.

Segundo dados do CIT/SC, 2005 (Centro de Informações Toxicológicas do

Estado de Santa Catarina), no período entre 1994 a 2004 foram 1.011 registros de

intoxicação por agrotóxicos em SC, sendo que 36 evoluíram para o óbito. Somente

no ano de 2004, foram 186 registros de intoxicação por agrotóxicos, sendo que 149

(80%) correspondem à intoxicações por organofosforados, resultando em 6 óbitos.

Os outros 37 registros (20%), são referentes à intoxicações por outros agrotóxicos

(organoclorados, carbamatos, paraquat, etc).

Todos os casos em que houver suspeita da ocorrência de efeitos à saúde

humana relacionada à exposição aos agrotóxicos, devem ser notificados ao setor

de Vigilância em Saúde ou nas unidades de saúde dos municípios. A notificação é

realizada quando a pessoa com suspeita de exposição ao produto, busca a unidade

de saúde ou quando a agente de saúde, durante as visitas domiciliares, identifica a

suspeita de exposição. A notificação é registrada no Sistema de Informações de

Agravos de Notificação – SINAN, cujo programa que é digital, iniciou em 1994.

Segundo dados da SES/SC, 2005 (Secretaria de Estado da Saúde de Santa

Catarina), no período entre 1994 a 2004 foram 3.286 registros de notificação. Até o

presente momento, não estão disponíveis o dados nacionais do SINAN.

A ANVISA, 2005 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), informa que os

dados epidemiológicos no Brasil são difíceis e sub-notificáveis, na sua maioria. O

Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas – SINITOX, não dispõe

de dados detalhados acerca dos agentes tóxicos. Na maioria dos Estados, as

notificações não são objeto dos sistemas de vigilância em saúde. A escassez de

equipamentos e de recursos humanos dos órgãos governamentais contribuem para

o sub-registro dessas intoxicações.

Segundo dados do MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO (2002), o Brasil é um dos maiores consumidores de agrotóxicos

do mundo, tanto de uso domésticos como de uso agrícola. Dada a grande

diversidade de produtos, cerca de 300 princípios ativos em 2 mil formulações

comerciais diferentes no Brasil, os agrotóxicos são classificados em inseticidas,

fungicidas, herbicidas e por outros grupos importantes (raticidas, acaricidas,

nematicidas, molusquicidas e fumigantes). Organofosforados (OF) são inseticidas,

constituídos por compostos orgânicos derivados do ácido fosfórico, do ácido

tiofosfórico ou do ácido ditifosfórico. Dos inseticidas organofosforados, o malation é

um dos mais utilizados na agricultura brasileira. É largamente utilizado nas culturas

de fumo e milho em Criciúma, Içara e região, além de ser empregado para uso

doméstico (domissanitários) em pomares caseiros e jardins.

No entanto a falta de controle no uso destas substâncias tóxicas, somado

com o desconhecimento da população quanto ao uso correto acarretam em graves

intoxicações a saúde humana e a contaminação do meio ambiente. Um grande

problema com relação aos agrotóxicos é que nem sempre o agricultor rural sabe

usar a quantidade recomendada e a maioria ignora os efeitos nocivos do produto.

Os agrotóxicos estão entre os contaminantes sintéticos que mais se destacam na

degradação de recursos hídricos e cujos efeitos atingem diversos graus de

toxicidade. Estas substâncias tóxicas percolam o solo, contaminando as águas

superficiais e subterrâneas que posteriormente poderão servir para o consumo

humano (WHO, 2003).

Os agricultores adultos são os grupos com maior potencial de exposição por

agrotóxicos, assim como as crianças dos agricultores. Diversos estudos associam

esta exposição com efeitos adversos à saúde. As crianças são o grupo mais

sensível à exposição de agrotóxicos, porque eles possuem altas taxas de

metabolismo, sistema imune em desenvolvimento, acesso à menor variedade de

alimentos na dieta e diferentes comportamentos quando comparado aos adultos

(CURL et al., 2002; FARAHAT et al., 2003; SEXTON et al., 2003).

Os veículos da exposição dos agrotóxicos às crianças são principalmente

das roupas e da pele dos adultos. As condições sociais e econômicas dos

agricultores são características que podem determinar a forma e o tempo de

exposição dos agrotóxicos. Para as famílias dos agricultores expostos aos OF,

aumentam os riscos de doenças tais como neuroblastomas, tumores no sistema

nervoso, doença de Hodgkin, câncer de próstata, estômago, pele, ossos, cérebro e

leucemias em crianças (CURL et al., 2002; MILLS e ZAHM, 2001; MITCHELL et al.,

1995).

Outra grande forma de exposição é através da alimentação, onde resíduos

dos agrotóxicos permanecem no alimento. A aplicação de práticas adequadas de

lavagem destes produtos pode contribuir na redução dos resíduos do agrotóxico no

alimento (ZOHAIR, 2001).

A contaminação por inseticidas organofosforados é tema de estudo em

diversos centros de pesquisa e universidades, tendo em vista as conseqüências

para a saúde humana e o risco de degradação do meio ambiente, causados pela

falta de controle no uso e pela aplicação inadequada.

1.1 Identificação do malation

O Malation, Malatox, Malaton, MLT, são os nomes comum e comercial de

inseticidas organofosforados. O nome químico (figura 1) é 0,0-dimetil S-(etil-1,2-

dicarboetoxi) fosforoditioato (WHO, 2003).

Figura 1. Representação estrutural do malation. Adaptado de WHO, 2003.

Quando puro é líquido amarelado. O produto técnico, que contém de 95 a

98% de substância ativa, é um líquido marrom-escuro com forte cheiro de alho. É

muito pouco solúvel na água (145 ppm a 20-25ºC) e solúvel na maioria dos

solventes orgânicos, tais como o álcool, éster, cetona, éter, hidrocarbonos

aromáticos e óleos vegetais. Decompõe-se facilmente em meio alcalino e em meio

ácido. A sua taxa de hidrólise (meia-vida) em pH 7,4, numa temperatura de 37,5ºC,

é aproximadamente 32 horas (THE MERCK INDEX, 2001; WHO, 2003).

No comércio são apresentados sob formas diversas: líquidos oleosos,

viscosos, pouco densos, de cor e cheiro variados; sólidos ou pós-cristalinos ou não,

incolores ou coloridos, são empregados em tipos de formulações e em

concentrações variadas. São inseticidas fito e zoosanitários, utilizados em

agropecuária, saúde pública (controle de vetores); alguns de baixa toxicidade, como

o malation, são usados como inseticidas domiciliares (AHMED et al., 2000).

Conforme a Lei Federal n.º 7802/89, o malation pode ser comercializado por

estabelecimentos, tais como agropecuárias, devidamente cadastradas nos órgãos

competentes do Estado, de acordo com a Lei Estadual n.º 11069/98, ou Município

que atuam na área da saúde, do meio ambiente e da agricultura. A comercialização

somente poderá ser efetuada mediante a apresentação do receituário agronômico

prescrito por profissionais legalmente habilitados. No entanto, o comércio do

malation para uso domissanitário ou para fins de jardinagem amadora, segundo a

Portaria MS n.º 321/97 e 322/97, poderá ocorrer através de venda direta ao

consumidor (sem a apresentação do receituário agronômico). Os frascos devem

possuir um volume que não exceda 100 ml para líquidos a diluir e 1000 ml para

líquidos prontos para o uso. Com relação à toxicidade, o produto deve possuir DL

via oral, para ratos brancos, machos, superior a 2.000 mg/Kg de peso corpóreo

para produtos sob a forma líquida, além de estar incluído na classe III da

classificação de pesticidas segundo a periculosidade, recomendada pela OMS.

1.2 Farmacologia do Malation

Os compostos organofosforados são substâncias colinérgicos indiretas, ou

seja, são inibidores da colinesterase, impedindo a inativação da acetilcolina (ACh),

permitindo assim sua ação mais intensa e prolongada nas sinapses colinérgicas.

Atuam, pois, como agonistas nos receptores colinérgicos, com os conseqüentes

efeitos muscarínicos, nicotínicos e sobre o sistema nervoso central (MITCHELL, et

al., 1995; MORETTO, 1998).

Os inseticidas OF atuam como inibidor “irreversível” da acetilcolinesterase

(AChE), que tem a função de destruir a acetilcolina que serve como mediadora das

transmissões nervosas no sistema nervoso central, parassimpático e

ortossimpáticos e nas junções mioneurais. Em excesso, a acetilcolina é prejudicial e

a função da acetilcolinesterase é destruir a acetilcolina dando origem à colina e ao

ácido acético, ambos inofensivos ao organismo humano (BRENNER, 1992;

HARDMAN et al., 2001).

O malation sofre decomposição quando armazenado em condições

inadequadas, produzindo compostos similares de elevada toxicidade,

especialmente o malaoxon e isomalation. O malaoxon apresenta uma atividade

anticolinesterásica superior à do malation enquanto que o isomalation, além de

apresentar uma ligação P=O que condiciona uma maior inibição da AChE, é um

efetivo inibidor da carboxiesterase provocando uma diminuição prejudicial da

hidrólise do malation no organismo humano (BRENNER, 1992; SEGALL et al.,

2003; SOGORB e VILANOVA, 2002).

O metabolismo do malation em animais ocorre de três formas, uma

oxidativa, outra hidrolítica e a redução do grupo metil catalizado pela glutationa S-

transferase (figura 2).

Figura 2. Biotransformação do malation. Adaptado de WHO, 2003.

1.3 Toxicidade do Malation

O malation é absorvido pelo organismo por todas as vias de forma

acelerada. A presença de solvente orgânico intensifica a absorção, e sua toxicidade

está relacionada à sua biotransformação, ou seja, a transformação da ligação P=S

(tion) em P=O (oxon) através de enzimas oxidases e citocromo P-450. Resulta,

portanto, numa maior inibição da colinesterase, provocando uma diminuição

prejudicial da hidrólise do malation no organismo humano e, como conseqüência,

um aumento acentuado da toxicidade do composto (GIRI et al., 2002). Essa

toxidez, causada pela biotransformação do malation, pode ser atribuída à

conversão deste composto em radicais livres. Há evidências que os radicais livres e

outras espécies ativas do oxigênio e nitrogênio estão envolvidas no mecanismo de

ação alguns agrotóxicos, tais como o malation (BANERJEE et al., 1999).

A absorção por via oral ocorre nas intoxicações agudas acidentais e nas

tentativas de suicídio, que já registraram casos fatais. A via dérmica é a via mais

comum de intoxicações ocupacionais, seguida da via respiratória (THOMPSON et

al., 1998). Estudo demonstra a distribuição do malation no corpo humano em

diversos tecidos e fluidos corporais, como no rim, sangue, fígado, baço, coração,

cérebro, pulmão e músculos (JADHAV et al., 1992). No entanto, somente uma

pequena fração é absorvida pelos tecidos. O tempo de exposição é um fator

determinante na absorção do malation nos tecidos biológicos (BOUCHARD et al.,

2003).

No homem, a eliminação do malation é principalmente urinária, sendo em

menor quantidade nas fezes. A excreção máxima ocorre em 2 dias, após diminui

rapidamente. Em ratos a principal via de excreção também é através da urina (80-

90%) nas primeiras 24 horas após a exposição. Os ratos convertem cerca de 4-6%

do malation em malaoxon. O tempo de meia-vida do malation em ratos é 1,4 dias

no sangue, na administração por via oral (WHO, 2003).

Os OF são compostos com propriedades alquilantes, ou seja, são agentes

que podem causar dano no DNA. A atividade mutagênica do malation pode estar

relacionada com a existência de dois sítios eletrofílicos em sua estrutura molecular

ou em seus metabólitos intermediários, nos quais são capazes de quebrar os sítios

nucleofílicos do DNA. Os sítios eletrofílicos do malation são o grupo alquil e o grupo

fosforil (GIRI et al., 2002).

Conforme a classificação da toxicidade aguda, os OF são classificados nas

seguintes classes: classe IA - extremamente perigosos; classe IB - altamente

perigosos; classe II - moderadamente perigosos; classe III - pouco perigosos. O

malation é um inseticida de uso agropecuário e domissanitário da classe III. A DL

aguda oral do malation em ratos machos é 1375 mg/Kg. Quimicamente são

considerados de grande toxicidade quando a DL

apresenta um valor pequeno, e

praticamente não tóxicos quando a DL

é grande. No entanto o valor da DL

pode

não demonstrar alguns efeitos quando a exposição ocorre por longo tempo (câncer,

defeitos no nascimento, toxicidade reprodutiva), que podem ocorrer a baixos níveis

daqueles que causam a morte (THE MERCK INDEX, 2001; WHO, 2003).

Vários fatores influem na toxicidade dos OF: o potencial de risco de cada

substância, dose, tempo e via de exposição; condições prévias de saúde do

paciente (algumas doenças alteram níveis de AChE), idade (neonatos, grávidas tem

baixa atividade colinesterásica) desnutrição, déficit protéico eleva risco na

intoxicação, etc. Os agrotóxicos podem determinar três tipos de intoxicação: aguda,

subaguda e crônica. A intoxicação aguda é aquela na qual os sintomas surgem

rapidamente, algumas horas após a exposição excessiva, por curto período, a

produtos extremamente ou altamente tóxicos. Pode ocorrer de forma leve,

moderada ou grave, dependerão da quantidade de veneno absorvido. Os sinais e

sintomas são nítidos e objetivos (WHO, 2003).

Tabela 1. Sintomatologia na intoxicação aguda devido à exposição ao malation.

Síndrome Muscarínica Síndrome Nicotínica Síndrome SNC

- Distúrbios cardiocirculatórios

(diminuição da contratilidade cardíaca,

bradicardia e vasodilatação).

- Distúrbios gastrointestinais (aumento

dos movimentos peristálticos e do

tônus intestinal, aumento das

secreções digestivas, diarréia, cólicas

abdominais, vômitos).

- Distúrbios das glândulas exócrinas

(sudorese, sialorréia, lacrimejamento).

- Outros distúrbios (miose bilateral,

broncoconstrição/hipersecreção e

aumento do peristaltismo uretral).

- Tremores de língua,

lábios, olhos e

pálpebras.

- Espasmos e tremores

da musculatura

esquelética.

- Flacidez e paralisia

muscular.

- Espasmos,

fasciculações e

fibrilações musculares,

principalmente na face

e pescoço.

- Cefaléia,

inquietude,

insônia.

- Tremores,

ataxia.

- Confusão

mental.

- Convulsões.

- Coma.

Fonte: WHO, 2003.

A intoxicação subaguda ocorre por exposição moderada ou pequena a

produtos altamente tóxicos ou medianamente tóxicos e tem aparecimento mais

lento. Os sintomas são subjetivos e vagos, tais como dor de cabeça, fraqueza, mal-

estar, dor de estômago e sonolência, entre outros. A intoxicação crônica

caracteriza-se por surgimento tardio, ou seja, anos após a exposição pequena ou

moderada a produtos tóxicos ou a múltiplos produtos (WHO, 2003).

Relatos em trabalhadores expostos a baixas concentrações, após exposição

crônica à organofosforados demonstram: enfraquecimento, déficit de memória e de

velocidade psicomotora, perda de concentração, dificuldade de fala. Também

alterações psíquicas: aumento de tendências depressivas, ansiedade, irritabilidade,

nervosismo. Pode ocasionar ainda danos irreversíveis, como paralisias e

neoplasias (RAY e RICHARDS, 2001; SALVI et al., 2003).

A intoxicação por OF pode induzir à síndrome extrapiramidal ou doença de

Parkinson em algumas pessoas (HSIEH, 2001; MENEGON et al., 1998) e promover

danos na reprodução de camundongos machos, causando disfunção da

espermatogênese (BUSTOS-OBREGÓN e GONZÁLES-HORMAZABAL, 2003).

Estudo demonstra a alteração de parâmetros eletrofisiológicos do cérebro

em ratos Wistar induzidos à intoxicação por organofosforados, na administração

oral. Foram analisados parâmetros eletrofisiológicos tais como eletrocorticograma,

sensoriamento do potencial cortical, velocidade de condução e período de refração

do nervo periférico. A exposição ao organofosforado ocasionou a alteração de

todos os parâmetros investigados. Esta análise pode ser utilizada como um

sensível indicador desta exposição (DÉSI e NAGYMAJTÉNYI, 1999).

A intoxicação por OF pode ainda levar a morte, usualmente por insuficiência

respiratória resultante de fraqueza muscular e depressão respiratória no SNC,

agravados por broncoconstrição e excessiva secreção brônquica – efeitos

muscarínicos (BRENNER, 1992; COCKER et al., 2002).

1.4 Imunotoxicidade e genotoxicidade do malation

O malation está relacionado com efeitos imunossupressores em diversos

níveis. Podem causar interferências fisiológicas e patológicas, no estado nutricional,

função hormonal, metabolismo hepático e de outros mecanismos

imunoregulatórios. Pode atuar diretamente ou indiretamente sobre células linfóides,

no metabolismo das imunoglobulinas, células T, macrófagos e na biosíntese

macromolecular (BANERJEE et al., 1998).

Estudos demonstram que o malation é um potente agente genotóxico e

pode estar relacionado com um potencial agente mutagênico em células

germinativas (GIRI et al., 2002).

2 RADICAIS LIVRES

Com exceção de certos anaeróbios e organismos unicelulares aeróbios

tolerantes, todos os animais, plantas e bactérias necessitam de O

para produção

de energia através do uso de canais transportadores de elétrons, dependente de

, tais como aqueles nas mitocôndrias das células de eucariontes. No entanto o

é um agente mutagênico tóxico. Os aeróbios sobrevivem porque eles possuem

defesas de antioxidantes para sua proteção. Os organismos que toleram a

presença de O

utilizam mecanismos metabólicos como, oxidases, oxigenases,

hidroxilases, tais como tirosina hidroxilase ou citocromo P-450 (HALLIWELL e

GUTTERIDGE, 1999).

Primeiros organismos vivos aeróbios

Stress com oxigênio

Evolução com defesas antioxidantes Morte Retroceder para anaeróbios

Figura 3. Evoluções adaptativas ao surgimento de O

. Adaptado de HALLIWELL e

GUTTERIDGE, 1999.

O desenvolvimento de defesas antioxidantes permitiu a evolução dos

organismos através da oxidação eficaz do alimento, sendo que os efeitos danosos

do O

são devido à oxidação de componentes celulares essenciais. Esta oxidação

reduz o O

para radicais livres (RL) de oxigênio e outras espécies tóxicas derivadas

do oxigênio. Então radicais livres são quaisquer espécies capazes, independe de

sua existência, de conter um ou mais elétrons não emparelhados. São espécies

instáveis que reagem rapidamente (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

As reações de radicais, usualmente, ocorrem em três fases: a fase inicial

(iniciação), fase de propagação e fase de término. A lipoperoxidação é uma reação

em cadeia, com o envolvimento de RL, onde L representa o lipídio na figura 4. Esta

reação inicia-se com o seqüestro do hidrogênio do ácido graxo polinsaturado (LH)

da membrana celular pelo OH

ou pelo LO

, formando o radical L

(radical lipídico).

Na fase de propagação, o L

reage com o O

resultando no radical LOO

, que

seqüestra um novo hidrogênio do ácido graxo polinsaturado, formando novamente

o L

. A fase de término ocorre quando os radicais LOO

e L

propagam-se até que

sejam eliminados (ZWART et al., 1999).

Iniciação: LH + OH

(ou LO

)  L

+ H

O (ou LOH)

Propagação: L

+ O

 LOO

Propagação: LH + LOO

 L

+ LOOH

Término: LOO

+ L

 LOOL

Término: LOO

+ LOO

 LOOL + O

Figura 4. Lipoperoxidação de lipídeos pela reação de radicais livres. Adaptado de

ZWART et al., 1999.

As espécies ativas do oxigênio (EAO) é um termo utilizado pelos cientistas

para incluir não somente os radicais de oxigênio (O

-

e OH



) mas também alguns

derivados do O

que não são radicais livres (H

, O

). As EAO e outros RL podem

ser produzidos por fontes exógenas, como os agrotóxicos, medicamentos, a

poluição ambiental e etc, ou por fontes endógenas. Nas células as EAO são

produzidas como conseqüência do metabolismo celular normal. As principais fontes

endógenas são a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, a degradação de

ácidos graxos nos peroxissomas, os mecanismos de detoxificação mediados pelo

complexo enzimático citocromo P-450, o processo de fagocitose e a oxidação de

pequenas moléculas como hidroquinonas, ferrodoxinas reduzidas e catecolaminas,

entre outras. Os peroxissomas (microcorpos) são organelas, com a aparência de

pequenas vesículas membranares, formados a partir do retículo endoplasmático.

São caracterizados por conterem enzimas catalisadoras de oxidações que se

processam em presença de oxigênio molecular (oxidases), e ainda de catalases,

enzimas decompositoras de peróxido de hidrogênio (HALLIWELL e GUTTERIDGE,

1999).

No transporte de elétrons ao longo da cadeia respiratória, as EAO podem

ser geradas durante episódios de erros no processo de redução univalente do

oxigênio, gerando o radical superóxido (O

-

), o peróxido de hidrogênio (H

) e o

radical hidroxila (OH

). A citocromo oxidase adiciona quatro elétrons para geração

de energia na mitocôndria (figura 5), mas inevitavelmente são formados

intermediários tóxicos (AMES et al., 1993).

Figura 5. Oxidantes do metabolismo normal. Adaptado de AMES et al., 1993.

Nos organismos, o O

-

participa na reação de Haber-Weiss: gerando

oxigênio e ferro reduzido, o qual catalisa a reação de Fenton; formando o radical

hidroxila (figura 6).

Reação de Haber-Weiss: O

-

+ Fe

 O

+ Fe

Reação de Fenton: Fe

+ H

 OH

+ OH

+ Fe

Figura 6. Representação da formação de OH

através das reações de Haber-Weiss/

Fenton. Adaptado de ANDREAZZA et al., 2004.

Acredita-se que a membrana mitocondrial, considerada a maior fonte de O

-

é impermeável a esse elemento. Porém, o O

-

é dismutado para H

, que

atravessa membranas com facilidade. A reação do superóxido com peróxido de

hidrogênio é acelerado in vivo na presença de metais de transição, particularmente

de ferro, por meio da reação de Haber-Weiss/Fenton. O radical hidroxil também

pode ser gerado por radiações ionizantes. O radical superóxido, em comparação ao

radical hidroxil é menos reativo em solução aquosa. O desaparecimento dos

radicais superóxido ocorre através da reação de dismutação. O peróxido de

hidrogênio não é um RL, mas pode induzir ao dano celular através da degradação

de certas proteínas (ANDREAZZA et al., 2004).

A toxicologia dos organofosforados na produção de EAO podem ocorrer de

duas formas: (a) através de seu ciclo de atividade redox, onde um elétron é captado

formando os radicais livres através da transferência para o oxigênio gerando anions

superóxido e peróxido de hidrogênio; (b) através da geração de radicais livres

devido a alteração na homeostase do corpo resultando no estresse oxidativo, com a

produção insuficiente de antioxidantes (VIDYASAGAR et al., 2004).

3 ESTRESSE OXIDATIVO

Em organismos aeróbios sadios, a produção de EAO e EAN estão

balanceadas com as defesas antioxidantes. O balanço não é perfeito, e pode

ocorrer dano em moléculas, que podem ou não ser reparadas (DNA) ou

substituídas (oxidação de proteínas). O estresse oxidativo é resultado da

diminuição de defesas antioxidantes ou aumento na produção de espécies ativas,

pela exposição a valores excessivos de O

ou de agentes intoxicantes. Portanto o

estresse oxidativo é um distúrbio no balanço entre pro-oxidantes e antioxidantes

(figura 7), em favor do primeiro, gerando um dano em potencial. Tal dano é

chamado de estresse oxidativo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Figura 7. Estresse oxidativo.

O estresse oxidativo pode resultar em adaptação ou lesão celular. Na

adaptação, as células podem tolerar o estresse oxidativo, através da auto-

regulação da síntese de defesas antioxidantes até restabelecer o equilíbrio. A lesão

é o resultado de estímulos químicos ou fisiológicos, que altera transitoriamente ou

permanentemente a homeostase da célula. A resposta à lesão pode ser reversível

ou irreversível. As reversíveis são chamadas de adaptações celulares (HALLIWELL

e GUTTERIDGE, 1999).

O estresse oxidativo pode causar dano em todos os tipos de biomoléculas,

incluindo DNA, proteínas e lipídios (figura 8). O alvo principal do estresse oxidativo

pode variar dependendo da célula, o tipo de exposição e a severidade do estresse

(FRIDOVICH, 1998).

O comportamento de algumas células pode ser alterado em conseqüência

do estresse oxidativo, afetando a comunicação intercelular, sendo que a excessiva

geração de H

promove a peroxidação de membranas, resultando na morte

celular (SAGARA et al., 1998). A morte celular pode ocorrer essencialmente de

duas formas, através da necrose e apoptose, sendo que esta também é chamada

de morte celular programada. É um tipo de autodestruição celular que requer

energia e síntese protéica para a sua execução. Está relacionado com a

homeostase na regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, exercendo um papel

oposto ao da mitose. A necrose difere da apoptose por representar um fenômeno

degenerativo irreversível, causado por um agressão intensa. Trata-se da

degradação progressiva das estruturas celulares sempre que existam agressões

ambientais severas (FORREST et al., 1994).

Figura 8. Principais alterações celulares geradas pelo estresse oxidativo. Adaptado

de HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999.

O estresse oxidativo desregula o metabolismo do Ca

, aumentando os

níveis celulares de cálcio, que, ao se ligar com a calmodulina, é capaz de ativar a

óxido nítrico sintetase, e gerar o NO

. Este por sua vez, pode formar o radical

peroxinitrito (ONOO

), que é neurotóxico (figura 8). A calmodulina é uma proteína

que se liga ao Ca

, amplamente distribuída, cuja ligação a outras proteínas é

gerada por alterações na concentração intracelular de Ca

. Sua ligação modifica a

atividade de várias enzimas-alvo e proteínas de transporte de membrana

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

3.1 Lipoperoxidação

A lipoperoxidação (LPO) é um processo de oxidação de lipídios

polinsaturados. Membranas e organelas celulares (mitocôndria, lisossomos e

peroxissomos) contém grande quantidade de lipídios polinsaturados, os quais

juntamente com as proteínas compõem os maiores constituintes biológicos de

membranas (URSO e CLARKSON, 2003).

A peroxidação lipídica resulta em uma mistura complexa de hidroperóxidos e

produtos secundários de oxidação, incluindo peróxidos cíclicos como o

malondialdeído (MDA) e o 4-hidroxi-2-trans-nonenal (HNE). (AKHGARI et al., 2003;

ANDREAZZA et al., 2004; BANERJEE et al., 1999). O MDA é importante na

lipoperoxidação há anos, porque é utilizado através da reação com o ácido

tiobarbitúrico (TBA) na análise da lipoperoxidação in vitro, expresso em MDA

equivalentes (nmol/mg proteína).

A LPO está relacionado com efeitos tóxicos de diversas substâncias

químicas, injúrias nos tecidos e no desenvolvimento de doenças (DAL-PIZZOL et

al., 2000). As lipoproteínas também são alvos do dano oxidativo. A peroxidação de

lipoproteínas de baixa densidade contribuem para a aterosclerose. As HDL são

lipoproteínas de alta densidade, que removem o excesso de colesterol dos tecidos

periféricos para o fígado, sendo considerado um agente que previne a

aterosclerose. No entanto as HDL também podem sofrer lipoperoxidação

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Há dados que a peroxidação na membrana de fígado e eritrócitos causam a

formação de agregados de proteína com alto peso molecular na membrana,

ocasionando deformações nos eritrócitos (AKHGARI et al., 2003). Os receptores

moleculares de resposta hormonal e citocinas também podem ser inativadas

durante a peroxidação de lipídios (GALLOWAY e HANDY, 2003).

3.2 Dano nas proteínas

O estresse oxidativo em proteínas pode causar dano nos receptores,

enzimas, transdução de sinais, transporte de proteínas e de enzimas, além de

danos em outras biomoléculas. A oxidação de proteínas pode ativar o sistema

imune induzindo a formação de anticorpos e doenças auto-imunes (GALLOWAY e

HANDY, 2003; VICTOR e DE LA FUENTE, 2003). O dano em enzimas reparadoras

do DNA (endonucleases, ligases, etc) pode elevar os níveis de dano oxidativo no

DNA e aumentar a freqüência de mutações. Pode ocorrer o dano nas proteínas

envolvidas na manutenção essencial do gradiente iônico entre os fluídos

extracelulares, tais como o Ca

-ATPase e Ca

/Na

(HALLIWELL e GUTTERIDGE,

1999).

A detecção de grupos carbonil está sendo muito utilizado como um indicador

de dano oxidativo em proteínas (URSO e CLARKSON, 2003). O aumento de

proteínas do grupo carbonil está associado a numerosos distúrbios patológicos,

incluindo artrite reumatóide, doença de Alzheimer, síndrome do distúrbio

respiratório, doença de Parkinson e aterosclerose (ZWART et al., 1999).

3.3 Dano no fígado

O fígado possui uma das mais altas atividades de enzimas antioxidantes do

corpo e está envolvido na maioria das detoxificações do organismo. O fígado é

importante na degradação e bio-ativação dos compostos organofosforados.

(AKHGARI, 2003).

Estudos sobre a indução de intoxicação de malation em ratos, via dérmica e

oral, demonstraram alterações histopatológicas no fígado. Na absorção via dérmica

no fígado, foi demonstrado a presença de degeneração parenquimatosa com

pequenas infiltrações nos hepatócitos. Na absorção oral, com análise ao

microscópio eletrônico foi demonstrado a presença de resíduos de organelas e

vacúolos de lipídio. Nas mitocôndrias foi observado a destruição de cristas

mitocondriais. As alterações histopatológicas demonstradas neste estudo

confirmam a toxicidade do malation no fígado (TOS´-LUTY et al., 2003).

3.4 Dano no pulmão

O impacto das espécies ativas do oxigênio sobre o pulmão é importante

porque este órgão está exposto a grande tensão de O

dos demais tecidos por área

de contato. O pulmão possui uma estrutura histológica complexa, com diferentes

tipos celulares com diferentes suscetibilidades ao estresse oxidativo. Como nos

outros tecidos, a exposição elevada de O

, no pulmão, gera o aumento intracelular

de O

·-

e H

pela promoção de reações de auto-oxidação e a fuga de elétrons do

para canais transportadores de elétron das mitocôndrias e retículo

endoplasmático. O H

também pode ser gerado por oxidases no pulmão

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Há evidências que a exposição aguda de pó de carvão induz a ação do

estresse oxidativo, em ratos, gerando inflamação e fibrose pulmonares. (PINHO et

al., 2004). Outra fonte de espécies ativas de oxigênio no pulmão é a ativação de

fagócitos (monócitos e neutrófilos) (AYUB et al., 2003; BABIOR, 2000).

Estudo demonstra que o pulmão de ratos submetidos à estresse oxidativo

crônico, induz ao aumento nos níveis de TBARS, que é um indicador de

lipoperoxidação em lipídeos. Na análise do TRAP (total radical-trapping potential)

que representa a capacidade antioxidante total, houve alteração somente nas

doses sub-crônicas (TORRES et al., 2004), demonstrando a ação das defesas

antioxidantes nesta fase.

Em testes histopatológicos, pela intoxicação oral de malation em ratos, foi

demonstrado a presença de fagócitos pulmonares e o aumento do septo

interalveolar. Ao microscópio eletrônico, foi observado o aumento dos canais do

ergastoplasma nos pneumócitos, bem como ocorreu inchaço das células do

endotélio vascular e da membrana basal (TOS´-LUTY et al., 2003).

3.5 Dano no rim

O rim é um órgão com atividade metabólica com altos níveis de ferritina e

proteínas do grupo heme. Estudo demonstra disfunções no rim devido à

lipoperoxidação através da formação de RL em ratos (KALE et al., 1999).

Há evidências que os OF podem causar citotoxicidade tubular renal e está

relacionado, em parte, na formação de EAO, causando lipoperoxidação e

citoxicidade. (POOVALA et al., 1998, 1999).

Na análise da toxicidade oral em ratos intoxicados com malation, através de

testes histopatológicos, foram demonstradas a presença de degenerações

parequimatosas e infiltrações nas células do túbulo renal. Ao microscópio

eletrônico, foi observado a presença da ruptura de membranas de vacúolos

autofágicos (TOS´-LUTY et al., 2003).

3.6 Dano no DNA

EAO formadas no metabolismo celular produzem lesões no DNA e em

outras estruturas celulares, fenômeno causador de doenças e provavelmente

relacionado com o processo de envelhecimento celular. Um dos alvos importantes

para o evento da senescência é o DNA, que, ao acumular lesões, desempenha

menos eficientemente sua função informativa, levando eventualmente a uma

degenerescência celular (FRIDOVICH, 1998). Há evidências que os EAO/EAN

estão envolvidas no desenvolvimento do câncer, não somente por efeitos diretos no

DNA, mas também na alteração de sinais de transdução, proliferação celular, morte

celular e comunicação intercelular. O dano pode ser direto através de ataque

químico ao DNA, nas bases purina e pirimidina ou na desoxirribose (HALLIWELL e

GUTTERIDGE, 1999).

As células possuem mecanismos de reparo ao dano no DNA, que podem

não ser suficientes na presença de excesso de EAO. O estresse oxidativo pode

ocasionar uma quebra na estrutura de elementos do DNA, modificando as bases e

gerando efeitos mutagênicos (BECKMAN e AMES, 1997).

3.7 Dano no SNC

Todos os organismos vivos podem sofrer com o dano oxidativo, no entanto o

cérebro é o órgão mais sensível devido ao alto consumo de oxigênio e glicose.

Também há grande consumo de energia, peroxidação de ácidos graxos, pequena

produção de antioxidantes e rápida peroxidação das membranas do cérebro

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

O cérebro obtém quase toda sua energia a partir da fosforilação oxidativa

mitocondrial, que produz ATP ao mesmo tempo que reduz o O

molecular a H

Em determinadas condições, espécies altamente reativas, como os radicais livres

de oxigênio e hidroxila, e o H

podem ser gerados como produtos colaterais

desse processo (GUPTA et al., 2001). O excesso de ferro depositado no cérebro e

alterações no metabolismo do ferro pode também contribuir no desenvolvimento de

muitas doenças (DAL PIZZOL et al., 2001).

Além disso, o metabolismo de alguns dos principais neurotransmissores,

como a dopamina, gera EAO capazes de consumir as defesas antioxidantes, que

são baixas em muitas regiões do cérebro (GILGUN-SHERKI et al., 2002).

Estudos apontam que medicamentos também induzem ao dano oxidativo no

cérebro de camundongos, como a apomorfina (MOREIRA et al., 2003) e que o

estresse oxidativo no SNC está relacionado com a patogênese de doenças

neurodegenerativas, tais como a esclerose múltipla (FLOYD e HENSLEY, 2002;

KOUTSILIERI et al., 2002).

4 DEFESAS ANTIOXIDANTES

Os organismos aeróbios somente conseguem sobreviver na presença do O

devido às defesas antioxidantes. Essas defesas diferem de tecido para tecido e de

célula para célula. As defesas antioxidantes podem ser induzidas por exposição do

organismo as EAO/EAN e por sinais celulares de moléculas, tais como as citocinas.

No entanto, essas defesas podem ser incompletas, ou seja, não previnem

completamente o dano. Antioxidantes são substâncias que quando presentes em

baixas concentrações comparadas como o agente oxidante, de modo significativo,

reduz ou previne a oxidação do substrato (molécula). Diferentes antioxidantes são

necessários para proteção contra o estresse oxidativo (BLOKHINA et al., 2003;

HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Os mecanismos de defesa são formados por enzimas, tais como a

superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx),

glutationa S-transferase (GST) e outras que não participam diretamente do

processo, mas fornecem suporte à GPx, como a glicose-6-fosfato desidrogenase

(G6DP) e a glutationa redutase (GR). Além dessas defesas enzimáticas, existem

ainda antioxidantes não-enzimáticos, como o -tocoferol (vitamina E), ácido

ascórbico (vitamina C), flavonóides e outras moléculas, como o -caroteno e N-

acetilcisteína (PALACE et al., 1999; RITTER et al., 2004).

Existem várias evidências da atividade protetora dos componentes do

sistema antioxidante. As lesões de reperfusão pós-isquemias de coração, rim,

fígado e intestino são prevenidas por SOD e CAT (LEFER e GRANGER, 2000).

Algumas citocinas, em particular a TNF-, que é produzida em condições de

isquemia cerebral ou inflamação, exercem efeito protetor, em parte ao aumentar a

expressão da SOD. No entanto o malation pode suprimir a geração de óxido nítrico

e TNF- (AYUB et al., 2003; GALLOWAY e HANDY, 2003).

4.1 Superóxido Dismutase

A SOD é uma importante enzima antioxidante, são abundantes em células

aeróbias e que agem sobre o radical O

·-

, dismutando-o a H

(figura 9).

·-

+ 2H

––SOD H

+ O

Figura 9. Reação de detoxificação de EAO promovida pela SOD (ANDREAZZA et

al., 2004).

Esse grupo de enzimas produz peróxido de hidrogênio, que é menos reativo

e pode ser degradado por outras enzimas, como a catalase ou glutationa

peroxidase (ANDREAZZA et al., 2004).

Em mamíferos, foram identificados três diferentes tipos de enzimas SOD:

SOD1 ou SodCuZn, um homodímero de cobre e zinco encontrado no citoplasma;

SOD2 ou SodMn, um tetrâmero que contém manganês e encontrado

exclusivamente na mitocôndria; SOD3 ou Sod EC, um tetrâmero de cobre e zinco

que apresenta peptídeo sinalizador que o direciona exclusivamente para o espaço

extracelular (KINNULA e CRAPO, 2004; MAIER e CHAN, 2002).

4.2 Catalase

A enzima catalase tem como função principal dismutar peróxido de

hidrogênio, formando água e oxigênio molecular (figura 10).

––CAT 2H

O + O

Figura 10. Reação de detoxificação de EAO promovida pela CAT (ANDREAZZA et

al., 2004).

A atividade da CAT, nos tecidos humanos, é maior no fígado, seguido do

rim, pulmão e músculo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Essa enzima é um tetrâmero formado por quatro unidades idênticas, sendo

que cada monômero contém um grupo prostético de heme no centro catalítico. Em

células eucarióticas, existem catalases citosólicas e perixossomais, estando

presentes principalmente nos peroxissomas. Por não possuírem peroxissomas,

alguns órgãos estão mais expostos aos danos provocados pela produção de EAO,

como o coração, os pulmões e o cérebro. Nesses órgãos, um mecanismo de defesa

pode ser a difusão do peróxido de hidrogênio para o sangue, onde reagem com a

CAT eritrocitária. (ANDREAZZA et al., 2004; BLOKHINA et al., 2003).

4.3 Glutationa peroxidase

A glutationa peroxidase (GPx) é uma selenoenzima cuja ação se baseia na

oxidação de glutationa (GSH) ao seu dissulfeto correspondente GSSG, removendo

o H

e gerando H

O (figura 11).

+ 2GSH ––GPx GSSG + 2H

Figura 11. Reação de detoxificação de EAO promovida pela GPx (ANDREAZZA et

al., 2004).

A razão entre GSH e GSSG em células normais é alta, pois existe um

mecanismo de redução da GSSG que é catalisado pela enzima glutationa redutase

(figura 12).

A glutationa desempenha também um importante papel na detoxificação de

xenobióticos e vários compostos endógenos, como prostaglandinas, leucotrienos e

hidroperóxidos orgânicos, por meio de reações mediadas pela glutationa

transferase (DICKINSON e FORMAN, 2002; SIES, 1999).

Figura 12. Mecanismo de defesa antioxidante. Adaptado de MAIER e CHAN, 2002.

4.4 Outros antioxidantes

Além dos antioxidantes citados, a vitamina E confere proteção à membrana

celular por atuar como quelante dos oxidantes produzidos durante a

lipoperoxidação. É um scavenger de radicais peroxil, sendo o mais importante

inibidor de radicais livres nas reações de lipoperoxidação em animais, podendo esta

função estar limitada em situações de sobrecarga de ferro (HALLIWELL e

GUTTERIDGE, 1999). Ratos induzidos à intoxicação por malation, com pré-

tratamento de vitamina E, demonstraram diminuição da lipoperoxidação em

eritrócitos, quando em comparação com o grupo dos ratos sem pré-tratamento

(JOHN et al., 2001).

O -caroteno interage com as EAO, especialmente quando ocorrem em

baixas tensões de O

, enquanto que a vitamina E se mostra mais eficiente quando

há altas tensões de O

no meio. A vitamina C, ou ascorbato é um antioxidante

hidrossolúvel que pode neutralizar diretamente as EAO, mas que pode funcionar

também como pró-oxidante quando em dose elevada, ou quando exposta a metal,

levando a lipoperoxidação. O possível benefício da ação destas vitaminas

antioxidantes, não deve ser negligenciado (AKHGARI et al., 2003).

Também há os antioxidantes vitamínicos disponíveis em medicamentos,

destacam-se os derivados do tióis, entre eles a N-acetilcisteína e

mercaptopropionilglicina. A capacidade antioxidante da N-acetilcisteína foi avaliada

em conjunto com a Desferoxamina pela redução da mortalidade em ratos

submetidos à indução de sepse (JOHN et al., 2001; RITTER et al., 2004).

As plantas também podem atuar como antioxidantes, tal como a ginger

(Zingiber officinales Rosc), que previne a formação de RL, mantendo a integridade

de eritrócitos e protegendo contra exposições sub-crônicas de malation (AHMED et

al., 2000). Já os compostos polifenólicos estão presentes em muitas plantas, frutas

e vegetais. Como constituintes de parte da dieta humana, estão relacionados com

atividade antioxidantes contra os radicais livres (MOLINA et al., 2003; SILVA et al.,

1998).

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral

Avaliar o estresse oxidativo em órgãos de ratos Wistar adultos quando

induzidos à intoxicação aguda e crônica por malation.

5.2 Objetivo Específico

Verificar o nível de estresse oxidativo nos dois tipos de tratamento, agudo e

crônico do fígado, rim, diafragma, pulmão, quadríceps e soro atingidos pela

intoxicação, em diferentes doses, de malation em ratos Wistar adultos.

Analisar os parâmetros de estresse oxidativo através das análises

bioquímicas das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e carbonil.

Analisar a atividade de antioxidantes enzimáticos através das análises

bioquímicas de catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD).

CAPÍTULO II – ARTIGO

OXIDATIVE PARAMETERS IN WISTAR RATS ACUTE AND

CHRONICALLY INTOXICATED WITH MALATHION

Possamai, F. P.; Fortunato, J. J.; Feier, G.; Agostinho, F. R.; Quevedo, J; Dal-

Pizzol, F.

Manuscrito em preparação

OXIDATIVE PARAMETERS IN WISTAR RATS ACUTE AND

CHRONICALLY INTOXICATED WITH MALATHION

(1)

Possamai, F. P.;

(2)

Fortunato, J. J.;

(2)

Feier, G.;

(2)

Agostinho, F. R.;

(2)

Quevedo,

(1)

Dal-Pizzol, F.*

(1)

Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul

Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;

(2)

Laboratório de Neurociências, Universidade do Extremo Sul Catarinense,

Criciúma, SC, Brazil;

*Correspondence: Prof. Felipe Dal-Pizzol, M.D., Ph.D. - Laboratório de

Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul Catarinense, CEP

88806-000, Criciúma, SC, Brazil. Phone: 55-48-4312759 - Fax: 55-48-4312750.

E-mail: piz@unesc.rct-sc.br