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INGRID CHAVES CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DE UM NOVO AGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DE
ADENOSINA, ATL313, SOBRE A ENTERITE INDUZIDA PELA TOXINA A DO
Clostridium difficile EM ALÇA ILEAL ISOLADA DE CAMUNDONGOS.
Dissetação submetida à coordenação do Curso
de Pós-graduação em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Profª. Drª. Gerly Anne de Castro
Brito.
FORTALEZA
2005
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2
C364e Cavalcante, Ingrid Chaves
Estudo do efeito de um novo agonista do receptor
A2A de adenosina, ATL313, sobre a enterite induzida
pela toxina A do Clostridium difficile
em alça ileal
isolada de camundongos/ Ingrid Chaves Cavalcante.
__ Fortaleza, 2005.
93f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Gerly Anne de Castro
Brito.
Dissertação (Mestrado) –
Universidade Federal do
Ceará. Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
1. Clostridi
um difficile. 2. Toxina A. 3.
Inflamação. 3. Enterite. 5. Adenosina. 6. Neutrófilo. I.
Título.
CDD 615.1
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3
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
INGRID CHAVES CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DE UM NOVO AGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DE
ADENOSINA, ATL313, SOBRE A ENTERITE INDUZIDA PELA TOXINA A DO
Clostridium difficile EM ALÇA ILEAL ISOLADA DE CAMUNDONGOS.
FORTALEZA
2005
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INGRID CHAVES CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DE UM NOVO AGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DE
ADENOSINA, ATL313, SOBRE A ENTERITE INDUZIDA PELA TOXINA A DO
Clostridium difficile EM ALÇA ILEAL ISOLADA DE CAMUNDONGOS.
Dissertação submetida à coordenação do
Curso de Pós-graduação em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção de grau de Mestre em
Farmacologia.
Aprovada em 29/04/2005.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profª. Drª. Gerly Anne de Castro Brito (orientadora)
Universidade Fedral do Ceará – UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. Marcus Raimundo Vale
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Prf. Dr. Armênio Aguiar dos Santos
Universidade Federal do Ceará – UFC
Trabalho realizado no Laboratório da Inflamação e do Câncer (LAFICA)
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Faculdade de Medicina - Universidade Federal do Ceará (UFC)
5
Dedico esta dissertação a meus pais e
irmãs pelo amor e apoio de sempre.
6
AGRADECIMENTOS
À Professora Gerly Anne de Castro Brito, pela sua firme orientação e
dedicação, imensurável incentivo,e, sobretudo, pela amizade e confiança.
Ao Professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro exemplo de dedicação à
pesquisa e profissionalismo.
Ao Professor Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza, por seu
conhecimento e disponibilidade em nos ajudar sempre.
Ao Professor Marcus Raimundo Vale, por sua dedicação, sabedoria,
simplicidade e pelo grande apoio na realização desse trabalho.
Ao Professor Fernando Queiroz Cunha da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da USP, pela gentileza na execução das dosagens de citocinas.
A Gail Sullivan por sua gentileza em nos ceder o ATL313 e pela grande
colaboração na realização desse trabalho.
Aos Professores Mônica Studart e Jeová Moreira, pelo exemplo e incentivo de
sempre.
Aos “anjos” bolsistas Marcelo Vasconcelos de Castro e André Rodrigues
Façanha Barreto por, apesar de tão jovens, apresentarem tanta responsabilidade e
profissionalismo na execução desse trabalho. Meu muito obrigada. Vocês foram
tudo!
Ao Davi, pela compreensão e companheirismo.
À Maria Silvandira França Pinheiro (Vandinha) por sua gentileza, amizade e o
imensurável apoio.
À Patrícia Sâmara de Souza que com muita disposição e simpatia nos ajudou
nas dosagens de ADA.
7
À Silvana França dos Santos que sempre nos ajudou quando solicitada.
Ao José Ivan Rodrigues, por sua boa vontade, fé e pela grande ajuda na
confecção das lâminas.
Aos funcionários de Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
especialmente a Silvia, Aura e Rose pela a ajuda, amizade e o bom humor de
sempre.
Aos funcionários do Biotério, Dra. Artemísia, Phoebe e Júnior pela constante
ajuda.
Aos pós-graduandos do LAFICA Renata, Pedro, Rose, Hellíada, Mariana,
Vilma, Rondinele e Prof. Paulo pela boa convivência e ajuda constante.
À amiga Antoniella por sua amizade e pela indispensável ajuda durante os
experimentos.
Ao amigo Thiago Moura, pela sua disposição constante em ajudar.
Às minhas amigas-irmãs, Rita Izabel, Silvia, Raquel e Virgínia. É impossível
expressar em palavras a minha gratidão por nossa amizade que me é fundamental.
A CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro.
Á minha família e a Deus que me guiam e iluminam todos os instantes da
minha vida.
8
LISTA DE ABREVIATURAS
AMP: adenosina monofosfato
ADP: adenosina difosfato
ATP: adenosina trifosfato
mg: miligrama
Kg: quilograma
g: micrograma
nM: nanomolar
L: Microlitro
TxA: toxina A do Clostridium difficile
TxB: toxina B do Clostridium difficile
ADA: adenosina deaminase
LPS: lipopolissacarédeo
TNF- fator de necrose tumoral alfa
LTB
4
: leucotrieno B
4
fMLP: formil-metionil-leucil-fenilalanina
C. difficile: Clostridium difficile
PBS: phosphate buffered saline
r.p.m.: rotação por minuto
MPO: mieloperoxidase
i.p.: intra-peritoneal
s.b.: sub-plantar
h hora (s)
min.: minuto (s)
Cg: carreginina
IL-1 Interleucina 1
IgG: Imunoglobulina G
H&E Hematoxilina e eosina
x: vezes
i
9
RESUMO
A toxina A do Clostridium difficile (TxA) desempenha um importante papel na
patogênese da diarréia induzida por antibióticos e na colite pseudomembranosa,
uma condição caracterizada por intensa secreção e inflamação da mucosa. A
estimulação de receptores A
2A
da adenosina reduz a inflamação e o dano tecidual.
Neste estudo, avaliou-se o efeito de um novo agonista seletivo para receptores A
2A
da adenosina (metil éster do ácido 4-{3-[6-amino-9-(5-ciclopropilcarbamoil-3,4-
dihidroxitetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-2-il]prop-2-inil}piperidina-1-carboxílico;
ATL313) na enterite induzida pela TxA em alças ileais de camundongos. O ATL313
(0,05-5 nM) e/ou o antagonista dos receptores A
2A
da adenosina (ZM241385; 5 nM)
ou PBS foram injetados em alças ileais imediatamente antes da injeção de TxA (1-10
µg/alça) ou PBS. As razões volume de secreção/comprimento da alça e
peso/comprimento da alça foram calculadas 3h depois. Amostras de tecido foram
coletadas para dosagem de atividade de mieloperoxidade (MPO), atividade de ADA,
histopatologia, imunohistoquímica para apoptose (ApopTag) e dosagem de TNF-α
por ELISA. A injeção de TxA (1-10 µg) nas alças ileais aumentou significativamente
(p<0,05) as razões volume de secreção/comprimento da alça e peso/comprimento
da alça com pico em 5µg. O tratamento das alças com ATL313 (5 nM) reduziu
significativamente (p<0,05) a secreção e o edema, preveniu a destruição da mucosa
e a apoptose induzidos por TxA. Tais efeitos protetores foram revertidos pelo
antagonista dos receptores A
2A
de adenosina, o ZM241385 (5 nM). O tratamento
com ATL313 (5 nM), reduziu ainda a infiltração neutrofílica, avaliada pela dosagem
de MPO, e reduziu o aumento da atividade de ADA induzidos pela TxA, bem como a
dosagem de TNF-α no tecido das alças ileais. O pré-tratamento sistêmico com
fucoidina, mas não com PBS, também reduziu o dano na mucosa e atividade de
ADA no tecido das alças ileais tratadas com TxA. Assim, conclui-se que na enterite
induzida pela TxA em camundongos, o agonista dos receptores A
2A
da adenosina
(ATL313) possui um potente efeito antiinflamatório, reduzindo consideravelmente a
lesão tecidual e a atividade de ADA. Nossos resultados também indicam que o
aumento da atividade de ADA e o dano tecidual induzido pela TxA em alça ileal de
camundongos está relacionado com a infiltração neutrofílica induzida por esta toxina.
ii
10
ABSTRACT
C. difficile toxin A (TxA) plays an important pathogenic role in antibiotic-induced
diarrhea and pseudomembranous colitis, a condition characterized by intense
mucosal inflammation and secretion. Agonist activity at A
2A
adenosine receptors (A
2A
ARs) attenuates inflammation and damage in many tissues. This study evaluated the
effect of a new selective A
2A
AR agonist (4-{3-[6-amino-9-(5-cyclopropylcarbamoyl-
3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-9H-purin-2-yl]prop-2-ynyl}piperidine-1-carboxylic
acid methyl ester; ATL313) on TxA-induced enteritis in murine ileal loops. ATL313
(0.05-5 nM) and/or the A
2A
AR antagonist (ZM241385; 5 nM) or PBS were injected
inside ileal loops immediately prior to challenge with TxA (1-10 µg/loop) or PBS.
Intestinal fluid volume/length and weight/length ratios were calculated 3 h later. Ileal
tissue samples were collected for measurement of myeloperoxidase (MPO) content,
evaluation of ADA activity, for histopathology and apoptotic immunohistochemistry
(ApopTag) and for assessment of TNF-α levels by ELISA. TxA (1-10 µg/loop)
significantly (p<0.05) increased volume/length and weight/length, reaching maximum
values at 5µg/loop dosage. ATL313 (5 nM) treatment significantly (p<0.05) reduced
TxA-induced volume/length and weight/length, as well as prevented mucosal
disruption and TxA-induced apoptosis. These protective effects were reversed by
ZM241385 (5 nM), the A
2A
AR antagonist. ATL313 (5 nM) also reduced neutrophil
infiltration, as measured by MPO content; reduced the toxin A-induced increase in
ADA activity. Prior to the challenge with TxA, a systemic injection of fucoidin, but not
PBS, also reduced tissue destruction and toxin A-induced increase in ADA activity. In
conclusion, the A
2A
AR agonist ATL313 has a great antiinflammatory effect in TxA-
induced mice enteritis, significantly reducing tissue destruction and ADA activity. In
addition, our data suggested that TxA-induced increase in ADA activity and tissue
damage in murine ileal loops are related to the neutrophil infiltration induced by this
toxin.
Iii
11
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS.........................................................................................i
RESUMO.......................................................................................................................ii
ABSTRACT..................................................................................................................iii
I. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1
1. Adenosina ................................................................................................................2
1.1 Receptores de Adenosina ...........................................................................5
1.2 Adenosina e Inflamação ..............................................................................7
2. Aspectos Gerais do Processo Inflamatório ..............................................................9
2.1 Migração de leucócitos para o foco inflamatório .......................................11
3. O Clostridium difficile .............................................................................................12
3.1 Doenças intestinais induzidas pelo Clostridium difficile ............................14
3.2 A Toxina A do Clostridium difficile..............................................................15
4. Justificativa e Objetivos...........................................................................................18
II. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................20
1.Animais ...................................................................................................................21
2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais...................................................................21
3. Drogas, soluções e corante ...................................................................................22
3.1 Drogas........................................................................................................22
3.2 Corantes ....................................................................................................23
3.3 Soluções ....................................................................................................23
3.4Tampões e soluções utilizados para o ensaio
imunoenzimático.........................................................................................................24
3.5Anticorpos ..................................................................................................24
3.6Tampões, reagentes e soluções usados para o ensaio de
imunohistoquímica para apoptose .............................................................................25
3.7 Tampões e soluções usados na dosagem da atividade de
mieloperoxidase.........................................................................................................25
12
3.8 Tampões e soluções usados na dosagem da atividade adenosina
deaminase.................................................................................................................26
4. Protocolo Experimental........................................................................................ 27
4.1 Alça ileal isolada de camundongo............................................................27
4.2 Avaliação do edema de pata induzido por carragenina...........................28
4.3Histopatologia ...........................................................................................29
4.4 Avaliação da atividade de mieloperoxidase no íleo..................................29
4.5 Avaliação da atividade de adenosina deaminase (ADA)..........................30
4.6 Dosagem de TNF-α...................................................................................31
4.7 Imunohistoquímica para apoptose ...........................................................32
4.8 Análise estatística......................................................................................32
III RESULTADOS.......................................................................................................34
1. Avaliação do efeito da toxina A do Clostridium difficile (TxA) quando injetada
dentro de alças isoladas do íleo de camundongo......................................................35
2. Avaliação do efeito do ATL313, agonista do receptor A
2A
de adenosina, nas alças
isoladas de íleo de camundongo tratadas com toxina A do Clostridium difficile
(5µg)...........................................................................................................................35
3. Efeito do agonista do receptor A
2A
da adenosina, ATL313, sobre o aspecto
macroscópico da alça ileal de camundongos induzido por toxina A do Clostridium
difficile (TxA)...............................................................................................................38
4. Avaliação histológica do tecido das alças ileais isoladas de camundongos tratadas
com PBS, toxina A OU ATL313+toxina A..................................................................38
5. Avaliação do efeito do antagonista do receptor A
2A
de adenosina, ZM241385, nas
alças ileais isoladas de camundongos tratadas com ATL313....................................41
6. Avaliação histológica do efeito do antagonista do receptor A
2A
de adenosina,
ZM241385, sobre a ação do ATL313 na enterite induzida por toxina A em alça ileal
de camundongos........................................................................................................41
7. Efeito do ATL313 sobre a atividade de mieloperoxidase no tecido das alças ileais
isoladas de camundongos..........................................................................................45
8. Avaliação do efeito do ATL313 sobre o edema de pata induzido por carragenina
em ratos.....................................................................................................................47
13
9. Dosagem de mieloperoxidase na pele e tecido celular subcutâneo da região
plantar de ratos tratados por via sub-plantar com carragenina ou salina e por via
intraperitoneal com salina ou ATL313........................................................................47
10. Dosagem da atividade de adenosina desaminase (ADA) no tecido das alças
ileais isoladas de camundongos tratadas com PBS, toxina A ou ATL313+
TxA.............................................................................................................................50
11. Avaliação do efeito do ATL313 (agonista do receptor A
2A
de adenosina) e do
ZM241385 (antagonista do receptor A
2A
de adenosina) sobre a apoptose induzida
pela toxina A do Clostridium difficile...........................................................................52
12. Dosagem de TNF-α no tecido de alça isolada de camundongos tratadas
localmente com PBS, toxina A, ATL313+TxA ou ZM341385+
ATL313+TxA..............................................................................................................54
13. Avaliação do efeito do pré-tratamento sistêmico dos animais com fucoidina sobre
o aumento de peso e volume das alças ileais isoladas induzidos pela toxina A do
Clostridium difficile (TxA)............................................................................................56
14. Efeito da fucoidina sobre a dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO) no
tecido de alças íleais isoladas tratadas com toxina a em camundongos..................
....................................................................................................................................56
15. Efeito da fucoidina sobre a dosagem da atividade de adenosina desaminase
(ADA) no tecido de alças ileais isoladas tratadas com toxina A em camundongos.
....................................................................................................................................59
16. Avaliação histológica do efeito da fucoidina sobre o tecido das alças ileais
isoladas de camundongos tratadas com toxina A......................................................59
IV. DISCUSSÃO.........................................................................................................63
V. CONCLUSÕES......................................................................................................74
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................76
14
INTRODUÇÃO
15
I. INTRODUÇÃO
1. ADENOSINA
A adenosina, um nucleosídeo purínico endógeno, está amplamente
distribuída pelo corpo, modulando várias respostas fisiológicas nos mamíferos
(DAVAL et al., 1996). Sob condições normais, é sintetizada de maneira constitutiva
mas, em locais de dano tecidual é produzida em altas concentrações. Assim, esta
molécula desempenha importante papel na regulação da homeostase de muitos
sistemas fisiológicos, incluindo cardiovascular, nervoso, renal e sistema imune
(BLACKBURN, 2003). É liberada por várias células incluindo os fibroblastos, células
epiteliais e endoteliais, plaquetas e células musculares, mas também pode ser
derivada do metabolismo extracelular de nucleotídeos purínicos (LAPPAS et al.,
2005).
É um potente mensageiro extracelular, cuja formação está usualmente
elevada na inflamação devido a sua liberação por células pertencentes ou não ao
sistema imune (CRONSTEIN, et al., 1985). Porém, outro fator que contribui para seu
aumento extracelular é a rápida degradação de ATP e ADP em adenosina,
principalmente em condições metabolicamente desfavoráveis, tais como hipóxia,
isquemia ou inflamação (THIEL et al., 2003; OKUSA, 2002).
A sepse, por exemplo, é uma síndrome clínica definida como uma
resposta inflamatória sistêmica do hospedeiro direcionada especificamente a
patógenos. Esta situação clínica tem como conseqüência a hipóxia tecidual
ocasionada pela distribuição deficiente de oxigênio aos tecidos. Assim, há um
comprometimento da energia celular, ocasionando uma quebra intensificada de ATP
e elevando-se os níveis de ADP. Este é, portanto, degradado a AMP, levando a um
aumento de AMP livre, o qual é desfosforilado em adenosina pela ação da 5’-
nucleotidase citossólica (THIEL et al., 2003). Dessa maneira, a adenosina atinge
uma alta concentração intracelular sendo, então, transportada para o meio
extracelular através de transportadores especializados, para que, assim, possa se
ligar a seus receptores específicos localizados na superfície das células. (Esquema
1)
16
AMP
5’-nucleotidase
Ectonucleotidases
Tranportado
res
de adenosina
Esquema 1. Metabolismo da adenosina. (Adaptado de HASKÓ e CRONSTEIN, 2004)
Além da formação de adenosina pela via supracitada, a liberação desta
pode ser potencializada através da prevenção de sua reutilização, ou seja, pela
inibição hipóxica da enzima adenosina quinase, a qual refosforila o nucleosídeo a
AMP (SITKOVSKY, 2003), aumentando de 15 a 20 vezes a adenosina intra e
extracelular (DECKING UKM, et al., 1997). Outra via que, provavelmente, contribui
para o aumento da adenosina extracelular é a liberação por células de precursores
nucleotídicos de adenina (ATP, ADP e AMP) que por ação de ectonucleotidases, tais
como, CD39 (nucleosídeo trifosfato defosforilase) e CD73 (5’-ectonucleotidase),
sofrem catabolismo extracelular (HASKO e CRONSTEIN, 2004).
ATP
ADP
ATP
Adenosina
Quinase
ADENOSINA
Adenosina
Deaminase
INOSINA
ADENOSINA
A
1
R
A
2A
R
A
2B
R
A
3
R
Produção intra
-
celular de
adenosina
Célula do Sistema
Imunológico
17
Ainda não estão totalmente elucidados, sendo assim interesse de muita
investigação, quais tipos celulares estão mais envolvidos na produção de adenosina
extracelular. No entanto, CRONSTEIN (1994) relatou que as células endoteliais e os
neutrófilos estão sendo consistentemente relacionados com a liberação de grande
quantidade de adenosina em sítios de estresse metabólito, inflamação e infecção.
Observa-se que vários mecanismos contribuem para o aumento da
concentração extracelular de adenosina. No entanto, a sua biodisponibilidade é
limitada pela enzima adenosina deaminase, a qual degrada a adenosina em inosina
(Esquema 2).
Esquema 2. Representação da reação de deaminação da adenosina pela enzima
adenosina desaminase (ADA).
A atividade da adenosina desaminase (ADA), no homem, é expressa por
duas iso-enzimas: ADA1e ADA2. A primeira é sintetizada em todos os tecidos e
pode ser encontrada livre ou associada ao CD26 (DONG, et al., 1997 e UNGERER,
et al., 1996), enquanto que a ADA2 é exclusivamente sintetizada em monócitos e
macrófagos (UNGERER, et al., 1996). A ADA exerce um importante papel no
controle da concentração de adenosina afetando, desse modo, muitas áreas de
modulação extracelular. Assim, a ausência de ADA leva a um descontrole nos níveis
ADA
ADENOSINA
INOSINA
18
de adenosina que conseqüentemente desencadeará várias alterações fisiológicas.
Desse modo, essa enzima desempenha papel crucial para o desenvolvimento e o
bom funcionamento do sistema imunológico.
1.1 RECEPTORES DE ADENOSINA
A investigação sobre o efeito que a adenosina exerce no processo
inflamatório e sistema imunológico pode ser dividida em três períodos. As primeiras
duas décadas deste período demonstraram: a inibição das células envolvidas no
processo inflamatório pela adenosina extracelular, implicou como reguladores da
inflamação as vias de elevação do AMPc e os receptores de adenosina e, enfim,
revelou múltiplos estímulos e condições que induzem a liberação da adenosina para
o espaço extracelular por diferentes tipos celulares (DEUTICKE et al., 1966;
SULLIVAN, et al., 1976; WINN, et al., 1981; BORN, et al., 1964; LICHTENSTEIN, at
al., 1968; WOLBERG et al., 1975; MARONE, et al., 1978; MARONE, et al., 1979;
FREDHOLM, et al., 1982).
As outras duas décadas de investigação caracterizaram-se por pesquisas
com síntese de novos ligantes e pela clonagem molecular e caracterização dos
quatro subtipos de receptores de adenosina (LINDEN, 2001; LIBERT et al., 1989;
OLAH e STILES, 1995; LINDEN et al., 1999). Assim, os efeitos farmacológicos da
adenosina são mediados por receptores específicos denominados receptores de
adenosina e, atualmente, são reconhecidos os quatro sub-tipos: A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
.
Estes receptores, amplamente distribuídos no corpo, pertencem à família de
receptores acoplados à proteína G, que dependendo do tipo de proteína G a qual se
ligam, inibem (G
i,
G
o
) ou estimulam (G
S
) a atividade da adenil ciclase (THIEL et al.,
2003). Os receptores A
1
e A
3
têm afinidade pelas proteínas G
i
e G
o
, enquanto que os
receptores A
2A
e A
2B
interagem com as proteínas G
S
, resultando no aumento
intracelular de AMPc (OLAH e STILES, 1995).
Estes diferentes receptores de adenosina podem exercer efeitos opostos
sobre uma mesma função (SITKOVSKY, 2003). CRONSTEIN et al. (1992) mostraram
que a aderência neutrofílica ao endotélio poderia ser inibida pelos receptores A
2A
e
aumentada por receptores A
1
. LINK et al. (2000) e BOUMA et al. (1994) relataram
que a secreção de IL-12 por monócitos humanos induzida por lipopolissacarídeo
(LPS) foi inibida pelos receptores A
2A
, mas não pelos receptores A
1
ou A
3
. Assim, o
19
efeito da adenosina sobre um tipo celular irá depender de qual receptor de
adenosina se expressa com predomínio sobre a célula.
Os receptores A
2
de adenosina são glicoproteínas com peso molecular
aproximado de 45 kD que têm sido clonados em várias espécies animais como o
rato, cachorro, cobaia e no homem (LIIBERT et al., 1989; MAENHAUT et al., 1990;
FINK et al., 1992; PIERCE et al., 1992; SALVATORE et al., 1992; STEHLE et al.,
1992; MENG et al., 1994). O domínio carboxi-terminal dos receptores A
2A
tem
muitos resíduos de serina e treonina que são sítios potenciais de fosforilação
(OKUSA, 2002).
Os receptores A
2A
apresentam uma distribuição regular no corpo. No
cérebro, estes receptores mostram-se altamente concentrados nas regiões do
putamen, caudado, globo palidum, núcleo accumbens e tubérculo olfatório (DAVAL
et al., 1996). O RNAm dos receptores A
2A
também tem sido encontrado no coração,
fígado e pulmão (LINDEN et al., 1993) e estudos farmacológicos e bioquímicos
mostraram a presença destes receptores no fígado (JOHNSON, 1982) e nas
plaquetas (HÜTTEMANN et al., 1984).
No sistema cardiovascular, sob condições fisiológicas, o relaxamento
vascular é produzido por receptores A
2
endoteliais que causam relaxamento
dependente do endotélio. Quando a demanda de energia é aumentada, ou seja,
situação de hipóxia/isquemia, grande quantidade de adenosina é liberada tanto das
células endoteliais para a circulação coronariana, como dos miócitos cardíacos e
vascular para o interstício. Assim, os receptores A
2
do endotélio e das células
musculares lisas vasculares, respectivamente, mediam a vasodilatação dependente
e independente do endotélio (DAVAL et al., 1996). Notadamente, os receptores A
2A
também mediam a inibição da agregação plaquetária por meio da geração de AMPc
(HÜTTEMANN et al., 1984; DIONISOTTI et al., 1992).
Há uma forte evidência de que os receptores A
2A
desempenham um
importante papel como modulador no processo inflamatório, que pode ser
demonstrado em estudos com animais deficientes nestes receptores. Esses
trabalhos mostram que a ausência dos receptores A
2A
aumenta a inflamação e o
dano tecidual em modelos de lesão aguda no fígado, sepse induzida por endotoxina
e inflamação de úlcera infectada. Assim, a deficiência de sinalização dos receptores
A
2A
pode resultar em dano excessivo e importante conseqüências biológicas
20
(GOMEZ e SITKOVSKY, 2003). Assim, muitos pesquisadores acreditam no potencial
terapêutico antiinflamatório dos agonistas de receptores A
2A
.
No entanto, além de estimular ou inibir a enzima adenil ciclase, os sub-
tipos de receptores de adenosina, via ligação a diferentes tipos de proteína G,
podem agir em outros sistemas efetores, tais como os canais de cálcio e potássio,
fosfolipases C, -D, -A2, GMPc, fosfodiesterases que modulam diferentes funções
celulares (THIEL, et al., 2003).
O terceiro estágio de investigação do papel da adenosina sobre o
processo inflamatório e sistema imune caracteriza-se pelo desenvolvimento de
modelos em camundongos deficientes em receptores de adenosina modificados
geneticamente. Estas pesquisas têm como grande objetivo elucidar o papel
fisiológico in vivo da sinalização mediada pelos receptores de adenosina no sistema
imunológico e na patogênese das doenças inflamatórias. Com este propósito, OHTA
e SITKOVSKY em 2001 demonstraram a primeira evidência in vivo do papel dos
receptores A
2A
sobre a down-regulation do processo inflamatório na inflamação
aguda usando camundongos deficientes nesse subtipo de receptor de adenosina.
1.2. ADENOSINA E INFLAMAÇÃO
Logo após a descrição dos receptores de adenosina, muitas
investigações foram feitas com o objetivo de elucidar a presença desses receptores
nos neutrófilos e se esses receptores modulavam as ações neutrofílicas. Assim,
CRONSTEIN e colaboradores em 1983 demonstraram que a adenosina, através da
ligação a seus receptores de superfície, diminuía a geração estimulada do ânion
superóxido. Estudos posteriores mostraram que a adenosina, agindo sobre seus
receptores A
2A
, inibia algumas funções neutrofílicas tais como, adesão às células
endoteliais, atividade bactericida, expressão de moléculas de adesão, secreção de
citocinas, fatores de crescimento e síntese de leucotrieno B4 (FLAMED et al., 2000).
Outros estudos demonstraram que os neutrófilos também expressam
receptores A
1
de adenosina, que quando ocupados, aumentam a quimiotaxia
neutrofílica e a fagocitose. Em geral, os efeitos antiinflamatórios modulados pelos
receptores A
2A
dominam as ações pró-inflamatórias dos receptores A
1
. Assim,
quando os neutrófilos chegam no sítio onde há intensa injúria tecidual, a adenosina,
gerada em altas concentrações pelo dano celular ou por células, age como um
21
feedback inibitório das funções inflamatórias dos neutrófilos (HASKO e
CRONSTEIN, 2004).
As células endoteliais desempenham um papel muito importante na
inflamação e na imunidade inata. Estas células expressam moléculas de adesão que
são responsáveis pelo recrutamento de leucócitos para os sítios inflamados, bem
como também sintetizam e liberam mediadores inflamatórios, como o fator de
ativação de plaquetas, IL-8 e IL-6, que exercem um papel direto no processo
inflamatório por conduzir a passagem dos leucócitos entre os compartimentos
teciduais. Já está documentado na literatura que vários tipos de células endoteliais
expressam receptores A
2A
e A
2B
(HASKÓ e CROSTEIN, 2004) e que estas células
são uma fonte importante de adenosina extracelular por sua capacidade de
desfosforilar os nucleotídeos de adenina (AMP) em adenosina, os quais são
liberados dos neutrófilos durante a transmigração através do endotélio (LENNON et
al., 1998).
A expressão dos receptores de adenosina A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
sobre os
linfócitos T no homem e no camundongo já tem sido demonstrada (LAPPAS et al.,
2005). O reconhecimento do antígeno pelo complexo TCR inicia uma cascata de
eventos que tem como resultado final a ativação das células T, demonstrado pela
síntese e secreção de citocinas como o ITF-γ e IL-2, pela citotoxicidade celular e
proliferação de células T. LAPPAS et al. (2005) investigaram o efeito da ativação das
células T CD4
+
mediado pelo complexo TCR sobre a expressão dos receptores de
adenosina e o papel desses receptores na regulação da atividade das células CD4
+
.
Assim, esses autores mostraram que a ativação das células T CD4
+
pelo complexo
TCR leva a uma rápida up-regulation da expressão dos receptores A
2A
de adenosina
e que a adenosina exógena através desses receptores pode agir como um regulador
endógeno da resposta inflamatória mediada pelos linfócitos T CD4
+
, formando dessa
maneira um feedback no qual a adenosina liberada do tecido inflamado serve para
inibir a atividade dos linfócitos T CD4
+
e também, por fim, a atividade dos
macrófagos (LAPPAS et al., 2005).
Alguns estudos mostram que a adenosina inibe a produção de O
2
-
induzida pelo fMLP (McGARRITY et al., 1989), bem como a agregação (SKUBITZ et
al., 1988) e aderência neutrofilíca (CRONSTEIN et al., 1985) demonstrando que a
adenosina desempenha importante efeito na modulação do processo inflamatório
22
(OKUSA, 2002), correlacionando este nucleosídeo com a inflamação e os estados
patológicos.
Um grande avanço no conhecimento da imunologia das células
apresentadoras de antígeno foi a descoberta do padrão de reconhecimento dos
receptores, que permite o reconhecimento de elementos microbianos repetidos
conservados tais como o lipopolissacarídeo (LPS) e o RNA viral, e nesse padrão se
inclui os receptores Toll-like (TLRs). A ligação dos receptores de adenosina sobre os
monócitos e macrófagos suprime fortemente a produção de IL-12, uma citocina pró-
inflamatória, induzida pelo LPS através do TLR4. Em outras observações, a
estimulação dos receptores de adenosina diminui a liberação induzida pelo TLR4 de
outros mediadores pró-inflamatórios do hospedeiro incluindo o TNF-α, MIP1-α e
óxido nítrico, porém aumenta a produção da citocina antiinflamatória IL-10. (HASCO
et al., 1996; SZABÓ et al., 1998). Em recente estudo utilizando camundongos
knockout para os receptores A
2A
e A
3
demonstrou-se que ambos receptores
contribuem para a supressão da produção de mediadores pró-inflamatórios seguidos
da estimulação de TLR (PINHAL-ENFIELD et al.; 2003; NÉMETH et al., 2003;
MAJUMDAR e AGGARWAL, 2003).
Portanto, o aumento da concentração de adenosina em pacientes com
sepse ou mesmo com outras patologias pode, não somente, refletir a severidade da
hipóxia tecidual, mas também ser de uma significância biológica para a regulação
das células pertencentes ao sistema imune (inato e adaptativo), especialmente as
células imunes que expressam receptores de adenosina (THIEL et al., 2003).
2. ASPECTOS GERAIS DO PROCESSO INFLAMATÓRIO
A reação inflamatória aguda é um conjunto de eventos que ocorrem nos
tecidos conjuntivos vascularizados, como resposta a estímulos adversos (COLLINS,
1999). É, portanto, uma reação de defesa do organismo, visando eliminar um agente
agressor, quer seja um microorganismo ou uma substância nociva. O efeito final
dessa reação pode ser a cura, com ou sem seqüelas, ou, se o estímulo nocivo
persistir, evolução para a inflamação crônica (RANG et al., 2003).
Para fins de sistematização, a resposta imune-inflamatória costuma ser
dividida, considerando a velocidade e a especificidade da reação, em inata ou
adaptativa. A imunidade inata compreende a ação de neutrófilos, macrófagos,
23
monócitos, sistema complemento, citocinas e proteínas de fase aguda que
promovem defesa imediata do hospedeiro. Já a resposta imune adaptativa consiste
de reações específicas contra antígenos promovidas por linfócitos T e B. A resposta
inata é rápida, mas costuma causar danos aos tecidos do hospedeiro por sua pouca
especificidade. Já a adaptativa é precisa, contendo estratégias de defesa projetadas
para combater um agente específico, mas demora alguns dias ou semanas para se
desenvolver (PARKIN & COHEN, 2001).
No início da era cristã, Cornelius Celsus (30 a.C. - 38 d.C.) descreveu os
quatro sinais clássicos da inflamação aguda: calor, rubor, tumor e dor. Virchow, no
século 19, acrescentou a eles mais um sinal: a perda ou alteração da função da
estrutura ou órgão acometido (COLLINS, 1999; RANG et al., 2003).
O evento desencadeante da reação inflamatória é o reconhecimento, por
receptores de superfície de macrófagos ou células dendríticas, de padrões
moleculares associados a patógenos (PMAP) (MEDZHITOV E JANEWAY, 2000).
Essas estruturas são componentes que grandes classes de patógenos têm em
comum, como o lipopolissacarídeos (LPS) das paredes bacterianas (RANG et al.,
2003). A interação PMAP - receptor produz uma resposta imediata que envolve:
- endocitose do agente estranho, sua destruição e o processamento de seus
componentes, posteriormente apresentados como antígenos;
- ativação do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB, do inglês nuclear factor
κB), que estimula a transcrição dos genes relacionados à produção de citocinas pró-
inflamatórias, dentre as quais se destacam a interleucina 1 (IL-1) e o fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) (PARKIN & COHEN, 2001).
Na fase aguda da inflamação dois fenômenos merecem destaque a nível
microscópico: a dilatação de arteríolas, capilares e vênulas, com aumento do fluxo
sangüíneo regional e exsudação e a migração de leucócitos para o foco inflamatório
(ROCHA E SILVA, 1978; SEDGWICK E WILLOUGHBY, 1985).
Esses fenômenos são orquestrados por um grande número de
mediadores oriundos do plasma e de vários tipos celulares que, em contrapartida,
influenciam-nos, formando uma rede de sinalizações. De fato, os vários caminhos
pelos quais se pode produzir uma mesma ação aumentam sobremaneira a eficiência
desses mecanismos de defesa, cruciais para a integridade dos organismos vivos
(RANG et al., 2003).
24
2.1. MIGRAÇÃO DE LEUCÓCITOS PARA O FOCO INFLAMATÓRIO
Um evento crítico da reação inflamatória e do combate à infecção é a
chegada dos leucócitos ao local da lesão. Isso envolve tanto a saída das células do
meio vascular para o interstício como seu deslocamento, já no interstício, até o foco
inflamatório (COLLINS, 1999; LUSTER, 1998).
Nos estágios precoces da inflamação, macrófagos ativados liberam
fatores estimuladores de colônia de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos e
macrófagos (GM-CSF). Essas citocinas agem sobre a medula óssea estimulando a
divisão celular dos precursores mielóides e lançando milhões de células na corrente
sangüínea. Advém daí a neutrofilia característica da inflamação aguda (PARKIN &
COHEN, 2001).
A seqüência de eventos que levam à saída de leucócitos para o interstício
pode ser sintetizada em: marginação, rolamento, adesão e transmigração ou
diapedese.
Logo no início da inflamação aguda situa-se o deslocamento dos
leucócitos para a periferia dos vasos, conhecido como marginação. Esse fenômeno
deve-se à estase sangüínea com redução da força de cisalhamento da parede
vascular (COLLINS, 1999; BRITO & RIBEIRO, 1999).
Liberação de TNF-α e IL-1 de macrófagos e mastócitos ativados e
endotoxinas de microorganismos em sítios de infecção causa aumento da expressão
de E e P-selectina nas células endoteliais locais e de L-selectina nos leucócitos. As
selectinas interagem com oligossacarídeos presentes em membranas celulares,
através de uma ligação transitória, de forma que o leucócito se liga ao endotélio, se
libera, acompanha o fluxo de sangue e volta a se ligar mais à frente. Isso causa o
movimento de ligação intermitente conhecido como rolamento (BRITO & RIBEIRO,
1999; PARKIN & COHEN, 2001).
O leucócito em rolamento tem sua velocidade bastante diminuída em
relação ao restante do fluxo sangüíneo. Ao mesmo tempo, entrando em contato com
o endotélio, durante o rolamento, os leucócitos ficam sujeitos à ação das quimiocinas
que se encontram aderidas aos proteoglicanos da superfície das células endoteliais.
As quimiocinas, além do forte poder de atração que exercem sobre leucócitos,
estimulam o aparecimento das integrinas e, mais importante, o aumento de sua
afinidade pelos ligantes. Fica, assim, facilitada a formação de uma ligação menos
25
forte, porém mais estável entre as integrinas leucocitárias e as moléculas de adesão
VCAM -1 e ICAM -1 (do inglês vascular cell adhesion molecule 1 e intercellular
adhesion molecule 1, respectivamente) no endotélio. Essa ligação promove a
adesão firme do leucócito à parede (LUSTER, 1998, COLLINS, 1999).
As quimiocinas são liberadas em sítios de inflamação por células
residentes, leucócitos residentes e recrutados e células endoteliais ativadas por
citocinas. Na matriz extracelular e proteoglicanos de superfície celular elas são
retidas, estabelecendo-se um gradiente de concentração de quimiocinas ao redor do
foco inflamatório. Os leucócitos aderidos ao endotélio, atraídos por esse gradiente, si
insinuam entre as células endoteliais ou através delas, no processo conhecido como
diapedese, e alcançam o meio extravascular (LUSTER, 1998). Outros fatores
quimiotáticos, além das quimiocinas, têm papel importante nesse processo. Entre
eles situam-se o C5a, o LTB
4
e produtos bacterianos, como a fMLP (PARKIN &
COHEN, 2001).
Uma vez nos tecidos extravasculares, os leucócitos se deslocam até o
local de maior concentração de fatores quimiotáticos. Nessa etapa, a locomoção
passa a depender de interações coordenadas e transitórias entre integrinas e
componentes da matriz extracelular, como o colágeno, a fibronectina e a laminina
(WERR et al., 2000). Altas concentrações de fatores quimiotáticos promovem down-
regulation de seus receptores na superfície dos leucócitos, de forma a retê-los no
local de inflamação (PARKIN & COHEN, 2001).
A maioria dos trabalhos realizados para elucidação do movimento de
leucócitos nesse contexto foi realizada com neutrófilos. De fato, eles constituem a
primeira linha de defesa, bem como a maioria das células que migram ao foco
inflamatório na inflamação aguda. No entanto, hoje está bem estabelecido que todos
os leucócitos usam mecanismos afins de locomoção, variando apenas os tipos
específicos de moléculas de adesão envolvidas em cada caso (PARKIN & COHEN,
2001; LLOYD & ADAMS, 1997).
3. O Clostridium difficile
O Clostridium difficile, uma bactéria anaeróbica gram-positiva, é um bacilo
formador de esporos. Essa sua habilidade de formar esporos parece ser a
característica chave que o torna capaz de persistir em pacientes e no ambiente
26
hospitalar por longos períodos, o que facilita a sua transmissão que é através da via
oral-fecal (POUTANEN & SIMOR, 2004). Um número de fatores de virulência,
incluindo produção de flagelo e de enzimas hidrolíticas tem sido associado com o
desenvolvimento de doenças (TASTEYRE, et al., 2000; SEDDON, et al., 1990).
Porém, os mais bem caracterizados e mais importantes fatores de virulência
produzidos pelo C. difficile são as exotoxinas A e B (BORRIELO, et al., 1998;
POXTON, et al., 2001; BONGAERTS & LYERLY, 1994) que estão relacionadas no
processo de desencadeamento das doenças diarréicas e de suas complicações
clínicas (TITOV et al., 2000).
As toxinas A e B do C. difficile são 50% idênticas na seqüência de seus
aminoácidos, possuindo estruturas primárias semelhantes e em ambas a atividade
enzimática e a citotoxicidade encontra-se no terminal NH
2
(SILVA & SALVIANO,
2003). Embora a toxina B possua uma maior ação citotóxica in vitro, a atividade
enterotóxica do Clostridium difficile em animais têm sido principalmente atribuída à
toxina A (HUMPHREY et al., 1979; REHG, 1980). No entanto, cepas de C. difficile
que produzem apenas TxB têm sido recentemente associadas com as doenças em
humanos (LIMAYE et al., 2000; PITUCH, et al., 2001). SOUZA et al. (1997)
investigando a habilidade da TxB em promover a migração neutrofílica na cavidade
peritoneal e na bolsa de ar subcutânea em ratos, encontraram que o sobrenadante
de macrófagos estimulados pela TxB induziu migração neutrofílica quando injetado
na cavidade abdominal e que essa toxina também estimulou a liberação de TNF-α
por macrófagos, sugerindo que a TxB induz uma intensa migração neutrofílica.
CARNEIRO-FILHO et al. (2001) encontraram no modelo de edema de pata que
ambas as toxinas A e B do C. difficile apresentaram atividade edematogênica, porém
com potência e time course distintos. Esses mesmos autores mostraram que
inibidores da produção de TNF-α (talidomida e pentoxifilina) inibiram
significativamente a migração neutrofílica induzida por ambas toxinas do C. difficile.
A maioria das cepas toxigênicas do C. difficile produz ambas as toxinas A
e B, as quais possuem mecanismos de ação similares: as toxinas são englobadas
pela célula intestinal e, no seu interior, afetam o citoesqueleto de actina, resultando
em morte celular (SILVA e SALVIANO, 2002). Também induzem a produção de fator
de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e interleucinas pró-inflamatórias, bem como
aumentam a permeabilidade vascular, o recrutamento de neutrófilos e monócitos, a
27
abertura entre as células epiteliais e a apoptose. A produção local de enzimas
proteolíticas causa a degeneração do tecido conjuntivo, levando a colite, diarréia e
formação de pseudomembranas. Essas últimas possuem uma aparência distinta
caracterizada por placas branco-amarealdas que histologicamente são compostas
por neutrófilos, fibrina, mucina e restos celulares (POUTANEN & SIMOR, 2004). De
acordo com esses mesmos autores, em suma, pelo menos três eventos devem
ocorrer na patogênese da diarréia induzida pelo C. difficile: alteração da flora fecal
normal, colonização colônica com o C. difficile toxigênico e o crescimento dessa
bactéria com a elaboração de suas toxinas.
3.1. DOENÇAS INTESTINAIS INDUZIDAS PELO Clostridium difficile
Em 1935 o C. difficile foi pela, primeira vez, isolado de fezes de neonatos,
no entanto, apenas quarenta anos mais tarde é que esta bactéria foi admitida como
a principal causa da colite pseudomembranosa e diarréia associada a antibióticos
(SILVA & SALVIANO, 2003), no entanto a colite pseudomembranosa fora descrita
pela primeira vez por Finney em 1893 (FERREIRA et al., 1999). Atualmente,
reconhece-se que esta bactéria é o agente causador de 20-30% dos casos de
diarréia associada a antibioticoterapia, 50-75% da colite associada a antibióticos e
90% da colite pseudomembranosa (BARLETT et al., 1980; BRETTLE et al., 1984;
GEORGE et al., 1982; GILLIGAN et al., 1981; PRICE & DAVIES, 1977).
A colonização pelo C. difficile ocorre principalmente devido à uma baixa
resistência do organismo do paciente durante terapia indiscriminada de antibióticos,
resultando em alteração na flora intestinal. No entanto, outros fatores de riscos
podem estar associados, como: períodos longos de internação hospitalar, doenças
debilitantes e imunossupressoras e idade avançada (JOHNSON et al, 1998; CLIMO
et al, 1998). Adultos hospitalizados têm índices de colonização em torno de 20 a
30%, enquanto que esse índice em pacientes não hospitalizados é apenas de 3%
(BARTLETT, 1992; VISCIDI et al., 1981; McFARLAND et al., 1989). Os antibióticos
mais freqüentemente associados com a diarréia associada ao C. difficile são as
clindamicinas, cefalosporinas e penicilinas de amplo espectro (BARTLETT, 1992;
KELLY, et al., 1994; GERDING, 1989; FEKETY e SHAH, 1989; BARTLETT, 1981).
Porém, segundo BARTLETT (2002), qualquer antibiótico pode conduzir a uma
28
diarréia associada ao C difficile, com exceção da vancomicina administrada por via
parenteral.
O período de incubação, que vai da ingestão do C. difficile ao início dos
sintomas, não tem sido determinado. Porém, o tempo da exposição ao antibiótico
para o início dos sintomas pode variar de um dia a seis semanas, ou mesmo mais
tempo. As doenças associadas ao C. difficile incluem desde a uma diarréia
moderada a uma colite que pode comprometer a vida (KELLY et al., 1994;
MYLONAKIS, et al., 2001). E as características clínicas típicas compreendem
diarréia, dor no baixo abdômen e sintomas sistêmicos como febre, anorexia, náusea
e mal-estar. Leucocitose e hemorragia colônica oculta freqüentemente ocorrem,
porém evacuação com sangramento profuso é um achado incomum (KELLY et al.,
1994).
Pouca importância tem sido dispensada ao papel do C. difficile como
potencial causador de diarréia comunitária. A incidência da infecção na comunidade
tem sido estimada em 8/100.000 pacientes por ano, mas esse dado pode estar
sendo subestimado pela falta de estudos multicêntricos de rastreamento desta
bactéria na comunidade. Porém, em 3 a 8% dos adultos saudáveis há presença do
C. difficile no trato gastrointestinal (AL-BARRAK et al., 1999; BARBUT et al., 1995).
Estudos sobre a diarréia associada ao C. difficile no Brasil tem sido
limitada talvez devido à deficiência de tecnologia na cultura de patógenos
anaeróbicos. Somente um pequeno número de laboratórios é capaz de alcançar um
diagnóstico definitivo das infecções causadas pelo C. difficile, por causa da
indisponibilidade de ensaios seguros para a detecção das toxinas dessa bactéria. No
entanto, GARCIA e UZEDA (1988), em um estudo, isolaram o C. difficile de 13,8%
de amostras clínicas de crianças hospitalizadas com diarréia aguda (FERREIRA et
al, 2003).
3.2. A TOXINA A DO Clostridium difficile
A toxina A do C. difficile, uma proteína de alto peso molecular (308 kDa),
causa destruição do epitélio intestinal, intensa inflamação na mucosa, secreção
intestinal e colite hemorrágica quando introduzida purificada no lúmen intestinal in
vivo (HUMPHREY et al., 1979; REHG, 1980). Essa reação necro-inflamatória é
causada pelo desarranjo primário da barreira epitelial ocasionado pela difusão da
29
toxina até a lâmina própria intestinal (PATHOULAKIS & LaMONT, 2001). A maioria
dos efeitos da toxina A é atribuída a sua capacidade de causar monoglicolisação de
pequenas proteínas da família Rho numa treonina 37/35 (JUST et al., 1995). Essa
modificação inativa proteínas Rho, Rac e Cdc42, resultando em desarranjo do
citoesqueleto, retração celular, perda de adesão e arredondamento de células em
cultura (JUST et al., 1995; HALL, 1998). A toxina A também afeta a fosfolipase A2,
levando a produção de prostaglandinas e leucotrienos, bem como causa danos nas
microvilosidades intestinais, podendo ocorrer completa erosão da mucosa com
produção de um fluido viscoso e sanguinolento em resposta ao dano tecidual
(FANG et al., 1994).
De acordo com KIRKWOOD et al. (2001), o mecanismo pelo qual ocorre
enterite envolve a ligação da toxina A aos receptores dos enterócitos, levando à
ativação dos nervos sensoriais e entéricos, o que levará a uma motilidade e
secreção intestinal intensificada, degranulação de mastócitos e infiltração da mucosa
pelos neutrófilos. A toxina A provoca quimiotaxia para leucócitos polimorfonucleares
(PMN) e a presença de numerosos PMN tanto dentro como entre as
pseudomembranas e na mucosa intestinal é um aspecto proeminente da colite e
diarréia induzida por antibióticos causada pela infecção pelo C. difficile (LYERLY et
al., 1988).
A colite induzida pela TxA do C. difficile está associada com um
proeminente influxo de neutrófilos dentro da mucosa colônica e, assim, a colite
pseudomembranosa é caracterizada por um infiltrado inflamatório agudo com micro-
abscessos e pseudomembranas ricas em neutrófilos (LYLERLY et al., 1988). Alças
ileais isoladas em coelho, quando expostas à TxA, apresentaram necrose das
células epiteliais e maciço infiltrado neutrofílico, sendo esses achados análogos aos
encontrados na colite induzida pelo C. difficile em humanos (KELLY et al., 1993).
Lima et al. em 1989 mostraram que após 2h de inoculação com TxA em alças
intestinais isoladas em coelho havia infiltrado neutrofílico na lâmina própria e na
superfície epitelial bem como destruição da mucosa (ROCHA et al., 1997). BRITO et
al. (2002a) demonstraram que a toxina A do C. difficile induz mudança substancial
na forma e função dos leucócitos polimorfonucleares quando essas células migram
para o sítio inflamatório em resposta ao fMLP.
Além disso, a toxina A estimula a liberação de outros mediadores
endógenos da inflamação, incluindo fator de necrose tumoral (TNF), interleucina-1
30
(IL-1), IL-8, leucotrieno B
4
(LTB
4
) e fator de ativação de plaquetas (BOBAK e
GILMER, 1994; TRIADAFILOPOULOS et al., 1989).
A substância P liberada pelas terminações dos neurônios sensoriais e os
receptores de neurocinina-1 (NK1R) também são mediadores da inflamação
induzida pela toxina A em animais experimentais (KIRKWOOD et al., 2001). A
substância P ativa os receptores de neurocinina-1 sobre vários de tipos de células
intestinais incluindo, nervos entéricos, células endoteliais, macrófagos da lâmina
própria e leucócitos para estimular o extravasamento plasmático, a secreção de
fluido, a degranulação de mastócitos e a produção de citocinas (CASTAGLIUOLO et
al., 1997; FIGINI et al., 1997; MANTYH, et al., 1996). Apesar de já estar bem
demonstrado que a substância P e os receptores de neurocinina-1 desempenham
um papel essencial na iniciação e progressão das respostas secretória e inflamatória
da TxA, não há ainda nenhuma informação sobre os mecanismos que
potencialmente modulam essa resposta intestinal induzido pela TxA (KIRKWOOD, et
al., 2001)
Recentes estudos sugerem que a suscetibilidade imunológica
desempenha um papel importante na infecção pelo C. difficile, assim, de acordo com
KYNE et al. (2000 e 2001) a presença de anticorpos IgG contra a toxina A do C.
difficile protege contra a expressão clínica da infecção causada por esse bacilo bem
a sua recorrência.
Além de causar necrose celular, a TxA do C. difficile também induz
apoptose nas células epiteliais intestinais, lâmina própria e nos mastócitos. Nesse
sentido, BRITO et al. (2002b) demonstraram que a toxina A do C. difficile é um
potente indutor de apoptose em uma linhagem de células de epitélio intestinal
humano e que esta apoptose é mediada por caspases 3, 6, 8, 9 e Bid e por lesão
mitocondrial seguida de liberação de citocromo c (BRITO, 2002b). MAHIDA et al.
(1998) demonstraram que a TxA induz a morte celular por apoptose de linfócitos T e
de eosinófilos, e que as células T purificadas também sofrem apoptose quando
exposta à TxA sugerindo que esses fenômeno ocorre em conseqüência da interação
direta entre essas células e a referida toxina. BRITO et al. (in press) concluíram que
a TxA causa apoptose, necrose, diminuição da resistência trans-epitelial, e inibe o
reparo da injúria epitelial por prejudicar a migração celular. Esses efeitos sobre a
sobrevivência, permeabilidade e reparo podem estar envolvidos no desarranjo da
31
barreira epitelial causado pela TxA que permite seu contato com a mucosa e intensa
inflamação observados na colite pseudomembranosa induzida pelo C. difficile.
FANG et al. em 1994 demonstraram que 10 mg/mL de TxA, injetada
dentro de alça isolada em coelho, causava consistente secreção inflamatória
hemorrágica após 6-8h. Porém, a co-administração de três diferentes inibidores de
PLA
2
(fosfolipase A
2
) dentro das alças bloquearam as respostas secretória e
inflamatória induzidas pela TxA.
MENEZES, 2002, concluiu em seu trabalho que a toxina A do Clostridium
difficile provoca uma potente secreção intestinal de forma dose e tempo dependente,
em modelo experimental de íleo isolado de coelho. Bem como, provoca extensas e
graves lesões teciduais na mucosa intestinal, podendo variar desde destruição de
vilosidades até a evidente infiltração neutrofílica.
CASTAGLIUOLO et al., 1998, em um modelo de alça ileal isolada em
ratos, mostraram em seu trabalho que o quimiotático neutrofílico MIP-2 é liberado
das células epiteliais intestinais de ratos durante os estágios iniciais da enterite
induzida pela toxina A do C. difficile por um mecanismo que envolve um efeito direto
da toxina sobre os enterócitos. ROCHA, et al. (1997) concluíram que migração
neutrofílica na cavidade peritoneal e na bolsa de ar de ratos induzido pela toxina A é
mediado por citocinas como o TNF-α, IL-β e por leucotrienos, liberados por
macrófagos residentes. Assim, esses autores sugerem que mediadores inflamatórios
podem ter uma contribuição importante na colite inflamatória causada pela TxA do C.
difficile.
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Tendo em vista o exposto, vê-se que muitos dos efeitos antiinflamatórios
da adenosina são atribuídos ao estímulo dos receptores A
2A.
Esses estão expressos
em muitas células envolvidas na inflamação, incluindo neutrófilos, macrófagos,
plaquetas e células endoteliais (McPHERSON, et al. 2001). Sendo a doença
colônica induzida pelo C. difficile caracterizada pela infiltração de células
inflamatórias na mucosa (MAHIDA et al., 1998), procuramos, nesse trabalho, avaliar
o efeito do agonista do receptor A
2A
de adenosina (ATL 313) na lesão induzida pela
toxina A do Clostridium difficile em alça intestinal isolada de camundongo.
32
Esse estudo, portanto, teve como objetivos gerais estudar o efeito do agonista
do receptor A
2A
de adenosina sobre o processo inflamatório, utilizando o modelo de
enterite induzida pela toxina A do Clostridium difficile em alça isolada do íleo em
camundongos Swiss. Espera-se, com isso, contribuir para o esclarecimento do papel
da adenosina no processo inflamatório, notadamente na enterite induzida pela TxA,
bem como fornecer argumentos científicos para um futuro teste clínico de agonistas
do receptor A
2A
em humanos. Para tanto, os objetivos específicos deste trabalho
foram:
• Investigar o efeito do agonista do receptor A
2A
de adenosina na destruição da
mucosa intestinal induzida por toxina A através da análise histopatológica.
• Verificar o efeito do agonista supracitado no aumento do peso e da secreção da
alça ileal induzido por TxA em camundongos.
• Verificar a ação desse agonista de adenosina sobre a infiltração neutrofílica
através da dosagem da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) na alça
ileal.
• Analisar o efeito do ATL313 nos níveis de TNF-α no tecido de alça ileal de
camundongos.
• Verificar o efeito deste agonista de adenosina na ação pró-apoptótica da toxina
A no tecido da alça ileal.
• Verificar o efeito da toxina A e do ATL313 na atividade da enzima adenosina
desaminase (ADA) mensurada na alça ileal.
• Verificar a relação entre o aumento da atividade da enzima adenosina
deaminase induzida pela TxA e a infiltração neutrofílica medida pela atividade
da mieloperoxidase, através do uso da fucoidina.
33
MATERIAIS E MÉTODOS
34
II. MATERIAIS E MÉTODOS
1. ANIMAIS
Foram utilizados camundongos Swiss e ratos Wistar de ambos os sexos,
pesando 25-30g e 180-200g, respectivamente. Estes animais eram provenientes do
Biotério Central do Campus do Pici e do Biotério Setorial do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará.
Os animais permaneceram acondicionados em caixas de plástico, forradas com
raspa de madeira e receberam água e ração ad libitum. Os camundongos foram
mantidos em jejum 24 horas antes de todos os procedimentos experimentais, com
livre acesso à água. No entanto, os ratos permaneceram em jejum com água ad
libitum somente durante os experimentos.
O tratamento dispensado aos animais estava de acordo com o "Guia de
Cuidados em Uso de Animais de Laboratório" do National Institues of Health
(Bethesda, MD, USA). Sendo o nosso projeto aprovado pela Comissão de Ética em
Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará, protocolo nº 11/03.
2. APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS
- Pletismômetro Ugo-Basile 7140
- Balança Analítica Ohaus AS2600
- Balança Analítica Marte AL200
- Centrífuga Eppendorf 5804R
- Microscópio Óptico binoclar Nikon Alphaphot 2 VS2
- Microscópio Óptico binocular acoplado à câmera fotográfica Olympus
- Medidor de pH Hanna Instruments HI 8519N
- Espectrofotômetro Spectrum SP-2000UV
- Centrífuga Marathon 26KMR
- Banho Maria Modelo 100
- Homogeneizador de Pater
- Autoclave
- Estufa Olidef cz
35
- Seringas para insulina (B-D, Ultra Fine II) com agulha de calibre 30G
- Lâminas para microscopia
- Lamínulas
- Papel de filtro qualitativo
- Alicate para deslocamento cervical
- Seringas de 1,3,5 mL (B-D Plastipak)
- Tubos de ensaio
- Micropipetas Gilson de 2, 10, 20, 100, 200 e 1000 µL
- Ponteiras para pipetas automáticas Sigma
- Material cirúrgico (pinças e tesouras)
- Capela de fluxo laminar Vico Biosafe Plus Classe II tipo A
- Proveta graduada
- Tubos de polipropileno para centrífuga (15 e 50mL)
- Espátulas de aço
- Eppendorfs
- Bequeres
- Homogeneizador de tecidos Ultra-turrax T8 e Dispergierstation T8.10 da Ika
Labortechnik
- Micrótomo Olympus
- Linha de algodão
- Fio de sutura
3. DROGAS, SOLUÇÕES E CORANTES
3.1 DROGAS
- Toxina A do Clostridium dificille
Esta toxina foi gentilmente cedida pelo Dr. David M. Lyerly do “Virginia
Polytechnic Institute”, Blaksburg, VA, EUA. Oriunda de um filtrado da cultura de C.
dificille (VPI/ 0463) (strain # 10463; molecular weight 308 kDa), foi purificada por
precipitação com sulfato de amônia, seguida por cromatografia de troca iônica e
cromatografia de imunoafinidade. A homogeneidade da toxina foi determinada por
imunoeletroforese cruzada e eletroforese em gel de poliacrilamida. A toxina foi
armazenadas a 4ºC.
36
- ATL313 (P.M.: 499,52) e ZM24138 (P.M.: 337,34): ambas gentilmente cedidas
pelo Jayson Rieger Adenosine Therapeutics, LLC, USA.
- Fucoidina (Fuciudan, Sigma F5631)
- Carragenina (Marine Colloids): sal não purificado dissolvido em salina estéril
0,9%
- Éter etílico (Synth)
- Xilol (Reagen)
- Peróxido de hidrogênio (Smith)
- Avidina-peroxidase (DAKO)
- O-fenilenediamina diicloreto (OPD- Sigma) disolvido no tampão substrato
descrito no protocolo de ELISA
- Reagentes do kit Vector para imunohistoquímica
3.2 CORANTES
- Hematoxilina (Reagen)
- Eosina (Merck)
3.3 SOLUÇÕES
- Salina tamponada com fosfato (PBS)
Cloreto de sódio (Synth)-------------------------------------------------------8,0 g
Cloreto de potássio (Synth) --------------------------------------------------0,2 g
Fosfato de sódio dibásico (Synth)---------------------------------------- 1,15 g
Fosfato de sódio monobásico (Synth)------------------------------------- 0,2 g
Água destilada--------------------------------------------------------------------1,0 L
O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH 0,1N
- Tampão de bicarbonato pH 8,2
NaCO3 (Synth)-------------------------------------------------------------------0,1M
NaCl (Synth)---------------------------------------------------------------------- 0,1M
37
- Albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem (Sigma)
- Solução salina 0.9% estéril
3.4 TAMPÕES E SOLUÇÕES UTILIZADOS PARA O ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
- Tampão bicarbonato pH 8.2
NaHCO
3
P.A.( Merk, Sharp and Dohme – MSD, USA) -----------0, 1M
NaCl P.A. (Merk, Sharp and Dohme – MSD, USA) -------------- 0, 1M
A solução mãe (1M) foi diluída 10 vezes (concentração final 0.1M)
- Tampão Substrato pH 5.0
Ácido cítrico) -------------------------------------------------------------34,7 mM
Na
2
HPO
4
(Merk) ----------------------------------------------------------0.5 mg
- Substrato
OPD --------------------------------------------------------------------------0,4 mg
H2O2 -------------------------------------------------------------------------0,4 µL
Tampão substrato q.sp. ----------------------------------------------------1 mL
- Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v
3.5 ANTICORPOS
- Concentrações de anticorpos e proteínas para ELISA
citocina Ac 1
ario
Ac 2
ario
Curva (11 pontos)
TNF-α
SB230499GR SB54/450499/GH 4000 pg/mL
Todas as citocinas e anti-soros foram gentilmente cedidas pelo Prof. Fernando de
Queiroz Cunha do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP.
38
3.6 TAMPÕES, REAGENTES E SOLUÇÕES USADOS PARA O ENSAIO DE
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA APOPTOSE
- Apop Tag Plus
®
Peroxidase In Situ, Apoptasis Detection Kit (Chemical
®
International).
3.7 TAMPÕES E SOLUÇÕES USADOS NA DOSAGEM DA ATIVIDADE DE
MIELOPEROXIDASE
- Tampão fosfato de potássio: 988 mL solução a + 12mL solução b
Solução a:
KH
2
PO
4
(Synth) -------------------------------------------------------------6,8 g
Água destilada ----------------------------------------------------------------1 L
Solução b:
K2HPO4 (Synth) ------------------------------------------------------------8,7 g
Água destilada -----------------------------------------------------------------1 L
- Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB)
HTAB (Sigma) -----------------------------------------------------------------5 g
Tampão fosfato de potássio ------------------------------------------------1 L
- Peróxido de hidrogênio 0,1%
Peróxido de hidrogênio 30% (Vetec) ----------------------------------1 mL
Água destilada -------------------------------------------------------------29 mL
- Solução de o-dianisidina (DDI)
O-dianisidina (Sigma) -------------------------------------------------16,7 mg
Tampão fosfato de potássio -------------------------------------------10 mL
H
2
O
2
---------------------------------------------------------------------------50 µL
Água destilada -------------------------------------------------------------90 mL
39
3.8 TAMPÕES E SOLUÇÕES USADOS NA DOSAGEM DA ATIVIDADE
ADENOSINA DEAMINASE
- Tampão Fosfato de Sódio (pH 7.2)
Fosfato ácido de sódio ----------------------------------------------------6,9 g
Fosfato básico de sódio ----------------------------------------------1000 mL
(bidestilada)
- Sulfato de Amônia (15 mM – Solução stock)
(NH
4
)
2
– anidro ---------------------------------------------------------0,1982 g
Água bidestilada (qsp) -------------------------------------------------100 mL
- Sulfato de Amônia (75 µM – Solução de uso)
Solução stock -------------------------------------------------------------500 µL
Tampão fosfato (qsp) -------------------------------------------------100 mL
- Fenol/Nitroprussiato (106 mM fenol / 0,17 mM nitroprussiato)
Fenol ----------------------------------------------------------------------------1 g
Nitroprussiato de sódio ---------------------------------------------------5 mg
Água bidestilada (qsp) -------------------------------------------------100 mL
- Hidróxido de sódio (1N)
NaOH ----------------------------------------------------------------------------4 g
Água bidestilada ----------------------------------------------------------100 mL
- Hipoclorito alcalino (11 mM NaOCl / 125 nM NaOH)
NaOH 1N -------------------------------------------------------------------2,5 mL
Hipoclorito de sódio a 5% ----------------------------------------------1,6 mL
Água bidestilada (qsp) -------------------------------------------------100 mL
- Adenosina (21 mM)
Adenosina -----------------------------------------------------------------140 mg
Tampão fosfato ------------------------------------------------------------15 mL
Tampão fosfato (qsp) ----------------------------------------------------25 mL
40
- Substância D (Substância A + Substância B + Substância C)
Substância A: Carbonato de Sódio 2% em NaOH 0,1N
Substância B: Tartarato de Sódio e Potássio 2%
Substância C: Sulfato de Cobre 1%
- Reativo de Folin-Ciocalteu (Merck)
4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
4.1 ALÇA INTESTINAL ISOLADA DE CAMUNDONGO
O protocolo para indução de enterite experimental por TxA em camundongo
seguiu o modelo descrito por KIRKWOOD et al. (2001) modificado para nossas
condições. Os animais, em jejum por 24 horas, foram anestesiados com a
associação de 1,5 mL de cloridrato de xilasina (100 mg/mL) e 10 mL de cloridrato de
quetamina (100 mg/mL), diluídos com salina na proporção de 1:4 e injetados por via
intramuscular na dose de 0,1 mL/20 g de peso corpóreo. Em seguida foi realizada
uma laparotomia mediana de 2-3 cm, incidindo-se, em primeira instância, a pele e,
em seguida, o peritônio, para a visualização do intestino delgado. Após exposição do
ceco e identificação do íleo, uma porção de aproximadamente 8cm do tubo entérico
terminal foi lavada com PBS, em um volume de 1 mL, para remoção de excesso de
fezes remanescentes do jejum. Durante este procedimento, teve-se o cuidado de
não traumatizar o íleo nem, tampouco, romper a vascularização entérica. Então, a
uma distância de cerca de 3cm do ceco, um segmento de aproximadamente 4 cm de
íleo foi feito, em dupla ligadura obstrutiva, com linha de algodão, para isolamento da
alça. Posteriormente, através de uma seringa de insulina, foi injetado na alça
isolada, volumes iguais a 100 µL no total. PBS (controle), toxina A do Clostridium
difficile (TxA) na dose de 1-10 µg/alça para o experimento da dose-resposta apenas
com TxA; ATL313 (agonista do receptor A
2A
de adenosina; na concentração final de
0,05-5 nM) + TxA (5 µg/alça) ou ZM24138 (antagonista do receptor A
2A
de
adenosina; na concentração final de 5 nM) + ATL313 (na concentraçã final de 5 nM)
e TxA (5 µg/alça). Em um outro experimento, os animais foram pré-tratados com
41
fucoidina (25mg/kg) ou PBS administrados por via intravenosa através do plexo
ocular e após 5 minutos as alças ileais desses animais receberam TxA (5µg/alça).
Após 3 horas da injeção do controle ou da TxA nas alças (Kirkwood et al.,
2001), os animais foram sacrificados em câmara de éter. Após a reabertura da
cavidade abdominal (pele e peritônio) dos animais, as alças isoladas foram retiradas,
medidas em centímetros, pesadas em miligrama, e o volume de seu conteúdo
mensurado em microlitros, por meio de seringa de 1 mL e acondicionado em tubos
plásticos. O edema e a secreção foram calculados dividindo-se o peso da alça pelo
seu comprimento, expresso em mg/cm, e pelo volume do fluido recuperado pelo
comprimento da alça intestinal, expresso em µL/cm.
4.2 AVALIAÇÃO DO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA
Os animais foram divididos em 3 grupos. Os grupo G1e G2 receberam
salina (1 mL; i.p.) e o grupo G3 recebeu ATL313 (1 µg/kg; i.p.) 30 minutos antes da
indução do edema de pata pela carragenina (500 µg/100 µL; sub-plantar). O volume
do edema da pata esquerda traseira dos animais foi medido por pletismômetro antes
da injeção do estímulo inflamatório (volume basal) e 1, 2, 3 e 4 horas após. Para
cada tempo, o volume do edema foi calculado como variação do volume da pata.
Após a avaliação do edema, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e a pele e tecido celular subcutâneo da região plantar da pata foram
retirados e armazenados a –70ºC para posterior dosagem da atividade de
mieloperoxidade (MPO). O esquema 1 ilustra esse experimento (Esquema 1).
Esquema 1: Protocolo do edema de pata
Aferição do volume de pata
0h
1h
2h 3h 4h
30 minutos
G1 – salina i.p.
G2 – salina i.p.
G3 – ATL313 i.p.
Volume basal
G1 – Salina s.p.
G2 – Cg s.p.
G3 – Cg s.p.
Colheita do tecido subplantar
das patas para dosagem de
atividade de MPO
42
4.3 HISTOPATOLOGIA
Logo após o sacrifício dos animais e remoção das alças intestinais,
fragmentos do íleo da alça foram extraídos e acondicionados em frascos contendo
formol a 10% por 12 horas. A seguir, as peças foram dispostas em álcool etílico a
70% para desidratação, para posterior processamento e inclusão em parafina. Após
microtomia na espessura de 4 micrômetros, procedeu-se a coloração pela
hematoxilina & eosina.
Realizou-se avaliação histológica onde foram atribuídos escores variando de
escores 0 (ausência de alterações), 1(alterações brandas), 2 (alterações moderadas)
a 3 (alterações severas), de acordo com o dano epitelial, edema e infiltração
neutrofílica, conforme previamente descrito (Castagliuolo et al., 1998; Pothoulakis et
al., 1994).
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE MIELOPEROXIDASE NO ÍLEO
Após os experimentos de enterite induzido por TxA em alça isolada foram
colhidos fragmentos da alça do íleo para posterior dosagem da atividade da
mieloperoxidase (MPO). A MPO é uma enzima encontrada predominantemente em
grânulos azurófilos de leucócitos polimorfonucleares e tem sido usada como índice
quantitativo para avaliar a inflamação em vários tecidos. Para tanto, as amostras
foram suspensas em tampão de hexadeciltrimetilamônio (pH 6.0; 50 mg de tecido
por mL de tampão) e depois trituradas com um homogeneizador de tecidos. As
amostras foram congeladas, descongeladas e homogeneizadas três vezes.
Posteriormente, foram centrifugadas a 4500 r.p.m., durante 12min a 4ºC, e o
sobrenadante foi colhido. Os níveis teciduais da atividade de MPO foram
determinados usando técnica descrita por Bradley et al. (1982), utilizando peróxido
de hidrogênio 0,0005% como substrato para a MPO. Uma unidade de MPO foi
definida como a quantidade capaz de converter 1 µmol de peróxido de hidrogênio a
água em 1min a 22ºC. No ensaio, à medida que o peróxido de hidrogênio era
degradado ocorria a produção de ânion superóxido, responsável pela conversão de
o-dianisidina em composto de cor marrom. A variação da densidade óptica da
mistura das amostras com a solução de o-dianisidina em função do tempo de reação
43
foi medida por espectrofotômetro. Os resultados foram expressos como unidades de
MPO/mg de tecido.
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE ADENOSINA DESAMINASE (ADA)
Após 3h da indução de enterite pela TxA nas alças ileais, amostras de
tecido e os conteúdos das alças foram coletados. Os tecidos foram homogeneizados
em oito volumes de tampão fosfato congelado (50 mmoles/L; pH7,2). Essa
preparação e o conteúdo das alças foram centrifugados a 10.000 x g em uma
centrífuga refrigerada a temperatura de 5-8ºC, por 30 minutos. O sedimento foi
descartado e amostras dos sobrenadantes foram coletadas para o ensaio da
atividade de ADA (LOWRY et al., 1951).
O ensaio enzimático é baseado no mensuramento pela a desaminação da
adenosina pelo método de Giusti (GIUSTI, 1974), com algumas modificações.
Assim, para um volume final de 220 µL, foi adicionado 200 µL de adenosina (21 mM)
em tampão fosfato (50 mM, pH 7,2) e 20 µL da amostra (sobrenadante do tecido
homogeneizado ou conteúdo secretório da alça ileal). Um tubo controle (200 µL de
adenosina 21 mM), um tubo padrão (200 µL de sulfato de amônia 75 µM em tampão
fosfato) e um tubo branco (200 µL de tampão fosfato) também foram preparados.
Após uma hora de incubação a 37ºC em banho maria, as reações foram
interrompidas pela adição de 600 µL de feno/nitroprussiato de sódio (106 mM/101,7
mM). Vinte microlitros da amostra foram adicionados ao controle e aos tubos padrão
e branco. Em seguida foram adicionados 600 µL de 11 mM de hipoclorito de sódio
em 125 mM de NaOH a todos os tubos que foram novamente incubados a 37ºC por
30 minutos e lidos no espectofotômetro no comprimento de onda de 628nm. A
atividade no tecido e no conteúdo secretório das alças foram expressos como
µmoles de amônia/mg de proteína/hora e µmoles de amônia/hora, respectivamente.
Todas as soluções utilizadas foram preparadas em água bidestilada e
mantidas em frascos hermeticamente vedados para minimizar a contaminação com
amônia de ambiente laboratorial. A solução de adenosina foi mantida no congelador
em alíquotas que foram congeladas somente uma vez e descongeladas
imediatamente antes de seu uso para evitar formação espontânea de amônia. Todas
as outras soluções foram mantidas a 15ºC.
44
4.6 DOSAGEM DE TNF-α
Os experimentos da enterite induzida por TxA em alça isolada de íleo de
camundongo forneceram fragmentos de tecido do íleo para posterior dosagem de
TNF-α por ELISA, utilizando o protocolo descrito a seguir:
• Suspensão da amostra em tampão inibidor de protease (500 µL de tampão para
cada 100 mg de tecido) e processamento com um homogeneizador de tecidos.
• Centrifugação a3000 r.p.m. por 10min a 4ºC e retirada do sobrenadante.
• Incubação com 2 µg/mL de anticoro (antidorpo de caotura) diluído em tampão de
bicarbonato (pH 8.2) – 100 L/poço (placa de 96 poços) por 16-24h a à 4º.
• Lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v.
• Bloqueio com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 µL/poço
por 2h à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x).
• Incubação com a curva padrão da citocina diluída em tampão de lavagem e das
amostras a serem dosadas (100 µL/poço por 16-24h à 4ºC).
• Lavagem d placa (3x).
• Incubação com anticorpo biotinilado diluído a 1:1000 em tampão de lavagem
contendo 1% de soro normal de carneiro por 1h à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x).
• Incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de
lavagem, 100 µL/poço por 15 min a temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x).
• Incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato, 100
µL/poço, cobrir a placa e deixar no escuro por 5-20 min à temperatura ambiente.
• A reação foi preparada com 150 µL/poço de H
2
SO
4
1M.
• A intensidade da coloração foi medida em espectrofotômetro a 490 nm.
• Os resultados são expressos como média ± EPM da quantidade de TNF-α, em
pg/mL, para 4-6 amostras por tratamento.
45
4.7 IMUNOHISTOQUÍMICA PARA APOPTOSE
Os experimentos da enterite induzida por TxA em alça isolada de íleo de
camundongo forneceram fragmentos de tecido do íleo para posterior ensaio de
imunohistoquímica para apoptose, usando ApopTag Plus Peroxidase in Situ
Detection Kit (Serologicals Corporation, Norcross, GA) de acordo com o protocolo
seguinte:
• Hidratação e incubadação das peças embebidas em parafina com 20 µg/mL de
proteinase K (Sigma, NY, USA) por 15min à temperatura ambiente foram hidratadas
• Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 3% (v/v) em PBS
por 5 min à temperatura ambiente.
• Lavagem
• Incubação em uma câmara úmida à 37ºC, por 1h com tampão TdT, contendo
enzima TdT e tampão de reação
• Incubação com tampão stop/lavagem à temperatura ambiente por 10 min.
• Incubação em uma câmara úmida com o conjugado peroxidase anti-digoxigenina
à temperatura ambiente por 30 min.
• Seguidas lavagens com PBS.
• Cobertura dos cortes com substrato de peroxidase para coloração.
• Lavagem com H
2
O (3x).
• Contra-coloração com methhyl green 0,5% (v/v) por 10 min. à temperatura
ambiente.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média.
Para comparação entre vários grupos de ensaios foi utilizado ANOVA e teste de
Bonferroni.
Nas análises histológicas, os dados foram expressos como mediana
seguida dos valores extremos e os testes estatísticos aplicados foram Kruskal-
Wallis seguido de teste de Dunn.
Os cálculos estatísticos foram realizados através de um microcomputador,
utilizando-se o programa profissional de software em Estatística GraphPrism . O n
46
diz respeito ao número de alças isolada em cada grupo estudado onde, foram
utilizados de quatro a nove animais. Valores de p<0,05 foram considerados
significantes.
47
RESULTADOS
48
III. RESULTADOS
1. AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TOXINA A DO Clostridium difficile (TxA)
QUANDO INJETADA DENTRO DE ALÇAS ISOLADAS DO ÍLEO DE
CAMUNDONGO.
Na figura 1 observa-se que TxA aumentou de forma dose dependente as
razões peso da alça e o volume de secreção/comprimento das alças ileais isoladas
de camundongos. O pico desse efeito ocorreu nas doses de 5 µg e 10 µg, optando-
se, dessa maneira, pela dose de 5 µg para os experimentos seguintes por ter
apresentado efeito máximo (peso/comprimento da alça: PBS = 41,164 ± 5,021 Vs
TxA 5 µg = 72,28 ± 4,683 e volume/comprimento: PBS = 2,222 ± 1,470 Vs TxA 5 µg
= 23,271 ± 2,860). FIGURA 1A E 1B
2. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ATL313, AGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DE
ADENOSINA, NAS ALÇAS ISOLADAS DE ÍLEO DE CAMUNDONGO TRATADAS
COM TOXINA A DO Clostridium difficile (5 µ
µµ
µg).
A concentração final de 5 nM do ATL313 reverteu de forma significativa
(p<0,05) o aumento de peso (Figura 2A) ( TxA =60,772 ±3,817 Vs ATL313 10nM
=38.189 ±2.399) e do volume de secreção/comprimento da alça (Figura 2B) (TxA
=26.364 ±3.652 Vs 2,143 ± 2,143) induzidos pela TxA (5 µg/alça). FIGURA 2A e 2B
49
B
A
Figura 1. Efeito da toxina A do Clostridium difficile (TxA) sobre o peso (A) e o
volume de secreção (B) da alça ileal em camundongos. Os animais foram
tratados com TxA (1; 2; 5; 10 µg/alça) ou PBS dentro da alça ileal e sacrificados 3
horas após a administração da TxA e PBS. Os dados, peso/comprimento da alça
(mg/cm) e volume de secreção/comprimento da alça (µL/cm), estão plotados como
média ± EPM (n=5-9). (*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo
controle (PBS). ANOVA/ Bonferroni.
PBS 1
µ
g 2
µ
g 5
µ
g 10
µ
g
0
25
50
75
100
*
*
_______________________
TxA
peso/comprimento da alça
(mg/cm)
PBS 1
µ
g 2
µ
g 5
µ
g 10
µ
g
0
10
20
30
*
*
_______________________
TxA
volume de
secreção/comprimento da
alça (
µ
µ
µ
µ
L/cm))
50
A
B
PBS PBS' 0,05nM 0,5nM 5nM
0
25
50
75
*
TxA
_________________
ATL 313
peso/comprimento da alça
(mg/cm)
PBS PBS' 0,05nM 0,5nM 5nM
0
10
20
30
40
*
TxA
__________________
ATL 313
volume de
secreção/tamanho da alça
(
µ
µ
µ
µ
L/cm)
Figura 2. Efeito do agonista do receptor A
2A
de adenosina, ATL 313, sobre o
peso (A) e o volume de secreção (B)/comprimento da alça ileal induzido por
toxina A do Clostridium difficile (TxA) em camundongos. Os animais foram
tratados com ATL313 (0,05; 0,5; 5 nM) e imediatamente em seguida com TxA (5
µg/alça) dentro da alça ileal e sacrificados 3 horas após a administração das drogas.
Os dados, peso/comprimento da alça (mg/cm) e volume de secreção/comprimento
da alça (µL/cm), estão plotados como média ± EPM (n=5-6). (*) p<0,05 indica
diferença estatística em relação ao grupo controle (PBS). ANOVA/Bonferroni.
51
3. EFEITO DO AGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DA ADENOSINA, ATL313,
SOBRE O ASPECTO MACROSCÓPICO DA ALÇA ILEAL DE CAMUNDONGOS
INDUZIDO POR TOXINA A DO Clostridium difficile (TxA).
A TxA na dose de 5 µg promoveu mudanças macroscópicas evidentes
nas alças ileais de camundongos que receberam apenas PBS (100 µL), TxA
(5µg/alça), TxA (5 µg) + ATL313 (5 nM). A alça ileal que recebeu TxA (B) mostrou-
se com edema, evidenciado pelo brilho, e cheia de secreção sanguinolenta. Na alça
tratada com o ATL313 (C) houve redução do edema e da secreção, bem como
ausência de secreção sanguinolenta. A alça tratada com o ATL313 apresentou
aspecto semelhante da alça controle que recebeu somente PBS (A). FIGURA 3
4. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO TECIDO DAS ALÇAS ILEAIS ISOLADAS DE
CAMUNDONGOS TRATADAS COM PBS, TOXINA A OU ATL313+TOXINA A.
A TxA na dose de 5 µg promoveu mudanças histológicas visíveis em
cortes de tecido do íleo na coloração H&E (aumento de 100 e 400x) em relação às
alças tratadas apenas com PBS, havendo uma destruição intensa da mucosa,
aumento do infiltrado celular inflamatório, edema intersticial e hemorragia tecidual.
Tais efeitos foram significativamente revertidos com o ATL313 (5 nM). FIGURA 4 e
TABELA 1
52
Figura 3. Efeito do agonista do receptor A
2A
da adenosina, ATL313, sobre o
aspecto macroscópico da alça ileal de camundongos induzido por toxina A do
Clostridium difficile. As figuras são as fotografias das alças ileais de camundongos
que receberam apenas PBS (A), TxA (5 µg/alça; B), TxA (5 µg/alça) + ATL313 (5nM;
C). Observa-se que a alça ileal que recebeu TxA apresenta-se com edema,
evidenciado pelo brilho, e cheia de secreção sanguinolenta. Na alça tratada com o
ATL313 houve redução do edema e da secreção, bem como há ausência de
secreção sanguinolenta. Observa-se que a alça tratada com o ATL313 tem aspecto
semelhante da alça controle (PBS).
A
B
C
53
A
B
C D
E F
Figura 4. Efeito do agonista do receptor A
2A
de adenosina, ATL313, sobre a
destruição da mucosa e infiltrado celular na alça ileal de camundongos
tratados com toxina A do Clostridium difficile (TxA). As figuras são as
fotomicrografias representativas de cortes histológicos corados pelo método de H&E
do tecido do íleo de camundongos que receberam na alça TxA (C, D), ATL313 + TxA
(E, F) ou somente PBS (A, B). Observa-se que a TxA induziu intensa destruição da
mucosa com aumento do infiltrado celular inflamatório e hemorragia e que o ATL313
diminuiu o infiltrado celular inflamatório e a destruição da mucosa. Aumento de 100x
(A, C, E) e de 400x (B, D, F).
PBS
ATL 313 + TxA
TxA
100x
400 x
54
5. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ANTAGONISTA DO RECEPTOR A
2A
DE
ADENOSINA, ZM241385, NAS ALÇAS ILEAIS ISOLADAS DE CAMUNDONGOS
TRATADAS COM ATL313.
O ZM241385 na concentração final de 5 nM administrado imediatamente
antes do ATL313 (5 nM) e da TxA (5 µg/alça) reverteu de modo significativo (p<0,05)
o efeito protetor do ATL313, levando ao aumento do peso (ZM241385 = 62,016 ±
6.836 Vs ATL313 =38,189 ± 2,399) e do volume de secreção (ZM241385 = 14,598
±5,056 Vs ATL313 = 1,727 ± 1,376) de maneira semelhante das alças tratadas
somente com TxA (5 µg/alça). FIGURA 5
6. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO EFEITO DO ANTAGONISTA DO RECEPTOR
A
2A
DE ADENOSINA, ZM241385, SOBRE A AÇÃO DO ATL313 NA ENTERITE
INDUZIDA POR TOXINA A EM ALÇA ILEAL DE CAMUNDONGOS.
O ZM241385 reverteu de forma significativa o efeito protetor do ATL313
nas alterações histológicas observadas em cortes de tecido do íleo na coloração
H&E (aumento de 100 e 400x). FIGURA 6 e TABELA 1
55
A
B
Figura 5. Efeito do antagonista do receptor A
2A
de adenosina, ZM241385, sobre
o aumento do peso e o volume de secreção da alça ileal induzido por toxina A
do Clostridium difficile (TxA) em camundongos. Os animais foram tratados com
ZM241385 (5 nM) + ATL313 (5 nM) + TxA (5 µg/alça), ATL313 (5 nM) + TxA
(5µg/alça), PBS + TxA (5µg/alça) ou somente PBS dentro da alça ileal e sacrificados
3 horas após a administração das drogas. Os dados, peso/comprimento da alça
(mg/cm) e volume de secreção/comprimento da alça (µL/cm), estão plotados como
média ± EPM (n=5-9). (*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo
controle (PBS). ANOVA/Bonferroni.
PBS PBS' ATL 313 ZM 241385
0
25
50
75
TxA
*
*
_________
ATL 313
peso/comprimento da alça
(mg/cm)
PBS PBS' ATL 313 ZM 241385
0
10
20
30
TxA
*
*
_________
ATL 313
volume de
secreção/tamanho da alça
(
µ
µ
µ
µ
L/cm)
56
B A
C
D
ZM241385 + ATLA313 + TxA
Figura 6. Efeito do antagonista do receptor A
2A
de adenosina, ZM241385, sobre
as alterações histológicas na alça ileal de camundongos tratados com ATL
313. As figuras são as fotomicrografias representativas de cortes histológicos
corados pelo método de H&E do tecido do íleo de camundongos que receberam na
alça ATL313 + TxA (A, B) ou ZM241385 + ATL313 + TxA (C, D). Observa-se nas
alças tratadas com o ZM241385 um aumento do infiltrado celular inflamatório e da
destruição da mucosa em relação às alças ileais tratados com ATL313 + TxA.
ATL 313 + TxA
100 x
400 x
57
Tabela 1. Efeito do ATL313 e do ZM241385 sobre as alterações histológicas na
enterite induzida pelo TxA nas alças ileais de camundongos
Grupos
TxA
PBS PBS ATL313 ATL313 + ZM241385
Escores 0 (0-0) 3 (2-3)* 1 (0-2)** 2.5 (2-3)*
O ATL 313 (5 nM) ou o PBS foram injetados dentro das alças ileais imediatamente antes
da TxA (5 µg/alça) ou PBS. As alças foram removidas para processamento e coloração
pelo H&E. A análise histológica considerou escores de 0-3 baseados nos seguintes
parâmetros: dano epitelial, edema e infiltração de neutrófilos. Os dados estão relatados
como mediana seguida dos valores extremos.
(*) P < 0,05 comparado ao grupo PBS. (**) P < 0,05 comparado ao grupo PBS + TxA.
(Kruskal-Wallis + Dunn’s test)
58
7. EFEITO DO ATL313 SOBRE A ATIVIDADE DE MIELOPEROXIDASE NO
TECIDO DAS ALÇAS ILEAIS ISOLADAS DE CAMUNDONGOS.
A administração de TxA na dose de 5 µg nas alças ileais isoladas
promoveu aumento significativo (p<0,05) na atividade de MPO no tecido de íleo de
camundongos em comparação as alças tratadas apenas com PBS (controle). A co-
administração de ATL313 (5 nM) nas alças ileais tratadas com TxA (5 µg/alça) fez
com que os níveis de MPO no íleo retornassem àqueles das alças tratadas apenas
com PBS (PBS = 1.601±0.949 Vs TxA =12,656 ±2,659 Vs ATL313 =1,001 ±0,612).
FIGURA 7
59
Figura 7. Dosagem de mieloperoxidase (MPO) no íleo de camundongos. Os
animais foram tratados com ATL313 (5 nM) ou PBS e imediatamente em seguida
com toxina A (TxA; 5µg/alça), ou somente com PBS dentro da alça ileal e
sacrificados 3 horas após a administração das drogas. Amostras do tecido do íleo
foram removidas, pesadas e congeladas a –70º e seu conteúdo de MPO
determinado por método enzimático colorimétrico. Os dados, U/mg de tecido (U/mg),
estão plotados como média ± EPM (n=5-12). (*) p<0,05 indica diferença estatística
em relação ao grupo controle (PBS) e ao grupo ATL 313 + TxA. ANOVA/Bonferroni.
PBS PBS ATL 313
0
10
20
*
__________________
TxA
Atividade da MPO
(U/mg)
60
8. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ATL313 SOBRE O EDEMA DE PATA INDUZIDO
POR CARRAGENINA EM RATOS.
A injeção sub-plantar de 500 µg de Cg em 0,1 mL de salina na pata
traseira dos animais pré-tratado com PBS (1 mL; i.p.) promoveu edema de pata
significativo (p<0,05), em comparação com os animais tratados com salina s.p., a
partir de 1 h da injeção do estímulo, com pico entre a 3ª e 4ª h. Nos ratos tratados
com ATL313 (1 µg/kg, i.p., 30 minutos antes da injeção do estímulo inflamatório)
houve uma redução significativa (p<0,05) do edema de pata induzido por Cg na 3ª e
4 ª horas após injeção do estímulo. FIGURA 8
9. DOSAGEM DE MIELOPEROXIDASE NA PELE E TECIDO CELULAR
SUBCUTÂNEO DA REGIÃO PLANTAR DE RATOS TRATADOS POR VIA SUB-
PLANTAR COM CARRAGENINA OU SALINA E POR VIA INTRAPERITONEAL
COM SALINA OU ATL313.
A injeção sub-plantar de 500 µg de Cg em 0,1 mL de salina na pata
traseira dos animais promoveu um aumento significativo (p<0,05) do conteúdo de
MPO na pele e tecido celular subcutâneo da região plantar, medido 4h após a
injeção do estímulo, em comparação com os animais tratados com salina s.p. O
tratamento com ATL313 (1 µg/kg, i.p., 30 minutos antes da injeção do estímulo
inflamatório) fez com que os níveis de MPO na pata retornassem àqueles dos
animais tratados com PBS i.p e salina s.p. FIGURA 9
61
Figura 8. Efeito do agonista A
2A
de adenosina, ATL313, sobre o edema de pata
induzido por carragenina (Cg) em ratos Wistar. Os animais receberam ATL313
(1µg/kg; i.p.) ou salina (1mL; i.p.) 30 minutos antes da indução do edema de pata
pela Cg (500 µg/100 µL; sub-plantar) . O volume do edema de pata foi aferido no
tempo zero antes da injeção do estímulo inflamatório e 1, 2, 3 e 4 h após a
administração sub-plantar de Cg. Os pontos das curvas representam a média ±
EPM da variação do volume da pata (mL) (n=5-6). (*)p < 0,05 indica diferença
estatística em relação ao grupo controle (salina) e ao grupo salina + Cg.
ANOVA/Bonferroni.
0 1 2 3 4 5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Salina
Salina+Cg
ATL 313+Cg
*
tempo (h)
volume do edema de
pata (mL)
*
62
Figura 9. Dosagem de mieloperoxidase (MPO) na pata de ratos Wistar tratados
com carragenina (Cg) ou salina sub-plantar. Os animais receberam ATL313
(1µg/kg; i.p.) ou salina (1mL; i.p.) 30 minutos antes da indução do edema de pata
pela Cg (500 µg/100 µL; sub-plantar). Quatro horas após a administração sub-
plantar de Cg, os animais foram sacrificados, retirou-se pele e tecido celular
subcutâneo da região plantar, e seu conteúdo de MPO determinado por método de
ELISA. As colunas representam a média ± EPM de unidade de MPO (U/mg de
tecido) das amostras de 5 animais por tratamento. (*)p < 0,05 indica diferença
estatística em relação ao grupo controle (salina). ANOVA/Bonferroni.
Salina Salina' ATL 313
0
5
10
15
*
_________________
Cg
Atividade da MPO
(U/mg de tecido)
63
10. DOSAGEM DA ATIVIDADE DE ADENOSINA DESAMINASE (ADA) NO
TECIDO DAS ALÇAS ÍLEAIS ISOLADAS DE CAMUNDONGOS TRATADAS COM
PBS, TOXINA A OU ATL313+TOXINA A.
A administração de TxA na dose de 5 µg nas alças ileais isoladas
promoveu aumento significativo (p<0,05) da atividade de ADA no tecido de íleo de
camundongos em comparação as alças tratadas apenas com PBS (controle). A co-
administração de ATL313 (5 nM) nas alças ileais tratadas com TxA (5 µg/alça) fez
com que os níveis de atividade de ADA no tecido ileal retornassem àqueles das
alças tratadas apenas com PBS (PBS = 2,476 ±0,585 Vs TxA = 5,731±0,764 Vs
ATL313 =1,706 ±0,328). FIGURA 10
64
A
B
Figura 10. Atividade de adenosina desaminase (ADA) no tecido do íleo de
camundongos. As alças ileais dos animais foram tratados com ATL313 (5 nM) e
imediatamente em seguida com toxina A (TxA; 5 µg/alça), ou com PBS e TxA ou
somente com PBS dentro da alça ileal e sacrificados 3 horas após a administração
das drogas. Avaliou-se a atividade da ADA no tecido da alça ileal (A) bem como no
líquido extravasado para dentro da alça (B). Os dados, µmoles de NH
3
/mg de
proteína/h (A) e µmoles de NH
3
/h (B), estão plotados como média ± EPM (n=5-8).
(*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo controle (PBS) e ao grupo
ATL 313 + TxA. ANOVA/Bonferroni.
PBS PBS ATL 313
0.0
2.5
5.0
7.5
*
___________________
TxA
Atividade específica da
ADA
(
µ
µ
µ
µ
moles de NH
3
/mg de
proteína/h)
PBS PBS ATL 313
0
1
2
3
*
_________________
TxA
Atividade da ADA
(
µ
µ
µ
µ
moles de NH
3
/h)
65
11. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ATL313 (agonista do receptor A
2A
de
adenosina) E DO ZM241385 (antagonista do receptor A
2A
de adenosina) SOBRE
A APOPTOSE INDUZIDA PELA TOXINA A DO Clostridium difficile
O ATL313 reduziu os índices de apoptose de células das alças ileais
induzidas pela TxA. O ZM241385 reverteu o efeito protetor do ATL313, elevando a
quantidade de células apoptóticas de forma semelhante aos níveis observados nas
alças tratadas apenas com TxA. FIGURA 11
66
A
Figura 11. Efeito do ATL 313 (agonista do receptor A
2A
de adenosina) e do
ZM241385 (antagonista do receptor A2a de adenosina) sobre a apoptose
induzida pela toxina A do Clostridium difficile (TxA) em alças ileais isoladas de
camundongos. As fotos C e D ilustram grande quantidade de células apoptóticas
coradas em marrom em alças ileais tratadas com TxA (5 µg/alça). As fotos E e F
mostram a significante redução do aumento da apoptose induzida pela TxA na
presença de ATL313 (5 nM). As fotos G e H mostram a ausência do efeito protetor
do ATL313 em alças tratadas com ZM241385 (5 nM) + ATL313 (5 nM) + TxA
(5µg/alça). As fotos A e B ilustram o aspecto de uma alça tratada apenas com PBS
(controle). Aumento de 100x (A, C, E, G) e de 400x (B, D, F, H).
B
D
F
H
C
E
G
A
PBS
TxA
ATL313 + TxA
ZM214385 + ATL313
+ TxA
100 x
4
00 x
67
12. DOSAGEM DE TNF-α
αα
α NO TECIDO DE ALÇA ISOLADA DE CAMUNDONGOS
TRATADAS LOCALMENTE COM PBS, TOXINA A, ATL313+TxA OU ZM341385+
ATL313+TxA.
A administração intra-luminal de toxina A, na dose de 5 µg, nas alças
ileais isoladas de camundongos produziu uma tendência não significativa ao
aumento da quantidade de TNF-α no tecido ileal, 3h após a injeção do estímulo
inflamatório, em relação às alças tratadas apenas com PBS. Nas alças tratadas com
ATL313 (5 nM) houve uma redução significativa (p<0,05) da quantidade de TNF-α
nessas amostras, em relação as alças tratadas somente com TxA (ATL313 =0,392 ±
0,054 Vs TxA =0,594 ±0,032). Esse efeito foi revertido pela o antagonista dos
receptores A
2A
de adenosina ZM241385. FIGURA 12
68
Figura 12. Dosagem de TNF-α
αα
α no tecido do íleo de camundongos. Os animais
foram tratados com toxina A (TxA; 5 µg/alça); ATL313 (5 nM) + TxA (5 µg/alça) ou
com ZM241385 (5 nM) + ATL313 (5 nM) + TxA dentro da alça ileal e sacrificados
após 3 horas a administração das drogas. Amostras do tecido do íleo foram
removidas para dosagem de TNF-α determinado por ELISA. As colunas
representam a média ± EPM da quantidade de TNF-α das amostras (n=5).
(*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo controle (TxA).
ANOVA/Bonferroni.
PBS PBS' ATL313 ZM241385
0.00
0.25
0.50
0.75
_____________________
TxA
TNF-α
α
α
α
(pg/mL)
*
69
13. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO SISTÊMICO DOS ANIMAIS
COM FUCOIDINA SOBRE O AUMENTO DE PESO E VOLUME DAS ALÇAS
ILEAIS ISOLADAS INDUZIDOS PELA TOXINA A DO Clostridium difficile (TxA)
O pré-tratamento sistêmico dos animais com Fucoidina (25 mg/kg) reduziu
de forma significativa (p<0,05) o aumento do peso (Figura 13A) (PBS= 58,983
±3,920 Vs Fucoidina= 39,318 ±4,375) e do volume da secreção/comprimento das
alças ileais (Figura 13B) (PBS= 19,717 ±6,053 Vs Fucoidina =4,800 ±2,939)
induzidos pela TxA (5 µg/alça) quando comparados com os animais que foram pré-
tratados somente com PBS. FIGURA 13A e 13B
14. EFEITO DA FUCOIDINA SOBRE A DOSAGEM DA ATIVIDADE DE
MIELOPEROXIDASE (MPO) NO TECIDO DE ALÇAS ÍLEAIS ISOLADAS
TRATADAS COM TOXINA A EM CAMUNDONGOS.
O pré-tratamento sistêmico dos animais com Fucoidina na dose de 25
mg/kg promoveu redução significativa (p<0,05) do conteúdo de MPO no tecido das
alças ileais de camundongos tratadas com TxA (5 µg/alça) a níveis comparáveis aos
animais pré-tratadas apenas com PBS (PBS =2,244 ±0,275 Vs Fucoidina =1,163
±0,303). FIGURA 14
70
A
B
FIGURA 13 Efeito da Fucoidina sobre o aumento do peso (A) e o volume de
secreção (B) / comprimento da alça ileal induzido por toxina A do Clostridium
difficile (TxA) em camundongos. Os animais foram pré-tratados com Fucoidina (25
mg/kg) ou PBS administrados por via-intravenosa (plexo ocular) e após 5 minutos as
alças ileais isoladas receberam TxA (5 µg/alça). O grupo controle recebeu apenas
PBS na alça. Após 3 horas da administração de TxA, os animais foram sacrificados
e as alças ileais removidas. Os dados, peso/comprimento da alça (mg/cm) e volume
de secreção/comprimento da alça (µL/cm), estão plotados como média ± EPM (n=5-
6).
(*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo controle (PBS).
ANOVA/Bonferron.
PBS PBS Fucoidina
0
25
50
75
*
__________________
TxA
peso/comprimento da alça
(mg/cm)
PBS PBS Fucoidina
0
10
20
30
*
_________________
TxA
volume de
secreção/comprimento da
alça
(
µ
µ
µ
µ
L/cm)
71
PBS PBS' Fucoidina
0
1
2
3
*
_________________
TxA
MPO (U/mg de tecido)
Figura 14. Efeito da Fucoidina sobre o aumento da atividade de
mieloperoxidase (MPO) no íleo de camundongos induzida pela TxA. Os animais
foram pré-tratados com Fucoidina (25 mg/kg) ou PBS administrados por via-
intravenosa (plexo ocular) e após 5 minutos as alças ileais isoladas receberam TxA
(5 µg/alça). O grupo controle recebeu apenas PBS na alça. Após 3 horas da
administração de TxA os animais foram sacrificados. Amostras do tecido do íleo
foram removidas, pesadas e congeladas a –70º e seu conteúdo de MPO
determinado por método enzimático colorimétrico. Os dados, U/mg, estão plotados
como média ± EPM (n=5). (*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao
grupo controle (PBS) e ao grupo ATL 313 + TxA. ANOVA/Bonferroni.
72
15. EFEITO DA FUCOIDINA SOBRE A DOSAGEM DA ATIVIDADE DE
ADENOSINA DESAMINASE (ADA) NO TECIDO DE ALÇAS ILEAIS ISOLADAS
TRATADAS COM TOXINA A EM CAMUNDONGOS.
O pré-tratamento dos animais com Fucoidina na dose de 25 mg/Kg
promoveu redução significativa (p<0,05) da atividade de ADA no tecido das alças
ileais de camundongos tratadas com TxA (5 µg/alça) a nívies comparáveis a dos
animais pré-tratados apenas com PBS (PBS =4,206 ±0,316 Vs. Fucoidina =2,772
±0,258). FIGURA 15
16. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO EFEITO DA FUCOIDINA SOBRE O TECIDO
DAS ALÇAS ILEAIS ISOLADAS DE CAMUNDONGOS TRATADAS COM TOXINA
A.
O pré-tratamento sistêmico dos animais com Fucoidina revelou um efeito
protetor nas mudanças histológicas induzidas pela TxA nas alças ileais visíveis em
cortes de tecido do íleo na coloração H&E (aumento de 100 e 400x) em relação aos
animais pré-tratados sistemicamente apenas com PBS. Houve uma redução na
destruição da mucosa, do infiltrado celular inflamatório, do edema intersticial e da
hemorragia tecidual. FIGURA 16 e TABELA 2
73
Figura 15. Efeito da Fucoidina sobre o aumento da atividade de adenosina
desaminase (ADA) no tecido do íleo de camundongos induzida pela TxA do
Clostridium difficile (TxA). Os animais foram pré-tratados com Fucoidina (25
mg/kg) ou PBS administrados por via-intravenosa (plexo ocular) e após 5 minutos as
alças ileais isoladas receberam TxA (5 µg/alça). O grupo controle recebeu apenas
PBS na alça. Após 3 horas da administração de TxA, os animais foram sacrificados.
Amostras do tecido do íleo foram removidas para se avaliar atividade da ADA no
tecido da alça ileal. Os dados, µmoles de NH
3
/mg de proteína/h estão plotados como
média ± EPM (n=5-6). (*) p<0,05 indica diferença estatística em relação ao grupo
controle (PBS) e ao grupo ATL 313 + TxA. ANOVA/Bonferroni.
PBS PBS Fucoidina
0
1
2
3
4
5
*
___________________
TxA
Atividade específica da
ADA
(
µ
µ
µ
µ
moles de NH
3
/mg de
proteína/h)
74
Figura 16. Avaliação histológica do efeito da Fucoidina sobre o tecido das
alças ileais isoladas de camundongos tratadas com toxina A do Clostridium
difficile. As figuras são as fotomicrografias representativas de cortes histológicos
corados pelo método de H&E do tecido do íleo de camundongos que receberam na
alça TxA (5 µg), os quais foram previamente tratados sistemicamente com PBS (A)
ou Fucoidina (B). Observa-se que o pré-tratamento com a Fucoidina reduziu o
infiltrado celular inflamatório e a destruição da mucosa em relação às alças ileais dos
animais pré-tratados apenas com PBS. Aumento de 400x.
A
B
75
Tabela 2. Efeito da Fucoidina sobre as alterações histológicas na enterite induzida
pelo TxA nas alças ileais de camundongos
Grupos
TxA
PBS PBS FUCOIDINA
Escores 0 (0-0) 3 (2-3)* 1 (0-3)
Os animais foram pré-tratados com Fucoidina (25 mg/kg) ou PBS administrados por via-
intravenosa (plexo ocular) e após 5 minutos as alças ileais isoladas receberam toxina A
(TxA; 5µg/alça). O grupo controle recebeu apenas PBS. Após 3 horas da administração
de TxA, os animais foram sacrificados e as alças ileais removidas para o histológico. A
análise histológica considerou escores de 0-3 baseados nos seguintes parâmetros:
dano epitelial, edema e infiltração de neutrófilos. Os dados estão relatados como
mediana seguida dos valores extremos.
(*) P < 0,05 comparado ao grupo PBS e Fucoidina + TxA. (Kruskal-Wallis + Dunn’s
test).
76
DISCUSSÃO
77
VI. DISCUSSÃO
Dados epidemiológicos mostram que o Clostridium difficile é a maior
causa reconhecida da diarréia associada a antibioticoterapia e a colite
pseudomembranosa. Esta bactéria anaeróbica gram-positiva é responsável por 20-
30% dos casos de diarréia e 50-75% dos casos de colite associados a antibiótico e
por 90% das colites pseudomembranosas (BRETTLE et al., 1984; GEORGE et al.,
1982; GILLIGA et al., 1981), sendo essa ocorrência mais comum em pacientes
hospitalizados. A terapia antibiótica leva a uma alteração na microflora normal
permitindo, dessa maneira, a colonização por patógenos oportunistas (DRUDY et al.,
2004). O C. difficile produz duas grandes exotoxinas, toxina A e B, no entanto, a
enterite aguda parece ser mediada principalmente pela TxA (KELLY et al., 1994).
Estudos utilizando alças intestinais de roedores mostraram que a TxA, mas não a
TxB, induz o aumento da secreção do fluido, destruição da mucosa e uma
proeminente infiltração neutrofílica na mucosa intestinal (POTHOULAKIS et al.,
1994; TRIADAFILOPOULOS et al., 1989). No entanto, cepas do C. difficile que
produzem apenas TxB têm sido recentemente associadas com a doença em
humanos (LIMAYE et al., 2000; PITUCH et al., 2001). A exposição de alças ileais de
coelhos a TxA provocou uma resposta inflamatória intensa com necrose de células
epiteliais com grande infiltrado neutrofílico na mucosa (TRIADAFILOPOULOS et al.,
1987 e 1989).
A adenosina, um nucleosídeo amplamente distribuído no corpo,
desempenha importante papel na regulação do sistema imunológico. Existem quatro
subtipos de receptores de adenosina, A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
, todos pertencentes ao grupo
de receptores acoplados à proteína G. Foi relatado que os receptores A
2A
de
adenosina possuem um papel antiinflamatório sobre os neutrófilos (CRONSTEIN et
al., 1983; SULLIVAN, et al., 1999) bem como sobre outras células inflamatórias
(SULLIVAN e LINDEN, 1998). No entanto, SITKOVSKY (2003) relatou que esses
sub-tipos de receptores de adenosina podem exercem efeitos contrários sobre uma
mesma função. Nesse sentido, CRONSTEIN et al. (1992) mostraram que a
aderência neutrofílica ao endotélio poderia ser inibida pela ativação dos receptores
78
A
2A
e aumentada pela ativação dos receptores A
3
. Enquanto que LINK et al. (2000)
e BOUMA et al. (1994) relataram que a secreção de IL-12 por monócitos humanos
induzida por lipopolissacarídeo (LPS) foi inibida pela ativação dos receptores A
2A
,
mas não pela ativação dos receptores A
1
ou A
3
.
No presente trabalho tivemos como objetivo investigar a ação
antiinflamatória de um novo agonista A
2A
dos receptores de adenosina, o ATL313 (4-
{3-[amino-9-(5-cycloprofyl-carbamoyl-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-9H-purin-2-
yl}piperidine-1-carboxylic acid metihyl ester) (LAPPAS et al., 2005), sobre a
inflamação induzida pela TxA em alças ileais isoladas em camundongos. Para isso,
nós inicialmente verificamos qual seria a dose de TxA que elevaria de forma
significativa o peso e a secreção das alças ileais isoladas de camundongos Swiss.
Verificamos então que a injeção de 5-10 µg de TxA induziu um aumento significante
do volume e da secreção da alça ileal de camundongos 3 horas após sua injeção.
Estes dados estão de acordo com KIRKWOOD et al. (2001) que usando
camundongos C57/BL6, verificou que a TxA administrada dentro das alças ileais
induzia aumento da secreção sendo o sacrifício dos animais também realizado 3h
após a administração de TxA. Escolhemos então a dose de 5µg de TxA para os
experimentos subseqüentes uma vez que essa dose apresentou efeito máximo no
aumento de peso e volume das alças ileais.
Observamos através da análise histopatológica que a TxA induziu nos
tecidos das alças intestinais destruição intensa da mucosa, aumento do infiltrado
celular inflamatório, edema intersticial e hemorragia tecidual. A hemorragia e o
edema encontram-se já evidentes na observação macroscópica da alça ileal. Esses
nossos achados estavam de acordo com os encontrados na literatura conforme
veremos a seguir. FANG et al. (1994) mostraram que a exposição a TxA de
segmentos de alças ileias de coelhos induziu a uma intensa destruição da mucosa
com grande infiltrado neutrofilico. KELLY et al. (1994) relataram que há um extenso
dano epitelial com quase completa destruição das vilosidades e criptas associado a
um denso infiltrado inflamatório na lâmina própria nas alças ileais de coelhos
tratadas com TxA. MENEZES (2002) observou que alças ileais isoladas de coelhos
tratadas apenas com TxA revelaram uma acentuada diminuição das vilosidades e da
espessura da mucosa com a destruição de epitélio e glândulas, bem como
exsudação neutrofílica moderada na mucosa intestinal. KIRKWOOD et al. (2001) no
estudo sobre a eliminação da endopeptidase neutra (NEP) aumentar a inflamação
79
intestinal induzida pela TxA, mostraram que as alças ileais de camundongos NEP
-
/
-
quando recebiam TxA apresentaram dano na mucosa e infiltração neutrofílica
exacerbada.
Utilizando o modelo de enterite induzido por TxA em alças ileais de
camundongos, verificamos que o ATL313, agonista do receptor A
2A
de adenosina,
na concentração final de 5 nM, reduziu de forma considerável o aumento de peso e
volume da secreção das alças ileais induzidos pela TxA, basicamente ao nível dos
controles sem TxA. Observamos também que o ATL313 reverteu todas as
alterações histológicas, reduzindo a destruição da mucosa, o edema, o infiltrado
celular inflamatório e a hemorragia. Macroscopicamente a alça ileal mostrou-se sem
hemorragia e com edema e secreção reduzido em relação à alça dos animais
tratados somente com TxA. Estes efeitos histológicos e macroscópicos, bem como o
efeito sobre volume e secreção foram quase completamente revertidos por um
antagonista seletivo do receptor A
2A
de adenosina, ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-[2-
furyl]1,2,] triazolo [2,3-a] [1,2,3]triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol), indicando que os
efeitos do ATL313, aqui demonstrados sobre a enterite induzida pela TxA ocorre por
sua ação específica sobre os receptores A
2A
de adenosina. SULLIVAN et al. (1999),
através do estudo sobre os quatro subtipos de receptores de adenosina,
encontraram que o ZM241385 é 17 a 142 vezes mais seletivo aos receptores A
2A
de
adenosina humanos do que aos outros subtipos receptores de adenosina. PEIRCE
et al. (2001) estudando o efeito de outro agonista A
2A
, o ATL-146e, sobre a redução
da formação de úlcera de pressão e inflamação, observaram que quando esse
agonista era administrado com o ZM241385, todos os efeitos protetores eram
bloqueados, tais como: redução significativa fluxo sanguíneo na isquemia cutânea
durante a reperfusão, o extravasamento leucocitário foi aumentado e a contagem
das áreas necróticas foi significativamente mais elevada. VISSER et al. (2000)
observaram que a interação do ZM241385 com os receptores A
2A
de adenosina
presente nos neutrófilos humanos atenuou completamente os efeito inibitórios da
adenosina sobre a produção de superóxido pelos neutrófilos ativados pelo fMLP.
É constatado através da literatura que a TxA quando utilizada em
modelos animais de alças intestinais isoladas leva a um intenso processo
inflamatório com a infiltração maciça de neutrófilos (ROCHA et al., 1997; KELLY et
al., 1994; CASATAGLIUOLO et al., 1998). Observamos no nosso trabalho que nas
alças ileais tratadas apenas com TxA havia um aumento da atividade da
80
mieloperoxidase, uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos,
sendo a dosagem da atividade dessa enzima um método indireto de se verificar a
infiltração neutrofílica local.
É bem reconhecido o importante papel que os neutrófilos desempenham
na patogênese da colite pseudomembranosa (LYERLY et al., 1988). KELLY et al.
(1994) e KUROSE et al. (1994) mostraram que a inibição do recrutamento de
neutrófilos por anticorpos para integrinas β
2
ou selectina-P diminuem o dano
intestinal de animais exposta à TxA. Também foi demonstrado que anticorpos para
as moléculas de adesão neutrofílicas, CD11-CD18, marcadamente reduziram a
secreção do fluido e o dano tecidual induzido pela TxA (KELLY, et al.,1994).
CASTAGLIUOLO et al. (1998) mostraram que a citocina pró-inflamatória MIP-2, um
quimioatraente neutrofílico, é liberada das células epiteliais intestinais durante os
estágios iniciais da enterite induzida pela TxA por um efeito direto dessa toxina sobre
os enterócitos e que anticorpos contra o MIP-2 inibe a secreção do fluido e a
migração neutrofílica induzida pela TxA no íleo do rato. Trabalho do nosso grupo
demonstra que a TxA desempenha um importante impacto sobre a migração, forma
e a função neutrofílica e que estes efeitos podem estar envolvidos na formação das
pseudomembranas, que são patognomônicas da colite pseudomembranosa (BRITO
et al., 2002a). QIU et al. (1999) demonstraram que a TxA purificada, quando
administrada no lúmen de alças intestinais de rato, induz a geração de grande
quantidade de radicais hidroxil e peróxido de hidrogênio e que esses metabólitos
reativos de oxigênio são gerados primariamente pela infiltração neutrofílica, o que
pode contribuir para o dano tecidual.
Dando continuidade ao nosso trabalho, verificamos que o ATL313 (5 nM)
preveniu o aumento da atividade da mieloperoxidase induzido por TxA em alça ileal
de camundongos, sugerindo um potente efeito inibidor deste agonista do receptor
A
2A
da adenosina sobre a infiltração neutrofílica. Sendo assim, sugerimos que o
efeito protetor do ATL313 sobre a inflamação e destruição da mucosa induzida pela
TxA seja, pelo menos em parte, devido à inibição do recrutamento neutrofílico
mediado pelo ATL313. CRONSTEIN (1994) e GLOVER et al. (2004) relatam que a
ativação dos receptores A
2A
de adenosina está envolvida na regulação da resposta
inflamatória e na redução da infiltração e função neutrofílica, o que vai de acordo
com a nossa hipótese. Adicionalmente, CRONSTEIN (1994) e SULLIVAN et al.
(2001) mostraram que a produção do ânion superóxido pelos neutrófilos era inibida
81
pelos agonistas dos receptores A
2A
o que poderia também contribuir para a redução
do dano tecidual induzido pela toxina A demonstrada em nosso trabalho.
Adicionalmente, BURKEY & WEBSTER (1993) e VISSER et al. (2000) mostraram
que a adenosina, via receptores A
2A
, inibia a produção de superóxido pelos
neutrófilos estimulados pelo fMLP. FLAMAND et al. (2000) mostraram que a
adenosina, agindo sobre seus receptores A
2A
, inibia algumas funções neutrofílicas
tais como, adesão às células endoteliais, atividade bactericida, expressão de
moléculas de adesão, secreção de citocinas, fatores de crescimento e síntese de
leucotrieno B
4
.
Tivemos a curiosidade de testar o efeito antiinflamatório do ATL313 em
outro modelo de inflamação que já é reconhecidamente mediado por neutrófilos.
Para isso, escolhemos o modelo de edema de pata induzido pela carragenina (Cg),
um polissacarídeo sulfatado derivado de algas marinhas, que foi usado como
estímulo inflamatório primeiro por GARDNER em 1960. É descrito que o edema
induzido pela Cg é bifásico (VINEGAR et al., 1969). Na primeira fase, que se
prolonga até 90min após a administração do estímulo, os mediadores mais
importantes são as aminas vasoativas (serotonina e histamina) resultante da
degranulação de mastócitos. (DI ROSA et al., 1971). A partir de então, os
mediadores produzidos de novo por células residentes teciduais passam a ter um
papel cada vez mais importante. Ao mesmo tempo os polimorfonucleares, atraídos
pelo processo inflamatório local, contribuem com o aumento de permeabilidade,
através da diapedese, dano endotelial direto e produção de mediadores (DI ROSA et
al., 1971; VINEGAR et al., 1969 e 1982; WEDMORE & WILLIAMS, 1981). Assim,
observamos nos nossos resultados que o ATL313 inibiu o edema de pata entre a 3ª
e 4ªh, ou seja, quando esse edema é mediado por neutrófilos. Para comprovar esse
novo achado, foi dosada a atividade de MPO na pele e tecido sub-plantar das patas
edemaciadas por Cg. A atividade de MPO foi significativamente reduzida nos
animais tratados com o ATL313, sugerindo que nesses animais a infiltração
neutrofílica na pata durante a 3ª e 4ªh foi inibida pelo ATL313. Este dado mostra que
o ATL313 inibe a infiltração neutrofílica estimulada por diferentes estímulos e em
diferentes sítios e sugere que esta inibição da infiltração neutrofílica pode está
envolvida no efeito protetor deste agonista contra a ação destruidora tecidual da
TxA.
82
Muitas pesquisas comprovam a ação antiinflamatória dos agonistas dos
receptores A
2A
de adenosina. Nesse sentido, BOUMA et al. (1996) e NEMETH et al.
(2003) afirmaram que esses agonistas desempenham uma ação inibitória sobre a
produção de quimiocinas e/ou de citocinas pró-inflamatórias produzidas por células
residentes tais como TNF-α, IL-8, IL-6. LINK et al. (2000) e PANTHER et al. (2001)
mostraram que análogos de adenosina, via estimulação de receptores A
2A
e
subseqüente elevação de AMPc, inibem a produção de IL-12 por monócitos
humanos ativados. Adicionalmente, a adenosina demonstrou induzir a liberação de
IL-10, uma citocina antiinflamatória, através dos monócitos humanos (MOSMAN
1994). Todos esses achados podem, assim, contribuir com o efeito antiinflamatório
desempenhado pelo ATL313 sobre a enterite induzida pela TxA.
SILVA & SALVIANO (2002), em uma revisão de literatura, afirmaram que
as cepas toxigênicas do C. difficile induziam a produção de TNF-α e de interleucinas
pró-inflamatórias, as quais contribuíam para a resposta inflamatória e a formação de
pseudomembranas. Trabalhos na literatura comprovam a liberação de TNF-α
induzido pela TxA e a participação dessa citocina como um mediador inflamatório.
Nesse sentido, ROCHA et al. (1997) concluíram que a migração neutrofílica na
cavidade peritoneal de ratos e na bolsa de ar induzidos pela TxA era mediada por
citocinas como o TNF-α , IL-β e por leucotrienos, liberados por macrófagos
residentes, sugerindo que esses mediadores inflamatórios podem exercer importante
contribuição na colite inflamatória induzida pela TxA do C. difficile. CANEIRO-FILHO
et al. (2001) mostraram que os inibidores da produção de TNF, talidomida e
pentoxifilina, inibiram a migração neutrofílica induzidas pelas toxinas do C. difficile no
modelo de edema de pata. ROCHA et al. (1998) afirmaram que macrófagos ativados
pela TxA são capazes de provocar secreção intestinal in vitro e que produtos da
cicloxigenase, fator de ativação de plaquetas e o TNF-α estão envolvidos na
secreção intestinal. BRITO et al. (2002b) demonstrou que uma linhagem de células
de epitélio colônico humano (células T84), era capaz de produzir TNF-α quando
estimuladas com TxA. No nosso trabalho foi realizado, então, a dosagem de TNF-α
no tecido das alças ileais. Observou-se que as alças tratadas apenas com TxA
apresentaram uma tendência não significativa no aumento da dosagem de TNF-α
quando comparadas com as alças controle que receberam somente PBS. Esta
ausência do efeito da TxA em aumentar a dosagem de TNF no intestino pode ser
83
atribuído ao fato de que o intestino já expressa níveis basais de TNF e que apesar
da TxA induzir aumento de TNF já relatado na literatura em outros tecidos, o método
utilizado aqui, não foi sensível o suficiente para detectar este aumento. No entanto,
no tecido das alças tratadas com o ATL313 houve uma redução significativa da
dosagem de TNF-α e esse efeito foi revertido por um antagonista específico dos
receptores A
2A
, o ZM241385. De acordo com nossos dados, a literatura mostra que
a ativação dos receptores A2Α por um outro agonista seletivo, o CGS21680,
preveniu o acúmulo de TNF-α in vivo (OHTA & SITKOVSKY, 2001). HASKÓ et al.
(2000) demonstraram que a produção de IL-12 e de TNF-α é suprimida pela
adenosina via ligação aos receptores A
2A
e de outros receptores de adenosina.
Ainda reforçando nossos resultados, dados da literatura demonstram que a ligação
do agonista do receptor A
2A
de adenosina, CGS21680, diminuiu a produção de TNF-
α estimulada pelo LPS através dos monócitos sangüíneos periféricos humanos, e
essa atividade inibitória era bloqueada pelo o antagonista do receptor A
2A,
ZM241385. A estimulação dos receptores A
2A
de adenosina inibe a liberação de
TNF-α por monócitos e macrófagos ativados enquanto aumenta a liberação de IL-
10, uma citocina anti-inflamatória, resultando na diminuição da secreção de citocinas
pró-inflamatórias (HASKO et al., 1996). No entanto estudos adicionais serão
necessários para definir qual a célula envolvida no efeito inibitório do ATL313 sobre
produção de citocinas no íleo de camundongos.
Nossos resultados mostraram, de forma inédita, que a TxA induz um
aumento significativo da atividade da enzima adenosina desaminase (ADA) no
tecido ileal de camundongos. Essa enzima cataliza a desaminação irreversível da
adenosina e da 2’-deoxiadenosina em inosina e deoxiinosina, respectivamente. A
ausência de ADA leva a um aumento descontrolado de adenosina desajustando
várias cascatas de sinalização da adenosina com conseqüentes efeitos em muitos
sistemas. O outro substrato da ADA, 2’-deoxiadenosina, é sabido ser citotóxico por
interferir com um número de vias metabólicas críticas como por exemplo a ativação
da cascata de caspases da apoptose (BLACKBURN et al., 2000).
A ADA está presente em todas as células de mamíferos e desempenha
uma função central na diferenciação e maturação de sistema linfóide (CRISTALLI et
al., 2001). Tem sido relatado que a ADA exerce um importante papel nas reações
imuno-inflamatórias agudas, e seu nível sérico tem sido utilizado como um marcador
84
bioquímico para inflamação e doenças (PIRAS et al., 1978; SARI et al., 2003).
Considerando que a adenosina tem um efeito antiinflamatório, é racional pensar que
o aumento da atividade da ADA induzido pela TxA poderia aumentar a degradação
da adenosina, resultando em um aumento do recrutamento neutrofilíco e
potencialização da resposta inflamatória e injúria tecidual. De acordo com os nossos
dados, tem sido mostrado que a pleurite induzida pela carragenina aumenta a
atividade de MPO e de ADA em paralelo à presença de neutrófilos (FRODE &
MEDEIROS, 2001). Adicionalmente, nós encontramos que o ATL313 reduziu o
aumento da atividade de ADA induzido por TxA a níveis semelhantes ao controle
(PBS). Como já discutido anteriormente, nossos dados também demonstraram que o
ATL313 reduziu a atividade de MPO induzida por TxA no mesmo tecido, sugerindo
que a diminuição da atividade de ADA pelo ATL313 possa estar relacionada com a
redução da infiltração neutrofílica induzida por este agonista da adenosina.
Tendo em vista o efeito estimulador da TxA sobre a atividade de ADA e
sobre a atividade de MPO, nós resolvemos investigar se ao reduzirmos a infiltração
neutrofílica induzida pela TxA reduziríamos também o aumento da atividade de ADA
induzida por esta toxina. Com esta finalidade utilizamos a fucoidina que é um
polissacarídeo que interfere na função da selectina-L. A selectina-L é uma molécula
de adesão presente na superfície dos leucócitos que interage com oligossacarídeos
presentes na superfície de células endoteliais formando ligações fracas, de forma
que o leucócito se liga ao endotélio, se libera, acompanha o fluxo de sangue e volta
a se ligar mais à frente. Isso causa o movimento de ligação intermitente conhecido
como rolamento (BRITO & RIBEIRO, 1999; PARKIN & COHEN, 2001).
A fucoidina, portanto, interferindo com a função da selectina-L, impede o
rolling leucocitário que é um passo inicial e importante para o extravasamento do
leucócito para o sítio inflamado (SHIMAOKA et al., 1996). SHIMAOKA et al. (1996)
mostraram que a inibição do rolling leucocitário pela fucoidina reduziu o acúmulo
neutrofílico no sítio inflamatório. Demonstramos então, que o pré-tratamento
sistêmico dos camundongos com fucoidina (25mg/kg, i.v.) reduziu o aumento do
peso e secreção das alça ileais, a atividade da MPO e ADA, bem como o dano
histológico nos tecidos das alças ileais induzido pela TxA. Em comum com o nosso
achado, ZHANG et al. (2001) mostraram que o pré-tratamento com fucoidina
(25mg/kg, i.v.) reduziu o dano da mucosa e a destruição das criptas na colite de
camundongos tratados com dextran sulfato. Assim, podemos concluir que os efeitos
85
da TxA sobre o a destruição tecidual e sobre a atividade de ADA devem ser, pelo
menos em parte, mediados pela presença dos neutrófilos.
Foi observado no nosso trabalho que o agonista do receptor A
2A
, ATL313,
reduziu a quantidade de células apoptóticas na mucosa ileal induzido pela TxA,
conforme mostra as fotomicrografias apresentadas. O efeito pró-apoptótico da TxA
tem sido demonstrado previamente em células epiteliais intestinais de humanos e
murinos pelo nosso grupo de pesquisa (BRITO et al. 2002b; BRITO et al. in press) e
nas células da lâmina própria (MEHIDA et al., 1996; MEHIDA et al., 1998). BRITO et
al. (2002b) mostraram que a TxA do C. difficile induziu apoptose em células T84 por
um mecanismo dependente da inativação da proteína Rho, da ativação das
caspases 3, 6, 8 e 9 e do Bib e do dano mitocondrial seguido pela liberação do
citocromo c, sugerindo que essa atividade pró-apoptótica apresentada pela TxA
pode contribuir para a indução da destruição da mucosa observada na enterite
induzida por essa toxina. Pelo fato da TxA ser uma molécula de alto peso molecular
(308 kDa), para chegar até a lâmina própria e induzir uma intensa inflamação
intestinal, essa toxina primeiro age destruindo as células epiteliais colônicas,
sugerindo, segundo BRITO et al. (2002b), que o efeito apotótico da TxA tem uma
implicação importante na iniciação da colite induzida por essa toxina. Em
concordância com esses achados, BRITO et al. (in press) concluem que a TxA
causa apoptose, necrose, diminuição da resistência trans-epitelial e inibe o reparo
epitelial por prejuízo da migração celular. Portanto, esses efeitos sobre a
sobrevivência, permeabilidade e reparo epitelial podem estar relacionados com o
desarranjo da barreira epitelial que a TxA causa para permitir seu contato com a
mucosa e, então, induzir uma intensa inflamação, observados na colite
pseudomembranosa induzida pelo C. difficile e também observado no modelo
experimental por nós utilizados neste trabalho.
Tendo em vista os dados citados no parágrafo anterior, nosso achado de
que o ATL313 pode prevenir a apoptose das células intestinais induzida pela TxA
pode ter implicações importantes sobre a prevenção da destruição da mucosa e
infiltração inflamatória ocasionado pela TxA, apesar de que o mecanismo que
envolve esse efeito anti-apoptótico necessite de mais investigações. Em
concordância com os nossos resultados, tem sido demonstrado que um outro
agonista dos receptores A
2A
, o ATL146e, diminuiu a apoptose neuronal durante a
reperfusão da espinha dorsal em coelhos (CASSADA et al., 2001). Entretanto,
86
WAKADE et al. (1995) demonstraram que, a nível intracelular, a adenosina também
mostrou induzir apoptose em neurônios simpáticos embrionários de pintos em
cultura primária. Observando esses achados contraditórios, podemos suspeitar que
a ação da adenosina sobre a apoptose deve variar de acordo com o tipo de célula
estudada.
Os resultados obtidos neste trabalho mostram, de forma inédita, o
importante efeito do agonista do receptor A
2A
da adenosina, ATL313, na prevenção
da destruição da mucosa, alterações inflamatórias, aumento da atividade de ADA e
apoptose induzida pela TxA do Clostridium difficile em alça ileal de camundongo.
Adicionalmente, nossos dados também sugerem um possível papel da ADA na
patogênese da inflamação induzida por TxA.
Embora estudos adicionais sejam necessários, o nosso estudo pode
servir de base para futuras investigações clínicas do efeito do ATL313 ou de outros
agonistas do receptor A
2A
da adenosina na colite induzida pelo C. difficile ou em
outras condições inflamatórias.
87
CONCLUSÕES
88
V. CONCLUSÕES
- A toxina A do Clostridium difficile induz enterite em alça ileal de
camundongo com intenso processo inflamatório, infiltração de neutrófilos,
destruição tecidual, edema, hemorragia, aumento de atividade de ADA e
apoptose.
- O agonista do receptor A
2A
da adenosina (ATL313), utilizado neste
trabalho, reduziu a destruição da mucosa intestinal, a infiltração
neutrofílica, o edema, a produção de TNF-α, a apoptose e o aumento da
atividade da adenosina desaminase induzidos pela TxA nas alças ileais de
camundongos, sugerindo que esse agonista da adenosina tem uma
potente ação antiinflamatória nesse modelo de enterite induzida pela
toxina A do C. difficile .
- Os efeitos do ATL313 sobre o edema, secreção, destruição da mucosa e
apoptose foram revertidos por um antagonista do receptor A
2A
da
adenosina, indicando que o efeito do ATL313 se deve a sua ação
específica sobre este receptor.
- O tratamento sistêmico com ATL313 reduziu de forma significativa o
edema de pata e atividade da enzima mieloperoxidase no modelo de
edema de pata, sugerindo que um dos mecanismos antiinflamatórios
desse agonista de adenosina é inibir a infiltração neutrofílica.
- Os animais pré-tratados sistemicamente com fucoidina apresentaram
redução significativa do dano tecidual e do aumento da atividade de ADA
induzida pela TxA, sugerindo que os efeitos dessa toxina sobre a
destruição tecidual e atividade de ADA podem ser, pelo menos em parte,
mediado pela presença de neutrófilos.
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