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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
Estudo de uma fração rica em compostos fenólicos
provenientes de uvas da variedade bordô (Vitis
labrusca L.), sobre o sistema cardiovascular:
enfoque na aterosclerose experimental
Elke Zuleika Schuldt
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa Catarina, como
requisito à obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
FLORIANÓPOLIS - SC
Junho de 2005
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Schuldt, Elke Zuleika. Estudo de uma fração rica em compostos fenólicos provenientes
de uvas da variedade bordô (Vitis labrusca L.), sobre o sistema cardiovascular:
enfoque na [aterosclerose] experimental. Florianópolis, 2005, .....f. Tese (Doutorado em
Farmacologia) - Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa
Catarina.
Orientadora: Professora Doutora Rosa Maria Ribeiro do Valle Nicolau.
Defesa: 08/06/2005.
O objetivo geral deste estudo foi investigar a atividade de uma fração rica em compostos
fenólicos - Fração Acetato de Etila (FAE), obtida a partir do extrato bruto dealcoolizado de um
[vinho] tinto catarinense, sobre o sistema cardiovascular de ratos Wistar normotensos e
camundongos C57/BLACK6 com ablação gênica para o receptor de LDL (LDLR KO),
submetidos a uma dieta hipercolesterolêmica (DH). Foram realizados ensaios para
determinar a atividade [antioxidante], experimentos de reatividade vascular, experimento
crônico para verificar o efeito da FAE em camundongos LDLR KO submetidos a uma DH,
dosagens bioquímicas de [colesterol] total, triglicerídeos, e lipoproteínas, cortes histológicos
de arcos aórticos de camundongos LDLR KO para determinar a formação de [ateromas] e
imunohistoquímica. Os resultados deste estudo demonstraram que a FAE apresenta alguns
efeitos biológicos importantes: 1) atividade [antioxidante] in vitro; 2) atividade vasorelaxante
sobre vasos de pequeno calibre, mais precisamente, sobre o leito arterial mesentérico de
ratos; 3) efeito hipolipidemiante na menor dose utilizada (3 mg/kg); 4) Diminuição sobre a
expressão dos marcadores CD40L e nitrotirosina (N-TYR). A diminuição da expressão dos
referidos marcadores aterogênicos foi ao encontro de todos os demais resultados anteriores,
confirmando as efetivas atividades antioxidantes, hipolipidemiantes e vasorelaxantes da FAE.
Palavras-chave: [vinho], [antioxidante], [ateromas], [colesterol], [aterosclerose].
Resumo
___________________________________________________________________
O objetivo geral deste estudo foi investigar a atividade de uma fração rica em
compostos fenólicos - Fração Acetato de Etila (FAE), obtida a partir do extrato bruto
dealcoolizado de um vinho tinto catarinense, sobre o sistema cardiovascular de ratos
Wistar normotensos e camundongos C57/BLACK6 com ablação gênica para o
receptor de LDL (LDLR KO), submetidos a uma dieta hipercolesterolêmica (DH).
Através da realização de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE - HPLC), os
principais compostos presentes nas amostras de: um vinho tinto (VT) dealcoolizado
proveniente de uvas (Vitis labrusca L.) da variedade Bordô; um vinho branco (VB)
dealcoolizado proveniente de uvas (Vitis labrusca L.) da variedade Niágara Branca;
um suco de uva (SU) proveniente de uvas (Vitis labrusca L.), da variedade Isabel e
uma Fração extraída com o solvente acetato de etila (FAE), obtida a partir de VT,
foram identificados. A partir da identificação dos diferentes compostos fenólicos
presentes nas amostras, passamos a investigar a atividade antioxidante de VT, VB,
SU e FAE. Foram realizados os ensaios do NBT (capacidade seqüestradora do
radical ânion superóxido); ensaio da desoxirribose (capacidade seqüestradora do
radical hidroxila) e o ensaio da peroxidação lipídica (capacidade seqüestradora do
radical peroxila). Os resultados demonstraram que as amostras apresentam
diferenças significativas em relação ao seu efeito antioxidante, obedecendo a
seguinte ordem de atividade: FAE > VT > SU > VB.
A partir da obtenção dos cromatogramas bem como dos ensaios bioquímicos
relacionados com a atividade antioxidante, selecionamos a FAE, a qual apresentou
os melhores resultados, para os experimentos em vaso de condutância (aorta) e
vasos de resistência (leito arterial mesentérico -LAM) de ratos. De acordo com os
resultados obtidos, a FAE apresenta uma atividade vasorelaxante sobre vasos de
pequeno calibre, mais precisamente, sobre o LAM de ratos. Com relação ao
mecanismo de ação da FAE, os resultados obtidos estabelecem uma relação direta
entre o aumento da biodisponibilidade do NO e sua atuação sobre canais de
potássio , com subsequente hiperpolarização das células lisas vasculares.
A partir dos resultados obtidos nos experimentos de reatividade vascular,
investigamos o efeito da FAE sobre camundongos LDLR KO. Neste protocolo
experimental, os animais foram divididos em sete grupos experimentais (CSD,
CCD, SD+V, FAE 3, FAE 10, FAE 30 e CP), e avaliados de acordo com: 1) os
parâmetros fisiológicos - peso e ingesta alimentar - dos camundongos LDLR KO,
ao longo dos três meses de tratamento; 2) dosagens bioquímicas pela verificação
dos níveis de colesterol total (CT), triacilgliceróis (TAG), e das lipoproteínas:
lipoproteína de muita baixa densidade (very low density lipoprotein - VLDL);
lipoproteína de baixa densidade (low density lipoprotein - LDL) e liproproteína de
alta densidade (high density lipoprotein - HDL); 3) através de protocolos os quais
avaliam a reatividade vascular, verificamos o efeito de um agonista α-
adrenérgico, a fenilefrina, bem como o efeito de um agonista colinérgico
muscarínico, a acetilcolina, sobre a aorta dos camundongos LDLR KO,
submetidos a DH e ao tratamento com a amostra de escolha (FAE); 4) a partir de
cortes histológicos corados pelo método hematoxilina-eosina (HE), identificamos
o índice de lesões dos diferentes grupos experimentais; 5) através de
metodologia imunohistoquímica, verificamos a influência do tratamento crônico
da FAE, nas diferentes concentrações utilizadas, sobre os marcadores
aterogênicos, CD40L e nitrotirosina (N-TYR).
De acordo com o tratamento crônico, a FAE demonstrou uma efetiva atividade
hipolipidemiante na menor dose utilizada (3 mg/kg). Por outro lado, as maiores
doses da FAE (10 e 30 mg/kg), não promoveram a mesma atividade, possivelmente
devido a uma atividade pró-oxidante dos componentes da FAE. Com relação à
imunohistoquímica, no grupo FAE 3, ocorreu uma significativa diminuição na
expressão dos marcadores CD40L e, principalmente, N-TYR. A diminuição da
expressão dos referidos marcadores aterogênicos vai ao encontro de todos os
demais resultados anteriores, confirmando as efetivas atividades antioxidantes,
hipolipidemiantes e vasorelaxantes da FAE.
Muitos estudos têm relatado que a associação de drogas redutoras do
colesterol plasmático e substâncias antioxidantes, seja uma proposta lógica
para a reversão de doenças de origem cardiovascular. Inúmeros trabalhos,
das mais diversas fontes, têm ainda apontado os "produtos de origem
natural", como efetivos promovedores de saúde e bem estar, sem mínimas
contra-indicações. Neste contexto, visto se tratar de um produto de ampla
comercialização e aceitação popular, o presente estudo pretendeu esclarecer
alguns pontos relacionados às efetivas e reais atividades atribuídas aos
compostos presentes na uva e vinho tinto.
* * * * *
Introdução
__________________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças cardiovasculares - Histórico
O aumento da prevalência de casos de doenças cardiovasculares é bastante
recente na história da humanidade, uma vez que tais patologias encontram-se
diretamente relacionadas à modificações nos hábitos de vida dos indivíduos. No
caso da hipertensão arterial, por exemplo, em sociedades mais primitivas, ou seja,
grupos de indivíduos ainda não submetidos à alimentação industrializada como os
Yanomames e Xavantes do Brasil, algumas populações de esquimós ou ainda os
Zulus da África Central e nativos da Polinésia, não ocorrem registros dessa
enfermidade (Neel et al, 1964; Oliver et al, 1975; Kurokawa, 2001).
O consumo de sal pelo homem teve início há cerca de 10.000 anos, quando o
excesso de caça, alterações climáticas e o crescimento populacional resultaram na
introdução da agricultura. A prática agrária desencadeou o aumento progressivo da
produção de alimentos, bem como o desenvolvimento de técnicas para seu
armazenamento (Catanozi et al, 2001). Um fato interessante é que o aumento da
ingestão de sal ocorreu a partir da descoberta de que os alimentos eram melhor
preservados quando mantidos em soluções salinas concentradas. Desde então, o
homem utilizou e desenvolveu esta técnica de conservação até a Revolução
Industrial e o surgimento do comércio agroindustrial, os quais geraram técnicas mais
avançadas de conservação. (Leopold e Ardrey, 1972; Ealton e Konner, 1985).
Além da sociedade moderna ter ao longo de sua evolução, realizado
importantes alterações em sua dieta alimentar, outros fatores, como o sedentarismo,
o tabagismo, a obesidade e o diabetes – têm contribuído de forma considerável para
a evolução das doenças de origem cardiovascular. Corrigir os fatores de risco como
deixar de fumar, fazer exercício, adotar uma dieta adequada ou tomar medicação,
tem melhorado muito o processo de evolução dessas doenças; a mudança no estilo
de vida a partir da redução desses fatores de risco, além do tratamento
farmacológico, têm sido, portanto, as grandes linhas de tratamento.
Por essas doenças serem muito frequentes e não produzirem sintomas em
sua fase inicial, o diagnóstico precoce também é fundamental. Uma vez feito o
diagnóstico, deve-se focalizar as possibilidades de tratamento e a correção,
portanto, de estilos de vida impróprios. No entanto, em especial no caso da
aterosclerose e da hipertensão arterial, tendo em vista que as alterações que
ocorrem no início são bastante assintomáticas, é freqüente os pacientes não terem
motivação para mudar o estilo de vida (Lemos da Luz, 2004).
1.2. Hipertensão Arterial
A hipertensão arterial consiste em um evento de elevada prevalência na
sociedade moderna. Esta patologia acomete cerca de 20% da população nos
Estados Unidos e entre 10% e 15% da população mundial. A hipertensão arterial
aumenta, consideravelmente, o risco de infarto do miocárdio, acidente vascular
cerebral (AVC), insuficiência cardíaca congestiva, doença vascular periférica e
insuficiência renal (Macmahon et al, 1990; Klag et al, 1996), estando, portanto, entre
os principais fatores de risco para a doença cardiovascular (Ames, 1986; Crook,
2002).
O tratamento anti-hipertensivo reduz as complicações cardiovasculares,
podendo diminuir o número de mortes decorrentes destas complicações, assim
como melhorar a qualidade de vida dos pacientes (Psaty et al, 1997; Hansson,
1999). Por outro lado, em relação ao tratamento da hipertensão arterial realizado
através da utilização de diuréticos ou beta-bloqueadores, tal procedimento tem sido
associado à alteração do catabolismo da lipoproteína (LP) de muito baixa densidade
(VLDL), contribuindo para o aumento da triacilglicerolemia e da colesterolemia, nos
indivíduos tratados (Nilsson et al, 1977; Shwan et al, 1978; Catanozi et al, 2001).
Esta modificação do perfil lipídico, muitas vezes tem sido considerada como possível
atenuante do tratamento anti-hipertensivo sobre a prevenção da doença arterial
coronariana (DAC) (Collins et al, 1990; Macmahon et al, 1990). Encontra-se
portanto, bem definido na literatura que a hipercolesterolemia e a
hipertriacilglicerolemia, associadas a baixa concentração de colesterol nas HDL,
estão entre os principais fatores de risco para a DAC prematura e o desenvolvimento
da aterosclerose (Kannel et al, 1971; Davingnon e Cohn, 1996; Libby, 2001; Lind,
2003).
1.3. Aterosclerose
A aterosclerose é considerada uma das principais causas de mortalidade na
população com estilo de vida ocidental (Libby, 2001), visto que desempenha um
papel determinante no desenvolvimento de infarto do miocárdio, derrame cerebral,
falência renal, gangrena, além de estar associada à perda de função nas
extremidades (Libby, 2002; Lind, 2003).
A aterosclerose constitui-se numa das patologias mais estudadas nas últimas
três décadas. No início da década de 70, acreditava-se que o simples acúmulo de
lipídios nas paredes das artérias - estreitando o lúmen das mesmas e levando ao
comprometimento do fluxo para os órgãos alvo - poderia ser a explicação mais
plausível para o subsequente aparecimento de placas ateroscleróticas. Além disso,
evidências clínicas apontavam uma direta relação entre a hipercolesterolemia e o
aparecimento de ateromas nos pacientes (Kannel et al, 1971). No final dos anos 70,
entretanto, verificou-se que não somente os lipídios, mas também determinados
fatores de crescimento bem como a proliferação da musculatura lisa vascular
propriamente dita, poderiam também desempenhar um papel coadjuvante na
patogenia da doença. Finalmente na década de 90, a aterosclerose passou a ser
estudada e reconhecida como uma distúrbio inflamatório crônico que pode ter
componentes infecciosos ou auto-imunes (Yu et al, 2001; Libby, 2000; Lind, 2003 ).
Dentre os fatores de risco tradicionais relacionados à doença aterosclerótica
podemos citar níveis séricos de colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL)
maiores que 160 mg/dL, tabagismo, hipertensão arterial sistêmica (PA > 140/90
mmHg), níveis séricos de colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL)
menores que 40 mg/dL, diabetes mellitus, idade acima de 45 anos para homens e
55 para mulheres e história familiar precoce de aterosclerose (Santos, 2001).
1.3.1. Patogenia da Aterosclerose
Os primeiros indícios de placa aterosclerótica começam a surgir muitos anos
antes de qualquer manifestação clínica, o que dificulta a compreensão da natureza
multíplice desse processo que não pode ser atribuído a apenas uma causa e parece
envolver fatores tão diversos quanto ambientais, alimentares, genéticos e
hemodinâmicos (Brown e Goldstein 1986; Ross, 1999; Libby, 2003).
O processo aterosclerótico é caracterizado por complexas séries de eventos e
interações celulares que ocorrem durante a produção das lesões ateroscleróticas. A
formação de uma lesão aterosclerótica - o ateroma - ocorre primariamente pela
passagem da lipoproteína de baixa densidade (LDL) através do endotélio arterial.
Isto ocorre em locais onde o endotélio encontra-se susceptível ou danificado, e
muitos fatores podem resultar em disfunção endotelial, incluindo a oxidação da LDL
(LDLox), forças físicas e químicas e infecções virais (Ross, 1999). Monócitos da
circulação sanguínea aderem a estes sítios e penetram no espaço sub-endotelial,
onde assumem a morfologia de macrófagos. Na seqüência, estas LDL
oxidativamente modificadas são rapidamente captadas pelos macrófagos através de
um receptor scavenger, levando ao acúmulo de ésteres de colesterol e formação
das chamadas células espumosas - foam cells (Ross, 1999; Libby, 2000). As LDLox
podem também danificar diretamente as células endoteliais e induzir as mesmas a
produzirem fatores quimiotáticos que irão atrair mais monócitos circulantes. Com
relação às células lisas vasculares, as células espumosas produzem fatores de
crescimento que induzem a migração da musculatura lisa, da média para a íntima,
levando à formação de uma lesão fibro-gordurosa. Em estágios subseqüentes,
ocorre uma calcificação e, caso a fibrose continue, formar-se-à uma cobertura
fibrosa cercada por um centro rico em lipídeos (Libby, 2002). Dependendo da
estabilidade da lesão, esta poderá romper e formar um trombo o qual, ao se
desprender, poderá ocluir total ou parcialmente o vaso sanguíneo; as consequências
clínicas mais relevantes de todo este processo são o infarto do miocárdio e o
derrame cerebral (Ross, 1999; Andreassi, 2003).
1.3.2. Aterosclerose e Marcadores Inflamatórios
1.3.2.1. CD40L: Pesquisas experimentais e evidências clínicas têm demonstrado
que as placas de ateroma, características da doença vascular aterosclerótica, são
consequência de uma série de respostas celulares e moleculares altamente
específicas (Mach et al, 1999). Neste contexto, o receptor de membrana
denominado CD40, bem como seu ligante, CD40L, desempenham um papel
fundamental tanto na patogênese precoce da doença aterosclerótica como no
desencadeamento dos fenômenos responsáveis pela ruptura da placa de ateroma,
responsável pelas síndromes isquêmicas agudas (Herman et al, 2001).
O receptor de membrana CD40 foi inicialmente descrito em linfócitos B como
parte crucial de um sistema de ativação e diferenciação dependente do contato com
o antígeno de membrana CD40L, presente em células T (Van Kooten e Banchereau,
2000). Posteriormente foi demonstrado que ambas as proteínas são expressas de
maneira funcional dentro da placa aterosclerótica; estes achados despertaram um
grande interesse sobre o papel da ligação CD40/CD40L na formação e
subsequente ruptura da placa de ateroma (Mach et al, 1997).
A ativação da via de sinalização CD40/CD40L está envolvida na manutenção
do processo inflamatório local, através da geração de citocinas (IL-1, IL-6), e
aumento da expressão de moléculas de adesão, como a ICAM-1 (intercellular
adhesion molecule 1) e a VCAM-1(vascular adhesion cell molecule 1). A ligação
CD40/CD40L aumenta também a expressão e a atividade de MMP-1 (colagenase
interticial do tipo 1), MMP-2 (gelatinase), MMP-3 (estromelisina 1) e MMP-9
(gelatinase B), tanto em células lisas vasculares como em macrófagos (Libby et al,
1999; Mach et al, 1997; Mach et al, 1999) . A essa atividade aumentada das
metaloproteinases, que leva a um maior risco de ruptura da placa de ateroma, soma-
se o fato de que a ligação CD40/CD40L ocasiona aumento da expressão do fator
tecidual em células endoteliais e vasculares (Mach et al, 1997). Em conjunto, a
perda da integridade da placa e a expressão aumentada de proteínas pró-
trombóticas, processos modulados pela via de sinalização CD40/CD40L, podem
desencadear os fenômenos trombóticos agudos responsáveis pela isquemia
tecidual. Dados experimentais e clínico-laboratoriais sugerem, portanto, que a via de
sinalização CD40/CD40L é um dos mecanismos mais importantes no
desencadeamento do processo inflamatório que culmina com a ruptura da placa de
ateroma e conseqüente síndrome isquêmica aguda (Libby, 2000).
1.3.2.2. Nitrotirosina (N-TYR): Muitos estudos têm reportado que o óxido nítrico
(NO) modula o tônus dos vasos através de mecanismos dependentes e
independentes da formação de monofostato de guanosina cíclico (GMPc), no interior
das células lisas vasculares ( Szilvassy et al., 2001; Niu et al., 2001) . De uma forma
geral, no processo de formação das placas ateroscleróticas, a inibição crônica da
produção de NO acelera o processo de formação de ateromas, enquanto que o
aumento de sua concentração nos vasos pode suprimir o desenvolvimento da
aterosclerose ou, ao menos, reduzir o índice de lesões (Cayatte et al., 1994; Naruse
et al., 1994). Várias pesquisas têm demonstrado que uma dieta rica em colesterol
pode comprometer a sinalização NO-GMPc, devido a formação de espécies reativas
de oxigênio, como o peroxinitrito (ONOO
-
), formado a partir da reação entre o NO e o
ânion superóxido (O
2
._
).
Em um experimento utilizando coelhos tratados com uma dieta
hipercolesterolêmica, verificou-se que ocorre uma diminuição nos níveis de NO e
GMPc, e um simultâneo aumento de O
2
._
e ONOO
-
, levando a um quadro de
hipertensão arterial (Szilvassy et al., 2001). Em outro estudo realizado com
camundongos knockout para a enzima óxido nítrico sintetase (eNOS-/-) os
pesquisadores demonstraram que a eNOS parece desempenhar um importante
papel antiaterogênico. Por outro lado, durante um processo inflamatório, o alto fluxo
de NO liberado a partir da ativação de uma forma induzida da NOS (iNOS) produz
também, altas concentrações de ONOO
-
, gerando nitrotirosina (N-TYR) ( Niu et al.,
2001).
A N-TYR é um composto biomarcador de ONOO
-
, sendo formado a partir da
nitração de resíduos de tirosina de determinadas proteínas, como por exemplo, a
apolipoproteína B-100 (apo B-100), encontrada nas LDLs. A exposição da LDL ao
ONOO
-
resulta na nitração dos resíduos de tirosina da apo B-100, promovendo
subseqüentemente a peroxidação lipídica da lipoproteína, além da depleção de
antioxidantes lipossolúveis, como a vitamina E (Hazen et al., 1999; Niu et al., 2001).
Neste contexto, estudos de imunohistoquímica e espectometria de massa têm
demonstrado que a N-TYR encontra-se significativamente aumentada em vasos
ateroscleróticos humanos, bem como na LDL. De acordo com Hazen e
colaboradores, em LDLs obtidas a partir de aortas ateroscleróticas humanas, a
concentração de N-TYR é aproximadamente cem vezes maior do que em LDLs
circulantes, obtidas de voluntários sadios (Hazen et al., 1999).
1.3.3. Terapia Antioxidante
A hipótese de que a peroxidação lipídica desempenha importante papel na
patogenia da aterosclerose, despertou crescente entusiasmo sobre a utilização de
antioxidantes como agentes antiaterogênicos. Os antioxidantes mais investigados,
tanto em animais como em humanos, têm sido a vitamina E), o beta-caroteno
(precursor da vitamina A), o ácido ascórbico (vitamina C), e os flavonóides.
A vitamina E, cuja forma mais prevalente e ativa é o α-tocoferol, é o
antioxidante lipossolúvel predominante nos tecidos e na LDL. Estudos laboratoriais
demonstraram que a vitamina E é um antioxidante extremamente potente,
responsável pela captura dos radicais peroxila, interrompendo a cadeia de
peroxidação lipídica. Além disso, protege os lípides poliinsaturados da oxidação
pelos radicais livres e parece ser essencial à proteção das lipoproteínas circulantes
e ao funcionamento adequado das membranas celulares. Por outro lado, alguns
estudos têm apontado que a suplementação através de dietas contendo vitaminas
(particularmente a vitamina E), não estaria necessariamente relacionada a um
retardo do processo aterosclerótico (Kritharides e Stocker, 2002). Acredita-se que
isto ocorra porque o α-tocoferol, além de ser um composto antioxidante, pode
também exercer uma forte atividade pró-oxidante sobre as lipoproteínas (Bowry et
al, 1995). Neste caso, os pesquisadores acreditam que uma dieta ideal seria aquela
cujos componentes, além de exercerem a atividade antioxidante per se, fossem
ainda capazes de proteger a oxidação do α-tocoferol. Neste contexto, de acordo
com um estudo feito por Stocker e O’Halloran, uma determinada fração enriquecida
com componentes obtidos a partir do vinho, foi capaz de atenuar tanto a
peroxidação do α-tocoferol como também a peroxidação da LDL, in vitro (Stocker e
O’Halloran, 2004). Este resultado é bastante importante, pois vai ao encontro de
outros estudos, os quais afirmam que num quadro de aterosclerose avançada em
humanos, grande parte da LDLox é gerada em função da presença do α-tocoferol
oxidado, muito embora os níveis de vitamina E oxidada não estejam
significativamente elevados (Witting et al, 1999). Neste caso, acredita-se que a
intervenção prévia utilizando agentes que são capazes de inibir a peroxidação
lipídica mediada pelo α-tocoferol, estariam, em última análise, inibindo também a
oxidação da própria LDL na parede arterial (Witting et al, 1999).
Os flavonóides são compostos cuja estrutura química é formada por quinze
átomos de carbono no seu núcleo básico, arranjados sob a configuração C6-C3-C6,
com dois anéis aromáticos ligados por três unidades de carbono, as quais podem ou
não formar um terceiro anel. Dentre os flavonóides mais pesquisados encontram-se
a catequina, quercetina, e glabridina (Rice Evans, 1996; Aviram e Fuhrman, 2002).
Tendo em vista que os flavonóides são encontrados em diversos alimentos da
dieta, como na maçã, brócolis, uva, chá e vinho tinto, a bioatividade destas
substâncias passou a ser investigada por inúmeros pesquisadores, no mundo todo.
O potencial benéfico dos componentes fenólicos, presentes estruturalmente nos
flavonóides, esteve primariamente relacionado à sua capacidade em seqüestrar
espécies reativas de oxigênio (EROs) nos sistemas biológicos (Husain et al, 1987;
Negre-Salvagyre e Salvagyre, 1992; Dragsted, 1993). No entanto, a vasta gama de
pesquisas realizadas com estes compostos têm apontado inúmeros efeitos
biológicos, os quais vão muito além desta atividade. Os principais efeitos
promovidos pelos compostos fenólicos, relacionados com os objetivos do presente
estudo, são:
• Atividade vasodilatadora: A partir de experimentos realizados com preparações
isoladas de aorta torácica de ratos, muitos pesquisadores verificaram que
determinados compostos fenólicos existentes em plantas utilizadas na medicina
popular, sob a forma de chás, tinturas e alcoolaturas, são capazes de promover
relaxamentos dependentes da presença do endotélio vascular (Fitzpatrick et al,
1995; Andriambeloson et al, 1997; Waslawik et al, 1997; Schuldt et al, 2000). Os
mecanismos de ação relacionados à esta atividade vão desde o aumento da
meia-vida do óxido nítrico e maior atividade da enzima NOS, até ações sobre o
influxo de cálcio transmembranário e inibição de fosfodiesterases.
• Ação antiinflamatória: Por inibirem a enzima ciclooxigenase, os compostos
fenólicos podem atuar diminuindo a agregação plaquetária e, conseqüentemente,
a formação de trombos (Pace-Asciak et al, 1996; Ruf et al, 1999; Dell'Agli et al,
2004).
• Ação moduladora sobre o sistema P450: Determinados extratos obtidos do vinho
tinto assim como alguns compostos isolados são capazes de inibir a atividade
das isoenzimas P450 2E1, 1A1 e 1A4, diminuindo em última análise, a formação
de espécies reativas deletérias aos tecidos (Chun et al, 1999; Chan et al, 2000;
Orellana et al, 2002).
• Atividade sobre a proliferação de células lisas vasculares: Compostos fenólicos
obtidos a partir do vinho tinto, são capazes de inibir a proliferação de células lisas
vasculares, bem como a síntese de endotelina 1 em células endoteliais de aorta
bovina (Corder et al, 2001; Araim et al, 2002).
• Inibição da oxidação da LDL: Os compostos fenólicos são capazes de inibir a
oxidação da LDL in vitro (Frankel et al, 1995; Frankel et al, 1998; Fuhrman et al,
2001; Fuhrman e Aviram, 2002) como também diminuir a formação de placas
ateroscleróticas em coelhos e hamsters hipercolesterolêmicos (Silva et al, 1995;
Vinson et al, 2001) e ainda camundongos com ablação gênica para a
apolipoproteína E (Stocker and O’Halloran, 2004).
1.4. Modelos animais para o estudo da Aterosclerose
O fato da aterosclerose ser uma doença de evolução lenta e silenciosa,
envolvendo múltiplos fatores de difícil controle em estudos clínicos, os quais geram
resultados muitas vezes de interpretação complexa, criou a necessidade do
desenvolvimento de modelos animais de experimentação (Fekete, 1993). De acordo
com Vesselinovitch (1988), o modelo ideal deve ser de fácil manuseio e
manutenção, ter baixo custo, tamanho adequado, ser passível de viabilização em
laboratório, possuir características genéticas definidas, guardar semelhanças
anatômicas, fisiológicas e bioquímicas com o homem quanto a aspectos do
processo patológico e desenvolver lesões com facilidade.
De acordo com estas premissas, a utilização de camundongos ou mesmo ratos, num
protocolo de aterosclerose, é ideal, principalmente com relação ao espaço físico,
manutenção e manuseio dos animais e tamanho da amostra. No entanto, com
relação aos camundongos, pelo fato de o sistema metabólico ser bastante eficiente
no que diz respeito a mobilização e metabolismo do colesterol, estes animais
tendem a responder brandamente à dietas hipercolesterolêmicas, desenvolvendo
somente discretas estrias gordurosas no arco aórtico (Paigen et al, 1987).
Em ratos, o aumento da ingestão de colesterol estimula a taxa de conversão
deste esteróide a ácidos biliares, o que não ocorre em humanos (Catanozi et al,
2001). Estes determinantes metabólicos caracterizam maiores valores séricos de
LDL colesterol no homem, enquanto o rato encontra-se entre os mamíferos que
apresentam a menor concentração plasmática desta classe de LP. Dentro deste
perfil fisiológico, os ratos, ao contrário do homem, dificilmente desenvolvem
hipercolesterolemia (Catanozi et al, 2001).
Os camundongos knockout para o receptor de LDL, denominados LDLR KO,
são obtidos a partir de recombinação homóloga de células tronco (steam cells)
embrionárias para produção de camundongos com perda funcional dos genes para
receptores de LDL. As partículas de VLDL e LDL, normalmente, competem por
receptores hepáticos comuns, denominados receptores de LDL ou B/E, os quais
reconhecem as apolipoproteínas B e E (apoB e apoE), presentes nestas
lipoproteínas (Catanozi et al, 2003). Os camundongos LDL KO não possuem estes
receptores de LDL de alta afinidade, porém, apresentam os receptores de LDL de
baixa afinidade. Desta forma, o prejuízo na taxa de remoção de VLDL, por meio dos
receptores B/E, resulta em aumento de competição na taxa de captação com as
partículas de LDL nos receptores de baixa afinidade (Ishibashi et al, 1994; Catanozi
et al, 2003). Consequentemente, ambos os tipos de partículas (VLDL e LDL) podem
apresentar suas concentrações plasmáticas simultaneamente aumentadas. Estes
camundongos passam então a apresentar uma moderada hipercolesterolemia
devido à ausência de receptores hepáticos suficientes para a captação de VLDL e
LDL. No entanto, quando são alimentados com uma dieta rica em colesterol, eles
tornam-se severamente hipercolesterolêmicos e desenvolvem aterosclerose aórtica
e xantomas subcutâneos (Ishibashi et al, 1993; Ishibashi et al, 1994; Catanozi et al,
2003).
Objetivos
__________________________________________________________
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
O objetivo geral deste estudo foi investigar a atividade de uma fração rica em
compostos fenólicos - Fração Acetato de Etila (FAE), obtida a partir do extrato bruto
dealcoolizado de um vinho tinto catarinense (VT), sobre o sistema cardiovascular de
ratos Wistar normotensos e camundongos C57/BLACK6 com ablação gênica para o
receptor de LDL (LDLR KO) submetidos a uma dieta hipercolesterolêmica.
2.2. Específicos
2.2.1. Identificar , atraves de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE - HPLC),
os principais compostos presentes em amostras de:
• um vinho tinto (VT) dealcoolizado proveniente de uvas catarinenses (Vitis
labrusca L.) da variedade Bordô;
• um vinho branco (VB) dealcoolizado proveniente de uvas catarinenses (Vitis
labrusca L.) da variedade Niágara Branca;
• um suco de uva (SU) proveniente de uvas catarienens (Vitis labrusca L.), da
variedade Isabel;
• uma Fração extraída com o solvente acetato de etila (FAE), obtida a partir de
VT.
Objetivos
__________________________________________________________
2.2.2. A partir dos resultados obtidos através do HPLC, verificar a atividade
antioxidante das amostras, através dos respectivos ensaios:
• ensaio do NBT (capacidade seqüestradora do radical ânion superóxido);
• ensaio da desoxirribose (capacidade seqüestradora do radical hidroxila);
• ensaio da peroxidação lipídica (capacidade seqüestradora do radical peroxila).
2.2.3. Com os cromatogramas obtidos e a partir dos ensaios bioquímicos
relacionados com a atividade antioxidante, selecionar a amostra que apresentou os
melhores resultados, para os experimentos em vaso de condutância (aorta) e vasos
de resistência (leito arterial mesentérico);
2.2.4. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de reatividade vascular,
verificar o efeito da FAE nos protocolos com camundongos LDLR KO:
2.2.4.1. Realizar um experimento crônico com camundongos LDLR KO durante um
período de três meses. Submeter os animais a uma dieta hipercolesterolêmica e a
um tratamento com diferentes concentrações da amostra de escolha. A partir deste
protocolo experimental, avaliar:
• os parâmetros fisiológicos - peso e ingesta alimentar - dos camundongos LDLR
KO, ao longo dos três meses de tratamento;
• com a coleta do soro dos animais, realizar dosagens bioquímicas verificando os
níveis de colesterol total (CT), triacilgliceróis (TAG), e das lipoproteínas:
Objetivos
__________________________________________________________
lipoproteína de muita baixa densidade (very low density lipoprotein - VLDL);
lipoproteína de baixa densidade (low density lipoprotein - LDL) e liproproteína de alta
densidade (high density lipoprotein - HDL);
Através de protocolos os quais avaliam a reatividade vascular, verificar o efeito de
um agonista α-adrenérgico, a fenilefrina, bem como o efeito de um agonista
colinérgico muscarínico, a acetilcolina, sobre a aorta dos camundongos LDLR KO,
submetidos a dieta hipercolesterolêmica e ao tratamento com a amostra de escolha;
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Animais: Para o ensaio da peroxidação lipídica e os protocolos envolvendo
preparações isoladas de aorta torácica e leito arterial mesentérico, foram utilizados
ratos albinos Wistar, machos, normotensos pesando entre 200 e 300g. Todos os
animais foram alojados em gaiolas plásticas, mantidos em temperatura ambiente
controlada (22 ± 2
o
C), com ciclo claro/escuro de 12 horas, recebendo dieta comercial
e água ad libitum. No ensaio da peroxidação lipídica, os animais foram submetidos a
um jejum de 12 horas antes da retirada do fígado dos mesmos, para a subseqüente
preparação dos homogenatos.
Nos protocolos onde foi verificada a atividade da FAE em animais
hiperlipidêmicos, foram utilizados camundongos (LDLR KO) machos C57BL/6 (com
ablação gênica para receptores de lipoproteína de baixa densidade - LDLR-/- mice),
com 8 a 10 semanas, pesando cerca de 20-25g, alojados em gaiolas plásticas
(máximo de 06 animais por gaiola) e mantidos em temperatura ambiente controlada
(22 ± 2
o
C), com ciclo claro/escuro de 12 horas.
Os camundongos LDLR KO foram gentilmente cedidos pela Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), sob a interveniência do Prof. Dr.
Heraldo Possolo de Souza. Os animais foram originalmente adquiridos da The
Jackson Laboratory (600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609-1500). Todos os
experimentos realizados com animais foram conduzidos conforme as diretrizes
estabelecidas pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), de
acordo com os protocolos 091/CEUA - 23080.001729/2001-45/UFSC e 264/CEUA -
23080.003548/2004-04/UFSC.
3.1.2. Drogas
Os kits enzimáticos para as dosagens do colesterol total (CT) e triacilglicerol
(TAG) foram obtidos, respectivamente, da MERCK (Darmstadt, Alemanha) e
ROCHE DIAGNOSTICS (Mannheim, Alemanha). A dosagem de LP foi realizada
com o kit enzimático da DADE BEHRING (Newark, EUA). Os compostos padrão
bem como os reagentes da fase móvel da análise feita por HPLC foram adquiridos
das empresas SIGMAe TEDIABRAZIL, respectivamente.
O peróxido de hidrogênio foi adquirido da QUIMEX. O ácido clorídrico (HCl),
cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), fosfato de potássio (KH
2
PO
4
) e
bicarbonato de sódio (NaHCO
3
), foram adquiridos da empresa NUCLEAR. A
glicose (C
6
H
12
O
6
), sulfato de magnésio (MgSO
4
7H
2
O), cloreto de cálcio (CaCl
2
H
2
O)
e cloreto de magnésio (MgCl
2
6H
2
O), da MERCK. O gel de congelamento (Tissue
Freezing Medium) - foi adquirido da Jung/Leica Instruments Gmbh (Alemanha).
Os anticorpos primários, CD40L (rabbit polyclonal antibody CD 154) e anti-
nitrotirosina ( rabbit anti-nitrotyrosine antibody N-409) foram adquiridos das
empresas Santa Cruz Biotechnology e Sigma, respectivamente. O cromógeno
diaminobencidina (DAB) e o soro albumina bovina (BSA), foram adquiridos,
respectivamente, da Sigma e Boehringer Ingelheim Bioproducts. O anticorpo
secundário foi adquirido da Vector Laboratories (CA, EUA).
Todas as demais substâncias relacionadas a seguir foram adquiridas da
SIGMA: fenilefrina, acetilcolina, indometacina, ácido clorogênico, ácido gálico, ácido
cinâmico, quercetina, ácido protocatêico, ácido p-cumárico, ácido m-cumárico,
hidroquinona, trans-resveratrol, epicatequina, dimetil sulfoxido (DMSO), ácido
tiobarbitúrico (TBA), ácido tricloroacético (TCA), manitol, butil-hidróxi-tolueno (BHT),
t-butil-peroxido, desoxirribose, cloreto férrico, ácido nitrilotriacético (NTA), enzima
superóxido dismutase, fenazina metasulfato, difosfato de nicotinamida e nitro blue
tetrazolium (NBT).
3.2. Métodos
3.2.1. Seleção das amostras dos vinhos e preparação dos extratos:
3.2.1.1. Os estudos foram conduzidos utilizando-se amostras (750 mL), de vinho
tinto (uvas da variedade Bordô - Vitis labrusca L.), vinho branco (uvas da variedade
Niágara Branca - Vitis labrusca L.) e suco de uva (uvas da variedade Isabel; Vitis
labrusca L., provenientes do Vale do Rio do Peixe, município de Tangará - Santa
Catarina/Safra 2000. As garrafas foram mantidas ao abrigo da luz, sob temperatura
de 20 a 22°C e, após aberta, a atmosfera interna foi substituída por N
2
.
3.2.1.2. O volume total de cada garrafa de vinho tinto e branco (750 mL), foi
aliquotado em duas partes, transferindo-se as amostras para um evaporador
rotatório para a remoção do componente etanólico (EtOH). A destilação fracionada
foi realizada sob condições de vácuo parcial e temperatura de 80-85
o
C, durante 2,5
horas/amostra. Ao final deste período, o resíduo foi coletado, determinando-se o
volume final deste em proveta graduada; a concentração de etanol (graus GL) foi
determinada com o auxílio de um alcoômetro.
3.2.1.3. Para os ensaios cromatográficos, o resíduo obtido foi dissolvido em 5,0 mL
de methanol:clorofórmio (1:1) e acondicionado a −20°C, até o momento das análises
(Maraschin et al, 2000).
3.2.1.4. Visto que os protocolos bioquímicos e farmacológicos não podem ser
realizados na presença de quaisquer solventes, foi necessário determinar o teor de
matéria seca do resíduo obtido. Para isso, 10 mL do resíduo foram transferidos para
placas de Petri e mantidos em estufa (≅ 60
o
C) até peso constante. O valor de
matéria seca foi calculado tendo por base os valores do peso fresco do conjunto
(amostra + placa Petri) e os valores obtidos do peso seco deste. A partir destes
valores, calculou-se a média do peso fresco/mL da amostra deacoolizada, utilizando-
se duas repetições para tal.
3.2.1.5. Os extratos brutos obtidos através da ressuspensão da matéria seca em
água deionizada passaram a ser denominados de VT, para o extrato dealcoolizado
obtido a partir do vinho tinto e VB, para o extrato dealcoolizado obtido a partir do
vinho branco.
3.2.1.6. Para extração dos compostos (poli)fenólicos de VT, 100 mL de amostra
foram adicionados a igual volume de acetato de etila (AcEtOH), e incubados durante
24 horas, em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A partir deste procedimento,
a fase orgânica foi coletada e o AcEtOH foi removido por evaporação, utilizando-se
um fluxo de N
2
. A matéria seca desta fração foi obtida realizando-se os mesmos
procedimentos descritos no item 3.2.1.4. A fração acetato de etila, obtida através da
ressuspensão da matéria seca em água deionizada, passou a ser denominada de
FAE.
3.2.1.7. A amostra do suco de uva (SU) foi obtida por secagem de 450 mL de suco
concentrado, sendo que para a realização dos ensaios bioquímicos, o resíduo de SU
também foi ressuspendido em água deionizada.
3.2.1.8. Todas as amostras obtidas - VT, VB, SU e FAE - foram mantidas em freezer,
à −20°C, sob o abrigo da luz, até a realização dos procedimentos bioquímicos e
farmacológicos.
3.2.2. Ensaio Cromatográfico
3.2.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE):
A análise dos compostos (poli)fenólicos via CLAE foi realizada através da
injeção de amostras de 10 µL em cromatógrafo Shimadzu LC-10, equipado com uma
coluna de fase reversa (Shim-pack C
18
, 4,6 mm ∅ x 25 cm comprimento) e detector
UV-visível (Shimadzu SPD 10A, 280 nm e 306 nm). A fase móvel utilizada foi
H
2
O:AcOH:n-BuOH (350:1:10, v/v/v), com fluxo contínuo de 0,8 mL/min. Para a
análise quantitativa dos componentes, foi realizada uma curva de calibração,
utilizando-se como padrão ácido gálico (1,0 a 100,0 µg/mL).
3.2.2.2. Os itens 3.2.1 e 3.2.2. foram realizados no Laboratório de Morfogênese e
Bioquímica Vegetal - Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Santa
Catarina, sob supervisão do Prof. Dr. Marcelo Maraschin.
3.2.3. Estudo da Atividade Antioxidante
3.2.3.1. Ensaio do NBT (capacidade seqüestradora do radical ânion superóxido):
O sistema gerador de EROs utilizado para detecção da capacidade
seqüestradora de radical ânion superóxido (O
2
-.
) foi realizado segundo Robak &
Gryglewski (1988). Para avaliar a capacidade sequestradora de O
2
-.
foi utilizado o
sistema gerador de radical ânion superóxido NADH-metassulfato de fenazina onde foi
acrescentado ao meio de reação uma substância que reage com o O
2
-.
, o NBT,
formando um produto corado que pode ser avaliado espectrofotometricamente a 560
nm.
O meio de incubação deste ensaio consistiu de fenazina-metasulfato (10 µM),
nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH, 78 µM) e nitro blue tetrazolium
(NBT, 25 µM) em tampão fosfato ( 0,1 M; pH 7,4). A enzima superóxido dismutase
(SOD; 100U/mL) também foi utilizada neste ensaio como controle positivo. Após dois
minutos de incubação à temperatura ambiente, a reação foi interrompida adicionando-
se aos tubos teste, HCl 0,01 N. a leitura foi realizada em espectofotômetro em
comprimento de onda de 560 nm contra um branco o qual não continha fenazina
metasulfato. Tomou-se como 100% da redução do NBT, a reação sem a presença de
VT, VB, FAE e SU.
3.2.3.2. Ensaio da degradação da desoxirribose (capacidade seqüestradora do
radical
.
OH):
O sistema gerador de EROs (radical
.
OH) utilizado para detecção de danos
oxidativos à desoxirribose foi realizado de acordo com Nishida e colaboradores
(1991). A detecção dos produtos oxidados (substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico - TBARS) foi realizada como descrita em Halliwell e Gutteridge (1981).
De acordo com este protocolo, o radical hidroxila (
.
OH) é gerado através da
reação de Fenton: Fe
2+
+ H
2
O
2
→
.
OH +
-
OH
-
+ Fe
3+
.O radical uma vez gerado,
oxida a desoxirribose e os produtos desta oxidação (TBARS), reagem
subseqüentemente com o TBA (ácido tiobarbitúrico), formando um produto corado,
que pode ser medido espectrofotometricamente a 532 nm. Da mesma forma como
ocorre no ensaio anterior, quanto maior a capacidade antioxidante do composto
testado, menor é a intensidade da cor.
Os ensaios foram realizados em triplicatas, num volume final de 1,2 mL.
Inicialmente foi realizada uma pré incubação de 25 µL de uma solução estoque de
FeCl
3
(25 µM) com 100 µL da solução estoque de NTA (ácido nitrilotriacético; 100
µM), por 10 minutos à temperatura ambiente, para formação do quelato.
Posteriormente foi adicionado água deionizada (volume necessário para 1,2 mL),
150 µL de tampão fosfato ( 0,01 M), 100 µL de solução de desoxirribose (2,8 mM) e
finalmente, 100 µL de H
2
O
2
(1,4 mM). Os tubos foram incubados por 20 minutos em
banho maria a 37
o
C. Ao final da incubação foi realizada a reação com o TBA
(reagente de cor), onde foram adicionados aos tubos, 1 mL da solução de TBA 1% e
1 mL de ácido tricloroacético (acidificante do meio) a 2,8 %.
Os tubos foram incubadas por mais 15 minutos à temperatura de 100
o
C para
a formação de pigmento e, ao final deste tempo, resfriados imediatamente em
banho de gelo. A absorbância das amostras foi medida em espectofotômetro visível
a 532 nm à temperatura ambiente, contra um branco contendo todos os reagentes,
com exceção da desoxirribose. Nos tubos contendo as amostras, foi adicionado 240
mL das diluições dos mesmos ao meio de reação, antes da adição do H
2
O
2
. A
absorbância de cada ensaio foi medida contra um branco especifico, contendo a
mesma concentração de VT, VB, FAE e SU. O manitol (250mM) foi utilizado
paralelamente como controle positivo dos ensaios. Os resultados forma expressos
em valores percentuais, considerando-se os valores médios da absorbância dos
controles como 100% da degradação da desoxirribose.
3.2.3.3. Ensaio da peroxidação lipídica (capacidade seqüestradora do radical
LOO
.
):
Neste ensaio, para a verificação da capacidade seqüestradora de VT, VB,
Fae e SU sobre biomoléculas, foi utilizado homogenato de fígado de ratos, de acordo
com Chen e Tappel (1996).
Neste sistema, a peroxidação lipídica foi induzida pelo peróxido de t-butila. Os
reagentes foram adicionados na seguinte ordem: 10 mM de tampão fosfato (K
2
HPO
4
-
KH
2
PO
4
) pH 7,4; diferentes concentrações de VT, VB, SU e FAE (0,03 a 1,0 µg/mL),
ou BHT ( 10mM; controle positivo), homogenato (150 µL; concentração de proteínas
= 179.31 mg/mL) e 100 µM de peróxido de t-butila. Esta mistura foi incubada a 37°C
a temperatura ambiente, por um período de 2 horas. Após este período, 1 mL de
TBA (1%) e 1 mL de TCA (2,8%) foram adicionados aos tubos e aquecidos a uma
temperatura de 100°C por 15 minutos. Após a retirada do precipitado por
centrifugação, a quantidade de TBARs foi mensurada através de leitura em
espectofotômetro a 532 nm.
3.2.4. Protocolos Experimentais Farmacológicos - Reatividade Vascular em
ratos Wistar normotensos:
3.2.4.1. Preparações isoladas de aorta torácica:
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical seguido de
exsanguinação feita pela secção da artéria carótida. Após a abertura da cavidade
torácica, a aorta foi delicadamente removida e transferida para uma placa de Petri
contendo solução fisiológica específica para este tipo de preparação, retirando-se os
tecidos adiposos e conectivos adjacentes (Andriambeloson et al, 1997).
O vaso foi seccionado na forma de anéis de 3 - 4 mm de comprimento, os
quais foram transferidos para cubas de vidro com volume total de 5,0 mL de solução
de Krebs-Henseleit, de acordo com a seguinte composição (mM): NaCl 118; KCl 4,7;
CaCl
2
2,5; MgSO
4
1,2; KH
2
PO
4
0,9; NaHCO
3
25; glicose 11. A solução nutriente foi
mantida à 37°C, pH 7,4 e aerada com uma mistura de 95% de O
2
e 5% de CO
2 .
Duas hastes metálicas foram inseridas na luz dos mesmos, sendo uma delas
adaptada a um transdutor de tensão isométrica acoplado a um software de
aquisição de dados da marca Soft and Solutions. A tensão de repouso das
preparações correspondeu a 1,0 g e a solução nutriente foi substituída a cada 15
minutos.
Após o período de equilíbrio (60 minutos) as preparações foram contraídas
com fenilefrina (1,0 - 3,0 µM) para verificar a capacidade contrátil das mesmas. A
presença do endotélio funcional foi avaliada pela capacidade da acetilcolina (ACh,
1µM) induzir ao relaxamento das preparações contraídas previamente com
fenilefrina. Somente as preparações que apresentaram relaxamento igual ou
superior a 75% foram consideradas com endotélio íntegro.
Após a realização do teste da integridade do endotélio, as preparações foram
lavadas com solução fisiológica e mantidas em repouso por 30 minutos, sendo a
solução nutriente substituída a cada 10 minutos. Passado o período de 30 minutos,
as preparações foram novamente contraídas com fenilefrina (1,0 - 3,0 µM) e foram
realizadas curvas concentração-resposta cumulativas (CCRc), à FAE (0,1 - 3000,0
µg/mL).
3.2.4.2. Isolamento do leito arterial mesentérico (LAM):
Os ratos foram anestesiados com uma mistura de quetamina (Francotar ) e
cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina (Rompum ) e, em seguida à
laparotomia, o leito mesentérico foi estendido para o exterior da cavidade abdominal e
envolto com gaze umedecida com solução de Krebs. Em seguida, os ramos
pancreático duodenal, íleo-cólico e cólico direito da artéria mesentérica superior foram
ligados e seccionados. A artéria mesentérica superior foi isolada na sua origem, à
altura da aorta abdominal e canulada com um tubo de polietileno (PE50), de
aproximadamente 4 cm de comprimento, preenchida com solução de Krebs
heparinizada. Em seguida, os animais foram sacrificados por meio de rompimento
do diafragma e o leito arterial mesentérico (LAM) foi removido. O intestino delgado
foi então separado do LAM, cortando-se rente a borda intestinal, e a preparação foi
perfundida com solução de Krebs (g/L): NaCl (6,9); KCl (0,35); CaCl
2
.2H
2
O (0,44);
MgCl
2
.6H
2
O (0,29); KH
2
PO
4
(0,16); NaHCO3(2,1g); glicose (2,0).
3.2.4.3. Medida da pressão de perfusão do LAM:
Após o isolamento, a preparação foi colocada em uma cuba (volume de 10
mL) e constantemente perfundida por meio de uma cânula inserida na artéria
mesentérica superior que foi conectada a uma bomba peristáltica. A solução de
Krebs, mantida a 37
0
C e areada com uma mistura carbogênica (95% de O
2
e 5% de
CO
2
), foi infundida à velocidade de 4mL/min e a pressão de perfusão registrada
continuamente em um computador PC, por um equipamento de análise de pressão
arterial Digi-Med (Modelo 190, NY, EUA), conectado a um software de integração
Digi-Med (Modelo 200) em um sistema operacional Windows 95TM (Microsoft
Corporation, EUA).
Os experimentos foram precedidos de um período de 30 minutos de
estabilização da preparação, durante o qual a pressão de perfusão basal permaneceu
entre 10 a 15 mmHg. Após o período de estabilização, em um dos béquers contendo
a solução de Krebs, foi adicionado o agonista adrenérgico - fenilefrina, à preparação
(solução mãe = 1 mg/mL), em concentração suficiente para que a pressão de
perfusão se mantivesse estável, em torno de 70 - 80 mmHg.
Nos experimentos onde foi utilizado Krebs-despolarizante, não se fez
necessária a utilização da fenilefrina para promover a contração do LAM e respectiva
PP em torno de 70 - 80 mmHg; a própria solução despolarizante, devido a alta
concentração de K
+
, tem a propriedade de contrair a preparação.
Foram realizadas curvas concentração-resposta (CCR) de relaxamento ao VT e à
FAE (30 – 3000 µg), e também aos compostos majoritários (1 nmol - 3 µmol),
detectados em maior concentração no HPLC da FAE: ácido gálico, ácido cinâmico,
ácido clorogênico, quercetina e resveratrol. Visto que o modelo empregado em nosso
estudo é um sistema de perfusão aberto, as diferentes concentrações de VT, FAE e
compostos isolados utilizadas nos experimentos, foram injetadas em doses isoladas,
in bolus, em volumes de 100 µL, por meio de uma seringa de insulina.
Para investigar a influência da FAE nos diferentes processos de vasodilatação,
foram utilizadas as seguintes drogas: Nω-nitro-L-arginina (L-NOARG 100 µM; inibidor
da enzima óxido nítrico sintase - NOS), 1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-alfa] quinoxalin
(ODQ 10 µM; inibidor da enzima guanilato ciclase do tipo solúvel - GC); glibenclamida
(GLI 100 µM; inibidor de canais de K
+
dependentes de ATP), ouabaína (OUA 100 µM;
inibidor da bomba de Na
+
/K
+
-ATPase), tetraetilamônio (TEA 500 µM; inibidor não
seletivo de canais de K
+
), cloreto de bário (BaCl
2
100 µM; inibidor de canais de
potássio retificadores para influxo - K
IR
); Charibdotoxina (ChTx 10 nM; inibidor não-
seletivo de canais de potássio ativados pelo cálcio, de média e alta condutância - K
ca
)
e Apamina (100nM; inibidor seletivo de canais de potássio ativados pelo cálcio, de
baixa condutância). Todas estas drogas foram dissolvidas em solução fisiológica de
Krebs, em volume final suficiente para a realização de uma CCR de relaxamento à
FAE. As soluções de Krebs despolarizante ou Krebs+droga só foram perfundidas
após o período de estabilização da preparação. Durante a estabilização, o LAM foi
perfundido somente com o líquido de Krebs.
Para verificar o efeito da acetilcolina na ausência e na presença de Krebs
despolarizante ou Krebs+droga, após a contração induzida pela fenilefrina, foi injetado
um volume de 20 µL de uma solução 10 mM (in bolus), do referido agonista.
3.2.5. Protocolos experimentais realizados com camundongos LDLR KO
3.2.5.1. Tratamento dos Animais:
Camundongos machos LDLR KO foram separados em sete diferentes grupos
e submetidos a um tratamento crônico por um período de três meses, de acordo
com a tabela a seguir:
Tabela 1: Diferentes Grupos Experimentais do tratamento crônico dos
camundongos LDLR KO
Nome do Grupo Experimental
Detalhamento da dieta/dia fornecida de
acordo com o peso semanal dos animais
CSD (N = 5)
CCD (N = 5)
SD + FAE (N = 5)
FAE 3 (N = 6)
FAE 10 (N = 6)
FAE 30 (N = 6)
CP (N = 5)
Dieta padrão e água destilada ad libitum + água
destilada (v.o.), por gavagem
Dieta hipercolesterolêmica* e água destilada ad
libitum + água destilada (v.o.), por gavagem
Dieta padrão e água destilada ad libitum + FAE
30 mg/kg (v.o.), por gavagem
Dieta hipercolesterolêmica* e água destilada ad
libitum + FAE 3 mg/kg (v.o.), por gavagem
Dieta hipercolesterolêmica* e água destilada ad
libitum + FAE 10 mg/kg (v.o.), por gavagem
Dieta hipercolesterolêmica* e água destilada ad
libitum + FAE 30 mg/kg (v.o.), por gavagem
Dieta hipercolesterolêmica* e água destilada ad
libitum + sinvastatina 1 mg/kg (v.o. controle
positivo), por gavagem.
A dieta hipercolesterolêmica* foi desenvolvida pelo ITAL - Instituto de
Tecnologia de Alimentos - da Unicamp/SP, sob supervisão da Drª Nádia Fátima G.
P. Dias. A dieta hipercolesterolëmica consistiu dos seguintes nutrientes, a saber:
1.25 % colesterol, contendo os seguintes nutrientes (g/100 g): caseína (20,4);
dextrina (11,3); bitartarato de colina (0,25); sacarose (10,0); amido de milho (27,0);
óleo de soja (20,0), minerais e vitaminas. A dieta, fornecida pelo ITAL na forma
liofilizada, foi misturada com água destilada em quantidade suficiente para a
confecção manual de pellets, os quais foram devidamente armazenados no interior
de caixas plásticas sob temperatura de - 20
o
C. Todos os grupos de camundongos
LDLR KO receberam a dieta (padrão ou hipercolesterolêmica) durante o período de
três meses.
3.2.5.2. Cálculo das doses de FAE administradas aos camundongos LDLR KO:
As doses de 3, 10 e 30 mg por Kg de peso foram calculadas considerando-se
os parâmetros farmacocinéticos homem/camundongo, a qual estabelece que o
metabolismo do camundongo é cerca de 10 (dez) vezes mais rápido em relação ao
metabolismo humano.
A partir da obtenção do rendimento da FAE (500 mg/garrafa de 750 mL de
vinho total), realizou-se inicialmente o cálculo da concentração da FAE em um
volume de 100 mL (volume que corresponde aproximadamente a uma taça de vinho
tinto).
De acordo com o cálculo acima citado, a ingestão diária de FAE, para um
homem de aproximadamente 70 Kg, corresponde a cerca de 70 mg/dia, ou ainda, 1
mg por kg de peso corporal. Tendo em vista que o metabolismo de camundongos é
mais acelerado que o metabolismo humano: 1(mg/kg) X 10 (fator de correção
farmacocinético) = 10 mg. A dose intermediária (10 mg/kg), administrada aos LDLR
KO, corresponde, portanto, a uma ingestão diária de FAE (70 mg/dia/homem).
Desta forma, a dose de 3 mg/kg corresponde a cerca de um terço da dose
intermediária e a maior dose, 30 mg/kg, a três vezes o valor da mesma dose.
3.2.5.3. Parâmetros Fisiológicos - Peso e Ingesta Alimentar:
Os animais LDLR KO foram avaliados de acordo com a ingesta alimentar
diária e o peso semanal. O volume das soluções que foram administradas por
gavagem (água destilada, FAE ou sinvastatina), foram ajustados de acordo com a
variação de peso semanal dos animais. A ingesta alimentar foi verificada
diariamente, de acordo com a seguinte fórmula:
Ração fornecida ao grupo (g) − Ração que sobrou no dia seguinte =
Valor obtido ÷ "N" do grupo = Média da ingesta alimentar diária.
3.2.5.4. Ensaios Bioquímicos - Dosagem de Lipoproteínas (VLDL, LDL, HDL),
colesterol total (CT), e triacilglicerol (TAG):
Os níveis de colesterol total (CT), lipoproteínas (VLDL, LDL e HDL) e ainda o
triacilglicerol (TAG) foram mensurados através de ensaios enzimáticos descritos no
item 3.1.2. Após os três meses de tratamento, foram retirados cerca de 0,4 a 0,6 mL
de sangue total de cada camundongo previamente anestesiado, via punção da veia
cava. Após a centrifugação do sangue (3000 rpm; 10 minutos), foram obtidas
amostras de soro num volume de aproximadamente 0,3 mL, as quais foram
devidamente aliquotadas em eppendorfes e armazenadas até a data das análises,
sob temperatura de - 70
o
C. O aparelho Dade Behring (Dimension - AR), foi utilizado
para a análise do soro. As análises foram realizadas no Laboratório de Análises
Clínicas do Hospital Universitário da UFSC, sob supervisão da farmacêutica
bioquímica Elisabeth Martins Hermes.
3.2.5.5. Reatividade Vascular: Preparações isoladas de aorta torácica:
Os camundongos foram anestesiados com uma mistura de quetamina
(Francotar ) e cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina (Rompum ).
Em seguida à laparotomia, à retirada do sangue e à separação do coração e arco
aórtico, a aorta foi delicadamente removida e transferida para uma placa de Petri
contendo solução fisiológica, retirando-se os tecidos adiposos e conectivos
adjacentes (Andriambeloson et al, 1997).
O vaso foi seccionado na forma de anéis de 2 mm de comprimento, os quais
foram transferidos para cubas de vidro com volume total de 5 mL de solução de
Krebs-Henseleit, de acordo com a seguinte composição (mM): NaCl 118; KCl 4,7;
CaCl
2
2,5; MgSO
4
1,2; KH
2
PO
4
0,9; NaHCO
3
25; glicose 11. A solução nutriente foi
mantida à 37°C, pH 7,4 e aerada com uma mistura de 95% de O
2
e 5% de CO
2 .
Duas hastes metálicas foram inseridas na luz dos mesmos, sendo uma delas
adaptada a um transdutor de tensão isométrica acoplado a um sistema de aquisição
de dados Kitcad, da marca Soft and Solutions. A tensão de repouso das
preparações correspondeu a 0,5 g e a solução nutriente foi substituída a cada 15
minutos. Uma vez que a aorta de camundongo é menos responsiva do que a aorta
de rato, durante o procedimento de lavagem das preparações, foi adicionado
fenilefrina (1µM) às cubas, de forma intercalar, no sentido de estimular levemente as
preparações. Nas duas lavagens que antecederam o início do experimento,
nenhuma droga foi adicionada ao banho.
Após o período de equilíbrio de 90 minutos, foram realizadas curvas concentração-
resposta (CCR) ao agonista α-adrenérgico - fenilefrina ( 1 nM - 3 µM) e,
subseqüentemente à obtenção do efeito máximo desse agonista, procedeu-se a
CCR ao agonista muscarínico - acetilcolina (1 nM - 3 µM).
3.3. Apresentação dos resultados e análise estatística:
Nos ensaios bioquímicos realizados para determinar a atividade antioxidante
das amostras, os resultados foram expressos em porcentagem ± EPM,
considerando-se 100% os valores médios da absorbância dos controles.
Os relaxamentos induzidos pelo VT e FAE no LAM, foram apresentados como
porcentagem de relaxamento em relação à contração máxima induzida pela
fenilefrina.
Nos experimentos de reatividade vascular com camundongos LDLR KO, os
efeitos induzidos pela fenilefrina e pela acetilcolina, foram expressos pelos
respectivos valores de contração e relaxamentos promovidos pelos agonistas, em
gramas. As CI
50
(concentrações inibitórias que promoveram 50% dos relaxamentos
máximos obtidos) e as CE
50
(concentrações efetivas que promoveram 50% da
contração máxima do agonista), foram apresentadas como médias geométricas,
acompanhadas de seus respectivos limites de confiança para 95% (Fleming et al,
1972). Os relaxamentos máximos (R
máx
) e as contrações máximas (E
máx
) foram
apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Nas dosagens
bioquímicas (CT, TAG e LPs), os resultados foram expressos em mg/dL.
A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando-se o teste t de
Student para amostras não pareadas (Snedecor e Cochram, 1967), ou a análise de
variância (ANOVA), seguida pelos testes de Dunnett ou Tukey como ANOVA-post
test, para experimentos com mais de duas amostras. As diferenças ponto-a-ponto
entre os valores experimentais obtidos com diferentes grupos, que apresentaram
níveis de probabilidade iguais ou menores do que 5 % (p<0,05), foram consideradas
estatisticamente significantes.
4. RESULTADOS
4.1. Ensaios Bioquímicos
4.1.1. Ensaio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC):
Todos os compostos fenólicos que foram investigados neste ensaio estão
relacionados na Tabela 2. De acordo com a referida tabela, os ácidos cinâmico e
clorogênico foram encontrados em todas as amostras analisadas, ambos em altas
concentrações, principalmente na FAE. As amostras de VT e VB destacaram os
ácidos protocatêico e cinâmico como principais componentes, chamando a atenção
também para a quercetina, a qual em VT, obteve uma concentração de cerca de 4
vezes superior à concentração detectada em VB.
O HPLC da FAE detectou o ácido gálico como o principal componente da
amostra, seguido dos ácidos cinâmico e clorogênico. No entanto, cabe ressaltar que
em todas as amostras testadas, tivemos um interesse particular na detecção do
trans-resveratrol, o qual foi detectado em pequenas concentrações na FAE e SU.
Similar ao HPLC da FAE, o ácido gálico também foi o componente de maior
concentração no SU, seguido do ácido p-cumárico. Com relação ao trans-resveratrol
presente no SU, assim como na FAE, foi detectada novamente uma pequena
concentração deste stilbeno na amostra do SU. No entanto, tal concentração foi
bastante superior à FAE, acenando para a possibilidade da utilização do suco de
uva como fonte de trans-resveratrol, sem as consequências deletérias à saúde
humana, promovidas pelo uso do álcool presente em bebidas fermentadas como o
vinho.
4.1.2. Estudo da atividade antioxidante
4.1.2.1. Capacidade seqüestradora do radical ânion superóxido (O
2
_ .
) :
No sistema fenazina/metasulfato/NBT, na concentração de 0,1 µg/mL, VT e
principalmente a FAE (Figura 1A), inibiram significativamente a redução do NBT pelo
O
2
-.
. De acordo com a Tabela 3, a FAE demonstrou ainda o menor valor de CI50 e
IC 95%. De acordo com esses resultados, tanto VT quanto a FAE demonstraram
uma maior capacidade sequestradora do radical ânion superóxido (O
2
-.
), quando
comparados às demais amostras testadas.
Neste ensaio, a enzima superóxido dismutase (SOD, 100 U/mL) foi utilizada
como controle positivo, sendo que a inibição da redução do NBT obtida foi de 75,0 ±
2,3 %.
4.1.2.2. Ensaio da degradação da desoxirribose (capacidade seqüestradora do
radical OH
.
):
As amostras de VT, VB, FAE e SU também foram avaliadas com relação à
sua capacidade seqüestradora de radicais hidroxila e/ou de quelar metais como o
ferro. O ensaio da desoxirribose mostrou que, muito embora VB e SU não tenham
sido muito efetivos nem na maior concentração utilizada (0,03 µg/mL) , VT e FAE
inibiram a degradação da desoxirribose desde a baixa concentração de 0,003
µg/mL (Figura 1B). Todas as amostras testadas apresentaram uma inibição dose
dependente da degradação da desoxirribose. Com relação aos valores de CI50,
novamente a FAE foi mais potente que VT (Tabela 3).
O manitol (250 mM) foi utilizado como controle positivo deste ensaio e a
inibição obtida foi de 85,6 ± 3,5 %.
4.1.2.3. Ensaio da Peroxidação Lipídica (capacidade seqüestradora do radical
LOO
.
):
As amostras de VT, VB, FAE e SU foram ainda avaliadas com relação a
capacidade de inibir a lipoperoxidação induzida pelo peróxido de t-butila em
homogenatos de fígado de ratos (Figura 1C). Neste ensaio, VT inibiu de forma
concentração-dependente, a peroxidação lipídica. Por outro lado, a FAE protegeu
contra a lipoperoxidação, em todas as concentrações utilizadas (Figura 1C). VB e
SU não promoveram uma significativa inibição da peroxidação lipídica, nem mesmo
na maior concentração utilizada no ensaio (1,0 µg/mL).
O controle positivo utilizado neste protocolo foi o BHT (10 mM) e a inibição
correspondeu a 96,0 ± 0,3 %.
Tabela 2: Compostos majoritários (µg/mL) encontrados no vinho tinto (VT), vinho
branco (VB), fração acetato de etila (FAE) e suco de uva (SU). Dados obtidos no
ensaio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).
COMPOSTOS VT VB FAE SU
Ácido protocatêico
48,92
0,38 * 2,34
Ácido clorogênico
17,88
0,27 43,24 4,87
Ácido cafêico
13,64
--- * 0,76
Ácido gálico
*
1,46 83,21 40,0
Ácido cinâmico
15,56
12,17 57,97 1,84
Ácido p-cumárico
7,42
--- 22,81 8,40
Ácido m-cumárico
* --- 16,27 ---
Quercetina
30,71 7,12 14,36 ---
Hidroquinona
21,22 --- 9,81 1,29
t- resveratrol
* --- 0,32 0,80
Epicatequina
--- --- --- 3,99
* O composto está presente mas não foi possível quantificar.
Figura 1: Curvas concentração-resposta dos efeitos inibitórios sobre a redução do NBT (A),
degradação da desoxirribose (B) e peroxidação lipídica (C), conferida pelas amostras de VT,
VB, SU e FAE. Cada ponto representa a média ± E.P.M de 03 experimentos (em triplicata).
* p<0,05; **p<0,01 em relação a 100% de redução do NBT, degradação da desoxirribose e
peroxidação lipídica, respectivamente (ANOVA/Dunnet).
0.30.030,03 0.10,1 0.30,3 1.01,0
0
15
30
45
60
75
90
105
120
VT
VB
SU
FAE
**
**
**
**
**
**
**
µg/mL
Redução do NBT (%)
( A )
0.0010,001 0.0030,003 0.010,01 0.030,03
0
15
30
45
60
75
90
105
120
VT
VB
SU
FAE
**
**
**
**
**
**
**
*
**
**
**
*
µg/mL
Degradação da
Desoxirribose (%)
( B )
0.30.030,03 0.10,1 0.30,3 1.01,0
0
15
30
45
60
75
90
105
120
VT
VB
SU
FAE
**
**
**
**
**
**
**
**
**
*
µg/mL
Peroxidação Lipídica
(%)
( C )
Tabela 3: Valores de CI50, respectivos intervalos de confiança e Inibição Máxima
(%) de VT e FAE nos ensaios bioquímicos referentes ao estudo da atividade
antioxidante.
Amostras NBT DESOXIRRIBOSE PEROX. LIPÍDICA
VT
0,36 (0,30-0,43) µg/mL
74,0 ± 1,3 %
3,27 (2,22-4,81) ng/mL
78,3 ± 1,3 %
0,16 ( 0,15-0,17) µg/mL
94,0 ± 0,6 %
FAE
0,25 (0,09-0,68) µg/mL
85,0 ± 8,40 %
2,15 (1,51-3,06) ng/mL
74,6 ± 1,2 %
< 0,03 µg/mL
≅ 100 %
4.2. Protocolos Experimentais Farmacológicos
4.2.1. Reatividade Vascular em anéis de aorta torácica de ratos Wistar
normotensos:
O gráfico da figura 2 ilustra os primeiros experimentos de reatividade vascular
realizados com a FAE. De acordo com a CCRc obtida em anéis de aorta, podemos
verificar que a FAE começou a relaxar as preparações apenas nas maiores
concentrações, ou seja, somente a partir de 100 µg/mL. Os valores de CI50 + IC95%,
seguido do relaxamento máximo (Rmáx), obtidos foram: 502,34 (257,5 - 980,0) µg/mL;
Rmáx= 40,54 ± 3,45.
10 30 100 300 1000 3000
0
25
50
FAE
FAE [µg/mL]
Relaxamento máximo (%)
Figura 2: Curva concentração-resposta cumulativa à Fração Acetato de Etila - FAE (10 - 3000
µg/mL), em anéis de aorta torácica de ratos normotensos. Cada ponto representa a média ±
EPM de 10 experimentos.
4.2.2. Reatividade Vascular em Leito Arterial Mesentérico (LAM) de ratos
normotensos:
Na figura 3 estão representadas as CCR ao VT e à FAE no leito arterial
mesentérico. De acordo com a figura 3 e valores da Tabela 4, podemos verificar que a
FAE foi mais eficiente em diminuir a pressão de perfusão das preparações, quando
comparada com VT, principalmente nas concentrações de 100 e 1000 µg/mL. A partir
destes resultados, passamos a testar a FAE na presença de diferentes drogas e soluções.
Na figura 4, temos as CCR à FAE, na presença do inibidor da enzima óxido
nítrico sintase (NOS), o Nω-nitro-L-arginina (L-NOARG, 100 µM), o qual foi utilizado
individualmente e em conjunto com Krebs-despolarizante (KCl) 40 mM. O ODQ (10 µM),
inibidor da enzima guanilato ciclase, também foi utilizado individualmente para investigar a
efetiva participação da via L-arginina/NO no efeito da FAE. Além disso, realizamos CCRs
à FAE na presença individual de uma alta concentração de potássio, através da perfusão
de KCl 80 mM.
Conforme podemos observar, a CCR à FAE na presença do KCl 80 mM, foi
significativamente deslocada para a direita, quando comparada com a curva controle à
FAE. Além disso, a presença simultânea de KCl e L-NOARG no líquido de perfusão, fez
com que o deslocamento da CCR à FAE para a direita fosse ainda mais evidente; esse
efeito é claramente evidenciado através dos valores de CI50 e Rmáx. da Tabela 4.
Assim como o L-NOARG, a perfusão de ODQ também promoveu o
significativo deslocamento da CCR à FAE para a direita.
Figura 3: Curvas concentração -resposta ao VT e a Fração Acetato de Etila - FAE
(30 - 3000 µg, bolus), em leito arterial mesentérico de ratos normotensos. Cada ponto
representa a média ± EPM de 5 a 6 experimentos. *p<0,05; **p<0,01 indicam diferença
significativa entre VT e FAE (teste t não pareado).
30 100 300 1000 3000
50
100
75
25
0
VT
FAE
*
**
Amostras do Vinho [µg]
Pressão de Perfusão (%)
Figura 4: Curvas concentração -resposta à Fração Acetato de Etila - FAE ( 30 - 3000 µg, bolus),
na ausência e na presença de L-NOARG e diferentes concentrações de Krebs Despolarizante
(KCl), em leito arterial mesentérico de ratos normotensos. Cada ponto representa a média ± EPM
de 5 a 6 experimentos. **p<0,01; ***p<0,001 indicam diferença significativa contra o grupo controle
FAE (Controle).
30 100 300 1000 3000
50
100
75
25
0
+ KCl 80
+ L-NOARG 100 µM
+ KCl 40 + L-NOARG 100 µM
Controle
***
**
***
***
***
***
***
**
**
+ ODQ 10 µM
*
***
FAE [µg]
Pressão de Perfusão (%)
Figura 5: Curvas concentração-resposta à Fração Acetato de Etila - FAE ( 30 - 3000 µg,
bolus), na ausência e presença de diferentes drogas atuantes sobre canais de K
+
, em leito
arterial mesentérico de ratos normotensos. Cada ponto representa a média ± EPM de 5 a 6
experimentos. *p<0,05; **p<0,01 indicam diferença significativa contra o grupo controle FAE
(Controle). #p<0,05; indica diferença significativa entre os grupos (BaCl
2
) X (BaCl
2
+ OUA);
ANOVA/Tukey.
Tendo em vista que nossos resultados, utilizando diferentes concentrações de KCl,
apontaram uma possível influência de canais de potássio sobre a diminuição da pressão
de perfusão induzida pela FAE, investigamos subseqüentemente o efeito desta fração na
presença de diferentes drogas que atuam sobre estes canais. Na Figura 5A, temos as
CCR à FAE, na presença de Glibenclamida (inibidor de canais de potássio dependentes
de ATP); de Ouabaína (inibidor da bomba de Na
+
/K
+
-ATPase e de Tetraetilamônio
(inibidor não seletivo de canais de K
+
). De acordo com esta figura e Tabela 4, a
glibenclamida não alterou a pressão de perfusão induzida pela FAE. Com relação ao
R
máx
, adicionando glibenclamida à solução de perfusão, novamente obtivemos um valor
de relaxamento máximo muito próximo à CCR controle da FAE. Com relação às demais
drogas atuantes nos canais de K
+
, a ouabaína e o tetraetilamônio promoveram
significativos deslocamentos de suas respectivas CCR, para a direita (Figura 5A). Os
valores da Tabela 4 ratificam a ilustração da Figura 5A , uma vez que a CCR à FAE na
presença de ambas as drogas (ouabaína e tetraetilamônio), resultou em valores de CI50
superiores e Rmáx inferiores, quando comparados à CCR controle da FAE. Na figura 5B
estão representadas as CCR à FAE, na ausência e presença de bário (droga inibidora
dos canais de potássio retificadores para influxo - K
IR
), bem como na presença de bário e
ouabaína, na mesma perfusão. De acordo com a figura 5B e tabela 4, a inibição
simultânea dos canais K
IR
e da bomba de Na
+
/K
+
-ATPase também promoveu um
significativo deslocamento da CCR da FAE para a direita.
Tomando como base os valores encontrados na Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (Tabela 2), procuramos investigar o efeito isolado de alguns
compostos majoritários encontrados na FAE, sobre o Leito Arterial Mesentérico
isolado. As CCR obtidas e demonstradas na Figura 6, revelam que, com exceção da
quercetina que promoveu um discreto relaxamento nas maiores doses, nenhum dos
ácidos fenólicos utilizados, nem mesmo o resveratrol, tiveram a capacidade de
diminuir a pressão de perfusão no LAM.
Com o objetivo de verificar o efeito de uma droga conhecida sobre o LAM, o
agonista colinérgico muscarínico - acetilcolina - foi utilizado como controle positivo e
administrado antes da realização das CCR à FAE. O histograma da Figura 7
demonstra o efeito da acetilcolina nos diferentes protocolos experimentais
realizados. Através destes resultados, constatamos que a acetilcolina, efetivamente
diminui a pressão de perfusão do LAM. Além disso, assim como vários trabalhos
descritos na literatura, nossos resultados também evidenciaram que o efeito deste
agonista parece ser mediado preferencialmente via modulação de canais de
potássio/EDHF do que via modulação do óxido nítrico (Figura 7).
Figura 6: Curvas concentração-resposta à diferentes compostos majoritários presentes na
FAE (1 nmol - 300 nmol, bolus), em leito arterial mesentérico de ratos normotensos. Cada
ponto representa a média ± EPM de 6 a 8 experimentos.
300100301031
-15
0
15
30
45
60
ácido gálico
ácido cinâmico
ácido clorogênico
quercetina
resveratrol
Compostos isolados [nmol]
Redução da Pressão de Perfusão
(%)
Figura 7: Histograma representando o relaxamento do leito arterial mesentérico de ratos
normotensos, induzido pela Acetilcolina (200 nmol, bolus). * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 indicam
diferença significativa contra o grupo controle. Cada ponto representa a média ± EPM de 4 a 6
experimentos (ANOVA/Tukey).
0
20
40
60
80
100
120
Controle
+ L-NOARG
+ ODQ
+ KCl40 + L-NOARG
+ KCl 80
+ BaCl
2
+ BaCl
2
+ OUA
+ ChTx + Apamina
+ GLI
+ OUA
+ TEA
**
**
***
***
*
Acetilcolina [200 nmol]
Diminuição da Pressão de
Perfusão (%)
Tabela 4: Valores de CI50, intervalos de confiança (95%) e relaxamentos máximos
(Rmáx), induzidos por VT e FAE, na ausência e na presença de diferentes soluções e
drogas, em leito arterial mesentérico de ratos Wistar normotensos.
Grupo
CI50 ( a )
( µg )
Rmáx ( b )
( % )
VT 891,25 (538,10 - 1475,70) ***
78,40 ± 3,67
FAE (Controle) 390,84 (252,27 - 605,53)
81,88 ± 4,04
+ KCl 40 mM +
L-NOARG)
1059,25 (906,06 - 1238,34) ***
49,68 ± 1,69 ***
+ KCl 80 mM 767,36 (457,35 - 1287,49) ***
61,11 ± 3,64**
+ L-NOARG 736,20 ( 330,17 - 1641,53)***
70,57 ± 4,38
+ ODQ 881,04 (370,13 – 2097,20)***
83,71 ± 3,62
+ GLI 252,34 (128,77 - 494,51)
82,01 ± 6,05
+ OUA 665,27 (474,14 - 933,45) ***
64,29 ± 1,80*
+ BaCl
2
638,26 (275,43 - 1479,02) ***
86,53 ± 1,96
+ BaCl
2
+ OUA 743,02 (312,70 - 1765,51) ***
71,16 ± 5,64
+ TEA 851,13 (543,30 - 1333,80) ***
68,60 ± 4,92
+ ChTx + Apamina 421,70 (210,71 – 843,94)
98,01 ± 6,45
( a ): CI50 é apresentada como média geométrica acompanhada pelo seu limite de confiança de
95%. ***p< 0,001 indicam diferenças significativas com relação ao grupo FAE (Controle).
ANOVA/Tukey.
( b ): Rmáx é apresentado como média ± EPM, referente ao percentual de relaxamento
máximo das preparações. *p<0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001 indicam diferenças significativas
com relação ao grupo FAE (Controle). ANOVA/Tukey.
4.3. Protocolos experimentais realizados com camundongos LDLR KO
4.3.1. Parâmetros Fisiológicos - Peso e Ingesta Alimentar
Os histogramas da Figura 8 (A e B) demonstram, respectivamente, as médias
e E.P.M. observados com relação a ingesta alimentar e ao peso dos camundongos LDLR
KO, ao longo dos três meses de tratamento. De acordo com o histograma da figura 8A,
nos dois primeiros meses de tratamento, não ocorreram diferenças significativas entre os
grupos que receberam a dieta hipercolesterolêmica. Por outro lado, no terceiro mês de
tratamento, o grupo FAE 3 e o grupo CP ingeriram uma quantidade maior de alimento,
quando comparados ao CCD.
Em relação ao peso dos animais (Figura 8B), podemos verificar que a dieta
hipercolesterolêmica foi efetiva, no sentido de que os animais do grupo CCD aumentaram
de peso nos dois últimos meses, quando comparados ao grupo CSD. A figura 8B mostra
ainda que, ao contrário do grupo CP, o grupo FAE 3 apresentou queda no peso em
relação ao grupo CCD. Neste sentido, é importante ressaltar que, embora a média de
peso do grupo FAE 3 tenha sido menor quando comparada ao grupo CCD, o grupo FAE 3
não perdeu peso ao longo dos três meses de tratamento com a dieta
hipercolesterolêmica.
Figura 8: Histogramas representando a variação dos parâmetros fisiológicos - Ingesta alimentar
(A) e Peso (B) dos camundongos LDLR KO (N = 5 - 6). * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
(ANOVA/Dunett). CSD = controle sem dieta; CCD= controle com dieta; FAE 3= tratado 3 mg/kg;
FAE 10= tratado 10 mg/kg CP= controle positivo (sinvastatina 1 mg/kg).
0
1
2
3
4
CSD
CCD
FAE 3
CP
1º Mês 2º Mês 3º Mês
( A )
*
*
Ingesta Alimentar (g)
0
10
20
30
40
CSD
CCD
FAE 3
CP
( B )
1º Mês 2º Mês
3º Mês
Peso ds animais (g)
**
***
*
**
***
**
**
***
4.3.2. Dosagem de colesterol total (CT), triacilglicerol (TAG) e Lipoproteínas (LPs -
VLDL, LDL, HDL):
Os histogramas da Figura 9 (A e B), demonstram os resultados obtidos nas
dosagens de CT e TAG. Com relação à dosagem de CT , os grupos que receberam ração
padrão normal, ou seja, os grupos CSD e SD+FAE, tiveram os níveis de CT
significativamente reduzidos ao final dos três meses de tratamento. No entanto, é
importante ressaltar que o FAE 3, o qual recebeu dieta hipercolesterolêmica, idêntica ao
grupo CCD, obteve um índice de CT significativamente inferior quando comparado ao
CCD (Figura 9A).
Em relação à dosagem do TAG, todos os grupos tiveram seus níveis
significativamente reduzidos ao final do tratamento (Figura 9B).
Na Figura 10 estão representados os valores obtidos com as dosagens de LPs. Com
relação à dosagem de LDL (Figura 10A) , os resultados foram semelhantes aos obtidos
na dosagem do CT, ou seja, além dos grupos que receberam a dieta padrão, somente o
FAE 3 teve seus níveis de LDL diminuídos ao final do tratamento de três meses. Na
dosagem do VLDL, por outro lado, todos os grupos com dieta normal e também os grupos
que receberam a FAE nas diferentes concentrações, tiveram os níveis dessa LP
diminuídos (Figura 10B). Finalmente, visto que a HDL em camundongos LDLR KO
apresenta valores de referência desejáveis por volta dos 90 mg/dL, todos os grupos
tiveram os valores dessa lipoproteína sensivelmente aumentados (Figura 10C).
Figura 9: Histogramas representando as médias (mg/dL) ± E.P.M. das dosagens de colesterol
total (A) e triacilglicerol (B), realizadas nos diferentes grupos experimentais de camundongos
LDLR KO. **p < 0,01(ANOVA/Dunnett).Cada barra representa a média ± E.P.M. de 3 a 6
dosagens. CSD= controle sem dieta; CCD= controle com dieta; SD+FAE= controle sem dieta +
FAE 30 mg/kg; FAE 3= tratado 3 mg/kg; FAE 10= tratado 10 mg/kg; FAE 30= tratado 30mg/kg;
CP= controle positivo (sinvastatina 1 mg/kg).
CSD CCD SD+FAE FAE 3 FAE 10 FAE 30 CP
0
250
500
750
1000
1250
( A )
**
**
**
Colesterol total (mg/dL)
CSD CCD SD+FAE FAE 3 FAE 10 FAE 30 CP
0
100
200
300
400
500
600
**
**
**
**
**
**
Triacilglicerol (mg/dL)
( B )
Figura 10: Histogramas representando as médias (mg/dL) ± E.P.M. das dosagens de LDL
(A), VLDL (B) e HDL (C), realizadas nos diferentes grupos experimentais de camundongos
LDLR KO. * p <0,05; **p<0,01 (ANOVA/Dunnett). Cada barra representa a média ± E.P.M.
de 3 a 6 dosagens. CSD= controle sem dieta; CCD= controle com dieta; SD+FAE= controle
sem dieta + FAE 30 mg/kg; FAE 3= tratado 3 mg/kg; FAE 10= tratado 10 mg/kg; FAE 30=
tratado 30mg/kg; CP= controle positivo (sinvastatina 1 mg/kg).
CSD CCD SD+FAE FAE 3 FAE 10 FAE 30 CP
0
250
500
750
1000
**
**
*
( A )
LDL (mg/dL)
CSD CCD SD+FAE FAE 3 FAE 10 FAE 30 CP
0
25
50
75
100
125
VLDL (mg/dL)
**
**
**
**
*
( B )
CSD CCD SD+FAE FAE 3 FAE 10 FAE 30 CP
0
50
100
150
200
*
( C )
HDL (mg/dL)
4.3.3. Reatividade Vascular: Preparações isoladas de aorta torácica:
As Figuras 11 e 12 ilustram os resultados obtidos na reatividade vascular dos
camundongos LDLR KO. De acordo com a Figura 11, o agonista α-adrenérgico -
Fenilefrina - promoveu seu efeito dependente da concentração, formando CCR
cumulativas. Embora neste tipo de preparação a resposta ao agonista seja bem inferior a
outros tipos de preparação - como por exemplo em aorta torácica de rato - podemos
observar claramente que o efeito contrátil da fenilefrina foi melhor evidenciado nos grupos
CSD, CSD + FAE, FAE 3 e CP. Tal efeito também pôde ser constatado com relação à
contração das preparações onde mais uma vez os mesmos grupos mencionados
anteriormente, foram os que apresentaram um maior efeito máximo (Tabela 5).
Na Figura 12 estão representadas as CCRc ao agonista colinérgico muscarínico - a
Acetilcolina . De acordo com nossos resultados, o agonista promoveu um maior
relaxamento nos grupos experimentais CSD, FAE 3 e CP. Aqui também é importante
ressaltar que, assim como nos experimentos com a fenilefrina, o menor valor de CI50 não
está necessariamente relacionado ao maior efeito de relaxamento. Um exemplo claro
pode ser evidenciado na Tabela 6, onde o CCD indicou um valor de CI50 dentro da faixa
de outros grupos experimentais mas, em contrapartida, promoveu o menor efeito máximo
(0,068 ± 0,018 g). Conforme a Tabela 6, não foi possível determinar os valores de CI50 e
IC 95% para o grupo FAE 30, uma vez que os relaxamentos obtidos não foram
dependentes da concentração do agonista.
Figura 11: Curvas concentração-resposta cumulativas à fenilefrina (1nM - 3µM), em anéis
de aorta torácica de camundongos LDLR KO. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 4
a 9 experimentos. (A): CSD= controle sem dieta; CCD=controle com dieta; SD+FAE=
controle sem dieta + FAE 30 mg/kg; CP= controle positivo (sinvastatina 1 mg/kg). (B): CSD,
CCD, FAE 3= tratado 3 mg/kg; FAE 10= tratado 10 mg/kg; FAE 30= tratado 30mg/kg.
6.07.08.09.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
CSD
CCD
SD + FAE
CP
( A )
Fenilefrina - log [M]
Efeito máximo (g)
6.07.08.09.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
CSD
CCD
FAE 3
FAE 10
FAE 30
Fenilefrina - log [M]
Efeito máximo (g)
( B )
Tabela 5: Valores de CI50, intervalos de confiança (95%) e efeitos máximos (Emáx),
induzidos pela fenilefrina (1 nM - 3 µM), em preparações isoladas de aorta torácica de
camundongos LDLR KO.
Grupo Experimental
CI50 ( a )
( nM )
Emáx ( b )
( g )
CSD 10,0 ( 6,0 - 17,0 )
0,32 ± 0,049***
CCD
16,0 ( 5,0 - 52,0 )
0,12 ± 0,023
SD + FAE 7,0 ( 2,0 - 17,0 )
0,40 ± 0,046***
FAE 3 30,0 ( 5,0 - 166,0 )
0,31 ± 0,039**
FAE 10 26,0 ( 9,0 - 78,0 )
0,176 ± 0,029
FAE 30 55 ( 17,0 - 174,0 )
0,165 ± 0,023#
CP 20,0 ( 8,0 - 47,0 )
0,266 ± 0,048
( a ) CI50 é apresentada como média geométrica acompanhada pelo seu limite de confiança
de 95%.
( b ) Emáx é apresentado como média ± E.P.M., referente a contração máxima das
preparações, em gramas. **p< 0,01; ***p< 0,001 indicam diferenças significativas com
relação ao CSD. #p<0,05 indica diferença significativa com relação ao FAE 3
ANOVA/Tukey.
Figura 12: Curvas concentração-resposta cumulativas à acetilcolina (1nM - 3µM), em anéis
de aorta torácica de camundongos LDLR KO. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 4
a 9 experimentos. (A): CSD= controle sem dieta; CCD=controle com dieta; SD+FAE=
controle sem dieta + FAE 30 mg/kg; CP= controle positivo (sinvastatina 1 mg/kg). (B): CSD,
CCD, FAE 3= tratado 3 mg/kg; FAE 10= tratado 10 mg/kg; FAE 30= tratado 30mg/kg.
6.07.08.09.0
0.0
0.1
0.2
0.3
CSD
CCD
SD + FAE
CP
Acetilcolina - log [M]
Relaxamento máximo (g)
( A )
6.07.08.09.0
0.0
0.1
0.2
0.3
CSD
CCD
FAE 3
FAE 10
FAE 30
( B )
Acetilcolina - log [M]
Relaxamento máximo (g)
Tabela 6: Valores de CI50, intervalos de confiança (95%) e relaxamentos máximos
(Rmáx), induzidos pela acetilcolina (1 nM - 3 µM), em preparações isoladas de aorta
torácica de camundongos LDLR KO.
Grupo Experimental
CI50 ( a )
( nM )
Rmáx( b )
( g )
CSD 38,0 ( 0,6 - 2340 )
0,23 ± 0,057
CCD 30,0 ( 6,0 - 137,0 )
0,068 ± 0,018
SD + FAE 36,0 ( 9,0 - 142,0 )
0,19 ± 0,043
FAE 3 21,0 ( 7,0 - 58,0 )
0,18 ± 0,026
FAE 10 10,0 ( 4,0 - 24,0 )
0,11 ± 0,017
FAE 30 *
0,12 ± 0,08
CP 33,0 ( 5,0 - 211,0 )
0,20 ± 0,040
( a ) CI50 é apresentada como média geométrica acompanhada pelo seu limite de confiança
de 95%.
( b ) Rmáx é apresentado como média ± E.P.M., referente ao relaxamento máximo das
preparações, em gramas.
* não foi possível determinar.
Discussão
___________________________________________________________________
5. DISCUSSÃO
5.1. Ensaios para determinar a atividade antioxidante
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são constantemente geradas sob
condições fisiológicas como consequência do metabolismo aeróbico. As EROs
caracterizam-se por serem espécies em frequente transição, altamente reativas e
promovendo efeitos deletérios ao DNA, proteínas, carbohidratos e lipídeos. O
estresse oxidativo, diretamente relacionado ao desequilíbrio entre a produção e
destruição das EROs, está implicado em muitas patologias, como o Mal de
Alzheimer, Aids, Mal de Parkinson e aterosclerose (Yoshikawa et al, 2000; Curtin et
al, 2002).
Os ensaios bioquímicos para avaliar o poder antioxidante, ponto de partida
deste trabalho, foram realizados com o objetivo de verificar primariamente a
capacidade scavenger das amostras de VT, VB, SU e FAE.
No sistema fenazina/metasulfato/NBT, VT e FAE foram mais efetivos em inibir
a redução do NBT, quando comparados com VB e SU (Figura 1A). A inibição da
redução do NBT reflete, de maneira indireta, a capacidade destas amostras em
sequestrar o radical ânion superóxido (O
2
-.
). A importância da descoberta de
substâncias capazes de neutralizar o O
2
-.
reside no alto poder deste radical em gerar
outras espécies reativas. Nos sistemas biológicos, o O
2
-.
reage rapidamente com o
NO, gerando peroxinitrito (ONOO
-
), o qual, sendo mais reativo que o NO e o O
2
-.
,
tem sido implicado na patofisiologia de inúmeras doenças como a aterosclerose,
artrite reumatóide e a síndrome da distrofia respiratória (Demiryurek et al, 1998;
Persinger et al, 2002).
Para investigar o efeito de VT, VB, SU e FAE sobre os radicais hidroxila (
.
OH)
e peroxila (LOO
.
), foram realizados dois tipos de ensaios, a saber: o ensaio da
desoxirribose foi realizado para verificar se as amostras seriam capazes de proteger
um carbohidrato - a desoxirribose - da oxidação promovida pelo radical gerado no
sistema, o
.
OH; o ensaio envolvendo o homogenato de fígado foi realizado para
verificar o efeito das amostras sobre a oxidação de lipídeos. De acordo com nossos
resultados, tanto os extratos quanto a fração promoveram uma inibição da
degradação da desoxirribose, com valores inferiores a 0,003 µg/mL (Figura 1B).
Com relação aos valores de CI50, a FAE obteve o melhor resultado, seguida de VT
(Tabela 3).
O efeito de VT e FAE sobre o radical hidroxila vai ao encontro de dados da
literatura. De acordo com Rice Evans e Miller (1996), em soluções aquosas,
amostras contendo o maior número de compostos fenólicos contendo grupamentos
OH, são mais efetivas quanto à sua capacidade antioxidante. Além da capacidade
de seqüestrar EROs, a atividade antioxidante dos compostos fenólicos neste ensaio,
pode ainda ser atribuída à sua capacidade de quelar metais de transição (Rodrigo e
Rivera, 2002). Neste contexto, Sestilli e colaboradores mostraram que, em baixas
concentrações, determinados componentes polifenólicos são capazes de quelar
metais como por exemplo, o ferro (Sestilli et al., 2002).
O poder antioxidante de VT, VB, SU e FAE também diminuiu a peroxidação
lipídica, induzida pelo peróxido de t-butila (Figura 1C). De acordo com a Tabela 2, a
FAE apresenta componentes fenólicos, os quais apresentam somente uma hidroxila
ligada ao anel aromático, como os ácidos cinâmico e p-cumárico. Se relacionarmos
as estruturas destas moléculas com sua capacidade scavenger e atividade
antioxidante, estes compostos oferecem pouca proteção contra as EROs (Galato et
al, 2001). No entanto, a FAE também apresenta uma significativa variedade de
compostos polihidroxilados, dentre eles o ácido gálico, o ácido clorogênico e a
quercetina, o que justifica o alto poder antioxidante da fração do vinho. Alguns
estudos têm reportado que determinados compostos fenólicos, como a quercetina e
o ácido clorogênico, têm alto poder antioxidante, sendo tal atividade superior ao
Trolox, um análogo solúvel da vitamina E (Lotito and Frei, 2004). Ainda com relação
à quercetina, a estrutura química deste flavonóide permite que este facilmente doe
elétrons ao meio, tendo portanto, um dos requisitos indispensáveis a um agente
antioxidante (Pekkarinen et al, 1999; Sestili et al, 2002; Drummen et al, 2004).
É importante ressaltar que todos os compostos majoritários de maior
interesse, ou seja, compostos que, de acordo com a literatura, apresentam maiores
propriedades antioxidantes, foram encontrados em quantidades bastante superiores
em VT, quando comparados à VB (Tabela 2). Tais resultados explicam o fato das
propriedades antioxidantes de VT serem muito superiores à VB. De acordo com os
resultados obtidos nos ensaios bioquímicos realizados para determinar a atividade
antioxidante, as amostras de VT e FAE foram as que apresentaram uma maior ação
seqüestradora de EROs. Tais resultados estão diretamente relacionados aos dados
obtidos na cromatografia líquida (HPLC), a qual demonstrou que VT e FAE
apresentam uma maior diversidade e concentração de compostos fenólicos, quando
comparados com VB e SU (Tabela 2).
Na última década, muitos estudos têm apontado o t-resveratrol como um
importante metabólito secundário de vinhos tintos, com relevante ação na doença
arterial coronária, principalmente por proteger a LDL contra a oxidação (Maraschin
et al, 2000; Maraschin et al, 2001). Embora alguns estudos atribuam parcialmente
este efeito ao álcool presente nos vinhos, outros autores apresentaram claras
evidências da bioatividade do resveratrol (Bhat et al, 2001).
O HPLC das amostras testadas (Tabela 2), mostrou que a FAE (0,32 µg/mL)
e o SU (0,80 µg/mL), apresentam maiores concentrações de t-resveratrol quando
comparadas com vinhos tintos como o Cabernet Sauvignon (0,09 µg/mL – Vitis
vinifera) e o Pinot Noir (0,21–0,23 µg/mL – Vitis vinifera) ambos produzidos na
California, EUA (Lamuella-Raventós et al, 1993).
A atividade antioxidante de derivados fenólicos e flavonóides derivados de
plantas e alimentos tem sido vastamente reportada na literatura (Krings and Berger
2001; McDonald et al, 2001; Schuldt et al, 2004). Nesta primeira etapa do trabalho,
verificamos que as amostras de VT, SU e FAE apresentaram uma significativa
atividade antioxidante, visto que as mesmas foram capazes de proteger a
desoxirribose e o homogenato de fígado do dano oxidativo, sendo também capazes
de inibir a redução do NBT, induzida pelo radical ânion superóxido (O
2
-.
). Dentre as
amostras que promoveram maior proteção contra as EROS, a FAE, obtida a partir do
extrato dealcoolizado (VT), foi eleita para os experimentos subseqüentes.
5.2. Reatividade vascular em aorta torácica e leito arterial mesentérico de
ratos
A natureza dinâmica dos vasos sanguíneos - que a muito tempo deixaram de
ser encarados como meros condutores de oxigênio e nutrientes para órgãos e
tecidos - evidencia claramente que o sistema circulatório é o mais ativo e reativo dos
sistemas fisiológicos.
O endotélio vascular exerce uma importante influência na modulação da
vasodilatação. Este processo é mediado via liberação de óxido nítrico, produção de
prostaciclinas e ainda através de um terceiro e importante mecanismo, resistente a
inibição simultânea de análogos da NOS e ciclooxigenase, que exerce seu efeito
vasodilatador através de uma hiperpolarização sensível a altas concentrações de
potássio (Hecker, 2000; Savage et al, 2003). Muitos pesquisadores têm assumido
uma postura cautelosa (Anderson et al, 2001; Lacy et al, 2000; Jiang and Dusting,
2001), afirmando que este terceiro mecanismo é promovido por um agente que
passaram a denominar de fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF -
endothelium-derived hyperpolarizing factor). Por outro lado, vários estudos têm
apontado o íon potássio (K
+
), como o verdadeiro responsável pelos efeitos mediados
via EDHF (Edwards et al, 1998; Hecker, 2000; Dora and Garland, 2001). Outros
autores têm ainda apontado alguns candidatos como possíveis EDHF, dentre eles,
certos metabólitos do ácido araquidônico (ácidos epoxi-eicosatrienóicos e seus
análogos - EETs); o peróxido de hidrogênio e as junções comunicantes ou "gap
junctions" (Matoba et al, 2000; Goto et al, 2000; Matoba et al, 2002). Dada a atual
controvérsia com relação à identidade do agente promovedor do relaxamento em
vasos de pequeno calibre, muitos autores têm simplesmente descrito este
mecanismo como um efeito "EDHF-like" (Coleman et al, 2001; Savage et al, 2003).
Os polifenóis, presentes em plantas de uso medicinal e também em bebidas
como a erva mate e o vinho, apresentam uma efetiva atividade vasodilatadora
(Fitzpatrick et al, 1995; Andriambeloson et al, 1997; Wazlawik et al, 1997; Schuldt et
al, 2000). Visto que a FAE é composta por uma grande mistura de ácidos fenólicos e
flavonóides aos quais são atribuídos efeitos vasodilatadores e hipotensores,
realizamos vários protocolos testando o VT e principalmente a FAE, na aorta e
também no leito arterial mesentérico (LAM) de ratos normotensos.
Na figura 2, temos os primeiros protocolos realizados com a FAE, em anéis
de aorta torácica. Visto que a FAE apresenta uma série de compostos com
conhecida atividade vasorelaxante (Duarte et al., 1993; Chen e Pace-Asciak, 1996,
Guerrero et al., 2001), esperava-se que FAE promovesse o efetivo relaxamento
destas preparações. No entanto, ao contrário do esperado, a FAE não promoveu um
relaxamento importante neste tipo de preparação isolada, nem nas maiores
concentrações utilizadas. Um dos possíveis motivos que podem explicar tal efeito,
reside no fato de a FAE apresentar uma expressiva concentração de ácido gálico
em sua composição. De acordo com a tabela 2, podemos constatar que, dentre
todos os compostos quantificados no HPLC, o ácido gálico encontra-se em maior
concentração na amostra da FAE. Neste sentido, nossos resultados vão ao
encontro de um estudo realizado por Sanae e colaboradores, o qual demonstrou que
o ácido gálico aumenta a resposta vasoconstritora da fenilefrina, além de inibir o
vasorelaxamento induzido pela acetilcolina e pelo nitroprussiato de sódio, em aorta
torácica de ratos (Sanae et al., 2002).
A partir dos resultados obtidos no vaso de condutância, passamos a
investigar o efeito de VT mas, principalmente da FAE, em vasos de pequeno calibre.
Na figura 3 estão representadas as CCR ao VT e à FAE, em leito arterial
mesentérico. Ao contrário do resultado obtido em anéis de aorta, o VT e,
principalmente a FAE, promoveram um vasorelaxamento bastante significativo
nestas preparações. A partir dos compostos majoritários de VT e da FAE
representados na tabela 2, podemos constatar que a FAE apresenta uma
concentração maior de ácidos fenólicos e flavonóides, quando comparada com VT.
Esta maior concentração de compostos possivelmente foi responsável pelo maior
relaxamento do LAM, induzido pela FAE. Em se tratando de um extrato bruto, VT
muito provavelmente apresenta certos componentes que poderiam estar interferindo
na diminuição da pressão de perfusão do LAM. Esta interferência dar-se-ía pela
presença de algum composto com atividade vasoconstritora ou ainda devido à
associação de algum composto importante para o efeito vasorelaxante, a um
polifenol, diminuindo sua atividade.
Fazendo uma análise comparativa dos efeitos da FAE na aorta e no LAM,
resolvemos dar continuidade ao nosso estudo investigando quais seriam as vias
mais relevantes em relação à atividade supra citada. Para isso, efetuamos alguns
protocolos nos quais foram realizadas CCR à FAE, na ausência e na presença de
algumas drogas e soluções inibidoras, atuantes na via L-arginina/NO e canais de
potássio.
O gráfico da figura 4, ilustra as CCR realizadas na ausência e na presença de
diferentes concentrações de K
+
. Além disso, em um dos protocolos, além da
concentração elevada de K
+
(KCl 40 mM), adicionamos ainda o L-NOARG à solução
fisiológica de Krebs despolarizante. Conforme podemos observar, a presença de
altas concentrações de K
+
causou um significativo desvio da CCR à FAE para a
direita (Tabela 4). Este efeito pôde ser ainda melhor evidenciado quando
adicionamos o L-NOARG à solução despolarizante.
Nas duas CCR acima mencionadas, podemos afirmar que a FAE promoveu
um efeito EDHF-like, pois ao adicionarmos o K
+
em grandes concentrações e
inibirmos com isso, a via EDHF, o efeito vasorelaxante da FAE tornou-se
notadamente menor (Tabela 4). No entanto, a via do NO parece também ser
importante para o efeito da FAE pois quando adicionamos o análogo da NOS, o L-
NOARG, ocorreu uma diminuição ainda maior do efeito da FAE.
De acordo com a tabela 1, a FAE é formada por vários compostos, dentre
eles ácidos fenólicos, resveratrol e flavonóides como a quercetina. Em um estudo
realizado por Martin e colaboradores (2002), o resveratrol e a quercetina foram
capazes de promover o aumento da concentração de cálcio intracelular pela inibição
das enzimas Ca
2+
-ATPases do retículo endoplasmático das células endoteliais.
Desta forma, o aumento do cálcio promoveu, em última análise, o aumento da
produção de NO nestas células, favorecendo o vasorelaxamento subsequente da
musculatura lisa. A figura 4 demonstra também as CCR à FAE, obtidas na presença
individual de L-NOARG ou ODQ, ambas drogas inibidoras da via L-arginina/NO. De
acordo com o gráfico, a via L-arginina/NO tem um papel relevante na atividade da
FAE, visto que, na presença destas drogas, ocorreu um significativo deslocamento
da CCR à FAE para a direita.
Alguns autores têm descrito a via EDHF como a via mais importante no
relaxamento de vasos de pequeno calibre. Estes mesmos estudos afirmam ainda
que as prostaciclinas e principalmente o NO desempenham um papel relativamente
menor quando comparado à via EDHF (Parkington et al, 2002; Busse et al, 2002;
Dabisch et al, 2004). Em nossos experimentos, assim como na literatura, também
evidenciamos que o relaxamento induzido pela acetilcolina, promoveu pouca
alteração quando o efeito do NO foi abolido. Por outro lado, a inibição da via EDHF,
tornou o relaxamento induzido pelo agonista subtancialmente menor quando
comparado com o controle (Figura 7). Neste contexto, analisando conjuntamente
todas as CCR à FAE da figura 4 e os relaxamentos induzidos pela acetilcolina na
figura 7, constatamos que, ao contrário do agonista muscarínico, a FAE parece
exercer sua atividade de uma forma muito mais dependente da liberação de NO.
Para uma investigação mais apurada em relação a principal via de atuação da
FAE, realizamos outros protocolos experimentais, onde as CCR à FAE foram
realizadas na ausência e presença de drogas atuantes em canais de potássio, a
saber: a glibenclamida, inibidor de canais de potássio dependentes de ATP (K
ATP
); a
ouabaína, inibidor da bomba de Na
+
/K
+
-ATPase; o tetraetilamônio (TEA), inibidor
não-seletivo de canais de potássio, o cloreto de bário, inibidor de canais de potássio
retificadores para influxo (K
IR
), a charibdotoxina (ChTx), inibidor não-seletivo de
canais de potássio ativados pelo cálcio (K
Ca
), de média e alta condutância; e a
apamina, inibidor seletivo de canais de potássio ativados pelo cálcio (K
Ca
), de baixa
condutância. Nesta etapa dos resultados, a ouabaína e o TEA, inibiram
significativamente a diminuição da pressão de perfusão induzida pela FAE (Figura
5A), efeito que pode ser confirmado pelos valores de CI50 e IC95% da Tabela 4.
Ainda de acordo com a mesma tabela, a glibenclamida não teve efeito sobre a
atividade da FAE. Em um trabalho realizado por Edwards e colaboradores, o
relaxamento atribuído ao EDHF foi significativamente inibido pela ouabaína, em
artérias mesentéricas e hepáticas de ratos. De acordo com estes autores, o efluxo
de K
+
das células endoteliais, através de canais de potássio ativados pelo cálcio
(K
ca
), estimula a hiperpolarização da musculatura lisa vascular subjacente. Esta
hiperpolarização ocorre através da ativação dos canais de potássio retificadores
para influxo (K
IR
), e da bomba de Na
+
/K
+-
-ATPase, ambos presentes nas células
lisas vasculares (Edwards et al, 1998). Alguns pesquisadores afirmam, por outro
lado, que os canais K
IR
não necessariamente estariam localizados nas células lisas
vasculares para promover a hiperpolarização. Segundo estes pesquisadores, o
efluxo de potássio via canais K
Ca
, pode ativar de maneira autócrina, os canais K
IR
presentes no endotélio. Desta forma, através de uma amplificação de sinal feita por
intermédio das junções comunicantes, a hiperpolarização das células endoteliais se
estenderia até as células lisas vasculares, promovendo a hiperpolarização destas e
consequentemente, o relaxamento dos vasos (Doughty et al, 1999; Lacy et al, 2000;
Dora and Garland, 2001; Busse et al, 2002).
Tomando como base os trabalhos supra citados, quando investigamos o
efeito da FAE na presença simultânea de cloreto de bário e ouabaína (Figura 5B),
obtivemos um valor de CI50 muito próximo ao valor obtido nos protocolos onde
utilizamos somente o krebs despolarizante, com altas concentrações de K
+
(KCl 80
mM). Tal resultado estabelece, novamente, o envolvimento da via EDHF no
vasorelaxamento induzido pela FAE.
Alguns trabalhos têm postulado que os flavonóides são capazes de abrir
canais de potássio do tipo K
Ca
(Li et al, 1997; Naderali et al, 1997). Através de um
experimento de eletrofisiologia realizado com oócitos da espécie Xenopus laevis,
certos pesquisadores verificaram que os flavonóides cujas estruturas químicas
apresentam duas hidroxilas no primeiro anel, uma hidroxila no segundo anel e ainda
um íon hidrogênio e uma hidroxila no terceiro anel, foram bastante eficazes na
abertura de canais de potássio do tipo K
ca
(Li et al, 1997). A estrutura química
apontada pelo estudo eletrofisiológico, que mais favoreceu a passagem do potássio
através dos canais K
ca
(também conhecidos como canais maxi-K
+
ou BK
ca
), é
bastante semelhante à quercetina, flavonóide presente na fração utilizada em nosso
estudo. O resveratrol promove também a abertura de canais de potássio do tipo k
ca
,
em células endoteliais humanas. O aumento do efluxo de K
+
após a ativação dos
canais K
Ca
pelo resveratrol, aumenta a concentração desse cátion no espaço
mioendotelial com consequente hiperpolarização da células lisas vasculares (Li et
al, 2000).
A partir dos estudos descritos na literatura, os quais apontam uma possível
atividade dos compostos presentes no vinho e também na FAE, sobre canais K
Ca
,
resolvemos investigar a relevância destes canais e sua relação com o mecanismo
de ação da FAE, no LAM. Neste contexto, ao contrário do esperado, não foi possível
estabelecer uma relação direta de efeito da FAE via abertura destes canais, uma vez
que a inibição dos canais K
Ca
, não impediu de forma significativa, o relaxamento
induzido pela FAE, nestas preparações (Figura 5B). O não deslocamento da CCR à
FAE para a direita, na presença de ChTx e apamina, pode ter ocorrido em função da
baixa concentração de ambos os inibidores, os quais foram administrados em
concentrações nanomolares e portanto, muito inferiores às concentrações utilizadas
para as demais drogas. No entanto, um estudo recente demonstrou que a
administração simultânea de charybdotoxina e apamina, promove uma significativa
redução da atividade vasorelaxante de um determinado extrato de vinho tinto, em
LAM de ratos; o mesmo estudo demonstrou ainda, que a administração de ambos os
inibidores, juntamente com um inibidor clássico da NOS, o L-NAME, resulta numa
potencialização deste mesmo efeito (Soares de Moura et al., 2004). Em nosso
estudo não foi possível avaliar o efeito da FAE na presença simultânea dos três
inibidores supra citados. Todavia, analisando individualmente as CCRs, obtidas na
presença de L-NOARG e/ou altas concentrações de K
+
(Figura 4), sugerimos que o
efeito da FAE possa ocorrer devido a uma combinação de diferentes mecanismos. A
FAE, por intermédio do sequestro de EROs, atuaria de forma a aumentar a
concentração e a meia vida do NO. O NO, por sua vez, sendo capaz de modular a
abertura de canais K
Ca
presentes em células endoteliais (Brakemeier et al., 2003),
atuaria de maneira autócrina sobre estes canais, favorecendo o efluxo de potássio, a
hiperpolarização das células lisas vasculares subjacentes e o subsequente
relaxamento vascular.
A Figura 6 mostra que, com exceção do discreto relaxamento induzido pela
quercetina nas maiores doses, o resveratrol e os ácidos fenólicos - ácido gálico,
cinâmico e clorogênico - não promoveram qualquer efeito vasodilatador sobre o leito
arterial mesentérico. Em relação ao ácido gálico, especificamente, chegamos até a
evidenciar um pequeno efeito contrátil do mesmo sobre as preparações testadas.
Neste contexto, muito embora a atividade vasoconstritora do ácido gálico tenha sido
verificada somente nos experimentos com o LAM, tal efeito poderia explicar, ao
menos em parte, a baixa atividade vasorelaxante da FAE, nos experimentos
realizados com preparações isoladas de aorta torácica (Figura 2). Apesar dos
ácidos fenólicos serem conhecidos devido ao seu alto poder antioxidante (pela
presença de radicais hidroxila nas moléculas), a atividade da FAE no LAM parece
estar diretamente relacionada com compostos arranjados numa configuração do tipo
C6-C3-C6, (configuração geral dos flavonóides). Além disso, não podemos descartar
que a FAE exerça sua atividade vasorelaxante através de um sinergismo químico-
farmacológico entre seus componentes.
5.3. Tratamento crônico: atividade da FAE em camundongos LDLR KO:
Muitos estudos que buscam determinar as mais variadas atividades biológicas
de polifenóis, são realizados através de ensaios in vitro, os quais necessitam,
portanto, a investigação e comprovação de efeitos através de experimentos in vivo.
Os recentes avanços das técnicas de biologia molecular têm permitido o acesso as
mais diferentes investigações, dentre elas, a utilização de modelos animais, mais
especificamente camundongos knockout, para diferentes enzimas e receptores
(Praticô et al, 2000; Zabalawi et al, 2003).
Em nosso estudo, realizamos um tratamento crônico durante um período de
doze semanas, utilizando camundongos machos C57BL/6, com ablação gênica para
receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDLR KO).
Com o objetivo de verificar se as diferentes dietas e tratamentos empregados
poderiam de alguma forma exercer influência sobre os parâmentros fisiológicos
destes animais, a ingesta alimentar e o peso dos camundongos foram anotados
semanalmente, para posterior interpretação.
Analisando o histograma da figura 8A, podemos constatar que o grupo FAE 3
ingeriu uma quantidade maior de alimento, quando comparado ao grupo CCD,
sendo que essa diferença foi mais expressiva no terceiro e último mês de
tratamento. Essa maior ingestão de DH do grupo FAE 3, no entanto, não promoveu
neste mesmo grupo, um aumento de peso significativo, visto que a média de peso
do grupo FAE 3 foi semelhante às médias do grupo CSD, ao longo dos três meses
de tratamento (Figura 8B). O grupo FAE 3, portanto, manteve o peso estável durante
todo o tratamento, ao nível do grupo que não recebeu a DH. Por outro lado, ao
compararmos o peso dos animais dos grupos CSD e CCD, podemos verificar que
ocorreu um claro aumento de peso dos animais referentes ao grupo CCD.
Este resultado é muito relevante pois comprova que a diminuição da
colesterolemia verificada no grupo FAE 3, demonstrada nos resultados
subsequentes, deve-se, portanto, a outro fator que não, simplesmente, a uma
diminuição de peso deste mesmo grupo, em consequência de uma menor ingestão
de alimento.
Com relação ao grupo CP, muito embora a ingesta alimentar tenha sido
semelhante ao grupo FAE 3, o tratamento com a sinvastatina (1,0 mg/Kg/dia),
favoreceu a um aumento de peso, superior inclusive ao grupo CCD.
Em nosso estudo, optamos pela administração da sinvastatina devido a sua
frequente utilização na clínica (Bea et al, 2003; Deedwania et al., 2005; van Wijk et
al., 2005). De acordo com Johnston e colaboradores, a eficácia das estatinas em
promover a diminuição dos níveis lipídicos do plasma, está correlacionada
positivamente com a sua hidrossolubilidade. A sinvastatina, assim como a
atorvastatina e a lovastatina, são estatinas pouco solúveís em água, obedecendo a
seguinte ordem, de acordo com sua hidrossolubilidade:
atorvastatina>sinvastatina>lovastatina (Johnston et al, 2001). Em nosso
experimento, também observamos a baixa hidrossolubilidade deste fármaco. Neste
sentido, para a administração ideal de nosso controle positivo nos camundongos
LDLR KO, dissolvemos a droga em Tween 80 (0,01%). Muito embora tenhamos
conseguido dissolver facilmente a sinvastatina na baixa concentração de Tween 80
mencionada, o aumento de peso do grupo CP pode ser devido a uma diminuição na
biodisponibilidade da sinvastatina, relacionada a sua baixa hidrossolubilidade. Além
da baixa solubilidade em água, o pouco efeito da sinvastatina sobre o peso dos
animais e níveis lipídicos, pode ser ainda somada ao fato de a sinvastatina ser uma
lactona inativa, ou seja, uma pró-droga, que necessita ser hidroxilada para exercer
sua atividade (Johnston et al, 2001).
Na figura 9 estão representadas as médias e EPM referentes às dosagens de
CT e TAG realizadas ao fim dos três meses de tratamento. De acordo com o
histograma da figura 9A, no grupo FAE 3 ocorreu uma diminuição nos níveis de CT,
quando comparado ao grupo controle CCD. Além disso, o tratamento crônico com a
FAE no grupo FAE 3, foi capaz de manter os níveis de CT próximos ao do grupo
CSD. De acordo com um estudo realizado por Pal e colaboradores (2002), um
determinado extrato dealcoolizado de vinho tinto foi capaz de inibir em 50% a
secreção de apolipoproteínas B100 (apoB100), em hepatócitos humanos. Os
mesmos autores verificaram também que o extrato do vinho impediu o acúmulo de
colesterol intracelular, na sua forma livre e esterificada. Visto que a apoB100 é uma
das principais apolipoproteínas das VLDL, a diminuição da secreção das apoB100,
diminuiu, em última análise, a liberação desta lipoproteína, e, consequentemente, do
colesterol, para o plasma (Boren et al, 1994; Mohammadi et al, 1998; Pal et al,
2002). Em outro estudo feito por Borradaile e colaboradores (2002), alguns
flavonóides presentes na soja e em frutas cítricas, foram capazes de diminuir a
secreção de apoB100 do fígado, sendo que esta diminuição foi atribuída a uma
degradação das apoB100.
Analisando simultaneamente os baixos níveis de CT do grupo FAE 3 (da figura
9A), com os resultados obtidos na dosagem de VLDL (Figura 10B), podemos sugerir
que nossos resultados vão ao encontro dos trabalhos supra citados. Os polifenóis
presentes na FAE poderiam ter influenciado a secreção das apoB100 as quais, por
sua vez, não estariam sendo devidamente incorporadas às partículas de VLDL.
Desta forma, tal qual verificamos em nossas dosagens, os níveis de VLDL no
plasma estariam significativamente diminuídos. Visto que a VLDL é convertida em
LDL no plasma, a diminuição das VLDL acarreta em uma diminuição subsequente
nos níveis de LDL, no plasma destes animais.
O receptor hepático de LDL é o mais importante carreador de colesterol da
circulação sanguínea e sua interação com as apoB100, presentes nas LDL, faz com
que estas lipoproteínas permaneçam distantes dos sítios aterogênicos (Brown and
Goldstein, 1998). Neste contexto, de acordo com Pal e colaboradores, os compostos
fenólicos existentes no vinho promovem seus efeitos de forma semelhante às
estatinas. Os compostos fenólicos aumentam a expressão de receptores para LDL,
inibem reversivelmente a HMG-CoA redutase (enzima geradora de colesterol) e,
conforme já foi mencionado, degradam as apoB100 inibindo a sua incorporação em
VLDL e liberação pelas células do fígado (Pal et al, 2002).
A partir do entendimento de que, a incorporação das partículas de LDL, via
interação do receptor de LDL com a apoB100, é fundamental para um dos
mecanismos de ação propostos aos componentes da FAE e, analisando os
resultados obtidos em nosso estudo, como explicar a significativa diminuição nos
níveis de colesterol total, triacilgliceróis, LDL e VLDL do grupo FAE 3, em
camundongos knockout para o receptor de LDL?
Um fator importante e diferencial, que pode explicar grande parte dos
resultados obtidos em nosso modelo experimental, diz respeito ao metabolismo de
lipídios, em roedores. O fígado de ratos e camundongos produz duas versões de
apoLP B, que são: apoB100 e apoB48, ambas incorporadas em VLDL (Chan, 1992;
Higuchi et al, 1992). Em humanos, ratos e camundongos, as partículas de VLDL
portadoras de apoB100, originam partículas remanescentes (lipoproteínas de
densidade intermediária - IDL), as quais são removidas do plasma, principalmente
pelos receptores de LDL. Entretanto, no fígado de ratos e camundongos, também
ocorre a produção de VLDL que contém apoB48, sendo que, em humanos, esta
última é encontrada somente nos quilomicrons (Chan, 1992; Higuchi et al, 1992). As
VLDL constituídas de apoB48, assim como os quilomicrons, originam, em
camundongos e ratos, remanescentes que podem ser captados por um segundo
receptor, denominado receptor de remanescentes de quilomicrons - RRQ (Mahley,
1988; Brown et al, 1991). Os remanescentes dos quilomicrons e das VLDL que
contém apoB48 são removidos rapidamente do plasma, mesmo na ausência dos
receptores de LDL, não originando, portanto, concentrações consideráveis de LDL
na circulação (Kita et al, 1982; Catanozi et al, 2003).
Analisando conjuntamente os histogramas da figura 9B e figura 10B,
podemos observar que em ambos os resultados, todos os grupos tratados com a
FAE (via gavagem) promoveram uma significativa diminuição nos níveis de
triacilgliceróis e VLDL, respectivamente. Visto que os triacilgliceróis são encontrados
em maior concentração nos quilomicrons e nas partículas de VLDL, os compostos
presentes na FAE, através dos mecanismos propostos, parecem atuar
conjuntamente com a via alternativa de metabolização de lipídios. A FAE,
promovendo a inibição da enzima HMG-CoA redutase no interior dos hepatócitos,
favoreceria a uma diminuição da síntese do colesterol. Além disso, a FAE, atuando
na degradação de apoB100, favoreceria uma maior interação de VLDL e
quilomicrons remanescentes, via apoB48. Este fato, em última análise, permitiria
uma maior incorporação de triacilgliceróis e de colesterol total pelas células e,
finalmente, favoreceria a diminuição nos níveis de LDL, no plasma destes animais.
O índice aterogênico é um importante parâmetro, que permite verificar o risco
de doença cardiovascular em humanos (Vinson et al, 2001). Tomando como base a
equação do índice aterogênico: nível de colesterol total/nível de HDL, um indivíduo
adulto, com níveis de colesterol e HDL normais (200 mg/dL de CT; 40 mg/dL de
HDL), teria um índice aterogênico correspondente a 5,0. De acordo com um estudo
realizado por Vinson e colaboradores, o tratamento crônico com suco de uva e
vinho, diminuiu significativamente os níveis de LDL e colesterol total em hambsters.
Por outro lado, não ocorreram diferenças significativas com relação aos níveis de
HDL, no grupo tratado com o extrato de vinho tinto, quando comparado com o grupo
controle. Entretanto, os pesquisadores, tomando como base a equação citada
acima, verificaram que o índice aterogênico dos hamsters que receberam o suco de
uva, atingiu o valor de 4,31. Em nosso experimento, o grupo FAE 3 também atingiu
um índice aterogênico quase idêntico ao trabalho citado, no valor de 4,35. Por outro
lado, os grupos CCD, FAE 10 e FAE 30 atingiram valores mais altos em relação ao
grupo FAE 3: 6,85, 6,84 e 6,60, respectivamente. A FAE em baixas doses é,
portanto, capaz de diminuir os níveis de colesterol, mantendo estáveis os níveis de
HDL, em nosso modelo experimental.
Na figura 11A e 11B, temos representadas as CCRc ao agonista α-
adrenérgico, a fenilefrina, nos diferentes grupos de camundongos LDLR KO. Nestes
experimentos, observamos que os grupos CSD, SD + FAE, FAE 3 e CP, foram mais
responsivos à fenilefrina, quando comparados às preparações do grupo CCD. Por
outro lado, nos grupos experimentais FAE 10 e FAE 30 ocorreu uma visível
diminuição da contração induzida pela fenilefrina, semelhante ao grupo CCD. De
acordo com nossos resultados, o tratamento crônico com a FAE, em baixas doses,
parece ter poupado a musculatura lisa vascular, dos efeitos provocados pela DH. De
fato, durante o procedimento de dissecação dos vasos nos grupos CCD, FAE 10 e
FAE 30 observamos claramente que os depósitos de gordura localizavam-se não
somente no arco aórtico mas também em alguns pontos da aorta torácica e
abdominal destes animais. O acúmulo de placas de gordura ao longo da aorta
comprometeu, portanto, o efeito contrátil da fenilefrina nestas preparações (Figura
11). Tal efeito pode ser melhor evidenciado através dos valores de relaxamento
máximo dos diferentes grupos, representados na tabela 5. Nesta tabela, embora os
valores de CI50 + IC95% dos grupos CCD e FAE 10 sejam inferiores com relação ao
FAE 3, não ocorreu uma correlação positiva entre valores de IC50 e relaxamento
máximo.
O sério comprometimento da musculatura lisa vascular nos camundongos
LDLR KO pôde ser melhor evidenciado nos experimentos realizados com o agonista
colinérgico muscarínico, a acetilcolina (figura 12A e 12B).
Tomando como base um estudo morfológico realizado por Jorge e
colaboradores, segmentos de aortas de coelhos hipercolesterolêmicos foram
analisados através de microscopia eletrônica. Paralelamente, assim como em
nossos experimentos com os camundongos LDLR KO, a função endotelial destes
segmentos vasculares foi verificada através da realização de curvas concentração-
resposta à acetilcolina. Os autores constataram que, ainda em estágios iniciais de
uma dieta rica em colesterol, ocorre uma evidente disfunção endotelial sem qualquer
alteração morfológica do endotélio ou da íntima arterial. Tal constatação sugere que
a alteração mais precoce na aterogênese é a disfunção endotelial (Jorge, 1997).
Em nossos experimentos, o número reduzido de camundongos LDLR KO não
nos permitiu realizar cortes histológicos nos diferentes grupos, ainda nos estágios
iniciais do tratamento. No entanto, ao final dos três meses, foram realizadas CCRc à
acetilcolina em todos os grupos experimentais. Assim como no trabalho descrito
acima, verificamos que o acúmulo de gordura sob a forma de placas, comprometeu
significativamente a camada de células endoteliais de todos os grupos que
receberam a DH, prejudicando consequentemente o relaxamento endotélio-
dependente do agonista. Entretanto, embora a formação de placas de gordura tenha
ocorrido em todos os grupos que receberam a DH, nas CCRc à acetilcolina,
realizada nos segmentos de aorta do grupo FAE 3, ocorreram níveis de relaxamento
bastante próximos ao grupo CSD (Figura 12A e 12B).
6. CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo demonstram os efeitos de uma fração rica em
polifenóis, obtida a partir de um vinho tinto fabricado no oeste do estado de Santa
Catarina. A FAE, através dos diferentes protocolos realizados ao longo desta
investigação, revelou alguns efeitos biológicos importantes:
• Promove uma efetiva atividade antioxidante, comprovada nos ensaios
bioquímicos in vitro;
• Apresenta uma atividade vasorelaxante sobre vasos de pequeno calibre, mais
precisamente, sobre o leito arterial mesentérico de ratos normotensos. Com
relação ao mecanismo de ação da FAE, os resultados obtidos estabelecem uma
relação direta entre aumento da biodisponibilidade do NO e sua atuação sobre
canais de potássio e subsequente hiperpolarização;
• Atividade hipolipidemiante na menor dose utilizada (3 mg/kg), verificada após
tratamento crônico em camundongos LDLR KO, submetidos à DH. As maiores
doses da FAE (10 e 30 mg/kg), não promoveram a mesma atividade,
possivelmente devido a uma atividade pró-oxidante dos componentes da FAE;
Muitos estudos têm relatado que a associação de drogas redutoras do
colesterol plasmático e substâncias antioxidantes, seja uma proposta lógica para a
reversão de doenças de origem cardiovascular. Inúmeros trabalhos, das mais
diversas fontes, têm ainda apontado os "produtos de origem natural", como efetivos
promovedores de saúde e bem estar, sem mínimas contra-indicações. Neste
contexto, visto se tratar de um produto de ampla comercialização e aceitação
popular, o presente estudo pretendeu esclarecer alguns pontos relacionados às
efetivas e reais atividades atribuídas aos compostos presentes na uva e vinho tinto.
* * * * * * * * *
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