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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
NÚCLEO DE DOENÇAS INFECCIOSAS
KELLY ROSE AREAL
ESTUDO DE SOROPREVALÊNCIA DE TOXOPLASMOSE EM GESTANTES
ATENDIDAS NA REDE MUNICIPAL DE SAÚDE DE VITÓRIA, ES.
VITÓRIA
2007
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Livros Grátis
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KELLY ROSE AREAL
ESTUDO DE SOROPREVALÊNCIA DE TOXOPLASMOSE EM GESTANTES
ATENDIDAS NA REDE MUNICIPAL DE SAÚDE DE VITÓRIA, ES.
Dissertação apresentada ao Núcleo de
Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da
Saúde, da Universidade Federal do Espírito
Santo, como pré-requisito para obtenção do
título de Mestre em Doenças Infecciosas.
Orientadora: Prof.ª Angélica Espinosa Miranda.
VITÓRIA
2007
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Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Areal, Kelly Rose, 1969-
Estudos de soroprevalência de toxoplasmose em gestantes
atendidas na rede Municipal de Saúde de Vitória, ES/ Kelly Rose
Areal. – 2007.
76f: il.
Orientadora: Angélica Espinosa Miranda
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do
Espírito Santo, Centro Biomédico.
1. Mulheres. 2. Toxoplasmose 3. Gestantes. 4. Diagnóstico. 5.
Transmissão. 6. Risco. I. Miranda, Angélica Espinosa
Barbosa. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro
Biomédico. III. Título.
Dedico esta dissertação,
A Deus pela benção do amor e da vida,
A minha filha Rafaela, pela paciência e
compreensão dos momentos de falta,
A minha família pelo grande incentivo e
dedicação.
“Se não houver frutos, valeu a beleza
das flores; se não houver flores, valeu
a sombra das folhas; se não houver
folhas, valeu a intenção da semente”.
Henfil
Agradeço,
A minha orientadora Angélica Espinosa Miranda, pela dedicação, incentivo,
disponibilidade, carinho com que me acolheu em todos os momentos de
dúvidas e angústias.
A Prefeitura Municipal de Vitória, na pessoa do Exmo. Prefeito João Coser,
pelo incentivo à pesquisa e qualificação de seus funcionários.
A Secretaria Municipal de Vitória, nas pessoas do Exmo. Sr. Luiz Carlos Reblin
e Srª. Maria Elizabeth Cuning, pela minha liberação para a realização deste
trabalho.
Ao Laboratório Central da Secretaria Municipal de Saúde, no nome de todos os
funcionários e especialmente aos do setor de Imunologia pelo incentivo, auxílio,
carinho, amizade e colaboração na realização deste trabalho.
A equipe de enfermeiras e médicos das unidades de saúde, pela colaboração
na realização deste trabalho.
Aos estagiários que participaram da realização deste trabalho.
Ao Programa Saúde da Mulher da Secretaria Municipal de Saúde, pela
dedicação em auxiliar na realização deste trabalho.
A FESCA, em nome de todos os funcionários, pela amizade e incentivo a
realização deste trabalho.
Ao Profº. Luiz Carlos Pedrosa Valli, pela consideração e prontidão em
colaborar, com a realização deste trabalho.
A todos os professores do Núcleo de Doenças Infecciosas pela dedicação nos
momentos de dúvidas.
Ao Profº. Fausto Edmundo Lima Pereira, coordenador do mestrado em
Doenças Infecciosas pela genialidade e dedicação.
A FAPES e CNPq pelo suporte financeiro através do financiamento PP-SUS.
As pacientes que aceitaram participar de forma acolhedora à pesquisa.
A todos aqueles, que não citados aqui, participaram incentivando e/ou
colaborando com a realização deste trabalho.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AIDS/SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Bcl-2 Gene regulador da apoptose
DNA Ácido desoxirribonucléico
ELISA
Ensaio Imunoenzimático (do original inglês: Enzime Linked
Immunosorbent Assay)
IL-2 Interleucina 2
IL-12 Interleucina 12
IFI Imunofluorescência Indireta
INF-γ Interferon γ
IgA Imunoglobulina A
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
Gene B1
Gene específico do DNA do Toxolpasma gondii
HAI Hemaglutinação Indireta
MCP-1
(d (do original ingles) Macrophage Chemoattractant Protein 1
MIP-1α, 1β (do original ingles) Macrophage Inflammatory Protein 1α,
1β
MHC (do original inglês) Major histocompatibility complex
µ Micrômetro
nn Nanômetro
ºC Graus Celsius
PCR Reação em Cadeia Polimerase (do original inglês)
Polymerase Chain Reaction)
PSF Programa de Saúde da Família
P30
Gene específico do DNA do Toxolpasma gondii
Rop 1 Proteína de Roptria 1
Rop 2 Proteína de Roptria 2
Rpm Rotações por minuto
SEMUS/PMV Secretaria Municipal de Vitória/ Prefeitura Municipal de
Vitória
Smad Mensageiro intracelular na expressão do RNA mensageiro
SNC Sistema Nervoso Central
SPSS Statistical Package for Social Sciences
TGFβ Fator β de crescimento e transformação
Th1 Linfócito auxiliar tipo 1
Th2 Linfócito auxiliar tipo 2
TNFα Fator de necrose tumoral –α
TRG1
Gene específico do DNA do Toxolpasma gondii
UFES Universidade Federal do Espírito Santo
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo biológico do Toxoplasma gondii …………………………..........21
Figura 2: Estrutura da forma taquizoíta do Toxoplasma gondii…………….......22
Figura 3: Mapa da regionalização de Saúde em Vitória…………………….......39
Figura 4: Distribuição das 1153 gestantes incluídas no estudo segundo as
regiões do Município..........................................................................49
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Evolução temporal dos anticorpos específicos anti Toxoplasma
gondii.................................................................................................................32
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1: Classificação taxonômica do Toxoplasma gondii.............................20
Tabela 1: Estudos sobre a prevalência de toxoplasmose em gestantes
realizados no Brasil de 1985 a 2005..................................................................27
Tabela 2: Significado do diagnóstico laboratorial de toxoplasmose, segundo
pesquisa de anticorpos......................................................................................35
Tabela 3: Conduta terapêutica adotada em gestantes com diagnóstico de
toxoplasmose recomendada pela Secretaria de Saúde de Vitória....................36
Tabela 4: Distribuição da freqüência de positividade dos anticorpos classe IgG,
IgM e avidez de IgG entre as gestantes atendidas no pré-natal das unidades de
saúde de Vitória em 2006..................................................................................48
Tabela 5: Dados sócio-demográficos das 1153 gestantes atendidas no pré-
natal das unidades de saúde de Vitória em 2006..............................50
Tabela 6: Dados gestacionais das 1153 gestantes atendidas no pré-natal das
unidades de saúde de Vitória em 2006.............................................51
Tabela 7: Correlação entre as duas metodologias utilizadas na pesquisa de
avidez de IgG das 15 amostras IgM positivas no Liaison..................52
Tabela 8: Dados demográficos e obstétricos das 15 gestantes com suspeita de
infecção toxoplásmica aguda (IgM positivo ou indeterminado), todas
apresentaram resultado de IgG positivo...........................................53
Tabela 9: Correlação entre os fatores de risco para aquisição de toxoplasmose
e resultados de anticorpos IgG e IgM positivos nas 1153 gestantes
atendidas no pré-natal das unidades de saúde de Vitória em
2006...................................................................................................54
Anexos
Anexo 1: Questionário aplicado.........................................................................74
Anexo 2: Comitê de ética...................................................................................75
Anexo 3: Termo de consentimento....................................................................76
RESUMO
Introdução: A toxoplasmose é de alta prevalência no Brasil. A infecção durante
a gravidez pode resultar em doença fetal com graves seqüelas para a criança.
Objetivo: Determinar a soroprevalência de toxoplasmose em gestantes
atendidas nas Unidades de Saúde do Município de Vitória e avaliar fatores
correlatos com a infecção.
Métodos: Estudo de corte transversal, realizado de janeiro a dezembro de
2006, em 1153 gestantes atendidas nas Unidades de Saúde das seis regiões
de saúde. Entrevista face-a-face contendo dados sócio-demográficos,
epidemiológicos e clínicos foi realizada e sorologias para pesquisa de IgG, IgM
e avidez de IgG pelo método de quimiluminescência (Diasorin) e
eletroquimioluminescência (Biolab-Merrieux).
Resultados: A prevalência da infecção foi de 73,5% (IC 95% 70,95%-76,05%)
para IgG e 1,3% (IC 95% 0,65%-1,95%) para IgM. Quando se considerou a
avidez de IgG, a prevalência de infecção aguda foi de 1,1% (IC 95% 0,5%-
1,7%). Um total de 26,5% (IC 95% 23,9%-29,0%) gestante era susceptível à
toxoplasmose e 72,2% (IC 95% 69,6%-74,8%) imunes. A presença de
anticorpos IgG esteve independentemente associada à aquisição de carne em
feiras livres [1,78 (IC95% 1,02-3,13). Já a presença de anticorpos IgM durante
a gravidez apresentou associação com uma menor escolaridade (até quatro
anos de estudo) [5,30 (IC95% 1,67-16,83)].
Conclusão: Estes resultados corroboram a importância da adesão precoce ao
pré-natal com a inclusão do ensaio de avidez de IgG no diagnóstico da
toxoplasmose. É necessário haver um maior rigor nas exigências sanitárias, no
que diz respeito ao comércio de carnes sem registro.
Palavras-chave: Gravidez, Toxoplasmose, Diagnóstico laboratorial.
ABSTRACT
Introduction: Toxoplasmosis is prevalent in Brazil. The infection during
pregnancy can affect the fetus and cause sequelae in the child.
Objectives: To determine seroprevalence of toxoplasmosis in pregnant women
attending primary health cares in Vitória Municipality and evaluate correlate
factors for the infection.
Methods: A cross-sectional study, performed from January to December 2006,
in 1153 pregnant women attending antenatal care in public clinics from the six
health areas. A face-to-face interview with sócio-demographic, behaviors and
clinics was performed; and serology for IgG, IgM and avidity of IgG by
quimiluminescence (Diasorin) and eletroquimioluminescence (Biolab-Merrieux).
Results: Prevalence of toxoplasmosis was 73.5% (CI 95% 70.95%-76.05%)
and 1.3% (CI 95% 0.65%-1.95%) of acute infection. Considering avidity of IgG,
prevalence of acute infection was 1.1% (CI 95% 0.5%-1.7%). A total of 26.5%
(CI 95% 23.9%-29.0%) pregnant women were susceptive to toxoplasmosis and
72.2% (CI 95% 69.6%-74.8%) immunes. IgG antibodies were independent
associated to buying meat in free markets [1.78 (CI 95% 1.02-3.13), and IgM
antibodies during pregnancy were associated to lower education (up to four
years) [5.30 (CI95% 1.67-16.83)].
Conclusions: These results corroborate the importance of earlier antenatal care
and the inclusion of avidity test in toxoplasmosis diagnosis. It is requested a
better sanitary control concerning the commerce of meat without registration.
Key words: Pregnancy, Toxoplasmosis, Laboratory diagnosis.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO...................................................................................................16
2 REVISÃO DA LITERATURA.........................................................................19
2.1 Histórico.......................................................................................................19
2.2 Agente etiológico.........................................................................................19
2.3 Biologia do agente.......................................................................................19
2.3.1 Taquizoítos...............................................................................................21
2.3.2 Bradizoítos................................................................................................22
2.3.3 Oocistos....................................................................................................22
2.4 Estrutura antigênica.....................................................................................23
2.5 Resposta Imune ao Toxoplasma gondii.......................................................23
2.6 Epidemiologia..............................................................................................26
2.7 Toxoplasmose clínica..................................................................................27
2.7.1 Toxoplasmose febril aguda......................................................................28
2.7.2 Linfadenite toxoplásmica..........................................................................28
2.7.3 Toxoplasmose ocular...............................................................................28
2.7.4 Toxoplasmose no indivíduo imunocomprometido....................................29
2.7.5 Toxoplasmose congênita.........................................................................29
2.8 Diagnóstico..................................................................................................30
2.8.1 Isolamento do parasito..............................................................................30
2.8.2 Pesquisa de antígenos.............................................................................31
2.8.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR).................................................31
2.8.4 Diagnóstico sorológico.............................................................................31
2.8.4.1 Pesquisa de anticorpos.........................................................................32
2.9 Tratamento...................................................................................................35
2.10 Profilaxia e vacinação................................................................................36
3 OBJETIVOS....................................................................38
3.1 Objetivo geral...............................................................................................38
3.2 Objetivos específicos..................................................................................38
4 MATERIAIS E MÉTODOS..............................................39
4.1 População do estudo..................................................................................39
4.2 Delineamento do estudo..............................................................................39
4.3. Coleta de dados..........................................................................................39
4.4 Aspectos éticos............................................................................................40
4.5 Cálculo do tamanho da amostra..................................................................40
4.6 Coleta, transporte e conservação das amostras biológicas........................40
4.7 Metodologias utilizadas na detecção dos anticorpos específicos anti
Toxoplasma gondii.............................................................................................41
4.8 Descrição das técnicas utilizadas no diagnóstico laboratorial.....................41
4.8.1 Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para determinação
quantitativa de anticorpos classe IgG contra o Toxoplasma gondii...................41
4.8.2 Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para determinação
quantitativa de anticorpos classe IgM contra o Toxoplasma gondii...................42
4.8.3 Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para avaliação de
anticorpos classe IgG avidez contra o Toxoplasma gondii................................43
4.8.4 Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para detecção
quantitativa de anticorpos classe IgG contra o Toxoplasma gondii...................45
4.8.5 Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para detecção
quantitativa de anticorpos classe IgM contra o Toxoplasma gondii...................46
4.8.6 Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para avaliação de
anticorpos classe IgG avidez contra o Toxoplasma gondii................................46
4.9 Análise estatística........................................................................................47
5 RESULTADOS...............................................................................................48
5.1 Freqüência de toxoplasmose em gestantes atendidas na rede Municipal de
Saúde de Vitória, ES..........................................................................................48
5.2 Distribuição, segundo região de saúde, das gestantes atendidas na rede
Municipal de Saúde de Vitória, ES....................................................................48
5.3 Dados sócio-econômicos das gestantes atendidas na rede Municipal de
Saúde de Vitória, ES..........................................................................................49
5.4 Dados gestacionais gestantes atendidas na rede Municipal de Saúde de
Vitória, ES..........................................................................................................51
5.5 Resultados relacionados à comparação entre os dois métodos de detecção
de anticorpos IgM e avidez de IgG....................................................................51
5.6 Dados demográficos e obstétricos das 15 gestantes com suspeita de
infecção aguda atendidas na rede Municipal de Saúde de Vitória, ES.............52
5.7Correlação entre a presença de fatores de risco para aquisição de
toxoplasmose em gestantes atendidas na rede Municipal de Saúde de
Vitória,ES...........................................................................................................53
6 DISCUSSÃO...................................................................................................55
7 CONCLUSÕES...............................................................................................60
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................61
9 ANEXOS……………………………………………………………………………74
1. INTRODUÇÃO
A infecção toxoplásmica é de ampla distribuição geográfica, sendo uma
zoonose de alta prevalência no Brasil, tornando-se importante em nosso meio
pelo fato de durante a gravidez a transmissão congênita poder resultar em
doença fetal com graves seqüelas para a criança (Stray-Pedersen,1993).
A infecção humana ocorre, predominantemente, pela ingestão de oocistos,
excretados em fezes de gatos que podem permanecer viáveis no solo por
longo tempo e através do consumo de carnes cruas ou mal cozidas, contendo
cistos (Sanchez et al,1994). Outras formas de infecção ocorrem ainda, como
nos casos de transplantes de órgãos e através da transmissão
transplacentária, sendo essa última, a forma mais importante de transmissão
por ser a causadora da infecção fetal (Remington et al, 1995).
A soroprevalência de toxoplasmose pode variar conforme características
climáticas, hábitos alimentares, fatores culturais e regiões geográficas
(Kapperud et al, 1997). A incidência da infecção durante a gestação varia em
diferentes países de 1 a 14 casos por 1000 gestações. No entanto a infecção
fetal ocorre em 0,2 a 2,0 recém nascidos por 1000 nascimentos (Williams et
al,1981). A gravidade da infecção no feto vai depender do período de gestação
no momento da infecção, o que pode levar a morte fetal ou a graves
manifestações clínicas (Desmonts,1974). Esta infecção ocorre quando
taquizoítos atingem o feto, que por imaturidade do sistema imunológico não
consegue controlar a infecção, podendo evoluir de forma grave e disseminada,
com comprometimento do sistema nervoso central e do olho (Remington et
al,1995). A idade gestacional no momento da infecção materna interfere na
taxa de transmissão fetal. Quando esta ocorre antes da décima quinta semana
de gestação, o índice de transmissão para o feto pode ser inferior a 5%.
Entretanto, se a infecção ocorre no final da gestação, próximo do termo, os
índices de infecção podem chegar a 80% (Remington et al,1995). As
características clássicas dos quadros mais graves desta infecção são
denominadas de tétrade de Sabin (Sabin, 1941), mas o espectro clínico da
infecção congênita pelo Toxoplasma gondii varia de alterações aparentes ao
nascer com morbimortalidade perinatal elevada (microcefalia, crescimento
intra-uterino retardado, hidrocefalia) à uma infecção subclínica com
possibilidade de risco para o desenvolvimento de corio-retinite e/ou
complicações na vida adulta (Koppe et al,1986 e Roisen et al,1995).
Existem vários métodos de diagnóstico para detecção da toxoplasmose, mas
os métodos indiretos, que detectam a presença de anticorpos específicos
contra o T. gondii são os mais utilizados (Camargo et al, 1991). Para os
profissionais de saúde envolvidos na assistência à gestante e ao seu concepto,
o diagnóstico sorológico laboratorial constitui um grande desafio, pois este
diagnóstico que até bem pouco tempo era realizado somente através de
técnicas de imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpos
específicos dos isotipos IgA, IgG ou IgM (Camargo et al,1977), hoje é
substituído por técnicas mais avançadas como as imunoenzimáticas, que por
terem alta sensibilidade, passou a detectar níveis muito baixos de anticorpos
IgM específicos circulantes, modificando assim a interpretação dos resultados.
Para tentar discriminar melhor as infecções pregressas das agudas introduziu-
se a técnica de avidez dos anticorpos IgG específicos, baseada na afinidade
com que os anticorpos IgG ligam-se a seus respectivos antígenos através da
avaliação de maior ou menor facilidade de quebra desta ligação (Hedman et al,
1989) .
A detecção da expressão de receptores índices de ativação celular como
CD25, CD71 e CD69E na superfície dos linfócitos pela técnica de citometria de
fluxo, poderão ser no futuro de grande auxílio para o diagnóstico de
toxoplasmose congênita (Kahi et al, 1998).
No mundo, há uma grande variação nas recomendações sobre a testagem de
toxoplasmose em gestantes: EUA e Canadá não realizam triagem no pré-natal,
a França faz exame mensal e a Áustria trimestralmente quando as gestantes
não possuem anticorpos contra o T. gondii no início da gravidez (Wallon et
al,1999 e Thulliez,1992). O Brasil ainda não possui uma recomendação do
Ministério da Saúde; no Município de Vitória, segundo o Protocolo da Saúde da
Mulher do ano de 2003, realiza-se um teste para diagnóstico da toxoplasmose
no 1º trimestre de gestação e se este teste for negativo para os anticorpos IgG
e IgM realiza-se um segundo teste no 3º trimestre de gestação.
Variações regionais e custos operacionais elevados para o diagnóstico e
tratamento das seqüelas da infecção pelo T. gondii são reconhecidos e
dificultam sobremaneira o enfrentamento do problema no âmbito da Saúde
Pública. Portanto, identificar a magnitude desta infecção em gestantes e os
fatores de risco associados são estratégias na proposição de medidas e
políticas de prevenção e assistência. A preocupação com estes fatores fez
surgir a idéia deste estudo que tem como objetivo principal determinar a
soroprevalência de toxoplasmose em gestantes atendidas nas Unidades de
Saúde do Município de Vitória/ES.
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Histórico
Toxoplasma gondii foi descoberto simultaneamente no ano de 1908, por
Splendore em um laboratório no estado de São Paulo, em cérebro de coelho, e
por Nicolle & Manceaux no Instituto Pasteur da Tunísia num roedor africano
Ctenodactylus gundi (Nicolle & Manceaux, 1908; Splendore, 1908) e em 1923
foi reconhecida como causa de doença humana (Jankun,1923). Em 1939 Wolf
e colaboradores observaram o Toxoplasma gondii em uma recém-nascida com
encefamielite caracterizando o quadro como de doença congênita (Remington
et al, 2001). Contudo a importância epidemiológica através da explicação do
contágio humano se deu em 1942 (Springer,1997). Quando Sabin e Feldman
descreveram a prova de diagnóstico teste do corante em 1948, tornou-se
possível a realização de inquéritos sorológicos revelando a grande prevalência
da infecção em humanos (Sabin & Feldman, 1948).
2.2 Agente etiológico
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório tendo os felídeos
como os únicos hospedeiros definitivos (Frenkel,1970), mas podem infectar
outros animais domésticos e selvagens principalmente aves e mamíferos,
incluindo também o homem ( Dubey & thulliez,1993). O parasito é capaz de
invadir e se multiplicar, ainda, em eritrócitos imaturos de mamíferos, cultura de
células de peixes e insetos (Kasper & Mineo, 1994), podendo ser facilmente
mantido em diversas culturas celulares ou passagens em animais (Park et al,
1993)
2.3. Biologia do agente
Na classificação atual feita por Dubey, o Toxoplasma gondii é um protozoário
pertencente ao filo Apicomplexa conforme descrito na Quadro 1. É o único
membro conhecido do gênero, apresentando um complexo ciclo de vida
(Figura1), com sete formas durante o ciclo sexuado. Dentre estas, três formas
infectantes: taquizoítos, bradizoítos e oocistos (Dubey et al, 1998). Os felinos
são os hospedeiros definitivos, apresentando o ciclo enteroepitelial (sexuado) e
o ciclo extra-intestinal. Já os homens, mamíferos não-felinos e aves
apresentam apenas o ciclo tecidual extra-intestinal (Frenkel & Wallace, 1979).
A transmissão transplacentária em humanos provavelmente ocorre pelos
taquizoítos (Bermudez & Frenkel, 2005).
Quadro 1 – classificação taxonômica do Toxoplasma gondii.
Reino Protista
Sub-Reino Protozoa
Filo Apicomplexa
Classe Sporozoea
Subclasse Coccidia
Ordem Eucoccidiida
Subordem Eimeriida
Família Sarcocystidae
Subfamília Toxoplasmatinae
Gênero Toxoplasma
Espécie gondii
Figura 1: Ciclo de vida do Toxoplasma gondii
2.3.1 Taquizoítos
Denominação dada por Frenkel, originada do grego “tachos” (rápidos) (Frenkel,
1973). Desenvolve-se em quase todas as células e tecidos de mamíferos e
aves e por isso pode ser considerado um dos parasitos de menor
especificidade para células e tecidos, facilitando sua manutenção tanto em
culturas celulares como em passagens sucessivas em animais (Park et al,
1993). São organismos de rápida multiplicação durante a infecção aguda. Essa
multiplicação se dá por sucessivas endodiogenias dentro dos vacúolos
intracitoplasmáticos. À microscopia eletrônica observam-se um complexo apical
anterior constituído por um anel cônico e polar de fibras espiraladas, roptrias e
micronemas que estão envolvidos no processo de penetração celular. Na
região central observa-se o núcleo, mitocôndrias, aparelho de Golgi e no
citoesqueleto microtúbulos que auxiliam na motilidade (Figura 2). A
multiplicação dos taquizoítos normalmente destrói a célula hospedeira, mas a
produção ou não de lesões dependerá da capacidade de autoregeneração das
células (Dubey et al, 1998).
Figura 2 – estrutura da forma taquizoíta do T.gondii
2.3.2 Bradizoítos
São também chamados de cistozoítos, multiplicam-se de forma lenta dentro
dos cistos do Toxoplasma durante a infecção crônica, principalmente no
cérebro, retina, músculo cardíaco e esquelético. O cisto possui cápsula
resistente e elástica que isola os bradizoítos da resposta imune do hospedeiro
e assim persistem por meses, anos e muitas vezes por toda a vida. Os cistos
variam de 10 a 200 µm de tamanho. Os jovens contêm em média dois
bradizoítos, enquanto os mais velhos podem conter milhares deles. Eles são
resistentes à digestão péptica e tríptica (Dubey et al, 1998). A formação de
cistos tissulares pode ser induzida por fatores relacionados à resposta do
hospedeiro à infecção (Lyons et al, 2002).
2.3.3 Oocistos
Medindo cerca de 10 a 13 µm, cada oocisto contém dois esporocistos e estes
quatro esporozoítos que são estruturas muito semelhantes aos outros dois
estágios. São muito infectantes quando ingeridos por mamíferos, aves e
homem (Dubey et al, 1998; Bermudez & Frenkel, 2005). Apresentam-se como
forma de resistência, podendo sobreviver por meses e até por anos em
condições ambientais severas e resistir a agentes químicos esterilizantes,
como o hipoclorito de sódio (Dubey et al, 1998). Dentro das células epiteliais do
intestino dos felídeos ocorre a reprodução sexuada, originando o oocisto que é
a forma infectante do parasito. Depois que ocorre o processamento gástrico, os
oocistos se rompem no intestino e os esporozoítos liberados penetram nas
células intestinais dividindo-se rapidamente e gerando os taquizoítos que
invadem outras células, atingindo outros órgãos do hospedeiro. Além desse
ciclo, o parasito desenvolve um ciclo enteroepitelial em felinos, de proliferação
rápida e divisão sexuada, originando oocistos que são liberados nas fezes do
hospedeiro definitivo (Frenkel & Wallace, 1979).
2.4 Estrutura antigênica
Apesar da estrutura genômica do Toxoplasma gondii ser bem conhecida,
muitos antígenos ainda não têm suas funções bem definidas (Boothroyd et al,
1997). Entretanto, estudos de imunolocalização mostram que antígenos
imunodominantes estão localizados na superfície da membrana do T. gondii
(SAG 1 e SAG2), dentro de organelas específicas como, por exemplo, as
ROPTRIAS (ROP 1 e ROP 2) ou ainda em micronemas e grânulos densos
como: GRA 1, GRA 2, GRA 4, GRA 6 e GRA 7 (Aubert et al, 2000).
Dos antígenos de superfície de membrana, a SAG 1 é a proteína mais
abundante, representando cerca de 5% do total de proteínas totais do
Toxoplasma gondii e só é expressa nos taquizoítos. A SAG 1 estimula as
células mononucleadas do sangue periférico de indivíduos infectados a
secretarem IFN-γ (KHAN et al, 1988), que é um importante mediador de
resistência contra o parasito. Por ser muito imunogênica, a SAG 1 induz a
produção de anticorpos específicos IgG, IgA e IgM e possui papel importante
nos mecanismos imunopatogênicos (Aubert et al, 2000). A SAG 2 está
presente em taquizoítos (Lyons et al, 2002). A ROP 2 estimula forte resposta
humoral no primeiro estágio da infecção, e por isso é indicada junto com outros
antígenos para uso no diagnóstico, detectando anticorpos específicos classe
IgG, IgA e IgM (Martin et al, 1998).
2.5 Resposta Imune ao Toxoplasma gondii
A aquisição de toxoplasmose em humanos ocorre por ingestão de cistos ou
oocistos e esses são digeridos no lúmen do intestino delgado. Através do
epitélio intestinal a infecção é disseminada para outros órgãos do hospedeiro,
principalmente o músculo e o sistema nervoso central (SNC). Em indivíduos
imunocompetentes, a infecção evolui de forma crônica caracterizada pela
presença de cistos contendo a forma de bradizoitos nos tecidos desses órgãos
(Kasper et al, 2004). Essa forma pode permanecer latente durante toda a vida
do hospedeiro, mas se em algum momento ocorre uma imunodeficiência seja
adquirida por SIDA/AIDS, por imunossupressão induzida por drogas de
quimioterapia ou de transplantes de órgãos ou mesmo uma alteração da
imunidade celular, poderá se dar a transformação das formas bradizoitas em
taquizoitas e então uma reativação da infecção pode ocorrer com sérios danos
ao hospedeiro (Sharma, 1990).
Depois que ocorre a infecção das células intestinais, estas secretam
quimiocinas (ex: MIP-1α, MIP-1β, MCP-1) e citocinas que atraem e ativam
células inflamatórias como neutrófilos polimorfonucleares, macrófagos, células
T, “Natural Killer” e células dendríticas. Estas células secretam mais
quimiocinas que atraem mais células T CD4+ para o local da infecção.
Receptores de quimiocinas como CCR1, CXCR3 e CCR2 são expressas por
essas várias células iniciando um importante papel no tráfego celular durante o
processo inflamatório. As células dendríticas apresentam os antígenos
parasitários para células T e produzem muitas citocinas como as IL-12 que
ativam a resposta imune adaptativa. Como mecanismo de manutenção da
homeostase, linfócitos intraepiteliais são atraídos pela interação entre
quimiocinas e seus receptores, bem como integrinas e seus receptores. Esses
linfócitos produzem TGF-β que modula negativamente a resposta imune
inflamatória, paralelamente a produção de INF-γ pela via Smad dependente
(Kasper et al, 2004).
Em modelos animais, estudos sugerem que o envolvimento de hormônios
sexuais é importante na determinação da susceptibilidade do hospedeiro à
infecção (Kasper et al, 2004), pois animais do sexo feminino morrem mais cedo
que os machos. Animais atímicos ou deficientes em células TCD4+ não
desenvolvem necrose intestinal e sobrevivem mais independentemente da
multiplicação tecidual dos parasitos, (Liesenfeld et al, 1996) demonstrando que
mutações genéticas acarretam danos à indução de resposta imune mediada
por células T, importante no controle da replicação do parasito no organismo do
hospedeiro (Sharma, 1990).
Estudos utilizando citocinas recombinantes e anticorpos monoclonais em
animais têm demonstrado o papel de células como macrófagos, células “natural
killer”, neutrófilos, linfócitos CD4+ e CD8+ na resposta celular contra o
Toxoplasma gondii. Desta forma os linfócitos CD8+ são importantes na
diminuição da disseminação da parasitemia, pois são reguladas pelo MHC-I e
atuam lisando células infectadas e expondo os parasitos que antes se
encontravam protegidos no interior de vacúolos parasitários a outras células
efetoras como macrófagos ativados. Também, permitem a opsonização dos
parasitos por anticorpos (Brown & Mcleod, 1990). Acredita-se que as células
CD8+ podem lisar parasitas extracelulares independentemente do MHC1.
Assim a formação de cistos teciduais é inibida pela atuação conjunta do MHC1,
linfócitos CD8+ e IFN-γ produzido. Os linfócitos CD4+ atuam como auxiliares
na ativação das células CD8+ e são a principal fonte de produção de IFN-γ na
fase crônica da infecção. Os linfócitos CD4+ juntamente com células “Natural
Killer” também são responsáveis pela produção precoce de IFN-γ, que
suprimindo a atividade de células CD4+ Th2 atuam selecionando a produção
de citocinas do tipo Th1 (citocina IL-2 e IFN-γ) e esses responsáveis pela
resistência à re-infecção e controle da infecção crônica. A produção de IL-2
pelos linfócitos e também de IL-12 pelos macrófagos, estimula a ação citotóxica
de células NK, linfócitos T CD8+ e o padrão Th1 de resposta. IFN-γ junto com
TNF-α ativam os macrófagos para que estes produzam altos níveis de óxidos
nitrogenados reativos envolvidos no controle de replicação do parasito,
adicionalmente células fagocíticas restringem a disponibilidade do triptofano,
reduzindo o crescimento intracelular do mesmo (Kasper et al, 2004).
Apesar da produção de anticorpos classe IgA, IgE, IgG e IgM, a resposta imune
humoral não fornece proteção durante a infecção pelo Toxoplasma (Sharma,
1990).
2.6 Epidemiologia
A toxoplasmose se apresenta como uma infecção cosmopolita, sendo que a
maior parte das infecções em indivíduos imunocompetentes é assintomáticas
ou oligossintomáticas. Toxoplasma gondii não tem predileção por animais,
infectando mamíferos e aves. No homem a infecção parece se apresentar de
forma igual entre os dois sexos e há um aumento na prevalência de acordo
com o aumento de idade (Feldman & Sabin, 1949; Bermudez & Frenkel, 2005;).
Inquéritos epidemiológicos demonstram que a infecção pelo parasito ocorre em
áreas de clima muito diverso, podendo haver predomínio em climas quentes e
úmidos. O hábito alimentar e condições sócio-econômicas podem influenciar na
taxa de transmissão. A infecção humana se dá principalmente por ingestão de
carne crua e mal cozida contendo cistos, ingestão de oocistos presentes em
alimentos e água contaminada, transmissão vertical e ainda por transplante de
órgãos e transfusão sanguínea (Frenkel et al, 1975; Ruiz & Frenkel, 1980).
Estudos realizados em gestantes demonstram que há um aumento da
prevalência na faixa etária acima de 34 anos de idade (Jenum et al, 1998). Os
estudos observaram também uma grande variação na soropositividade em
gestantes como 70,0% em Paris (Remington et al, 2001), 32,0% em Nova
Iorque (Remington et al, 2001), 20,3% na Finlândia (Lappalainen et al,1995),
18,8% em Londres (Gilbert et al,1993), 14,0% em Estocolmo (Peterson et
al,2000) e 10,9 % na Noruega (Jenum et al,1998). A média de prevalência na
América Latina é de 50 a 60% (Frenkel,1986). A variação na prevalência de
toxoplasmose em gestantes no Brasil foi demonstrada por 11 estudos
publicados na literatura e que estão listados na Tabela 1.
No Espírito Santo três estudos sobre toxoplasmose foram publicados
anteriormente, o primeiro foi realizado em crianças do ensino primário
provenientes de nove regiões do Estado (3.083 amostras de zona rural e 305
amostras de zona urbana), a prevalência encontrada foi de 28,0% na zona rural
e 42,95% na zona urbana (Sessa et al, 1979). O segundo realizado em Vitória,
pesquisou a prevalência de toxoplasmose em 40 estudantes de medicina,
encontrando 45,0% de anticorpos IgG na amostra estudada (Barros et al,
1979). O terceiro estudo foi sobre toxoplasmose ocular no município de Venda
Nova do Imigrante, e descreveu uma taxa de prevalência de 11,3% em 1.074
pessoas examinadas (Abreu et al, 1998). O Espírito Santo não tem nenhum
estudo de soroprevalência em gestante publicado.
Tabela 1. Estudos sobre a prevalência de toxoplasmose em gestantes
realizados no Brasil de 1985 a 2005.
Autor Ano Local Método
diagnóstico
N Prevalência
%
Meirelles 1985 Rio de janeiro,
RJ
IFI 156 77,1%
Moreira 1988 Salvador, BA IFI 410 42,0%
Vaz et al 1990 São Paulo, SP IFI/HA 481 32,4%
Nóbrega et al 1999 Recife, PE ELISA 1309 69,4 %
Oliveira 2002 Belém, PA ELISA 531 72,7%
Varella et al 2003 Porto Alegre, RS
MEIA 1.261 59,8%
Spalding et al 2003 Alto
Uruguaia,RS
IFI 2.126 74,5 %
Avelino et al 2004 Goiânia, GO IFI 2.242 65,8%
Neto et al 2004 Botucatu, SP Vários* 892 60,0%
Carmo et al 2005 Santa Maria, RS MEIA 553 64,0%
Figueiró-Filho
et al
2005 Campo Grande,
MS
IFI 32.512
92,0%
*Foram utilizadas diferentes metodologias ( IFI, EIA e HAI), sendo assim os resultados foram
classificados como reagente, não reagente ou indeterminado conforme resultado impresso do
laudo.
.
2.7 Toxoplasmose clínica
Nos indivíduos imunocompetentes a infecção assume geralmente caráter
benigno, pois o rápido desenvolvimento de imunidade humoral e celular
restringe a ação patogênica do parasito, o que não acontece em indivíduos
imunocomprometidos (transplantados, SIDA) em que o parasito invade órgãos
e tecidos se reproduzindo como taquizoítos, causando as formas graves da
toxoplasmose.
2.7.1 Toxoplasmose febril aguda
Indivíduos imunocompetentes, quando infectados pelo Toxoplasma gondii,
apenas cerca de 10 a 20% apresentam sintomas da doença (Beamam,1995)
que são inespecíficos e autolimitadas e raramente necessitam de tratamento.
Os sintomas são generalizados, as lesões resultam da proliferação rápida dos
organismos nas células hospedeiras e, quando há manifestações clínicas,
estas têm evolução benigna. Há casos em que ocorrem pneumonia difusa,
miocardite, miosite, hepatite, encefalite e exantema máculo-papular
(Remington, 1974).
2.7.2 Linfadenite toxoplásmica
A linfadenite mesentérica pode estar relacionada à porta de entrada, durante a
síndrome febril aguda. Geralmente, o quadro se caracteriza por linfadenopatia
localizada, especialmente em mulheres e, em geral, envolvendo os nódulos
linfáticos cervicais posteriores ou, mais raramente, linfadenopatia generalizada.
Isso é capaz de persistir por uma semana ou um mês. A linfadenite é
considerada como resposta imunológica mais ou menos adequada.
Hepatosplenomegalia às vezes também é relatada (McCabe et al, 1987).
2.7.3 Toxoplasmose ocular
A retinocoroidite é o achado clínico mais comumente encontrado em indivíduos
com toxoplasmose devido ao tropismo do parasito pela retina (Roberts &
McLeod, 1999). Geralmente a retinocoroidite é devido à reativação da infecção
congênita, mas também pode se apresentar na infecção aguda. Assim dois
tipos de lesões de retina são observados. A primeira, retinite aguda, se
apresenta com intensa inflamação que desaparece após um curto período e se
deve à liberação do antígeno pela ruptura do cisto no processo de invasão
celular e à presença de hipersensibilidade que rapidamente são contidos por
uma imunidade suficientemente capaz de inibir a proliferação dos taquizoítos
liberados. A segunda é a retinite crônica, progressiva, podendo levar a
cegueira, provavelmente devida a uma necrose de células da retina
conseqüente à multiplicação ativa de taquizoítos (Bermudez & Frenkel, 2005).
Glaucoma, deslocamento de retina, hiperemia conjuntiva, dor, fotofobia,
catarata e organização vítrea com opacificação permanente são conseqüências
comuns da toxoplasmose ocular e podem aumentar com o número e a
gravidade das crises (Diniz et al, 1991; Remington et al, 1995).
2.7.4 Toxoplasmose no indivíduo imunocomprometido
A toxoplasmose em pacientes imunodeprimidos ocorre por reativação da
infecção latente, principalmente em pacientes com SIDA/AIDS, mas também
naqueles com doença de Hodgkin ou outros linfomas, assim como em
pacientes em uso de imunossupressores. A toxoplasmose cerebral, dentre
outras infecções oportunistas, apresentou a maior prevalência (21%) em um
estudo com pacientes com SIDA/AIDS (Wainstein,1992). As manifestações
decorrem principalmente de infecção do sistema nervoso central,
apresentando-se como meningoencefalite até lesões parenquimatosas com
efeito de massa, que costumam ser múltiplas. Sinais meníngeos, distúrbios
cognitivos, distúrbios da fala, defeitos no campo visual, transtornos sensoriais,
sinais cerebelares, convulsões e distúrbios do movimento ocorrem dependendo
da área cerebral acometida. Pneumonite intersticial e miocardite também são
freqüentes nestes pacientes (Kasper et al, 1998).
2.7.5 Toxoplasmose congênita
A toxoplasmose pode ser transmitida ao feto durante toda a gravidez, quando
os taquizoítos entram em contato com o feto via placenta. A freqüência de
transmissão aumenta com o decorrer da gestação, 9% no primeiro trimestre,
chegando a 59% no terceiro trimestre de gestação, enquanto que a gravidade
da doença diminui com o avanço da gravidez (Ajzenberg et al, 2002).
Crianças infectadas no primeiro trimestre de gestação podem apresentar a
tétrade de Sabin com hidrocefalia, microcefalia, corio-retinite, calcificações
intracranianas e retardamento mental (Dubey, 1991; Sabin, 1941) resultante da
associação da lesão causada pelo Toxoplasma gondii e a reparação tecidual
fetal que levam à obstrução dos sistemas de transporte do líquido
cefalorraquidiano e grande destruição dos tecidos nervosos como o cérebro e
retina. Comumente, as manifestações ao nascer são prematuridade, baixo
peso, corio-retinite, estrabismo, icterícia e hepatomegalia, e nos exames
laboratoriais encontra-se pleocitose com proteinorraquia. Também podemos
encontrar defeitos endócrinos devido à disfunção hipotalâmica e pituitária.
Estenose do arqueoduto, hidrocefalia interna, necrose periventricular e por
infarto são achados patognômonicos da toxoplasmose (Fuchs et al, 1974). O
recém-nascido assintomático pode desenvolver retinocoroidite, retardo
psicomotor e neurológico na adolescência ou na vida adulta (Frenkel, 1990;
Remington et al, 1995). No Brasil cerca de 2 bebês a cada 1000 nascem por
ano com infecção congênita, e nos EUA as infecções durante a gravidez
ocorrem em 2 casos por mil gestações, com até 50% de infecção
transplacentária (Silveira, 2001).
2.8 Diagnóstico
O diagnóstico da toxoplasmose é realizado principalmente por provas indiretas,
através da detecção de anticorpos contra o Toxoplasma gondii. Apesar de fácil
execução a sorologia da toxoplasmose apresenta-se como uma das mais
complexas, estando em contínua evolução. Exige experiência para a
interpretação de seus resultados. Os métodos diretos, como o isolamento do
parasito, são considerados como de alto valor diagnóstico, mas os métodos
indiretos são os mais usados em laboratórios clínicos. O uso da pesquisa de
imunidade celular com fins de diagnóstico está atualmente em estudo,
principalmente para o diagnóstico da toxoplasmose congênita (Camargo,
2003).
2.8.1 Isolamento do parasito
São métodos parasitológicos onde há evidências do parasito ou de seus
componentes, a partir do isolamento e replicação do patógeno em
camundongos e cultura celular. Utilizam-se materiais biológicos como sangue,
líquor, lavado brônquico-alveolar, placenta, entre outros. Estes métodos
possuem alta especificidade, mas são demorados e apresentam sensibilidade
relativamente baixa. Desse modo, são métodos mais utilizados em laboratórios
de pesquisa e não em rotinas laboratoriais (Desmonts & Remington, 1980).
Além disso, o isolamento do parasito pode evidenciar apenas a presença dos
cistos, não diferenciando infecção aguda e crônica.
2.8.2 Pesquisa de antígenos
Durante a fase aguda da toxoplasmose é possível detectar material antigênico
e complexo imunes dos antígenos parasitários no soro e na urina (Van Knapen
et al, 1985). A pesquisa de antígenos apresenta boa sensibilidade em urina
para o diagnóstico da neurotoxoplasmose. (Fachado et al, 1994). Técnicas
como imuno-histoquímica, também têm sido utilizadas (Camargo, 2003).
2.8.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Atualmente a técnica de PCR tem sido muito utilizada para detecção de
segmentos do DNA do Toxoplasma gondii, sendo capaz de identificar
quantidades mínimas do parasito em diversos materiais biológicos como líquido
amniótico, líquor, sangue de cordocentese de recém-nascidos, sangue venoso
e em fragmentos de tecidos (Howe et al, 1997). Cuidados na interpretação de
seus resultados devem ser tomados, pois apesar da alta sensibilidade, há uma
grande variedade de genes-alvos e de primers utilizados nos ensaios. Os
segmentos de DNA mais investigados têm sido o gene B1 (Hohlfeld et al,
1994), SAG (Aubert et al, 2000), TRG1 (Spalding et al, 2002; Chaves-Borges et
al, 1999).
2.8.4 Diagnóstico sorológico
No ato de penetração na célula hospedeira, o Toxoplasma gondii libera grande
quantidade de antígenos e uma rápida resposta imune celular e humoral é
montada. Altos níveis de anticorpos específicos são produzidos, primeiramente
anticorpos classe IgM e IgA e em seguida IgG de baixa avidez, que com o
passar do tempo são substituídos por anticorpos IgG de alta afinidade em
conseqüência da evolução da resposta imune (Gráfico 1).
Gráfico 1: Evolução temporal de anticorpos específicos anti Toxoplasma gondii
classe IgG, IgM e IgA.
Fonte: Cerba Internacional – Laboratórios de Análises Clínicas.
Os métodos indiretos de diagnóstico residem na detecção desses anticorpos
específicos produzidos pela resposta humoral do indivíduo à infecção
toxoplásmica. Esses métodos são amplamente utilizados em laboratórios
clínicos e de pesquisa (Mineo et al, 1980; Giraldo et al, 2002; Segundo et al
2004; Petersen et al, 2005). As técnicas mais rotineiramente utilizadas são
ELISAS (Testes imunoenzimáticos), IFI (Imunofluorescência indireta) e HAI
(Hemaglutinação Indireta). O diagnóstico sorológico para detecção de
anticorpos específicos classe IgG , IgM e IgA anti Toxoplasma gondii são
usados em larga escala no rastreamento do pré-natal.
2.8.4.1 Pesquisa de anticorpos
O primeiro método de diagnóstico sorológico foi desenvolvido em 1948 por
Sabin & Feldman, chamado teste do corante e conhecido mundialmente como
“dye-test” (Sabin & Feldman, 1948). Esse método clássico, que é altamente
sensível e específico, foi por muito tempo utilizado tanto em inquéritos
epidemiológicos como em diagnóstico, e ainda hoje é considerado teste de
referência para a toxoplasmose. Entretanto caiu em desuso devido a fatores
como necessidade de manutenção de parasitas viáveis e manipulação de
camundongos infectados o que leva ao aumento de risco para os técnicos e ao
aumento de custo. Além disso, a técnica é demorada, laboriosa e não permite
diferenciar a presença de anticorpos classe IgG e IgM.
A partir de 1957 com Jacobs & Lunde tornou-se possível o diagnóstico da
infecção utilizando-se o método de hemaglutinação indireta (Jacobs & Lunde,
1957). Ensaios líticos, como o teste de Fixação do complemento, apesar de
muito sensível caíram em desuso por serem trabalhosos e complexos, já que
necessita de reagentes dependentes do consumo de complemento exógeno
em sistemas padronizados (Sanches, 1996). Abaixo discutiremos os métodos
sorológicos em uso atualmente para o diagnóstico da infecção toxoplásmica.
A- Teste de aglutinação (HA)
Reação baseada no uso de eritrócitos ou partículas inertes como o látex
adsorvido com antígenos do Toxoplasma gondii. Estas hemáceas quando
reagem com anticorpos específicos podem aglutinar e essa aglutinação que é
visível a olho nu, pode ser quantificada por série de diluições no soro. A baixa
sensibilidade e especificidade do teste original foram solucionadas com o uso
de hemáceas de aves recobertas com antígenos completos do parasito. A
detecção de anticorpos IgM separadamente dos anticorpos IgG é possível
devido ao uso de 2-mercaptanol, visto que o 2-ME inativa as moléculas de IgM.
Ocorre então uma redução do título denotando a presença desses anticorpos
de fase aguda (Walls & Remington, 1983; Camargo et al, 1996). Na HAI
anticorpos IgG de baixa avidez têm menor poder aglutinante, resultando em
detecção de títulos baixo, enquanto que nos testes de imunofluorescência e
ELISA a avidez não interfere, resultando em títulos elevados. Essa
discrepância entre os testes pode auxiliar na diferenciação entre infecção
recente e passada (Camargo, 2003).
B- Imunofluorescência indireta (IFI)
Baseado na capacidade das moléculas de anticorpos se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o
antígeno, o teste de IFI têm sido um dos mais utilizados no laboratório apesar
de necessitar de observador bem treinado (Sanches, 1996). Reações falso
positivas na detecção de anticorpos IgM podem ser minimizadas pelo
tratamento do soro analisado com γ-globulina agregada que é capaz de retirar
o fator reumatóide interferente da reação (Camargo et al 1972). Apesar de ser
um teste muito específico, reações falso-positivas podem ser encontradas em
indivíduos com lúpus eritematoso, devido à presença de anticorpos
antinucleares (Bermudez & Frenkel, 2005).
C-Testes imunoenzimáticos (ELISA)
O princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em fase sólida, no
caso, extratos ou frações antigênicas do Toxoplasma gondii enquanto outro
reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade
enzimática como da imunológica do anticorpo. Depois os anticorpos
específicos aderidos são quantificados pela reação enzimática a produtos
coloridos (Pelloux et al, 1998). A capacidade de detectar quantidades
extremamente pequenas de anticorpos, ser bastante específico e ainda de fácil
execução e automação, faz deste ensaio um dos mais utilizados em
laboratórios clínicos e de pesquisa. Mas sua alta sensibilidade interfere na
determinação da curva temporal da infecção, levando-se a detecção de
anticorpos classe IgM até 18 meses após a fase aguda, o que pode
descaracterizar o diagnóstico de infecção aguda (Jones et al, 2001). Assim
cuidados devem existir na interpretação dos resultados de sorologia positiva
para IgM durante o screening de pré-natal.
Atualmente tem sido empregado a pesquisa de avidez de anticorpos IgG. Este
método baseia-se na avaliação da afinidade de ligação entre anticorpos IgG e
seus antígenos específicos (Lappalainen & Hedman, 2004; Remington et al,
2004). A medida desta afinidade se dá numa evolução característica, sendo
seu aumento dependente da maturação da resposta imune (Einsen & Siskind,
1964). Imunologicamente, o aumento progressivo de anticorpos IgG de alta
avidez ocorre pela seleção de clones de células B. Linfócitos de baixa
afinidade sofrem apoptose no folículo, envolvendo o gene Bcl-2 e os de alta
afinidade são selecionados como células de memória (Tarlinton & Smith, 2000).
Estudos demonstraram que a medida de avidez pode ser um bom marcador de
tempo de infecção, auxiliando no diagnóstico de casos em que anticorpos IgM
estão presentes (Tabela 2), mas problemas na padronização do agente
caotrópico, concentração dos mesmos e escolha do método (diluição ou
eluição) têm dificultado a comparação de resultados entre os ensaios de avidez
(Suzuki et al, 2001).
Tabela 2: Significado do diagnóstico laboratorial de toxoplasmose, segundo
pesquisa de anticorpos.
IgG IgM IgA Avidez Diagnóstico
Negativo Negativo Negativo - Sem infecção
Negativo Positivo Negativo - Infecção aguda
Negativo Positivo Positivo - Infecção aguda
Positivo Positivo Positivo baixa Infecção aguda
Positivo Positivo Positivo alta Infecção crônica
Positivo Positivo Negativo alta Infecção crônica
positivo Negativo Negativo alta Infecção crônica
2.9 Tratamento
O diagnóstico correto é de essencial importância na adoção de medidas
profiláticas e terapêuticas para minimizar a transmissão vertical e a ocorrência
de danos ao desenvolvimento fetal (Remington et al, 2001). Como ainda não
há um esquema terapêutico que elimine o Toxoplasma gondii, o tratamento da
toxoplasmose tem sido realizado na tentativa de diminuir a ação do parasito,
inibindo a sua proliferação no organismo humano e assim minimizando os
efeitos da infecção (Deroin, 2001).
O tratamento clássico utiliza a combinação de sulfadiazina e pirimetamina
alternando com a espiramicina. Mais recentemente a sulfaziadina tem sido
substituída pela sulfadoxina. Novos fármacos que atuam contra o Toxoplasma
gondii têm sido testados (ex: azitromocina, clindamicina) (Petersen, 2003). A
suplementação com ácido folínico é necessária, pois a pirimetamina é uma
droga de efeito antagonista ao ácido fólico levando a depressão gradual e
reversível da medula óssea, com neutropenia, anemia e plaquetopenia. O uso
da pirimetamina deve ser evitado no 1º trimestre de gestação por essa ser
teratogênica (Jones et al, 2001). A Secretaria de Saúde de Município de Vitória
utiliza a conduta descrita na Tabela 3 para o tratamento de gestantes com
suspeita de toxoplasmose aguda.
Tabela 3 - Conduta terapêutica adotada em gestantes com diagnóstico de
toxoplasmose, recomendada pela Secretaria de Saúde de Vitória.
Semanas de gestação Esquema terapêutico
Diagnóstico até 19º semana Espiramicina
A partir da 16º semana PCR de líquido amniótico
Negativo positivo ou não realizado
20 a 22 semanas Espiramicina S + P+ AF*
23 a 25 semanas Espiramicina Espiramicina
26 a 28 semanas Espiramicina S + P+ AF*
29 a 31 semanas Espiramicina Espiramicina
32 a 34 semanas Espiramicina S + P+ AF*
35 semana até o parto Espiramicina Espiramicina
* S: Sulfadiazina + P: PIRIMETAMINA + AF: Ácido Folínico.
Avaliação por PCR do líquido amniótico: pedir o consentimento livre e esclarecido para a investigação.
Fonte: Protocolo Saúde da Mulher – SEMUS/PMV, 2004.
2.10 Profilaxia e vacinação
Como a infecção pelo Toxoplasma gondii tem mais facilidade de ser tornar
doença no feto, criança e imunossuprimidos, a profilaxia deve ser mais
recomendável para gestantes, crianças e indivíduos imunossuprimidos
(Bermudez & Frenkel, 2005).
Na prevenção, as orientações de higiene, dieta e cuidados com animais
domésticos são essenciais. Portanto, evitar a ingestão de carnes cruas ou mal
cozidas e queijos frescos, lavar bem frutas e verduras e ainda limpar
reservatórios de água são consideradas medidas profiláticas importantes
(Hiramoto et al, 2001). Em gestantes, que apresentem sorologia negativa para
anticorpos classe IgG e IgM contra o Toxoplasma gondii as orientações devem
ser intensificadas. Ainda como prevenção de transmissão vertical e infecção
fetal deve-se realizar a triagem sorológica no primeiro trimestre de gravidez
(Remington et al, 1995).
Vacinas experimentais têm sido desenvolvidas com a intenção de imunizar
mulheres em idade fértil e receptores de transplantes cardíacos com sorologia
negativa para a toxoplasmose (Galisteo Jr, 2004). Além da vacinação humana,
o uso de taquizoítos irradiados em vacina oral para felinos domésticos e
selvagens tem sido desenvolvido (Galisteo Jr, 2004).
3.0 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Descrever a soroprevalência da infecção pelo Toxoplasma gondii em gestantes
atendidas nas Unidades de Saúde do município de Vitória, ES.
3.2 Objetivos Específicos
3.2.1 Determinar a prevalência de anticorpos IgG específicos contra o
Toxoplasma gondii em gestantes atendidas nas Unidades de Saúde
3.2.2 Determinar a prevalência de anticorpos IgM específicos contra o
Toxoplasma gondii em gestantes atendidas nas Unidades de Saúde
3.2.3 Avaliar os possíveis fatores associados para a infecção pelo Toxoplasma
gondii.
3.2.4 Avaliar o comportamento dos anticorpos IgG baixa avidez nas gestantes
que possuírem sorologia positiva para anticorpos classe IgM contra o
Toxoplasma gondii.
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 População do estudo
Gestantes, em primeira consulta de pré-natal, atendidas nas Unidades de
Saúde do Município de Vitória - ES, no período de janeiro a dezembro de 2006.
4.2. Delineamento do estudo
Estudo de corte transversal realizado com gestantes atendidas nas 28
Unidades básicas de Saúde dispostas em seis regiões de saúde do Município
de Vitória (Figura 3).
Figura 3: Mapa das unidades básicas de saúde de Vitória dispostas nas regiões de saúde.
Fonte: Semus/2006.
4.3. Coleta de dados
As informações utilizadas no estudo foram obtidas através de uma entrevista
face-a-face contendo dados sócio-demográficos, epidemiológicos e clínicos,
tais como: idade, escolaridade, estado civil, residência, profissão, número de
gestações e abortos, tipo de parto, comportamento de risco para toxoplasmose,
idade gestacional e sorologia anterior para toxoplasmose (Anexo1), após
assinatura do termo de consentimento esclarecido.
4.4 Aspectos éticos
Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo (CEP-
CCS-UFES) (Anexo 2).
As informações relatadas pelas participantes somente foram utilizadas para a
proposta da pesquisa. A confidencialidade dos dados foi protegida durante todo
o tempo, informações que pudessem facilitar a identificação foram anotadas
somente no questionário da pesquisa e de forma codificada. Todas as
gestantes que aceitaram participar do projeto foram informadas dos objetivos
da pesquisa e assinaram um termo de consentimento escrito no momento da
realização da entrevista (Anexo 3). As gestantes diagnosticadas com
toxoplasmose receberam aconselhamento e tratamento específico.
4.5 Cálculo do tamanho da amostra
No Município de Vitória são atendidas aproximadamente 4.200 gestantes/ano,
sendo que em média 3.066 são atendidas no serviço público de saúde
(DATASUS, 2006).
O tamanho da amostra foi calculado para estimar a taxa de prevalência de
infecção pelo Toxoplasma gondii na população de gestantes atendidas nas
unidades de saúde de Vitória, com um intervalo de 95% de confiança de
tamanho bilateral de 0,5%. Tomou-se como base para cálculo uma taxa de
infecção aguda de 1% (Meirelles,1985, Nascimento et al,2002, Reiche et
al,2000, Mozzato et al,2003 e Varella et al,2003) o que gerou um número de
1.137 gestantes. Supondo uma perda de 15%, o tamanho de amostra final foi
de 1.308 gestantes, o que representa 42,7% das gestantes atendidas no
serviço público de saúde. As gestantes foram selecionadas proporcionalmente,
segundo número de atendimento nas 28 Unidades básicas de Saúde dispostas
nas seis regiões de saúde do Município de Vitória.
4.6 Coleta, transporte e conservação das amostras biológicas
As amostras de sangue das gestantes incluídas no estudo foram coletadas em
tubos sem anticoagulante com gel separador (4mL) e identificados conforme
protocolo de coleta para exames sorológicos do Laboratório Municipal de
Análises Clínicas do Município de Vitória.
As amostram de sangue eram transportadas até o laboratório em caixas
térmicas e controle de temperatura. Depois de recebidas, as amostras eram
centrifugadas a 3.500 rpm por 15 minutos para separação do soro. Quando os
ensaios não eram realizados no mesmo dia, as amostra eram conservadas à
temperatura entre 2º e 8ºC para serem processadas no prazo máximo de 48
horas após coleta ou então as amostras eram congeladas à -20ºC por 7 dias.
4.7 Metodologias utilizadas na detecção dos anticorpos específicos anti
Toxoplasma gondii
Para análise das 1153 amostras utilizou-se o método de quimioluminescência
(equipamento Liaison - DiaSorin) na detecção de anticorpos específicos IgG e
IgM contra o Toxoplasma gondii, e pesquisa de avidez de IgG nas amostras
IgM positivas ou indeterminadas. A metodologia ELFA - Enzyme Linked
Fluorescent Assay (equipamento mini-vidas - Biolab-Merrieux) foi utilizada para
detecção de anticorpos IgM e avidez de IgG nas amostras que apresentaram
resultados positivos ou indeterminados para IgM pelo método de
quimioluminescência.
4.8 Descrição das técnicas utilizadas no diagnóstico laboratorial
4.8.1. Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para
determinação quantitativa de anticorpos classe IgG contra o Toxoplasma
gondii.
Teste indireto baseado no princípio da quimioluminescência (CLIA). Na fase
sólida é utilizado o antígeno do parasita (cepa RH de T.gondii inativado) para
revestir as partículas magnéticas e um anticorpo monoclonal de camundongo
anti-IgG humana é ligado a um derivado do isoluminol (conjugado anticorpo-
isoluminol). Durante a primeira incubação, os anticorpos anti-Toxoplasma
gondii presentes nos calibradores, amostras ou nos controles ligam-se à fase
sólida. Na segunda incubação, o anticorpo conjugado reage com a IgG anti-
Toxoplasma gondii já ligada a fase sólida. Depois de cada incubação, o
material não ligado é removido mediante um ciclo de lavagem.
Em seguida, adicionam-se os reagentes iniciadores que induzem uma reação
de quimioluminescência. O sinal luminoso é derivado da quantidade de
conjugado anticorpo-isoluminol e é medido por um fotomultiplicador em
unidades relativas de luz (RLU). Essa medida é indicativo da concentração de
IgG anti-Toxoplasma gondii presente nos calibradores, amostras e controles.
Todos os reagentes são prontos para uso e todo o procedimento seguiu
estritamente as instruções do fabricante.
Interpretação dos resultados: O intervalo de medição é de 0 a 500 UI/mL de
IgG anti-Toxoplasma gondii, quando uma amostra contêm concentrações de
anticorpos acima do intervalo de medição podem ser pré-diluídas através da
função Dilute do equipamento e testada novamente.
- Amostras com concentração de IgG anti-Toxoplasma gondii abaixo de 6UI/mL
são consideradas negativas.
- Amostras com concentração de IgG anti -Toxoplasma gondii entre 6 e 8UI/mL
são consideradas duvidosas.
- Amostras com concentração de IgG anti -Toxoplasma gondii acima de 8UI/mL
são consideradas positivas.
Sensibilidade do teste: 99,35%
Especificidade do teste: 99,68%
4.8.2 Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para
determinação quantitativa de anticorpos classe IgM contra o Toxoplasma
gondii.
Teste de captura de anticorpos baseado no princípio da quimioluminescência
(CLIA). Na fase sólida partículas magnéticas são revestidas com uma IgG
monoclonal de camundongo anti-IgM humana, e um anticorpo monoclonal de
camundongo anti-Toxoplasma gondii é ligado a um derivado do isoluminol
(conjugado anticorpo-isoluminol). Durante a primeira incubação, os anticorpos
de classe IgM presentes nos calibradores, amostras e controles ligam-se à fase
sólida. Durante a segunda incubação, o anticorpo conjugado reage com o
antígeno do parasito (cepa RH de T.gondii inativado obtidos por sonificação e
extração de trofozoítos) adicionado anteriormente e o complexo imune formado
reage com a IgM já ligada à fase sólida. Depois de cada incubação, o material
não ligado é removido mediante um ciclo de lavagem.
Em seguida, adicionam-se os reagentes iniciadores que induzem uma reação
de quimioluminescência. O sinal luminoso é a quantidade de conjugado
anticorpo-isoluminosol e é medido por um foto multiplicador em unidades
relativas de luz (RLU) e indica a quantidade da concentração de IgM anti-
Toxoplasma gondii presente nos calibradores, amostras e controles. Todos os
reagentes são prontos para uso e todo o procedimento seguiu estritamente as
instruções do fabricante.
Interpretação dos resultados: O intervelo de medição é de 0 a 160 AU/mL de
IgG anti-Toxoplasma gondii, quando uma amostra contêm concentrações de
anticorpos acima do intervalo de medição podem ser pré-diluídas através da
função Dilute do equipamento e testada novamente.
- Amostras com concentração de IgM anti-Toxoplasma gondii abaixo de 6UI/mL
são consideradas negativas.
- Amostras com concentração de IgM anti-Toxoplasma gondii entre 6 e 8UI/mL
são consideradas duvidosas.
- Amostras com concentração de IgM anti-Toxoplasma gondii acima de 8UI/mL
são consideradas positivas.
Sensibilidade do teste: 100,0%
Especificidade do teste: 98,49%
4.8.3 Ensaio CLIA (Tecnologia de Quimioluminescência) para avaliação de
anticorpos classe IgG avidez contra o Toxoplasma gondii.
Teste indireto baseado no princípio da quimioluminescência (CLIA). Nesse
ensaio dois testes em conjuntos são ensaiados nos calibradores, amostra e
controles:
1- testes não tratados com tampão de Uréia (teste de referência) e
2- testes tratados com tampão de uréia.
A avidez dos anticorpos IgG presentes é determinada pela diferença entre os
testes não tratados com uréia e os testes tratados com uréia. A uréia funciona
como um separador de anticorpos de alta e baixa avidez, pois modifica as
ligações antígeno-anticorpo (Ag/Ac), destruindo as ligações de baixa avidez.
Na fase sólida partículas magnéticas são revestidas com a cepa RH do
Toxoplasma gondii (obtido por sonificação e extração de antígenos de
taquizoítos) e um anticorpo monoclonal de camundongo anti-IgG humana é
ligado a um derivado do isoluminol (conjugado anticorpo-isoluminol). Durante a
primeira incubação, os anticorpos anti-Toxoplasma gondii presentes nos
calibradores, amostras e controles ligam-se à fase sólida (teste 1 de referência
e teste 2). Durante a segunda incubação, o agente separador modifica as
ligações entre Ag/Ac no teste tratado com uréia. Só os testes de alta avidez
permanecem ligados na fase sólida, enquanto os de baixa avidez são
eliminados na lavagem. Na última incubação, o anticorpo conjugado reage com
a IgG anti-Toxoplasma gondii já ligada à fase sólida tanto no teste de
referência quanto no teste tratado com uréia. Depois de cada incubação, o
material não ligado é removido mediante um ciclo de lavagem.
Em seguida, adicionam-se os reagentes iniciadores que induzem uma reação
de quimioluminescência. O sinal luminoso é relativo à quantidade de conjugado
anticorpo-isoluminol e é medido por um fotomultiplicador em unidades relativa
de luz (RLU) indicando a concentração de IgG anti-Toxoplasma gondii presente
nos calibradores, amostras e controles.
O índice de avidez da ligação da IgG é dado pela relação entre o teste tratado
com uréia e o teste de referência (não tratado com uréia).
Interpretação dos resultados: Intervalo de medição: 0 a 1,00 de índice de
avidez (Av). Se a amostra apresentar níveis de IgG superior a 500 UI/mlL
devem ser diluídas previamente.
- amostras com valor de índice de avidez abaixo de 0,20 devem ser
classificadas como de baixa avidez, e sugere uma infecção primária adquirida
antes de 4 meses.
- amostras com valor de índice de avidez entre 0,20 e 0,25 devem ser
consideradas como de avidez moderada.
- amostras com índice de avidez superior a 0,25 devem ser consideradas como
de alta avidez, e pode excluir que a infecção primária tenha sido adquirida
antes de 4 meses.
4.8.4 Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para detecção
quantitativa de anticorpos classe IgG contra o Toxoplasma gondii.
Teste que associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com
uma detecção final em ELFA.
Na primeira etapa os anticorpos anti-Toxoplasma gondii se presentes na
amostra vai se fixar aos antígenos toxoplásmicos membranários e citoplásmico
da cepa RH Sabin presos no interior do cone. Na segunda etapa as IgGs
monoclonais de rato anti-IgG humanas conjugadas com com fosfatase alcalina
são dispensadas no cone ligam-se as IgGs humanas presas no antígeno.
Durante a fase final de revelação, o substrato (4-Metil-umbeliferilfosfato) é
adicionado à reação. Então a enzima do conjugado cataliza a reação de
hidrólise desse substrato em 4-Metl-umbeliferona cuja fluorescência emitida é
medida a 450nm. O valor do sinal da fluorescência é proporcional à
concentração de anticorpos específicos na amostra. Ao final de cada incubação
etapas de lavagem eliminam os componentes não fixados.
Interpretação dos resultados:
Negativo: valores inferiores a 4,0 UI/mL de anticorpos contra o Toxoplasma
gondii.
Indeterminado: valores entre 4 e 8 UI/mL de anticorpos contra o Toxoplasma
gondii.
Positivo: valores superiores a 8 UI/mL de anticorpos contra o Toxoplasma
gondii.
As amostras que apresentarem concentrações superiores a 300 UI/mL deverão
ser diluídas em controle negativo e testadas novamente.
Sensibilidade do teste: 99,65%
Especificidade do teste: 99,92%
4.8.5. Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para detecção
quantitativa de anticorpos classe IgM contra o Toxoplasma gondii.
Teste que associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com
uma detecção final em ELFA. Os anticorpos IgM anti-Toxoplasma gondii se
presentes na amostra são capturados pelos anticorpos de cabra policlonais
anti-cadeia µ humana presentes no cone de reação. A IgM anti-Toxoplasma
gondii são detectadas especificamente pelo antígeno toxoplásmico cepa RH
Sabin, esse mesmo revelado por um anticorpo monoclonal de murino anti-P30
do Toxoplasma gondii, conjugado com fosfatase alcalina.
Durante a etapa final de revelação, o substrato 4-Metilumbeliferil é adicionado
ao poço de reação. A enzima de reação cataliza a hidrólise do desse substrato
em 4-Metilumbeliferona cuja fluorescência emitida é medida a 450nm. O valor
do sinal da fluorescência é proporcional à concentração de anticorpos
específicos na amostra. Ao final de cada incubação etapas de lavagem
eliminam os componentes não fixados.
Interpretação dos resultados: O equipamento calcula para cada amostra um
valor de teste (índice) que é a relação entre o seu RFV (Reactive Fluorescence
Value) e o do calibrador.
Negativo: índice inferior a 0,55
Indeterminado: índice entre 0,55 e 0,65
Positivo: índice superior a 0,65
Sensibilidade do teste: 96,0%
Especificidade do teste: 99,25%
4.8.6. Ensaio ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) para avaliação de
anticorpos classe IgG avidez contra o Toxoplasma gondii.
Teste que associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com
uma detecção final em ELFA. No decurso da reação, é adicionada uréia que é
o agente de perturbação da ligação antígeno-anticorpo. A uréia tem pouco
efeito sobre as ligações de forte avidez e muito efeito dissociante nas ligações
de anticorpos de fraca avidez. A comparação entre os resultados obtidos nas
reações com ou sem a uréia equivale a uma medida de avidez.
O teste utiliza um barrete duplo onde são realizados conjuntamente o teste de
referência e teste com o agente dissociante. O teste é realizado como no
ensaio para detecção de anticorpos IgG acima citado.
Interpretação dos resultados: Para interpretar o resultado o equipamento
calcula automaticamente o índice de relação entre a RFV do teste com agente
dissociante sobre a RFV do teste sem o agente dissociante.
Baixa avidez: índice inferior a 0,200
Avidez indeterminada: valor de índice entre 0,200 e 0,300
Alta avidez: valor de índice superior a 0,300. Esse valor pode indicar que a
primo infecção tenha ocorrido a mais de 4 meses.
4.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando-se o SPSS versão 9.0 para
Windows. Inicialmente foi realizada uma análise descritiva, incluindo
distribuição de freqüência para variáveis qualitativas e cálculo de média e
desvio-padrão para variáveis quantitativas. As taxas de prevalência de
anticorpos IgG e IgM para toxoplasmose foram estimadas pela presença de
anticorpos IgG e IgM positivos, respectivamente. As taxas foram fornecidas
pela freqüência do diagnóstico em questão, sendo calculado o correspondente
intervalo de confiança de 95%. As possíveis associações entre toxoplasmose e
comportamentos de risco ou variáveis demográficas e clínicas foram testadas
através de testes de qui-quadrado com correção de Yates ou de Fischer
quando apropriado. Odds Ratio e intervalos de confiança foram calculados em
análises bivariadas para estimar o grau de associação entre a infecção e os
potenciais fatores de risco. Análise multivariada de regressão logística foi
utilizada para estimar o efeito de uma variável, ao mesmo tempo em que se
controla o efeito das demais, na probabilidade de apresentar anticorpos IgG e
IgM para toxoplasmose na gravidez.
5. RESULTADOS
Do total de 1.308 gestantes selecionadas, 1.153 participaram do estudo o que
representa 88,1% da amostra inicialmente selecionada. A mediana de idade foi
de 24 anos (intervalo interquartil de 20 a 30 anos) e média de escolaridade
8,24 anos (DP 3,01).
5.1 Freqüência de infecção pelo Toxoplasma gondii em gestantes
atendidas na rede Municipal de Saúde de Vitória, ES
A prevalência de anticorpos IgG para toxoplasmose foi de 73,5% (IC 95%
70,9%-76,1%) e 1,3% (IC 95% 0,6%-1,9%) de anticorpos IgM. A distribuição
das 1.153 gestantes quanto à susceptibilidade para toxoplasmose foi de 26,5%
(IC 95% 23,9%-29,0%) gestantes susceptíveis e 72,2% (IC 95% 69,6%-74,8%)
de imunes. Na análise de avidez seis das 15 gestantes com IgM positivo ou
indeterminado apresentaram avidez fraca ou intermediária (Tabela 4).
Tabela 4: Distribuição da freqüência de positividade dos anticorpos classe IgG,
IgM e avidez de IgG entre as gestantes atendidas no pré-natal das unidades de
saúde de Vitória em 2006.
Anticorpos n/N %
IgG negativas
IgG positivas*
IgM negativas
IgM positivas*
Avidez de IgG
(fraca e intermediária)
Avidez de IgG (alta)
306/1153
847/1153
1138/1153
15/1153
6/15
9/15
26,5
73,5
98,7
1,3
40,0
60,0
* As amostras que apresentaram resultados indeterminados foram contadas como positivas.
5.2 Distribuição, segundo região de saúde, das 1.153 gestantes atendidas
na rede Municipal de Saúde de Vitória, ES
Em relação à região de saúde do município, 41,5% das gestantes realizaram
pré-natal nas unidades de Maruípe.
Continental
11,1%
Maruípe
41,5%
São Pedro
32,3%
Santo Antônio
5,3%
Forte São João
1,3%
Centro
8,5%
Figura 4: Distribuição das 1.153 gestantes incluídas no estudo segundo as
regiões de saúde do município.
5.3 Dados sócio-econômicos das 1.153 gestantes atendidas na rede
Municipal de Saúde de Vitória, ES
Na Tabela 5 estão descritos os dados sócio-demográficos das gestantes. Foi
observado que 69,8% delas são casadas ou vivem maritalmente com
companheiro estável; 64,3% nasceram na capital; 48,2% possuem renda
familiar menor do que três salários mínimos e 72,3% moram em casa com
menos de cinco pessoas.
Tabela 5: Dados sócio-demográficos das 1.153 gestantes atendidas no pré-
natal das unidades de saúde de Vitória em 2006.
Variáveis N %
Idade (anos)
13 a 19
20 a 29
30 a 39
Mais de 40
283
580
271
19
24,5
50,3
23,5
1,7
Escolaridade (anos)
Analfabeto
1 a 4 anos
5 a 8 anos
9 a 11 anos
Mais que 12 anos
14
117
494
417
111
1,2
10,1
42,8
36,2
9,6
Estado civil
Solteira
Casada/vive junto
Outros
333
805
15
28,9
69,8
1,3
Região de origem
Maruípe
São Pedro
Continental
Centro
Centro Santo Antônio
Forte São João
479
372
128
98
61
15
41,5
32,3
11,1
8,5
5,3
1,3
Renda familiar (SM)*
Até 1
1 a 3
4 a 5
Mais de 5
430
556
134
33
37,3
48,2
11,6
2,9
Nº de habitantes por moradia
1 a 4
5 a 8
Mais de 8
833
293
27
72,3
25,4
2,3
* SM: salário mínimo. 1 SM=R$ 350,00.
5.4 Dados gestacionais das 1.153 gestantes atendidas na rede Municipal
de Saúde de Vitória, ES
A Tabela 6 mostra que 51% das gestantes apresentavam idade gestacional
menor que 25 semanas no momento da entrevista; 44% eram primíparas,
16,9% relatou história de aborto espontâneo e 96,2% relatou nunca ter
provocado aborto.
Tabela 6: Dados gestacionais das 1.153 gestantes atendidas no pré-natal das
unidades de saúde de Vitória em 2006.
Variáveis N %
Idade gestacional (semanas)
12 ou menos
13 a 24
25 a 36
37 ou mais
118
470
303
262
10,2
40,8
26,3
22,7
Número de gestações
Uma
Duas a três
Quatro ou mais
507
493
153
44,0
42,8
13,2
Número de filhos
Nenhum
1 a 2
3 a 4
5 ou mais
507
491
123
32
44,0
42,6
10,6
2,8
Aborto espontâneo
Nenhum
Um
Dois ou mais
959
160
34
83,1
14,0
2,9
Aborto provocado
Nenhum
Um
Dois ou mais
1109
33
11
96,2
2,9
0,9
5.5 Resultados relacionados à concordância entre os dois métodos de
detecção de anticorpos IgM e de avidez de IgG.
Para essas análises foram considerados os resultados obtidos pelo
equipamento Liaison. Das 15 amostras IgM positivas houve concordância de
resultados para detecção de IgM em 13 (86,6%) amostras e discordância
entre outras 2 (13,3%). Quinze amostras foram positivas e/ ou indeterminadas
no Liaison, e 13 amostras foram positivas e/ ou indeterminadas no sistema
Vidas.
Em relação à distribuição da freqüência da avidez de IgG das 15 amostras
positivas para IgM no Liaison (Diasorin), 60% apresentaram alta avidez de IgG.
Houve concordância na baixa avidez em duas amostras quando comparadas
as duas metodologias utilizadas na determinação da avidez de IgG (Tabela 7).
Tabela 7 – Correlação entre as duas metodologias utilizadas na pesquisa de
avidez de IgG das 15 amostras IgM positivas no Liaison (Diasorin).
Índice de avidez de IgG
Liaison assay
Nº %
Mini-Vidas assay
Nº %
Baixa
Intermediária
Alta
2 13,3
4 26,7
9 60,0
2 13,3
2 13,3
11 73,4
5.6 Dados demográficos e obstétricos das 15 gestantes com suspeita de
infecção aguda atendidas na rede Municipal de Saúde de Vitória, ES
A Tabela 8 demonstra que entre as 15 gestantes com suspeita de infecção
aguda, 46,7% têm menos de 29 anos, 40% possuem até quatro anos de
estudo, 46,7% tem renda familiar de até um salário mínimo, 20% estavam com
até 12 semanas de gestação. Apenas uma gestante (6,7%) relatou estar na
primeira gravidez.
Ainda em relação à Tabela 8, considerando os dados das gestantes que
apresentaram baixa avidez (duas gestantes) podemos observar que: têm idade
inferior a 29 anos; uma possui até quatro anos de estudo; possuem renda
familiar de até três salários mínimos; estão com até 32 semanas de gestação; e
já tiveram outra gestação. Em relação as nove gestantes que apresentaram
alta avidez de IgG o dado mais significantes foi que duas (13,3%) tinham até 12
semanas de gestação, o que reduziria a possível prevalência de infecção
aguda para 1,1%.
Tabela 8: Dados demográficos e obstétricos das 15 gestantes com suspeita de
infecção toxoplásmica aguda (IgM positivo ou indeterminado), todas
apresentaram resultado de IgG positivo.
Gestante
Proce-
dência
Idade
(anos)
Escola-
ridade
Renda
familiar
Idade
Gestac.
Nº de
gestações
Nº de
Partos
Avidez
de IgG
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
ES
Vitória
Vitória
Vitória
MG
Vitória
Vitória
Vitória
Vitória
BA
MG
Vitória
BA
RJ
PE
31
16
27
18
35
20
21
20
35
23
36
30
33
41
29
4
8
12
10
2
4
6
3
3
6
12
12
6
2
5
1 a 3
1 a 3
1 a 3
Até 1
Até 1
Até 1
3 a 5
Até 1
Até 1
Até 1
+ de 5
Até 1
1 a 3
1 a 3
3 a 5
12
32
12
28
40
32
16
40
28
40
12
18
40
40
32
2
2
5
1
7
3
3
3
6
3
3
3
2
3
3
1
1
3
0
6
1
2
1
5
2
1
1
1
2
2
Alta
Baixa
Alta
Alta
Ind.
Baixa
Ind.
Alta
Alta
Alta
Ind.
Ind.
Alta
Alta
Alta
Escolaridade (anos de estudo); renda familiar (salário mínimo); idade gestacional (semanas);
Indeterminada (Ind.)
5.7 Correlação entre a presença de fatores de risco para aquisição de
toxoplasmose em gestantes atendidas na rede Municipal de Saúde de
Vitória, ES
Houve correlação estatisticamente significante de IgG e IgM positivas com
anos de estudo. Houve também correlação entre a aquisição de carnes em
feiras livres e sorologia positiva para IgG. Não houve associação entre os
outros fatores e o resultado positivo de anticorpos IgG e IgM (Tabela 9).
Tabela 9: Correlação entre os fatores de risco para aquisição de toxoplasmose
e resultados de anticorpos IgG e IgM positivos nas 1153 gestantes atendidas
no pré-natal das unidades de saúde de Vitória em 2006.
Fator de risco Nº + com
IgG+
OR
(IC 95%)
Nº+ com
IgM+
OR
(IC95%)
Idade
30 anos ou mais
225
77,6%
1,34
(0,98 – 1,84)
7
2,4%
2,64
(0,95 – 7,36)
Escolaridade
Até 4 anos
106
80,9%
1,61
(1,02 – 2,54)
6
5,6%
5,40
(1,89 – 15,43)
Renda familiar
Até 3 SM
729
73,9%
1,18
(0,82 – 1,70)
12
1,2%
0,67
(0,19 – 2,41)
Idade gestacional
Até 12 semanas
91
77,1%
1,24
(0,79 – 1,95)
3
2,5%
2,22
(0,62 – 7,99)
Aquisição de carnes
em feiras livres
82
83,7%
1,94
(1,12 – 3,38)
1
1,0%
0,77
(0,10 – 5,89)
Ingestão de carnes
cruas
158
76,3%
1,20
(0,85 – 1,71)
3
1,4%
1,15
(0,32 – 4,09)
Hábito de comer
churrasquinho de rua
413
75,1%
1,17
(0,90 – 1,53)
9
1,6%
1,66
(0,59 – 4,68)
Presença de animais
domésticos
285
76,8%
1,23
(0,97 – 1,73)
8
2,2%
2,44
(0,88 – 6,78)
Trabalhos manuais
com terra e areia
85
78,7%
1,37
(0,85 – 2,22)
2
1,9%
1,50
(0,33 – 6,73)
No modelo final de regressão logística a presença de anticorpos IgG esteve
independentemente associada à aquisição de carne em feiras livres [OR:1,78
(IC95% 1,02-3,13). Já a presença de anticorpos IgM durante a gravidez
apresentou associação com uma menor escolaridade (até quatro anos de
estudo) [OR:5,30 (IC95% 1,67-16,83)].
6. DISCUSSÃO
Este foi o primeiro estudo de soroprevalência de toxoplasmose em gestantes
realizado no município de Vitória e também no estado do Espírito Santo. Foram
analisadas gestantes na faixa etária de 13 a 43 anos, residentes no Município
de Vitória e assistidas pelo PSF. A taxa de participação no estudo foi alta,
quase 90,0% da amostra selecionada. A prevalência de infecção latente
encontrada foi de 72,25%, taxa de acordo com outros estudos brasileiros que
relataram dados variando de 59,8% a 92,0% (Avelino et al, 2004; Figueiró-Filho
et al, 2005; Nóbrega et al,1999; Spalding et al,2003 e Varella et al, 2003).
Foi considerado como indicador de infecção aguda a presença de anticorpos
IgM, que neste estudo foi de 1,3% das gestantes. Este resultado está em
concordância com outros estudos realizados no Brasil que utilizaram a
detecção de IgM na avaliação de infecção aguda, como por exemplo, Rio de
Janeiro,1,4% (Meirelles,1985); Bahia, 1,19% (Nascimento et al,2002), e Paraná
1,8% (Reiche et al,2000). Em Pernambuco, a prevalência de infecção aguda foi
maior: 2,4% (Nóbrega et al,1999) e em Mato Grosso do Sul menor: 0,42%
(Figueiró-Filho et al, 2005). Já em trabalhos realizados no Rio Grande do Sul a
prevalência variou de 0,6% a 2,4% (Mozzato et al, 2003; Varella et al, 2003).
As diferenças encontradas podem ser devidas aos diferentes hábitos
alimentares que ocorrem entre os estados como também às variações
climáticas e condições sócio-demográficas. Além disso, populações que já
possuem alta prevalência de infecção crônica tendem a ter menor risco de
infecção aguda como aconteceu no estudo de Figueiró Filho et al em Mato
Grosso do Sul (IgG – 92% e IgM – 0,42%).
Para este estudo, o diagnóstico laboratorial de infecção pelo Toxoplasma
gondii foi totalmente realizado no Laboratório Municipal de Vitória que
atualmente utiliza técnicas de quimioluminescência (CLIA) na rotina e
eletroquimioluminescência (ELFA) como 2º método para detecção de
anticorpos específicos, classe IgM, IgG e avidez de IgG no rastreamento
sorológico em gestantes. As amostras que apresentaram resultados
indeterminados para IgM foram consideradas como positivas para efeito de
análise. Apesar da análise de anticorpos IgM no sangue materno não ser
suficiente para diferenciar a infecção aguda da pregressa, todas as gestantes
receberam o tratamento independentemente do resultado de IgM ser positivo
ou indeterminado.
A maioria dos testes de detecção de anticorpos IgM contra o Toxoplasma
gondii disponíveis no mercado apresenta boa especificidade, mesmo assim,
resultados falso-positivos podem ser encontrados e por esses testes
apresentarem alta sensibilidade podem ser capazes de detectar anticorpos IgM
residuais por meses ou anos após a infecção aguda (Naot & Remington,1980;
Liesenfeld et al,1997; Wilson et al,1997). Esta possibilidade de detecção de
anticorpos IgM residuais torna muito mais complexa a diferenciação da
infecção aguda da pregressa. Por isso o uso de um teste auxiliar como
ferramenta para tentar estabelecer o período mais provável da infecção passa
a ser imprescindível. Com este objetivo os laboratórios clínicos têm introduzido
a pesquisa de avidez de IgG em casos de sorologia positiva para IgM
subsidiando um diagnóstico clínico mais eficaz. Muitos estudos relatam a
eficácia deste teste como capaz de definir melhor o período no qual ocorreu a
infecção do que somente a detecção de anticorpos IgM (Jones et al, 2001),
mesmo assim cuidados são necessários na escolha do método, pois há
dificuldades relativas à concentração e tipo do agente caotrópico utilizado nos
diferentes testes existentes no mercado (Suzuky et al, 2001).
Neste estudo, 13,3% das gestantes com IgM positiva apresentaram baixa
avidez, 26,7% avidez intermediária e 60,0% alta avidez. Estes resultados são
semelhantes aos de outro estudo descrito na literatura, onde uma grande
porcentagem das gestantes com IgM positiva apresentaram alta avidez de IgG
e portanto possível infecção pregressa (Macre, 2002).
O teste da avidez de anticorpos IgG pode precisar melhor o tempo de infecção,
excluindo a possibilidade de infecção recente, em gestantes que apresentam
alta avidez no primeiro trimestre de gestação (Remington et al,2001, Lefevre-
Peltazzoni, 2006 Sensine, 2006, e Kodym et al, 2007). Neste estudo 13,3% de
resultados de alta avidez foram encontrados em mulheres com até 12 semanas
de gestação o que poderia excluir possibilidade de infecção aguda na gravidez.
Refazendo a prevalência de infecção aguda a partir da inclusão da análise de
avidez de IgG pode-se dizer que ela se aproxima de 1,1% nesta amostra.
A distribuição das gestantes segundo as regiões de saúde encontra-se de
acordo com a representatividade populacional de cada região. A região de
Maruípe possui a população mais jovem e com maior proporção de gestantes
atendidas pelo PSF. No estudo esta região representou 41,5% das gestantes.
O município de Vitória não tem área rural, assim todas as gestantes residem
em áreas urbanas e apresentam hábitos sócio-culturais semelhantes. As
características sócio-demográficas das gestantes incluídas no estudo refletem
as características de todas gestantes assistidas pelo PSF no Município de
Vitória, que é constituída por bairros de classe média baixa e baixa, mas com
acesso a escolas e aos serviços públicos de saúde, e que, na sua maioria, têm
grau médio de escolaridade. Neste estudo 69,8% das gestantes são casadas
ou vivem maritalmente; 64,3% nasceram na capital; 48,2% possuem renda
familiar menor que três salários mínimos e 72,3% moram em casa com menos
de cinco pessoas. Estes dados demonstram a semelhança existente entre as
gestantes incluídas no estudo e as mulheres, da mesma faixa etária e classe
social, residentes no Município (Instituto Jones, 2000).
Ainda em relação às variáveis sócio-econômicas, a escolaridade (mais de 4
anos de estudo) demonstrou ser o principal fator protetor para toxoplasmose na
gravidez (OR:0,18), resultados semelhantes aos descritos por Varella e
colaboradores (2003). Aproximadamente 25% das gestantes tinham idade até
19 anos e 59% até 29 anos o que reafirma a necessidade de investimento em
educação, principalmente de jovens. Alguns autores relatam um aumento na
positividade de IgG com um aumento da idade (Jenum et al,1998). Neste
estudo este dado não foi estatisticamente significante.
A idade gestacional mais freqüente foi entre 13 e 24 semanas (40,8%),
resultados semelhantes aos encontrados por Oliveira em Belém (Oliveira,
2002) e Figueiró-Filho em Mato Grosso do Sul (Figueiró-Filho et al, 2005) (30%
e 45,8% respectivamente). Oitenta e três porcento das gestantes nunca tiveram
aborto e 44% delas estavam grávidas pela primeira vez.
A aquisição de carnes em feiras livres apresentou significância estatística (OR:
1,8) com a prevalência de toxoplasmose neste estudo. A ingestão de carne
crua, hábito de comer churrasquinho de rua, presença de animais em casa e
trabalhos manuais com terra e areia não tiveram significância estatística. Estas
variáveis foram incluídas para avaliar a correlação entre elas e a presença de
toxoplasmose. No Brasil, Avelino e colaboradores (2004) avaliaram variáveis
semelhantes e encontraram associação entre toxoplasmose e ingestão de
carne crua ou mal cozida e realização de trabalhos manuais com terra e areia.
Como limitações deste estudo podemos citar o tamanho da amostra que não
foi suficiente para analisar associações entre toxoplasmose e todos os fatores
de risco. Apesar disso, o estudo mostra uma tendência de associação de
alguns fatores estudados e a prevalência da doença. Como o estudo foi
realizado considerando a base populacional de gestantes que realizam pré-
natal nas unidades de saúde do Município, estes dados não podem ser
extrapolados para todas as gestantes do Município, pois não foram incluídas no
estudo as gestantes que procuram atendimento no serviço privado de saúde.
Acredita-se não haver viéis de seleção na amostra selecionada já que foram
incluídas, proporcionalmente, gestantes atendidas em todas as seis regiões de
saúde do Município.
Os resultados obtidos neste estudo mostram que 26,5% das gestantes
atendidas no Município de Vitória são susceptíveis à infecção pelo Toxoplasma
gondii. Medidas de prevenção relacionadas à educação, à higiene e ao
saneamento básico devem ser implementadas. Incluir nas discussões das
políticas de saúde estratégias que possam informar e dar condições favoráveis
as gestantes de não se infectarem irão melhorar a qualidade do pré-natal e
diminuirão a possibilidade de transmissão vertical desta infecção.
Como parte do rastreamento sorológico do pré-natal, todas as gestantes do
município realizam o exame para detecção de anticorpos IgG e IgM para
toxoplasmose. Para que o uso desta triagem sorológica seja eficiente é
necessário a implementação do teste de avidez de IgG e que o diagnóstico
ocorra ainda no 1º trimestre de gestação, onde há maior possibilidade de
avaliação de infecção aguda (Remington et al,2001, Lefevre-Peltazzoni, 2006
Sensine, 2006, e Kodym et al, 2007). O diagnóstico laboratorial seria mais
eficiente e evitaria danos de ordem psicológica e clínica uma vez que os
medicamentos utilizados podem causar efeitos adversos à mãe e ao feto
(Deroin, 2001; Jones et al, 2001).
O Município de Vitória lançou a meta mobilizadora Vitória da Vida em 2001,
que tem como objetivo principal a redução da mortalidade infantil para menos
de um dígito. Para atingir esta meta é necessária a adoção de procedimentos
que resultem em melhoria do acesso e da qualidade dos serviços prestados às
mulheres durante a gravidez, parto e puerpério. Este estudo vem de encontro
às necessidades do município em promover a saúde e o bem estar das
gestantes, identificando fatores de risco e prevalência de infecções no ciclo
gravídico-puerperal. Estes dados auxiliarão na implementação da prevenção
primária e secundária necessárias para a redução da morbi-mortalidade infantil.
7. CONCLUSÕES
1. A taxa de prevalência encontrada neste estudo reflete a importância do
diagnóstico da toxoplasmose na gravidez. O acesso aos meios de prevenção e
maior rigor nas exigências sanitárias no que diz respeito ao comércio de carnes
sem registro nos estabelecimentos que fornecem e que manipulam esses
alimentos podem ser medidas úteis à diminuição da infecção congênita por
toxoplasmose.
2. O ensaio de avidez de IgG contra o Toxoplasma gondii nas gestantes em
que a detecção de anticorpos IgM for indeterminada ou positiva deveria ser
incluído no Protocolo de Saúde da Mulher (SEMUS/PMV) que hoje contempla
apenas a realização dos testes de detecção IgG e IgM.
3. A inclusão precoce das gestantes ao pré-natal com a realização da testagem
sorológica para toxoplasmose no 1º trimestre de gestação permitirá um
diagnóstico mais eficaz e reduzirá os danos ao recém-nascido.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Anexo 1: Questionário aplicado – pesquisa de toxoplasmose em
gestantes
Nome:__________________________________________________________
Idade:___________
Origem: ___________________________________________
Bairro: ____________________
Escolaridade em anos: ____________________
Profissão: __________________
Estado civil: solteira ( ) casada/vive junto ( ) separada/divorciada ( )
Viúva ( )
Renda familiar em salários mínimos: até 1( ) 1 a 3( ) 3 a 5( ) mais de
5( )
Nº de habitantes em casa:______________
Idade gestacional em semanas:_____________________________
Nº de gestações (incluindo a atual): ( ) Nº de filhos (nascidos vivos): ( )
Nº de abortos: expontâneos: ( ) Provocados: ( )
Tipo de parto: normal ( ) cesárea ( ) fórceps ( )
Gestação múltipla: sim ( ) não ( )
Sorologia anterior para toxoplasmose: sim ( )____________ não ( )
Sorologia para toxoplasmose nesta gestação: sim ( )____________ não ( )
Comportamento de risco para toxoplasmose:
Ingestão de carnes cruas ou mal cozidas: sim ( ) não ( )
Hábito de comer churrasquinho de rua: sim ( ) não ( )
Adquirir carnes em feiras livres: sim ( ) não ( )
Presença de animais domésticos em casa:sim ( ) não ( )
Trabalhos manuais com terra e/ou areia: sim ( ) não ( )
Obs.:___________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_____________________
Anexo 2: Comitê de Ética
Anexo 3 : Termo de Consentimento
Numero : |__|__|__|
TERMO DE CONSENTIMENTO
Você está sendo convidada à participar do estudo « Determinação da
soroprevalência de toxoplasmose em gestantes na rede municipal de saúde de
Vitória, ES». Este estudo é estritamente confidencial e suas respostas serão
mantidas no anonimato.
Sua participação não é obrigatória e a qualquer momento você pode
desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum
prejuízo em sua relação com o pesquisador ou com a instituição.
Sua participação será de grande importância, pois permitirá uma
avaliação da toxoplasmose entre as gestantes de Vitória, assim como
comportamentos de risco para esta infecção, permitindo assim a elaboração de
estratégias de prevenção e assistência.
Se você concordar em participar neste estudo, você irá responder a um
questionário e doará uma amostra de sangue para realização de testes
diagnósticos para toxoplasmose. Você receberá os resultados dos exames,
tratamento para a infecção diagnosticada e aconselhamento sobre prevenção.
Os dados coletados serão utilizados somente para os objetivos propostos pelo
estudo.
Não haverá nenhum risco envolvendo as participantes, assim como não
haverá custos ou pagamentos pela aceitação em participar.
As informações obtidas através dessa pesquisa serão confidenciais e
asseguramos o sigilo sobre sua participação. Os dados não serão divulgados
de forma a possibilitar sua identificação.
Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e o
endereço do pesquisador principal, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto
e sua participação, agora ou a qualquer momento.
Dra Kelly Rose Areal
Laboratório Central da Secretaria Municipal de Saúde de Vitória
Av. Mascarenhas de Moraes, 1185 Vitória Tel: 3132 5026
Declaro que entendi os objetivos, riscos e
benefícios de minha participação na
pesquisa e concordo em participar.
_____________________________
Assinatura da participante
Assinatura da entrevistada
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