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MARISTELA BARBOSA PORTELA
ESTUDO DE PROTEÍNAS FUNCIONAIS DE Candida
spp. ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL DE
CRIANÇAS INFECTADAS PELO VÍRUS DA
IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
2006
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas (Microbiologia).
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2
FICHA CATOLOGRÁFICA
PORTELA, Maristela Barbosa
Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade
bucal de crianças infectadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana /
Maristela Barbosa Portela. – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes (IMPPG), 2006.
xv, 176p.: il.
Orientadores: Rosangela Maria de Araújo Soares
Ivete Pomarico Ribeiro de Souza
Tese: Doutorado em Ciências Biológicas (concentração Microbiologia)
Referências bibliográficas: f.
1. Candida spp. 2. Fator de Virulência. 3. Protease. 4. Infecção pelo
HIV. 5. Serina protease
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) – IMPPG.
II. Título
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3
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia de Protista,
Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes (IMPPG), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do
Rio de Janeiro (UFRJ), sob orientação das Professoras Rosangela Maria de
Araújo Soares e Ivete Pomarico Ribeiro de Souza.
4
“Paciência e
“Paciência e “Paciência e
“Paciência e perseverança
perseverançaperseverança
perseverança
tê
têtê
têm o efeito m
m o efeito mm o efeito m
m o efeito mágico
ágicoágico
ágico de fazer as dificuldades
de fazer as dificuldades de fazer as dificuldades
de fazer as dificuldades
desaparecerem e os obstáculos sumirem”.
desaparecerem e os obstáculos sumirem”.desaparecerem e os obstáculos sumirem”.
desaparecerem e os obstáculos sumirem”.
John Quincy Adamas
5
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIADEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
Ao meu pai Álvaro (
Ao meu pai Álvaro (Ao meu pai Álvaro (
Ao meu pai Álvaro (
in memoriam)
in memoriam)in memoriam)
in memoriam)
...
......
...
...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha
...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha ...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha
...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha
lembrança. A sua falta é sol sem calor. Está a
lembrança. A sua falta é sol sem calor. Está alembrança. A sua falta é sol sem calor. Está a
lembrança. A sua falta é sol sem calor. Está aqui, mas já se foi. Já não
qui, mas já se foi. Já não qui, mas já se foi. Já não
qui, mas já se foi. Já não
fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção.
fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção. fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção.
fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção.
Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a
Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a
Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a
continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.
continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.
continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.
(autor desconhecido)
(autor desconhecido) (autor desconhecido)
(autor desconhecido)
6
AGRADECIMENT
AGRADECIMENTAGRADECIMENT
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
OS ESPECIAISOS ESPECIAIS
OS ESPECIAIS
A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais
A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais
A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais
difíceis de minha vida. Com a sua luz e bondade consegui transformar os
difíceis de minha vida. Com a sua luz e bondade consegui transformar os difíceis de minha vida. Com a sua luz e bondade consegui transformar os
difíceis de minha vida. Com a sua luz e bondade consegui transformar os
espinhos em flores e as pedras do caminho em degraus para que, cada vez mais,
espinhos em flores e as pedras do caminho em degraus para que, cada vez mais, espinhos em flores e as pedras do caminho em degraus para que, cada vez mais,
espinhos em flores e as pedras do caminho em degraus para que, cada vez mais,
possa estar mais perto de ti.
possa estar mais perto de ti.possa estar mais perto de ti.
possa estar mais perto de ti.
Ao
AoAo
Aos meus pais, Álvaro (
s meus pais, Álvaro (s meus pais, Álvaro (
s meus pais, Álvaro (
in memoriam
in memoriamin memoriam
in memoriam
)
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) e Marina, meus maiores
e Marina, meus maiores e Marina, meus maiores
e Marina, meus maiores
incentivadores, por todos seus esforços para me ajudar. Pai, sua vida foi uma
incentivadores, por todos seus esforços para me ajudar. Pai, sua vida foi uma incentivadores, por todos seus esforços para me ajudar. Pai, sua vida foi uma
incentivadores, por todos seus esforços para me ajudar. Pai, sua vida foi uma
lição de bondade e dedicação não só para mim, mas para todos que tiveram o
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lição de bondade e dedicação não só para mim, mas para todos que tiveram o
privilégio de sua companhia. Obrigada pela abd
privilégio de sua companhia. Obrigada pela abdprivilégio de sua companhia. Obrigada pela abd
privilégio de sua companhia. Obrigada pela abdicação de tantos sonhos para
icação de tantos sonhos para icação de tantos sonhos para
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que os meus pudessem ser realizados, mas hoje acho que consegui realizar um
que os meus pudessem ser realizados, mas hoje acho que consegui realizar um que os meus pudessem ser realizados, mas hoje acho que consegui realizar um
que os meus pudessem ser realizados, mas hoje acho que consegui realizar um
sonho em comum. E você, de um lugar privilegiado está assistindo essa nossa
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sonho em comum. E você, de um lugar privilegiado está assistindo essa nossa
vitória. Mãe, obrigada pelo eterno amor e estímulo nos momentos mais difíce
vitória. Mãe, obrigada pelo eterno amor e estímulo nos momentos mais difícevitória. Mãe, obrigada pelo eterno amor e estímulo nos momentos mais difíce
vitória. Mãe, obrigada pelo eterno amor e estímulo nos momentos mais difíceis
is is
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de minha vida. Sem você presente, não conseguiria concretizar a metade dos
de minha vida. Sem você presente, não conseguiria concretizar a metade dos de minha vida. Sem você presente, não conseguiria concretizar a metade dos
de minha vida. Sem você presente, não conseguiria concretizar a metade dos
meus sonhos e ambições. Sem você, tudo isso seria impossível!
meus sonhos e ambições. Sem você, tudo isso seria impossível! meus sonhos e ambições. Sem você, tudo isso seria impossível!
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A minha irmã Viviane, minha grande e fiel amiga. Hoje, sei que
A minha irmã Viviane, minha grande e fiel amiga. Hoje, sei que A minha irmã Viviane, minha grande e fiel amiga. Hoje, sei que
A minha irmã Viviane, minha grande e fiel amiga. Hoje, sei que
posso contar com você em todos os momentos da minh
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posso contar com você em todos os momentos da minha vida. Sei, também, que
a vida. Sei, também, que a vida. Sei, também, que
a vida. Sei, também, que
estarás sempre disposta a me acolher em todas as situações. Muito obrigada!
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A minha sobrinha
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A minha sobrinha-
--
-afilhada e “aluna de iniciação científica” Beatriz
afilhada e “aluna de iniciação científica” Beatriz afilhada e “aluna de iniciação científica” Beatriz
afilhada e “aluna de iniciação científica” Beatriz
por todo seu carinho e companheirismo. Esta conquista também é sua, Bia!
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7
Afinal, você
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Afinal, você foi a minha grande companhia nos finais de semana e feriados que
foi a minha grande companhia nos finais de semana e feriados que foi a minha grande companhia nos finais de semana e feriados que
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precisei estar no laboratório. Sua ajuda na preparação dos materiais para
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esterilização foi imprescindível! Muito obrigada!
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Ao Alexandre,
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“A maior de todas as artes é a de viver juntos”.
Wilian Lyon Phelps
Obrigada pela companhia, segurança e preocupação ao longo
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desses anos. Sou muito grata a você!
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À Professora Rosangela Maria de Araújo
À Professora Rosangela Maria de Araújo À Professora Rosangela Maria de Araújo
À Professora Rosangela Maria de Araújo
Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança
Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança
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durante todas as etapas desse trabalho.
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À Dra. Iv
À Dra. IvÀ Dra. Iv
À Dra. Ivete Pomarico Ribeiro de Souza, minha
ete Pomarico Ribeiro de Souza, minha ete Pomarico Ribeiro de Souza, minha
ete Pomarico Ribeiro de Souza, minha
eterna orientadora, por todo incentivo e conhecimentos
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transmitidos ao longo desses anos de convivência.
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“Obrigado por fazerem do aprendizado não um
“Obrigado por fazerem do aprendizado não um “Obrigado por fazerem do aprendizado não um
“Obrigado por fazerem do aprendizado não um
trabalho, mas um contentamento. Por fazerem com que
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nos sentíssemos
nos sentíssemos nos sentíssemos
nos sentíssemos pessoas de valor; por nos ajudarem a
pessoas de valor; por nos ajudarem a pessoas de valor; por nos ajudarem a
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descobrir o que fazer de melhor e, assim, fazê
descobrir o que fazer de melhor e, assim, fazêdescobrir o que fazer de melhor e, assim, fazê
descobrir o que fazer de melhor e, assim, fazê-
--
-lo cada vez
lo cada vez lo cada vez
lo cada vez
melhor. Obrigado por afastarem o medo das coisas que
melhor. Obrigado por afastarem o medo das coisas que melhor. Obrigado por afastarem o medo das coisas que
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pudéssemos não compreender, levando
pudéssemos não compreender, levandopudéssemos não compreender, levando
pudéssemos não compreender, levando-
--
-nos, por fim, a
nos, por fim, a nos, por fim, a
nos, por fim, a
compreendê
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--
-las; por resolverem o que achávamos
las; por resolverem o que achávamos las; por resolverem o que achávamos
las; por resolverem o que achávamos
complica
complicacomplica
complicado, por serem pessoas dignas de nossa total
do, por serem pessoas dignas de nossa total do, por serem pessoas dignas de nossa total
do, por serem pessoas dignas de nossa total
confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se
confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se
confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se
mostrar difícil... Obrigado por nos convencerem de que
mostrar difícil... Obrigado por nos convencerem de que mostrar difícil... Obrigado por nos convencerem de que
mostrar difícil... Obrigado por nos convencerem de que
éramos melhor do que suspeitávamos”.
éramos melhor do que suspeitávamos”.éramos melhor do que suspeitávamos”.
éramos melhor do que suspeitávamos”.
A amiga Laura Primo, exemplo de profissionalismo, pela confianç
A amiga Laura Primo, exemplo de profissionalismo, pela confiançA amiga Laura Primo, exemplo de profissionalismo, pela confianç
A amiga Laura Primo, exemplo de profissionalismo, pela confiança
a a
a
e as várias oportunidades concedidas. Admiro
e as várias oportunidades concedidas. Admiroe as várias oportunidades concedidas. Admiro
e as várias oportunidades concedidas. Admiro-
--
-te muito!
te muito!te muito!
te muito!
9
As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela,
As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela, As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela,
As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela,
por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades!
por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades! por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades!
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Durante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos vári
Durante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos váriDurante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos vári
Durante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos vários conhecimentos
os conhecimentos os conhecimentos
os conhecimentos
científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas
científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas
científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas
tão amigas como vocês!
tão amigas como vocês!tão amigas como vocês!
tão amigas como vocês!
As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu
As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu
As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu
gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...
gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...
gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...
A Celina
A CelinaA Celina
A Celina, uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no
, uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no , uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no
, uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no
início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil!
início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil! início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil!
início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil!
Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar
Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar
Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar
outro caminho...
outro caminho...outro caminho...
outro caminho...
Aos Professores do Departame
Aos Professores do DepartameAos Professores do Departame
Aos Professores do Departamento de Microbiologia Geral do
nto de Microbiologia Geral do nto de Microbiologia Geral do
nto de Microbiologia Geral do
IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por
IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por
IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por
compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a
compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a
compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a
esclarecerem as minhas dúvidas.
esclarecerem as minhas dúvidas.esclarecerem as minhas dúvidas.
esclarecerem as minhas dúvidas.
A Professora Eliana Barreto pelas considerações e revis
A Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisA Professora Eliana Barreto pelas considerações e revis
A Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisão da
ão da ão da
ão da
presente tese em um curto período de tempo.
presente tese em um curto período de tempo.presente tese em um curto período de tempo.
presente tese em um curto período de tempo.
A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”,
A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”, A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”,
A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”,
por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.
por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.
por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.
10
Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia,
Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia, Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia,
Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia,
Crist
CristCrist
Cristina, Davi, Ricardo, Fátima e Luís pela convivência amigável e divertida e,
ina, Davi, Ricardo, Fátima e Luís pela convivência amigável e divertida e, ina, Davi, Ricardo, Fátima e Luís pela convivência amigável e divertida e,
ina, Davi, Ricardo, Fátima e Luís pela convivência amigável e divertida e,
também, pelas contribuições inestimáveis neste período.
também, pelas contribuições inestimáveis neste período.também, pelas contribuições inestimáveis neste período.
também, pelas contribuições inestimáveis neste período.
As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico,
As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico, As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico,
As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico,
pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.
pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.
pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.
Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o
Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o
Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o
curso de Doutorado.
curso de Doutorado.curso de Doutorado.
curso de Doutorado.
11
RESUMO
Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade
bucal de crianças infectadas pelo HIV
O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da serina protease secretada
(SPS) por Candida spp no processo de interação com células epiteliais,
formação de biofilme, degradação de proteínas de matriz extracelular (laminina
(LAM) e fibronectina (FN)) e componentes do soro (albumina humana, bovina e
IgG). Foi comparado o perfil de proteínas de Candida albicans HIV+ e HIV-
responsável pelo reconhecimento de FN, LAM e colágeno tipo IV (COL);
avaliação do efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de aspártico
protease do HIV no crescimento, diferenciação e adesão a células epiteliais de
C. albicans; e envolvimento da atividade ecto-fosfatásica de C. albicans HIV+ e
HIV- nos processos de interação também com células epiteliais. Após o
isolamento de Candida spp. de sítios sub-gengivais, essas foram crescidas em
meio BHI por 48 horas à 37
o
sob agitação. In vitro, SPS foi responsável pela
hidrólise de laminina, fibronectina, IgG, albumina bovina e humana. O
tratamento de C. albicans com 1000 µM de PMSF, inibidor de serina protease,
reduziu em 80% a adesão destas leveduras a células epiteliais e modulou a
expressão de proteínas de superfície das células tratadas de forma dose-
dependente. A inibição da atividade da serina protease reduziu a adesão das
células formadoras do biofilme quando comparado ao sistema controle. C.
albicans HIV+ apresentou maior expressão de proteínas responsáveis pelo
reconhecimento à FN, LAM e COL. Apenas o Saquinavir influenciou no
crescimento de C. albicans quando crescida em meio BHI. Esta droga inibiu a
adesão a células epiteliais (p<0,05, na concentração de 150 µM) e indução de
tubo germinativo (p<0,05, na concentração de 100 µM). C. albicans HIV+
apresentaram altos índices de ecto-fosfatase quando comparadas com cepas
HIV-. Esta atividade mostrou-se envolvida no processo de interação fungo-
hospedeiro.
12
ABSTRACT
Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade
bucal de crianças infectadas pelo HIV
This study aimed to correlate the secreted serine proteinase (SSP) by Candida
spp. with epithelial cells interaction, biofilm formation, extracellular matrix
proteins cleavage (laminin (LAM), fibronectin (FN)) and serum compounds
(bovine albumin, human albumin and IgG). Its also compared the protein profile
of C. albicans HIV+ and HIV- that binds to FN, LAM and collagen type IV
(COL); and the effect of antiretroviral drugs aspartic proteinase inhibitor on
growth, cellular differentiation and epithelial cells adhesion of C. albicans; and
the ecto-phosphatase activity of C. albicans HIV+ e HIV- in the interaction
process with epithelial cells. After Candida spp. isolation from sub-gingival sites,
the yeasts were growth in BHI medium for 48 hours at 37
o
with agitation. In
vitro, SSP was able to cleave LAM, FN, IgG, bovine albumin and human
albumin. The C. albicans treatment with 1000 µM of PMSF, a serine proteinase
inhibitor, decreased 80% of the adhesion index using epithelial cells and
modified the surface proteins expression of treated yeasts in a dependent drug
concentration. The serine proteinase activity inhibition decreased the biofilm
yeast adhesion when compared with control system. C. albicans HIV+
demonstrated higher protein expression that recognize FN, LAM e COL.
Saquinavir was the only drug that decreased C. albicans growth in BHI medium.
This medication inhibited the adhesion to epithelial cells (p<0,05, in a
concentration of 150 µM) and germ tube differentiation (p<0,05, in a
concentration of 100 µM). C. albicans HIV+ ecto-phosphatase present a higher
activity than the others isolates suggesting that, the expression and activity of
ecto-phosphatase in these cells may contribute to the early mechanisms
required for disease establishment.
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
BHI - Infusão de cérebro e coração
BSA - Soro albumina bovina
o
C - Graus Celsius
Candida spp. - Espécies do gênero Candida
CDC - “Centers for Disease Control and Prevention”
CD4 - Proteína de superfície do linfócito T-auxiliar (grupo
de diferenciação do tipo 4)
COL IV - Colágeno tipo IV
Crianças HIV+ - Crianças infectadas pelo HIV
Crianças HIV- -Crianças sem evidências clínicas de
imunossupressão
Cut-off - Microconcentradores “Centricon”com membrana
de exclusão
DNA - Ácido desoxirribonucléico
E-64 -L-trans-epoxisuccinil leucilamido-(4-
guanidino)butano
ELISA - “Enzyme-linked Immunosorbent Assay”
Fc - Fragmento cristalizável
FN - Fibronectina
g - Grama
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
14
HSA - Soro albumina Humana
IgG - Imunoglobulina G
kDa - Kilodalton
LAM - Laminina
M - Molar
mL - Mililitro
mM - Milimolar
NaCl - Cloreto de sódio
pH - Potencial hidrogeniônico
PMSF - Fluoreto de fenilmetanosulfonil
SAP - Aspártico protease secretada
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo
SDS
UFC - Unidades formadoras de colônia
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
v/v/v - Relação volume/volume/volume
w/v - Relação peso/volume
YCB - “Yeast Carbon Base”
µm - Micrômetro
µM - Micromolar
15
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO 01-05
2. REVISTA DA LITERATURA 06-53
2.1 Síndrome da Imunodeficiência Humana em Crianças 06
2.2 Manifestações Bucais em Crianças Portadoras da Síndrome da
Imunodeficiência Humana
09
2.2.1 Candidíase Bucal 12
2.2.1.1 Relação com a progressão da infecção pelo HIV e o
impacto da terapia anti-retroviral
16
2.3 Candida spp.
18
2.4 Fatores de Virulência de Candida spp.
20
2.4.1 Parede Celular 22
2.4.2 Produção de Enzimas Hidrolíticas - Proteases 26
2.4.2.1 Inibidores proteolíticos 36
2.4.3 Diferenciação celular 43
2.4.4 Adesão e formação de biofilme de Candida
46
2.4.5 Ecto-fosfatases em Candida
50
3. OBJETIVOS 54
4. MATERIAIS E MÉTODOS 56-68
5. RESULTADOS 69-113
6. DISCUSSÃO 114-128
7. CONCLUSÕES 129-131
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 132-174
9. ARTIGOS EM ANEXO 175-166
16
1. Introdução
1. Introdução1. Introdução
1. Introdução
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) vem
aumentando de forma alarmante. De acordo com o último boletim da UNAIDS
(UNAIDS, 2005) há uma média de 40,3 milhões (36,7 – 45,3 milhões) de
pessoas vivendo com AIDS em todo o mundo. Somente no ano de 2005,
detectou-se um total de 4,9 milhões de novos casos de infecção, sendo destes
700 mil somente em crianças abaixo de 15 anos de idade. Com relação ao
número de óbitos, a AIDS foi responsável por 3,1 milhões de mortes no ano de
2005 (UNAIDS, 2005). Na América Latina o número estimado de pessoas
vivendo com o vírus HIV é de 1,8 milhões (1,4 milhões – 2,4 milhões), sendo o
Brasil o responsável por mais de um terço deste número (UNAIDS, 2005).
A AIDS tornou-se a primeira causa de morte em mulheres de 20-
40 anos nas grandes cidades das Américas, Europa Ocidental e África Sub-
Saara. Além de centenas de milhares de casos de AIDS pediátrica, mais de um
milhão de crianças não infectadas tornaram-se órfãs porque suas mães e seus
pais morreram de AIDS (LAMBERT et al., 2001). O grande ponto para a
proteção de crianças contra o vírus HIV é a tentativa de prevenção da infecção
em seus pais. A prevenção da transmissão vertical (mãe-criança) é crucial com
relação à prevenção primária. A implantação de programas educativos tem
eliminado virtualmente a transmissão do HIV de mães para seus filhos em
países industrializados. No entanto, em um alto número de países a AIDS é
ainda a responsável pelo aumento de uma parte dos óbitos de crianças abaixo
dos 5 anos de idade (UNAIDS, 2005). Os maiores obstáculos encontrados
17
nestes programas educativos incluem os inadequados serviços de atenção a
gestante (pré-natal), o não conhecimento da presença da infecção durante a
gestação, o preconceito e discriminação, e por fim a dificuldade no acesso a
profilaxia anti-retroviral durante a gravidez. Um fator agravante a ser
considerado seria ainda o alto número de mulheres que desconhecem a
possibilidade de transmissão do vírus HIV para seu filho (UNAIDS, 2005).
Muitas manifestações bucais têm figurado na literatura por sua
freqüência em crianças infectadas pelo HIV (FALOON et al., 1989; LEGGOTT,
1992; VALDEZ et al., 1994; RAMOS-GOMEZ et al., 1996; CASTRO, 1998;
RAMOS-GOMEZ et al., 2000), sendo consideradas indicativas do estado
imunológico e da progressão da infecção nestes pacientes (GREENSPAN &
GREENSPAN, 1992; SANTOS et al., 2001). As lesões bucais mais comuns
são: candidíase, estomatite herpética, eritema linear gengival, linfadenopatia
cervical, leucoplasia pilosa, hipertrofia de parótidas e gengivite
(CHIGURUPATTI et al., 1996; CASTRO, 1998; PORTELA et al., 2000).
Dessas, a candidíase bucal e a gengivite são as mais freqüentes (CASTRO,
1998). O eritema linear gengival, embora pouco freqüente, tem se mostrado
intimamente relacionado com a progressão da infecção pelo HIV (VELEGRAKI
et al., 1999; PORTELA, 2002).
Embora represente condição comum em crianças infectadas pelo
HIV (SAN MARTIN et al., 1992; VALDEZ et al., 1994; CASTRO, 1998;), as
alterações periodontais têm sido pouco descritas na literatura principalmente
quanto a sua etiologia, os microrganismos envolvidos e sua relação com a
debilidade do sistema imunológico destas crianças.
18
Tem-se especulado sobre a possível correlação entre a presença
de Candida sp. e a alteração gengival, como por exemplo o eritema linear
gengival (VELEGRAKI et al., 1999). ZAMBON et al. (1990) no intuito de
determinar os microrganismos presentes na região subgengival de pacientes
adultos infectados pelo HIV, mostraram que em 62% dos pacientes com
gengivite e periodontite foram encontradas diferentes espécies de fungos e,
sugeriram serem estes patógenos oportunistas importantes no
desenvolvimento da doença periodontal em pacientes com AIDS e com outras
doenças imunossupressoras. Em um estudo transversal, do tipo caso-controle
com 50 crianças infectadas pelo HIV e 44 crianças sem evidências clínicas de
imunossupressão, PORTELA e colaboradores (2004) demonstraram uma
freqüência de isolamento de Candida spp. maior no grupo HIV+. Este achado
esteve ainda diretamente relacionado com o grau de inflamação gengival
presente nos pacientes da amostra. Nesse mesmo estudo, observou-se que
todas as crianças com eritema linear gengival apresentaram cultura positiva
para espécies de Candida.
O aumento no número de infecções oportunistas causadas por
fungos, principalmente em indivíduos infectados pelo HIV, tem estimulado
novas pesquisas para esclarecer os fatores de virulência e as circunstâncias da
patogenicidade das várias espécies (GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1990;
MULLER, GROLL & WALSH, 1999). A virulência do microrganismo é o
resultado de uma multiplicidade de fatores que agem simultaneamente para
vencer as defesas do hospedeiro. No caso da infecção por Candida, estes
fatores podem estar correlacionados com a aderência à célula epitelial, ao
19
dimorfismo, a capacidade de crescimento como blastoporos, pseudo-hifas e
hifas, a produção de enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases e
lisofosfolipases) (NAGLIK, CHALLACANBE & HUBE, 2003) e a produção de
endotoxinas de baixa e alta massa molecular, bem como a composição da
parede celular, que facilita a adesão e a penetração através do tecido infectado
(GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1990; SCHALLER et al., 2005).
A produção e a secreção de proteases por espécies de Candida
vêm sendo intensamente estudadas por ser considerada um fator importante
nas diferentes fases da interação fungo-célula hospedeiro (MacDONALD &
ODDS, 1983; GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1986). Nestes microrganismos, as
proteases são capazes de digerir proteínas do hospedeiro (MacDONALD,
1984), invadindo os tecidos através da degradação de proteínas de matriz
extracelular (MORSCHHÄUSER et al., 1997) e driblando a ação do sistema
imune, através da hidrólise de imunoglobulinas e proteínas do sistema
complemento (KAMINISHI et al., 1995; RÜCHEL, 1986). As aspártico-
proteases constituem uma família composta de várias isoenzimas, onde
algumas (SAP1-10) são produzidas pelas espécies de Candida (HUBE, 1996;
SMOLENSKI et al. 1997; HUBE, 1998; HUBE et al. 1998; SCHALLER et al.
1998; HUBE, 2000; KOELSCH et al. 2000; SCHALLER et al. 2000). No
entanto, nenhuma outra classe de protease extracelular havia sido detectada
(HUBE, 2000). COSTA (2001) e PORTELA (2002) ao avaliarem a secreção de
proteases em isolados de diferentes espécies de Candida, provenientes de
diferentes sítios da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV,
20
evidenciaram a produção de serina e metalo-proteases por essas espécies,
quando cultivadas em meio BHI (infusão de cérebro e coração).
A capacidade destes microrganismos de sofrer diferenciação
celular (transição de blastoporos, pseudo-hifas, hifas e no caso de C. albicans
e C. dubliniensis, tubo germinativo) é uma característica muito importante no
estudo da patogenicidade das mesmas (CUTTER, 1991). A parede celular do
tubo germinativo apresenta certas peculiaridades que facilitam a instalação da
infecção, como a presença de antígenos de superfície específicos
(CASANOVA et al., 1991; CASANOVA et al., 1992
a
; CASANOVA et al., 1992
b
),
a indução da expressão de proteínas de superfície que promovem a interação
com o tecido ou proteínas do hospedeiro proporcionando a formação de um
biofilme patogênico (BOUALI et al., 1987; BOUCHARA et al., 1990;
CASANOVA et al., 1992) e o aumento da hidrofobicidade da parede celular
(HAZEN & HAZEN, 1988; LÓPEZ-RIBOT et al., 1991). FERNANANDO et al
(1999) ainda atribuem à presença de fosfatases de superfície (ecto-fosfatases)
como possíveis fatores a serem considerados na patogênese de Candida
parapsilosis.
Diante desta problemática, o objetivo geral do presente estudo foi
comparar a expressão de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas de
diferentes sítios da cavidade bucal de crianças soropositivas para o HIV e de
crianças sem evidências clínicas de imunossupressão e, expandir os
conhecimentos sobre esta nova classe de protease (serina-protease) secretada
por espécies de Candida.
21
2. Revista da Literatura
2. Revista da Literatura2. Revista da Literatura
2. Revista da Literatura
2.1 Síndrome da Imunodeficiência Humana em Crianças
A contaminação pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)
vem aumentando de forma alarmante. De acordo com a Organização Mundial
de Saúde, mais de um milhão de crianças estariam infectadas pelo HIV em
1998 e, no ano 2000, esta seria a quinta causa de morte em crianças de todo o
mundo (MANN & TARANTOLA, 1998).
A Síndrome da Imunodeficiência Humana pode variar da
ausência de sintomas à presença de doenças em estágios mais avançados,
resultando assim na AIDS (FALOON et al., 1989).
Em 1994, o CDC (Center of Disease Control) revisou o sistema
de classificação para a infecção pelo HIV em crianças, e propôs dois critérios
da mesma: um para crianças menores de 18 meses e o outro para as maiores.
Isso porque, como os pacientes menores de 18 meses podem estar
manifestando os anticorpos maternos, eles só serão considerados infectados
se apresentarem dois resultados positivos em um ou mais testes de detecção
do HIV (cultura em célula animal; reação em cadeia da polimerase – PCR - e
detecção do antígeno viral circulante – p24) ou se preencher os critérios de
definição da AIDS determinados pelo CDC em 1987. Já no caso das crianças
acima de 18 meses, bastam dois testes ELISA positivos confirmados por outro,
como o “western blotting” ou imunofluorescência, para serem consideradas
soropositivas para o HIV.
22
O agente etiológico da AIDS é o HIV, um retrovírus cujo material
genético está sob a forma de RNA, que possui tropismo pelo antígeno de
superfície CD4 presente em linfócitos “T auxiliar” e macrófagos (FALOON et al.,
1989). A infecção pelo HIV provoca uma anormalidade na função linfocitária,
resultando em um decréscimo no número de linfócitos T, inversão da relação
linfócito “T auxiliar” e “T supressor” (T
CD4
/T
CD8
), aumento nos níveis de
imunoglobulinas e produção deficiente de interferon, o que gera defeitos
profundos no sistema imune do paciente (LANE & FAVCI, 1985; FALOON et
al., 1989).
As anormalidades presentes no sistema imunológico das crianças
infectadas pelo HIV irão levar a disfunções sistêmicas bem mais graves que
aquelas presentes em adultos HIV+ (MANN & TARANTOLA, 1998). Dentre
estas disfunções, pode-se citar a maior susceptibilidade ao desenvolvimento de
infecções de origem fúngica e bacteriana, bem como às demais condições
vistas na AIDS (FALOON et al., 1989; LANE & FAVCI, 1985).
As crianças de 0 a 12 anos infectadas pelo HIV são classificadas,
atualmente, de acordo com a condição da infecção, condição imunológica e
presença de sintomas clínicos, em concordância com a proposta oferecida pelo
CDC em 1994 (Quadros 1 e 2).
A principal fonte de transmissão do vírus para crianças é a
vertical, ou seja, da mãe para o filho e, em menor escala, devido à transfusão
de sangue ou derivados (MANN & TARANTOLA, 1998).
Experimentos que buscaram traçar o perfil das crianças
infectadas pelo HIV confirmaram que grande parte delas tinham sofrido
23
transmissão vertical. Vários autores como CHIGURUPATI et al. (1996),
CASTRO (1998) e PORTELA et al. (2000), observaram que esta via estava
presente em 85, 88 e 90,1% dos casos, respectivamente.
Quadro 1 – Classificação da AIDS Pediátrica, CDC, 1994.
Fonte: Revised classification system for Human Immunodeficiency Vírus
infection in children less than 13 years of age (CDC), 1994.
Categoria Clínica Categoria Imunológica
N: sintomas
ausentes
A: sintomas
leves
B: sintomas
moderados
C: sintomas
graves
1. imunossupressão
ausente (%CD4≥
≥≥
≥25)
N1 A1 B1 C1
2. imunossupressão
moderada (%CD4 15-24)
N2 A2 B2 C2
3. imunossupressão
grave (%CD4<15)
N3 A3 B3 C3
24
Quadro 2 – Características Clínicas
Fonte: Revised classification system for Human I(mmunodeficiency Vírus
infection in children less than 13 years of age (CDC), 1994.
Características Clínicas
# Categoria N: Assintomático
Nenhum sinal ou sintoma considerado como resultado da infecção pelo
HIV ou presença das condições listadas na categoria A.
# Categoria A: Sintomas Leves
Presença de duas ou mais das seguintes condições abaixo e nenhuma
das listadas nas categorias B e C:
Linfadenomegalia
Hepatoesplenomegalia
Dermatite
Aumento de parótidas
Infecção respiratória superior, sinusite ou otite recorrente ou persistente
# Categoria B: Sintomas Moderados
Anemia, neutropenia ou plaquetopenia por mais de 50 dias
Meningite, pneumonia ou sepse (um único episódio)
Candidíase oral por mais de 2 meses em crianças > 6 meses
Cardiomiopatia
Diarréia crônica ou recorrente
Hepatite
Estomatite herpética (mais de 2 vezes em 1 ano)
Herpes zoster (2 ou mais episódios ou mais de 1 dermátomo)
Pneumonia intersticial linfóide (LIP)
Nefropatia
Nocardiose
Febre persistente por mais de 1 mês
Varicela disseminada
Toxoplasmose, infecção pelo vírus herpes simples (HSV) ou
citomegalovírus (CMV) com menos de 1 mês de idade
# Categoria C: Sintomas Graves
Criança com qualquer das doenças definidoras de AIDS (CDC, 1987) com
exceção da LIP.
2.2 Manifestações Bucais em Crianças Portadoras da Síndrome da
Imunodeficiência Humana
As manifestações bucais da infecção pelo HIV são comuns em
crianças soropositivas, com freqüência de aparecimento variando de 28% a
25
65% (FALOON et al., 1989; LEGGOT et al., 1992; VALDEZ et al., 1994;
FONSECA, 1996; CASTRO 1998; PORTELA et al., 2000; RAMOS-GOMEZ et
al., 2000; FLAITZ et al., 2001; SANTOS et al., 2001). Devido a esta alta
prevalência, estudos em todo o mundo têm investigado, principalmente à
freqüência do seu aparecimento, o seu alto valor prognóstico e a sua grande
relação com o uso da nova terapia múltipla anti-retroviral.
Vários autores como FALOON et al. (1989); LEGGOT et al.
(1992); VALDEZ et al. (1994); FONSECA, (1996); CHIGURUPATI et al. (1996);
CASTRO (1998); PORTELA et al. (2000); RAMOS-GOMEZ et al. (2000) e
FLAITZ et al. (2001); SANTOS et al. (2001) observaram que as manifestações
bucais mais comumente encontradas em crianças infectadas pelo HIV são as
seguintes: candidíase bucal, estomatite herpética, eritema linear gengival,
gengivite, leucoplasia pilosa e hipertrofia de parótidas.
MONIACI et al. (1993) e CASTRO et al. (1998) demonstraram
que o aparecimento de lesões como a candidíase bucal estaria mais associado
à infecção pelo HIV, especialmente em um estágio mais avançado da doença.
No estudo de CASTRO et al. (1998), 93% das 14 crianças com lesão de
candidíase agravaram seu quadro clínico, sendo que 79% dessas evoluíram
para o óbito durante os 18 meses de acompanhamento.
A utilização de uma terapia múltipla anti-retroviral em estágios
iniciais da infecção pelo HIV em crianças aumenta a expectativa de vida
(LAMBERT et al., 1996; DE MARTINO et al., 2000) e diminui a freqüência de
aparecimento das lesões bucais (CASTRO et al., 1999; RAMOS-GOMEZ et al.,
2000). Com o objetivo de verificar a influência da utilização dessa terapia no
26
decréscimo da mortalidade em uma população infantil infectada pelo HIV, DE
MARTINO et al. (2000) avaliaram prontuários médicos de 1142 crianças de 106
centros de atendimentos de AIDS pediátrica, nascidas entre os anos de 1980 e
1997. Neste estudo, as crianças foram agrupadas de acordo com o tipo de
terapia anti-retroviral utilizada, podendo-se concluir que houve aumento da
sobrevida das crianças no período de 1996 a 1998 como resultado da
introdução da terapia anti-retroviral múltipla.
Em um estudo longitudinal com um grupo de crianças
soropositivas para o HIV, CASTRO et al. (1998) observaram que havia uma
diminuição da freqüência de lesões bucais nos anos de 1993 a 1998.
Posteriormente (1999), estes mesmos autores relacionaram a redução do
aparecimento dessas lesões ao emprego de drogas anti-retrovirais (CASTRO
et al., 1999). No entanto, estudos mais recentes de PORTELA et al. (2000),
com 206 crianças infectadas pelo HIV, mostraram freqüência de 28,20% de
lesões bucais.
A distribuição das manifestações bucais relacionadas à infecção
pelo HIV em crianças, em muitos estudos, revela que a gengivite e a
candidíase são as lesões que mais acometem tais pacientes (CASTRO, 1998;
PORTELA et al., 2000; RIBEIRO, 2000). Assim, uma melhor compreensão da
patogenicidade de microrganismos oportunistas tende a permitir o
desenvolvimento de terapias eficazes para estas infecções, já que, mesmo com
o grande avanço da terapia anti-retroviral, crianças infectadas pelo HIV
continuam apresentando quadros de lesões oportunistas que, em algumas
27
situações, são resistentes ao tratamento antifúngico convencional (ABRAMS,
2000).
2.2.1 Candidíase Bucal
A candidíase bucal, lesão de origem fúngica, é uma das mais
comuns em crianças infectadas pelo HIV, podendo ser ainda a primeira
manifestação da AIDS (KATZ et al., 1993; VALDEZ et al., 1994; JANDINSKI et
al., 1994; FONSECA, 1996; CASTRO, 1998). Estudos mostraram que a
freqüência de aparecimento varia de 8,5% a 72% e que apresenta significante
valor prognóstico no desenvolvimento da AIDS em crianças (CASTRO et al.,
1998). Atualmente, devido ao grande avanço das drogas anti-retrovirais –
terapia com inibidor de proteases - está ocorrendo uma mudança do padrão
das infecções bucais oportunistas, constatando-se uma redução no seu
aparecimento (PATTON et al., 2000). Vários estudos, tanto in vitro (GRUBER
et al., 1999a; GRUBER et al., 1999b; CASSONE et al., 1999), quanto in vivo
(CASSONE et al., 1999; TAYLOR et al., 2000), têm mostrado a redução da
atividade da protease ácida (aspártico-protease) secretada por espécies de
Candida frente à utilização dos inibidores de proteases utilizados na terapia do
HIV, já que em ambos os sistemas (Candida e HIV) há a secreção de uma
mesma classe de protease.
Entretanto, em outros casos pode ocorrer o aparecimento de
quadros graves de lesões resistentes à terapia convencional antifúngica
utilizada, devido à falha na resposta do hospedeiro ao tratamento anti-retroviral,
28
levando a necessidade de terapias profiláticas com antibacterianos e
antifúngicos (ABRAMS, 2000).
A candidíase bucal pode apresentar-se clinicamente de três
formas distintas: candidíase eritematosa, candidíase pseudomembranosa e
quelite angular (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004).
A espécie considerada predominante na infecção fúngica da
cavidade bucal em indivíduos imunocomprometidos é a C. albicans, seguida
ainda por outras espécies, como: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C.
lusitaniae e C. parapsilosis (SAMARANAYAKE, 1992; REPENTIGNY,
LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). Em 1995, uma nova espécie de
Candida, com características fenotípicas semelhantes às da C. albicans, foi
descrita e denominada de C. dubliniensis (SULLIVAN et al., 1995).
Frente ao aumento do número de casos de indivíduos infectados
pelo HIV, o estudo desses microrganismos tem recebido novo significado, já
que se trata dos patógenos comensais responsáveis por uma das mais
freqüentes lesões bucais em indivíduos imunocomprometidos. Ou seja, quando
presentes em um indivíduo com aspectos de normalidade tendem a evoluir de
forma comensal, não causando alteração, mas, em situações anormais, estas
mesmas cepas assumem características de patogenicidade, pois quebram o
equilíbrio com o hospedeiro (CUTLER, 1991). O aparecimento destes
microrganismos, principalmente quando se trata da C. albicans, dá-se logo
após o nascimento, dos 2 aos 6 meses de vida, e a principal fonte de
transmissão é sua mãe (HANNULA et al., 1999).
29
Considerando o conhecimento da colonização bucal por espécies
de Candida, um fator importante na implementação de uma terapia antifúngica
para a prevenção de candidíase orofaríngea e na detecção de indivíduos com
maior propensão à rápida evolução da infecção pelo HIV, HICKS et al. (1998)
determinaram a prevalência de espécies destes fungos na saliva não
estimulada de crianças infectadas pelo HIV através da via vertical, comparando
ainda com a de crianças não infectadas, mas que foram expostas ao vírus
durante a gravidez ou o nascimento. Observaram, então, que estes
microrganismos estavam presentes em 19% dos pacientes infectados pelo HIV
e em 9% daqueles soronegativos para tal vírus. E, ainda, que esta presença foi
mais prevalente em crianças HIV+ sintomáticas com imunossupressão
moderada e grave e que estavam fazendo uso de agentes anti-retrovirais e de
nenhuma medicação antifúngica.
Corroborando esse estudo, COSTA et al. (2000), ao avaliarem a
influência da infecção pelo HIV na prevalência de Candida spp. em mucosa
bucal de crianças clinicamente saudáveis, observaram sua presença em uma
maior porcentagem quando comparada ao estudo anterior – 76% das crianças
HIV+ e 46% das saudáveis (p<0,05) o que provavelmente foi decorrente de
metodologias de coleta de saliva diferentes. No primeiro trabalho (HICKS et al.,
1998) a saliva não estimulada foi removida por meio de um aspirador a vácuo,
enquanto que COSTA et al. (2000) empregaram a fricção suave no dorso de
língua com swab estéril. Mas ambos concluíram que espécies de Candida
podem ser encontradas em mucosa normal tanto em pacientes
imunocomprometidos como em pacientes sem evidências de
30
imunossupressão, sendo, porém esta diferença estatisticamente significante
somente neste último estudo.
BROWN et al. (2000), ao estudarem 27 isolados bucais de
crianças infectadas pelo HIV, obtiveram resultado positivo para Candida em 15
amostras. Desses 15 isolados, 3 foram identificados como C. dubliniensis, um
foi positivo para C. glabrata e 12 pacientes estavam colonizados somente por
C. albicans. Neste mesmo estudo, todos os pacientes que apresentaram
isolados positivos para C. dubliniensis estavam gravemente imunodeprimidos e
com classificação C3 da doença, mas somente um desses tinha história
passada de candidíase bucal. Os autores atribuem esse fato ao avanço da
terapia anti-retroviral, já que todos faziam uso de inibidor de proteases, o qual
reduz a prevalência de candidíase bucal.
Os mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos
pertencentes à família dos azoles em cepas C. albicans isoladas de pacientes
infetados pelo HIV são multifatoriais com predominância da “overexpression”
dos genes (MDR1 e CDR) codificadores da bomba de efluxo, fato esse
detectado em 85% de todos os isolados com esta característica fenotípica de
resistência (PEREA et al. 2001). SAGEORZAN et al (1994) e BARCHIESI et
al. (1995) observaram que estas cepas não ficam confinadas aos pacientes
infectados pelo HIV e sim, apresentam potencial para serem transmitidas aos
seus cônjuges e outros membros da família, incluindo crianças (MULLER et al.,
1999).
31
2.2.1.1 Relação com a progressão da infecção pelo HIV e o impacto da
terapia anti-retroviral
A candidíase bucal pode ocorrer em qualquer momento durante o
curso da infecção pelo HIV, o que inclui a infecção primária pelo HIV, fase
crônica assintomática e a AIDS propriamente dita (PENA et al., 1991; PATTON,
2000). Durante a fase assintomática da infecção pelo vírus HIV a presença de
quadros de candidíase pseudomembranosa ou eritematosa são sinais
preditivos da progressão da imunossupressão, independentemente da
contagem de células CD4
+
(NIELSEN et al., 1994). VARGAS & JOLY (2002) ao
relacionarem a freqüência e intensidade de colonização de leveduras na
cavidade oral de pacientes infectados pelo HIV com a progressão para o
estabelecimento da candidíase oral, observaram que o aumento da carga de C.
albicans ocorre antes do primeiro episódio da infecção fúngica e a intensidade
da colonização aumenta significantemente de acordo com a progressão do
quadro assintomático para o primeiro sinal clínico de candidíase. Estas
observações sugerem que as defesas normais do hospedeiro contra este fungo
possam estar sendo alteradas em um estágio muito precoce da evolução da
infecção pelo HIV, antes mesmo que ocorra uma depleção acentuada das
células CD4
+
(REPENTIGNY, LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). No
entanto, a prevalência das formas clínicas de candidíase oral aumentam
drasticamente a medida que a infecção pelo HIV avança, associado a
diminuição da contagem de células CD4
+
(<200/mm
3
) (VARGAS & JOLY,
2002).
32
Através de um estudo analítico retrospectivo, compreendendo um
intervalo de quatro anos, SOARES e colaboradores (2002) avaliaram a
evolução da freqüência de candidíase oral em crianças brasileiras infectadas
pelo HIV, relacionando-a com o grau de imunossupressão e terapia anti-
retroviral. A análise dos 18 prontuários indicou uma correlação significante
entre a ocorrência de candidíase e imunossupressão grave (p=0,0048), dado
este que corrobora com o último estudo citado acima.
Com a introdução da terapia anti-retroviral de alto impacto em
1996 (HAART), que inclui os inibidores de proteases, tem-se observado uma
drástica redução da prevalência de candidíase bucal em pacientes infectados
pelo HIV. Durante o período de 12 meses após o início desta nova terapia anti-
retroviral a prevalência de candidíase oral reduziu de 30-56% para 1-9%, assim
como o número de casos de candidíase recorrente e a colonização
assintomática por C. albicans na cavidade oral (MARTINS, LOZANO-CHIU &
REX, 1998).
Em relação às crianças infectadas pelo HIV, quadro semelhante
tem sido observado desde a implantação do HAART. SOARES et al. (2002)
observaram que o uso de inibidores de protease em terapia tripla aumentou
durante o período de estudo (1997 a 2000) em um grupo de crianças
brasileiras atendidas em um Hospital de referência para o tratamento da
infecção na cidade do Rio de Janeiro, em concomitância com o declínio da
freqüência de candidíase bucal, sendo que, em 2000, não foi verificado na
amostra nenhum episódio da lesão.
33
Um dos fatores responsáveis pela mudança na incidência de
infecções oportunistas em pacientes soropositivos para o HIV em uso desta
terapia anti-retroviral de alto impacto está relacionado a elevação da contagem
de células CD4
+
, conferindo assim uma reconstituição imunológica do
hospedeiro. Concomitantemente, alguns estudos demonstram a ação direta
destas drogas sobre as aspártico-proteases secretadas por espécies de
Candida, onde tal inibição atenua a adesão de C. albicans às células do epitélio
oral (CASSONE et al., 1999).
2.3 Candida spp.
Os fungos são organismos eucariotos e podem ser unicelulares
ou multicelulares. O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, da
classe Ascomycetes e filo Ascomycota e é caracterizado por leveduras que
apresentam formas arredondadas ou ovais que medem aproximadamente de
2,0 a 4,0 µm (GUARRO, 1999) e reproduzem-se por brotamento ou gemulação.
Algumas espécies, como C. albicans, produzem brotos que não se separam
uns dos outros; estes brotos formam uma cadeia de células chamada de
pseudo-hifa, forma esta necessária para invadir tecidos mais profundos nos
quadros de infecção (Figura 1) (MOLERO et al., 1998). Esta transição entre os
dois fenótipos pode ser induzida in vitro em resposta a variações do ambiente
como pH e temperatura, ou determinadas substâncias como N-
acetilglucosamina ou prolina. No entanto, o mais importante critério para a
patogenicidade é a indução para a forma micelial por macrófagos e
componentes do soro. Associado a isso, o grande interesse biológico do
34
dimorfismo é a capacidade do microrganismo mudar de forma e isso estar
associado diretamente a sua patogenicidade (MOLERO et al., 1998).
GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1990) em uma revisão da
literatura descreveram os determinantes da patogenicidade destes
microrganismos e observaram que a C. albicans e outras espécies exibem
características importantes para sua virulência, como composição de sua
parede celular com a presença de adesinas (manoproteínas), produção de
enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases, hialuronidase e condroitina
sulfatase) e formação de hifas.
Figura 1 - Dimorfismo em Candida albicans. (A) Blastosporos; (B) Tubos
germinativos; (C) Formação de hifas a partir do crescimento apical de tubos
germinativos; (D) Micélios; (E) Blastosporos secundários separados dos
filamentos. Fonte: MOLERO et al., 1998.
35
2.4 Fatores de Virulência de Candida spp.
A patogenicidade de um microrganismo é definida como sendo a
capacidade desse para causar doença. A prevenção ou a ocorrência vai
depender da interação entre o agente causador e o hospedeiro (GHANNOUM
& ABU-ELTEEN, 1990). CASADEVALL & PIROFSKI (2001) enfatizam, ainda,
que a virulência não pode ser considerada como uma característica isolada do
microrganismo, mas sim um processo dinâmico e com fenômenos de troca que
incluem tanto o hospedeiro como os fatores microbianos.
Espécies de Candida são comensais presentes na cavidade bucal
de indivíduos clinicamente saudáveis, sendo isoladas numa frequência que
varia de 40 a 60% (ARENDORF & WALKER, 1980). Vários fatores predispõem
ao desenvolvimento da candidíase, como por exemplo, distúrbios endócrinos,
gravidez, deficiência de ferro, xerostomia e desordens imunológicas
(SAMARANAYAKE & MACFARLANE, 1982). HUBE (2000) ressalta, ainda, que
o número de pacientes predispostos a infecções causadas por microrganismos
oportunistas, como a C. albicans, vem crescendo significantemente nesta
última década e os pacientes de risco para essa infecção seriam aqueles sob
tratamento para o câncer, transplantados e portadores do HIV.
GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1990) em uma revisão da
literatura que buscou descrever os determinantes da patogenicidade da
Candida, observaram que a C. albicans e outras espécies exibem como fatores
responsáveis pela virulência, a aderência à célula epitelial, dimorfismo,
capacidade de crescimento como blastosporos, pseudo-hifas e hifas, produção
36
de enzimas (proteases, fosfolipases) e endotoxinas de baixo e alto peso
molecular, bem como a composição da parede celular que facilita a adesão e
penetração através do tecido infectado. Concluem, ainda, que a virulência da
C. albicans resulta da ação conjunta desses fatores contra as defesas do
hospedeiro. Mais tarde, SENET (1997) corroborou as conclusões destes
autores quanto aos determinantes da patogenicidade da Candida, ressaltando
a importância de um melhor conhecimento dos mecanismos precisos
envolvidos na fisiopatologia da candidíase, para que se elaborem estratégias
de prevenção.
VERSTREPEN & KLIS (2006) enfatizam, ainda, a notável
capacidade de formação de biofilme a partir da propriedade de adesão de
alguns fungos como C. albicans. Esta característica apresenta grande
relevância médica e industrial, já que a presença de um biofilme maduro
dificulta a ação de antifúngicos e pode tornar-se um reservatório de células
com características de resistência a determinadas drogas. No âmbito industrial,
pode ocasionar problemas econômicos devido a formações de biofilmes em
instalações industriais em companhias de processamento de alimentos.
Ainda sobre os determinantes da patogenicidade de Candida,
FERNANANDO e colaboradores (1999) estudaram a presença de fosfatases
de superfície em C. parapsilosis e demonstraram a associação da atividade
fosfatásica ácida e alcalina com o índice de adesão destas cepas a células
epiteliais. Os autores observaram, ainda, que os isolados de C. parapsilosis
que exibiram maior atividade fosfatásica foram os que apresentaram maior
capacidade de adesão às células epiteliais bucais humanas. Concluíram assim
37
que fosfatases de espécies de Candida podem desempenhar um papel crucial
na potencialização da virulência deste fungo.
2.4.1 Parede Celular
A parede celular de Candida spp. é uma estrutura de grande
importância, pois mantém a morfologia característica de cada forma, levedura e
hifa, e é o primeiro local onde ocorre a interação entre o organismo e o
ambiente. Por isso, estudos relacionados à identificação e a distribuição dos
componentes da parede celular podem contribuir para o conhecimento do seu
papel na patogênese fúngica (ex.: expressão de adesinas e receptores para
proteínas do hospedeiro; atividade proteolítica extracelular; hidrofobicidade
[BORG & RUCHEL, 1988; CALDERONE & SCHELD, 1987; DOUGLAS, 1987;
HAZEN, 1989; BOUCHARA et al., 1990]) e na interação parasito-hospedeiro
(LOPEZ-RIBOT et al., 1991).
A parede celular dos fungos é formada por aproximadamente 80
a 90% de carboidratos. Três constituintes básicos formam a porção
polissacarídica da parede celular: polímeros de glucose com ligações β-1,3 e β-
1,6 (β-glucanas); polímeros de N-acetil-
D
-glucosamina (GlcNAc) com ligações
β-1,4 (quitina) e polímeros de manose (manana) em associação covalente com
proteínas (glico[mano]proteínas). Além disso, a parede celular apresenta
proteínas (6 a 25%) e uma pequena porção de lipídeos (1 a 7%) (CALDERONE
& BRAUN, 1991; CHAFFIN et al. 1998; CABIB et al., 2001). Os polímeros de β-
glucanas e quitina apresentam uma função estrutural formando um rígido
esqueleto que proporciona uma forte propriedade física à célula. Quanto ao
38
ponto de vista quantitativo, as β-glucanas representam o principal constituinte,
correspondendo a 47 a 60% do peso da parede celular, enquanto que a quitina,
embora sendo minoria, 0,6 a 9% em peso, apresenta uma importante função
na reprodução do fungo por formar uma constrição entre a célula parenteral e a
célula filha durante o brotamento (MOLANO et al. 1980; CABIB et al., 2001).
A parede celular de Candida spp. apresenta grande importância
na patogenicidade desses microrganismos por proporcionar adesão aos
tecidos e a células do hospedeiro, assim como por participar ativamente da
imunomodulação da resposta imune do hospedeiro (CHAFFIN et al. 1998). A
adesão é um pré-requisito para a colonização e um passo essencial para o
estabelecimento da infecção. As espécies de Candida possuem algumas
características peculiares que favorecem essa adesão, dentre elas a presença
de adesinas em suas paredes celulares. O grande repertório de adesinas
presente nesses fungos propicia uma enorme variedade de sítios no
hospedeiro que servem de porta de entrada para a infecção (CALDERONE &
BRAUN, 1991; CALDERONE, 1993). No Quadro 3 podem ser observadas
algumas manoproteínas com função de adesinas em C. albicans e seus
respectivos ligantes. Os componentes da parede celular, incluindo glucana,
quitina e manoproteínas, possuem a capacidade de modular a resposta imune
do hospedeiro ativando ou desativando-o (CASSONE, 1989), tendo as
mananas e manoproteínas como as moduladoras de atividade mais potentes
(CASSONE, 1989).
Vários estudos na literatura têm demonstrado o potencial de
adesão de isolados de Candida spp. a células epiteliais (BIASOLI et al. 1999;
39
MURPHY & KAVANAGH, 2001). MURPHY & KAVANAGH (2001) ao tratarem
um isolado de C. albicans com manosidase observaram um substancial
decréscimo (60%) na aderência a células epiteliais, demonstrando a
importância deste componente da parede (manoproteínas) no processo de
aderência de C. albicans aos tecidos do hospedeiro.
Quadro 3 – Manoproteínas (MP) de C. albicans. Adaptado de Candida
albicans adhesins: Biochemical aspects and virulence. Rev Iberoam Micol, 14,
p. 90-97, 1997.
Adesinas (kD) Ligantes
MP60 iC3b, C3d
MP60 Laminina, fibrinogênio, fibronectina
MP58 Fibrinogênio
MP165 iC3b
MP70, 55, 42 C3H
2
O
MP130 iC3b
MP37/67 Laminina
Na parede celular destes fungos existem algumas enzimas
funcionais envolvidas na biossíntese ou remodelação da parede celular, que
acompanha o crescimento e divisão celular. O Quadro 4 demonstra de forma
resumida as enzimas hidrolíticas presentes na parede celular de espécies de
Candida e seu alvo de ação.
40
Quadro 4 – Enzimas hidrolíticas da parede celular de Candida spp. Adaptado
de Cell Wall and Secreted Proteins of Candida albicans: Identification, function
and expression. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62(1), p. 130-180, 1998.
Enzima Localização Comentário Referência
β-1,3-glucanase
Parede celular Morfogênese da
Parede celular
CHAMBERS et al.
1993
β-1,3-glucana
transferase
Parede celular Metabolismo da
Parede celular
HERRERO et al. 1987
Quitinase Parede celular Enzima hidrolítica;
Morfogênese da
Parede celular
GOODAY et al. 1992
Transglutaminase
Parede celular Covalent cross-
links?
RUIZ-HERRERA et al.
1995
Fosfolipase A Parede celular Enzima hidrolítica BARRET-BEE et al.
1985
Lisofosfolipase Parede celular Enzima hidrolítica BANNO et al. 1985
Fator hemolítico Parede celular Enzima hidrolítica BANNO et al. 1985
Metaloproteases Parede celular Enzima hidrolítica EL MOUDNI et al.
1995; EL MOUDNI et
al. 1997
Trehalase Parede celular Enzima hidrolítica MOLINA et al. 1989;
RUIZ-HERRERA &
SENTANDREU 1989
Visto a grande complexidade estrutural e funcional da parede
celular dos fungus, principalmente os causadores de infecções em humanos,
NIMRICHTER e colaboradores (2005) em uma revisão recente, demonstraram
que este conjunto de características e a biossíntese destes componentes
podem ser considerados como alvos potenciais para drogas e anticorpos
antifúngicos. Estes autores descrevem, ainda, novos aspectos de
41
determinados componentes da parede celular no envolvimento direto na
patogênese fúngica, como por exemplo: glicolipídios, melanina, proteínas de
choque térmico, histonas e antígenos de superfície (Figura 2).
Figura 2 – (A) Parede celular “clássica”; (B eC) Estrutura da parede celular apresentando os
possíveis alvos (componentes da parede celular envolvidos diretamente na patogênese de
determinados fungos) para drogas e estruturas com capacidade antifúngica. Fonte: NIMRICHTER
et al. (2005).
2.4.2 Produção de Enzimas Hidrolíticas - Proteases
As espécies de Candida apresentam uma grande variedade de
enzimas que facilitam o desenvolvimento da infecção, como: proteases ácidas,
fosfolipases, hialuronidase, condroitina sulfatase, metalo-protease
citoplasmática, serina-protease citoplasmática, esterase, glicomilase, fator
hemolítico e fosfatase ácida (CHAFFIN et al. 1998).
As proteases são enzimas encontradas em vários organismos,
desde vírus até humanos, catalisando um amplo espectro de reações
42
biológicas importantes, que inclui metabolismo protéico, reações imunes,
remodelação tecidual e coagulação sangüínea (McKERROW, 1989). As
proteases que degradam os terminais da cadeia polipeptídica são chamadas
de exoproteases ou, mais especificamente de amino e carboxiproteases,
dependendo do final que é liberado da cadeia de aminoácidos do substrato
(McDONALD, 1985; BARRETT, 1986), ao passo que, as que catalisam a
clivagem de ligações peptídicas internas são denominadas endoproteases ou
proteases.
As análises in vitro das suas propriedades proporcionaram a
classificação das proteases segundo diversos critérios, com base nos
seguintes fatores: pH ótimo de atividade (ácida, neutra e alcalina), capacidade
de hidrolisar proteínas específicas (queratinase, elastase, colagenase e outras)
e similaridade com proteínas já caracterizadas, como a pepsina, tripsina,
quimiotripsina e catepsinas de mamíferos. As endoproteases podem ser
divididas em seis subclasses, que são: serina, cisteína, aspártico, metalo,
treonina e glutâmico proteases. Ao passo que as carboxiproteases foram
subdivididas em três classes, serina, metalo e cisteína carboxiproteases.
Algumas proteases não se encaixam nestas subclasses e formam a subclasse
3.4.99, de mecanismo catalítico desconhecido (BARRET, RAWLINGS &
O’BRIEN, 2001).
As proteases celulares podem apresentar funções de degradação
de proteínas e peptídeos residentes na célula, como é o caso das proteases
citossólicas e mitocôndriais; outras são sintetizadas para serem exportadas
para o espaço extracelular (proteases secretadas), como as proteases
43
lisossomais e de membrana plasmática. Ainda com relação à ação das
proteases, pode ser dividida em proteólise limitada ou ilimitada, levando em
consideração o tipo de proteólise realizada. A primeira, as proteases clivam
somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas com o objetivo de
ativar proteínas alvo, enquanto que a outra ocorre uma degradação sem
controle e/ou completa das ligações peptídicas de uma proteína (WOLF, 1992).
A atividade proteolítica celular deve ser altamente regulada para
prevenir degradação inapropriada e incontrolada de proteínas. Portanto, a ação
de uma protease deve ser limitada por sua localização subcelular e regulada
em inúmeras etapas (BOND & BUTLER, 1987).
A classe de uma protease pode ser determinada de acordo com
os seus efeitos de inibidores sobre a atividade enzimática (BARRET, 1977),
sendo esses designados em três classes: a dos que reagem com mais de uma
classe de protease; a dos específicos para uma única classe; a dos que têm
alta especificidade por uma única protease (BEYNON & BOND, 1989).
Devido à existência de vários inibidores naturais das proteases,
vários grupos de pesquisa buscam um melhor conhecimento a respeito destas
classes de enzimas, o que é estimulado pelo seu evidente potencial como alvo
para novas terapias (HUBE, 2000). Dessa forma, o armazenamento e a
obtenção da informação devem ser otimizados e, para tal, os sistemas de
classificação e nomenclatura das enzimas devem seguir os avanços dos
estudos da química de proteínas, como o seqüenciamento de aminoácidos e a
cristalografia. Dessa forma, foi criado o sistema MEROPS
(htttp://merops.sanger.ac.uk) que agrupa as enzimas em famílias de acordo
44
com a homologia na seqüência de aminoácidos. Por sua vez, as famílias de
mesma origem ancestral são agrupadas em clãs e este tipo de informação é
determinado pela estrutura terciária das proteases (BARRET, TOLLE &
RAWLINGS, 2003).
No Quadro 5 podem ser observadas algumas classes de
proteases com seus respectivos inibidores e espectro de ação.
45
Quadro 5 – Relação das classes de proteases com respectivos inibidores e
espectro de ação. Fonte: McKERROW et al., 1993
Classe de Protease
Inibidores Espectro de ação
Diisopropilfluorfosfato (DFP ou DIFP);
Diisopropilfluorfosfofluorideto (DispF)
Todas
Fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF)
Muitas
Serina-proteases
Clorometil cetonas (N-p-tosil-L-lisina-
clorometil cetona, TLCK; L-1-
tosilamido-2-feniletil clorometil cetona,
TPCK)
Algumas
p-hidroximercuriobenzoato (pHMB); E-
64 (L-trans-epoxisuccinil leucilamido-
(4-guanidino) butano); reagentes
alcaninos ( acetato de iodo,
iodoacetamida e N-etilmaleimida
(NEM)
Todas Cisteína-proteases
PMSF; Clorometil cetonas Algumas
Aspártico-proteases
Pepstatinas (pentapeptídeos acilados,
isolados de actinomicetos); compostos
diazoacetílicos (diazoacetil-L-fenil-metil
éster)
Todas
Metalo-proteases Agentes quelantes: EDTA (ácido
etileno-diamino tetracético); EGTA;
Fenantrolina
Algumas
A produção e secreção de proteases por espécies de C. albicans
foi descrita pela primeira vez em 1965 (STAIB, 1965) e desde então vem sendo
intensamente estudada por ser considerada um fator importante na
patogenicidade de espécies de Candida (MacDONALD & ODDS, 1983;
GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1986). Tem capacidade de digerir proteínas do
46
hospedeiro (MacDONALD, 1984), invadir os tecidos através da degradação de
imunoglobulinas e proteínas do sistema complemento (RUCHEL, 1986;
KAMINISHI et al., 1995), e proteínas da matrix extracelular (MORSCHHÄUSER
et al., 1997).
MacDONALD & ODDS (1983) verificaram a influência da
produção e secreção de proteases por espécies de C. albicans na invasão e
destruição dos tecidos de camundongos através da inoculação de espécies de
Candida produtoras de proteases e cepas mutantes que não produziam tal
enzima. Os camundongos inoculados com as espécies produtoras de protease
morreram, enquanto o mesmo não ocorreu com os aqueles onde as cepas
mutantes foram inoculadas. Os autores concluíram então que as proteases
seriam um dos fatores determinantes da virulência de C. albicans. Mais tarde,
GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1986) corroborando tais achados, mostraram
que a produção de proteases por espécies de Candida é essencial para que
haja a invasão nos tecidos, levando a a uma ruptura na adesão entre as
células ou até na lise da membrana celular do hospedeiro.
A produção e secreção de proteases não é característica
exclusiva de C. albicans. Todas as espécies de Candida até o presente
momento estudadas, crescidas na presença de proteína com fonte de
nitrogênio, são produtoras de proteases para o meio extracelular, o que faz
com que este não seja um fator de virulência exclusivo de C. albicans (RAY &
PAYNE, 1990; CHAKRABARTI et al., 1991).
Estudos realizados por CHAKRABARTI et al (1991) identificaram
proteases produzidas por outras espécies de Candida, comparando com a C.
47
albicans, e observaram que, além dessa a C. tropicalis, C. parapsilosis e C.
glabrata são capazes de produzir e secretar aspártico-proteases. Concluíram,
também que as proteases devem ser importantes fatores na patogênese de
espécies de Candida, principalmente em sítios onde estão presentes, também,
na ausência de doença.
HUBE (2000) cita que em C. albicans não foi detectada a
presença de outra classe de protease, a não ser a aspártico-protease. No
entanto, COSTA e colaboradores (2003) descreveram pela primeira vez que C.
albicans isoladas da mucosa oral de crianças infectadas pelo HIV e de crianças
sem evidências clínicas de imunossupressão eram capazes de produzir e
secretar para o meio extracelular outras duas classes, metalo e serina
proteases, quando cultivadas em meio BHI (infusão de cérebro e coração), e
tendo a gelatina como substrato. SANTOS & SOARES (2005) demonstraram
que uma espécie de Candida não-albicans (C. guillermondii), isolada de um
indivíduo soropositivo para o HIV, era capaz de secretar uma serina protease
de 50 kDa com propriedades de hidrolisar proteínas presentes no soro humano
e componentes da matriz extracelular. Mais tarde, este mesmo grupo
demonstrou que espécies de C. albicans isoladas de urina também foram
capazes de secretar serina protease para o meio extracelular quando
cultivadas em BHI (SANTOS et al., 2006).
OLLERT et al. (1995), ao investigarem a relação entre a atividade
secretora de protease de C. albicans isoladas da mucosa orofaríngea saudável
e com lesão de 100 pacientes infectados pelo HIV e 112 indivíduos HIV-,
observaram que no grupo HIV+ a secreção foi estatisticamente maior quando
48
comparada com o grupo controle, embora a produção tenha ocorrido em todas
as cepas analisadas. A intensidade de produção da protease das espécies de
Candida isoladas dos indivíduos HIV+ mostrou-se independente da condição
sistêmica e da relação CD4/CD8 dos pacientes. De acordo com estes achados,
os autores concluíram que a deterioração do sistema imune provocada pela
infecção pelo HIV não influenciou na virulência destes microrganismos, embora
o grupo HIV apresentasse maior produção de protease. Provavelmente
ocorreria uma seleção de espécies de Candida logo após a infecção pelo HIV.
Adicionalmente, este achado corrobora como outros estudos em que
constatou-se que a imunodeficiência celular, neutropenia crônica, câncer e
outras situações em que se faz necessária a terapia imunossupressiva são
fatores que predispõem a mudança do fungo de um estágio comensal para um
patogênico (STEWART et al. 1999; HUBE, 2000). No entanto, DE BERNARDIS
et al. (1992) demonstraram que isolados de C. albicans de pacientes infectados
pelo HIV em estágios avançados apresentavam padrões proteolíticos mais
intensos do que no caso de indivíduos não infectados ou em estágios iniciais
da infecção, o que discorda dos achados de OLLERT et al. (1995).
SCHALLER et al. (1999), ao demonstrarem a localização e
expressão, in vivo, de anticorpos contra aspártico-proteases durante um
episódio de candidíase orofaríngea através de anticorpos monoclonais e
microscopia eletrônica, detectaram o sítio de contato entre a C. albicans e as
células epiteliais, sugerindo ser a protease a responsável por toda capacidade
de causar doença nesta interação fungo-hospedeiro. Concluíram, então, que a
49
inibição desta enzima deve ser considerada como uma importante alternativa
na prevenção e tratamento da candidíase.
Existem evidências claras na literatura, da interação das
proteases produzidas por Candida spp. com proteínas chaves do hospedeiro.
CALDERONI (1989) e RUCHEL et al. (1992) demonstraram que esta classe de
enzima, durante a colonização do fungo no organismo, é responsável pela
degradação das barreiras da mucosa do hospedeiro, facilitando a sua
aderência, digestão de proteínas com finalidade nutricional e quebra da
barreira imunológica através do ataque aos linfócitos e macrófagos. Esta ação
seria facilitada pela existência, em algumas destas proteínas chaves do
hospedeiro, de epítopos com propriedades de adesão que seriam reconhecidas
pelo fungo. BOUCHARA et al.(1990) demonstraram a existência de receptores
específicos nos tubos germinativos de espécies de C. albicans para laminina,
umas das mais importantes glicoproteínas constituintes da membrana basal.
Isso facilitaria a adesão deste microrganismo, contribuindo para o
estabelecimento da candidíase.
MORSCHHÄUSER et al (1997), ao investigarem se a secreção
de protease ácida (aspártico-protease) por C. albicans facilitaria a invasão
destes microrganismos para tecidos mais profundos através da degradação
metabólica de proteínas da matriz extracelular, observaram haver grande
hidrólise. Concluíram ser a enzima secretada por estes fungos fator importante
na penetração através dos tecidos mais profundos podendo, também, atingir a
circulação sanguínea. Esta atividade proteolítica é atribuída a família
multigenes SAP de C. albicans com 10 membros. Oito dessas proteases
50
(Sap1-8) são secretadas para o espaço extracelular, enquanto as Sap 9 e Sap
10 estão ligadas a membrana via âncora de GPI (SCHALLER et al., 2005).
Esses autores propõem, ainda, nesta recente revisão da literatura sobre
enzimas hidrolíticas de C. albicans, que a presença de 10 genes que codificam
diferentes sub-classes de aspártico-proteases apresentam uma variedade de
funções cruciais na patogênese das infecções por C.albicans (Figura 3).
Figura 3 – Expressão das diferentes sub-classes de aspártico-proteases por C.
albicans durante o processo de infecção. Fonte: MUNRO & HUBE, 2002.
De acordo com o processo de infecção, diferentes isoenzimas
são expressas. Em um estudo in vitro utilizando um modelo de candidíase
vaginal, SCHALLER e colaboradores (2005) sugerem que diferentes Saps
possuem importância crucial na indução da resposta de citocinas durante a
infecção vaginal por C. albicans.
51
2.4.2.1 Inibidores proteolíticos
Algumas proteases celulares devem exclusivamente degradar
proteínas e peptídeos residentes na célula, incluindo proteases citossólicas e
mitocondriais; outras são sintetizadas para serem exportadas para o espaço
extracelular (proteaes secretadas), como é o caso das proteases de membrana
plasmática e parede celular. A ação das proteases pode ainda ser dividida em
duas categorias, levando-se em consideração o tipo de proteólise realizada,
isto incluiria proteólises limitadas, nas quais as proteaes clivam somente uma
ou um número limitado de ligações peptídicas com o objetivo de ativar
proteínas alvo e proteólises ilimitadas, nas quais ocorre uma degradação sem
controle e/ou completa, das ligações peptídicas de uma proteína (WOLF,
1992). Assim, a atividade proteolítica celular deve ser altamente regulada para
prevenir degradação inapropriada e incontrolada de proteínas vitais para a
célula (BOND & BUTLER, 1987). Neste contexto, os inibidores proteolíticos
assumem papéis cruciais na manutenção da integridade celular e,
conseqüentemente do hospedeiro como um todo.
Muitos inibidores proteolíticos naturais e sintéticos têm sido
identificados (BODE & HUBER, 1992; BARRETT, 1996). Inibidores naturais
desenvolvem funções importantes na regulação pós-traducional da atividade
proteolítica em microrganismos e em seus hospedeiros (LUSTIGMAN et al.,
1992). Inibidores sintéticos são usados como ferramentas importantes na
subclassificação das proteases em seus grupos principais (BARRETT, 1996).
Os efeitos de inibidores sobre a atividade enzimática podem determinar a
classe das proteases (Quadro 5).
52
Os inibidores proteolíticos têm sido considerados como
ferramentas em potencial para o tratamento de inúmeras patologias, como
câncer (DE VIZCAYA-RUIZ et al., 2000; ZHOU et al., 2002), infecções fúngicas
e parasitárias (BECKER et al., 1995; BRINDLEY et al., 1997), infecção pelo
HIV (DASH et al., 2003), Hepatite (KIM et al., 1996, LOVE et al., 1996), Herpes
(GIBSON & HALL, 1997), desordens inflamatórias, imunológicas e respiratórias
(TANAKA et al., 1995; HUGLI, 1996; FATH et al., 1998), alterações
cardiovasculares (OEHFNER et al., 1999) e disfunções neurodegenerativas
como doença de Alzheimer (HONG et al., 2002).
ABBENANTE & FAIRLIE (2005) ao realizarem uma extensa
revisão da literatura sobre os inibidores proteolíticos observaram que esses
apresentam atividades terapêuticas promissoras. No entanto, apesar do grande
número de estudos realizados nestas duas últimas décadas, ainda existe um
reduzido número de drogas disponíveis com adequada efetividade e segurança
para o uso como medicamentos em humanos.
Com relação a infecção fúngica causada por C. albicans, que
possui sua patogenicidade associada a um grupo de fatores de virulência que
inclui os genes que codificam as SAPs – aspártico-proteases secretadas
(SCHALLER et al., 2005), e mais recentemente a secreção também de serina-
protease (COSTA et al., SANTOS et al., 2006), ainda não se utiliza no
tratamento da infecção antifúngicos tendo como alvo estas enzimas. No
entanto, ABBENANTE & FAIRLIE (2005) listaram um grande número de drogas
em diferentes fases do desenvolvimento clínico para o tratamento de várias
53
desordens, exceto a candidíase, tento como alvo a inibição de serina (Figura 4)
e aspártico- proteases (Figura 5).
Uma das principais causas para o aumento de infecções
oportunistas, dentre elas a candidíase, foi o grande aumento do número de
indivíduos infectados pelo HIV (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI &
JOLICOEUR, 2004). Com o intuito de impedir a evolução da AIDS, as drogas
uitlizadas agem impedindo e/ou desorganizando o processo de replicação do
vírus HIV. Em 1996, um novo esquema anti-retroviral foi introduzido – HAART,
onde havia a associação de medicamentos com diferentes alvos, incluindo a
inibição da protease viral (MARTINS, LOZANO-CHIU & REX, 1998). A enzima
aspártico-protease tem ação na clivagem das poliproteínas gag e gag-pol, que
são precursoras das proteínas funcionais (p17, p24, p7, p6, p2, p1, proteases,
transcriptase reversa e integrase), responsáveis então pela maturação do vírus
HIV (CAVERT et al., 1997; SEPKOWITZ, 1998). Com a inibição dessa enzima
através deste novo esquema anti-retroviral foi observado um aumento do
número de células T CD4
+
e uma diminuição da incidência de infecções
oportunistas, como a candidíase (SOARES et al., 2002).
Vários estudos na literatura vêm atribuindo a redução da infecção
por Candida em pacientes infectados pelo HIV ao efeito indireto (melhora da
condição imunológica do hospedeiro), como também a um efeito direto sobre
as aspártico-proteases secretadas por estes fungos (BORG-VON ZEPELIN et
al., 1999; KORTING et al., 1999; CASSONE et al., 1999; GRUBER et al., 1999;
BERKTIÉ et al., 2001) exercendo desta forma um efeito protetor contra o
estabelecimento da infecção fúngica (Figura 6). Por isso, os inibidores de
54
aspártico protease do HIV estão sendo alvo de pesquisas para o tratamento
alternativo para infecções fúngicas, devido a crescente resistência dos fungos
aos quimioterápicos existentes (PALMEIRA, 2006).
Figura 6 – (A) Adesão, degradação do tecido do hospedeiro e penetração
proporcionada pela secreção de diferentes Saps; (B) Efeito protetor gerado
pela presença dos inibidores da aspártico-protease do HIV (HIV-PI) através da
inibição da atividade das Saps de Candida albicans. Fonte: MUNRO & HUBE,
2002.
No entanto, como a maioria dos medicamentos, cabe aqui
ressaltar os efeitos colaterais causados por estes inibidores, por serem
hidrofóbicos e se depositarem nos adipócitos, podendo causar disfunção
mitocondrial nas células do hospedeiro (MUKHOPADHYAY et al., 2002),
disfunções na diferenciação de adipócitos, atrofia lipídica periférica devido ao
55
aumento de ácidos graxos liberados dos adipócitos mortos por apoptose
(RUDICH et al., 2001; HADIGAN et al., 2002), acúmulo de gordura no
abdômen, devido à interrupção do hormônio do crescimento e de cortisol
(RUDICH et al., 2001; HADIGAN et al., 2002), elevado índice de triglicerídeos
(GOUGEON et al., 2000; LENHARD et al., 2000) e colesterol (LIANG et al.,
2001; DUBE et al., 2002). Apesar desses efeitos colaterais, seus benefícios em
pacientes infectados pelo HIV são significativos, levando ao declínio da carga
viral, aumento da resposta imunológica e conseqüente diminuição das
infecções oportunistas.
56
Figura 4 – Inibidores de serina-protease em desenvolvimento clínico. Fonte:
ABBENANTE & FAIRLIE, 2005.
57
Figura 5 – Inibidores de aspártico-protease em desenvolvimento clínico. Fonte:
ABBENANTE & FAIRLIE, 2005.
58
2.4.3 Diferenciação celular
A observação de hifas em tecidos infectados e sua maior
resistência à fagocitose sugere tratar-se da forma patogênica de C. albicans,
enquanto a forma ovóide da levedura representa seu estado comensal
(SWEET, 1997).
As espécies de C. albicans exibem a capacidade de crescimento
tanto na forma de levedura como de micélio (tubo germinativo) em resposta
aos diferentes fatores ambientais. Experimentos in vivo demonstram que esta
transição de levedura para micélio deve estar relacionada com a
patogenicidade deste microrganismo, passando, então, a ser considerada
como um importante fator de virulência (CUTLER, 1991). In vitro, esta mudança
morfológica é facilmente induzida através de algumas características
ambientais e/ou nutricionais (como por exemplo: temperatura, pH e fonte de
carbono) (SIMONETTI et al. 1974; BUFFO et al. 1984). No entanto, os
mecanismos fisiológicos envolvidos no processo de morfogênese e regulação
molecular em C. albicans devem ser mais bem esclarecidos (CASANOVA et al.
1997). Por isso vários estudos vêm sendo realizados a fim de se compreender
melhor estes eventos para que se possa usá-los no tratamento e prevenção de
infecções fúngicas, principalmente em pacientes mais susceptíveis.
Os eventos de diferenciação celular são induzidos pelas
mudanças na expressão de genes que codificam fatores específicos, muitos
dos quais são necessários para a virulência do microrganismo (WHITEWAY &
OBERHOLZER, 2004). A via de transdução de sinal pertencente a família de
proteínas Ras – proteína cinase A (PKA) é importante no processo de
59
regulação e diferenciação tanto para a formação de hifas quanto para a
virulência de Candida albicans durante o desenvolvimento da infecção (LO et
al., 1997). Recentemente, UENO e colaboradores (2004) demonstraram que
poliaminas apresentam uma ação “upstream” na ativação da via de sinalização
da adenilato ciclase elevando a concentração de AMP cíclico intracelular,
regulando assim a formação de hifas em Candida albicans (Figura 6).
Figura 6 – Interação de Poliaminas na via de transdução de sinal da Adenilato
ciclase-AMP cíclico. Fonte: UENO et al., 2004.
PARK et al. (2005) corroboraram os resultados do estudo anterior
ao observarem, através de um modelo de infecção de células epiteliais orais in
vitro e um modelo de infecção in vivo de camundongos, que a formação de
hifas é mediada pela via das proteínas RAS – cinase A sendo ainda um
mecanismo de virulência chave durante o processo de infecção orofaríngea. No
entanto, WARENDA et al. (2003) ao estudarem a capacidade de diferenciação
60
de Candida albicans em hifas in vitro e in vivo e invasão aos tecidos do
hospedeiro, observaram que cepas mutantes para a produção de septinas
apresentaram capacidade para o crescimento em forma de hifas normal mas
reduzida invasão aos tecidos e atenuação na virulência. A família das septinas
é formada por proteínas responsáveis pela formação dos filamentos do
citoesqueleto e recentemente tem-se investigado a sua importância na
formação de hifas em C. albicans, já que essas proteínas apresentam funções
na morfogênese e em importantes eventos na superfície celular de outros
fungos (LONGTINE et al., 1996; WARENDA et al., 2002). Assim, WARENDA e
colaboradores (2003) concluíram que as septinas são necessárias para a
invasão, o que parece ser mais importante para o sucesso da patogênese de
Candida albicans que a formação de hifas isoladamente. Isso porque as cepas
formadoras de hifas mas com baixa produção de septinas (mutantes) não
foram capazes de produzir infecção.
Em outros fungos, esta via de sinalização celular também é
crucial para o processo de diferenciação celular. D`SOUZA e colaboradores
(2001) observaram em Cryptococcus neoformans que um mutante pka, por
apresentar uma atividade reduzida desta enzima, mostrou com reduzida
virulência quando comparado com uma cepa selvagem. A baixa atividade de
PKA influenciou não somente o processo de diferenciação celular, mas
também a produção de melanina e de cápsula, fatores estes já associados à
patogênese do microrganismo.
Muitos componentes de outras vias de transdução de sinal podem
ser necessárias no controle da morfogênese. A sinalização através do cálcio
61
tem sido associada a diferenciação do estado de levedura para hifa. A
subunidade A da calcineurina, que é regulada pelo cálcio ligado a calmodulina
é necessária para o desenvolvimento adequado da hifa, e a proteína cinase
dependente de cálcio/calmodulina já foi identificada em Candida albicans
(SATO et al., 2004).
2.4.4 Adesão e formação de biofilme de Candida
Para muitos microrganismos a adesão aos tecidos do hospedeiro
é essencial para a patogênese, e as características microbianas responsáveis
por esta adesão às supefícies das mucosas são considerados atributos da
virulência (CASADEVALL & PIROFSKI, 2001). Para C. albicans, a adesão as
superfícies do hospedeiro também é de extrema necessidade para ocorrer o
desenvolvimento da infecção. Além dessa adesão, há a capacidade de
formação de biofilme devido a hidrofobicidade da parede celular. Esta
importante característica permite com que C. albicans colonize além dos
tecidos do hospedeiro, implantes, catéteres e materiais cirúrgicos. Uma das
molécula sinalizadora, farnesol (“quorum-sensing” molécula), que inibe a
formação de hifas em C. albicans, tem apresentado também capacidade de
prevenir a formação de biofilme por este fungo. CAO e colaboradores (2005)
utilizando análises de expressões de genes por “microarray” de uma população
fúngica tratada com farnesol caracterizou uma série de produtos gênicos
importantes para a formação do biofilme.
No entanto, para que ocorra a formação desta comunidade
microbiana altamente estruturada, o biofilme, é necessário haver interação
62
entre moléculas presentes na superfície da célula fúngica e na célula epitelial.
Evidências sugerem as manoproteínas de Candida albicans como as principais
adesinas responsáveis pela adesão às células do hospedeiro (TOSH &
DOUGLAS, 1992).
O fenômeno de adesão é conferido a proteínas especializadas de
superfície celular chamadas de adesinas que se ligam especificamente a
aminoácidos ou açúcares na superfície de outras células ou promovem a
adesão a superfícies abióticas. Todas as adesinas fúngicas compartilham em
comum três domínios estruturais, que são: domínio C-terminal que contém a
âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol) responsável pela ligação da adesina a
parede celular, a porção N-terminal que contém o carboidrato ou peptídeo de
ligação e o domínio central caracterizado pela presença de múltiplas repetições
de serina- e treonina- codificados por uma sequência conservada do DNA
(Figura 7) (VERSTREPEN & KLIS, 2006).
O envolvimento de vários fatores na adesão da Candida às
células epiteliais tem sido também demonstrado, e entre eles, a atividade
proteolítica extracelular (BORG & RÜCHEL, 1988; HUBE, 1996). A secreção de
enzimas proteolíticas aumenta a capacidade do fungo para colonizar e penetrar
nos tecidos bem como escapar do sistema imune do hospedeiro (MacDONALD
& ODDS, 1980; BORG & RÜCHEL, 1988; RAY & PAYNE, 1988; CUTLER,
1991; RÜCHEL et al., 1992; KAMINISHI et al., 1995; KRETSCHMAR et al.,
1999). O “phenotypic swiching” (mudanças reversíveis nas características
fenotípicas das células) também contribui para a aderência, pois permite ao
fungo assexuado adaptar-se às mudanças ambientais. Ou seja, quando ocorre
63
alteração no equilíbrio do meio bucal, pode haver mudança na expressão de
moléculas de superfície da Candida, favorecendo sua aderência na mucosa
bucal e consequentemente infecção (CANNON et al., 1995). Os genes de
adesão são ativados por diversos fatores, tais como: estarvação do meio por
carbono e/ou nitrogênio, mudanças de pH ou alterações nos níveis de etanol
(SAMPERMANS et al., 2005). Estas mudanças da forma “não-aderente” para a
“aderente” permite uma adaptação das leveduras a estas situações de “stress”.
Tem-se sugerido que o DNA proviral do HIV pode estar presente
em células epiteliais bucais e provocar mudanças na superfície celular, de
forma a favorecer a colonização da Candida (QURESHI et al., 1995).
Posteriormente foi demonstrado que C. albicans se liga a um número
significantemente maior de celulas epiteliais bucais de pacientes HIV+ do que
de indivíduos saudáveis. Isto pode significar que receptores das células
hospedeiras possuem papel decisivo na recorrência de candidíase oral em
pacientes infectados pelo HIV (SCHWAB et al., 1997).
64
Figura 7 – Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas.
As adesinas fúngicas consistem de três domínios. Durante o transporte através
da via de secreção, as adesinas sofrem extensas modificações pos-
transducionais. No retículo endoplasmático, o peptídeo sinal da porção N-
terminal é removido e o peptídio da porção C-terminal é substituído pela âncora
de GPI, e ainda se inicia o processo de N-glicosilação e O-glicosilação
envolvendo os resíduos de serina e treonina. Acredita-se que íons cálcio sejam
necessário para a estalização da longa e semi-rígida estrutura formada pela
adesina ao reconhecer seu receptor. Fonte: VERSTREPEN & KLIS, 2006.
O processo de adesão de espécies de Candida às superfícies
do hospedeiro é controlado e induzido por várias cascatas de sinalização
celular tanto no fungo como também no ambiente, em prol de sua virulência.
DRAGO et al. (2000) observaram que células epiteliais orais promoviam a
endocitose de Candida albicans. Mais tarde, PARK e colaboradores (2005)
corroboraram este achado ao demonstrarem que o acúmulo de actina na célula
epitelial ao redor da hifa internalizada sugeriria a endocitose do fungo por estas
células. Assim, concluíram que após a adesão, Candida albicans invade o
65
epitélio oral in vitro através da indução da sua própria endocitose pelas células
do hospedeiro.
Além da adesão, espécies de Candida podem formar biofilmes
tornando esses microrganimos menos susceptíveis aos antifúngicos. Biofilme
de C. albicans consiste em uma mistura de leveduras, hifas e pseudohifas e
apresenta uma camada basal de leveduras que ancora todo este biofilme na
superfície (BAILLIE & DOUGLAS, 2000). Resultados de muitos estudos têm
demonstrado que biofilmes formados por espécies de Candida mostram-se
mais resistentes a importantes agentes antifúngicos utilizados na clínica, como
anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Novos azóis, como
voriconazol e ravuconazol, também mostraram-se ineficazes contra estes
biofilmes (KUHN et al., 2002).
O mecanismo de resistência do biofilme aos agentes
antimicrobianos ainda não está totalmente elucidado. Uma das hipóteses que
pode explicar esta resistência é a presença da matriz restringindo a penetração
dos medicamentos através da formação de uma barreira de difusão (GILBERT
et al., 2002) e somente as camadas mais superficiais estariam em contato com
doses letais dos antibióticos.
2.4.5 Ecto-fosfatases em Candida
Todas as células necessitam monitorar constatemente seus
ambientes internos para responder a estímulos indutores de proliferação,
66
diferenciação e morte celular (DICKMAN & YARDEN, 1999). Em eucariotos, os
processos de fosforilação e defosforilação são eventos chave na manutenção
do balanço de atividades celulares como de processos metabólicos, expressão
gênica, controle do ciclo celular, mecanismos secretórios e de transporte,
organização do citoesqueleto, adesão celular e apoptose (WERA &
HEMMINGS, 1995; BARFORD et al., 1998; McCLUSKEY & SAKOFF, 2001).
As alterações dos estados de fosforilação de proteínas são reguladas por duas
classes de enzimas, as proteína-cinases, que catalisam a adição covalente de
grupos fosfatos a resíduos de aminoácidos, ou através da ação reversa de
proteína-fosfatases (BARFORD et al., 1998). A fosforilação protéica permite a
regulação de atividades enzimáticas através de mudanças conformacionais
alostéricas, ou impedindo o acesso ao sítio catalítico da enzima (JOHNSON &
BARFORD, 1993). Desta forma, a adição ou remoção de um grupo fosfato
pode alterar profundamente a atividade ou propriedade de uma proteína.
As proteínas-fosfatases constituem uma família de enzimas
estrutural e funcionalmente diversas que fazem parte integral do sistema
regulatório de fosforilação e hidrolisam uma variedade de ésteres orgânicos,
incluindo proteínas, com liberação de fosfato inorgânico (FISHER et al., 1991).
Estas enzimas desempenham papel chave na biologia celular de espécies
fúngicas. Vários processos biológicos fundamentais em fungos, tais como ciclo
celular, transcrição, “mating” e diferenciação celular são modulados através da
fosforilação de proteínas (MADHANI & FINK, 1998; DICKMAN & YARDEN,
1999; DA SILVA et al., 1999; ZHAN et al., 2000).
67
Fosfatases de superfície, que apresentam o sítio ativo está
voltado para o meio extracelular, são conhecidas como ecto-enzimas e podem
ser estudadas utilizando células vivas (FURUYA et al., 1998). As ecto-
fosfatases foram detectadas em vários microrganismos, incluindo protozoários
(FERNANDES et al., 1997; MEYER-FERNANDES et al., 1999) e bactérias
(BRAIBANT & CONTENT, 2001). A presença de fosfatases de supefície em
fungos foi estudada, incluindo Cryptococcus neoformans (MAHVI et al., 1974),
S. cerevisiae (MILDNER et al., 1975), Sporothrix schenckii (ARNOLD et al.,
1986), paracoccidiodes brasiliensis (AASEN & ALBORNOZ, 1994), Candida
parapsilosis (FERNANDO et al., 1999), Aspergillus fumigatus (BERNARD et al.,
2002) e Fonsecaea pedrosoi (KNEIPP et al., 2003), através de métodos
citoquímicos e/ou bioquímicos.
O papel fisiológico das ecto-fosfatases expressas em diferentes
microrganismos ainda não foi elucidado, embora alguns estudos sugiram suas
funções. As fosfatases de superfície podem funcionar regulando a fonte de
fosfato inorgânico para o crescimento microbiano, através da hidrólise de
metabólitos fosfomonoéster (GOTTLIEB & DWYER, 1981; FERNANDES et al.,
1997). Essas enzimas foram ainda associadas à diferenciação celular
(BAKALARA et al., 2000). As ecto-fosfatases podem ainda funcionar como
marcadores de virulência, já que amostras virulentas de Leishmania donovani
apresentam níveis de atividade enzimática significantemente maiores do que
os detectados em amostras avirulentas (SINGLA et al., 1992). As fosfatases
podem também interferir nas interações parasito-célula hospedeira
(FERNANDO et al., 1999; KNEIPP et al., 2005). No caso de espécies
68
pertencentes ao gênero Leishmania as fosfatases ácidas podem modular a
adesão a macrófagos (VANNIER-SANTOS et al., 1995) e eventos cruciais
durante a infecção por este parasito, através da regulação da sinalização
celular (MARTINY et al., 1996). Em C. parapsilosis foi demonstrada a
associação da atividade fosfatásica ácida e alcalina com a adesão de
diferentes isolados deste fungo a células epiteliais bucais humanas. Os autores
demonstraram que isolados de Candida parapsilosis que exibiram maior
atividade fosfatásica foram os que apresentaram maior capacidade de adesão
as células epiteliais. Esta relação indica que fosfatases de espécies de Candida
podem desempenhar um papel crucial na potencialização da virulência deste
fungo (FERNANDO et al., 1999). No entanto, na literatura consultada nenhum
estudo foi encontrado sobre a influência da infecção pelo HIV sobre etas
leveduras.
69
3. Objetivos
3. Objetivos3. Objetivos
3. Objetivos
O presente estudo teve como objetivos:
1 Identificar possíveis associações entre a secreção de serina-protease por
espécies de Candida e os seguintes parâmetros:
degradação de proteínas presentes na matriz extracelular (laminina,
fibronectina e colágeno) e componentes do soro (albumina humana e bovina e
IgG);
adesão à células epiteliais (Ma 104);
formação de biofilme.
Comparar o perfil de proteínas de superfície de C. albicans isolada de
criança infectada pelo HIV e criança sem evidências clínicas de
imunossupressão com relação ao reconhecimento de proteínas formadoras da
matriz extracelular.
Avaliar o efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de protease do
HIV no crescimento, diferenciação celular e adesão a células epiteliais (Ma
104) de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV.
Verificar o possível envolvimento das atividades fosfatásicas ácidas de
superfície de C. albicans isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas
pelo HIV e de crianças sem evidências clínicas de imunossupressão em
70
processos de adesão a células epiteliais (Ma 104), e ainda comparar com a
condição sistêmica de cada paciente.
71
4. Materiais e
4. Materiais e4. Materiais e
4. Materiais e Métodos
Métodos Métodos
Métodos
4.1 Microrganismos
No presente trabalho foram utilizadas Candida spp. isoladas da
mucosa bucal de crianças infectadas pelo HIV e de crianças sem evidências
clínicas de imunossupressão (COSTA et al., 2003; PORTELA et al., 2005). As
leveduras vêm sendo mantidas em tubos de rosca contendo 5 mL de meio
Sabouraud-dextrose sólido com vaselina estéril no Laboratório de Protistas do
Departamento de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia Professor
Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
4.2 Condições de cultivo
Para obtenção dos extratos celulares e sobrenadantes de cultivo,
os isolados de Candida, após o crescimento em meio sólido, foram cultivados
em meio BHI (infusão de cérebro e coração, Difco, Bacto) distribuídos em
alíquotas de 10 mL em frasco Erlemeyer de 50 mL permanecendo sob agitação
por 48 horas a 37°C.
Para induzir a secreção de aspártico-protease, as leveduras
foram crescidas por 5 dias a 37
o
C em meio de cultivo o YCB (Yeast Carbon
Base, Difco, Bacto) suplementado com 1% de BSA (soro albumina bovina) pH
5.5, em um mesmo volume e frasco Erlemeyer.
72
4.3 Contagem do número de células
O crescimento celular foi estimado através de contagem das
células em câmara hematocitométrica de Neubauer (Neubauer Improved
Chamber).
4.4 Obtenção do extrato celular
As células foram coletadas e lavadas três vezes com PBS (pH
7,2) gelado, transferidas para um tubo de 20 mL e ressuspendidas em PBS
contendo os seguintes inibidores proteolíticos: 1,10-fenantrolina a 10 mM, E-64
a 10 µM (L-trans-epoxisuccinil leucilamido-(4-guanidino) butano), fluoreto de
fenilmetanosulfonil (PMSF) a 100 µM, pepstatina a 10 µM. A este material foi
adicionado pérolas de vidro, de diâmetro de 425-600 µm, previamente lavadas
por 12 horas com ácido nítrico e mais 12 horas com água destilada. As
leveduras foram então rompidas utilizando-se um homogenizador de células
(bead-beater) por 5 períodos de 2 minutos cada, intercalados com banhos de
gelo de 1 minuto. O extrato celular foi obtido através da centrifugação a
10.000xg durante 2 minutos.
4.5 Obtenção do sobrenadante de cultivo
As leveduras foram coletadas, na fase logarítmica de
crescimento (48 horas de cultivo), através de centrifugação a 7000xg durante 8
minutos a 4°C. O sobrenadante obtido foi filtrado e m membrana Millipore 0,22
µm e, posteriormente, 3 mL foram submetidos a concentração por ultrafiltração
utilizando microconcentradores Centricon com membrana de exclusão (“cut-
73
off”) igual a 10 kDa, durante aproximadamente 7 horas a 4°C finalizando uma
solução concentrada 30x. Ao sobrenadante concentrado foram adicionados 10
µL de tampão de amostra (SANTOS et al., 1999).
4.6 Viabilidade celular
Após o crescimento as leveduras foram submetidas ao teste de
exclusão do corante azul de Trypan para verificação da viabilidade celular
(PATTERSON, 1979). O sobrenadante de cultivo, concentrado 30x foi utilizado
para dosagem da enzima lactato-desidrogenase (SANTOS et al., 2006).
4.7 Dosagem de proteínas
As proteínas foram quantificadas de acordo com o método
descrito por LOWRY et al. (1951), utilizando-se a soro albumina bovina (BSA)
(Sigma) como solução padrão.
4.8 Determinação do perfil de proteínas totais
Para a análise do perfil de proteínas totais foi realizado um gel de
poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE), contendo gel de empacotamento a 3%, de
acordo com o sistema descrito por LAEMMLI
(1970). As amostras foram
adicionadas de 5% de 2-β-mercaptoetanol e aquecidas, em banho-maria, por
aproximadamente 5 min, a 100°C. Os géis foram carregados com 50 µg de
proteína referentes à amostra e a eletroforese processada a 100 V, a 4°C. As
proteínas foram reveladas através da coloração dos géis com 0,2% de
74
Coomassie Brilliant Blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40 v/v/v)
ou com solução de nitrato de prata (GONÇALVES et al.,
1984).
4.9 Ensaio para atividade proteolítica
As proteases foram caracterizadas por SDS-PAGE a 10% (com um
gel de empacotamento a 3%), contendo 0,1% de gelatina (Sigma) como
substrato co-polimerizado ao gel (HENSSEN & DOWDLE, 1980). Aos géis foram
aplicados os extratos das leveduras e os sobrenadantes de cultivo concentrado
e a corrida eletroforética realizada a 120 V, a 4°C. Ao término da corrida, os géis
foram incubados em 1% Triton X-100, com e sem os seguintes inibidores
proteolíticos: 1,10-fenantrolina a 10 mM, E-64 a 10 µM, PMSF a 100 µM,
pepstatina a 10 µM, por 1-2 h, à temperatura ambiente, com agitação suave. Os
géis foram, então, lavados com água destilada e incubados por 48 h, a 37°C em
50 mM de tampão fosfato, pH 5,5, suplementado com 2 mM de ditiotreitol (DTT),
na presença e na ausência dos inibidores proteolíticos citados anteriormente.
Depois da digestão enzimática, a revelação das bandas proteolíticas foi feita,
primeiramente, através da coloração do gel com 0,2% de Coomassie Brilliant
Blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40 v/v/v) e, finalmente,
descorados em solução contendo 7% de metanol e 5% de ácido acético, à
temperatura ambiente, com agitação suave, por aproximadamente 16 h
(SANTOS et al., 1999). Ao final da descoloração, os géis foram mantidos em
água destilada, por 1 h, fotografados e postos para secar a temperatura
ambiente, em folhas de papel celofane. Análises densitométricas das bandas
75
proteolíticas foram realizadas utilizando-se o “software” do analisador de
imagens Kodak Digital Science EDAS 120.
4.10 Massa molecular aparente de proteínas e proteases
As massas moleculares aparentes das proteínas e proteases foram
determinadas por comparação com proteínas padrões de massas moleculares
conhecidas (GIBCO BRL) aplicadas ao gel de poliacrilamida.
4.11 Análise da fragmentação dos substratos protéicos por SDS-PAGE
A identificação das atividades peptidásicas secretórias das
amostras de Candida foi realizada em SDS-PAGE através da análise dos
fragmentos de hidrólise dos substratos protéicos.
Alíquotas de 20 µl (aproximadamente 40 µg) do sobrenadante de
BHI e YCB + 1% de BSA concentrado foram incubados com 10 µl de tampão
fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5 (para o BHI) e fosfato de sódio 50 mM, pH 4,5 e
10 µl das seguintes soluções de proteínas: laminina humana (concentração final
de 2 µg/mL), fibronectina humana (2 µg/mL), BSA (soro albumina bovina) (5
µg/mL), HSA (soro albumina humana) (5 µg/mL) e IgG (imunoglubulina G) (2
µg/mL) por 12 horas a 37
o
C. Em seguida, o material foi concentrado à vácuo
(“speed vac”) e ressuspenso em 5 µl de água destilada e 5 µl de tampão de
amostra para SDS-PAGE, contendo 10% de β-mercaptoetanol (PUCCIA et al.,
1998). O perfil de proteínas foi analisado através de SDS-PAGE, como descrito
no item 4.8. As proteínas foram evidenciadas após coloração dos géis com 0,2%
de Coomassie brilliant blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40
76
v/v/v). A atividade proteolítica foi também ensaiada na presença de diferentes
inibidores proteolíticos, tendo apenas como substrato o BSA. Para verificação da
capacidade hidrolítica do sobrenadante concentrado do YCB + 1% de BSA, foi
utilizado somente o BSA como substrato.
4.12 Marcação de proteínas de superfície com biotina
A biotinilação das proteínas de superfície foi realizada segundo o
método descrito por ALTIN
&
PAGLER
(1995). Resumidamente, as células de
Candida foram lavadas três vezes em PBS, pH 8,0, para remoção das proteínas
presentes no meio de cultivo. Uma suspensão correspondente a 2,5 × 10
7
células/mL em PBS, pH 8,0, foi adicionada de 0,5 mg de Sulfo-NHS-LC-biotina
(Pierce). As suspensões celulares foram incubadas por 1 h a 4
o
C e, em seguida,
foram centrifugadas a 1.500×g por 2 min. Um controle negativo foi realizado,
consistindo do mesmo número de células incubadas nas mesmas condições,
com exceção da adição da biotina. As células, por sua vez, foram lavadas três
vezes em PBS, para a remoção do excesso de biotina. Finalmente, os extratos
protéicos foram obtidos.
4.13 “Western blotting”
Os polipeptídeos correspondente ao extrato de células foram
separados através de SDS-PAGE e transferidos para membrana de
nitrocelulose (Pharmacia) segundo o método descrito por TOWBIN,
STAEHELIN & GORDON (1979). A transferência foi realizada utilizando-se
tampão contendo 12,5 mM Tris, 96 mM glicina e 20% metanol, por 2 h a 4
o
C.
77
Após a transferência, as membranas foram incubadas por 16
horas a 4
o
C, em tampão de bloqueio (TBS, pH 7,2; 0,1% Tween 20; 5% leite
em pó desnatado). Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes por
10 minutos com TBS/0,1% Tween 20.
Para revelação das proteínas de superfície biotiniladas, as
membranas foram incubadas por 1 hora, sob agitação, com estreptoavidina
conjugada à peroxidase (Pierce), diluída 1:400 em tampão de bloqueio. As
membranas foram novamente lavadas três vezes por 10 min com TBS/Tween
20.
Para a detecção de proteínas ligantes a fibronectina, laminina e
colágeno, as membranas foram incubadas por 1 hora, sob agitação, com essas
proteínas de matriz extracelular na concentração de 100 µg/mL em tampão de
bloqueio. As membranas foram então lavadas três vezes por 10 minutos com
TBS/0,1% Tween 20. Após, as membranas foram incubadas com soluções
contendo os anticorpos monoclonais das respectivas proteínas de matriz
(diluição 1:500). Para remoção dos anticorpos que não foram reconhecidos,
realizaram-se três lavagens por 10 minutos com TBS/0,1% Tween 20. Por fim,
as membranas foram incubadas com soluções contendo os anticorpos
secundários conjugados à peroxidase na diluição de 1:2000. Antes da
revelação, as membranas foram lavadas novamente três vezes com TBS/0,1%
Tween 20.
A revelação tanto das proteínas biotiniladas como das ligantes a
proteínas componentes da matriz extracelular foi realizada por
quimioluminescência.
78
4.14 Análise através de citometria de fluxo (FACs)
Após o crescimento por 48 horas em meio BHI, 1 x 10
6
leveduras/mL de Candida albicans isolada de criança infectada pelo HIV,
criança sem evidência clínica de imunossupressão e ATCC foram incubadas
em uma solução de BSA 1% em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Após
duas lavagens com PBS, as células foram mantidas em soluções distintas de
fibronectina, laminina e colágeno (100 µg/mL cada) por 3 horas a 4
o
C. As
leveduras foram então lavadas com PBS e fixadas com tampão cacodilato
paraformaldeído 0.1 M, pH 7,2 por 1 hora a temperatura ambiente. As células
fixadas foram novamente lavadas com PBS e sequencialmente incubadas na
presença de anticorpos anti-proteínas de matriz (diluição 1:500) e anticorpos
secundários marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (diluição
1:100) por 1 hora a temperatura ambiente. As leveduras foram novamente
lavadas e 10.000 células foram analisadas no citômetro de fluxo EPICS ELITE
(Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA) equipado com laser de argônio 15 mW
com comprimento de onda de 488 nm. Células controles, que não foram
incubadas com as respectivas soluções com proteínas de matriz extracelular,
foram analisadas previamente.
4.15 Interação de Candida com células epiteliais
A linhagem celular Ma 104 (epitélio renal de macaco), cedida pela
Profa. Carla Holandino, da Faculdade de Farmácia da UFRJ foram utilizadas
para os ensaios de interação celular. As células animais foram cultivadas em
79
frascos de 25 cm
2
, contendo meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB), a 37
o
C. O controle do pH foi garantido pela adição de 3,0 g/L de
N-(2-hidroxietil)-piperazina-N`-(2-ácido etanosulfônico) (HEPES) e 2,0 g/L de
NaHCO
3
na composição do meio, como previamente descrito por FRESHNEY
et al. (1994). Um inoculo inicial de 5 X 10
4
células/mL foi utilizado e as culturas
mantidas na fase logarítmica de crescimento.
As leveduras foram crescidas em BHI por 48 horas e, em
seguida, lavados três vezes em NaCl 0,85% e incubadas na ausência ou
presença dos inibidores proteolíticos, incluindo drogas anti-retrovirais usadas
no tratamento da infecção pelo HIV e inibidores de fosfatases ácidas durante 1
hora a 37
o
C. Após este tempo, as leveduras foram lavadas duas vezes com
NaCl 0,85% e uma vez com DMEM. A interação fungo-célula animal foi
realizada conforme descrito por KNEIPP et al. (2005). As células epiteliais
foram cultivadas sobre lamínulas distribuídas em placas de 24 poços. A cada
poço contendo 5 x 10
4
células animais foi adicionada uma suspensão de
leveduras, em meio de cultura DMEM, contendo 5 x 10
5
leveduras. Após 1 hora
e 30 minutos de interação a 37
o
C, as leveduras não aderidas foram retiradas
através de lavagem das culturas com PBS, para posterior fixação com solução
de Bouin e coloração com Giemsa. Para determinação dos índices de adesão,
as lamínulas coradas foram observadas em microscópio óptico (100x). Em
cada experimento foram analisadas 400 células animais e o índice de adesão
determinado.
80
4.16 Efeito de anti-retrovirais do tipo inibidores de protease do HIV no
crescimento e diferenciação celular em C. albicans
Para verificação dos efeitos de inibidores de proteases no
processo de crescimento celular, após o cultivo em meio de cultura BHI (Brain
heart infusion) líquido por 48 horas à 37
o
C, 1x10
8
leveduras/mL foram
incubadas por 72 horas em meio BHI na ausência (controle positivo) e na
presença dos inibidores de protease, Ritonavir, Indinavir, Saquinavir e
Nelfinavir em diferentes concentrações (100µM; 200µM; 250µM). O
monitoramento do crescimento foi realizado através de contagem em câmara
de Neubauer a cada 24 horas (item 4.6).
Com a finalidade de observar os efeitos das diferentes drogas no
processo de diferenciação celular de C. albicans, uma suspensão de 1 x 10
6
leveduras/mL, após terem sido cultivadas em BHI na presença e ausência das
drogas anti-retrovirais por 24 horas, foram induzidas por SFB a diferenciação
(levedura -> tubo germinativo). As células foram lavadas três vezes em PBS e
analisadas através de microscopia óptica.
O efeito dos inibidores no processo de diferenciação também foi
verificado. Para tal, leveduras que ainda não tinham sido crescidas na
presença das drogas anti-retrovirais, foram induzidas a diferenciação por SFB,
na presença dos inibidores de protease do HIV. A análise também foi realizada
através de microscopia óptica utilizando câmara de Neubauer.
81
4.17 Determinação da atividade ecto-fosfatásica em C. albicans
A atividade ecto-fosfatásica foi determinada através da hidrólise
do substrato 4-metilumbeliferil utilizando-se 2,5 x 10
7
leveduras, crescidas em
meio de cultura BHI líquido por 48 horas à 37
o
C, após foram suspensas em 0,5
mL de tampão fosfato de sódio pH 5,5. Após 60 minutos à temperatura
ambiente, os tubos foram centrifugados a 1.500 g por 10 minutos (4
o
C) e 0,2
mL do sobrenadante foi adicionado 0,4 mL de NaOH 1M e submetido à leitura
espectrofotométrica a 425 nm. Todos os experimentos foram feitos em
triplicada e mais um controle, no qual o substrato foi adicionado às células
imediatamente antes do término da reação o que permitiu a avaliação da
hidrólise de 4-metilumbeliferil não específica. A concentração de 4-
metilumbeliferona liberada foi calculada através de uma curva padrão de 4-
metilumbeliferona e as atividades foram expressas em picomoles/h/10
7
células
liberados.
4.17.1 Efeito de diferentes inibidores na atividade ecto-fosfatásica de C.
albicans
Diferentes inibidores específicos de fosfatases como:
ortovanadato de sódio (Na
3
VO
3
, 1 mM), molibdato de sódio (Na
2
MoO
4
, 1 mM),
tartarato de sódio (10 mM) e fluoreto de sódio (NaF, 1mM) foram testados. A
atividade fosfatásica foi determinada conforme descrito no item 4.16.
82
4.18 Formação de biofilme por C. albicans
As leveduras foram crescidas em meio de cultura BHI por 48 h à
37
o
C. Após este período, sistemas contendo uma suspensão de 10
5
células/mL
com e sem 10 mM de fluoreto de sódio, 1 mM de ortovanadato de sódio, 100,
500, 1000 µM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 1 µg/mL de aprotinina
foram depositados em membranas de policarbonato (diâmetro de 25 mm e com
poros de 0,44 µm; Millipore) previamente esterilizadas (AL-FATTANI &
DOUGLAS, 2004). Para a formação do biofilme, estas membranas foram
mantidas em placa de Petri contendo BHI por 72 h à 37
o
C. Após o
crescimento, as membranas foram lavadas com salina para remoção das
células não aderidas e posteriormente transferidas para tubos estéreis onde
foram submetidas à agitação em vórtex por 20 segundos. Alíquotas de 100 µl
foram semeadas em placa de Petri contendo BHI e mantidas por 24 h à 37
o
C.
As membranas também foram preparadas para serem analisadas por
microscopia eletrônica de varredura.
4.19 Microscopia eletrônica de varredura
Após a remoção das células não aderidas através de uma
lavagem suave com solução salina, as membranas com os biofilmes aderidos
foram fixadas com uma solução de glutaraldeído 2,5% contendo 3,7% de
sacarose por 1 hora a temperatura ambiente. As membranas foram então
lavadas com PBS, pH 7,2 e posteriormente pós-fixadas com tetróxido de ósmio
1% em uma solução tampão de cacodilato 0,1 M contendo 0,8% de
ferrocianeto de potássio e cloreto de cálcio 5 mM por 30 minutos a temperatura
83
ambiente. As amostras foram desidratadas em etanol, secas no ponto crítico
com CO
2,
e por fim, cobertas com ouro. As imagens foram analisadas e obtidas
em microscópio eletrônico de varredura JEOL-JSM-5310 através da emissão
de elétrons secundários.
4.20 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicada e os
resultados foram expressos através da média ± desvio padrão. Os resultados
foram analisados através dos Programas estatísticos SPSS 11.0 e EPI-INFO
6.04, tendo sempre como valor significante p<0,05.
84
5. Resultados
5. Resultados5. Resultados
5. Resultados
5.1 Colonização de espécies de Candida isoladas de sítios sub-gengivais
de crianças infectadas pelo HIV
PORTELA e colaboradores (2004) (ANEXO 1) identificaram a
presença de espécies de Candida no sulco gengival em 40,4% de crianças
infectadas pelo HIV, enquanto que no grupo de pacientes sem evidências
clínicas de imunossupressão (HIV-) este valor foi de 7, 14% (p<0,001). Neste
estudo, também foi observado a presença de eritema linear gengival em seis
pacientes infectados pelo HIV, e nessas lesões orais foram isoladas espécies
de Candida (Tabela 1) que tiveram o seu perfil proteolítico determinado através
de SDS-PAGE, tendo a gelatina como substrato.
85
Tabela 1 – Identificação das espécies de Candida isoladas de lesões orais de
eritema linear gengival através de testes bioquímicos e análise morfológica. A
condição sistêmica de cada paciente portador da lesão (Classificação da
infecção pelo HIV, cargal viral e percentual de células CD4) foi obtida através
da consulta aos prontuários médicos das respectivas crianças.
Identificação
dos
Pacientes
Idade
(anos)/Sexo
Classificação
da Infecção
pelo HIV
(CDC)
Carga
Viral
(cópias/ml)
CD4
(%)
Leveduras
isoladas/código
A 12/feminino C3 170,000 1 C. albicans/(a)
B 4/masculino C3 66,000 3 C. albicans/ (b)
C 10/masculino
C3 110,000 12 C. albicans/ (c
1
)
C. tropicalis/ (c
2
)
D 7/masculino B3 37,000 18,5
C. albicans/ (d)
E 8/feminino C2 280,000 27 C. dubliniensis/
(e)
F 5/masculino C3 900 35 C. albicans/ (f)
5.2 Secreção de serina protease por espécies de Candida e degradação
de componentes do soro e da matriz extracelular
No presente estudo, investigamos se espécies de C. albicans e
Candida não-albicans, isoladas de outros sítios da cavidade bucal seriam
capazes de secretar enzimas proteolíticas da classe serina protease. Para tal,
os isolados citados na Tabela 1 foram crescidos em BHI por 48 horas e após
este tempo os sobrenandantes de cultivo foram concentrados 30 vezes e o
perfil proteolítico identificado através de SDS-PAGE (Figura 8). O sobrenadante
de cultivo de todos os sete isolados apresentaram atividades majoritárias com
86
peso molecular aparente variando de 52 a 62 kDa. No entanto, discretas
diferenças qualitativas e quantitativas foram observadas nos perfis proteolíticos
dentro da mesma espécie (Figura 8). No isolado de C. albicans do paciente a,
foram detectadas quatro bandas com atividades proteolíticas de 52, 56, 61 e
104 kDa, enquanto que nos outros isolados desta mesma espécie dos
pacientes b, c, d e f foram detectados proteases com 61; 62 e 52; 62; 62 e 40
kDa, respectivamente. Todas as atividades proteolíticas foram totalmente
inibidas na presença de 10 mM PMSF, um inibidor de serina protease.
Figura 8 – SDS-PAGE 10%, contendo gelatina como substrato, mostrando os
diferentes perfis proteolíticos observados em espécies de Candida isoladas de
lesões de eritema linear gengival da cavidade oral de crianças infectadas pelo
HIV quando cultivadas em meio BHI, por 48 horas a 37
o
C. Os géis contendo
sobrenadantes concentrados (30 vezes), correspondendo a 1,7 x 10
8
células/mL, foram incubados por 48 horas em 0,5 M de tampão fosfato, pH 5,5
a 37
o
C. Coloração dos géis com 0,2% de “Coomassie Brilliant Blue” R-250.
87
As outras duas espécies de Candida identificadas, como C.
tropicalis e C. dubliniensis, também foram capazes de secretar esta mesma
classe de protease identificada na espécie de C. albicans. O isolado de C.
tropicalis apresentou uma atividade proteolítica de 44 kDa que não foi
observada em nenhuma das outras espécies identificadas.
Uma correlação positiva foi observada entre o perfil proteolítico e
os dados médicos de cada paciente. No paciente A, que apresentava a
condição sistêmica mais grave (percentual de CD4=1% e elevada carga viral),
também foi observado o perfil proteolítico mais complexo de todos os isolados
identificados.
Com o objetivo de avaliar uma possível função para serina
protease detectada no sobrenadante de cultivo de diferentes espécies de
Candida, além da C. albicans, foi analisada a capacidade de clivar proteínas
importantes para o hospedeiro, como a fibronectina, laminina, IgG, soro
albumina humana e soro albumina bovina. A análise eletroforética em SDS-
PAGE do sobrenadante concentrado de todos os isolados de Candida
evidenciou atividade proteolítica quando estas proteínas foram utilizadas como
substrato (Tabela 2). Com a finalidade de avaliarmos a atividade proteolítica
secretada por C. albicans frente a outros inibidores proteolíticos, o
sobrenadante concentrado foi incubado com BSA na presença e ausência de
inibidores proteolíticos (10 µM pepstatina A, 10 µM E-64, 10 mM PMSF e 10
mM 1,10-fenantrolina). O PMSF, inibidor de serina protease, foi capaz de inibir
completamente a clivagem do BSA. No entanto, discreta inibição foi observada
no sistema contendo fenantrolina (Figura 9).
88
Tabela 2 – Clivagem proteolítica de proteínas do soro e de componentes da
matriz extracelular pelo sobrenadante de cultivo de Candida spp. isoladas de
lesões de eritema linear gengival de crianças infectadas pelo HIV (±, moderada
clivagem; +, intensa clivagem; A, substrato; B, substrato e sobrenadante).
Substrates Yeast Isolate/Code
BSA HSA IgG FN LAM
C. albicans / (a) + + +
± ±
C. albicans / (b) + + +
±
+
C. albicans / (c
1
) + + +
±
+
C. tropicalis / (c
2
) + + + + +
C. albicans / (d) + + + +
±
C. dubliniensis / (e) + + + + +
C. albicans / (f) + + +
± ±
Leveduras isoladas/código
Substratos
89
Figura 9 - Clivagem de BSA pelo sobrenadante de cultivo de C. albicans após
crescimento em meio de cultura BHI por 48 horas a 37
0
C sob agitação. O
sobrenadante de cultivo obtido foi misturado com BSA e adicionado tampão
fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5. Estas misturas foram incubadas por 5 horas a
37
0
C, na ausência (b) ou presença dos seguintes inibidores proteolíticos: 1,10-
fenentrolina 10 mM (c), E-64 10 µM (d), PMSF 10 mM (e) e pepstatina A 10 µM
(f).
Para excluirmos a participação de enzimas proteolíticas de
origem citoplasmática nos ensaios com os sobrenadantes de cultivo,
realizamos a dosagem da lactato desidrogenase, uma enzima citoplasmática
detectada em meio extracelular quando ocorre lise celular. A dosagem da
atividade da enzima lactato desidrogenase no sobrenadante de cultivo não
demonstrou nenhuma atividade (Figura 10). Este resultado elimina a
possibilidade da existência de proteases citoplasmáticas no sobrenadante
como, por exemplo, a Kex 2 que trata-se de uma serina proteases presente no
citoplasma de espécies de Candida. Foi utilizado um extrato celular de Candida
albicans como um controle positivo para a presença da enzima lactato
desidrogenase.
90
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Candida lisada
sobrenadante BHI
(48 hs de
crescimento)
sobrenadante
concentrado BHI
(48 hs de
crescimento)
Figura 10 – Dosagem da atividade da lactato desidrogenase no sobrenadante,
sobrenadante concentrado 30 vezes e extrato celular de C. albicans crescida
em meio de cultura BHI por 48 horas a 37
o
C sob agitação. A atividade foi
mensurada através da oxidação do NADH a NAD em espectofotômetro a 340
nm.
Para investigar a capacidade destas leveduras isoladas de lesões
orais de crianças infectadas pelo HIV de secretarem também aspártico
protease, um isolado de C. albicans (Paciente 1) foi crescido em meio de
cultura YCB suplementado com 1% de BSA, pH 4,5, por 5 dias a 37
o
C sob
agitação. A detecção desta classe de protease foi realizada através da
utilização de anticorpos anti-Sap 1-3, anti-Sap 5 e 6 (Figura 11). O
sobrenadante de cultivo em BHI também foi analisado com o objetivo de
validarmos os resultados anteriores que demonstraram a secreção de serina
protease. Os resultados requerentes ao sobrenadante em BHI demonstraram
ausência de reconhecimento de polipeptídeos referentes às Saps.
91
A B C
1 2 1 2 1 2
43 kDa
4
1
kDa
Figura 11 – Análise por “Western blotting” de aspártico-protease no
sobrenadante de cultivo de C. albicans. O sobrenadante de cultivo de YCB +
1% de BSA (2) e BHI (1) foram analisados através de SDS-PAGE e
posteriormente transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As
membranas foram sequencialmente incubadas na presença de anticorpos
policlonais anti-Sap 1-3 (A), anti-Sap 6 (B) and anti-Sap 8 (C) na diluição de
1:1000, anticorpo anti-IgG de ovelha anti-coelho na diluição de 1:2500 e
posteriormente reveladas com reagentes ECL para quimiluminescência. Massa
molecular dos polipeptídeos está expressas em kDa.
5.3 Associação entre a secreção de serina protease e a adesão a células
epiteliais (Ma 104)
Com o objetivo ainda de aferir possíveis funções da serina
protease secretada para o sobrenadante de cultivo de C. albicans quando
crescida em BHI, foi realizada interação celular entre as leveduras tratadas
com diferentes concentrações de PMSF (inibidor de serina protease) e células
epiteliais Ma 104. A interação com células hospedeiras revelou que o
tratamento com PMSF inibiu os índices de adesão de forma dose dependente,
atingindo até 80% de redução nas maiores concentrações do PMSF (Figura
12).
92
Durante a interação de C. albicans com Ma 104, observou-se que
as leveduras não tratadas com o inibidor de protease diferenciaram-se para
tubo germinativo (Figura 13). No entanto, no ensaio onde as leveduras tratadas
com PMSF a partir da concentração de 100 µM, não foi mais observado a
presença de tubos germinativos.
Figura 12 – Efeito do inibidor de serina-peptidae (PMSF) em diferentes
concentrações na adesão celular entre leveduras de C. albicans e células
epiteliais Ma 104. As leveduras, após crescimento em meio BHI por 48 horas a
37
o
C, foram previamente incubadas com o inibidor de serina protease, em
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5, durante 1 hora. Depois deste tempo as
leveduras foram lavadas 2 vezes em PBS e 1 vez em meio DEMEN, e
colocadas para interagir com Ma 104 na proporção de 10:1 (leveduras:célula
epitelial) por 1 hora e 30 minutos a 37
o
C. Após este período, o material foi
lavado, fixado e submetido à coloração para posterior observação em
microscópio óptico. Os índices de adesão foram calculados como descrito em
Materiais e Métodos. Os valores representam as médias±desvio padrão de três
experimentos diferentes realizados em triplicada.
Índice de adesão
93
Figura 13 – Efeito do PMSF na interação celular entre leveduras de C. albicans
isolada de criança infectada pelo HIV e células epiteliais Ma 104. As leveduras
de C. albicans foram previamente incubadas com o inibidor, em tampão fosfato
de sódio 50 mM, pH 5,5, durante 1 hora. Depois deste tempo os conídios foram
lavados 2 vezes em PBS e 1 vez em meio DEMEN e colocados para interagir
com Ma 104 na proporção de 10:1 (levedura:célula epitelial), por 1 hora e 30
minutos a 37
o
C. Após este período, o material foi lavado, fixado e submetido a
coloração para posterior análise em microscópio óptico. Controle (- PMSF) sem
adição do inibidor. A partir da concentração de 100 µM de PMSF (+ 100 µM
PMSF) houve uma intensa inibição na formação de tubo germinativo.
Foi analisado o perfil de proteínas totais e de proteases
associadas à célula de C. albicans tratadas com diferentes concentrações de
PMSF. Não foi observada nenhuma alteração na expressão de proteínas
associadas à célula. No entanto, em relação ao perfil de proteases associadas
à célula, foi observada inibição da atividade proteolítica a partir da
94
concentração de 0,1 µM, sendo a atividade totalmente abolida na concentração
de 100 µM (Figura 14).
Figura 14 – SDS-PAGE mostrando o perfil de proteínas (A) e proteases (B)
associadas à célula de C. albicans na ausência (0) e com o tratamento por 1
hora com PMSF em diferentes concentrações (0,1; 1; 5; 10; 50; 500; 1000 µM).
A
B
95
As proteínas de superfície de Candida albicans possuem uma
importância fundamental no processo de interação fungo-hospedeiro. Foi
analisado também, o perfil protéico de células tratadas com biotina e
posteriormente analisadas por “Western Blotting”. Como descrito em Materiais
e Métodos, as leveduras de C. albicans foram submetidas à marcação com
biotina e posteriormente incubadas com PMSF nas concentrações de 1, 10, 50,
100, 500 e 1000 µM, em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5 por 1 hora.
Depois, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e foi obtido o extrato
celular. A análise do perfil de proteínas celulares biotiniladas demonstrou haver
uma modulação das proteínas de superfície da célula fúngica quando
comparado com as células controle. Observamos que o tratamento com PMSF
a 1, 10 e 50 µM ocasionou uma pequena alteração na expressão de proteínas,
principalmente proteínas com massa molecular acima de 70 kDa. Já nas
células tratadas com PMSF nas concentrações de 100, 500 e 1000 µM, foi
observado modificações nas proteínas com massa molecular abaixo de 40 kDa
(Figura 15).
A análise do sobrenadante deste tratamento revelou um perfil
protéico inverso ao encontrado no extrato de proteínas de superfície da célula
fúngica.
96
Figura 15 – “Western Blotting” mostrando o perfil de proteínas totais biotiniladas
associadas à célula após o tratamento com PMSF por 1 hora em diferentes
concentrações (A – controle; B – PMSF 1 µM; C – PMSF 10 µM; D – PMSF 50
µM; E – PMSF 100 µM; F – PMSF 500 µM; G – PMSF 1000 µM).
5.4 Efeito de inibidores de serina protease e a formação de biofilme por C.
albicans
As cepas de C. albicans ao colonizar tecidos do hospedeiro
possuem a capacidade de formar biofilme, que por sua vez está envolvido na
patogênese da infecção causada por este fungo. Assim, foi também nosso
objetivo observar a influência do PMSF e aprotinina – inibidores de serina-
protease durante a formação de biofilme. Experimentos prévios mostraram que
as concentrações que apresentaram efeitos mais significativos nas variáveis
analisadas até então foram a de 100, 500 e 1000 µM de PMSF. Portanto, todos
os experimentos envolvendo a formação de biofilme foram realizados com
estas concentrações.
97
A metodologia escolhida para induzir a formação de biofilme
sobre uma membrana de policarbonato mostrou-se muito eficiente em todos os
sistemas analisados (Figura 16).
Figura 16 – Aspecto macroscópico dos biofilmes de C. albicans crescidos sobre
membranas de policarbonato mantidas sobre meio de cultura BHI sólido. Cada
sistema era formado de uma suspensão celular com 10
5
leveduras/mL e
inibidores de serina-protease (PMSF e aprotinina) e foram aplicados sobre as
membranas previamente esterilizadas. As placas de Petri foram incubadas por
72 horas a 37
o
C.
Os biofilmes artificiais foram induzidos na ausência (sistema
controle) e presença dos inibidores proteolíticos. Previamente à remoção das
células formadoras do biofilme aderido, as membranas foram cuidadosamente
mantidas em solução salina para remoção das leveduras não-aderidas.
Alíquotas dessas suspensões contendo células não aderidas foram semeadas
em meio de cultura BHI sólido para verificar a influência dos inibidores e de
suas concentrações na formação de um biofilme fortemente aderido. Na Figura
17, podemos observar que os dois inibidores de serina proteases empregados
induziram modificações no perfil de adesão das leveduras formadoras dos
98
biofilmes nos diferentes sistemas. Isso foi revelado ao observar um elevado
crescimento celular avaliado pelo número de unidades formadoras de colônias
(UFC) preferencialmente nos sistemas onde o biofilme foi induzido na presença
do PMSF nas diferentes concentrações. Estes resultados foram corroborados
pelas análises das membranas através de microscopia eletrônica de varredura,
onde observamos um reduzido biofilme nos sistemas com PMSF quando
comparado com o controle.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Relative Growth (% )
Control
PM SF 100
PM SF 500
PM SF 1000
A protinin
Figura 17 – Crescimento relativo das leveduras não aderidas nos diferentes
biofilmes. Alíquotas das suspensões contendo as células não-aderidas foram
inoculadas em meio BHI sólido. Todos os sistemas com inibidores proteolíticos
foram capazes de provocar mudanças no padrão de adesão das leveduras na
formação de biofilmes. Este achado foi mais significante na presença das
diferentes concentrações de PMSF. O sistema controle (barra preta)
demonstrou ser formado por um biofilme de C. albicans mais denso e aderido.
Após a remoção das células não aderidas, as membranas foram
transferidas para tubos contendo 1 mL solução salina estéril para serem
Crescimento relativo (%)
99
agitadas por 20 segundos em vórtex. Posteriormente, alíquotas destas
suspensões foram semeadas em placas de Petri contendo meio de cultura BHI.
De acordo com a contagem das UFC, foi possível verificar que o biofilme do
sistema controle apresentava mais células aderidas quando comparado com os
outros biofilmes induzidos na presença de inibidores de serina protease (Figura
18). Este achado pôde ser confirmado pela análise destas membranas ao
microscópio eletrônico de varredura. A metodologia utilizada na preparação das
amostras para a microscopia eletrônica tem como característica a não
preservação da matriz do biofilme. O biofilme controle de C. albicans, induzido
na ausência de qualquer tipo de inibidor proteolítico, mostrou uma alta
densidade celular (Figura 19). Este padrão de biofilme não foi observado nos
demais sistemas (Figuras 20, 21, 22 e 23). Além disso, uma acentuada
redução do número de células presentes no biofilme foi observada
principalmente quando concentrações mais altas de PMSF foram empregadas
(Figura 22).
100
0
20
40
60
80
100
120
140
CFU
Control
PM SF 100
PM SF 500
PM SF 1000
A protinin
Figura 18 – Crescimento das leveduras aderidas às membranas formadoras
dos biofilmes extraídas através de agitação em vórtex por 20 segundos.
Alíquotas de cada sistema foram inoculados em placa de Petri contendo meio
BHI. A contagem das UFC correspondentes ao biofilme controle (barra preta)
demonstrou ser esse um biofilme mais aderido e denso formado por Candida
albicans, o que foi confirmado pela dificuldade na remoção das leveduras da
membrana de policarbonato.
101
Figura 19 – Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C.
albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre
membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM;
Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37
o
C. Os
procedimentos utilizados durante a preparação das amostras permitiram a
visualização das leveduras formadoras do biofilme. No entanto, não foi possível
a preservação da matriz presente no biofilme (A e B). Nas imagens C e D pode
ser observada a alta densidade celular.
102
Figura 20 - Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C.
albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre
membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM;
Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37
o
C na presença de
100 µM de PMSF. As imagens A, B e C mostram a baixa densidade de
leveduras. Na imagem C pode ser observada a presença de “ilhas” de células
fúngicas. Nessas ilhas, as leveduras parecem, contudo, semelhantes às do
biofilme controle (D).
103
Figura 21 - Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C.
albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre
membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM;
Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37
o
C na presença de
500 µM de PMSF. As imagens A e B mostram também a presença das “ilhas”
de leveduras. Apesar da presença destas “ilhas”, a densidade de células
fúngicas no restante da membrana de policarbonato é muito baixa (C e D).
104
Figura 22 - Microscopia eletrônica de varredura da formação do biofilme de C.
albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre
membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM;
Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37
o
C na presença de
1000 µM de PMSF. Em todas as imagens é possível observar a ausência de
“ilhas” de células e a densidade de leveduras na membrana de policarbonato
foi a mais baixa encontrada.
105
Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura da formação do biofilme de C.
albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre
membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM;
Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37
o
C na presença de 2
µg/mL de aprotinina. O tratamento com este inibidor de serina protease causou
uma redução significante na densidade de células fúngicas em toda membrana
de policarbonato (A e D), mas as “ilhas” formadas por leveduras ainda estão
presentes (B e C).
106
5.5 Comparação entre os perfis de proteínas de superfície de Candida
albicans isolada de criança infectada pelo HIV e criança sem evidências
clínicas de imunossupressão com relação ao reconhecimento de
proteínas de matriz extracelular
Com o objetivo de verificar a influência da infecção pelo HIV na
capacidade adesiva de C. albicans às proteínas de matriz extracelular e
identificar as proteínas responsáveis por estas ligações, foi empregado um
isolado da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV, um isolado da
cavidade bucal de criança sem evidências clínicas de imunossupressão e um
isolado ATCC. As proteínas utilizadas nestes experimentos foram a fibronectina
(HFN), laminina e colágeno tipo IV. A fim de facilitar a comparação entre os
isolados e observar as diferenças entre eles, os resultados foram agrupados de
acordo com a proteína de matriz utilizada.
5.5.1 Fibronectina
Dados na literatura já mostraram que isolados de C. albicans
apresentam afinidade de ligação à fibronectina (HFN), assim como a
caracterização das proteínas adesinas responsáveis por este reconhecimento.
No entanto, com relação a possível influência da infecção pelo HIV no aumento
deste reconhecimento, pouco se tem descrito. Portanto, nossos ensaios iniciais
foram analisar através de citometria de fluxo as leveduras previamente
incubadas com fibronectina e posteriormente com anticorpos monoclonais anti-
HFN. Os resultados demonstraram que todos os isolados testados foram
capazes de se ligarem a fibronectina. No entanto, o isolado oriundo de criança
107
infectada pelo HIV apresentou um índice de ligação significantemente maior
(Figuras 24 e 25).
Figura 24 – Análise por citometria de fluxo da ligação de C. albicans à
fibronectina solúvel. As leveduras foram sequencialmente incubadas na
presença de HFN, anticorpo monoclonal anti-HFN e anticorpos marcados com
FITC (painéis do lado direito). Dez mil células de cada isolado foram analisadas
através de citometria de fluxo. Células controle (Ct), que não foram incubadas
com HFN, estão expostas nos painéis do lado esquerdo.
108
Figura 25 – Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença
de HFN, anticorpo monoclonal anti-HFN e anticorpos marcados com FITC e
analise através de citometria de fluxo.
Figura 26 - Detecção de proteínas ligantes à fibronectina de C. albicans
separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue (A) e transferidas
para membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de
fibronectina, anticorpos anti-fibronectina e anticorpos conjugados com
peroxidase. Os polipeptídios que reagiram com fibronectina foram detectados
no extrato total protéico em cada isolado (B).
Intensidade de fluores
cência (%)
109
Após a obtenção do extrato protéico de cada isolado de C.
albicans através da lise celular com auxílio de pérolas de vidro, as proteínas
foram separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue ou
transferidas para membrana de nitrocelulose para incubação com uma solução
de fibronectina e anticorpos monoclonais para HFN. Na Figura 26 pode ser
observado os polipeptídeos ligantes à fibronectina que são mais expressos no
isolado de C. albicans HIV+.
5.5.2 Laminina
Apesar de não ser observada a mesma intensidade de ligação à
fibronectina, C. albicans isolada da cavidade oral de criança infectada pelo HIV
também apresentou um maior número de proteínas ligantes à laminina que os
demais isolados. No entanto, todas as cepas apresentaram ligação significativa
a esta proteína de matriz extracelular (Figuras 27 e 28).
A detecção das proteínas responsáveis por este reconhecimento
revelou uma semelhança muito grande entre a expressão dos isolados HIV+ e
HIV-. O isolado ATCC apresentou a menor expressão de proteínas ligantes à
laminina (Figura 29).
110
Figura 27 – Análise por citometria de fluxo da ligação de C. albicans à laminina
solúvel (LAM). As leveduras foram sequencialmente incubadas na presença de
HFN, anticorpo monoclonal anti-LAM e anticorpos marcados com FITC (painéis
do lado direito). Dez mil células de cada isolado foram analisadas através de
citometria de fluxo. Células controle (Ct), que não foram incubadas com LAM,
estão expostas nos painéis do lado esquerdo.
111
Figura 28 - Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença
de LAM, anticorpo monoclonal anti-LAM e anticorpos marcados com FITC e
analise através de citometria de fluxo.
Figura 29 - Detecção de proteínas ligantes à laminina de C. albicans separadas
por SDS-PAGE e coradas com Coomassie Blue (A) e transferidas para
membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de laminina,
anticorpos anti-laminina e anticorpos conjugados com peroxidase. Os
polipeptídios que reagiram com laminina foram detectados no extrato total
protéico em cada isolado (B).
Intensidade de fluorescência (%)
112
5.5.3 Colágeno Tipo IV
De todas as proteínas de matriz extracelular analisadas, o
colágeno tipo IV foi a que apresentou a maior semelhança de ligação entre os
três isolados (HIV+, HIV- e ATCC), por isso não apresentando diferença
estatisticamente significante. Embora a infecção pelo HIV não tenha
influenciado no reconhecimento deste isolado de C. albicans a esta proteína de
matriz, os isolados clínicos (HIV+ e HIV-) mostraram expressar mais adesinas
do que a ATCC (Figuras 30 e 31).
Assim como o observado na citometria de fluxo, a análise das
membranas de nitrocelulose com os polipeptídeos responsáveis pela ligação
ao colágeno tipo IV revelou uma semelhança entre as cepas isoladas de
criança infectada pelo HIV e criança sem evidências clínicas de
imunossupressão (isolados clínicos). A cepa ATCC demonstrou reduzida
expressão de proteínas ligantes quando comparado com os demais (Figura
32).
113
Figura 30 – Análise através de citometria de fluxo da ligação de C. albicans ao
colágeno tipo IV solúvel (COL IV). As leveduras foram sequencialmente
incubadas na presença de COL IV, anticorpo monoclonal anti-COL IV e
anticorpos marcados com FITC (painéis do lado direito). Dez mil células de
cada isolado foram analisadas através de citometria de fluxo. Células controle
(Ct), que não foram incubadas com COL IV, estão expostas nos painéis do lado
esquerdo.
114
Figura 31 – Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença
de COL IV, anticorpo monoclonal anti-COL IV e anticorpos marcados com FITC
e analise através de citometria de fluxo.
Figura 32 - Detecção de proteínas ligantes ao colágeno tipo IV de C. albicans
separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue (A) e transferidas
para membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de COL
IV, anticorpos anti-COL IV e anticorpos conjugados com peroxidase. Os
polipeptídios que reagiram com colágeno foram detectados no extrato total
protéico em cada isolado (B).
Intensidade de fluorescência (%)
115
5.6 Avaliação do efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de
protease do HIV no crescimento, diferenciação celular e adesão a células
epiteliais (Ma 104) de Candida albicans isolada de criança infectada pelo
HIV.
Estudos na literatura têm demonstrado uma grande influência de
drogas anti-retrovirais da classe inibidores de protease do HIV no crescimento
e em fatores de virulência de espécies de Candida. Autores têm atribuído este
achado ao fato destas drogas serem inibidores de aspártico-protease, que
coincidentemente trata-se da mesma classe de protease secretada e
responsável, em grande parte, pela patogenicidade destes fungos. No entanto,
o presente estudo buscou investigar a influência destes inibidores em C.
albicans crescida em BHI, onde há a indução de secreção de serina protease.
Em determinados fungos que secretam esta classe de protease como sendo a
majoritária durante a infecção, estas drogas mostraram-se como opções
antifúngicas.
5.6.1 Avaliação do efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de
protease do HIV no crescimento de Candida albicans isolada de criança
infectada pelo HIV
A avaliação do efeito de diferentes inibidores de aspártico
protease do HIV (indinavir, saquinavir, nelfinavir e ritonavir) sobre o
crescimento de C. albicans crescida BHI por 48 horas à 37
o
C demonstrou que
todas as drogas apresentaram efeito fungistático (sem significância estatística),
com exceção do Saquinavir o qual, a partir da concentração de 200µM, foi
116
observado morte celular. O tempo necessário para se atingir o maior efeito na
inibição do crescimento, assim como a melhor concentração foi de 24 horas
para o Ritonavir 100µM, 24 horas para o Indinavir 200µM, 24 horas para o
Saquinavir 150µM e 48 horas para o Nelfinavir 250µM, respectivamente (Figura
33).
Como descrito em Materiais e Métodos estes experimentos foram
realizados após o crescimento do isolado de C. albicans (HIV+) em meio de
cultura BHI líquido por 48 horas à 37
o
C, onde 1x10
8
leveduras/mL foram
incubadas por 72 horas em meio BHI na ausência (controle positivo) e na
presença dos inibidores de protease Ritonavir, Indinavir, Saquinavir e Nelfinavir
em diferentes concentrações (100µM; 200µM; 250µM). O monitoramento do
crescimento foi realizado através de contagem em câmara de Neubauer a cada
24 horas.
Após análise dos resultados e estipulado o tempo necessário
para se atingir o maior efeito no crescimento e a melhor concentração de cada
droga, este experimento foi repetido utilizando-se UFC com tais valores (Figura
34).
117
Figura 33 – Influência de diferentes inibidores de aspártico protease do HIV
sobre o crescimento de leveduras de C. albicans. Após o crescimento em meio
BHI por 48 horas à 37
o
C, 1 x 10
8
células/mL de C. albicans foram incubadas
com drogas anti-retrovirais em diferentes concentrações por 72 horas. A cada
24 horas foi realizada contagem do número de células viáveis (azul de Tripan)
e calculado o percentual de crescimento celular em relação ao controle. Todos
os experimentos foram realizados em triplicada e os valores representam as
médias.
118
0
20
40
60
80
100
120
Antiretroviral drugs
Percentual of growth (CFU)
(% )
Control
Ritonavir 100
Indinavir 200
Saquinavir 150
Nelfinavir 250
Figura 34 – Influência de diferentes inibidores de aspártico protease do HIV
sobre o crescimento de C. albicans. Após o crescimento em meio BHI por 48
horas à 37
o
C, 1 x 10
8
células/mL de C. albicans foram incubadas com drogas
anti-retrovirais em concentrações previamente determinadas por 24 horas.
Após esse tempo os sistemas foram repicados para o meio BHI sólido e
mantido à 37
o
C por 24 horas quando foram contadas as UFC. Os valores
representam as médias de três experimentos diferentes realizados em
triplicada.
Na figura 34 pode ser observado que apenas o Saquinavir
apresentou um efeito promissor com um percentual de inibição celular de
70,3%. A partir destes resultados, foram realizados experimentos com a
finalidade de evidenciar possíveis alvos desta droga (Saquinavir 150 µM),
assim como efeitos sobre determinados fatores de virulência de C. albicans
(formação de tubo germinativo e adesão a células epiteliais).
Percentual de crescimento
–
UFC
(%)
Medicamentos anti-retrovirais
119
5.6.2 Avaliação do efeito do tratamento com Saquinavir na interação
Candida albicans X célula epitelial (Ma 104) e indução de tubo germinativo
Após determinar a melhor droga com capacidade de inibição do
crescimento, assim como a melhor concentração, realizou-se interação celular
entre as leveduras previamente tratadas e células epiteliais Ma 104. Além da
concentração de 150 µM de Saquinavir, os experimentos também foram
realizados com 100 µM já que a diferença de crescimento entre essas duas
concentrações foi muito elevada.
Os ensaios de adesão foram realizados após as leveduras terem
sido incubadas por 24 horas na ausência (controle) e com Saquinavir 100 e
150 µM, e após esse tempo foram lavadas duas vezes com solução de PBS.
Assim como observado no crescimento celular, a diferença de adesão entre as
duas concentrações mostrou-se estatisticamente significante. No entanto, na
menor concentração utilizada foi observada uma redução da adesão de
aproximadamente 50% em relação ao controle (Figura 35), o que não foi
verificado no crescimento celular entre esses dois sistemas (Figura 34).
120
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Control Saquinavir 100 Saquinavir 150
Adhesion index
Figura 35 – Efeito do tratamento com Saquinavir na interação celular entre
leveduras de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV e células
epiteliais Ma 104. As leveduras foram previamente incubadas com o inibidor de
aspártico protease do HIV, em meio BHI, durante 24 horas. Depois desse
tempo as leveduras foram lavadas três vezes em PBS e uma vez em meio
DEMEN, e colocados para interagir com Ma 104 na proporção de 10:1
(leveduras:célula epitelial) por uma hora e trinta minutos a 37
o
C. Após esse
período, o material foi lavado, fixado e submetido à coloração para posterior
observação em microscópio óptico. Os valores representam as médias±desvio
padrão de três experimentos diferentes, realizados em triplicada.
Com relação à indução de tubo germinativo em C. albicans
tratadas com Saquinavir, observou-se que a concentração de 100 µM da droga
foi capaz de reduzir em 47% a formação de tubo germinativo. A concentração
de 150 µM se mostrou a mais eficiente com relação à inibição do crescimento
celular (Figura 34) e adesão a células epiteliais (Figura 35). No entanto,
apresentou apenas 14% de redução na diferenciação celular de C. albicans
isolada de criança infectada pelo HIV (Figura 36).
Índice de adesão
121
Candida albicans
Germ tube (%)
0
20
40
60
80
100
Control Saquinavir 100 µ
µµ
µM Saquinavir 150 µ
µµ
µM
Figura 36 - Efeito do tratamento com Saquinavir na indução da diferenciação
celular em C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV. As leveduras
foram previamente incubadas com o inibidor de aspártico protease do HIV, em
meio BHI, durante 24 horas. Depois desse tempo as leveduras foram lavadas
três vezes em PBS e colocadas para indução de tubo germinativo na presença
de soro fetal bovino por três horas a 37
o
C. Após esse período, o material foi
lavado, fixado e submetido à leitura em câmara de Neubauer. Os valores
representam as médias±desvio padrão de três experimentos diferentes,
realizados em triplicada.
Tubo Germinativo (%)
122
5.6.2 Envolvimento das atividades fosfatásicas ácidas de superfície de C.
albicans isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV e de
crianças sem evidências clínicas de imunossupressão no processo de
adesão a células epiteliais (Ma 104)
A atividade de ecto-fosfatases já tem sido associada à virulência
de determinados fungos, inclusive C. parapsilosis. No entanto, na literatura
consultada não foram encontrados estudos sobre esta associação com C.
albicans, muito menos considerando a infecção pelo HIV como fator agravante
desta correlação. Assim foram selecionadas 35 isolados de C. albicans (20
isolados de crianças infectadas pelo HIV e 15 oriundos de crianças sem
evidências clínicas de imunossupressão) e em todos foi avaliado a atividade
fosfatásica. Essa atividade foi constatada através da capacidade de conversão
do substrato 4-metilumberiferil fosfato (4-MUP) a 4-metilumbeliferona (4-MU)
gerando uma fluorescência que foi mensurada por um fluorímetro digital Turner
com um filtro de 360 nm de excitação e um filtro de 450 nm de emissão.
Após uma hora de incubação das leveduras na presença do
substrato fosforilado, a atividade enzimática atingiu 610,27±166,36 e
241,25±78,96 picomoles/h/10
7
leveduras para o grupo HIV positivo e grupo HIV
negativo, respectivamente. Com isso foi verificada uma correlação positiva
entre a atividade ecto-fosfatásica e a infecção pelo HIV (Mann-Whitney,
p=0,089) (Figura 37). A atividade da lactato desidrogenase do sobrenadante de
cultivo não revelou nenhuma atividade. Isso descarta a possibilidade da
hidrólise do 4-MUP ser gerada por fosfatases intracelulares.
123
Figura 37 – Atividade ecto-fosfatásica de isolados de C. albicans. 10
7
leveduras
foram incubadas por uma hora a temperatura ambiente em um meio de reação
contendo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 e 5 mM de 4-MUP. As
atividades enzimáticas foram mensuradas através da hidrólise do substrato
fosforilado (4-MUP) e expressas em picomoles desse substrato hidrolisado a 4-
MU/h/10
7
leveduras. Valores médios de 610,27±166,36 e 241,25±78,96
picomoles 4-MU/h/10
7
leveduras para os isolados de crianças infectadas pelo
HIV e para o grupo HIV negativo, respectivamente (Mann-Whitney, p=0,089).
Devido a forte influência da infecção pelo HIV na atividade
fosfatásica em C. albicans (Figura 37), buscou-se avaliar dentro do grupo de
isolados de crianças HIV positivas se a condição sistêmica de cada paciente
poderia alterar a atividade desta enzima. Assim, correlações foram realizadas
entre a carga viral e percentual de CD4 de cada paciente com a atividade ecto-
fosfatásica. Na Figura 38 podemos observar uma moderada correlação com a
15
20
N =
HIV+ HIV-
3000
2000
1000
0
-1000
26
10
2
Phosphatase activity
Atividade fosfatásica
124
contagem de linfócitos T CD4
+
. No entanto, não foi observada nenhuma
correlação entre a atividade fosfatásica e CD4
+
(Figura 39).
Figura 38 – Correlação entre as atividades ecto-fosfatásicas de C. albicans
isoladas de crianças infectadas pelo HIV com a contagem de linfócitos T CD4
+
(r=-0,014; p=0,952).
50
40
30
20
10
0
3000
2000
1000
0
-1000
Phosphatase activity
Percentual of CD4
Atividade fosfatásica
Percentual de CD4
125
Figura 39 - Correlação entre as atividades ecto-fosfatásicas de C. albicans
isoladas de crianças infectadas pelo HIV com a carga viral (r=-0,508; p=0,022).
A atividade ecto-fosfatásica das leveduras foi ensaiada utilizando-
se diferentes inibidores clássicos de fosfatase. Como foi observado o
ortovanadato, um potente inibidor de fosfatases ácidas, aboliu completamente
a atividade enzimática das leveduras. Outros inibidores de fosfatase ácida
também foram utilizados como, molibdato de sódio, fluoreto de sódio e fosfato
inorgânico (Pi) e o resultado encontrado foi uma forte inibição da atividade
ecto-fosfatásica. A inibição da fosfatase fúngica promovida por molibdato,
fluoreto e Pi foram reversíveis, enquanto que a inibição por ortovanadato foi
revertida parcialmente (Figura 40).
Viral load
4000003000002000001000000
-100000
3000
2000
1000
0
-1000
Phosphatase activity
Ati
vidade fosfatásica
Carga Viral
126
0
20
40
60
80
100
120
None Sodium
orthovanadate
(1mM )
Sodium
molybdate
(1mM )
Sodium
fluoride (1mM )
Pi (10mM )
Inhibitor
Relative phosphatase activity (%)
Figura 40 – Efeito dos inibidores na atividade fosfatásica de leveduras intactas
de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV. As barras pretas
representam a atividade enzimática do fungo pré-tratado com os inibidores por
1 hora antes da incubação com o substrato 4-MUP. As barras brancas mostram
a atividade ecto-fosfatásica relativa quando os inibidores estão presentes
durante a reação com o substrato 4-MUP. O efeito inibitório do molibdato de
sódio, fluoreto de sódio e fosfato inorgânico (Pi) foi reversível, enquanto aquele
gerado pelo ortovanadato de sódio foi irreversível (* p<0,05). Estas médias
percentuais foram obtidas de três experimentos com diferentes suspensões
celulares de isolados de crianças HIV+ e convertidos para percentagem a partir
do controle. No grupo de crianças sem evidências clínicas de
imunossupressão, resultados semelhantes foram observados.
A expressão diferenciada da atividade ecto-fosfatásica nas
células fúngicas dos grupos HIV+ e HIV- proporcionou subsídios para a
realização de novos experimentos a fim de investigar a possível participação
destas ecto-fosfatásicas fúngicas na interação de C. albicans com células
epiteliais. Observou-se, então, que leveduras com elevada atividade enzimática
apresentavam também altos índices de adesão a células do hospedeiro (Ma
*
*
Inibidores
Atividade fosfatásica relativa (%)
127
104). Análises estatísticas mostraram um alto índice de correlação entre a
atividade enzimática e a interação fungo-célula epitelial (r=0,8) (Figura 41).
0
20
40
60
80
100
120
140
Relative phosphatase activity
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Adhesion index
Figura 41 – Correlação entre atividade fosfatásica (- -
- -) índice de adesão (-
-) na interação de Candida albicans isoladas de crianças HIV positivas e HIV
negativas com células epiteliais (r=0,8; p=0,2).
O pré-tratamento das leveduras com o ortovanadato de sódio
também inibiu a adesão das células fúngicas a células epiteliais, o que sugere
o envolvimento de ecto-fosfatases na interação de C. albicans com uma
linhagem de célula epitelial Ma 104 (Figura 42).
Atividade fosfatásica relativa
Índice de adesão
128
Figura 42 – Influência da atividade ecto-fosfatásica na interação de quatro
isolados de C. albicans com células epiteliais. O pré-tratamento das leveduras
com ortovanadato de sódio influenciou negativamente a adesão das células
fúngicas em todos os isolados.
Índice de adesão
Presença do ortovanadato
Ausência do ortovanadato
Isolados de C. albicans
1 2 3 4 1 2 3 4
129
6. Discussão
6. Discussão6. Discussão
6. Discussão
A epidemia de AIDS continua sendo um grande problema de
saúde em todo o mundo. Várias são as manifestações clínicas da infecção,
podendo ser as lesões orais os primeiros sinais e sintomas em crianças
(LEGGOTT, 1992; GREENSPAN & GREENSPAN, 1993; KATZ et al., 1993;
RAMOS-GOMEZ et al., 1999; SANTOS et al., 2001). Elas estão diretamente
relacionadas com o grau de imunossupressão do paciente e são consideradas
importantes indicadores na progressão da infecção (SANTOS et al., 2001). Das
manifestações orais encontradas em crianças soropositivas, a candidíase
(pseudomembranosa, eritematosa e quelite angular) é a lesão mais comum
(LEGGOTT et al., 1992; SANTOS et al., 2001). No entanto, após o uso da
terapia múltipla combinada com inibidores de protease do HIV (HAART), vem
se observando um declínio não só desta manifestação bucal, como também de
todas outras lesões oportunistas observadas nestes pacientes (PATTON et al.,
2000).
A espécie considerada predominante na infecção fúngica da
cavidade bucal em indivíduos imunocomprometidos é a C. albicans, seguida
ainda por outras espécies, como: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C.
lusitaniae e C. parapsilosis (SAMARANAYAKE, 1992; REPENTIGNY,
LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). Em 1995, uma nova espécie de
Candida, com características fenotípicas semelhantes às da C. albicans, foi
descrita e denominada C. dubliniensis (SULLIVAN et al., 1995). Em outras
130
manifestações bucais que não apresentam espécies de Candida como agente
etiológico principal, também tem sido descrito o seu isolamento. Relatos na
literatura têm demonstrado que dentre outros patógenos, mais de 50% dos
pacientes com gengivite associada ao HIV apresentam a C. albicans nos sítios
infeccionados (ZAMBON et al., 1990; LUCHT, HEIMDAHL & NORD, 1991). No
presente estudo, demonstramos que 42,3% das crianças infectadas pelo HIV
atendidas na Faculdade de Odontologia da UFRJ apresentavam cultura
positiva para espécies de Candida e esse isolamento esteve diretamente
relacionado com a baixa contagem de linfócitos T CD4, elevada carga viral e
presença de gengivite (PORTELA et al., 2004).
A segunda parte do presente estudo teve como objetivo atribuir
possíveis funções associadas à virulência de serina protease secretada por
espécies de Candida crescida em meio de cultura BHI. O primeiro relato desta
secreção foi dado por nosso grupo (COSTA et al., 2003). Na presente
pesquisa, utilizou-se amostras de Candida isoladas de lesões orais de eritema
linear gengival presente em crianças infectadas pelo HIV, enquanto que o
estudo de COSTA et al. (2003) avaliou amostras de Candida isoladas da
cavidade bucal saudável de crianças infectadas pelo HIV. O eritema linear
gengival trata-se de uma lesão oral com freqüência de aparecimento que varia
de 1,96% a 22% (BARASCH et al., 2000; FONSECA, CARDOSO &
POMARICO, 2000; PORTELA et al., 2000).
As proteases são enzimas amplamente distribuídas na natureza,
sendo importante fator na patogênese de inúmeras doenças microbianas,
possuindo função relevante na adesão, penetração, nutrição, sobrevivência
131
intracelular, multiplicação e diferenciação celular (HUBE, 2000). Muitas
espécies fúngicas, patogênicas ao homen, secretam proteases in vitro
(RODRIGUES et al., 2003). Assim, de acordo com a metodologia utilizada por
COSTA e colaboradores (2003) foi possível a detecção de serina protease
secretada para o meio extracelular pelas espécies de Candida isoladas de
lesões de eritema linear gengival. Esta classe de protease extracelular já foi
descrita em outros fungos, como Aspergillus fumigatus (LARCHER et al.,
1992), Pseudallescheria boydii (LARCHER et al., 1996), Paracoccidioides
brasiliensis (PUCCIA et al., 1998) e Cryptococcus neoformans (RODRIGUES et
al., 2003). Corroborando os resultados de COSTA et al. (2003) observamos
uma variação no padrão de expressão de proteases, principalmente quanto ao
número de bandas líticas dentre vários isolados da mesma espécie. No
entanto, todas as atividades proteolíticas observadas foram completamente
inibidas na presença de 10 mM PMSF, enquanto que no primeiro estudo de
nosso grupo (COSTA et al., 2003) foi observada também a presença de
metaloproteases secretadas por tais microrganismos. Essa diferença pode
estar relacionada ao fato das amostras serem isoladas de diferentes sítios
dentro da cavidade oral. Corroborando este resultado, JIN et al. (2005)
observaram uma freqüência de 1% de variabilidade fenotípica em biofilme de
C. albicans quando comparado a células planctônicas. Os autores citam que as
diferenças observadas nos diferentes fenótipos de C. albicans estão
relacionadas ao padrão de assimilação de carboidratos, adesão, formação de
biofilme, diferenciação e crescimento celular.
132
Os resultados dos perfis de enzimas proteolíticas de C. albicans
do presente estudo sugerem uma relação positiva entre a intensidade do perfil
proteolítico e condição sistêmica dos pacientes. No paciente a foi observado a
condição sistêmica mais grave e um perfil de proteases mais complexo, apesar
de todos os pacientes apresentarem grave comprometimento sistêmico. Todos
os pacientes estavam em uso da terapia combinada anti-retroviral com inibidor
da aspártico protease do HIV. Adicionalmente, este achado corrobora outros
estudos em que foi constatado que imunodeficiência celular, neutropenia
crônica, cancer e outras situações em foi empregada a terapia
imunossupressiva são fatores que predispõem a mudança do fungo de um
estágio comensal para um patogênico (STERWART et al., 1999; HUBE, 2000).
É importante salientar que McCULLOUGH e colaboradores (1995) identificaram
um isolado de C. albicans geneticamente atípica em pacientes infectados pelo
HIV, a qual secreta índices maiores de proteases extracelulares quando
comparada com os isolados de C. albicans de indivíduos normais. No entanto,
DE BERNARDIS et al. (2004) ao compararem o efeito do HAART (terapia anti-
retroviral com associação de diferentes classes de medicamentos incluindo os
inibidores de protease do HIV) na prevalência, produção de SAP e biotipagem
de isolados de Candida spp. observaram que esta terapia inibe a expressão de
SAP mas não elimina ou seleciona cepas de Candida na cavidade oral.
Vários estudos na literatura já demonstraram a ação hidrolítica da
SAP de C. albicans sobre proteínas importantes do hospedeiro, como albumina
(RÜCHEL et al., 1983), colágeno (KAMINISHI et al., 1986; KAMINISHI et al.,
1988), IgA (RÜCHEL, 1981), IgG (KAMINISHI et al., 1995), queratina (NEGI et
133
al., 1984) e hemoglobina (REMOLD et al., 1968). Assim, avaliamos a
capacidade de degradação de proteínas importantes para o hospedeiro por
serina-protease secretada por espécies de Candida. Nossos resultados
sugerem que serina protease secretada participa no estabelecimento da
infecção por possuírem também a especificidade de degradar proteínas de
matriz extracelular (fibronectina e laminina), proteínas do sistema imunológico
(imunoglobulina G) e do soro (albumina humana e bovina). A atividade desta
classe de protease foi demonstrada em outros fungos como capazes de
degradar componentes do hospedeiro, como Paracoccidioides brasiliensis
(MONTENEGRO et al., 1993) e Cryptococcus neoformans (RODRIGUES et al.,
2003).
Para excluirmos a possibilidade de estarmos evidenciando a
enzima Kex2, uma serina protease intracelular, foi realizado em todos os
sobrenadantes de cultivo a dosagem da lactato desidrogenase que se mostrou
ausente em todos os sistemas. A Kex2 é uma serina protease intracelular
presente em espécies de Candida e responsável pela regulação de fatores de
virulência como a expressão de SAP e formação de hifas (NEWPORT et al.,
2003). Com isso foi possível confirmar tratar-se de proteases secretadas para o
sobrenadante de cultivo e não proteases intracelulares que foram liberadas
devido à lise celular. A análise do genoma de C. albicans demonstra a
presença de genes responsáveis pela codificação de serina proteases
secretadas.
COSTA (2001) sugere que um dos motivos pelos quais não foram
identificadas aspártico proteases secretadas (SAP) nos sobrenadantes de
134
cultivo das cepas de Candida spp. isoladas da cavidade bucal de crianças
infectadas pelo HIV, fato que também não observamos no presente estudo,
esteja relacionado ao meio de cultura utilizado. O meio de cultura BHI (infusão
de cérebro e coração) utilizado neste trabalho não induziu a expressão e
secreção de SAP, em contraste com o que ocorreu nos estudos anteriores
onde as leveduras eram cultivadas em meio suplementado com proteínas
exógenas (BSA 1%) (MacDONALD & ODDS, 1980; RÜCHEL et al., 1982; DE
BERNARDIS et al., 1992; KAMINISHI et al., 1995; OLLERT et al., 1995;
MORSCHHÄUSER et al., 1997). Com o objetivo de avaliarmos a influência do
meio de cultura na expressão de SAP, cultivamos isolados de Candida em YCB
(Yeast carbon base) suplementado com 1% de soro albumina bovina. Nossos
resultados mostraram que todos os isolados de Candida quando cultivadas em
YCB suplementado foram capazes de secretar aspártico proteases. A
avaliação da atividade da aspártico protease foi realizada por “Western blotting”
com utilização de anticorpos anti-SAP.
MORSCHHÄUSER et al (1997), ao investigarem se a secreção
de SAP por C. albicans participaria na invasão destes microrganismos para
tecidos mais profundos através da degradação metabólica de proteínas da
matriz extracelular, concluíram que a enzima secretada por estes fungos seria
um fator importante na penetração através dos tecidos mais profundos
podendo, também, atingir a circulação sanguínea. SCHALLER et al., 2005 em
uma recente revisão da literatura sobre enzimas hidrolíticas de C. albicans
mostraram a presença de 10 genes que codificam diferentes isoenzimas de
aspártico proteases que apresentam uma variedade de funções cruciais na
135
patogênese da candidíase. A expressão destas isoenzimas de SAP está
relacionada ao local da infecção no hospedeiro e as diferentes formas celulares
de Candida. Neste contexto, o presente estudo avaliou a influência do PMSF
no processo de interação de C. albicans com células epiteliais (Ma 104) in vitro.
Previamente a interação celular, as leveduras de C. albicans, crescidas em
meio de cultura BHI, foram tratadas por uma hora com PMSF em diferentes
concentrações. Os resultados demonstraram que nos sistemas onde as
leveduras tinham sido tratadas houve uma forte inibição no processo de
adesão de forma dose-dependente a partir da concentração de 0,1 µM.
Observamos também, que a partir da concentração de 100 µM de PMSF foi
evidenciado uma forte inibição do processo de diferenciação de levedura para
tubo germinativo.
Diante destes resultados de interação, o presente estudo analisou
também as possíveis alterações celulares (perfil protéico e proteases
associada à célula) induzidas pelo tratamento com PMSF. O perfil de proteínas
associadas a célula não mostrou diferenças significativas entre o sistema
controle (leveduras sem o tratamento com PMSF) e os demais sistemas com
concentrações variadas de PMSF. No entanto, um dado importante foi
observado no perfil de proteases associadas a célula onde verificamos uma
inibição, também de forma dose-dependente, sendo a atividade proteolítica
totalmente abolida a partir da concentração de 100 µM. Analisando todas estas
modificações celulares em conjunto e os resultados de inibição da
diferenciação celular e adesão a células epiteliais, sugerimos a proteína Kex2
como um dos alvos do PMSF. NEWPORT e colaboradores (2003)
136
demonstraram que a deleção do gene “kexin” (KEX2) em C. albicans acarretou
mudanças no fenótipo e na virulência devido à alterações na expressão de dois
importantes fatores de virulência, expressão de aspártico protease e formação
de hifas. Concluíram assim que a Kex2 participa diretamente na virulência de
C. albicans.
Dando continuidade as análise das alterações celulares, foi
avaliado o perfil das proteínas de superfície de C. albicans através da
marcação com biotina succnilada antes do tratamento com PMSF. Após o
tratamento, foi obtido o extrato celular de cada sistema, realização de “Western
blotting” e revelação dos polipeptideos marcados com biotina. Os resultados
demonstraram que o tratamento pode estar modulando a expressão das
proteínas de superfície de C. albicans, já que no sistema controle a quantidade
de proteínas marcadas foi significantemente menor que nos sistemas onde
houve o tratamento com as diferentes concentrações de PMSF. A análise do
sobrenadante do tratamento revelou a presença dos peptídeos marcados com
biotina no sistema controle. Já no sistema correspondente ao tratamento com
1000 µM de PMSF não foram identificadas proteínas biotiniladas secretadas. A
família de genes ALS (“agglutinin-like sequence”) de C. albicans codifica um
grupo de proteínas contendo glicosilfosfatidilinositol (GPI) que permanecem
ancoradas na superfície celular e funcionam como adesinas. No genoma de C.
albicans existem pelo menos oito diferentes genes ALS. A expressão destes
genes depende, assim como a expressão de Sap, do local onde será
estabelecido a infecção. As células do epitélio oral e células vasculares
endoteliais induzem a expressão de Als1p e Als3p em C. albicans (Filler, 2006).
137
Os nossos resultados demonstraram que o tratamento com PMSF nas diversas
concentrações induziu à uma modificação do perfil das proteínas de superfície
de C. albicans. Estas alterações podem estar impedindo o reconhecimento dos
sítios de ligação específica para as células epiteliais, justificando assim o baixo
índice de adesão encontrado.
É sabido que além do fenômeno de adesão, espécies de Candida
podem formar biofilmes tornando esses microrganimos menos susceptíveis aos
antifúngicos. Biofilme de C. albicans consiste em uma mistura de leveduras,
hifas e pseudohifas e apresenta uma camada basal de leveduras que ancora
todo este biofilme à superfície (BAILLIE & DOUGLAS, 2000). Foi também um
dos objetivos do presente estudo avaliar a influência de inibidores de serina
protease durante a formação de biofilme por C. albicans. Embora existam
muitos trabalhos na literatura sobre o fenômeno da penetração incompleta de
agentes antimicrobianos através do biofilme de Candida, nenhum destes
estudos investigaram o efeito de inibidores proteolíticos na formação do
biofilme. No presente trabalho avaliamos o papel da serina protease secretada
por C. albicans no processo de desenvolvimento de biofilme, empregando o
PMSF nas concentrações de 100, 500 e 1000 µM e aprotinina 2 µg/mL. A
indução à formação de biofilme foi realizada de acordo com a metodologia
descrita por ALVIANO et al. (2005) modificada. Foi empregado membranas de
policarbonato para análise em microscopia eletrônica de varredura (AL-
FATTANI & DOUGLAS, 2004; SAMARANAYAKE et al., 2005). A análise dos
sistemas onde havia a presença dos inibidores revelou a presença de células
menos aderentes quando comparado com o sistema controle. Esse resultado
138
foi avaliado através da contagem das unidades formadoras de colônias
oriundas das suspensões celulares obtidas após lavagens das membranas
para remoção das células não aderidas. Estes resultados também foram
corroborados pela análise das membranas ao microscópio eletrônico de
varredura.
Diante dos resultados observados a partir da utilização de
inibidores de serina proteases, estudos futuros tornam-se necessários a fim de
se identificar in vivo a participação destas enzimas no processo de infecção por
espécies de Candida.
A candidíase orofaríngea é descrita como a lesão mais comum
em indivíduos infectados pelo HIV, com uma prevalência que pode ultrapassar
90% durante o curso da infecção (TORSSANDER et al., 1987; KORTING et al.,
1988; SAMARANAYAKE & HOLMSTRUP, 1989; SAMARANAYAKE, 1992). Em
crianças soropositivas para o HIV esta prevalência se repete, podendo ainda
ser encontrado quadros mais graves da infecção fúngica por causa da
imaturidade do sistema imunológico (FALLOON et al., 1989; LEGGOT et al.,
1992; GREENSPAN & GREENSPAN, 1993; CHIGURUPATI et al., 1996;
RAMOS-GOMEZ et al., 1999). C. albicans é a espécie encontrada com maior
incidência em lesões de candidíase bucal (POWDERLY, 1992; GREENSPAN &
GREENSPAN, 1993; CHIGURUPATI et al., 1996; RAMOS-GOMEZ et al.,
1999). Ela ocorre como um microrganismo comensal na cavidade bucal dos
indivíduos não causando alterações, entretanto, em pacientes
imunocomprometidos, assume características de patogenicidade alterando a
harmonia com o hospedeiro (ARENDORF & WALKER, 1980). Sabendo-se
139
ainda da importância da parede celular fúngica no processo de infecção, o
presente estudo comparou a expressão de proteínas responsáveis pela ligação
a componentes importantes da matriz extracelular (fibronectina, laminina e
colágeno) entre cepas de C. albicans isoladas da cavidade bucal de criança
infectada pelo HIV, criança sem evidência clínica de imunossupressão e uma
cepa ATCC. GOZALBO et al. (2004) atribuem à parede celular fúngica
importância crucial na patogenicidade de C. albicans por ser responsável pela
proteção física da célula, interação com o hospedeiro incluindo adesão aos
tecidos e modulação da resposta imune, podendo ainda ser considerada como
alvo para a terapia anti-fúngica.
No hospedeiro humano, a interação de células a proteínas de
adesão da matriz extracelular desencadeia sinais que afetam a morfologia,
expressão de genes e a sobrevivência de células aderentes (JOHANSSON et
al., 1997). A fibronectina e laminina são importantes componentes da matriz e
servem de pontes de união entre as células e esta matriz extracelular (TIMPL
et al., 1979; SKERL et al., 1984). Além disso, a fibronectina e laminina são
responsáveis pela adesão de vários microrganismos aos tecidos do
hospedeiro, e particularmente a fibronectina está envolvida no processo de
opsonização de Staphylococcus aureus (PROCTOR et al., 1985) e C. albicans
(CALDERONE & SCHELD, 1987). Pode-se citar ainda que estas proteínas têm
sido associadas a fagocitose via sistema complemento e receptores Fc
(BOHNSACK et al., 1985; BROWN, 1986). BOUCHARA et al. (1990)
identificaram receptores específicos no tubo germinativo de C. albicans para
laminina e isso poderia contribuir para o estabelecimento da candidíase. Mais
140
recentemente, HOSTETTER (1999) observou que proteínas de superfície de C.
albicans e C. tropicalis apresentam “motifs” remanescentes de integrinas e
ressalta, para a importância de uma dessas proteínas, Int1p, na adesão,
morfogênese e virulência destes microrganismos. Apesar de muitos estudos
objetivarem a identificação e caracterização destas proteínas participantes do
processo de infecção fúngica, pouco é conhecido sobre a influência da infecção
pelo HIV na expressão destes ligantes.
O presente estudo revelou que a cepa de C. albicans isolada de
paciente HIV positivo apresentou uma expressão significantemente maior de
proteínas ligantes à laminina, colágeno tipo IV e principalmente à fibronectina.
Além da maior capacidade de reconhecimento a proteínas de matriz
extracelular, o processo de degradação dessas proteínas por proteases
secretadas após o estabelecimento das ligações também ocorreu de forma
mais acelerada que as demais cepas. Isso fez com que durante a realização
dos experimentos de “binding” foi importante a adaptação da metodologia
utilizada por RODRIGUES et al. (2003). Os autores preconizavam a realização
de todas as etapas sob temperatura ambiente. No entanto, ao trabalharmos
nestas condições, a cepa de C. albicans isolada de paciente HIV+ não
apresentou ligação à nenhuma proteína de matriz devido à rápida degradação
destes substratos pelos altos índices de proteases secretadas. Assim, como
descrito nos materiais e métodos, todo o experimentos foram realizados sob
baixa temperatura (4
o
C).
Os peptídeos responsáveis pela ligação à fibronectina, laminina e
colágeno tipo IV nos três isolados mostraram perfis semelhantes e pesos
141
moleculares abaixo de 80 kDa. NÈGRE et al. (1994) demonstraram que um
fragmento de colágeno mostrou-se como um potente inibidor da ligação de C.
albicans à fibronectina. Nos resultados corroboraram os de GOZALBO et al.
(1998) que demonstraram através de microscopia imunoeletrônica que a
enzima da via glicolítica, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase associada à
parede celular de C. albicans está envolvida na adesão das células fúngicas à
fibronectina e laminina.
A introdução da terapia múltipla anti-retroviral com inibidores de
proteases vêm causando uma redução da infecção por Candida em pacientes
infectados pelo HIV devido ao efeito indireto (melhora da condição imunológica
do hospedeiro), como também a um efeito direto sobre as aspártico-proteases
secretadas por estes fungos (BORG-VON ZEPELIN et al., 1999; KORTING et
al., 1999; CASSONE et al., 1999; GRUBER et al., 1999; BERKTIÉ et al., 2001)
exercendo desta forma um efeito protetor contra o estabelecimento da infecção
fúngica. Por isso, os inibidores de aspártico protease do HIV estão sendo alvos
de pesquisas como tratamento alternativo para infecções fúngicas, mesmo nas
infecções onde o agente etiológico trata-se de um microrganismo que não
secrete aspártico protease (MANFREDI, CALZA & CHIODO, 2002; CASOLARI
et al., 2004). Por isso, no presente estudo avaliou-se a influência destes
inibidores de protease do HIV sobre o crescimento, diferenciação celular e
interação de C. albicans com células epiteliais. No entanto, é sabido que estas
leveduras quando são induzidas a secretarem aspártico protease apresentam
forte influência de todas estas drogas, inclusive na expressão de fatores de
142
virulência, como por exemplo diferenciação celular e interação com células do
hospedeiro (CASSONE et al., 1999; BEKTIÉ et al., 2001).
Ao contrário do observado em Cryptococcus neoformans (BLASI
et al., 2004; MONARI et al., 2005) os inibidores de aspártico protease do HIV
não foram capazes de inibir o crescimento de C. albicans crescida em meio
BHI, com exceção do saquinavir que levou a 100% de morte celular na
concentração de 200 µM. Além da inibição do crescimento, as leveduras
tratadas com Saquinavir durante 24 horas em meio de cultura BHI
apresentaram inibição na diferenciação celular (levedura -> tubo germinativo) e
na interação com células epiteliais in vitro. Nossos resultados corroboram
estudos na literatura que observaram, em fungos produtores de serina protease
para o meio extracelular, efeito inibitório no crescimento e na interação com
células hospedeira como conseqüência do tratamento com drogas inibidoras de
aspártico protease do HIV in vitro (BLASI et al., 2004; MONARI et al., 2005).
Estes resultados sugerem a importância da realização de estudos
in vivo com o objetivo de identificar a expressão e secreção de serina durante a
infecção por espécies de Candida na cavidade bucal. Com isso poderíamos
justificar a presença da lesão oral nos pacientes em terapia com estas drogas
anti-retrovirais inibidoras de aspártico protease, já que de acrodo com os
nossos resultados apenas o Saquinavir apresentou atividade antifúngica. Cabe
ainda salientar a necessidade de investigações sobre a concentação real
destes inibidores na saliva dos pacientes infectados pelo HIV, pois na literatura
consultada não foi encontrada tal informação. Assim, poderíamos definir a ação
143
real destas drogas na diminuição da incidência de candidíase oral – efeito
direto ou indireto nos fatores de virulência de espécies de Candida?
144
7. Conclusões
7. Conclusões7. Conclusões
7. Conclusões
De acordo com os resultados pode mos concluir que:
1 Serina proteases secretadas por espécies de Candida isoladas de lesões de
eritema linear gengival de crianças infectadas pelo HIV foram capazes de
utilizar como substrato proteínas presentes na matriz extracelular (fibronectina
e laminina), proteínas pertencentes ao sistema imunológico (imunoglobulina G)
e componetes do soro (albumina humana e bovina).
O tratamento das leveduras de C. albicans com PMSF (inibidor de serina
protease) inibiu de forma dose-dependente a adesão deste fungo a células
epiteliais (Ma 104) a partir da menor concentração utilizada (0,1 µM de PMSF).
O tratamento com PMSF induziu nas leveduras de C. albicans alterações
celulares como, inibição da atividade de proteases associadas a célula, inibição
da diferenciação celular de levedura para tubo germinativo e modulação da
expressão de proteínas de superfície. Estas alterações celulares ocorreram a
partir da concentração de 100 µM de PMSF.
O tratamento com PMSF e aprotinina (inibidores de serina protease) induziu
a formação de um biofilme de C. albicans com células fracamente aderidas
145
quando comparado ao sistema controle, fato este, que facilitaria a sua remoção
e difusão de medicamentos.
A infecção pelo HIV parece influenciar a expressão de proteínas
responsáveis pela adesão de C. albicans a proteínas de matriz extracelular. O
isolado de C. albicans de criança infectada pelo HIV apresenta maiores
propriedades adesivas à fibronectina, laminina e colágeno tipo, quando
comparado com os isolados oriundos de pacientes sem evidências clínicas de
imunossupressão.
O tratamento das leveduras com os inibidores da aspártico protease do HIV
não influenciou no crescimento de C. albicans, com exceção do saquinavir que
na concentação de 200 µM induziu a 100% de morte celular e nas
concentrações de 100 e 150 µM inibiu a diferenciação celular e adesão a
células epiteliais (Ma 104).
Todos os isolados de C. albicans apresentaram atividade ecto-fosfatásica.
No entanto, os isolados de crianças infectadas pelo HIV apresentaram
atividades significantemente maiores quando comparadas com os isolados de
crianças sem evidências clínicas de imunossupressão. No entanto, não foi
observado correlação positiva entre a atividade enzimática e a condição
sistêmica dos pacientes infectados pelo HIV. Esta atividade enzimática parece
estar envolvida no processo de interação fungo-hospedeiro como um
importante fator no estabelecimento da infecção, já que houve correlação
146
significante entre a elevada atividade ecto-fosfatásica e índice de adesão a
células epiteliais (Ma 104).
A presença de fluoreto de sódio em fluidos salivares parece não ser
importante apenas na prevenção da doença cárie, mas também na prevenção
de infecções fúngicas, principalmente as causadas por C. albicans, por inibir a
formação de um biofilme firmemente aderido produzido por este fungo.
147
8.
8. 8.
8. Referências Bibliográfica
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190
9. Artigos em Anexo
9. Artigos em Anexo9. Artigos em Anexo
9. Artigos em Anexo
9.1) Correspondente à Tese de Doutorado
PORTELA, M. B.; SOUZA, I. P. R.; COSTA, E. M. M. B.; HAGLER, A. N.;
SOARES, R. M. A.; SANTOS, A. L. S. Differential recovery of Candida species
from subgengival sites in human immunodeficiency virus-positive and healthy
children from Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol, v. 42, n. 12, p. 5925-27,
2004.
9.2) Realizado em colaboração
COSTA, E. M. M. B.; SANTOS, A. L. S.; CARDOSO, A. S.; PORTELA, M. B.;
ABREU, C. M.; ALVIANO, C. S.; HAGLER, A. N.; SOARES, R. M. A.
Heterogeneity of metallo and serine extracellular proteinases in oral clinical
isolates of Candida albicans in HIV-positive and healthy chldren from Rio de
Janeiro, Brazil. FEMS Immunol Med Microbiol, v. 38, p. 173-80, 2003.
SANTOS, A. L. S.; De CARVALHO, I. M.; Da SILVA, B. A.; PORTELA, M. B.;
ALVIANO, C. S.; SOARES, R. M. A. Secretion of serine peptidase by a clinical
strain of Candida albicans: influence of growth conditions and cleavage of
191
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Med Microbiol, v. 46, p. 209-20, 2006.
CERQUEIRA, F. C.; PORTELA, M. B.; SOUZA, L. P. R.; CASTRO, G. F.;
SOARES, R.M. A.; SOUZA, I. P. R. Dentinal carious lesions: a predisposing
factor for the oarl prevalence of Candida ssp in HIV-infected children? ASDC J
Dent Child. Artigo submetido.
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