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Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Fernandes Figueira
Pós Graduação em Saúde da Criança e da Mulher
Estudo de precursores eosinofilicos derivados de sangue de cordão
umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação
alérgica
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Rio de Janeiro
Fevereiro 2008
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Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Fernandes Figueira
Pós Graduação em Saúde da Criança e da Mulher
Estudo de precursores eosinofilicos derivados de sangue de cordão
umbilical: interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação
alérgica
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Orientadora: Dra Maria Ignez Capella Gaspar Elsas
Co-orientador: Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas
Tese de doutorado apresentado
a
Pós graduação em Saúde da Crianç
a
e da Mulher do Instituto Fernandes
Figueira para obtenção de titulo de
doutor.
Rio de Janeiro
Fevereiro 2008
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Dedico esta tese à meus filhos,
João Felipe e Gustavo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço de todo o coração, à minha família: meus pais, Maria Lúcia e Frank,
minhas irmãs, Vanessa e Paula (as melhores amigas que alguém pode ter), meu esposo
Alberto pelo apoio, amor e compreensão dedicados a mim, em especial durante o período
da tese de doutorado.
Durante a realização deste doutorado muitas pessoas importantes passaram a fazer
parte da construção desta tese de doutorado e deste período da minha vida.
Agradeço à Drª Maria Ignez Gaspar Elsas, , pela oportunidade e orientação e pelo
acolhemimento como profissional. Agradeço a oportunidade de desenvolver com ela este
trabalho de pesquisa e incorporar à minha vida a experiência de trabalhar em um
laboratório sério e comprometido com a verdade e com os princípios éticos e técnicos da
pesquisa científica.
Ao Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas, um agradecimento especial e o meu
reconhecimento sincero de sua integridade profissional. Agradeço a orientação impecável
e sobretudo a paciência e a argüição rigorosa, mas sempre generosa, que tornaram possível
a realização desta tese de doutorado e que lapidou de forma marcante a minha postura
profissional.
Agradeço a Pós graduação do Instituto Fernandes Figueira por fazerem deste
doutorado algo construído e dirigido com competência e amor ao ensino.
Aos colegas de laboratório, atualmente amigos queridos que me apoiaram de todas
as formas possíveis ao longo de todo o período de construção desta tese. Agradeço a Anisia
Praxedes, Bianca De Lucca, Carla Jones, Daniela Masid, Maria Carolina Souza, Marcelo A.
Gardel, Mônica Barradas, Ricardo Alves Luz, Roseli da Cunha Rodrigues,Túlio Queto,
Vanessa Ecard e Zilton Vasconcelos.
Agradeço especialmente a Túlio Queto que foi meu anjo da guarda, estando sempre
disponível e solícito durante todo este doutorado, tendo sido sua colaboração fundamental
para a boa formatação de todas as figuras contidas na tese.
Agradeço especialmente a Zilton Vasconcelos pela ajuda e nos procedimentos de
separação magnética de CD34+ e citometria de fluxo.
Agradeço especialmente a Ricardo Luz por toda ajuda com o protocolo de cultura
de sangue humano.
Agradeço a colegas de laboratório, Elisabeth Maximiano Santos e Simone Salles ,
que por motivos pessoais nos deixaram ao longo do caminho, mas que marcaram sua
presença de forma inesquecível.
Ao Departamento de Pediatria e Obstetrícia da Maternidade Oswaldo Nazareth pela
recepção cordial e prestativa e sobretudo minha admiração ao serviço pelo reconhecimento
da importância do incentivo à pesquisa. Em especial, meus agradecimentos ao Dr.
Arnaldo Costa Bueno. Agradeço a colaboração de todas as equipes médicas e de
enfermagem de obstetrícia que me recepcionaram sempre de forma prestativa e forneceram
suporte para que o sangue de cordão umbilical fosse colhido da maneira adequada.
Ao Departamento de Obstetrícia do Instituto Fernandes Figueira pela colaboração
valorosa para a construção desta tese de doutorado. À Drª Augusta Maria Batista de
Assumpção, chefe do Departamento de Obstetrícia pelo reconhecimento da importância da
pesquisa científica e a todas as equipes médicas e de enfermagem, que forneceram uma
ajuda de suma importância na coleta de sangue de cordão umbilical. À Dra Valéria Seidl
pela ajuda inestimável.
Agradeço a CAPES pela bolsa de doutorado recebida para a realização do
doutorado.
Agradeço aos membros da minha banca de doutorado: Dr. José Roberto de Moraes
Ramos, Dr. Marcelo Pelajo Machado, Dr. Zilton Farias Meira de Vasconcelos, Dr Neio
Lucio Fernandes Boechat Boechat e Dra Maria Ignez Capella Gaspar Elsas, pelas valiosas
sugestões e orientações
“Determinação, coragem e auto confiança são fatores decisivos para o sucesso. Se
estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los.
Independente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de
orgulho.”
Dalai Lama
RESUMO
Os corticoesteróides são as principais drogas utilizadas no controle da inflamação
alérgica, na qual o eosinófilo tem um papel importante. Contudo, os corticoesteróides
também têm um papel essencial na resposta de estresse, que está associada à piora clínica
nas alergias. O uso de culturas de células hematopoiéticas oferece uma oportunidade para
estudarmos o efeito dos glicocorticóides sobre a linhagem eosinofílica num período crítico
do desenvolvimento do sistema imune. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos
dos glicocorticóides sobre a diferenciação eosinofílica em cultura de sangue de cordão
umbilical humano. Foram realizadas culturas líquidas por 14 a 28 dias, na presença de IL-3,
IL-5 e GM-CSF, a partir de células mononucleares ou de células enriquecidas em
progenitores CD34+, obtidas a partir de sangue de cordão umbilical. Adicionamos, onde
indicado, dexametasona, hidrocortisona ou budesonide no início da cultura. Onde indicado,
o mifepristone (RU486) foi acrescentado às culturas para avaliar o envolvimento do
receptor de glicocorticóide nos efeitos observados. Observamos, na presença de
dexametasona 10
-7
M, um aumento do número de células totais, do percentual de
eosinófilos e do número absoluto de eosinófilos, que foi estatisticamente significativo, em
relação ao grupo controle. Com a presença de 10
-7
M de budesonide e hidrocortisona,
observamos auo mento estatisticamente significativo do percentual de eosinófilos e número
total de eosinófilos. Os eosinófilos após coloração com Wright-Giemsa apresentavam grau
de maturidade variável, com uma significativa proporção de células com o núcleo bilobado
característico da forma madura. Em culturas enriquecidas na população CD34+, a
dexametasona também aumentou o número de eosinófilos recuperados no 14
o
dia. Estudos
cinéticos mostraram que a dexametasona, para ter efeito, precisava ser adicionada no início
da cultura, sendo ineficaz quando acrescentada a partir do 14
o
e do 21
o
dia de cultura. No
28º. dia de cultura, não havia mais diferença significativa entre culturas experimentais e
controles, sugerindo que os eosinófilos formados na presença de dexametasona sofreram
envelhecimento e morte celular programada. Os efeitos da dexametasona foram bloqueados
pela adição de RU486 à cultura, mostrando a importância do receptor de glicocorticóide
para o efeito observado. A análise do efeito da dexametasona em experimentos realizados a
partir de sangue de cordão umbilical de mães atópicas não mostrou diferença
estatisticamente significativa quando comparado com experimentos realizados a partir de
sangue de cordão umbilical de mães não atópicas. Desta forma, este estudo mostrou que a
dexametasona, budesonide e hidrocortisona apresentam efeito potencializador sobre a
linhagem eosinofílica em células hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical
humano e que estes efeitos são mediados pelo receptor de glicocorticóide.
Abstract
Corticosteroids are the major therapeutic resources for the control of allergic
inflammation, for which eosinophils are essential contributors. However, corticosteroids
also have an essential role in stress responses, which are associated with the precipitatiohn
of allergic episodes. The use of hemopoietic cell cultures allows us to study the effects of
corticosteroids on the eosinophil lineage, in a critical period of development of the immune
system. In the present study, we aimed at evaluating the effects of corticosteroids on
eosinophil differentiation in human cord blood cultures. We established liquid culutres for
14 to 28 days, in the presence of IL-3, IL-5 and GM-CSF, with mononuclear cells, or with
cells further enriched in CD34+ progenitors. Where indicated, dexamethasone,
hydrocortisone or budesonide were added at the beginning of the cultures. Where needed,
mifepristone (RU486) was added to the cultures to probe for the involvement of
glucocorticoid receptors in effects of exogenous glucocorticoids. We observed, in the
presence of dexamethasone 10
-7
M, an increase in total cell numbers, in the percent of
eosinophils, and the total eosinophil numbers, that was highly significant, relative to the
control group. In the presence of 10
-7
M budesonide or hydrocortisone, we observed a
significant increase in the percent eoosinophils and total eosinophil numbers, over control
cultures. Eosinophils stained with Wright-Giemsa displayed a variable degree of
cytological maturity, with a sizable fraction presenting the typical bilobed nucleus of the
mature form, and abundant cytoplasmic granules stained in red. In cultures enriched for
CD34+ cells, dexamethasone also increased eosinophil numbers recovered by day 14.
Kinetic analyses showed that dexamethasone had to be added at the beginning of the
culture, and became ineffective if added at day 14 or 21. At the 28
th
. day of culture, there
was no longer a significant difference between experimental and control cultures,
suggesting that the eosinophils maturing in the presence of dexamethasone underwent
subsequently senescence and programmed cell death. The effects of dexamethasone were
blocked by adding RU486 to the culture, showing the requirement for glucocorticoid
receptor signaling for the effects observed. The analysis of the effects of dexamethasone in
experiments carried out with cord blood from atopic mothers did no show a significant
difference relative to controls with samples from mothers who denyed previous atopic
disease. Overall, our findings indicated that dexamethasone, budesonide and hydrocortisone
present an enhancing effect on the differentiation of eosinophils from hemopoietic cells
isolated from human cord blood, which is mediated by the glucocorticoid receptor.
LISTA DE ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucleico mensageiro
CCR3 Receptor de quimiocinas
CD102 ICAM-2
CD34 Molécula de superfície que marca células hematopoiéticas
CD40L Ligante de CD40
CD54 ICAM-1
CD62L Molécula de superfície que caracteriza L-selectina
CFU Unidade formadora de colônia
CXCR2 Receptor de quimiocinas
CXCR4 Receptor de quimiocinas
ECP Proteína catiônica eosinofílica
EDN Neurotoxina derivada do endotélio
Eo/B Eosinófilos/ Basófilos
FcεRI Receptor Fc do tipo I para imunoglobulina E
FcεRII Receptor Fc do tipo II para imunoglobulina E
GM-CSF Fator estimulador do crescimento de colônias de granulócitos e monócitos
GR Receptor de glicocorticóide
HPA Hipotálamo hipofisário adrenal
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular do tipo 1
ICAM-2 Molécula de adesão intercelular do tipo 2
ICAM-3 Molécula de adesão intercelular do tipo 3
IFNγ Interferon gama
IgE Imunoglobulina E
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-10 Interleucina 10
IL-11 Interleucina 11
IL-13 Interleucina 13
IL-2 Interleucina 2
IL-3 Interleucina 3
IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5
IL-5Rα Subunidade alfa do receptor de interleucina 5
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LFA-1 Antígeno da função leucocitária do tipo 1
M2 Receptor muscarínico tipo 2
MBP Proteína básica principal
MCP-1 Proteína quimiotática de monócito 1
MCP-2 Proteína quimiotática de monócito 2
MCP-3 Proteína quimiotática de monócito 3
MCP-4 Proteína quimiotática de monócito 4
PAF Fator de ativação de plaquetas
RANTES Quimiocina para eosinófilos
SAM Simpático adrenal medular
STAT 5 Transdutor de sinal e ativador de transcripção 5
Th0 Linfócito T auxiliar
Th1 Linfócito T auxiliar tipo 1
Th2 Linfócito T auxiliar tipo 2
TNFα Fator de necrose tumoral alfa
VCAM-1 Molécula de adesão da célula vascular tipo 1
VLA-4 Antígeno muito tardio tipo 4
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Tabela de potências relativas e doses equivalentes dos
corticoesteróides
25
FIGURA 2 – Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de células
totais obtidas.
54
FIGURA 3 –Gráfico do efeito da dexametasona sobre o percentual de
eosinófilos obtidos.
56
FIGURA 4- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número total de
eosinófilos obtidos.
57
FIGURA 5a e 5b- Fotos das lâminas (controle e com dexametasona) de
experimentos realizados a partir de células mononucleares coradas com
panótico e wright giemsa.
58; 59
FIGURA 6- Gráficos de citometria de fluxo – análise da pureza de
separação das células CD34+.
61
FIGURA 7- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de células
totais obtidas em cultura realizada a partir de células CD34+.
62
FIGURA 8- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o percentual de
eosinófilo obtido em cultura realizada a partir de células CD34+.
63
FIGURA 9- Gráfico do efeito da dexametasona sobre o número de
eosinófilos obtidos em cultura realizada a partir de células CD34+.
63
FIGURA 10ª e 10b – Fotos das lâminas ( controle e com dexametasona) de
experimentos realizados a partir de células CD34+ coradas com panótico e
wright-giemsa..
64 e 65
FIGURA 11- Gráfico do efeito do RU486 sobre o percentual de eosinófilos 67
FIGURA 12 – Gráfico do efeito do RU486 sobre o número de eosinófilos 68
FIGURA 13- Gráfico da cinética de ação da dexametasona – células totais. 69
FIGURA 14 – Gráfico da cinética de ação da dexametasona – percentual de
eosinófilos
71
FIGURA 15- Gráfico da cinética de ação da dexametasona – número de
eosinófilos.
72
FIGURA 16 – Gráfico do efeito do Budesonide – células totais 74
FIGURA 17- Gráfico do efeito do Budesonide – percentual de eosinófilos 75
FIGURA 18- Gráfico do efeito do Budesonide – número de eosinófilos 76
FIGURA 19- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – células totais 78
FIGURA 20- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – percentual de
eosinófilos
79
FIGURA 21- Gráfico do efeito da Hidrocortisona – número de eosinófilos 80
FIGURA 22 –Fotos de lâminas (controle e com hidrocortisona) coradas com
Wright-Giemsa.
81
FIGURA 23- Gráfico de efeito da dexametasona sobre o número de
eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados com sangue de
cordão umbilical humano coletado de mães atópicas e não atópicas.
82
FIGURA 24 a e b- Gráfico de efeito da dexametasona sobre o número de
eosinófilos obtidos a partir de experimentos realizados com sangue de
cordão umbilical humano coletado de mães atópicas e não atópicas
83
FIGURA 25- Gráfico de enhancement entre experimentos realizados a partir
de mães atópicas e não atópicas.
84
Figura 26. Tabela do Perfil de gestantes 85
ÍNDICE
I – Introdução
1
1. Apresentação e justificativa do estudo
1
2. Revisão da literatura
3
2.1. Impacto das doenças atópicas na saúde da criança
3
A.Hipótese da Higiene 6
• Efeito irmão
7
• Freqüência a creche
9
• Colonização do intestino
10
• Exposição ao ambiente de fazenda
12
• Exposição a animais domésticos
13
• Exposição a endotoxina
14
B. Hipótese da Programação fetal
15
• Tipo de Parto
15
• Probióticos
16
• PUFA
17
• Antioxidantes
18
2.2 Estresse e alergia
21
A. Histórico 21
B. Estresse e corticoesteróides 22
C. Corticoesteróides e alergia 24
D. Mecanismo de ação dos corticoesteróides 25
E. Estudos experimentais 30
F. Relaçao entre os efeitos do estresse e a propensão a reações alérgicas 32
G. Importância dos corticoesteróides no amadurecimento pulmonar fetal. 37
2.3. Eosinopoiese 38
2.4. Citocinas eosinopoiéticas 40
• GM-CSF
40
• IL-3
41
• IL-5
41
3. Relevância do estudo
42
II- Objetivos 45
• Gerais
45
• Específicos
45
III- Metodologia
1. População de pacientes estudados e critérios de inclusão 46
2. Critérios de exclusão 46
3. Estudos com células hematopoiéticas 47
3.1.Materiais 47
3.2 Cultura de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical 48
3.3. Colorações hematológicas 52
3.4. Microfotografia 52
3.5. Métodos estatísticos 52
IV-Resultados
53
1. Efeito da dexametasona sobre a cultura realizada a partir de células
mononucleares derivadas de sangue de cordão
53
2. Efeito da dexametasona sobre a cultura realizada a partir de células
CD34+ enriquecidas derivadas de sangue de cordão
60
3. Bloqueio dos efeitos da dexametasona pelo mifepristone 66
4. Cinética de ação da dexametasona 69
5. Efeito do budesonide sobre a formação de eosinófilos 73
6. Efeito da hidrocortisona sobre a formação de eosinófilos 77
7. Efeito da atopia materna sobre o efeito potencializador de eosinófilos
pela dexametasona.
82
8. Pefil das gestantes e recém nascidos dos quais foram coletados o
sangue de cordão umbilical humano.
84
V- Discussão
84
VI-Referências Bibliográficas
96
VII- Anexo
110
Anamnese 110
Termo de consentimento live e informado da Maternidade Oswaldo
Nazareth
111
Termo de consentimento livre e informado da Maternidade IFF. 112
Autorização do Comitê de Ética da Secretaria Municipal de Saúde 113
Autorização do Comitê de Ética do Instituto Fernandes Figueira 114
1
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
I- INTRODUCÃO
1. Apresentação e Justificativa do estudo.
No presente estudo, procuramos utilizar a cultura de células hematopoiéticas
isoladas a partir de sangue de cordão umbilical como um sistema experimental, visando
a analisar alguns dos efeitos da exposição aos corticosteróides e a outros agentes
moduladores da hematopoiese.
Em especial, procuramos definir se os glicocorticóides, da mesma forma que já foi
descrito em outros estudos que utilizaram medula óssea humana ou de animais
experimentais, potencializam em cultura de sangue de cordão a produção de eosinófilos,
na presença da combinação apropriada de citocinas (GM-CSF, IL-3 e IL-5).
Procuramos igualmente caracterizar o possível envolvimento do receptor de
glicocorticóide nos efeitos desta classe de agentes sobre a diferenciação hematopoiética
ex vivo.
A iniciativa deste estudo está ligada à necessidade de abordar a um problema
extremamente complexo, a saber, quais os fatores ambientais que podem influenciar o
desenvolvimento das doenças alérgicas, através da sua atuação no eixo Hipotálamo-
Pituitária-Adrenal (HPA), que é central para a homeostasia e para a imuno-regulação.
Uma grande quantidade de estudos da literatura indica que a evolução das
doenças alérgicas, ainda que delimitada por fatores hereditários, é decisivamente
influenciada pelo meio ambiente, através de uma ampla variedade de mecanismos –
como a atuação de subpopulações de linfócitos imuno-regulatórios, a exposição a
2
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
produtos microbianos, com ativação dos receptores de tipo Toll, e os perfis de produção
de citocinas que resultam dessa exposição.
Como é próprio de estudos envolvendo seres humanos, no entanto, tais
mecanismos básicos se manifestam clinicamente num nível de organização biológico
muito superior, transparecendo sobretudo como efeitos epidemiológicos (“efeito irmão”,
“freqüência à creche”, “exposição a ambiente de fazenda”, entre tantos outros).
Dentre os muitos problemas científicos interessantes e importantes que se
apresentam nesta área, hoje, procuramos nos concentrar na associação entre estresse e
alergia, ou, mais precisamente, em alguns mecanismos fundamentais que poderiam
contribuir para essa inegável associação.
No caso, o foco da nossa pesquisa foi a possível contribuição dos
glicocorticóides para a produção de eosinófilos, um dos subtipos de leucócitos mais
característicos das doenças alérgicas.
Achados da literatura sugerem que os glicocorticóides, em concentrações
compatíveis com a atuação do eixo hipotálamo-hipofisário, estimulam a produção de
eosinófilos a partir de células hematopoiéticas, o que forneceria um possível racional
para a influência do estresse na progressão da doença alérgica.
Tal mecanismo, se for confirmado com o uso de células de sangue de cordão
umbilical, que são representativas do sistema hematopoiético fetal, e suscetíveis a uma
variedade de influências de origem materna, poderia ter o interesse adicional de sugerir
um racional para a conhecida associação entre estresse nas mães e alergia nos filhos.
3
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1- Impacto das doenças atópicas na saúde da criança
As doenças atópicas, tais como asma brônquica, rinite alérgica, dermatite
atópica e conjuntivite alérgica apresentam um curso de evolução crônico com períodos
de exacerbação. Estima-se que os custos econômicos mundiais de apenas a asma
brônquica, exceda a combinação de custos da infecção pelo HIV/SIDA e tuberculose
(Gleich, 2000), que são consideradas problemas epidemiológicos de importância
mundial.
A morbidade relacionada a estas doenças, e o custo elevado com medicações ( e,
por vezes, internações) tornam as doenças alérgicas e sua fisiopatologia alvos constantes
de investigação. A prevalência da asma e outras doenças alérgicas tem aumentado nas
últimas décadas (Warner et al, 2000). Tem ocorrido um aumento no número de
admissões hospitalares, particularmente em lactentes com asma, que não é devido nem a
um aumento na taxa de readmissão nem a uma redução na gravidade requerida para a
admissão. Isto gera um problema econômico. No Reino Unido em 1993, 11% do custo
total com prescrições foi gasto com drogas para o tratamento de asma. No mesmo ano,
ocorreram 103.000 admissões hospitalares por asma, sendo que 1 em 4 eram pacientes
na faixa pediátrica. Os custos indiretos não podem ser quantificados, mas um recente
estudo com 8000 crianças com asma mostrou que 56% eram sintomáticos a cada
semana, e 20% acordavam toda a noite com os sintomas. Além disso, 74% revelaram ter
ao menos restrições moderadas no seu estilo de vida (Warner, 1990). Anualmente,
4
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
segundo o Consenso Brasileiro de Manejo de Asma, ocorrem cerca de 350.000
internações por asma no Brasil, constituindo-se na quarta causa de hospitalização pelo
SUS (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianças e adultos jovens. Há
registro de aumento desse número de internações entre 1993 e 1999, e indícios de que a
prevalência da asma esteja aumentando em todo o mundo, inclusive no Brasil (III
Consenso Brasileiro de Asma). Em 1996, os custos do SUS com internação por asma
foram de 76 milhões de reais, 2,8% do gasto total anual e o terceiro maior valor gasto
com uma doença. Foi realizado um estudo multicêntrico (International Study for
Asthma and Allergies in Chilhood - ISAAC) em 56 países, que mostrou uma
variabilidade da asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando o Brasil em 8
o
. lugar, com uma
prevalência média de 20%. A mortalidade de asma ainda é baixa, mas apresenta uma
magnitude crescente em diversos países e regiões. Nos países em desenvolvimento, a
mortalidade por asma vem aumentando nos últimos 10 anos, correspondendo a 5-10%
das mortes por causa respiratória,com elevada proporção de óbitos domiciliares
(Chatkin et al, 1999).
Os estudos de comparações de prevalência regionais e internacionais são
imprescindíveis para o estudo etiológico da asma. Entretanto, estes estudos são difíceis
de realizar, uma vez que um estudo de prevalência de asma requer um mínimo de 1000
pessoas (idealmente 3000 pessoas), com uma taxa de resposta maior que 90%, para que
se possam estimar a prevalência e a gravidade com precisão razoável (Beasley et al,
2000). Apesar destas dificuldades, o estudo de comparações internacionais já nos trouxe
algumas informações valiosas. Foi observado que a prevalência de asma está
aumentando no mundo todo. A prevalência da asma é maior nos países desenvolvidos e
5
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
naqueles que falam a língua inglesa. Tem sido observado um aumento da prevalência da
asma nos países em desenvolvimento, à medida em que estes se tornam mais
desenvolvidos, mais urbanizados. A prevalência de outros distúrbios alérgicos tais como
rinite, dermatite atópica, e urticária também está aumentando no mundo todo (Beasley
et al, 2000). Estas características dos padrões internacionais de prevalência da asma
suscitam questões importantes. É evidente, com base neste conhecimento, que nenhum
fator etiológico já identificado possa ser responsabilizado sozinho pelo aumento da
prevalência da asma no mundo todo. Por exemplo, temos evidências, através das
comparações globais de que a poluição do ar não é o fator de risco principal para o
desenvolvimento da asma. Regiões como a China e o Leste Europeu, que são os locais
que possuem os mais altos níveis de poluição do ar, em geral, apresentam taxas de
prevalência de asma menores do que aquelas encontradas em países como Austrália,
6
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
podemos conjeturar que existam outros fatores que possam afetar a suscetibilidade à
sensibilização alérgica (independente dos níveis de alérgeno).
Várias hipóteses tem surgido na tentativa de explicar este fenômeno, que
recentemente, parece ter atingido um platô tais como a hipótese da higiene e a hipótese
da programação fetal.
A- HIPÓTESE DA HIGIENE
Em 1989, a observação epidemiológica de Strachan, de que o risco de febre do
feno e a sensibilização alérgica diminuem à medida que aumenta o número de irmãos
numa prole, deu origem à chamada hipótese da higiene. Strachan propôs que a
diminuição no tamanho da família, a melhoria da moradia, e os altos padrões de limpeza
pessoal haviam reduzido as oportunidades de infecções cruzadas entre as crianças e que
as infecções poderiam ter um papel em prevenir as doenças atópicas (Strachan, 1989).
Esta teoria ganhou respaldo com as descobertas de Mosmann em 1986. Este autor
mostrou que quando células T CD4+ naive eram estimuladas, elas poderiam se
desenvolver em duas populações distintas com base no perfil de citocinas produzidas. A
população de células chamada Th1 produz interleucina 2 (IL-2), interferon γ (IFN-γ) e
fator de necrose tumoral alfa (TNFα). A população Th2 produz IL-4 (importante para a
mudança de isotipo de classe para IgE), IL-5 (importante para prolongar a sobrevida de
eosinofilos), IL-6 e IL-13 (estimula a produção de IgE) (Mosmann et al, 1986). A
descoberta destas subpopulaçoes ofereceu um arcabouço conceitual para a hipótese da
higiene. Dentro desta visão, uma baixa exposição a patógenos virais e bacterianos
durante a primeira infância resultaria em estimulação insuficiente das células Th1, que
7
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
em condições normais, contrabalança a expansão de células Th2, e este desequilíbrio
resultaria em predisposição para doenças alérgicas (Braun-Fahrländer et al, 2002).
É conhecido que todos os RN nascem com um viés para uma resposta Th2. Isto
possivelmente ocorre porque o modo Th2 pode contribuir para a manutenção da
gravidez (Wegman et al, 1993). Repetidas infecções induzindo as atividades de
citocinas Th1, principalmente nos primeiros meses de vida, poderiam ajudar a resposta
T a amadurecer para um fenótipo mais balanceado. Os atópicos produzem menos IFN-γ
e o desvio para Th2 persiste (Prescott et al, 1999). Desta forma, eventos e exposiçoes
durante os primeiros anos de vida podem modular o desenvolvimento do sistema imune,
contribuindo para o recente aumento das alergias (Prescott, 2003).
Com base na hipótese da higiene, vários agentes infecciosos e condições que
predispõem a infecções em uma fase precoce da vida foram estudados tais como a
aglomeração, número maior de irmãos, freqüência a creche, imunizações, infecções
como sarampo e hepatite A e outros.
•
EFEITO IRMÃO
Vários estudos sugerem que o fato de ter mais irmãos mais velhos protegeria o
filho mais novo das doenças atópicas , uma associação epidemiológica conhecida como
“efeito irmão”.
Segundo Strachan (Strachan, 1989), a possibilidade de infecções cruzadas entre o
irmão mais velho e o mais novo, protegeria o último do desenvolvimento de atopia por
induzir um perfil de citocinas Th1.
8
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Este efeito foi primeiramente descrito na literatura por Golding e Peters (Golding
e Peters, 1986) em um estudo que buscou avaliar a saúde e o comportamento das
crianças na Grã Bretanha, incluindo associações epidemiológicas com fatores de risco
como condições de moradia, classe social e fumo. Neste estudo foi detectado que para
asma e sibilancia não havia associação com o número de outras crianças na família,
mas para eczema e febre do feno, observou-se uma diminuição do quando havia um
número maior de irmãos.
Recentemente foi feita uma revisão por Karmaus (Karmaus e Botezan, 2002)
levando em conta a relação entre o número de irmãos e a presença de doenças alérgicas.
Para eczema, 10 dos 11 estudos analisados mostraram associação inversa com o número
de irmãos. 22 dos 31 estudos mostraram associação inversa para asma. Todos os 17
estudos de febre do feno mostraram associação inversa com o número de irmãos; 14 de
16 estudos mostraram associação inversa com a sensibilização alérgica. A proporção de
casos atribuíveis ao efeito irmão é considerada como sendo de 34% para o eczema, 28%
para asma, 56% para febre do feno, 38% para o desenvolvimento de IgE especifica.
Karmaus sugere que, se compreendermos melhor os fatores que compõem o efeito
irmão, poderemos previnir cerca de 30% dos casos de asma, eczema e febre do feno.
Foi demonstrado que os níveis de IgE encontrados diminuem à medida que se
avança na ordem de nascimento das crianças estudadas (Karmaus et al, 2001). Um
estudo de Van Gool (Van Gool et al, 2004) mostrou que a mais alta paridade é
associada com níveis mais baixos de IgE sérica neonatal. Outros determinantes de IgE
sérica neonatal achados foram : IgE sérica materna elevada, idade materna avançada e
9
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
nascimento nos primeiros 3 meses do ano. Estes estudos levantam a possibilidade de
que o “efeito irmão”possa ter suas origens ainda no útero.
• FREQÜÊNCIA À CRECHE
A creche deve ser vista como um indicador de exposição precoce a numerosos
agentes infecciosos. Um estudo norueguês mostrou que a freqüência à creche
aumenta significativamente o risco de infecções do trato respiratório superior e de
otite recorrente, em crianças de 3-5 anos (Nafstad et al, 1999). Estes achados foram
confirmados por um estudo prospectivo, que mostrou que lactentes que freqüentam
creches no primeiro ano de vida estão em maior risco para o desenvolvimento de
infecções de ouvido, resfriados, ou doenças do trato respiratório inferior como
bronquite, bronquiolite e pneumonia (Celedon et al, 1999).
A frequência à creche na primeira infância é uma característica do estilo de
vida da Alemanha Ocidental. Em um estudo alemão , Kramer (Kramer et al, 1999)
mostrou que crianças que entravam na creche no primeiro ano de vida apresentavam
risco menor para o desenvolvimento de febre do feno e de positividade ao teste
cutâneo para alergenos. Um estudo nos Estados Unidos corroborou este achado
mostrando que lactentes que freqüentavam a creche nos primeiros 6 meses de vida
estavam associados com um risco diminuído para atopia após um período de 13
anos de acompanhamento clínico, embora apresentassem mais sintomas de
broncoespasmo aos 2 anos (Ball et al, 2000).
10
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
• COLONIZAÇÃO DO INTESTINO
O estímulo microbiano, tanto pela flora comensal como por patógenos
no intestino, pode ter um papel protetor contra o desenvolvimento de atopias.
Matricardi e colaboradores (Matricardi et al, 2000) mostraram em um estudo caso-
controle, realizado com cadetes italianos, que a atopia era inversamente relacionada
com marcadores de infecções transmitidas através da rota orofecal ou transmitida
através de mãos contaminadas ou alimentos (Toxoplasma gondii, Helicobacter pylori
e vírus da hepatite A). Os autores sugeriram, neste estudo, que características da vida
ocidental que poderiam estar ligadas a este aumento das alergias incluiria a dieta
ocidentalizada, com uso de aditivos anti microbianos, e com baixo conteúdo
microbiano aliada à diminuição da transmissão de doenças pela via orofecal. Sepp e
colaboradores mostraram que a flora intestinal de lactentes da Estônia (onde a
prevalência de alergia é relativamente baixa) difere da flora intestinal de lactentes
suecos de 1 ano de idade. Nos lactentes da Estônia eram achados mais
freqüentemente lactobacilos. Em contraste, as contagens de Clostridium ( em
particular Clostridium difficile ) eram mais altas nos lactentes suecos (Sepp et al,
2005). Foi feito outro estudo que comparou estas duas populações, mas dividindo
cada um em indivíduos alérgicos e não alérgicos. Este estudo mostrou que as
crianças alérgicas dos dois paises mostravam intestino menos colonizado com
lactobacilos do que as não alérgicas achado (Bjöksten et al, 1999).
11
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Tem sido observada uma baixa prevalência de sensibilização alergênica
em crianças de escolas antroposóficas quando comparadas a outras crianças da
mesma idade da vizinhança. O estilo de vida da Antroposofia, que inclui o uso
restrito de antibióticos e o uso em grande quantidade de alimentos fermentados, que
contêm abundantemente lactobacilos, tem sido associado com um risco diminuído de
alergia (Alm et al, 1999). Um estudo mostrou que o uso prévio de antibióticos
causava desvio para uma resposta imune tipo Th2, provavelmente por causar um
distúrbio na flora intestinal, sendo este efeito prevenido pela suplementação oral com
bactérias intestinais probioticas (Sudo et al, 2002).
Um estudo randomizado controlado, com 159 crianças de alto risco, mostrou
que a administraçao perinatal de bactérias intestinais probióticas (Lactobacilus GG)
diminuiu o desenvolvimento de eczema atópico durante os primeiros 2 anos de vida
(Kalliomaki et al, 2001). Em apoio a este estudo, temos alguns outros estudos bem
sucedidos, que usaram cepas especificas de probióticos para o tratamento de crianças
com eczema atópico e alergia ao leite de vaca (Majama et al, 1997; Isolauri et al,
2000)
Um estudo de Nover testou uma dos aspectos da hipótese da higene, ao
investigar se a antibioticoterapia e alterações na microbiota, incluindo o crescimento
de Candida albicans poderia desregular a resposta imune, gerando uma resposta do
tipo Th2 em resposta a um alergeno inalavel (Noverr et al, 2004 ) .Neste estudo, os
autores demonstraram que, em modelo animal, a resposta alérgica pode ocorrer se
houver perturbação da microbiota intestinal.
12
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
• EXPOSIÇÃO A AMBIENTE DE FAZENDA
Vários estudos têm mostrado que existe uma menor prevalência de febre do
feno e de sensibilização alergênica em crianças de fazenda, quando comparadas com
crianças que não são de fazenda (Braun-Fahrländer et al, 1999 ). Um estudo de Ernst
& Cornier (Ernst & Cormier, 2000) mostrou uma prevalência significativamente
mais baixa de asma (definida como sibilância e hiperreatividade da via aérea a
metacolina) e atopia (aferida atraves de teste de puntura para 24 alergenos inalados
comuns), em crianças criadas em fazenda, quando comparadas a crianças que
estudam na mesma escola, na mesma zona rural mas que não tem contato regular
com o ambiente de fazenda. Um estudo de Leynaert e col. foi conduzido para avaliar
se o fato de ter vivido em uma fazenda quando criança poderia exercer um efeito
protetor para atopia que persistisse pela vida adulta. Este estudo mostrou que o risco
de sensibilização atópica e de febre do feno foi mais baixo para aqueles indivíduos
que viveram em fazenda quando eram crianças do que entre os que não viveram
(Leynaert et al, 2001). Não foi achada associação entre o ambiente de fazenda na
infância e o risco de ter asma ou sibilância na vida adulta , sendo isto atribuído ao
fato de que a asma pode ter outros desencadeantes que não a atopia. Os autores
sugerem que este trabalho fornece evidências de que fatores ambientais encontrados
na infância podem ter um efeito protetor por um longo período contra o
desenvolvimento de atopia.
As condições de vida das famílias que vivem em fazenda diferem, em muitos
detalhes do estilo de vida de outras famílias. As diferenças incluem: um tamanho de
13
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
família maior, mais animais domésticos, freqüente aquecimento da casa com lenha,
menos uso de fumo entre as mães, e hábitos de alimentação característicos (Von
Mutius, 2001) . Ainda não é conhecido o que, dentre estes fatores, determina o
“efeito fazenda”. Um estudo realizado na Áustria mostrou que o contato com granjas
ou pequenas criações de animais explicava a relação negativa entre o ambiente de
fazenda e atopia (Von Ehrenstein et al, 2000).
• EXPOSIÇÃO A ANIMAIS DOMÉSTICOS
Existe uma vasta literatura sugerindo que a sensibilização a animais
domésticos constitui um importante fator de risco para asma (Plaschke et al, 1999). A
sensibilização a animais domésticos pode ocorrer tanto em casas que tenham animais
como nas que não têm, e alguns estudos mostraram que o fato de ter um cachorro em
casa estava associado a um risco menor de sensibilização ao cachorro por volta dos
6-7anos (Ownby et al, 2002). Um outro estudo mostrou que ter um gato em casa na
infância estava associado a um risco menor de sensibilização aos gatos quando
adulto naqueles que tinham historia familiar de atopia (Roost et al, 1999).
Um estudo esclarece que os animais domésticos são muito mais do que os seus
alérgenos, e que o fato de ser dono de um animal domestico pode resultar em
diversas formas de exposições como mordidas de animais e arranhões , além da
exposição a altos níveis de endotoxina (Heinrich et al, 2001). Desta forma, como a
exposição passiva é importante, o fato de não ser dono do animal poderia deixar um
14
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
individuo apenas com a exposição passiva ao alergeno . Os estudos ainda são
inconclusivos como indicado por revisão de Simpson e Custovic (Simpson &
Custovic, 2003): alguns estudos indicam que ser dono do cão ou gato aumentam e
outros que diminuem a sensibilização a estes. Entretanto, em função da exposição
passiva, o fato de não ter o animal em casa não necessariamente vai impedir que o
indivíduo seja sensibilizado. Desta forma aqueles indivíduos que apresentarem
sintomas relacionados com a sensibilização devem ser afastados da exposição para os
demais, a literatura ainda tem que trazer mais algumas respostas .
• EXPOSIÇÃO A ENDOTOXINA
As endotoxinas bacterianas são potentes imunomoduladores que podem inibir
a resposta Th2, pela indução de um perfil Th1 atraves da produção de IL-12 e IFN-γ
pelas células apresentadoras de antígenos(Douwes et al, 2004). Alguns estudos têm
mostrado que a atopia está associada com polimorfismo do CD14, que é o co-
receptor para endotoxina nos monócitos e outras células inflamatórias (Woo et al,
2003).
As concentrações de endotoxina têm se mostrado altas em casas de crianças
morando em fazendas, quando comparadas às casas de crianças que não moram em
fazendas (Von Mutius et al, 2000). Os níveis de endotoxina tem se mostrado altos em
paises desenvolvidos, quando granjas e pequenas criações são mantidas perto da
casa.
15
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
O momento da exposição à endotoxina parece ser importante. É possível que
haja uma janela de oportunidade nos primeiros anos de vida, durante a qual o
fenótipo Th2 típico do nascimento pode ser desviado para o fenótipo Th1 (Martinez
& Holt, 1999). Em modelo animal foi mostrado que a exposiçao à endotoxina antes
do processo de sensibilização alergenica prevenia o desenvolvimento de atopia;
entretanto, a exposiçao de endotoxina após o estimulo alergênico aumentava o
infiltrado celular nas vias aéreas que é visto na fase tardia da reação alérgica (Tulik et
al, 2000).
B. HIPÓTESE DA PROGRAMAÇÃO FETAL
Uma outra hipótese para explicar a tendência mundial ao aumento das alergias é a
de programação fetal. Tem sido crescente o interesse na possibilidade de que a mãe
possa desempenhar, no curso da gestação, um papel determinante no desenvolvimento
da resposta imune fetal a alérgenos. Atualmente , as interações entre mãe, placenta e o
feto estão formando uma nova fronteira da pesquisa e oferecem um alvo potencial para
a intervenção no sentido de prevenir a asma alérgica (Warner et al, 1998).
• TIPO DE PARTO
Um estudo de Brown e colaboradores mostrou que o tipo de parto pode alterar a
produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue de cordão umbilical. Estes
autores mostraram que, quando o parto é normal, ocorre uma maior produção de IFN-γ
enquanto no parto cesariano ocorre diminuição. Os autores ressaltam a necessidade de
16
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
outros estudos para avaliar por quanto tempo este efeito pode persistir, mas é possível
que o parto normal seja o primeiro estímulo para fazer com que o desvio Th2 protetor
da gravidez venha para um novo ponto de equilíbrio, uma vez que o interferon gama
estimula o perfil Th1 e inibe o Th2 (Brown et al, 2003)
•
PROBIÓTICOS
Um estudo de Kaliomaki e colaboradores ressaltou a importância dos probióticos
na modulação das doenças alérgicas. Estes pesquisadores conduziram um estudo
randomizado controlado, no qual era introduzido o Lactobacilus GG no período pré
natal na dieta de gestantes que apresentassem risco para a transmissão de atopia (ou
seja, tenham ao menos um parente de primeiro grau com eczema ou parceiro com
eczema atópico, rinite ou asma) e de lactentes nos primeiros 6 meses de vida. O estudo
mostrou que a freqüência de eczema atópico aos 2 anos de idade foi reduzido à metade
no grupo que consumiu probiótico, quando comparado com o grupo placebo, o que
mostrou que o Lactobacilus GG é efetivo na prevenção do eczema atópico (Kaliomaki
et al, 2001). Os probióticos , especialmente as cepas Lactobacillus e Bifidobacterium,
são capazes de modificar in vitro o perfil de citocinas produzidas por monócitos e
linfócitos, levando à uma produção aumentada de interleucina 12 e interferon gama,
típica do fenótipo Th1 (Vaarala, 2003). Os probióticos podem portanto representar um
importante estímulo, capaz de conduzir o sistema imune fetal que encontra-se desviado
para o eixo Th2 rumo a um novo equilíbrio, sem com isso representar um dano ao
organismo, como o que seria causado por um vírus ou bactéria patogênica.
17
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Um estudo de Pohjavuori e colaboradores (Pohjavuori et al, 2004) mostrou que as
bactérias probióticas são potencialmente benéficas para o amadurecimento do sistema
imune do lactente. Estes pesquisadores conduziram um estudo randomizado duplo cego,
no qual pacientes com suspeita de alergia a leite de vaca receberam, por 4 semanas,
Lactobacillus rhamnosus GG. Foi mostrado que as células mononucleares periféricas de
lactentes com alergia a leite de vaca apresentam uma produção diminuída de IFN-γ e
que esta produção aumenta no grupo que recebeu o probiótico. A alergia a leite de vaca
é considerada uma manifestação de uma falha no estabelecimento da tolerância oral, e
em geral se resolve por volta dos 2 anos, quando o intestino completa seu
amadurecimento. A exposição apropriada a micróbios orofecais pode diminuir a
polarização para Th2, que é predominante no período neonatal e assim contribui para
um desenvolvimento de um perfil de citocinas e resposta a antígenos alimentares mais
equilibrado.
Apesar destes efeitos benéficos do uso dos probióticos em uma fase precoce da
vida, estudos em adultos não mostraram melhora de alergia a pólen após consumo de
lactobacillus (Helin et al, 2002).
• ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS (PUFA)
Em 1997, Black e Sharpe assinalaram que alterações recentes no consumo de
gorduras pela população poderiam ter algum papel no aumento das alergias. Nos países
industrializados, como conseqüência de medidas de saúde pública tomadas para
diminuir o risco de doença coronariana, o consumo de gordura saturada (manteiga e
18
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
banha) foi diminuído e o consumo de n-6 PUFAs (presentes nas margarinas e óleos
vegetais) foi aumentado. Estes autores também sugeriram que o consumo diminuído de
óleo de peixe (atum fresco, arenque, cavala, truta e salmão) ou de produtos derivados do
óleo de peixe (óleo de fígado de bacalhau), rico em n-3 PUFAs, ácido
eicosapentaenoico (EPA) e acido docosahexaenoico (DHA) pode ter contribuído para o
aumento das alergias (Black & Sharp, 1997).
Os acidos graxos poliinsaturados (PUFA) mais comuns são o ácido linoléico (n-6)
e o ácido α-linoléico (n-3). O ácido linoléico é convertido em ácido araquidônico, que
pode ser subseqüentemente metabolizado pelas vias da ciclooxigenase e da
lipooxigenase para produzir prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos. O aumento da
produção de ácido araquidônico e de prostaglandina E2 aumenta a sensibilização
atópica. O ácido α-linoleico inibe o metabolismo do ácido linoléico uma vez que
compete pela mesma cascata enzimática (Devereaux & Seaton, 2005).
Outros nutrientes envolvidos nas alergias são os ácidos graxos. As dietas
ocidentais sofreram nas últimas décadas, um declínio no consumo de ácidos graxos
poliinsaturados anti inflamatórios (n-3 PUFAs), com um correspondente aumento do
consumo dos n-6 PUFAs. Alguns estudos utilizando suplementação de n-3 PUFA em
adultos com asma estabelecida tem sido desapontadores (Woods et al, 2000). No
entanto, isso pode significar apenas que, uma vez que a resposta imune esteja
estabelecida, pode já ser tarde demais. Com este entendimento, Dunstan e colaboradores
conduziram um estudo randomizado, controlado com 98 gestantes atópicas que
receberam n-3 PUFAs ou placebo desde a 20a. semana de gestação até o parto. Foi
encontrado uma produção diminuida de todas as citocinas neonatais (IL-5, IL-13, IL-10
19
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
e IFN-γ), o que sugere que a suplementação com óleo de peixe pode ter um papel
imunoregulador (Dunstan et al, 2003) e não um papel na polarização Th1 ou Th2.
Ainda existem poucos estudos de intervenção com PUFAs, e desta forma, as evidencias
ainda são insuficientes para recomendar ou não o uso de suplementação dietética com
PUFA.
Um estudo de Kankaanpää e colaboradores mostrou que o baixo consumo materno
de alimentos ricos em n-3 PUFA estava associada com uma razão aumentada de n-6/n-3
PUFA no leite materno tanto em mães atópicas como saudáveis (Kankaanpää et al,
2001).
• ANTIOXIDANTES
Um dos mecanismos propostos para os danos sabidamente causados pela falta de
substâncias antioxidantes na dieta seria um aumento na suscetibilidade da via aérea ao
dano oxidativo, resultando em inflamação e asma (Devereaux & Seaton, 2005). São
incluídos como tendo atividade antioxidante: a vitamina E, vitamina C, vitamina A,
selênio , flavonóides (obtidos de frutas frescas, como maçãs).
O consumo diminuído de vitamina E, selênio, flavonóides e frutas pelas mães
durante a gestação e pelas crianças pequenas pode ter o potencial de predispor a asma.
Isto poderia ocorrer não apenas por afetar o desenvolvimento da via aérea através do seu
efeito antioxidante mas também através de efeitos estimulantes da produção de citocinas
Th1, não relacionado com ação anti-oxidante (Devereaux & Seaton, 2005) .
20
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Alguns estudos têm se preocupado em avaliar o papel da vitamina C. Soutar e
colaboradores conduziram um estudo populacional, comparando indivíduos que
apresentavam hiperreatividade de vias aéreas com controles. Os resultados indicaram
que o menor percentil de consumo de vitamina C estava associado com um risco sete
vezes maior de ter hiperreatividade (Soutar et al, 1997). Em outro estudo, Bodner e
colaboradores fizeram um estudo de seguimento e compararam quem desenvolveu
sibilância na vida adulta com aqueles que não evoluíram para este quadro. Os riscos de
apresentar sibilância se mostraram aumentados 2 vezes mais para o percentil mais baixo
de consumo de vitamina C, e 5 vezes mais para o percentil mais baixo de consumo de
vitamina E (Bodner et al, 1999).
O selênio é um importante componente da glutationa-peroxidase, uma importante
enzima do metabolismo oxidativo. Recentes estudos no Reino Unido mostraram que o
consumo de selênio pela população diminuiu muito e, que existe uma deficiência
subclínica de selênio (Brown et al, 1997).
Vários estudos tem mostrado uma relação inversa, no qual o percentil mais alto de
consumo de vitamina E apresentaria uma menor chance de sensibilização atópica
(Fogarty et a;. 2000). Um estudo (Devereux et al, 2002) mostrou que a resposta
proliferativa a alérgenos, em células mononucleares de sangue de cordão umbilical,
estava significativamente aumentada quando havia história familiar de doença atópica
ou hábito de fumo pela mãe, e diminuída significativamente por uma dieta materna rica
em vitamina E.
21
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Segundo Devereaux & Seaton, o papel dos antioxidantes e dos ácidos graxos
poliinsaturados (PUFA) na asma são provavelmente complementares (Rubin et al,
2004).
A vitamina A é uma classe que inclui o retinol e mais de 600 carotenóides
estruturalmente relacionados, muitos dos quais tem forte atividade antioxidante (Rubin
et al, 2004). Dois estudos em crianças mostraram associações negativas entre asma e os
níveis séricos de alfa caroteno e beta caroteno (Harik-Khan et al, 2004, Seaton &
Devereux, 2000).
2.2. Estresse e Alergia
A. Histórico
A importância clínica das glândulas supra renais foi avaliada pela primeira
vez por Addison, que descreveu o curso fatal da insuficiência destas glândulas em
pacientes com destruição adrenal em 1849. Tais estudos, posteriormente publicados
(1855), foram logo expandidos por Brown-Séquard, que demonstrou que a
adrenalectomia bilateral era fatal em animais de laboratório. Logo a seguir, foi
evidenciado que a córtex da supra-renal, ao invés da medula, era a parte essencial para a
sobrevida nestas experiências; muitos estudos adicionais demonstraram que a córtex da
supra-renal regulava o metabolismo dos carboidratos e o equilíbrio hidroeletrolítico. Por
fim, os esforços empreendidos por vários pesquisadores levaram ao isolamento e
caracterização de uma ampla diversidade de adrenocorticoesteróides. O estudo dos
fatores reguladores do metabolismo dos carboidratos (denominados glicocorticóides)
22
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
culminou com a síntese da cortisona – o primeiro glicocorticóide biologicamente ativo a
ficar disponível em grande quantidade. Logo depois da cortisona sintética ter se
tornado disponível, Hench e colaboradores demonstraram a dramática melhora trazida
pelos glicocorticóides e do ACTH no tratamento da artrite reumatóide. Estes estudos
abriram caminho para o uso clínico dos corticoesteróides em uma ampla variedade de
estados patológicos (Goodman & Gilman, 1996).
Os corticoesteróides de ocorrência natural incluem três famílias de hormônios:
os glicocorticóides, os mineralocorticóides e os esteróides sexuais. Historicamente, as
ações dos glicocorticóides foram ligadas à regulação do metabolismo dos carboidratos,
mas como classe essas substâncias agem em todos os sistemas do organismo. Desde
1948, a hidrocortisona (cortisol), o principal hormônio produzido pela córtex adrenal na
espécie humana, é reconhecida como tendo potentes efeitos antiinflamatórios e
imunossupressivos quando administrado farmacologicamente (Asadullah et al, 2002).
B.
Estresse e os corticoesteróides
Através de mecanismos ainda não totalmente compreendidos, os
corticoesteróides dotam o organismo com a capacidade de resistir a circunstâncias
estressantes, como os estímulos nocivos e as alterações ambientais. As ações anti-
inflamatória e imunossupressora dos corticoesteróides, que fundamentam um dos
principais usos terapêuticos desta classe de substâncias, também propiciam um
mecanismo protetor no contexto fisiológico, pois muitos dos imunomediadores
associados à resposta inflamatória diminuem o tono vascular e poderiam levar ao
colapso cardiovascular, quando não contrapostos pelos corticoesteróides adrenais. A
23
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
taxa de produção diária de cortisol pode aumentar muito (pelo menos 10 vezes) no
quadro do estresse grave (Goodman & Gilman, 1996).
As modalidades de ação dos glicocorticóides (Sapolsky et al, 2000) durante o
estresse incluem: as ações permissivas (exercidas pelos glicocorticóides antes da
presença do estressor), supressivas (atribuídas ao aumento das concentrações de
glicocorticóides mediada pelo estresse), estimuladoras (associadas com o aumento da
concentração do glicocorticóide, iniciando-se 1 hora ou mais depois do aparecimento do
estressor) e preparativas (ações que não afetam a resposta imediata ao estressor, mas
modulam a resposta do organismo a um estressor subseqüente). As ações permissivas e
supressivas foram reconhecidas desde a década de 50. As ações estimuladoras foram
tidas como responsáveis pela proteção contra o estresse propiciado pelo aumento dos
níveis de glicocorticóides. Até onde sabemos, a designação de algumas ações dos
glicocorticóides como preparativas é nova. É raro, que os efeitos dos glicocorticóides
sobre algum sistema fisiológico consistam de apenas um destes tipos de ações. Em
princípio, todas as ações podem ser observadas dentro da ampla faixa de concentrações
de glicocorticóides. As ações permissivas são tipicamente associadas com níveis basais
de glicocorticóides (Sapolsky et al, 2000). Para ilustrar estas ações podemos recorrer a
uma analogia para melhor compreensão. Uma resposta imediata a um estressor, por
exemplo, um invasor armado, pode consistir em atirar no inimigo, o que corresponderia
à primeira onda de resposta hormonal ao estresse (catecolaminas, etc). Entre as ações
que poderiam modular esta resposta, as ações permissivas seriam aquelas que já
estivessem presentes no momento do ataque, como as armas de defesa. As ações
estimulatórias aumentam a resposta e são iniciadas após o ataque, e como exemplo,
24
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
poderíamos citar o recrutamento de combatentes ativos da reserva. As ações
supressivas, que contraem a resposta defensiva, poderiam corresponder ao
cancelamento de um ataque para evitar a autodestruição por “fogo amigo”. As ações
preparativas poderiam ser o desenvolvimento de ações designadas não para repelir o
invasor, mas para estabelecer medidas de sobrevivência a longo prazo, para o caso do
conflito durar muito tempo, ou se reapresentar como uma próxima invasão (como
desenvolver melhores sistemas de detecção).
Citando um outro exemplo, temos que as ações dos glicocorticóides estão
relacionadas de modo complexo àquelas de outros hormônios. Por exemplo, na ausência
de hormônios lipolíticos, o cortisol quase não tem efeito sobre a taxa de lipólise nos
adipócitos. Da mesma forma, na ausência de glicocorticóides, a adrenalina e a
noradrenalina apresentam efeitos apenas discretos sobre a lipólise. A administração de
uma pequena dose de um glicocorticóide, no entanto, potencializa acentuadamente a
ação lipolítica dessas aminas. Estes efeitos dos glicocorticóides, envolvendo as ações
conjugadas a outros reguladores hormonais, permissivos, e, mais provavelmente ,
refletem as alterações na síntese protéica induzidas pelos esteróides, as quais, por sua
vez, modificam a responsividade do tecido (Goodman & Gilman, 1996).
C. Corticoesteróides e alergia
Os corticoesteróides são de longe o tratamento mais eficaz disponível até o
momento para o controle das doenças alérgicas, incluindo asma brônquica, rinite
alérgica e dermatite atópica (Barnes, 2001). Entretanto, quando administrados por
25
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
tempo prolongado, seus efeitos benéficos podem ser sobrepujados pelos seus efeitos
colaterais, o que justifica os esforços em separar os efeitos benéficos dos
corticoesteróides dos seus efeitos colaterais indesejáveis. Do ponto de vista clínico,
uma boa maneira de reduzir o risco de efeitos colaterais é evitar estender o tratamento
além do tempo acima necessário. A terapêutica com glicocorticóides deve ser ajustada
a cada paciente individualmente (Asadullah et al, 2002). Outra possibilidade consiste no
uso de glicocorticóides mais seletivos com efeitos colaterais reduzidos. Isto reforça a
necessidade de um melhor entendimento das ações dos glicocorticóides para sua melhor
utilização.
Tendo em vista principalmente as ações antiinflamatórias do cortisol, foram
desenvolvidos vários glicocorticóides sintéticos. Na tabela 1 a seguir listamos as
potências relativas e doses equivalentes de alguns corticoesteróides naturais (como o
cortisol e a cortisona) e sintéticos (como a prednisona, prednisolona, triancinolona,
betametasona e dexametasona).
Drogas Potência
antiinflamatória
Duração de
ação
Dose
equivalente
Cortisol
1 Curta 20
Cortisona
0.8 Curta 25
Prednisona
4 Intermediária 5
Prednisolona
4 Intermediária 5
Betametasona
25 Longa 0.75
Dexametasona
25 Longa 0.75
Tabela 1. Potências relativas e doses equivalentes dos corticoesteróides representativos
(Goodman e Gilman, 1996).
* curta: meia-vida biológica de 8-12 horas. Intermediária: meia-vida biológica de 12-36 horas.
Longa: meia-vida biológica de 36-72 horas.
D. Mecanismo de ação dos corticoesteróides
26
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Os glicocorticóides ( Goodman & Gilman, 1996) interagem com proteínas
receptoras específicas nos tecidos alvo, regulando a expressão dos genes responsivos
aos corticoesteróides. O receptor de glicocorticóide (GR, do inglês glucocorticoid
receptor) situa-se predominantemente no citoplasma em uma forma inativa, até sua
associação ao ligante (glicocorticóide ou análogo inativo como o mifepristone). A
ligação do glicocorticóide ao receptor resulta em ativação do mesmo e subsequente
translocação para o núcleo. O GR inativo é encontrado como um complexo com outras
proteínas, inclusive (HSP)90 – membro da família de proteínas do choque térmico
induzidas pelo estresse; HSP70; e uma imunofilina de 56kDa – do grupo de proteínas
intracelulares que se ligam aos agentes imunossupressores ciclosporina e tacrolimus. A
HSP90, através de interações com o domínio de ligação de esteróides, pode manter a
conformação do GR de forma que favoreça a associação com estas proteínas que
servem de âncoras e que ajudam a reter o receptor no citoplasma na ausência de ligante.
Após fixação do ligante, a HSP90 e várias outras proteínas associadas sofrem
dissociação do GR, e o GR dirige-se para dentro do núcleo, onde pode interagir com
seqüências específicas de DNA dentro de regiões reguladoras dos genes-alvo.
Estas seqüências curtas de DNA presentes na região promotora, que são
identificadas pelo receptor de glicocorticóide ativado, são denominados elementos
responsivos ao glicocorticóide (GRE) e proporcionam a especificidade de alvo na
indução da transcrição gênica pelos glicocorticóides.
Esta ação sobre a transcrição pode ser inibitória ou estimulatória. Inicialmente
(Sapolsky et al 2000) a ligação do complexo hormônio-receptor ao GRE (os receptores
de mineralocorticóides, receptores de progesterona e de androgênios também se ligam
27
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
ao GRE) era tida como necessária, tanto para a ativação como a repressão. Esta visão
ainda é aceita para a ativação, entretanto a repressão é mediada através da ligação a
GRE negativos (nGREs); Neste caso, o receptor desloca ou interfere com fatores
positivamente ativos em sítios adjacentes.
Existem muitos casos nos quais o receptor de glicocorticóide ativado não
necessita ligar-se ao GRE ou ao nGRE, ou até mesmo ao ADN, para controlar a
transcrição. O receptor de glicocorticóide ativado, pode, por exemplo, se ligar
diretamente a um outro fator de transcrição que ative a transcrição através do seus
próprios sítios de ligação com o ADN. Pode haver tanto interferência como
cooperação, sendo a interferência o resultado mais freqüente. Dentre os fatores-alvo
mais conhecidos, destaca-se a proteína ativadora –1 (AP-1).
A interação do glicocorticóide com o receptor de glicocorticóide (GR) pode
inibir a síntese de certas proteínas, através da redução na estabilidade do ARNm
correspondente, ao induzir a transcrição de genes que codificam ribonucleases
específicas. Este é o mecanismo pelo qual o glicocorticóide inibe a síntese de GM-
CSF, que tem um papel importante na sobrevida das células inflamatórias nos sítios de
inflamação (Barnes, 1998).
Os glicocorticóides podem atenuar ou suprimir a inflamação através do aumento
da síntese de várias proteínas antiinflamatórias. Eles aumentam a síntese de
lipocortina-1, uma proteína de 37 kDa que inibe a fosfolipase A2 e, conseqüentemente,
inibe a liberação do ácido araquidônico e a sua subseqüente metabolização a produtos
das vias da lipoxigenase e cicloxigenase, como os leucotrienos, tromboxanos e
prostaglandinas, além das lipoxinas. O bloqueio da fosfolipase A2 impede igualmente
28
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
a produção de fator ativador de plaquetas (Barnes et al, 1998). Nas células epiteliais,
os glicocorticóides também aumentam a expressão da enzima endopeptidase neutra, que
degrada peptídeos inflamatórios, como a Substância P, a bradicinina e a endotelina-1.
Pacientes com asma, tratados com glicocorticóides inalados apresentam níveis mais
altos de expressão de endopeptidase neutra do que controles não tratados (Sont et al,
1997).
Os glicocorticóides aumentam a expressão de receptores β2 adrenérgicos
através do aumento da taxa de transcrição gênica. Isto pode ser relevante na asma,
impedindo a perda de receptores β2 adrenérgicos que ocorre após o tratamento
prolongado com agonistas β2 (Barnes et al, 1998).
Os glicocorticóides inibem a transcrição de várias citocinas que são relevantes
nas doenças alérgicas, incluindo IL-1β, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, TNF-α, GM-CSF e
quimiocinas que atraem células inflamatórias para os sítios de inflamação, incluindo IL-
8, RANTES, MCP-1, MCP-3, MCP-4, MIP-1α e eotaxina (Barmes et a;l 1998). Na
inflamação alérgica, a expressão das citocinas IL-4 (importante para síntese de IgE) e
IL-5 (importante para inflamação eosinofílica) também está inibida pelos
glicocorticóides (Barnes et al, 1998).
As moléculas de adesão têm um papel fundamental no tráfego de células
inflamatórias para os sítios de inflamação. A expressão de muitas moléculas de adesão
nas células endoteliais é induzida por citocinas como a IL-1β e o TNF-α, e como já
vimos, os corticoesteróides inibem a produção destas citocinas. Os glicocorticóides
podem também ter um efeito inibitório direto sobre a expressão de moléculas de adesão,
como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a E- selectina, através da inibição
29
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
da transcrição gênica (Barnes et al, 1998). Um estudo de Juan e colaboradores (Juan et
al, 1999) avaliou o efeito da dexametasona em cultura de eosinófilos purificados
derivados do sangue periférico, no que se refere às moléculas de adesão. Este estudo
demonstrou que ICAM-3 encontra-se altamente expresso em eosinófilos em repouso.
Neste estudo não houve alteração de : LFA-1, Mac-1 ou CD18 em presença de
dexametasona na concentração de 10
-6
M. Neste estudo, não foi mostrado efeito em
ICAM-1 e ICAM-2; houve contudo uma inibição significativa da expressão de ICAM-3
e um aumento na expressão de L-selectina .
Os glicocorticóides diminuem a sobrevida de algumas células inflamatórias como
os linfócitos T e os eosinófilos. A sobrevivência do eosinófilo é dependente da
presença de citocinas como IL-5 e GM-CSF. A exposição ao glicocorticóide em
determinadas condições inibe a produção destas citocinas e também leva a morte celular
programada ou apoptose. Contudo, quantidades mínimas destes fatores de sobrevida
são suficientes para antagonizar a indução de apoptose pelos glicocorticóides.
O mecanismo molecular pelo qual o glicocorticóide induz a apoptose em
eosinófilos e linfócitos T ainda não é bem compreendido. Em contraste, os
glicocorticóides diminuem a apoptose o que tem importantes implicações na resolução
da inflamação aguda de neutrófilos (Meagher et al, 1996).
Uma das isoformas de sintase de óxido nítrico (Nos-2, iNOS) é induzida por
citocinas inflamatórias, resultando em grande aumento da produção de óxido nítrico. O
óxido nítrico pode aumentar o fluxo sanguíneo regional e a exsudação de plasma e
pode amplificar a resposta inflamatória. Segundo algumas hipóteses pode contribuir
para a inflamação eosinofílica na asma, mudando o equilíbrio rumo ao perfil Th2,
30
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
através da sua ação quimiotática para eosinófilos, paralelamente ao aumento da
sobrevida de eosinófilos (Yates et al, 1995). A indução de iNOS é inibida pelos
glicocorticóides, que podem bloqueá-la indiretamente através da inibição da transcrição
de NF-κB.
E. Estudos experimentais
Os glicocorticóides apresentam uma série de efeitos tanto in vivo como in vitro,
que parecem favorecer os mecanismos responsáveis pelas reações alérgicas
Examinaremos a seguir algumas evidências recentes de efeitos que favorecem nesta
ordem: a) a produção de eosinófilos; b) a produção de anticorpos anafiláticos; e c) a
produção de citocinas Th2.
Em 2000, um estudo realizado em camundongos normais e alérgicos (Gaspar
Elsas et al, 2000a) demonstrou que a dexametasona, um representante sintético do grupo
dos glicocorticóides, apresentava efeitos paradoxais quando adicionado às culturas de
medula óssea. Neste estudo, a dexametasona aumentou, de forma dose-dependente, o
número total de colônias mielóides formadas, assim como o tamanho das colônias
eosinofílicas e a fração de colônias mielóides que foram comprometidas com a
produção de eosinófilos. A dexametasona, em concentrações ainda mais baixas,
estimulava fortemente a diferenciação terminal de eosinófilos de camundongo a partir
da medula óssea cultivada na presença de IL-5. Este foi o mais recente e detalhado de
uma série de relatos de vários grupos (revisto em Gaspar Elsas et al, 2000b) mostrando,
em diferentes condições, estimulação da eosinopoiese por glicocorticóides.
31
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Um estudo mais recente (Debierre-Grockieco et al 2003) mostrou que a
dexametasona no curso da produção de eosinófilos em cultura, aumenta a proliferação e
diferenciação de células imaturas, enquanto aumenta a morte celular de células
maduras. Neste estudo, os autores sugerem que este efeito seja devido a uma ação sobre
STAT 5 ( transdutor de sinal e ativador de transcrição 5), que é um fator de transcrição
envolvido na proliferação, diferenciação e sobrevida das células hematopoiéticas que
interage com o receptor de glicocorticóide.
Um outro estudo (Miranda Buitenhuis et al, 2003) mostrou que STAT5 tem um
papel muito importante na diferenciação eosinofilica a partir de celulas CD34+
derivadas de sangue de cordão umbilical humano No sistema ex vivo, a expressão e a
ativação de STAT5 se mostrou bastante alta nas fases iniciais de diferenciação e
encontra-se diminuida nas fases finais de diferenciação o que poderia explicar o efeito
estimulador da dexametasona sobre as células imaturas e pró apoptótico sobre as células
maduras.
Um estudo avaliou o efeito do corticoesteróide in vivo na produção de IgE.
Neste estudo 10 pacientes que tiveram crise de asma receberam 20mg de prednisona e
todos apresentaram um aumento da IgE serica após o curso de prednisona. Além disso o
estudo mostrou que as células mononucleares do sangue periférico destes pacientes
produzizam níveis maiores de IgE in vitro quando a IL-4 exógena era adicionada (Zieg
et al, 1994). As bases moleculares para estes efeitos paradoxais dos corticoesteróides na
atopia foram pelo menos em parte elucidadas por Jabara et al., 2001, que demonstraram
que a síntese de IgE induzida pelo corticoesteróide, na presença de IL-4, depende de um
aumento da molécula coestimulatória ligante de CD40 (CD40L), uma glicoproteína
32
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
transmembrana pertencente à superfamília do TNF. O CD40L é normalmente expresso
em linfócitos T ativados, que interagem com uma glicoproteína de superfície
denominada CD40 que é constitutivamente expressa em linfócitos B. A interação CD40
– CD40L é essencial para a indução da síntese de IgE pela IL4 e IL-13. Foi estabelecido
que o aumento da expressão de CD40L pela hidrocortisona envolve interação com GR e
translocação para o núcleo, onde o receptor vai agir, aumentando a transcrição de
RNAm para CD40L (Jabara et al, 2001). Os efeitos supressivos sobre a IL-4 e CD40
ocorrem em menores concentrações do que aqueles efeitos que envolvem aumento da
transcrição de CD40L (Barnes, 2001). A concentração de hidrocortisona que resulta
em ótima expressão de CD40L (10
-6
M) está na faixa dos níveis de cortisol sérico
encontrados em humanos sob condições de stress (Jabara et al, 2001).
Um estudo de Ramirez e colaboradores (Ramirez et al, 1996), mostrou que
células T de rato, ativadas in vitro na presença de dexametasona, sintetizavam uma
quantidade maior de RNAm para IL-4, IL-10 e IL-13, enquanto a síntese de interferon
gama e fator de necrose tumoral alfa encontra-se diminuída globalmente, estes efeitos
da dexametasona favorecem um perfil TH2 .
F. Relação entre os efeitos do estresse e a propensão às reações alérgicas
Uma das mais comuns definições psicológicas de estresse têm sido de que o
estresse ocorre quando a demanda do ambiente ultrapassa a capacidade adaptativa
do indivíduo ou capacidade de lidar com a demanda (Cohen et al, 1991). Devido ao
fato de que a mesma demanda ambiental poder produzir respostas variáveis tanto
33
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
do ponto de vista emocional, comportamental e psicológico, tem sido sugerido que
é essencial considerar a perspectiva subjetiva daquele evento supostamente
estressante. Desta forma, para que o evento adverso seja estressante ele tem que ser
considerado pelo indivíduo como algo ameaçador ou impossível de manejar.
Um estudo prospectivo de 18 meses envolvendo crianças com asma que
foram submetidas a uma experiência negativa de vida (ex; morte de um membro
próximo da família) mostrou um risco aumentado de crise de asma de cerca de 2 x
quando comparado com o grupo controle. É importante ressaltar que o impacto de
um evento negativo mostrou-se aumentado quando no contexto de estresse crônico
(Sandberg et al, 2000).
Um estudo prospectivo realizado com uma coorte de 150 crianças em risco
de ter asma (pelo fato de a mãe ter asma) mostrou que duas variáveis estavam
altamente associadas com a presença de asma aos 6 e 8 anos: a IgE sérica
aumentada aos 6 meses de vida e a taxa de dificuldades parentais avaliada quando o
RN tem 3 semanas de vida (Klinnert et al, 2001). Este estudo sugere que a história
natural da asma, uma das mais importantes doenças alérgicas, pode ter seu início
em uma fase bem precoce da vida, em um momento onde o sistema imune está se
desenvolvendo e ao mesmo tempo interagindo com fatores ambientais. O fato da
avaliação de eventos estressantes vivenciados pelos pais correlacionar-se
fortemente com a presença de asma aos 6 anos, nos remete a pensar novamente no
corticoesteróide, um dos principais hormônios do estresse como possível
modulador desta correlação.
34
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Um outro estudo realizado com 20 universitários alérgicos (teste cutâneo
positivo para inalantes e história de broncoespasmo) avaliou o estresse psicológico
associado com os exames finais e a resposta alérgica a alergenos inalados (Liu et
al, 2002). Este estudo mostrou que o período de exames finais e provavelmente o
estresse associado com este evento estava associado com um aumento da eosinofilia
no escarro e nos níveis de EDN ( neurotoxina derivada do endotélio) às 6 e 24horas
após a provocação com alergeno, refletindo o aumento dos eosinofilos na via aérea
Já é conhecido que sob a exposição a muitas formas de estresse agudo ocorre
a ativação do eixo HPA e do eixo SAM ( simpatico-adrenal-medular) levando a um
aumento da secreção de hormônios como cortisol, adrenalina e noradrenalina. Altos
níveis de cortisol diminuem a inflamação nas vias aéreas. De forma similar os
agonistas beta adrenergicos, como a epinefrina são potentes broncodilatadores
(Chen and Miller 2007). Também é conhecido que certos estressores, em especial
aqueles graves e crônicos, podem suprimir a função do sistema imune celular em
humanos Em conjunto, estas observações poderiam apoiar a idéia de que
experiências estressantes devem atenuar, em vez de exacerbar, as crises alérgicas.
Entretanto, os achados nos estudos de asma sugerem ao contrário que, o
estresse em geral piora as crises alérgicas. Várias hipóteses foram levantadas para
explicar esta associação.
Um estudo (Millet et al, 2007) mostrou que quando o estresse crônico
começa, ocorre uma ativação inicial do eixo HPA resultando em uma elevada
concentração circulante de cortisol e ACTH; entretanto, à medida que o tempo
passa, esta atividade diminui e a secreção de cortisol fica a níveis abaixo do
35
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
normal, o que sugere que estressores crônicos podem levar o eixo HPA a ficar
menos responsivo.
Um outro estudo (Miller and Chen, 2006) mostrou que em crianças asmáticas
que vivenciaram simultaneamente condições de estresse agudo e crônico
apresentaram uma diminuição de 5,5 vezes no RNAm para receptor de
glicocorticoide (GR) na população de leucócitos.
Este estudo encontra apoio em um outro estudo envolvendo pacientes com
dermatite atopica, publicado por Buske-Kirschbaum e colaboradores em 2002. . A
dermatite atópica é uma doença inflamatória da pele de curso crônico, evoluindo
com períodos de exacerbação, cujos principais sintomas são a pele seca, eczematosa
e o prurido intenso (Leung et al, 2000). A importância do estresse na manutenção e
nas exacerbações da dermatite atópica é evidenciada por um estudo (King and
Wilson, 1991) que encontrou uma correlação significativamente positiva entre
níveis elevados de estresse interpessoal e exacerbações de dermatite atópica 24h
depois. Neste estudo, foi documentada a eficácia das intervenções psicoterapicas
na redução dos sintomas associados à dermatite atópica. Um outro estudo (Buske-
Kirschbaum et al, 2002) procurou estudar o eixo hipotálamo-hipofisario- adrenal,
em virtude deste ser uma das principais vias pela qual o sistema nervoso central
exerce seu controle sobre o sistema imune em condições estressantes. Neste estudo,
os autores mostraram que os pacientes que sofrem de dermatite atópica, apresentam
um eixo hipotálamo-hipofisário-adrenal com baixa responsividade, ou seja,
apresentam uma resposta atenuada de cortisol desencadeada pelo estresse e
ressaltam que a disfunção do eixo ocorre a nível suprapituitario, uma vez que, a
36
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
resposta de ACTH ao estresse também encontra-se diminuida . Os autores discutem
a possibilidade de que o uso prolongado de corticoide inalado ou oral, assim como
o tratamento com esteróides tópicos em altas doses (Matsuda et al,2000), possa
resultar em um eixo HPA com baixa responsividade, como apontado por alguns
autores (Clark & Lipworth 1997).
Um estudo de Ball (2006) ressalta que, embora a relação entre alterações
funcionais do eixo hipotálamo-hipofise-adrenal e as doenças alérgicas ter sido
primariamente explicada como resultado do estresse associado à doença crônica,
trabalhos recentes mostraram que as alterações do ciclo circadiano do cortisol
podem preceder a doença alérgica. Desta forma, respostas aumentadas de liberação
de cortisol endógeno a estímulos estressores podem predispor indivíduos
suscetíveis à atopia e à doenças alérgicas, através do desvio do sistema imune para
uma resposta predominantemente TH2, aumentando a produção de IgE total e
alergeno especifica e/ou inibindo a tolerância imune periférica (Ball, 2006).
Finalmente, vários estudos sugerem que a exposição a altas doses de cortisona
pode desviar o sistema imune em direção a uma resposta predominantemente Th2
(Marshall and Agarwal, 2000). Em um estudo com estudantes universitários
asmáticos, Liu e col mostraram que no período de exames finais , a razão IFN-γ/IL-
5 (ou seja, desvio para resposta Th2) estava bastante aumentada e se correlacionava
com o número absoluto de eosinófilos no escarro após 24 horas de provocação
alergenica (Liu et al, 2002) .Tendo em vista o valor preditivo dos níveis de IgE aos
6 meses de vida para asma na infância (Klinnert et al, 2001), este mecanismo deve
ser importante .
37
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Com base nestes estudos é possível que o estresse crônico propicie as reações
alérgicas através de uma diminuição na quantidade receptores de glicocorticoides
em leucócitos, através da diminuição da resposta do eixo HPA ao estresse, e do
desvio do sistema imune para uma resposta Th2.
G. .Importância dos corticoesteróides no amadurecimento pulmonar fetal
O uso de corticoesteróide pré natal consagrou-se em 1995 com a
publicação do consenso do National Institutes of Health, a respeito dos efeitos dos
corticoesteróides na maturação pulmonar (Crowley, 2003). A administração de
corticoesteróides para mulheres antes de um parto prematuro está associada a uma
redução significativa na mortalidade e na incidência de síndrome de insuficiência
respiratória assim como de hemorragia intracraniana nos recém nascidos (Gibson,
2002). Foi realizada uma revisão dos benefícios e riscos do uso de corticoesteróide
antenatal para maturação fetal o que gerou algumas recomendações dos seus
revisores, o Comitê de Medicina Materno-fetal da Sociedade de Obstetras e
Ginecologistas do Canadá (SOGC). Estas recomendações (Crane et al, 2003) da
SOGC são: toda gestante entre 24-34 semanas de gestação que estiver em risco de
parto prematuro deve ser considerada candidata para o tratamento antenatal com
curso único de corticoesteróide; O tratamento deverá consistir de duas doses de
12mg de betametasona IM com intervalo de 24horas, ou 4 doses de 6mg de
dexametasona IM com intervalo de 12horas. Como não existem dados que garantam
a eficácia e segurança de cursos repetidos de corticoesteróides, isto não deve ser
38
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
feito, devendo ficar reservado para gestantes participantes de ensaios controlados
randomizados. Visto que vários experimentos e estudos clínicos (Lee et al, 2006)
sugeriram um risco aumentado para dano neurológico com o uso da dexametasona
quando comparado com a betametasona, a betametasona perinatal deve ser a
primeira escolha.
2.3 Eosinopoiese
A inflamação eosinofílica é um dos principais fatores na patogênese das doenças
alérgicas, incluindo a asma brônquica. Um papel importante é atribuído ao eosinófilo
pelo seu potencial de causar dano aos tecidos (Popken-Harris et al, 1998). A ativação
dos eosinófilos envolve a liberação de ânions superóxido, mediadores lipídicos e de
componentes granulares tóxicos, como por exemplo, a proteína básica principal, a
peroxidase eosinofílica, a neurotoxina derivada do endotélio, a proteína catiônica
eosinofílica e a proteína do cristal de Charcot-Leyden (Mahmudi-Azer et al, 2000).
Os eosinófilos maduros se desenvolvem a partir de células hematopoiéticas
pluripotenciais (progenitores hematopoiéticos) que apresentam a glicoproteína CD34 na
sua superfície. Tem sido demonstrado um aumento do número de células CD34+ tanto
no sangue como na medula óssea de indivíduos asmáticos atópicos, quando comparado
com indivíduos normais (Kuo et al, 2001).
Recentemente, vários achados tem demonstrado uma contribuição das células
progenitoras inflamatórias para inflamação das vias aéreas na asma. Um destes é a
presença aumentada de unidades formadoras de colônias (CFU) para
eosinófilos/basófilos no sangue de indivíduos alérgicos (Cyr & Denburg, 2001). Estes
números flutuam de acordo com a exacerbação e resolução da asma clínica e estão
39
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
aumentados após a inalação alergênica em associação com o desenvolvimento de
hiperresponsividade das vias aéreas (Kim et al, 1999). O aumento de células
progenitoras no sangue periférico e na medula óssea em resposta à inalação alergênica
provavelmente contribui para o acúmulo de células inflamatórias maduras nas vias
aéreas de indivíduos asmáticos, através do aumento da produção e liberação destes
progenitores pela medula óssea (Kim et al, 1999).
Até recentemente, era difícil e dispendioso estudar a linhagem eosinofílica no
homem. Eosinófilos maduros podiam ser isolados no sangue periférico em gradiente
de densidade, mas o rendimento era baixo, a pureza variável e o custo elevado. Estes
fatores eram influenciados de forma decisiva pelos números circulantes de eosinófilos
no sangue coletado. Por esta razão, a maior parte dos estudos era realizada com
eosinófilos purificados a partir do sangue de doadores com diversas formas de
eosinofilia, que não correspondem necessariamente ao encontrado no sangue de
indivíduos sadios. A eosinopoiese, por outro lado, só podia ser estudada em cultura de
medula óssea, o que necessitava de procedimentos invasivos, devido ao difícil acesso ao
compartimento medular.
Um estudo recente, contudo, demonstrou que as células mononucleares de
sangue de cordão umbilical humano, quando cultivadas na presença das citocinas IL-3 e
IL-5 por um tempo relativamente longo, dão origem a células que se coram como
eosinófilos, apresentando características similares aos eosinófilos humanos do sangue
periférico após ativação com fMLP (Zardini et al, 1997) . Portanto, este sistema pode
ser considerado um modelo de maturação eosinofílica in vitro, potencialmente útil para
a investigação das atividades biológicas dos eosinófilos. A maior vantagem da
40
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
utilização de células mononucleares do sangue de cordão umbilical consiste na obtenção
de uma quantidade maior de eosinófilos que a disponível na circulação sanguínea de
indivíduos sadios. Os eosinófilos cultivados a partir de células mononucleares de
sangue de cordão umbilical tem capacidades funcionais similares em testes de
desgranulação e quimiotaxia, às dos eosinófilos maduros, mas não formam os grânulos
cristalóides maduros (Ohashi et al, 1999; Popken-Harris et al, 1998).
2.4. CITOCINAS EOSINOPOIÉTICAS
GM-CSF
GM-CSF foi primeiramente isolado de pulmoes murinos e mais tarde de uma
linhagem leucemica de celulas T. O GM-CSF recombinante ou purificado age na via de
diferenciação de granulócitos (que incluem neutrofilos e eosinofilos) e macrófagos,
estimula a formação de colônias de megacariocitos e provavelmente aumenta a
formação de colônias eritroides na presença de eritropoietina. Possui também muitas
atividades sobre as células maduras da via de diferenciação GM. Estimula a síntese de
membrana e proteínas nucléicas em granulocitos murinos, aumenta a adesão de
neutrofilos e expressão de glicoproteinas de adesão de superfície, inibe a migração de
neutrofilos, estimula a atividade citotoxica e fagocitica contra bactérias, parasitas e
células tumorais recobertas de anticorpos, e aumenta a sobrevida de neutrofilos e
eosinofilos humanos in vitro. Também tem efeitos indiretos, aumentando a produção
de superoxido em resposta a componentes quimiotaticos bacterianos, e aumenta a
liberação de acido araquidônico e a síntese de leucotrieno B4 em resposta a ionóforo de
cálcio (Barnes et al, 1998, Abbas et al, 1997) .
41
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Interleucina 3
A interleucina 3 (IL-3) também conhecida como fator estimulador de colônia
multilinhagem (Multi-CSF), é um produto de peso molecular 20-26 kDa das células T
CD4+, tanto do subtipo Th1 como Th2, que age sobre a maioria dos progenitores
imaturos da medula óssea e promove a expansão de várias linhagens mielóides.(Abbas
et al, 1997). A IL-3 recombinante parece ser um fator ativador para eosinofilos mas não
para neutrofilos. A administração de IL-3 no camundongo induz ao aumento de 10
vezes da eosinofilia sanguinea e de 2-3 vezes nos números de granulocitos e monócitos
(Barnes et al, 1998).
Interleucina 5
A IL-5 foi originalmente identificada de forma independente como um fator
envolvido em fenômenos inteiramente distintos: a) como um fator estimulante de célula
B que mediava a proliferação e diferenciação de linfócitos B e induzia secreção de
IgM (B cell Differentiation Factor II, ou abreviadamente, BCDF-II); b) como um fator
liberado em grande quantidade por linfócitos T de camundongos infectados com o
helminto Mesocestoides corti, que induz intensa eosinofilia no sangue e nos tecidos, e
que estimulava a medula óssea a produzir grande quantidade de eosinófilos em cultura
(Eosinophil Differentiation Factor, Eosinophil CSF). Além dos linfócitos Th, uma das
mais importantes fontes de IL-5 na inflamação alergia advém de mastócitos e
eosinófilos. A IL-5 interage com um receptor especifico que consiste em um
heterodimero formado pelas cadeias IL-5rα e IL-5rβ. A subunidade β é compartilhada
com os receptores de GM-CSF e IL-3 (Takatsu, 1992). Hoje, a IL-5 está firmemente
42
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
estabelecida como o principal fator eosinopoiético em condições fisiológicas, e o sua
interação sinérgica com GM-CSF e IL-3, promovendo a eosinofilopoiese, está bem
documentada.
Após sua clonagem e geração de proteína purificada, a IL-5 humana mostrou ter
mínima atividade sobre os linfócitos B; em camundongos, a IL-5 parece desempenhar
um papel significativo na produção de anticorpos, consistente com a atividade de
BCDF-II originalmente descrita. Entretanto, a IL-5 induz o amadurecimento de uma
população homogênea de eosinófilos quando acrescida a cultura de precursores de
medula óssea (Clutterbuck et al 1989), e os camundongos transgênicos para a expressão
constitutiva de IL-5 desenvolvem intensa eosinofilia (Tominaga et al, 1991). Além de
sua capacidade de estimular a produção de eosinófilos, a IL-5 é quimiotática para
eosinófilos e capaz de ativar eosinófilos maduros. A importância da IL-5 nos distúrbios
alérgicos encontra suporte pela demonstração de níveis séricos aumentados de IL-5 na
síndrome hipereosinofílica, síndrome eosinofilia-mialgia e após desafio alergênico
endobrônquico (Borish and Rosenwasser, 1996).
Também pode atuar promovendo o crescimento e diferenciação de linfócitos B,
desempenhando um papel importante na síntese de imunoglobulina, especialmente IgA
(Barnes et al, 1998) .
3- Relevância
Asma e alergia são problemas de saúde pública em escala mundial . Sua
incidência está aumentando em todo o mundo, de forma explosiva nas últimas duas
43
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
décadas (Warner et al, 1990) . Através do estudo de comparações globais não se
encontra um fator de risco já conhecido para o desenvolvimento da asma, que, sozinho
possa ser responsabilizado por este aumento de prevalência (Beasley et al, 2000). Desta
forma, tornam-se necessários estudos que avaliem a contribuição de outros fatores para
o aumento das doenças alérgicas. O presente estudo visa ajudar a elucidar o impacto dos
corticoesteróides, que constituem as drogas atualmente mais utilizadas para o
tratamento das doenças alérgicas, e que são igualmente mediadores centrais das reações
de estresse, sobre as células hematopoiéticas, em particular as precursoras da linhagem
eosinofílica.
O estudo de células hematopoiéticas em através do sangue de cordão umbilical
representa uma conquista para a pesquisa em saúde da criança e da mulher. O tecido-
alvo representa uma interface crítica onde os efeitos de diferentes fatores que
influenciam a mãe, a criança ou ambos podem ser criteriosamente avaliados (Thorton &
Vance, 2002). A literatura internacional é rica em estudos sobre hematopoiese
utilizando sangue de cordão umbilical (Zardini et al, 1997; Velásquez et al, 2000,
Scepek et al, 1997). Por outro lado, este sistema experimental se harmoniza
especialmente com a temática multidisciplinar da interação mãe-filho, que é
indissociável da missão institucional do Instituto Fernandes Figueira. Valorizando-se
este modelo, poderemos estabelecer uma ferramenta preciosa para futuros estudos que
envolvam efeitos de medicamentos na mãe e na criança. Principalmente se entendermos
esse momento do nascimento e os primeiros meses de vida como um período de janela
imunológica onde possíveis intervenções possam ter um impacto significativo.
44
INTRODUÇÃO
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Durante a elaboração da dissertação de Mestrado defendida em 2003, obtivemos
resultados preliminares que apontaram para uma maior sensibilidade das células
hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical humano à ação estimulatória
da dexametasona, diferentemente do que ocorre em medula óssea murina. Para nossa
surpresa, o efeito no aumento da porcentagem de colônias eosinofílicas, com alto
significado estatístico foi encontrado na concentração de dexametasona mais baixa em
nosso estudo (10
-11
M), o que não era esperado pois os efeitos dos glicocorticóides
raramente são observados em concentrações tão baixas. A eficácia de concentração tão
baixa em um teste de formação de colônias torna importante a construção de uma curva
dose-resposta detalhada que consiste um dos objetivos do presente estudo.
Os resultados apresentados aqui documentam somente o efeito dos
corticoesteróides (dexametasona e hidrocortisona) in vitro . O estudo dos efeitos dos
corticoesteróides in vivo poderia ser feito utilizando-se sangue de cordão umbilical de
gestantes que receberam corticoesteróide no período perinatal. Ao iniciar o estudo, era
nosso objetivo incluir pacientes nesta situação. O uso de corticoesteróide perinatal, cuja
indicação visa acelerar a maturação pulmonar do concepto cuja gestação deva ser
interrompida antes do termo, ocorre com freqüência mais elevada na Maternidade do
Instituto Fernandes Figueira pelo fato desta se constituir em maternidade de risco.
Contudo, o número de amostras obtidas no período de desenvolvimento do projeto, que
correspondessem a esta descrição foi muito menor do que o de amostras de parto normal
obtidas. Por esta razão, atendendo a prioridades práticas, nos concentramos inicialmente
no estudo dos efeitos in vitro, deixando para estudos futuros o estabelecimento de uma
comparação entre os efeitos obtidos in vitro e possíveis efeitos in vivo.
45
OBJETIVOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
II- OBJETIVOS
OBJETIVOS GERAIS
Estudar o efeito de glucocorticóides (dexametasona, budesonide e hidrocortisona)
sobre a produção de eosinófilos em cultura de células hematopoiéticas derivadas do
sangue de cordão umbilical humano na presença de IL-5, IL-3, e GM-CSF.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Avaliar o efeito dos glucocorticóides sobre a eosinopoiese em cultura de
sangue de cordão umbilical, caracterizando a relação dose-resposta e a
cinética dos efeitos observados.
• Analisar o envolvimento do receptor de glucocorticóide nas ações sobre
produção de eosinófilos.
• Avaliar os possíveis efeitos da atopia materna sobre a resposta à
dexametasona no sistema.
46
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
III- METODOLOGIA
1. População de Pacientes Estudados e Critérios de Inclusão
Foi utilizado sangue de cordão umbilical (cerca 15-20ml de sangue por paciente)
obtido na hora do parto, após a obtenção do consentimento livre e informado da
gestante. Além da assinatura do termo consentimento livre e informado, as gestantes
foram submetidas a uma anamnese (roteiro em anexo). As coletas foram realizadas em:
Maternidade Oswaldo Nazareth (Praça XV) e Maternidade do Instituto Fernandes
Figueira, com aprovação de seus respectivos comitês de ética (em anexo) .
2. Critérios de Exclusão
As amostras de sangue de cordão umbilical não foram colhidas em pacientes
portadores de doenças neoplásicas, distúrbios linfoproliferativos, imunodeficiências,
infecções e pacientes que estavam em uso de droga imunossupressora. Era de grande
interesse, na fase inicial do estudo, obter um grupo de pacientes que haviam utilizado
corticoesteróide perinatal visando acelerar a maturidade pulmonar do recém nato.
Entretanto, a maior parte dos partos prematuros assistidos, nos quais a mãe havia
utilizado corticoesteróide perinatal, apresentavam infecção e por esta razão foram
excluídos deste estudo. No presente estudo, não foram incluídos resultados de pacientes
em uso de corticoesteróide perinatal sem infecção, os quais constituirão, futuramente, o
objeto de uma análise separada.
47
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
3. Estudos com células hematopoiéticas
3.1 Materiais
3.1.1. Drogas
Foram utilizadas, nas culturas de células, as seguintes drogas: dexametasona (ref.
D8893, Sigma chemical co), hidrocortisona (ref. 4001, Sigma chemical co), budesonide
(Foraseq®), mifepristone (Ref. M8046, Sigma chemical co). A dexametasona foi
diluída em RPMI . A solução de estoque mantida em congelador foi de 10
-4
M. As
concentrações de uso foram mantidas em geladeira a 4
o
C. O conteúdo de 1 cápsula de
budesonide contendo 400 μg (Foraseq®, Novartis) foi dissolvido em RPMI até uma
concentração 10
-4
M, sendo a solução esterilizada por filtração e mantida em
congelador, sendo as diluições de uso preparadas no momento da cultura e guardadas a
4
o
C. A hidrocortisona foi diluída em etanol PA e filtrada em milipore. A solução de
estoque mantida em congelador foi de 10
-3
M. As concentrações 10
-5
M, 10
-7
M , 10
-9
M
foram diluídas em RPMI e mantidas em geladeira a 4
o
C. Onde indicado, foi utilizado
mifepristone (RU 486, ref. M 8046, Sigma chemical co), a partir de uma solução
estoque 10
-2
M em álcool PA, mantida em congelador. A concentração de uso de 10
-5
M
foi mantida em geladeira a 4
o
C.
3.1.2 Anticorpos
Foram utilizados, para separação (“sorting”) de células CD34+ e para citometria de
fluxo, os seguintes anticorpos contidos no MACS CD34 Progenitor Cell Isolation Kit,
48
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Miltenyi Biotec : reagente A1 (Ig humana para o bloqueio da ligação a FcR), reagente
A2 (anticorpo monoclonal anti CD34 conjugado ao hapteno) e reagente B (esferas
magnéticas conjugadas com um anticorpo anti hapteno)
3.1.3 Citocinas
Foram utilizadas as citocinas: rhIL-3 (Pharmingen 19631 T), rhIL-5 ( ref.205- IL-005
R&D) e GM-CSF (ref. 19741, pharmingen).
3.2 Cultura de células hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical
3.2.1 Cultura de células mononucleares de sangue de cordão umbilical
Foram coletados 15-20 ml de sangue de cordão umbilical heparinizado (heparina
livre de conservantes) logo após o parto. O sangue foi diluído com meio RPMI
suplementado com 2mM de L-glutamina, 100U/ml de estreptomicina e 100U/ml de
penicilina, na razão de 1:1, e em seguida centrifugado a 450xg por 40 minutos sobre um
gradiente de Lymphoprep™ (Nycomed), carregado na proporção de 2:1 entre sangue e
meio de separação. Ao final da centrifugação, o anel de células mononucleares foi
coletado e transferido para outro tubo, sendo lavado 2 vezes com meio RPMI a 500xg
por 10 minutos. O depósito celular final foi ressuspendido em 3ml de RPMI. As células
foram contadas em Câmara de Neubauer, após uma diluição 1:10 em solução de Turk
para contagem de células nucleadas totais. As culturas de células mononucleares
derivadas de sangue de cordão umbilical foram inoculadas na densidade de
10
6
células/ml e mantidas em placa de 24 poços com meio RPMI e 10% FCS, a 37
o
C,
49
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
numa atmosfera humidificada de 5% CO2/ 95% ar, por 14 dias.. Foram adicionados às
culturas, as citocinas rhGM-CSF (2ng/ml, concentração final), rhIL-3 (2ng/ml, idem) e
rhIL-5 (0,2ng/ml, idem). Onde indicado, as culturas foram estabelecidas na presença de
dexametasona, hidrocortisona e budesonide (concentrações finais 10
-7
M a 10
-9
M).
Após 14 dias de cultura, foi realizada a contagem do número de células nucleadas totais.
Em seguida foi realizada citocentrifugação das amostras e os citocentrifugados foram
corados com Panótico ou Wright-Giemsa, seguindo-se a contagem diferencial em
microscópio Olympus BX-50 sob objetiva de 100x com imersão em óleo.
3.2.2 Cultura de células CD34+ purificadas
Para a purificação de células CD34+, foram coletados 150-200ml de sangue de
cordão umbilical, através de punção da placenta e drenagem sob a ação da gravidade (a
placenta foi suspensa e o cordão foi puncionado diretamente para uma bolsa de coleta
de sangue que já contem anticoagulante). O sangue, sem diluição prévia, foi carregado
num gradiente de Lymphoprep™ na proporção de 2:1, sendo em seguida centrifugado a
400xg por 35 minutos. O anel de células mononucleares foi coletado e transferido para
outro tubo, onde foi diluido com RPMI e lavado por 10 minutos a 500xg por 2 vezes. O
depósito celular final foi ressuspendido em 5ml de RPMI e as células obtidas contadas
em câmara de Neubauer. As células foram analisadas por citometria de fluxo no
Laboratório de Citocinas, Depatamento de Imunologia da UFRJ, Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Preparamos 3 tubos para citometria de fluxo com 30
μl de suspensão celular:
50
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
1
o
. tubo= contendo o anticorpo controle de isotipo, conjugado a FITC (controle para
anti-CD45) e o anticorpo controle de isotipo, conjugado a a PE (controle para anti-
CD34), 1μl de cada.
2
o
. tubo= contendo anti-CD45-FITC (clone 2D1) e anticorpo controle de isotipo,
conjugado a PE, 1μl de cada
3
o
. tubo= contendo anti-CD45-FITC (clone 2D1) e anti-CD34-PE (clone 8G12), 1μl de
cada.
Deixamos estes 3 tubos no escuro por 15 minutos, e depois adicionamos 1000μl de
tampão de lise, seguindo-se uma incubação no escuro por 10 minutos, centrifugação
por 5 minutos a 500xg e descarte do sobrenadante. O depósito foi ressuspendido em
1000μl de PBS e centrifugado por 5 minutos a 500xg. Ressuspendemos o depósito final
em 1000μl de PBS e levamos ao citômetro para analisarmos o percentual de celulas
CD34+ contidas nesta amostra.
Para a separação (“sorting”), utilizamos um kit para separação magnética de
células CD34+ (MACS CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec). Com este
kit, as células progenitoras hematopoiéticas, que constituem cerca de 0,1-0,5% das
células do sangue de cordão umbilical humano, podem ser eficientemente enriquecidas
até uma pureza de 85-98%. Já conhecendo o percentual de células CD34+ que temos na
nossa suspensão celular, voltamos a trabalhar com a amostra guardada, que tinha sido
ressuspendida em 5ml de RPMI, e centrifugada por 5 minutos a 500g , sendo o
depósito lavado em 5ml de tampão MiniMACS e ressuspendido em 800μl do mesmo
tampão. Seguiu-se a adição de 100μl do reagente A1 (Ig humana para o bloqueio da
51
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
ligação a FcR) e do reagente A2 (anticorpo monoclonal anti CD34 conjugado ao
hapteno). Deixamos em repouso por 15 minutos no gelo a suspensão, após
homogeneizar, e em seguida, adicionamos 10 ml de tampão, seguindo-se uma
centrifugação por 5 minutos a 500xg. Após o descarte do sobrenadante, o depósito foi
ressuspendido em 400μl de tampão. Adicionamos 100μl do reagente B (esferas
magnéticas conjugadas com um anticorpo anti hapteno), e incubamos por 15 minutos no
gelo, seguindo-se nova diluição com 10 ml de tampão, centrifugação (5 minutos a
500xg), descarte de sobrenadante e resuspensão em 500μl de tampão. A suspensão
celular foi então passada pela coluna de separação magnetica miniMACS, previamente
equilibrada em tampão. O efluente desta coluna contém o produto da seleção negativa.
Em seguida, a coluna foi removida do suporte magnetico e lavada com tampão,
obtendo-se o eluato que foi coletado no tubo de seleção positiva, contendo as celulas
CD34+. Foi feita contagem em câmara de Neubauer com solução de Turk e realizada
cultura liquida com 2,5 x 10
5
células CD34+/ml com 1ng/ml de rhIL-3, 1ng/ml de rhIL-
5 e rh10 ng/ml de GM-CSF (Lundahl et al, 2002). Adicionamos onde indicado a
dexametasona na concentração de 10
-
7 M e a cultura foi mantida em estufa por 14 dias.
3.3 Colorações hematológicas
As lâminas foram coradas rotineiramente com Panótico Rápido LB (Laborclin,
cód.620529). As lâminas eram submersas por 5 segundos na solução 1 (solução de
triarilmetano a 0,1%) para fixação, depois na solução 2 (solução de xantenos a 0,1%)
por mais 5 segundos e, finalmente na solução 3 ( solução de tiazinas a 0,1%) por mais 5
segundos. As lâminas eram em seguida secadas em ar ambiente.
52
METODOLOGIA
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Para melhor visualização dos grânulos dos eosinófilos, utilizamos a coloração de
Wright-Giemsa (ACCUSTAIN® Wright-Giemsa stain, modified, Sigma Aldrich®),
com fixação em metanol (1 minuto de imersão por lâmina) e secadas. Após isto eram
colocadas verticalmente imersas na solução de Wright-Giemsa modificado por 5
minutos e depois imersas em água deionizada por mais 5 minutos. O excesso era lavado
gentilmente em água corrente. As lâminas eram secadas e analisadas ao microscópio
sob imersão.
3.4 Microfotografia
Algumas das lâminas preparadas foram fotografadas com auxílio de microscópio
Leica DMLS e programa Leica IM50 image manager .
3.5 Métodos estatísticos
Para análise estatística foi utilizado o teste T de student para comparação entre dois
grupos. E realizado Anova com correção de Tukey com auxílio do programa Systat
for Windows quando foram feitas comparações múltiplas entre diferentes grupos.
53
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
IV RESULTADOS
1. Efeito da Dexametasona sobre a cultura de precursores eosinopoiéticos
derivados de sangue de cordão umbilical humano.
Resultados anteriores do nosso laboratório mostraram que a dexametasona aumentava
de forma dose-dependente, o numero total de colônias mielóides formadas, assim como o
tamanho das colônias eosinofilicas e a fração de colônias mieloides comprometidas com a
produção de eosinofilos em culturas de medula óssea de camundongos normais e alérgicos.
Com o objetivo de verificar se estes resultados poderiam ser reproduzidos a partir de células
precursoras eosinofílicas humanas, realizamos uma cultura liquida, establecendo uma curva
dose-resposta para dexametasona .
A figura 2 mostra que a dexametasona quando acrescida à cultura líquida realizada a
partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical humano, aumenta
de forma altamente significativa o número de células totais obtidos, após 14 dias de cultura,
na concentração de 10
-7
M (p=0,000957) quando comparado com o grupo controle que
apresenta apenas as citocinas eosinopoiéticas IL-5, GM-CSF e IL-3. Ainda observamos um
efeito estatisticamente significativo na concentração de dexametasona 10
-8
M quando
comparado com o grupo controle (p=0,013). O efeito desapareceu na concentração de 10
-
9
M onde não vemos diferença estatisticamente significativa quando comparada com o grupo
controle (p=0.787).
54
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
GM-CSF+ IL-3+IL-5
+D 10
-
7
M
+ D 10
-8
M
+ D 10
-9
M
No. células totais x 10
6
células/ml
*
*
Fig.2- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de dexametasona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A
presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p <
0,05.
Analisando o percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura observamos
como ilustrado na figura 3, que a dexametasona (D7) aumenta significativamente o
55
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura liquida na concentração de 10
-7
M
(p=5,56E-06) e este efeito diminui na concentração de 10
-8
M (p= 0,03316) mas ainda
permanece estatisticamente significativo. Já na concentração de 10
-9
M (p=0.4718) não
observamos mais diferença estatistica significativa em relação ao grupo controle.
Como mostrado na figura 4, observamos que a dexametasona quando acrescida à
cultura líquida a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical
humano, aumenta significativamente o numero de eosinófilos na concentração de 10
-7
M
(p=8.7412E-05) e a medida que a concentração diminui 10
-8
M o efeito diminui (p=0,046),
desaparecendo na concentração de 10
-9
M .
Após 14 dias de cultura à partir de células mononucleares derivadas de sangue de
cordão umbilical humano, observamos células em vários estágios de amadurecimento. Os
eosinófilos são identificados como células contendo grânulos abundantes no seu citoplasma,
cuja cor avermelhada é mais evidente nas preparações coradas com Wright-Giemsa, como
ilustra a figura 5.
56
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
5
10
15
20
25
30
35
GM-CSF+IL-3+ IL-5 + D 10
-
7
M
+D 10
-
8
M
+
D 10
-9
M
Percentual de eosinófilos
*
*
Fig.3- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de dexametasona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A
presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p <
0,05.
57
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
GM-CSF+IL3+IL5
+D 10
-
7
M
+ D 10
-
8
M
+ D 10
-9
M
No. de eosinófilos x10
6
células/ml
*
*
Fig.4- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14 dias
de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos foram
desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição de
dexametasona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +D7, +D8 e +D9, respectivamente). A presença
de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.
58
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.5a- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com
panótico.
59
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.5b- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com
Wright-Giemsa..
2. Efeito da dexametasona em cultura liquida realizada a partir de células CD34+
enriquecidas
60
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Procuramos verificar se este efeito potencializador, observado com a dexametasona na
concentração de 10
-7
M, quando realizamos a cultura diretamente a partir de células
mononucleares de sangue de cordão umbilical humano, poderia ser reproduzido se
fizessemos a cultura a partir de células CD34+ purificadas. Na figura 6 podemos
observar gráficos de citometria de fluxo que mostram a pureza da separação obtida. Os três
primeiros gráficos (dotplots) são referentes ao sangue de cordão umbilical humano após a
separação por gradiente de densidade e anterior a coluna imunomagnetica. Encontramos,
como pode ser visto no gráfico c, 5% de células CD34+CD45+low, fenótipo característico
de células tronco hematopoiéticas humanas. O último gráfico (letra d), representa a células
após a coluna imunomagnética, com enriquecimento de 8 vezes das células CD34+45low.
As outras células presentes no gráfico apresentam tamanho e complexidade compatíveis
com monócitos e devem ser eliminadas com um protocolo de aderência prévio à coluna
imunomagnética.
61
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig. 6- Gráfico de análise do enriquecimento por citometria de fluxo das populações
celulares obtidas após separação magnética das células CD34+.
Como observado na figura 7, a dexametasona na concentração de 10
-7
M não foi
capaz de alterar o número de células totais obtidos após 14 dias de cultura quando
comparado com o grupo controle, entretanto, como ilustra respectivamente a figura 8 e 9
foi capaz de potencializar o número de precursores eosinofílicos e o número de
eosinófilos totais. Podemos observar na figura 10 que o controle obtido apresenta uma
5,0 %
40,0 %
0,02 %
Isotipo controle
FITC
CD45
FITC
Isotipo controle PE
CD34
PE
b
c
d
a
62
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
população bem mais homogênea de células com aspecto mononuclear e no grupo onde
foi acrescida a dexametasona, observamos um aumento do número de eosinófilos e de
células com núcleo segmentado.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
GM-CSF + IL-3+ IL-5
+ D 10
-
7
M
No células totais x 10
6
células/ml
Fig.7-
O gráfico mostra o número de células totais obtidas após 14 dias de cultura realizada a partir
de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle e o
grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-5 foi acrescida
dexametasona na concentração de
10
-7
M.
63
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
GM-CSF+ IL-3 + IL-5 D7
Percentual de eosinófilos
Fig.8- O gráfico mostra o percentual de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir
de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle e o
grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-5 foi acrescida
dexametasona na concentração de 10
-7
M..
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
GM-CSF + IL-3 + IL-5
+ D 10
-
7
M
N
o
. de eosinófilos x 10
6
células/ml
Fig.9- O gráfico mostra o número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura realizada a partir
de de células CD34+ purificadas. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo
controle e o grupo D7 ao grupo no qual além das citocinas eosinopoiéticas GM-CSF, IL-3 e IL-
5 foi acrescida dexametasona na concentração de 10
-7
M.
64
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.10a- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com panótico.
65
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.10b- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com Wright-
Giemsa.
3.
Bloqueio dos efeitos da dexametasona pelo mifepristone (RU486)
66
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Após verificar o efeito potencializador da dexametasona sobre a diferenciação dos
eosinófilos, decidimos avaliar se este efeito ocorria via receptor de glicocorticóide.
Desta forma utilizamos o mifepristone (RU486) que é um bloqueador do receptor de
glicocorticóide.
Como mostrado na figura 11, observamos que, quando a cultura era desenvolvida
na presença de dexametasona, o efeito potencializador sobre os eosinófilos (p=0.026,
n=4, comparação entre o grupo controle e as culturas com dexametasona) era totalmente
bloqueado pelo RU486 (p=0,04, comparação entre culturas com dexametasona e culturas
com RU486 + dexametasona). O RU486, por si só, não teve efeito estatístico
significativo (p=0.204).
O efeito inibitório do mifepristone sobre a diferenciação de eosinófilos é ainda
detectável quando analisamos o número total de eosinófilos recuperados das culturas.
Como mostrado na figura 12, observamos que o RU486 quando adicionado à cultura,
bloqueia totalmente o efeito potencializador sobre o número de eosinófilos observado
com a dexametasona (p=0,036). Em contraste, o RU486 não teve efeito por si só
(p=0,290).
Nestes 4 experimentos realizados com mifepristone, a dexametasona não foi capaz
de potencializar o número de células totais e desta forma, não pudemos avaliar o efeito
do RU486 com relação ao número de células totais.
67
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
GM-CSF+ IL-3 +
IL-5
+ D 10
-
7
M
+RU486 +RU486+D7
Percentual de eosinófilos
*
Fig.11- Efeito do mifepristone (RU486) sobre o percentual de eosinófilos obtidos após
14 dias de cultura realizada a partir de células mononucleares derivadas de sangue de
cordão umbilical humano. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo
controle. O grupo D7 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas a
dexametasona na concentração de 10
-7
M. O grupo RU486 corresponde às culturas nas
quais foram acrescidas o RU486 na concentração de 10
-7
M. No grupo RU486 +D7
foram acrescido RU486 e dexametasona, ambos na concentração de 10
-7
M.
68
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
GM-CSF+ IL-3
+ IL-5
+ D 10
-7
M
+RU486 +RU486+D7
número de eosinófilos x 10
6
células/ml
*
Fig.12- Efeito do mifepristone (RU486) sobre o número de eosinófilos obtidos após 14 dias
de cultura realizada a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão
umbilical humano. O grupo GM-CSF + IL-3 + IL-5 corresponde ao grupo controle. O grupo
D7 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas a dexametasona na concentração de
10
-7
M. O grupo RU486 corresponde às culturas nas quais foram acrescidas o RU486 na
concentração de 10
-7
M. No grupo RU486 +D7 foram acrescido RU486 e dexametasona,
ambos na concentração de 10
-7
M.
4. Cinética de ação da dexametasona
69
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Para observar o efeito da dexametasona ao longo do desenvolvimento em cultura dos
eosinófilos, realizamos uma cultura líquida com até 28 dias de duração, com interrupção em
14 dias, 21 dias e 28 dias de cultura, onde indicado.
Como observamos na figura 13, a dexametasona aumenta o número de células totais
quando comparada com o controle no 14º. dia de cultura(p=
0,0009) , o que já não ocorre no
21º dia (p=0.144) e no 28º dia (p=0.615).
0
1
2
3
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 14
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 21
N
o
de células totais (x10
6
/
ml)
D7
D7
D7 no dia
14
D7
D7 no dia
21
*
14 dias
21 dias
21 dias
28 dias
28 dias
Fig.13- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células nucleadas totais
obtidas após 14 dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os
demais grupos foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-
5, sendo que, no grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10
-7
M .
70
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Como mostrado na figura 14, quando analisamos o percentual de eosinófilos
obtidos após 28 dias de cultura, observamos que a dexametasona foi capaz de aumentar
significativamente o percentual de eosinófilos no 14º.dia de cultura (p= 4,40699E-07) e
no
21º dia de cultura (p=0.027), o que já não ocorre no 28º dia de cultura (p=0.48).
Também notamos que nem a introdução da dexametasona apenas no 14º.dia seguindo-se
da interrupção com 21 dias , nem a sua introdução com 21 dias seguida de interrupção
com 28 dias aumentou significativamente o percentual de eosinófilos observado (p=0,20
e p=0,49 respectivamente).
Como observado na figura 15, a dexametasona aumentou de forma altamente
significativa o número de eosinófilos recuperados no 14º dia (p=1,22378E-05) como no
21º dia (p=0.0009) em relação aos respectivos controles. No 28º dia de cultura, contudo,
seu efeito não foi mais significativo (p= 0,81) quando comparada com o grupo controle.
A dexametasona acrescentada tardiamente (no 14º.dia e no 21º.dia ) também não teve
efeito potencializador sobre o número de eosinófilos recuperados
71
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
20
40
60
80
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 14
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 21
% Eosinófilos
D7
D7
D7 no dia 14
D7
D7 no dia 21
*
*
14 dias
21 dias
21 dias
28 dias
28 dias
Fig.14- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, sendo que, no
grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10
-7
M .
72
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,5
1
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 14
GM-CSF
+IL-3
+IL-5
D7 D7 no
dia 21
N
o
de eosinófilos (x10
6
)
D7
D7
D7 no dia 14
D7
D7 no dia 21
*
*
14 dias
21 dias
21 dias
28 dias
28 dias
Fig.15- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, sendo que, no
grupo D7 houve adição de dexametasona na concentração de 10
-7
M .
5. Efeito da Budesonide sobre a formação de eosinófilos
Buscamos analisar se o efeito potencializador sobre os precursores eosinofilicos
observado com a dexametasona poderia também ser observado com outros
73
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
corticoesteróides, especialmente aqueles correntemente utilizados no tratamento das
alergias. Desta forma realizamos experimentos com budesonide, um corticoesteróide muito
utilizado por via inalatória para prevenção tanto da asma brônquica como da rinite alérgica
.Observamos, como ilustrado na figura 16, que o budesonide na concentração de 10
-7
M, 10
-
8
M e 10
-9
M , numa série limitada de experimentos (n=5) quando acrescido a cultura, não
apresentou efeito estatisticamente significativo sobre o número de células totais ao final de
14 dias de cultura quando comparado com o grupo controle (p=
0,07; p=0,20; p=0,11,
respectivamente
).
Como mostrado na figura 17, quando verificamos o efeito do budesonide sobre o
percentual de eosinófilos obtidos, observamos que com budesonide na concentração de 10
-
7
M ocorreu um aumento significativo (p= 0,02) em relação ao grupo controle. Este efeito
diminui na concentração de 10
-9
M (p=0,05) e desparece na concentração de 10
-11
M (p=0.28)
em relação ao grupo controle.
Como mostrado na figura 18, o efeito potencializador do budesonide ainda é detectável quando
analisamos o número de eosinófilos recuperados. O budesonide na concentração de
10
-7
M foi capaz
de aumentar significativamente o número de eosinófilos totais quando comparado com o
grupo controle (p=0.047), contudo este efeito não foi observado na concentração de 10
-9
M. e
10
-11
M (p=0,12; p=0,43, respectivamente)
74
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,5
1
1,5
2
2,5
GM + IL-3+IL-5
+ B 10
-
7
M
+ B 10
-
9
M
+ B 10
-
11
M
numero de celulas totais x 10
6
/ml
Fig. 16 - Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de budesonide (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +B7, +B8 e +B9, respectivamente). A presença
de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.
75
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
5
10
15
20
25
30
GM-CSF + IL-
3+ IL-5
+ B 10
-
7
M
+ B 10
-
9
M
+ B 10
-
11
M
Percentual de eosinófilos
*
*
Fig. 17- Os dados correspondem a média +
76
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
GM-CSF + IL-
3+IL-5
+ B 10
-
7
M
+ B 10
-
9
M
+ B 10
-
11
M
N
o
eosinófilos x 10
6
células/ml
*
Fig. 18- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de budesonide (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +B7, +B8 e +B9, respectivamente). A presença
de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p < 0,05.
6. Efeito da hidrocortisona sobre a formação de eosinófilos
77
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
A hidrocortisona, foi um dos corticoesteróides testados pelo nosso grupo em função de
sua relação com o hormônio produzido pelo corpo humano nas reações de estresse.
Como mostrado na figura 19, a análise do efeito da hidrocortisona sobre o número de
células totais mostrou que a hidrocortisona não apresentou efeito estatisticamente
significativo nas concentrações de 10
-7
M, 10
-9
M e10
-11
M (p=0,14, p=0,12, p=0,10,
respectivamente)
Como mostrado na figura 20, quando analisamos o percentual de eosinófilos obtidos,
vemos que a hidrocortisona na concentração de 10
-7
M aumenta de forma altamente
significativa o percentual de eosinófilos obtidos (p=0.003) em relação ao grupo controle.
Este efeito já desaparece na concentração 10
-9
M (p=0.11) e também na concentração de 10
-
11
M (p=0.43) quando comparado com o grupo controle.
Como observado na figura 21, o efeito potencializador da hidrocortisona ainda é
detectável quando analisamos o número absoluto de eosinófilos obtidos. A hidrocortisona
aumentou significativamente o número de eosinófilos na concentração de 10
-7
M (p=0.03).
Este efeito já não é mais significativo nas concentrações de 10
-9
M e 10
-11
M (p=0.31,p=0.82,
respectivamente) quando comparados com o grupo controle.
78
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
GM-CSF+IL-
3+IL-5
+ H 10
-
7
M
+ H 10
-
9
M
+ H 10
-
11
M
N
o
. células totais x 10
5
células/ml
Fig. 19 - Os dados correspondem a média + erro padrão do número de células totais obtidas após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de hidrocortisona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A
presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p <
0,05.
.
79
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
5
10
15
20
25
30
GM-CSF+IL-
3+IL-5
+ H 10
-
7
M
+ H 10
-
9
M
+ H 10
-
11
M
percentual de eosinofilos obtidos
*
Fig. 20- Os dados correspondem a média + erro padrão do percentual de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de hidrocortisona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A
presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p <
0,05.
80
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
0,5
1
1,5
2
2,5
GM-CSF+IL-
3+IL-5
+ H 10
-
7
M
+ H 10
-
9
M
+ H 10
-
11
M
N
o
. eosinófilos x 10
5
células/ml
*
Fig. 21- Os dados correspondem a média + erro padrão do número de eosinófilos obtidos após 14
dias de cultura. O grupo GM-CSF + IL-3 +IL-5 corresponde ao grupo controle. Os demais grupos
foram desenvolvidos na presença de citocinas eosinopoiéticas GM-CSF + IL-3 + IL-5, com a adição
de hidrocortisona (10
-7
M , 10
-8
M, e 10
-9
M, nos grupos +H7, +H8 e +H9, respectivamente). A
presença de * representa diferença significativa entre o grupo experimental e o grupo controle, p <
0,05.
Na figura 22 podemos observar a fotografia de uma lâmina vista ao microscópio sob aumento
de 100x com imersão em óleo, mostrando o aumento de número de eosinófilos, com seus grânulos
bem evidenciados pela coloração de Wright-Giemsa, observados na concentração de
10
-7
M.
81
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.22- fotos obtidas com aumento de 100x em imersão com óleo de lâminas coradas com Wright-
Giemsa.
7. Efeito da atopia materna sobre ao efeito potencializador de eosinófilos da dexametasona
82
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Foi avaliado o impacto da atopia sobre o efeito potencializador sobre a linhagem
eosinofílica exercido pela dexametasona. Atopia foi definida como a presença de história
pessoal ou familiar de doença atópica (asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite
atópica) Como mostra a figura 23, a maioria dos experimentos realizados mostra aumento do
número de eosinófilos obtidos após 14 dias de cultura na presença de dexametasona.
0
1
2
Controle D7
N
o
Eosinófilos (x10
6
)
Fig.23- Efeito
da dexametasona sobre o no. de eosinófilos obtidos a partir de experimentos
realizados através da coleta de sangue de cordão umbilical de mães não atópicas e atópicas.
Na figura 24 podemos observar o aumento do numero de eosinófilos nos
experimentos realizados a partir de coleta de sangue de cordão umbilical humano de
mães atópicas (painel a) e não atópicas (painel b) respectivamente. Não observamos
83
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
diferença estatisticamente significativa entre o percentual de aumento de eosinófilos em
relação ao grupo controle entre o grupo de mães atópicas e não atópicas como ilustra a
figura 25, apesar do enhancement observado ter sido maior no grupo de mães atópicas.
0
1
2
12
N
o
Eosinófilos (x10
6
)
0
1
2
12
N
o
Eosinófilos (x10
6
)
Fig.24 – Efeito da dexametasona sobre o n
o
. de eosinófilos obtidos a partir de experimentos
realizados através da coleta de sangue de cordão umbilical de mães atópicas (painel a) e mães
não atópicas.
Painel a
Painel b
84
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Mães atópicas Mães não atópicas
percentual de aumento entre o grupo
experimental e o controle
Fig.25 – Enhancement obtido com a dexametasona em experimentos realizados a partir
do sangue de cordão umbilical humano de mães atópicas e não atópicas.
8. Pefil das gestantes e recém nascidos dos quais foram coletados o sangue de cordão
umbilical humano.
Na figura 26 podemos verificar o perfil das gestantes que participaram do estudo e
dos seus recém natos . Para garantir a confidencialidade da informação disponibilizada
pelas gestantes, seus nomes não ficarão expostos na tabela abaixo nem tampouco de seus
recém nascidos. O sangue de cordão umbilical representa o sangue do recém nascido,
mas tendo em vista a íntima interface com o sangue/organismo materno torna-se
importante a presença dos dados maternos.
85
RESULTADOS
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
Fig.26. Tabela do perfil de gestantes.
idade
Tipo
sanguineo
paridade tipo de parto IG atopia
sexo do
bebê
peso
nasc
estatura apgar
O + GII PI A0 cesariana 39s nao masculino 3260 51 9 e 10
23 O - GII PI A0 cesariana 41s nao masculino 3210 51 8 e 10
29 O + GI P0 A0 normal 40s nao masculino 4175 54 9 e 9
25 O+ GIII PI AI cesariana 38s sim masculino 3835 51 8 e 8
36 GI P0 A0 cesariana 41s nao masculino 3765 53 9 e 10
27 O + GII P0 AI normal 40s nao masculino 3400 52 9 e 10
19 A + GII PI A0 cesariana 40s nao masculino 3830 51 8 e 9
A + GII PI cesariana 38s nao masculino 3385 50 8 e 8
18 O + GI P0 A0 normal 35s sim feminino 2745 47,5 9 e9
GIV PIII
A0
normal 39 nao feminino 2595 46 9 e 9
17 GI P0 A0 normal 41s nao feminino 3135 51 9 e 9
24 O + GIII PI AI cesariana 39s nao feminino 3540 50 8 e 9
31 A - GII PI A0
normal com
forceps
40s sim feminino 3705 53 9 e 10
34 GI P0 A0 normal 40s nao masculino 3460 51 9 e 10
18 O - GI P0 A0 normal 38s não masculino 2966 52 9 e 9
22 O + GI P0 A0 normal 38s nao feminino 3490 51 9 e 9
15 B + GI P0 A0 normal 41s sim feminino 3740 50 8 e 6
18 O+ GI P0 A0 normal 40s nao masculino 3910 52 9 e 10
33 O+ GIII PI AI normal 39s não feminino 3295 49 9 e 9
27 A+ GIV PII AI normal 37s feminino 2510 51 9 e 9
19 O - GI P=0 normal 37s masculino 2400 48 9 e 10
19 O+ GIII PII normal 39s não masculino 3470 50 9 e 9
27 A + GI P0 A0 normal 36s sim feminino 2495 48 7 e 9
37 O+ GII P0 AI cesariana 41s não feminino 3630 9 e 9
24 O+ GIII PI cesariana 40s sim feminino 4015 54 9 e 10
22 O+ GI P0 normal 40s não masculino 3030 49
38 O+
GVI PIV
A1
cesariana 36s nao masculino 3130 9 e 9
24 B+ GIII PI AI cesariana 40s sim feminino 3415 49 9 e 10
34 O+
GVI PII
AIII
cesariana 38s não masculino 4205 53 9 e 10
86
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
V- DISCUSSÃO
Os glicocorticóides são as drogas mais utilizadas atualmente para o tratamento das
doenças alérgicas, entretanto , alguns estudos tem demonstrado efeitos paradoxais dos
glicocorticóides (Ramirez et al, 1996; Buitenhuis et al2003; Debierre-Grokierko, 2003) que
poderiam contribuir para a manutenção da doença alérgica. Um estudo de Gaspar Elsas e
colaboradores demonstrou que em células obtidas de medula óssea de murinos, a
dexametasona aumentava o número total de colônias mielóides formadas, assim como
tamanho das colônias eosinofílicas e a fração de colônias mielóides que foram
comprometidas com a produção de eosinófilos. (Gaspar Elsas et al, 2000a). O nosso estudo
buscou avaliar se efeitos semelhantes poderiam ser observados com células de origem
humana. Para isto, escolhemos utilizar células derivadas de sangue de cordão umbilical
humano que constitui um sistema bastante vantajoso para o estudo da maturação
eosinofílica in vitro uma vez que possibilita o cultivo de eosinófilos com características
morfológicas similares aos encontrados na medula óssea além de ser menos invasivo do
que o componente medular.
O nosso estudo mostrou que existe correspondência com os resultados obtidos
por Gaspar Elsas e colaboradores em camundongos, em precursores eosinofilicos humanos.
Nossos experimentos a partir de células mononucleares derivadas de sangue de cordão
87
Daniella Campelo Batalha Cox Moore
umbilical humano mostraram que a dexametasona na concentração de 10
-7
M é capaz de
aumentar de forma estatisticamente significativa o número total de células obtidas, o
percentual de eosinófilos e por conseguinte o número total de eosinófilos. À medida que a
concentração diminui, o efeito observado vai sendo diminuído, mas ainda apresenta
diferença estatisticamente significativa na concentração de 10
-8
M; já na concentração de
10
-9
M não observamos mais este efeito. Este efeito potencializador da dexametasona
mostrou-se linhagem especifico, potencializando seletivamente a linhagem eosinofílica.
Estes resultados encontram apoio em alguns outros estudos. Um estudo de Barr et al
(1987), demonstrou aumento do número de colônias eosinofílicas formadas a partir de
células derivadas da medula óssea humana por concentrações fisiológicas e farmacológicas
de hidrocortisona. Um estudo de Debierre Grokierko também encontrou aumento do
número de eosinófilos na presença de dexametasona em cultura realizada a partir de células
CD34+.
Estes estudos, assim como o nosso, trazem um alerta para uma sensibilidade diferente
das células precursoras hematopoiéticas ao glicocorticóide . É importante ressaltar que estes
achados não contradizem a literatura existente na qual os corticoesteróides atuem
aumentando a apoptose do eosinófilo maduro e assim contribuindo para a resolução do
quadro alérgico, e sim tenta esclarecer que existem células que tem importância para os
quadros alérgicos, que são as células precursoras hematopoiéticas que não estão sendo
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
mortas e sim potencializadas. Isto pode ajudar a explicar alguns estudos que tem mostrado
que o glicocorticóide pode predispor a reações alérgicas (Agarwal and Marshall., 2000,
Ramirez et al, 1996) e principalmente fornecer mais uma base para explicar a ampla
literatura existente ligando o estresse à exacerbação das crises alérgicas (Sandberg et al,
2000; Klinnert et al, 2001).
Quando nos nossos experimentos observamos o aumento no percentual de
eosinófilos, dirigimos nossa atenção para verificar se a dexametasona seria capaz de atuar
sobre populações enriquecidas em progenitores CD34+. Esta questão é igualmente
relevante para o problema de se algum outro tipo celular, presente na cultura de células
mononucleares, exerce efeitos inibitórios sobre a diferenciação de eosinófilos. Esta
possibilidade deve ser levada em conta, pois os dados de outros laboratórios insistem em
que a diferenciação eosinofílica a partir de sangue de cordão umbilical só se faz
eficientemente a partir de células CD34+ purificadas (Lundahl et al, 2002) levando, além
disso, o dobro do tempo do requerido em nosso sistema na presença de dexametasona. Tais
discrepâncias poderiam ser resolvidas, se alguma célula acessória, presente na cultura de
mononucleares, secretasse alguma substancia inibitória para a eosinopoiese, na ausência
mas não na presença da dexametasona. Uma destas possibilidades, tendo em vista que a
nossa cultura apresenta uma grande quantidade de monócitos, seria de que a dexametasona
pudesse estar inibindo a geração de alguma substância produzida por estes monócitos,
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
como por exemplo a prostaglandina E2 (PGE2). A PGE2 tem efeitos supressivos
conhecidos sobre a eosinopoiese e a adição de dexametasona à cultura poderia estar
inibindo a via da ciclooxigenase e com isso diminuindo a síntese de PGE2 pelos monócitos.
Com a perda da inibição exercida pela PGE2, os eosinófilos poderiam proliferar.
Em virtude das dificuldades técnicas e do alto custo envolvido no experimento,
realizamos apenas um experimento utilizando a separação magnética de células CD34+. O
percentual de células CD34+ encontrado normalmente no sangue de cordão umbilical
humano varia de 0,1 a 0,5%. Após a inicial separação das células mononucleares por
gradiente de densidade utilizando Lymphoprep, obtivemos um percentual de 5% das células
como sendo CD34+ como mostrado nos dados obtidos através de citometria de fluxo. Após
a separação magnética, o enriquecimento de células CD34+ foi de 40%, ou seja, 8 vezes
maior do que antes deste procedimento. Ainda ficamos com uma contaminação de duas
populações celulares que pelas características observadas em citometria de fluxo
corresponderiam a hemácias e monócitos (foram tentados alguns experimentos com lise de
hemácias por cloreto de amônio ou NaCl hipotônico; entretanto, o tratamento afetou
significativamente a função das células hematopoiéticas, inviabilizando esta estratégia).
Com este experimento realizado a partir de células CD34+ enriquecidas, sem lise de
hemácias, obtivemos resultados semelhantes aos obtidos quando realizamos a partir de
células mononucleares sem purificação adicional. Isto confirma que a dexametasona pode
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
modifica algumas propriedades regulatórias de células dendríticas derivadas de monócitos e
estimula a produção por estas de IL-10 e IL-13. A IL-13 (Taube et al, 2002) é uma citocina
pleiotrópica que é secretada por células Th2 ativadas e monócitos. Apresenta atividade
imunológica redundante com a IL-4. A IL-13 é capaz de regular a mudança de classe para
IgE nas células B e a expressão de MHC II e receptores de baixa afinidade para IgE (CD23)
nas células B e em monócitos. É capaz de ativar mastócitos e eosinófilos, além da função
neutrofilica. IL-13 também aumenta a expressão de VCAM-1 nas células endoteliais,
facilitando o recrutamento preferencial de eosinófilos e também células T para o tecido da
via aérea. Apesar de não ser necessária para a a indução do desenvolvimento de uma
resposta Th2, ela é capaz de estimular a ativação da resposta Th2 uma vez que inibe a
produção de IL-12 nos monócitos. Mais importante, em cultura de medula óssea murina, a
IL-13 potencializa significativamente a produção de eosinófilos em presença de IL-5
(Queto et al., manuscrito em preparação).
Realizamos experimentos para avaliar a cinética do efeito da dexametasona ao longo
de uma cultura de 28 dias com o objetivo de analisar o efeito da dexametasona ao longo do
amadurecimento eosinofílico. Nestes experimentos, a dexametasona foi capaz de aumentar
de forma altamente significativa os precursores eosinofilicos no 14º. e no 21º dia de
cultura, mas não observamos mais este efeito no 28º. dia de cultura. Nossas células no 28º.
dia de cultura apresentavam já aumento da apoptose principalmente no grupo com
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
dexametasona. Isto pode significar que à medida que os precursores eosinofílicos vão se
desenvolvendo rumo ao eosinófilo maduro, progressivamente, vai perdendo a sensibilidade
ao efeito potencializador de eosinófilos e ganhando sensibilidade ao efeito pró apoptótico
da droga, efeito este já consagrado e que valida o uso terapêutico da droga. Adcionamos a
dexametasona tardiamente no 14º. e 21º. dia de cultura, e não observamos o efeito
potencializador da dexametasona, o que sugere que para que esta exerça este efeito
potencializador torna-se necessário que ela esteja presente na cultura quando os
progenitores estão começando a se comprometer com a linhagem.
Adicionalmente, houve grande interesse em avaliar se o efeito exercido pela
dexametasona ocorria via receptor de glicocorticóide. Utilizamos então, o mifepristone
(RU486) que é um derivado da noretindrona que se liga ao receptor da progesterona com
afinidade maior que a progesterona, mas não ativa esse receptor, agindo portanto como uma
antiprogestina. O mifepristone também se liga ao GR humano (receptor de glicocorticóide
humano) com uma afinidade de 3 a 4 vezes maior do que a dexametadona e cerca de 18
vezes maior do que o cortisol. A ligação do mifepristone ao receptor, impede o receptor de
se dissociar da proteína do choque térmico e desta forma evita a translocação do complexo
RU486/receptor para o núcleo (Johanssen & Allolio, 2007). Desta forma, os efeitos anti-
glicocorticoide do mifepristone são dose dependentes. Com a adição do mifepristone a
cultura , observamos que o efeito potencializador exercido pela dexametasona pode ser
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
completamente bloqueado por este, caracterizando o efeito observado via receptor de
glicocorticóide. É importante ressaltar que quando o RU486 é adicionado isoladamente a
cultura não ocorre nenhuma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo
controle onde só temos citocinas eosinopoiéticas (IL-3, GM-CSF e IL-5), o que sugere que
a progesterona não é, sozinha, responsável por nenhum efeito sobre a eosinopoiese, embora
experimentos adcionais devam ser realizados para confirmar o efeito da progesterona. Fica,
no entanto, por estabelecer se ela não tem um efeito aditivo ou sinérgico com os
glicocorticóides. Foi importante avaliar um possível efeito da progesterona, uma vez que
esta é sintetizada em grande quantidade e liberada pela placenta durante a gravidez. No
terceiro trimestre da gravidez, a taxa de secreção de progesterona aumenta de 10-20mg/dia
e pode chegar a centenas de miligramas durante a parte final da gravidez (Lu et al, 2006).
Embora as lavagens a que são submetidas as células do sangue de cordão umbilical durante
o seu isolamento possam reduzir consideravelmente o transporte de progesterona para
dentro da cultura, com níveis iniciais tão elevados, e com a alta afinidade do receptor de
progesterona, uma quantidade residual deve atingir a cultura, em condições suficientes para
interagir com este receptor, e, se for o caso, interagir com os glicocorticóides também.
Para avaliar se o efeito potencializador para precursores eosinofílicos
observado pela dexametasona poderia ser reproduzido por outros corticoesteróides,
realizamos experimentos utilizando a hidrocortisona e a budesonide. A hidrocortisona
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
(cortisol), o principal hormônio glicocorticóide produzido pelo córtex adrenal e envolvido
com o estresse fisiológico, mostrou que também é capaz de potencializar os precursores
eosinofilicos no nosso estudo. Ao avaliar a hidrocortisona, estávamos em parte tentando
avaliar um possível efeito das concentrações de estresse deste hormônio sobre os
precursores eosinofilicos que pode ser encontrado na concentração de 10
-6
M (Jabara et al,
2001). No nosso estudo, a hidrocortisona mostrou efeito estatístico somente na
concentração de 10
-7
M, já perdendo este efeito em concentrações baixas. Estes resultados
estão de acordo com o fato de que a hidrocortisona apresenta uma afinidade oito vezes mais
baixa para o receptor de glicocorticóide do que a dexametasona (Vissser et al,1998), e uma
potência anti-inflamatória vinte e cinco vezes menor in vivo (Goodman & Gilman, 1996).
O estilo de vida ocidental tem sido freqüentemente associado ao aumento de
prevalência de doenças alérgicas e, desta forma , o estresse do estilo de vida ocidental pode
ajudar a fornecer um racional adequado, uma vez que existe a possibilidade de que doses
mantidas de cortisol possam hipoteticamente potencializar o número de precursores
eosinofílicos in vivo como já observamos in vitro em nosso estudo.
O budesonide foi outro corticoesteróide escolhido, tendo em vista que tem sido
amplamente utilizado por via inalatória tanto para prevenção da asma brônquica como da
rinite alérgica. A budesonide também mostrou-se capaz de potencializar os precursores
eosinofilicos.
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
A absorção sistêmica do corticoesteróide pode ocorrer após inalação ou por
deglutição da droga. Imediatamente após a inalação do corticoesteroide com aerossol ,
cerca de 10-20% da dose normal é depositada nos pulmões, enquanto que a maior parte fica
na orofaringe e é deglutida. Após absorção no trato gastrointestinal, a droga passa pelo
fígado antes de chegar a circulação sistêmica. Alguns corticoesteróides, especialmente a
budesonide e o fluticasone são metabolizados (89% e 99% respectivamente) na primeira
passagem pelo fígado dando origem a metabólitos inativos. Somente uma pequena
proporção pode ainda se manter ativa após a primeira passagem. A droga que se deposita
no pulmão é absorvida rapidamente se a droga não é bem metabolizada localmente podem
ocorrer efeitos colaterais extra pulmonares, especialmente em altas doses (Rizzo e Sole,
2006). Tendo conhecimento que a absorção sistêmica pode ocorrer, é pertinente a
preocupação com a influência desta droga sobre os precursores eosinofílicos.
Com base nos dados obtidos através da anamnese realizada com a gestante separamos
os experimentos realizados em 2 grupos: sangue de cordão umbilical humano de mães
atópicas e sangue de cordão umbilical humano de mães não atópicas. Comparando os dois
grupos observamos não observamos diferença estatisticamente significativa, embora a
magnitude do efeito tenha sido maior nos experimentos de mães atópicas. A nossa
incapacidade de demonstrar um efeito significativo da atopia, neste caso, pode ser devido
ao fato de termos ignorado uma variável importante, ou seja, a atopia paterna, que não foi
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Daniella Campelo Batalha Cox Moore
contemplada na nossa anamnese. A avaliação da atopia materna é muito importante para
atopia fetal, uma vez que a mãe contribui tanto com a parte genética como provendo um
microambiente uterino atópico. No estudo de Liu e colaboradores (Liu,. 2003), os bebês
nascidos de mães alérgicas apresentaram maior risco de serem alérgicos do que aqueles nos
quais apenas os pais eram alérgicos. Embora a contribuição materna para atopia da prole
pareça ser maior do que a do pai, certamente, a transmissão genética da atopia paterna
ocorre e não deve ser ignorada. Um desenho de estudo ideal deveria conter dados sobre a
atopia e possivelmente dosagem de IgE sérica do bebê aos 6 meses de vida.
Alternativamente, poderíamos desenhar o experimento de forma a excluir atopia no
grupo de interesse e fazer a pergunta de se a ausência de atopia (materna ou paterna), afeta
a magnitude da resposta observada aos glicocorticóides.
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ANAMNESE Prontuario:________________
Nome:__________________________________________________________________
Endereço:_______________________________________________________________
Telefone:______________________Data de nascimento:_________________________
Escolaridade:____________Estadocivil:__________ Raça:______________________
Paridade:______________ Grupo Sanguíneo:___________________________________
Hospital:________________________________________________________________
Tipo de Parto:_____________________ Indicação: ______________________________
Idade Gestacional:__________________ Tipo de anestesia:________________________
Intercorrencias gestacionais:_________________________________________________
________________________________________________________________________
Número de consultas de pré natal:____________________________________________
História Pessoal de atopia: __________________________________________________
Uso de Imunoterapia:______________________________________________________
Historia Familiar de atopia:__________________________________________________
Uso de corticoesteróide na gestação:______________________ motivo:______________
Uso de outras drogas na gestação:____________________________________________
Hábitos: Fumo__________________________ Bebida alcoólica___________________
Animais domésticos:_______________________________________________________
Condições de domicilio: saneamento básico________ água encanada________________
Água filtrada _______________ rua asfaltada ___________ pessoas morando no
domicílio________________________________________________________________
Hábitos alimentares: _______________________________________________________
(leite, frutas, yougurtes, leite fermentado, carne de vaca, peixe, gordura trans).
Eventos estressantes durante a gravidez:_______________________________________
_______________________________________________________________________
(perda de emprego, perda de parceiro, morte ou doença na família, falta de dinheiro,
mudança de domicilio)
Sorologias da gestação:
VDRL:_________________________
Anti HIV:________________________ data:____________________
Anti hepatite B:___________________ data:____________________
Anti Toxoplasmose:________________ data:____________________
Anti Rubéola:_____________________ data:____________________
Doenças Prévias a gestação:_________________________________________________
Doenças da gestação:______________________________________________________
Nome do RN_______________ Sexo =________ Pnasc=___________
Est=_____________ Apgar=___________ Data do parto=___________________
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto Estudo das Células Progenitores hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical:
interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação alérgica e impacto da exposição
perinatal aos corticoesteróides
Instituição: Instituto Fernandes Figueira/ Fundação Oswaldo Cruz/MS-RJ.
Pesquisador responsável: Daniella Campelo Batalha Cox Moore.
Orientadores: Dra. Maria Ignez Capella Gaspar Elsas e Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas.
Paciente:____________________________________ Prontuário: ______________________
Após estar inteiramente esclarecida sobre a natureza da pesquisa, eu,________________________________, estou sendo solicitada a
contribuir numa investigação científica no período destinado à pesquisa.
Informações sobre o estudo
:
O estudo tem a finalidade de estudar o eosinófilo que é uma célula presente no sangue que
tem importância em várias doenças alérgicas como a asma brônquica, a rinite alérgica, a dermatite
atópica, dentre outras. Buscando entender melhor esta célula, seu comportamento, como reage a
remédios tradicionalmente utilizados para tratar as doenças alérgicas, pretendemos com isso
aumentar o conhecimento nesta área para que o médico tenha um melhor entendimento das doenças
alérgicas e com isto melhorar a forma como trata seus pacientes.
Assim, estou sendo informada:
1. Recebi informações sobre o procedimento, riscos, benefícios e inconvenientes do exame.
2. Que a pesquisadora manterá sigilo sobre a identidade da paciente e que todas as informações
contidas no prontuário da paciente são consideradas confidenciais.
3. Que o exame a ser realizado será colhido do sangue vindo do cordão umbilical após o parto;
Desta forma, não existe qualquer risco ou desconforto para a paciente ou para o recém
nascido.
4. Que a coleta de 15ml de sangue do cordão umbilical destina-se a realização de estudos do
projeto de pesquisa registrado no Instituto Fernandes Figueira.
5. Que este procedimento não interfere com o parto, recuperação da gestante e com o recém
nascido.
6. Que se assim desejar, terei acesso livre aos resultados dos exames realizados no sangue
obtido do cordão umbilical.
7. Que a recusa em participar da pesquisa jamais terá qualquer penalidade ou constrangimento
por parte da Instituição, a qual manterá o acompanhamento e o tratamento pelos mesmos
médicos que prestam atendimentos pela saúde da puérpera e do Recém nascido.
Nesta pesquisa médica não será testada qualquer medicação. não há fins lucrativos, apenas de
aumento de conhecimento na área médica.
Declaro estar ciente deste termo de consentimento autorizando a coleta de sangue do cordão
umbilical após o parto, sendo de minha responsabilidade participar deste projeto.
Paciente:_____________________________________________________________________.
Rio de Janeiro, ____ de ________ de ________.
OBS.: A paciente poderá pedir informações sobre a pesquisa sempre que achar necessário. A médica a ser
contactada neste caso será:
Nome: Dra. Daniella Campelo Batalha Cox Moore. Endereço: Av. Rui Barbosa , 176 - Flamengo.
Tel: 25541731 (Laboratório de Fisiopatologia Humana)
Comitê de Ética em Pesquisa. Endereço: Rua Afonso Cavalcanti, 455, sala 701 Cidade Nova.
Tel: 2503-2024/ 2503-2026.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto Estudo das Células Progenitores hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical:
interação com drogas e citocinas relevantes para a inflamação alérgica e impacto da exposição
perinatal aos corticoesteróides
Instituição: Instituto Fernandes Figueira/ Fundação Oswaldo Cruz/MS-RJ.
Pesquisador responsável: Daniella Campelo Batalha Cox Moore.
Orientadores: Dra. Maria Ignez Capella Gaspar Elsas e Dr. Pedro Paulo Xavier Elsas.
Paciente:____________________________________ Prontuário: ______________________
Após estar inteiramente esclarecida sobre a natureza da pesquisa, eu,________________________________, estou sendo solicitada a
contribuir numa investigação científica no período destinado à pesquisa.
Informações sobre o estudo
:
O estudo tem a finalidade de estudar o eosinófilo que é uma célula presente no sangue que
tem importância em várias doenças alérgicas como a asma brônquica, a rinite alérgica, a dermatite
atópica, dentre outras. Buscando entender melhor esta célula, seu comportamento, como reage a
remédios tradicionalmente utilizados para tratar as doenças alérgicas, pretendemos com isso
aumentar o conhecimento nesta área para que o médico tenha um melhor entendimento das doenças
alérgicas e com isto melhorar a forma como trata seus pacientes.
Assim, estou sendo informada:
8. Recebi informações sobre o procedimento, riscos, benefícios e inconvenientes do exame.
9. Que a pesquisadora manterá sigilo sobre a identidade da paciente e que todas as informações
contidas no prontuário da paciente são consideradas confidenciais.
10. Que o exame a ser realizado será colhido do sangue vindo do cordão umbilical após o parto;
Desta forma, não existe qualquer risco ou desconforto para a paciente ou para o recém
nascido.
11. Que a coleta de 15ml de sangue do cordão umbilical destina-se a realização de estudos do
projeto de pesquisa registrado no Instituto Fernandes Figueira.
12. Que este procedimento não interfere com o parto, recuperação da gestante e com o recém
nascido.
13. Que se assim desejar, terei acesso livre aos resultados dos exames realizados no sangue
obtido do cordão umbilical.
14. Que a recusa em participar da pesquisa jamais terá qualquer penalidade ou constrangimento
por parte da Instituição, a qual manterá o acompanhamento e o tratamento pelos mesmos
médicos que prestam atendimentos pela saúde da puérpera e do Recém nascido.
Nesta pesquisa médica não será testada qualquer medicação. não há fins lucrativos, apenas de
aumento de conhecimento na área médica.
Declaro estar ciente deste termo de consentimento autorizando a coleta de sangue do cordão
umbilical após o parto, sendo de minha responsabilidade participar deste projeto.
Paciente:_____________________________________________________________________.
Rio de Janeiro, ____ de ________ de ________.
OBS.: A paciente poderá pedir informações sobre a pesquisa sempre que achar necessário. A médica a ser
contactada neste caso será:
Nome: Dra. Daniella Campelo Batalha Cox Moore.
Endereço: Av. Rui Barbosa , 176 - Flamengo. Tel: 25541731 (Laboratório de Fisiopatologia
Humana)
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