( PDF ) Estudo de espécies do gênero solanum (solanaceae): quimiotaxonomia e ensaios biológicos

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA PROF. DELBY

FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

ESTUDO DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM (SOLANACEAE):

QUIMIOTAXONOMIA E ENSAIOS BIOLÓGICOS

ROBERTO JEFFERSON BEZERRA DO NASCIMENTO

JOÃO PESSOA, PARAÍBA-BRASIL

FEVEREIRO DE 2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA PROF. DELBY

FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

ESTUDO DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM (SOLANACEAE):

QUIMIOTAXONOMIA E ENSAIOS BIOLÓGICOS

ROBERTO JEFFERSON BEZERRA DO NASCIMENTO

Sob a Orientação da Professora: Dra. Tania Maria Sarmento da Silva

Dissertação submetida como requisito

parcial para obtenção do grau de

Mestre em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos. Área de

concentração em Farmacoquímica.

JOÃO PESSOA, PARAÍBA-BRASIL

FEVEREIRO DE 20

ads:

III

Ficha Catalográfica

N244e Nascimento, Roberto Jefferson Bezerra do

Estudo de espécies do gênero Solanum (Solanaceae):

quimiotaxonomia e ensaios biológicos/ Roberto Jefferson Bezerra do

Nascomento, João Pessoa, 2006.

103p.

Orientadora: Tania Maria Sarmento da Silva

Dissertação (Mestrado)-UFPB/LTF

1. Solanum, 2. Quimiotaxonomia, 3. Flavonóides.

UFPB/BC CDU: 582.951.4 (043)

ESTUDO DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM (SOLANACEAE):

QUIMIOTAXONOMIA E ENSAIOS BIOLÓGICOS

ROBERTO JEFFERSON BEZERRA DO NASCIMENTO

Aprovada em 24 de fevereiro de 2006

Dra. Tania Maria Sarmento da Silva ________________________________________

(CCS-LTF-UFPB)

(Orientadora)

Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira __________________________________________

(CCS-LTF-UFPB)

Prof. Dr. Jorge Maurício David __________________________________________

(IQ-UFBA)

Prof. Dr. Jnanabrata Bhatthachayya __________________________________________

(CCS-LTF-UFPB)

JOÃO PESSOA, PARAÍBA-BRASIL

FEVEREIRO DE 2006

Dedico esta dissertação a minha grande esposa Simone Ayres

Mendes do Nascimento pelo amor e presença constante e ao nosso

filho querido, o pequeno notável, Gabriel Ayres Bezerra do

Nascimento.

Aos meus queridos pais Abmar Lucas do Nascimento e Maria

Daguia Bezerra do Nascimento que com a ajuda de Deus abriram as

portas para o meu sucesso, mesmo diante de tantas dificuldades.

AGRADECIMENTOS

-Ao Pai criador, razão da minha existência.

- Aos meus Pais, Abmar Lucas e Maria Daguia; irmãos: Welmax e Litzamary, e todos os

outros familiares, sem exceção.

- A Professora Dra. Tania Maria Sarmento da Silva, por ter me apresentado à pesquisa

científica no LTF-UFPB, pela orientação, amizade e ensinamentos indispensáveis em minha

formação.

- Ao Professor Dr. Celso de Amorim Camara, por ter me apresentado à pesquisa científica no

LTF-UFPB, pelo apoio e amizade.

- Ao LTF, UFPB e CNPq, pela oportunidade, acolhimento e apoio financeiro.

- A Professora Dra. Maria de Fátima Agra, pela grande contribuição na coleta e identificação

botânica das espécies estudadas.

- Ao Professor Dr. Eduardo de Jesus Oliveira, pelas explicações e ensinamentos bem como a

ajuda com a CLAE-DAD.

- À Professora Dra. Bagnólia de Araújo Silva da UFPB, por colaborar com os estudos das

espécies do gênero Solanum através da realização dos testes biológicos em músculo liso e

pelos ensinamentos e apoio constante.

- A todos os participantes dos seminários de grupo, que contribuíram de forma bastante

concreta no meu polimento para o ensino e apresentação da dissertação. Em especial aos

professores: Tania Maria Sarmento da Silva, Celso de Amorim Camara, Temilce Simões de

Assis, Eduardo de Jesus Oliveira, Mário Luiz Araújo de Almeida Vasconcellos e Heloisa

Mello.

- Aos amigos e colegas de laboratório, Kristerson Reinaldo, Ticiano Pereira, Antônio Cláudio,

Stanley Chavez, Rodrigo Molina, Rodrigo Albuquerque, Thiago Gomes, Daniella Fernandes,

Girliane Regina e Íris, cujo companheirismo e apoio me auxiliou bastante.

- Aos colegas da pós-graduação, todos, sem exceção.

-Aos técnicos, Raimundo Nonato, Vicente Carlos, Sócrates Golzio e Alexsandro, sem o

auxilio deles não teria feito muita coisa.

VII

ÂTÑÜxÇw| Öâx Éá áÉÇ{Éá àÜtÇáyÉÜÅtÅ t ä|wt xÅ

âÅt zÜtÇwx täxÇàâÜtA XÄxá ÇûÉ wxàxÜÅ|ÇtÅ É

ÄâztÜ tÉÇwx äÉv£ ät| v{xztÜ? Åtá ÑÜÉwâéxÅ t

yÉÜ†t ÇxvxááöÜ|t ÑtÜt tÜÜtÇvö@\É wÉ ÄâztÜ xÅ

Öâx äÉv£ xáàöAÊ

Augusto Cury

Nunca desista dos seus sonhos

Augusto Cury. - Rio de Janeiro: Sextante, 2004.

VIII

SUMÁRIO

Ficha Catalográfica ................................................................................................................... III

Índice de Figuras....................................................................................................................... XI

Índice de Esquemas................................................................................................................ XIV

Índice de Quadros .................................................................................................................. XIV

Índice de tabelas.......................................................................................................................XV

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS........................................................................................ XVI

RESUMO.............................................................................................................................XVIII

ABSTRACT........................................................................................................................... XIX

Produção bibliográfica em anais de congressos e encontros ...................................................XX

Substâncias isoladas neste trabalho ....................................................................................... XXI

Derivado obtido neste trabalho .............................................................................................XXII

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 9

2.1 GERAL ................................................................................................................................. 9

2.2 ESPECÍFICOS...................................................................................................................... 9

3. ASPECTOS BOTÂNICOS................................................................................................... 10

3.1 Solanum agrarium Sendtner ........................................................................................... 10

3.1.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA................................................................................... 10

3.1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA..................................................................................... 10

3.1.3 NOMES LOCAIS ............................................................................................................ 11

3.2 Solanum asperum Richard.............................................................................................. 11

3.2.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA................................................................................... 11

3.2.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA..................................................................................... 11

3.2.3 NOMES LOCAIS ............................................................................................................ 11

3.3 Solanum stipulaceum Roem & Schult ............................................................................ 12

3.3.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA................................................................................... 12

3.3.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA..................................................................................... 12

3.3.3 NOME LOCAL ............................................................................................................... 12

4. EXPERIMENTAL GERAL.................................................................................................. 13

4.1 Equipamentos e reagentes................................................................................................... 13

4.1.1 Derivatizações.................................................................................................................. 13

a) Acetilação ............................................................................................................................. 14

4.1.2 Teste anti-radicalar........................................................................................................... 14

4.1.3 Bioensaio com Artemia salina................................................................................. 14

CAPÍTULO I ............................................................................................................................ 15

ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS DE SOLANUM STIPULACEUM ROEM & SCHULT 16

I.1 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum stipulaceum Roem & Schult........ 17

I.2. Identificação estrutural dos constituintes de Solanum stipulaceum Roem & Schult ......... 19

ESTUDO QUÍMICO DAS PARTES AÉREAS DE SOLANUM ASPERUM RICHARD....... 31

I.3 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum asperum Richard...................... 32

I.4 Determinação estrutural dos constituintes de Solanum asperum Richard........................... 34

ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS SOLANUM AGRARIUM SENDTNER ........................ 52

I.6 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum agrarium Sendtner....................... 53

I.7 Determinação estrutural do constituinte de Solanum agrarium Sendtner....................... 54

CAPÍTULO II ........................................................................................................................... 58

II.1 Introdução........................................................................................................................... 59

II.2 Objetivos ............................................................................................................................ 59

II.3 Experimental .................................................................................................................. 59

II.3.1 Instrumental............................................................................................................. 59

II.3.2 Material vegetal e isolamento dos flavonóides ....................................................... 60

II.4 Análise Por CLAE-DAD................................................................................................ 61

II.4.1 Reagentes e flavonóides padrões............................................................................. 61

II.4.2 CLAE dos flavonóides padrões............................................................................... 61

II.4.3 CLAE-DAD dos extratos de Solanum e identificação das substâncias .................. 63

II.5 Resultados e Discussão ...................................................................................................... 76

II.6 Conclusões ......................................................................................................................... 80

CAPÍTULO III.......................................................................................................................... 81

ESTUDO DA ATIVIDADE SEQUESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DE ESPÉCIES

DE SOLANUM.......................................................................................................................... 82

III.1 Introdução ..................................................................................................................... 83

III.1.2 Objetvos ......................................................................................................................... 83

III.1.3 Metodologia................................................................................................................... 83

III.1.4 Resultados e Discussão.................................................................................................. 84

ENSAIO DE TOXIDADE DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM FRENTE À ARTEMIA

SALINA ..................................................................................................................................... 88

III.2 Introdução ......................................................................................................................... 89

III.2.1 Metodologia................................................................................................................... 90

III.2.1.1 Material vegetal e preparação dos extratos......................................................... 90

III.2.1.2 Preparação dos Extratos.............................................................................................. 90

III.2.2 Ensaio Biológico.................................................................................................... 90

III.2.3 Resultados e Discussão.......................................................................................... 91

III.2.4 Conclusão............................................................................................................... 92

5. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 94

6. REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 95

Índice de Figuras

FIGURA 1. GLICOALCALÓIDES ISOLADOS DE ESPÉCIE DO GÊNERO SOLANUM. .............................. 5

FIGURA 2. NÚCLEO BÁSICO DOS FLAVONÓIDES ........................................................................... 6

FIGURA 3. ESPECTRO NO IV (KBR) DO FLAVONÓIDE 1.............................................................. 19

FIGURA 4. ESPECTRO NO IV (KBR) DO FLAVONÓIDE 2.............................................................. 19

FIGURA 5. A) ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 1 (TILIROSÍDEO) ........... 21

FIGURA 6. A) ESPECTRO DE APT (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 1 (TILIROSÍDEO)......................... 22

FIGURA 7. ESPECTRO DE HMQC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 1

(TILIROSÍDEO). ................................................................................................................... 23

IGURA 8. ESPECTRO DE HMBC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 1

(TILIROSÍDEO) .................................................................................................................... 24

FIGURA 9. ESPECTRO DE COSY

H (200 MHZ EM DMSO-D

) DO FLAVONÓIDE 1

(TILIROSÍDEO). ................................................................................................................... 25

FIGURA 10. ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 2 (KANFEROL) ................. 27

FIGURA 11. ESPECTRO NO IV (KBR) DO FLAVONÓIDE 3............................................................ 28

FIGURA 12. ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 3 (QUERCETINA).............. 29

FIGURA 13. ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO ÁCIDO P-HIDROXIBENZÓICO (4)............ 30

FIGURA 14. A) ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 5................................. 34

FIGURA 15. ESPECTRO DE IV (KBR) DO FLAVONÓIDE 6. ........................................................... 35

FIGURA 16. A) ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6................................. 36

FIGURA 17. ESPECTRO DE APT (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6 ................................................... 38

IGURA 18. ESPECTRO DE HMQC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6 .... 39

IGURA 19. ESPECTRO DE HMBC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6..... 40

FIGURA 20. CROMATOGRAMA E ESPECTROS DE UV (CLAE-DAD) DOS PADRÕES DOS

FLAVONÓIDES

.................................................................................................................... 43

FIGURA 21. ESPECTRO NO IV (KBR) DE 6A ............................................................................... 44

FIGURA 22. A) ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6A .............................. 46

FIGURA 23. D) EXPANSÃO EM CAMPO ALTO DO ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DE 6A. . 47

FIGURA 24. A) ESPECTRO DE APT (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6A............................................ 47

FIGURA 25. C), D) E E). EXPANSÕES DO ESPECTRO DE APT (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6A ..... 48

FIGURA 26. ESPECTRO DE HMBC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 6A. . 49

IGURA 27. A) ESPECTRO DE RMN DE

H (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 7 (3,3’,7-TRI-O-METIL-

MIRICETINA) ...................................................................................................................... 54

XII

FIGURA 28. A) ESPECTRO DE APT (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 7 (3,3’,7-TRI-O-METIL-

MIRICETINA) ...................................................................................................................... 55

FIGURA 29. ESPECTRO DE HMQC (RMN

H: 200 MHZ, APT: 50 MHZ) DO FLAVONÓIDE 7

(3,3’,7-TRI-O-METIL-MIRICETINA)..................................................................................... 55

FIGURA 30. ESPECTRO DE NOESY (200 MHZ) DO FLAVONÓIDE 7 (3,3’,7-TRI-O-METIL-

MIRICETINA) ...................................................................................................................... 56

FIGURA 31. CROMATOGRAMA DOS FLAVONÓIDES PADRÕES. .................................................... 62

FIGURA 32. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E ESPECTRO DE UV-VISÍVEL DO EXTRATO

MEOH DAS FOLHAS DE S. ACRESCENS SSP. FLOCCOSUM. .................................................... 63

FIGURA 33. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

CORDIFOLIUM

..................................................................................................................... 64

FIGURA 34. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

DECOMPOSITIFOLIUM

.......................................................................................................... 65

FIGURA 35. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

DIAMANTINENSE

.................................................................................................................. 66

FIGURA 36. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

MEGALONYX

........................................................................................................................ 66

FIGURA 37. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE

RONDONIENSE

.................................................................................................................... 67

FIGURA 38. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

HEXANDRUM

....................................................................................................................... 68

IGURA 39. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

MARONIENSE

....................................................................................................................... 69

IGURA 40. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

POLYTRICHUM

..................................................................................................................... 70

IGURA 41. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

POLYTRICHUM

..................................................................................................................... 71

FIGURA 42. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

GRANDIFLORUM

.................................................................................................................. 72

FIGURA 43. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

LEPTOSTACHYO

................................................................................................................... 73

IGURA 44. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

LEPTOSTACHYO

................................................................................................................... 74

XIII

FIGURA 45. CROMATOGRAMA POR CLAE-DAD E UV DO EXTRATO MEOH DAS FOLHAS DE S.

FULVIDUM

.......................................................................................................................... 75

FIGURA 46. ESTRUTURAS DO DPPH, BHT E ÁCIDO ASCÓRBICO ............................................... 84

FIGURA 47. GRUPOS FUNCIONAIS NECESSÁRIOS PARA HAVER ATIVIDADE ANTI-RADICALAR. ... 85

FIGURA 48. ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DO EXTRATO MEOH BRUTO, DAS

FRAÇÕES E DE UMA SUBSTÂNCIA ISOLADA DAS FOLHAS DE

SOLANUM STIPULACEUM ROEM &

SCHULT.............................................................................................................................. 86

FIGURA 49. ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DO EXTRATO MEOH BRUTO E

DAS FRAÇÕES DAS PARTES AÉREAS DE

SOLANUM ASPERUM RICHARD................................. 87

FIGURA 50. ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DO EXT. ETOH BRUTO E DA

FRAÇÃO

ACOET DAS FOLHAS DE SOLANUM AGRARIUM SENDTNER..................................... 87

XIV

Índice de Esquemas

ESQUEMA 2. ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS DE SOLANUM ASPERUM RICHARD. ...................... 33

ESQUEMA 3. MECANISMO PARA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DO FLAVONÓIDE 6........................... 45

ESQUEMA 4. MARCHA PARA O ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS DE SOLANUM AGRARIUM

SENDTNER. ........................................................................................................................ 53

ESQUEMA 5. ESQUEMA FILOGENÉTICO ILUSTRANDO O RELACIONAMENTO ENTRE CADA SEÇÃO

COM BASE NA COMPLEXIDADE BIOSSINTÉTICA

*................................................................. 79

ESQUEMA 6. PROPOSTA BIOSSINTÉTICA PARA OS FLAVONÓIDES DE SOLANUM SEÇÃO

ERYTHTROTRICHUM CHILD. ................................................................................................ 80

Índice de Quadros

QUADRO 1. FLAVONÓIDES AGLICONAS ISOLADOS DE SOLANUM SUBG. LEPTOSTEMONUM.......... 77

QUADRO 2. USOS NA MEDICINA POPULAR E OUTROS DE SOLANUM SPP. DO NORDESTE DO BRASIL.

.......................................................................................................................................... 92

Índice de tabelas

TABELA 1. SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE SOLANUM STIPULACEUM ROEM & SCHULT................... 18

TABELA 2. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) E

C (50 MHZ) DO TILIROSÍDEO (1) ................ 26

TABELA 3. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) DO KANFEROL (2)............................................. 27

TABELA 4. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) DE QUERCETINA (3).......................................... 29

TABELA 5. SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE SOLANUM ASPERUM RICHARD E OS DERIVADOS OBTIDOS.

.......................................................................................................................................... 33

TABELA 6. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) E

C (50 MHZ) DO GLICOSÍDEO 6 3-O-[Β-D-

GLICOPIRANOSIL-(1→6)-Α-L-RAMNOPIRANOSIL]-7-O-Α-L-RAMNOPIRANOSILKANFEROL 41

TABELA 7. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) E

C (50 MHZ) DO GLICOSÍDEO 6A ACETILADO50

TABELA 8. DADOS DE INTERAÇÃO HETERONUCLEAR SPIN-SPIN A LONGA DISTÂNCIA (

)

DE ÁTOMOS DE CARBONO E HIDROGÊNIO OBTIDOS DO ESPECTRO DE

HMBC DE 6A. .......... 51

TABELA 9. DADOS DE RMN DE

H (200 MHZ) E

C (50 MHZ) DO FLAVONÓIDE (7)................ 57

TABELA 10. ESPÉCIES DE SOLANUM SUBG. LESPTOSTEMONUM RETIRADAS DE EXCICATAS DE

HERBÁRIOS

......................................................................................................................... 61

TABELA 11. ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DE ESPÉCIES DO GÊNERO

SOLANUM UTILIZANDO O RADICAL LIVRE DPPH. .............................................................. 86

TABELA 12. BIOENSAIO (CONCENTRAÇÃO LETAL MÉDIA) DOS EXTRATOS METANÓLICOS DAS

RAÍZES

, PARTES AÉREAS E/OU FRUTOS DE SOLANUM SPP. EM ARTEMIA SALINA E

COMPARAÇÃO COM A ATIVIDADE MOLUSCICIDA

................................................................ 93

XVI

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

δ deslocamento químico (ppm)

Ac acetila

O anidrido acético

AcOEt acetato de etila

AcOH ácido acético

Ar arila

APT Attached Proton Test

CC Cromatografia em Coluna (pressão atmosférica)

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

COSY Correlated Spectroscopy

d dubleto

dd duplo dubleto

dl dubleto largo

DAD Detector com Arranjo de Diodos

DMSO-d

dimetilsulfóxido deuterado

DPPH 1,1-difenil-2-picril-hidrazila

EtOH etanol

Ext. extrato

Hex:EtO

Hexano: éter

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence

Hz Hertz

IV Infra-Vermelho

J constante de acoplamento

m multipleto

MeOH metanol

MHz Megahertz

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C Ressonâncua Magnética Nuclear de Carbono-13

s singleto

XVII

sl singleto largo

t tripleto

XVIII

RESUMO

ESTUDO DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM (SOLANACEAE):

QUIMIOTAXONOMIA E ENSAIOS BIOLÓGICOS

Roberto Jefferson Bezerra do Nascimento

Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (Farmacoquímica)

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, UFPB, Caixa Postal 5009, Cep 58051-970 João

Pessoa, Paraíba, Brasil. ([email protected]).

O gênero Solanum (Solanaceae) é considerado o maior e o mais complexo das

angiospermas com cerca de 1250 espécies e 5000 epitétos publicados. Este trabalho teve como

objetivo estudar espécies de Solanum ssp. dando ênfase na quimiotaxonomia e testes

biológicos. O estudo químico com as folhas de Solanum agrarium resultou no isolamento do

flavonóide 3,3’,7-O-tri-metil-miricetina. Das partes aéreas de Solanum asperum foram

isolados os flavonóides tilirosídeo e 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6) α-L-ramnopiranosil]-7-O-

α-L-ramnopiranosilkanferol e S. stipulaceum forneceu as substâncias tilirosídeo, kanferol,

quercetina e ácido p-hidroxibenzoico. Os extratos brutos e as frações obtidas destas três

espécies mostraram atividade antiradicalar frente ao DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil). Uma

correlação quimiotaxonomica (por CLAE-DAD) foi realizada com S. agrarium, 12 espécies

coletadas em herbário e espécies estudadas anteriormente (S. jabrense, S. rythidoandrum, S.

paludosum, S. paraibanum e S. stramonifolium), todas sendo do subgênero Leptostemonum.

Os tricomas estrelados de duas espécies de Solanum subgênero Brevantherum foram também

anlisados e mostraram a presença de flavonóides glicosilados. Através dos padrões de

substituição apresentados pelos flavonóides já isolados, incluindo também os novos

resultados, de espécies de Solanum foi possível desenvolver uma hipótese do relacionamento

filogenético entre as seções Erythrotrichum e Brevantherum. A similaridade química

apresentada pelas espécies de um mesmo subgênero suporta a classificação infregenérica

tradicional, baseado na morfologia. Foi proposta também uma rota biossintética para Solanum

seção Erythrotrichum. O teste de toxicidade com Artemia salina foi realizado com 13

espécies de Solanum ssp. que foram testadas anteriormente em Biomphalaria glabrata. O

resultado mostrou que muitas espécies de Solanum spp. ativas no ensaio com Artemia salina

não são ativas para o molusco Biomphalaria glabrata. Por outro lado todas as plantas que

apresentaram atividade moluscicida também foram ativas com Artemia salina.

XIX

ABSTRACT

CHEMOTAXONOMIC AND BIOLOGICAL ASSAY OF SOLANUM SSP.

(SOLANACEAE)

Roberto Jefferson Bezerra do Nascimento

Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (Farmacoquímica)

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, UFPB, Caixa Postal 5009, Cep 58051-970 João

Pessoa, Paraíba, Brasil. ([email protected]).

The genus Solanum (Solanaceae) which comprised of about 1250 species and 5000

published epithets is considered to be the largest and the most complex among the

Angiosperms. The aim of this work is to study three species of Solanum with emphasis on

chemotaxonomy and biological assay. The chemical study of the leaves of Solanum agrarium

resulted in the isolation of the flavonoid, myricetin 3,3’,7- tri- O-methyl ether. The leaves of S.

stipulaceum furnished three flavonóides; kaempferol, quercetin, and tilliroside. The aerial

parts of S. asperum also afforded the flavonoid tilliroside in addition to 3-O-[β-D-

glycopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkaempferol. The crude

extract and soluble fraction of each of the three species studied showed free radical scavenging

property as measured by DPPH. An attempt was made to study the chemotaxonomic

relationship (by HPLC-DAD) betwen S. agrarium, 12 specimens collected from herbarium

sheets and species studied earlier such as S. jabrense, S. rythidoandrum, S. paludosum, S.

paraibanum, and S. stramonifolium all belonging to the Solanum subg. Laptostemonum. The

two species of Solanum subgenus Brevantherum, S. asperum and S. stipulaceum showed the

presence of flavonoids in the stellate trichomes. On the basis of the existing knowledge on

flavonoid patterns in addition to the new results on ring substitution in the flavonoid content in

members of the Solanum, subgenus Leptostemonum and Brevantherum, it is possible to

develop a hypothesis on phylogenetic relationships between sections Erythrotrichum and

Brevantherum as well as the biosynthetic route for Erythrotrichum section. The chemical

similarity presented by most of the species is a strong evidence in support of the traditional

infrageneric classification as well as the placement of species in the subgenus Leptostemonum

and Bravantherum based on morphological features. The methanolic extracts of 13 Solanum

spp. were tested for bioactivity aganist Artemia salina. The extracts investigated were

prepared from various parts of the plants. The lethal concentrations of the extracts were

determined. Four of the thirteen plants tested to be inactive. All of the plants previously

showing molluscicidal activity against Biomphalaria glabrata were also found to be active in

brine shrimp bioassay.

Produção bibliográfica em anais de congressos e encontros

1. NASCIMENTO, Roberto Jefferson Bezerra; SILVA, Tania Maria Sarmento; CAMARA,

Celso Amorim; AGRA, Maria Fátima; LUNA FREIRE, Kristerson Reinaldo; LINS, Antônio

Cláudio Silva. Flavonóides e Atividade Antioxidante das Folhas de Solanum stipulaceum

Roem & Schult. In: 28A REUNIÃO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 2005,

Poços de Caldas.

2. NASCIMENTO, Roberto Jefferson Bezerra; SILVA, Tania Maria Sarmanto da; CAMARA,

Celso de Amorim; AGRA, Maria de Fátima. Flavonóides Glicosilados Isolados das Partes

Aéreas de Solanum asperum Richard. In: V SIMPÓSIO BRASILEIRO DE

FARMACOGNOSIA, 2005, Recife.

3. NASCIMENTO, Roberto Jefferson Bezerra; SILVA, Tania Maria Sarmanto; CAMARA,

Celso Amorim; AGRA, Maria Fátima. Estudo Fitoquímico de Solanum agrarium Sendtner.

In: IV SIMPÓSIO BRASILEIRO DE FARMACOGNOSIA, 2003, Salvador/BA.

4. NASCIMENTO, Roberto Jefferson Bezerra. Estudo Químico de Solanum megalonyx

Sendtner e Solanum stipulaceum Roem & schult. In: III ENCONTRO ANUAL DE

PESQUISA DO LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA-UFPB. Dezembro

de 2004.

XXI

Substâncias isoladas neste trabalho

Flavonóides:

Solanum stipulaceum Roem & Schult

5 ''

1 ''

8 '''

6 ''

3 ''

4 ''

9 '''

7 '''

2 '''

2 ''

5 '''

6 '''

4 '''

3 '''

1 '''

Solanum asperum Richard

5 ''

1 ''

8 '''

6 ''

3 ''

4 ''

9 '''

7 '''

2 '''

2 ''

5 '''

6 '''

4 '''

3 '''

1 '''

2R1

1R1

3R1

4R1

5R1

2R2

1R2

3R2

4R2

5R2

6R2

6R1

Solanum agrarium Sendtner

(5)

tilirosídeo

(6)

3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-

ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol

(1)

tilirosídeo

(2)

kanferol

(3)

quercetina

(7)

3,3’,7-tri-O-metil-miricetina

XXII

Solanum stipulaceum Roem & Schult

Derivado obtido neste trabalho

Flavonóides:

OAc

AcO

OAc

AcO

2R1

1R1

3R1

4R1

5R1

2R2

1R2

3R2

4R2

5R2

6R2

6R1

(4)

ácido p-hidroxibenzóico

(6a)

3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-

ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol

peracetilado

1. INTRODUÇÃO

O ser humano com sua incessante curiosidade oferece constantemente interpretações

para os acontecimentos físicos, químicos, biológicos e psíquicos que já ocorriam desde a

origem das espécies, mais propriamente do universo. Os estudos conduziram à produção de

uma linguagem sistemática, empírica e crescente, que no passado dobrava-se a cada duzentos

anos, hoje em cinco aproximadamente, e transmite de forma lógica os meandros dos

acontecimentos imperceptíveis aos olhos, requerendo a memorização e consulta de um número

crescente de termos e regras. A partir deste conhecimento o homem chegou aos avanços

tecnológicos que propiciam o surgimento das mais avançadas e elaboradas formas de atender

as necessidades humanas. Um exemplo disto é a produção de medicamentos que de forma

concreta contribui ajudando a estabelecer maior e melhor sobrevida ao ser humano bem como

evitar, até mesmo, o seu desaparecimento da face da Terra.

O homem cada vez mais fez uso da arte de pensar, o que permite diferenciá-lo dos

outros seres terrestres, portanto criou as mais diversas ciências que hoje conhecemos. As

ciências exatas da natureza representam de forma consistente o que o pensamento humano foi

e é capaz de produzir na busca de recursos naturais que atinjam rendimentos e elevada

importância científica, econômica e principalmente social visando uma melhor qualidade de

vida. Mais especificamente, a química de produtos naturais, é um dos ramos científicos que

condensa as idéias sobre a busca incessante de produtos farmacêuticos utilizando a própria

natureza como fonte ou modelo para obtenção de produtos úteis na prevenção, tratamento e

até mesmo erradicação de doenças ou males que afligem a população mundial.

Apesar de ter acumulado o conhecimento ao longo dos séculos a espécie humana se

aproveita de uma fração muito pequena das plantas com as quais sempre conviveu e que a

antecedem no planeta Terra. O reino vegetal ainda permanece como uma grande incógnita

cujos mistérios começam a serem desvendados. A humanidade ao longo do tempo selecionou

apenas cerca de 300 plantas para a alimentação e, de um pouco mais de uma centena, obteve

princípios ativos puros para o tratamento de doenças. Estes números são bem modestos

quando se está diante de um universo de aproximadamente 250.000 espécies de plantas

superiores. Porém, a natureza de forma geral tem produzido um grande número das

substâncias orgânicas conhecidas (PINTO et al., 2002). Entre esta riqueza, as Angiospermas

são as mais numerosas, mais conhecidas e economicamente importantes. São as plantas que

dominam praticamente todos os ecossistemas terrestres.

Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o que tem contribuído de forma

mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários. O isolamento das primeiras

substâncias puras do reino vegetal começa a acontecer no século XVIII. Este século,

juntamente com o XIX, caracteriza-se pelos trabalhos de extração, principalmente de ácidos

orgânicos e de alcalóides. É desta época o isolamento de morfina (1) (1806), quinina (2) e

estriquinina (3) (1820) (PINTO et al., 2002), muitos destes de grande valor agregado devido

às suas aplicações como medicamento, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PHILLIPSON

et al., 1998). Muitas dessas substâncias constituem-se, sobretudo, em modelos para o

desenvolvimento de medicamentos sintéticos modernos, tais como procaína, cloroquina,

tropicamida (PINTO et al., 2002), ou de fármacos imprescindíveis como, vimblastina

(Velban®) (a), vincristina (Oncovin®) (b), podofilotoxina e os análogos etoposídeo (VP-16-

213; Vepeside®) (c) e teniposídeo (VM-26; Vumon®) (d), taxol e (Paclitaxel; Taxol®) (e),

com participação em um mercado que movimenta cerca de 50 bilhões de dólares anualmente.

Depois da descoberta destes medicamentos de origem vegetal, é possível entender a

competição entre algumas indústrias internacionais pela busca de substâncias novas bioativas.

Esta busca foi intensificada nos anos 90, especialmente nas florestas tropicais onde se

concentra grande parte da biodiversidade (ROUHI, 1997) e especialmente no Brasil, onde a

grande maioria das espécies continua sem qualquer estudo químico ou biológico (CORDELL,

1995).

O homem sempre procurou entender a natureza da vida e as chances de alcançá-la.

Novas informações sobre genes e suas funções, em parte, são responsáveis por uma revolução

tecnológica dirigida para as ciências da vida. Cabe neste momento ao químico brasileiro, parar

e refletir sobre o que nós realmente precisamos saber para passarmos da compilação de dados

para o entendimento destes (PINTO et al., 2002) ressaltando que a descoberta de um princípio

OCOPh

AcO

Taxol(e)

MeO

MeO OAc

R=Me vimblastina

R=CHO vincristina

(a)

(b)

OMe

MeO

R=Me etoposídeo

R= teniposídeo

(c)

(d)

ativo, por mais importante que seja a sua propriedade farmacológica, pode ficar restrita a uma

publicação científica se o seu isolamento pelas técnicas químicas tradicionais for

economicamente inviável. Por isso, o químico de produtos naturais deve enveredar pelos

estudos de biossíntese, melhoramento genético de plantas medicinais, filogenia molecular,

clonagem de enzimas e por domínios da biologia molecular (PINTO et al., 2003). Este novo

evento vai emergir da necessidade de se colocar a química de Produtos Naturais realizada no

Brasil dentro dos novos paradigmas da pesquisa internacional, cujo enfoque nesta e nas

próximas décadas, estará centrado na genômica funcional de plantas.

O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior

floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os

produtos naturais além de possuir uma característica territorial muito diferente dos países

industrializados, marcada principalmente pela sua imensa biodiversidade, sendo, portanto,

ainda um celeiro para a busca de substâncias novas, de interesse biológico ou não. Só um

trabalho científico integrado de todos os grupos existentes no país poderá, em um tempo

limite, propiciar o conhecimento real da diversidade química dos ambientes tropicais e auxiliar

nos estudos futuros sobre o perfil metabólico (metaboloma) e associações com perfil

macromolecular (proteoma) das espécies de interesse de nossa biota (PINTO et al., 2002) e de

forma paralela a isso deve ser pautado sempre os meios de proteção do conhecimento gerado

através destes estudos, com geração e melhoramento programas de proteção patentearia tendo

em vista que uma grande parte da informação tecnológica disponibilizada anualmente no

mundo é divulgada somente sob a forma de documentos de patente, a pesquisa em bancos de

dados de patente é indispensável para o desenvolvimento científico e econômico de um país

(OLIVEIRA et al., 2005).

Os pesquisadores desta área têm à mão a matéria prima mais abundante e diversificada

do planeta. Estima-se que 20 % desse patrimônio genético estejam concentrados em território

nacional, onde o índice de endemismo é altíssimo. São 55 mil espécies vegetais (22 % do total

registrado no planeta), 524 mamíferos (cerca de 130 endêmicos), 517 anfíbios (294

endêmicos), 1.622 aves (191endêmicas), 468 répteis (172 endêmicos), 3 mil espécies de

peixes de água doce e cerca de 15 milhões de insetos (muitos sem qualquer descrição

taxonômica) (http://www.biota.org.br, acessada em Março 2002).

Um dos bons exemplos que pode representar tamanha grandeza da flora brasileira é a

família Solanaceae L. (JUSSIEU, 1789) uma das maiores e mais complexas das angiospermas

e que contém cerca de 2296 espécies subordinadas a 96 gêneros (D’ARCY, 1991) e concentra

de forma representativa espécies extremamente importantes para os seres humanos, incluindo

desde espécies usadas na alimentação humana até as que produzem drogas potencialmente

ativas. Dentre as espécies largamente cultivadas como alimento destacam-se a batatinha

(Solanum tuberosum L.), o tomate (Solanum lycopersicon L.), a berinjela (Solanum

melongena L.) e a pimenta malagueta (Capsicum frutescens L.), entre outras (AGRA, 1991).

Como plantas medicinais: Solanum paniculatum (jurubeba verdadeira), usado como regulador

das funções intestinais; lobeira (Solanum lycocarpum) para hipertensão, diabete e combate do

colesterol (AGNOL et al., 2000; MOTTA et al., 2002). A importância econômica negativa se

dá com as plantas infestantes e nocivas, um exemplo é Solanum fastigiatum que causa

disfunção cerebelar e epilepsia em animais após ingestão (SILVA, 2001). Como fonte de

drogas farmacologicamente ativas, destacam-se as que possuem alcalóides de usos

terapêuticos como Atropa belladona, com atropina e correlatos da beladona, Hyosciamus

niger L. com hiosciamina e Datura spp. que possui a hioscina. Estas substâncias apresentam

atividade antimuscarínica e inibem a ação da acetilcolina (BROWN, 2003). Além da

importância farmacológica, as Solanaceae possuem espécies com propriedades narcóticas e

alucinógenas como Nicotiana tabacum L. e também algumas pertencentes aos gêneros Datura

e Brugmansia que têm figurado em rituais de magia e superstições, desde as mais antigas

civilizações (RODDICK, 1996).

Do ponto de vista econômico o interesse por espécies desta família intensificou-se nas

últimas décadas, principalmente após a demonstração de (SATO et al., 1951; KUHN et al.,

1952; SATO et al., 1952) de que o alcalóide espirostano solasodina, comumente encontrado

em espécies de Dioscorea e Solanum, poderiam funcionar como matéria-prima na síntese de

hormônios esteroidais e corticosteróides e também pela atividade antineoplásica encontrada

em glicoalcalóides obtidos de Solanum dulcamara L. e Solanum sodomeum (KUPCHAN et

al., 1965; CHAM et al., 1987a; CHAM et al., 1987b).

Solanum é o maior gênero da família Solanaceae com cerca de 1.250 espécies e 5.000

epítetos descritos (NEE, 1999), habitam sistemas ecológicos estabelecidos nas regiões

tropicais e subtropicais do mundo e tem a América do Sul como centro de diversidade e

distribuição (AGRA, 1999a). Contudo, possui grande diversidade que não é comum nas

angiospermas, tornando-as extremamente interessante tanto do ponto de vista evolutivo quanto

de sua utilidade para os humanos (KNAPP et al., 2004). Apesar das riquezas e propriedades

que as espécies do gênero Solanum apresentam, poucas são estudadas química e

biologicamente. Além disso, muitas espécies são consideradas ervas daninhas e isto estimula

ao conhecimento das substâncias bioproduzidas pelo seu metabolismo especializado. No

Nordeste brasileiro são utilizadas na medicina popular e são conhecidas principalmente como

“jurubeba”, palavra original do Tupi-Guarani, yu’beba devido a presença de espinhos em

algumas espécies(AGRA et al., 1999b). O gênero Solanum apresenta o centro de

biodiversidade no Brasil, com espécies endêmicas (AGRA, 1999a). No Nordeste existem 80

espécies: com 32 espécies representando 73% das espécies endêmicas do Brasil e 20 espécies

representando 45% das espécies endêmicas do Nordeste (AGRA, 1999c). Espécies de

Solanum produzem uma grande variedade de glicoalcaloides Figura 1, que respondem pela

resistência natural contra inimigos. Comparando-se com outros tipos de metabólitos especiais,

muito pouco é conhecido sobre a(s) atividade(s) biológica(s) dos glicoalcalóides de plantas

selvagens (RODDICK, 1996). Cerca de 200 alcalóides esteroidais já foram isolados e

apresentam-se na planta em sua forma livre ou como glicoalcaloides (ATTA-UR-RAHMAN

et al., 1998). Muitas plantas do gênero Solanum apresentam atividade moluscicida devido à

presença dos glicoalcalóides (SILVA et al., 2005a).

Figura 1. Glicoalcalóides isolados de espécie do gênero Solanum.

Além dos alcalóides os flavonóides costituem um dos grupos de substâncias mais

freqüentes no gênero Solanum (SILVA et al., 2003) e são caracterizados pelo esqueleto

carbônico C

-C

tendo estrutura denominada benzo-γ-pirona Figura 2., sendo relatados

mais de 5000 diferentes tipos de flavonóides derivados de plantas. É uma das classes de

produtos naturais que mais impressiona pala notável variedade, número de membros e

complexidade das estruturas dos constituintes, que podem possuir hidroxilação, metilação,

acetilação glicosilação, isoprenilação, etc. Os flavonóides são frequentemente hidroxilados nas

solasonina

tomatina

posições 3,5,7,3’,4’. Alguns destes grupos hidroxila são frequentemente metilados, acetilados

ou sulfatados. Quando glicosilados, as ligações glicosídicas são localizadas normalmente nos

oxigênios dos carbonos 3 e 7 e os carboidratos mais comuns são L-ramnose, D-glicose,

glicoramnose, galactose e arabinose podendo-se encontrar também C-glicosídeos. A

prenilação ocorre diretamente no átomo de carbono do anel aromático, embora exista também

O-prenilação (HAVSTEEN, 2002).

Figura 2. Núcleo básico dos flavonóides

A literatura relata um perfil químico de Solanum com base na freqüência de

flavonóides presentes nas espécies desse gênero (STEINHARTER et al., 1986; ANDERSON

et al., 1987). Os padrões flavonoídicos podem contribuir significativamente, ajudando a

entender a sistemática dos táxons na família (HARBORNE et al., 1979) e esse potencial ainda

não é tão explorado. A ocorrência de um padrão particular de substituição dos flavonóides é

freqüentemente usada como um indicador de avanço filogenético (HARBORNE, 1977;

SWAIN, 1980). No entanto, os trabalhos de sistemática química sobre o gênero Solanum são

relativamente reduzidos, aparentemente devido às dificuldades de se trabalhar com um gênero

com grande plasticidade morfológica (D’ARCY, 1979). Dados químicos baseados nos padrões

flavonoídicos são relatados por contribuirem para uma compreensão sistemática dos táxons

nos níveis mais baixos de classificação na família (STEINHARTER et al., 1986).

Os estudos de sistemática em evolução são importantes principalmente para elucidar

problemas taxonômicos. E isso pode servir como ótima ferramenta para o estudo filogenético

deste gênero seja na formulação de uma hipótese ou na reformulação da mesma. Em vista

disso é importante saber que a taxonomia está engrenada a três esferas que são a descrição,

identificação e filogênese. Com cada um destes componentes sendo enriquecido pelos outros

dois e sem os três a ciência é incompleta. Filogênese é o estudo dos inter-relacionamentos

entre os organismos ― mostrando como espécies, gêneros e famílias estão relacionados uns

com os outros. Como a filogênese é a hipótese entre a relação dos organismos conforme

estudos, os taxonomistas e quimiotaxonomistas resolvem problemas e investigam aparentes

conflitos adicionais (KITCHING I. J. et al., 1998).

O incremento de dados ou diferentes interpretações de dados pode levar a modificação

de uma hipótese e deste modo modificar a idéia de como os organismos estão relacionados,

quais espécies viveram ontem, vivem hoje e terão possibilidade de continuar vivendo amanhã

em uma determinada área, sabendo também qual tipo de equilíbrio existe no interior da

comunidade que habita uma área e por que reina esse equilíbrio, qual o custo da

biodiversidade de uma dada área e o que acontecerá com o equilíbrio biológico de uma área se

as condições ambientais que a governam forem alteradas podendo ter importância para a

Agricultura, Saúde, Ecologia, Genética, Biologia Molecular e Biologia do Comportamento,

entre outras áreas. A construção de árvores filogenéticas para muitos grupos de organismos

tem revolucionado o campo da sistemática e levam a novas interpretações de como os grupos

estão relacionados como também poder determinar o possível caráter de armação evolutiva

(KNAPP et al., 2004).

Os flavonóides além de serem considerados ótimos marcadores quimiotaxonômicos

também são tidos como protetores potenciais contra os efeitos nocivos dos radicais livres,

sendo de um modo geral, inibidores dos processos de peroxidação e de envelhecimento dos

tecidos. Sabendo que maior parte dos compostos polifenólicos possuem atividade antioxidante

e podem ser administrados para prevenir e tratar algumas doenças (CAMPOS, 1997).

Os radicais livres, espécies químicas altamente reativas, surgem em diversos processos

fisiológicos, comumente no sistema respiratório e é necessária certa quantidade destes, em

concentrações equilibradas para que o organismo exerça suas funções de forma completa.

Durante o metabolismo normal em células aeróbicas, o oxigênio molecular é reduzido para

água, um produto seguro, mas sua redução parcial leva a formação de compostos altamente

reativos, por exemplo, o ânion superóxido (•O

), peróxido de hidrogênio (H

) e radical

hidroperóxido (•OH). Outros radicais tais como alquil (R•), alcoxil (RO•) e peroxil (ROO•)

podem ser produzidos endogenamente, através da peroxidação lipídica (SIMIC et al., 1989). A

geração excessiva destes radicais pode deteriorar proteínas, carboidratos, ácidos graxos e o

DNA, e pode deste modo levar o organismo ao estado de estresse oxidativo tendo como

conseqüência processos degenerativos como envelhecimento, imunodeficiências, doenças

neurológicas, inflamação, aterosclerose, doenças coronárias e certos tipos de cânceres (CRIMI

et al.; JAY et al.; MINAMIYAMA et al.; KARAA et al., 2005; LOPEZ-DIAZGUERRERO et

al., 2005; YANO et al., 2005; DENNERY, 2006; FENG et al., 2006).

Este trabalho é uma continuação do estudo químico e biológico de espécies do gênero

Solanum (SILVA, 2001; SILVA et al., 2002; SILVA, 2002a; SILVA et al., 2002b; SILVA et

al., 2002c; SILVA et al., 2003; ALVES et al., 2004; CORNELIUS et al., 2004; SILVA et al.,

2004; SILVA et al., 2005b; SILVA et al., 2005c) com ênfase na quimiotaxonomia e atividade

antiradicalar devido à presença dos flavonóides, além do bioensaio com a Artemia salina de

espécies que apresentaram atividade moluscicida.

Para o estudo químico deste trabalho foram selecionadas três espécies: Solanum

agrarium Sendtner, do subgênero Leptostemonum seção Acanthophora, espécie nativa do

Nordeste brasileiro, Solanum asperum Richard e Solanum stipulaceum Roem & Schult

pertencentes ao subgênero Brevantherum seção Brevantherum, sendo estas as únicas

representantes deste subgênero e seção na Paraíba. Quanto à composição química já foi

relatado o isolamento do kanferol de S. agrarium (SILVA, 2002a), solaparnaina

(BHATTACHARYYA, 1985) e solasodina (BHATTACHARYYA, 1984) de S. asperum,

além disso, o extrato etanólico bruto inibiu a atividade da enzima acetilcolinesterase em

ensaiados na microplaca e em cromatografia de camada delgada (TREVISAN et al., 2003) e

solasodina de S. stipulaceum (SILVA et al., 2005).

2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

- Realizar os estudos químicos e biológicos de algumas espécies do gênero Solanum do Brasil.

2.2 ESPECÍFICOS

-Estudar químicamente as espécies Solanum agrarium Sendtner, Solanum asperum Richard e

Solanum stipulaceum Roem & Schult, através do isolamento e identificação estrutural dos

constituintes envolvendo, principalmente, métodos cromatográficos e espectrométricos.

-Avaliar a capacidade seqüestradora de radicais livres e toxidade dos extratos/substâncias de

espécies de Solanum frente ao radical livre DPPH e Artemia salina L. respectivamente.

- Estudar as relações quimiotaxonômicas das espécies de Solanum spp através dos padrões de

oxigenação dos flavonóides presentes nas espécies.

3. ASPECTOS BOTÂNICOS

Todas as espécies de plantas estudadas foram identificadas pela Professora Doutora

Maria de Fátima Agra (Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da

Paraíba) e as amostras do material vegetal estão depositadas no Herbário Professor Lauro

Pires Xavier (JPB), Campus I da Universidade Federal da Paraíba.

3.1 Solanum agrarium Sendtner

É uma erva a sub-arbusto, ereto levemente prostado, ramificado, fortemente armado,

50-90 cm de altura. Caule cilíndrico 4-5 mm de largura, indumento glabrescente com

diminutos tricomas glandulares estipitados e tricomas simples. Folhas com acúleos

semelhantes aos do caule, obovada com 30 a 40 mm de comprimento e 15-50 mm de largura.

Baga globosa com 13-15 mm de diâmetro, glabra amarelo-claro (AGRA, 1991).

3.1.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

-Brasil (Bahia, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio de Janeiro), Colômbia, Venezuela, Ilhas do

Caribe. É uma das espécies provavelmente nativa do Nordeste Brasileiro, embora não se tenha

evidências para prová-lo (AGRA, 1991).

3.1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

-Algumas informações quanto ao uso das espécies, foram encontradas em etiquetas de

herbários, informando sobre a toxidade das folhas para o gado, “provocam timpanite”

(SOUSA et al. 1193). Em outras etiquetas há informação sobre “frutos comestíveis” (SOUSA

et al. 1193, XAVIER 862). Popularmente o decocto da raiz é empregado como abortivo. Há

Foto: Maria de Fátima Agra

referências ao uso do decocto das folhas no tratamento de doenças venéreas (LEWIS et al.,

1977).

3.1.3 NOMES LOCAIS

-Baba, Gogóia e Melancia da Praia (AGRA, 1991).

3.2 Solanum asperum Richard

É um arbusto ereto, 2,0-3,0 m de altura com caule cilíndrico, coberto por um

indumento denso pulverulento de cor acastanhada, constituído por tricomas estrelados. Folhas

opostas lanceoladas, inteiras, sésseis, com 5,0-13 cm de comprimento e 2,0-3,5 cm de largura,

com ápice acuminado. Frutos são bagas globosas, 0,8-1,0 cm de diâmetro, verde escuro com

exocarpo pubescente, tricomas estrelados espaços (AGRA, 1991).

3.2.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

-Brasil (Amazonas, Bahia, Ceará, Espírito Santo, Maranhão, Pará, Paraíba, Pernambuco e Rio

de Janeiro) (AGRA, 1991).

3.2.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

-Suas folhas são irritantes para pele e seus frutos não são comestíveis, nem referidos por suas

propriedades medicinais. Todavia na Farmacopéia Tyriyó relata que as folhas maceradas são

empregadas no tratamento da dor de dentes (CAVALCANTI et al., 1973).

3.2.3 NOMES LOCAIS

-Coça-Coça, Jussara, Jurubeba-Branca, Velame-Bravo (AGRA, 1991).

Foto: Tania Maria Sarmento da Silva

3.3 Solanum stipulaceum Roem & Schult

É um arbusto que chega até 3,0 m de altura, com ramos delgados, quando jovem

apresenta indumento estrelado tomentoso e mais velho é glabrascente. Folhas alternas, macias

e algumas vezes rugosas, com dimensões que variam de 4,0-20 cm comprimento x 1,0-4,5 cm

de largura, elíptico-lanceoladas, de ápice agudo ou acuminado e base cuneada ou redonda,

freqüentemente assimétrica, com margens contínuas, na superfície adaxial o indumento é

estrelado pubescente, na abaxial é estrelado tomentoso. Frutos verdes acinzentados com

diâmetro variando entre 8,0-12 mm, globosos, com indumento densamente estrelado

pubescente. (STANNARD et al., 1995)

3.3.1 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

-Brasil (Bahia e Pernambuco).

3.3.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

-Folhas tóxicas para o homem (AGRA et al., 1999b).

3.3.3 NOME LOCAL

-Jurubeba-roxa (AGRA et al., 1999b).

Foto: Maria de Fátima Agra

4. EXPERIMENTAL GERAL

4.1 Equipamentos e reagentes

Os pontos de fusão foram determinados em placa de aquecimento de aparelho digital de

ponto de fusão (Micro química MQAPF-302, Microquímica Equipamentos LTDA). Os

espectros no infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro MB-100M. Series, BOMEM

(Canadá) e aparelho VANKEL 50 UV-Visível Varian (Australia) para leitura da absorbância

das soluções no teste anti-radicalar. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear,

H e

(incluindo experimentos em 2D) foram registrados em espectrômetro da Varian Mercury que

opera a 200 MHz para

H e a 50 MHz para

C . Como padrão interno foi usado

tetrametilsilano ou resíduo de solvente como CHCl

, DMSO e acetona.

Para análise em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) o sistema consistiu

de uma bomba de solvente modelo SCL-10Avp, equipado com um detector UV-VIS SPD-

M10Avp (Shimadzu), Corp., Kyoto, Japan). As amostras foram injetadas em um injetor

Rheodyne 7125i com um loop de 20 μL. A separação cromatográfica foi feita com uma coluna

Supelcosil LC-18 (125 cm x 10mm x 5μm, Supelco, Bellefonte, USA) e CLAE (Shimadzu),

Corp., Kyoto, Japan). com degaseificador DGU-14, misturador FCV-10ALvp, detector com

arranjo de diodos SPD-M10 Avp, forno para coluna CTO-10ASvp e controlador de sistema

SCL-10Avp (Kyoto, Japan), coluna C18 Shim-Pack, pré coluna C-18 SULPELCO 4,0 mm,

solvente (MeOH) da Tedia Company (EUA) grau HPLC/Espectro UV-visível, ácido fórmico

Merck (Alemanha), cartuchos com membrana millipore com poros de 0,45 μm de diâmetro

(SUPELCO, USA) para filtração das amostras a serem analisadas foram usados.

A cromatografia em coluna foi realizada tendo como suporte Sephadex LH-20

(Amersham Biosciences, Suécia), para Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA)

foram usadas cromatofolhas de sílica gel 60F

254

(Merck)

e como reveladores foram utilizados,

UV-visível a 254 e 366 nm e reagentes específicos para revelação como Draggendorff

(alcalóides) e ácido difenilbórico etanolamina-MeOH (flavonóides)

4.1.1 Derivatizações

A preparação do derivado acetilado serviu para facilitar a análise dos dados espectrais.

a) Acetilação

- Solventes e reagentes

• anidrido acético(Merck), piridina (Aldrich) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP)

(Merck).

4.1.2 Teste anti-radicalar

• DPPH, Alfa Aesas (USA)

• BHT, Acros Organics (Bélgica)

• ácido ascórbico

• EtOH absolute PA, VETEC, (BRASIL)

4.1.3 Bioensaio com Artemia salina

• MeOH PA, VETEC, (BRASIL)

• Cremophor EL

, Fluka/Biochemika (Alemanha)

• DMSO, VETEC (BRASIL)

• Ovos de Artemia salina (adiquirido em lojas de produtos de psicultura)

CAPÍTULO I

ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS DE SOLANUM AGRARIUM SENDTNER,

SOLANUM STIPULACEUM ROEM & SCHULT E PARTES AÉREAS DE SOLANUM

ASPERUM RICHARD

ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS DE SOLANUM STIPULACEUM ROEM &

SCHULT

I.1 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum stipulaceum Roem & Schult

As folhas de Solanum stipulaceum foram coletadas no Pico do Jabre, município de

Maturéia, e submetidas à secagem em estufa a 40

C por uma semana. O material seco e

pulverizado (573,5 g) foi macerado com MeOH até completa exaustão mostrada pela

descoloração da solução extrativa. A solução extrativa foi concentrada em evaporador

rotatório sob pressão reduzida a 40

C fornecendo um resíduo de cor verde escuro (92,5 g). O

extrato (90,5 g) foi dissolvido em água destilada e MeOH (1:1) depois particionado em funil

de separação com solução de Benzeno:éter etílico (1:1) e CHCl

As soluções extrativas foram

concentradas fornecendo os extratos Benzeno:etéreo (25,5 g) e CHCl

(3,0 g). A fase

MeOH:aquosa foi alcalinizada com KHCO

até pH=9,0 e submetida à extração com solução

de CHCl

:EtOH (2:1). Esta solução foi concentrada obtendo-se o extrato CHCl

:EtOH (16,2 g)

e a MeOH :aquosa.

O extrato Benzeno:etéreo mostrou a presença de flavonóides quando corado com

reagente NP (ácido difenilbórico etanolamina, 1% em MeOH) em CCDA e foi escolhido para

o fracionamento cromatográfico. O extrato foi submetido a coluna cromatográfica com

Sephadex LH-20

usando como eluente CHCl

:MeOH (1:1), obtendo-se onze frações. As

frações foram reunidas de acordo com os fatores de retenção (R

) revelados com reagente NP.

As frações de 7-11 foram reunidas e recromatografadas seguindo o mesmo procedimento,

resultando em 10 frações, quatro dessas apresentaram precipitados que foram recristalizados

em acetona obtendo-se os compostos 1, 2, 3 e 4 Esquema 1. As massas, rendimentos e pontos

de fusão estão listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Substâncias isoladas de Solanum stipulaceum Roem & Schult.

Substância (código) Massa (mg) Rendimento (%) Ponto de fusão (

1 20,8 0,0036 224-226

2 37,0 0,0065 274-278

3 8,6 0,0014 -

4 12,8 0,0022 -

Folhas secas e moídas (573,5 g)

Extrato MeOH (92,5 g)

¾ Macera

ão com MeOH

Extrato Benzeno:Etéreo

(25,5 g)

¾ MeOH:H

O (1:1)

¾Benzeno:Éte

etílico

(

1:1

)

Extrato CHCl

(3,0 g)

Fase aquosa

Extrato CHCl

:EtOH (16,2 g)

¾ Sephadex LH-20

(CHCl

:MeOH (1:1)

Frações de 7 a 11

10 frações

Fração 4

1 (20,8 mg)

Fração 5

2 (37,0 mg)

Fração 6

3 (8,6 mg)

Fração 8

4 (12,8 mg)

¾ CHCl

¾ Sephadex LH-20

(CHCl

:MeOH (1:1)

¾ CHCl

:EtOH (2:1)

KHCO

, pH=9,0

Esquema 1. Isolamento das substâncias de Solanum stipulaceum Roem & Schult.

I.2. Identificação estrutural dos constituintes de Solanum stipulaceum Roem & Schult

As substâncias 1 e 2 apresentaram cor amarelo brilhante intenso quando coradas com

reagente NP (ácido difenilbórico etanolamina, 1% em MeOH) para flavonóides. Nos espectros

de IV dos flavonóides 1 (Figura 3) e 2 (Figura 4) observaram-se absorções de sistemas

aromáticos entre 1600 e 1500 cm

-1

, de função carbonila α, β-insaturada envolvida em ponte de

hidrogênio intramolecular em tre 1650-1680 cm

-1

e intensas e longas absorções para grupos

hidroxílicos em 3400 cm

-1

. O flavonóide 1 mostrou ainda absorção adicional em 1068 cm

-1

para ligação C-O, sugerindo a presença da função álcool.

Figura 3. Espectro no IV (KBr) do flavonóide 1.

Figura 4. Espectro no IV (KBr) do flavonóide 2.

estiramento

O-H

estiramento

C-H

estiramento

C-H

C=C

aromático

C=C

olefina

C-O

álcool

C-O

éter e fenol

-CH

C=O

α, β-

insaturada

estiramento

O-H

C=C

aromático

C-O

éter e fenol

C=O

α, β-

insaturada

Os espectros de RMN de

H dos flavonóides 1 (Figura 5) e 2 (Figura 10)

apresentaram sinais típicos de substituição para o flavonóide 3,4’,5,7-tetraidroxiflavona

(kanferol). O flavonóide 1 apresentou sinais de sistema AB correspondentes a dois átomos de

hidrogênio que mantêm entre si relação meta no anel A, com dubleto em δ 6,38 (J=1,8 Hz) e

singleto largo em δ 6,14 referentes aos hidrogênios H-8 e H-6 respectivamente. O anel B

apresentou sinais de sistemas AA’BB’ com dubletos em δ 7,98 (J=8,8 Hz) atribuídos aos

hidrogênios H-2’/H-6’ e em δ 6,84 (J=8,8 Hz) dos hidrogênios H-3’/H-5’ (Tabela 2). Com o

mesmo padrão de substituição o espectro do flavonóide 2 apresentou singletos largos em δ

6,43 e δ 6,18 atribuídos aos hidrogênios H-8 e H-6 respectivamente, referentes ao anel A

Figura 10. O anel B com dubletos em δ 8,03 (J=8,6 Hz) e em δ 6,91 (J=8,6 Hz) atribuídos aos

hidrogênios H-2’/H-6’ e H-3’/H5’ respectivamente (Figura 10) (Tabela 3). Os dois

flavonóides apresentaram sinais típicos de hidroxila (OH-5) de caráter quelatogênico em anéis

de seis membros em δ 12,56 para 1 (Figura 5) e δ 12,48 para 2 (Figura 10).

O espectro de RMN de

H (Figura 5) do flavonóide 1 mostrou sinais adicionais

correspondentes a uma unidade de açúcar, destacando o sinal de hidrogênio ligado ao carbono

carbinólico em δ 5,44 (d, J=7,0 Hz) de H anomérico em posição axial e uma unidade

coumaroíla identificada pelo sistema AA’BB’ em δ 6,77 (2H, H-3’’’ e H-5’’’; d, J=8,4 Hz) e δ

7,39 (2H, H-2’’’ e H-6’’’; d, J=8,2 Hz) e dubletos em δ 7,48 (J=15,8 Hz) e em δ 6,10 (J=16,0

Hz) para os hidrogênios H-7’’’ e H-8’’’ respectivamente. A fórmula molecular C

flavonóide acilado foi deduzida pela comparação dos espectros de APT, {

H} (1D) e 2D

HMQC (Figuras 5, 6 e 7) permitindo reconhecer os sinais correspondentes aos átomos de

carbono não hidrogenados (12 carbonos sp

), metínicos ( 8 sinais representando 12 carbonos

e cinco sp

oxigenados, entre eles um anomérico em δ

100,98 correlacionado com um

dubleto em δ

5,44 (J=7,0 Hz), no espectro de HMQC) e um metilênico em δ 62,1

correlacionado com um dubleto largo em δ 4,26 (J=10,6 Hz) e um duplo dubleto em δ 4,01

(J=12,0 e 6,4 Hz). A presença de uma unidade O-β-D-(6”-coumaroil-glicopiranosil foi

confirmada pela análise dos demais sinais dos espectros de RMN de

H e RMN de

(Tabela 2). A localização desta unidade estrutural no átomo de oxigênio ligado ao carbono C-

3 da aglicona foi realizada pelas observações dos valores dos deslocamentos químicos do

átomo de carbono C-2 (δ

156,39) e do carbono metilênico C-6’’ (δ

63,0) no espectro de

RMN

C e grupo cumaroil ligado em C-6’’ respectivamente. O assinalamento completo foi

feito com auxílio dos espectros de RMN 2D: HMQC (Figura 7), HMBC (Figura 8) e COSY

(Figura 9). A comparação com os dados da literatura permitiu identificar o flavonóide 1 como

sendo o tilirosídeo (224-226

C) e o 2 kanferol (274-278

C) (AGRAWAL et al., 1989).

Figura 5. A) Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 1 (tilirosídeo) em DMSO-d

B) e C) Expansões em campo baixo e alto respectivamente.

OH-5

OH-7

OH-4’ OH-4’’’

H-7 ’’’

H-2’, H-6’ H-2’’’, H-6’’’

H-1’’

H-6’’

H-3’, H-5’

H-3’’’, H-5’’’

H-8

H-6

H-8’’’

Figura 6. A) Espectro de APT (50 MHz) do flavonóide 1 (tilirosídeo) em DMSO-d

. B) e C)

Expansões em campo baixo e alto respectivamente.

C-4

C-7

C-5

C-4’

C-9 C-2

C-3

C-2’’’, C-6’’’

C-2’, C-6’

C-7’’’

C-1’

C-3’’’, C-5’’’

C-3’, C-5’

C-8’’’

C-10

C-1’’

C-6

C-8 C-3’’

C-2’’, C-5’’

C-4’’

C-6’’

Figura 7. Espectro de HMQC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 1

(tilirosídeo) em DMSO-d

B) Expansão em campo alto.

Figura 8. Espectro de HMBC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 1

(tilirosídeo) em DMSO-d

B) e C) Expansões em campo baixo.

Figura 9. Espectro de COSY

H (200 MHz em DMSO-d

) do flavonóide 1 (tilirosídeo).

Tabela 2. Dados de RMN de

H (200 MHz) e

C (50 MHz) do tilirosídeo (1) em DMSO-d

Deslocamentos químicos em δ e constantes de acoplamentos (J) em Hz.

5 ''

1 ''

8 '''

6 ''

3 ''

4 ''

9 '''

7 '''

2 '''

2 ''

5 '''

6 '''

4 '''

3 '''

1 '''

H-

C-HMQC-

H-

C-HMBC-

2 156,39 - - -

3 133,07 - - -

4 177,45 - - -

5 161,18 - - -

7 164,24 - - -

9 156,49 - H-8 -

10 103,9 - -

1’ 120,79 - - H-3’, H-5’

4’ 160,07 - H-3’, H-5’ H-2’, H-6’

1’’’ 124,95 - - -

4’’’ 159,86 - - -

9’’’ 166,23 - - -

CH - -

6 98,82 6,14 (sl) - H-8

8 93,732 6,38 (d, 1,8) - H-6

2’,6’ 130,88 7,98 (d, 8,8) - H-6’, H-2’

3’, 5’ 115,16 6,84 (d, 8,6) - -

1’’ 100,98 5,44 (d, 7,0) - -

2’’ 74,17 - - -

3’’ 76,25 - - -

4’’ 69,97 - - -

5’’ 74,26 - - -

2’’’,6’’’ 130,22 7,39 (d, 8,2) - -

3’’’,5’’’ 115,8 6,77 (d, 8,4) - -

7’’’ 144,67 7,48 (d, 15,8) - -

8’’’ 113,65 6,10 (d, 16,0) - -

6’’ 63,0

4,26 (dl, 10,6)

4,01 (dd, 12,0; 6,4)

- -

-OH

4 - 12,57 (s) - -

4’’’ - 10,89 (s) - -

5 - 10,19 (s) - -

7 - 10,05 (s) - -

Figura 10. Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 2 (kanferol) em DMSO-d

Tabela 3. Dados de RMN de

H (200 MHz) do kanferol (2) em DMSO-d

. Deslocamentos

químicos em δ e constantes de acoplamentos (J) em Hz.

2 -

3 -

4 -

5 -

7 -

9 -

10 -

1’ -

4’ -

6 6,18 (sl)

8 6,43 (sl)

2’,6’ 8,03 (d, 8,6)

3’, 5’ 6,91 (8,6)

5 12,58 (s)

H-2’, H6’ H-3’, H-5’

H-8

H-6

OH-5

A substância 3 mostrou-se como um sólido amarelo coloração amarelo-laranja com

reagente NP para flavonóides indicando ser um flavonóide com hidroxilas em posições orto

(MARKHAM, 1982). O espectro de IV (Figura 11) apresentou sinais de sistema aromático

em 1429 e 1513 cm

-1

, função carbonila α, β-insaturada envolvida em ponte de hidrogênio

intramolecular em 1616 cm

-1

, e intensa e larga absorção em 3420 cm

-1

referente à ligação O-

Figura 11. Espectro no IV (KBr) do flavonóide 3.

O espectro de RMN de

H (Figura 12) mostrou sinais típicos para o padrão para

3,3’,4’,5,7-pentaidroxiflavona (quercetina) observando-se sinais de sistema AB para o anel A

do flavonóide com dubletos em δ 6,39 (J=1,8 Hz) e em δ 6,17 (J=2,0 Hz) referentes aos

hidrogênios H-8/H6 respectivamente. E sinais característicos de sistema ABX para o anel B

com duplo dubleto em δ 7,52 (J=8,5 Hz, J=2,1 Hz) atribuído ao hidrogênio H-6’, dubleto em δ

6,86 (J=8,6 Hz) para H-5’ e em δ 7,66 (J=2,2 Hz) para H-2’ Tabela 4.

estiramento

O-H

C=O

α, β-

insaturada

C=C

aromático

C-O

éter e fenol

Figura 12. Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 3 (quercetina) em DMSO-d

Expansão em campo baixo.

Tabela 4. Dados de RMN de

H (200 MHz) de quercetina (3) em DMSO-d

. Deslocamentos

químicos em δ e constante de acoplamento (J) em Hz.

2 -

3 -

4 -

5 -

7 -

9 -

10 -

1’ -

4’ -

6 6,17 (d, 2,0)

8 6,39 (d, 1,8)

2’ 7,66 (d, 2,2)

5’ 6,86 (d, 8,6)

6’ 7,52 (dd, 8,5, 2,1)

5 12,48(s)

OH-5

H-2’

H-6’

H-5’

H-8

H-6

A substância 4 não corou com reagente NP para flavonóides. O espectro de RMN

(Figura 13) desta apresentou sinais de anel aromático p-dissubstituído. Com um sinal de

hidroxila de ácido carboxílico em δ 10,26 e dubletos em δ 6,81 (J=8,4 Hz) e em δ 7,75 (J=8,8

Hz) atribuídos aos hidrogênios H-3/H-5 e H-2/H-6 do ácido p-hidroxibenzóico

respectivamente.

Figura 13. Espectro de RMN de

H (200 MHz) do ácido p-hidroxibenzóico (4) em DMSO-d

H-2, H-6 H-3, H-5

OH de ácido

carboxílico

ESTUDO QUÍMICO DAS PARTES AÉREAS DE SOLANUM ASPERUM RICHARD

I.3 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum asperum Richard

As partes aéreas de Solanum asperum foram coletadas no Campus I, UFPB, João

Pessoa, PB e submetidas à secagem em estufa a 40

C por uma semana. As partes aéreas secas

e pulverizadas de S. asperum (1.178 g) foram extraídas exaustivamente em Soxhlet com 6 L

de MeOH. A solução extrativa foi concentrada em evaporador rotatório, fornecendo o extrato

MeOH (77,0 g). O Extrato MeOH (74,0 g) foi suspenso em H

O e em seguida particionado

com solução de Hexano:Éter (1:1) e depois com AcOEt obtendo-se os extratos Hexano:Etéreo

(11,0 g) e AcOEt (4,4 g).

Devido a presença de uma maior concentração de flavonóides evidenciados com

reagente NP o extrato AcOEt (3,4 g) foi escolhido para ser submetido a permeação em

Sephadex LH-20

usando como eluente CHCl

:MeOH (1:1), obtendo-se 29 frações. Nas

frações 14 a 20 houve formação de um precipitado de cor amarelo claro (5, 2,5 mg) e na fase

aquosa houve a formação de outro precipitado amarelo pardo (6, 720,0 mg). O flavonóide 6

(50 mg) foi acetilado com 1,0 mL de piridina e 1,0 mL de anidrido acético e DMAP em

quantidades catalíticas. A mistura ficou sob agitação durante 1 h até consumir todo o

flavonóide. Após o término da reação a mesma foi tratada com raspas de gelo formando-se um

precipitado branco que foi filtrado a vácuo e lavado várias vezes com H

O para retirar o

excesso de piridina. O flavonóide resultante foi o 6a com massa de 53,1 mg (65 % de

rendimento).

Esquema 2. Isolamento das substâncias de Solanum asperum Richard.

Tabela 5. Substâncias isoladas de Solanum asperum Richard e os derivados obtidos.

Substância (código) Massa (mg) Rendimento (%) Ponto de fusão (

5 2,5 0,0002 228-230

6 720 0,06 184-186

Derivado 6a 53,1 65 (reação) 141-143

Extrato MeOH (77,0 g)

¾ Extração em Soxhlet com MeOH

Extrato Hexano:Etéreo

(11,0 g)

¾ MeOH:H

O (1:1)

¾ Hexano:Éter (1:1)

Extrato AcOEt

(4,4 g)

Fase aquosa

alcaloidal

¾ Sephadex LH-20

(CHCl

:MeOH (1:1)

29 frações

Frações de 14 a 20

5 (2,5 mg)

ppt 6 (720 mg)

¾ AcOEt

6 (50 mg)

acetilação

Partes aéreas secas e moídas

(1178,0 g)

6a (53,1 mg)

I.4 Determinação estrutural dos constituintes de Solanum asperum Richard

As substâncias 5 e 6 apresentaram coloração amarelo brilhante intenso quando coradas

com reagente NP para flavonóides em CCDA.

O flavonóide 5 tem ponto de fusão 228-230

C e espectro de RMN de

H (Figura 14)

semelhante ao do flavonóide 1 isolado de S. stipulaceum sendo identificado como tilirosídeo.

Figura 14. A) Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 5 em DMSO-d

. B) e C)

Expansões em campo baixo e alto respectivamente.

OH-5

H-6

H-2’/H-6’

H-2’’’/H-6’’’

H-7’’’

H-8’’’

H-3’’’/H-5’’’

H-3’/H-5’

H-8

H-6’’

H-1’’

O espectro no IV do flavonóide 6 (Figura 15) apresenta absorções de sistema

aromático em1491 cm

-1

e 1596 cm

-1

, função carbonila α, β-insaturada envolvida em ponte de

hidrogênio intramolecular em 1655 cm

-1

, intensa e larga absorção em 3411 cm

-1

referente a

ligação O-H e em 1052 cm

-1

sugerindo a presença da função álcool.

Figura 15. Espectro de IV (KBr) do flavonóide 6.

A natureza glicosídica desta substância foi indicada pelo número de sinais

oximetínicos e oximetilênico observados nos espectros de RMN de

H e APT, e confirmada

pelos espectros 2D de correlação heteronuclear (

H-

C-HMQC, Figura 18, e

H-

C-HMBC,

Figura 19), permitindo caracterizar a estrutura do glicosídeo.

A unidade aglicona de 6 foi caracterizada como 3,4’,5,7-tetrahidroxiflavona (kanferol)

através da análise dos espectros de RMN de

H (Figura 16) reconhecendo os sinais do sistema

AB, correspondentes a dois átomos de hidrogênio que mantêm entre si relação meta e

atribuídos aos hidrogênios H-6/H-8[δ

6,44/6,79; d, J=1,6 Hz)] e AA’BB’ do anel B com os

valores δ

8,09 (d; J=8,8 Hz) e δ

6,86 (d; J=8,6 Hz) atribuídos aos hidrogênios 2’, 6’ e 3’, 5’,

respectivamente.

estiramento

O-H

estiramento

C-H

estiramento

C-H

C=O

α, β-

insaturada

C-O

álcool

C-O

éter e fenol

-CH

C=C

aromático

Figura 16. A) Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 6 em DMSO-d

. B) e C)

Expansões em campo alto.

H-2’/H-6’

H-8

H-6

1R1

1G 2R2 2R1 5R2 5R1

2R1/4R1

3R1 3R2

1R2

6R2 6R1

Os dados espectrais de RMN de

H (Figura 16) e APT (Figura 17) permitiram

caracterizar o flavonóide 6 como o kanferol triglicosilado e as três unidades glicosídicas foram

identificadas como sendo duas ramnoses e uma glicose. A presença de uma unidade α-L-

ramnopiranosídica ligada ao oxigênio do carbono C-7 que foi deduzida pelos sinais em δ

5,54 (singleto largo) do hidrogênio H-1R2 (hidrogênio H-1 da ramnose em posição equatorial)

e em δ

161,69 atribuído ao carbono C-7. A localização da unidade diglicosídica α-L-

ramnopiranosil-(1→6)-β-D-glicopiranosil no átomo de carbono de oxigênio do carbono C-3

está fundamentada nas seguintes observações: a) o deslocamento químico do átomo do

carbono C-2 (δ

157,17) revelado pelo espectro de APT (Figura 17) sugeriu a presença do

glicosídeo em C-3; b) o deslocamento químico do átomo de carbono metilênico C-6G (δ

65,29) permitiu a localização da unidade ramnose restante, neste átomo de carbono, já que o

sinal do grupo hidroximetilênico livre de uma unidade glicopiranosila ocorre em torno de δ

62,0 (AGRAWAL et al., 1989).

Assim, a estrutura pode ser caracterizada como sendo 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-

α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol. Os deslocamentos químicos de RMN

H e APT, incluindo dados obtidos nos espectros de HQMC (Figura 18) e HMBC (Figura

19) estão na Tabela 6. Os dados obtidos nos espectros foram comparados com os da literatura

(PIZZOLATTI et al., 2003).

Figura 17. Espectro de APT (50 MHz) do flavonóide 6 em DMSO-d

B) e C) Expansões em

campo baixo e alto.

C-4

C-7

C-5

C-4’

C-2

C-9

C-3

C-2’/C-6’

C-3’/C-5’

C-1’

C-10

C-1R6/C-2R6

C-1G

C-6

C-1R2

C-1R1

C-8

C-3G C-5G

C-4R2

C-4R1

C-2G

C-2R2

C-3R2

C-4G C-3R1

C-2R1

C-5R1

C-5R2

Figura 18. Espectro de HMQC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 6 em

DMSO-d

B) Expansão em campo baixo.

C-2’/C-6’

H-2’/H-6’

C-3’/C-5’

H-3’/H-5’

C-8

H-8

C-1R1

H-1R1

C-1G

H-1H

C-1G

H-1H

Figura 19. Espectro de HMBC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 6 em

DMSO-d

B) Expansão em campo baixo.

Tabela 6. Dados de RMN de

H (200 MHz) e

C (50 MHz) do glicosídeo 6 3-O-[β-D-

glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol em DMSO-d6.

Deslocamentos químicos em δ e constantes de acoplamentos (J) em Hz.

2R1

1R1

3R1

4R1

5R1

2R2

1R2

3R2

4R2

5R2

6R2

6R1

H-

C-HMQC-

H-

C-HMBC-

2 157,17 - - -

3 133,62 - - 1G

4 177,74 - - -

5 160,94 - OH-5 -

7 161,69 - H-6; H-8 -

9 156,10 - H-8 -

10 105,66 - - H-6

1’ 120,77 - - H-3’, H-5’

4’ 160,25 - H-3’, H-5’ H-2’, H-6’

CH - -

6 100,09 6,44 (d, 1,6) - H-8; OH-5

8 94,73 6,79 (d, 1,4) - -

2’,6’ 131,20 - - -

3’,5’ 115,23 - - -

1G 101,91 5,34 (d, 7,6) - -

2G 71,17 3,84 - -

3G 73,66 3,09 (dd, 14,0; 5,0) - -

4G 70,32 - - -

5G 73,01 - - -

1R1 98,44 4,39 (sl) - -

2R1 69,90 5,23 (d, 5,0) - -

3R1 70,16 4,47 (sl) - -

4R1 71,67 4,62 (sl) - -

5R1 68,35 4,84 (d, 5,2) - -

1R2 99,44 5,54 (sl) - -

2R2 70,65 5,18 (d, 4,0) - -

3R2 70,49 4,50 (s) - -

4R2 71,98 4,62 (sl) - -

5R2 68,06 4,96 (d, 3,6) - -

- -

6G 65,29 -

1R1

- -

6R1 18,01 1,03 (d, 6,2) - -

6R2 18,01 1,10 (d, 6,0) - -

OH - -

4’ 10,26 (s) - -

5 12,56 (s) - -

O flavonóide 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-

ramnopiranosilkanferol foi isolado apenas das espécies Lens esculenta (EI-NEGOUMY et al.,

1987) e Bauhinia forficata (PIZZOLATTI et al., 2003), sendo portanto o terceiro relato na

literatura.

As folhas da espécie Bauhinia forficata, de onde foi isolado também o flavonóide

glicosilado são utilizadas na medicina popular brasileira como agente diurético e

hipoglicemiante (MARTINS et al., 1998). Recentemente (SOUSA et al., 2004) foi

comprovado que parte da atividade hipoglicemiante desta espécie é devido a presença do

flavonóide 3,7-di-O-α-L-ramnopiranosil-kanferol isolado e testado.

Como a espécie Solanum asperum, apresentou uma quantidade razoável (0,4 %) do

flavonóide 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-

ramnopiranosilkanferol com fácil isolamento, sendo um dos flavonóides isolados de Bauhinia

forficata, as folhas de Solanum asperum foram novamente coletadas e cuidadosamente

extraídas para o isolamento e teste hipoglicemiante do flavonóide. Desta vez, seguindo o

mesmo procedimento anterior para o isolamento, a partir de 726,0 g do pó seco das folhas foi

precipitado na fase aquosa 3,0 g do flavonóide triglicosilado.

Os testes para atividade hipoglicemiante estão sendo realizados no LTF (Profa.

Temilce Simões de Assis) e os resultados preliminares (dados não mostrados) mostraram-se

promissores.

Em continuação ao estudo com flavonóides de Solanum, tipos de tricomas e

quimiotaxomia (SILVA, 2002a; SILVA et al., 2004), apresentamos agora o estudo com os

tricomas das duas espécies Solanum asperum Rich. e Solanum stipulaceum Roem & Schult de

Solanum subg. e seção Brevantherum através da análise dos flavonóides por CLAE-DAD.

Espécies deste subgênero se caracterizam pela ausência de aculeos, inflorescências

ramificadas, dicotômicas, multifloradas; flores andróginas com as anteras curtas e oblongas (o

nome do grupo é uma alusão ao tamanho das anteras , Brevantherum = anteras curtas),

indumento é constituído de tricomas estrelados sesséis e estipitados com a cèlula central

reduzida, unicelular. De acordo com (D’ARCY, 1972) o subgênero Brevantherum é

representado por 28 espécies com distribuição nas regiões tropicais e subtropicais. O Brasil é o

centro da diversidade e na Paraíba, Nordeste do Brasil, é representado apenas por estas duas

espécies.

Como descrito anteriormente, foram isolados de S. asperum os flavonóides 3-O-[β-D-

glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol (1) e tilirosídeo

(3) e de S. stipulaceum foram isolados kanferol (4), quercetina (2) e tilirosideo (3). Para

verificar se estes flavonóides isolados das duas espécies estavam presentes nos tricomas, estes

foram retirados das folhas e ramos de S. asperum (234,8 mg) e S. stipulaceum (232,5 mg) e

extraídos com MeOH em ultra-som. Os extratos metanólicos de S. asperum (43,2 mg) e S.

stipulaceum (39,0 mg) foram analisados por CLAE-DAD. A figura 20 mostra o cromatograma

obtido, juntamente com o espectro de UV-Visível com o UV dos flavonóides. Os flavonóides

isolados de cada espécie estão presentes também nos tricomas. Este resultado mostra que pelo

menos parte dos flavonóides em espécies de Solanum são secretados nos tricomas e existe uma

correlação entre os tipos de tricomas e os flavonoides presentes. As duas espécies são do

subgênero e seção Brevantherum e se caracterizam pela presença de tricomas estrelados

multiangulados. É um subgênero com características comuns aos subgêneros Solanum e

Leptostemonum. A presença de um flavonóide (tilirosídeo) comum às duas espécies reforça os

dados morfológicos e o parentesco entre ambas.

Figura 20. Cromatograma e espectros de UV (CLAE-DAD) dos padrões dos flavonóides (a):

flavonóides 1-4, (b): Extrato MeOH dos tricomas de S. asperum e (c): Extrato MeOH dos

tricomas de S. stipulaceum. Condições: A=H

O (1% de ác. fórmico), B=MeOH. 0 min 50%B,

10 min 60%B, fluxo de 1 mL/min, cromatograma em 360nm.

4 a

5 ''

1 ''

8 '''

6 ''

3 ''

4 ''

9 '''

7 '''

2 '''

2 ''

5 '''

6 '''

4 '''

3 '''

1 '''

tilirosídeo

2R1

1R1

3R1

4R1

5R1

2R2

1R2

3R2

4R2

5R2

6R2

6R1

3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]

-7-

O-α-L ramnopiranosilkanferol

quercetina

kanferol

I.5 Elucidação estrutural do flavonóide derivado 6a

O flavonóide derivado 6a apresentou-se como um sólido branco e coloração amarelo

brilhante quando corado com reagente NP para flavonóides. O espectro de IV do flavonóide

6a (Figura 21) apresenta absorções de sistema aromático em 1438 cm

-1

e 1505 cm

-1

, função

carbonila α, β-insaturada envolvida em ponte de hidrogênio intramolecular em 1632 cm

-1

absorção de carbonila de éster em 1752 cm

-1

e sinais de metilas em 1371 cm

-1

Figura 21. Espectro no IV (KBr) de 6a.

Embora as informações obtidas nos espectros de RMN de

H e APT, inclusive com as

técnicas bidimensionais como HMBC e HMQC, tenham permitido deduzir a estrutura

proposta para o flavonóide 6, informações relevantes e mais conclusivas foram obtidas com os

espectros de RMN de

H e APT do derivado 6a.

O flavonóide 6 foi acetilado nas hidroxilas fenólicas e de álcoois dos açúcares

(Esquema 3) resultando no derivado 6a 3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-

7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol peracetilado, solúvel em CDCl

, permitindo a análise dos

sinais dos hidrogênios oximetilênicos e oximetínicos dos açúcares. A hidroxila OH-5 quando

acetilada há proteção de δ

5,8 ppm no carbono C-4, δ

4.9 ppm no carbono C-2 e desproteção

estiramento

O-H

estiramento

C-H

estiramento

C-H

C=O

α, β-

insaturada

C=O

éster

C-O

álcool

C-O

éter e fenol

C=C

aromático

-CH

de δ

3,0 ppm no carbono C-3 devido à ausência da formação de ponte de hidrogênio entre o

hidrogênio da hidroxila OH-5 e o oxigênio da carbonila 4. A acetilação na posição 4’ protegeu

o carbono C-4’, (∆ δ

4,8). Os espectros de RMN de

H (Figura 22), APT e HMBC estão nas

(Figuras 24-25 e 26) respectivamente e os dados na (Tabelas 7 e 8).

O O

4-DMAP

anidrido acético

HOR +

4-DMAP

Mecanismo

Esquema 3. Mecanismo para reação de acetilação do flavonóide 6.

Figura 22. A) Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 6a em CHCl

. B) e C)

Expansões em campo baixo e alto respectivamente.

H-2’/H-6’

H-3’/H-5’

H-8

H-6

1R1

5R1

2R1

2R2

4R1

4R2

3R2

3R1

1R1

5R2

H-2G

H-6G

H-5G

H-4G

H-3G

Figura 23. D) Expansão em campo alto do espectro de RMN de

H (200 MHz) de 6a em

CHCl

Figura 24. A) Espectro de APT (50 MHz) do flavonóide 6a em CHCl

. B) Expansão em

campo baixo.

Ac-H-5G

Ac-H-4’

Ac-H-4G

Ac-H-2G

Ac-H-2R1

Ac-H-2R2 Ac-H-3G

Ac-H-3R1

Ac-H-6R2 Ac-H-6R1

Ac-H-3R2

Ac-H-4R2 ; 4R1

C-4

Ac, 4R2

Ac, 4R1

Ac, 3R1

Ac, 3R2

2G,3G,4G,2R2

Ac,2R1

Ac, 4’

Ac,5

C-7 C-5

C-4’

C-2

C-9

Figura 25. C), D) e E). Expansões do espectro de APT (50 MHz) do flavonóide 6a em

CHCl

CH3 Ac, 5

CH3 Ac, 4’

CH3 Ac:

2G, 3G,

4G, 2R1,

3R1, 4R1,

2R2, 3R2, 4R2

6R2 6R1

C-3

C-2’/C-6’

C-1’

C-3’/C-5’

C-10

1G C-6 1R2 1R1 C-8

4R2

4R1

2R2

3R2 4G

3R1

2R1

5R1/ 5R2

Figura 26. Espectro de HMBC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 6a em

CDCl

B) Expansão em campo baixo.

Tabela 7. Dados de RMN de

H (200 MHz) e

C (50 MHz) do glicosídeo 6a acetilado em

CDCl

. Deslocamentos químicos em δ e constantes de acoplamentos (J) em Hz.

OAc

AcO

OAc

AcO

2R1

1R1

3R1

4R1

5R1

2R2

1R2

3R2

4R2

5R2

6R2

6R1

2 152,26 -

3 136,64 -

4 171,90 -

5 157,08 -

7 159,08 -

9 150,60 -

10 112,66 -

1’ 128,01 -

4’ 155,44 -

6 101,83 6,74 (d, 2,2)

8 95,64 7,10 (d, 2,2)

2’,6’ 130,51 8,07 (d, 8,8)

3’,5’ 121,20 7,15 (d, 8,8)

1G 109,22 5,54 (d, 7,6)

2G 69,25 3,89 (dd, 9,6; 6,4)

3G 71,52 3,14 (dd, 9,9; 6,4)

4G 68,45 3,41 (dd, 10,0; 5,6)

5G 70,66 3,57 (dd, 9,2; 6,4)

1R1 97,66 4,44 (sl)

2R1 67,49 5,30 (sl)

3R1 67,86 4,92 (sl)

4R1 70,40 5,03 (sl)

5R1 66,42 5,14 (sl)

1R2 100,29 5,54 (sl)

2R2 69,65 5,33 (sl)

3R2 68,86 4,97 (sl)

4R2 70,55 5,07 (sl)

5R2 66,42 5,19 (sl)

6G 65,98 3,69 (t, 10,6; 5,3)

6R1 17,13 1,06 (d, 6,4)

6R2 17,36 1,20 (d, 6,2)

Ac (CH

)

4’ 20,97 2,29 (s)

5 21,09 2,42 (s)

2G 20,81 2,04 (s)

3G 20,61 2,08 (s)

4G 20,59 2,17 (s)

2R1 20,68 2,14 (s)

3R1 20,78 1,91 (s)

4R1 20,71 1,96 (s)

2R2 20,68 2,12 (s)

3R2 20,78 2,01 (s)

4R2 20,71 1,96 (s)

Ac (C=O)

4’ 169,45 -

5 168,92 -

2G 169,89 -

3G 169,89 -

4G 169,89 -

2R1 169,68 -

3R1 170,01 -

4R1 170,13 -

2R2 169,89 -

3R2 169,94 -

4R2 170,20 -

Tabela 8. Dados de interação heteronuclear spin-spin a longa distância (

) de átomos

de carbono e hidrogênio obtidos do espectro de HMBC de 6a.

2 152,26 - -

3 136,64 - -

4 171,90 - -

5 157,08 - -

6 101,83 - -

7 159,08 H-6 H-1R2

8 95,64 - -

9 150,60 - -

10 112,66 - H-6; H-8

1’ 128,01 - H-3’; H-5’

2’,6’ 130,51 - -

3’,5’ 121,20 - -

4’ 155,44 - H-2’; H-6’

1G 109,22 - -

2G 69,25 - -

3G 71,52 - -

4G 68,45 - -

5G 70,66 - -

6G 65,98 - H-1R1

1R1 97,66 - -

2R1 67,49 - -

3R1 67,86 - -

4R1 70,40 - -

5R1 66,42 - -

6R1 17,13 - H-4R1

1R2 100,29 - -

2R2 69,65 - -

3R2 68,86 - -

4R2 70,55 - -

5R2 66,42 - -

6R2 17,36 - H-4R2

ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS SOLANUM AGRARIUM SENDTNER

I.6 Isolamento e purificação dos constituintes de Solanum agrarium Sendtner

As folhas secas e trituradas de Solanum agrarium (179,0 g) foram extraídas com EtOH

por maceração exaustiva a temperatura ambiente. O solvente foi evaporado em rotavapor sob

pressão reduzida fornecendo o extrato etanólico bruto (50,0 g) que foi solubilizado com

solução de ácido acético (2%) e extraído com hexano:éter etílico (1:1) e em seguida com

AcOEt. Os solventes foram evaporados, obtendo-se os extratos hexano:éter (18,1 g) e AcOEt

(6,0 g). A presença de flavonóides nos extratos obtidos foi verificada por cromatografia em

camada delgada analítica por revelação com reagente NP e visualizacão em luz UV 366 nm. O

extrato AcOEt que mostrou a presença de flavonóides foi cromatografado, sucessivamente, em

coluna de Sephadex LH-20

utilizando CHCl

:MeOH (1:1) como eluente e forneceu 6,1 mg

do flavonóide 7.

Esquema 4. Marcha para o isolamento das substâncias de Solanum agrarium Sendtner.

Folhas secas e moídas (179,0 g)

Extrato EtOH (50,0 g)

¾ EtOH

Extrato Hexano:Éter

(18,1 g)

¾MeOH:H

(

1:1

)

Extrato AcOEt

(6,0 g)

Fase aquosa

¾ Sephadex LH-20

(CHCl

:MeOH 1:1)

7 (6,1 mg)

¾Hexano:Éter etílico

(

1:1

)

¾AcOEt

I.7 Determinação estrutural do constituinte de Solanum agrarium Sendtner.

O espectro de RMN de

H (Figura 27) mostrou a presença de três grupos metoxila em

3,91; 3,90 e 3,88, uma hidroxila qulatogênica na posição 5 em δ

12,74, sinais de sistema

AB, correspondentes a dois átomos de hidrogênio que mantêm entre si relação meta,

atribuídos aos hidrogênios H-6/H-8 (δ

6,30/ 6,67; d; J=2,0 Hz) e por fim um singleto em δ

7,4, integrando para dois hidrogênios correspondentes aos hidrogênios H-2’/H-6’ do anel B. A

fórmula molecular C

foi deduzida pela comparação dos espectros de APT (Figura 28)

e HMQC (Figura 29), permitindo reconhecer os átomos de carbono não hidogenados (11

carbonos sp

), metínicos (4 carbonos sp

) e metílicos (3 carbonos sp). As posições das

metoxilas foram deduzidas através do espectro de NOESY (Figura 30) que mostrou as

interações espaciais entre a metoxila 7, δ

3,91 com os hidrogênios H-6 (δ

6,30) e H-8 (δ

6,67) e da metoxila 3’ (δ

3,90) com o singleto em δ

7,4 dos hidrogênios H-2’ e H-6’. Os

dados de RMN de

H e

C foram comparados com a literatura (KUMARI et al., 1984) e foi

confirmada a estrurtura para o flavonóide 3,7,3’-tri-O-metilmiricetina.

Este flavonóide foi isolado anteriormente de Solanum pubescens (KUMARI et al.,

1984) que pertence ao gênero Leptostemonum, o mesmo de Solanum agrarium.

Figura 27. A) Espectro de RMN de

H (200 MHz) do flavonóide 7 (3,3’,7-tri-O-metil-

miricetina) em acetona-d

B) Expansão em campo baixo.

Figura 28. A) Espectro de APT (50 MHz) do flavonóide 7 (3,3’,7-tri-O-metil-miricetina) em

CDCl

Figura 29. Espectro de HMQC (RMN

H: 200 MHz, APT: 50 MHz) do flavonóide 7 (3,3’,7-

tri-O-metil-miricetina) em acetona-d

Figura 30. Espectro de NOESY (200 MHz) do flavonóide 7 (3,3’,7-tri-O-metil-miricetina) em

acetona-d

Tabela 9. Dados de RMN de

H (200 MHz) e

C (50 MHz) do flavonóide (7) 3,3’,7-tri-O-

metil-miricetina em acetona-d6. Deslocamentos químicos em δ e constantes de acoplamentos

(J) em Hz.

2 157,02 -

3 138,34 -

4 179,54 -

5 162,74 -

7 165,17 -

9 157,67 -

10 106,48 -

1' 121,67 -

3' 149,17 -

4' 138,34 -

5' 146,26 -

2' 105,14 7,40 (s)

6’ 110,62 -

6 98,42 6,30 (d, 2,2)

8 92,85 6,67 (d, 2,2)

OCH3

3 60,16 3,88 (s)

3’ 56,63 3,90 (s)

7 56,40 3,91 (s)

5 12,74 (s)

CAPÍTULO II

ANÁLISE DE FLAVONÓIDES DE FOLHAS RETIRADAS DE EXSICATAS DE

SOLANUM SUBGENERO LEPTOSTEMONUM POR CLAE-DAD

II.1 Introdução

Depois dos alcalóides, os flavonóides constituem um dos grupos de substâncias mais

frequentes em espécies do gênero Solanum. O número de trabalhos em sistemática química

sobre o gênero Solanum é relativamente reduzido, aparentemente devido às dificuldades de se

trabalhar com um gênero contendo um grande número de espécies morfologicamente variáveis

(D’ARCY, 1979). Porém, dados químicos baseados nos padrões flavonoídicos contribuíram

para uma compreensão sistemática dos táxons nos níveis mais baixos de classificação na

família (STEINHARTER et al., 1986). A literatura relata um perfil químico de Solanum com

base na freqüência de flavonóides (HARBORNE (1969), WHALE (1978), HARBORNE &

SWAIN (1979), REZNIK & WIETSCHEL (1979), WHALEN & MABRY (1979),

SCHILLING (1984), ANDERSON et al. (1987), STEINHARTER (1986) e SILVA et al.

(2000, 2003).

II.2 Objetivos

Este trabalho é uma continuação do estudo em quimiotaxomia do gênero Solanum e

pretende agrupar as espécies de acordo com os padrões dos flavonóides isolados suportando os

dados morfológicos de Solanum sect. Erythrotrichum e Solanum sect. Brevantherum dos

subgêneros Leptostemonum e Brevantherum respectivamente. Para isto, alguns dados sobre os

padrões dos flavonóides de Solanum subg. Leptostemonum foram obtidos de trabalhos

anteriores realizados pelo nosso grupo (SILVA, 2001; SILVA et al., 2002; SILVA, 2002a;

SILVA et al., 2002b; SILVA et al., 2002c; SILVA et al., 2004). Para a análise são incluídas

agora as espécies estudadas quimicamente neste trabalho: S. agrarium, S. asperum e S.

stipulaceum, além das espécies analisadas através de CLAE-DAD, descrita abaixo.

II.3 Experimental

II.3.1 Instrumental

O sistema de cromatografia líquida de alta eficiência consistiu de uma bomba de

solvente modelo SCL-10Avp, e um detector UV-VIS SPD-M10Avp (Shimadzu), Corp.,

Kyoto, Japan). As amostras foram injetadas em um injetor Rheodyne 7125i com um loop de

20 μL. A separação cromatográfica foi feita com uma coluna Supelcosil LC-18 (125 cm x 10

mm x 5μm, Supelco, Bellefonte, USA), usando água:ácido fórmico (99:1, solvente A) e

MeOH (Solvente B) como fase móvel.

Outro aparelho utilizado foi o Shimadzu com degaseificador DGU-14, misturador

FCV-10ALvp, detector com arranjo de diodos SPD-M10 Avp, forno para coluna CTO-

10ASvp e controlador de sistema SCL-10Avp (Kyoto, Japan), coluna C18 Shim-Pack, pré

coluna C-18 SULPELCO 4,0 mm.

Depois de tentar diferentes gradientes de solventes, o melhor sistema de eluição

encontrado foi o seguinte: 0 min 50% B, 15 min. 60% B, 30 min 70% B e 35 min. 80% de B,

fluxo de 1.0 mL/min. A eluição foi feita em 320 nm em temperatura ambiente. Os picos

cromatográficos foram identificados por comparação com os tempos de retenção das

substâncias padrão, bem como através da comparação de seus espectros no UV-Visível.

II.3.2 Material vegetal e isolamento dos flavonóides

Para análise em CLAE-DAD, as folhas das espécies de Solanum foram retiradas de

exsicatas de herbário doadas pela Botânica Dra. Maria de Fátima Agra (LTF-UFPB). Todas as

espécies são gênero Solanum subgênero Leptostemonum, pertencentes à Solanum sect.

Erythrotrichum, Solanum sect. Polytrichum, Solanum sect. Crinitum e Solanum sect.

Micracanthum. A Tabela 10 mostra as espécies, o peso das folhas e a quantidade de extrato

obtido.

As folhas foram trituradas e extraídas com MeOH em aparelho de ultra-som. O

solvente foi evaporado obtendo-se assim os extratos metanólicos. Estes extratos foram

submetidos a uma pequena coluna de Sephadex LH-20

para remoção da clorofila dos

flavonóides totais. As frações flavonoídicas obtidas foram analisadas em placas

cromatográficas de camada fina com sílica gel 60 F254 e a visualização só foi feita com a

solução de difenilboriloxietilamina (NP, 1%) em MeOH sendo observado na luz ultravioleta

em 366 nm. As frações foram evaporadas, redissovidas em MeOH e filtradas sobre a

membrana de 0,45 μm (Millipore) antes da análise por CLAE.

Tabela 10. Espécies de Solanum subg. Lesptostemonum retiradas de excicatas de herbários

(Doação da Dra. Maria de Fátima Agra).

Espécies Código

Peso das

folhas (g)

Peso dos

extratos (g)

Solanum sect. Erythrotrichum

S. acrescens ssp. floccosum S1 0,0196 0,0136

S. cordifolium S2 0,1011 0,0429

S. decompositifolium S3 0,0941 0,0197

S. diamantinense S4 0,0972 0,0446

S. magalonyx S5 0,0762 0,0182

S. rondoniense S6 0,0741 0,0479

Solanum sect. Polytrichum

S. hexandrum S7 0,0318 0,0125

S. maroniense S8 0,0909 0,0442

S. polytrichum S9 0,1787 0,1265

Solanum sect. Crinitum

S. grandiflorum S10 0,0731 0,0486

Solanum sect. Desconhecida

S. leprostachyo S11 0,2369 0,0650

Solanum sect. Micracantha

S. fulvidium S12 0,1497 0,0357

II.4 Análise Por CLAE-DAD

II.4.1 Reagentes e flavonóides padrões

Todos os solventes utilizados foram de grau HPLC/UV (Tedia Brasil). O ácido fórmico

(Merck) foi usado para ajustar o pH. Os padrões dos flavonóides, Miricetina (F1), Quercetina

(F2) e Kanferol (F3) foram compradas da Merck (Darmstadt, Alemanha), 3,4’,7,8-tetra-O-

metilgossipetina (F6), 7-O-metilkanferol (F7), 3,7-di-O-metilkanferol (F9), 7-O-

metilapigenina (F8), 3,3’,4’,7,8-penta-O-gossipetina (F10), 3-O-metilquercetina (F4) e

3,3’,4’,7-tetra-O-metilquercetina (F11) foram isolados de S. paludosum. Todos os padrões

foram preparados em MeOH e H

O (9:1, solução estoque).

II.4.2 CLAE dos flavonóides padrões

Na Figura 31 estão as estruturas com o cromatograma e UV dos flavonóides padrões:

Miricetina (F1), Quercetina (F2), 3-O-metilquercetina (F3), Kanferol (F4), 3,4’,7,8-tetra-O-

metilgossipetina (F6), 7-O-metilkanferol (F7), 7-O-metilapigenina (F8), 3,7-di-O-

metilkanferol (F9), , 3,3’,4’,7,8-penta-O-gossipetina (F10), e 3,3’,4’,7-tetra-O-metilquercetina

(F11). Todos foram submetidos a cromatografia separadamente ou em combinação para

determinar o tempo de retenção.

Figura 31. Cromatograma dos flavonóides padrões. As condições cromatográficas estão

descritas na seção experimental. Os compostos são os seguintes: F1) miricetina; F2)

quercetina; F3) 3-O-metilquercetina; F4) kanferol; F6) 3,4',7,8-tetra-O-metil gossypetina; F7)

7-O-metilkanferol; F8) 7-O-metilapigenina; F9) 3,7-O-dimetilcanferol, F10) 3,3',4',7,8-penta-

O-metilgossipetina e F11) 3,3',4',7-tetra-O-metilquercetina.

II.4.3 CLAE-DAD dos extratos de Solanum e identificação das substâncias

As análises por CLAE-DAD dos extratos MeOH das folhas das espécies estão

mostradas nas Figuras 32-45. A identificação das substâncias nos extratos foi feita por (1)

comparação dos tempos de retenção e espectro no UV-Visível entre os picos desconhecidos e

os flavonoides padrões, (2) e co-cromatografia dos extratos com os flavonóides padrões.

Figura 32. Cromatograma por CLAE-DAD e espectro de UV-Visível do extrato MeOH das

folhas de S. acrescens ssp. floccosum.

Figura 33. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

cordifolium (azul). Extrato MeOH + F6 (vermelho).

Figura 34. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

decompositifolium (azul). Extrato MeOH + F6 (vermelho).

Figura 35. Cromatograma por CLAE-DAD do extrato MeOH das folhas de S. diamantinense.

Figura 36. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

megalonyx (azul). Extrato MeOH + F6 (vermelho).

Figura 37. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de rondoniense

(azul). Extrato MeOH + F1 + F6 (vermelho).

Figura 38. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

hexandrum (azul). Extrato MeOH + F6 + F11 (vermelho).

OOH

OMe

MeO

3, 7, 8, 4'-tetra-O-metilgossipetina

Figura 39. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

maroniense (azul). Extrato MeOH + F3 + F4 + F5 + F6 (vermelho).

Figura 40. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

polytrichum (azul). Extrato MeOH + F1 + F2 + F3 + F5 + F6 + F11 (vermelho).

Figura 41. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

polytrichum (azul). Extrato MeOH + F1 + F2 + F3 + F5 + F6 + F11 (vermelho). Parte 2.

Figura 42. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

grandiflorum (azul). Extrato MeOH + F6 + F11 (vermelho).

OOH

OMe

MeO

OMe

3, 7, 3', 4'-tetra-O-metilquercetina

Figura 43. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

leptostachyo (azul). Extrato MeOH + F2 + F3 + F5 + F6 + F9 + F10 + F11 (vermelho).

OOH

OMe

3-O-metilquercetina

Figura 44. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S.

leptostachyo (azul). Extrato MeOH + F2 + F3 + F5 + F6 + F9 + F10 + F11 (vermelho). Parte 2

OMe

MeO

3,7-O-dimetilkanferol

OOH

OMe

MeO

OMe

3, 7, 8, 3', 4'-penta-O-metilgossipetina

OOH

OMe

MeO

OMe

3, 7, 3', 4'-tetra-O-metilquercetina

Figura 45. Cromatograma por CLAE-DAD e UV do extrato MeOH das folhas de S. fulvidum

(azul). Extrato MeOH + 6 + F7 + F8 (vermelho).

II.5 Resultados e Discussão

As 12 espécies de Solanum analisadas pertencem ao subgênero Leptostemonum

(Dunal) Bitter e são de quatro seções diferentes. De acordo com NEE (1999) este subgênero

tem cerca de 450 espécies e 10 seções. É caracterizado pela pubescência estrelada, ervas

espinhosas e apresenta anteras atenuadas, estando bastante concentrado na América tropical,

África e Austrália (WHALEN, 1984). Solanum acrescens ssp. floccosum (S1), S. cordifolium

(S2), S. decompositifolium (S3), S. diamantinense (S4), S. megalonyx (S5) e S. rondoniense

(S6) pertencem a seção Erythrotrichum Child, S. fulvidium (S12) é da seção Micracantha

Dunal e pelos cromatogramas obtidos foi possível observar a presença de substâncias

aromáticas, mas devido a pouca quantidade de material disponível foi impossível fazer

qualquer análise para estas espécies. As espécies S. hexandrum (S7), S. maroniense (S8) e S.

polytrichum (S9) são da seção Polytrichum Chil.. Estas espécies também apresentaram

substâncias aromáticas e em S. hexandrum (S7) foi possível verificar a presença do flavonóide

3,4',7,8-tetra-O-metilgossipetina (F6), comum em outras espécies de Solanum sect.

Erythrotricum. Em S. grandiflorum (S10) de Solanum sect. Crinitum foi encontrado o

flavonóide 3,3',4',7-tetra-O-metilquercetina (F11), comum também em Erythrotrichum. Na

espécie S. leptostachyo (S11) de seção desconhecida foi possível localizar os flavonóides 3-O-

metilquercetina (F3), 3,7-O-dimetilkanferol (F9), 3,3',4',7,8-penta-O-metilgossipetina (F10) e

3,3',4',7-tetra-O-metilquercetina (F11).

Apesar do insucesso obtido pela pouca quantidade de material vegetal disponível,

observa-se que o projeto com espécies herborizadas durante muito tempo pode ser viável, uma

vez que foi possível verificar a presença de substâncias aromáticas (flavonóides?) nas espécies

e que em pelo menos três espécies foi identificado alguns flavonóides idênticos a partir dos

padrões. Em um trabalho posterior será coleta de uma maior quantidade de material vegetal

fresco no campo e os resultados serão comparados. No entanto, a análise quimiotaxonômica

pode ser realizada apartir dos resultados obtidos com todas as espécies estudadas até o

momento pelo grupo (SILVA et al. 2002, 2004), incluindo aquelas do presente trabalho. No

quadro abaixo estão às espécies com os flavonóides de Solanum subg. Leptostemonum.

Quadro 1. Flavonóides agliconas isolados de Solanum subg. Leptostemonum.

Seção

Acanthophora

Crinitum

Erythrotrichum

Lasiocarpum

Micracantha

Polytrichum

Desconhecido

Espécies

S. agrarium

S. crinitum

S. grandiflorum

S. jabrense

S. paludosum

S. rrytidoandrum

S. stramonifolium

S. paraibanum

S. hexandrum

S. leptostachyo

Flavonas

Apigenin X X

Ap-7-Me

Flavonols

Kanferol X X X X X X

K-7-Me X X

K-3-7-diMe X

Quercetina

Q-3-Me X X

Q-3,7,3’,4’-tetraMe X X X X X

Gossipetina

G-3,7,3’,4’-tetraMe X X X X X X X

G-3,7,8,3’,4’-pentaMe

Miricetina X X X X X X

M-3,7,3’-triMe X

Além das espécies do subgênero Leptostemonum, mostradas no quadro acima, duas

espécies do subgênero Brevantherum, Solanum sect Brevantherum, S. asperum e S.

stipulaceum, foram estudadas quimicamente. Destas espécies foram isolados flavonóides

glicosilados e acilados derivados do kanferol. Os tricomas foram estudados separadamente e

foi verificado que os flavonóides estavam presentes nestes, que são do tipo estrelado. Este

dado é inédito, uma vez que anteriormente os flavonóides glicosilados não haviam sido

relatados em estruturas secretórias de Solanum.

Muitos flavonóis (3-oxiflavonas) glicosilados descritos como bioprodutos de espécies

deste gênero são geralmente derivados do kanferol (3,5,7,4’-tetraidroxiflavona) e quercetina

(3,5,7,3’,4’-pentaidroxiflavona), o mesmo ocorrendo também com os derivados metilados e

acilados. Substâncias derivadas da isoramnetina (3,5,7,4’-tetraidroxi-3’-metoxiflavona) e

miricetina (3,5,7,3’,4’,5’-hexaidroxiflavona) são mais restritos. A glicose e a ramnose

aparecem como os carboidratos mais frequentes, podendo-se considerar a galactose, a

arabinose e a xilose como de ocorrência relativamente rara. A única flavona glicosilada

(Quadro 1) encontrada até o presente é derivada da luteolina (5,7,3’,4’-tetraidroxiflavona).

Os flavonóis livres ocorrem em um número menor de espécies. Derivados da

gossipetina (3,5,7,8,3’,4’-hexahidroxiflavona), (SILVA, 2002a; SILVA et al., 2004) e a

herbacetina (3,5,7,8,4’-pentaidroxiflavona), (SILVA, 2002a; SILVA et al., 2004) foram

relatados recentemente. Relativamente poucos derivados das flavonas apigenina (5,7,4’-

triidroxiflavona), luteolina (5,7,3’,4’-tetraidroxiflavona) e crisoeriol (5,7,4’-triidroxi-3’-

metoxiflavona) encontram-se descritos na literatura.

A posição 5 dos flavonóides das espécies da família Solanaceae apresenta-se ocupada

por um grupo hidroxila (BOHM, 1998). As espécies do gênero Solanum destacam-se pela

capacidade excepcional para produzir 3-O-glicosídioflavonóis, mas também fornecem um

número significativo de kanferol metilado, quercetina e miricetina como agliconas, muitos dos

quais mostram 8-hidroxilação/glicosilação (STEINHARTER et al., 1986).

O acúmulo de flavonóides não glicosilados está relacionado com a existência de

estruturas secretórias e a formação de outros produtos naturais lipofílicos. Assim, os

flavonóides dos exudatos são observados em famílias e gêneros distintos, espalhados no reino

vegetal. Solanaceae (Lycopersicum, Solanum) é uma das famílias que acumulam flavonóides

livres externamente (WOLLENWEBER et al., 1988). Recentemente, nós demonstramos pela

primeira vez na literatura (SILVA, 2002a; SILVA et al., 2004) que tais flavonóides de

Solanum Subg. Leptostemonum estão localizados nos tricomas estrelados (SILVA, 2002a;

SILVA et al., 2004).

A ocorrência de um padrão particular de substituição é frequentemente usada como um

indicador de avanço filogenético (HARBORNE, 1977; SWAIN, 1980). Steinharter (1986)

estabeleceu um esquema filogenético hipotético para as seções do gênero Solanum, mostrando

o relacionamento entre cada seção com base na complexidade biossintética dos flavonóis

bioproduzidos. No esquema proposto, a presença de metoxila em 3, 4’ e 7 e hidroxila em C-8

foi usada para definir estados de caracteres avançados. A seção Androceras (Subg.

Leptostemonum) revelou elevado grau de complexidade em flavonóis, exibindo caracteres de

flavonóides avançados por trimetilação e 8-hidroxilação. Estes dados e os resultados obtidos

recentemente através da investigação das espécies S. paludosum, S. rhytidoandrum e S.

jabrense permitem agora colocar a seção Erythrotrichum (Subg. Leptostemonum) no mesmo

nível da seção Androceras, já que os flavonóides isolados destas espécies podem ser

classificados como complexos e como indicativo de avanço filogenético. Com base no

esquema filogenético proposto por Steinharter (1986), sugerimos agora o acréscimo das seções

dos dois subgêneros estudados nas posições destacadas no Esquema 5.

Esquema 5. Esquema filogenético ilustrando o relacionamento entre cada seção com base na

complexidade biossintética*

*Steinharter, T. P. et al. Biochem. System. Ecol. 14(3), 299, 1986.

As similaridades químicas apresentadas pelas espécies do mesmo subgênero suportam

a classificação infragenérica tradicional de acordo com os dados morfológicos. Nosso estudo

evidencia também uma correlação entre o grau de complexidade dos flavonóides e os tipos de

tricomas. Espécies com tricomas estrelados (S. agrarium, S. asperum, S. crinitum, S.

paraibanum e S. stramonifolium) e tricomas glandulares estrelados (S. jabrense, S. paludosum

e S. rhytidoandrum) apresentam flavonóides com estruturas mais complexas e características

mais avançadas

Pelos padrões flavonoídicos encontrados nas espécies de Solanum sect.

Erythrotrichum, S. jabrense, S. paludosum e S. rhytidoandrum é possível traçar uma rota

biossintética para esta seção. No Esquema 6 está a nossa proposta da rota biossintética para os

flavonóides encontrados das três espécies.

Seção Subgênero

Esquema 6. Proposta biossintética para os flavonóides de Solanum seção Erythtrotrichum

Child.

II.6 Conclusões

A análise dos flavonóides das espécies estudadas aqui permitiu correlacionar o grau de

complexidade dos flavonóides com os tricomas presentes, além de suportar a classificação

infragenérica tradicional pela similaridade química entre as espécies. Nenhuma espécie da

seção Erythrotrichum havia sido estudada anteriormente, portanto este trabalho contribuirá

para catalogação quimiotaxonômica, colocando as espécies como mais derivadas no gênero

Solanum, próximo a Solanum sect. Androceras. Com os flavonóides semelhantes encontrados

nas espécies S. jabrense, S. paludosum e S. rhytidoandrum (Sect. Erytrotrichum) foi possível

propor uma rota biossintética.

Este é o primeiro relato da existência de flavonóides glicosilados em estruturas

secretórias de Solanum.

CAPÍTULO III

ESTUDO DA ATIVIDADE SEQUESTRADORA DE RADICAIS LIVRES E

BIOENSAIO COM ARTEMIA SALINA DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM

ESTUDO DA ATIVIDADE SEQUESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DE

ESPÉCIES DE SOLANUM

III.1 Introdução

A atividade anti-radicalar utilizando o radical DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil)

(Figura 46), tem sido muito utilizada para verificar a capacidade seqüestradora dos radicais

livres de muitos produtos naturais (AHMAD et al., 2005; ASSIMOPOULOU et al., 2005;

CHOUDHARY et al., 2005).

Além dos alcalóides, os flavonóides constituem uma classe de metabólitos especiais

freqüentes no gênero Solanum (SILVA et al., 2003) e a presença destas substâncias nos levou

a verificar a atividade sequestradora de radicais livres dos extratos obtidos de espécies do

gênero Solanum uma vez que os flavonóides são bem conhecidos por apresentar esta atividade

(CHU et al., 2000; AKDEMIR et al., 2001; OKAWA et al., 2001; SANG et al., 2002;

HORVATHOVA et al., 2003).

III.1.2 Objetvos

Avaliar a atividade seqüestradora de radicais livres com os extratos brutos, as frações

obtidas das partições e as substâncias de algumas espécies. Foram testadas quatro espécies do

gênero Solanum: Folhas de Solanum agrarium (Ext. EtOH bruto e fração AcOEt), partes

aéreas de Solanum asperum (Ext. MeOH bruto, frações hexano:éter e AcOEt) e Solanum

stipulaceum (Ext. MeOH bruto, frações CHCl

, benzeno:éter, MeOH:aquoso). Além dos

extratos e frações foram testados os flavonóides 6 (isolado da fração MeOH aquosa de S.

asperum) e 3 (isolado da fração benzeno:éter de S. stipulaceum).

III.1.3 Metodologia

O teste foi realizado seguindo a metodologia descrita por Campos (1997). A solução

estoque dos extratos ou substâncias foram preparadas a 0,5 mg/mL. Quantidades apropriadas

(obtidas através do screening preliminar) destes extratos/substâncias foram tranferidas para

tubos de ensaio contendo 5 mL da solução de DPPH (23,6 µg/mL em EtOH) fornecendo

concentrações finais que variaram de 12 a 333 µg/mL. Cada concentração foi testada em

triplicata. Após 30 minutos de agitação em aparelho de ultra-som a quantidade de radicais de

DPPH foi registrada em espectrofotômetro operando no UV-Visível em comprimento de onda

de 517 nm. A percentagem da atividade seqüestradora foi calculada pela equação:

% AS = 100 x Δhx / hc hc = absorbância controle (DPPH + Etanol)

hx = absorbância teste (DPPH + Substância teste)

∆hx = hc – hx

A eficiência anti-radicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão linear no

intervalo de confiança de 95 % (p<0,05) obtido pelo programa de estatística GraphPad Prism

4.0. Os resultados são expressos através da CE

± EPM, que representa a concentração da

amostra necessária para obter metade da atividade seqüestradora dos radicais DPPH. Os

extratos e substâncias são considerados ativos quando apresentam CE

<500 µg/mL

(CAMPOS et al., 2003). Como controle positivo foram ustilizados o ácido ascórbico e o BHT

(2,6-di-terc-butil-4-metil-fenol) (Figura 46).

(a) 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH)

(b) 2,6-di-terc-butil-4-metil-fenol (BHT)

OH OH

Figura 46. Estruturas do DPPH, BHT e ácido ascórbico

III.1.4 Resultados e Discussão

Nas Figuras 48-50 e Tabela 11 estão os resultados obtidos com extratos brutos,

frações e substâncias de S. agrarium, S. asperum e S.stipulaceum e os respectivos valores das

encontrados.

Todos os extratos e frações testadas apresentaram atividade anti-radicalar. Esta pode

estar relacionada com a presença dos flavonóides ou de outras substâncias fenólicas nos

extratos.

O extrato EtOH bruto de S. agrarium (CE

=166,67 ± 0,48 µg/mL) apresentou

atividade maior que a fração AcOEt (CE

=251,22 ± 0,70 µg/mL). Do extrato AcOEt foi

isolado apenas 6,1 mg do flavonóide 3,3’,7-tri-O-metil-miricetina (7). A pouca quantidade da

substância impossibilitou o estudo para comprovação ou não da atividade anti-radicalar

mostrada pela fração AcOEt. Futuros testes serão feitos com extratos hexano:éter para

comparação com extrato EtOH bruto.

A fração AcOEt (CE

=15,88 ± 0,20 µg/mL) das partes aéreas de S. asperum

apresentou atividade maior que o extrato MeOH bruto (CE

=69,36 ± 0,44 µg/mL) e MeOH

aquoso (CE

=153,82 ± 7,64 µg/mL). Da fração AcOEt foi isolado o flavonóide tilirosídeo

(5). Este flavonóide já é conhecido por apresentar atividade anti-radicalar frente ao DPPH

(SALA et al., 2003).

Entre os extratos MeOH (CE

=99,17 ± 2,28 µg/mL) e as frações benzeno:éter

(CE

=141,90 ± 3,32 µg/mL), CHCl

(CE

=61,06 ± 0,67 µg/mL) e MeOH aquoso

(CE

=147,10 ± 1,81 µg/mL) de S. stipulaceum, a mais ativa foi a fração CHCl

. Apesar disso

e pela presença de flavonóides mostrada na fração benzeno:éter com regente NP em CCDA,

este foi primeiramente escolhido para estudo químico. Desta fração foram isolados os

flavonóides tilirosídeo (1), kanferol (2) e quercetina (3), portanto a atividade anti-radicalar

pode estar associada à presença de pelo menos dois flavonóides, pois em trabalhos anteriores

foi verificada a atividade seqüestradora de radicais livres, utilizando o DPPH, dos flavonóides

quercetina (MATERSKA, 2005; PINELO; et al., 2004; RUSAKC; et al., 2005) e tilirosídeo

(SALA et al., 2003), sendo o kanferol pouco ativo frente a este radical (RUSAKC; et al.,

2005; YU; et al., 2005). Apesar da presença dos flavonóides no extrato benzeno:éter estes

estão em pequenas quantidades e isto pode justificar em parte o menor valor de CE

quando

comparado com o extrato MeOH bruto.

Várias teorias tem sido as apresentadas sobre a forma de como os flavonóides podem

interferir na reação de espécies radicalares. Uma das mais aceitas aponta para a necessidade de

existência de pelo menos um dos grupos funcionais nos flavonóides destacados na Figura 47

(CAMPOS, 1997):

Figura 47. Grupos funcionais necessários para haver atividade anti-radicalar.

Tabela 11. Atividade seqüestradora de radicais livres de espécies do gênero Solanum

utilizando o radical livre DPPH.

* Média±SEM (n=3);

Concentração suficiente para obter 50% da capacidade máxima de sequestrar os radicais

livres (descrito em materias e métodos). Os valores de EC

foram calculados pela reta da

regressão linear de cada extrato, fase e substância.

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

(μg/mL)

Figura 48. Atividade seqüestradora de radicais livres do extrato MeOH bruto, das frações e de

uma substância isolada das folhas de Solanum stipulaceum Roem & Schult (A).

Plantas

Parte da

planta

Extratos e substâncias testados

± *E.P.M.

(µg/ mL)

Folhas

EtOH 166,67 ± 0,49

S. agrarium

Folhas

AcOEt 251,22 ± 0,70

Partes aéreas

MeOH 69,36 ± 0,44

Partes aéreas

AcOEt 15,88 ± 0,20

Partes aéreas

MeOH aquoso 153,82 ± 7,64

S. asperum

Flavonóide (6) >500

Folhas

MeOH 99,17 ± 2,28

Folhas

Benzeno:etéreo 149,90 ± 3,32

Folhas

CHCl

61,06 ± 0,67

Folhas

MeOH aquoso 147,10 ± 1,81

S. stipulaceum

Quercetina 1,73 ± 0,35

Ácido ascórbico 2,48 ± 0,03

Controle

positivo

BHT 4,47 ± 0,08

ácido ascórbico

BHT

quercetina

Fração MeOH:H

Fração CHCl

FraçãoBenzeno:éter

ExtratoMeOH

2,48 ± 0,03

4,47 ± 0,08

1,73 ± 0,35

147,10 ± 1,81

61,06 ± 0,67

141,90 ± 3,32

99,17 ± 2,28

0 50 100 150 200 250

(μg/mL)

Figura 49. Atividade seqüestradora de radicais livres do extrato MeOH bruto e das frações

das partes aéreas de Solanum asperum Richard (B).

0 50 100 150 200 250

(μ g/mL)

Figura 50. Atividade seqüestradora de radicais livres do Ext. EtOH bruto e da fração AcOEt

das folhas de Solanum agrarium Sendtner (C).

ácido ascórbico 2,48 ± 0,03

BHT 4,47 ± 0,08

FraçãoMeOH:H

O 153,82 ± 7,64

FraçãoAcOEt 15,88 ± 0,20

ExtratoMeOH

69,36 ± 0,44

ácido ascórbico 2,48 ± 0,03

BHT 4,47 ± 0,08

Fração AcOEt 251,22 ± 0,07

Extrato EtOH 116,67 ± 0,49

ENSAIO DE TOXIDADE DE ESPÉCIES DO GÊNERO SOLANUM FRENTE À

ARTEMIA SALINA

III.2 Introdução

A Artemia salina, também conhecida como camarão de água salgada, ordem

Anostraca, classe Branchiopoda representa a mais primitiva forma de vida crustácea. Devido a

sua grande sensibilidade frente a uma grande variedade de compostos, a possibilidade de

estocar seus ovos por anos à temperatura ambiente e a obtenção de suas larvas entre 24-48 h, a

A. salina tem sido muito utilizada como organismo alvo indicador de toxicidade em

bioensaios. Por ser um indicador de toxicidade, este bioensaio consegue detectar uma grande

variedade de bioatividades que podem ser inerentes à planta e, possivelmente seriam ignoradas

em testes biológicos específicos. Além disso, estudo com substâncias bioativas de extratos de

plantas no laboratório de química é difícil por falta de um procedimento simples e fácil.

Existem muitos testes para bioensaios com animais, tecidos isolados ou com sistemas

bioquímicos, mas eles podem ser complicados e caros. Geralmente faz-se necessário a

colaboração com biólogos ou farmacologistas para execução dos testes em animais ou tecidos

e órgãos isolados. Uma alternativa para realização de bioensaio é o screening para toxicidade

geral que vem sendo usado nos laboratórios de química para ajudar no isolamento de

substâncias bioativas é com o microcrustáceo Artemia salina (SAM, 1993).

O ensaios com Artemia salina L. é estabelecido como um teste seguro, prático e

econômico para determinação da bioatividade de compostos sintéticos (ALMEIDA et al.,

2002) e produtos naturais (MEYER et al., 1982; MCLAUGHLIN et al., 1991). Existe uma

correlação significante entre o bioensaio com Artemia salina e a inibição da multiplicação de

linhagens de células tumorais humanas, demonstrado pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI,

USA). O bioensaio serve como pré-screening para triagem de drogas anti-tumorais

(ANDERSON et al., 1991).

O teste de letalidade com a Artemia salina é usado para investigar toxinas de fungos

(EPPLEY, 1974; YAMAMOTO, 1975), atividades anticancerígenas (MEYER et al., 1982),

moluscicida (STOESSL et al., 1989), antifúngicas (WANG et al., 1990) e antibióticos

(GOLINSKI et al., 1986), entre outras.

A larga distribuição de espécies do gênero Solanum e as propriedades anti-tumorais

apresentadas pelos glicoalcalóides (KUPCHAN et al., 1965; CHAM et al., 1987a; CHAM et

al., 1987b; DAUNTER et al., 1990; HU et al., 1999; ESTEVES-SOUZA et al., 2002; LEE et

al., 2004; FRIEDMAN et al., 2005) bem como a atividade moluscicida (SILVA et al., 2005a)

dos extratos brutos levou a escolha das espécies para o estudo no presente trabalho.

III.2.1 Metodologia

III.2.1.1 Material vegetal e preparação dos extratos

Foram investigadas 13 espécies do gênero Solanum. Todas as espécies foram coletadas

na região simi-árida do Nordeste brasileiro e identificadas pela Prof. Dra. Maria de Fátima

Agra (LTF-UFPB). As exsicatas enumeradas estão depositadas no Herbário Prof. Lauro Pires

Xavier (JPB) e duplicatas estão mantidas na coleção de referência do Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Brasil.

III.2.1.2 Preparação dos Extratos

O bioensaio feito com os frutos verdes de S. asperum, S. capsicoides, S. palinacantum,

S. paludosum, S. paniculatum, S. paraibanum e S. sisymbriifolium, as partes aéreas de S.

asperum, S. asterophorum, S. capsicoides, S. crinitum, S. diamentinense, S. megalonyx, S.

paniculatum, S. palinacantum, S. sisymbriifolium e S. torvum e as raízes de S. asperum, S.

asterophorum, S. paniculatum, S. paludosum e S. stipulaceum. Todos foram extraídos com

MeOH de acordo com SILVA et al., 2005a. Todos os extratos foram testados anteriormente

em Biomphalaria glabrata (SILVA et al., 2005a).

III.2.2 Ensaio Biológico

O ensaio de letalidade com Artemia salina foi realizado de acordo com MEYER et al.,

1982 e algumas modificações por SILVA et al., 2005b. Os ovos da Artemia salina foram

adicionados a um pequeno tanque dividido em dois compartimentos com água do mar e com

um lado coberto. Uma lâmpada foi colocada sobre o lado aberto do tanque para atrair os

nalplios. Depois de 48 h os nauplios são ultilizados no bioensaio. Os extratos MeOH testados

foram dissolvidos em três gotas de Cremophor

, 2,0 mL de DMSO e completado para 5,0 mL

com água do mar. Volumes apropriados da solução estoque foram adicionados em tubos de

ensaio contendo 5,0 mL de solução salina e 10 nauplios em quadruplicata. O controle foi feito

com Cremophor

e DMSO, nas mesmas condições. Após 24 h de incubação sob a luz, foram

contados mortos e vivos em cada tubo. Os valores de CL

foram calculados pelo gráfico da

concentração dos extratos versus a percentagem de mortos usando ajuste de escala probit. A

analise estatística foi feita pelo programa Origin 6.0.

III.2.3 Resultados e Discussão

Algumas espécies do presente estudo são utilizadas na medicina popular. As raízes de

Solanum asterophorum, Solanum paniculatum e Solanum torvum, por exemplo, são usadas no

tratamento de doenças do fígado (AGRA et al., 1999b) e este parece ser o uso etnomedicinal

mais comum. Um vinho é produzido comercialmente dos frutos de S. paniculatum e é utilizado

na medicina popular. S. asperum é conhecida como Coça-coça e causa irritação da pele

(AGRA et al., 1999b). A utilização das espécies do gênero Solanum pela medicina popular

estão na Quadro 2. As plantas que são conhecidas na medicina popular como tóxicas

apresentam também atividade em Artemia salina. A letalidade de diferentes extratos de

Solanum spp. frente a Artemia salina estão na Tabela 13. Os extratos são considerados

inativos quando os nauplios sobrevivem a concentração de 1000 µg/mL (MEYER et al., 1982).

Das treze espécies testadas, quatro foram inativas. Como mostrado na Tabela 13, os extratos

que apresentaram atividade moluscicida (SILVA et al., 2005a) também foram ativos nos

ensaios com a Artemia salina. As partes aéreas de S. asperum e S. megalonyx, e as raízes de S.

palinacanthum foram inativas no teste moluscicida e bioensaio com Artemia salina..

Os dados da Tabela 13 mostram que muitas espécies de Solanum spp. ativas no ensaio

com Artemia salina não são ativas para o molusco Biomphalaria glabrata. Por outro lado as

espécies de Solanum spp. que apresentaram atividade moluscicida também foram ativas com

Artemia salina. Os extratos mais ativos neste estudo foram os das raízes de S. asterophorum

(CL

=107,3 µg/mL) e das partes aéreas de S. torvum (CL

=295,2 µg/mL).

Surpreendentemente, o estudo químico das folhas desta espécie não mostrou a presença de

glicoalcalóides (MAHMOOD et al., 1985) enquanto que as raízes de S. asterophorum mostrou

a presença de alcalóides (SILVA et al., 2005a). Isto sugere que a bioatividade não é devido a

presença de alcalóides, mas de outros constituintes, por exemplo, as saponinas e sapogeninas

podem também apresentar atividade.

A atividade moluscicida observada em algumas espécies de Solanum é geralmente

atribuída à presença de glicoalcalóides. As outras classes de metabólitos secundários incluindo

as alcamidas, têm pouca ou nenhuma atividade (ALZERRECA et al., 1982; WANYONYI et

al., 2003; SILVA et al., 2005a).

III.2.4 Conclusão

Este estudo mostra que a bioatividade em Artemia salina para algumas espécies do

gênero Solanum não está relacionada com a atividade moluscicida, sugerindo que não existe

uma correlação direta entre o teste de toxidade com Artemia salina e atividade moluscicida,

como encontrado com a atividade citotoxica, indicando que outras classes de metabólitos

especiais estão envolvidas no processo. Outros testes biológicos como por exemplo anticâncer,

antifúngico devem ser feitos com os extratos.

Quadro 2. Usos na medicina popular e outros de Solanum spp. do Nordeste do Brasil.

R=Raízes; Fo=Folhas; F=Frutos.

Nome da planta Nome comum

Esxcicata

Agra n°

Uso medicinal

(parte usada)

S. agrarium Sendtner Gogoia 2120 Abortivo, prostata

S. asperum Rich. Jussara 1243

Irritante a pele

(Fo)

S. asterophorum Mart. Jurubeba-de-fogo 1744

Em doenças do

fígado (R)

S. capsicoides All. Gogoia 1292 Toxico (F)

S. crinitum Lam. Jurubeba 2246 Toxico (F)

S. diamantinense Jurubeba 5176 Desconhecido

S. megalonyx Sendtn. Jurubeba 5987 Desconhecido

S. palinacanthum Dunal Jurubeba 1296 Toxico (F)

S. paludosum Moric. Jurubeba-roxa 1100 Toxico (F)

S. paniculatum L. Jurubeba 1261

Anemia.

Tuberculose,

Doenças do fígado

(Fo, R)

S. paraibanum Agra Jurubeba-de-rama 1111 Desconhecido

S. sisymbrifolium Lam. Jurubeba 5553 Desconhecido

S. stipulaceum Roem. &

Schult.

Jurubeba-roxa 1806 Toxico (F)

S. torvum Sw. Jurubeba 1477

Em doenças do

fígado

Fonte: (AGRA, 1999c)

Tabela 12. Bioensaio (concentração letal média) dos extratos metanólicos das raízes, partes

aéreas e/ou frutos de Solanum spp. em Artemia salina e comparação com a atividade

moluscicida (PA=Partes aéreas; F=Frutos; R=Raízes).

Artemia slina Moluscicida

Nome da Planta

Parte

testeda

Ensaio

(CL

em µg/mL)

atividade

(CL

em µg/mL)

PA >1000 Inativo

F 420.5 Ativo (43.56)

S. asperum Rich.

R 593.4 Ativo (44.11)

PA 552.8 Inativo

S. asterophorum

Mart.

R 107.3 Inativo

PA 440.1 Inativo

S. capsicoides All.

F 476.9 Inativo

S. crinitum Lam. PA 833.4 Inativo

S. diamantinense PA 481.0 Ativo (52.80)

S. megalonyx Sendtn. PA >1000 Inativo

PA 488.3 Inativo

F >1000 Inativo

S. palinacanthum

Dunal

R >1000 Inativo

F 548.0 Ativo (82.86)

S. paludosum Moric.

R >1000 Inativo

PA 953.9 Inativo

S. paniculatum L.

F 823.2 Inativo

S. paraibanum Agra F 694.8 Inativo

PA 382.7 Ativo (46.66) S. sisymbrifolium

Lam.

F 696.4 Inativo

S. stipulaceum Roem.

& Schult.

R 823.1 Ativo (73.87)

S. torvum Sw. PA 295.2 Inativo

>1000 µg/mL é inativo; b.(SILVA et al., 2005a).

5. CONCLUSÕES

- O estudo químico de três espécies de Solanum resultou no isolamento do flavonóide 3,3’,7-

tri-O-metil-miricetina de Solanum agrarium, dois flavonóides de Solanum asperum:

tilirosídeo, 3-O-[β-D-glycopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-

ramnopiranosilkaempferol, e de Solanum stipulaceum foram isoladas as substâncias:

quercetina, kanferol, tilirosídeo e o ácido p-hidroxibenzóico. Todos os extratos e frações

obtidas destas três espécies apresentaram atividade seqüestradora do radical livre DPPH,

provavelmente devido à presença dos flavonóides.

-O estudo químico com as folhas obtidas de excicatas de espécie de Solanum subgênero

Leptostemonum por CLAE-DAD e dados obtidos anteriormente permitiu traçar um esquema

de avanço filogenético das espécies de acordo com as seções, além de propor uma rota

biossintética para Solanum sect. Erythrotrichum. Os resultados obtidos quimicamente

suportam os dados morfológicos.

-As duas espécies, S. asperum e S. stipulaceum, de Solanum subgênero e seção Brevantherum

apresentam flavonóides glicosilados nos tricomas estrelados. Estas duas espécies apresentaram

o flavonóide tilirosídeo.

-O estudo de toxidade com Artemia salina mostrou que a bioatividade em para algumas

espécies do gênero Solanum não está relacionada com a atividade moluscicida, sugerindo que

não existe uma correlação direta entre o teste de toxidade com Artemia salina e atividade

moluscicida, como encontrado com a atividade citotoxica, indicando que outras classes de

metabólitos especiais (sem ser os glicoalcaloides) estão envolvidas no processo. Outros testes

biológicos como por exemplo anticâncer, antifúngico devem ser feitos com os extratos.

6. REFERÊNCIAS

AGNOL, R.D.; POSER, G.L. The use of complex polysaccharides in the management of

metabolic diseases: the case of Solanum lycocarpum fruits. Journal of Ethnopharmacology,

v.71, n.1, p.337-341, 2000.

AGRA, M.F. Estudo Taxonômico do Gênero Solanum (Solanaceae) no município de João

Pessoa, Paraíba-Brasil. 1991. 243 f. Dissertação (Mestrado em Botânica) - Universidade

Federal Rural de Pernambuco, Recife.

AGRA, M.F. A new species of Solanum subgenus Leptostemonum (Solanaceae) from

Chapada da Diamantina, Bahia, Brazil. Novon, v.9, n.3, p.292-295, 1999a.

AGRA, M.F. Diversty and distribution of Solanum subgenus Leptostemonum in noth-east

Brazil. In: NEE, M.S., D.E.; LESRER, R.N.; JESSOP, J.P. Solanaceae IV. Royal Botanic

Gardens, Kew, 1999c. p.197-203.

AGRA, M.F.; BHATTACHARYYA, J. Ethnomedicinal and phytochemical investigation of

the Solanum species in the Northeast of Brazil. In: NEE, M.S., D.E.; LESRER, R.N.; JESSOP,

J.P. Solanaceae IV. Royal Botanic Gardens, Kew, 1999b. p. 341-343.

AGRAWAL, P.K.; THAKUR, R.S.; BANSAL, M.C.; MARKHAM, K.R.; PORTER, L.J.;

FOO, L.Y. Studies in Organic Chemistry 39 - Carbon-13 NMR of Flavonoids. ed. New

York: Elsevier Science Publishing Company, 1989. 564 p.

AHMAD, R.; ALI, A.M.; ISRAF, D.A.; ISMAIL, N.H.; SHAARI, K.; LAJIS, N.H.

Antioxidant, radical-scavenging, anti-inflammatory, cytotoxic and antibacterial activities of

methanolic extracts of some Hedyotis species. Life Sciences, v.76, n.17, p.1953-1964, 2005.

AKDEMIR, Z.S.; TATLI, II; SARACOGLU, I.; ISMAILOGLU, U.B.; SAHIN-ERDEMLI, I.;

CALIS, I. Polyphenolic compounds from Geranium pratense and their free radical scavenging

activities. Phytochemistry, v.56, n.2, p.189-193, 2001.

ALMEIDA, P.A.; SILVA T.M.S.; ECHEVARRIA, A. Mesoionic 5-alkyl-1,3-dithiolium-4-

thiolates: Synthesis and brine shrimp toxicity. Heterocyclic Communications, v. 8, n.6,

p.593-600, 2002.

ALVES, C.C.F.; ALVES, J.M.; SILVA, T.M.S.; CARVALHO, M.G.; JACOB NETO, J.

Atividade alelopática de alcalóides glicosilados de Solanum crinitum Lam. Floresta e

Ambiente, Brasil, v.10, n.1, p.93-97, 2004.

ALZERRECA, A.; HART, G. Molluscicidal Steroid Glycoalkaloids Possessing

Stereoisomeric Spirosolane Structures. Toxicology Letters, v.12, n.2-3, p.151-155, 1982.

ANDERSON, G.J.; STEINHARTER, T.P.; COOPERDRIVER, G. Foliar Flavonoids and the

Systematics of Solanum Sect Basarthrum. Systematic Botany, v.12, n.4, p.534-540, 1987.

ANDERSON, J.E.; GOETZ, C.M.; MCLAUGHLIN, J.L.; SUFFNESS, M. A blind

comparison of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as antitumor

prescreens. Phytochemical Analysis, v.2, p.107-111, 1991.

ASSIMOPOULOU, A.N.; SINAKOS, Z.; PAPAGEORGIOU, V.P. Radical scavenging

activity of Crocus sativus L. extract and its bioactive constituents. Phytotherapy Research,

v.19, n.11, p.997-1000, 2005.

ATTA-UR-RAHMAN; CHOUDHARY, I. Chemistry and Biology of Steroidal Alkaloids.

50. vol. San Diego. Academic Press, 1998. p.61-107.

BHATTACHARYYA, J. Isolation of Solasodine from the Fruits of Solanum asperum and

Solanum paludosum. Journal of Natural Products, v.47, n.6, p.1059-1060, 1984.

BHATTACHARYYA, J. Structure of solaparnaine, a new spirosolane alkaloid from the green

berries of Solanum asperum Vahl. Heterocycles, v.23, n.12, p.3111-3112, 1985.

BOHM, B.A. Introduction to Flavonoids. 2. vol. Vancouver: Harwood Acad. Publishers, p

119.

BROWN, J.H.T., PALMER. Agonistas e antagonistas dos receptores muscarínicos. In:

HARDMAN, J.G.L., L. E.; GILMAN, A. G. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. 10.

ed. Rio de Janeiro: Mc Graw Hill, 2003. p. 125-132.

CAMPOS, M.G. Caracterização do pólen apícola pelo seu perfil em compostos fenólicos e

pesquisa de algumas actividades biológicas. 1997. 318 f. Tese (Doutorado em fitoquímica e

farmacognosia) - Faculdade de Farmácia de Coimbra, Coimbra.

CAMPOS, M.G.; WEBBY, R.F.; MARKHAM, K.R.; MITCHELL, K.A.; DA CUNHA, A.P.

Age-induced diminution of free radical scavenging capacity in bee pollens and the

contribution of constituent flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51,

n.3, p.742-745, 2003.

CAVALCANTI, P.; FRIKEL, P. A Farmacopéia Tiriyó: Etno-botanico, museu paraense

Emílio Goeldi. Belém, Pará, 1973. p.145.

CHAM, B.E.; GILLIVER, M.; WILSON, L. Antitumour effects of glycoalkaloids isolated

from Solanum sodomaeum. Planta Medica, v.53, n.1, p.34-37, 1987a.

CHAM, B.E.; MEARES, H.M. Glycoalkaloids from Solanum sodomaeum are effective in the

treatment of skin cancers in man. Cancer Letters, v.36, p.111-118, 1987b.

CHOUDHARY, M.I.; BEGUM, A.; ABBASKHAN, A.; AJAZ, A.; SHAFIQUE UR, R.;

ATTA UR, R. Phenyl polypropanoids from Lindelofia stylosa. Chemical & Pharmaceutical

Bulletin, v.53, n.11, p.1469-1471, 2005.

CHU, Y.H.; CHANG, C.L.; HSU, H.F. Flavonoid content of several vegetables and their

antioxidant activity. Journal Of The Science Of Food And Agriculture, v.80, n.5, p.561-

566, 2000.

CORDELL, G.A. Chemistry of the Amazon: Biodiversity, Natural Products and

Enviromental Issues. 588. vol. ACS Symposium Series, 1995. p.315.

CORNELIUS, M.T.F.; ALVES, C.C.F.; SILVA, T.M.S.; ALVES, K.Z.; CARVALHO, M.G.;

BRAZ-FILHO, R.; AGRA, M.F. Solasonina e flavonóides isolados de Solanum crinitum Lam.

Revista Brasileira de Farmácia, v.85, n.2, p.57-59, 2004.

CRIMI, E.; SICA, V.; WILLIAMS-IGNARRO, S.; ZHANG, H.; SLUTSKY, A.S.;

IGNARRO, L.J.; NAPOLI, C. The role of oxidative stress in adult critical care. Free Radical

Biology and Medicine, v.In Press, Received 5 August 2005; revised 16 October 2005;

accepted 22 October 2005.

D’ARCY, W.G. Tipification of subdivisions of Solanum. In: Solanaceae II. 59. ed. London:

Missouri Botanical Garden, 1972. p. 262-278.

D’ARCY, W.G. The classification of the Solanaceae. In: HAWKES, J.G.L., R. N.;

SKELDING, A. The biology and taxonomy of the Solanaceae. 7. ed. London: Academic

Press, 1979. p. 3-47.

D’ARCY, W.G. The Solanaceae since 1976, with a review of its biogeography. In: HAWKES,

L., NEE & ESTRADA. Solanaceae III: taxonomy, chemistry evolution. ed. London: Royal

Botanic Gardens Kew and Linnean Society of London, 1991. p. 75-137.

DAUNTER, B.; CHAM, B.E. Solasodine glycosides. In vitro preferential toxicity for human

cancer cells. Cancer Letters, v.55, n.3, p. 209-220, 1990.

DENNERY, P.A. Introduction to serial review on the role of oxidative stress in diabetes

mellitus. Free Radical Biology and Medicine, v.40, n.1, p.1-2, 2006.

EI-NEGOUMY, S.I.; EI-SAYED, N.H.; MABRY, T.J. Revista Latinoamericana de

Quimímica, v.18, p.88, 1987.

EPPLEY, R.M. Sensitivity of the brine shrimp (Artemia salina) to trichothecenes. Journal

Association of Official Analytical Chemists, v.57, p.618, 1974.

ESTEVES-SOUZA, A.; DA SILVA, T.M.S.; ALVES, C.C.F.; DE CARVALHO, M.G.;

BRAZ, R.; ECHEVARRIA, A. Cytotoxic activities against Ehrlich carcinoma and human

K562 leukaemia of alkaloids and flavonoid from two Solanum species. Journal of the

Brazilian Chemical Society, v.13, n.6, p.838-842, 2002.

FENG, Z.; QIN, C.; CHANG, Y.; ZHANG, J.-T. Early melatonin supplementation alleviates

oxidative stress in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Free Radical Biology

and Medicine, v.40, n.1, p.101-109, 2006.

FRIEDMAN, M.; LEE, K.R.; KIM, H.J.; LEE, I.S.; KOZUKUE, N. Anticarcinogenic effects

of glycoalkaloids from potatoes against human cervical, liver, lymphoma, and stomach cancer

cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.53, p.6162-6169, 2005.

GOLINSKI, P.; WNUK, S.; CHELKOWSKI, J.; VISCONTI, A.; SCHOLLENBERGER, M.

Antibiotic Y biosynthesis by Fusarium avenaceum. Isolation and some physicochemical and

biological properties. Applied Environment Microbiology, v.51, p.743, 1986.

HARBORNE, J.B. Flavonoids and Evolution of Angiosperms. Biochemical Systematics and

Ecology, v.5, n.1, p.7-22, 1977.

HARBORNE, J.B.; SWAIN, T. In: HAWKES, J.G.L., R. N.; SKELDING, A. The biology

and taxonomy of the Solanaceae. 7. ed. London: Academic Press, 1979. p. 257.

HAVSTEEN, B.H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.

Pharmacology & Therapeutics, v.96, p.67-202, 2002.

HORVATHOVA, K.; NOVOTNY, L.; VACHALKOVA, A. The free radical scavenging

activity of four flavonoids determined by the comet assay. Neoplasma, v.50, n.4, p.291-295,

2003.

http://www.biota.org.br, acessada em Março 2002.

HU, K.; KOBYASHI, H.; DONG, A.; JING, Y.; IWASAKI, S.; YAO, X. Antineoplastic

agents III: steroidal glycosides from Solanum nigrum. Planta Medica, v.65, p.35-38, 1999.

JAY, D.; HITOMI, H.; GRIENDLING, K.K. Oxidative stress and diabetic cardiovascular

complications. Free Radical Biology and Medicine, v.In Press, Corrected Proof, Received 21

April 2005; accepted 15 June 2005.

JUSSIEU, A.L. Genera Plantarum Secundum Ordines Naturales disposita. Paris: Herissan

& Barrois, 1789.

KARAA, A.; KAMOUN, W.S.; CLEMENS, M.G. Oxidative stress disrupts nitric oxide

synthase activation in liver endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine, v.39, n.10,

p.1320-1331, 2005.

KITCHING I. J.; FOREY P. L.; HUMPHRIES C. J.; M., W.D. Cladistics:The Theory and

Practice of Parsimony Analysis. 2. ed. Oxford: Oxford University Press, 1998. p.

KNAPP, S.; BOHS, L.; NEE, M.; SPOONER, D.M. Solanaceae - a model for linking

genomics with biodiversity. Comparative and Functional Genomics, v.5, n.3, p.285-291,

2004.

KUHN, R.; LOW, I. Abbau Von Tomatidin Zum Tigogeninlacton - (Mitbearbeitet Von

Heinrich Trischmann). Chemische Berichte-Recueil, v.85, n.5, p.416-424, 1952.

KUMARI, G.N.K.; RAO, L.J.M.; RAO, N.S.P. Myricetin methyl ethers from Solanum

pubescens. Phytochemistry, v.23, n.11, p. 2701-2702, 1984.

KUPCHAN, S.M.; BARBOUTIS, S.J.; KNOX, J.R.; LAU CAM, C.A. Beta-solamarine:

tumor inhibitor isolated from Solanum dulcamara. Science, v.150, p.1827-1828, 1965.

LEE, K.R.; KOZUKUE, N.; HAN, J.S.; PARK, J.H.; CHANG, E.Y.; BAEK, E.J.; CHANG,

J.S.; FRIEDMAN, M. Glycoalkaloids and metabolites inhibit the growth of human colon

(HT29) and liver (HepG2) cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.52,

p.2832-2839, 2004.

LEWIS, W.; ELEWIN-LEWIS, M. Medical Botany, Plants affecting human health. 2. ed.

John Wiley & Sons, 1977. 832 p.

LOPEZ-DIAZGUERRERO, N.E.; LOPEZ-ARAIZA, H.; CONDE-PEREZPRINA, J.C.;

BUCIO, L.; CARDENAS-AGUAYO, M.C.; VENTURA, J.L.; COVARRUBIAS, L.;

GUTIERREZ-RUIZ, M.C.; ZENTELLA, A.; KONIGSBERG, M. Bcl-2 protects against

oxidative stress while inducing premature senescence. Free Radical Biology and Medicine,

v.In Press, Corrected Proof, Received 27 April 2005; revised 28 October 2005; accepted 3

November 2005, 2005.

MAHMOOD, U.; AGRAWAL, P.K.; THAKUR, R.S. Torvonin-A, a spirostane saponin from

Solanum torvum leaves. Phytochemistry, v.24, p.2456-2457, 1985.

MARKHAM, K.R. Techniques of flavonoid identification. ed. London: Academic Press,

1982. p.

MARTINS, R.E.; CASTRO, D.M.; CASTELLANI, D.C.; DIAS, J.E. Plantas Medicinais. 2.

ed. Viçosa: UFV- Imprensa Universitária, 1998. 220 p.

MATERSKA, M.P., IRENA. Antioxidant Activity of the Main Phenolic Compounds Isolated

from Hot Pepper Fruit (Capsicum annuum L.). Journal Agricultural and Food Chemistry,

v.53, n.5, p. 1750-1756, 2005.

MCLAUGHLIN, J.L.; CHANG, C.J.; SMITH, D.L. “Bench-top” bioassays for the discovery

of bioactive natural products: an update. In. In: A., R. Studies in Natural Product

Chemistry. 9. ed. Amsterdam: Elsevier, 1991. p. 383-409.

MEYER, B.N.; FERRIGNI, N.R.; PUTNAM, J.E.; JACOBSEN, L.B.; NICHOLS, D.E.;

MCLAUGHLIN, J.L. Brine Shrimp - A Convenient General Bioassay for Active-Plant

Constituents. Planta Medica, v.45, n.1, p.31-34, 1982.

MEYER, B.N.; FERRIGNI, N.R.; PUTNAM, J.E.; JACOBSEN, L.B.; NICHOLS, D.E.;

MCLAUGHLIN, J.L. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant

constituents. Planta Medica, v.45, p.31-34, 1982.

MINAMIYAMA, Y.; TAKEMURA, S.; HAI, S.; SUEHIRO, S.; OKADA, S. Vitamin E

deficiency accelerates nitrate tolerance via a decrease in cardiac P450 expression and

increased oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine, v.In Press, Received 21 July

2005; revised 15 September 2005; accepted 4 October 2005.

MOTTA, S.; GUERRA, M.O.; PETERS, V.M.; REIS, J.E.P. Administração de polvilho de

lobeira (Solanum lycocarpum St. Hil.) a ratas lactando: desenvolvimento físico das crias.

Revista Lecta, Bragança Paulista, v.20, n.1, p.53-60, 2002.

100

NEE, M. Synopsis of Solanum in the New World. In: NEE, M.S., D.E.; LESTER, R.N.;

JESSOP, J.P. Solanaceae IV: advances in biology and utilization. ed. Royal Botanic

Gardens.Kew, 1999. p. 285-333.

OKAWA, M.; KINJO, J.; NOHARA, T.; ONO, M. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

radical scavenging activity of flavonoids obtained from some medicinal plants. Biological &

Pharmaceutical Bulletin, v.24, n.10, p.1202-1205, 2001.

OLIVEIRA, L.G.; SUSTER, R.; PINTO A. C.; RIBEIRO, N.M.; SILVA, R.B. Informação de

Patentes: Ferramenta Iindispensável para a Pesquisa e o Desenvolvimento Tecnológico.

Quimica Nova, v.28 (suplemento), p.S36-S40, 2005.

PHILLIPSON, G.W.; ANDERSON, A.C. Journal of Ethnopharmacolology, v.25, p.61,

1998.

PINELO, M.; MANZOCCO, L.; NUÑEZ, M.J.; NICOLI, M.C. Solvent effect on quercetin

antioxidant capacity. Food Chemistry, v. 88, p.201-207, 2004.

PINTO, A.C.; REZENDE, C.M.; GARCEZ, F.R.; EPIFANIO, R.D. An overview of the

Brazilian natural product community. Química Nova, v.26, n.6, p.966-971, 2003.

PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.D.; LOPES, N.P.; EPIFANIO, R.D. Current

status, challenges and trends on natural products in Brazil. Química Nova, v.25, p.45-61,

2002.

PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.D.; LOPES, N.P.; EPIFANIO, R.D. Current

status, challenges and trends on natural products in Brazil. Química Nova, v.25, p.45-61,

2002.

PIZZOLATTI, M.G.; CUNHA, A.; SZPOGANICZ, B.; DE SOUSA, E.; BRAZ, R.;

SCHRIPSEMA, J. Flavonoids glycosides from leaves and flowers of Bauhinia forficata

(Leguminosae). Química Nova, v.26, n.4, p.466-469, 2003.

RODDICK, J.G. Steroidal Glycoalcaloids: Nature and Consequences of Bioactivity. In:

GEORGE, R.W.; YAMASAKI, K. Saponins used in tradicional and modern medicine. ed.

New York: Plenum Press, 1996. p. 277-295.

ROUHI, A.M. Chem. Eng. News, v.7, p.214, 1997.

RUSAKC, G.; GUTZEITA, H.O.; MQLLERB, J.L. Structurally related flavonoids with

antioxidative properties differentially affect cell cycle progression and apoptosis of human

acute leukemia cells. Nutrition Research, v. 25, p.141-153, 2005.

SALA, A.; RECIO, M.C.; SCHINELLA, G.R.; MANEZ, S.; GINER, R.M.; CERDA-

NICOLAS, M.; RIOS, J.L. Assessment of the anti-inflammatory activity and free radical

scavenger activity of tiliroside. European Journal of Pharmacology, v.461, n.1, p.53-61,

2003.

101

SAM, T.W. Toxicity testing using the brine shrimp: Artemia salina. In: STEVEN M.C.;

MOLYNEUX, R.J. Bioactive Natural Products, Detection, Isolation, and Structural

Determination. ed. Tokyo: CRC Press, 1993. p. 528.

SANG, S.M.; LAPSLEY, K.; JEONG, W.S.; LACHANCE, P.A.; HO, C.T.; ROSEN, R.T.

Antioxidative phenolic compounds isolated from almond skins (Prunus amygdalus batsch).

Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50, n.8, p.2459-2463, 2002.

SATO, Y.; KATS, A.; MOSETTIG, E. Degradation of tomatidine. Journal of the American

Chemical Society, v.74, p.538-539, 1952.

SATO, Y.; MILLER, H.K.; MOSETTIG, E. Degradation of Solasodine. Journal of the

American Chemical Society, v.73, n.10, p.5009-5009, 1951.

SILVA, T.M.S. Investigação Fitoquímica de Solanum L. (Solanaceae) do Nordeste do

Brasil. 52º Congresso Nacional de Botânica. João Pessoa, Paraíba: Resumos. 22 a 28 de julho,

2001.

SILVA, T.M.S. Estudo de Espécies de Solanum. 2002a. 194 f. Tese (Doutorado em química

orgânica) - Universidade Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

SILVA, T.M.S.; AGRA, M.D.F.; BHATTACHARYYA, J. Studies on the alkaloids of

Solanum of northeastern Brazil. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v.15, n.4, p.292-293,

2005.

SILVA, T.M.S.; AGRA, M.F.; BHATTACHARYYA, J. Studies on the alkaloids of Solanum

of northeastern Brazil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n.4, p.292-293, 2005b.

SILVA, T.M.S.; BATISTA, M.M.; CAMARA, C.A.; AGRA, M.F. Molluscicidal activity of

some Brazilian Solanum spp. (Solanaceae) against Biomphalaria glabrata. Annals of

Tropical Medicine and Parasitology, v.99, n.4, p.419-425, 2005a.

SILVA, T.M.S.; BRAZ-FILHO, R.; DE CARVALHO, M.G.; AGRA, M.F. Flavonoids and an

alkamide from Solanum paludosum Moric. Biochemical Systematics and Ecology, v.30, n.5,

p.479-481, 2002b.

SILVA, T.M.S.; BRAZFILHO, R.; CARVALHO, M.G.; AGRA, M.F. 1,2,3,4-Tetrahydro-2-

methyl-B-carboline and Solavetivone from Solanum jabrense Agra & M. Nee. Biochemical

Systematics and Ecology, v.30, n.11, p.1083-1085, 2002c.

SILVA, T.M.S.; COSTA, R.A.; OLIVEIRA, E.J.; BARBOSA-FILHO, J.M.; AGRA, M.F.;

CAMARA, C. Complete

H and

CNMR assignments of Isojuripidine from Solanum

asterophorum Mart. Journal of the Brazilian Chemical Society, v.16, n.6B, p.1467-1471,

2005c.

SILVA, T.M.S.; DE CARVALHO, M.G.; BRAZ, R.; AGRA, M.D. Occurrence of flavones

and flavonols aglycones and its glycosides in Solanum (Solanaceae). Química Nova, v.26,

n.4, p.517-522, 2003.

102

SILVA, T.M.S.; NASCIMENTO, R.J.B.; CAMARA, C.A.; CASTRO, R.N.; BRAZ, R.;

AGRA, M.D.; DE CARVALHO, M.G. Distribution of flavonoids and N-trans-caffeoyl-

tyramine in Solanum subg. Leptostemonum. Biochemical Systematics and Ecology, v.32,

n.5, p.513-516, 2004.

SILVA, T.M.S.; SILVA, C.C.; AGRA, M.F.; CARVALHO, M.G.; BRAZ FILHO, R.

Constituintes químicos do extrato acetato de etila das partes aéreas de Solanum paludosum

Moric. Revista brasileira de farmacognosia, v.12, p.85-86, 2002.

SIMIC, M.G.; BERGTOLD, D.S.; KARAM, L.R. Generation of oxy radicals in biosystems.

MUTATION RESEARCH, v.214, p.3-12, 1989.

SOUSA, E.; ZANATTA, L.; SEIFRIZ, I.; CREEZYNSKI-PASA, T.B.; PIZZOLATTI, M.G.;

SZPOGANIEZ, B.; SILVA, F. Hypoglycemic effect and antioxidant potential of kaempferol-

3,7-O-(alpha)-dirhamnoside from Bauhinia forficata leaves. Journal of Natural Products,

v.67, n.5, p.829-832, 2004.

STANNARD, B.L.; HAVEY, Y.B.; HARLEY, R.M. Flora of the Pico das Almas Chapada

Diamantina-Bahia, Brasil. 1. ed. Grã-Bretanha: Whitstable Litho Ltd, 1995. p. 599-601.

STEINHARTER, T.P.; COOPERDRIVER, G.A.; ANDERSON, G.J. The Phylogenetic

Relationship of Solanum Flavonols. Biochemical Systematics and Ecology, v.14, n.3, p.299-

305, 1986.

STOESSL, A.; COLE, R.J.; ABRAMOWSKI, Z.; LESTER, H.H.; TOWERS, G.H.N. Some

biological properties of traversianal, a strongly molluscicidal diterpenoid aldeyde from

Cercospora traversiana. Mycopathologia, v.106, n.1, p. 41-46, 1989.

SWAIN, T. Flavonoids as chemotaxonomic markers in plants. In: CZYGAN, F. Pigments in

Plants. 2. ed. Stuttgard: Gustav Fischer Verlog, 1980. p. 224.

TREVISAN, M.T.S.; MACEDO, F.V.V. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from

plants to treat alzheimer’s disease. v.26, n.3, p.301-304, 2003.

WANG, Y.; TOYOTA, M.; KRAUSE, F.; HAMBURGER, M.; HOSTETTMANN, K.

Polyacetylenes from Artemisia borealis and their biological activities. Phytochemistry, v.29,

n.1, p.3101-3105, 1990.

WANYONYI, A.W.; CHHABRA, S.C.; MKOJI, G.; NJUE, W.; TARUS, P.K. Molluscicidal

and antimicrobial activity of Solanum aculeastrum. Fitoterapia, v.74, n.3, p.298-301, 2003.

WHALEN, M.D. Conspectus of species groups in Solanum subgenus Leptostemonum. Gentes

Herbarium, v.2, n.4, p.179-292, 1984.

WOLLENWEBER, E.; JAY, M.E. The Flavonoids, Advances in Research since 1980. In:

HARBONE, J.B. ed. London: Chapman & Hall, 1988. p. 233.

YAMAMOTO, K. Methods for the determination of mycotoxins. III. Investigations of the

mycotoxin bioassay method using brine shrimp larvae (Artemia salina) and its applications.

Nara Igaku Zasshi, v.26, p. 264, 1975.

103

YANO, C.L.; MARCONDES, M.C.C.G. Cadmium chloride-induced oxidative stress in

skeletal muscle cells in vitro. Free Radical Biology and Medicine, v.39, n.10, p.1378-1384,

2005.

YU, J.; WANG, L.; WALZEM, R.L.; MILLER, E.G.; PIKE, L.M.; PATIL, B.S. Antioxidant

Activity of Citrus Limonoids, Flavonoids, and Coumarins. Journal Agricultural and Food

Chemistry, v.53, p.2009-2014, 2005.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 