( PDF ) Estudo de elementos moduladores da expressão gênica em diferentes linhagens de células de mamífero em cultura

Download PDF

ads:

Estudo de elementos moduladores da expressão gênica

em diferentes linhagens de células de mamífero

Luana Salgado Quilici

Orientadora: Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão

Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Brasília – DF

2008

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Dissertação apresentada ao

Departamento de Biologia Celular do

Instituto de Ciências Biológicas como

requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Biologia Molecular

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Estudo de elementos moduladores da expressão gênica

em diferentes linhagens de células de mamífero

Luana Salgado Quilici

Orientadora: Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão

Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Brasília – DF

2008

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Dissertação apresentada ao

Departamento de Biologia Celular do

Instituto de Ciências Biológicas como

requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Biologia Molecular

ads:

Banca Examinadora:

Dra. Santuza Maria Ribeiro Teixeira (UFMG – Membro Externo)

Prof. Dr. Márcio José Poças Fonseca (UnB – Membro Interno)

Profª. Dra. Ildinete Silva Pereira (UnB – Suplente)

Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão (UnB – orientadora)

Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido (UnB – co-orientador)

Trabalho desenvolvido no Laboratório de

Biologia Molecular da Universidade de

Brasília, sob a orientação da Profª. Dra.

Andréa Queiroz Maranhão

Dedico este trabalho aos meus

pais, Eva e Gedson, por sempre

me incentivarem a estudar e a

seguir meus sonhos...

Agradeço a Deus pela força e

coragem nas horas em que mais

me desesperei...

... agradeço também à Andréa e

ao Marcelo, por me agüentarem

quatro anos e me ajudarem a

descobrir esse mundo

maravilhoso da Ciência!!!

... agradeço também ao Renato, que

me ajudou em momentos muito

complicados desse período, seja com

palavras certas na hora certa, com as

corridas, os carinhos, ou apenas com

a companhia! Você é muito especial!

TE AMO ☺

AGRADECIMENTOS EXTRAS

Aos professores da banca, pelo tempo dispensado à leitura deste

trabalho! Tomara que tenha valido a pena!!

À professora Ildinete, que me auxiliou em várias etapas deste

trabalho, e sempre esteve disposta a ajudar! Será que agora você sabe o

que é um “coacervado”??? Te considero minha co-co-orientadora!! Rsrsrs.

Ao professor Márcio Poças pelas dicas da sala de cultura e de

bandshift.

Aos demais professores da BioMol e agregados: Lídia, Élida, Sueli,

Fernando e Cyntia, pelas dicas e matérias super-proveitosas.

Ao professor Bergman e ao pessoal do seu laboratório, por

permitirem o uso do Luminômetro! Sem esse equipamento esse trabalho não

existiria!!! Susane, valeu!!

Ao professor Alan Carvalho, do Cenargen, e a todo o pessoal do seu

laboratório! Sem vocês não teria nada de qPCR neste trabalho, e nem as

Havaianas mais lindas!! Obrigada por me acolherem tão bem!

Ao pessoal do Lab1, que é simplesmente maravilhoso!! Isabella, você é

uma amigona! Aprendi muito com você nesses anos. Barbarela, você já me

agüentou uns cinco anos, vai ter que me engolir mais uns quatro!! Admiro

muito a sua persistência, inteligência e autenticidade... rsrsrs (como diz a

sua mãe). E o que seria dos estágios da licenciatura sem as conversas nas

horas ociosas?? Adoro você, você é uma grande amiga!! Hernandez, vou

sentir saudades, de você, do seu mau-humor, do seu desespero para clonar e

transfectar! Seja muito feliz em São Paulo!! Maryani, você é uma figura!!

Divirto-me muito com nossos almoços! Mariana, obrigada por me ensinar

tudo e mais um pouco sobre a sala de cultura! E só mesmo uma pisciana como

eu pra entender porque somos tão grudentas (não chora não, senão eu choro

também)!!! Victor, você é também uma figuraça!!!! Meu primeiro estagiário!!!

Rsrsrs.

Agradeço também a todos os outros colegas do Lab1 e agragados, que

sempre me ajudaram em tudo: Carol, Rafa, Léo, Thayssa, Kelly, Yuri, Paulo,

Alex (Lab2), Janaína, Fernanda, Mikael, Tiago, Hugo, Thiago, Lorena,

Calliandra... enfim, vou esquecer alguém, mas não foi por mal não, tá?

Obrigada a todos!!!

Obrigada à Izabel pela ajuda nas análises estatísticas, e também

pelos produtos maravilhosos da Avon!!

Aos meninos do seqüenciamento, Marcus e Saulo, obrigada pela

paciência e pela eficiência.

Ao Davi, OBRIGADA por sempre estar disposto a parar tudo que está

fazendo para abrir aquele almoxarifado!! Você vai pro céu!!

À Fátima e Ivanildes, por cuidarem do laboratório, dos nossos

reagentes, materiais e por serem tão legais comigo!!

À Fernanda, por sempre manter o laboratório limpo, apesar de dois

minutos depois todo mundo sujar!

A todo o pessoal da sala de cultura, obrigada por aturarem os meus

momentos de estresse quando a sala estava uma bagunça!

A toda minha família (vós, tios, primos), obrigada por me apoiarem!

À família do Renato, que sempre me acolheu de braços abertos e

sempre me admirou, mesmo sem saber direito o que eu estava fazendo!

Aos meus amigos queridos do Colégio Militar, que me acompanharam

em TODA a minha jornada de futura cientista! Vocês sempre torceram por

mim, e acho que me entenderam nos momentos em que tive que estar

ausente! Obrigada Beatriz, Beliza, Carol, Jaque (minha madrinha ☺), Mairão,

Thamara e Well!!! Vocês moram no meu coração!!!

À Ana e Sandra da Secretaria, obrigada por sempre estarem à nossa

disposição!

E obrigada a todos que porventura eu tenha deixado de mencionar,

mas que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho!

Caminhada

Sei que a minha caminhada tem um destino e uma direção, por isso

devo medir meus passos, prestar atenção no que faço e no que fazem os que

por mim também passam ou pelos quais passo eu... Que eu não me iluda com

o ânimo e o vigor dos primeiros trechos, porque chegará o dia em que os pés

não terão tanta força e se ferirão no caminho e se cansarão mais cedo...

Todavia, quando o cansaço houver, que eu não me desespere e acredite que

ainda terei forças para continuar, principalmente quando houver quem me

auxilie... É oportuno que, em meus sorrisos, eu me lembre de que existem os

que choram para que, assim, meu riso não ofenda a mágoa dos que sofrem:

por outro lado, quando chegar a minha vez de chorar, que eu não me deixe

dominar pela desesperança, mas que eu entenda o sentido do sofrimento, que

me nivela, que me iguala, que torna todos os homens iguais... Que eu não me

considere melhor do que aqueles que ficarão atrás, porque pode vir o dia em

que nada terei mais para minha jornada e aqueles, que ultrapassei na

caminhada, me alcançarão e também poderão fazer como eu fiz e nada de fato

fazer por mim, que ficarei no caminho sem concluí-lo... Quando o dia brilhar,

que eu tenha vontade de ver a noite em que a caminhada será mais fácil e

mais amena; quando for noite, porém e a escuridão tornar mais difícil a

chegada, que eu saiba esperar o dia como aurora, o calor como bênção... Que

eu perceba que a caminhada sozinho pode ser mais rápida, mas muito mais

vazia... Quando eu tiver sede, que encontre a fonte no caminho, e quando eu

me perder, que ache a indicação, a seta, a direção... Que eu não siga os que

desviam, mas que ninguém se desvie seguindo os meus passos... Que a

pressa em chegar não me afaste da alegria de ver as flores simples que estão

a beira da estrada, que eu não perturbe a caminhada de ninguém, que eu

entenda que seguir faz bem, mas que, às vezes, é preciso ter-se a bravura de

voltar atrás e recomeçar e tomar outra direção... Que eu não caminhe sem

rumo, que eu não me perca nas encruzilhadas, mas que eu não tema os que

me assaltam, os que embuçam, mas que eu vá onde devo ir e, se eu cair no

meio do caminho, que fique a lembrança de minha queda para impedir que

outros caiam no mesmo abismo... Que eu chegue, sim, mas, ainda mais

importante, que eu faça chegar quem me perguntar, quem me pedir conselho

e, acima de tudo, me seguir confiando em mim!

(Ponsancini)

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas .........................................................................................................i

Resumo .............................................................................................................................v

Abstract ............................................................................................................................vi

1 – INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1

1.1 – A transcrição em eucariotos ....................................................................................1

1.2 – Elementos estruturais e funcionais na modulação da expressão gênica em

eucariotos ..........................................................................................................................5

1.2.1 – Intron ....................................................................................................................5

1.2.2 – Z-DNA ................................................................................................................13

1.3 – Principais promotores utilizados em vetores para expressão de proteínas

heterólogas em células de mamífero: o promotor de CMV e o intron A .......................17

1.4 – A produção de proteínas recombinantes em células de mamífero ........................20

1.5 – Modelo Experimental ............................................................................................22

2 – OBJETIVOS .............................................................................................................23

3 – MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................25

3.1 – Materiais ................................................................................................................25

3.1.1 – Linhagens bacterianas ........................................................................................25

3.1.2 – Linhagens de células de mamífero .....................................................................25

3.1.3 – Plasmídios utilizados nas clonagens e transfecções ...........................................26

3.1.4 – Meios de Cultura ................................................................................................29

3.1.5 – Soluções .............................................................................................................31

3.1.6 – Antibióticos ........................................................................................................35

3.1.7 – Materiais e soluções para a mensuração da atividade da luciferase ...................37

3.1.8 – Materiais e soluções para a extração de RNA total de CHO-K1 .......................37

3.1.9 – Tampões de Reação ............................................................................................39

3.1.10 – Enzimas ............................................................................................................41

3.1.11 – Marcadores de massa molecular de DNA .......................................................43

3.1.12 – Oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento, clonagens e reações

de PCR ...........................................................................................................................44

3.2 – Métodos .................................................................................................................47

3.2.1 – Preparo e transformação de células competentes de Escherichia coli ...............47

3.2.2 – Preparação de DNA plasmidial ..........................................................................50

3.2.3 – Extração e purificação de DNA de gel de agarose .............................................54

3.2.4 – Digestão de DNA plasmidial com enzimas de restrição ....................................56

3.2.5 – Reação de defosforilação com a enzima SAP (fosfatase alcalina de camarão) ..56

3.2.6 – Reação de polimerização de extremidades de DNA utilizando o fragmento

Klenow da DNA polimerase I ........................................................................................56

3.2.7 – Reação de anelamento de oligonucleotídeos ......................................................56

3.2.8 – Análise de DNA em gel de agarose ....................................................................57

3.2.9 – Ligação de fragmentos de DNA .........................................................................57

3.2.10 – Seqüenciamento de DNA com o kit DYEnamic ET DYe Terminator Cycle

Sequencing kit for MegaBACE .......................................................................................57

3.2.11 – Precipitação de DNA utilizando glicogênio como carreador ...........................58

3.2.12 – Cultura de células .............................................................................................58

3.2.13 – Ensaio de atividade da luciferase utilizando o Kit Dual Luciferase Assay

System .............................................................................................................................63

3.2.14 – Análise estatística dos valores de atividade da luciferase ................................64

3.2.15 – Extração de RNA total de células de mamífero (CHO-K1) com o reagente

Trizol ..............................................................................................................................65

3.2.16 – Tratamento do RNA total extraído de CHO-K1 com DNase RNase free .......66

3.2.17 – Síntese do DNA complementar (cDNA) por meio de transcrição reversa (RT)

com a enzima transcriptase reversa Superscript III ........................................................66

3.2.18 – Reação de qPCR (PCR quantitativa) utilizando os cDNAs preparados a partir

de amostras de RNA de CHO-K1 tratadas com DNase I RNase free ............................67

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................................70

4.1 – Clonagem dos elementos gênicos ..........................................................................70

4.1.1 – Clonagem do promotor de CMV sem intron (pGLCMVI-) ...............................71

4.1.2 – Clonagem do promotor de CMV com intron A (pGLCMV) ..............................72

4.1.3 – Construção de versões deletadas do intron A .....................................................74

4.1.4 – Introdução de seqüências indutoras de Z-DNA no vetor pGLCMV ..................75

4.1.5 – Construção do vetor pMACIA scFvZ22 NLS ....................................................77

4.2 – Determinação dos níveis de expressão gênica das diferentes construções em

células de mamífero ........................................................................................................86

4.2.1 – O cultivo de diversas linhagens de células de mamífero ....................................86

4.2.2 – Transfecção Transiente .......................................................................................86

4.2.2.1 – Efeito do intron A inteiro na atividade da luciferase nas linhagens celulares

CHO-K1, CÓS-7, HepG2 e HEK-293 ............................................................................87

4.2.2.2 – Efeito das deleções do intron A na atividade da luciferase nas linhagens

celulares CHO-K1, CÓS-7, HepG2 e HEK-293 ............................................................90

4.2.2.2.1 – Efeito do intron A inteiro e deletado na expressão do mRNA da luciferase de

vaga – lume .....................................................................................................................95

4.2.2.2.2 – Análise do splicing do intron A nas construções com intron A inteiro e

deletado .........................................................................................................................106

4.2.2.3 – Efeito da remoção da região 5’do promotor/enhancer de CMV....................109

4.2.2.4 – Efeito dos oligonucleotídeos indutores de Z-DNA na atividade da luciferase

em células CHO-K1 ......................................................................................................111

4.2.3 – Transfecção Estável ..........................................................................................112

5 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS .....................................................................115

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................119

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Localização dos componentes básicos de um promotor eucariótico.................2

Figura 2. Ligação funcional entre o splicing, o transporte do mRNA núcleo-

citoplasmático e o NMD, com a participação das proteínas do EJC ..............................11

Figura 3. Três principais conformações assumidas pelo Z-DNA ...................................14

Figura 4. Conformação espacial das bases nitrogenadas no DNA .................................15

Figura 5. Conformação adotada pela fita de DNA quando há a movimentação do aparato

transcricional ..................................................................................................................16

Figura 6. Esquema do promotor completo de CMV ......................................................19

Figura 7. Mapas dos vetores utilizados para as clonagens do promotor com e sem intron

A .....................................................................................................................................27

Figura 8. Mapa do vetor pGL4.73 (Promega) ................................................................27

Figura 9. Mapas dos vetores pMACIA e pIg16, utilizados para a construção do

pMACIA scFvZ22 NLS .................................................................................................28

Figura 10. Clonagem do promotor de CMV sem intron, resultando no vetor

pGLCMVI- .....................................................................................................................71

Figura 11. Clonagem do promotor de CMV com intron A, resultando no vetor

pGLCMV ........................................................................................................................73

Figura 12. Deleções realizadas no intron A de CMV .....................................................74

Figura 13. Anelamento dos oligonucleotídeos Z1, Z3 e Z5 e clonagem no vetor

pGLCMV ........................................................................................................................75

Figura 14. Alinhamento da seqüência dos vetores pGLCMVZ5 (painel A) e

pGLCMVZ3 (painel B) ..................................................................................................77

Figura 15. Obtenção do fragmento scFvZ22 NLS – 1ª etapa .........................................79

Figura 16. Obtenção do fragmento scFvZ22 NLS – 2ª etapa .........................................81

Figura 17. Seqüência do scFvZ22 NLS ..........................................................................83

Figura 18. Clonagem do fragmento scFvZ22 NLS no vetor pMACIA ..........................85

Figura 19. Efeito do intron A inteiro na atividade da luciferase em CHO-K1 (painel A),

COS-7 (painel B), HepG2 (painel C) e HEK-293 (painel D) .........................................88

Figura 20. Efeito das deleções do intron A na atividade da luciferase em CHO-K1

(painel A), HepG2 (painel B), COS-7 (painel C), e HEK-293 (painel D) .....................91

Figura 21. Curvas de amplificação das amostras com os iniciadores para os genes de

GAPDH de hamster (painel A), da luciferase de Renilla (painel B) e para a luciferase de

vaga-lume (painel C) ......................................................................................................97

Figura 22. Curvas de dissociação dos iniciadores dos genes de GAPDH (painel A),

luciferase de Renilla e vaga-lume (painel B) .................................................................99

Figura 23. Validação da reação de RT-qPCR para a quantificação relativa da expressão

gênica da luciferase de vaga-lume ................................................................................100

Figura 24. Ensaio de RT-qPCR utilizando o normalizador GAPDH ...........................101

Figura 25. Ensaio de RT-qPCR utilizando o normalizador luciferase de Renilla ........102

Figura 26. Análise do splicing nas construções contendo o intron A deletado ............108

Figura 27. Efeito da deleção da região 5’ do promotor/enhancer de CMV na atividade

da luciferase em CHO-K1 (painel A) e COS-7 (painel B) ...........................................110

Figura 28. Efeito dos oligonucleotídeos Z1, Z3 e Z5 na atividade da luciferase 24 e 48

horas pós-transfecção em CHO-K1 ..............................................................................111

Figura 29. Efeito do anticorpo anti-Z-DNA na forma scFv Z22 com sinal de localização

nuclear (NLS) em clones estáveis de Z3 e Z5 (CHO-K1) ............................................113

Figura 30. Mecanismos que ocasionarão aumentos na expressão de um determinado

gene de interesse quando os elementos são colocados em um mesmo vetor para

expressão heteróloga .....................................................................................................118

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Relação das proteínas terapêuticas produzidas em CHO-K1 .........................20

Tabela 2. Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados nas diversas etapas deste

trabalho ...........................................................................................................................44

Tabela 3. Valores médios de Ct das amostras amplificadas com os iniciadores para

GAPDH e luciferase de Renilla ....................................................................................104

LISTA DE ABRAVIATURAS

ATP – nucleotídeo trifosfato de adenosina

BSA – albumina bovina sérica

ºC – grau Celsius

cDNA – DNA complementar

CMV – citomegalovírus

DEPC – dietil pirocarbonato

DNA – ácido desoxirrobonucléico

dNTPs – mistura dos desoxirribonucleotídeos trifosfatados adenosina, citidina,

guanosina e timidina.

dsDNA – DNA de fita dupla

DTT – ditiotreitol

EDTA – ácido etilenodiaminoacético

EGTA – ácido tetraacético etileno glicol (mais afinidade por cálcio do que por íons de

magnésio)

F – Faraday

g – força gravitacional

g – grama

IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo

kb – quilobases

L – litro

m – metro

M – molar

mA – miliamperes

mg - miligrama

mL – mililitro

mM - milimolar

mRNA – RNA mensageiro

OD – densidade óptica

PEG – polietileno glicol

pb – pares de base

PBS – tampão fosfato

PCR – reação de polimerase em cadeia (do inglês Polymerase Chain Reaction)

pH – potencial hidrogeniônico

p/v – razão peso/volume

qPCR – PCR quantitativa

RNA – ácido ribonucléico

RT – PCR – transcrição reversa seguida de PCR

RT – qPCR – transcrição reversa seguida de PCR quantitativa

scFv – fragmento variável de cadeia única

SFB – soro fetal bovino

TE – tampão Tris/EDTA

Tris – tri(hidroximetil)aminometano

U – inidades de reação da enzima

V – volts

v – volume

v/v – razão volume/volume

X-gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

Z-DNA – DNA na conformação Z

ηg - nanograma

ηmol - nanomol

ρmol - picomol

τ – tempo de passagem da corrente elétrica

Ω – unidade de medida da resistência elétrica (ohm)

1X – concentração para uso normal

5X – cinco vezes concentrado

10X – dez vezes concentrado

50X – cinqüenta vezes concentrado

RESUMO

Foram construídos plasmídios com o promotor de CMV sem intron

(pGLCMVI), com intron A (IA) completo (pGLCMV) e deletado em 200

(pGLCMV∆200), 400 (pGLCMV∆400) e 600 pb (pGLCMV∆600), dirigindo a

expressão do gene repórter da luciferase, além de diferentes seqüências indutoras de Z-

DNA localizadas a montante do promotor. Estas construções foram transfectadas de

forma transiente em células CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293. O IA aumentou em

100 a 1.000 vezes a atividade da luciferase em relação à construção sem intron,

dependendo da linhagem celular testada. Dentre as versões deletadas do intron, a

construção pGLCMV∆200 foi a mais eficiente, aumentando de 3 a 6 vezes a atividade

da luciferase, seguida da construção pGLCMV∆600, cuja atividade melhorou em até 4

vezes, comparado com o IA selvagem. Entretanto, a remoção de 400 pb do IA resultou

na redução da expressão gênica a níveis quase comparados aos da construção sem IA.

Tomados em conjunto, esses dados sugerem a existência de uma região de ligação a um

fator transcricional de inibição no fragmento de 200 pb. Os dados da atividade da

luciferase foram corroborados com experimentos de RT-qPCR, que relacionaram o

aumento da atividade da enzima com o aumento da expressão do gene nas diferentes

construções testadas. O splicing nas construções com IA deletado foi estudado por RT-

PCR, mostrando que há evidências de que não há processamento correto dos exons 1 e

2 de CMV quando o sítio aceptor é removido. Foi estudado o efeito da remoção da

região 5’ do promotor de CMV em CHO-K1 e COS-7, que resultou em uma redução de

50% da atividade da luciferase. Dentre os vetores contendo as seqüências indutoras de

Z-DNA que também foram transfectados de forma transiente em CHO-K1, apenas

naquele em que foi clonada a seqüência Z3 observou-se um aumento de 50% na

atividade da luciferase comparado com a seqüência-controle Z5. Foram desenvolvidos

clones estáveis de CHO-K1 com esta construção a fim de verificar o potencial de

formação de Z-DNA desta seqüência na região adjacente ao promotor. Nestes clones

estáveis, transfectou-se de forma transiente o plasmídeo pMACIA scFvZ22 NLS, um

fragmento de anticorpo anti-Z-DNA. A atividade da enzima aumentou em 3 vezes

quando este elemento em trans foi adicionado ao sistema de expressão, indicando que

esta seqüência realmente forma Z-DNA e que a modulação da expressão gênica ocorre

em níveis transcricionais. Portanto, neste trabalho foi mostrado que o IA e suas deleções

inovadoras, bem como seqüências indutoras de Z-DNA, podem melhorar a expressão

gênica, sendo ferramentas importantes para a otimização da expressão de proteínas de

interesse comercial em células de mamífero.

ABSTRACT

It had been constructed plasmids with the promoter of CMV and the luciferase

reporter gene comprising the following features: without the CMV intron A (IA)

(pGLCMV I-), with the full IA (pGLCMV) or the deleted versions of it

(pGLCMV∆200, pGLCMV∆400 and pGLCMV∆600), and Z-DNA inducer sequences

upstream the promoter. These constructions had been transiently transfected in CHO-

K1, COS-7, HepG2 and HEK-293 cells. The whole intron A resulted in a 100 to 1000-

fold increase in the activity of luciferase compared to the intronless version, depending

on the cell line tested. The pGLCMV∆200 construction had also enhanced in 3 to 6-fold

the luciferase activity compared to the wild-type IA. Following the results obtained with

the construction above, the IA deleted in 600 pb had improved the luciferase activity no

more than 4 times, depending on the cell line used. The pGLCMV∆400 construction,

instead, resulted in a reduction of gene expression to levels similar to the intronless

construction. Taken together, these data suggest that there are a binding region for an

inhibitory transcription factor comprising the 200 pb fragment. The data of the activity

of luciferase had been corroborated with experiments of RT-qPCR, which had

correlated the increases of luciferase activity for the different constructions above with

the increase of the expression of the gene of luciferase. To verify the effect of splicing

in the constructions with the deleted IA, a RT-PCR experiment was carried through

showing that the removal of the donor splicing site might have a relation with the

incorrect processing of exons 1 and 2 of the CMV IE gene. Amongst the Z-DNA-

inducer sequences cloned upstream the CMV promoter, the Z3 sequence resulted in a 2-

fold increase of the transient luciferase activity when compared to the control-sequence

Z5. As a result, it had been developed stable clones of CHO-K1 cells with this sequence

in order to verify if the sequence in question exerts its activity by means of the

formation of Z-DNA in the adjacent region to the promoter. In these stable clones, it

had been transiently transfected the pMACIA scFvZ22NLS plasmid, that codes for an

antibody fragment anti-Z-DNA. The values of the luciferase activity had increased 3

times when this element in trans it was added to the expression system, indicating that

this sequence really forms Z-DNA and that the effect observed occurs in transcriptional

levels. Therefore, in this work it was shown that the intron A and its innovative

deletions, as well as Z-DNA-inductive sequences, can improve the gene expression,

being important tools for the optimization of clinical relevant protein expression in

mammalian cells.

1. Introdução

1.1) A transcrição em eucariotos

Em 1998, Ruvkin e Robert mapearam aproximadamente 20000 genes no verme

nematóide Caenorhabditis elegans. Pouco depois, em 2000, Adams e colaboradores

identificaram em torno de 14000 genes em Drosophila melanogaster. Esses dados, quando

comparados com os apresentados pelo genoma humano, com aproximadamente 30000

genes (Baltimore, D. 2001; Lander et al, 2001), indicam que a complexidade dos

organismos existentes no planeta não pode se relacionar com o número de genes que eles

possuem. Portanto, o que determina a variabilidade das espécies e a complexidade das

mesmas é a regulação diferencial de seus genes, ou seja, os diferentes processos que

ocorrem para proporcionar maior flexibilidade ao genoma. Além disso, outros fatores

podem estar relacionados a esta complexidade genêmica, como a presença de RNAs não

codificadores e do splicing alternativo. Desse modo, quando maior a complexidade do

organismo em questão, maior será a variedade de mecanismos de regulação existentes.

Com isso, para que se entenda a complexidade do sistema transcricional eucariótico é

necessário o estudo dos promotores eucarióticos, bem como o processo transcricional em

si.

* Estrutura dos promotores eucarióticos

Em procariotos, o promotor possui regiões bem definidas e conservadas para a

ligação da RNA polimerase, denominadas regiões -10 e -35 (Harley e Reynolds, 1987).

São nestes sítios, antes do início da fase de leitura aberta (ORF), que a enzima se ancora

para iniciar o processo transcricional. Para maior especificidade de seleção do promotor, a

enzima ainda se liga a uma proteína denominada fator sigma (σ). Ela possui vários

subtipos, que são recrutados pela RNA polimerase II dependendo do gene a ser transcrito.

Desse modo, de acordo com o tipo de condição ambiental a qual o organismo é submetido,

é acionado um determinado tipo de fator σ para ativar a transcrição de genes necessários

para a resposta do organismo ao ambiente.

Entretanto, no caso de organismos eucarióticos, o conceito de promotor é mais

complexo, visto que as regiões de ligação da RNA polimerase II e outros fatores

necessários para o reconhecimento do DNA a ser transcrito não são tão bem definidos

quanto em procariotos. Além disso, em organismos multicelulares, a regulação da

expressão gênica temporal, espacial e tecido-específica são também fatores que dificultam

a caracterização minuciosa dos promotores eucarióticos. Entretanto, apesar de sua

complexidade, pode-se identificar nestes promotores algumas regiões importantes para o

processo transcricional, dentre elas o TATA box, o Iniciador (Inr), o Elemento promotor a

jusante (DPE – do inglês downstream promoter element), e o Elemento de reconhecimento

a TFIIB (BRE) (Smale e Kadonaga, 2003). A localização destes elementos no promotor

pode ser visualizada no esquema da figura 1. É importante ressaltar que alguns desses

elementos podem não estar presentes em todos os promotores eucarióticos conhecidos, o

que é mais uma evidência da variedade de mecanismos e elementos que geram a

complexidade desse sistema.

Figura 1. Localização dos componentes básicos de um promotor eucariótico. Esse

esquema mostra alguns dos elementos que podem contribuir para a transcrição basal a partir

do promotor. Acima dos retângulos coloridos são mostradas as possíveis regiões de ocorrência

dessas seqüências dentro do promotor. Esquema adaptado de Smale e Kadonaga (2003).

- TATA box

Esse elemento foi o primeiro motivo de promotores eucarióticos a ser caracterizado

(Goldberg, 1979), apresentando a seqüência consenso “TATAAA”. Entretanto, outras

seqüências podem funcionar in vivo (testes realizados com leveduras) como o consenso,

inclusive aquelas contendo repetições de bases C e G (Singer et al, 1990). O primeiro

passo para a formação do complexo de iniciação da transcrição em promotores que

contêm este elemento é a ligação do fator acessório TFIID a uma região próxima ao

TATA box. Este fator transcricional essencial para o mecanismo de início da transcrição

em promotores que contêm o TATA box é uma associação de uma proteína denominada

proteína ligante a TATA (TBP, do inglês TATA binding protein) com uma proteína

denominada TAF

IID

. As proteínas TAF (do inglês TBP associated factors) são fatores que

se ligam à TBP para o posterior reconhecimento do elemento TATA. Em outras palavras,

TFIID é um complexo de proteínas associadas que se ligam ao TATA box, mediando o

recrutamento dos demais fatores transcricionais necessários para a continuidade do

processo da transcrição (Lewin, 2001).

BRE

TATA

box

Inr

DPE

-37 a -32 -31 a -26 -2 a +4 +28 a +32

Uma característica interessante de TBP é que esta proteína se liga ao DNA de uma

forma diferenciada, posicionando-se sobre a cavidade menor da fita e curvando DNA em

torno de 80º. Essas modificações estruturais na molécula de DNA favorecem uma

associação mais íntima dos fatores transcricionais com o promotor (melhoram a

acessibilidade ao promotor), potencializando a atividade transcricional (Lewin, 2001).

Outra característica desta proteína é a sua incompatibilidade com a presença de

nucleossomos, visto que a formação destes ocorre em regiões ricas em A e T com as

cavidades voltadas para a parte interna. Desse modo, pode-se explicar porque a presença

de nucleossomos impede o início da transcrição gênica (Lewin, 2001).

- Iniciador (Inr)

A região do promotor denominada Inr engloba o sítio de iniciação da transcrição,

sendo que este elemento está presente em diversos eucariotos (Butler e Kadonaga, 2002).

O iniciador é encontrado tanto em promotores com TATA box como naqueles sem esta

seqüência, indicando ser uma região importante para o processo transcricional. A

seqüência consenso deste elemento em células de mamífero é: “Pyr-Pyr(C)-A

(geralmente o início da transcrição)-N-T/A-Pyr-Pyr” (Corden et al, 1980; Bucher, 1990;

Javahery et al, 1994). Há evidências que o fator de transcrição basal TFIID se liga a Inr de

uma forma seqüência-específica (Kaufmann e Smale, 1994), além de outros fatores como

TFII-I (Roy et al, 1991; Cheriyath et al, 1998) e YY1 (Weis e Reinberg, 1997). Desse

modo, a interação seqüência-específica destas proteínas com o elemento Inr de promotores

eucarióticos leva a crer que elas participam ativamente do processo transcricional.

- DPE

Este elemento foi inicialmente identificado em Drosophila por Burke e Kadonaga

(1996), sendo um sítio de ligação para o fator de transcrição basal TFIID. Este se liga

cooperativamente a motivos DPE e também Inr, sendo que a mutação em algum dos sítios

resulta em uma diminuição significativa da transcrição. Este motivo é encontrado

principalmente em promotores sem o elemento TATA box. Além dos estudos avançados

da importância desta seqüência em promotores de Drosophila, ela também foi identificada

em humanos (Burke e Kadonaga, 1997; Zhou e Chiang, 2001). Estima-se que a seqüência

consenso de DPE seja “A/G

+28

-G-A/T-C/T-G/A/C” (Kutach e Kadonaga, 2000).

Entretanto, apesar de um pouco degenerada, a localização dela (entre a região +28 e +32,

logo após Inr) é fundamental para a sua funcionalidade. Isso porque, como há uma ligação

de TFIID tanto a Inr quanto a DPE, essa distância entre esses elementos deve ser

invariável, possibilitando a interação entre esses dois motivos (Burke e Kadonaga, 1997;

Kutach e Kadonaga, 2000).

- BRE

Este elemento é um sítio de ligação ao fator TFIIB, localizado imediatamente a

montante do TATA box (Langrange et al, 1998). Sua seqüência consenso é G/C-G/C-

G/A-C-G-C-C, sendo que logo após o último nucleotídeo do BRE já se observa o TATA

box. Para a identificação deste sítio, foram realizados experimentos de transcrição in vitro

contendo diversos fatores de transcrição purificados. O resultado dessas análises revelou

que a seqüência BRE facilita a incorporação de TFIIB aos complexos de iniciação da

transcrição que são produtivos (Langrange et al, 1998). Com isso, além do TFIID, outro

fator de transcrição basal possui a característica de ser seqüência-específico, o que

favorece a regulação do processo da transcrição em eucariotos.

* Engenharia de promotores para melhoramento da atividade transcricional em

eucariotos

Como pôde ser acima observado, os promotores eucarióticos são ao mesmo tempo

complexos e bem estruturados no que se refere à sua regulação e atividade. Entretanto, há

ainda outros estudos que buscam o melhoramento da atividade dos diversos promotores

conhecidos por meio da adição ou remoção de elementos ou motivos no promotor, ou seja,

por meio da engenharia de promotores.

A adição de elementos em cis em promotores como o de Citomegalovírus (CMV) e

o de SV 40 (do inglês Simian Virus) foi uma técnica de melhoramento de promotores

realizada por Ogawa e colaboradores, em 2007. Em suas construções, foram utilizados

diversos oligonucleotídeos cuja seqüência correspondia a um sítio de ligação a fatores

transcricionais (neste trabalho foram utilizadas seqüências de AP-1, CArG, NF-κB e NF-

Y). Estas seqüências foram clonadas aleatoriamente nas regiões adjacentes aos promotores

estudados, resultando em diversas construções de plasmídios com promotores quiméricos

que foram testados em diversas linhagens de células de mamíferos.

Esta técnica de adição de elementos em cis de forma randômica também foi

realizada em procariotos (Cox III et al, 2007). Neste trabalho, construiu-se uma biblioteca

de promotores para Escherichia coli para a análise das melhores construções que

expressavam o gene Lux.

Outros elementos em cis que podem ser adicionados nas regiões próximas a

promotores para a modulação da expressão gênica em eucariotos são os introns e

seqüências indutoras de Z-DNA. Estes elementos serão mais bem detalhados nos tópicos a

seguir.

1.2) Elementos estruturais e funcionais na modulação da expressão gênica em

eucariotos

1.2.1) Intron

Desde 1978, quando se definiu o conceito de intron por Walter Gilbert, o

surgimento de questões que buscavam o entendimento da função biológica dos introns foi

o primeiro passo para que se relacionassem estes elementos em cis com a transcrição

gênica. Nesta época, postulou-se que introns eram seqüências genômicas presentes em

eucariotos e que eram removidas do correspondente transcrito de RNA por meio de um

processo denominado splicing. Mais tarde, verificou-se que este evento é mediado por um

complexo composto por ribonucloproteínas e pequenos RNAs (snRNAs, do inglês small

RNAs), conhecido como spliceossomo. Este complexo é responsável por cortar as junções

intron-exon, remover os introns, e por fim unir as extremidades dos exons, que são as

regiões do genoma que codificam para uma proteína, formando um RNA mensageiro

(mRNA) maduro. Vale ressaltar que, de acordo com o pensamento desta época, as

seqüências intrônicas eram imediatamente degradadas sem que realizassem qualquer outra

função celular, sendo consideradas apenas um apêndice evolutivo.

Logo após os estudos iniciais dos introns e do evento do splicing, em 1979, Gruss e

colaboradores lançaram a idéia de que os introns teriam uma importância fundamental

para a biogênese dos mRNAs e para o processo transcricional. Consequentemente, a partir

da quebra do paradigma de que as seqüências intrônicas eram um material sem função na

célula, diversos trabalhos corroboraram esta idéia lançada no final da década de 70,

indicando que a adição de introns em seqüências gênicas recombinantes era capaz de

aumentar o nível do produto protéico esperado.

O grau de abrangência do efeito de otimização da expressão gênica abrange

diversas classes de eucariotos. Em 1988, Buchman e Berg mostraram o aumento da

expressão do gene da β-globina com íntron em células de mamífero em cultura, além de

estudarem o efeito deletério da remoção dos introns do gene DYN2 de Saccharomyces

cerevisae. Chang e colaboradores (2006) melhoraram a expressão do Fator IX humano

(FIX) plasmático com a inserção de um íntron entre o primeiro e o segundo exon do FIX.

Estudos da função dos introns também foram realizados em plantas. Boudon e

colaboradores (2001) verificaram o efeito da inserção do intron de um gene específico de

milho na expressão do gene repórter da luciferase. Por fim, Hasania e colaboradores

(2006) verificaram o aumento da expressão do gene recombinante da α-1 antitripsina

humana em Pichia pastoris, indicando que o efeito dos introns também pode ser observado

em leveduras. Desse modo, a inserção de íntrons nas construções gênicas parece ser de

grande relevância para a otimização da produção de proteínas recombinantes em culturas

de células.

A partir daí, percebeu-se que o splicing não era um evento estático,

correlacionando-se com a seqüência de DNA associada e com outros processos do

metabolismo do RNA, como a poliadenilação do pré-mRNA e seu transporte pelo núcleo,

a tradução e o decaimento. Em outras palavras, muitas proteínas que compõem a

maquinaria de um determinado processo podem também fazer parte de outros, sendo que o

efeito final desta interação é o aumento da produção de uma proteína recombinante (Le

Hir et al, 2003). Porém, como o splicing pode aumentar as taxas de transcrição de um

gene recombinante?

*Efeito dos introns em nível de DNA

O efeito dos introns na otimização da expressão gênica pode ser verificado

primeiramente no nível do DNA, podendo funcionar como seqüências às quais diversos

elementos reguladores da transcrição se ligam. Os introns podem controlar a

acessibilidade ao DNA por meio da modulação da posição dos nucleossomos. Sleckman e

colaboradores, em 1996, verificaram que os enhancers intrônicos de imunoglobulinas

continham regiões de ligação a fatores regulatórios da transcrição importantes. Estes sítios

localizavam-se na região a montante do primeiro exon da cadeia constante. Com o

rearranjo V(D)J que permitia a variabilidade dos anticorpos existentes, esses sítios eram

trazidos mais próximos do promotor, permitindo a regulação da transcrição por tais

elementos.

Sabe-se também que os introns podem modificar o nível de remodelamento da

cromatina, fazendo com que o DNA esteja mais acessível para a ligação da RNA

polimerase II e dos fatores de transcrição associados, consequentemente aumentando o

nível de transcrição do gene estudado. Corroborando tal hipótese, foi constatado que, tanto

in vitro quanto em camundongos transgênicos, os introns do gene do hormônio de

crescimento de ratos promovem um remodelamento da cromatina, permitindo um aumento

de até quinze vezes da produção da proteína comparando-se com a versão sem intron (Liu

et al, 1995). Este remodelamento da cromatina se refere ao posicionamento ordenado

destas estruturas na molécula de DNA, visto que as versões sem intron das construções

analisadas possuíam os nucleossomos com espaçamentos irregulares ou então altamente

empacotados, o que impede o acesso da RNA polimerase ao promotore para que ocorra a

transcrição do gene. O remodelamento da cromatina devido à utilização de introns em

construções gênicas recombinantes também foi verificado por Lauderdale e Stein, em

1992. Os autores utilizaram introns do gene da ovoalbumina de galinha e estudaram seus

efeitos apenas in vitro. Curiosamente, a versão sem introns deste gene (o cDNA) não foi

capaz de induzir o alinhamento da cromatina, indicando realmente que o efeito positivo

dos introns nesta construção se devia à acessibilidade do DNA.

Sabe-se também que, depois de transcritos, os sinais de splicing de introns podem

melhorar a atividade e processividade da RNA polimerase II. Estudos demonstraram que

um dos principais componentes do spliceossomo, o snRNA U1, interage com o fator de

transcrição geral TFIIH no estágio inicial da transcrição, estimulando a taxa de formação

da primeira ligação fosfodiéster pela RNA polimerase II (Kwek et al, 2002). A interação

entre TFIIH com U1 foi verificada com experimentos in vitro, incubando-se diversos

fatores de transcrição com RNAs randômicos. Após a ligação destes RNAs aos fatores

transcricionais utilizando T4 RNA ligase e fósforo marcado radioativamente, foi

identificado um produto de aproximadamente 160 pb ligado ao fator TFIID, o snRNA U1.

Com isso, há grandes indícios de que o snRNA U1 funcione como um regulador da

transcrição por meio da RNA polimerase II, além do seu papel no processamento do RNA.

A determinação da posição do intron também é importante para que a sua função

de potencializador da expressão gênica seja alcançada. Um estudo indicou que a posição

do sítio de splicing 5’ em relação ao promotor é proporcional à transcrição gênica, sendo

que quanto maior a distância entre eles, menor é taxa de transcrição (Furger et al, 2002).

Neste caso, foram clonados espaçadores entre o promotor de CMV e o primeiro intron de

uma construção de um minigene de HIV, sendo que esse procedimento reduziu

significativamente a produção do mRNA. Ainda neste trabalho avaliou-se o efeito da

redução de dois introns do gene DYN2 de Saccharomyces cerevisae. A remoção do intron

próximo ao promotor, bem como a do intron mais distal, tiveram efeitos de redução da

produção do transcrito. Entretanto, essa redução foi maior quando se removeu o intron

próximo ao promotor. O efeito de diminuição dos níveis de mRNA na construção sem o

intron distal pode ser explicado pela menor estabilidade do mRNA devido a menor taxa de

poliadenilação do transcrito (Furger et al, 2002). Quanto à levedura S. cerevisae, sabe-se

que é um eucarioto bastante simples que possui apenas 3,8% dos seus genes com introns,

sendo que a maioria destes se localiza próximo a promotores (Spingola et al, 1999). É

possível então deduzir que a posição do intron pode afetar a intensidade de produção de

um transcrito. Outro trabalho que também analisou a questão do efeito do posicionamento

dos introns nos níveis de transcrição foi o de Nott e colaboradores (2003). Eles testaram a

atividade do intron da triose-fostato isomerase humana no sistema de expressão do gene

repórter da luciferase. Verificou-se que quando aquele era colocado mais distante do

promotor, a atividade era menor do que a apresentada pela construção onde o intron foi

colocado mais próximo ao promotor. Mesmo assim, apenas a construção com o intron

distal foi capaz de aumentar a atividade do gene repórter.

Entretanto, ainda não é possível afirmar que há um padrão para o posicionamento

dos introns e o seu efeito na transcrição gênica, visto que os mecanismos que estão

envolvidos neste processo são muito complexos. Com isso, há apenas indícios que

mostram que a atividade potencializadora dos introns é melhor quando estes são

posicionados próximos ao promotor de estudo.

Sobre a interação do splicing com os estágios da iniciação da transcrição, Zorio e

Bentley (2004) revisaram o papel do domínio C-terminal da RNA polimerase II (CTD).

Os autores descrevem que a deleção deste domínio CTD inibe os três principais passos do

processamento do pré-mRNA: a adição do cap, o splicing e a poliadenilação. Desse modo,

eventos considerados tardios no metabolismo do RNA estão relacionados com a iniciação

da transcição, por meio da interação de suas maquinarias com a região CTD, um

componente-chave para o processo transcricional em eucariotos.

*Interação do splicing

splicing splicing

splicing com eventos de processamento de pré- mRNAs – efeito dos

introns

Os dois principais processos de maturação do mRNA de eucariotos antes de sua

tradução, além do splicing, são a adição da 7-metil-guanosina (CAP) na região 5’ do

mRNA, e a clivagem e poliadenilação de sua região 3’. Sabe-se que o primeiro processo

ocorre no início do processamento do mRNA, não sendo então dependente do splicing ou

proteínas componentes do spiceossomo.

Entretanto, a formação da região 3’ do mRNA maduro é um evento dependente do

splicing, sendo que proteínas pertencentes ao spliceossomo e ao complexo de

poliadenilação interagem entre si e participam dos dois processos. Isso foi demonstrado

com experimentos de co-imunoprecipitação e western blotting que indicaram que snRNP

U1 se ligava diretamente com a subunidade de uma proteína que participava da clivagem e

poliadenilação do RNA (Lutz et al, 1996). Estes experimentos in vitro indicam que a

presença dos introns em uma construção gênica pode ser importante também para a

completa formação e estabilidade do mRNA (por meio da poliadenilação), visto que os

processos de maturação de mRNA (splicing e poliadenilação) estão interligados.

*Efeito dos introns nos processos tardios do metabolismo do mRNA (transporte e

nonsense-mediated decay - NMD)

Após o processamento, os mRNAs são transportados através do Complexo do Poro

Nuclear (Nuclear Pore Complex - NPC) para o citoplasma, onde serão traduzidos. O NPC

é constituído por proteínas que, em conjunto, atuam interagindo com outras proteínas do

spliceossomo, do complexo de poliadenilação e do complexo de ligação a CAP (CAP-

binding complex - CBP). Se um mRNA está pronto para ser transportado para o

citoplasma, ou seja, sofreu todas as etapas de processamento corretamente, este evento

ocorrerá normalmente. O mecanismo pelo qual os introns aperfeiçoam a exportação de

mRNAs maduros para o citoplasma é o recrutamento de fatores específicos de transporte

ligando-se aos RNAs processados, sendo que estes fatores fazem parte do Complexo da

Junção Exon-Exon (Exon Junction Complex - EJC).

O EJC consiste em quatro proteínas principais denominadas eIF4A3 (Chan et al,

2004), Y14 (Kataoka et al, 2000), Magoh (Le Hir et al, 2001a) e MLN51 (Degot et al,

2004), além de outras proteínas auxiliares, como Aly/REF (Le Hir et al, 2000), RNPS1

(Mayeda et al, 1999), SRm160 (Blencowe et al, 1998), e hUpf3 (Le Hir et al, 2001b). O

complexo EJC se deposita a -20 nucleotídeos das junções exon-exon, sendo que, após o

transporte através dos poros nucleares, o complexo REF rapidamente se dissocia,

enquanto Y14 permanece ligado ao mRNA no citoplasma. Entretanto, segundo Gatfield e

Izaurralde (2002), apesar do splicing aumentar o transporte de mRNAs, do núcleo para o

citoplasma, de genes contendo introns, algumas proteínas responsáveis pelo transporte do

transcrito, como Aly/REF, interagem com o RNA independentemente do splicing. Os

autores verificaram essa afirmação em Drosophila.

Se o mRNA não for corretamente processado, ele poderá ser retido no núcleo.

Neste último caso, Legrain e Rosbach (1989) demonstraram que alguns fatores de splicing

agem de modo a impedir o transporte de transcritos que ainda não tenham sido

processados. Foi observado que fatores de splicing como U1 snRNA, RNA 6 e RNA 9

interagem in vivo com a junção de splicing 5’, fazendo com que este pré-mRNA siga o

caminho do splicing, e não seja portanto transportado sem ser processado. Este mecanismo

impede que porventura mRNAs mal-formados possam ser traduzidos, produzindo-se

proteínas aberrantes na célula. Em outro modelo de estudo, os retrovírus como o HIV, a

produção da proteína rev é necessária para o transporte do mRNA do gene env

(Hammarskjold et al, 1989). Isso foi demonstrado por meio da deleção do gene que

expressava rev de um vetor que também co-expressava env. Observou-se que os níveis de

mRNA de env caíram bastante quando a proteína rev parou de ser expressa, mas que

paralelamente, a quantidade de RNA total de env não foi alterada, indicando que havia um

acúmulo de RNA no núcleo da célula hospedeira que não foi processado e transportado

(Hammarskjold et al, 1989). Desse modo, fatores in trans do próprio vírus regulam o

transporte do RNA processado, não-processado e parcialmente processado. Ainda neste

trabalho, foi descoberto um elemento em cis da região codificadora do envelope que

regula o transporte do transcrito de env (Hammarskjold et al, 1989).

No caso de genes naturalmente sem introns, o mRNA correspondente é

transportado normalmente também com o auxílio das proteínas do complexo EJC. Porém,

diferentemente do processo que ocorre nos genes com introns, as proteínas do complexo

interagem com proteínas do CBP, e não do spliceossomo (Nojima et al, 2007).

Por fim, um importante mecanismo de qualidade do RNA, denominado non sense

mediate decay (NMD), também pode ser influenciado pela presença de introns no gene

recombinante. O NMD é um mecanismo presente no citoplasma de células eucarióticas

pelo qual mRNAs com códons de terminação prematuros são degradados. O NMD evita a

tradução destes mRNAs aberrantes, o que pode gerar proteínas truncadas danosas para a

célula (Le Hir et al, 2003). Em genes de mamíferos, considera-se um códon de terminação

prematuro quando este se localiza a mais de 50 nucleotídeos a montante de uma junção

exon-exon. O depósito de uma série de proteínas do Complexo Exon-Junction (EJC) e do

spliceossomo nas junções exon-exon cria “marcas” no mRNA que são reconhecidas pela

maquinaria do NMD, destinando ou não o mRNA para a degradação (Le Hir et al, 2003).

Estas “marcas” são na verdade uma série de proteínas que não se deslocaram das junções

do complexo EJC no transporte núcleo-citoplasma do mRNA. Com isso, conclui-se que

em mamíferos, o reconhecimento de códons prematuros de terminação relaciona-se com o

splicing. Já em outros organismos, como Drosophila ou Saccharomyces cerevisae, esse

reconhecimento independe de proteínas do EJC e do splicing (Conti e Izaurralde, 2005).

A iniciação mecanismo de NMD depende da proteína efetora chave, hUpf1. Ela

forma um complexo com as proteínas hUpf2 e hUpf3, e em seguida é fosforilada

(Ansmant e Izaurralde, 2006). Este complexo trimérico é a base da maquinaria de NMD.

Após a interação com hUpf2 e hUpf3 e fatores do complexo EJC, a proteína hUpf1 é

recrutada para o mRNA com códon de terminação prematura (CTP) por meio de

interações com fatores de liberação (release factors) da tradução (eRF1 e eRF3) (Ansmant

e Izaurralde, 2006). A montagem desse complexo multiprotéico promove a remoção do

CAP 5’ do mRNA, e ele é degradado. Porém, apesar dos avanços no estudo do processo

de NMD, há ainda muito a ser esclarecido sobre a influência real destas interações para

que o mecanismo de NMD seja disparado, principalmente em eucariotos superiores

(Ansmant e Izaurralde, 2006).

A figura 2 mostra um esquema da interação das proteínas do EJC durante o

splicing, o transporte nuclear do mRNA maduro e também durante o mecanismo de NMD.

SRm160

Pré-

mRNA

DEK

Aly

Y14

RNPS

hUpf

TAP

mRNA

20 nt

Y14

Complexo

EJC

Splicing

NPC (Poro

nuclear)

CTP

ter

hUpf2

TAP e Aly

Y14

hUpf2

hUpf3

CITOPLASMA

NÚCLEO

ter

mRNA com códon de

terminação prematura (CTP)

mRNA normal

Transporte

Primeiro

round da

Tradução

Iniciação

Ribossomo

Elongação:

dissociação do

complexo Y14 e

hUpfs

Terminação: o

mRNA é degradado

por NMD ou é

preservado

eRFs

hUpf1

Próximo round de

tradução

Remoção do CAP 5’

Degradação do mRNA

Figura 2. Ligação funcional entre o splicing, o transporte do mRNA núcleo-

citoplasmático e o NMD, com a participação das proteínas do EJC. O EJC consiste de

proteínas que se ligam ao mRNA produzido no núcleo por splicing. Após o transporte,

algumas prteínas do EJC permanecem ligadas ao mRNA já no citoplasma, formando “marcas”

de splicing no mRNA. Após o transporte, o mRNA pode ser reconhecido pela maquinaria de

NMD se possuir um CTP (códon de terminação prematura), e ser posteriormente degradado.

Neste caso, não há o desligamento das proteínas do EJC quando o ribossomo percorre o

mRNA para traduzí-lo. No caso de mRNAs normais, as proteínas do EJC que permaneceram

ligadas ao mRNA após o seu transporte para o citoplasma serão removidas após a passagem

do ribossomo para a síntese da proteína, sendo que posteriormente haverá a ligação de fatores

de terminação (eRFs) e da proteína hUpf1, um importante efetor do NMD. Esta última

proteína, se interagir com hUpF2 e 3, como ocorre em mRNAs com CTP, disparará o

mecanismo de NMD. Esquema adaptado de Kim et al, 2001.

Foram mostrados diversos aspectos funcionais dos efeitos dos introns e do splicing

em diversas etapas do processo transcricional, desde a formação do pré-mRNA até a

degradação do mRNA maduro. Desse modo, pode-se inferir que os introns funcionam

como elementos moduladores da transcrição e são importantes ferramentas na engenharia

de promotores para a construção de novos vetores para expressão em eucariotos com alta

eficiência.

1.2.2) Z-DNA

O DNA pode assumir três conformações distintas: a forma A, B e Z (figura 3). A

primeira conformação não é encontrada naturalmente nos seres vivos, e a hélice gira para a

direita, sendo necessários 11 pares de base para que haja uma volta completa na hélice.

Geralmente observa-se o A-DNA quando há poucas moléculas de água no meio para

interagir com a hélice ou em alguns complexos DNA-proteína. O B-DNA é a forma mais

encontrada nos seres vivos, e também tem a direção de rotação para a direita. Entretanto,

esta forma é mais longa e fina do que o A-DNA, precisando-se de 10 pares de base para

que se complete uma volta na hélice. O Z-DNA, ao contrário das outras duas formas, tem

a orientação da hélice para a esquerda, e requer 12 pares de base para que se complete uma

volta inteira na hélice. Este tipo ocorre geralmente quando há uma grande concentração

iônica no meio.

Figura 3. Três principais conformações assumidas pelo DNA. Da esquerda para a direita,

observa-se o A-DNA, o B-DNA (o mais encontrado nos seres vivos) e o Z-DNA. Figura

retirada do site http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico em 20 de

dezembro de 2007.

A mudança da conformação B para a Z requer um super-enrolamento negativo da

molécula de DNA (Wolfl et al, 1996). Outro fator que estabiliza a conformação Z do

DNA é a alta concentração de sais em solução devido à redução da repulsão eletrostática

entre os grupamentos fosfato (Blackburn e Gait, 1995 em Lim e Feng, 2005). Além disso,

o Z-DNA pode se formar quando ocorrem seqüências específicas no DNA que mostrem a

alternância entre purinas e pirimidinas. Nessa situação, as bases púricas assumem uma

conformação sin e as pirimidinas uma conformação anti em relação à pentose (figura 4)

(Wolfl et al, 1995 em Lim e Feng, 2005).

A B

Figura 4. Conformação espacial das bases nitrogenadas no DNA. Em “a” observa-se a

base guanina em conformação anti em relação à pentose. Em “b” pode ser verificada a

conformação sin da guanina em relação à pentose. Na conformação Z do DNA, as purinas

encontram-se na conformação sin, como se observa em “b”. O B-DNA, ao contrário, possui as

purinas na conformação anti. Figura retirada, em 12 de dezembro de 2007, do site

http://www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Struc_Nucleic_Acids_Chpt2.htm.

O tipo de seqüência mais relatada na literatura que induz a conformação Z no DNA

é a alternância (G.C)

(Klysik et al, 1982; McLean e Weels, 1988; Peck et al, 1982 e

Schroth et al, 1992). Entretanto, outras seqüências já se mostraram indutoras de Z-DNA,

como a repetição (A.T)

flanqueada por pequenas regiões de até 5 repetições de (G.C), a

repetição (T.G)

e a repetição (A.C)

(McLean e Weels, 1988). Apenas a repetição (A.T)

ao contrário, inibe fortemente a formação do Z-DNA mesmo em condições de grandes

torções negativas, sendo capaz de induzir a conformação cruciforme no DNA (McLean e

Weels, 1988 e McClellan et al, 1986).

Regiões de Z-DNA ocorrem naturalmente no genoma de eucariotos. Entretanto,

pouco se sabe da função biológica das ilhas de Z-DNA nestes locais. Schroth e

colaboradores (1992) mapearam, por meio de um programa computacional, potenciais

seqüências formadoras de Z-DNA no genoma humano, verificando que a maioria delas

encontrava-se basicamente em regiões que flanqueiam a extremidade 5’ dos genes

avaliados, dentre eles o da β-actina, fator VII de coagulação, desmina e apolipoproteína A-

I. Na época, o genoma humano ainda não estava completo, sendo que foram avaliados

apenas 137 genes completos. Devido à localização dessas regiões próxima a promotores

de genes do cromossomo estudado, especula-se que o Z-DNA esteja relacionado com a

transcrição do DNA.

Liu e Wang, em 1987, propuseram um modelo no qual, durante a transcrição, a

topologia de domínios locais do DNA é dinâmica, havendo o acúmulo de torção positiva à

direita do aparato transcricional e torção negativa à esquerda (figura 5). No caso de

procariotos, a torção positiva é anulada pela enzima DNA girase e a negativa é eliminada

pela DNA topoisomerase I. Mas em organismos com aparato transcricional mais

complexo, considera-se que a formação de Z-DNA em regiões gênicas específicas tenha

um importante papel na própria regulação da transcrição, facilitando a abertura da fita e

anulando os efeitos de torções negativas, visto que o Z-DNA é estabilizado pelas torções

negativas formadas pelo aparato transcricional.

Figura 5. Conformação adotada pela fita de DNA quando há a movimentação do

aparato transcricional. “R” é o aparato transcricional, que se movimenta na direção

indicada pela seta. À direita, há um acúmulo de torção positiva na molécula de DNA,

enquanto que à esquerda, observa-se um acúmulo de torção negativa. Figura retirada de Liu

e Wang, 1987.

Com isso, estudos verificando o real potencial de seqüências formadoras de Z-

DNA modularem a expressão gênica começaram a ser realizados. Em 2002, Oh e

colaboradores estudaram a ativação da trascrição do gene repórter da β-galactosidase em

leveduras. Clonou-se a montante do promotor do gene repórter um oligonuclotídeo que

induz a formação de Z-DNA no plasmídio, fusionando-se ao domínio de ativação da

proteína Gal4 o domínio de ligação a Z-DNA, conhecido como Z

. Quando este domínio

ligou-se à região formada pelo oligonucleotídeo clonado, a região em Z-DNA próxima ao

promotor foi estabilizada, funcionando como um enhancer transcricional e aumentando a

expressão do gene repórter em estudo. O domínio Z

é um domínio de ligação a Z-DNA

presente na enzima Deaminase de Adenosina de RNA-fita dupla (double stranded RNA

adenosine deaminase), ou ADAR1. (Hebert e Rich, 1996; Schade et al, 1999, Kim et al,

1994). A caracterização deste domínio ligante a Z-DNA foi importante para os estudos de

localização de Z-DNA in vivo, bem como a caracterização de anticorpos que reconhecem

Z-DNA, como o Z22 (Sanford e Stollar, 1990; Andrade et al, 2000 e Brígido e Stollar,

1991).

Corroborando a tese de aumento da taxa de transcrição gênica por meio da

formação de Z-DNA, um estudo abordou a ativação do gene CSF1 (colony-stimulating

factor 1) por meio de BRG1 (uma subunidade com atividade ATPásica que compõe o

complexo BAF de remodelamento da cromatina por meio de modificações nas histonas),

resultando na formação de Z-DNA na região promotora deste gene (Liu et al, 2006).

Quando inativo, o gene CSF1 tem uma região constituída por uma repetição TG, que fica

escondida no nucleossomo. Entretanto, a ativação por BRG1 desestabiliza este

nucleossomo, ocasionando a formação de uma região expandida de Z-DNA. Porém, não é

a transcrição ativa do gene que acarreta a formação do Z-DNA, visto que essa

conformação já é observada mesmo quando o gene não está sendo transcrito. A região que

contém o Z-DNA se expande à medida que a transcrição ocorre. Experimentos mostraram,

ainda, que em construções gênicas sem a repetição TG presente na região promotora não

se observou a formação de Z-DNA.

Outro estudo mostrando a importância biológica do Z-DNA na regulação da

transcrição gênica foi realizado por Wolfl e colaboradores em 1996. Neste trabalho, os

autores demonstraram que o gene do hormônio liberador de corticotropina humano

(human corticotropin-releasing hormone) tem sua expressão dependente da formação de

Z-DNA próxima à região do promotor. Isso foi verificado com a permeabilização do

núcleo da célula estudada e o tratamento com um anticorpo que reconhece Z-DNA,

indicando a presença desta conformação na região transcricional. Foi observado neste

trabalho que a inibição da transcrição deste gene com a adição de dexametasona no meio

de cultura também inibe a formação de Z-DNA na região próxima ao promotor (Wolfl et

al,1996).

Demonstrou-se que o Z-DNA está associado à modulação da expressão gênica em

eucariotos. Desse modo, a adição de seqüências indutoras de Z-DNA em regiões próximas

a promotores é uma ferramenta importante na construção de vetores para expressão em

eucariotos.

1.3) Principais promotores utilizados em vetores para expressão de proteínas

heterólogas em células de mamífero: o promotor de Citomegalovírus e o

intron A

Como descrito anteriormente, uma das alternativas para o controle da expressão

gênica é a manipulação de promotores, ou seja, a construção de promotores quiméricos e

que possuem diversos elementos moduladores como os descritos neste trabalho, os introns

e seqüências indutoras de Z-DNA. Desse modo, uma forma de se otimizar a expressão de

proteínas heterólogas em eucariotos, como por exemplo, em células de mamíferos, é

construir vetores plasmidiais que contêm os promotores engenherados.

Dentre os principais promotores utilizados na construção de vetores para expressão

em células de mamífero, destacam-se o promotor de SV40, do vírus do Sarcoma de Rous

(RSV), do hormônio de crescimento bovino (BGH) e o de Citomegalovírus (CMV) (Xu et

al, 2001). Neste trabalho, foram testadas diversas combinações destes promotores com

enhancers de CMV e de SV40, e sinais de poliadenilação de BGH e SV40 em três

linhagens de células de mamífero distintas. Dentre as combinações de elementos usadas,

as melhores em praticamente todas as células estudadas foram aquelas com o promotor e

enhancer de CMV (Xu et al, 2001).

Um dos promotores mais comumente utilizados em construções de vetores de

expressão em células de mamífero é o promotor constitutivo do citomegalovírus (CMV).

Paradoxalmente, apesar da lenta replicação em culturas celulares e no próprio hospedeiro,

estes vírus possuem um dos promotores mais fortes, justificando-se a sua utilização ubíqua

nos vetores de expressão de células de mamífero (Stinski, 1999). Este promotor contém

ainda, na região 5’, um elemento enhancer, contendo diversas regiões regulatórias em cis,

como por exemplo, quatro sítios de ligação ao fator nuclear 1 (NF1) em tandem

(Champman et al, 1991), além de sítios para AP1, CREB/ATF e NF-κB (Stinski, M.F.;

1999).

O promotor de CMV e seu enhancer dirigem a expressão do gene Imediatamente

Precoce de CMV (IE), que codifica proteínas que participam das vias de replicação do

vírus. O gene sofre splicing alternativo, originando diversas proteínas que fazem parte do

ciclo de replicação viral. Ele é constituído por 4 exons e 3 introns, sendo que o maior dos

introns, o intron A (IA), possui um sítio de ligação a NF1, mais forte que os 4 presentes no

promotor (Champman et al, 1991; Hennighausen e Fleckenstein, 1986). Neste mesmo

estudo, observou-se que o IA possui ainda um sítio homólogo ao elemento regulador

interno do gene da troponina I, um elemento similar a um enhancer. Além disso, este

intron pode também funcionar como sítio para a ligação de outros fatores de transcrição

(Champman et al, 1991). Desde então, não foram mapeadas no intron A novas regiões de

ligação a outros fatores de transcrição, sendo que apenas o estudo de Ghazal e Nelson

(1991) indicou que há a ligação de proteínas não-identificadas no exon 1 do gene. Na

figura 6 observa-se a representação esquemática do promotor do CMV, o enhancer a

montante do promotor e o IA flanqueado pelos dois exons do gene. Os sítios de restrição

mais importantes para este trabalho também foram evidenciados na figura, além das

regiões dos sítios de ligação a NF1, tanto no enhancer quanto no IA. Nesta contrução, o

exon 1 corresponde à região 5’UTR do mRNA correspondente ao gene IE1. Há ainda

apenas parte do exon 2 (que contém o AUG correspondente ao início da tradução), que

possui originalmente aproximadamente 200 pb

Figura 6. Esquema do promotor completo de CMV. O enhancer com os 4 sítios de NF1

(*), o primeiro e o segundo exon e o intron A, o maior intron deste gene, com

aproximadamente 800 pb, podem ser observados na figura. O intron A possui ainda o sítio

mais forte de ligação a NF1, representado por ( * ). As setas vermelhas indicam os sítios de

splicing, sendo que a primeira seta evidencia o sítio doador e a segunda o sítio aceptor de

splicing. Os sítios de restrição utilizados para a clonagem deste promotor foram evidenciados.

Diversos grupos de pesquisa utilizaram o IA com sucesso em suas construções,

comparando níveis de expressão de diversas proteínas na presença e ausência do intron. Já

se sabe que a adição de introns em contruções gênicas é capaz de aumentar os níveis de

produção de proteínas por diversos mecanismos já citados nesta introdução Desse modo,

alguns dos estudos realizados foram a análise da expressão de anticorpos (Xia et al, 2006),

do fator VIII humano de coagulação e da gp120 de HIV (Champman et al, 1991), além de

proteínas repórteres, como a luciferase (Xu et al, 2001). Estudos determinando o potencial

de modulação da expressão gênica utilizando formas truncadas do intron A ainda são

bastante restritos, havendo apenas pedidos de patentes das novas construções (Missha e

Shupisu, 2007). Como o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília já

utiliza o promotor de CMV nos vetores para expressão em células de mamífero (Ruggiero,

2002; Campos-da-Paz et al, no prelo), o intron A foi escolhido como objeto de estudo

deste trabalho.

Enhancer

* * *

* PROMOTOR * INTRON A (800 pb)

1º Exon (100 pb)

Início do 2º Exon (40 pb)

Bgl

Ssp

Hind

III

1.4) A produção de proteínas recombinantes em células de mamífero

Em 1986 foi produzida a primeira proteína recombinante com fins terapêuticos em

células de mamífero, a proteína ativadora de plasminogênio tissular humana (human tissue

plasminogen activator) (Wurm, 2004). Atualmente, 60 a 70% de biofármacos e proteínas

com interesse comercial são produzidos em células de mamífero. Isso porque as células de

mamífero têm características fisiológicas mais similares aos humanos do que células de

leveduras ou de E. coli. Desse modo, a existência de processos como glicosilação de

proteínas, fosforilação, formação de pontes-dissulfeto e outras modificações pós-

traducionais tornam a produção de proteínas com interesse comercial mais viável em

células de mamífero do que em outros tipos celulares (Wurm, 2004).

O tipo celular mais utilizado até então para tais fins é a linhagem parental

imortalizada de células de ovário de hamster chinês (Cricetulus griseus) (CHO), sendo

que inclusive a proteína ativadora de plasminogênio tissular humana foi produzida nesta

linhagem. Essas células são epiteliais, têm a morfologia fibroblastóide e são aderentes ao

material plástico onde são cultivadas. Um subclone da linhagem parental de CHO foi

estabelecido por Puck e colaboradores em 1958. Esta população celular deu origem à

sublinhagem CHO-K1. Uma das características desta linhagem é a ausência do gene para a

síntese de prolina, sendo necessária sua adição no meio de cultura. Já se produziu neste

tipo celular diversas proteínas visando aplicações farmacológicas e industriais, como pode

ser observado na tabela 1.

Tabela 1. Relação de proteínas terapêuticas produzidas em CHO.

Proteínas com fins comerciais produzidas em CHO Referência

Calicreína 9 humana Memari, et al (2006)

Eritropoietina humana Restelli et al (2006)

Anticorpo anti-IL2 Shi et al (2005)

Glicoproteínas do vírus da herpes B Perelygina et al (2005)

Fator VIII humano Yonemura et al (1993)

Atualmente, utilizam-se outros tipos celulares para a produção de proteínas

heterólogas com fins terapêuticos. Dentre eles, destaca-se a linhagem HEK293, derivada

de células embrionárias de rim humano transformadas com o DNA de adenovírus tipo 5

(Grahan et al, 1977). Esta linhagem é utilizada principalmente para a expressão transiente

de proteínas de interesse, como a glicoproteína de membrana do retrovírus HTLV-1

(Penteado et al, 2006). Outro tipo celular utilizado para transfecção de plasmídios

contendo proteínas de interesse é a linhagem HepG2, um carcinoma hepatocelular humano

que não contém o genoma do vírus da hepatite B (Knowles et al, 1980). Estas células

podem ser utilizadas para a expressão em larga escala de FVIII recombinante, visto que há

indícios da melhora de sua produção quando são utilizadas linhagens celulares hepáticas

(Picanço et al, 2007). Por fim, a linhagem celular denominada COS-7 é também uma

hospedeira de transfecção largamente utilizada. Esta linhagem celular fibroblastóide,

oriunda do rim do “macaco verde” africano (Cercopithecus aethiops), é derivada da

linhagem CV-1 que foi transformada com um mutante de SV40 que codifica o antígeno T

(Gluzman, 1981). As células COS-7 são geralmente escolhidas para a transfecção de

vetores que requeiram a expressão do antígeno T ou que contenham o promotor de SV40.

Desse modo, há no mercado várias opções de linhagens celulares para a melhor

produção das diversas proteínas com interesse comercial. Estudos massivos visando à

otimização da expressão gênica nestes tipos celulares foram feitos desde a década de 80,

culminando em produções de quantidades significativas de proteínas comerciais. Um

exemplo é a produção em 1986, que tinha um rendimento de 50 mg/L de proteína

recombinante. Quatorze anos depois, já se conseguia um rendimento de 5g/L de proteínas

(Wurm, 2004), um avanço significativo que tornou a produção em células de mamífero

um negócio mais viável. Entretanto, um dos principais obstáculos para a utilização das

células de mamífero em cultura como hospedeiros de produção ainda é o alto custo para

produção em larga escala quando se compara com custo da produção em leveduras e em

E. coli. Para isso, pesquisas buscando o desenvolvimento de novos métodos para melhorar

os níveis de produção de biofármacos e tentar otimizar essa relação de custo-benefício

estão sendo realizadas, para que deste modo, se atinja um patamar de produção industrial.

Alguns já descritos são: a mudança da temperatura de cultivo das células (Shi et al, 2005),

adição de compostos químicos no meio de cultura, como o butirato de sódio (Sung et al,

2005) e derivados de aminoácidos (Chang et al, 1999); a melhora da eficiência de

transfecção e a engenharia dos vetores de expressão para células de mamíferos. Dentro da

engenharia de vetores de expressão, a principal metodologia para a otimização da

expressão de transgenes em células de mamífero é justamente o melhoramento de

promotores por meio da inserção de elementos como os mostrados neste trabalho, como

introns e seqüências indutoras de Z-DNA.

1.5) Modelo Experimental

O grupo de Imunologia Molecular trabalha com a produção de proteínas

heterólogas em células de mamífero desde 2001, sendo que já foram produzidos

anticorpos humanizados de interesse comercial como o anti-CD18, anti-Z22 (Ruggiero,

2001) e anti-CD3 (Hernandez Silva, 2008 – em preparação), e também fatores plasmáticos

humanos, como o fator VIII e IX (Campos-da-Paz et al, no prelo). Todos os vetores que

albergam estes genes contêm o promotor de CMV, sendo este nosso modelo de estudo.

Desse modo, são necessários estudos para buscar elementos que, ao modificar este

promotor, possam otimizar a expressão das proteínas expressas pelo grupo, para que elas

possam futuramente ser produzidas em larga escala para comercialização.

2. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo a caracterização e o estudo do intron A de

CMV e de seqüências indutoras de Z-DNA, no contexto do promotor do gene IE de CMV,

como elementos moduladores da expressão gênica em diferentes linhagens de células de

mamífero.

2.1) Abordagem experimental

Para que o objetivo central fosse alcançado, realizaram-se as seguintes etapas

experimentais:

1 – Clonagem do promotor de CMV, com e sem o intron A, no vetor pGL4.14 (Promega)

que contém o gene repórter da luciferase.

2 – Geração de formas variantes e inovadoras do intron A por meio de deleções em

determinadas regiões do elemento.

3 – Remoção da região 5’do promotor/enhancer de CMV com intron A, e nesta região

clonagem das seqüências indutoras de Z-DNA Z1, Z3 e do controle Z5.

4 – Transfecção transiente das construções citadas acima em CHO-K1, HepG2, COS-7 e

HEK-293 para a mensuração da atividade da luciferase. As construções com as seqüências

indutoras de Z-DNA foram analisadas apenas em CHO-K1.

5 – Clonagem do gene que codifica o fragmento de anticorpo scFv anti-Z-DNA Z22

contendo uma seqüência codificadora de um sinal de localização nuclear (NLS) e a

proteína A e His-TAG como elementos para a detecção e isolamento da proteína.

6 – Produção de clones estáveis com as construções contendo as seqüências indutoras de

Z-DNA e co-transfecção da construção codificadora do fragmento de anticorpo anti-Z-

DNA com NLS.

7 – Mensuração dos níveis de produção de mRNA da luciferase de vaga-lume das diversas

construções por meio de qPCR.

8 – Análise do splicing das variantes deletadas do intron A de CMV por meio de RT-PCR.

3. MATERIAS E MÉTODOS

3.1) MATERIAIS

3.1.1) Linhagens bacterianas

As linhagens da bactéria Escherichia coli utilizadas para os procedimentos de

clonagem neste trabalho são destacadas a seguir, juntamente com o seu genótipo:

• XL1-blue (Stratagene): recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´

proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]. Os genes listados indicam alelos mutantes.

• DH5α: F'/endA1 hsdR17(r

) supE44 thi

-1

recA1 gyrA (Nal

) relA1 D(laclZYA-

argF)U169 deoR (F80dlacD(lacZ)M15). Os genes listados indicam alelos

mutantes.

• XL10-gold (Stratagene): Tet

D(mcrA)183 D(

mcr

CB-hsdSMR-mrr)173 endA1

supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZDM15 Tn10 (Tet

)

Amy Cam

]. Os genes listados indicam alelos mutantes. Esta linhagem de E. coli

foi desenvolvida para a transformação de moléculas de DNA grandes, e com alta

eficiência.

3.1.2) Linhagens de células de mamífero

Para a transfecção das construções de DNA plasmidial obtidas neste trabalho,

foram utilizadas as seguintes linhagens de células de mamífero:

• CHO-K1 (ATCC nºCCL-61): linhagem celular derivada de células epiteliais de

ovário de hamster chinês (Cricetulus griseus). As células foram cultivadas em

meio HAM-F12 (Hyclone) contendo soro fetal bovino (SFB) a uma concentração

de 10% (v/v).

• COS-7 (ATCC nºCRL-1651): esta linhagem celular é proveniente de células

fibroblastóides do rim do macaco verde africano (Cercopithecus aethiops). As

células foram cultivadas em meio DMEM (GIBCO) contendo SFB a uma

concentração de 10% (v/v).

• HEPG2 (ATCC nºHB-8065): esta linhagem celular é derivada de um

hepatocarcinoma celular humano. As células foram cultivadas em meio RPMI-

1640 (GIBCO) contendo SFB a uma concentração de 10% (v/v).

• HEK-293 (ATCC nºCRL-1573): é uma linhagem derivada de células de rim

embrionário humano que contêm o genoma do adenovírus tipo 5. As células foram

cultivadas em meio DMEM (GIBCO) contendo SFB a uma concentração de 10%

(v/v).

Todas as linhagens celulares utilizadas neste trabalho são linhagens aderentes.

3.1.3) Plasmídios utilizados nas clonagens e transfecções

- pGL4.14 (Promega) (figura 7a): este vetor comercial possui o tamanho de 5,8

kb, e foi utilizado como arcabouço para a clonagem de todos os promotores construídos

neste trabalho. Ele apresenta o gene repórter da luciferase de vaga-lume (luc 2),

controlado pelos promotores desenvolvidos neste trabalho, um sinal de poliadenilação

sintético, e a marca de resistência à higromicina B, sendo que este gene tem a expressão

controlada pelo promotor de SV40.

- pCMVLacI (Stratagene) (figura 7b): este vetor de 8 kb foi utilizado nos

procedimentos de clonagem do promotor de CMV com e sem intron A no vetor pGL4.14.

Ele possui o promotor completo de CMV (com enhancer e intron A), o gene lacI, o sinal

de localização nuclear (NLS) de SV40 (para que o produto do gene lacI seja direcionado

para o núcleo), marca de resistência à higromicina B, origem de replicação pUC e f

- pGEM-T Easy (Promega): este vetor comercial possui o tamanho de 3,15 kb, e

foi utilizado para a clonagem de produtos de PCR. É constituído pelo promotor T7 e SP6,

múltiplos sítios de clonagem, gene αLacZ, gene da β-lactamase, origem de replicação de

fago (f

ori) e origem de replicação plasmidial.

Figura 7. Mapas dos vetores utilizados para as clonagens do promotor com e sem intron

A. No painel “A” está representado o esquema do vetor pGL 4.14 (Promega, figura retirada

do site www.promega.com), utilizado como arcabouço das novas contruções de promotores

de CMV para a análise da atividade do gene repórter da luciferase. Em “B” observa-se o vetor

pCMVLac I (Stratagene, figura retirada do site www.stratagene.com), do qual retirou-se o

promotor com e sem intron A para as clonagens.

- pGL4.73 (Promega) (figura 8): este vetor comercial tem o tamanho de 3,9 kb, e

foi utilizado neste trabalho para co-transfecções com o vetor contendo o gene da luciferase

de vaga-lume. Ele possui o gene repórter da luciferase de Renilla (hluc) controlado pelo

promotor de SV40 e o sinal de poliadenilação também de SV40.

Figura 8. Mapa do vetor pGL4.73 (Promega). Este vetor foi utilizado para a co-transfecção

com as demais construções feitas neste trabalho, para que desta forma a atividade da

luciferase seja aferida como uma relação entre as atividades da luciferase de vaga-lume

(construções testadas) e de Renilla (vetor pGL4.73). Esta figura foi retirada do site da

Promega (

www.promega.com )

- pMACIA (figura 9a): este vetor de aproximadamente 5,5 kb foi construído por

Hernandez Silva em 2007 durante sua dissertação de mestrado. Ele é derivado do vetor

pMAC (Ruggiero, L. A, 2001 – dissertação de mestrado) pela substituição do promotor

mínimo de CMV pelo promotor/enhancer de CMV com intron A.

- pIg16 (Brígido et al, 1993) (figura 9b): este vetor de 4,1 kb possui o gene que

codifica do fragmento de anticorpo na forma scFv Z22, um anticorpo anti-Z-DNA. Ele foi

utilizado como substrato para a reação de PCR que permitia a introdução da seqüência

codificadora de NLS no gene do fragmento de anticorpo na forma scFv (do inglês single

chain variable fragment) Z22 anti-Z-DNA.

Figura 9. Mapas dos vetores pMACIA e pIg16, utilizados para a construção do pMACIA

Z22 NLS. No painel A está representado o esquema do mapa do vetor pMACIA, onde foi

clonado o gene do scFv de Z22 com NLS. O vetor pIg16, utilizado para a amplificação do

produto correspondente ao scFv Z22 com NLS, está mostrado no painel B. Os sítios de

clonagem no vetor pMACIA estão evidenciados em vermelho.

pMACIA

5500 pb

Nhe I

BamH I

3.1.4) Meios de cultura

- Cultura de bactérias

LB (Luria-Broth)

Peptona de Caseína 1,0%(p/v)

Extrato de Levedura 0,5% (p/v)

NaCl 1,0% (p/v)

pH 7,2

LB-ágar

Adicionar ágar bacteriológico a uma concentração final de 1,4% (p/v).

SB (Super-Broth)

Peptona de Caseína 3,0% (p/v)

Extrato de Levedura 2,0% (p/v)

MOPS 1,0% (p/v)

pH 7,0

SOB

Peptona de Caseína 20g

Extrato de Levedura 5g

NaCl 0,584g

KCl 0,186g

O qsp 1L

pH 7,0

SOC (100 mL)

Solução estoque de Mg

2M 1mL

Solução estoque de glicose 2M 1mL

Meio SOB 98mL

Estoque de Magnésio 2M

MgCl

.6H

O 20,33g

MgSO

.7H

O 24,65g

O qsp 100mL

Estoque de Glicose 2M

Glicose 26,04g

O qsp 100mL

Os meios de cultura para bactéria foram autoclavados por 15 minutos a 120ºC.

Para a cultura das linhagens de células de mamífero utilizadas neste estudo, foram

utilizados os meios de cultura HAM-F12, DMEM e RPMI-1640. Todos esses meios de

cultura apresentam uma composição química bastante complexa, contendo sais

inorgânicos diversos, vitaminas, aminoácidos e outros compostos, como piruvato de sódio.

Desse modo, todos os meios para cultura de células de mamíferos foram adquiridos

prontos (em pó) para serem posteriormente dissolvidos em água, sendo necessária apenas

a adição de determinada quantidade de bicarbonato de sódio (agente tamponante)

dependendo do tipo de meio.

HAM-F12 (Ham’s Nutrient Mixture F-12)

Dissolver o conteúdo do pacote em 1L de água destilada e acrescentar 1,176g de

bicarbonato de sódio.

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)

Dissolver o conteúdo do pacote em 1L de água destilada e acrescentar 3,7g de

bicarbonato de sódio.

RPMI-1640

Dissolver o conteúdo do pacote em 1L de água destilada e acrescentar 2g de

bicarbonato de sódio.

Os meios de cultura foram filtrados com filtro Millipore de 0,22µm para

esterilização e o pH foi ajustado com NaOH 2M para 7,3.

Meio de Congelamento de Células

DMEM

Soro Fetal Bovino 20% (v/v)

DMSO 5% (v/v)

3.1.5) Soluções

- Soluções utilizadas para cultura de células

BSS (Solução Salina Balanceada) – GIBCO

NaCl 8g

KCl 0,4g

CaCl

0,014g

MgSO

.7H

O 0,098g

HPO

0,048g

0,06g

Glicose 1g

Vermelho de fenol 0,01g

O qsp 1L

pH 7,3

BSS.CMF (Solução Salina Balanceada sem Cálcio e Magnésio) – GIBCO

NaCl 8g

KCl 0,4g

HPO

0,048g

0,06g

Glicose 1g

Vermelho de fenol 0,01g

O qsp 1L

pH 7,3

Soro Fetal Bovino (GIBCO)

Foi adicionado aos meios de cultura na concentração de 10% (v/v).

Tripsina-EDTA (GIBCO)

Tripsina 2,5g

EDTA 0,38g

BSS.CMF qsp 1L

pH 8,0

Azul de Tripan

Corante Azul de Tripan 400mg

PBS pH 7,2 qsp 100mL

Reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n

de catálogo 11668019)

É um lipídeo catiônico cuja formulação específica permite a transfecção de

diversas linhagens de células de mamífero, como se pode observar neste trabalho.

- Soluções utilizadas para extração de DNA

Solução I

Tris-HCl pH 8,0 25mM

EDTA pH 8,0 10mM

Glicose 50mM

Quando necessário, adicionou-se a esta solução RNAse A em uma concentração

final de 200µg/mL.

RNAse A

RNAse A 10mg/mL

A enzima é dissolvida em 10mM Tris-HCl pH 7,5 e 15mM de NaCl. Esta solução

foi fervida por 15 minutos para a inativação de DNAses contaminantes e em seguida

resfriada lentamente até que fosse atingida a temperatura ambiente. Depois, foram feitas

alíquotas estocadas a -20ºC.

Solução II

NaOH 0,2M

SDS 1,0% (p/v)

Solução III

Acetato de Sódio 3 M

Ácido Acético Glacial 2 M

Etanol 100%

Etanol 100% (v/v)

Etanol 70%

Etanol 70% (v/v)

Acetato de Amônio

Acetato de Amônio 7,5M

Acetato de Sódio

Acetato de Sódio 3M

pH 5,2

Clorofane

Fenol (equilibrado em pH 7,6) 1v

Clorofórmio 1v

Β-Mercaptoetanol 0,02%

Hidroxiquinolina 0,1%

Equilibrado com igual volume de Tris-HCl 0,01M em pH 8,0.

Clorofil

Clorofórmio 24v

Álcool Isoamílico 1v

Equilibrado com 0,25v de tampão TE

Tampão TE

Tris-HCl pH 8,0 10mM

EDTA pH 8,0 1mM

Tampão Tris

Tris-HCl pH 8,0 10mM

Glicogênio

Glicogênio 20mg/mL

- Soluções para preparo de células competentes e transformação

CaCl

a uma concentração de 50mM, dissolvido em água destilada e filtrado com

filtro Millipore de 0,22µm

CaCl

/glicerol

CaCl

a uma concentração de 50 mM contendo 15% de glicerol (v/v) para o

congelamento de células competentes para choque térmico. A solução foi filtrada com

filtro Millipore de 0,22 µm.

Solução de Glicerol

Glicerol 10% (v/v)

Solução de X-Gal

Solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo (X-Gal) dissolvido em

N,N-dimetilformamida em solução estoque de 2,5%. Solução armazenada a -20ºC e

protegida da luz. Usada no meio de cultura na proporção de 1:100.

Solução de IPTG

Solução de isopropil-tio-β-D-galactosídeo (IPTG) dissolvido em água em solução

estoque de 100 mM e esterilizado por filtração em membrana Millipore de 0,22 µm. Usada

no meio de cultura na proporção de 1:1000.

- Soluções para preparo de gel de agarose

Tampão de corrida para gel de agarose (TEB) 10X

Trizima-base 0,89M

Ácido Bórico 0,89M

EDTA 0,02M

pH 8,0 a 8,4

Tampão de corrida para gel de agarose (TAE) 50X

Tampão Tris-acetato 2M

Trizima-base 242g

Ácido Acético Glacial 57,1mL

EDTA pH 8,0 0,05M

Tampão de Amostra para gel de agarose

Tampão de corrida TEB 10X 50% (v/v)

Glicerol 50% (v/v)

Azul de Bromofenol 0,1% (p/v)

Xileno Cianol 0,1% (p/v)

Brometo de Etídeo

10mg/mL dissolvidos em água e protegidos da luz.

3.1.6) Antibióticos

Ampicilina

A ampicilina liofilizada foi ressuspendida em água destilada na concentração de 20

a 50 mg/mL. Após a ressuspensão, ela foi esterilizada por filtração em membrana

Millipore de 0,22 µm. Após a filtração, ela foi estocada a -20ºC e protegida da luz. Este

antibiótico foi utilizado como marca de seleção para plasmídios transformados em células

de E. coli.

Tetraciclina

A tetraciclina liofilizada foi ressuspendida em água destilada na concentração de

50 mg/mL e esterilizada por filtração em membrana Millipore de 0,22 µm. Após a

filtração, ela foi estocada a -20ºC e protegida da luz. Este antibiótico foi utilizado para a

semeadura e manutenção de células E. coli das linhagens XL1-blue e XL10-gold, que

possuem o gene de resistência a esse antibiótico.

Cloranfenicol

O cloranfenicol liofilizado foi ressuspendido em etanol 100% na concentração de

50 mg/mL e esterilizado por filtração em membrana Millipore de 0,22 µm. Após a

filtração, ele foi estocado a -20ºC e protegido da luz. Este antibiótico foi utilizado para a

semeadura e manutenção de células E. coli da linhagem XL10-gold, que possui o gene de

resistência a esse antibiótico.

Higromicina

A higromicina liofilizada foi ressuspendida em água destilada na concentração de

40 mg/mL e esterilizada por filtração em membrana Millipore de 0,22 µm. Após a

filtração, ela foi estocada a -20ºC e protegida da luz. A higromicina foi utilizada para a

obtenção de clones estáveis de construções com seqüências indutoras de Z-DNA na

linhagem CHO-K1.

Antibiótico/Antimicótico 100X (GIBCO)

Penicilina 10.000U

Estreptomicina 10.000µg

Anfotericina B 25µg/mL

Preparada em 0,85% de salina

Solução utilizada como antibacteriano e antimicótico que foi adicionada aos meios

de cultura das células de mamífero, na concentração final 1X.

3.1.7) Materiais e soluções para a mensuração da atividade da luciferase

Para os ensaios de atividade da luciferase realizados utilizou-se o kit comercial da

Promega Dual-Luciferase Reporter Assay System (nº de catálogo E1910). Ele contém

os seguintes componentes:

- Luciferase Assay Buffer (tampão de ensaio da luciferase)

- Luciferase Assay Substrate (produto liofilizado) (substrato de ensaio da luciferase)

- Stop and Glo Buffer (tampão Stop and Glo)

- Stop and Glo Substrate 50X (substrato Stop and Glo)

- Passive Lysis Buffer 5X (tampão de lise passiva)

Além dos reagentes fornecidos pelo fabricante, foi utilizado PBS na concentração

final 1X. Para isso, foi preparado um estoque 10X, que foi em seguida autoclavado, com a

seguinte formulação:

PBS 10X

11,5g

NaCl 80g

KCl 2g

pH 7,4

3.1.8) Materiais e soluções para extração de RNA total de CHO-K1

Todos os reagentes e materiais foram manipulados em condições RNAse free.

- DEPC (dietil pirocarbonato)

Preparar solução estoque a 1% (p/v).

- Clorofórmio

Foi aliquotado no momento da extração em tubos do tipo Falcon, devido à sua

volatilidade.

- Isopropanol

Este reagente foi estocado em um tubo Falcon, sendo manipulado com luvas para

que não fosse contaminado com RNAses.

- Etanol 100%

Etanol 100% manuseado com luvas e estocado em tubo tipo Falcon.

- Etanol 75% (v/v)

Etanol 100% 75mL

Água destilada RNAse free 25mL

- Acetato de Sódio

Acetato de Sódio 3M

pH 5,2

Este reagente foi manuseado com luvas e dissolvido em água MiliQ RNAse free.

- Plásticos e vidrarias RNAse free

As vidrarias foram incubadas a uma temperatura de 180ºC durante a noite para que

ficassem livres de RNAses. As caixas das ponteiras e outros materiais plásticos foram

incubados com DEPC a 0,01% a 4ºC durante a noite, e posteriormente autoclavados para a

remoção do reagente residual.

- Água RNAse free

Água destilada

DEPC 0,01% (v/v)

Após a mistura, autoclavar a 120ºC por 15 minutos.

- Materiais para preparo de gel de agarose RNAse free

A cuba de eletroforese, os pentes e a fôrma do gel foram tratados com DEPC a

0,1% (v/v) durante 1 hora (temperatura ambiente), ou a 4ºC durante a noite. Após este

período, os materiais foram lavados exaustivamente com água MiliQ para a remoção do

DEPC. O tampão TEB foi preparado com a mesma fórmula citada anteriormente, sendo

que foi preparado com água RNAse free. Toda a vidraria e espátulas necessárias para a

pesagem da agarose foram incubadas a 180ºC durante a noite. O tampão de amostra para a

corrida do gel e o brometo de etídeo também foram preparados com a mesma formulação

já descrita, sendo que a água utilizada era RNAse free.

3.1.9) Tampões de reação

- Tampões de Endonucleases de Restrição da Biolabs (NEB) 1X

NEBuffer 1

Bis-Tris-Propano-HCl 10mM

MgCl

10mM

DTT 1mM

pH 7,0

NEBuffer 2

Tris-HCl 10mM

MgCl

10mM

DTT 1mM

NaCl 50mM

pH 7,9

NEBuffer 3

Tris-HCl 50mM

MgCl

10mM

DTT 1mM

NaCl 100mM

pH 7,9

NEBuffer 4

Tris-acetato 20mM

Acetato de Magnésio 10mM

Acetato de Potássio 50mM

DTT 1mM

pH 7,9

- Tampões de reação da GIBCO 1X

REACT 2

Tris-HCl 50mM

MgCl

10mM

NaCl 50mM

Espermidina 25mM

- Tampão de reação da enzima Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP) – Promega 1X

Tris-HCl 50mM

MgCl

10mM

pH 9,0

- Tampão de Reação da Enzima T4 DNA Ligase – Promega 1X

Tris-HCl 30mM

MgCl

10mM

DTT 10mM

ATP 1mM

pH 7,6

- Tampão de Reação da Enzima T4 DNA Ligase – Invitrogen 1X

Tris-HCl 50mM

MgCl

10mM

ATP 1mM

DTT 1mM

Polietileno Glicol (PEG)-8000 25% (p/v)

pH 7,6

- Tampão de Reação da Taq DNA Polimerase CENBIOT/RS 10X

Tris-HCl 0,1M

KCl 0,5M

BSA 0,1% (p/v)

Na PCR foi adicionado cloreto de magnésio para uma concentração final de 1mM.

- Tampão de Anelamento de Oligonucleotídeos

Tris-HCl 1M

MgCl

100mM

pH 7,6

- Tampão de Reação da DNAse I RNAse free 10X (Promega)

Tris-HCl pH 8,0 400mM

MgSO

100mM

CaCl

10mM

- Stop Solution da DNAse I RNAse free 10X (Promega)

EGTA pH 8,0 20mM

- Tampão de Reação da Transcriptase Reversa (5X RT Buffer) (Invitrogen)

Tris-HCl pH 8,3 250mM

KCl 375mM

MgCl

15mM

- Outros componentes de reação

Mistura dNTP: com dGTP, dATP, dCTP e dTTP na concentração de 10 mM cada.

Albumina Sérica Bovina (BSA): 10 mg/mL (100X)

MgCl

: 50 mM, utilizado nas reações de PCR (concentração final de 1 mM)

DTT: 0,1 M, utilizado nas reações de transcrição reversa na concentração final de 0,01M.

RNAse OUT (40 U/ µL): um inibidor de RNAse para as reações de síntese de cDNA.

3.1.10) Enzimas

- Enzimas de Restrição

Biolabs

Bgl II (10U/µL)

Hind III (10U/

µL)

Sac II (20U/µL)

Mlu I (10U/µL)

Ssp I (5U/µL)

Xcm I (5U/µL)

BspE I (10U/µL)

BssH II (20U/µL)

- Outras enzimas

Invitrogen

T4 DNA Ligase (1U/µL)

Fragmento Klenow da DNA polimerase (0,5U/µL)

Superscript III (transcriptase reversa) (200U/ µL)

Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (2X) (Invitrogen – número de catálogo

11733046)

Este mix contém a enzima Taq Platinum, além do corante SYBR Green, MgCl

mM, 400 µM de dATP, 400 µM de dCTP, 400 µM de dGTP, 800 µM de dUTP, uracil

DNA glicosilase (UDG), estabilizadores e outros reagentes não-especificados. A presença

da enzima UDG previne a reamplificação de produtos de PCR entre os passos da reação,

permitindo apenas a amplificação de seqüências-alvo genuínas. Esta enzima é inativada

pelas altas temperaturas durante a ciclagem da PCR.

Promega

T4 DNA Ligase (1U/µL)

Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP) (1U/µL)

DNAse I RNAse free (1U/ µL)

CENBIOT/RS

Taq DNA polimerase (2U/µL)

3.1.11) Marcadores de massa molecular de DNA

1 kb plus DNA LADDER (Invitrogen – número de catálogo 10787018)

Fragmentos de DNA em pb: 100, 200, 300, 400, 500, 650, 850, 1000, 1650, 2000, 3.000,

4000, 5.000, 6.000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 11000, 12.000.

High DNA Mass LADDER (Invitrogen – número de catálogo 10496016)

Mistura equimolar de fragmentos de DNA em pb de 10.000, 6.000, 4000, 3.000, 2000 e

1000. Quando se utiliza 4 µL do marcador, correlaciona-se as bandas já citadas com as

seguintes massas: 200, 120, 80, 60, 40 e 20 ng, respectivamente.

Low DNA Mass LADDER (Invitrogen – número de catálogo 10068013)

Mistura equimolar de fragmentos de DNA em pb de 2000, 1200, 800, 400, 200 e 100.

Quando se utiliza 4 µL do marcador, correlaciona-se as bandas já citadas com as seguintes

massas: 200, 120, 80, 60, 40 e 20 ng, respectivamente.

3.1.12) Oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento, clonagens e reações de PCR

Tabela 2. Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados nas diversas etapas deste trabalho

(os oligonucleotídeos citados foram sintetizados pela IDT, Integrated DNA Technologies,

Inc.).

OLIGONUCLEOTÍDEO

SEQUÊNCIA

UTILIZAÇÃO

M13 Universal 5’ GTAAAACGACGGCCACT 3’ Utilizado para

sequenciamento

de fragmentos de

PCR clonados no

vetor pGEM T-

easy.

M13 Reverso 5’ CAGGAAACAGCTATGAC 3’ Utilizado para

sequenciamento

de fragmentos de

PCR clonados no

vetor pGEM T-

easy.

Z0 Ssp 5’ ACGCGGCCGCACGCGT 3’ Utilizado para se

anelar com Z1,

Z3 e Z5.

Z1 Ssp 5’

CGCACACACGCACACGCACGCACACACACGCGG

CCG

3’

Quando anelado

com Z0, é

clonado no sítio

de Ssp I no vetor

pGLCMV para

formação de Z-

DNA. Derivado

de seqüências

repetitivas que

induzem Z-DNA

no genoma de

camundongo.

Z3 Ssp 5’ CACGCACGCACGCACGCACGCACGCGGCCG 3’ Quando anelado

com Z0, é

clonado no sítio

de Ssp I no vetor

pGLCMV para

formação de Z-

DNA. Derivado

de seqüências

repetitivas que

induzem Z-DNA

no genoma de

camundongo.

Z5 Ssp 5’ ACGCGGCCGCACGCGT 3’ Quando anelado

com Z0, é

clonado no sítio

de Ssp I no vetor

pGLCMV para

formação de Z-

DNA.

Seq pGL4.14 5’ CTAGCAAAATAGGCTCCC 3’ Utilizado para

sequenciamento

de regiões

clonadas no vetor

pGL4.14

(Promega)

Z22NLS int. UP 5’GAAGAAGCGGAAGGTAGGTAAGGTGCAACTT

GTTGAGT 3’

Iniciador de PCR

para a

amplificação

interna do

fragmento scFv

Z22 com NLS

Z22NLS int. LOW 5’AGCCATGATGATGGTGATGGTGAGCTTTTGGT

GCTTGT 3’

Iniciador de PCR

para a

amplificação

interna do

fragmento scFv

Z22 com NLS

Z22NLS ext. Nhe 5’GGCTAGCCACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGG

AAGGTA 3’

Iniciador de PCR

para amplificação

externa do

fragmento scFv

Z22 com NLS.

Adiciona o sítio

de Nhe I.

Z22NLS ext. Bam 5’CTCGGATCCTTAGCCATGATGATGGTGATGGT Iniciador de PCR

GAGCTT 3’ para amplificação

externa do

fragmento scFv

Z22 com NLS.

Adiciona o sítio

de BamH I.

5’ pCMV 5’ GGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA 3’ Utilizado para

seqüenciamento

do promotor de

CMV

3’ pCMV 5’ GCATTCTAGTTGTGGTTTGTTCC 3’ Utilizado para

seqüenciamento

do promotor de

CMV

Primer pCMV 1088 Low 5’ CCGTGCCAAGAGTGACGTA 3’ Utilizado para a

reação de PCR a

partir do cDNA

produzido pelo

primer RT pCMV

1115 Low

Primer pCMV104 Up 5’ CCGTGCCAAGAGTGACGTA 3’ Utilizado para a

reação de PCR a

partir do cDNA

produzido pelo

primer RT pCMV

1115 Low

Primer RT pCMV 1115

Low

5’ ATATGTGCGTCGGTAAAGGC 3’ Primer específico

tilizado para a

síntese da fita de

cDNA do

promotor de

CMV e intron A

ChGAPDH Foward * 5’ CCATGTTCCAGGAGGGAGATC 3’ Utilizado na

reação de qPCR

para a

amplificação do

gene constitutivo

de CHO GAPDH

ChGAPDH Reverse * 5’ GCCTTCTCCATGGTGGTGAA 3’ Utilizado na

reação de qPCR

para a

amplificação do

gene constitutivo

de CHO GAPDH

H Luc Foward * 5’ CTCGCTGCAAGCAAATGAAC 3’ Utilizado na

reação de qPCR

para a

amplificação do

gene da luciferase

de Renilla

H Luc Reverse * 5’ GCAGCGTTACCATGCAGAAA 3’ Utilizado na

reação de qPCR

para a

amplificação do

gene da luciferase

de Renilla

Fly Luc2 Foward * 5’ CAGCTGCACAAAGCCATGAA 3’ Utilizado na

reação de qPCR

para a

amplificação do

gene da luciferase

de Renilla

Fly Luc2 Reverse * 5’ CGAAGTACTCGGCGTAGGTAATG 3’ Utilizado na

reação de Qpcr

para a

amplificação do

gene da luciferase

de Renilla

* Os iniciadores destacados foram desenhados com o programa Primer Express Program for Real-Time

PCR, versão 3.0. Eles foram sintetizados pela Sigma, no CIRAD Institute (França), em colaboração com o

professor Alan Andrade, da Embrapa Cenargen de Brasília – DF.

3.2) MÉTODOS

3.2.1) Preparo e transformação de células compententes de Escherichia coli.

- Células competentes preparadas com CaCl

para choque térmico (adaptado de

Sambrook e Russel, 2001)

1 – Inoculou-se 50mL de meio LB com 500

µL de um pré-inóculo de E. coli crescido

durante a noite.

2 – Incubou-se este inóculo a 37ºC sob agitação de 250 rpm, até que fosse atingida uma

600

de 0,1 a 0,3 (início da fase exponencial de crescimento).

3 – Depois de crescida, a cultura foi centrifugada a 3.000 x g a 4ºC por 15 minutos.

4 – O sedimento foi ressuspendido em 10mL de solução de CaCl

50mM gelada por meio

de suave agitação. A partir deste momento, a suspensão de células foi mantida sempre no

gelo.

5 – Centifugou-se a amostra a 3.000 x g por 15 minutos a 4ºC.

6 – Em seguida, descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi ressuspendido em 1mL de

solução de CaCl

50mM gelada. Alternativamente, quando as células foram preparadas

para congelamento, o sedimento foi ressuspendido em 1mL de solução de CaCl

50mM /

glicerol 15% (v/v) gelada.

7 – O tubo contendo as células foi mantido por pelo menos meia hora, quando as células

então foram consideradas competentes. Desse modo, foram usadas imediatamente após o

preparo ou então congeladas em banho de gelo seco e etanol e posteriormente

armazenadas no freezer a -80ºC.

8 – Após os procedimentos realizados acima, 100 a 200µL de células competentes foram

incubadas com 100 a 500ηg de DNA plasmidial em banho água/gelo por pelo menos 30

minutos.

9 – Em seguida, os sistemas de transformação foram incubados a 42ºC por 3 minutos, e

após este período eles foram rapidamente retornados ao gelo por até 1 minuto.

10 – Adicionou-se 1mL de meio LB aos sistemas submetidos ao choque térmico. Depois,

os tubos foram incubados por pelo menos 1 hora a 37ºC. Após este período, semeou-se 50

a 100µL (plasmídio intacto) ou 200 a 500µL (sistema de ligação) das células

transformadas em placas contento meio LB ágar com ampicilina a uma concentração final

de 150µg/mL. As placas foram mantidas a 37ºC durante a noite.

- Preparo de células competentes para transformação por eletroporação (Maranhão,

A. Q, em Azevedo et al, 2003).

1 – Uma colônia isolada de E. coli foi inoculada em 10mL de meio SB. A cultura foi

incubada durante a noite a 37ºC sob uma agitação de 250 rpm.

2 – No dia seguinte, utilizou-se 500µL do pré-inóculo para 500 mL de meio SB contendo

2,5mL de glicose 2M e 2,5mL de solução estoque de Mg

2M. A cultura foi incubada a

37ºC sob a agitação de 250 rpm até que fosse atingida a OD a 600ηm de 0,7 a 0,9. Após

esse passo, o frasco contendo a cultura já na densidade óptica desejada deve ser resfriado a

0ºC (no gelo), bem como todas as soluções a serem utilizadas, ponteiras, pipetas e outros

materiais necessários para o procedimento.

3 – As células foram centrifugadas a 3.000 x g por 20 minutos a 4ºC.

4 – Após a centrifugação, o sedimento foi ressuspendido em 25mL de glicerol 10% (v/v)

gelado, utilizando pipetas pré-resfriadas. A seguir, adicionou-se mais 75mL de glicerol

10% (v/v) e centrifugou-se por 20 minutos a 3.000 x g e 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e esse procedimento foi repetido mais uma vez.

5 – O sedimento foi ressuspendido em 25mL de glicerol 10% (v/v) gelado. Em seguida, as

células foram transferidas para um tubo de 50mL e centrifugadas a 3.000 x g por 20

minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado.

6 – As células foram ressuspendidas com glicerol 10% (v/v) para uma densidade óptica a

600ηm de 200 a 250 (aproximadamente 1 a 2mL). Em geral, não é necessário adicionar

mais solução de glicerol, sendo as células ressuspensas no volume residual presente no

tubo da centrífuga após o descarte do sobrenadante.

7 – Neste ponto, as células foram consideradas competentes, sendo utilizadas

imediatamente ou, alternativamente, sendo congeladas em alíquotas de 100µL em tubos

novos no banho de gelo seco e álcool, sendo armazenadas a – 80ºC.

- Transformação por eletroporação (Maranhão, A. Q. em Azevedo et al, 2003).

1 – Adicionou-se a um microtubo tipo Epperndorf, previamente resfriado em gelo picado,

a amostra de DNA a ser transformada. As cubetas de eletroporação também foram

previamente resfriadas. O volume máximo de DNA a ser eletroporado deve corresponder

a 1/10 do volume de células usadas a fim de garantir a condutância adequada ao impulso

elétrico.

2 – Após o descongelamento das alíquotas de células a serem utilizadas, elas foram

misturadas ao DNA com movimentos circulares e suaves.

3 – A mistura de DNA com as células foi transferida rapidamente para a cubeta de

eletroporação previamente resfriada. Os parâmetros elétricos para tal procedimento foram

os seguintes: 2,5 kV, 25 µF e 200 Ω. O τ (tempo em que a corrente passa pela amostra)

esperado nessas condições é de 4,0 a 5,0 milissegundos.

4 – Imediatamente após a eletroporação, adicionou-se meio SOC à cubeta (três lavagens

com 1mL de meio para assegurar a remoção total das células eletroporadas). Os 3mL

resultantes das lavagens foram juntados em um falcon de 50mL estéril.

5 – O recipiente contendo as células transformadas foi incubado a 37ºC por 1 hora sob

agitação de 250 rpm.

6 – Em seguida, diluições desta cultura foram semeadas em placas contendo meio LB ágar

e ampicilina a uma concentração final de 200µg/mL. As placas foram incubadas a 37ºC

durante a noite.

7 – No dia seguinte, observou-se o crescimento de colônias isoladas de bactérias,

indicando a presença de células transformadas, ou seja, resistentes ao agente seletivo.

3.2.2) Preparação de DNA plasmidial

- Extração de DNA plasmidial em pequena escala pelo método de lise alcalina

(adaptado de Sambrook e Russel, 2001).

1 – Uma colônia bacteriana contendo o plasmídio de interesse foi inoculada em 5mL de

meio LB com 150µg/mL de ampicilina . A cultura foi crescida durante 16 a 20 horas sob

agitação de 250 rpm a 37ºC.

2 – No dia seguinte, o meio foi coletado em um microtubo de 1,5mL e centrifugado a

5.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e a coleta foi realizada

novamente, sob as mesmas condições.

3 – O sedimento foi ressuspenso em 200µL de solução I por meio de vigorosa agitação ou

pipetagem.

4 – Em seguida, adicionaram-se 400µL de solução II (feita na hora). As amostras foram

homogeneizadas por inversão de tubo (delicadamente), cerca de 5 vezes. Após a adição da

solução II, as amostras não devem ficar mais do que 5 minutos à temperatura ambiente.

5 – Ao lisado celular foram adicionados 300µL de solução III, sendo feita novamente a

homogeneização das amostras por inversão de tubos (5 vezes). Depois, incubou-se no gelo

por 10 minutos.

6 – As amostras foram centrifugadas a 10.000 x g por 15 minutos a 4ºC.

7 – O sobrenadante foi então coletado em novos tubos de 1,5mL, onde adicionou-se

RNAse A a uma concentração final de 2

µg/mL. Para a ação da enzima, as amostras foram

incubadas a 37ºC por 1 hora.

8 – Após a incubação com RNAse, as proteínas das preparações foram extraídas

adicionando-se 300 µL de clorofane às amostras. Essa mistura foi então agitada em

aparelho do tipo Vortex por aproximadamente 2 minutos.

9 – Os tubos foram centrifugados a 10.000 x g por 5 minutos, e a fase aquosa da mistura

(que continha o DNA plasmidial) foi transferida para outro microtubo de 1,5mL. Em

seguida, ao tubo com as amostras recolhidas, adicionou-se 300µL de clorofil, e as

amostras foram novamente agitadas no aparelho Vortex por 2 minutos e depois

centrifugadas a 10.000 x g por 5 minutos.

10 – Após a centrifugação, a fase aquosa foi coletada em um microtubo de 2 mL, onde

adicionou-se etanol 100% gelado até que se completasse o volume do tubo. As amostras

foram então incubadas a – 20ºC durante a noite ou então a – 80ºC por pelo menos 1 hora,

para a precipitação do DNA plasmidial. Essa metodologia foi realizada conforme descrito

na sessão 3.2.12.

11 – Após a precipitação, o sedimento foi ressuspendido em 40µL de tampão Tris ou

tampão TE (como o TE tem EDTA, que pode inibir algumas reações enzimáticas

subseqüentes, optou-se por ressuspender as amostras com o tampão Tris).

- Extração de DNA em larga escala pelo método de lise alcalina (adaptado de

Sambrook e Russel, 2001).

1 – Uma colônia bacteriana foi inoculada em 3mL de meio LB contendo 150µg/mL de

ampicilina. A cultura foi incubada sob agitação de 250 rpm, por 12 a 16 horas, a 37ºC.

2 – Desse pré-inóculo, utilizou-se 500µL para inocular 250mL de meio LB com 150µg/mL

de ampicilina. A cultura foi incubada a 37ºC sob agitação de 250 rpm por 16 a 20 horas.

3 – A cultura foi então coletada por centrifugação a 6.000 x g por 15 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado.

4 – O sedimento foi ressuspenso em 5mL de solução I por meio de vigorosa agitação.

5 – Adicionaram-se 10mL de solução II (feita na hora) às células ressuspendidas. O tubo

foi homogeneizado por inversão (cuidadosamente) cerca de 5 vezes. As amostras não

ficaram mais do que 5 minutos à temperatura ambiente.

6 – Depois, foram adicionados 7,5mL de solução III gelada, sendo feita nova

homogeneização por inversão de tubos. As amostras foram incubadas no gelo por 20

minutos.

7 – Em seguida, os tubos foram centrifugados a 20.000 x g por 30 minutos a 4ºC.

8 – O sobrenadante foi transferido para um tubo menor, e a ele foram adicionados 0,6

volumes de isopropanol à temperatura ambiente. O sistema foi incubado por 5 minutos.

Depois, centrifugou-se a amostra a 12.000 x g por 30 minutos a 4ºC.

9 – O sedimento foi seco e ressuspenso em 500 µL de TE, onde adicionou-se RNAse A a

uma concentração final de 2µg/mL. As amostras foram então incubadas a 37ºC por pelo

menos 1 hora e meia.

10 – Após a incubação com RNAse, as proteínas das preparações foram extraídas com 1

volume de clorofane. Elas foram agitadas vigorosamente em aparelho do tipo Vortex por

2 minutos e centrifugadas a 10.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa foi coletada em outro

microtubo e este procedimento foi repetido mais uma vez.

11 – Após a segunda extração com clorofane, adicionou-se 1 volume de clorofil. A

mistura foi novamente agitada e centrifugada a 10.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa

foi transferida para um novo microtubo.

12 – À última fase aquosa coletada, adicionou-se ½ volume de acetato de amônio 7,5M e

2 volumes de etanol 100% gelado. As amostras foram então incubadas a – 20ºC durante a

noite ou a – 80ºC por pelo menos 1 hora. Após este período, foi seguido o protocolo de

término da precipitação descrito da sessão 3.2.12.

13 – Em seguida, o sedimento correspondente ao DNA plasmidial extraído foi

ressuspendido em 200µL de tampão Tris ou tampão TE (como o TE tem EDTA, que pode

inibir algumas reações enzimáticas subseqüentes, optou-se por ressuspender as amostras

com o tampão Tris).

- Extração de DNA plasmidial em pequena escala utilizando o kit comercial

QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen – número de catálogo 27106)

1 – Foi inoculada uma colônia bacteriana em meio LB com ampicilina a 150µg/mL. A

cultura foi incubada a 37ºC por 12 a 16 horas sob agitação de 250 rpm.

2 – As amostras foram centrifugadas a 5.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente

em tubos de 1,5 mL. O sobrenadante foi descartado e esse procedimento repetido, sendo

que no final o volume de células coletadas foi de 3mL.

3 – O sedimento foi ressuspendido em 250µL de tampão P1. A este tampão já foi

adicionada RNAse A.

4 – A essa mistura, adicionaram-se 250

µL de tampão P2 (promove a lise celular), e

misturou-se vagarosamente por inversão de tubo 4 a 6 vezes.

5 – Em seguida, foram adicionados 350µL de tampão P3 previamente resfriado às

amostras. Elas foram homogeneizadas por inversão de tubo 4 a 6 vezes.

6 – Os tubos foram centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente.

7 – O sobrenadante foi coletado e aplicado na coluna de troca iônica do kit (QIAprep spin

columm).

8 – As colunas contendo o sobrenadante do passo 6 foram centrifugadas a 13.000 rpm por

30 a 60 segundos. O líquido que saiu da coluna foi descartado.

9 – Em seguida, a coluna foi lavada com 750µL de tampão PE e centrifugada a 13.000

rpm por 30 a 60 segundos. O líquido que saiu da coluna foi descartado.

10 – As colunas foram centrifugadas novamente nas mesmas condições para que o tampão

PE residual fosse removido.

11 – As colunas foram colocadas em tubos novos de 1,5 mL. Para a eluição do DNA,

foram adicionados 50 µL de tampão EB (Tris-HCl 10 mM pH 8,5) previamente aquecido

por 10 minutos a 75ºC no centro da coluna. Após 1 minuto, as amostras foram

centrifugadas por 1 minuto, sendo o DNA recuperado nos microtubos.

- Extração de DNA plasmidial em larga escala utilizando o kit comercial QIAGEN

Maxi Kit (QIAGEN-tip 500) (Qiagen – número de catálogo 12163).

1 – Uma colônia bacteriana foi inoculada em 3mL de meio LB com ampicilina a

150µg/mL e incubada por até 8 horas a 37ºC sob agitação de 250 rpm.

2 – Quinhentos microlitros desse pré-inóculo foram adicionados a 250mL de meio LB

com ampicilina a 150 µg/mL. A cultura foi então incubada a 37ºC sob agitação de 250

rpm por 12 a 16 horas.

3 – As células foram centrifugadas a 6.000 x g por 15 minutos a 4ºC. Descartou-se o

sobrenadante.

4 – O sedimento foi ressuspendido em 10mL de tampão P1.

5 – Adicionaram-se 10mL de tampão P2 e misturou-se cuidadosamente por inversão de

tubo (cerca de 5 vezes).

6 – À mistura, adicionaram-se 10mL de tampão P3 previamente resfriado. Homogeneizou-

se o líquido por inversão de tubo (também cerca de 5 vezes).

7 – Os tubos foram centrifugados a 20000 x g por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

removido, colocado em outro tubo, e centrifugado novamente a 20000 x g por 15 minutos

a 4ºC.

8 – Enquanto a centrifugação do passo 7 ocorria, a coluna QIAGEN-tip 500 foi

equilibrada com 10mL de tampão QBT, que passou por meio da ação da gravidade.

9 – O sobrenadante do passo 7 foi aplicado na coluna já equilibrada, e também passou por

meio da ação da gravidade.

10 – A coluna foi lavada 2 vezes com 30mL de tampão QC.

11 – O DNA foi eluído com 15mL de tampão QF. O líquido contendo o DNA plasmidial

foi coletado em um tubo de 50 mL.

12 – O DNA foi precipitado com 10,5mL de isopropanol a temperatura ambiente (0,7

volumes). Misturou-se o líquido por inversão de tubo e centrifugou-se a 15.000 x g por 30

minutos a 4ºC. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.

13 – O sedimento foi lavado com 5mL de etanol 70% gelado e centrifugado a 20000 x g

por 15 minutos a 4ºC.

14 – O sobrenadante foi descartado e o sedimento secado a temperatura ambiente. Após a

secagem, foi ressuspendido em 200µL de tampão EB.

3.2.3) Extração e purificação de DNA de gel de agarose

- Purificação de DNA a partir de pedaços de gel de agarose com o kit comercial

QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen – número de catálogo 28104).

1 – A banda correspondente ao fragmento de DNA a ser purificado foi cortada do gel de

agarose feito com tampão TAE.

2 – A banda foi pesada. Adicionou-se 3 volumes de tampão QG para 1 volume de gel

(100mg correspondem a 100µL).

3 – A mistura foi incubada a 50ºC por 10 minutos, ou até que o gel se dissolvesse

completamente no tampão. Para que esse processo ocorresse mais rapidamente, a mistura

foi agitada vigorosamente em aparelho do tipo Vortex a cada 2 minutos.

4 – Após a dissolução do gel no tampão, a mistura adquiriu a cor amarela. Caso contrário,

se a cor da mistura fosse laranja ou violeta, deveriam ser acrescentados 10µL de acetato de

sódio 3M, pH 5,0.

5 – Foi adicionado 1 volume de isopropanol (esse passo foi realizado quando os

fragmentos de DNA possuíam tamanho menor que 500 pb e maior que 4 kb).

6 – A coluna de troca iônica do kit foi posicionada no tubo coletor de 2mL, também

fornecido pelo fabricante.

7 – A amostra foi aplicada na coluna e centrifugada a 13.000 x g por 1 minuto.

8 – O líquido remanescente foi descartado.

9 – A coluna foi lavada com 750µL de tampão PE. Centrifugou-se a 13.000 x g por 1

minuto e descartou-se o líquido remanescente.

10 – A coluna foi centrifugada novamente nas mesmas condições para que o tampão PE

residual fosse removido.

11 – A coluna foi colocada em um microtubo novo de 1,5mL, e o DNA foi eluído com 50

µL de tampão EB previamente aquecido a 75ºC por 10 minutos. Após a adição do tampão,

a coluna ficou em repouso por 1 minuto, e depois foi centrifugada a 13.000 x g por 1

minuto.

- Purificação de DNA de gel de agarose utilizando o método de Freeze/Squeeze

(Barbas III et al, 2001).

1 – A banda correspondente ao fragmento de DNA a ser purificado foi cortada do gel de

agarose feito com tampão TAE.

2 – Foi feita uma bolsa com um pedaço de Parafilm para se colocar o pedaço de agarose

cortado. Essa bolsa teve as extremidades seladas por pressão com a parte inferior de um

microtubo de 1,5mL, e na parte não-selada a banda foi inserida.

3 – A bolsa contendo o pedaço de gel foi congelada a – 20ºC por pelo menos 15 minutos

ou a -80ºC por 5 minutos.

4 – Após o congelamento, o fragmento de agarose foi amassado com o auxílio da tampa

de um microtubo de 1,5mL. Quanto mais eficiente fosse a trituração da banda, maior o

rendimento da eluição.

5 – O líquido que foi obtido com o processo de trituração e o gel triturado foram

transferidos para uma unidade de pré-filtro de 0,45µm (Millipore Ultrafree Collum)

adaptada em um tubo de 1,5mL.

6 – O sistema foi centrifugado a 12.000 x g por 10 minutos, e após este procedimento a

unidade de filtro foi descartada.

7 – O líquido contendo o DNA foi precipitado com 2,5 volumes de etanol 100%, 1/10 do

volume de acetato de sódio 3M pH 5,2 e 3µL de glicogênio 20mg/mL, como descrito na

sessão 3.2.12.

8 – Após a precipitação, o sedimento foi ressuspendido em 10

µL de tampão Tris, e o DNA

plasmidial foi quantificado em gel de agarose.

3.2.4) Digestão de DNA plasmidial com enzimas de restrição

As digestões das amostras de DNA plasmidial utilizadas neste trabalho foram

realizadas conforme as instruções do fabricante. As enzimas de restrição apresentadas no

item 3.1.8 são do tipo II, ou seja, reconhecem seqüências palindrômicas do DNA,

cortando-o no sítio de restrição, e com isso formando extremidades coesivas ou cegas,

dependendo da enzima utilizada. A quantidade de enzima utilizada foi padronizada para

1U de enzima por µg de DNA, sendo que esta reação ocorreu durante 2 a 6 horas, na

temperatura recomendada pelo fabricante.

3.2.5) Reação de defosforilação com a enzima SAP (fosfatase alcalina de camarão -

Promega).

Essa enzima remove o grupamento fosfato da extremidade 5’ de DNAs fita-dupla,

impedindo desse modo a auto-ligação. Para essa reação, foram incubados cerca de 1 µg de

DNA, 2U de enzima e o seu tampão apropriado. O sistema foi então incubado a 37ºC por

1 hora e inativado por 20 minutos a 65ºC.

3.2.6) Reação de polimerização de extremidades de DNA utilizando o fragmento Klenow

da DNA polimerase I (Invitrogen).

Para a extensão das extremidades coesivas geradas por meio de digestão com

enzima de restrição, utilizou-se a mistura de dNTP na concentração final da reação de

1mM e 0,5U de enzima para cada 100 ng de material utilizado na digestão. O tampão

utilizado foi o tampão da própria enzima de restrição utilizada para a digestão do DNA,

visto que o fragmento Klenow tem atividade ótima em qualquer tampão. A reação ocorreu

a 37ºC durante 40 minutos e depois a enzima foi inativada a 65º C por 20 minutos.

3.2.7) Reação de anelamento de oligonucleotídeos

100ρmoles de cada oligonucleotídeo foram colocados em um microtubo de 1,5mL,

juntamente com 6,6 µL de tampão de anelamento e água MiliQ para um volume final de

µL. Essa mistura foi fervida durante 10 minutos, e depois a temperatura do banho foi

caindo lentamente, até que fosse atingida a temperatura ambiente. Esse processo durou

cerca de 3 horas. A partir daí, os oligonucleotídeos anelados já estavam prontos para a

reação de ligação aos vetores plasmidiais.

3.2.8) Análise de DNA em gel de agarose (Sambrook e Russel, 2001).

A agarose foi derretida em tampão TEB 1X (gel de análise) ou TAE 1X (gel de

eluição) no microondas. Após o resfriamento do gel, adicionou-se brometo de etídeo a

uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após a gelificação, o gel foi colocado em uma cuba

de eletroforese com tampão de corrida (TEB ou TAE 0,5 X) e submetido a uma corrente

elétrica. À amostra contendo o DNA a ser analisado, foi adicionado o tampão de amostra

para a concentração de 1X. Após a corrida, o DNA foi visualizado a partir da incidência

de luz ultravioleta.

3.2.9) Ligação de fragmentos de DNA

As concentrações de DNA (vetor e inserto) utilizadas nos sistemas de ligação

variaram de acordo com o experimento, sendo normalmente uma razão molar que variou

de 1:1,5 a 1:5, aplicando-se a seguinte fórmula:

ηg vetor x tamanho do inserto em pb x razão inserto = ηg de inserto

tamanho do vetor em pb vetor

As reações de ligação foram preparadas em tampão de ligase 1X contendo 1U de

T4 DNA ligase. Os sistemas possuíam 10 a 20 µL de volume final, sendo incubados por

16 horas a 16ºC ou 4ºC, dependendo do tipo de extremidade do DNA. Após este período,

o sistema foi transformado em células competentes de E. coli.

3.2.10) Sequenciamento de DNA com o kit DYEnamic ET DYe Terminator Cycle

Sequencing kit for MegaBACE (Amershan Pharmacia Biotech)

As reações de sequenciamento foram realizadas conforme as instruções do

fabricante. Os parâmetros de ciclagem da PCR utilizados são mostrados a seguir:

- desnaturação: 94ºC por 20 segundos

- anelamento: 50ºC por 15 segundos

- polimerização: 60ºC por 1 minuto

25 ciclos

Em seguida, a reação de PCR foi precipitada e o DNA ressuspendido. Após estes

tratamentos, realizou-se a reação de sequenciamento no aparelho MegaBACE 500 Plus,

que ocorreu por 100 minutos a 9 kVa. As seqüências foram depositadas no banco de dados

do Laboratório de Biologia Molecular (https://www.biomol.unb.br/), sendo a qualidade

das mesmas analisadas com o programa PHRED (Ewing et al, 1998).

3.2.11) Precipitação de DNA utilizando glicogênio como carreador.

O volume do material a ser precipitado foi aferido. Em seguida, acrescentou-se, na

ordem, 3µL de glicogênio 20mg/mL, 1/10 do volume de acetato de sódio 3M pH 5,0 e 2

volumes de etanol 100 % gelado. O sistema de precipitação foi incubado a – 20ºC durante

a noite. No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por 45 minutos a

4ºC. Descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi lavado com 200µL de etanol 70%

(v/v) gelado, centrifugando-se a 12.000 x g por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e o sedimento foi deixado à temperatura ambiente por cerca de 15 minutos para

secar.

3.2.12) Cultura de células

Durante toda a manutenção da cultura, as células foram observadas em no

microscópio invertido de constraste de fase NIKON DIAPOH.

Congelamento de células eucarióticas – Criopreservação (Ruggiero, 2002)

1 – As células em cultura aderente foram lavadas 3 vezes com BSS.CMF. Após esse

procedimento, foram adicionados 3mL de tripsina para que as células se soltassem da

garrafa de cultura.

2 – A suspensão celular foi transferida para um tubo falcon de 15mL, ao qual se adicionou

3mL de meio apropriado (dependendo do tipo celular) com SFB, para a inativação da

tripsina.

3 – As células foram centrifugadas a 130 x g por 8 minutos.

4 – O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso no meio de cultura

remanescente do tubo.

5 – As células foram distribuídas em alíquotas de 500µL em criotubos, onde foram

adicionados 500µL de meio de congelamento. Os criotubos foram identificados com nome

da linhagem celular e data do congelamento.

6 – Os criotubos foram incubados a 4ºC por 30 minutos, depois a – 20ºC por 30 minutos e

depois a – 80ºC durante a noite. As células poderiam permanecer estocadas a esta

temperatura ou ser transferidas para a estocagem em nitrogênio líquido.

Descongelamento de células eucarióticas (Ruggiero, 2002)

1 – Os criotubos foram transferidos para um banho de 37ºC até o total descongelamento

das células.

2 – As células foram plaqueadas em densidade de 2 x 10

células por garrafa de 25cm

meio adequado com SFB.

Tripsinização e inóculo celular (passagem de células) (Ruggiero, 2002)

1 – Este procedimento foi realizado quando as células atingiram a confluência de 90% na

garrafa.

2 – O meio de cultura da garrafa foi descartado.

3 – A monocamada de células aderentes foi lavada 3 vezes com cerca de 1mL de

BSS.CMF.

4 – Foram adicionados 3mL de tripsina.

5 – Após 3 minutos, as células começaram a se descolar da superfície da garrafa.

6 – A tripsina foi neutralizada com cerca de 3mL de meio com SFB.

7 – A suspensão celular foi transferida para tubos falcon de 15mL, e centrifugados a

130 x g por 8 minutos.

9 – O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 3mL de meio com SFB.

10 – Foram transferidas 10

células por garrafa de 25 cm

contendo 5mL de meio com

SFB. As células foram repicadas a cada confluência, que ocorria geralmente a cada 2 dias.

As garrafas foram incubadas na estufa a 37ºC com 5% de CO

e 70% de umidade.

Estimativa do número de células por meio de contagem em câmara de Neubauer

(adaptado de Spector et al, 1998)

1 – As células foram tripsinizadas e ressuspensas em 1mL de meio de cultura.

2 – A câmara de Neubauer foi coberta com a lamínula e foram aplicados 10µL de

suspensão de células em cada compartimento da Câmara. Caso alguma diluição tivesse

sido necessária, o número de células contado era multiplicado por esse fator de diluição.

3 – As células foram observadas em microscópio óptico (na objetiva com aumento de 40

vezes) e contadas nos quadrantes. Em seguida, foi utilizada a fórmula:

número de células contadas X fator de diluição X 10

= nº de células / mL

número de quadrantes contados

Viabilidade celular (adaptado de Spector et al, 1998)

1 – As células foram tripsinizadas e transferidas para um tubo falcon de 15mL, ao qual se

adicionou 3 mL de meio com SFB.

2 – As células foram centrifugadas a 130 x g por 8 minutos.

3 – O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 3mL de meio de cultura

remanescente.

4 – Vinte microlitros da suspensão celular foram incubados com 80µL da solução de Azul

de Tripan (diluição de 5 vezes da cultura).

5 – A câmara de Neubauer foi montada, e nela aplicou-se um volume de 10µL da mistura.

6 – Foram contadas 200 células, entre viáveis (transparentes) e não-viáveis (azuis). A

célula não-viável tem a membrana celular mais permeável, e por isso, o corante entra na

célula, tornando-a azul. Após a contagem, foi estabelecida a porcentagem de células

viáveis.

Transfecção utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen - n

de catálogo

11668019)

1 – Em uma placa de cultura de 24 poços foram semeadas cerca de 5 x 10

células por

poço, adicionando-se em seguida 500µL de meio contendo SFB.

2 – As células foram incubadas em estufa a 37ºC, 5% de CO

e 70% de umidade durante a

noite, até que se atingisse a confluência de 90%.

3 – No dia seguinte, a monocamada celular foi lavada com 200µL de BSS, e depois se

adicionou 500µL de meio de cultura sem soro.

4 – O DNA a ser transfectado foi diluído em meio de cultura sem soro. Para placas de 24

poços, a quantidade a ser utilizada é: 800 ng de DNA para um volume final de 50µL,

completado com meio sem soro.

5 – O reagente lipídico também foi diluído em meio de cultura sem soro. Para placas de 24

poços, a quantidade de lipídeo a ser utilizada é 2µL, para um volume final de 50µL.

6 – As duas diluições, do DNA e do lipídeo, foram misturadas e incubadas a temperatura

ambiente por 15 minutos.

7 – Após este período, a mistura foi adicionada lentamente sobre o poço em movimentos

cruciformes (no total, foram adicionados 100µL da mistura por poço).

8 – As células foram incubadas a 37ºC com 5% de CO

e 70% de umidade.

9 – Transcorridas 5 horas após a transfecção, o meio de cultura sem soro foi trocado para

um meio de cultura com soro. Em seguida, a placa foi incubada durante a noite nas

mesmas condições descritas no passo 8.

10 – No tempo de 24 e 48 horas pós-transfecção as células foram submetidas ao ensaio de

leitura da atividade da luciferase.

Curva de morte celular e transfecção estável (adaptado de Spector et al, 1998).

Para a obtenção de clone estável e que expresse o gene de interesse é necessário

determinar a concentração mínima requerida do agente seletivo que leve à morte de

células não transfectadas (controle).

1 – Para a seleção com Higromicina B, foram testadas concentrações que variavam de 50 a

550µg/mL.

2 – As células foram semeadas (com meio contendo 10% de SFB) para que no dia

seguinte fosse atingida a confluência de 20 % em placas de 24 poços (10

células). As

placas foram incubadas a 37ºC, 5% de CO

e 70% de umidade.

3 – No dia seguinte, o meio de cultura foi trocado por meio contendo concentrações

variadas de Higromicina (50, 150, 250, 350, 450 e 550µg/mL) e 10% SFB.

4 – O meio de cultura com antibiótico foi trocado a cada 48 horas, e as células foram

visualizadas diariamente ao microscópio, por um período de até 14 dias, até que fosse

determinada a concentração onde a maioria das células não-transfectadas morresse.

5 – Após a determinação da concentração do antibiótico a ser usada, a população mista de

células transfectadas estavelmente foram passadas para garrafas de 25 cm

, e a partir daí

mantidas com metade da concentração de Higromicina até a obtenção dos clones estáveis

finais.

6 – Para células CHO-K1, a concentração mínima de antibiótico a ser utilizada foi

determinada em 100µg/mL, e o tempo para que as células do controle morressem foi de 10

dias (durante a observação, verificou-se que a concentração de 50µg/mL não matava as

células em 14 dias, e que a concentração de 150µg/mL matava as células com apenas 6

dias, então optou-se pela concentração intermediária, de 100µg/mL).

7 – Após a transfecção desta linhagem celular em placas de 24 poços com os plasmídios

contendo os plasmídios com luciferase, intron A e os oligonucleotídeos Z3 e Z5, as células

foram mantidas durante 10 dias com meio de cultura contendo 10% de SFB e 100µg/mL

de Higromicina B.

8 – Após este período, verificou-se que todas as células do controle morreram. As células

que foram transfectadas com o DNA plasmidial contendo a marca seletiva ainda foram

mantidas nas placas de 24 poços por mais 4 dias (com meio contendo 10% de SFB e 100

µg/mL de higromicina B), até que a confluência deste poço chegasse a 90%.

9 – Em seguida, as células do poço foram tripsinizadas e transferidas para garrafas de 25

10 – Após 1 semana, as células (ainda mantidas com a mesma concentração de

antibiótico) atingiram a confluência de 90% na garrafa.

11 – A população mista de células estáveis foi tripsinizada e transferida para um tubo

falcon de 15mL, ao qual se adicionou meio com SFB para a inativação da tripsina.

12 – O tubo foi centrifugado a 130 x g por 8 minutos.

13 – O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido em 5mL de meio de

cultura.

14 – Em seguida, as células foram contadas na câmara de Neubauer.

15 – Após a contagem, foram feitas diluições seriadas de 0,1 célula por poço, 1 célula por

poço e 10 células por poço, em placas de 96 poços (8 poços para cada diluição para cada

construção). Ao poço foi adicionado 100µL de meio com 10% de SFB e 50µg/mL de

Higromicina B.

16 – As células na placa foram observadas durante 1 semana no microscópio de contraste

de fase invertido. Quando era possível observar um pequeno aglomerado celular, que

possuía aproximadamente 3 a 5 células agrupadas em um formato circular, considerava-se

que no poço havia um clone estável. Se houvesse mais de um aglomerado celular no poço,

ele era excluído da análise, pois não eram clones isolados, e sim uma população mista.

17 – Este clone foi propagado da placa de 96 poços para uma de 48 poços, e em seguida

para uma garrafa de 25 cm

, ainda contendo antibiótico a 50µg/mL e SFB a 10%. A partir

de então, as células já poderiam ser congeladas.

3.2.13) Ensaio de atividade da luciferase utilizando o Kit Dual Luciferase Assay System

(Promega – nº de catálogo E1910)

Os ensaios foram realizados em um Luminômetro TD – 20/20, Turner Designs,

com tempo de atraso de pré-leitura (premeasurement delay) de 5 segundos e tempo de

leitura (measurement) de 30 segundos. Todos os ensaios foram feitos com triplicatas de

cada amostra, em placas de transfecção de 24 poços, e cada ensaio foi repetido pelo menos

três vezes.

Este kit permite a leitura simultânea da atvidade de 2 luciferases distintas, a

luciferase de vaga-lume (V) e a luciferase de Renilla (R). O valor da atividade apresentada

pela primeira enzima é dividido pelo valor da atividade da segunda enzima, que funciona

como um controle para minimizar diferenças na eficiência de transfecção. Assim, os dados

apresentados nos gráficos indicam a razão entre a atividade de V/R.

Após a abertura do kit, o tampão Luciferase Assay Buffer (tampão de ensaio da

luciferase) foi utilizado para ressuspender o Luciferase Assay Substrate, sendo que este

reagente foi utilizado como substrato da luciferase de vaga-lume. A este reagente deu-se o

nome de LAR II, e este foi aliquotado em tubos de 1,5mL e estocado a – 80ºC. O tampão

Stop and Glo Buffer também foi aliquotado em tubos de 1,5mL e estocado a - 20ºC. O

subtrato Stop and Glo Substrate 50X foi diluído no tampão para a concentração 1X

somente na hora do uso, pois esse reagente é muito sensível à degradação. Esse reagente,

após a diluição, foi utilizado como substrato para a luciferase de Renilla. Durante os

ensaios, os substratos são mantidos no gelo.

1 – No tempo de 24 e 48 horas pós-transfecção, as células transfectadas em placas de 24

poços foram retiradas da estufa de incubação, e em seguida foram lavadas com 200µL de

PBS 1X, fora do fluxo laminar.

2 – Após a lavagem, o Tampão de Lise Passiva 5X (PLB) foi diluído para a concentração

1X, e a cada poço adicionou-se 100

µL de PLB.

3 – A placa foi incubada a temperatura ambiente por 15 minutos com suave agitação, para

permitir a lise celular.

4 – Enquanto as células eram lisadas, foram preparados tubos novos de 1,5mL para leitura

das amostras, sendo que elas foram diluídas 1:1000 no próprio tampão de lise 1X.

5 – Após a lise, 20µL das amostras diluídas foram utilizados para a leitura da atividade das

duas luciferases.

6 – À amostra diluída, foram acrescentados 100µL de LAR II para a leitura da atividade da

luciferase de vaga-lume. O tubo foi homogeneizado por pipetagem e colocado no

luminômetro para a leitura. Em seguida, o valor foi anotado.

7 – Após a adição do LAR II, foram adicionados 100µL de Stop and Glo

(tampão+substrato) ao mesmo tubo de leitura. A mistura foi homogeneizada por

pipetagem e o tubo foi colocado no luminômetro para a leitura da atividade da luciferase

de Renilla. O valor foi anotado, e em seguida foi feita a razão V/R.

Os plasmídios contendo o gene repórter da luciferase de vaga-lume foram co-

transfectados na proporção 10:1 com o plasmídio pGL.73, que contém o gene repórter da

luciferase de Renilla. Com isso, a atividade da luciferase de vaga-lume das construções

testadas é normalizada de uma forma mais fácil, visto que a leitura da atividade das duas

luciferases pode ser feita sequencialmente e também no mesmo tubo, utilizando o kit

comercial Dual Luciferase Assay System (Promega).

Cada construção foi transfectada em triplicata, sendo que cada poço transfectado

fornece uma leitura da atividade da luciferase de vaga-lume e de Renilla. Com isso, haverá

três leituras para cada construção testada. Os valores obtidos na leitura da atividade da

luciferase de vaga-lume são divididos pelos valores obtidos na leitura da atividade da

luciferase de Renilla, obtendo-se uma relação V/R. Dos três valores verificados para cada

construção testada é feita uma média aritmética e o desvio-padrão para essa média. Os

valores obtidos são plotados em um gráfico comparando a eficiência de cada construção.

Cada experimento foi repetido como descrito acima pelo menos três vezes.

3.2.14) Análise estatística dos valores de atividade da luciferase

O programa utilizado para as análises estatísticas dos dados provenientes dos

ensaios de atividade da luciferase foi o Minitab versão 14.0. Os valores foram avaliados

por meio de testes de ANOVA.

3.2.15) Extração de RNA total de células de mamífero (CHO-K1) com o reagente Trizol

(Invitrogen)

Esse método baseia-se na ação do reagente comercial Trizol, que consiste em uma

solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina, promovendo a extração de RNA

em um passo único (Chomczynski e Sacchi, 1987). De acordo com a metodologia, durante

a homogeneização e lise da amostra, o Trizol mantém a integridade do RNA enquanto

rompe as células e destrói componentes celulares, como proteínas e lipídeos. Além disso,

esse é um método que pode ser utilizado tanto com pequenas quantidades de amostra ou

tecido celular quanto com grandes quantidades. A seguir é apresentado o protocolo

seguido para a extração de RNA de células de mamífero.

1 – Após a transfecção das células (6, 12, 24 e 48 horas pós-transfecção), 6 x 10

células

em um poço de 10 cm

(correspondente ao da placa de 6 poços) foram lisadas diretamente

com a adição de 1mL de Trizol no poço. As amostras foram homogeneizadas para melhor

eficiência de lise.

2 – Em seguida, o volume correspondente ao lisado celular foi transferido para microtubos

de 1,5mL e incubado a temperatura ambiente por 5 minutos, permitindo desse modo a

completa dissociação do complexo de nucleoproteínas.

3 – Foram adicionados 200µL de clorofórmio para cada mL de Trizol, misturando-se

vigorosamente por 15 segundos (com o vortex).

4 – As amostras foram novamente incubadas a temperatura ambiente por 3 minutos e

depois centrifugadas a 4.000 rpm por 10 minutos. Após a centrifugação, a fase aquosa

(superior, que contém o RNA) foi coletada em um novo microtubo, ao qual se adicionam

500µL de isopropanol. Estas foram homogeneizadas e incubadas a temperatura ambiente

por 10 minutos.

5 – As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos a temperatura

ambiente, sendo que houve a formação de um sedimento com aspecto vítreo, difícil de ser

visualizado.

6 – O sedimento do passo 5 foi lavado com 100µL de etanol 75% (v/v) e centrifugado a

12.000 rpm por 10 minutos.

7 – Descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi deixado à temperatura ambiente para

secar. Em seguida, ele foi ressuspendido em 30

µL de água MiliQ RNAse free.

3.1.16) Tratamento do RNA total extraído de CHO-K1 com DNAse RNAse free (Promega)

Após a extração e quantificação do RNA total extraído de CHO-K1, as amostras

foram tratadas com a enzima DNAse I RNAse free, uma endonuclease que degradará

somente as moléculas de DNA que por ventura estejam contaminando as amostras de

RNA. A reação foi realizada com 5µg de RNA total, tampão de reação 10X, e uma

unidade da enzima por micrograma de RNA tratado. Geralmente o volume final da reação

ficava em torno de 20µL. Em seguida, esse sistema foi incubado a 37ºC por 45 minutos, e

após este período, foi adicionada a solução Stop Solution 10X, que contém EGTA e inibe

a enzima, a uma concentração final de 1X. Por fim, o sistema foi aquecido a 65ºC por 10

minutos para a inativação da enzima. Para a remoção dos compostos que poderiam inibir

as reações subseqüentes (a de síntese da fita de DNA complementar, por exemplo), como

o EGTA, o sistema foi precipitado com 2,5 volumes de etanol 100% e 1/10 do volume de

acetato de sódio 3M, todos RNAse free. Essa mistura foi precipitada a – 20ºC durante a

noite. No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por 45 minutos a 4ºC.

O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com 100µL de etanol 75% (v/v).

As amostras foram novamente centrifugadas 12.000 x g por 15 minutos a 4ºC, e após o

descarte do sobrenadante, o sedimento foi deixado à temperatura ambiente para secar e

ressuspenso em 10µL de água MiliQ RNAse free.

3.2.17) Síntese do DNA complementar (cDNA) por meio de transcrição reversa (RT) com

a enzima transcriptase reversa Superscript III da Invitrogen.

A reação de síntese da fita de DNA complementar por meio de transcrição reversa

foi realizada com células de mamífero da linhagem CHO-K1 que foram transfectadas com

os plasmídios construídos neste trabalho. Os RNAs tratados com a DNAse RNAse free

foram utilizados como molde para a reação.

1 – A fita de cDNA foi sintetizada utilizando-se 2µg de RNA total tratado com DNAse.

2 – Adicionou-se 1µL de oligo(dT)

e 1µL de um mix de dNTPs a 10 mM.

3 – O volume da reação foi completado para 13µL com água MiliQ RNAse free.

4 – A mistura foi aquecida a 65ºC por 15 minutos e incubada no gelo por pelo menos 1

minuto.

5 – Após breve centrifugação, aos componentes da reação foram adicionados 4µL do

tampão 5X de síntese de cDNA, 1µL de DTT a 0,1M, 1µL de RNAse OUT e 1µL de

SuperScript III.

6 – A reação foi incubada a 50ºC por 1 hora e inativada por 15 minutos a 70ºC.

7 – O cDNA sintetizado era então utilizado para amplificação por PCR, geralmente 4µL

da amostra.

3.2.18) Reação de qPCR (PCR quantitativa) utilizando os cDNAs preparados a partir de

amostras de RNA de CHO-K1 tratadas com DNAse I RNAse free

Este experimento visa verificar os níveis de expressão do mRNA de luciferase das

construções transfectadas em CHO-K1 para avaliar se a quantidade dos transcritos

corresponde à atividade da luciferase observada nos ensaios. Para isso, a máquina cuja

reação foi preparada foi a 7500 Fast Real-Time PCR System, da Applied Biosystems. O

programa utilizado para a leitura da corrida foi o 7500 Fast System SDS Software, versão

1.3.1. Foi feita uma reação de qPCR relativa, ou seja, o valor obtido correspondente aos

níveis de mRNA da amostra será comparado relativamente ao valor dos níveis de mRNA

de um controle. No nosso caso, foi feita uma comparação entre os valores dos níveis de

mRNA de luciferase de vagal-me (target) e de Renilla (endogenous). Foi feita também

uma reação com GAPDH, para verificar se a amplificação das amostras foi homogênea,

mas os valores dos níveis de mRNA de GAPDH não foram utilizados para os cálculos.

Para a reação de PCR, utilizou-se o kit Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-

UDG (2X), da Invitrogen. Esse kit contém a enzima Taq, o corante SYBR Green, a

mistura de dNTP, e a enzima UDP, que impede a reamplificação de transcritos durante os

ciclos da reação. Para este experimento, que foi realizado em placas específicas de 96

poços, a reação padrão foi a seguinte:

SYBR Green Mix 2X 5 µL

Primer 1 (10 mM) 0,2 µL

Primer 2 (10 mM) 0,2 µL

cDNA (diluído 1:50) 2 µL

O MiliQ 2,6 µL

Volume final 10

µL

Após a pipetagem da reação na placa, que ocorreu dentro do fluxo laminar, foi

ajustado o padrão de ciclagem da PCR no programa 7500 Fast System SDS Software, que

é descrito a seguir:

Estágio 1 – Ativação/Inativação da enzima UDP

1) 50°C 2 minutos

2) 95°C 5 minutos

3) 95°C 20 segundos

Estágio 2 – Ciclagem

4) 95°C 3 segundos

5) 60°C 30 segundos

O estágio 2 foi repetido 40 vezes.

A placa foi bem selada com um adesivo antes de ir à máquina. Após a reação de

PCR, foi feita uma reação que fornece uma curva de dissociação dos iniciadores

utilizados, indicando se eles formam dímeros e também se amplificam um só produto de

PCR. Os parâmetros de ciclagem para esta curva são mostrados abaixo:

1) 95°C 15 segundos

2) 60°C 1 hora

3) 95°C 15 segundos

Após a obtenção dos dados brutos, eles foram analisados por meio de uma

ferramenta existente no próprio programa, denominada Relative Quantification Study.

Nesta ferramenta, os valores correspondentes às amostras-alvo são divididos pelo valor de

uma amostra escolhida pelo próprio usuário, o calibrador. Esta ferramenta já calcula os

valores de ∆Ct, ∆∆Ct, 2

∆Ct

e 2

∆∆Ct

. Este último valor foi plotado no gráfico mostrado na

sessão de Resultados e Discussão.

A análise de quantificações relativas pode ser feita por meio do Método da Curva

Relativa Padrão ou pelo Método Comparativo de Ct (∆∆Ct). O primeiro método requer

que cada placa de reação tenha uma curva-padrão, o que demanda maior gasto de

reagentes, visto que devem ser feitas várias diluições seriadas das amostras. O segundo

método, por nós utilizado, não requer essa curva-padrão, havendo menor gasto de

reagentes. Entretanto, para a utilização deste método, deve-se estabelecer se a eficiência da

reação de PCR entre a amostra-alvo e a controle é equivalente. Feito isso, utiliza-se a

fórmula aritmética 2

-∆∆Ct

Para a determinação do ∆∆Ct, primeiro deve-se obter o Ct, que é o ciclo onde a

linha de base se intercepta com a curva de reação, denominado Threshold Cicle, ou Ciclo

de Limiar. O valor de Ct já é fornecido pela própria ferramenta de análise do programa. O

valor de ∆Ct é dado pela fórmula:

∆Ct = Ct amostra-alvo – Ct amostra controle

Utilizando os valores de ∆Ct, é possível calcular o ∆∆Ct, que é dado pela fórmula:

∆∆Ct = ∆Ct amostra-alvo – ∆Ct amostra controle

Em seguida, este último valor é submetido à fórmula aritmética 2

-∆∆Ct

e os valores

obtidos são mostrados no gráfico de análise.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1) Clonagem dos elementos gênicos

4.1.1) Clonagem do promotor de CMV sem intron (pGLCMVI-)

A expressão de proteínas heterólogas em células de mamífero esbarra em uma

questão ainda difícil de resolver: qual o melhor promotor a ser utilizado? Em seu trabalho,

Xu e colaboradores (2001) verificaram que a eficiência do promotor em um vetor

plasmidial para expressão heteróloga depende do tipo celular utilizado. Em nosso trabalho,

foi avaliado o potencial de expressão do gene repórter da luciferase em 4 linhagens de

células de mamífero distintas: CHO-K1, COS7, HEPG2 e HEK-293. Em todos os tipos

celulares estudados, foram testadas diversas construções do promotor de Citomegalovírus

(CMV).

Este promotor já foi utilizado por diversos grupos de pesquisa para a produção de

proteínas recombinantes em várias linhagens celulares (Ciafrè et al, 1998; Berdoz et al,

1999; McLean et al, 2000; Schiedner et al, 2002; Papagatsias et al, 2007; Thanaketpaisarn

et al, 2008). Alguns trabalhos mostram ainda que o promotor de CMV, juntamente com o

enhancer, é mais eficiente do que outros promotores que também são utilizados em

vetores para expressão em células de mamífero, como o promotor de SV40 e o do vírus do

Sarcoma de Rous (Mc. Lean et al, 2000; Xu et al, 2001; Gruh et al, 2008; Ogawa et al,

2007). Com base nesses estudos que demostram a eficiência do promotor/enhancer de

CMV, o nosso grupo de Imunologia Molecular vem utilizando este promotor para a

expressão e produção de anticorpos recombinantes humanizados e fatores de coagulação

sanguínea, e por isso, foi o nosso objeto de estudo.

Como neste trabalho pretendemos avaliar o potencial de otimização da expressão

gênica do promotor de CMV juntamente com o elemento em cis denominado intron A, é

necessária a construção do vetor com um gene repórter e o promotor de CMV sem o intron

A, para que posteriormente a atividade da luciferase possa ser comparada. Na figura 10 é

mostrado um esquema da clonagem do promotor de CMV sem intron A no vetor pGL4.14

(Promega), arcabouço que contém o gene repórter da luciferase de vaga-lume.

Figura 10. Clonagem do promotor de CMV sem intron, resultando no vetor pGLCMVI-.

O vetor pGL4.14 foi digerido com Hind III e tratado com o fragmento Klenow da DNA

polimerase I para a obtenção de extremidades abruptas. Em seguida, digeriu-se o mesmo vetor

com Bgl II, obtendo-se o vetor linearizado de 5800 pb para a ligação com o promotor sem

intron. Já o vetor pCMVLacI foi utilizado para a obtenção do inserto. Ele foi digerido com Sac

II e posteriormente tratado com Klenow, para a formação de extremidades abruptas. Depois, o

vetor foi digerido com Bgl II, obtendo-se um fragmento de 1200 pb, correspondente ao

promotor e enhancer de CMV, sem intron A. O vetor e o inserto foram ligados e obteve-se o

vetor pGLCMVI-, que contém o gene repórter da luciferase de vaga-lume Luc2, o gene de beta-

lactamase que confere resistência à ampicilina, gene de resistência à Higromicina B, cuja

expressão é dirigida pelo promotor de SV40, o promotor de CMV sem intron (que foi clonado),

o sinal de poliadenilação de SV40 (para o gene da luciferase) e um sinal de poliadenilação

sintético (para o gene de resistência à Higromicina B).

Digestão com Hind III

Tratamento com Klenow

Digestão com Bgl II

Bgl

Hind III/Klenow

Vetor Linearizado de 5800 pb

Sac II/Klenow

Bgl

Sac

Digestão com Sac II

Tratamento com Klenow

Digestão com Bgl II

Inserto isolado correspondente ao

promotor de CMV sem intron de 1200 pb

T4 DNA Ligase

Para a obtenção do vetor pGLCMVI-, os fragmentos de DNA obtidos após as

digestões com as enzimas de restrição indicadas na figura 10 foram analisados em gel de

agarose para eluição. As bandas correspondentes a esses fragmentos de DNA foram

cortadas do gel e eluídas por freeze-squeeze. Os fragmentos de DNA foram ligados e esta

reação transformada em células competentes XL10-gold por choque térmico. Os clones

transformantes foram analisados por perfil de restrição com as enzimas Bgl II e Pst I. Os

clones considerados positivos foram também seqüenciados com os iniciadores

seqpGL4.14, 5’pCMV e 3’pCMV.

4.1.2) Clonagem do promotor de CMV com intron A (pGLCMV)

O vetor pGLCMV é o vetor para a expressão do gene repórter da luciferase de

contém o intron A de citomegalovírus. O procedimento para a clonagem do

promotor/enhancer de CMV com intron A no vetor pGL4.14 foi o seguinte: digeriu-se

este plasmídio com Bgl II e Hind III, obtendo-se um fragmento linear com

aproximadamente 5800 pb, sendo as duas extremidades de ligação coesivas. O vetor

pCMV LacI foi digerido com as mesmas enzimas, sendo isolado um fragmento de

aproximadamente 2100 pb. O vetor e o inserto foram ligados com a enzima T4 DNA

Ligase, e este sistema de ligação foi transformado em células XL10-gold por choque

térmico. Os clones obtidos foram tiveram seu perfil de restrição analisado em gel de

agarose 0,8% com as enzimas Bgl II e Hind III, liberando o fragmento clonado em torno

de 2000 pb. Além da confirmação por digestão, a seqüência do clone positivo foi também

confirmada por seqüenciamento com os mesmos iniciadores utilizados para o vetor

pGLCMVI-. A figura 11 mostra o esquema da estratégia de construção do vetor.

Figura 11. Clonagem do promotor de CMV com intron A, resultando no vetor pGLCMV.

O vetor pGL4.14 foi digerido com Hind III e Bgl II, obtendo-se o vetor linearizado de 5800 pb

para a ligação com o promotor com intron A. Já o vetor pCMVLacI foi utilizado para a

obtenção do inserto. Ele foi digerido com Hind III e Bgl II, obtendo-se um fragmento de 2100

pb, correspondente ao promotor e enhancer de CMV com intron A. O vetor e o inserto foram

ligados e obteve-se o vetor pGLCMV, que contém o gene repórter da luciferase de vaga-lume

Luc2, o gene de beta-lactamase que confere resistência à ampicilina, gene de resistência à

Higromicina B, cuja expressão é dirigida pelo promotor de SV40, o promotor de CMV sem

intron (que foi clonado), o sinal de poliadenilação de SV40 (para o gene da luciferase) e um

sinal de poliadenilação sintético (para o gene de resistência à Higromicina B).

Digestão com Hind III

Digestão com Bgl II

Vetor Linearizado de 5800 pb

Bgl

Hind

III

Digestão com Hind III

Digestão com Bgl II

Inserto isolado correspondente ao promotor

de CMV com intron A de 2100 pb

T4 DNA Ligase

Bgl

Hin

III

Hind III

Bgl

4.1.3) Construção de versões deletadas do intron A (IA)

O potencial de melhoramento da expressão de proteínas de interesse foi avaliado

por diversos autores (Chapman et al, 1991; Xia et al, 2006; Xu et al, 2001), que

compararam a produção dos produtos por meio de análises quantitativas do sobrenadante

das culturas celulares, como ELISA e Western Blot. Entretanto, pouco se sabe sobre as

regiões específicas do intron A necessárias para a sua função, sendo que apenas uma

patente teve como abordagem a deleção de uma região do intron A (Missha e Shupisu,

2007). Desse modo, foram construídas 3 versões de vetores contendo o gene repórter da

luciferase de vaga-lume, cada uma com uma deleção distinta do intron A. Assim, busca-se

um intron mínimo que possa funcionar de maneira similar ao intron selvagem, ou melhor.

A figura 12 mostra um esquema de como foram realizadas as deleções no intron A do

vetor pGLCMV.

Figura 12. Deleções realizadas no intron A de CMV. Os quatro painéis mostram construções

com o intron A deletado (B, C e D) comparadas com a construção contendo o intron A

selvagem (A). Os triângulos azuis representam o promotor e enhancer de CMV, e os traços

pretos o intron A, inteiro ou deletado. No painel “A” estão evidenciados os três sítios de

restrição utilizados para a realização das deleções, os potenciais sítios doador e aceptor de

splicing ( ), e o ATG predito ( ) . O promotor e intron não estão em escala.

Como observado na figura 12, foram construídas 3 versões de vetores com o intron

A deletado e o gene repórter da luciferase. No painel “A” é mostrada a construção

pGLCMV, e nos painéis “B”, ”C” e ”D” as construções com as deleções de 400, 600 e

200pb, respectivamente. Elas foram denominadas pGLCMV∆400 (B), pGLCMV∆600 (C)

e pGLCMV

∆200 (D). No anexo 1 são fornecidos maiores detalhes sobre a construção das

versões deletadas do intron A.

IA ∆400

CMV

IA ∆200

IA ∆600

IA inteiro

4.1.4) Introdução de seqüências indutoras de Z-DNA no vetor pGLCMV

Tendo em vista o potencial da conformação Z do DNA de interferir na expressão

gênica (Schroth et al, 1992; Liu e Wang, 1987; Oh et al, 2002), foi adicionado ao vetor

pGLCMV, que já contém o intron A, seqüências que podem induzir a conformação Z do

DNA próximas à região do promotor de CMV. Suas seqüências podem ser verificadas na

tabela 2 da sessão Materiais e Métodos. A figura 13 mostra um esquema de como foi

realizado o anelamento dos oligonucleotídeos denominados Z1, Z3 e Z5 e a clonagem

deles no vetor pGLCMV.

OU OU

Figura 13. Anelamento dos oligonucleotídeos Z1, Z3 e Z5 e clonagem no vetor pGLCMV.

Os oligonucleotídeos foram todos anelados ao oligonucleotídeo Z0, e em seguida, as

extremidades sobressalentes foram preenchidas por meio de tratamento com o fragmento

Klenow da DNA polimerase I. Após esse tratamento, as seqüências resultantes foram clonadas

no vetor pGLCMV, entre os sítios de restrição da enzima Ssp I, evidenciados em vermelho na

região 5’do promotor de CMV.

Como foi verificado na figura 15, o oligonucleotídeo Z0 foi usado como base para

o anelamento dos outros três (Z1, Z3 e Z5). É possível verificar também pela figura e pela

análise da tabela 2 (Materiais e Métodos) que as seqüências dos oligonucleotídeos Z0 e Z5

são inteiramente complementares, sendo que desse modo, o anelamento não originará

Oligo Z0

Oligo Z3

Oligo Z5

Oligo Z1

Oligo Z0

Anelamento dos oligos,

preenchimento das extremidades

com o fragmento Klenow e

ligação no vetor pGLCMV

Ssp

Digestão do vetor pGLCMV

com a enzima de restrição Ssp I.

Os sítios estão evidenciados em

vermelho.

extremidades sobressalentes. Diferentemente das seqüências Z1 e Z3, que após o

anelamento com Z0 e extensão com Klenow resultam em alternâncias de purinas e

pirimidinas, a seqüência Z5 não possui esse padrão de repetições. Com isso, esta

seqüência não induz a formação de Z-DNA, mas funciona apenas como um controle para

a manipulação do vetor, sendo uma seqüência não-relacionada introduzida no mesmo sítio

de clonagem das demais seqüências, os objetos de estudo.

Com a análise da figura 13, observa-se que a digestão do vetor pGLCMV com a

enzima de restrição Ssp I removeu propositalmente a região inicial do promotor de CMV.

Esta região contém 4 sítios de ligação ao fator de transcrição NF1 (Hennighausen e

Fleckenstein, 1986), como foi representado na figura 6 da Introdução, sendo que eles

foram eliminados do promotor após a digestão do vetor. Segundo Chapman e

colaboradores (1991), esses sítios de NF1 na região 5’do promotor/enhancer funcionam

como moduladores negativos na expressão de transgenes em células da linhagem COS-7.

Com isso, a remoção desta região nessas construções do vetor pGLCMV com seqüências

formadoras de Z-DNA pareceu ser importante para a melhor atividade do promotor.

Após a digestão do vetor com a enzima Ssp I, o vetor linearizado e os

oligonucleotídeos (anelados e tratados com Klenow) foram ligados com a enzima T4 DNA

ligase. O sistema de ligação, antes de ser transformado, foi digerido com a enzima Ssp I, a

fim de que fossem eliminados os plasmídios que religaram. Isso impede que vários

oligonucleotídeos se liguem entre si, permitindo apenas a ligação de uma seqüência

indutora de Z-DNA no vetor. Apenas depois desse tratamento que o sistema de ligação foi

transformado em células DH5α por choque térmico. Os clones transformantes foram

analisados por digestão com a enzima de restrição Not I e por seqüenciamento. As

seqüências obtidas foram alinhadas no programa BioEdit com a seqüência predita dos

oligonucleotídeos. Na figura 14 são mostrados os alinhamentos dos clones obtidos para os

vetores pGLCMVZ5 e pGLCMVZ3. Não foi obtida nenhuma seqüência de qualidade do

vetor pGLCMVZ1, mas ele foi confirmado como sendo positivo pela digestão com a

enzima de restrição citada acima. Uma outra construção derivada da digestão do vetor

pGLCMV com a enzima de restrição Ssp I foi denominada pGLCMV∆5’, pois ela resulta

apenas da digestão do vetor e remoção da região de aproximadamente 700 pb do início

(5’) do promotor de CMV, que tinha sido descrita como inibotória COS-7 (Chapman et al,

1991).

Figura 14. Alinhamento da seqüência dos vetores pGLCMVZ5 (painel A) e pGLCMVZ3

(painel B). As seqüências obtidas por seqüenciamento automático com o MegaBace foram

alinhadas no programa BioEdit com as seqüências preditas para os oligonucleotídeos Z5 e Z3

(painel B e A, respectivamente) após o anelamento com Z0 e preenchimento das extremidades

com Klenow.

4.1.5) Construção do vetor pMACIA scFvZ22NLS

O grupo de Imunologia Molecular da UnB já utiliza o anticorpo recombinante anti-

Z-DNA denominado Z22 há mais de 10 anos (Brígido et al, 1993; Andrade et al, 2000;

Ruggiero, 2001; Vaz de Andrade et al, 2005; Burtet et al, 2007), tanto na forma scFv (do

inglês single chain fragment variable) quanto na forma FvFc, que consiste na forma scFv

com a porção cristalizável do anticorpo (Fc), ou ainda como Fab recombinante. O Fab é

um fragmento de anticorpo que contém o sítio de reconhecimento do antígeno, com uma

cadeia leve e parte de uma cadeia pesada, obtido por digestão enzimática. Apesar de já ser

conhecido e utilizado desde a década de 80 como anticorpo monoclonal, foi somente na

década de 90 que o gene codificando este anticorpo na forma scFv foi clonado,

seqüenciado e expresso em E. coli (Brígido et al, 1993). Este anticorpo reconhece o Z-

DNA, independentemente da seqüência associada à esta conformação (Brígido e Stollar,

1991).

Desse modo, a fim de verificar se as regiões onde foram clonadas as seqüências

indutoras de Z-DNA realmente promovem a formação desta conformação, foi construído

um plasmídio para transfecção em células de mamífero que continha o gene

correspondente ao fragmento scFv do Z22. Entretanto, ao contrário dos vetores já

existentes que possuem um peptídeo sinal para a secreção do anticorpo após a sua

produção, este vetor contém uma seqüência codificadora do sinal de localização nuclear

(NLS, do inglês nuclear localization signal), que direciona o anticorpo para o núcleo após

a produção. Isso porque as seqüências indutoras de Z-DNA encontram-se nos plasmídios

que foram transfectados em células de mamífero de forma transiente ou estável, e dessa

forma, permanecem no núcleo de forma epissomal ou integrada. A seqüência

correspondente ao NLS foi inserida no lugar da seqüência do peptídeo sinal, na região

5’do gene. Essa mesma construção de um vetor com o NLS depois do gene também foi

feita por Stallings e Silverstain em 2005, que verificaram a presença do NLS na região 5’

da ORF (do inglês open reading frame) do vírus da Varicella. Esta construção, alpem do

NLS, contém a proteína A e uma seqüência His-TAG para a detecção e recuperação desta

proteína. Segundo Iosef e colaboradores (2007), para a construção de uma proteína

recombinante com NLS, é fundamental que a molécula resultante tenha o tamanho

máximo de aproximadamente 40 kDa, visto que proteínas com tamanho maior têm

dificuldade para atravessar o poro nuclear. No caso da construção realizada neste trabalho,

o tamanho da proteína com o NLS, proteína A e His-TAG não ultrapassa este valor, tendo

um tamanho aproximado de 30 kDa.

Para a construção do vetor pMACIA scFvZ22NLS, foram realizadas as seguintes

etapas:

a) Realização de 2 PCRs com 2 pares de iniciadores distintos (seqüências observadas

na tabela 2 da sessão Materiais e Métodos). Na primeira PCR o vetor utilizado

como molde foi o vetor pIg16, cujo mapa esquemático foi mostrado na figura 9.

Esta PCR utiliza um par de iniciadores que amplificam o gene do fragmento

scFvZ22 e inserem a seqüência correspondente ao NLS, resultando em uma banda

correspondente a um fragmento de DNA de aproximadamente 1000 pb (figura 15).

MM 1 2 3 4 5

Figura 15. Obtenção do fragmento scFvZ22NLS – 1ª Etapa. O primeiro poço do gel mostra

o marcador de tamanho molecular 1 Kb plus da Invitrogen (MM). Em “1” e “2” são mostrados

dois controles negativos sem o DNA molde. O poço “3” é a reação sem o iniciador 5’, e o poço

“4” é a reação sem o iniciador 3’. As duas bandas que aparecem nos poços “3” e “4”

representam o DNA plasmidial utilizado como molde e que foi colocado nas reações. O poço

“5” é a reação de PCR completa, com os dois iniciadores e o DNA plasmidial molde. Na seta

foi indicado o tamanho esperado da banda de amplificação. No gel foi aplicado 1/10 do volume

total da PCR.

Os componentes utilizados para a primeira reação são mostrados a seguir:

DNA molde (50 ng) = 1 µL

Tampão 10X CenBIOT = 5 µL

dNTP 10mM = 1 µL

MgCl

50mM = 2 µL

Primer 5’ 10mM = 4 µL

Primer 3’ 10 mM = 4 µL

Taq CenBIOT (2 u/ µL) = 1 µL

Água MiliQ = 32 µL

Volume Final = 50 µL

1,65Kb

2 Kb

1 Kb

O padrão de ciclagem realizado nesta reação é mostrado abaixo:

1- 94ºC 5 minutos

2- 94ºC 1 minuto

3- 58ºC 1 minuto

4- 72ºC 2 minutos

5- ir ao passo 2 30 vezes

6- 72ºC 10 minutos

7- 4ºC indefinidamente

8- Fim

Tendo em vista o aparecimento de bandas inespecíficas na reação, tentamos

realizar a mesma PCR em outras condições: modificando a concentração de cloreto de

magnésio da reação e aumentando a temperatura de anelamento dos iniciadores. A

primeira condição não evitou o aparecimento das outras bandas no gel, e o aumento da

temperatura de anelamento não resultou no aparecimento da banda esperada na reação. A

combinação do aumento da temperatura de anelamento e da concentração de magnésio

também não resultou na amplificação de bandas no gel. Com isso, optamos por seguir os

parâmetros citados acima, que apesar de mostrarem uma amplificação inespecífica,

resultam no aparecimento do fragmento de DNA do tamanho esperado.

b) No próprio gel de agarose, visualizou-se a banda correspondente ao fragmento de

DNA do tamanho esperado. Apesar de ter ocorrido uma amplificação inespecífica

que resultou no aparecimento de mais duas bandas que representam fragmentos de

DNA de tamanhos diferentes do esperado, a banda maior foi isolada para o

próximo passo da PCR. Com uma micropipeta, inseriu-se a ponta de uma ponteira

na região do gel onde se observava a banda, com auxílio da luz UV. Recolheu-se

um pouco de líquido que continha o DNA a ser utilizado como molde para a

segunda PCR. Na segunda PCR, foram utilizados dois iniciadores que inseriram

sítios para as enzimas de restrição BamH I e Nhe I nas extremidades do gene. Estes

sítios são fundamentais para a clonagem deste produto no vetor pMACIA, que é o

vetor para a expressão heteróloga em células de mamífero. O produto dessa reação

de PCR também é um fragmento de DNA com aproximadamente 1000 pb (figura

16).

MM 1

Figura 16. Obtenção do fragmento scFvZ22NLS – 2ª Etapa. No primeiro poço do gel

mostrado na figura verifica-se o marcador molecular 1 kb plus da Invitrogen (MM). No poço

representado por “1”, observa-se a segunda reação de PCR completa, utilizando como molde o

DNA oriundo da banda de tamanho esperado do gel da primeira PCR. No gel foi aplicado 1/10

do volume total da PCR.

Os componentes utilizados nesta reação foram os seguintes:

DNA molde da primeira PCR = 4 µL

Tampão 10X CenBIOT = 5 µL

dNTP 10mM = 1 µL

MgCl

50mM = 2 µL

Primer 5’ 10mM = 4 µL

Primer 3’ 10 mM = 4 µL

Taq CenBIOT (2 u/ µL) = 1 µL

Água MiliQ = 28 µL

Volume Final = 50 µL

Os parâmetros de ciclagem da segunda PCR foram idênticos aos da primeira

reação. Neste caso, ainda apareceram algumas bandas de fragmentos de DNA

inespecíficas, mas a banda correspondente ao fragmento de DNA com tamanho esperado

era mais forte e mais nítida.

c) A banda no gel correspondente ao fragmento de DNA de 1000 pb oriundo da

segunda reação de PCR foi cortada do gel e o DNA foi purificado da agarose por

freeze-squeeze. O fragmento de DNA resultante foi ligado no vetor pGEM T-easy,

da Promega, com a enzima T4 DNA Ligase. Este vetor possui extremidades

1 Kb

1,65 Kb

2 Kb

coesivas com o desoxinucleotídeo timidina. Em produtos de PCR amplificados

com a enzima Taq polimerase, há a formação de extremidades contendo um

nucleotídeo de adenosina. A seqüência do clone considerado positivo é observada

na figura 17.

L A T M A P K K K R K V G K V Q L V E S G G G L V Q

1 GGCTAGCCACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTAGGTAAGGTGCAACTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAG 80

P K G S L K L S C A A S G F N F N T Y A M N W V R Q A

81 CCTAAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCAACTTCAATACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGC 160

P G K G L E W V A R I R S K S N N Y A T Y Y A D S M

161 TCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAATGA 240

K D R F T I S R D D S E N M L Y L Q M I N L K A E D T

241 AAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCAGAAAACATGCTCTATCTGCAAATGATCAACTTGAAAGCTGAGGACACA 320

A M Y Y C V R Q A Y S N Y G A M D Y W G Q G I S V T V

321 GCCATGTATTACTGTGTGAGACAGGCATATAGTAACTACGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATTTCAGTCACCGT 400

S S R G G G G S G G G G S G G G G S D L Q M T Q T T

401 CTCCTCTAGAGGTGGGGGCGGTTCGGGTGGCGGGGGCTCGGGCGGGGGAGGCTCAGATCTCCAGATGACGCAGACTACAT 480

S S L S A S L G D R V T I S C S A S Q G I S N Y L N W

481 CCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGTAATTATTTAAACTGG 560

Y Q Q K P D G T V K L L I Y Y T S R L H S G V P S R F

561 TATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTT 640

S G S G S G T D Y S L T I S N L E P E D I A T Y F C

641 CAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCAGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTATTTTTGTC 720

Q Q Y S K F P F T F G S G T K L E I K H H H H H G D P

721 AGCAGTATAGTAAGTTCCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACATCATCATCACCATGGTGATCCG 800

K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E E Q

801 AAAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAATGAAGAACA 880

R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L A E A K K L N

881 ACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATG 960

D A Q A P K A H H H H H H G *

961 ATGCACAAGCACCAAAAGCTCACCATCACCATCATCATGGCTA 1000

Figura 17. Seqüência do scFvZ22NLS. É mostrada a seqüência do clone 7 do vetor pGEM

scFvZ22NLS obtida por meio do seqüenciamento automático. Acima da seqüência de

nucleotídeos foi evidenciada a seqüência de aminoácidos da proteína predita. Em vermelho está

representada a seqüência do NLS. Em verde observa-se a seqüência da região variável pesada

(VH) do anticorpo, em amarelo o peptídeo conector, ou linker, em roxo a seqüência da porção

variável leve (VL) do fragmento scFv, em marrom a seqüência da proteína A e em azul o o His-

Tag.

d) O clone do pGEM scFvZ22NLS foi digerido com Nhe I e BamH I, mesmas

enzimas usadas para a digestão do vetor pMACIA (representado na figura 9). Após

as digestões dos dois vetores para a obtenção de um vetor linear e do inserto, os

fragmentos de DNA foram ligados com a enzima T4 DNA ligase, e os clones

obtidos a partir da transformação do sistema de ligação por choque térmico em

células DH5α foram digeridos com Bgl II para análise do perfil de restrição e

confirmação da clonagem final. Assim, obteve-se o vetor pMACIA scFvZ22NLS

para a co-transfecçao com os plasmídios contendo as seqüências indutoras de Z-

DNA. Um esquema da clonagem do fragmento scFv Z22NLS no vetor pMACIA

pode ser verificado na figura 18.

Figura 18. Clonagem do fragmento scFvZ22NLS no vetor pMACIA. A clonagem do

fragmento de DNA de aproximadamente 1000 pb no vetor para a expressão em células de

mamífero pMACIA (vetor com promotor de CMV e intron A) foi realizada conforme o

esquema acima. Os sítios para as enzimas de restrição utilizadas foram evidenciados em

vermelho. A seta azul identificada por “bla” é o gene da β-Lactamase, que confere resistência à

ampicilina para a amplificação dos plasmídios em bactérias.

pMACIA

5500 pb

pGEMT

scFv NLS

4000 pb

Bam HI

Nhe

Bam HI

scFvZ22NLS

Digestão com

Nhe I e BamH I

Digestão com

Nhe I e BamH I

Vetor linear de

5500 pb

Inserto de 1000 pb

T4 DNA Ligase

scFvZ22NLS

SV40-poliA

pMACIA

scFvZ22

NLS

6500 pb

NLS VH L VL PA HT

4.2) Determinação dos níveis de expressão gênica das diferentes construções em

células de mamífero

4.2.1) O Cultivo de diversas linhagens de células de mamífero

Neste trabalho foram utilizadas as seguintes linhagens para a transfecção transiente

dos plasmídios contendo o gene repórter da luciferase: CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-

293. A linhagem CHO-K1 foi cultivada com meio HAM-F12 suplementado com 10%

(v/v) de SFB. As linhagens COS-7 e HEK-293 foram crescidas em meio DMEM, também

contendo 10% de SFB. Por fim, a linhagem HepG2 foi cultivada em meio RPMI com 10%

de SFB. Todas as garrafas foram mantidas na estufa a 37ºC, 70% de umidade e 5% de

. Quando o meio de cultura tornava-se amarelado (significando maior acidez), as

células eram tripsinizadas e passadas em menor quantidade para as garrafas. Após três

passagens (metodologia descrita na sessão Materiais e Métodos), as células já estavam

prontas para serem transfectadas com os plasmídios contendo os elementos a serem

testados.

4.2.2) Transfecção Transiente

Após o número mínimo de passagens requeridas para a transfecção, as células

foram transferidas para placas de cultura de 24 poços e transfectadas com os plasmídios de

interesse utilizando-se o lipídio catiônico Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Em todas as

linhagens celulares estudadas, foram testadas as seguintes construções por meio de

transfecção transiente: os plasmídios contendo o gene repórter da luciferase com o

promotor de CMV sem intron, com intron A inteiro e deletado (deleções de 200 pb, 400

pb e 600 pb). Nas linhagens CHO-K1 e COS-7 foram testadas a construção que contém o

promotor de CMV deletado na região 5’ e com intron A inteiro. Por fim, apenas na

linhagem CHO-K1 foram testadas todas as construções com intron A e oligonucleotídeos

indutores de Z-DNA (Z1, Z3 e Z5).

4.2.2.1) Efeito do intron A inteiro na atividade da luciferase nas linhagens celulares

CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293

As construções pGLCMVI- e pGLCMV, que contêm respectivamente o promotor

de CMV sem o intron A e com o intron A inteiro, foram transfectadas transientemente em

CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293, e após a transfecção a atividade da luciferase foi

medida 24 e 48 horas após a transfecção. Na figura 19 são mostrados os gráficos

referentes a esses valores em todas as linhagens celulares citadas. Cada gráfico representa

um experimento significativo de três repetições realizadas.

Ensaio de Atividade da Luciferase em CHO-K1 -

Efeito do intron A

0,1

100

1000

pGLCMVI- pGLCMVIA

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em COS-7 - Efeito

do intron A

0,01

0,1

100

1000

pGLCMVI- pGLCMVIA

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em HpG2 - Efeito

do intron A

0,1

100

1000

pGLCMVI- pLGCMVIA

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em HEK-293 -

Efeito do intron A

0,1

100

1000

10000

pGLCMVI- pGLCMVIA

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Figura 19. Efeito do intron A inteiro na atividade da luciferase em CHO-K1 (painel A),

COS-7 (painel B), HepG2 (painel C) e HEK-293 (painel D). As construções referentes aos

plasmídios com o gene repórter da luciferase de vaga-lume e promotor de CMV sem intron A

(pGLCMVI-) e com intron A (pGLCMV) foram transfectadas em quatro linhagens de células

de mamíferos e posteriormente mediu-se a atividade da luciferase 24 e 48 horas pós-

transfecção. O asterisco vermelho indica que os valores apresentados são estatisticamente

significativos, com P<0,05.

pGLCMV

Os resultados acima mostram a grande eficiência do intron A para a melhora da

atividade da luciferase induzida em condições de transfecção transiente, sendo que foram

observados aumentos de 100 até quase 1000 vezes da atividade da enzima, dependendo da

linhagem celular. Destaca-se a linhagem celular HEK-293, que apresentou os maiores

níveis de atividade da luciferase. Este dado corrobora a afirmação de que esta linhagem

celular é uma das mais eficientes para a obtenção de níveis significativos de proteínas em

transfecções transientes (Durocher et al, 2002). O intron A já foi utilizado na sua forma

inteira em diversos trabalhos (Tripathy et al, 1996; Chapman et al, 1991; Xu et al, 2001;

Xia et al, 2006), sendo que em todos os estudos foi mostrado que este elemento tem um

grande potencial de otimização da expressão gênica, com aumentos de 2 a 9 vezes da

expressão do produto de interesse, dependendo do tipo celular utilizado e da proteína

produzida. Apesar destes aumentos observados na literatura serem bem menores do que os

apresentados neste trabalho, deve-se considerar que o tipo de ensaio é diferente. Na

maioria dos autores analisados, o estudo comparativo foi realizado com proteínas

secretadas e que sofrem modificações pós-traducionais, como glicosilação. Nossos ensaios

foram feitos verificando a atividade da enzima luciferase, que é uma proteína menos

complexa que as dos demais estudos, tendo produção intracelular e não apresentando

nenhuma modificação pós-traducional. Com isso, os dados de aumento da atividade da

luciferase mostram o real potencial de otimização da expressão gênica do intron A sem a

influência de fatores complicadores, como a complexidade da proteína de estudo, dos tipos

celulares e de suas capacidades de secreção.

No trabalho de Xu e colaboradores (2001) demonstrou-se também que o intron A,

dentre os outros introns utilizados (intron da β-actina e intron quimérico), foi o que

apresentou melhor eficiência de expressão gênica (in vivo e in vitro) dentre todas as

linhagens de células de mamífero por ele testadas. Nos experimentos in vitro, os aumentos

em relação aos introns da β-actina e quimérico variaram de 3 a 8 vezes, dependendo da

linhagem celular. A atividade dos outros dois introns era similar. Nos experimentos in

vivo, o aumento foi de 2 vezes para células hepáticas e 4 vezes para células musculares.

Com isso, os resultados obtidos corroboram os dados da literatura, que mostram o intron A

como um importante elemento para a otimização da expressão gênica.

4.2.2.2) Efeito das deleções do intron A na atividade da luciferase nas linhagens celulares

CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293.

Uma vez definida a ação positiva da presença do intron A, passamos a tentar a

delimitar a região capaz de exercer essa atividade, com o objetivo de tentar identificar

introns mais curtos com menor impacto nos vetores utilizados. Foram feitas construções

em que o intron A foi deletado em algumas regiões, a fim de verificar a porção mínima do

intron que fosse funcional. As diferentes construções com o intron A deletado estão

descritas na figura 13. Todas elas foram transfectadas de forma transiente em CHO-K1,

COS-7, HepG2 e HEK-293, e 24 e 48 horas pós-transfecção foi medida a atividade da

luciferase. Na figura 20 são mostrados os gráficos com os valores relativos da atividade da

luciferase para as quatro linhagens de células destacadas. Cada gráfico representa um

experimento significativo de três repetições realizadas.

A B

Ensaio de Atividade da Luciferase em CHO-K1 -

Efeito das deleções do intron A

100

200

300

400

500

600

Intron A d200 d400 d600

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em HepG2 -

Efeito das deleções do intron A

100

200

300

400

500

600

700

pGLCMVIA ∆200 ∆400 ∆600

Unidades relativas de luminescência

(V/R)

24 h

48 h

C D

Ensaio de Atividade da Luciferase em COS-7 - Efeito das

deleções do intron A

100

150

200

250

300

pGLCMVIA ∆200 ∆400 ∆600

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em HEK-293 - Efeito das

deleções do intron A

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

pGLCMVIA ∆200 ∆400 ∆600

Unidades relativas de Luminescência

(V/R)

24 h

48 h

Figura 20. Efeito das deleções do intron A na atividade da luciferase em CHO-K1 (painel A), HepG2 (painel B), COS-7 (painel C) e HEK-293 (painel D).

As construções referentes aos plasmídios com o gene repórter da luciferase de vaga-lume e promotor de CMV com intron A (pGLCMV), intron A deletado em

200 pb (∆200), intron A deletado em 400 pb (∆400) e intron A deletado em 600 pb (∆600) foram transfectadas em quatro linhagens de células de mamíferos e

posteriormente mediu-se a atividade da luciferase 24 e 48 horas pós-transfecção. Os asteriscos vermelhos indicam que os valores apresentados têm diferença

estatisticamente significativa, com P<0,05. Os asteriscos verdes indicam que não há diferença significativa entre o valor de pGLCMV∆600 e de pGLCMV para as

linhagens celulares em questão.

pGLCMV

∆200

∆400 ∆600

pGLCMV

Os valores mostrados nos gráficos acima indicam que as construções com intron

A deletado funcionam tão bem quanto ou até melhor do que a construção com intron A

selvagem. A deleção de 200 pb no intron A foi a que apresentou melhores resultados em

relação ao aumento da atividade da luciferase, que foi de aproximadamente 4 a 6 vezes,

dependendo da linhagem celular.

A deleção de 400 pb, ao contrário, resultou em uma queda brusca da atividade

da luciferase em todas as células estudadas, sendo que essa redução chegou a mais de 10

vezes. A deleção de 600 pb melhorou a atividade da luciferase apenas em HepG2 (em

torno de 3 vezes) e em CHO-K1 (em torno de 2 vezes), enquanto que nas outras células

essa construção não mostrou uma diferença significativa na atividade da luciferase

quando comparada com a atividade da construção com intron A inteiro. É importante

ressaltar também que os valores da atividade da luciferase na linhagem celular HEK-

293 foram os maiores dentre todas as linhagens celulares estudadas, o que pode ser

verificado pela análise da escala dos gráficos, que é 10 vezes maior em HEK-293 do

que nas outras três linhagens.

Uma possível explicação para os valores obtidos das deleções no intron A está

na presença de um sítio de ligação a um fator inibidor da transcrição na região de 200

pb deletada na construção pGLCMV∆200. Com a remoção desta região, o fator não

mais se ligaria e consequentemente não inibiria a atividade da luciferase. Porém, no

intron A inteiro essa região está presente e mesmo assim não se observa um efeito de

modulação negativa na atividade da luciferase. Em 1991, Ghazal e Nelson mostraram

que um sítio de ligação a um fator transcricional desconhecido é encontrado no exon 1,

e que apenas este elemento, sem o intron A, já é capaz de melhorar a expressão da

enzima CAT (do inglês chloranphenicol acetyltransferase) em quase 10 vezes em

células da linhagem HeLa. Como observado na figura 6 da Introdução, o exon 1 contém

a região 5’UTR do mRNA do gene IE1 de CMV. Além disso, há a presença do sítio de

ligação ao fator NF-1 (Chapman et al, 1991), que é um ativador transcricional. Portanto,

o sítio inibidor putativo, estando dentro do contexto do intron A, exon 1 e 2 teria um

efeito atenuado. Além disso, pode haver outros sítios que anulem ou atenuem o efeito

deste possível sítio de ligação a um fator inibidor localizados na região mais distal do

intron A, que em conjunto contribuiriam para o efeito do intron A na sua forma

completa. Apesar do extenso estudo sobre o intron A e o gene IE de CMV, ainda não

foram identificados ou mapeados muitos sítios para ligação de fatores transcricionais.

Apenas o trabalho de Ghazal e Nelson indicou a presença de um sítio onde se liga um

fator de transcrição desconhecido de ativação e o trabalho de Chapman e colaboradores

(1991) descreveu a presença e função do sítio para ligação ao fator NF-1. O que ainda

se encontra na literatura sobre fatores de inibição foi mostrado por Stinski (1999), relata

a ligação do fator de inibição YY1 no promotor de CMV, mas não no intron A.

A presença de um sítio de ligação a um fator de inibição da transcrição também

explicaria a redução abrupta da atividade da luciferase na construção pGLCMV∆400.

Como nesta construção não foi removida a região que pensamos conter um sítio de

ligação a um fator transcricional de inibição, ela atuará de forma a regular

negativamente a expressão do gene estudado, sendo que este efeito é verificado pela

redução significativa da atividade da luciferase. Além disso, nesta construção foram

removidos o exon 2 e o sítio aceptor de splicing, o que pode ter alguma influência para a

atividade da lucifease.

Por fim, os valores da atividade da luciferase praticamente inalterados

observados para a construção pGLCMV∆600 podem também estar relacionados à

remoção desta região de 200 pb, onde se ligaria um fator de inibição. Apesar da

remoção de 75% do elemento (o intron A, juntamente com os exons 1 e 2 contêm 800

pb, aproximadamente) e do sítio aceptor de splicing 3’, a atividade ainda permaneceu

em níveis semelhantes aos observados para a construção com o intron A inteiro para as

linhagens COS-7 e HEK-293, ou maiores, para as linhagens CHO-K1 e HepG2 . Com

isso, pode-se dizer que a atividade mínima de otimização do intron A está compreendida

nesta região contida na construção pGLCMV∆600. Outra observação a ser feita sobre

os resultados obtidos com esta construção é que o efeito é variável dependendo do tipo

celular estudado. Na região mais distal do intron A e do exon 2 pode haver algum sítio

para ligação de um fator transcricional tipo-celular-específico. A deleção desse sítio

putativo não teve efeitos detectáveis em COS-7 e em HEK-293, mas em CHO-K1 e em

HepG2 a remoção desta região promoveu um aumento significativo da atividade da

luciferase.

Ghazal e Nelson (1991) mostraram que parte da atividade otimizadora do

elemento estava contida no exon 1 devido à presença de um sítio para ligação de um

fator transcricional de ativação. Além disso, a região inicial do intron A contém um sítio

de ligação a NF1, mais forte que os quatro sítios presentes na região inicial do

promotor/enhancer de CMV (Chapman et al, 1991). Desse modo, os dados observados

neste trabalho poderiam indicar que o intron A possui um forte sítio de ligação a um

fator transcricional de inibição, mas que pode permanecer atenuado devido à presença

de outros sítios complementares de ligação a fatores ativadores. Cabe ainda mostrar que

mesmo com a remoção da região correspondente ao exon 2 e ao sítio aceptor de

splicing, a atividade da luciferase apresentada por esta construção ainda é tão boa

quanto, ou melhor, do que a atividade do intron A selvagem.

A fim de verificar se o efeito da região de 200 pb deletada no vetor

pGLCMV∆200 é em nível pré ou pós-transcricional, poderia ser feita uma construção

em que a seqüência correspondente a essa região estivesse com sua orientação invertida.

Se o efeito estiver realmente relacionado ao fato de haver uma região de ligação a um

fator transcricional no DNA, a melhora da atividade da luciferase ainda será verificada.

Entretanto, se o seu efeito residir em alguma seqüência do pré-mRNA, a inversão da

seqüência no DNA alterará os níveis da atividade da luciferase. Este experimento ainda

está em fase de andamento.

Outro efeito verificado na linhagem COS-7 no tempo de 48 horas pós-

transfecção foi a redução significativa da atividade da luciferase em todas as

construções analisadas. Entretanto, esse resultado se deve a um aumento muito maior da

atividade da luciferase de Renilla, presente no vetor pGL4.73 (Promega), em detrimento

da atividade da luciferase de vaga-lume, em valores absolutos. Este vetor comercial

utilizado como controle da transfecção contém o promotor de SV40 dirigindo a

expressão do gene repórter da luciferase de Renilla. Desse modo, fazendo-se a razão, a

atividade relativa diminui bastante. Na literatura não há relatos sobre a eficiência do

promotor de SV40 em células COS-7, mas provavelmente esse aumento repentino da

atividade da luciferase de Renilla se deve a um melhor funcionamento deste promotor

em relação ao promotor de CMV, já que a linhagem COS-7 foi desenvolvida a partir da

infecção de células CV1 com o vírus SV40 (Gluzman, 1981).

A fim de verificar se o efeito modulador do intron A e de suas deleções na

atividade da luciferase está diretamente relacionado a uma mudança na expressão do

mRNA da luciferase de vaga-lume, foi realizado um experimento de RT-PCR

quantitativa em tempo real, que será melhor detalhado a seguir. Além disso, será

verificado se o splicing do intron A nas construções com as deleções ocorre

normalmente, e se isso tem alguma relação com os valores mostrados da atividade da

luciferase.

4.2.2.2.1) Efeito do intron A inteiro e deletado na expressão do mRNA da

luciferase de vaga-lume.

Desde 1983, quando a reação de PCR (do inglês polymerase chain reaction) foi

criada, já foram descritas diversas modificações que proporcionaram o uso mais extenso

dessa tecnologia. Uma reação derivada da PCR é a PCR quantitativa em tempo real, ou

qPCR. Nesse tipo de experimento, é realizado o monitoramento do progresso da PCR na

medida em que ela ocorre, e não somente no final da reação, com a verificação do

produto que foi acumulado. Desse modo, a aferição do progresso da reação é feita a

partir do início da fase exponencial da reação, e não na fase de platô, como ocorre na

reação de PCR normal. Após a aferição dos níveis de transcritos produzidos após os

ciclos de amplificação, estes são comparados com os níveis iniciais de DNA ou RNA

molde. A qPCR é também uma metodologia mais sensível, que é capaz de detectar uma

diferença de até duas cópias de DNA ou RNA na amostra, ao contrário da detecção da

PCR normal, que é feita por meio de análise em gel de agarose corado com brometo de

etídio, uma técnica bem menos sensível.

Para o estudo dos níveis de expressão de um determinado transcrito, pode ser

realizada a RT-qPCR, a transcrição reversa do RNA total associada à reação de qPCR.

Nesse caso, o molde para a reação será o cDNA. A quantidade do cDNA obtido será

então medida a cada ciclo da reação. A quantificação da expressão de um determinado

mRNA pode ser absoluta ou relativa.

Na quantificação relativa, o que se busca é a mudança da expressão gênica em

uma determinada amostra relativa à outra amostra de referência, um controle. Um

exemplo para esse uso pode ser o estudo da mudança do padrão de expressão de um

determinado gene em resposta a um tratamento de determinada linhagem celular com

uma droga. Nesse caso, serão utilizadas as amostras de RNA no tipo celular que foi

tratado com a droga e do RNA de células não-tratadas, que será a amostra de referência.

Em nosso estudo, foi realizada uma quantificação relativa, já que se desejava

verificar a mudança da expressão do gene repórter da luciferase quando o promotor de

CMV foi modificado por meio da adição do intron A inteiro e deletado. Com isso, a

amostra de referência, ou seja, o controle a construção do promotor de CMV sem intron.

O experimento foi então realizado da seguinte forma: foram transfectadas em

células CHO-K1 as construções do vetor contendo o gene repórter da luciferase de

vaga-lume (pGLCMVI-, pGLCMV, pGLCMV

∆200, pGLCMV∆400 e pGLCMV∆600)

e Renilla. Após 6, 12, 24 e 48 horas, o RNA total das células transfectadas foi extraído,

e a partir dele foi sintetizada a fita de cDNA utilizando-se como iniciador um

oligonucleotídeos de politimidina (OligodT). A quantidade de RNA utilizada para esta

reação foi a mesma para todas as amostras.

Para a realização da reação de qPCR, foi utilizado o corante SYBRGreen, que

intercala no DNA dupla-fita (dsDNA). À medida a reação de amplificação ocorre, mais

corante se liga ao dsDNA, havendo um aumento do sinal proporcional ao aumento da

quantidade de DNA sintetizada . Após todos os ciclos de reação, o programa da

máquina para a leitura e análise dos dados fornece curvas sigmóides que representam

todo o processo da reação em cada amostra. Essas curvas são mostradas na figura 21,

sendo que cada painel representa a amplificação com um iniciador específico (os

iniciadores de GAPDH de hamster, da luciferase de Renilla e da luciferase de vaga-

lume).

Figura 21. Curvas de amplificação das amostras com os iniciadores para os genes de

GAPDH de hamster (painel A), da luciferase de Renilla (painel B) e para a luciferase de

vaga-lume (painel C). Cada linha colorida nos gráficos é de uma amostra específica, sendo

que no total foram utilizadas 24 amostras (4 tempos de extração de RNA e 6 construções –

não-transfectado, sem intron, intron A, ∆200, ∆400 e ∆600). No eixo das abscissas é

mostrado o número do ciclo da reação, e no eixo das ordenadas o valor de leitura da

florescência do corante (Rn).

As curvas sigmóides indicam que a fase exponencial de amplificação começa a

ocorrer em ciclos variados, dependendo da amostra e do iniciador utilizado. Quanto

menor é o ciclo onde se iniciou a detecção do sinal de amplificação, maior é a expressão

do gene, já que são necessários menos ciclos para a mensuração do sinal inicial. Em

outras palavras, quanto mais à esquerda estiver a curva, mais o gene é expresso. No caso

das curvas com o iniciador de GAPDH, a variação dos ciclos de amplificação foi menor

e sempre em ciclos avançados, já que este é um controle endógeno, que é expresso

constitutivamente pela célula e em níveis inferiores daqueles encontrados para o

promotor heterólogo. Desse modo, o gene de GAPDH não sofre alterações de expressão

com a modificação da construção transfectada ou com o tempo de extração de RNA

pós-transfecção.

Após a amplificação das amostras, foi realizado um outro controle, uma reação

que é denominada dissociação dos iniciadores. Essa reação, cujos parâmetros foram

descritos na sessão de Materiais e Métodos, gera uma curva que deve ter apenas um

pico. Esse pico indica que o iniciador utilizado amplifica especificamente um produto e

que não há a formação de dímero de iniciador. A figura 22 mostra esses gráficos,

denominados curvas de dissociação.

Figura 22. Curvas de dissociação dos iniciadores dos genes GAPDH (painel A),

luciferase de Renilla e vaga-lume (painel B). Cada linha colorida é a curva de dissociação

de uma amostra específica. No eixo das abscissas dos gráficos é mostrada a temperatura de

dissociação do iniciador, e no eixo das ordenadas verifica-se a derivada dos valores de leitura

do corante SYBRGreen. No painel B, a primeira curva (com temperatura de

aproximadamente 82ºC) é a do iniciador da luciferase de Renilla, e a segunda curva (com

temperatura de aproximadamente 85ºC) é a do iniciador da luciferase de vaga-lume.

Todos os gráficos mostrados acima mostram uma única curva, indicando que os

iniciadores utilizados na reação não formam dímeros e que amplificam especificamente

um produto de PCR.

Para a análise dos dados obtidos, foi utilizada a ferramenta do programa 7500

Fast System SDS Software denominada Relative Quantification Study. Esta ferramenta

verifica os dados obtidos na placa de reação, e retorna os valores médios de Ct, que é o

ciclo de limiar (threshold). Este ciclo é obtido por meio da intersecção da linha de base

(uma linha paralela à linha do eixo das abscissas, que elimina o background) com a

curva sigmóide de amplificação das amostras.

Com a obtenção do valor de Ct para todas as amostras, o estudo da quantificação

relativa da expressão gênica pode ser feito por meio da fórmula aritmética 2

-∆∆Ct

. Este

estudo é denominado estudo pelo Método do Ct comparativo. Com o uso dessa fórmula,

não é necessário o uso de uma curva padrão, e deve ser utilizado apenas se a eficiência

de amplificação da amostra - alvo e da amostra – controle for equivalente. Quando é

usada a sonda Taqman para a amplificação, não é necessária essa verificação. Porém,

quando se usa o corante SYBRGreen, que pode gerar algum background inespecífico,

deve ser realizado um experimento de validação da reação.

Este experimento é feito por meio da reação de amostras-alvo e amostras-

controle em diferentes diluições seriadas. Os valores da diluição são quotados no

gráfico na forma logarítmica (no eixo X), e o valor de ∆Ct (o cálculo deste valor já foi

mostrado na sessão Materiais e Métodos) é colocado no eixo das ordenadas. A linha

obtida no gráfico com as amostras testadas deve ser próxima à linha de tendência, como

mostrado na figura 23. No nosso gráfico, foram feitas diluições de 1 ng, 0,1 ng e 0,001

ng das amostras com luciferase de vaga-lume e Renilla. Este experimento ainda não foi

realizado para os iniciadores de GAPDH.

Experimento de Validação da qPCR

y = 1,0055x - 3,2903

= 0,9876

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

-3 -1 0

Log da quantidade de DNA (ng)

dCt (Ct vaga-lume - Ct

Renilla)

∆Ct

Linear (∆Ct)

Figura 23. Validação da reação de RT-qPCR para a quantificação relativa da

expressão gênica da luciferase de vaga-lume. No eixo das abscissas são mostrados os

valores das diluições das amostras utilizadas na reação na forma de logaritmo. No eixo das

ordenadas é mostrado o valor de ∆Ct das amostras após a reação. Esse valor é dado pela

diferença entre o Ct da luciferase de vaga-lume pelo Ct da luciferase de Renilla.

100

A análise do gráfico acima mostra que a eficiência de amplificação tanto da

amostra alvo quanto da amostra controle é equivalente, e o estudo por meio do Método

Comparativo de Ct pode ser realizado. Com isso, foram feitos dois tipos de cálculo para

a obtenção dos gráficos que mostram os níveis relativos da expressão gênica da

luciferase de vaga-lume: no primeiro cálculo, o valor de Ct obtido com os iniciadores da

luciferase de vaga-lume foi diminuído do valor de Ct das amostras amplificadas com o

iniciador de GAPDH. Isso porque o GAPDH é o controle endógeno da célula, e deve

ser constante para todos os tempos de extração de RNA e para todas as construções

analisadas. Com esse cálculo obtém-se o valor de ∆Ct. Apesar de não ter sido feito o

experimento de validação da PCR para estes iniciadores, foi considerado inicialmente

que a eficiência de amplificação foi similar a dos dois outros genes testados. Esse valor

de todas as amostras foi posteriormente diminuído do valor de ∆Ct da construção sem

intron, que é a amostra controle (sem “tratamento”), gerando assim o valor ∆∆Ct. Por

fim, esse valor foi utilizado na fórmula aritmética 2

-∆∆Ct

, e foi quotado no gráfico

mostrado na figura 24. No segundo cálculo, os valores obtidos pela amplificação com os

iniciadores da luciferase de vaga-lume foram diminuídos dos valores obtidos com os

iniciadores da luciferase de Renilla, que é um controle de transfecção, e não um

normalizador endógeno. Os cálculos foram realizados como descrito acima, e os valores

obtidos de 2

-∆∆Ct

foram quotados no gráfico mostrado na figura 25. É importante

ressaltar que os resultados referentes aos gráficos abaixo ainda são preliminares, sendo

que devem ser realizadas mais repetições e análises mais refinadas dos dados.

Ensaio de qPCR (utilizando o normalizador GAPDH)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

6 h 12 h 24 h 48 h

Tempo de extração do RNA total pós-transfecção

2^(-ddCt)

pGLCMVI-

pGLCMV

∆200

∆400

∆600

Figura 24. Ensaio de RT-qPCR utilizando o normalizador GAPDH.

101

Ensaio de RT-PCR Quantitativa (qPCR) (utilizando

apenas o normalizador Renilla)

6 h 12 h 24 h 48 h

Tempo de Extração do RNA pós-transfecção

Valor de 2^(ddCt)

pGLCMVI-

pGLCMV

∆200

∆400

∆600

Figura 25. Ensaio de RT-qPCR utilizando o normalizador luciferase de Renilla.

A análise dos gráficos mostrados nas figuras 24 e 25 mostra que há uma

diferença do padrão de expressão relativa do gene da luciferase de vaga-lume

dependendo do gene utilizado como normalizador. Quando se utiliza o normalizador

GAPDH, as construções com intron A inteiro e as deleções dele mostram um padrão de

expressão semelhante entre os tempos de extração, sendo que a diferença está nos níveis

da expressão do gene da luciferase de vaga-lume. Nos tempos de 6 e 12 horas, a

expressão do gene é praticamente inalterada, sendo que há um pico de expressão no

tempo de 24 horas e uma redução da expressão no tempo de 48 horas. Na construção

com intron A inteiro, há uma tendência a uma estabilidade da expressão nos tempos

analisados, já que as variações são menores do que nas outras construções. Na

construção com a deleção de 200 pb, há o maior pico de expressão em 24 horas pós-

transfecção, sendo que o valor desse pico é o maior de todas as construções analisadas.

As construções com a deleção de 400 e 600 pb apresentam uma semelhança no padrão

das curvas, sendo que a curva da deleção de 600 pb está sempre acima da de 400 pb.

Isso indica que a expressão do gene da luciferase de vaga-lume é maior quando há a

deleção de 600 pb no intron A do que quando a deleção é de 400 pb. Por fim, a amostra

sem intron apresenta uma curva com comportamento distinto, apresentando uma queda

gradativa da expressão gênica ao longo do tempo, chegando a quase zero no tempo de

48 horas.

102

Entretanto, quando o normalizador utilizado foi a luciferase de Renilla, as curvas

apresentaram um padrão distinto do mostrado acima. Para as amostras sem intron, com

intron A inteiro e com a deleção de 400 pb, os valores permaneceram quase constantes

ao longo do tempo. Entretanto, de acordo com o gráfico, o nível de expressão do gene

da luciferase de vaga-lume na deleção de 400 pb do intron A é menor do que na

construção sem intron, o que não condiz com os dados da atividade da luciferase. Na

construção de 600 pb, observa-se um aumento gradativo da expressão do gene estudado

até o tempo de 24 horas, e depois há uma queda brusca da expressão. Na construção

com a deleção de 200 pb, a expressão permanece constante até o tempo de 24 horas,

havendo um grande aumento no tempo de 48 horas. Esse dado também não se relaciona

com os dados observados para a atividade da luciferase, já que ela cai no tempo de 48

horas pós-transfecção em relação ao tempo de 24 horas.

Desse modo, visto que os valores apresentados no gráfico em que se utilizou o

normalizador GAPDH se relacionam melhor com os dados da atividade da luciferase

apresentados em gráficos anteriores, parece que é melhor o uso deste normalizador em

detrimento do normalizador da transfecção, que é a luciferase de Renilla. Este é um

gene exógeno (assim como o gene alvo a ser testado), e também pode sofrer variações

distintas da expressão gênica que não foram avaliadas neste experimento e que podem

influenciar na relação dos dados. Outro ponto a ser considerado é que após a leitura da

atividade das duas luciferases é feita uma razão entre os dois valores, e não uma

subtração, e esta razão, independentemente dos valores absolutos, tem pouca variação

(exceto a variação entre os valores referentes às diferentes construções). Como para as

análises de qPCR deve ser feito o cálculo em que o valor da amostra-alvo é subtraído do

valor da amostra-controle, pode haver uma variação maior que não mostre uma

correlação entre a atividade da luciferase e a expressão do mRNA, já que as operações

aritméticas para a análise da atividade da luciferase e para a quantificação da expressão

de um mRNA por qPCR são bastante distintas. Então, apesar deste controle ser utilizado

para a normalização da atividade da luciferase, para o estudo dos níveis de expressão do

mRNA talvez seja necessária a utilização de um gene endógeno, que seja

constitutivamente expresso pela célula.

A escolha de um normalizador para qPCR é uma etapa importante da delineação

experimental, visto que pode haver alteração nos resultados se a variação da expressão

do gene controle for muito significativa (Bustin et al, 2005; Szabo et al, 2004). Foi

então realizado o teste estatístico ANOVA para analisar se havia variação entre os

103

valores de Ct das diferentes construções com os iniciadores de GAPDH e de Renilla. No

caso de GAPDH, não houve variação significativa entre os valores de Ct, resultando em

um valor de “P” igual a 0,34. Em contrapartida, os valores de Ct para as amostras

amplificadas com os iniciadores de Renilla tiveram uma variação significativa, segundo

análises estatísticas da variação do valor de Ct entre as construções, com valor de “P”

igual a 0,001. Na tabela 3 são mostrados os valores das médias de Ct de cada

construção, os valores de desvio-padrão e de “P”.

Tabela 3. Valores médios de Ct das amostras amplificadas com os iniciadores para

GAPDH e luciferase de Renilla.

Média Ct

GAPDH

Desvio-Padrão

GAPDH

Ct Renilla Desvio-padrão

Renilla

Sem Intron

(6h,12h,24h e 48h)

25,84 1,677 25,843 6,456

Intron A

(6h,12h,24h e 48h)

24,44 1,025 18,105 0,784

∆200

(6h,12h,24h e 48h)

24,85 2,054 17,733 1,725

∆400

(6h,12h,24h e 48h)

26,578 1,038 25,758 0,486

∆600

(6h,12h,24h e 48h)

24,275 2,561 18,455 0,849

P = 0,34 P = 0,001

Desse modo, tendo em vista a baixa variação da expressão do controle GAPDH,

ele foi escolhido como normalizador da reação de RT-qPCR. Em outros trabalhos

também foi mostrado que a utilização de GAPDH como controle endógeno para

experimentos de qPCR era a melhor opção dentre as testadas em diversos modelos

experimentais (Goossens et al, 2005; Liu et al, 2007; Vascotto et al, 2005; Winer et al,

1999; Goswami et al, 1997). Entretanto, alguns autores ainda criticam a utilização deste

gene em controles para experimentos de qPCR pois em algumas situações

experimentais há variações significativas da expressão gênica, como por exemplo entre

indivíduos distintos (Bustin et al, 1999), em células cancerosas (Chang et al, 1998;

Bhatia et al, 1994) e em diferentes estágios do ciclo celular de células normais humanas

(Mansur et al, 1993). Porém, em determinadas condições experimentais, como no caso

de tratamento com fármacos ou observação de mudanças celulares temporais (ciclo

104

celular, diferentes estágios de desenvolvimento), é de se esperar que haja uma mudança

global do padrão de expressão gênica, inclusive de genes considerados constitutivos.

Desse modo, a escolha do gene controle do experimento de qPCR deve ser avaliada de

acordo com o procedimento experimental a ser analisado. Como mostrado na tabela 3,

não houve variação significativa da expressão do gene de GAPDH nas condições

experimentais avaliadas neste trabalho, ou seja, entre os tempos pós-transfecção e entre

as diferentes construções analisadas. Portanto, é importante que se avalie mais de um

gene para ser utilizado como controle da reação para a fim de se determinar qual possui

a expressão mais constante na condição experimental a ser estudada (Bustin et al, 2005;

Goossens et al, 2005; Vascotto et al, 2005). Neste trabalho foram avaliados dois

possíveis genes-controle, o de GAPDH e o da luciferase de Renilla, sendo que se

estabeleceu como melhor controle o de GAPDH.

Os dados observados na figura 24 aproximam-se mais do que se esperava ao

padrão da expressão do gene da luciferase de vaga-lume. A queda gradativa da

expressão gênica observada na construção sem o intron A em relação ao tempo pós-

transfecção pode ser explicada pelo mecanismo de degradação de mRNAs denominado

NMD (nonsense mediated RNA decay). Já foi decrito que esse mecanismo é responsável

pela degradação de mRNAs com códons de terminação prematuros, além de mRNAs

oriundos de genes recombinantes sem introns, ou seja, cDNAs (Le Hir, 2003). Esse

último caso pode explicar o decaimento da expressão do gene repórter da luciferase na

construção sem intron A, já que este é um intron natural de CMV. Além disso, não se

pode descartar a possibilidade de que o intron A contenha algum elemento que possa ser

fundamental para a estabilidade do mRNA. A construção com intron A inteiro parece

realmente ter uma estabilidade maior de expressão ao longo do tempo, já que os níveis

de expressão do mRNA da luciferase de vaga-lume se alteram pouco nos tempos

estudados. Por fim, os padrões apresentados pelas construções com deleções no intron

A também correspondem aos valores da atividade da luciferase mostrados, sendo que a

construção pGLCMV∆200 tem maior expressão do gene da luciferase de vaga-lume do

que a construção pGLCMV∆600. Esta, por sua vez, apresenta maior expressão do gene

estudado do que a construção pGLCMV400, que possui o menor nível de expressão

dentre as construções com o intron A/deleções. Esse padrão se relaciona com os níveis

de atividade da luciferase observados. Entretanto, no tempo de 24 para 48 horas na

construção pGLCMV

∆200, há uma queda brusca dos níveis de mRNA da luciferase,

sendo que esta queda foi maior do que a observada nas outras construções. Este padrão

105

de expressão não condiz com o que se observa em relação aos níveis de atividade da

luciferase.

Como já foi dito anteriormente, esses experimentos ainda necessitam de maiores

ajustes, como repetições sistemáticas para a melhor avaliação do padrão de expressão

entre os tempos de extração do RNA. É também importante mencionar que a relação

entre os tempos de extração do RNA celular e da mensuração da atividade da luciferase

não são essencialmente equivalentes, visto que a produção do mRNA é sempre anterior

à produção da proteína. Em outras palavras, o tempo de extração de RNA de 24 horas

pós-transfecção não indica que esses níveis de mRNA estão presentes nas mesmas

quantidades quando a atividade da luciferase é medida 24 horas pós-transfecção. Para

que fosse feita uma melhor correlação entre os níveis do mensageiro e os da proteína

(nesse caso representados pela atividade da luciferase), seria necessária uma aferição da

atividade da luciferase em tempos anteriores ao de 24 horas pós-transfecção.

O estudo da expressão do mRNA da luciferase de vaga-lume em relação à

expressão do gene endógeno de GAPDH corrobora os dados da luciferase e apóia a

hipótese de que o aumento da atividade estaria relacionada a uma maior estabilidade

conferida ao transcrito pelo intron A. A ausência deste elemento, por outro lado,

favoreceria a degradação do mRNA provavelmente por meio do mecanismo do tipo

NMD.

4.2.2.2.2) Análise do splicing do intron A nas construções com intron A inteiro e

deletado.

O gene IE1 de CMV possui 4 exons e 3 introns, entre eles o intron A (Awasthi et

al, 2004). Este gene pode sofrer splicing alternativo, devido a um sítio aceptor de

splicing críptico no meio do exon 4, gerando uma proteína de 72 kDa quando há o

splicing normal e uma de 19 kDa quando há o splicing alternativo (Awasthi et al, 2004).

Esta mesma autora também mostrou que havia outros sítios aceptores de splicing no

chamado gene IE 2, que possui apenas um exon. Com isso, há a junção do exon 3 do

gene IE1 com regiões distintas do exon do gene IE2, formando proteínas de 86, 55 e 18

kDa (Awasthi et al, 2004). Quanto ao splicing do intron A, ainda não foi encontrado

nenhum sítio que possa substituir o sítio aceptor de splicing presente no exon 2, que foi

removido nas construções com a deleção de 400 e 600 pb do intron A.

106

Para avaliar se o splicing do fragmento do intron A nas construções em que foi

deletado o sítio aceptor ocorreu de forma normal, foi realizado um experimento com o

objetivo de amplificar o fragmento correspondente ao exon 1 (aproximadamente 100

pb) juntamente com a região inicial do exon 2 (aproximadamente 50 pb, sendo que a

região inteira tem 200 pb) após o splicing. A hipótese caso o processamento das versões

deletadas sem o sítio aceptor original ocorresse normalmente é a de que pode haver

sítios crípticos de splicing que permitam o correto processamento destas construções.

Para isso, extraiu-se o RNA total de células CHO transfectadas com as construções

pGLCMV, pGLCMV∆200, pGLCMV∆400 e pGLCMV∆600. A partir desse RNA foi

sintetizada uma fita de cDNA com um iniciador específico que reconhecia o gene da

luciferase. Depois, utilizando como molde a fita de cDNA sintetizada, foi realizada uma

reação de PCR com iniciadores que reconheciam as regiões proximais do exon 1 e do

gene da luciferase. Se a construção for processada corretamente, o fragmento de DNA

amplificado terá um tamanho aproximado de 150 pb, correspondente ao exon 1, parte

do exon 2 e parte do gene da luciferase. Qualquer outro padrão de amplificação indicará

uma forma alternativa de splicing. Na figura 26 é mostrado um esquema de como foi

realizado este experimento.

107

B) 1 2 3 4 MM

Figura 26. Análise do splicing nas construções contendo o intron A deletado.

A) Exemplo de dois mRNAs, um proveniente de uma amostra que sofreu processamento

correto e outra que não foi devidamente processada. Após a reação de PCR, as amostras

foram analisadas em gel de agarose 0,8% (B). Em “B”, “1” representa a amostra com intron

A selvagem, “2” representa a amostra com a deleção de 200 pb no intron A, “3” é a amostra

com a deleção de 400 pb no intron A e “4” é a amostra com a deleção de 600 pb no intron A.

“MM” é o marcador molecular 1 kb plus da Invitrogen. No gel foram utilizados 10 µL de um

volume total de 50 µL da reação de PCR. A seta preta indica o tamanho de banda esperado

para o transcrito normalmente processado.

mRNA processado

normalmente

(exon 1, parte do exon 2 e parte

do gene da luciferase)

mRNA não processado

(exon 1, intron A, parte do

exon 2 e parte do gene da

luciferase)

Síntese da fita de cDNA Síntese da fita de cDNA

Amplificação por PCR Amplificação por PCR

Análise das PCRs em gel de agarose 0,8%

100 pb

200 pb

300 pb

400 pb

500 pb

150 pb

550 pb (pGLCMV∆400) e

350 pb (pGLCMV∆600)

108

A figura 26 mostra que o splicing ocorreu normalmente nas construções com o

intron A inteiro e deletado em 200 pb (“1” e ”2”), visto que a banda correspondente ao

fragmento de DNA esperado tem um tamanho de aproximadamente 150 pb, que é o

tamanho aproximado do exon 1 juntamente com o exon 2. Já as amostras “3” e “4”

aparentemente não sofreram o processamento correto, já que apareceram bandas

correspondentes a fragmentos de DNA de tamanhos maiores do que 150 pb. No caso da

construção com deleção de 400 pb do intron A, o tamanho da banda observada foi de

aproximadamente 550 pb, que é o tamanho correspondente à versão não-processada da

construção. Na construção com a deleção de 600 pb, o tamanho da banda observado foi

de aproximadamente 350 pb, que também é o tamanho correspondente à versão não-

processada desta construção. Isso indica que a parte do intron A que não foi removida

nas construções com deleções de 400 e 600 pb foi amplificada na PCR, resultando no

tamanho da banda visualizado.

Desse modo, pode-se inferir que a remoção do sítio aceptor de splicing nas

construções com deleções de 400 e 600 pb no intron A impede que este seja removido

corretamente do transcrito primário, permanecendo no mRNA final. Entretanto, para a

confirmação exata de que essas bandas observadas no gel sejam mesmo os transcritos

processados e não-processados, o DNA deve ser eluído do gel e clonado em um vetor

para seqüenciamento posterior. Outro ajuste que pode ser feito neste experimento é a

utilização de outros iniciadores para que uma banda de tamanho maior seja amplificada,

melhorando assim a visualização e definição no gel.

Com relação à funcionalidade das construções para o aumento da expressão

gênica, infere-se que o correto processamento do transcrito do gene IE1 de CMV não é

fundamental para a observação deste efeito nos níveis da atividade da luciferase. Isso

porque a construção pGLCMV∆600 ainda mantém níveis tanto de expressão do

transcrito quanto da atividade da luciferase similares aos da construção selvagem

(pGLCMV). Desse modo, com o não-processamento do intron A e do exon 1, haveria a

formação de um mRNA híbrido de luciferase com a região 5’URT do gene IE1 de

CMV, mas produzindo uma proteína ainda biologicamente ativa.

4.2.2.3) Efeito da remoção da região 5’ do promotor/enhancer de CMV

Segundo Chapman e colaboradores (1991), a região entre os sítios de Ssp I na

região inicial do promotor/enhacer de CMV tem um efeito de modulação negativa para

109

a expressão de proteínas heterólogas em COS-7. Desse modo, a fim de avaliar o efeito

da deleção dessa porção inicial do promotor de CMV (que contém 2 sítios de ligação a

NF1) na atividade da luciferase em CHO-K1 e COS-7, foi feita uma construção

denominada pGLCMV∆5’. Esta construção possui o promotor de CMV deletado na

região 5’ e o intron A inteiro, e foi transfectada transientemente em CHO-K1 e COS-7

para a aferição da atividade da luciferase 24 e 48 horas pós-transfecção. Este plasmídio

foi também utilizado como arcabouço para a clonagem dos oligonucleotídeos Z1, Z3 e

Z5, cujo efeito será analisado no tópico seguinte. O gráfico da figura 27 mostra o efeito

dessa deleção na atividade da enzima repórter.

Ensaio de Atividade da Luciferase em CHO-K1 -

Efeito da deleção da região 5' do promotor

100

120

140

160

pGLCMVIA ∆5'

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Ensaio de Atividade da Luciferase em COS-7 - Efeito

da deleção da região 5' do promotor

100

150

200

250

300

pGLCMVIA ∆5'

Unidades relativas de

luminescência (V/R)

24 h

48 h

Figura 27. Efeito da deleção da região 5’ do promotor/enhancer de CMV na atividade

da luciferase em CHO-K1 (painel A) e COS-7 (painel B). Foram transfectadas as

construções com intron A inteiro (pGLCMV) e com a deleção na região 5’ do promotor de

CMV (∆5’). Os asteriscos vermelhos indicam que há diferença significativa entre os valores,

com P<0,05.

pGLCMV

110

Os valores mostrados nos gráficos da figura 27 indicam que a deleção da região

5’ do promotor de CMV diminuiu a atividade da luciferase em quase 50%, tanto em

CHO-K1 quanto em COS-7, sendo que estes valores são estatisticamente significativos.

Os dados acima não corroboram os de Chapman e colaboradores (1991), que mostraram

que a retirada desta região aumentava a expressão do FVIII humano recombinante e da

glicoproteína do vírus HIV gp120. Talvez as diferenças entre a luciferase e as

glicoproteínas expressas por Chapman et al (1991) reflitam um mecanismo não

antecipado que pode envolver a natureza do transgene. No nosso modelo de estudo, a

proteína luciferase consiste em uma proteína intracelular e sem modificações ou

processamento pós-traducional, o que difere das glicoproteína estudadas por Chapman e

colegas (1991), que têm natureza complexa quanto às modificações pós-traducionais e

aos processos celulares de secreção.

4.2.2.4) Efeito dos oligonucleotídeos indutores de Z-DNA na atividade da luciferase em

células CHO-K1 (transfecção transiente).

As construções pGLCMV, pGLCMVZ1, pGLCMVZ3 e pGLCMVZ5 foram

transfectadas transientemente em células CHO-K1, e após 24 e 48 horas, as células

foram lisadas para a aferição da atividade da luciferase. A figura 28 mostra esses

valores para as construções com os oligonucleotídeos Z1, Z3 e Z5.

Ensaio de Atividade da Luciferase em CHO-K1 - Efeito dos

oligonucleotídeos indutores de Z-DNA Z1, Z3 e Z5

100

120

140

160

pGLCMV Oligo Z1 Oligo Z3 Oligo Z5

Unidades de Luminescência (LU) -

Razão V/R

24 horas

48 horas

Figura 28. Efeito dos oligonucletídeos Z1, Z3 e Z5 na atividade da luciferase 24 e 48

horas pós-transfecção em CHO-K1. Foram transfectadas as construções com intron A

inteiro (pGLCMV) e com intron A e os oligonucleotídeos Z1 (oligo Z1), Z3 (oligo Z3) e Z5

(oligo Z5). Os asteriscos vermelhos indicam que há diferença significativa entre os valores,

com P<0,05. Os asteriscos verdes mostram que não há diferença significativa entre os

valores, com P>0,05.

* *

111

O oligonucleotídeo Z3 aumentou significativamente (em mais de 50%) a

atividade da luciferase em CHO-K1 em relação à construção com o oligonucleotídeo Z5,

como mostrado na figura 38. A atividade da construção com a seqüência Z3 é ainda

menor do que a da construção selvagem pGLCMV, já que para a clonagem do

oligonucleotídeo foi necessária a remoção da região 5’ do promotor/enhancer. Como já

foi mostrado na figura 27, a remoção desta região diminuiu a atividade da luciferase

tanto em CHO-K1 quanto em COS-7, tanto que a construção com o oligonucleotídeo Z5,

que é o controle da manipulação destes plasmídios, teve valores da atividade da

luciferase semelhantes aos da construção pGLCMV∆5’, que é apenas a deleção da região

5’ sem a adição de nenhuma seqüência externa. Desse modo, a comparação da

modulação da atividade da luciferase deve ser feita sempre com a construção que contém

o oligonucleotídeo Z5. Nesse caminho, os valores da atividade da luciferase da

construção Z1 mostraram-se equivalentes aos da construção Z5, indicando que este

oligonucleotídeo não teve o efeito de modulação positiva esperado.

Dentre os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho, apenas o Z3 foi capaz de

melhorar a atividade da luciferase como esperado. Entretanto, ainda não se sabe se este

efeito se deve à formação de Z-DNA na região adjacente ao promotor de CMV. Para

isso, foram estabelecidos clones estáveis das construções com as seqüências Z3 e Z5 em

CHO-K1, sendo que este tópico será mais bem discutido a seguir.

4.2.3) Transfecção estável

De acordo com o gráfico da figura 28, o oligonucleotídeo Z3 foi a única

seqüência, dentre todas as que foram clonadas próximas à região 5’ do promotor de

CMV, que apresentou o resultado esperado de aumento da atividade da luciferase.

Portanto, para que a hipótese de que essa seqüência forma Z-DNA e que foi essa

formação a responsável pelo aumento da atividade da luciferase, foram estabelecidos

clones estáveis em CHO-K1 das construções Z3 e Z5, como um controle. Nestes clones,

foi transfectado transientemente o plasmídio pMACIAscFvZ22 NLS. A hipótese é que

se a seqüência Z3 realmente induzir a conformação Z no DNA, o fragmento de

anticorpo anti-Z-DNA, que foi produzido no citoplasma e redirecionado ao núcleo, se

ligará nessa região do promotor, estabilizando então a conformação Z e proporcionando

maior acessibilidade de fatores transcricionais ao promotor de CMV. Também como

controle, foi transfectado transientemente o plasmídio pMAC vazio, que é o mesmo

112

arcabouço onde foi clonado o gene do anticorpo anti-Z-DNA. A transfecção deste

plasmídio não deve afetar a atividade da luciferase nos clones estáveis, já que não foi

introduzido nenhum gene exógeno para ser transcrito e traduzido, servindo de controle

para quaisquer efeitos de seqüestro de fatores transcricionais, já que todos os vetores são

baseados no promotor de CMV. O gráfico mostrando a atividade da luciferase em

clones estáveis de Z3 e Z5 transfectados transientemente com o vetor pMAC vazio e

pMAC scFvZ22NLS é mostrado abaixo na figura 29.

Ensaio de Atividade da Luciferase em clones estáveis de CHO-K

- Efeito do fragmento scFvZ22NLS

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Z3e + pMAC Z3e + NLS Z5e + pMAC Z5e + NLS

Unidades relativas de luminescência

(V/R)

24 horas

48 horas

Figura 29. Efeito do anticorpo anti-ZDNA Z22 na forma scFv Z22 com sinal de

localização nuclear (NLS) em clones estáveis de Z3 e Z5 (CHO-K1). Foram transfectadas

transientemente nos clones estáveis (Z3 e Z5) as construções pMAC (vetor pMAC vazio) e

NLS (vetor pMAC scFvZ22NLS). Os asteriscos vermelhos indicam que há diferença

significativa entre os valores, com P<0,05. Os asteriscos verdes mostram que não há

diferença significativa entre os valores, com P>0,05.

A transfecção do gene do fragmento de anticorpo anti-Z-DNA Z22 no clone

estável de Z3 aumentou significativamente a atividade da luciferase, comparando-se

com as amostras que foram transfectadas com o vetor pMAC vazio. Esse aumento foi

aproximadamente 3 vezes. É importante ressaltar também que a transfecção da

construção com o anticorpo Z22 e NLS não alterou a atividade da luciferase no clone

estável de Z5, que é um controle cuja seqüência não induz a formação de Z-DNA.

Da mesma forma que Oh e colaboradores (2002) demonstraram para a levedura

Saccharomyces cerevisae, sugerimos neste trabalho que para a linhagem celular CHO-

* *

113

K1, a clonagem de uma seqüência indutora de Z-DNA próxima a um promotor pode

melhorar a expressão do gene associado. Também há indícios de que esta seqüência

demonstre esse efeito por induzir efetivamente a conformação Z no DNA adjacente ao

promotor, já que a adição de um elemento em trans nesse sistema proporcionou um

aumento ainda maior na atividade da luciferase em clones estáveis. A fim de verificar se

o aumento da atividade da luciferase com a adição da seqüência Z3 a montante do

promotor de CMV se deve ao aumento da taxa de transcrição, e consequentemente dos

níveis de mRNA, deve ser realizado um experimento de RT-qPCR, da mesma forma

que foi feito para as construções com deleções no intron A. Dessa forma, estaríamos

correlacionando diretamente o aumento da atividade da enzima com aumentos dos

níveis de expressão do transcrito.

114

5. Conclusões e perspectivas

No presente trabalho foi avaliado o potencial do intron A e de seqüências

indutoras de Z-DNA em melhorar a atividade da luciferase, que foi o modelo de estudo

para o teste das construções realizadas. Verificou-se que o intron A inteiro promove um

aumento significativo da atividade da luciferase em todas as linhagens celulares

estudadas, sendo que este aumento varia de 100 a quase 1000 vezes, este último para a

linhagem HEK-293. Este resultado é corroborado pelo aumento nos níveis de expressão

do transcrito da luciferase de vaga-lume, como visto nos experimentos de RT-qPCR.

Foram construídas versões do intron A deletado ainda não descritas na literatura, sendo

que a versão com deleção de 600 pb pode ser considerada um intron A mínimo

funcional, tendo em vista que a atividade da luciferase se manteve praticamente

inalterada nas linhagens de células de mamífero analisadas. A construção com deleção

de 200 pb também apresentou aumentos de 2 a 7 vezes na atividade da luciferase,

dependendo da linhagem celular utilizada, sendo que esta foi a melhor construção

dentre todas. Os dados do experimento de RT-qPCR também confirmam que há uma

relação entre a atividade da luciferase observada nas construções com deleção de 600 e

200 pb com os níveis de expressão do mRNA. Foi também mostrado que o splicing nas

construções em que foi deletado o sítio 3’ aceptor (pGLCMV∆400 e pGLCMV∆600)

não ocorre normalmente como na construção com intron A selvagem e deletado em 200

pb. Nestas construções o sítio aceptor permaneceu inalterado. Como os níveis da

atividade da luciferase na construção pGLCMV∆600 são tão bons quanto ou melhores

do que os da versão com intron A inteiro, pode-se inferir que o splicing nesta região

entre o exon 1 e 2 não é crítico para que haja melhora da expressão gênica. Com isso,

pode ser que o mRNA híbrido de luciferase com a região 5’UTR do gene IE1 de CMV

seja funcional, produzindo a proteína biologicamente ativa.

Foi demonstrado também que a seqüência indutora de Z-DNA Z3 foi capaz de

aumentar em aproximadamente 2,5 vezes a atividade da luciferase em comparação com

a construção Z5. Os valores um pouco menores da atividade da luciferase da construção

Z3 em comparação com a construção selvagem (pGLCMV) são explicados pela deleção

da região 5’ do promotor/enhancer de CMV entre os sítios de restrição de Ssp I. Esta

região ao contrário do que foi descrito na literatura, tem uma importância significativa

para a expressão gênica, visto que sua remoção das construções com seqüências

115

indutoras de Z-DNA diminuíram pela metade a atividade da luciferase em CHO-K1 e

em COS-7. Com a utilização do fragmento de anticorpo scFv Z22 com NLS foi possível

demonstrar, em clones estáveis de Z3 e Z5 em CHO-K1, que há grandes indícios de que

a seqüência Z3 exerça a sua atividade moduladora por meio da formação de Z-DNA,

visto que a transfecção transiente desta construção nos clones estáveis aumentou

significativamente a atividade da luciferase em Z3, e não em Z5, o controle.

Com isso, este trabalho mostrou a influência de elementos em cis (introns e

seqüências indutoras de Z-DNA) e em trans (fragmento de anticorpo anti-Z-DNA) na

atividade da luciferase. Estes elementos têm o potencial de otimizar a expressão gênica

em várias linhagens de células de mamífero, sendo alvos interessantes para o estudo

mais aprofundado e posterior construção de vetores para expressão de proteínas

heterólogas de interesse comercial.

Dentre as perspectivas futuras para este trabalho, que terá continuidade por mais

quatro anos como um projeto de Doutorado, estão:

- clonagem e seqüenciamento dos fragmentos de DNA obtidos nas reações de RT-PCR

para o estudo do splicing nas construções com deleções no intron A.

- restauração do sítio aceptor de splicing na construção pGLCMV∆600, por meio de

PCR.

- estabelecimento de novos clones estáveis em CHO-K1 das construções com os

oligonucleotídeos Z12, Z3 e Z5 para estudos dos padrões de metilação no promotor de

CMV por meio de seqüenciamento bissulfito e tratamento com 5-azacitidina.

- imunoflorescência e imunoprecipitação de cromatina nos clones estáveis de Z3 e Z5,

utilizando o anticorpo construído neste trabalho (scFvZ22 NLS), a fim de comprovar a

formação de Z-DNA na região adjacente ao promotor.

- monitorar os níveis de expressão do gene da luciferase de vaga-lume por RT-qPCR

nas construções com a seqüência Z3, na presença e na ausência do scFvZ22 NLS.

- construção de um novo vetor para expressão de proteínas de interesse em células de

mamífero contendo uma associação dos elementos que mostraram resultados positivos

para o gene repórter da luciferase. Em outras palavras, em um novo vetor seria testado o

116

intron A (e versões deletadas) em conjunto com o elemento Z3 e restaurando-se a região

5’ do promotor de CMV, na expressão estável de uma proteína de interesse comercial.

Nesse sistema estaria incluso também a expressão transiente do scFvZ22 NLS. Na

figura 30 é mostrado um esquema de como funcionariam os elementos estudados se

estivessem em um mesmo vetor para expressão heteróloga de uma proteína de interesse

comercial. Na figura é possível verificar como todos os elementos estudados neste

trabalho podem agir de forma cooperativa para melhorar a expressão de uma proteína de

interesse.

117

Figura 30. Mecanismos que ocasionarão aumentos na expressão de um gene de

interesse quando os elementos são colocados em um mesmo vetor para expressão

heteróloga. Na figura observa-se o esquema de um vetor que contém os elementos

estudados neste trabalho (seqüências indutoras de Z-DNA e intron A), além do promotor de

CMV dirigindo a expressão de um gene de interesse qualquer. Os mecanismos mostrados

agiriam de forma sinergística, proporcionando um aumento global da produção da proteína

de interesse.

CMVp

DNA

INTRON A

Gene de

interesse

Exon 1

Exon 2

Efeitos na expressão do gene de

interesse em nível de DNA

Efeitos na expressão do gene de

interesse em nível de RNA

Gene de

interesse

Z-DNA

Indução da conformação Z no DNA

adjacente ao promotor

Maior acessibilidade para a ligação de

fatores transcricionais e RNA

polimerase II

INTRON A

Ligação de fatores transcricionais

ativadores que interagem com a

maquinaria transcricional

RNA polimerase II

Transcrição

Maior estabilidade do mRNA do gene

de interesse

Gene de

interesse

Maior produção da proteína de interesse

RNA polimerase II

scFv Z22NLS

Intron A ∆200

Intron A ∆600

118

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adams, M. D. et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science.

2000; 287, 2185–2195.

Andrade, E.V.; Albuquerque, F.C.; Moraes, L.M.; Brigido, M.M. e Santos-Silva, M.A.

Single-chain Fv with Fc fragment of the human IgG1-tag: construction, Pichia

pastoris expression and antigen binding characterization. Journal of Biochemistry

(Tokyo). 2000; 128(6): 891-5.

Ansmant, I. B e Izaurralde, E. Quality controlo f gene expression: a stepwise

assembly pathway for the surveillance complex that triggers nonsense-mediated

mRNA decay. Genes and Development. 2006; 20: 391-8.

Awasthi, S.; Isler, J. A. e Alwine, J. C. Analysis of splice variants of the Immediate-

Early 1 Region of Human Cytomegalovirus. Journal of Virology. 2004; 78(15): 8191-

200.

Azevedo, M. O.; Felipe, M. S. S.; Brígido, M. M.; Maranhão, A. Q. e De-Souza, M . T.

Técnicas Básicas em Biologia Molecular. 2003. 1ª edição. Editora UnB.

Baltimore, D. Our genome unveiled. Nature. 2001; 409: 814–816.

Barbas III, C.F.; Burton, D. R.; Scott, J. K. e Silverman, G. J. Phage display: a

Laboratory Manual. 2001. 1ª edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, NY, USA.

Berdoz, J.; Blanc, C. T.; Reinhardt, M.; Kraehenbuhl, J. P. e Corthésy, B. In vitro

comparison of the antigen-binding and stability properties of the various

molecular forms of IgA antibodies assembled and produced in CHO cells. PNAS.

1999; 96: 3029-34.

119

Bhatia, P.; Taylor, W. R.; Greenberg, A. H. e Wright J. A. Comparison of

glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase and 28S-ribosomal RNA gene

expression as RNA loading controls for northern blot analysis of cell lines of vary

malignant potential. Analytical Biochemistry. 1994; 216: 223-6.

Blackburn, G.M. e Gait, M. G. Nucleic Acids in chemistry and biology. 1995;

Segunda Edição, Oxford, UK.

Blencowe, B. J.; Issner, R.; Nickerson, J. A. e Sharp, P. A. A coactivator of pre-

mRNA splicing. Genes & Development. 1998; 12: 996-1009.

Bourdoun, V.; Harvey, A. e Lonsdale, D.M. Introns and their position affect the

translational activity of mRNA in plant cells. EMBO reports. 2001; 2(5): 394-8.

Brígido, M. M. e Stollar, B. D. Two induced anti-Z-DNA monoclonal antibodies use

VH gene segments related to those of anti-DNA autoantibodies. The Journal of

Immunology. 1991; 146(6): 2005-9.

Brígido, M.M.; Polimenis, M. e Stellar, B.D. Role of mouse VH10 and VL segments

in the specific binding of antibody to Z-DNA, analyzed with recombinant single

chain Fv molecules. Journal of Immunology. 1993; 150: 469-75.

Bucher, P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II

promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. Journal of

Molecular Biology. 1990; 212: 563-78.

Buchman, A. R. e Berg, P. Comparison of intron-dependent and intron-independent

gene expression. Molecular Cell Biology. 1988; 8: 4395-405.

Burke, T. W. e Kadonaga, J. T. Drosophila TFIID binds to a conservated

downstream basal promoter element that is present in many TATA-box- deficient

promoters. Genes and Development. 1996; 10: 711-24.

120

Burke, T. W. e Kadonaga, J. T. The downstream core promoter element, DPE, is

conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAF

60 of Drosophila.

Genes and Development. 1997; 11: 3020-31.

Burtet, R. T.; Santos-Silva, M. A.; Buss, G. A.; Moraes, L. M.; Maranhão, A. Q. e

Brígido, M. M. Production of recombinant Fab in Pichia pastoris from a

monocistronic expression vector. Journal of Biochemistry. 2007. A ser publicado.

Bustin, S. A.; Benes, V.; Nolan, T. e Pfaffl, M. W. Quantitative real-time RT-PCR –

a perspective. Journal of Molecular Endocrinology. 2005; 34: 597-601.

Bustin, S. A.; Gyselman, V.G.; Williams, N. S. e Dorudi, S. Detection of cytokeratins

19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients.

British Journal of Cancer. 1999; 79: 1813–20.

Campos-da-Paz, M.; Costa, C. S.; Quilici, L. S.; Simões, I. C.; Kyaw, C. M.; Maranhão,

A. Q. e Brígido, M. M. Production of recombinant human Factor VIII in different

cell lines and the effect of human XBP-1 co-expression. Molecular Biotechnology.

2008, no prelo.

Chan, C. C.; Dostie, J.; Diem, M. D.; Feng, W.; Mann, M.; Rappsilber, J. e Dreyfuss, G.

eIF4A3 is a novel component of the exon junction complex. RNA. 2004; 10(2): 200-

Chang, A.H.; Stephan, M.T. e Sadelain, M. Stem cell-derived erythroid cells mediate

long-term systemic protein delivery. Nature Biotechnology. 2006; 24(8): 1017-21.

Chapman, B.S.; Thayer, R.M.; Vincent, K.A. e Haigwood, N.L. Effect of intron A

from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene of heterologous

expression in mammalian cells. Nucleic Acid Research. 1991; 19(14): 3979-86.

Chen, R. W.; Saunders, P. A.; Wei, H.; Li, Z.; Seth, P. e Chuang, D. M. Involvement of

glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) and p53 in neuronal

121

apoptosis: evidence that GAPDH is upregulated by p53. Journal of Neuroscience.

1999; 19: 9654–62.

Cheryiath, V.; Novina, C. D. e Roy, A. L. TFII-I regulates V

promoter activity

through an iniciator element. Molecular Cell Biology. 1998; 18: 4444-54.

Chomczynski, P. e Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid

guanidiniun-thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry.

1987; 162(1): 156-9.

Chung, K. H.; Kim, K. S. e Kim, J. H. N-Acetylcysteine increases the biosynthesis of

recombinant EPO in apoptotic Chinese hamster ovary cells. Free Radical Research.

1999; 64: 108-19.

Ciafrè, S. A.; Rinaldi, M.; Vespignani, I.; Parrella, P.; Seripa, D.; Signori, E.; Ria, F.;

Farace, M. G. e Fazio, V. M. A plasmid family containing two different expression

cassettes suitable for immunomodulation and genetic immunization. Plasmid. 1998;

40 (1): 84-9.

Conti, E. e Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay: molecular insights and

mechanistic variations across species. Current Opinion in Cell Biology. 2005; 17(3):

316-25.

Corden, J.; Wasylyk, B.; Buchwalder, A.; Sassone-Corsi, P.; Kedinger, C. e Chambon,

P. Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes . Science. 1980; 209:

1406-14.

Cox III, R. S.; Surette, M. G. e Elowitz, M. B. Programming gene expression with

combinatorial promoters. Molecular Systems Biology. 2007; 3(145): 2-11.

Degot, S.; Le Hir, H.; Alpy, F.; Kedinger, V.; Stoll, I.; Wendling, C.; Seraphin, B.; Rio,

M. C. e Tomasetto, C. Association of the breast cancer protein MLN51 with the

exon junction complex via its speckle localizer and RNA binding module. The

Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(32): 33702-15.

122

Durocher, Y.; Perret, S. e Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant

protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-

EBNA1 cells. Nucleic Acid Research. 2002; 30 (2): E9.

Ewing, B.; Hilier, L.; Wendl, M. e Green, P. Basecalling of automated sequencer

traces using phred I – Accuracy assessment. Genome Research. 1998; 8: 175-85.

Furger, A.; O’Sullivan, J. M.; Binnie, A.; Lee, B. A. e Proudfoot, N. J. Promoter

proximal splice sites enhance transcription. Genes and Development. 2002; 16: 2792-

99.

Gatfield, D. e Izaurralde, E. REF1/Aly and the additional exon junction complex

proteins are dispensable for nuclear mRNA export. The Journal of Cell Biology.

2002; 159(4): 579-88.

Gazhal, P. e Nelson, J. A. Enhancement of RNA Polymerase II initiation complexes

by a novel DNA control domain downstream from the Cap Site of the

cytomegalovirus major immediate-early promoter. Journal of Virology. 1991; 65(5):

2299-307.

Gilbert, W. Why genes in pieces. Nature. 1978; 271(5645): 501.

Gluzman, Y. SV-40 transformed simian cells support the replication of early SV-40

mutants. Cell. 1981; 23(1): 175-82.

Goldberg, M. L. Sequence analysis of Drosophila histone genes. Dissertação de

Doutorado. 1979. Stanford University, Califórnia.

Goossens, K.; Poucke, M. V.; Soom, A. V.; Vandesompele, J.; Zeveren, A. V.;

Peelman, L. J. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bovine

preinplantation embryos. BMC Developmental Biology. 2005; 5 (27): 1-9.

Grahan, F.L.; Smiley, J.; Russel, W.C. e Nairn, R. Characteristics of a human cell line

transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of General

Virology. 1977; 36(1): 59-74.

123

Gruh, I.,; Wunderlich, S.; Winkler, M.; Schwanke, K.; Heinke, J.; Blömer, U.;

Ruhparwar, A.; Rohde, B.; Li, R. K.; Haverich, A.; e Martin, U. Human CMV

immediate-early enhancer: a useful tool to enhance cell-type-specific expression

from lentiviral vectors. Journal of Gene Medicine. 2008; 10(1): 21-32.

Gruss, P.; Lai, C.J.; Dhar, R. e Khoury, G. Splicing is a requirement for biogenesis of

functional 16S mRNA of simian virus 40. PNAS. 1979; 76(9): 4317-21.

Hammarskjold, M-L.; Heimer, J.; Hammarskjold, B.; Sangwan, I.; Albert, L. e Rekosh,

D. Regulation of human immunodeficiency virus env expression by the rev gene

product. Journal, of Virology. 1989; 63(5): 1959-66.

Hardley, C. B. e Reynolds, R. P. Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic

Acids Research. 1987; 15 (5): 2343-61.

Hasania, S.; Lotfi, A. S.; Mahboudi, F.; Rezaii, A.; Rahbarizadeh, F. e Mohsenifar, A.

Elevated expression of human alpha-1 antitrypsin mediated by yeast intron in

Pichia pastoris. Biotechonology Letters. 2006; 28(19): 1545-50.

Hennighausen, L. e Fleckenstein, B. Nuclear Factor 1 interacts with five DNA

elements in the promoter region of human cytomegalovirus major immediate early

gene. The EMBO Journal. 1986; 5(6): 1367-71.

Herbert, A. e Rich, A. The biology of left-handed Z-DNA. The Journal of Biological

Chemistry. 1996; 271(20): 11595-8.

Iosef, C.; Gkourasas, T.; Jia, C. Y. H.; Li, S. S. C. e Han, V. K. M. A functional

nuclear localization signal in insulin-like growth factor binding protein-6 mediates

its nuclear import. Endocrinology. 2007; a ser publicado.

Javahery, R.; Khachi, A.; Lo, K.; Zenzie-Gregory, B. e Smale, S. T. DNA sequences

requirements for transcriptional iniciator activity in mammalian cells. Molecular

Cell Biology. 1994; 14: 116-27.

124

Kataoka, N.; Yong, J.; Kim, V. N.; Velazquez, F.; Perkinson, R. A.; Wang, F. e

Dreyfuss, G. Pre-mRNA splicing imprints mRNA in the nucleus with a novel RNA-

binding protein that persists in the cytoplasm. Molecular Cell. 2000; 6(3): 673-82.

Kaufman, J. e Smale, S. T. Direct recognition if iniciator elements by a component

of the transcription factor IID complex. Genes and Development. 1994; 8: 821-9.

Kim, U.; Wang, Y.; Sanford, T.; Zeng, Y. e Nishikura, K. Molecular cloning of cDNA

for double-stranded RNA adenosine deaminase, a candidate enzyme for nuclear

RNA editing. PNAS. 1994; 91(24): 11457-61.

Klysik, J.; Stirdivant, S.M. e Wells, S.M. Left-handed DNA. Cloning,

characterization, and instability of inserts containing different lengths of (dC-dG)

in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 1982; 257(17): 10152-8.

Knowles, B,B.; Howe, C.C. e Aden, D.P. Human hepatocellular carcinoma cell lines

secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 1980;

209(4455): 497-9.

Kutach, A. K. e Kadonaga, J. T. The downstream promoter element DPE appears to

be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Molecular Cell

Biology. 2000; 20: 4754-64.

Kwek, K.Y.; Murphy, S.; Funger, A.; Thomas, B.; O’Gorman, W.; Kimura, H.;

Proudfoot, N.J. e Akoulitchev, A. U1 snRNA associates with TFIIH and regulates

transcriptional iniciation. Nature Structural Biology. 2002; 9(11): 800-5.

Lagrange, T.; Kapanidis, A. N.; Tang, H.; Reinberg, D. e Ebright, R. H. New core

promoter element in RNA polymerase II – dependent transcription: sequence-

specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes and Development. 1998; 12:

34-44.

Lander, E. S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature

409, 860–921 (2001).

125

Lauderdale, J. D. e Stein, A. Introns of the chicken ovalbumin gene promote

nucleossome alignment in vitro. Nucleic Acid Research. 1992; 20(24): 6589:96.

Le Hir, H.; Gatfield, D.; Braun, I. C.; Forler, D. e Izaurralde, E. The protein Mago

provides a link between splicing and mRNA localization. EMBO reports. 2001;

2(12): 1119-24.

Le Hir, H.; Izaurraulde, E.; Maquat, L. E. e Moore, M. J. The spliceossome deposits

multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions. The

EMBO Journal. 2000; 19(24): 6860-69.

Le Hir, H.; Moore, M. J. e Maquat, L. E. Pre-mRNA splicing alters mRNP

composition: evidence for stable association of proteins at exon-exon junctions.

Genes & Development. 2000b; 14: 1098-1108.

Le Hir, H.; Nott, A. e Moore, M.J. How introns influence and enhance eukaryotic

gene expression. Trends in Biochemical Sciences. 2003; 28(4): 215-20.

Legrain, P. e Rosbash, M. Some cis- and trans- acting mutants for splicing target

pre-mRNA to the cytoplasm. Cell. 1989; 57(4): 573-83.

Lewin, B. Genes VII. 2001. Editora Artmed, Porto Alegre, Rio Grande do Sul.

Li, Y. P.; Bang, D. D.; Handberg, K. J.; Jorgensen, P. H. e Zhang, M. F. Evaluation of

the suitability of six host genes as internal control in real-time RT-PCR assays in

chicken embryo cell cultures infected with infectious bursal disease virus.

Veterinary Microbiology. 2005; 110(3-4): 155-65.

Lim, W. e Feng, Y. P. The stretched intermediate model of B-Z DNA transition.

Biophysical Journal. 2005; 88: 1593-607.

Liu, H.; Mulholland, N.; Fu, H. e Zhao, K. Cooperative activity of BRG1 and Z-DNA

formation in chromatin remodeling. Mollecular and Cellular Biology.

2006; 26(7): 2550-9.

126

Liu, K.; Sandgren, E. P.; Pamiter, R. D. e Stein, A. Rat growth hormone gene introns

stimulate nucleossome alignment in vitro and in transgenic mice. PNAS. 1995; 92:

7724:28.

Liu, L.F. e Wang, J.C. Supercoiling of the DNA template during transcription.

PNAS. 1987; 84: 7024-27.

Liu, X-N.; Zhang, C-Y.; Jin, X-D.; Li, Y-Z.; Zheng, X-Z.; Li, L. Inhibitory effect of

schisandrin B on gastric cancer cells in vitro. World Journal of Gastroenterology.

2007; 13(48): 6506-11.

Lutz, C.S.; Murthy, K.G.; Schek, N.; O’Connor, J.P.; Manley, J.L. e Alwine, J.C. The

interaction between the U1 snRNP-A protein and the 160 kD subunit of cleavage-

polyadenylation specificity factor increases polyadenylation efficiency in vitro.

Genes & Development. 1996; 10(3): 325-37.

Mansur, N. R.; Meyer-Siegler, K.; Wurzer, J. C. e Sirover, M. A. Cell cycle regulation

of the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase/uracil DNA glycosylase gene in

normal human cells. Nucleic Acid Research. 1993; 21: 993-8.

Mayeda, A.; Badolato, J.; Kobayashi, R.; Zhang, M. Q.; Gardiner, E. M. e Krainer, A.

R. Purification and characterization of human RNPS1: a general activator of pre-

mRNA splicing. The EMBO Journal. 1999; 18(16):4560-70.

McClellan, J.A.; Palecek, E. e Lilley, D.M.J. (A-T)

tracts embedded in random

sequence DNA – formation of a structure which is chemically reactive and

torsionally deformable. Nucleic Acids Research. 1986; 14(23): 9291-309.

McLean, G. R.; Nakouzi, A.; Casadeval, A. e Green, N.S. Human and Murine

immunoglobulin expression vector cassettes. Molecular Immunology. 2000; 37(14):

837-45.

127

McLean, M.J. e Wells, R.D. The role of DNA sequence in the formation of Z-DNA

versus cruciforms in plasmids. The Journal of Biological Chemistry. 1988; 263(15):

7370-7.

Memari, N.; Grass, L.; Nakamura, T.; Karakucuk, I. e Diamandis, E. P. Human tissue

kallikrein 9: production of recombinant proteins and specific antibodies. Biological

Chemistry. 2006; 387(6): 733-40.

Missha, L. e Shupisu, G. A. Description of Artificial Sequence: expression vector

cassette vector DNA plasmid. Patente nº JP 2007506443-A, de 22 de março de 2007.

Nojima, T.; Hirose, T.; Kimura, H. e Haqiwara, M. The interaction between Cap-

binding Complex and RNA Export Factor is required for intronless mRNA

transport. The Journal of Biological Chemistry. 2007; 282(21): 15645-51.

Nott, A.; Meislin, S. H. e Moore, M. J. A quantitative analysis of intron effects on

mammalian gene expression. RNA. 2003; 9: 607-17.

Ogawa, R.; Kagiya, G.; Kodaki, T.; Fuduka, S. e Yamamoto, K. Construction of

strong mammalian promoters by random cis-acting element elongation.

Biotechniques. 2007; 42: 628-33.

Oh, D.B.; Kim, Y.G. e Rich, A. Z-DNA binding proteins can act as potent effectors

of gene expression in vivo. PNAS. 2002; 99(26): 16666-71.

Papagatsias, T.; Rozis, G.; Athanasopoulos, T.; Gotch, F.; Dickson, G. e Patterson, S.

Activity of different vaccine-associated promoter elements in human dendritic

cells. Immunology Letters. 2007; a ser publicado.

Peck, L.J.; Northeim, A.; Rich, A. e Wang, J.C. Flipping of cloned

d(pCpG)

.d(pCpG)

DNA sequences from right-to-left handed helical structure by

salt, Co(III), or negative supercoilling. PNAS. 1982; 79: 4560-64.

128

Pelerygina, L.; Patrusheva, I.; Hombaiah, S.; Zurkuhlen, H.; Wildes, M. J.; Patrushev,

N. e Hilliard, J. Production of herpes B virus recombinant glycoproteins and

evaluation of their diagnostic potential. Journal of Clinical Microbiology. 2005;

43(2): 620-8.

Penteado, F.C.L.; Medeiros, L.; Orellana, M.D.; Palma, P.; Fontes, A.M.; Takayanagui,

O.M. e Covas, D.T. Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do

retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos. Revista da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical. 2006; 39(2): 169-173.

Picanço, V.; Heinz, S.; Bott, D.; Behrmann, M.; Covas, D.; Seifried, E. e Tonn, T.

Recombinant expression of coagulation factor VIII in hepatic and non-hepatic cell

lines stably transduced with third generation lentiviral vectors comprising the

minimal factor VIII promoter. Cytotherapy. 2007; 1-10 (epub ahead of print).

Puck, T. T.; Cieciura, S. J. e Robinson, A. Long – Term cultivation of euploid cells

from human and animal subjects. The Journal of Experimental Medicine. 1958;

108(6): 945-56.

Restelli, V.

;

Wang, M.D.; Huzel, N.; Ethier, M.; Perreault, H. e Butler, M. The effect of

dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant

human erythropoietin produced from CHO cells. Biotechnology and Bioengineering.

2006; 94(3): 481-94

Roy, A. L.; Meisterernst, M.; Pognonec, P. e Roeder, R. G. Cooperative interaction of

an iniciator-binding transcription iniciation factor and the helix-loop-helix

activator USF. Nature. 1991; 354: 245-8.

Ruggiero, L. A. Clonagem de anticorpos recombinantes e expressão em cultura de

células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). 2002. Dissertação de Mestrado.

Universidade de Brasília.

Ruvkun, G. e Hobert, O. The taxonomy of developmental control in Caenorhabditis

elegans. Science. 1998; 282: 2033–41.

129

Sambrook, J. e Russel, D. W. Molecular Cloning – a laboratory manual. 2001. 3ª

edição. Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory.

Sanford, D. G. e Stollar, B. D. Characterization of anti-Z-DNA antibody binding

sites on Z-DNA by nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of

Biological Chemistry. 1990, 265(30): 18608-14.

Schade, M.; Turner, C. J.; Kuhne, R.; Schmieder, P.; Lowenhaupt, K.; Herbert, A.;

Rich, A. e Oschkinat, H. The solution structure of the Z

domain of the human RNA

editing enzyme ADAR1 reveals a prepositioned binding surface for Z-DNA. PNAS.

1999; 96(22): 12465-70.

Schiedner, G.; Hertel, S.; Johnston, M.; Biermann, V.; Dries, V.; Kochanek, S.

Variable affecting in vivo performance of high-capacity adenovirus vectors.

Journal of Virology. 2002; 76(4): 1600-9.

Schoroth, G.P.; Chou, J.P. e Ho, P.S. Mapping Z-DNA in the Human Genome. The

Journal of Biological Chemistry. 1992; 267(17): 11846-55.

Shi, M.; Xie, Z.; Yu, M.; Shen, B. e Guo, M. Controled growth of Chinese hamster

ovary cells and high expression of antibody-IL-2 fusion proteins by temperature

manipulation. Biotechnology Letters. 2005; 27(23-24): 1879-84.

Singer, V. L.; Wobbe, C. R. e Struhl, K. A wide variety of DNA sequences can

functionally replace a yeast TATA element for transcriptional activation. Genes

and Development. 1990; 4: 636-45.

Sleckman, B. P.; Gorman, J. R. e Alt, F. W. Accessibility control of antigen-receptor

variable-region gene assembly: role of cis-acting elements. Annual Reviews of

Immunology. 1996; 14: 459-81.

Smale, S. T. e Kadonaga, J. T. The RNA polimerase II core promoter. Annual Review

of Biochemistry. 2003; 72: 449-79.

130

Spector, D. L.; Goldman, R. D. e Leinwand, L. A. Cells: a Laboratory Manual. 1998.

Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, CSHL Press, p 1.1 – 2.13.

Spingola, M.; Grate, L.; Haussler, D. e Ares, M.A. Genome-wide bioinformatic and

molecular analysis of introns in Saccharomyces cerevisae. RNA. 1999; 5: 221-34.

Stinski, M. F. Cytomegalovirus promoter for expression in mammalian cells, em

“Gene Expression Systems: Using Nature of the Art of Expression”. 1999.

Academic Press.

Sung, Y. H. e Lee, G. M. Enhanced human thrombopoietin production by sodium

butyrate addiction to serum-free suspension culture of bcl-2-overexpressing CHO

cells. Biotechnology Progress. 2005; 21(1): 50-7.

Szabo, A.; Perou, C. M.; Karaca, M.; Perreard, L.; Quackenbush, J. F. e Bernard, P. S.

Statistical modeling for selecting housekeeper genes. Genome Biology. 2004; 5(8):

R59.

Thanaketpaisarn, O.; Nishikawa, M.; Okabe, T.; Yamashita, F.; e Hashida, M. Insertion

of nuclear factor-kappaB binding sequence into plasmid DNA for increase

transgene expression in colon carcinoma cells. Journal of Biotechnology. 2008;

133(1): 36-41.

Tripathy, S. K.; Svensson, E. C.; Black, H. B.; Goldwasser, E.; Margalith, M.; Hobart,

P. M. e Leiden, J. M. Long-term expression of erythropoietin in the systemic

circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector. PNAS.

1996; 93: 10876-80.

Vascotto, S. G.; Beug, S.; Liversage, R. A. e Tsilfidis, C. Nvβ-actin and NvGAPDH as

normalization factors for gene expression analysis in limb regenerates and

cultured blastema cells of the adult newt, Notophthalmus viridescens. International

Journal of Developmental Biology. 2005; 49: 833-42.

131

Vaz de Andrade, E.; Freitas, S. M.; Ventura, M. M.; Maranhão, A. Q. e Brígido, M. M.

Thermidynamic basis for antibody binding to Z-DNA: comparison of a

monoclonal antibody and its recombinant derivatives. Biochemical et Biophysical

Acta. 2005; 1726(3): 293-301.

Weis, L. e Reinberg, D. Accurate positioning of RNA polymerase II on a natural

TATA-less promoter is independent of TATA-binding-protein-associated factors

and iniciator-binding-proteins. Molecular Cell Biology. 1997; 17: 2973-84.

Winer, J.; Jung, C. K.; Shackel, I. e Williams, P. M. Development and validation of

real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction for

monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Analytical Biochemistry.

1999; 270(1): 41-9.

Wolfl, S.; Martinez, C.; Rich, A. e Majzoub, J. A. Transcription of the human

corticotrophin-release hormone gene in NPLC cells is correlated with Z-DNA

formation. PNAS. 1996; 93: 3664-8.

Wolfl, S.; Vahrson, W. e Herbert, A. Capítulo 4 em: DNA and Nucleoprotein

Structure in vivo. 1995; Volume 1, H.P.Saluz e K.Wiebauer editors. R.G. Landes,

Austin, TX 137.

Wurm, F.M. Production of recombinant protein therapeutic in cultivated

mammalian cells. Nature Biotechnology. 2004; 22(11): 1393-8.

Xia, W.; Bringmann, P.; McClary, J.; Jones, P.P.; Manzana, W.; Zhu, Y.; Wang, S.;

Liu, Y.; Harvey, S.; Madlansacay, M.R.; McLean, K.; Rosser, M.P.; MacRobbie, J.;

Olsen, C.L. e Cobb, R.R. High levels of protein expression using different

mammalian CMV promoters in several cell lines. Protein Expression and

Purification. 2006; 45(1): 115-24.

Xu, Z.L.; Mizuguchi, H.; Watabe, A.I.; Uchida, E.; Mayumi, T. e Hayakawa, T.

Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid

vectors. Gene. 2001; 272: 149-56.

132

Yonemura, H.; Sugawara, K.; Nakashima, K.; Nakahara, Y.; Hamamoto, T.; Mimaki, I.;

Yokomizo, K.; Tajima, Y.; Masuda, K.; Imaizumi, A.; et al. Efficient production of

recombinant human factor VIII by co-expression of the heavy and light chains.

Protein Engineering. 1993; 6(6): 669-74.

Zhou, T. e Chiang, C. M. The intronless and TATA-less human TAF

55 gene

contains a functional iniciator and a downstream promoter element. Journal of

Biological Chemistry. 2001; 276: 25503-11.

Zorio, D. A. R e Bentley, D. L. The link between mRNA processing and

transcription: communication works in both ways. Experimental Cell Research.

2004; 296: 91-7.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 