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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ESTUDO DE DUAS INVERSÕES (INV1 E INV22) NO GENE DO FATOR VIII E O
DESENVOLVIMENTO DE INIBIDORES CONTRA O FVIII EM HEMOFÍLICOS A
DO TIPO GRAVE NO RIO GRANDE DO SUL.
LEONARDO BARBOSA LEIRIA
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular da
UFRGS como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre.
Orientador: Francisco M. Salzano
Co-orientador: Israel Roisenberg
Participação Especial: Eliane Bandinelli
Porto Alegre, Março de 2008.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
As fontes financiadores desse estudo foram a Financiadora de
Estudos e Projetos (FAURGS-FINEP), o Conselho Nacional de
Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (CNPq) e a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
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Agradecimentos
Ao professor Israel por todo apoio, auxílio e valorosos ensinamentos para a minha formação
pessoal e profissional, bem como pela confiança depositada em mim ao longo do tempo.
Ao professor Salzano por suas contribuições e por aceitar me orientar no último ano de
mestrado.
À professora Eliane pelo convívio e pela contribuição na minha formação acadêmica ao longo
desses anos.
À professora Sídia por me auxiliar nas análises estatísticas do estudo e pelo convívio.
À professora Lavínia e ao seu grupo por todo auxílio e convívio.
À Daisy e a Kátia por serem meus exemplos de profissionalismo ao longo da minha
caminhada acadêmica e pelo convívio no laboratório.
À Ana Maria por me auxiliar na parte técnica das dosagens de fator VIII e inibidores e pelo
convívio nesses anos.
Aos doutores Mauro e Kozue e demais profissionais do Instituto Fleury por me auxiliarem no
início desse trabalho.
À professora Mara e ao seu grupo pelo convício e por permitirem e me ajudarem na
quantificação das amostras.
Aos integrantes, ex-integrantes e agregados do Laboratório de Hemostasia pelo convívio
durante o mestrado e antes disso.
Aos professores do Departamento de Genética da UFGRS, que muito contribuíram para a
minha formação nesses anos.
Ao Elmo e à Elen por toda ajuda dada durante o mestrado.
Aos meus familiares pelo total apoio e auxílio em todos os momentos durante essa
caminhada.
Aos meus amigos pelas valorosas contribuições pessoais e profissionais.
À Gisele por toda atenção, carinho, apoio, preocupação e dedicação.
E a todos que de alguma forma contribuíram para esse trabalho.
Apresentação
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Hemostasia do Departamento
de Genética dessa universidade, sob a orientação dos professores Israel Roisenberg e
Francisco Mauro Salzano e supervisionado pela professora Eliane Bandinelli. O trabalho
desenvolvido ao longo desses dois anos de Mestrado foi divido em dois grandes grupos
(Capítulos 2 e 3).
O Capítulo 2 informa a freqüência de duas inversões (Inv1 e Inv22) na população de
hemofílicos A graves do Rio Grande do Sul e a comparação com outras populações mundiais,
já o Capítulo 3 aborda a relação dessas inversões e de outras condições com o
desenvolvimento de inibidores contra o Fator VIII. Dados complementares dos dois capítulos
se encontram no Apêndice dessa Dissertação.
Sumário
Páginas
Lista de Abreviaturas........................................................................................................ 7
Lista de Figuras e Tabelas................................................................................................ 8
Resumo............................................................................................................................. 9
Abstract........................................................................................................................... 11
Capítulo 1. Introdução e Objetivos................................................................................. 13
1. Introdução............................................................................................................... 13
1.1. A Hemostasia...................................................................................................... 13
1.1.1. A Via Clássica da Cascata de Coagulação ..................................................... 15
1.1.2. A Via Celular-Enzimática da Cascata de Coagulação.................................... 18
1.1.3. O Fator VIII (FVIII)....................................................................................... 22
1.1.4. O Gene e a Estrutura do FVIII........................................................................ 24
1.2. As Hemofilias..................................................................................................... 29
1.2.1. A Hemofilia A................................................................................................ 29
1.2.2. Sintomatologia e Classificação dos Hemofílicos do tipo A........................... 30
1.2.2.1. O Tratamento de Pacientes com Hemofilia A............................................ 31
1.2.2.2. As Mutações no Gene do FVIII e a hemofilia A........................................ 31
1.2.2.3. A Inversão do Intron 1 (Inv1)..................................................................... 33
1.2.2.4. A Inversão do Intron 22 (Inv22)................................................................. 35
1.3. O Desenvolvimento de Inibidores Contra o FVIII............................................. 39
2. Objetivos................................................................................................................. 43
2.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 43
2.2. Objetivos Específicos......................................................................................... 43
Capítulo 2. Introns 1 and 22 inversions and factors VIII inhibitors in patients with severe
hemophilia A in southern Brazil..................................................................................... 44
Capítulo 3. História natural de uma população de hemofílicos A graves do sul do Brasil,
com ênfase no desenvolvimento de inibidores do Fator VIII........................................ 59
Discussão........................................................................................................................ 78
Conclusão Final e Perspectivas ...................................................................................... 83
Referências Bibliográficas.............................................................................................. 84
Apêndices ....................................................................................................................... 94
Apêndice 1. Seguimento................................................................................................. 95
Apêndice 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido........................................... 96
Apêndice 3. Ficha Clínica dos Pacientes........................................................................ 98
7
Lista de Abreviaturas
CRIO: Crioprecipitado (derivado de plasma precipitado)
FVIII: Fator VIII da coagulação
FvW: Fator von Willebrand
HA: Hemofilia do tipo A
INV1: Inversão do intron 1
INV22: Inversão do intron 22
I-PCR: PCR inverso
PAI: Inibidores de Ativadores do Plasminogênio
TF: Fator tecidual (tissue factor)
T-PA: Ativador de plasminogênio do tipo tissular
U-PA: Ativador de plasminogênio do tipo uroquinase
8
Lista de Figuras e Tabelas da Introdução
Figuras: Página
Fig. 1. A via clássica da cascata da coagulação sangüínea ..........................................17
Fig. 2. Modelo via celular-enzimática da cascata da coagulação sangüínea ............... 21
Fig. 3. Estrutura molecular do fVIII ............................................................................ 23
Fig. 4. Organização física do gene do fVIII humano .................................................. 26
Fig. 5. Domínios estruturais de ativação do fVIII ....................................................... 28
Fig. 6. Mecanismo hipotético de formação da Inv1 .................................................... 34
Fig. 7. Mecanismo hipotético de formação da inv22 .................................................. 38
Fig. 8. Fatores de risco associados com o desenvolvimento de resposta imune contra o FVIII
em hemofilia A ............................................................................................................ 42
Tabelas:
Tabela 1. Organização do gene do fVIII humano ........................................................ 27
9
Resumo
Introdução: A Hemofilia A (HA) é a doença hemorrágica ligada ao X mais freqüente na
população mundial, causada por alterações no fator VIII (FVIII), afetando 1:5000
nascimentos masculinos. A forma grave dessa doença é encontrada em 50% dos pacientes e é
caracterizada por intensos episódios hemorrágicos. O principal problema no tratamento desses
pacientes é o desenvolvimento de anticorpos que neutralizam o FVIII infundido, chamados de
inibidores contra o FVIII. Alterações estruturais no gene do fator VIII são possíveis fatores de
risco ao desenvolvimento de inibidores. Duas inversões (Inv1 e Inv22) são as mais freqüentes
e ocorrem exclusivamente em famílias de pacientes com HA grave, afetando cerca de 50%
das famílias. Outros fatores genéticos e ambientais estão descritos na literatura como
candidatos a fatores de risco ou associados com a produção de anticorpos contra o FVIII.
Objetivos: Estabelecer as freqüências dessas inversões em hemofílicos graves do Rio Grande
do Sul e verificar a associação entre o desenvolvimento dos inibidores e a presença das
inversões nos pacientes, bem como estudar outros fatores relacionados ao surgimento dos
inibidores.
Metodologia: Foram entrevistadas e estudadas 158 famílias não aparentadas, representadas
por 229 pacientes com hemofilia A graves (<1% FVIII) provenientes dos centros de
hemoterapia do Rio Grande do Sul (Hemocentro-RS) que aceitaram livremente participar
desse estudo. A partir disso, os pacientes foram genotipados para as duas inversões. Desses,
foram dosados inibidores de 136 famílias (168 pacientes). Resultados: As freqüências das
inversões do intron 1 e 22 nas famílias foram de aproximadamente 4% e 45%,
respectivamente, estando essas de acordo com as freqüências de outras populações mundiais.
Não foi encontrada uma associação estatisticamente significativa entre o surgimento de
inibidores e a presença das inversões nos pacientes. Outros possíveis fatores de risco como
tipo de tratamento, a etnia e a idade dos pacientes, a dose administrada de FVIII, a duração do
10
tratamento e a presença de infecções virais crônicas foram também estudados. Quando
analisados em separado, o tempo de uso de FVIII, a utilização de crioprecipitado, a dose do
fator e a idade dos pacientes estão associados com desenvolvimento de inibidores, porém
quando analisados em conjunto em um modelo preditor da formação de inibidores esse
modelo fornece resultados não significativos.
Conclusões: Esse estudo constitui-se em uma primeira aproximação ao problema, que é
complexo; a continuação das pesquisas, agora envolvendo também fatores específicos do
sistema imune dos pacientes, poderá fornecer dados mais conclusivos.
11
Abstract
Introduction: Hemophilia A (HA) is the most common sex-linked bleeding disorder caused
by genetic changes in factor VIII, affecting 1:5000 male births. Severe HA is the most
frequent form and occur in 50% of the patients and is characterized by intense hemorragic
episodes. The main problem in the treatment of these patients is the development of FVIII
antibodies that neutralize the infused FVIII, called FVIII inhibitors. Structural alterations in
the factor VIII gene are possible risk factors for the development of inhibitors. Two inversions
(Inv1 and Inv22) are the most frequent and they occur exclusively in patients of families with
severe HA, affecting about 50% of the families. Other genetic and environmental factors are
described in the literature as candidates to risk factors or as being associated with the
production of FVIII antibodies.
Objectives: To establish the frequencies of these inversions in severe hemophiliacs from Rio
Grande do Sul and to verify the association between the development of the inhibitors and the
presence of the inversions in the patients, as well as to study other factors related to the
appearance of the inhibitors.
Patients and Methods: The study was carried out on 158 unrelated families, represented by
229 patients with severe HA (<1% FVIII) ascertained from Rio Grande do Sul’s centers of
hemotherapy (Hemocentro-RS) that freely accepted to participate in the investigation. The
patients were genotyped for the two inversions, and their inhibitor levels tested in 136
families (168 patients).
Results: Intronn 1 and 22 inversion frequencies were approximately 4% and 45%,
respectively, in agreement with those reported for other world populations. No statistically
significant association between the occurrence of inhibitors and the presence of these
inversions in the patients was found. Other possible risk factors as the type of treatment,
ethnic group, patients' age, administered FVIII dose, duration of treatment and the presence of
12
chronic viral infections were also studied. When separately analyzed, duration of FVIII,
treatment, cryoprecipitate use, the factor dose and the patients' age are associated with
inhibitor development, but when analyzed together in a model of inhibitors formation
prediction the model yields non-significant results.
Conclusions: This study is a first approximation to this complex problem; the continuation of
the research, now involving also specific factors of the patient’s immune system, could
furnish more conclusive data.
13
Capítulo 1. Introdução e Objetivos
1. Introdução
Desde as civilizações mais remotas, os seres humanos vêm buscando conhecer mais sobre
os mecanismos e os princípios que envolvem a hemostasia e as doenças ocasionadas devido
ao seu desequilíbrio, sobretudo, as doenças hemorrágicas.
Mesmo sendo uma das patologias mais antigas já descritas, muitos mecanismos e
peculiaridades que envolvem as doenças hemorrágicas ainda não estão bem esclarecidos.
Além disso, ainda hoje é grande a busca por tratamentos mais eficientes e que melhorem a
qualidade de vida dos pacientes acometidos por essas desordens e sua prevenção.
Dentre essas doenças hemorrágicas, cabe ressaltar a Doença de von Willebrand e as
Hemofilias A e B que juntas, afetam cerca de 97% dos indivíduos com alguma deficiência na
hemostasia (Peyvandi et al., 2006).
1.1. A Hemostasia
Uma das principais funções do sangue é manter estável o ambiente interno do corpo, de
forma que os processos fisiológicos possam ocorrer normalmente. A fim de manter essa
estabilidade, o sangue tem que permanecer fluido dentro do sistema circulatório. No caso de
ocorrer um extravasamento de sangue ou o sangue não permanecer fluído, surgem certas
modificações que estancam a hemorragia ou atuam na fluidez do sangue. Esse conjunto de
mudanças fisiológicas é conhecido como hemostasia. (Tuddenham & Cooper, 1994a).
O processo de hemostasia envolve um mecanismo complexo, multifuncional, finamente
regulado e, sobretudo, vital na defesa contra a perda de sangue. Dele depende a formação do
coágulo (coagulação) e a sua degradação (fibrinólise) (Marcus & Safier, 1993).
14
A hemostasia envolve: (1) constrição e retração dos vasos sangüíneos na região lesada;
(2) aglutinação, adesão e agregação plaquetárias; (3) a ativação da cascata de coagulação
sangüínea, levando à formação da rede de fibrina; (4) a sua posterior dissolução. Em situações
em que qualquer um desses componentes esteja alterado, a hemostasia é comprometida e o
resultado pode ser tanto uma trombose como uma hemorragia (Tuddenham & Cooper, 1994b;
Dahlbäck, 2000).
A lesão tecidual e o rompimento dos vasos induzem a agregação plaquetária pela
exposição do colágeno até então indisponível para o contato com proteínas plasmáticas e
outros componentes da circulação. Em pequenos vasos, as plaquetas sozinhas são capazes de
interromper um sangramento. Em sua forma inativa as plaquetas possuem morfologia
discóide; quando ativadas por ADP, trombina, adrenalina, colágeno e fatores teciduais,
tornam-se arredondadas, apresentando numerosos pseudópodos, e levando à adesão e
agregação plaquetária (shape change). Após a lesão vascular, a primeira reação das plaquetas
é a sua interação com proteínas adesivas, como o Fator von Willebrand (FvW) e o colágeno
no subendotélio. A ativação das plaquetas leva à liberação de ADP, tromboxana e serotonina.
A secreção desses agonistas provoca o recrutamento e a agregação de outras plaquetas
levando à formação de um tampão celular. Paralelamente à agregação plaquetária, inicia-se a
reação de coagulação (Marcus & Safier, 1993; Dahlbäck, 2000).
O caráter essencial do processo de coagulação é que uma proteína circulante, solúvel no
plasma, o fibrinogênio, transforma-se em fibrina, o coágulo sólido (Marcus & Safier, 1993).
De acordo com os pontos de vista clássicos da coagulação, este é o evento final após duas
seqüências de reações principais: (1) a conversão da protrombina em trombina através da ação
da tromboplastina e dos íons de cálcio e (2) a transformação do fibrinogênio em fibrina sob a
influência da trombina, sendo envolvidas várias etapas e a ativação de vários fatores de
15
coagulação em cada uma das reações (Tuddenham & Cooper, 1994a). Como esses fatores de
coagulação são interdependentes na formação de um coágulo, a deficiência de um ou mais
fatores pode resultar em uma resposta hemostática anormal.
1.1.1. A Via Clássica da Cascata de Coagulação
Esta via compreende as cascatas de ativação das vias intrínseca e extrínseca, um conceito,
formulado por E.W. Davie e O. Ratnoff e R. G. MacFarlane em 1964 (fig. 1). A via
extrínseca, ou via do fator tecidual constitui o principal e mais rápido mecanismo que leva à
geração de trombina (Opal & Esmon, 2003). Já a via intrínseca, ou via do contato mediada
por superfície negativa ou ainda via do fator FXII, tem papel na sustentação e manutenção do
processo sob sua ativação. Nas duas vias atuam cerca de 20 fatores plasmáticos, quase todos
de natureza protéica, sendo majoritariamente enzimas que circulam em estado não ativado
(zimogênios), suscetíveis à ativação em cascata pelo fator anterior ativo. Vários processos de
retroalimentação - tanto positivos como negativos - regulam a cascata de coagulação (Broze,
1995; Dahlbäck, 2000).
Em conseqüência de uma lesão celular, de uma lesão tecidual ou ainda de um processo
inflamatório, o sistema fisiológico latente, representado principalmente pelas plaquetas e
pelas proteínas plasmáticas que circulam de forma inativa, é "apresentado" aos componentes
celulares estruturais da parede vascular (membrana basal, microfibrilas e colágeno) e torna-se
ativado. As plaquetas sofrem mudanças estruturais, emitem pseudópodos e passam a uma
etapa de intensa atividade e reatividade, levando à adesão e à secreção de agonistas pró-
agregantes. O fator tecidual (TF) liberado da membrana das células endoteliais, por sua vez,
liga-se às formas zimogênicas do fator VII presentes no sangue. Essa ligação ativa o fator VII
(VIIa), promovendo a formação do complexo tenase extrínseco, que depende do cálcio e
16
consiste da interação entre o TF, o fator VIIa e o fator X na membrana fosfolipídica
(Tuddenham & Cooper, 1994a; Opal & Esmon, 2003).
O fator XIa, ativado pelo fator XIIa, ativado, por sua vez, pelo fator intrínseco ou de
contato (Calicreína), participa da formação do complexo tenase intrínseco, dependente de
cálcio e fosfolipídeos de membrana, que envolve a interação dos fatores IXa, VIIIa e X,
levando à ativação do fator X (Tuddenham & Cooper, 1994a; Dahlbäck, 2000; Opal &
Esmon, 2003).
A ativação do fator X para sua forma ativa Xa, ativa o fator V, possibilitando a formação
do complexo protrombinase, formado pelos faores Xa, Va e protrombina na membrana
fosfolipídica das plaquetas. O complexo protrombinase, que também depende de cálcio, leva à
conversão da protrombina em trombina, que promove a transformação do fibrinogênio em
monômeros de fibrina, além de ativar o fator XIII. O fator XIIIa, por sua vez, promove a
formação de ligações covalentes na rede de fibrina, estabilizando o coágulo. O processo é
finalizado com a formação de um aglomerado de plaquetas, englobando também outras
células, especialmente eritrócitos, o que consolida o coágulo que sela a lesão e interrompe o
extravasamento sangüíneo. Após o reparo da lesão tecidual, o coágulo é degradado pela via
fibrinolítica (Tuddenham & Cooper, 1994a; Broze, 1995; Dahlbäck, 2000; Opal & Esmon,
2003).
A partir desta via proposta para explicar os mecanismos da coagulação foram baseados os
teste in vitro de Tempo de Protrombina, Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado, Dosagens
dos Fatores de Coagulação e Dosagens dos Inibidores de Fatores de Coagulação VIII e IX,
empregados na triagem e detecção de deficiências de fatores de coagulação.
17
Fig. 1. A via clássica da cascata da coagulação sangüínea. Representação da Via Extrínseca
e Intrínseca da Coagulação. Adaptado de Enzyme Research Co., Reino Unido, 2005.
http://www.enzymeresearch.co.uk/coag.htm, acesso em Março de 2005.
18
1.1.2. A Via Celular-Enzimática da Cascata de Coagulação
Em 2001 um novo modelo de coagulação sangüínea, baseado em células, foi proposto,
enfatizando a interação dos fatores da coagulação com superfícies celulares específicas
(Hoffman & Monroe, 2001, Hoffman, 2003a; Hoffman, 2003b, Bishop & Lawson, 2004).
Esse modelo se baseia numa série de três etapas (Iniciação, Propagação e Amplificação) que
ocorrem em diferentes tipos celulares (fig. 2).
A etapa de iniciação ocorre em células extravasculares carreadoras de TF (fibroblastos do
estroma, células mononucleares, macrófagos e células endoteliais) que só expõem o TF ao
sangue quando ocorre um dano vascular ou uma inflamação (fig. 2a). Com a liberação do TF
na superfície das células extravasculares ocorre a formação do complexo fator VIIa/TF, que
ativa pequenas quantidades dos fatores IX e X. Esse fator Xa associado ao seu cofator, Va,
forma o complexo protrombinase na superfície das células carreadoras de TF. O fator V pode
ser ativado pelo fator X ou por outras proteases não coagulantes. Cabe ressaltar que níveis
baixos de TF ocorrem no espaço extravascular todo o tempo, sendo liberados por diferentes
tipos celulares.
Alguns fatores de coagulação, como o FVII, atravessam a camada endotelial dos vasos,
podendo ser encontrados na linfa. Assim, o FVIIa pode ser encontrado ligado ao TF mesmo
na ausência de lesão vascular e os fatores IX e X podem ser ativados quando passam pelos
tecidos. Esse fenômeno, chamado de coagulação basal, não leva a formação de um coágulo
em situações normais devido à ausência de componentes de alta massa molecular, como
plaquetas e o complexo FVIII/FvW. O processo prossegue para a segunda etapa, a fase de
amplificação, apenas quando um dano vascular permite que plaquetas e o fator VIII/FvW
entrem em contato com o tecido extravascular.
A segunda fase, a fase de amplificação (fig. 2b) é preparatória para a subseqüente ativação
da trombina em grande escala na fase de propagação. A pequena quantidade de trombina
19
gerada nas células carreadoras de TF possui várias funções, entre elas a ativação de plaquetas,
expondo receptores e sítios de ligação para fatores de coagulação ativos e liberando formas de
fator V parcialmente ativadas em suas superfícies. A trombina formada na fase inicial também
ativa os fatores V e VIII na superfície de plaquetas ativadas. Nesse contexto, o complexo fator
VIII/FvW dissocia-se, permitindo que o FvW plasmático atue como mediador adicional na
adesão e agregação plaquetária. Também nessa fase o fator XI na superfície das plaquetas é
ativado a fator XIa pela trombina.
A fase de propagação (fig. 2c) ocorre na superfície das plaquetas ativadas aderidas e
agregadas no local da lesão. O fator IXa (ativado via VIIa ou trombina) se liga ao fator VIIIa
nas plaquetas. Já que o fator Xa não pode se mover das células carreadoras de TF até as
plaquetas ativadas, este deve ser suprido diretamente na superfície plaquetária pelo complexo
fator IXa/VIIIa (complexo Xase). O fator Xa rapidamente se associa com o fator Va ligado às
plaquetas na fase de amplificação. A formação do complexo protrombinase leva à ativação da
protrombina em grandes quantidades, levando à clivagem do fibrinogênio e à formação de
fibrina.
A trombina também ativa o fator XIII em XIIIa, uma transglutaminase plasmática. O fator
VIIIa catalisa a modificação covalente entre monômeros de fibrinas, formando a rede estável
de fibrina. A reação envolve a formação de uma ligação amida entre o grupamento carbonil
de resíduos de glutamina e de uma molécula de fibrina e o aminogrupo da cadeia lateral de
resíduos de lisina em outra molécula de fibrina, formando o coágulo estável de fibrina
(Hettasch & Greenberg, 1998).
Todo o processo de coagulação é regulado por outros componentes fisiológicos
circulantes, tais como o inibidor da via do fator tecidual, fosfolipase A2, fosfodiesterase, 5’-
nucleotidase, antitrombina III, via anticoagulante da proteína C/trombomodulina, que
inativam os fatores Va e VIIIa. Além disso, a via regulatória composta pelo plasminogênio
20
também tem um papel importante na degradação da rede de fibrina gerada pela ativação do
processo hemostático. O sistema de plasminogênio possui também participação em vários
processos celulares. A via é ativada por dois ativadores fisiológicos de plasminogênio:
ativador de plasminogênio do tipo tissular (t-PA) e ativador do plasminogênio tipo uroquinase
(u-PA). A via de ativação mediada por t-PA está primariamente envolvida na homeostase da
fibrina. Já, a via mediada por u-PA está envolvida em fenômenos como migração celular e
remodelagem de tecidos. O plasminogênio ativado gera plasmina, que atua na degradação de
fibrina e fibrinogênio e na ativação de metaloproteinases de matriz responsáveis pela
degradação da matriz extracelular. A inibição do sistema de regulação do plasminogênio
ocorre na etapa de ativação do plasminogênio, pela ativação específica de inibidores de
ativadores de plasminogênio (PAI) e diretamente na plasmina ativa, através da serpina α2-
antiplasmina (Collen, 1999; Vaughan e Declerk, 1998).
21
Fig. 2. Modelo via celular-enzimática da cascata da coagulação sangüínea. Baseado em
Hoffman (2003a) e Bishop & Lawson (2004). Cedido gentilmente por Markus Berger,
comunicação pessoal.
22
1.1.3. O Fator VIII (FVIII)
O Fator VIII (FVIII) (fig. 3) é uma glicoproteína que serve como cofator para o fator IXa
(serinoprotease) na conversão do fator X em fator Xa na via intrínseca da coagulação
(Kaufman, 1992). Após, o fator Xa ativa a protrombina (fator II) em trombina (fator IIa), que
cliva o fibrinogênio em fibrina, formando o coágulo (fig. 1) (Tuddenham & Cooper, 1994a;
Broze, 1995; Dahlbäck, 2000; Opal & Esmon, 2003). O FVIII é identificado no plasma pela
sua atividade pró-coagulante (FVIII:C) ou pela atividade antigênica (FVIII:Ag) (Lenting et
al., 1998).
23
Fig. 3. Estrutura molecular do FVIII. Retirado de: Escola de Medicina– Universidade de
Washington, http://Depts.Washington.Edu/Mednews/Research/Hemophilia.Html. Acesso em
Março de 2005. Em roxo os principais motivos imunogênicos.
24
1.1.4. O Gene e a Estrutura do FVIII
O gene do FVIII é amplo e estruturalmente complexo, contendo 26 éxons (Fig. 4; Tabela
1), apresentando aproximadamente 186 kb de DNA genômico e está localizado no
cromossomo Xq28 (Gitscheir et al., 1984; Peake, 1995). Os íntrons representam cerca de 95%
do gene (177kb), enquanto que os éxons, constituem os restantes 5% (9kb) (Gitsheir et al.,
1984; Toole et al., 1984, Bowen, 2002).
O RNA mensageiro (mRNA) do fator VIII compreende cerca de 9.010 nucleotídeos
que codificam um polipeptídeo precursor de 2.351 aminoácidos. Após o processamento do
peptídeo sinal (19 aminoácidos), origina-se uma proteína madura de 2.332 aminoácidos
(Vehar et al., 1984). A proteína madura foi isolada e purificada por Fay et al. (1982) e sua
estrutura primária foi primeiramente descrita em 1984 (Gitscheir et al., 1984; Vehar et al.,
1984).
A partir da análise de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos, observou-se a
existência de regiões de homologia interna no FVIII, sendo estabelecidos 3 domínios
estruturais diferentes, denominados, A, B e C, abreviados como NH
2
-A1-A2-B-A3-C1-C2-
COOH (Vehar et al., 1984).
O FVIII é ativado por proteólise, catalisada pela trombina (FIIa), onde os principais
sítios de clivagem para a ativação encontram-se na região C-terminal dos resíduos de
arginina nas posições 372, 740 e 1689 (Tuddenham & Cooper, 1994a). A partir dessa
clivagem, ocorre a liberação do domínio B, e a formação do FVIIIa a partir da ligação com o
Ca
+2
(fig. 5).
A estabilidade do FVIII depende da interação não-covalente com o fator von
Willebrand, que também atua na adesão e agregação plaquetárias. Tal interação, além de
promover a estabilidade do FVIII, aumenta a sobrevida do FVIII circulante, já que confere
25
uma proteção contra a degradação proteolítica na circulação sangüínea, bem como a inibição
da neutralização do FVIII por anticorpos (Jacquemin & Saint-Remy, 1998).
26
Fig. 4. Organização física do gene do FVIII humano. As Barras Representam os Éxons do
Gene. Baseado em Gitscheir et al., (1984).
27
Tabela 1. Organização do gene do FVIII humano.
Exon Tamanho (pb) Intron Tamanho (kb)
1 313 1 22.9
2 122 2 2.6
3 123 3 3.9
4 213 4 5.4
5 69 5 2.4
6 117 6 14.2
7 222 7 2.6
8 262 8 0.3
9 172 9 4.8
10 94 10 3.8
11 215 11 2.8
12 151 12 6.3
13 210 13 16.0
14 3106 14 22.7
15 154 15 1.3
16 213 16 0.3
17 229 17 0.2
18 183 18 1.8
19 117 19 0.6
20 72 20 1.6
21 86 21 3.4
22 156 22 32.4
23 145 23 1.4
24 149 24 1.0
25 177 25 22.4
26 1958
Baseado em Gitscheir et al., (1984).
28
Fig. 5. Domínios estruturais de ativação do FVIII. Baseado em Bowen (2002). N, região
aminoterminal; C, região carboxiterminal; (A) FVIII sintetizado contendo a pré-seqüência de
19 aminoácidos (peptídeo sinal) e o peptídeo maduro de 2332 aminoácidos. A1, A2, A3, B,
C1 e C2 representam os domínios de homologia. Os resíduos de arginina são os sítios de
ativação e clivagem pela trombina. (B) FVIII ativado. Os dois domínios (A e C)
correspondem às cadeias leve e pesada, ligadas pelo cálcio divalente.
29
1.2. As Hemofilias
O termo hemofilia foi proposto inicialmente por Schölein em 1820, sendo a sua
separação em dois tipos sugeridos por Pavlovsky (1947) e a distinção entre as hemofilias A e
B por três grupos independentes: Aggeler et al. (1952), Biggs et al., (1952) e Schulman &
Smith, (1952) (conferir Da Costa, 2004).
A Doença de von Willebrand, bem como as hemofilias A e B, são as coagulopatias
hereditárias mais freqüentes na população mundial, e resultam em sangramentos prolongados
após lesões, extrações dentárias ou cirurgias. A hemofilia A é caracterizada pela redução da
atividade do fator VIII circulante no plasma, enquanto a hemofilia B é causada pela redução
da atividade do fator IX, ambos fatores da via intrínseca da coagulação sangüínea.
1.2.1. A Hemofilia A
A hemofilia A é uma das doenças hemorrágicas mais freqüentes da via intrínseca da
cascata de coagulação sangüínea. Ela é causada pela redução da atividade do fator VIII da
coagulação (FVIII), devido a alterações no gene do FVIII (Gitscheir et al., 1984; Lander et
al., 2001). O padrão de herança é recessivo ligado ao X, e a condição clínica afeta,
aproximadamente, 1 em cada 5000 nascimentos masculinos (Hoyer, 1994 apud Soares et al.,
2001). No Rio Grande do Sul, a prevalência estimada é de 1:11.700 homens (Alexandre &
Roisenberg, 1985).
Nos testes de triagem da cascata de coagulação, o hemofílico A apresenta o tempo de
tromboplastina parcial ativado (TTPA) alterado, enquanto que o tempo de protrombina (TP) e
o tempo de trombina (TT) apresentam valores normais.
30
1.2.2. Sintomatologia e Classificação dos Hemofílicos do tipo A
As manifestações hemorrágicas podem aparecer já no primeiro ano de vida e sua
gravidade depende dos níveis plasmáticos de FVIII. As hemorragias podem ser
espontâneas ou precedidas por traumas, podendo ocorrer sob a forma de hematúria,
epistaxe, melena/hematêmese, ou se apresentarem como hematomas, sangramentos
retoperitoniais e intra-articulares (hemartroses), que constituem os aspectos mais
característicos das formas graves (Gilbert, 1981; Rezende et al, 2005).
Os pacientes podem ser classificados em três grupos (graves, moderados e leves) de
acordo com as características clínicas apresentadas e a dosagem do fator VIII no plasma
(FVIII:C). A classificação, segundo a International Society of Thrombosis and
Haemostasis e o Ministério da Saúde, quanto à atividade do fator VIII, estabelece que os
graves apresentariam <1%, os moderados de 1 a 5% e os leves de 5 a 50% (Forbes &
Madhok, 1991, Rezende et al, 2005).
Cerca de 50% dos indivíduos afetados são hemofílicos graves (Tuddenham & Cooper,
1994b; Antonarakis et al., 1995; Bowen & Keeney, 2003), já os moderados e leves,
ocorrem nas freqüências de 30% e 20%, respectivamente (Antonarakis et al., 1995).
Os hemofílicos graves apresentam sangramentos espontâneos freqüentes ou após traumas
leves; os moderados apresentam sangramentos importantes após pequenos traumas, enquanto
que os benignos apenas manifestam a doença após traumatismos fortes ou em intervenções
cirúrgicas.
31
1.2.2.1. O Tratamento de Pacientes com Hemofilia A
Atualmente o tratamento baseia-se na administração de fator VIII utilizando-se uma
variedade de preparações derivadas de plasma humano, como o crioprecipitado, infusão de
FVIII purificado ou obtido por técnicas de DNA recombinante. A terapia de substituição é
efetiva na maioria dos casos, porém, 7 a 30% dos indivíduos tratados desenvolvem anticorpos
que neutralizam o FVIII infundido e diminuem sua efetividade, denominados de inibidores do
FVIII (Lusher et al., 1993; Rieger, 1996, Rezende et al., 2005).
1.2.2.2. As Mutações no Gene do FVIII e a hemofilia A
A redução da atividade do fator VIII da coagulação (FVIII) ocorre por alterações no gene,
localizado na região Xq28 humano (Gitscheir et al., 1984; Lander et al., 2001, Bowen, 2002).
Estudos moleculares indicam que mutações de ponto são os defeitos genéticos mais comuns,
correspondendo a mais da metade dos casos, seguidos pelas deleções e pelos casos de
inserções e rearranjos/inversões. Em pacientes com hemofilia A, as inversões no gene do
FVIII são responsáveis por 20% de todos os casos dessa doença, sendo que em hemofílicos
leves e moderados são eventos muito raros e em hemofílicos graves apresentam uma alta
prevalência, sobretudo a inversão do intron 22 (Antonarakis et al., 1995; Bowen, 2002).
Em uma revisão e estudo de meta-análise, Antonarakis et al. (1995) investigaram
mutações no gene do FVIII em 1000 pacientes não consangüíneos. Os resultados foram: 46%
dos hemofílicos graves apresentaram mutações de ponto, 42% inversões, 8% deleções, e 4%
não apresentaram qualquer dessas mutações. No mesmo estudo, 91% dos hemofílicos
benignos apresentaram mutações de ponto e em 9% não foram encontradas mutações. Dentre
as mutações de ponto estavam incluídas: mutações do tipo missense (53%); CpG-para-TpG
(16%); pequenas deleções (12%); mutações do tipo nonsense (9%); pequenas inversões (3%);
32
mutações em sítios de splicing (3%); polimorfismos missense (2%); mutações silenciosas em
exons (2%) e mutações de inserção (1%).
Resultados similares foram descritos por Bagnall et al (1998, 2002, 2005), que
estudaram as inversões do intron 1 e 22 em 209 pacientes, onde 45% dos hemofílicos graves
apresentavam a inversão do intron 22; 3% a inversão do intron 1; 40% apresentavam
rearranjos; deleções e mudanças na fase de leitura, mutações nonsense ou de splicing e 10%
mutações missense. Quanto aos hemofílicos benignos e moderados, 97% apresentavam
rearranjos, deleções, mudanças na fase de leitura, mutações nonsense ou de splicing e 1%
possuia mutações missense; nenhum apresentou as inversões do intron 1 ou 22.
Em um estudo com 113 famílias européias contendo 231 hemofílicos A grave, 74
apresentavam a inversão do intron 22; 14 portavam mutações nonsense; 9 mutações missense;
9 pequenas deleções ou inserções; 4 grandes deleções no gene do FVIII; 3 famílias com
mutações em sítios de splicing (Astermark, 2005).
Como já indicado acima, duas inversões compreendem as mutações mais freqüentemente
encontradas (inversão do intron 22 e inversão do intron 1), ocorrendo em aproximadamente
50% dos hemofílicos do tipo grave (Liu & Sommer, 1998; Liu et al., 1998; Bagnall et al.,
2002), não havendo registros dessas duas inversões em hemofílicos com formas moderadas ou
leves (Rossetti et al., 2004). Portanto, torna-se interessante o estudo dessas duas inversões em
hemofílicos graves, devido à sua alta freqüência.
Outras mutações que causam hemofilia A são muito diversificadas, sendo descritas
atualmente mais de 950, sendo 270 mutações em hemofílicos graves. A maioria são simples
substituições de nucleotídeos (aproximadamente 65%), seguidas em freqüência por pequenas
deleções, inserções e outros rearranjos e inversões (Hamsters, acesso janeiro, 2008). Essa
33
variabilidade genética dificulta o rápido diagnóstico molecular de hemofílicos, pois a sua
avaliação global implicaria na varredura de todo o gene.
1.2.2.3. A Inversão do Intron 1 (Inv1)
A inversão do intron 1 (Inv1) é a segunda inversão mais freqüente descrita na
literatura, ocorrendo em cerca de 5% dos casos de hemofilicos A graves da população
mundial (Bagnall et al, 2002; Tizzano et al, 2003).
Os primeiros relatos dessa inversão foram apresentados por Brinke et al. (1996); havia
alteração do primeiro intron do FVIII com deslocamento da maior parte do exon 1 (100 kb)
em direção ao telômero. Essa inversão era causada por um rearranjo cromossômico que
envolvia uma recombinação homóloga intracromossômica (Kenwrick et al., 1992). Em outros
estudos, Brinke et al. (1996) notaram que a Inv1 criava 2 unidades de transcrição híbridas.
Uma seqüência de 1041 pares de base do intron 1 (Int1h-1) foi encontrada duplicada e a de
orientação oposta (Int1h-2) a cerca de 140 kd fora do gene. A Int1h-1 é formada pelo
promotor e o primeiro exon de fator VIII e expressa as seqüências que estão entre uma região
denominada de C6.1A e a região telomérica (Tizzano et al., 2003). A outra unidade de
transcrição híbrida contém a ilhas CpG, toda a região C6.1A e parte do gene.
O mecanismo de formação da Inv1 envolve um evento de recombinação
intracromossômica, entre as seqüências homólogas Int1h-1 localizada no éxon e Int1h-2
localizada a 100 kb da região 5’ do gene (Bagnall et al., 2002) (Fig. 6), levando à produção de
uma proteína truncada, um FVIII não funcional (Acquila et al., 2003a).
34
Fig. 6. Mecanismo hipotético de formação da Inv1. Baseado em Bagnall et al.
(2002), com modificações. TEL, região centromérica; CEN, região centromérica. (A) As
barras mostram o intron 1 flanqueado pelos éxons, as setas indicam o sentido da transcrição
contendo a seqüência repetida 9b (em cinza) flanqueada por uma seqüência única 9a ou 9c.
Fora do gene há uma seqüência homóloga ao 9b (B, C). A recombinação homóloga entre as
seqüências 9b acaba originando essa inversão. (D) Resultado da inversão do intron 1, gerando
as regiões 9ab, 9ac e 9bc.
35
1.2.2.4.A Inversão do Intron 22 (Inv22)
Com o interesse de buscarem novas informações a respeito do genoma humano
Patterson et al. (1989) verificaram que seqüências do genoma eram reconhecidas por uma
mesma sonda em duas regiões do cromossomo X (Xq28). Uma região dentro do intron 22
do gene do fator VIII e outra localizada 1,2 kb do gene. Levinson et al. (1990) procurando
transcritos na região Xq28, encontraram uma região denominada de A (F8A) que
hibridizava com uma região do exon 22 do gene do fator VIII. A F8A estava em orientação
inversa à região do gene e continha uma região homóloga ao intron 22. Análises
computacionais sugeriam que se tratava de uma região codificadora e o cDNA da F8A
também apresentava um bom grau de similaridade em ratos, camundongos e macacos.
O cromossomo X contém 3 cópias de F8A e suas regiões adjacentes, sendo uma no
intron 22, denominada de Int22h1 e duas cópias adicionais na região telomérica upstream,
a aproximadamente 500kb ao códon de início do gene do fator VIII (Int22h2 e Int22h3)
(Freije & Schlessinger (1992). O intron 22 encontra-se numa região de 32 kb e contém
uma ilha de CpG, a aproximadamente 10 kb donwstream do exon 22 (Int22h1). Esta ilha
parece servir como um promotor bidirecional para os Int22h2 e Int22h3 (Lakich et al.,
1993).
A inversão do intron 22 (Inv 22) origina-se de uma recombinação homóloga
intracromossômica entre uma região de 9,5 kb do intron 22 (Int22h1) e uma região
homóloga extra-gênica, proximal (Int22h2) ou distal (Int22h3) do gene, próximo à região
telomérica (Lakich et al., 1993; Antonarakis et al., 1995; Naylor et al., 1995). Estas
seqüências repetidas possuem uma identidade de mais de 99% (Naylor et al., 1993).
36
Os trabalhos de Naylor et al. (1991, 1992) demonstraram que mutações envolvendo
regiões do intron 22 levavam a um acoplamento defeituoso dos éxons 22 e 23 no RNAm
sendo uma das causas de hemofilia A grave em pacientes afetados no Reino Unido.
Diversas mutações no FVIII que causam a hemofilia A grave são resultantes da
recombinação entre as sucessivas regiões F8A homólogas dentro do intron 22 upstream ao
gene. Tal recombinação conduziria a uma inversão das seqüências de DNA e a formação
de um códon de parada. Lakich et al. (1993) apresentaram evidências para apoiar este
modelo e descreveram uma técnica de Southern blot para detectar esse tipo de inversão,
sendo que 45% dos hemofílicos graves estudados apresentaram a inversão. Também
sugeriram que se formava um RNA mensageiro híbrido entre as regiões dos exons 1-22 do
fator VIII e que as inversões que envolvem o intron 22 são a base dos defeitos no RNAm.
Estas mutações em pacientes gravemente afetados ocorrem à taxa de aproximadamente 4 x
10
-6
por gene/por gameta/por geração.
Oldenburg et al. (2000) demonstraram que a Inv22 pode se apresentar como um
mosaicismo somático e que a inversão não é restrita a divisões celulares meióticas, mas
também pode acontecer durante divisões mitóticas, ou em precursores das células
germinativas ou de células somáticas. Além disso, nas células germinativas femininas, o
emparelhamento do Xq com seu homólogo inibe a inversão intracromossômica do intron
22 e esse evento de inversão ocorreria predominantemente em células germinativas
masculinas, com uma relação de 3:1 (Oldenburg et al., 2000; Leuer et al., 2001).
Antes do ano de 2000 pensava-se que as duas cópias extragênicas possuíam o mesmo
sentido e que este era oposto ao gene. Com isso, ao ocorrer a recombinação homóloga da
região gênica Int22h1 com umas das regiões Int22h extra gênicas, proximal (Int22h2) ou
distal (Int22h3), ocorreria a interrupção do gene do FVIII e a produção de um transcrito
37
defeituoso (fig. 7A e B), não gerando o FVIII ou gerando um FVIII truncado (Naylor et al.,
1991; 1992). Porém com os avanços nas técnicas de seqüenciamento humano, ao contrário do
que se pensava, as cópias na porção mais telomérica ao gene (Int22h2 e Int22h3) foram
identificadas como estando em uma orientação inversa uma em relação à outra, podendo se
comportar como seqüências palindrômicas (Ross et al., 2005; Bagnall et al., 2006). Com isso,
um evento de recombinação homólogo, intracromossômico e não alélico entre as cópias
Int22h levaria ao mecanismo de inversão clássico (fig. 7A e B). Porém um evento de
recombinação homóloga inter-cromossômica entre as cópias de mesmo sentido causaria uma
duplicação-deleção recíproca (fig.7C e 7D) (Bagnall et al., 2006).
38
Fig. 7. Mecanismo hipotético de formação da inv22. Baseado em Bagnallet al.
(2006). As setas representam o sentido da transcrição. (A) Recombinação homóloga
intracromossômica distal ao gene; (B) Recombinação homóloga intracromossômica proximal;
Exons 1 a 22 apresentam orientação invertida levando à produção de um transcrito defeituoso
e de um FVIII truncado. (C) Recombinação homóloga intercromossômica causando deleção e
duplicação recíproca. (D) recombinação homóloga intracromossômica causando deleção;
39
1.3. O Desenvolvimento de Inibidores Contra o FVIII
Uma das complicações mais sérias no tratamento de hemofílicos é o desenvolvimento de
anticorpos (inibidores) contra o FVIII, cuja ampla maioria é pertencente à classe IgG (Rieger,
1996), o que leva à diminuição da qualidade e expectativa de vida dos pacientes (Scandella et
al., 1993). A incidência de inibidores em diferentes populações de hemofílicos A é muito
ampla, variando de 7 a 30% (Lusher et al., 1993), sendo que no Brasil ela foi estimada em
torno de 20% (Rieger & Roisenberg, 1999).
Inibidores contra o FVIII são classificados em tipo I ou de alta resposta e tipo II ou de
baixa resposta. Inibidores do tipo I são anticorpos que inibem completamente o fator VIII
devido à alta afinidade, ligação tempo-dependente (dependência de dose), e normalmente
apresenta uma ligação irreversível que segue uma cinética de segunda ordem. (Aly & Hoyer,
1992; Aly, 1992).
Títulos do inibidor de tipo I apresentam-se altos após infusões repetidas de
concentrados de fator VIII e mantêm-se elevados mesmo na ausência de tratamento
(estímulo), podendo ser detectadas suas concentrações durante meses e até anos (resposta
anamnésica) (Aly & Hoyer, 1992; Aly et al., 1992).
Inibidores do tipo II não inibem completamente a função do FVIII, não apresentando
resposta ou uma resposta anamnésica mínima, com um baixo título e baixa afinidade, com um
tempo independente da dose e reversível; além disso, seguem uma cinética de reação de fases
múltiplas (multifásica). Os hemofílicos comumente apresentam inibidores do tipo I, enquanto
que os não-hemofílicos apresentam predominantemente o tipo II (Aly & Hoyer, 1992; Aly et
al., 1992., 1992; Nilsson, 1994) e podem apresentar uma desordem adquirida semelhante à
hemofilia A (Nilsson, 1994).
Segundo Rieger (1996), dois grupos liderados por M. S. Gawryl e L.W. Hoyer em
1982 estudaram a inativação do FVIII nos dois tipos diferentes de inibidores e sugeriram que
40
inibidores do tipo I e do tipo II interagem com diferentes determinantes antigênicos do FVIII.
Inibidores do tipo I interagem com determinantes próximos ao sítio da atividade pró-
coagulante, enquanto que os do tipo II interagem com o determinante próximo ao sítio de
ligação do FVIII com o fator von Willebrand (FvW). Neste caso, o impedimento estérico
explicaria a maneira de inativação do FVIII:C pelos inibidores do tipo II (Rieger 1996).
Doenças autoimunes, como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e
polimiosites; malignidades; doença inflamatória intestinal e certas inflamações cutâneas estão
associadas com inibidores do tipo II. (Aly & Hoyer, 1992; Aly et al., 1992; Nilsson, 1994;
Fay, 1999; Gill, 1999).
Algiman et al. (1992), estudando doadores de sangue saudáveis, verificaram que 17%
apresentam inibidores. Apesar dos anticorpos detectados serem do tipo IgG e apresentarem
atividade neutralizante contra o FVIII, os níveis médios de atividade do FVIII não diferiram
significativamente entre os grupos com e sem inibidor. Outra observação interessante é o fato
das amostras com inibidor neutralizarem a atividade coagulante do fator VIII em misturas de
plasmas normais, mas não neutralizarem o FVIII da própria amostra, sugerindo que os
anticorpos naturais desenvolvidos contra o FVIII em indivíduos saudáveis são policlonais e
podem estar dirigidos contra diferentes epitopos, representando um polimorfismo não
identificado no FVIII.
Por outro lado, Mondorf et al. (1994), investigando a presença de anticorpos através
de uma técnica imunoenzimática (ELISA), encontraram que 5,43% dos indivíduos com níveis
de FVIII normais apresentavam anticorpos contra o FVIII, sugerindo que os anticorpos
presentes nesses indivíduos não apresentavam atividade inibidora.
Alguns trabalhos mostram que hemofílicos portando certos tipos de mutações no gene do
FVIII, dentre eles inversões e grandes deleções, podem apresentar o desenvolvimento de
inibidores (Ljung et al., 1992; Nilsson & Lamme, 1993; Hoyer, 1995; Tuddenham & Mcvey,
41
1998; Bowen, 2002; Astermark et al., 2005). Além disso, a produção de inibidores pode
variar conforme a idade, a origem étnica, a dose de FVIII administrada, a freqüência de
exposição, a idade do primeiro tratamento e a atividade do produto (Astermark et al., 2005;
Penner, 2001; Nilsson & Lamme, 1993; Dasgrupta et al., 2007). A figura 8 resume, em
grandes blocos, os fatores acima mencionados.
42
Fig. 8. Fatores de risco associados com o desenvolvimento de resposta imune
contra o FVIII em hemofilia A. Dasgupta et al., 2007.
43
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
O presente trabalho visa o estudo de duas inversões (Inv1 e Inv22) presentes no gene do
Fator VIII em hemofílicos A graves, bem como uma série de outras características
relacionadas com o desenvolvimento de inibidores do FVIII nos pacientes, com o intuito de
auxiliar na obtenção de mais informações sobre o perfil dos hemofílicos A do tipo grave do
Rio Grande do Sul.
2.2. Objetivos Específicos
Dentre os objetivos específicos destacam-se:
• A verificação da freqüência das duas inversões (inv1 e inv22) nas amostras estudadas
e com base nessas informações a estimativa de suas freqüências na população de hemofílicos;
• Caracterizar as populações de hemofílicos A grave quanto à etnia e ao número de
pacientes/famílias com hemofilia A portando essas inversões;
• Verificar a possível associação entre a presença dessas inversões e a produção de
inibidores nos hemofílicos estudados.
• Estudar outros fatores relacionados ao desenvolvimento de inibidores nos pacientes
estudados (etnia, idade, casos múltiplos familiares, tipo de tratamento utilizado, sua dose e
duração, presença de infecção viral crônica).
44
Capítulo 2. Introns 1 and 22 inversions and factors VIII inhibitors in patients with
severe hemophilia A in southern Brazil
Artigo submetido para publicação na revista “Haemophilia”.
45
Introns 1 and 22 inversions and factor VIII inhibitors in patients with
severe haemophilia A in southern Brazil
LEONARDO BARBOSA LEIRIA, ISRAEL ROISENBERG, FRANCISCO MAURO
SALZANO AND ELIANE BANDINELLI
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970 Porto Alegre, RS, Brazil
RUNNING TITLE: INVERSIONS 1 AND 22 IN BRAZILIAN HAEMOPHILIACS
Keywords: inversions 1 and 22, factor VIII inhibitors, severe haemophilia A, antibody
formation, Brazilian haemophiliacs, risk factors
Correspondence: Prof. Francisco M. Salzano, Departamento de Genética, Instituto de
Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970
Porto Alegre, RS, Brazil. Tel + 55 51 3308-6747, Fax: + 3308-9823; e-mail:
46
Summary. A total of 107 unrelated severe haemophilia A patients living in the southern
Brazilian state of Rio Grande do Sul were studied in relation to the prevalences of inversions
present in introns 22 and 1, and a subsample of them (95) tested for the presence of Factor
VIII inhibitors. These data were then incorporated with those from 13 other countries and
2,509 patients. The frequencies of these two inversions show a remarkable homogeneity in
series collected in different continents, from people with diverse ethnic extraction. The
prevalence of inhibitors among patients with inversion 22, on the other hand, vary widely
(5%-51%), the value observed by us being the highest. The importance of obtaining data from
patients throughout the world to clarify the aetiology of this important complicating factor in
the therapeutics of the disease is emphasized.
47
Introduction
Haemophilia A is characterized by a wide heterogeneity of changes in the Factor VIII
(FVIII) gene. In severe haemophilia A (FVIII levels lower than 1%) the only common gene
defects are intron 1 (inv. 1) and intron 22 (inv. 22) inversions. Inv. 22 is much more frequent
than inv. 1 but both lead to highly defective FVIII proteins and in this way increase the risk of
formation of inhibiting anti-FVIII antibodies that interfere with treatment [1-5]. As part of a
long-term project we have been conducting for more than three decades now (selected
references in [6-9]) on different aspects of haemorragic diseases in our population, the present
report presents data on the prevalences of these two inversions in severe haemophiliacs A
from southern Brazil and their association with the presence of anti-FVIII inhibitors. Two
questions of general interest were asked: (a) do the frequencies of inv. 22 and inv. 1 vary
among severe haemophilia A patients distributed throughout the world? and (b) how variable
is the presence of anti-FVIII inhibitors in these series? In this way we are contributing to
enhance the knowledge about this important complicating factor in the therapeutics of the
disease.
Materials and methods
Patients and samples
The study included 107 unrelated families with 168 patients having severe
haemophilia A who are assisted by Rio Grande do Sul’s (Brazil) Center of Haematology and
Haemotherapy (HEMOCENTRO-RS). We have been collaborating with its staff for many
years now, providing specialized diagnosis for a series of haemorrhagic and other types of
haematological disorders. The average age of the patients was 21±14 years and 89% of them
were of European descent, the remaining 11% being of African or mixed origin, as
ascertained by visual inspection. Since no significant differences in relation to the variables
studied were obtained between Euro and Afro-Brazilians their results were pooled, but
separate frequencies according to continental origin can be supplied on request. Patients, their
parents, or legal representatives gave their consent to participate in the study. The
48
investigation was approved by the Federal University of Rio Grande do Sul Ethics
Committee.
Blood was collected in tubes with sodium citrate and DNA extraction carried out by
nonenzymatic and salting-out methods [10, 11].
Laboratory and statistical tests
Inverse PCR was employed for the detection of inv. 22 as described in [12], while a
rapid PCR was used for the identification of inv. 1 according to the technique of Bagnall et al.
[13]. Inhibitor titrations were performed using the Bethesda assay [14], and its absence was
defined as less than 1 BUml
-1
[15]. These latter determinations were made in 124 patients from
95 independent families. Pearson’s χ
2
and Fisher’s Exact test were utilized in the
heterogeneity tests using the SPSS program, version 12.
Results and discussion
Table 1 presents the result of inv. 22 and inv. 1 in our patients, comparing them with
series studied in 13 other countries, in a total of 2,509 individuals. The study of 2,093 severe
haemophilia A patients described by Antonarakis et al. [4] was also considered, but since the
series was a composite one including many centers and it was not possible to separate specific
populations from the whole it was not listed in the Table. The frequency of inv. 22 found by
them (42%) is however well within the range shown in Table 1 (39%-49% in 14 of the 19
series distributed along 14 countries listed there). The prevalences of inv. 1 varied from 0% to
8% in basically the same series and countries. Considering the different sample sizes and he
variety of countries considered there is a remarkable homogeneity, no statistically significant
differences between them being observed.
Results concerning the quantitative presence of inhibitors in haemophiliacs with or
without inversions 22 and 1 of the present investigation are summarized in Table 2.
Independently of their status the majority showed low titres, with only two patients (one with
inv. 22 and the other without it) presenting a titre >5BU. The three carriers of inv. 1 did not
show inhibitors.
49
Our data for the relationship between inv. 22 and the presence/absence of inhibitors
were compared with those of eight other series, studied in Europe, Asia, and Latin America,
in Table 3. Now there is considerable between-series heterogeneity, the percentage of patients
with inv. 22 showing inhibitors varying all the way from 5% (Spain) to 51% (our data).
Complete information on this matter is not available for another Brazilian study, but
Figueiredo et al. [29] found only 13% of patients with inhibitors among 24 inv. 22
haemophiliacs with the severe form of the disease.
Therefore, as was already well emphasized by many authors [3, 5, 36-41] other factors
besides inv. 22 influence the presence of anti-FVIII inhibitors. To illustrate this point we
show information about differences in inhibition titres between carriers of the same inv. 22
inversion in two families studied by us (Table 4). The type of therapeutic agent used, the
possible influence of the von Willebrand factor as an immuno-chaperone agent for FVIII [39-
41], and the role of other characteristics of the genetic immunologic system of those affected
[5, 36] should be considered in patients throughout the world to disentangle the environmental
and genetic components of this phenomenon. We are presently starting an investigation about
the third approach listed above.
Acknowledgments
We thank Ana M.C.B. Pereira for laboratory help, as well as the patients and
HEMOCENTRO-RS’s staff for agreeing to participate in the study and for logistical support.
Funding was provided by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico, Institutos do Milênio and Apoio a Núcleos de Excelência Programs, and
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul.
50
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55
Table 1. Prevalence of introns 22 and 1 inversions in severe haemophiliacs from different
regions of the world
Inv. 22 Inv. 1
Population No. patients
% %
References
Europe
United Kingdom 209 45 2 [13]
Germany 753 45 2 [5]
Czech Republic 162 44 4 [16]
Hungary 104 52 0 [17]
Italy 20 40 5 [18]
93 42 6 [20]
293 41 2 [19]
Spain 102* 41 5 [21,22]
Portugal 135 54 2 [23]
Albania 19 10 0 [24]
Asia
Iran 124 40 2 [25]
India 80 44 3 [26]
89 56 2 [27]
Latin America
Mexico 31 45 0
†
[28]
Brazil 49 49 NA [29]
33 39 NA [30]
107 46 3 Present study
Argentina
80 45 1 [31]
Oceania
New Zealand 26 54 8 [32]
NA: Not available.
*The inv. 1 prevalence was obtained in an idenpendent series of 79 patients.
†
Sixty-five patients were screened for inv. 1.
56
Table 2. Presence of introns 1 and 22 inversions and development of FVIII inhibitors
Negative Low titre
Inhibitors
No. % No. %
Total
Presence of inv1 3 100 - 0 3
Presence of inv22 21 49 22 51 43
Absence of inv1 or inv22 33 67 16 33 49
Total 57 60 38 40 95
57
Table 3. Relationship between inversion 22 and the presence/absence of FVIII inhibitors
Population
With inv.22
and with
inhibitors
(1)
With inv.22
and without
inhibitors
(2)
%
inv.22 with
inhibitors
(1/1+2)
Without inv.22
and with
inhibitors
(3)
Without inv.22
and without
inhibitors
(4)
Total References
Europe
Spain N 1 19 4 31 55 [33]
% 2 35 5 7 56
Italy N 17 21 10 48 96 [34]
% 18 22 45 10 50
Asia
Iran N 9 40 6 67 122 [25]
% 7 33 18 5 55
India N 4 46 3 36 89 [27]
% 5 52 8 3 40
N 4 13 0 33 50 [35]
% 8 26 23 0 66
Latin America
Mexico N 3 4 2 5 14 [28]
% 21 29 43 14 36
Brazil N 22 21 16 36 95 Present study
% 23 22 51 17 38
Argentina N 5 37 11 38 91 [31]
% 5 41 12 12 42
Heterogeneity χ
2
: 78.9, 21 d.f., P=0.0000.
58
Table 4. Examples of patients with the same inversion 22 showing inhibitor status
discordance
Identification Present age Treatment type Inhibitor status
Family 1
Proband Deceased
(born 1948)
Plasma
Cryoprecipitate
Negative
Purified FVIII
Brother 1
57 Plasma
Cryoprecipitate
Purified FVIII
Positive
(5 BUml
-1
)
Brother 2 46 Plasma
Cryoprecipitate
Purified FVIII
Negative
Family 2
Proband Deceased
(born 1988)
Purified FVIII Negative
Brother 1 10 Purified FVIII Positive
(2 BUml
-1
)
Brother 2 8 Purified FVIII Negative
59
Capítulo 3. História natural de uma população de hemofílicos A graves do sul do
Brasil, com ênfase no desenvolvimento de inibidores do Fator VIII
Artigo a ser submetido para publicação na revista “Cadernos de Saúde Pública”.
60
História natural de uma população de hemofílicos A graves do sul do Brasil, com ênfase
no desenvolvimento de inibidores do Fator VIII
Natural history of a population of southern Brazilian severe hemophiliacs, with
emphasis in the development of Factor VIII inhibitors
Leonardo Barbosa Leiria, Israel Roisenberg, Francisco Mauro Salzano, Eliane
Bandinelli
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brasil.
Correspondência
F.M. Salzano, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS,
Brasil.
61
Abstract:
A characterization of a sample of severe hemophilia A patients living in the state
of Rio Grande do Sul that is being studied by our group for many years, with a special
emphasis in the presence or absence of factor VIII inhibitors was made. The latter
characteristic is the most important complication which occurs in the therapeutics of
these patients. A total of 168 severe hemophiliacs were considered, examined in relation
to the presence of inversions in introns 1 and 22, the dose of factor VIII administered,
the type of product utilized, time of treatment with purified factor VIII, ethnic
extraction, and age. Statistically significant associations between some of these factors
and the risk of development of these inhibitors were observed, that however disappeared
when a multiple regression logistic analysis was employed. The study, however, is
important for a first approach to the problem, that will be investigated by us specially
with relation to genetic factors in the immune system of these same patients.
Keywords: FVIII inhibitors, severe hemophilia A, hemophiliacs
62
Introdução
A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica com padrão de herança ligada
ao X, caracterizada pela deficiência no fator VIII (FVIII) da via de coagulação ou na sua
produção devido a mutações no gene do FVIII. A doença afeta cerca de 1 em cada 5000
nascimentos masculinos
1-3
. Dentre os tipos de hemofilia A (grave, moderado e leve), a
forma grave é encontrada em cerca de metade dos pacientes, e desses cerca de 50%
possuem uma mutação, uma inversão no intron 22 (Inv22) que leva à não produção do
FVIII, sendo esta a mutação de maior freqüência na HA grave, não sendo ela encontrada
nas outras formas
4-7
. A produção de anticorpos contra o FVIII exógeno(aloanticorpos),
cuja ampla maioria é pertencente à classe IgG, representa a maior complicação no
tratamento desta doença, sobretudo na sua forma mais grave (FVIII <1%), pois leva à
neutralização do FVIII infundido no paciente, acarretando uma diminuição na sua
qualidade e expectativa de vida
7
. A incidência de inibidores em diferentes populações
de hemofílicos A é muito ampla, variando de 5 a 30%, onde a maior parte é composta
por pacientes com a forma grave, prevalências de 25-30%, sendo de 5% para as outras
formas
8-12
. A presença de inibidores contra o FVIII em pacientes HA no Brasil foi
estimada numa freqüência em torno de 20%
13
. Segundo dados do Ministério da Saúde
são gastos anualmente mais de US$ 100 milhões de dólares com a importação de
hemoderivados para cerca de 9 mil hemofílicos atendidos pelo Sistema Único de
Saúde
14
.
Diversos trabalhos mostram que o risco de desenvolvimento de inibidores está
relacionado com fatores genéticos e ambientais
11,12,15-18
. Dentre os fatores genéticos
destacam-se alterações estruturais no gene do FVIII (genótipos de FVIII) e genes
envolvidos na resposta imune. Cerca de 80% das alterações genéticas no gene do FVIII
predispõe ao desenvolvimento de inibidores em 17-41% dos pacientes com HA
11
.
63
Mutações associadas com a ausência do produto gênico, como no caso de deleções e
inversões, possuem um maior risco de seus portadores apresentarem inibidores
11,19,20
.
Polimorfismos em genes relacionados com o sistema imune, como genes codificadores
para citocinas (interleucina 10, IL-10) e fatores imunoreguladores como o fator de
necrose tumoral (TNF-α) também estão relacionados com a presença de inibidores,
sendo que esses fatores parecem ser mais importantes do que alterações estruturais no
gene do fator VIII
18,21
.
Fatores ambientais como a dose de FVIII administrada, a idade da primeira
exposição, a freqüência de exposição, o hemoderivado utilizado e a atividade do
produto são fatores de risco ao desenvolvimento de inibidores contra o FVIII
11,16-18,22
.
Além disso, o tipo de FVIII utilizado no tratamento - purificado, altamente purificado,
recombinante ou derivado de plasma - também é um fator de risco
22-24
.
Outros fatores, como a severidade da doença, o histórico familiar de inibidores e
a idade dos pacientes, sua origem étnica, são fatores de risco ao desenvolvimento de
inibidores contra FVIII
11,16,18-21,25-26
. Num estudo com irmandades
19
, o risco relativo foi
de 3,2x maior para pacientes que apresentavam ao menos um irmão desenvolvendo
inibidores; além disso, a incidência de inibidores em pacientes com irmandades é maior
que nos casos esporádicos; e segundo alguns autores
19,23
a incidência de inibidores em
pacientes de origem africana é duas vezes maior que em pacientes de origem européia.
O objetivo deste trabalho é descrever uma população de hemofílicos graves que
vem sendo objeto de estudos de nosso grupo por muitos anos, considerando possíveis
fatores que influenciariam no desenvolvimento de inibidores contra o FVIII.
64
Métodos
Pacientes e aspectos éticos
Foram estudados 168 pacientes com hemofilia A grave representantes de 136
famílias não aparentadas que são assistidos nas redes HEMOCENTRO do Rio Grande
do Sul, Brasil. Todos os pacientes ou seus representantes legais assinaram um termo de
consentimento livre e esclarecido e aceitaram livremente participar deste estudo; e este
foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. A média de idade dos pacientes foi de 23±14 anos (intervalo de 3-66 anos),
sendo 91% dos pacientes de origem européia e 9% de origem africana ou mestiça.
Dosagens de inibidores contra o FVIII e estudos moleculares
O sangue dos pacientes foi coletado por punção venosa e a partir dele foram
realizados os ensaios de atividade para dosagens dos inibidores contra o FVIII segundo
o método de ensaio Bethesda
23,
tendo como ponto de corte dosagens de inibidores <1
UB/ml
24
. Para os estudos moleculares do FVIII foram realizadas as genotipagens das
inversões do intron 1
22
e do intron 22
24
.
Análise estatística dos dados
Foram coletados dados sobre a origem étnica dos pacientes, dose de FVIII
recebida nos últimos três anos (2005-2007), tipo de hemoderivado utilizado desde o
início do tratamento até hoje, tempo de tratamento, idade e presença de infecção viral
por HIV (vírus da Imunodeficiência Humana), HCV (vírus da hepatite C), ou HBV
(vírus da hepatite B). Para as análises de dados foram utilizados testes paramétricos e
não paramétricos: o teste t, o teste de Mann-Whitney, o teste de Qui-quadrado e o teste
Exato de Fisher, conforme a necessidade dos dados. Para se verificar a dependência do
65
desenvolvimento de inibidores com relação a fatores múltiplos de risco foi realizada
uma análise por regressão logística. Todos os dados estatísticos foram desenvolvidos
utilizando-se o programa SPSS 12.
Resultados e Discussão
Na Tabela 1 estão apresentadas as principais características dos 168 pacientes.
Desses 53 apresentaram inibidores contra o FVIII (31,5%) correspondendo a 49
famílias (36%). Formalmente, nas análises univariadas discriminadas na tabela ocorrem
associações significativas com relação a: 1. Tipo de tratamento com crioprecipitado:
60% dos indivíduos que apresentaram inibidores fizeram o tratamento com
crioprecipitado, enquanto 39% dos que não desenvolveram inibidores utilizaram este
tratamento; 2. Dose e tempo de uso de FVIII purificado (probabilidade no limiar da
significância estatística); e 3. Idade: a partir dos 3 anos de idade quanto maior a idade,
maior a prevalência de inibidores. Entretanto, muitos dos tratamentos envolvem mais de
um produto, e naturalmente, indivíduos mais velhos geralmente receberam mais doses
terapêuticas do que os mais jovens.
A Tabela 2 fornece dados sobre os casos múltiplos que ocorreram nas famílias
estudadas, relacionando-os com a presença ou ausência de inibidores. Foram dosados
inibidores de mais de um indivíduo de 22 famílias. Com relação à presença de
inibidores nas famílias, em 9 nenhum paciente apresentou inibidores (41%), em 2 todos
os pacientes apresentaram inibidores (9%) e em 11 os dados de inibidores entre os
familiares foram discordantes entre si (50%). Apenas 6 pacientes de famílias não
aparentadas desenvolveram inibidores de alta resposta, (níveis de inibidores maiores
que 5 UB/ml), sendo 3 casos esporádicos e 3 familiares. Um dos casos esporádicos
apresentou ao longo do estudo, um decréscimo dos níveis de inibidores basais,
66
chegando esse a zero. Os três casos familiares apresentaram níveis de inibidores
discordantes: um caso de discordância entre dois irmãos, outro de discordância entre os
níveis de dois irmãos e um primo e o último em relação a dois irmãos e seu tio.
Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a presença da
inversão do intron 22 e o desenvolvimento de inibidores nos pacientes mesmo quando
separados por grupos étnicos (Tabela 3).
Quando se faz uma regressão logística considerando quatro das variáveis
principais estudadas (Tabela 4) as diferenças se mostraram estatisticamente não
significativas, ou seja, os fatores estudados, quando controlados entre si, não se
apresentaram como fatores de risco significativos na predição do desenvolvimento de
inibidores nos pacientes; o mesmo se refere quanto à presença de infecção viral crônica
(HIV, HCV ou HBV).
Quando se trata do desenvolvimento de inibidores em pacientes com hemofilia
A, especialmente com a forma grave, uma das grandes questões quanto aos inibidores é
por que alguns pacientes com HA grave desenvolvem inibidores enquanto outros não.
Como já mencionado, muitos fatores genéticos e ambientais estão relacionados com
essa característica. Face ao mencionado, e considerando que muitos desses fatores de
risco foram por nós avaliados, a pergunta é por que na análise global de nossa amostra
as diferenças mostraram-se não significativas. Embora o tamanho amostral não seja
pequeno (168 pacientes) é possível que devido a distribuições específicas das variáveis
consideradas um número maior de pacientes tivesse de ser investigado, evitando a
reunião de diferentes fatores de um só grupo. Adicionalmente, um enfoque que nos
parece bastante promissor é o da investigação de fatores específicos relacionados ao
sistema imune dos pacientes. O assunto é muito importante porque somente através da
elucidação da relação herança/ambiente será possível ter uma profilaxia mais eficiente e
67
assim melhorar a qualidade de vida dos pacientes com hemofilia A que utilizam as
terapias de reposição de fator.
68
Resumo
Foi feita a caracterização de uma amostra de hemofílicos graves residentes no
estado do Rio Grande do Sul que vem sendo estudada pela nossa equipe por muitos
anos, com ênfase especial na presença ou não de inibidores do fator VIII, a maior
complicação que ocorre na terapêutica desses pacientes. Foram considerados 168
pacientes com hemofilia A grave nos quais se examinou a presença das inversões dos
introns 1 e 22, a dose do fator VIII administrada, o tipo de produto utilizado, o tempo de
tratamento com o fator VIII purificado, a etnia e a idade dos pacientes. Foram
observadas associações significantes entre alguns desses fatores e o risco de
desenvolvimento de inibidores que, entretanto, desapareceram após uma análise de
regressão logística múltipla. As possíveis razões para esses achados foram apresentadas.
O estudo serve, no entanto, como uma primeira aproximação do problema, que
continuará a ser investigado por nós com relação, especialmente, a fatores genéticos no
sistema imune desses pacientes.
69
Colaboradores
L. B. Leiria foi responsável pelo desenvolvimento da parte experimental e das
análises estatísticas posteriores, sob a orientação de I. Roisenberg e E. Bandinelli.
Todos os autores foram responsáveis pela elaboração e redação do texto. F. M. Salzano
contribuiu também na coordenação final.
Agradecimentos
Agradecemos a Ana M. C. B. Pereira por auxílio no laboratório, a Sidia M.
Callegar-Jacques por assistência na parte estatística, bem como aos pacientes e
profissionais do HEMOCENTRO-RS por concordarem em participar do estudo e por
apoio logístico. O suporte financeiro foi fornecido pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Programas Institutos do Milênio e Apoio a
Núcleos de Excelência e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do
Sul.
70
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73
Tabela 1
Características básicas dos pacientes e sua relação com a presença ou ausência de inibidores
Características Presença de
Inibidores
Ausência de
Inibidores
Total Probabi
lidade
(P)
Teste
Etnia
Eurodescendentes
Afrodescendentes
47
5
106
10
153
15
0,999
Fisher
Alterações no gene
do FVIII
1
Inv22
Inv1
Sem Inv1 ou Inv22
24
0
29
50
6
59
74
6
88
0,959
Q
ui-quadrado
Tipo de tratamento
utilizado (+/-)
Sangue ou plasma
Crioprecipitado
FVIII/FvW
11/41
31/21
30/22
21/95
45/71
56/60
168
168
168
0,800
0,019
0,336
Q
ui-quadrado
Q
ui-quadrado
Q
ui-quadrado
Dose média de
fator VIII
(UI/kg/ml)
purificado
1,2
<20
20-40
40-60
60-80
80-100
100-120
120-140
140-160
160-180
180-200
>200
8
7
6
12
5
3
2
1
0
3
5
26
17
13
22
14
7
1
3
1
3
9
34
24
19
34
19
10
3
4
1
6
14
0,056
Mann-
Whitney
Idade (anos)
1
3-5
5-10
10-15
15-20
20-25
25-30
30-40
>40
2
3
13
5
8
5
4
12
9
19
17
16
12
11
20
12
11
22
30
21
20
16
24
24
0,034
Teste t
74
Tabela 1 Cont
Características básicas dos pacientes e sua relação com a presença ausência de inibidores
Características
Presença de
inibidores
Ausência de
inibidores
Total
Probabilidade
(P)
Teste
Tempo de
tratamento com
FVIII purificado
(anos)
1
3-5
5-10
10-15
15-20
1
11
35
5
8
28
79
1
9
39
114
6
0,016
Teste t
Presença de
infecção viral
crônica (HIV,
HBV ou HCV)
Sim
Não
8
44
16
100
24
144
0,973
Q
ui-quadrad
o
¹ Dados utilizados na Regressão Logística.
² Dose média de fator VIII infundida nos últimos três anos.
75
Tabela 2
Informação sobre casos múltiplos em uma mesma família e sobre a presença ou
ausência de inibidores
Tipo de caso Geral Presença de inibidores
Familial Esporádico
Número de famílias 22 27
Número de pacientes 32 27
Familial Detalhamento N° de
famílias
N° de pacientes
testados por irmandade
1. Famílas sem a presença de
inibidores
4
5
3
2
2. Famílias com todos os
pacientes com inibidores
2 2
3. Discordância entre
familiares
4
1
6
3
4
2
76
Tabela 3
Freqüência das inversões dos introns 1 e 22 nos pacientes classificados por etnia e
presença ou ausência de inibidores
Euro- descendentes Afro-descendentes Característica
Com Inib Sem Inib Com Inib Sem Inib
Inv1 0 6 0 0
Inv22 22 46 2 4
Sem Inv1 ou
Inv22
25 54 3 6
*Qui-quadrado P=0,930.
77
Tabela 4
Associação entre a presença ou ausência de inibidores com as diversas variáveis controlada
pelas covariantes
1,2
Intervalo de Confiança
(IC OR, 95%)
Fator Probabilidade
(P)
Odds ratio
(OR)
Menor Maior
Inv22 0,937 1,029 0,512 2,065
Idade 0,090 0,281 0,65 1,219
Dose FVIII (<30
U/kg/ml)
Dose FVIII (30-60
U/kg/ml)
Dose FVIII (>60
U/kg/ml)
------
0,579
0,194
1
1,349
1,727
-----
0,468
0,757
------
3,887
3,936
Tempo de uso do fator
VIII em anos
0,466 0,659 0,215 2,022
Tratamento com
crioprecipitado
0,108 1,802 0,878 3,700
¹Covariantes estudadas: presença/ausência de inv22, idade dos pacientes, dose de FVIII
purificado, tempo de uso de FVIII purificado em anos, uso ou não de crioprecipitado
(Crio) no tratamento.
²Regressão Logística: P=0,293.
78
Discussão
As técnicas empregadas
Figueiredo et al.(1994) e Soares et al. 2001 foram os primeiros a descrever a
freqüência da inv22 em pacientes com HA grave no Brasil, utilizando a técnica de
Southern blotting. Em 1998, Liu et al. desenvolveram uma técnica de detecção baseada
na amplificação de fragmentos de DNA maiores do que 10 kb (LD-PCR) a partir de
ciclos múltiplos de anelamento e extensão (subcycling). Essa técnica foi utilizada no
início de nosso trabalho, porém com a mesma há dificuldades na amplificação e a
necessidade de condições muito específicas para se obter um sucesso e um diagnóstico
do material molecular correto.
Em 2005 Rossetti et al. desenvolveram uma técnica de PCR inverso (I-PCR),
que se constitui em uma forma mais rápida, eficiente e de menor custo na detecção
dessa inversão e que foi utilizada nesse trabalho, sendo que todos os pacientes testados
anteriormente com a técnica descrita por Liu et al. (1998) foram confirmados. Bagnall
et al. (2006) desenvolveram uma técnica baseada na descrita por Liu et al. (1998),
também analisando amplicons de grande tamanho (10,11,12 kbs), porém capaz de
detectar e discriminar os subtipos dessa inversão (Int22h). Essa técnica não foi utilizada
devido ao seu custo mais elevado e porque na inv22 os dois produtos (proximal e distal)
levam à não produção da proteína, não havendo diferenças entre elas no fenótipo final
dos pacientes.
A técnica utilizada na quantificação dos inibidores foi baseada no método
Bethesda, e foi descrita por Kasper et al. (1975) e Kasper (1995); o ponto de corte
escolhido para a presença de inibidores foi de 1 UB/ml, considerado o melhor ponto de
corte para evitar falsos positivos. Outros trabalhos utilizam variações nesta técnica e
79
pontos de corte diferentes. Diferenças na metodologia empregada na coleta, detecção e
o tipo de estudo realizado podem explicar algumas discrepâncias entre os resultados
observados nos trabalhos publicados.
A hemofilia A e suas complicações
A hemofilia A é a segunda doença genética hemorrágica mais freqüente na
população humana, e metade dos pacientes acometidos por ela apresentam a forma mais
grave da doença, acarretando dificuldades físicas e psicológicas. Essas induzem danos
articulares causados pelas hemartroses e hemorragias por traumas em geral, sendo a
reposição do FVIII a forma de tratamento mais eficiente. Porém alguns pacientes,
quando submetidos à infusão de FVIII acabam desenvolvendo anticorpos contra esse
fator (inibidores), dificultando a ação terapêutica. Muitos fatores genéticos e ambientais
foram descritos como fatores de risco à essa predisposição (Dasgupta et al., 2007).
Dentre os fatores genéticos estariam grandes inversões e deleções. Duas inversões (inv1
e inv22) ocorrem numa parcela considerável dos hemofílicos graves despertando um
grande interesse para a sua detecção. Além disso, estudos iniciais mostraram que a
inversão mais freqüente (inv22) poderia ser um fator de risco ao desenvolvimento de
inibidores; entretanto, trabalhos recentes não encontram tal associação, como foi
relatado nos capítulos 2 e 3.
No capítulo 2 é estabelecida a freqüência dessas inversões na amostra estudada e
realizada uma comparação com os principais trabalhos referentes à freqüência das
mesmas e sua associação ao desenvolvimento de inibidores. Como foi demonstrado, as
populações apresentam freqüências médias muito próximas e não associadas com o
desenvolvimento de inibidores, apesar de pacientes com a inversão possuírem uma
maior freqüência, em média, desses inibidores.
80
Outros fatores de risco foram estudados (capítulo 3), tais como a dose de FVIII
recebida, o tempo de seu uso, o grupo étnico, a utilização de determinados
hemoderivados e a idade dos pacientes.
A literatura registra que pacientes não euro-descendentes quando comparados
com euro-descendentes apresentam títulos mais elevados e freqüência maior de
inibidores. Porém, em nossa amostra isso não ocorreu, não sendo as diferenças
significativas. Um estudo brasileiro sobre a epidemiologia dos inibidores em pacientes
com HA mostrou que o grupo composto por euro-descendentes apresentava uma
freqüência de inibidores maior que no grupo de afro-descendentes (Rieger &
Roisenberg, 1999) e que pacientes das regiões sul e sudeste (regiões de colonização
predominantemente européia) apresentavam uma maior incidência de inibidores que os
pacientes das demais regiões do Brasil. Uma possível explicação para essa diferença
entre a população brasileira e as demais, é que nossa população é miscigenada, e mesmo
apresentando características externas européias, os fatores imunogenéticos relacionados
com o risco de inibidores de origem africana estariam presentes nessa população
aparentemente caucasóide. Por outro lado, o baixo número amostral de pacientes de
origem não-européia de nossa amostra pode estar mascarando as diferenças existentes
entre essas duas populações no Rio Grande do Sul.
No Brasil, até o momento, não é utilizado como terapia de reposição o fator VIII
produzido de forma recombinante, sendo utilizados apenas hemoderivados produzidos a
partir de plasma humano purificado. Nos Estados Unidos e em países europeus é
comum a utilização do Fator VIII recombinante nas clínicas de hemoterapia. Muito se
discute a respeito da imunogenicidade do fator FVIII recombinante frente aos derivados
de plasma ou menos purificados. Muitos autores defendem que moléculas presentes em
hemoderivados produzidos a partir de plasma humano seriam menos imunogênicas que
81
hemoderivados de fatores VIII altamente purificados ou recombinantes. Nesse modelo,
pacientes expostos exclusivamente a fatores derivados de plasma apresentariam em
média freqüências menores de anticorpos e inibidores de baixo título. Note-se, no
entanto, que a nossa amostra apresenta uma freqüência de inibidores mais elevada do
que as de populações que utilizam o FVIII recombinante, mas nossos pacientes
apresentaram predominantemente inibidores de baixo título, sendo que em apenas 6
famílias os pacientes apresentaram inibidores de alta resposta. Isto contrasta com os
resultados dos outros países, nos quais a freqüência de inibidores de alta resposta é
elevada.
Os primeiros contatos com o FVIII (50 primeiras doses) estão diretamente
relacionados com a produção de inibidores nos pacientes. Em estudos com hemofilia
moderada, doses iniciais de FVIII na infância são fatores de risco para o
desenvolvimento de inibidores, e em inibidores de baixo título eles desaparecem à
medida que aumenta a freqüência do tratamento. Doses profiláticas freqüentes teriam
um menor risco de desenvolvimento de inibidores que doses recebidas apenas quando
existe o trauma. Não foram registrados em nossa amostra os primeiros contatos com o
tratamento, pois em hemofílicos graves normalmente os pacientes são diagnosticados
nos primeiros meses de vida. Porém o tempo de uso do FVIII e a idade dos pacientes
estariam indiretamente relacionados com esse fator de risco.
Muitas questões ainda estão por resolver quanto à produção de inibidores do
FVIII: por que alguns pacientes desenvolvem inibidores e outros não? por que gêmeos
monozigóticos e/ou irmandades com a mesma mutação apresentam discrepâncias
quanto à presença de inibidores, apesar de receberem o mesmo tratamento? por que um
paciente que recebe continuamente FVIII apresenta inibidores de títulos baixos por um
curto período de tempo, enquanto outros não os apresentam ou apresentam títulos altos?
82
Todas essas questões e os mecanismos que envolvem o desenvolvimento dos inibidores
ainda não estão claros, sendo necessários mais estudos para o melhor entendimento
dessa principal complicação na qualidade de vida dos pacientes graves.
83
Conclusão Final e Perspectivas
A detecção da inv22 e inv1 nos pacientes é importante para o aconselhamento
genético, porém com relação à produção de anticorpos contra o FVIII essas alterações
estruturais parecem não influenciar no risco. Fatores não genéticos como a dose e o tipo
do fator, bem como a idade dos pacientes, parecem influenciar no desenvolvimento de
inibidores.
Como perspectivas para o estudo dos pacientes com HA podem-se mencionar a
busca por outras mutações no gene do FVIII candidatas a influenciarem o
desenvolvimento de inibidores e o estudo de fatores de risco imunogenéticos, como
genes reguladores da resposta imune (IL-10, TNF-α) e ambientais, como a idade inicial
de tratamento.
84
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94
Apêndices
1. Seguimento
2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
3 .Ficha Clínica dos Pacientes
95
Apêndice 1. Seguimento
Após a finalização das análises e do texto do primeiro artigo (capítulo 2) foram
obtidos novos dados e feitas algumas comparações adicionais como segue.
Foram estudados 229 pacientes com hemofilia A grave, representando 158
famílias residentes no Rio Grande do Sul. A média de idade foi de 23±14 anos (IC:1-66
anos) e aproximadamente 90% da amostra está representada por pacientes de origem
européia, os outros 10% sendo formada por indivíduos de origem não- européia ou
miscigenada. Quanto ao histórico familiar (presença de hemofilia nas últimas 3
gerações), 85 famílias (54%) apresentavam apenas um paciente com hemofilia A (casos
esporádicos), as demais sendo compostas por mais de um indivíduo afetado dentro de
cada família (46%).
Nas famílias de euro-descendentes 26 casos isolados apresentaram a Inv22, 1
caso a Inv1 e outros 47 não apresentaram nenhuma delas. Já nas famílias de origem não-
européia, os casos isolados foram de 7, zero e 4, respectivamente.
Quando o histórico familiar é comparado com a presença das inversões cerca de
35% dos pacientes com a inversão do intron 22 são casos esporádicos. Este dado está de
acordo com os encontrados nas populações da Argentina (Rossetti et al., 2007), Itália
(Acquila et al., 2003b) e República Tcheca (Habart et al., 2003).
As freqüências da inv22 e da inv1 foram respectivamente de aproximadamente
42% e 3% nas famílias. Este dado quando comparado aos dados do capítulo 2, não
apresentou diferença estatisticamente significativa.
96
Apêndice 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Queremos convidá-lo para participar de um estudo sobre aspectos genéticos
relacionados com a Hemofilia. Para o presente projeto estaremos investigando a
ocorrência de duas variantes moleculares do gene do fator VIII (INVERSÕES INV1 E
INV22) em pacientes com hemofilia A no Rio Grande do Sul.
A sua participação voluntária é muito importante para que possamos chegar a
conclusões que possam lhe beneficiar, a seus familiares ou a outros pacientes em futuros
tratamentos e aconselhamento genético. Você tem o direito de se retirar do estudo a
qualquer momento, bastando unicamente manifestar a sua vontade, sem prejuízo de seu
tratamento. As informações são confidenciais e as conclusões serão utilizadas para
publicações em revistas científicas e congressos científicos, sempre com total sigilo das
identidades dos pacientes.
Como os assuntos em medicina evoluem rapidamente, estamos também
solicitando o seu consentimento para que o DNA obtido da sua amostra de sangue seja
armazenado para esta pesquisa e possa ser analisado para outros fatores, que
futuramente venham a serem considerados importantes para esta linha de pesquisa.
Eventualmente, seus familiares poderão também ser convidados a participar da
pesquisa.
Para realizarmos o estudo é necessário que, além de responder a um
questionário, sejam coletados 10mL de sangue de uma veia periférica. O volume
coletado não tem repercussão sobre seu organismo e o único desconforto que você
poderá sentir será a dor da picada da agulha e eventualmente a formação de um pequeno
hematoma.
97
Garantimos que todos os procedimentos realizados estão de acordo com as
normas previstas nas resoluções do Conselho Nacional de Saúde n° 196/96 e n° 347/05
e que lhe será entregue uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido.
Os resultados dos exames estarão à sua disposição com os pesquisadores
responsáveis Leonardo Barbosa Leiria, Eliane Bandinelli e Israel Roisenberg,
Laboratório de Hemostasia, Departamento de Genética, UFRGS, Av. Bento Gonçalves
9500, Prédio 43323, telefone 3308-6728.
Eu, _______________________________________ (ou meu responsável legal),
abaixo assinado estou ciente dos termos acima descritos e concordo com a minha
participação no estudo.
…………………………………………………...................
assinatura do paciente ou responsável legal
....................................................................................................
assinatura do investigador, pesquisador ou médico responsável
...................................................................................................
assinatura de testemunha
Declaro que esse formulário foi lido para o paciente
………………………………………………………..em……../………/……., pelo
(a) ………………………………………………………….enquanto
eu………………….…………………estava presente.
…………………………………………….
assinatura da testemunha
Porto Alegre, ____ de ______________ de ________.
98
Apêndice 3. Ficha Clínica dos Pacientes
FICHA CLÍNICA DE PACIENTE
DNA n°: ________ LOCAL: __________ AMOSTRA: _________________
GENEALOGIA nº: ______________ Data: ___/___/___
1. IDENTIFICAÇÃO
Nome:_________________________________________________________________
Fone 1: ______________ Fone 2: ____________ Sexo: 1- masculino 2- feminino
Data de nascimento: ___/___/___ Idade: ___________ Estado Civil:______________
Endereço: ___________________________________________ Bairro: ____________
Cidade: __________________ Estado: ____ CEP: __________
Local de nascimento: _____________________________________________________
Nome do pai: _____________________________________________ Idade: _______
Local de nascimento: __________________ Falecido: Causa: _________________
Nome da mãe: _____________________________________________ Idade: _______
Local de nascimento: __________________ Falecido: Causa: _________________
Entrevistador: _________________
Grupo étnico (impressão do examinador): 1- caucasóide 2- negróide 3- outro
Entre as seguintes opções, como você se classifica em relação à cor da pele?
1- branco 2- negro 3- mulato 4- oriental 5- índio 6- outros
Origem dos avós/bisavós (Europa, África, Ásia - se possível, especificar o país):
______________________________________________________________________
99
2. HISTÓRICO CLÍNICO
Sintomas (sangramentos): S – Sim; N – Não; P – Prejudicado; R – Raro
1 – Primeira dentição 2 – Dentição definitiva 3 – Equimoses e/ou hematomas
4 – Hemartroses 5 – Epistaxes 6 – Gengivorragias
7 – Hematúria 8 – Melena 9 – Hematemese
10 – Cortes 11 – Cirurgias 12 – Hipermenorréia
13 – Outras hemorragias: ________________________________________________
Primeiros Sintomas:______________________ Idade: _____________
Tratamentos: Fator VIII Crioprecipitado Feiba (FVII/FII/FX) Plasma
Outros:_______________________
Causas:________________________________________________________________
Freqüência do Tratamento:_________________________________________________
Início do Tratamento:_____________________________________________________
Último Tratamento (dias):_________________________________________________
Presença de Inibidor: __________ Maior Título:________ Menor Título: ___________
Peso:_____________
Outros Afetados na Família: Sim Não
100
3. HISTÓRIA FAMILIAR
Parentes com histórico de sangramento
Nome Grau de Parentesco Sintomas Afetado
1
2
3
4
5
6
Heredograma:
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