( PDF ) Estudo de associação de variações dos genes BCHE (Butirilcolinesterase) e GHRL (Grelina) com obesidade.

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VÍTOR DE GÓES LIMA DANTAS

ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE VARIAÇÕES DOS GENES BCHE

(BUTIRILCOLINESTERASE) E GHRL (GRELINA) COM OBESIDADE

Dissertação apresentada

Ao Programa de Pós-Graduação em

Genética, Área de Concentração em

Genética, Departamento de Genética,

Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná, como

parte das exigências para a obtenção

do título de mestre em Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Eleidi A.

Chautard Freire Maia.

Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo L. R.

de Souza.

CURITIBA

2008

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III

“VENI, VIDI, VINCI”

Julio César

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AGRADECIMENTOS

A meus pais e irmãos, que com muito carinho e amor puderam sentir a dor da

separação e apoiar-me nas decisões mais importantes da minha vida, além de me

ajudarem a viver esse mestrado;

À professora Eleidi A. Chautard Freire Maia, que foi como uma mãe, pela

orientação, carinho, apoio e puxões de orelha quando necessário;

Ao professor Ricardo Lehtonen Rodrigues de Souza, o nosso “irmão mais

velho”, pela co-orientação, apoio e amizade e salvamento quando algo dava errado;

Aos colegas de laboratório, Átila, Kelly, Fabiana, Dellyana, Carol, Alejandro,

Henrique, que colaboraram para o desenvolvimento da parte experimental do projeto

me ensinando e me relembrando várias Modologias e também pelos momentos

divertidos que me proporcionaram ;

Ao HEMEPAR pela concessão das amostras de sangue;

À pessoa mais importante da minha vida, minha noiva linda e maravilhosa,

Wiolene, pelo apoio, carinho, paciência, dedicação e amor.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. VII

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... X

LISTA DE ABREVIATURAS SÍMBOLOS E SIGLAS.................................................. XI

RESUMO..................................................................................................................XIV

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................... 3

2.1. GENE DA GRELINA – LOCALIZAÇÃO E ESTRUTURA..........................................4

2.1.2. ESTRUTURA DA GRELINA ......................................................................................6

2.1.2.1. FORMA DES-ACILADA DA GRELINA.............................................................6

2.1.2.2. DESACILAÇÃO DA GRELINA PELA BUTIRILCOLINESTERASE E

OUTRAS ESTERASES ......................................................................................................7

2.1.2.3. ENZIMA ACIL-MODIFICADORA PARA A GRELINA..................................10

2.1.2.4. DERIVADOS DA GRELINA..............................................................................11

2.1.3. CONCENTRAÇÃO DA GRELINA E DISTRIBUIÇÃO DA GRELINA.................11

2.1.3.1. CONCENTRAÇÃO .............................................................................................11

2.1.3.2. DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO..................................................................12

2.1.3.2.1. ESTÔMAGO E ÓRGÃOS GASTROINTESTINAIS.............................12

2.1.3.2.2 CÉREBRO E PITUITÁRIA........................................................................12

2.1.3.2.3. OUTROS TECIDOS .................................................................................13

2.1.4. RECEPTOR DA GRELINA .......................................................................................13

2.1.4.1. ATIVAÇÃO DO RECEPTOR PARA A GRELINA...........................................14

2.1.4.2. DISTRIBUIÇÃO DO RECEPTOR PARA A GRELINA....................................14

2.1.5. FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA GRELINA .............................................................15

2.1.5.1. ATIVIDADE DE LIBERAÇÃO DO GH ............................................................17

2.1.5.2. REGULAÇÃO DO APETITE .............................................................................18

2.1.5.3. A GRELINA E A OREXINA ..............................................................................19

2.1.5.4. MECANISMOS DE ESTIMULAÇÃO DE APETITE PELA GRELINA ..........20

2.1.5.5. FUNÇÕES GASTROINTESTINAIS ..................................................................21

2.1.5.6. FUNÇÕES CARDIOVASCULARES .................................................................21

2.1.6. REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE GRELINA.......................................................22

2.1.7. POLIMORFISMOS NO GENE DA GRELINA E OBESIDADE..............................23

2.2. BUTIRILCOLINESTERASE ........................................................................................24

2.2.1. ORIGEM DO GENE BCHE ...................................................................................25

2.2.2. FORMAS MOLECULARES DA BChE.................................................................26

2.2.3. VARIABILIDADE GENÉTICA.............................................................................28

2.2.3.1. GENE BCHE.................................................................................................28

2.2.4. FUNÇÃO BIOLÓGICA DA BChE ........................................................................31

2.2.4.1. RELAÇÃO DA BChE COM PESO, ALTURA E ÍNDICE DE MASSA

CORPORAL (IMC)......................................................................................................32

3. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 35

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:........................................................................................35

4. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 36

4.1. MATERIAL ...................................................................................................................36

4.2. MÉTODOS LABORATORIAIS....................................................................................36

4.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA ...........................................................................................36

4.2.2. PCR..........................................................................................................................37

4.2.3. ELETROFORESE...................................................................................................38

4.3. MÉTODOS ESTATÍSTICOS ........................................................................................42

5. RESULTADOS...................................................................................................... 44

5.1 VARIABILIDADE DO GENE GHRL ...........................................................................44

5.2. ÍNDICE DE MASSA CORPORAL, IDADE E ATIVIDADE. .....................................47

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 54

6.1. FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DE R51Q E L72M ........................54

6.2. VARIAÇÃO R51Q DO GENE GHRL E IMC ..............................................................56

6.3. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E IMC..............................................................57

6.4. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E IDADE DE INÍCIO DA OBESIDADE.......58

6.5. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E ATIVIDADE DA

BUTIRILCOLINESTERASE ...............................................................................................59

7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 62

REFERÊNCIAS......................................................................................................... 63

VII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Médias (± D.P.) de idade e de índice de massa corporal (IMC) em

controles e obesos

Tabela 2: Seqüências dos iniciadores utilizados para amplificar os fragmentos

de DNA na técnica de SSCA (Análise Conformacional de Fita Simples).

Tabela 3: Condições das eletroforeses de SSCA para os diferentes fragmentos

dos genes GHRL e BCHE

Tabela 4: Freqüências genotípicas quanto ao sítio do gene GHRL codificador do

aminoácido 51

Tabela 5: Freqüências genotípicas quanto ao sítio do gene GHRL codificador do

aminoácido 72

Tabela 6: Freqüências alélicas (%) do gene GHRL 44

Tabela 7: Freqüências genotípicas para o gene GHRL (N = 295, aa51; N = 296,

aa72), referente à amostra total de descendentes de europeus de Curitiba

Tabela 8: Freqüências alélicas de variantes de dois sítios do gene GHRL em

amostra total de descendentes de europeus de Curitiba

Tabela 9: Distribuição de freqüência dos genótipos de controles quanto aos

genes GHRL da grelina e BCHE da butirilcolinesterase

Tabela 10: Distribuição de freqüência dos genótipos de obesos quanto aos

genes GHRL da grelina e BCHE da butirilcolinesterase

Tabela 11: Dados de idade, índice de massa corporal (IMC) e atividade da

butirilcolinesterase de controles, classificados quanto ao aminoácido 72

VIII

codificado pelo gene GHRL da grelina

Tabela 12: Dados de idade, índice de massa corporal (IMC) e atividade da

butirilcolinesterase de obesos, classificados quanto ao aminoácido 72 codificado

pelo gene GHRL

Tabela 13: Médias de índice de massa corporal ± erros padrões, em obesos

classificados pelos genótipos dos genes da butirilcolinesterase e da grelina

Tabela 14: Média (± D.P.) da atividade (KU/L) da butirilcolinesterase em

controles e obesos

Tabela 15: Distribuição de freqüência da atividade da butirilcolinesterase em

126 obesos homozigotos para o alelo 72L

Tabela 16: Distribuição de freqüência da atividade da butirilcolinesterase em 17

obesos com a variante 72M em hetero ou homozigose..

Tabela 17: Dados dos cinco obesos que possuem o alelo 72M do gene GHRL e

que apresentam os maiores níveis de atividade da butirilcolinesterase

Tabela 18: Coeficientes de correlação das variáveis idade, IMC, atividade da

butirilcolinesterase, exon 1 e exon 4 do gene BCHE em relação à variável

aminoácido 72, codificada pelo gene GHRL, em 144 controles

Tabela 19: Coeficientes de correlação das variáveis idade, IMC, atividade da

butirilcolinesterase, exon 1 e exon 4 do gene BCHE em relação à variável

aminoácido 72, codificada pelo gene GHRL, em 130 obesos

Tabela 20: Resultados da análise de regressão múltipla escalonada, referentes

à amostra de obesos (N = 130), considerando-se a atividade da

butirilcolinesterase como variável dependente (Y)

Tabela 21: Comparações entre as freqüências genotípicas de dois sítios do

gene GHRL entre o presente estudo e o realizado por Ukkola et. al. (2001)

Tabela 22: Comparações entre as freqüências alélicas de dois sítios do gene

GHRL entre o presente estudo e o realizado por Ukkola et. al. (2001)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Desenho esquemático do gene GHRL, mostrando os cinco exons

(retângulos) e os introns (linhas) que o compõem.

Figura 2: Peptídeo (grelina) maduro com 28 aminoácidos, mostrando a serina 3

n-octanoilada

Figura 3: Sítios de ação, produção e função da grelina e obestatina, os sinais +

indicam uma ação positiva do peptídeo, os sinais de – indicam uma ação

negativa do poeptídeo.

Figura 4: Desenho esquemático do gene BCHE, mostrando os quatro exons

(em negrito) os introns e o tamanho do gene

Figura 5: Gel de poliacrilamida 29:1, 10% descontínuo. 1 – 51RR, 2 – 51RQ 38

Figura 6: Gel de poliacrilamida 29:1, 8% contínuo. 1 – 72LM, 2 – 72MM, 3 –

72LL

Figura 7: Freqüências de homozigotos para o alelo 72L, distribuídas segundo o

nível de atividade da butirilcolinesterase

Figura 8: Freqüências de homozigotos e heterozigotos para o alelo 72M,

distribuídas segundo o nível de atividade da butirilcolinesterase

LISTA DE ABREVIATURAS SÍMBOLOS E SIGLAS

R Arginina

AChE Acetilcolinesterase

ACTH Hormônio Adenocorticotrófico

AGRP Proteína Relacionada a Agouti

AMPK Proteinase Ativada por Adenosina Monofosfato

ARC Núcleo Arqueado

BChE Butirilcolinesterase (colinesterase do soro)

BCHE Gene da Butirilcolinesterase

D.P. Desvio Padrão

DNA Ácido desoxiribonucleico

E.P. Erro Padrão

EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético

GH Hormônio do Crescimento

GHRH Hormônio Liberador do Hormônio do Crescimento

GHRL Gene da Grelina

GHS Secretagogo do Hormônio do Crescimento

GHS-R Receptor do Secretagogo do Hormônio do Crescimento

GPCR Receptor de ligação para proteína G

HEMEPAR Centro de Hematologia e Hemoterapia do Paraná

IMC Índice de massa corporal

L Leucina

XII

M Metionina

NaF Fluoreto de Sódio

NPY Neuropeptídeo Y

PCR Polymerase Chain Reaction, Reação em Cadeia da Polimerase

PMSF Fenil-Mil-sulfonil-fluoreto

Q Glutamina

RCQ Razão Cintura Quadril

SSCA Single Strand Conformational Analysis, Análise de Conformação

de Fita Simples.

VMN Núcleo Ventromedial

XIV

RESUMO

O presente estudo determinou, através da técnica de PCR-SSCA, as

variações R51Q e L72M do gene GHRL em homens euro-brasileiros, sendo 144

obesos (IMC ≥ 30) e 153 controles (20 ≤ IMC< 25), doadores de sangue de Curitiba,

e analisou-as no que se refere ao índice de massa corporal (IMC), idade e atividade

da butirilcolinesterase (BChE), isoladas ou em conjunto com as variantes dos exons

1 e 4 do gene BCHE. As freqüências genotípicas e alélicas não diferiram em obesos

e controles em relação às variantes R51Q (χ

= 0,004; p > 0,90 e χ

= 0,26; p > 0,60,

respectivamente) e L72M (χ

= 0,026; p > 0,95 e χ

= 0,01; p > 0,90, respectivamente).

Quando estes dados foram comparados com os de Ukkola et. al. (2001), foi

encontrada diferença significativa decorrente de menor freqüência de 51Q no

presente estudo. Devido ao pequeno número de indivíduos com o alelo 51Q (N = 3),

não foi possível realizar análise estatística relacionando esse sítio do DNA com as

demais variáveis estudadas. Quando se analisou a variante L72M em relação ao IMC

não foi encontrada diferença significativa entre as médias obtidas de indivíduos 72LL

e 72LM+72MM (t = 1,22; p > 0,20 em controles; t = 0,06; p > 0,95, em obesos).

Também não foi encontrada diferença entre as médias de IMC quando se

compararam os genótipos 72LL e 72LM+72MM em obesos, classificados quanto às

variantes dos exons 1 e 4 do gene BCHE. Em relação à atividade da BChE, foi

encontrada correlação positiva entre o alelo 72M e maior atividade dessa enzima (r =

0,185; p < 0,05) em obesos. Uma análise de regressão múltipla escalonada mostrou

associação positiva do alelo 72M com atividade da BChE. Os resultados do presente

trabalho não corroboraram a hipótese inicial de que as variações R51Q e L72M

pudessem estar associadas com o IMC, entretanto a associação positiva encontrada

entre o alelo 72M e maior atividade da BChE se mostra interessante, demandando

mais estudos a respeito.

XVI

ABSTRACT

This study determined the variations R51Q and L72M of the GHRL gene by

PCR-SSCA in Euro-Brazilian men, being 144 obese individuals (BMI ≥ 30) and 153

controls (20 ≤ BMI <25) and analyzed them in relation to body mass index (BMI), age

and activity of butyrylcholinesterase (BChE) alone or in connexion to the variants of

exons 1 and 4 of the BCHE gene. The genotype and allele frequencies did not differ

in obese and control samples for the variants R51Q (χ

= 0.004, p> 0.90 and χ

= 0.26,

p> 0.60, respectively) and L72M (χ

= 0.026, p> 0.95 and χ

= 0.01, p> 0.90,

respectively). When these data were compared with those found by Ukkola et. al.

(2001) significant difference was found in view of lower frequency of the 51Q in the

present study. Due to the low number of individuals with the 51Q allele (N = 3) it was

not possible to perform any statistical analysis of this DNA site with the other studied

variables. When the variable L72M was analyzed in relation to the mean of BMI, no

mean significant difference was found between 72LL and 72LM +72 MM individuals (t

= 1.22; p> 0.20 in controls; t = 0.06; p> 0, 95, in obese people). No difference was

found in mean BMI when the genotypes 72LL and 72LM +72 MM were compared in

obese individuals, as classified by the variants of exons 1 and 4 of the BCHE gene.

Regarding BChE activity, positive correlation was found between the allele 72M and a

higher enzyme activity (r = 0.185, p < 0.05) in obese inividuals. A multiple step-wise

regression analysis showed positive correlation between 72M with BChE activity. The

results from the present study did not support the initial hypothesis that the variations

R51Q and L72M may be associated with BMI. However, the positive association

XVII

found between the allele 72M and BChE activity is very interesting, demanding more

studies on the subject.

1. INTRODUÇÃO

A obesidade é um fator de risco para várias doenças graves, como

cardiovasculares, diabetes, sendo determinada por diversos fatores genéticos e

ambientais. Ela é considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma

epidemia mundial, sendo a principal causa de mortes nos Estados Unidos e Canadá.

A descoberta da grelina abriu uma gama de possibilidades de estudos nas

áreas de Endocrinologia e Metabolismo.

Bowers et al. (1980) mostraram que um tipo de GHS (Growth Hormone

Secretagogue; secretagogo do hormônio do crescimento) participava da via

reguladora da liberação do GH (Growth Hormone; hormônio do crescimento)

juntamente com o já conhecido GHRH (Growth Hormone Release Hormone;

hormônio de liberação do hormônio do crescimento). Desde então, vários GHSs

sintéticos foram desenvolvidos e a estrutura do GHS-R (Growth Hormone

Secretagogue Receptor; receptor do secretagogo do hormônio do crescimento) foi

desvendada (Smith et. al., 1996). O ligante endógeno do GHS-R era desconhecido

até a descoberta da grelina. Este achado inaugurou um novo campo de estudo

relacionado ao GH e à regulação do apetite. Foram relatadas evidências de que o

controle para a liberação do GH não é só exercido pelo GHRH, mas também pela

grelina, e, além disso, a grelina também funciona como um sinal para a necessidade

da ingestão, agindo de forma antagonista à leptina, um peptídeo com funções

determinantes de saciedade. Em vista dos dados encontrados, a grelina talvez seja

um hormônio essencial para a manutenção do GH e para a homeostase energética.

A grelina foi identificada em 1999 (Kojima et al., 1999) e é o primeiro

exemplo de um peptídeo modificado por um ácido graxo, modificação que é

essencial para sua atividade. O gene da grelina humana (GHRL) está localizado no

cromossomo 3 (3p25-p26).

A butirilcolinesterase (BCHE; EC 3.1.1.8) é uma enzima sérica produzida no

fígado e codificada pelo gene BCHE (Arpagaus et al., 1990), localizado no braço

longo do cromossomo 3 (3q26.1-q26.2). Atualmente, mais de 65 variantes foram

identificadas no gene BCHE, por métodos de identificação ao nível do DNA.

A interação do gene BCHE e do gene CHE2, que determina proteína ainda

não identificada, condiciona o complexo C

, determinante do fenótipo CHE2 C5+,

associado com peso e IMC mais baixos do que o fenótipo CHE2 C5- (Chautard-

Freire-Maia et al., 1991; Alcântara et al., 2001).

Segundo Souza et al. (2005a), a própria BChE pode estar relacionada com o

Metabolismo de lípides, uma vez que variantes do aminoácido 539 dessa enzima

afetam diferentemente a distribuição do IMC. Andrade et al. (2008), continuando o

estudo de Souza et al. (2005a) e genotipando as mesmas amostras, quanto ao sítio -

116 do exon 1 do gene BCHE, verificaram que o alelo -116A está associado com o

aumento da variância da distribuição do IMC e deve ser o responsável pelo resultado

obtido por Souza et al. (2005a), uma vez que a variante 539T, do exon 4 do gene

BCHE, só afeta o IMC, quando na presença de -116A.

O presente estudo visou principalmente pesquisar as relações entre as

variações do gene GHRL e a obesidade, levando também em consideração as

variações dos exons 1 e 4 do gene BCHE.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O hormônio do crescimento (GH) é um hormônio multifuncional, secretado

pelo órgão somatotrófico da região anterior da pituitária. Regula todo o crescimento

celular e corporal, Metabolismo de carboidratos, proteínas e lípides, bem como

mantém o balanço eletrohídrico (Aetsinger et al., 1996).

O GH é controlado por muitos fatores, em particular por dois neuropeptídeos

hipotalâmicos (GHRH e somatostatina, esse ultimo age inibindo o GH).

Recentemente, uma terceira via de controle do GH foi descoberta em estudos com

secretagogos do GH (GHSs) (Dickson et al., 1999). GHSs são componentes

sintéticos, que são potentes estimuladores para a liberação do GH, atuando

mediante um receptor protéico específico (GHS-R) (Korbonits et al., 1999). Por

serem componentes sintéticos, foi postulado que deveria existir um ligante natural

para o receptor do secretagogo do GH, que tivesse uma estrutura similar aos GHSs

no sítio de ligação ao receptor (Smith et al., 1996).

Vários grupos tentaram, sem sucesso, isolar o ligante endógeno para o

GHS-R, usando extratos do cérebro, pituitária e hipotálamo, regiões nas quais há

expressão do GHS-R (Bennet et al., 1997 e Guan et al., 1997). Inesperadamente

conseguiu-se, em 1999, isolar e identificar o ligante natural do GHS-R em tecidos de

estômago e nomearam-no de grelina (GHRL) (Kojima et al., 1999 e 2001). A grelina

é um peptídeo estimulador de apetite e que atua na liberação do GH (Korbonits et al.,

2004). O nome grelina é baseado em “ghre” uma palavra de origem proto-indo-

européia que significa crescimento, em alusão ao fato de estimular o GH (Kojima e

Kangawa, 2005).

2.1. GENE DA GRELINA – LOCALIZAÇÃO E ESTRUTURA

O gene da grelina humana (GHRL) está localizado no cromossomo 3 (3p25-

p26) e o gene do receptor para a grelina (GHS-R) também foi localizado nesse

cromossomo (3q26-q27) (Smith et al., 1997).

O gene da grelina humana, assim como o do camundongo, contém cinco

exons (Figura 1) (Tanaka et al., 2001; Kojima e Kangawa 2005). O primeiro e mais

curto contém apenas 20 pb, e engloba parte da região 5’ não traduzida (5’ UTR), não

sendo considerado por outros autores que consideram o gene da grelina como tendo

4 exons (Ukkola et.al., 2001).

Figura 1: Desenho esquemático do gene GHRL, mostrando os cinco exons (retângulos) e os introns

(linhas) que o compõem.

FONTE: Kojima e Kangawa, 2005

A grelina é um peptídeo de 28 aminoácidos (Figura 2), codificado pelos

exons 2 e 3 (Kojima e Kangawa, 2005). No rato e no camundongo o códon para o

aminoácido Q14 (CAG) é usado como sinal para processamento alternativo, gerando

assim dois mRNAs diferentes (Hosoda et al., 2000b). Um codifica o precursor da

grelina e o outro o precursor da grelina des-Q14.

Figura 2: Peptídeo da grelina humana madura com 28 aminoácidos, mostrando a serina 3 n-

octanoilada.

FONTE: KOJIMA, M.; KANGAWA, K. Ghrelin: structure and function. Phisio. Rev., v. 85, p. 495-522,

2005.

A seqüência de aminoácidos em mamíferos para o precursor da grelina é

bastante conservada. Nesses precursores a seqüência ativa da grelina com 28

aminoácidos vem logo após o peptídeo sinal. O sítio de clivagem para o peptídeo

sinal é o mesmo em todas as grelinas de mamíferos (Kojima e Kangawa, 2005).

O precursos da grelina humana, codificado pelos 5 exons do gene GHRL

(sendo o exon 1 codificador da região 5’ UTR), é constituído por 518 pb codificados

em uma seqüência de 117 aminoácidos, distribuídos em 23 aminoácidos do peptídeo

Grupo n-octanoil (C8:0)

sinal e 94 aminoácidos da pró-grelina, os quais compreendem os 28 aminoácidos da

grelina madura e mais 66 aminoácidos, que incluem os 23 da obestatina, hormônio

com características antagônicas à grelina, que suprime o apetite e a atividade

estomacal. (Kojima et. al., 1999; Zhang et. al., 2005)

2.1.2. ESTRUTURA DA GRELINA

A grelina é um peptídeo de 28 aminoácidos, no qual a terceira serina (ser3)

está n-octanoilada, que é uma condição essencial para a atividade da grelina. A

grelina é o primeiro caso de um peptídeo modificado por um ácido graxo (Kojima et

al., 1999).

No curso dos estudos sobre a grelina, várias outras formas naturais do

peptídeo foram identificadas (Hosoda et al., 2003). Estas formas podem ser

classificadas em quatro grupos de acordo com o tipo de acilação observada na

serina 3: não acilada (sem modificação pós-traducional), e as formas modificadas

pós tradução, como, octanoilada (C8:0), decanoilada (C10:0), e possivelmente

decenoilada (C10:1). Todos esses peptídeos encontrados têm 27 ou 28 aminoácidos

e são derivados do mesmo precursor da proteína por duas vias diferentes de

recomposição, sendo que a principal forma da grelina é a de 28 aminoácidos com a

serina 3 octanoilada (Kojima e Kangawa, 2005).

2.1.2.1. FORMA DES-ACILADA DA GRELINA

A forma des-acilada da grelina também existe em níveis significativos no

estômago e no sangue (Hosoda et al., 2000a). No plasma essa forma da grelina é

encontrada predominantemente (80% a 90%) e se liga às lipoproteínas de alta

densidade (HDLs), que contêm algumas esterases (Beaumont et al., 2003). Portanto,

a forma des-acilada da grelina seria um produto de modificação da forma acilada. A

forma des-acilada da grelina não substitui a grelina acilada nas regiões de ligação no

hipotálamo e pituitária e também não mostra atividade endócrina nem em ratos nem

em humanos (Kojima e Kangawa, 2005). A questão que surge então é onde atuaria

essa forma des-acilada da grelina. Baldanzi et al. (2002) sugeriram a existência de

um outro receptor para a grelina no sistema cardiovascular, pois mostraram que

tanto a grelina acilada quanto a des-acilada reconhecem uma região de ligação em

cardiomiócitos que não possui o receptor para a grelina (GHS-R). Além disso, foi

destacado que a forma des-acilada compartilha, com a forma acilada, algumas ações

não endócrinas como o controle de proliferação celular e adipogênese (Cassoni et

al., 2004).

2.1.2.2. DESACILAÇÃO DA GRELINA PELA BUTIRILCOLINESTERASE E

OUTRAS ESTERASES

No soro, a grelina está, em sua maioria, desoctanoilada. Este processo de

desoctanoilização é fortemente diminuído por fluoreto fenilMilsufonil, um inibidor de

proteases serínicas e esterases.

No soro humano, a desoctanoilização da grelina é parcialmente inibida por

salicinato de eserina e por fluoreto de sódio, dois inibidores da butirilcolinesterase. A

butirilcolinesterase purificada é capaz de degradar a grelina, e há uma relação

positiva entre a butirilcolinesterase e a desoctanoilização da grelina no soro humano.

Comparado com o soro humano, o soro de ratos tem bem menos butirilcolinesterase,

mas uma maior atividade de hidrólise em relação à grelina, indicando que há uma

outra esterase para essa reação no soro de ratos.

A desoctanoilização da grelina é fortemente inibida por PMSF, um inibidor de

proteases serinícas e esterases, mas não por 4-(amidino-fenil)-Manosufonil fluoreto,

um inibidor irreversível e específico para proteases serínicas.

As esterases do soro têm uma especificidade ampla com o substrato com

algumas diferenças individuais e interespecíficas. Elas são classificadas em três

grupos: A, B e C, de acordo com o tipo de interação com organofosfatos.

As esterases do tipo A (arilesterases/paraoxonases) do soro humano

catalisam a hidrólise de ésteres aromáticos, como o paraoxon e fenilacetato. O cálcio

é necessário para que ocorra o processo de catálise e esta atividade é reduzida

quando é adicionado EDTA. Por conta de a grelina estar associada ao HDL, que

contém paraoxonase, supôs-se que essa enzima pudesse estar relacionada com a

desoctanoilização da grelina. Porém, De Vriese et al. (2004) mostraram que a

desoctanoilização da grelina não é inibida por EDTA. Além do mais, a inibição da

desoctanoilização da grelina por PMSF indica que as esterases B, ao invés da A e C,

são as que contribuem para a reação de desoctanoilização.

As esterases do tipo B hidrolisam ésteres alifáticos e são inibidas por

organofosfatos. As esterases do tipo C (colinesterases) são inibidas pelos

organofosfatos e hidrolisam preferencialmente ésteres de colina a uma taxa maior do

que ésteres aromáticos e alifáticos.

A acetilcolinesterase e a butirilcolinesterase são ambas inibidas por eserina

e NaF. Sendo que a butirilcolinesterase humana purificada desoctanoiliza a grelina.

Entretanto, a eserina e o NaF inibem apenas parcialmente a desoctanoilização da

grelina. Uma relação positiva entre a butirilcolinesterase e a desoctanoilização da

grelina foi encontrada. Por conta de que a butirilcolinesterase representa uma

proporção significante das atividades de esterases no soro humano, seu papel no

processo de desoctanoilização da grelina é provável, mas ela não parece ser a única

enzima que participa desse processo.

Esterases do tipo B também incluem carboxilesterases não específicas

encontradas no soro e nos tecidos. Estas enzimas catalisam a hidrólise de uma

variedade de drogas e substâncias que contêm ligações amida ou éster, bem como

componentes endógenos como acil-gliceróis de cadeia curta e longa e ésteres de

cadeia longa de coenzima-A, indicando que essas esterases possam participar no

Metabolismo de drogas e de lípides endógenos.

Carboxilesterases purificadas do fígado são capazes de degradar a grelina

para sua forma des-acilada, sugerindo que as carboxilesterases podem participar no

processo de desoctanoilização. Em ratos, a desoctanoilização da grelina é mais

rápida do que em humanos, sendo isso consistente com a atividade da

carboxilesterase encontrada no soro dos ratos.

No soro de ratos a desoctanoilização da grelina é inibida por BNPP, um

inibidor de carboxilesterases. Em contraste, nos soro de humanos, De Vriese et al.

(2004) não encontraram sinais de inibição da desoctanoilização da grelina por BNPP.

Isto indica que a carboxilesterase não está relacionada ao processo de

desoctanoilização da grelina no soro humano, estando de acordo com Li et al.

(2000), que concluíram não existir carboxilesterases no soro humano.

2.1.2.3. ENZIMA ACIL-MODIFICADORA PARA A GRELINA

Uma enzima que cataliza a acilação da grelina ainda não foi identificada. A

incorporação do acido n-octanóico em anfíbios, peixes, mamíferos e aves sugere que

esta enzima seja específica na transferência de uma cadeia de tamanho médio de

ácido graxo (Kojima e Kangawa, 2005).

Foram encontradas evidências de que a ingestão de cadeias de ácidos

graxos de tamanho médio, bem como de trigliceróis de tamanho médio aumentam a

produção da grelina acil-modificada sem modificar o nivel total (acilada e des-acilada)

da grelina. O grupamento acil que se liga à grelina recém sintetizada corresponde

aos que foram ingeridos, indicando que os ácidos graxos ingeridos são usados

diretamente para a acilação da grelina (Kojima et al., 2005; apud Kojima e Kangawa,

2005).

Um número de acil-transferases foi identificado em mamíferos. Na mucosa

do estômago de ratos foi encontrada uma acil-transferase que catalisa a

transferência de acil – CoA para as proteínas do muco (Kasinathan et al., 1990). A

enzima ser O-acil-transferase que modifica a grelina ainda não é conhecida mas

deve ter alguma homologia estrutural com essas acil-transferases.

2.1.2.4. DERIVADOS DA GRELINA

Produção de derivados da grelina por via sintética mostra que os grupos

hidrofóbicos ligados ao terceiro aminoácido são essenciais para uma atividade

máxima da grelina (Bednarek et al., 2000; Matsumoto et al., 2001). A atividade

máxima da grelina foi observada quando a grelina estava n-octanoilada.

Um peptídeo pequeno, contendo apenas os primeiros quatro aminoácidos da

grelina, ainda consegue ativar o GHS-R. Entretanto, apenas os três primeiros são

incapazes de ativar o receptor, o que indica que os quatro primeiros peptídeos

constituem o mínimo essencial para essa ação (Bednarek et al., 2000; Matsumoto et

al., 2001).

2.1.3. CONCENTRAÇÃO DA GRELINA E DISTRIBUIÇÃO DA GRELINA

2.1.3.1. CONCENTRAÇÃO

A concentração normal da grelina no plasma sangüíneo em humanos é de

10 – 20 fmol/ml para a grelina n-octanoilada e 100 – 150 fmol/ml para a grelina total

(acilada e des-acilada). A concentração da grelina no plasma aumenta em condições

de jejum e reduz após alimentação, sugerindo assim que a grelina possa ser um

sinal inicial para o aumento do apetite (Cummings et al., 2001). A concentração de

grelina no plasma é mais baixa em obesos do que em controles com IMC normal,

pareados por idade, o que sugere um processo de regulação (Hansen et al., 2002).

2.1.3.2. DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO

2.1.3.2.1. ESTÔMAGO E ÓRGÃOS GASTROINTESTINAIS

A grelina é produzida principalmente no estômago, em vertebrados. As

células produtoras de grelina do estômago são mais abundantes no fundus (corpo)

do que no piloro (Date et al., 2000a).Estudos por hibridização in situ e por análises

histoquímicas indicam que as células produtoras de grelina (X/A) são um tipo distinto

de célula endócrina encontrada na mucosa do estômago (Date et al., 2000).

Células imunorreativas para a grelina também são encontradas no duodeno,

jejuno, íleo, e cólon (Date et al., 2000a). O pâncreas também é um órgão produtor de

grelina, porém há controvérsias quanto às células que a produzem nesse órgão

(Date et al., 2002).

2.1.3.2.2 CÉREBRO E PITUITÁRIA

A grelina já foi encontrada no núcleo arqueado do hipotálamo, uma

importante região controladora do apetite (Lu et al., 2002) e estudos recentes

também indicaram a presença da grelina em neurônios hipotalâmicos de tipo não

caracterizado previamente (Cowley et al., 2003).

A grelina foi encontrada nas glândulas pituitárias onde pode agir na liberação

do GH por uma via autócrina ou parácrina (Kojima e Kangawa, 2005).

2.1.3.2.3. OUTROS TECIDOS

O mRNA refrente à grelina é expresso no rim, especialmente no glomérulo

(Gnanapavan et al., 2002), sendo que, estratos de peptídeos de rim de ratos contêm

tanto as formas acilada quanto des-acilada da grelina em quantidades significativas.

Células imunorreativas para a grelina foram encontradas em citotrofoblastos

da placenta no primeiro trimestre da gravidez e não foram detectadas no segundo

trimestre (Gualillo et al., 2001). A grelina foi encontrada em células do

sinciciotrofoblasto da placenta humana e em células trofoblásticas labirínticas da

placenta do rato.

2.1.4. RECEPTOR DA GRELINA

O receptor da grelina é um GPCR típico (receptor de ligação para uma

proteína G) com sete domínios trans-membrânicos (7-TM) (Smith et al., 1999). Dois

cDNAs distintos de receptores da grelina foram identificados (Howard et al., 1996). O

primeiro, GHS-R tipo 1a, codifica um GPCR 7-TM com propriedades de ligação e

funcionais consistentes com seu papel como receptor da grelina. O tipo 1b é

produzido por um mecanismo de recomposição alternativa (Howard et al., 1996). O

gene para o GHS-R consiste de dois exons; o primeiro codifica os domínios trans-

membrânicos do 1 ao 5, e o segundo codifica os domínios 6 e 7. O tipo 1b é derivado

apenas do primeiro exon, que codifica apenas cinco dos sete domínios

transmembrânicos, correspondendo a uma forma COOH-truncada do tipo 1a, sendo

inativo farmacologicamente.

O receptor da grelina é bem conservado entre todas as espécies de

vertebrados estudadas, incluindo vários mamíferos, galinhas e baiacus (fugu)

(Palyha et al., 2000). Esta forte conservação sugere que a grelina e seu receptor têm

uma função fisiológica muito importante.

2.1.4.1. ATIVAÇÃO DO RECEPTOR PARA A GRELINA

A ativação do receptor para a grelina se dá pela ligação dela ao GHS-R

ativando a fosfolipase C para gerar IP

e diacilglicerol, resultando num aumento do

nível interno de Ca

, indicando que o receptor para a grelina está associado a uma

subunidade G

, isto é, uma subunidade da família de proteínas que se ligam ao

nucleotídeo guanina (Kojima e Kangawa, 2005).

2.1.4.2. DISTRIBUIÇÃO DO RECEPTOR PARA A GRELINA

O mRNA do receptor para a grelina é proeminentemente expresso no núcleo

arqueado (ARC) e ventromedial (VMN) e no hipocampo (Nakazato et al., 2001). O

mRNA do GHS-R também é detectado em múltiplos núcleos hipotalâmicos e na

pituitária, bem como em outras regiões (Kojima e Kangawa, 2005).

Análises por RT-PCR demonstraram que o mRNA do GHS-R é expresso em

vários órgãos, incluindo o coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, estômago,

intestinos fino e delgado, tecido adiposo e células do sistema imune (Gnanapavan et

al., 2002).

2.1.5. FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA GRELINA

A figura 3 mostra um esquema de ação da grelina e da obestatina no corpo

humano. A grelina, que se liga ao GHS-R, causa um aumento na ingestão alimentar

e uma diminuição no gasto energético. A obestatina, que se liga ao receptor GPR39

faz o inverso, ela aumenta o gasto energético e diminui a ingestão alimentar. Esses

dois hormônios trabalham no sentido de manter um equilíbrio energético.

Figura 3: Sítios de ação, produção e função da grelina e obestatina, os sinais + indicam uma ação

positiva do peptídeo, os sinais de – indicam uma ação negativa do peptídeo.

Fonte: Nogueiras et. al., 2005.

Equilíbrio

energético

Gasto energético

Grelina

Nervo vago

Preprogrelina

Obestatina

Ingestão

alimentar

2.1.5.1. ATIVIDADE DE LIBERAÇÃO DO GH

A grelina é um hormônio com várias propriedades. Age no GHS-R

aumentando a concentração interna de Ca

2+-

via IP

para estimular a liberação de

GH. Comparado ao efeito estimulador do GHRH (um outro hormônio relacionado à

liberação do GH), que age no seu próprio receptor, o efeito causado pela grelina na

liberação de GH é duas a três vezes maior (Arvat et al., 2000).

A grelina estimula a liberação de GH tanto in vivo, quanto in vitro,

diretamente proporcional à dose aplicada (Arvat et al., 2000). A liberação de GH

atinge o seu pico em aproximadamente 5 a 15 minutos após a injeção intravenosa de

grelina e cai ao nível basal, uma hora após a injeção. Uma simples administração de

grelina intracerebroventricularmente também aumenta a concentração de GH no

plasma de ratos de uma maneira diretamente proporcional, com uma dose mínima

de 10 pmol (Date et al., 2000b).

A grelina estimula a liberação de GH a partir da pituitária primária (Kojima et

al., 1999). Entretanto, o próprio hipotálamo parece estar envolvido na estimulação da

liberação do GH mediada pela grelina. Pacientes com lesões no hipotálamo

mostraram uma liberação insuficiente do GH mesmo quando estimulados pela

grelina (Popovic et al., 2003).

Altas doses de grelina em humanos aumentam os níveis de ACTH,

prolactina e cortisol (Arvat et al., 2001).

2.1.5.2. REGULAÇÃO DO APETITE

A grelina funciona de modo a transmitir sinais de fome para o cérebro.

Análises imunohistoquímicas indicaram que os neurônios que contêm grelina são

encontrados no núcleo arqueado (ARC) do hipotálamo, uma região envolvida na

regulação do apetite (Lu et al., 2002). No ARC, estes neurônios que contêm grelina

possuem fibras eferentes para neurônios que expressam os peptídeos NPY e AGRP,

estimulando a liberação destes peptídeos orexigênicos, e neurônios produtores de

proopiomelanocortin (POMC) que suprimem a liberação de peptídeos anorexigênicos

(Cowley et al., 2003) .

Quando a grelina é injetada nos ventrículos cerebrais de ratos, a ingestão

alimentar é estimulada (Kamegai et al., 2001). Injeção intracerebroventicular de

grelina de forma crônica aumenta de modo cumulativo a ingestão alimentar e diminui

o gasto de energia, levando a um aumento de peso.

Quando a grelina é injetada perifericamente ela consegue estimular os

neurônios hipotalâmicos (Ruter et al., 2003). Porém, a taxa com que a grelina

atravessa a barreira sangue-cérebro é bastante baixa. Isto sugere que a grelina deve

ativar as regiões hipotalâmicas adequadas por uma outra via.

A detecção de receptores para a grelina nos neurônios vagais aferentes nos

gânglios nodosos dos ratos sugere que os sinais da grelina enviados do estômago

são transmitidos para o cérebro através do nervo vago (Sakata et al., 2003). Além

disso, a observação de que a administração intracerebroventricular de grelina induz

um aumento de c-Fos no núcleo dorsomotor do nervo vago e estimula a secreção de

ácido gástrico, indica que a grelina ativa o sistema vago (Date et al., 2001). Em

contraste, uma vagotomia inibe a habilidade da grelina de estimular a ingestão

alimentar e a liberação de GH (Date et al., 2002).

A grelina é produzida primariamente nos órgãos gastrointestinais em

resposta a fome, e circula pelo sangue servindo como um sinal periférico que avisa

ao sistema nervoso central para estimular a ingestão alimentar. Os níveis de grelina

no plasma aumentam imediatamente antes de cada refeição e caem aos níveis

mínimos 1 hora após a ingestão (Cummings et al., 2001).

O aumento inicial dos níveis de grelina foi observado em humanos que

iniciaram as refeições em qualquer horário e sem disposição para comer (Cummings

et al., 2004). De fato os níveis de grelina e de fome se mostraram positivamente

relacionados. Além disso, a diminuição tardia do nível de grelina no plasma é

proporcional à quantidade de calorias ingeridas (Callahan et al., 2004).

A expressão do gene da grelina no estômago aumenta com o jejum e

diminui com a administração de leptina e interLcina (IL)-1β (Kim et al., 2003). A

grelina produz um balanço energético positivo devido a promoção da ingestão

alimentar e à diminuição do gasto de energia, bem como pelo bloqueio da anorexia

induzida pela IL-1β.

2.1.5.3. A GRELINA E A OREXINA

A orexina, um neuropeptídeo hipotalâmico orexigênico, está envolvido na

estimulação e regulação da ingestão alimentar (Chemelli et al., 1999). Sua injeção

intracerebroventricular estimula a ingestão alimentar, e sua expressão está

negativamente correlacionada com os níveis de glicose e leptina no sangue, bem

como com os níveis de ingestão alimentar (Siegel, 2004). A grelina estimula,

isoladamente, os neurônios para orexina, ao passo que a glicose e a leptina os

inibem (Yamanaka et al., 2003). Injeção intracerebroventricular de grelina induz a

uma expressão Fos nas células produtoras de orexina (Toshinai et al., 2003). A

atividade estimuladora de apetite da grelina é reduzida em ratos onde não existem as

orexinas. Injeções contendo grelina com antagonistas para NPY-Y1 e anti-orexina

IgG mostraram uma supressão de 87% na ingestão alimentar. Estes resultados

indicaram que os comportamentos alimentares são regulados cooperativamente

entre a grelina e a orexina (Kojima e Kangawa, 2005).

2.1.5.4. MECANISMOS DE ESTIMULAÇÃO DE APETITE PELA GRELINA

O ARC hipotalâmico é a região principal de ação da grelina no sistema

nervoso central. O ARC também é um alvo da leptina, um hormônio supressor de

apetite produzido nas células adiposas, e dos peptídeos NPY e AGRP, os quais são

estimuladores de apetite (Flier, 2004). NPY e AGRP são produzidos pela mesma

população de neurônios no ARC, e seus efeitos estimuladores de apetite são inibidos

diretamente pela leptina. De fato, uma parte dos efeitos orexigênicos da grelina

funcionam por regulação dos genes que codificam esses estimulantes de apetite.

Injeção intracerebroventricular de grelina induz expressão Fos nos neurônios

que expressam o NPY e assim aumenta a quantidade de mRNA de NPY no ARC

(Nakazato et al., 2001) e também aumenta o nível de mRNA de AGRP no

hipotálamo.

Recentemente, foi descoberto que a quinase ativada por AMP (AMPK) está

envolvida nos processos hipotalâmicos de regulação do apetite (Minokoshi et al.,

2004). Quando a grelina é administrada in vivo a atividade da AMPK se mostra

aumentada no hipotálamo. Em contraste, quando a leptina é injetada a atividade da

AMPK se mostra diminuída.

2.1.5.5. FUNÇÕES GASTROINTESTINAIS

Administração intravenosa de grelina aumenta a secreção do acido gástrico

e estimula a movimentação gástrica (Dornonville et al., 2004). Em termos de

secreção de acido gástrico, a resposta máxima obtida com a grelina é cerca de

3mg/kg. Do mesmo modo que ocorre com a injeção intravenosa, uma injeção

intracerebroventricular aumenta a secreção de ácido gástrico de acordo com a dose

aplicada (Date et al., 2001).

2.1.5.6. FUNÇÕES CARDIOVASCULARES

Estudos feitos no coração e na aorta observaram expressão de mRNA que

codifica tanto para a grelina quanto para seu receptor e, além disso, injeção

intravenosa de grelina reduz a pressão arterial (Nagaya et al., 2001).

Bolus (isto é, quantidade elevada) de grelina injetados intravenososamente

diminuem a pressão arterial principal sem modificar a taxa de batimento cardíaco

(Nagaya et al., 2001). Ratos com problemas cardíacos, quando tratados com grelina,

mostraram um aumento na potência dos batimentos cardíacos, volume maior e dP/dt

ventricular esquerda máxima, quando comparados com ratos controles afligidos pelo

mesmo problema mas tratados com placebo (Nagaya e Kangawa, 2003).

A diminuição na pressão arterial induzida pela grelina parece não ocorrer

através de sua ação direta no sistema circulatório, mas através da sua ação no

cérebro, especificamente no núcleo do trato solitário (Matsumura et al., 2002).

Injeção de grelina diretamente nesses núcleos dimini significativamente a pressão

arterial e a taxa de batimento cardíaco. Este tipo de injeção também suprime a

atividade simpática.

2.1.6. REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE GRELINA

O fator mais importante para a regulação da secreção da grelina é a

alimentação. O nível de glicose no sangue também pode ser um fator crítico, quando

a glicose é administrada oral ou intravenosamente a concentração de grelina no

plasma diminui (Shiiya et al., 2002). A concentração de grelina no plasma é sensível,

entretanto ao número e horário de refeições; e diminui mediante a uma refeição rica

em gordura (Erdmann et al., 2003 e Greenman et al., 2004).

A concentração de grelina no plasma é mais baixa em indivíduos obesos do

que em não obesos (Tschöp et al., 2001 e Haqq et al., 2003). Relacionado a este

fato, o nível de grelina no plasma se encontra bastante elevado em portadores de

anorexia nervosa e retorna a níveis normais com ganho de peso e quando o

individuo se recupera da doença (Tanaka et al., 2003b). As concentrações de grelina

também são elevadas em indivíduos com bulimia nervosa (Tanaka et al., 2003a).

Administração de GH exógeno diminui a expressão do mRNA de grelina no

estômago e a concentração de grelina no plasma, mas não afeta o estoque

estomacal de grelina (Qi et al., 2003). Estes achados sugerem que o GH pituitário

exibe uma regulação feedback na produção estomacal de grelina.

2.1.7. POLIMORFISMOS NO GENE DA GRELINA E OBESIDADE

Em humanos, vários polimorfismos foram identificados no gene GHRL:

várias mutações intrônicas foram encontradas (rs35683, rs35682, rs2075356, rs

35681, rs11923313, rs697228, rs11923293, rs9866514, rs42451, rs35680, rs35679,

rs26802) e três variações localizadas nos exons 2 (R51Q - rs34911341 e L72M - rs

696217) e 4 (Q90L - rs4684677). As freqüências alélicas para os polimorfismos

R51Q e L72M são similares em obesos e controles. Entretanto, foi relatado que

obesos com o alelo 72M adquirem a obesidade mais cedo do que os obesos

homozigotos para o tipo selvagem L72, sugerindo que L72M deve afetar a atividade

da grelina.

A mutação R51Q resulta numa mudança do sítio COOH-terminal

responsável pela recomposição do peptídeo da grelina, resultando numa falha nessa

recomposição que é necessária para produzir a grelina com 28 aminoácidos. Uma

pro-grelina com 94 aminoácidos de comprimento é produzida no lugar da normal,

cuja atividade biológica ainda não foi avaliada. Ukkola et al. (2001) estudaram 96

mulheres obesas mórbidas (IMC = 42,3 ± 3,4 kg/m2) e 93 não obesas (IMC = 23 ±

1,4 kg/m

), sendo que a mutação R51Q foi identificada em seis heterozigotas obesas

(6,3%) mas não entre os controles (p < 0,05). Identificaram também a mutação

G274A do intron 1 em duas obesas, que apresentaram também a mutação L72M,

levando a sugerir que esse aparecimento conjunto possa ser devido a desequilíbrio

de ligação.

As freqüências genotípicas, quando se considerou a mutação Q90L, foram

semelhantes entre indivíduos magros e obesos, levando à sugestão de que essa

mutação não participa no processo de regulação do peso corporal (Hinney et al.

2002).

A obestatina, um hormônio derivado da pré-progrelina, possui 23

aminoácidos. A obestatina, como a grelina, parece que sofre uma modificação pós-

tradicional, sendo modificada pela adição de um grupo amida na sua região carboxi-

terminal numa glicina conservada entre as espécies (Gualillo et. al. 2006). Ela possui

função contrária a grelina, de saciedade e inibição de apetite.

2.2. BUTIRILCOLINESTERASE

A butirilcolinesterase (BChE; EC 3.1.1.8) é uma enzima sérica produzida no

fígado. Sua variabilidade é conhecida desde a década de 50 (Kalow and Staron,

1957), devido a sua capacidade de hidrolisar diversos ésteres de colina. Devido ao

fato de alguns ésteres serem usados como relaxantes musculares em procedimentos

cirúrgicos, essas variantes foram identificadas mediante a incapacidade desses

ésteres, em alguns casos, de atuar corretamente.

A estrutura da enzima BChE é codificada pelo gene BCHE (Arpagaus et al.,

1990) que está localizado no braço longo do cromossomo 3 (3q26.1-q26.2). O gene

BCHE tem 73 kb de comprimento e contém quatro exons (figura 3). Os primeiros

alelos identificados nesse gene foram: BCHE*U – usual, BCHE*A e BCHE*F. Estes

alelos determinam enzimas com diferentes comportamentos frente a uma variedade

de inibidores. Algumas variantes também foram identificadas devido à atividade

ausente ou reduzida em relação à enzima usual. Atualmente, muitas variantes têm

sido identificadas utilizando-se técnicas de análise de DNA.

Figura 4: Desenho esquemático do gene BCHE, mostrando os quatro exons (E1, E2,

E3 e E4) e os três introns. As estruturas representam as regiões UTR e as

estruturas representam as regiões traduzidas.

Fonte: Nunes, K. Haplótipos do gene BCHE da butirilcolinesterase humana e

aspectos evolutivos. Curitiba, 2006. 152f. Dissertação (Mestrado em Genética) –

Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná.

2.2.1. ORIGEM DO GENE BCHE

A seqüência de aminoácidos da BChE humana tem 54% de identidade com a

AChE (outra colinesterase) de Torpedo californica e Torpedo marmorata, duas

espécies de arraia, e 38% de identidade com a AChE de Drosophila melanogaster

(McTiernan et al., 1987). O gene da AChE de Torpedo tem um grande exon que

contém a maior parte da região codificadora, assim como ocorre no exon 2 do gene

BCHE humano. Essa grande similaridade sugere que esses genes derivam de um

ancestral comum.

Há uma grande similaridade entre o gene BCHE humano e o de vários outros

mamíferos. A maior identidade, entre mamíferos, em relação ao polipeptídeo foi

encontrada entre humanos e macacos, Pan troglodytes, (99,48%) e a menor entre

humanos e camundongos, Mus musculus, (81,12%). As seqüências em torno do sítio

ativo e do sítio aniônico estavam conservadas em vários animais (Nunes, 2006).

2.2.2. FORMAS MOLECULARES DA BChE

A BChE do soro ou plasma, após eletroforese, pode aparecer sob cinco

formas moleculares (Harris et al., 1963) que, em ordem de peso molecular, são: C

(monômero), C

(monômero ligado à albumina sérica através de uma cisteína), C

(dímero), C

(tetrâmero) e C

(tetrâmero ligado a uma substância desconhecida).

Esse complexo C

é formado pela interação dos genes BCHE e CHE2.

A banda C

é formada por quatro subunidades unidas por fortes ligações não

covalentes, sendo que o conjunto é estabilizado pelas pontes dissulfeto inter-dímeros

(Lockridge et al., 1979). Cada tetrâmero contém quatro sítios ativos.

Após estimativas de massa molecular e sua relação com a cAa, identificou-se

a banda C

como um heterodímero formado pela associação da banda C

com uma

proteína com 65Kda através de uma ponte dissulfeto. Após eletroforese posterior à

imunoadsorção para albumina, se nota que a banda C

não aparece, demonstrando

que a imunoadsorção para albumina consegue remover a banda C

. Portanto, o

resultado indica que a banda C

é um conjugado covalente entre o monômero C

e a

albumina (Masson, 1989).

A variabilidade do loco CHE2 afeta uma substância que se liga à BCHE

(Masson, 1991). Esse polimorfismo é caracterizado de acordo com a presença ou a

ausência de uma banda detectada em eletroforese denominada C

, cujo padrão de

herança é autossômico dominante (Harris et al., 1963). As freqüências mais comuns

desse alelo em populações caucasóides estão em torno de 5%.

Existem várias técnicas eletroforéticas para se detectar a banda C

entretanto, a técnica de eletroforese em gel de ágar ácido (Van Ros e Vervoort,

1973, com modificações de Fadel-Picheth, 1991 e Souza, 1995) permite uma melhor

separação entre a banda C

, que migra para o pólo positivo, e as demais formas

moleculares da BChE que formam só uma banda com mobilidade para o pólo

negativo.

A banda C

4/5

foi encontrada pela primeira vez por Souza (1995) quando

tentava padronizar a técnica de eletroforese em gel de ágar ácido de Van Ros e

Vervoort (1973), com modificações de Fadel-Picheth (1991) para posterior

quantificação da banda C

Alcântara et al. (1999 e 2000) encontraram 12 bandas eletroforéticas em gel

de poliacrilamida em nosso laboratório, sugerindo que a BCHE possa estar ligada a

diversas outras substâncias.

O centro ativo da BChE é constituído por um sítio esterásico e um sítio

aniônico. O sítio aniônico se liga com o grupo amônio quaternário (cAa positiva) da

colina (Sussman et al., 1991). Masson et al. (1996) demonstraram que o aminoácido

mais importante para o sítio aniônico da BCHE é a Asp70 e que os aminoácidos

aromáticos não são importantes para essa função.

2.2.3. VARIABILIDADE GENÉTICA

2.2.3.1. GENE BCHE

O alelo do gene BCHE, denominado usual, é o mais freqüente, e atípico (70G)

foi o primeiro descrito (Kalow e Genest, 1957). Alguns dos fenótipos foram

identificados usando-se inibidores diferenciais, que podem inibir em graus diferentes

as variantes não usuais. Atualmente, devido ao conhecimento da seqüência e

caracterização da estrutura desse gene, já é possível identificar as variantes pela

análise do DNA. Em vista disso já foram descritas mais de 65 mutações nesse gene

(Souza et al., 2005b).

Kalow e Genest (1957) mostraram que a inibição pela dibucaína distinguia

dois tipos de indivíduos, os sensíveis e os não sensíveis à inibição (determinadas

respectivamente pelos alelos usual e atípico). Essa variante, denominada variante A,

foi identificada molecularmente por McGuire et al. (1989), sendo que ela é

caracterizada por uma mutação de ponto no nucleotídeo 290, o que ocasiona uma

modificação de ácido aspártico 70 (GAT) para glicina (GGT) no sítio aniônico.

Uma outra variante, resistente ao fluoreto, BCHE*F foi identificada usando-se

o fluoreto de sódio como inibidor diferencial (Harris e Whittaker, 1961).

Posteriormente foram identificadas duas formas resistentes ao fluoreto: F-1 (243M),

caracterizada por uma mutação de ponto que altera a treonina 243 (AC

G) para

Mionina (AT

G) e F-2 (390V), caracterizada por uma mutação de ponto que altera a

glicina 390 (GGT) para valina (GTT) (Nogueira et al., 1992).

Outra variante, esta denominada de J, foi identificada por Garry et al. (1976).

Essa variante é caracterizada por uma mutação que altera o ácido glutâmico 497

(GA

A) para valina (GTA) (Bartels et al., 1992a). Essa variante, encontrada em

ligação absoluta com a variante K (Bartels et al., 1992a), determina uma queda de

66% na enzima circulante e a um decréscimo correspondente na atividade

enzimática.

A variante K (539T) foi descrita por Rubinstein et al. (1978) sendo

caracterizada por uma mutação de ponto que causa uma substituição da alanina

CA) para treonina (ACA) na posição 539 do exon 4, e também se verificou que a

variante A, em 89% dos casos, encontra-se na conformação cis com a variante K

(Bartels et al., 1992b).

Estudos populacionais, baseados em análise do DNA, indicaram que a

variante K é a mais freqüente dentre as variantes não usuais da BCHE. Bartels et al.

(1992a) encontraram, em população norte-americana, uma freqüência de 12,8% para

a variante K. Gaffney e Campbell (1994) observaram uma freqüência de 19,6% em

população escocesa. Shibuta et al. (1994) e Izumi et al. (1994) encontraram uma

freqüência de 16,4% e 17,5% em amostras de japoneses, respectivamente. Jensen

et al. (1996), em população dinamarquesa, encontraram uma freqüência de 18%. No

Brasil, estudando amostras de brancos e miscigenados (brancos x negros), Souza et

al. (1998) encontraram freqüências de 18,4% e 17,1%, respectivamente.

As variantes consideradas como silenciosas levam à ausência total de

atividade enzimática ou a uma diminuição de mais de 90% dessa atividade, em

relação à do fenótipo usual. O primeiro caso de deficiência completa foi descrito por

Liddel et al. (1962), revelando a existência de um homozigoto para alelo silencioso.

Entretanto, mais tarde se observou heterogeneidade entre as variantes silenciosas

(Goedde et al., 1965, Scott e Wright, 1976). Pela análise de DNA, vários alelos

silenciosos foram identificados (Nogueira et al., 1990; Muratani et al., 1991; Hada et

al., 1992; Hidaka et al., 1992; Hidaka e Yuchi, 1995; Maekawa et al., 1995 e 1997;

Primo-Parmo, 1996; Sudo et al., 1996 e 1997; Sakamoto et al., 1998).

Existem, também, polimorfismos descritos fora da região codificadora da

enzima madura, como as variantes no sítio -116 no exon 1, que leva à alteração de

C para TAC, sendo que a freqüência do alelo -116A, observada pelos autores que

descreveram a mutação, foi igual a 8% (BARTELS et al., 1990).

Furtado (2005) investigou em amostra de obesos (IMC ≥ 30) e controles de

peso normal (20 ≤ IMC < 25) a presença do polimorfismo G→A nessa posição nt -

116 no exon 1 do gene BCHE. Este estudo foi o primeiro relato da presença desse

polimorfismo na população brasileira. A autora não verificou diferenças significativas

entre as amostras de obesos e controles quanto às freqüências do alelo -116A.

Neste mesmo trabalho, Furtado (2005) determinou a atividade da BChE em obesos

classificados de acordo com o genótipo relativo aos alelos –116A e –116G do exon

1, e constatou que a mutação –116A está associada a uma diminuição da atividade

da BChE. A autora também realizou análises levando em conta as mutações –116A

e A539T, visto que as variações desses sítios estão em desequilíbrio de ligação

(BARTELS et al., 1990). Foi observado que a atividade da BChE era menor somente

quando os indivíduos portavam a mutação –116A.

2.2.4. FUNÇÃO BIOLÓGICA DA BChE

A BChE é encontrada nos principais sistemas corpóreos dos mamíferos, como

massa branca do cérebro, sistema vascular, respiratório, digestório, urogenital e

também em certas glândulas endócrinas e exócrinas. Entretanto sua função biológica

ainda não foi claramente estabelecida, havendo sugestões de que esteja relacionada

com o Metabolismo de lípides, condução nervosa lenta e regulação dos níveis de

colina e acetilcolina do plasma (revisão em Kutty, 1980 e Whittaker, 1980).

Vários fatores foram associados com alterações na atividade da BChE. Entre

os que se referem a sua diminuição, encontram-se os estrógenos (Sidell e

Kaminskis, 1975) e entre os que se relacionam com seu aumento, temos a

hiperlipoproteinemia e a obesidade (revisão em Kutty, 1980), o diabetes (Antopol et

al., 1937) e o alelo CHE2*C5+, que determina cerca de 25% de aumento na atividade

da BChE (Harris, 1980).

2.2.4.1. RELAÇÃO DA BChE COM PESO, ALTURA E ÍNDICE DE MASSA

CORPORAL (IMC)

Já foi encontrada correlação positiva entre a atividade da BChE e o peso

corporal (Stueber-Odebrecht et al., 1985). Chautard-Freire-Maia et al. (1990 e 1991)

encontraram correlação positiva da atividade da BChE com peso em indivíduos

CHE2 C5- e, posteriormente, em indivíduos CHE2 C5+ de banda fraca, sendo que o

mesmo não ocorre em CHE2 C5+ de banda forte.

Também foi encontrada uma correlação positiva entre a atividade da BChE e o

teor de gordura subcutânea (Berry et al., 1954). Foi encontrada também um aumento

da atividade da BChE em obesos e em hiperlipêmicos com peso normal (Cucuianu

et. al., 1968).

A atividade da BChE mostrou-se correlacionada positivamente com peso e

negativamente com altura, indicando aí sua correlação com o índice de massa

corporal (Chautard-Freire-Maia, 1989).

Chautard-Freire-Maia et al. (1991) verificaram que os indivíduos CHE2 C5+,

com o complexo C

forte, apresentavam em média, significaivamente, menor peso

(64,66 ± 0,73kg) que os controles CHE2 C5- (70,59 ± 0,97kg). Esses resultados

também foram verificados por Alcântara (2000) analisando essas relações com o

IMC. Sendo que, para explicar-los, Alcântara et al. (2001) levantaram a hipótese de

que a presença de C

numa proporção alta pode levar a uma estocagem menor de

gordura.

Os dados diferenciais obtidos quanto ao IMC em pessoas CHE2 C5+ e CHE2

C5- foram indicativos da influência do loco CHE2 no Metabolismo de lípides. Em

obesos, o fenótipo CHE2 C5+ forte mostrou-se associado com menores valores

médios de RCQ (razão cintura/quadril) e insulina. Locos condicionadores dessas

variáveis podem ser moduladores da expressividade do complexo C

, sendo que o

menor valor médio de insulina pode explicar a maior freqüência de emagrecimento

nos indivíduos de fenótipo CHE2 C5+ forte. Esses também apresentaram uma

tendência para maiores valores de creatinina, indicando maior massa corporal do

que os indivíduos de fenótipo CHE2 C5+ fraco (Alcântara, 2000).

Alcântara (2000) verificou uma maior freqüência de bandas extras da BChE

em obesos (2,20% ± 1,09%) do que na população geral (0,25% ± 0,14%; χ

= 8,40, p

<0,01), sugerindo um papel do gene BCHE na determinação genética da obesidade.

Segundo Souza et al. (2005a), a BCHE pode estar relacionada com o

Metabolismo de lípides, uma vez que variantes do nucleotídeo A539T do gene BCHE

afetam diferentemente a variância do IMC. Andrade et al. (2008), ampliando o estudo

de Souza et al. (2005a), e determinando nessa mesma amostra os genótipos do

gene BCHE, no que se refere ao nt -116 do exon 1, verificaram que o alelo -116A é

necessário para o aumento da variância do IMC e deve ser o responsável pelo

resultado obtido anteriormente, quando foram estudadas as variações do nt 1615,

que se encontram em desequilíbrio de ligação com as do nt -116.

A interação do gene BCHE da butirilcolinesterase e do gene CHE2, que

determina proteína ainda não identificada, condiciona o fenótipo CHE2 C5 +,

associado com peso e IMC mais baixos do que o fenótipo CHE2 C5- (Chautard-

Freire-Maia et al., 1991; Alcântara et al., 2001). A grelina, determinada pelo gene

GHRL, só quando acilada ativa o receptor do segretagogo do GH (Kojima et al.,

2001). Em roedores, Tschöp et al. (2000) mostraram que a grelina causa aumento de

peso pelo aumento da ingestão de alimento e redução na utilização da gordura. De

Vriese et al. (2004) mostraram que a BChE do soro humano atua na desacilação da

grelina. Considerando esses dados sobre a grelina, é possível explicar a associação

negativa da atividade da BChE com IMC como devida ao papel dessa enzima na

inativação da grelina. Assim, é esperado que o fenótipo CHE2 C5+, que determina

cerca de 25% mais atividade da BChE, esteja associado com a diminuição do peso e

do IMC, como relatado (Chautard-Freire Maia et al., 1991; Alcântara et al., 2001).

3. OBJETIVO GERAL

1) Verificar o efeito conjunto de variações dos genes BCHE (condicionador da

butirilcolinesterase) e GHRL (condicionador da grelina) no índice de massa

corporal e na obesidade.

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1) Determinar as freqüências de variações do exon 2 (R51Q, L72M) do gene

GHRL da grelina, em obesos e controles pareados.

2) Verificar se ocorre associação entre os polimorfismos do gene GHRL e a

obesidade.

3) Verificar o efeito conjunto das variações do gene GHRL e do gene BCHE

(exons 1 e 4), no que se refere à associação com obesidade.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAL

O material se refere a homens euro-brasileiros, doadores de sangue de

Curitiba, classificados em 144 obesos (IMC ≥ 30) e 153 controles (20 ≤ IMC< 25),

pareados por idade (t= 0,249; p> 0,80; tabela 1). A amostra desses obesos inclui os

obesos mórbidos da amostra inicial de doadores de sangue (N = 3006) e já consta

com dados sobre a atividade da butirilcolinesterase e sobre os genótipos dos exons 1

e 4 do gene BCHE..

Tabela 1: Médias (± D.P.) de idade e de índice de massa corporal (IMC) em

controles e obesos

Amostras n Variáveis Media

± D.P Amplitude de Variação

Idade 36,31 ± 9,36 18 - 60

Controles 153

IMC 23,10 ±1,26 20,28 - 24,98

Idade 36,59 ±9,80 18 - 59

Obesos 144

IMC 32,93 ±3,22 30,04 - 47,12

4.2. MÉTODOS LABORATORIAIS

4.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA

O DNA da amostra já tinha sido extraído, excetuando-se as amostras 2717 e

2056 as quais foram extraídas no decorrer da pesquisa, pelo método de salting-out

(Lahiri e Nurnberger, 1991) e estava estocado a -20

C no Laboratório de

Polimorfismos e Ligação. A Modologia de análise de DNA é por PCR-SSCA (Single

Strand Conformational Analysis). Com relação às mutações, localização e

identificação, do gene GHRL, seguiu-se o protocolo de Hinney et. al. (2002).

4.2.2. PCR

A solução de PCR contém 4 ۟µl de PCR SuperMix (Invitrogen), 1 ۟µl de DNA

(cerca de 100ng), 10pmol de cada um dos iniciadores.

As condições da PCR são as seguintes:

1. Desnaturação inicial: 94º C por 5 minutos

2. Desnaturação: 94

C por 30 segundos;

3. Hibridização: 48

C por 30 segundos;

4. Extensão: 72

C por 30 segundos;

5. Ciclos: 35 (passos 2 a 4);

6. Extensão final: 72

C por 10 minutos.

Os iniciadores utilizados estão mostrados na tabela 2.

Após a PCR, foram misturados 5 ۟µl de DNA, já amplificado, a 5 ۟µl de solução

de manutenção da fita simples (95% de formamida, 0,25% de azul de bromofenol,

0,25% de xileno cianol, 10mM de EDTA e 10mM de NaOH). Esta solução foi

subMida a 94

C por 5 minutos e imediatamente colocada no gelo, até sua aplicação

no gel de poliacrilamida.

A técnica de SSCA (análise de conformação de fita simples) baseia-se na

amplificação do DNA e posterior desnaturação por calor, gerando fitas simples. As

amostras resultantes são colocadas em gel de poliacrilamida. As fitas simples

adquirem conformação tridimensional e podem correr em posições diferentes no gel.

Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e,

conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento.

Tabela 2: Seqüências dos iniciadores utilizados para amplificar os fragmentos de

DNA na técnica de SSCA (Análise Conformacional de Fita Simples)

4.2.3. ELETROFORESE

As condições de eletroforese para os fragmentos analisados (tabela 3) foram

estabelecidas experimentalmente.

Iniciadores Seqüência 5’  3’

Tamanho do fragmento

(pb)

GHRL - gene da grelina

GHRL15 TCTCCCAGAGCACAAAGGAC 184

GHRL13 TTCTGCTTGACCTCCATCTTCC

GHRL25 GGAGTCGAAGAAGCCACCA 138

GHRL23 CAGAAGCATAAAACTGCAGAGG

BCHE – gene da butirilcolinesterase

E1F CTGCTGCCAACTCTCGCGAG 203

E1R CGAAGGTGTAAATTCAGAGC

N45 CTGTGTAGTTAGAGAAAATG 258

P43

GAAAATATGTTCTATAAAGGG

Tabela 3: Condições das eletroforeses de SSCA para os diferentes fragmentos dos

genes GHRL e BCHE.

Fragmentos

Concentração

de acrilamida

% de

bisacrilamida

em relação à

acrilamida

pH do

tampão de

preparo do

gel

Pré-corida

(tempo;

Volts)

Tempo de

corrida

(horas)

GHRL

aa 51 10 3,4 1 h; 180

5:30

aa 72 8 3,4 8,20 1 h; 180

BCHE

exon 1 10 2 8,20 30’; 100

exon 4 10 2 8,2 30’; 100

Para o fragmento de GHRL- aa 51, (figura 4) foi utilizada uma solução estoque

de acrilamida 29:1 (29g de acrilamida; 1g de bisacrilamida; 5ml de glicerol, completar

para 100 ml com água bidestilada).

A concentração final do gel foi de 10 %, e o tampão do gel foi o ácido (tampão

Tris-HCl 33mM, pH 4,7). A corrida eletroforética consistiu em duas etapas, a primeira

foi de 1:30 horas a 350 volts e 17mA e depois de 4 horas a 200 volts.

FIGURA 5: Gel de poliacrilamida 29:1, 10% descontínuo. Genótipos quanto ao

gene GHRL: 1 – 51AA, 2 – 51AQ.

Para o fragmento GHRL- aa 72, (figura 5) foi utilizada uma solução estoque de

acrilamida de 29:1 (29g de acrilamida; 1g de bisacrilamida; 5ml de glicerol, completar

para 100 ml com água bidestilada).

A concentração final de acrilamida do gel foi de 8%, e o tampão do gel foi o

básico (tampão TBE 1x, pH 8,2).

A corrida eletroforética foi realizada a 180 volts e 17mA, por um período de 6

horas.

FIGURA 6: Gel de poliacrilamida 29:1, 8% contínuo. Genótipos quanto ao

gene GHRL: 1 – 72LM, 2 – 72MM, 3 – 72LL.

Para o exon 1 da butirilcolinesterase foi utilizada uma solução estoque de

acrilamida de 49:1 49g de acrilamida; 1g de bisacrilamida; 5ml de glicerol,

completando para 100 ml com água bidestilada.

A concentração final de acrilamida do gel foi de 10%, e o tampão do gel foi o

básico (tampão TBE 1x, pH 8,2).

A corrida eletroforética foi realizada a 100 volts e 13mA, por um período de 20

horas.

12 3

Para o exon 4 da butirilcolinesterase foi utilizada uma solução estoque de

acrilamida de 49:1 49g de acrilamida; 1g de bisacrilamida; 5ml de glicerol,

completando para 100 ml com água bidestilada.

A concentração final de acrilamida do gel foi de 10%, e o tampão do gel foi o

básico (tampão TBE 1x, pH 8,2).

A corrida eletroforética foi realizada a 100 volts e 13mA, por um período de 22

horas.

A solução estoque de tampão TBE 5X é preparada com 54g de Tris, 27,5 g de

ácido bórico, 20 ml de EDTA 0,5M (pH 8,0) e completar o volume para 1000 ml de

água destilada.

Após a corrida, seguiu-se a coloração do gel com nitrato de prata (Budowle e

cols., 1991). O gel foi lavado em solução de HNO

a 1% por três minutos. Em

seguida foi lavado três vezes com água destilada. O gel foi, então, coberto com

solução de AgNO

(2,02 g de AgNO

em 1000 ml de água bidestilada) e colocado por

30 segundos no microondas. A solução de nitrato de prata foi retirada e o gel foi

lavado três vezes com água destilada. A revelação foi feita com solução de Na

(170 ml de Na

e 92 ۟µl de formaldeído), sendo preparada cinco minutos antes do

uso. Um terço dessa solução foi despejada sobre o ge, que foi colocado no forno

microondas por 30 segundos. O gel foi retirado do forno microondas e a solução

enegrecida foi eliminada. O restante da solução de Na

foi despejada sobre o

gel, que foi mantido em agitação até que aparecessem bandas. A solução foi, então,

retirada e o gel foi lavado três vezes com água destilada. Depois, o gel foi subMido a

uma solução de ácido acético a 10% por dez minutos e após esse tempo a solução

foi retirada e o gel foi lavado três vezes com água destilada. Após esse processo, o

gel foi subMido a uma solução de glicerol a 5% por 7 minutos. Por fim, o gel foi

mergulhado em uma solução de Manol 30% e glicerol 1% sendo, juntamente com

ele, mergulhado também papel celofane transparente, o qual foi estirado sendo o gel

colocado em cima do mesmo, coberto com um papel filtro e guardado no meio de

duas placas de vidro até que fosse escaneado.

4.3. MÉTODOS ESTATÍSTICOS

As freqüências alélicas foram obtidas pelo método de contagem direta.

As análises estatísticas (médias, freqüências, teste t, teste F, teste

, teste

exato de Fisher, coeficiente de correlação etc.) foram realizadas com o uso do

programa STATISTICA for Windows (Statsoft, Inc. 1996).

Foram comparadas as médias dos diferentes genótipos em obesos e

controles, no que se refere ao IMC, idade e atividade da butirilcolinesterase,

considerando-se os sítios do gene GHRL codificantes dos aminoácidos 51 e 72.

Sempre que as variâncias diferiram estatisticamente, aplicou-se o teste-t para

variâncias separadas.

Foi feita uma análise de regressão múltipla escalonada, tendo a atividade da

butirilcolinesterase como variável dependente. Nessa análise, as variáveis

independentes foram: idade, IMC, exons 1 e 4 do gene BCHE e a região do gene

GHRL codificadora do aminoácido 72. Os códigos adotados para os genótipos foram

os seguintes: exon 1 do gene BCHE (1 = -116GG, 2 = -116GA, 3 = -116AA); exon 4

do gene BCHE (1 = 539AA, 2 = 539AT, 3 = 539TT); região do gene GHRL

codificadora do aminoácido 72 (1 = 72LL e 2 = 72LM + 72MM).

5. RESULTADOS

5.1 VARIABILIDADE DO GENE GHRL

Com relação ao sítio do gene GHRL, codificador do aminoácido 51 (R51Q),

os resultados obtidos quanto às freqüências genotípicas estão dispostos na tabela 4.

Tabela 4: Freqüências genotípicas quanto ao sítio do

gene GHRL codificador do aminoácido 51.

Obesos Controles

Genótipos N % N %

51AA

141 99,30 151 98,69

51AQ

1 0,70 2 1,31

51QQ

0 0,00 0 0,00

Total 142 100,00 153 100,00

Comparação

= 0,004; p > 0,90

A tabela 5 mostra os dados referentes às freqüências genotípicas do sítio do

gene GHRL, codificador do aminoácido 72 (L72M).

Tabela 5: Freqüências genotípicas quanto ao sítio

do gene GHRL codificador do aminoácido 72.

Obesos Controles

Genótipos N % N %

72LL

126 88,11 134 87,58

72LM

16 11,19 18 11,77

72MM

1 0,70 1 0,65

Total 143 100,00 153 100,00

Comparação

= 0,026; p > 0,95

A tabela 6 mostra os dados de freqüências alélicas para o gene GHRL,

considerando-se separadamente os dois sítios estudados.

Tabela 6: Freqüências alélicas (%) do gene GHRL.

Amostras GHRL

51A 51Q 72L 72M

Controles 99,35% ± 0,46% 0,65% ± 0,46% 93,46% ± 1,41% 6,54% ± 1,41%

Obesos 99,65% ± 0,35% 0,35% ± 0,35% 93,71% ± 1,42% 6,29% ± 1,42%

Comparações χ

= 0,26; p > 0,60 χ

= 0,01; p > 0,90

Considerando-se que os grupos de obesos e controles não diferiram quanto

às freqüências genotípicas e alélicas desses dois sítios do gene GHRL, na tabela 7

foram reunidos esses grupos, de modo a se constituir uma amostra

predominantemente de descendência européia, referente à cidade de Curitiba. Na

tabela 7, são mostradas as distribuições genotípicas totais e os resultados de

comparações com o esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na tabela 8, são

mostradas as respectivas freqüências alélicas.

Tabela 7: Freqüências genotípicas para o gene GHRL (N = 295, aa51; N = 296,

aa72), referente à amostra total de descendentes de europeus de Curitiba, com

respectivos valores de χ

em relação à comparação com o equilíbrio de Hardy-

Wemberg.

Genótipos do gene GHRL

51AA 51AQ 51QQ 72LL 72LM 72MM

N % N % N % N % N % N %

292 98,98 3 1,02 0 0,0 260 87,84 34 11,48 2 0,68

= 0,002; p > 0,90 χ

= 0,201; p > 0,50

Tabela 8: Freqüências alélicas de variantes de dois sítios do

gene GHRL na amostra total de descendentes de europeus de Curitiba.

Gene GHRL da grelina

Alelo % ± E.P. Alelo % ± E.P.

51A

99,49 ± 0,29

72L

93,58 ± 1,01

51Q

0,51 ± 0,29

72M

6,42 ± 1,01

As tabelas 9 e 10 mostram os dados de distribuição dos genótipos de

controles e obesos, respectivamente, considerando-se os genes GHRL da grelina e

BCHE da butirilcolinesterase.

Tabela 9: Distribuição de freqüência dos genótipos de

controles quanto aos genes GHRL da grelina e BCHE

da butirilcolinesterase

Genótipos

GHRL BCHE

51;72 -116; 539 N

51AA; 72LL -116GG; 539AA

81 55,48

51AA; 72LL -116GG; 539AT

23 15,75

51AA; 72LL -116GG; 539TT

3 2,05

51AA; 72LL -116GA; 539AA

2 1,37

51AA; 72LL -116GA; 539AT

17 11,64

51AA; 72LL -116GA; 539TT

2 1,37

51AA; 72LL -116AA; 539TT

1 0,68

51AA; 72LM -116GG; 539AA

8 5,48

51AA; 72LM -116GG; 539AT

2 1,37

51AA; 72LM -116GA; 539AA

1 0,68

51AA; 72LM -116GA; 539AT

1 0,68

51AA; 72LM -116GA; 539TT

2 1,37

51AA; 72MM -116GG; 539AA

1 0,68

51AQ; 72LL -116GG; 539AT

1 0,68

51AQ; 72LM -116GG; 539AA

1 0,68

Totais 146 100%

Tabela 10: Distribuição de freqüência dos genótipos de

obesos quanto aos genes GHRL da grelina e BCHE

da butirilcolinesterase.

Genótipos

GHRL BCHE

51;72 -116; 539 N

51AA; 72LL -116GG; 539AA

77 59,23

51AA; 72LL -116GG; 539AT

15 11,54

51AA; 72LL -116GG; 539TT

3 2,31

51AA; 72LL -116GA; 539AT

17 13,08

51AA; 72LL -116GA; 539TT

2 1,54

51AA; 72LM -116GG; 539AA

6 4,61

51AA; 72LM -116GG; 539AT

6 4,61

51AA; 72LM -116GA; 539AT

2 1,54

51AA; 72MM -116GG; 539AA

1 0,77

51AQ; 72LL -116GA; 539TT

1 0,77

Totais 130 100,00%

5.2. ÍNDICE DE MASSA CORPORAL, IDADE E ATIVIDADE.

As tabelas 11 e 12 mostram dados referentes a idade, IMC e atividade da

butirilcolinesterase em controles e obesos, respectivamente, classificados quanto aos

genótipos de L72M. Tanto em obesos como em controles, a variância da distribuição

da atividade da BChE é maior, com diferença estatisticamente significativa, em

indivíduos com o alelo 72M, quando comparado com os que não o possuem.

Tabela 11: Dados de idade, índice de massa corporal (IMC) e atividade da

butirilcolinesterase de controles, classificados quanto ao aminoácido 72 codificado

pelo gene GHRL da grelina.

GHRL (aa72)

Idade IMC Atividade da BChE (KU/L)

Genótipos n Média ± D.P. S

n Média ± D.P. S

Média ±

D.P.

72LL

134 36,00 ± 9,39 88,14 134 23,05 ± 1,29 1,653 131 4,64 ± 1,31 1,71

72LM

+72MM

19 38,53 ± 9,08 82,37 19 23,43 ± 0,96 0,923 18 4,92 ± 2,07 4,28

Testes

t = 1,10, p

> 0,20

F = 1,07,

p > 0,90

t = 1,22, p

> 0,20

F = 1,79,

p > 0,90

t = 0,57,

p > 0,10

F = 2,50, p

<0,05

Tabela 12: Dados de idade, índice de massa corporal (IMC) e atividade da

butirilcolinesterase de obesos, classificados quanto ao aminoácido 72 codificado pelo

gene GHRL.

GHRL (aa72)

Idade IMC Atividade da BChE (KU/L)

Genótipos n Média ± D.P. S

n Média ± D.P. S

Média ±

D.P.

72LL

126 36,99 ± 9,92 98,41 126 32,95 ± 3,29 10,86 121 6,30 ± 2,71 7,32

72LM

+72MM

17 33,71 ± 8,86

78,47 17 32,90 ± 2,7 7,28 15 7,99 ± 3,97 15,76

Testes

t = 1,30, p

> 0,15

F = 1,25;

p > 0,60

t = 0,06, p

> 0,95

F = 1,49;

p > 0,35

t = 1,60, p

> 0,10

F = 2,15;

p < 0,05

Em obesos, classificados pelos genótipos mais comuns quanto aos genes

GHRL e BCHE (ver tabela 10), foram feitas comparações entre as médias do IMC,

como mostra a Tabela 13, não sendo verificadas diferenças estatísticamente

significativas entre os genótipos 72LL e 72LM+72MM.

Tabela 13. Médias de índice de massa corporal ± erros padrões, em obesos

classificados pelos genótipos dos genes da butirilcolinesterase e da grelina.

Média do IMC ± Erro Padrão

Genótipos do gene da butirilcolinesterase

Genótipos do gene

da grelina

-116GG;539AA -116GG;539AT -116GA;539AT

72LL

32,9 ± 0,6 31,8 ± 0,4 33,4 ± 0,6

72LM+72MM

33,7 ± 1,4 32,4 ± 0,6 33,7 ± 0,4

Teste t 0,67 0,86 0,16

p > 0,50 > 0,40 > 0,85

A tabela 14 mostra comparação entre as médias da atividade da

butirilcolinesterase, quando se comparam todos os obesos e controles, mostrando

que obesos apresentam uma atividade mais alta da BChE do que os controles,

sendo adiferença entre as médias estatisticamente significativa.

Tabela 14: Média (± D.P.) da atividade (KU/L) da butirilcolinesterase em controles e

obesos.

Amostras N Média ± D.P.

Controles 149 4,67 ± 1,42

Obesos 137 6,47 ± 3,00

Teste-t t = 6,58; p < 0,001

A tabela 15 mostra dados de distribuição de freqüência da atividade da

butirilcolinesterase, em intervalos classe, considerando-se obesos homozigotos para

o alelo 72L do gene GHRL. O gráfico 1 ilustra os dados da tabela 15.

Tabela 15: Distribuição de freqüência da atividade da butirilcolinesterase em 121

obesos homozigotos para o alelo 72L.

Atividade (KU/L) N (%)

0,0 < x ≤ 2,0 2 1,65

2,00 < x ≤ 4,0 19 15,70

4,0 < x ≤ 6,0 42 34,71

6,0 < x ≤ 8,0 33 27,27

8,0 < x ≤ 10,0 15 12,40

10,0 < x ≤ 12,0 6 4,96

12,0 < x ≤ 14,0 2 1,65

14,0 < x ≤ 16,0 1 0,83

16,0 < x ≤ 18,0 0 0

18,0 < x ≤ 20,0 1 0,83

Figura 7: Freqüências de homozigotos para o alelo 72L, distribuídas segundo

o nível de atividade da butirilcolinesterase.

0,0 < x ≤ 2,0 2,00 < x ≤ 4,0 4,0 < x ≤ 6,0 6,0 < x ≤ 8,0 8,0 < x ≤ 10,0 10,0 < x ≤ 12,0 12,0 < x ≤ 14,0 14,0 < x ≤ 16,0 16,0 < x ≤ 18,0 18,0 < x ≤ 20,0

Atividade

A tabela 16 mostra os dados de distribuição de freqüência da atividade da

butirilcolinesterase, em intervalos classe, considerando-se obesos com o alelo 72M

em hetero ou em homozigose. O gráfico 2 ilustra os dados da tabela 16.

Tabela 16: Distribuição de freqüência da atividade da butirilcolinesterase em 15

obesos com a variante 72M em hetero ou homozigose.

Atividade (KU/L) N (%)

2,0 < x ≤ 4,0 1 6,67

4,0< x ≤ 6,0 6 40,00

6,0< x ≤ 8,0 3 20,00

8,0 < x ≤ 10,0 1 6,67

10,0 < x ≤ 12,0 0 0

12,0 < x ≤ 14,0 2 13,33

14,0 < x ≤ 16,0 2 13,33

Figura 8: Freqüências de homozigotos e heterozigotos para o alelo 72M,

distribuídas segundo o nível de atividade da butirilcolinesterase.

2,0 < x ≤ 4,0 4,0< x ≤ 6,0 6,0< x ≤ 8,0 8,0 < x ≤ 10,0 10,0 < x ≤ 12,0 12,0 < x ≤ 14,0 14,0 < x ≤ 16,0

Observa-se que em obesos homozigotos para o alelo 72L, cerca de 20,7%

possuem atividade da BChE acima de 8KU/L, enquanto nos obesos homo ou

heterozigotos para o alelo 72M, cerca de 33,3% possuem atividade acima desse

valor. Para detalhar esses resultados, elaborou-se a tabela 17, que mostra dados

dos cinco obesos que possuem o alelo 72M e a atividade da BCHE acima de 8 KU/L.

Tabela 17: Dados dos cinco obesos que possuem o alelo 72M do gene GHRL e que

apresentam os maiores níveis de atividade da butirilcolinesterase.

Identificação Idade IMC Atividade (KU/L) GHRL

1714 37 32,39 15,09 72LM

1692 31 41,00 8,61 72LM

1576 44 31,64 12,94 72LM

1435 35 35,92 13,93 72MM

1173 30 30,48 14,32 72LM

As tabelas 18 e 19 mostram coeficientes de correlação entre as variantes do

aminoácido 72, codificado pelo gene GHRL, com as variáveis idade, IMC, atividade

da BChE (KU/L), variantes dos exons 1 e 4 do gene BCHE, em controles e obesos,

respectivamente. Os códigos utilizados para as análises foram: para o exon 1 (1 = -

116GG, 2 = -116GA, 3 = -116AA), para o exon 4 (1 = 539AA, 2 = 539AT, 3 = 539TT)

do gene BCHE. Para o gene GHRL foram utilizados os códigos: 1 = 72LL e 2 = 72LM

+ 72MM.

Tabela 18: Coeficientes de correlação das variáveis idade, IMC, atividade da

butirilcolinesterase, exon 1 e exon 4 do gene BCHE em relação à variável

aminoácido 72, codificada pelo gene GHRL, em 144 controles.

Butirilcolinesterase Gene BCHE

Idade IMC

Atividade Exon 1 Exon 4

0,088 0,066 0,061 0,061 0,021

GHRL – aa 72

0,293 0,433 0,471 0,467 0,802

Tabela 19: Coeficientes de correlação das variáveis idade, IMC, atividade da

butirilcolinesterase, exon 1 e exon 4 do gene BCHE em relação à variável

aminoácido 72, codificada pelo gene GHRL, em 130 obesos.

Butirilcolinesterase Gene BCHE

Idade IMC

Atividade Exon 1 Exon 4

-0,115 0,048 0,185 -0,035 0,084

GHRL – aa 72

0,194 0,589 0,035 0,696 0,345

O único coeficiente de correlação significativo (r = 0,185; p< 0,05) foi

encontrado entre as variáveis atividade da BChE e o gene GHRL (aa 72) de obesos,

indicando que os genótipos com a presença do alelo 72M tendem a possuir atividade

mais alta da BChE do que os homozigotos selvagens.

A tabela 20 mostra os dados da análise de regressão múltipla escalonada em

130 obesos, que teve como variável dependente a atividade da BChE e como

variáveis independentes os exons 1 e 4 do gene BCHE, a idade, o IMC, e o

aminoácido 72, codificado pelo gene GHRL. O modelo mais econômico de regressão

múltipla confirmou os resultados obtidos pela correlação simples, indicando

corelação significativa entre atividade da BChE e genótipos do gene GHRL, além de

mostrar a influência das variações do sítio -116 do exon 1 do gene BCHE, mostrando

que os genótipos com a variante -116A tendem a ter menor atividade dessa enzima.

Tabela 20: Resultados da análise de regressão múltipla escalonada, referentes à amostra de obesos (N = 130),

considerando-se a atividade da butirilcolinesterase como variável dependente (Y)

Y ± D.P. = 6,47 ± 2,95

Intercepto ± E.P. = 6,62 ± 1,22

Variáveis independentes M ± D.P. b ± E.P. t p

Exon 1 1,17 ± 0,38 -1,67 ± 0,67 2,51 < 0,013

GHRL – aa72 1,12 ± 0,32 1,63 ± 0,78 2,09 < 0,039

Análise de variância

Fontes de variação G.L. Soma dos quadrados F r

Regressão 2 89,62 5,52 0,080

Resíduo 127 1030,31 P < 0,05

Total 129 1119,93

6. DISCUSSÃO

6.1. FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DE R51Q E L72M

Nos 295 doadores de sangue analisados no presente estudo para R51Q,

foram encontrados apenas 3 heterozigotos para o alelo 51Q (dois controles e um

obeso), de modo que não houve diferenças entre as freqüências genotípicas e

alélicas, quando se compararam obesos e controles (tabelas 4 e 6).

Os dados obtidos pelo presente estudo são comparados com os de Ukkola et.

al. (2001), quanto às freqüências genotípicas (tabela 22) e alélicas (tabela 23),

mostrando que em três comparações não houve diferença entre as amostras de

obesos e controles utilizadas pelos dois estudos. Isso pode ser devido ao fato de o

presente estudo utilizar amostras de brasileiros descendentes de europeus, assim

como o estudo realizado por Ukkola et. al. (2001), que estudou uma amostra da

população sueca. No entanto, houve diferença estatisticamente significativa entre os

dois estudos, quando se compararam as freqüências genotípicas e alélicas de

obesos, sendo que as freqüências do presente estudo em relação a 51Q são

significativamente menores que as encontradas por Ukkola e. al. (2001). Em relação

a esses dados, pode-se ressaltar que a média de IMC da amostra de obesos de

Ukkola et. al. (2001) é 42,3 ± 3,4, enquanto que a do presente estudo é 32,9 ± 3,4,

no que se refere aos 142 obesos genotipados para R51Q. Comparando-se essas

médias pelo teste t, verifica-se que a média de IMC dos obesos do presente estudo é

estatisticamente menor (t = 21,36; p <0,001). Como Ukkola et. al. (2001) só

encontraram a variante 51Q em obesos mórbidos, é possível que se obtenha uma

freqüência mais alta desse alelo do que a encontrada no presente estudo, se for

considerada uma amostra brasileira com IMC maior.

Nos 296 indivíduos estudados no presente estudo para L72M não houve

diferenças entre as freqüências genotípicas e alélicas, quando se compararam

obesos e controles (tabelas 5 e 6). Comparando esses dados com os obtidos por

Ukkola et. al. (2001) também não foram encontradas diferenças estatísticas

significativas entre os dois estudos, tanto em obesos como em controles,

considerando-se as freqüências genotípicas e alélicas (tabelas 22 e 23,

respectivamente).

Tabela 21: Comparações entre as freqüências genotípicas de dois sítios do gene

GHRL entre o presente estudo e o realizado por Ukkola et. al. (2001)*.

Estudos Freqüências ± E. P. (%) dos genótipos do gene GHRL

Aminoácido 51 Aminoácido 72

51AA 51AQ + 51QQ 72LL 72LM + 72MM

Controles

Presente estudo

98,69 ± 0,92

(151)

1,31 ± 0,92

(2)

87,58 ± 2,67

(134)

12,42 ± 2,67

(19)

Ukkola at. al.

(2001)

100,00 ± 0,00

(96)

0,00 ± 0,00

(0)

87,50 ± 3,38

(84)

12, 50 ± 3,38

(12)

p (teste exato de

Fisher)

> 0,50 > 0,99

Obesos

Presente estudo

99,30 ± 0,70

(141)

0,70 ± 0,70

(1)

88,11 ± 2,71

(126)

11,89 ± 2,71

(17)

Ukkola et. al.

(2001)

93,75 ± 2,47

(90)

6,25 ± 2,47

(6)

84,38 ± 3,71

(81)

15,63 ± 3,71

(15)

p (teste exato de

Fisher)

< 0,05 > 0,40

* Valores de N entre parênteses.

Tabela 22: Comparações entre as freqüências alélicas de dois sítios do gene GHRL

entre o presente estudo e o realizado por Ukkola et. al. (2001).

Estudos % ± E.P.

Controles Obesos

51Q 72M 51Q 72M

Presente estudo 0,65 ± 0,46 6,54 ± 1,41 0,35 ± 0,35 6,29 ± 1,42

Ukkola et. al.

(2001)

0,00 ± 0,00 6,25 ± 1,75 3,13 ± 1,25 9,38 ± 2,11

p (teste exato de

Fisher)

> 0,50 > 0,99 < 0,05 > 0,20

Comparando as freqüências alélicas obtidas pelo presente estudo com as

disponíveis no HAPMAP (http: //www.hapmap.org/cgi - perl/gbrowse/hapmap_B35/?

name= chr3:1036457.. 1036457), para a variação L72M, não foi encontrada

diferença estatística significativa entre os dados obtidos quanto a análise da

poulação de UTAH (χ

= 0,58, p > 0,4). Foi encontrada diferença estatísticamente

significativa quando comparadas as freqüências obtidas pelo presente estudo com

as das populações: Chinesas (χ

= 9,26, p < 0,05), Japonesa (χ

= 14,5, p < 0,05) e

Africana (χ

= 4,98, p < 0,05) disponíveis no site HAPMAP.

Quanto à variação R51Q, os dados obtidos foram comparados com os

disponíveis no NCBI (SNP, H:\Reference SNP(refSNP) Cluster Report

rs34911341.htm) e não foi encontrada diferença estatisticamente significativa com a

população de afro-americanos disponível (χ

= 069, p > 0,4).

6.2. VARIAÇÃO R51Q DO GENE GHRL E IMC

Segundo Kojima e Kangawa (2005) o aminoácido 51 é o último aminoácido da

grelina madura, localizado na porção COOH – terminal, sendo a trinca

correspondente de DNA importante para a correta ocorrência da recomposição

alternativa. Quando a mutação ocorre e o aminoácido muda de Ainina para

glutamina, a recomposição alternativa fica prejudicada, gerando então uma proteína

aberrante com 94 aminoácidos ao invés da proteína normal com 28 aminoácidos. O

aminoácido é o 51

da pró-grelina.

Ukkola et. al. (2001) reportaram a presença do alelo mutante em 6

heterozigotos de uma amostra de 96 obesos mórbidos (média de IMC = 42,3 ± 3,4

Kg/m

) e sua ausência em controles (p < 0,05). No entanto, o presente estudo

encontrou 2 controles com o alelo mutante 51Q em heterozigose e 1 heterozigoto em

obesos (p > 0,90). De acordo com Kojima e Kangawa (2005), apesar de ser

encontrada associação entre a variação do aminoácido 51 de Ainina para glutamina

com um defeito na recomposição alternativa, ainda não está claro que esta mutação

de fato altere a atividade ou as propriedades biológicas da grelina.

O número reduzido de heterozigotos encontrados no presente estudo

impossibilitou a realização das análises estatísticas comparativas entre a variação

R51Q do gene GHRL com o IMC, isoladamente, e em conjunto com as variações

dos exons 1 e 4 do gene BCHE. Sugerimos um estudo mais amplo com uma

amostra com média de IMC mais elevada, que possa incluir muitos obesos mórbidos

(IMC ≥ 40 Kg/m

6.3. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E IMC

O presente estudo não encontrou nenhuma associação entre a variação L72M

e o IMC tanto em controles (t = 1,22, p > 0,20) como em obesos (t = 0,06, p > 0,95),

quando se compararam os genótipos 72LL e 72LM + 72MM (tabelas 11 e 12,

respectivamente).

Os presentes dados corroboram os de estudos anteriores (Ukkola et. al.,

2001; Hinney et. al. 2002), que também não encontraram associação entre a

freqüência do alelo mutante 72M e a obesidade. É interessante notar que a variação

L72M ocorre numa região não codificadora do gene GHRL (Ukkola et. al., 2001).

Além disso, o presente estudo também não encontrou diferença entre as

médias de IMC, quando se compararam os genótipos 72LL e 72LM+72MM em

obesos, classificados quanto aos genótipos dos exons 1 e 4 do gene BCHE (tabela

13), indicando que essas variações do gene BCHE não alteram o comportamento

desses genótipos de GHRL, quanto ao IMC.

6.4. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E IDADE DE INÍCIO DA OBESIDADE

De acordo com Kojima e Kangawa (2005) e Ukkola et. al. (2001), apesar de a

variação L72M não estar presente na região codificadora da proteína grelina, o alelo

mutante 72M induz a uma obesidade mais precoce.

Ukkola et. al. (2001) reportaram que, indivíduos com o genótipo 72LM tendem

a se tornarem obesos mais cedo (15,6 ± 7,9 anos) do que homozigotos 72LL (20,5 ±

10,5 anos; 0,1 > p > 0,05) e que o inicio da obesidade ainda é mais precoce em

homozigotos 72MM (13,7 ± 3,2 anos), sugerindo que o alelo 72M tenha um efeito na

manifestação precoce da obesidade.

O presente estudo não foi elaborado no sentido de obter informações sobre a

idade de início da obesidade, tendo sido apenas registrada a idade no momento da

doação de sangue. Não foi encontrada associação entre a presença do alelo

mutante 72M e a idade dos obesos (t = 1,30, p > 0,15). No entanto, na tabela 12,

nota-se que a idade média de 17 obesos com 72M é 33,7, enquanto que nos 126

homozigotos 72LL é 36,99, estando no sentido dos dados obtidos por Ukkola et. al.

(2001). É possível que, numa amostra com número maior de portadores de 72M,

pudesse ser obtida diferença entre as médias de idade dos dois grupos.

Quando se realizou, entre os obesos, análises de correlação entre a variação

L72M e as variáveis idade, IMC, atividade da BCHE e variantes dos exons 1 e 4 do

gene BCHE (tabela 19), mais uma vez não foi encontrada correlação entre L72M e

idade, porém a presença do alelo 72M está no sentido de associação negativa com a

idade (r = - 0,115, p = 0,19).

6.5. VARIAÇÃO L72M DO GENE GHRL E ATIVIDADE DA

BUTIRILCOLINESTERASE

A variância da atividade da BChE foi significativamente maior no genótipo

72LM + 72MM, quando comparado com o 72LL, tanto em obesos como em

controles, indicando relação da variação 72M com a distribuição da atividade dessa

enzima.

Além desses dados, em obesos também foi encontrado coeficiente de

correlação positivo (tabela 19) entre a atividade da BChE e a presença do alelo 72M

do gene GHRL. As distribuições das freqüências dos indivíduos 72LL (tabela 15) e

72LM+72MM (tabela 16) com relação à atividade da butirilcolinesterase mostram que

aqueles com atividade relativamente alta da BCHE (> 8,00 KU/L) representam 20,7%

no caso do genótipo 72LL e 33,3% em 72LM + 72MM (Figuras 7 e 8), ilustrando

essa tendência entre o alelo 72M e atividade mais alta da BChE .

É interessante salientar que as médias da atividade da BChE, em obesos, não

diferiram significativamente entre os genótipos, pois em vista das variâncias serem

estatisticamente diferentes, foi utilizado o teste t que considera as variâncias em

separado, de acordo com Blalock (1972). O teste t sem essa consideração seria

significativo (t = 2,15, p < 0,05), de modo que é possível que, em amostra de maior

tamanho, as médias de atividade da BChE difiram entre os genótipos considerados,

quando comparados por teste t.

Em controles, o coeficiente de correlação entre L72M e atividade da BChE

(tabela 18) não foi significativo (r = 0,061; p > 0,40), sugerindo que a relação entre

72M e atividade da BChE parece ser um fenômeno exclusivo de obesos.

O modelo mais econômico de regressão múltipla confirmou os resultados

obtidos pela correlação simples (tabela 20), indicando relação significativa entre

atividade da BChE e genótipos do gene GHRL, após ser considerada a relação das

variações do sítio -116 do exon 1 do gene BCHE, que mostrou que os genótipos com

a variante -116A tendem a ter menor atividade dessa enzima. A relação negativa

entre -116A e atividade da BChE já era esperada uma vez que o presente estudo

utilizou praticamente as mesmas amostras examinadas por Furtado et. al. (2008) que

encontraram média de atividade da BChE menor, quando essa variante está

presente tanto em controles como em obesos. O genótipo -116GG; 72LM+MM

apresentou média de atividade da BChE de 8,42 KU/L em 13 obesos e no genótipo -

116GG; 72LL essa média foi de 6,53 KU/L em 98 obesos. O dado novo do presente

trabalho é a relação entre a variante 72M e atividade mais alta da BChE, mesmo

após ser considerada a influência da variante -116A do gene BCHE.

7. CONCLUSÕES

As freqüências alélicas e genotípicas, para as variações A51Q e L72M do

gene GHRL, parecem ser as primeiras obtidas em amostra do Brasil.

Os presentes dados de freqüências não diferiram dos encontrados por

Ukkola et. al. (2001), exceto os dados quanto ao alelo 51Q.

Não foi encontrada relação entre o IMC e as variantes A51Q e L72M.

Não foi encontrada relação entre o alelo 72M e a idade dos obesos.

Foi encontrada correlação positiva entre a presença do alelo 72M e a

atividade da BChE .

Análise de regressão múltipla escalonada mostrou que o alelo 72M está

associado com o aumento da atividade da butirilcolinesterase, após ser considerada

a relação das variantes do exon 1 do gene BCHE com a atividade dessa enzima

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