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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA APLICADA
MARILEI CASTURINA MENDES
ESTUDO DAS PROPRIEDADES DAS PORFIRINAS TMPyP E ZnTPPS
4
PARA
POTENCIAL APLICAÇÃO EM TERAPIA FOTODINÂMICA
PONTA GROSSA
2008
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1
MARILEI CASTURINA MENDES
ESTUDO DAS PROPRIEDADES DAS PORFIRINAS TMPyP E ZnTPPS
4
PARA
POTENCIAL APLICAÇÃO EM TERAPIA FOTODINÂMICA
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Química na Universidade Estadual de
Ponta Grossa, Programa de Pós-Graduação em
Química Aplicada.
Orientadora: Prof.ª Dr.
a
Christiane Philippini Ferreira
Borges.
PONTA GROSSA
2008
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2
Dedico aos meus pais Valdenir e Rosilda, aos meus
irmãos Valdenir, José (in memorian), Paulo e Suzana, a
meu marido Ricardo e a nosso filho Gabriel.
Sinto saudades dos dias que caminhamos lado a lado e
da amizade que sempre nos uniu. Te amo pra sempre
meu irmão!
3
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por sempre estar ao meu lado, por me
carregar nos dias difíceis e por ter me trazido até aqui.
Agradeço meus pais, que sempre se empenharam em me ensinar a retidão, o
caráter, a perseverança e todos os valores que me permitiram alcançar essa
conquista. Agradeço ainda o amor ímpar que sempre me dedicaram, e a doçura de
suas palavras no decorrer do caminho.
Aos meus irmãos, meus sobrinhos, enfim, a toda minha família que sempre
torceu e acreditou em mim.
Ao meu marido, meu amigo, meu companheiro e grande incentivador dos
meus sonhos, que sempre me apoiou.
A Prof. Christiane, por ter sido mais que uma orientadora e estendido nossos
laços à amizade, sendo compreensiva e paciente nos momentos em que mais
precisei.
As colegas de pesquisa Juliana Hyckzy, Ariana Antonangelo e Jeanine
Domareski, pela ajuda neste trabalho.
As minhas grandes amigas Ana Paula e Silvia, pela amizade, carinho e
gentileza com que sempre me ajudaram e me acolheram em seus lares.
Ao Professor Fábio e a laboratorista Luzia, que se mostraram imensamente
solícitos e me auxiliaram na execução dos testes microbiológicos.
Ao Professor Noboru Hioka e seus alunos que muito me ajudaram para o
entendimento das técnicas colocadas em prática neste trabalho.
A Professora Shirley Nakagaki por ter gentilmente fornecido a porfirina
ZnTPPS
4
, para o estudo apresentado neste trabalho.
4
RESUMO
Neste trabalho estudou-se a porfirina base livre, catiônica, meso-tetrakis(4-
metilpiridil)porfirina, TMPyP e a porfirina metalada, aniônica, Zinco(II)-meso-
tetrakis(4-sulfonatofenil), ZnTPPS
4
, para avaliar suas possíveis aplicações em
terapia fotodinâmica (TFD). Para tanto, foram investigadas através de
espectroscopia molecular UV-Vis, a interação das referidas porfirinas com modelos
biomiméticos, a capacidade de agregação em diferentes proporções água/etanol, o
foto-branqueamento perante iluminação de LEDs vermelhos e a geração de oxigênio
singlete através do teste do ácido úrico. Também foram realizados testes com a
Artemia salina e com a bactéria Escherichia coli, a fim de avaliar a ação
fotodinâmica in vitro sobre esses microrganismos. O comportamento espectral da
porfirina ZnTPPS
4
, foi avaliado variando-se o pH da solução de porfirina em meio
aquoso e em acetato/fosfato na presença e na ausência dos surfactantes SDS
(aniônico), CTAB (catiônico) e HPS (zwiteriônico). Através dessa análise, verificou-
se que a mudança espectral da porfirina em decorrência da variação de pH, ocorreu
em pHs menores quando a porfirina encontrou-se na presença dos surfactantes
CTAB e HPS, indicando que houve interação entre porfirina/micela de surfactante,
mediada por interações hidrofóbicas e eletrostáticas. A capacidade de agregação foi
avaliada, acrescentando solução das porfirinas a misturas água/etanol de diferentes
proporções, a fim de analisar o comportamento espectral de ambas as porfirinas
com o aumento do teor de água. Através dessa análise verificou-se o deslocamento
da banda Soret para comprimentos de onda menores, bem como, a diminuição da
intensidade da absorbância em condição de 100% de água, fato que pode estar
relacionado aos diferentes valores de coeficiente de absortividade molar das
porfirinas nos solventes utilizados. A análise de foto-branqueamento foi realizado
colocando-se soluções aquosas e etanólicas de porfirina sob iluminação de LEDs
vermelhos durante um período total de 1 hora, e mostrou que ambas as porfirinas
não se decompõem perante a fonte de luz empregada. Quanto a geração de
oxigênio singlete realizado através do teste do ácido úrico, verificou-se que a
geração dessa espécie é melhor em água que etanol. A porfirina TMPyP mostrou
maior atividade fotodinâmica (AF) que a ZnTPPS
4
, por possuir maior absorção na
faixa de emissão dos LEDs empregados. Em relação aos testes microbiológicos
verificou-se que o maior índice de mortalidade sobre A. salina ocorre na presença
das porfirina e sob iluminação, indicando ação fotodinâmica das porfirinas sobre
esse microrganismo. No teste feito com a E. coli, evidenciou-se maior inibição no
crescimento das colônias desse microrganismo quando as mesmas foram tratadas
com porfirinas e luz, em comparação com os controles: I) sob luz e sem porfirina; II)
na presença de porfirina e sem luz; III) na ausência de luz e porfirina.
5
ABSTRACT
In this work is to porphyrin free base, cationic, meso-tetrapyridylporphyrin, TMPyP,
and porphyrin metal, anion, zinc (II)-meso-Tetrakis (4-sulfonatophenyl), ZnTPPS
4
, in
order to assess its possible applications in photodynamic therapy (PDT). For both,
were investigated by molecular spectroscopy and UV-Vis, some properties of these
porphyrins, such as interaction with biomimetic models, the ability to aggregate in
different proportions water/ethanol, the photo-bleaching before lighting the red LEDs
and generation of singlet oxygen through the test of uric acid. Microbiological tests
were also conducted with Artemia salina and the bacterium Escherichia coli, to
assess the in vitro photodynamic action on these microorganisms. The spectral
behavior of porphyrin ZnTPPS
4
was estimated to be varying the pH of the solution of
porphyrin in aqueous medium and acetate/phosphate in the presence and absence
of surfactant SDS (anion), CTAB (cationic) and HPS (zwiterionic). Through this
analysis, we found that the porphyrin spectral change due to changes in pH,
occurred at pHs lower when the porphyrin found himself in the presence of
surfactants CTAB and HPS, indicating that there was interaction between porphyrin/
micelle surfactant, mediated by hydrophobic and electrostatic interactions. The ability
of aggregation was evaluated by adding the solution of the porphyrin mixtures water/
ethanol in different proportions in order to analyze the spectral behavior of both
porphyrins with the increase of water content. Through this analysis it was found the
displacement of the Soret band for a wavelength smaller, and the decrease in
absorbance intensity of the condition of 100% water, a fact that may be related to
different coefficients of molar absorptivity of porphyrins in solvents used. The photo-
bleaching was putting itself and ethanol aqueous solutions of porphyrin under lighting
of LEDs red during a total period of 1 hour, and showed that both porphyrins do not
fall apart before the light source used. As the generation of singlet oxygen conducted
through the test of uric acid, found that the generation of this species is better in
water than ethanol, probably because there is more molecular oxygen dissolved in
the first solvent. The porphyrin TMPyP showed increased photodynamic activity (PA)
that ZnTPPS
4
, due to higher absorption in the range of issuing LEDs employees.
Regarding microbiological tests found that the highest viewing on A. salina mortality
occurs in the presence of porphyrin and under illumination, indicating photodynamic
action of porphyrins on the microorganism. The testing done with E. coli, it is further
inhibit the growth of this microorganism colonies where they were treated with
porphyrins and light, compared with the controls: I) under light and without porphyrin;
II) in the presence of porphyrin and no light; III) in the absence of light and porphyrin.
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Detecção de lesões cancerosas por TFD: (a) tecido sendo irradiado; (b)
tecido após a Irradiação..........................................................................16
Figura 02 - Estrutura do agente fototerapêutico Photofrin
®
na forma de éter............18
Figura 03 - Medicamento Levulan
®
Kerastick............................................................18
Figura 04 - Medicamento Visudyne
®
..........................................................................19
Figura 05 - Mecanismos de atuação da TFD.............................................................22
Figura 06 - Estrutura básica das porfirinas.................................................................27
Figura 07 - Estrutura básica de (a) porfirinas, (b) clorinas e (c) bacterioclorinas.......27
Figura 08 - Estrutura de porfirina de primeira geração...............................................28
Figura 09 – Estrutura de porfirina de segunda geração.............................................29
Figura 10 - Estrutura de porfirina de terceira geração................................................29
Figura 11 - Grupo heme presente na hemoglobina e na mioglobina.........................31
Figura 12 - Tabela periódica com os metais que podem constituir as metaloporfirinas
..................................................................................................................31
Figura 13 - Espectro de absorção de porfirinas na forma de base livre (
_
_
_
) e na
forma metalada (
___
), (a) banda de Soret (b) bandas Q...........................32
Figura 14 - Agregados do tipo J e H...........................................................................38
Figura 15 - Estrutura da: (a) micela; (b) bicamada lipídica.........................................40
Figura 16 (a) – Foto-branquemento de um composto porfirínico na presença de
oxigênio singlete.......................................................................................43
Figura 16 (b) - Reações do oxigênio singlete no meio biológico. Reações com
moléculas do próprio fotossensibilizador caracterizam uma via de reação
de foto-branqueamento............................................................................44
Figura 17 -
Estrutura química da porfirina TMPyP.....................................................51
Figura 18 - Espectros de absorção na região visível e ultravioleta da porfirina TMPyP
em acetato/fosfato 20 mmol/L em função do pH (a) na faixa de pH de 0,5
até 7,0 (b) na faixa de pH 7,0 até 14,0....................................................52
Figura 19 - (a) frações das componentes em função do pH na faixa de pH de 0,5 até
7,0; (b) Frações dessas componentes em função do pH na faixa de pH de
7
7,0 até 14,0...............................................................................................53
Figura 20 – Estrutura química da porfirina ZnTPPS
4
................................................57
Figura 21 - Estrutura química da quitosana...............................................................61
Figura 22 - Sistema de LEDs, utilizado para iluminação das soluções de porfirina...67
Figura 23 - Recipiente utilizado para eclosão dos ovos de Artemia salina................69
Figura 24 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em água em função do pH,
na faixa de pH de 6,73 a 0,73..................................................................72
Figura 25 - Gráfico da absorbância da porfirina ZnTPPS
4
em solução aquosa, em
função do pH em 421 nm () e 434 nm ().............................................73
Figura 26 (a) - Espectros de absorção da porfirina TPPS
4
em água na faixa de pH de
0,55 a 13,59.............................................................................................74
Figura 26 (b) - Gráfico da absorbância da porfirina TPPS
4
em solução aquosa, em
água em função do pH em 434 nm () e 413 nm () após ajuste pela
função sigmoidal......................................................................................75
Figura 27 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em água na faixa de pH de
7,0 a 13,2.................................................................................................75
Figura 28 (a) - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato em
função do pH na faixa de pH de 5,86 a 0,91............................................76
Figura 28 (b) - Deslocamento das bandas Q da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato
na faixa de pH de 5,86 a 0,91.............................................................77
Figura 29 - Gráfico da absorbância da porfirina ZnTPPS
4
em solução de acetato
fosfato, em função do pH em 421 nm () e 434 nm ().........................77
Figura 30 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato na faixa
de pH de 5,83 a 13,18.............................................................................78
Figura 31 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato fosfato na
presença de SDS na faixa de pH de 5,86 a 0,96.....................................79
Figura 32 - Gráfico da Absorbância da porfirina ZnTPPS
4
em solução de acetato
fosfato, na presença de SDS em função do pH em 421 nm () e 434 nm
()............................................................................................................80
Figura 33 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato fosfato na
presença de SDS na faixa de pH de 5,90 a 13,13...................................81
Figura 34 - Espectro de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato na
presença de CTAB na faixa de pH de 5,83 a 0,76...................................81
8
Figura 35 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato na
presença de CTAB na faixa de pH de 5,79 a 13,09.................................82
Figura 36 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato na
presença de HPS,na faixa de pH de 5,88 a 0,98.....................................83
Figura 37 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em acetato/fosfato na
presença de HPS na faixa de pH de 5,85 a 13,22...................................83
Figura 38 - Espectros de absorção da porfirina ZnTPPS
4
em diferentes misturas
água/etanol..............................................................................................87
Figura 39 - Espectros de absorção da porfirina TMPyP em diferentes misturas
água/etanol..............................................................................................87
Figura 40 - Espectros da porfirina ZnTPPS
4
durante o teste de foto-branqueamento
em água, durante um período total de iluminação de 60 minutos..............90
Figura 41 - Espectros da porfirina ZnTPPS
4
durante o teste de foto-branqueamento
em etanol, durante um período total de iluminação de 60 minutos..........91
Figura 42 - Espectros da porfirina TMPyP durante o teste de foto-branqueamento em
água, durante um período total de iluminação de 60 minutos..................91
Figura 43 - Espectros da porfirina TMPyP durante o teste de foto-branqueamento em
água, durante um período total de iluminação de 60 minutos.................92
Figura 44 - Espectros de absorção da solução de porfirina ZnTPPS
4
a 10
-
6
mol.L
-
1
em etanol, na presença de ácido úrico a 10
-4
mol.L
-1
e sob iluminação
com LEDs vermelhos por um período total de 30 minutos......................94
Figura 45 - Espectro de emissão da fonte a base de LEDs......................................95
Figura 46 - Espectros de absorção da solução de porfirina ZnTPPS
4
a 10
-
6
mol.L
-
1
em água, na presença de ácido úrico a 10
-4
mol.L
-1
e sob iluminação
com LEDs vermelhos por um período total de 30 minutos...................96
Figura 47 - Espectro de absorção das bandas Q da porfirina TMPyP em água........97
Figura 48 - Espectros de absorção da solução de porfirina TMPyP a 10
-
6
mol.L
-
1
em
etanol, na presença de ácido úrico a 10
-4
mol.L
-1
e sob iluminação com
LEDs vermelhos por um período total de 30 minutos..............................97
Figura 49 - Espectros de absorção referentes às bandas do ácido úrico com
max
em
293 nm, e da banda Soret da porfirina TMPyP durante o período de
iluminação com LEDs vermelhos............................................................98
Figura 50 - Espectros de absorção da solução de porfirina TMPyP a 10
-
6
mol.L
-
1
em
água, na presença de ácido úrico a 10
-4
mol.L
-1
e sob iluminação com
9
LEDs vermelhos por um período total de 30 minutos ...........................98
Figura 51 - Espectros de absorção referentes à banda do ácido úrico com
max
em
287 nm, durante o período de iluminação com LEDs vermelhos na
presença da porfirina TMPyP..................................................................99
Figura 52 - Toxicidade da porfirina ZnTPPS
4
frente a Artemia salina sem iluminação
(■) e sob iluminação () ......................................................................102
Figura 53 - Toxicidade da porfirina TMPyP frente à Artemia salina sem iluminação (■)
e sob iluminação ().............................................................................102
Figura 54 - Gráfico do log UFC/mL em função do tempo, na presença da porfirina
ZnTPPS
4
sob iluminação azul () e iluminação vermelha ()...............106
Figura 55 - Unidades formadoras de colônias de E. coli na presença da porfirina
ZnTPPS
4
(a) sob iluminação de luz vermelha e (b) sob iluminação de luz
azul por 30 minutos................................................................................107
Figura 56 - Unidades formadoras de colônias de E. coli (a) na presença da porfirina
ZnTPPS
4
sem iluminação (b) sob iluminação de luz vermelha por 30
minutos e sem porfirina .........................................................................107
Figura 57 - Gráfico do log UFC/mL em função do tempo, na presença da porfirina
TMPyP sob iluminação azul () e iluminação vermelha ()...................108
Figura 58 - Unidades formadoras de colônias de E. coli na presença da porfirina
TMPyP (a) sob iluminação de luz vermelha e (b) sob iluminação de luz
azul por 30 minutos................................................................................108
Figura 59 – Unidades formadoras de colônias de E. coli (a) na presença da porfirina
TMPyP sem iluminação (b) sob iluminação de luz vermelha por 30
minutos e sem porfirina..........................................................................109
Figura 60 – Gráfico do log UFC/mL em função do tempo, sem porfirina sob
iluminação azul () e iluminação vermelha ().......................................109
Figura 61 – Unidades formadoras de colônias de E. coli sem porfirina e sem
iluminação...............................................................................................110
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Medicamentos utilizados em TFD.............................................................20
Tabela 2 - Distribuição eletrônica dos orbitais moleculares (*) do oxigênio no
estado singlete (
1
O*
2
e
1
O
2
) e estado fundamental triplete (
3
O
2
)
..................45
Tabela 3 - Coeficientes de absortividade molar das porfirinas ZnTPPS
4
e
TMPyP.......................................................................................................71
Tabela 4 - Valores das cmc’s dos surfactantes SDS, HPS e CTAB..........................79
Tabela 5 - pK
1
da porfirina ZnTPPS
4
em diferentes meios a 421 e 434 nm..............84
Tabela 6- pK
2
da porfirina ZnTPPS
4
em diferentes meios a 421 e 430 nm...............85
Tabela 7 - Valores médios de algumas grandezas, obtidas através dos espectros do
teste do ácido úrico para as porfirinas TMPyP e ZnTPPS
4
.....................96
Tabela 8 – Valores de Atividade Fotodinâmica (AF) determinado pelo teste do ácido
úrico, de alguns fotossensibilizadores comerciais..................................100
Tabela 9 - Número de UFC/mL - Unidades Formadoras de Colônias - E.coli na
presença e na ausência de porfirinas, sob diferentes tempos de
iluminação vermelha e azul....................................................................105
11
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
AF – Atividade Fotodinâmica
ALA – Ácido-5-aminolivulínico
AU – Ácido Úrico
BPMDA – Derivado Benzoporfirínico Monoácido
CMC – Concentração Micelar Crítica
CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônio
CuTPPS
4
- Cu(II) meso-tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina
D
2
O – Água deuterada
DEAEMA - 2 – dietilamino etil metacrilato
Dp – Deuteroporfirina
EAEC – Escherichia coli Enteroagregativa
EHEC – Escherichia coli Enterohemorragica
EIEC – Escherichia coli Enteroinvasiva
EPEC – Eschechiria coli Enteropatogênica
ETEC – Eschechiria coli Enterotoxigênica
FDA – Food and Drug Administration
Fe(III)TPPS
4
– Fe(III) meso-tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina
FMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
FS – Fotossensibilizador
HEMA - 2-hidroximetil metacrilato
HpD - Derivado hematoporfirínico
HPS - N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanosulfonato
IARC - International Agency Research on Cancer
INCA – Instituto Nacional de Câncer
LDL – Lipoproteína de baixa densidade (do termo em inglês: low- density
lipoproteins)
LED – Diodo emissor de luz (do termo em inglês: light emitiing diode)
LTA – Leishmaniose Tegumentar Americana
MAA - Ácido metacrílico
Mn(II)TPPS
4
– Mn (II) meso-tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina
nm – nanômetro
OMS – Organização Mundial da Saúde
Pp IX – Protoporfirina IX
RLS – do inglês: ressonance light scattering
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
SDS - Dodecil sulfato de sódio
TAS – Toxicidade sobre Artemia Salina
TFD – Terapia Fotodinâmica
TMPyP - meso-tetrakis(4-metilpiridil)porfirina
TPPS
4
- meso-tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina
TSA – do inglês: tripticase soy agar
UEPG – Universidade Estadual de Ponta Grossa
UFPR – Universidade Federal do Paraná
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
UV-Vis – Ultravioleta e Visível
ZnTPPS
4
- Zinco(II)-meso-tetrakis(4-sulfonatofenil)porfirina
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................14
1.1 Terapia fotodinâmica (TFD)......................................................................15
1.2 Mecanismos de ação da TFD...................................................................21
1.3 Como se faz uso da TFD.........................................................................24
1.4 Porfirinas....................................................................................................26
1.5 Metaloporfirinas.........................................................................................30
1.6 Porfirinas como agentes da TFD...............................................................34
1.7 Fatores que interferem na eficiência do fotossensibilizador....................36
1.7.1 Agregação de compostos porfirínicos...................................................36
1.7.2 Localização do fotossensibilizador no tecido doente...........................39
1.7.3 Reações de foto-branqueamento..........................................................41
1.7.4 Geração de oxigênio singlete................................................................44
1.8 Testes de toxicidade.................................................................................46
1.9 Porfirinas TMPyP e ZnTPPS
4
............................................,......................51
1.9.1 TMPyP....................................................................................................51
1.9.2 ZnTPPS
4
...............................................................................................57
2 OBJETIVOS............................................................................................................63
2.1 Objetivo geral..........................................................................................63
2.2 Objetivos específicos.............................................................................63
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................64
3.1 Materiais e equipamentos......................................................................64
3.2 Determinação do coeficiente de absortividade molar das porfirinas nos
solventes água/etanol............................................................................64
3.3 Estudo espectrofotométrico da porfirina ZnTPPS
4
sob variação de pH
na ausência e na presença de surfactantes..........................................65
13
3.4 Análise da capacidade de agregação....................................................66
3.5 Reações de foto-branqueamento..........................................................66
3.6 Teste do ácido úrico...............................................................................67
3.7 Ensaios biológicos in vitro.....................................................................68
3.7.1 Toxicidade sobre Artemia salina (TAS)..............................................68
3.7.2 Ensaio in vitro: cultura bacteriana......................................................69
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................71
4.1 Determinação do coeficiente de absortividade molar das porfirinas nos
solventes água e etanol.........................................................................71
4.2 Estudo espectrofotométrico da porfirina ZnTPPS
4
sob variação de pH
na presença e na ausência de surfactantes..........................................72
4.3 Análise da capacidade de agregação....................................................87
4.4 Teste de foto-branqueamento...............................................................90
4.5 Teste do ácido úrico.............................................................................93
4.6 Testes de toxicidade............................................................................101
4.6.1 Teste de toxicidade sobre Artemia salina (TAS).............................101
4.6.2 Ensaio in vitro: cultura bacteriana....................................................103
5 CONCLUSÕES.....................................................................................................111
6 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS....................................................113
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................114
14
1 INTRODUÇÃO
Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer - INCA a estimativa de
casos de câncer para o ano de 2008 é de 466.730 novos casos entre homens e
mulheres considerando todos os tipos de neoplasias. Recentemente, a Organização
Mundial da Saúde (OMS) através da International Agency Research on Cancer –
IARC, apontou uma crescente incidência da doença, sendo que a previsão é de que
12 milhões de pessoas no mundo todo serão diagnosticadas ainda esse ano com a
doença. Esse número pode chegar a 17 milhões no ano de 2020, ou seja, um
aumento de quase 50% de casos em 12 anos.
Devido ao registro do crescimento da incidência de câncer pela comunidade
científica, tem se buscado constantemente métodos de tratamento com maior
eficiência de cura e que sejam menos agressivos que as terapias utilizadas
atualmente, quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Dentro dessa perspectiva, a
terapia fotodinâmica (TFD) surge como uma opção com potencial aplicação. Essa
técnica consiste basicamente na utilização de luz com comprimento de onda
adequado capaz de excitar eletronicamente uma substância fotossensível, a qual
por sua vez gera espécies reativas, com capacidade de destruição celular. Para seu
êxito, no entanto, é necessário que a substância fotossensibilizadora empregada,
apresente características satisfatórias à aplicação do método, a luz incidente
alcance o alvo desejado e por conseqüência dê-se origem a uma concentração
razoável de espécies reativas, em especial o oxigênio singlete (
1
O
2
).
A comunidade científica interessada nessa nova terapia concentra esforços
em estudar substâncias fotossensíveis que possam apresentar maior destruição
celular com menos efeitos colaterais; transportadores eficazes capazes de localizar
com precisão e em concentração adequada o fotossensibilizador (FS) no tecido
15
doente; fontes adequadas de luz, capazes de penetrar de forma efetiva o tecido alvo
sem representar danos ao paciente, e assim tentar garantir a geração das espécies
reativas necessárias ao sucesso da terapia.
As porfirinas estão entre as substâncias mais utilizadas como
fotossensibilizadores comerciais e devido a isso surge o interesse em estudar os
fatores que podem viabilizar e/ou otimizar a utilização desses compostos na terapia
fotodinâmica.
1.1 Terapia fotodinâmica (TFD)
A terapia fotodinâmica tem como base a combinação de um composto
fotossensível com luz de comprimento de onda capaz de ativá-lo, gerando espécies
reativas capazes de induzir a inviabilização de células (MACHADO, 2000;
SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002). Essa terapia visa à destruição localizada de
tecido anormal mediante sua necrose ou apoptose (CHARLESWORTH, 1994;
SILVA, 2003). A TFD vem sendo utilizada como um tratamento alternativo no
tratamento de tumores, podendo ser este de natureza benigna ou maligna (câncer),
já que outras terapias para esse tipo de patologia, tais como, a radioterapia, a
quimioterapia e a cirurgia, apresentam efeitos colaterais severos. No entanto, essa
terapia não se restringe somente ao tratamento de tumores, mas aplica-se também
no tratamento de outras doenças que têm como característica o crescimento
anormal de células tais como degeneração macular da retina – doença que acomete
grande parte dos idosos - psoríase, infecções bacterianas, verrugas, arteriosclerose,
entre outras (BECHARA, 2004; PERUSSI, 2007; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA,
2002).
16
Clinicamente, a TFD já vem sendo empregada no tratamento de alguns
casos de câncer de bexiga, pulmão, pele, intestino, trato digestivo, ou seja, casos
onde a penetração da luz é facilitada por simples exposição ou pelo uso de
endoscópios acoplados a fibras óticas. Sua aplicação vem crescendo também no
diagnóstico e delineamento de lesões por fluorescência (Figura 1), além de poder
ser aliada com técnicas convencionais, para redução do tumor antes da intervenção
cirúrgica bem como, da profilaxia após a cirurgia com uma pequena margem de
segurança, apresentando bons resultados em ambos os casos (MACHADO, 2000;
MENEZES, 2006; BEGA, 2008).
(a) (b)
Figura 1 - Detecção de lesões cancerosas por TFD: (a) tecido sendo irradiado; (b) tecido após a
irradiação (BEGA, 2008)
Essa terapia é mais eficaz quando aplicada em tumores pequenos a médio e
onde a aplicação de luz é facilitada, pois nesses casos a penetração da luz se dá de
forma mais fácil e os resultados são mais eficazes (MACHADO, 2000; MENEZES,
2006; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
Essa modalidade de tratamento permite a completa restauração do tecido e
pode ser repetida várias vezes, além de causar um mínimo de danos ao tecido
saudável, sendo estas as maiores vantagens em relação aos incômodos das outras
17
terapias (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI; SALA, 2007b; GANDINI, et al.; 2005;
MENEZES, 2006;).
A terapia fotodinâmica começou a ser utilizada de forma leiga, desde tempos
remotos, com a associação de qualquer substância fotossensível e luz, mas foi
somente em 1925 que estudou-se a fototoxicidade das porfirinas em tumores
malignos. A partir da década de 50, com a purificação de uma hematoporfirina por
Schwartz, iniciou-se a primeira geração de drogas para terapia fotodinâmica. (ALI;
VAN LIER, 1999; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002)
Em 1960, Lipson, sob a orientação de Schwartz, passou a estudar o
acúmulo preferencial dessas substâncias em tecidos tumorais em ratos e constatou
que com a incidência de luz sobre o tecido promovia-se a regressão da doença.
Dessa forma, já no final da década de 60, Lipson tratou uma mulher com câncer de
mama, com êxito. Deu-se início então a TFD como terapia clínica contra o câncer.
(MACHADO, 2000; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
A partir da década de 70, várias preparações de derivados de porfirina
começaram a ser testadas, até obtenção do Photofrin II
®
, medicamento desenvolvido
por Thomas J. Dougherty (DOUGHERTY, 1993). No fim da década de 80, a
empresa QLT purificou e otimizou o produto inicial e obteve o Photofrin
®
(Figura 2),
no ano de 2000. A natureza estrutural do Photofrin
®
, ainda não está totalmente
elucidada, sendo considerada uma mistura de oligômeros de hematoporfirina em
que as ligações preponderantes entre as unidades monoméricas são ligações éster
ou éter (ALI; VAN LIER, 1999; MACHADO, 2000).
18
Figura 2 - Estrutura do agente fototerapêutico Photofrin
®
na forma de éter (MACHADO, 2000)
A segunda geração de medicamentos para a TFD busca substâncias com
características foto-físicas melhores que o Photofrin
®
. Assim, alguns outros
medicamentos tais como o Levulan
®
Kerastick (Figura 3), e mais tarde o Visudyne
®
foram desenvolvidos, sendo que este último foi desenvolvido também pela QLT em
associação com a University of British Columbia e foi aceito com grande impacto
pela área médica, tendo sido aprovado pelas autoridades de saúde da Suíça em
1999, pela FDA – Food and Drug Administration /EUA - em abril de 2000 e na Grã
Bretanha/ União Européia em julho de 2000 (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI,
SALA, 2007a; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
O ácido-5-aminolevulínico, ALA, precursor do PpIX, princípio ativo do
Levulan
®
Kerastick, concentra-se trinta vezes mais nos tecidos doentes que nos
tecidos sadios e é a substância mais utilizada nos últimos anos (CALZAVARA-
PINTON; VENTURINI, SALA, 2007a; CHAVANTES, 2007).
NH
2
O
HO
2
C
Biossíntese
ALA
CO
2
H
N
H
N
N
N
H
CO
2
H
PpIX
Figura 3 – Princípio ativo do medicamento Levulan
®
Kerastick (SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA,
2002)
19
O composto ativo do Visudyne
®
(Figura 4), também é um derivado da
porfirina, o BPMDA, uma benzoporfirina. Contudo, esse medicamento foi aprovado
somente para o tratamento de degeneração macular da retina, e encontra-se em
fase de testes para a terapia do câncer e demais doenças (MACHADO, 2000).
N
H
N
N
N
H
CO
2
MeCO
2
Me
MeO
2
C
MeO
2
C
Figura 4 - Medicamento Visudyne
®
(SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002)
Os fotossensibilizadores mais utilizados em TFD, ainda têm sido os
derivados de hematoporfirina, que são considerados de primeira geração,
destacando-se o Photofrin
®
(americano), Photosan
®
(alemão) e Photogem
®
(russo).
Todos são misturas de monômeros, dímeros e oligômeros de até oito unidades de
porfirinas unidos por ligação éter ou éster e são produzidos a partir da protoporfirina
IX existente na circulação sanguínea, de acordo com a tecnologia de desfribilação
de sangue de animais e de humanos. Não são considerados ideais porque
apresentam elevada retenção cutânea, causando efeito colateral indesejável de
fotossensibilização do paciente que deve se proteger da luz por 4 a 8 semanas.
Além dos mais a ultima banda de absorção desses FS se encontra na faixa de 620 a
630 nm com baixo coeficiente de absortividade molar (CALZAVARA-PINTON;
VENTURINI, SALA, 2007a; MENEZES, 2006).
20
Há ainda os fotossensibilizadores de segunda geração, que apresentam
estrutura básica semelhante às porfirinas, contudo são quimicamente puros e
apresentam menor fotossensibilização cutânea. Esses FS são divididos nas
seguintes classes: a) ftalocianinas e naftalocianinas, b) clorinas e bacterioclorinas, c)
purpurinas. Os nomes comerciais estão citados na Tabela 1.
Tabela 1 - Medicamentos utilizados em TFD (MENEZES, 2006)
Família Drogas aprovadas (TFD) Data e local
de
aprovação
Indicações Coeficiente de
Absortividade
Molar banda Q
(mol.L
-1
.cm
-1
)
λmax
(nm)
Porfirina Derivado de
HpD
Photofrin® 1998 EUA Câncer de
pulmão,
estomago,
esôfago, bexiga,
laringe, cavidade
oral, pele
1,0 x 10
4
630
Photogem® 1999 Rússia
Photosan® 2002 Europa
Precursor da
PpIX
Levulan® 1999 EUA Câncer de pele
1,0 x 10
4
450
Metvix® 2001 Europa
Clorinas Verteporfirina – derivado
monoacídico da benzoporfirina
(BPDMA): Visudyne®
1999
EUA
Degeneração
macular da retina
3,5 x 104
690
m-THPC (Temoporfin): Foscan® 2001
Europa
Câncer de cabeça
e pescoço
2,24 x 10
4
652
Clorina e
6
Photoditazine® 1999
Rússia
Câncer de pele,
cavidade oral,
laringe, brônquios,
esôfago,
estômago, vulva
3,2 x 10
4
662
Radaclorin® 2001
Rússia
Câncer de mama,
lábios, melanoma,
esôfago,
estômago, reto,
vulva, tireóide
3,0 x 10
4
662
Mono-Laspatil
clorina e
6
(NPe
6
ou
MACE)
Não
aprovado
Câncer de pele,
bexiga, pulmão,
gastrointestinal
4,0 x 10
4
654
Bacterioclorina Pheophorbite
1999
Alemanha
3,2 x 10
4
780
Ftalocianina Ftalocianina tetrasulfonada:
Photosense®
1999
Rússia
Câncer de pele,
bexiga, pulmão,
gastrointestinal
1,1 x 10
5
675
No Brasil, a terapia fotodinâmica chegou em 2002 e já está sendo
empregada no tratamento do câncer no Hospital do Câncer Amaral Carvalho, no
Hospital Sírio Libanês, no Hospital Universitário da UNICAMP, no INCOR e no
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), todos do
21
estado de São Paulo, obtendo bons resultados (BECHARA, 2004, MENEZES,
2006).
1.2 Mecanismos de ação da TFD
O câncer ocorre quando determinadas células de um organismo se
multiplicam de maneira descontrolada devido a anormalidades nos genes. Forma-se
então um núcleo sólido de células com velocidade de multiplicação muito rápida
sustentada por uma rede de vasos sanguíneos. Através da corrente sanguínea ou
linfática as células malignas podem atingir outros órgãos do corpo, dando origem a
novos tumores, num processo conhecido como metástase. Assim, acionar um
mecanismo capaz de bloquear a irrigação sanguínea e o suprimento de nutrientes a
essas células é uma forma de evitar que esse processo se sustente.
O mecanismo de ação da TFD está relacionado a capacidade do
fotossensibilizador absorver radiação na faixa do visível, preferencialmente próximo
ao vermelho. Para que o tratamento seja satisfatório, a droga fotossensível deve se
acumular, preferencialmente, no tecido doente, para que este seja irradiado de
forma localizada e não ocorram danos ao tecido sadio. Assim, ao receber a radiação
de comprimento de onda apropriado, as moléculas da substância passam do estado
fundamental S
o
a um estado singlete excitado (S
1
) e podem ter diferentes rotas de
atuação (Figura 5), (ALI; VAN LIER, 1999; CALZAVARA-PINTON; VENTURINI;
SALA, 2007a):
A molécula poderá sofrer desativação do estado S
1
por colisão ou
fluorescência voltando ao estado S
o
, cuja luz de emissão possibilita
detecção de tecidos tumorais;
Poderá no estado excitado (S
1
ou T
1
) reagir com diferentes biomoléculas
gerando radicais ou íons radicais que através de transferência de elétrons a
22
molécula de oxigênio pode gerar radicais livres extremamente reativos, tais
como
.
O
2
-
(ânion supéroxido),
.
OH (radical hidroxil), que provocarão a morte
celular, constituindo assim, a chamada TFD do tipo I;
Ou ainda poderá sofrer uma conversão não radioativa entre sistemas,
passando do estado S
1
para um estado triplete (T
1
) e daí transferir essa
energia a uma molécula de O
2
, normalmente no estado triplete (
3
O
2
), o qual
será promovido a um estado singlete
1
O
2
. Esta espécie reagirá com o
substrato biológico resultando no processo chamado TFD do tipo II,
ilustrado na figura abaixo.
S
0
S
1
T
1
S
0
S
1
T
1
3
O
2
3
O
2
1
O
2
+ P
0
Fotoprodutos
Biomoléculas
3
O
2
.-
+ P
.+
Fotoprodutos
Biomoléculas
P
.+
+ S
.-
HP
.
+ S
.
Biomoléculas
Fonte
Luz
h.v
Fotossensibilizador (P)
Tipo II
Tipo I
Figura 5 - Mecanismos de atuação da TFD (BORISSEVITCH; SCHABERLE, 2006)
23
No estado singlete o oxigênio é uma espécie altamente reativa, com tempo
de vida de cerca de 0,04 µs em sistemas biológicos e por ser extremamente
oxidante poderá reagir com sítios de alta densidade eletrônica, como colesterol,
cadeias laterais de aminoácidos contendo anéis aromáticos ou enxofre, ligações
duplas de esteróides, DNA e membranas celulares, sendo portanto, citotóxico e
levando a interrupção de processos biológicos (BECHARA, 2004; HOPPER, 2000;
MACHADO, 2000; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002). O mecanismo do tipo II, é
o mais aceito, mas há a possibilidade de os dois tipos de mecanismos ocorrerem
nos sistemas biológicos, sendo que o que determinará a ocorrência do mecanismo I
ou II é a competição entre o substrato (macromoléculas) e o oxigênio pelo estado
excitado do fotossensibilizador (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI; SALA b, 2007;
BORISSEVITCH; SCHABERLE, 2006).
A morte celular pode ainda ser atribuída a outras espécies reativas tais como
radicais livres como o ânion superóxido (O
2
.
-
), hidroxil (OH
.
) via reação Fenton e
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). A espécie
.
OH causa avarias nas membranas
celulares por reação com ácidos graxos insaturados, resultando na formação de
radicais lipídicos L
.
, radicais alcoxil lipídicos (LO
.
), peróxidos lipídicos (LOO
.
) e
hidroperóxidos lipídicos (LOOH
.
) (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI, SALA, 2007).
Esses produtos iniciam reações em cadeia, causando danos a seções
extensivas de membranas. No entanto, dos vinte aminoácidos naturais apenas cinco
(cisteína, histidina, tirosina, triptofano e metionina) são altamente suscetíveis a
oxidações via mecanismo de tipo I e, por isso, o mecanismo via oxigênio singlete é
freqüentemente mais eficiente que processos radicalares. O oxigênio singlete possui
ainda alta difusibilidade e maiores constantes de velocidade de reação com
substratos corporais, facilitando sua ação (SETÚBAL, 2007)
24
Como o raio de ação do oxigênio singlete é muito curto (aproximadamente
0,02 µm), não se verifica logo após a irradiação a diminuição do tumor, contudo a
região mais superficial que sofre a ação da luz sofre necrose e o efeito ao restante
do tumor é propagado pela falta de irrigação sanguínea do tecido. Com o sistema
vascular comprometido a irrigação tumoral que alimenta as células deixa de existir e
elas sofrem apoptose (MACHADO, 2000; SILVA, 2003).
1.3 Como se faz uso da TFD
Na terapia fotodinâmica o FS pode ser aplicado de forma tópica, oral ou
intravenosa, dependendo da natureza do câncer. Para o uso de forma intravenosa, o
medicamento que geralmente se encontra no estado sólido deve apresentar boa
solubilidade no veículo utilizado para aplicação (BECHARA, 2004).
Assim que o medicamento é injetado, ele percorre todo o corpo, sendo
absorvido por todas as células, no entanto, as células sadias eliminam essa droga
em um período de 24 a 36 horas, enquanto as células cancerosas, que apresentam
um metabolismo diferente, retêm essa droga por mais tempo, cerca de 72 horas.
Decorrido o tempo mínimo necessário para que este se acumule preferencialmente
no tecido doente, faz-se a incidência da luz. Esse tempo mínimo necessário, bem
como o tempo para a excreção irá depender de cada medicamento. No caso do
Photofrin
®
, por exemplo, são necessárias cerca de 48 horas para incorporação da
droga pelas células, e até 90 dias para total excreção (MENEZES, 2006;
PHOTOFRIN, 2006; SILVA, 2003; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
Após a decorrência do tempo de assimilação do FS, o paciente pode ser
exposto a radiação direcionada, com comprimento de onda que varia de 600 a 800
nm, pois quanto maior o comprimento de onda na região do visível, menor será o
25
espalhamento sofrido pela mesma ao penetrar o tecido. Comprimentos de onda que
ultrapassam 800 nm também não são convenientes, pois acima dessa faixa
encontra-se a radiação infravermelha, que é facilmente absorvida pelas moléculas
de água presentes em grande quantidade em nosso organismo (TESSARO, 2005).
No caso das porfirinas e similares a excitação é geralmente realizada através das
bandas Q localizadas entre 600 a 800 nm (TOMINAGA et al; 2004). Assim, ao
receber a luz nessa faixa de comprimento de onda a substância fotossensível será
excitada e desencadeará os processos descritos anteriormente (Figura 5), levando a
morte do tecido.
As quantidades aplicadas e as características da luz incidida (tipo, dosagem
de potência e tempo de iluminação) dependem da droga que está sendo aplicada,
da espécie e da gravidade da doença (SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
Contudo como esses compostos costumam se localizar por mais tempo nos
tumores, pele, fígado e baço, durante o tratamento recomenda-se que o paciente
seja protegido da luz para que não tenha fotossensibilidade (irritações na pele
semelhante às porfirias), originadas da excitação da substância.
Apesar de apresentar os inconvenientes de fotossensibilização do paciente
caso este seja exposto à luz e exigir o resguardo da mesma, a TFD é uma técnica
de combate ao câncer muito menos agressiva que as convencionais (quimioterapia
e radioterapia), apresentando um número reduzido de efeitos colaterais e tendo a
vantagem de necessitar de radiação com comprimento de onda não agressivo, ao
contrário da radioterapia, que se utiliza de raios X. O fato da terapia ser localizada
também evita que regiões sadias do corpo sejam atingidas e debilitadas.
As drogas usadas na TFD devem apresentar algumas características
essenciais:
26
Possuir características fotofísicas favoráveis;
Ser seletivo em relação aos tecidos doentes;
Apresentar alta absorção de luz na região do espectro entre 600 a 800 nm,
onde a luz apresenta maior penetração nos tecidos e onde os tecidos são
relativamente transparentes;
Ter alto rendimento quântico de estado triplete;
Ter alto rendimento quântico de geração de oxigênio singlete;
Ter baixa toxicidade no escuro;
Fotossensibilidade não prolongada;
Apresentar farmacocinética favorável (rápida eliminação);
Ter baixo rendimento de reação de foto-branqueamento;
Apresentar simplicidade na formulação, reprodutibilidade e alta estabilidade
de formulação (tempo mínimo de 2 anos), bem como, seja passível de
obtenção em escala industrial e de preferência com baixo custo;
(SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002; TESSARO, 2005).
1.4 Porfirinas
Porfirina é o nome dado à grande classe de compostos intensamente
coloridos vermelhos ou púrpuros, pigmentos cristalinos fluorescentes, de origem
natural ou sintética. As porfirinas são substâncias precursoras do grupo heme, que
estão presentes na hemoglobina e em outras proteínas, desempenhando funções
vitais nesses sistemas bioquímicos, como o transporte de elétrons na cadeia
respiratória e o transporte de oxigênio (LEHNINGER, 2000; NELSON; COX, 2002;
SETÚBAL, 2007; WHITE, 1968).
27
A estrutura básica das porfirinas (Figura 6) é formada por quatro anéis
pirrólicos conectados por pontes de metileno numa configuração cíclica, sendo que
uma variedade de cadeias laterais podem encontrar-se ligadas nas posiçoes , , ,
, diferenciando-as.
N
H
N
N
N
H
Figura 6 - Estrutura básica das porfirinas
Os quatro anéis pirrólicos são numerados empregando-se algarismos
romanos de I a IV e os quatro carbonos das metinas, denominadas também como
posição meso, são identificadas pelas letras gregas , , , respectivamente 5,
10,15 e 20 (DAL SANTOS, 1999; NELSON; COX, 2002).
As porfirinas possuem um sistema eletrônico altamente conjugado, com 22
elétrons , mas apenas 18 deles sofrem deslocalização, segundo a regra de Hückel
([4n + 2] ; sendo n= 4). O número de elétrons , diferencia as porfirinas das
clorinas e bacterioclorinas, (Figura 7) sendo que estas possuem 20 e 18 elétrons
respectivamente (DAL SANTOS, 1999; RIBEIRO, 2005).
28
Figura 7 - Estrutura básica de (a) porfirinas, (b) clorinas e (c) bacterioclorinas (RIBEIRO, 2005)
Quando se encontra na forma de base livre o macrociclo porfirínico possui
dois átomos de nitrogênio capazes de aceitar prótons e dois grupos NH capazes de
perder prótons. A protonação da porfirina pode ser promovida em meio fortemente
ácido e, como conseqüência, há uma alteração significativa das suas propriedades
espectroscópicas. Essas porfirinas possuem um espectro com uma banda
extremamente intensa, (= 10
5
L.mol
-1
.cm
-1
) na região de 400 nm (banda Soret), e
mais quatro bandas no visível na região de 500 a 700 nm (bandas Q). As cinco
bandas têm origem na transição Î * (HALMA, 2004; SOARES, 2005;
TOMINAGA, 1997).
Porfirinas substituídas com grupos fenila nas posições meso do anel,
representam a classe das porfirinas de 1
a
geração, também denominadas de meso
substituídas (Figura 8). As porfirinas de primeira geração incluem as meso-tetrakis-
fenilporfirinas. Tais porfirinas não apresentam grupos volumosos que levem a
impedimento estérico para a formação de dímeros. Além disso, não há a proteção
contra destruição oxidativa (auto-oxidação) do macrociclo da porfirina.
29
N
H
N
N
N
H
Figura 8 - Estrutura de porfirina de primeira geração
As porfirinas de segunda geração são as que possuem grupos fenil
substituídos nas posições meso, com halogênios ou outros substituintes elétron-
retiradores (Figura 9). Essas porfirinas apresentam uma melhor ativação do anel,
uma vez que os halogênios atuam como retiradores de densidade eletrônica do anel
da porfirina.
N
H
N
N
N
H
F
F
FF
F
F
F
F
Figura 9 – Estrutura de porfirina de segunda geração
As porfirinas de terceira geração correspondem àquelas que apresentam
halogênios (ou outro tipo de substituintes volumosos) nas posições do macrociclo
da porfirina (Figura 10). A presença de grupos volumosos nestas posições confere a
estas porfirinas maior proteção à destruição oxidativa e impede ou minimiza a
30
formação de espécies diméricas (HALMA, 2004; SETÚBAL, 2007). As porfirinas
podem ainda ser carregadas positiva (catiônicas) ou negativamente (aniônicas) de
acordo com as cargas presentes nos substituintes situados no anel porfirínico.
N
H
N
N
N
H
F
F
F
F
F
F
F
F
Figura 10 – Estrutura de porfirina de terceira geração
1.5 Metaloporfirinas
Quando há remoção dos prótons do nitrogênio dos anéis II e IV e
coordenação de diferentes íons de metais com os quatro átomos de nitrogênio dá-se
origem a uma grande variedade de metaloporfirinas. O macrociclo da porfirina é
capaz de coordenar metais de transição em diversos estados de oxidação devido
principalmente às dimensões internas da cavidade do macrociclo, cerca de 70 pm.
Durante o processo de metalação, ocorre uma mudança significativa na
simetria do anel da porfirina. O tamanho do cátion influencia a conformação do anel
e, conseqüentemente a estabilidade da porfirina. Este tipo de modificação do anel
porfirínico leva a alterações do comportamento da porfirina a níveis eletrônicos e
estéricos , alterações essas que por sua vez, são fortemente dependentes do
próprio metal introduzido (HALMA, 2005; PEREIRA, 2004; SETÚBAL, 2007). Em
nível estrutural, a porfirina metalada perde a planaridade e passa a ter uma
conformação em forma de cela ou cesta, em onda ou em cúpula (PEREIRA, 2004).
31
Estes compostos apresentam atividade catalítica atuando em reações de
oxidação e redução. O macrociclo altamente conjugado da porfirina, bem como,
muitos dos seus derivados metálicos estão presentes em diversas proteínas
(HALMA, 2005; SETÚBAL, 2007). Como exemplo tem-se:
Os grupos heme da hemoglobina e da mioglobina, pigmentos com função de
transportar e armazenar oxigênio respectivamente - em que há um átomo de ferro
no centro do anel porfirínico (Figura 11);
Clorofila, com a qual as plantas captam energia solar para síntese de carboidratos
e outros compostos, e possui um anel porfirínico coordenado ao íon magnésio;
Vitamina B12 ou cobalamina: vitamina presente em alimentos de origem animal e
que atua em sistemas enzimáticos de transferência de certos grupos entre
moléculas, e apresenta um íon cobalto em sua estrutura (LENINGER, 2000;
NELSON; COX, 2002).
N
N
N
N
COO-
-OOC
Fe
+
+
Figura 11 - Grupo heme presente na hemoglobina e na mioglobina (NELSON; COX, 2002)
Na figura 12, encontram-se sublinhados na tabela periódica todos os metais
que podem ser coordenados ao anel porfirínico.
3
Li
4
Be
5
B
6
C
7
N
8
O
11
N
a
12
Mg
13
Al
14
Si
15
P
16
S
32
19
K
20
Ca
21
Sc
22
Ti
23
V
24
Cr
25
Mn
26
Fe
27
Co
28
N
i
29
Cu
30
Zn
31
Ga
32
Ge
33
As
34
Se
37
Rb
38
Sr
39
Y
40
Zr
41
N
b
42
Mo
43
Tc
44
Ru
45
Rh
46
Pd
47
Ag
48
Cd
49
In
50
Sn
51
Sb
52
Te
55
Cs
56
Ba
*
71
Lu
72
Hf
73
Ta
74
W
75
Re
76
Os
77
Ir
78
Pt
79
Au
80
Hg
81
Tl
82
Pb
83
Bi
84
Po
87
Fr
88
Ra
**
103
Lr
104
Rf
105
Db
106
Sg
107
Bh
108
Hs
109
Mt
110
Ds
111
Rg
112
Uub
113
Uut
114
Uuq
115
Uup
116
Uuh
*Lantanídeos *
57
La
58
Ce
59
Pr
60
Nd
61
Pm
62
Sm
63
Eu
64
Gd
65
Tb
66
Dy
67
Ho
68
Er
69
Tm
70
Yb
**Actinídeos **
89
Ac
90
Th
91
Pa
92
U
93
N
p
94
Pu
95
Am
96
Cm
97
Bk
98
Cf
99
Es
100
Fm
101
Md
102
N
o
Figura 12 - Tabela periódica com os metais que podem constituir as metaloporfirinas (MERCK, 2008)
As metaloporfirinas apresentam um espectro com bandas diferenciadas das
porfirinas base livre visto que a inserção de íons metálicos pouco eletronegativos
resulta em deslocamentos batocrômicos da banda Soret (Figura 13 a). As bandas Q
das metaloporfirinas são reduzidas a duas (Figura 13 b) sendo que com a metalação
duas delas tornam-se proibidas e deixam de ser observadas (HALMA, 2005;
SOARES, 2005).
(a) (b)
Figura 13 – Espectro de absorção de porfirinas na forma de base livre (
___
) e na forma metalada (
___
),
(a) banda Soret (b) bandas Q (SOARES, 2005)
As metaloporfirinas desempenham importantes papéis como catalisadores
em sistemas biológicos. O citocromo P- 450, metaboliza diferentes substratos e
processa materiais xenobióticos gerando metabólitos hidroxilados, que são mais
33
facilmente excretados, assim surgiu o interesse em estudar esses compostos como
catalisadores em reações (HALMA, 2005).
Nas reações de catálise utilizando metaloporfirinas, a formação do complexo
metálico de alta valência, o qual supostamente é responsável pela atividade
catalítica, se dá através da reação de metaloporfirinas com um doador de oxigênio.
Esta reação depende da natureza do oxidante, bem como da estrutura da
metaloporfirina. Os compostos porfirínicos principalmente de manganês (II) e (III) e
ferro (III) são estudados como catalisadores para oxidação de substratos orgânicos,
bem como em reações eletroquímicas. Tanto sistemas homogêneos (reagentes e
catalisador contidos na mesma fase) e heterogêneos (catalisador e reagentes em
fases distintas) têm sido estudados (HALMA et al., 2008; HALMA, 2005).
Certas porfirinas têm-se apresentado altamente ativas como catalisadores
para hidroxilação de alcanos na presença de diferentes doadores de oxigênio.
Observa-se freqüentemente que a catálise homogênea utilizando ferroporfirinas de
primeira geração, podem apresentar algumas desvantagens como a destruição do
catalisador, causada por ataques de espécies oxidantes às posições meso do anel
porfirínico num processo muitas vezes denominado de auto-oxidação. Além disso, a
dimerização da porfirina pode dificultar os processos catalíticos pela formação de
espécies diferentes daquelas esperadas como catalíticas ativas (HALMA, 2005).
No entanto, as metaloporfirinas podem ser usadas em solução homogênea
ou imobilizadas em matrizes sólidas, tais como, polímeros orgânicos amorfos ou
materiais inorgânicos cristalinos a exemplo da sílica e, crisólita e zeólita. O suporte
inorgânico confere seletividade para a metaloporfirina promovendo assim um
ambiente especial para a reação entre o substrato e a espécie cataliticamente ativa,
o que não acontece em meio homogêneo (HALMA et al., 2008)
34
A imobilização de metaloporfirinas em matrizes sólidas confere algumas
vantagens ao processo catalítico, porque impede a agregação das metaloporfirinas e
a sua auto-destruição, evitando a desativação do catalisador, além de facilitar sua
recuperação do meio reacional e posterior reutilização, o que minimiza impactos
ambientais. A forma como a metaloporfirina está ligada ao suporte é extremamente
importante, porque diferentes modos de vinculação com a matriz podem levar a
diferentes seletividades nas reações de oxidação, inclusive à regioseletividade
(HALMA et al., 2008; MACHADO et al., 2008).
A atividade catalítica das porfirinas metaladas para promover oxidações de
alcanos sob condições brandas, tem sido alvo de muitos estudos. Sabe-se que há
uma grande quantidade de hidrocarbonetos, em especial de alcanos, presentes nas
reservas de gás natural e petróleo, contudo, a grande estabilidade das ligações C-H
e C-C, fazendo com que se torne um obstáculo para seu aproveitamento. Há uma
grande dificuldade em encontrar reagentes capazes de quebrar estas ligações de
maneira seletiva e em condições brandas (BEGA, 2008; HALMA et al., 2008;
MACHADO et al., 2008).
A oxidação de alcanos por porfirinas ocorre a partir da formação de espécies
metal-oxo, onde o metal adquire alta oxidação. Esta espécie retira um átomo de
hidrogênio do hidrocarboneto, gerando um radical. Este radical irá retirar a hidroxila
ligada ao centro metálico, provocando uma redução do metal. Além de alcanos, as
porfirinas podem oxidar também olefinas, através de dois mecanismos: 1) oxidação
alílica; e 2) adição a dupla ligação, podendo levar a uma epoxidação. Sendo este
ultimo mecanismo de grande interesse, visto que a síntese de epóxidos está
envolvida na síntese industrial de muitos produtos, como os inseticidas, detergentes
e solventes (BEGA, 2008).
35
1.6 Porfirinas como agentes da TFD
As porfirinas se tornaram drogas com alto potencial de utilização na TFD já
que são cromóforos fotossensíveis aos comprimentos de onda a faixa de 630 nm
(bandas Q), com alto rendimento quântico do estado triplete e bons geradores de
oxigênio no estado singlete (PERUSSI, 2007; TOMINAGA et al., 2004).
Os derivados porfirínicos exibem alta afinidade por lipoproteínas de baixa
densidade (LDL) as quais são encontrados em altas concentrações em tecidos
neoplásicos, em comparação com os tecidos sadios. Sendo assim, na tentativa de
explicar o acúmulo preferencial dessas substâncias no tecido doente, sugere-se que
esses compostos porfirínicos são encaminhados aos tecidos doentes junto às
lipoproteínas acumulando-se nessas células e possibilitando uma ação localizada da
TFD (MACHADO, 2000; SIMPLÍCIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002; TESSARO, 2005;
TOMINAGA et al., 2004).
Outro fator que pode contribuir para a maior retenção das porfirinas no
tecido doente são os baixos valores de pH do fluido intersticial do tecido doente. O
pH de tecidos tumorais é freqüentemente menor que o de tecidos normais, devido a
grande produção de ácido láctico ocasionada pela microvasculatura alterada e o
fluxo de sangue reduzido nesse tecido. Assim, enquanto o pH em tecidos normais
está entre 7,2 e 7,4; o pH de tecidos doentes varia entre 6,0 e 7,0. Com o aumento
da acidez, a ionização de espécies de porfirina com valores de pK
a
levemente
ácidos é afetada, elas se tornam mais hidrossolúveis podendo assim, ser retidas de
forma seletiva (LEHNINGER, 2000; MENEZES, 2006).
Contudo, as porfirinas possuem uma alta hidrofobicidade, sobretudo na
forma desmetalada. Essa propriedade faz com que haja grande tendência a esses
36
compostos se auto-agregarem em solução aquosa (SOARES, 2006). Com isso
diminui drasticamente a capacidade dessas substâncias em gerar oxigênio singlete,
espécie essencial para o sucesso da terapia pelo mecanismo tipo II.
As porfirinas podem ainda sofrer reações de foto-branqueamento, que
refere-se à capacidade de a substância cromófora sofrer reações químicas induzidas
pela luz, transformando-se em espécies com outras características fotofísicas e
menos interessantes a TFD. Outra desvantagem que acompanha os compostos
porfirínicos são seus elevados custos, o que dificulta sua utilização. Dessa forma no
intuito de romper essas barreiras, tem-se buscado rotas sintéticas economicamente
mais viáveis que as já existentes, assim como, estudar os efeitos que controlam a
auto-agregação, na intenção de evitá-la.
1.7 Fatores que interferem na eficiência do fotossensibilizador
1.7.1 Auto - agregação de compostos porfirínicos
Os FS são compostos sólidos, no entanto, é necessário um meio líquido
para injeção ou uma emulsão para aplicação tópica. Ao serem introduzidos em um
meio incompatível com sua polaridade, as moléculas de FS tendem a sofrer
agregação (MUSSI, 2003).
As porfirinas são conhecidas por sofrer diferentes tipos de agregação,
mesmo a concentrações inferiores a 10
-6
mol/L, que dependem normalmente de
fatores (a) intrínsecos, como a presença ou não de átomos metálicos centrais; da
coordenação; da natureza de seus substituintes ou ainda da posição no anel onde
ocorre a substituição (nas posições meso ou nos anéis pirrólicos), (b) de fatores
extrínsecos motivados, por exemplo, por baixas solubilidades no solvente utilizado,
37
por diferentes pH ou força iônica da solução, ou mesmo pela própria natureza do
solvente (PEREIRA, 2004).
Os mecanismos que regem o fenômeno de auto-agregação de porfirinas
ainda não estão totalmente estabelecidos. Entretanto, é conhecido que forças de
natureza eletrostática, forças de van der Walls, efeito hidrofóbico, etc. contribuem
para a formação desses agregados (HUNTER; SANDERS, 1990). A natureza dos
substituintes das porfirinas, força iônica, temperatura, pH e presença de surfactantes
também podem influenciar na formação de auto-agregados (GANDINI, 2001).
A auto-agregação de porfirinas gera espécies pequenas (dímeros e
trímeros) e/ou agregados grandes (poliméricos). Este estado afeta fortemente suas
propriedades espectrais e energéticas, reduzindo o tempo de vida dos estados
excitados, conseqüentemente o rendimento quântico de formação de oxigênio
singlete e, portanto, comprometendo a eficácia em TFD (BORISSEVITCH; GANDINI,
1998; MUSSI, 2003).
A auto-associação dessas moléculas pode ser ocasionada por diferentes
razões, entre as quais se destaca a interação do FS com o solvente (auto-agregação
em solução aquosa), bem como a interação da porfirina com estruturas biológicas
(MENEZES, 2006). É de salientar também que muitos dos agregados observados
derivam da formação prévia de formas protonadas das porfirinas. De fato, a repulsão
resultante da forte densidade eletrônica do anel central é fortemente atenuada se for
colocada carga positiva no centro desse mesmo anel que, assim, favorece a
aproximação entre os monômeros ao aumentar a atração eletrostática entre partes
da molécula com diferentes cargas efetivas (PEREIRA, 2004).
Uma das principais maneiras de aferir a presença de espécies agregadas
numa amostra de porfirina passa pela análise espectroscópica das amostras,
38
através de testes de conformidade à lei de Beer‐Lambert. Desvios negativos a esta
lei evidenciam uma provável presença de agregados. Os seus espectros de
absorção também evidenciam diferenças, principalmente do comprimento de onda
dos máximos de absorção, bem como, do próprio coeficiente de absortividade molar
(PEREIRA, 2004).
As propriedades espectrais típicas intrínsecas dos agregados dos FS com
respeito aos monômeros são: deslocamento e alargamento da banda Soret e da
última banda Q para o vermelho no caso de formação de agregado J e
deslocamento em torno de 10 nm da banda Soret e das bandas Q para o azul no
caso de agregado H (Figura 14); tempo relativamente curto do estado singlete (S
1
);
baixo rendimento quântico de fluorescência e também uma insignificante geração de
oxigênio singlete (MENEZES, 2006; PEREIRA, 2004).
Figura 14 – Agregados do tipo J e H (MENEZES, 2006)
A agregação pode ainda, levar a precipitação do fármaco com perda de
material, ou mesmo obstrução de artérias no corpo humano (AVELINE, et al., 1995).
Desta forma, a auto-agregação de fármacos deve ser evitada para aplicação em
TFD, ou seja, desde as etapas de processamento industrial, aplicação clínica,
circulação corpórea, até o momento da iluminação, o fármaco deve ser mantido no
estado monomérico (SOARES, 2006; TESSARO, 2006).
Algumas modificações podem ser promovidas no anel porfirínico a fim de
evitar esse fato indesejado, tais como, promover a inclusão de substituintes
39
periféricos carregados que, em virtude da repulsão eletrostática, impedem ou
minimizam a tendência de agregação ou ainda a inserção de íons metálicos
hexavalentes, já que, nesse caso, há um impedimento estérico que impossibilita a
formação de dímeros (MACHADO, 2000). A agregação também pode ser evitada
através da adição de pequenas concentrações de solventes orgânicos, detergentes,
proteínas do sangue ou a incorporação do FS em micelas (MUSSI, 2003).
A literatura mostra que a hematoporfirina (Hp) e alguns de seus derivados
em solução são encontrados em forma de misturas de monômeros, dímeros, e
oligômeros em solução aquosa e que são os maiores responsáveis pelo efeito
fotodinâmico, uma vez que são os melhores localizadores tumorais. Sendo assim, as
espécies agregadas dos derivados de Hp são conhecidos por serem essenciais para
o tratamento do tumor ao contrário das espécies monoméricas. Deste modo, pode-
se dizer que deve existir um equilíbrio da proporção monômero/agregado na solução
do FS a tal ponto que não interfira nos processos de distribuição da droga e,
conseqüentemente, não comprometa a atividade anti-tumoral (MENEZES, 2006).
O conhecimento sobre a relação entre a agregação e a atividade
fotodinâmica pode facilitar o desenvolvimento de drogas e poderá contribuir
significativamente para aumentar a eficiência em TFD. Uma vez que os agregados
moleculares podem ser diferenciados de suas formas monoméricas por suas
características espectroscópicas, os métodos espectroscópicos são os mais
adequados para sua investigação (MENEZES, 2006).
1.7.2 Localização do fotossensibilizador no tecido doente
A membrana plasmática ou membrana celular consiste numa estrutura
lipoprotéica, semipermeável e que funciona como uma barreira à entrada e saída de
40
substâncias (LEHNINGER, 2000). Funciona como um elemento mediador da
comunicação entre a célula e o meio externo e possui uma variedade de
transportadores, proteínas que atravessam a espessura da membrana e transportam
nutrientes para dentro e produtos residuais para fora da célula. Possuem ainda
proteínas de superfície de membrana - receptores de sinais - que apresentam sítios
altamente específicos, constituindo assim um sistema complexo (LEHNINGER,
2000; MARZZOCO; TORRES, 1999)
Os modelos biomiméticos ou biofísicos consistem em modelos simples que
simulam as membranas celulares. Através desses modelos é possível simular a
estrutura lipídica básica das membranas e analisar a interação dos fármacos com
essas estruturas, isto permite prever a capacidade de penetração que a substância
apresenta em relação a membrana, fator essencial para sua ação como agente
terapêutico.
Para obtenção desses modelos biomiméticos utiliza-se freqüentemente
surfactantes na forma de micelas, os quais permitem um estudo inicial de um grande
número de fenômenos que ocorrem nas membranas (BORGES, 1994; MOREIRA,
2005; TOMINAGA et al., 2004). Os surfactantes são compostos por monômeros de
moléculas anfóteras que se organizam em micelas, com a parte polar voltada para o
meio externo e a parte apolar organizada internamente (Figura 15 a), e fornecem
boa semelhança com a bicamada lipídica, constituinte da membrana celular (Figura
16 b).
41
Figura 15 - Estrutura da: (a) micela; (b) bicamada lipídica (MARZZOCO; TORRES, 1999)
As micelas são definidas como agregados coloidais, estáveis
termodinamicamente, espontaneamente formados quando se atinge uma
determinada concentração de anfifílico em solução (concentração micelar crítica –
cmc). A cmc é um parâmetro característico de cada tipo de surfactante e define o
balanço de interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Geralmente anfifílicos com
longas cadeias de hidrocarbonetos possuem uma cmc baixa (da ordem de mmol/L).
É muito importante saber se a solução de FS preparada está acima ou
abaixo da cmc. A formação de micelas em solução aquosa depende da presença de
forças de repulsão entre as cabeças polares anfifílicas dos surfactantes que podem
ser neutros, catiônicos, zwiteriônicos ou aniônicos, e da associação entre as caudas
hidrofóbicas, bem como do seu tamanho, que são responsáveis pela formação das
micelas e da cmc (MENEZES, 2006).
Um fator que deve ser levado em consideração quando se estuda a
interação de um fármaco com membranas celulares é o pH, uma vez que, em
organismos vivos pode existir variação de pH de acordo com as regiões corpóreas.
Embora o pH fisiológico esteja na faixa de 7,2 a 7,4, alguns meios intra ou
extracelulares têm variações micro-locais e a intensa atividade neo-vascular,
característica comum em tecidos neoplásicos, aparentemente proporciona aumento
de acidez em regiões micro-localizadas (TESSARO, 2005). Sendo assim, o estudo
42
da influência da variação de pH do meio sobre os agentes fotossensibilizadores
passa a ter grande importância.
Os derivados porfirínicos apresentam como grupamento ácido-base os
nitrogênios dos anéis pirrólicos e, eventualmente grupos periféricos ligados à
estrutura porfirínica. O fator pH determina a estrutura da espécie presente afetando
as propriedades de absorção de luz, rendimento quântico, geração de oxigênio
singlete, foto-branqueamento, facilidades na formulação, solubilização, lipofilicidade,
afinidade celular, tempo de retenção, biodistribuição, etc.
1.7.3 Reações de foto-branqueamento
Outra característica importante de um bom FS é que o mesmo não sofra
foto-degradação durante o tratamento clínico. O processo denominado foto-
branqueamento em substâncias cromóforas corresponde a reações químicas
induzidas pela luz, onde as moléculas são transformadas em outros compostos e
podem ocorrer in vitro, in vivo, nos fluidos celulares, células e tecidos. A ocorrência
desse processo resulta na diminuição de absorção e intensidade de fluorescência do
FS. O foto-branqueamento mais comum em TFD pode ocorrer por processo de foto-
oxidação ou foto-redução, sendo o primeiro o mais comum (MENEZES, 2006).
Existem dois tipos irreversíveis de foto-degradação que levam a mudanças
fotoquímicas em cromóforos:
I – Foto-modificação: quando a diminuição na intensidade de absorção e
emissão de fluorescência ocorre em alguns comprimentos de onda, mas o
cromóforo é retido em uma forma modificada (Equação 1). Ocorre também a
diminuição da intensidade dos picos de absorção e o surgimento de uma nova
banda de absorção.
43
h
Cromóforo Î Cromóforo modificado Equação (1)
Solvente
Em caso de algumas porfirinas ocorre a formação de fotoprodutos com
absorção no vermelho.
II – Fotoclareamento verdadeiro: quando as mudanças químicas são
profundas e resulta em fragmentos pequenos que não tem mais uma absorção
apreciável na região do visível (Equação 2). A amostra torna-se incolor.
h
Cromóforo Î Cromóforo fragmentado Equação (2)
Solvente
Ambos os processos acarretam no decréscimo da concentração do FS
original no sítio de ação da TFD e menor poder de absorção de luz do cromóforo
modificado, no comprimento de onda da fonte utilizada. Isso implica em menor
quantidade de princípios ativos excitados, o que diminui a ação fotodinâmica. Em
conseqüência tem-se menor formação de espécies citotóxicas, ou seja, compromete
a eficácia do tratamento (SILVA, 2003; STERNBERG; DOLPHIN, 1998).
Por comprometer a formação de espécies reativas capazes de matar o
tecido alvo, o foto-branqueamento implica na necessidade de administração de
doses elevadas do FS para compensar a perda ocasionada no processo de foto-
degradação. Mas, se a velocidade deste foto-branqueamento for lenta, e não
prejudicar o tratamento, ele passa a ser interessante, uma vez que serve para
eliminar o FS após a terapia. Isto é importante, já que diminui o tempo em que o
paciente tem que ficar ao abrigo da luz solar para evitar fotossensibilidade da pele.
Deste modo a foto-degradação dos fotossensibilizadores é o elo fundamental da
44
distribuição da dose fotodinâmica dos fluidos biológicos, estando relacionada com a
cinética de eliminação do FS do organismo (MENEZES, 2006; RIBEIRO, 2005).
O oxigênio singlete, por ser uma espécie extremamente reativa, pode por si
levar a degradação dos compostos fotossensibilizadores (os seus próprios
precursores), caracterizando um tipo especial de foto-branqueamento. Em resumo
ao receber a luz, o fármaco gera
1
O
2
(oxigênio singlete) que por sua vez pode reagir
com as moléculas do substrato que o produziu, ocasionando nestas, modificações
químicas, como mostra a figura 16 (a) e descreve-se na figura 16 (b).
Figura 16 (a) – Foto-branquemento de um composto porfirínico na presença de oxigênio singlete
(RIBEIRO, 2005)
Figura 16 (b): Reações do oxigênio singlete no meio biológico. Reações com moléculas do próprio
fotossensibilizador caracterizam uma via de reação de foto-branqueamento (SOARES, 2006)
Formação de oxigênio singlete:
3
S
1
* +
3
O
2
Î
1
S
0
+
1
O
2
Reações do oxigênio com espécies do meio biológico:
1
O
2
+
1
A
0
Î produtos
ou
1
O
2
+
1
S
0
Î reações de foto-branqueamento
45
Quanto a foto estabilidade, os FSs comportam-se diferentemente um do
outro em relação a foto-degradação, apresentando-se estáveis ou instáveis frente a
iluminação. Uma forma de tentar corrigir a foto-degradação é a diminuição da dose
de luz, seguida por múltiplas sessões de irradiação (MENEZES, 2006).
1.7.4 Geração de oxigênio singlete
Uma vez que a TFD consiste na associação de um FS com luz visível para
geração de espécies reativas capazes de matar o tecido alvo e tendo-se em vista
que o principal mecanismo de ação dessa terapia se utiliza da geração de oxigênio
singlete, então entende-se a geração dessa espécie como sendo determinante para
o sucesso da técnica.
O oxigênio molecular, no estado fundamental, possui dois elétrons com
spins paralelos ocupando dois orbitais de mesma energia, chamados de
degenerados, caracterizando, portanto, um estado triplete (
3
O
2
). Conseqüentemente,
a redução direta do oxigênio por dois elétrons é proibida pela regra de conservação
do spin. Uma forma mais reativa do oxigênio, conhecida como oxigênio singlete,
pode ser gerada por um acréscimo de energia. Nela, a restrição da regra de
conservação do spin é removida (RONSEIN et al, 2006).
Sendo assim, o oxigênio singlete é muito mais oxidante que o oxigênio
molecular no seu estado fundamental. Existem dois estados singlete do oxigênio: o
primeiro estado excitado,
1
O
2
, tem dois elétrons com spins opostos no mesmo
orbital, possui uma energia de 22,5 kcal acima do estado fundamental e tempo de
meia vida em solvente aquoso de aproximadamente 10
-6
s; o segundo estado
excitado,
1
O*
2
tem um elétron em cada orbital degenerado, com spins opostos, e
possui uma energia de 37,5 kcal acima do estado fundamental. O estado
1
O*
2
tem
46
um tempo de vida muito curto (10
-11
s) em meio aquoso, sendo rapidamente
desativado para o estado
1
O
2
(Tabela 2). Portanto, apenas o primeiro estado
apresenta interesse em sistemas biológicos e será denotado por
1
O
2
(RONSEIN et
al, 2006).
Tabela 2 – Distribuição eletrônica dos orbitais moleculares (*) do oxigênio no
estado singlete (
1
O*
2
e
1
O
2
) e estado fundamental triplete (
3
O
2
)
Estado Orbitais * Energia (kcal/mol) Tempo de vida (s)
1
O*
2
↑ ↓
37,5 10
-
11
1
O
2
↓↑
22,5 10
-
6
3
O
2
↑ ----- -----
A ação do oxigênio singlete (
1
O
2
) na morte ou inviabilização de células
tumorais tem sido evidenciada de diversas maneiras (MACHADO, 2000). Para
avaliar os possíveis danos a biomoléculas, causadas pelo
1
O
2
e por moléculas por
ele oxidadas, faz-se necessária à utilização de ferramentas analíticas, tais como
seqüestradores químicos do
1
O
2
. Seqüestradores químicos são moléculas que
reagem com o
1
O
2
gerado e o produto pode ser identificado (RONSEIN et al., 2006)
Para mensurar a capacidade de geração de oxigênio singlete utiliza-se
freqüentemente o teste do ácido úrico. O ácido úrico (AU) é um conhecido aceptor
eficiente de oxigênio singlete, tem sido usado como reagente para determinação
química quantitativa da ação fotodinâmica de compostos fotossensibilizadores em
TFD nos casos em que a produção de oxigênio singlete esta associada ao processo
fotodinâmico (MAESTRIN et al., 2004).
1.8 Testes de toxicidade
47
A Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada utilizado como
alimento vivo para peixes. Seus ovos são comumente comercializados em lojas para
aquaristas e não apresentam custo elevado, além de permanecerem viáveis por
anos no estado seco (BARBOSA et al.; 2006; SIQUEIRA et al., 1998). Essas
vantagens contribuíram para a popularização do bioensaio com A. salina, sobretudo
a partir da década de 90 (LHULLIER et al., 2006). O ensaio foi proposto inicialmente
por Michael,Thompson e Abramovitz, e posteriormente desenvolvido por Vanhaecke.
A metodologia admite variações, segundo Solis e colaboradores (1993) e permite
também a triagem de novos fármacos (LHULLIER et al., 2006).
Os testes com Artemia salina são amplamente utilizados para extratos de
plantas, para detectar compostos bioativos nesses extratos (RUIZ et.al., 2005), mas,
recentemente, tem sido utilizado também com testes de substâncias sintéticas. O
teste da Artemia salina pode ser utilizado ainda como avaliação prévia de toxicidade,
sendo a substância posteriormente testada em diferentes culturas de células
tumorais, com boa aproximação de resultados (LHULLIER et al., 2006; SIQUEIRA et
al., 1998). Assim, o teste da Artemia salina (TAS) pode ser conveniente para estimar
o potencial de uma determinada substância em ser utilizada em TFD.
Uma substância é considerada citotóxica quando a DL
50
(dose letal
mediana) ou CL 50 (citotoxicidade basal) < 1000 ppm (µg/mL) (MEYER, 1982). A
citotoxicidade basal pode ser definida como os efeitos adversos resultantes da
interferência com estrutura e/ou processos celulares essenciais para a sobrevida,
proliferação e/ou função comum a todas as células do organismo. A citotoxicidade
basal é expressa como concentração que inibe 50% das células ou organismos,
quando comparadas com o controle não tratado (VALADARES, 2006).
48
Avaliar a toxicidade de fotossensibilizadores em microrganismos pode
passar uma idéia prévia da sua ação em células doentes. Especialmente, o teste de
toxicidade sobre bactérias se faz interessante, porque oportuniza avaliar a
capacidade de inativação desses microrganismos sobre os quais os antibióticos –
medicamentos mais comumente empregados no seu combate – já não mais se
mostram suficientemente eficazes. Também viabiliza o estudo da TFD não somente
para tratamento do câncer, abrindo um leque de possibilidades de aplicação dessa
técnica, como já vem sendo reportado em muitos trabalhos que focam essa
modalidade de tratamento.
Testes in vitro com cultura de microrganismos, tais como bactérias e
leveduras, podem também ser um excelente modelo para mimetizar células
tumorais. Bactérias são microorganismos resistentes que possuem alta velocidade
de reprodução, identificando-se e relacionando-se com células doentes (ex: tecidos
em metástase) que se reproduzem mais rapidamente que células normais. Quando
determinadas substâncias apresentam atividade frente a esses microrganismos,
acredita-se que as mesmas interferem na síntese protéica (principalmente DNA e
RNA), inviabilizando a reprodução celular, fato que poderia ser repetido com células
tumorais. Intuitivamente, pode-se concluir que a Escherichia coli, bactéria que se
desenvolve em ambientes internos ao corpo humano, é um bom modelo para
enfermidades em órgãos internos, enquanto que a Staphilococcus aureus, que se
desenvolve em superfícies corpóreas, acaba sendo um bom modelo para doenças
de pele (SOARES, 2006).
A E. coli, é uma espécie da família Enterobacteriacea extremamente
heterogênea e complexa. Pode-se distinguir dois grandes grupos de amostras: uma
que habita nossos intestinos desde o nascimento e outro que causa diferentes tipos
49
de infecções. O primeiro á chamado de E. coli comensal e o outro de E. coli
patogênica. A E. coli comensal só causa infecções em imunodepressivos ou quando
encontra situações não fisiológicas como o uso de cateteres implantados nas vias
urinárias (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005).
Há categorias de E. coli, designadas pelas siglas EPEC; EHEC; EAEC;
ETEC e EIEC que são diarreiogênicas, sendo capazes de causar uma lesão
histopatológica no epitélio do intestino denominada lesão A/E (attaching and
effacing), a qual ocorre depois que a bactéria atravessa a barreira gástrica e adere à
mucosa do intestino delgado e grosso, determinando alterações que levam a
diarréia. Há ainda categorias de E. coli que causam infecções extraintestinais, como
infecções no trato urinário, meningite neonatal ou infecções intraperitoneal – em
qualquer tecido do corpo (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005).
As bactérias podem ser classificadas como Gram-negativas ou Gram-
positivas de acordo com seu comportamento frente ao corante de Gram, sob o qual
as Gram negativas monstram-se em rosa no microscópio e as Gram-positivas
mostram-se violeta púrpura (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1996). Além desse fator, as
paredes de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas apresentam diferenças
marcantes. As Gram-negativas apresentam parede celular composta de várias
camadas que diferem na composição química e são mais complexas que as das
bactérias Gram-positivas, que apesar de ter a parede celular mais espessa,
apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2005).
A parede celular das bactérias Gram-negativas possui duas membranas,
uma citoplamática e uma membrana externa complexa (ZANCANELA et al., 2007). A
camada interna é formada por fosfolipídeos enquanto a mais externa é composta
50
predominantemente por lipopolissacarídeos e proteínas. A membrana externa
constitui uma barreira adicional à entrada de algumas substâncias como antibióticos
e metais pesados (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005), o que as tornam ainda mais
difíceis de serem combatidas.
O mecanismo de morte fotodinâmica das bactérias Gram-positivas induzida
por deuteroporfirina (Dp), mostrou perturbação da síntese do RNA e DNA levando a
morte da célula. No entanto, a inativação fotodinâmica da bactéria Escherichia coli e
Pseudomonas auroginosa, falhou quando foi usada a porfirina natural aniônica,
tendo dano fotoinduzido apenas na presença de espécies que estimulam a
translocação de porfirinas através da membrana da bactéria. Isso mostra que a
complexidade das espécies Gram-negativas previne a ação intracelular de porfirinas
hidrofóbicas ou carregadas negativamente e assim impede a ação fotodinâmica das
mesmas (ASHKENAZI, 2002; DIVON, 2004).
Apesar da aplicação de luz e corantes para inativação de microorganismos
não ser uma descoberta recente, esta técnica não de disseminou na prática clínica,
possivelmente devido a grande disponibilidade de agentes antimicrobianos
desenvolvidos a partir do descobrimento da penicilina. No entanto, após dois anos
da introdução da penicilina como agente terapêutico, foram descobertas cepas de
bactérias resistentes a este agente. A partir de então começou um fenômeno cíclico:
tão logo um novo agente antibiótico era introduzido na terapêutica, bactérias
resistentes ao seu mecanismo de ação eram isoladas (NUÑEZ; GARCEZ; RIBEIRO,
2007).
Assim, como até o momento não existem evidências de resistência
microbiana à TFD, esta modalidade terapêutica pode ser de extremo valor para o
tratamento de doenças ocasionadas por esses microorganismos, principalmente em
51
casos de infecções superficiais como as de ocorrência mais freqüente na pele ou na
cavidade oral.
Infecções generalizadas ou localizadas causadas por microorganismos são
as doenças de maior prevalência na cavidade oral e determinados tipos de
microorganismos podem tornar o indivíduo mais ou menos susceptíveis a infecções
oportunistas ou a uma determinada patologia (NUÑEZ; GARCEZ; RIBEIRO, 2007).
Por esse motivo tem crescido as aplicações da TFD na Odontologia, sendo
utilizado em doenças periodontais para redução microbiana pós tratamento e
equilíbrio da flora normal, evitando a perda óssea. Também em endodontia,
implantodontia e no combate a bactérias cariogênicas a TFD tem se mostrado um
eficiente método de redução microbiana e seu uso na odontologia parece bastante
promissor (MENDES, 2005; NUÑEZ; GARCEZ; RIBEIRO, 2007).
Outras doenças causadas por microrganismos têm dado bons resultados de
cura quando tratadas por TFD, como é o caso da Leishmaniose, particularmente a
do tipo Tegumentar Americana (TA), causada por um protozoário, transmitido por um
mosquito do tipo flebótomo, que leva a ulcerações desfigurativas em seres humanos
e animais (HIOKA; 2007).
1.9 Porfirinas TMPyP e ZnTPPS
4
1.9.1 TMPyP
As porfirinas catiônicas têm atraído considerável atenção como
fotossensibilizadores efetivos, devido sua afinidade para ácidos nucléicos, podendo
fotoclivar seletivamente DNA. Estudos mostram também sua capacidade de
fotoinativação de bactérias extremamente resistentes e sua atividade antiviral
52
(MOSINGER et al., 2006).Entre as porfirinas mais estudadas está a porfirina
catiônica TMPyP - meso-tetrakis(4-metilpiridil)porfirina (Figura 17).
Figura 17 – Estrutura química da porfirina TMPyP
O motivo de interesse nessa porfirina reside na sua capacidade de
solubilização tanto em solventes orgânicos como em água, mostrando-se
monomérica em soluções orgânicas e aquosas em concentrações menores que 10
-4
mol.L
-1
, até mesmo a altas forças iônicas, além de outros aspectos já comprovados
experimentalmente, tal como sua estabilidade em uma ampla faixa de pH e sua
fotoestabilidade, mesmo na presença de
1
O
2
(MOSINGER et al., 2006; TOMINAGA
et al., 2004). A porfirina TMPyP possui capacidade de produzir
1
O
2
com alta
eficiência (
= 0,77), além de ser relativamente estável irradiação (ZEBGER et al.,
2004).
O grupo de pesquisa SCEOM - Síntese e Caracterização Espectroscópica
de Compostos Orgânicos e Materiais da UEPG, em trabalhos anteriores analisou a
referida porfirina, determinando o pK
a
da mesma na ausência e na presença dos
surfactantes SDS, HPS e CTAB. Observou-se a presença de três espécies em
N
H
N
N
N
H
N
N
N
N
CH
3
C H
3
CH
3
H
3
C
+
+
+
+
53
equilíbrio na ausência de micelas e sob variação de pH: TMPyP
6+
, H
2
TMPyP
4+
e
TMPyP
+2
(TOMINAGA et al., 2004).
TMPyP
6+
↔ H
2
TMPyP
4+
+ 2 H
+
(pK
1
= 1,4)
H
2
TMPyP
4+
↔ TMPyP
+2
+ 2 H
+
(pK
2
> 12,5)
As mudanças espectrais decorrentes da variação de pH e do surgimento de
cada uma das espécies acima citadas, estão nas figuras 18 (a) e 18 (b), bem como,
os valores de pK para cada uma dessas espécies estão nas Figuras 19 (a) e 19 (b).
.
Figura 18 - Espectros de absorção na região visível e ultravioleta da porfirina TMPyP em
acetato/fosfato 20 mmol/L em função do pH (a) na faixa de pH de 0,5 até 7,0 (b) na faixa de pH 7,0
até 14,0 (TOMINAGA et al, 2004)
(a)
54
(b)
Figura 19 - (a) frações das componentes em função do pH na faixa de pH de 0,5 até 7,0; (b) Frações
dessas componentes em função do pH na faixa de pH de 7,0 até 14,0 (TOMINAGA et al, 2004).
Portanto, pode-se verificar que a porfirina TMPyP encontra-se em sua forma
base livre numa ampla faixa de pH (entre 3,0 e 12,0), o que lhe confere vantagens
em sua possível utilização em TFD, pois mesmo exposta a grandes diferenças de
pH não há alterações em seu sistema eletrônico, o que poderia gerar deslocamentos
em suas absorções na janela fotodinâmica e diferentes rendimentos de
fluorescência.
Na presença de micelas do surfactante SDS (aniônico), observou-se que o
pK
1
ficou próximo de 0,0 e o pK
2
não foi observado indicando que o mesmo ocorre
em pH’s muito altos. Tendo isso em vista, verificou-se que houve interação,
provavelmente de caráter eletrostático, entre a porfirina e o surfactante, ocorrendo a
proteção da porfirina com relação a protonação e desprotonação. Em presença de
HPS, observou-se comportamento espectral semelhante ao observado em solução
acetato/fosfato, com uma diminuição discreta no valor de pK
1
, que passou de 1,4
para 0,8 na presença desse surfactante, indicando alguma interação entre porfirina e
micela. Na presença de CTAB, não foram observadas mudanças em relação aos
dados obtidos em solução acetato/fosfato 20 mmol/L, indicando que não houve
interação entre as micelas de CTAB e a porfirina (TOMINAGA et al, 2004).
A TMPyP também vem sendo estudada para inativação de
microorganismos, sendo feita a associação do FS e luz visível para inativação de
bactérias, fungos e vírus. A fotoinativação de bactérias desperta um interesse
55
especial, visto que esses microorganismos mostram–se resistentes a uma gama de
antibióticos hoje utilizados. A resistência de bactérias patogênicas a antibióticos
representa nos dias de hoje um desafio para o desenvolvimento de modalidades
antibacterianas. A possibilidade de erradicar bactérias, especialmente as espécies
Gram-negativas através de drogas ativadas por luz tem imediato potencial
terapêutico para controlar doenças infecciosas. A fotossensibilização de bactérias
tem mostrado ser independente da resistência dessas aos antibióticos hoje
utilizados (ASHKENAZI, 2002; DIVON, 2004; PERUSSI, 2007).
Porfirinas catiônicas e ftalocianinas têm mostrado produzir inativação direta
de bactérias Gram-negativas sem a presença de agentes permeabilizantes
adicionais (ASHKENAZI, 2002). Testes feitos com a porfirina TMPyP em dose de 3 a
11 µmol/L e uma dose de luz de 6 J.cm
-2
, mostram que há conjugação das cargas
positivas da TMPyP com resíduos negativamente carregados da E. coli. Assim, a
conjugação faz com que o fotodano seja localizado em alvos macromoleculares, em
proteínas e ácidos nucléicos por ação do
1
O
2
através da excitação luminosa da
TMPyP. Com isso, conclui-se que a natureza catiônica do FS é crucial para a
inativação da bactéria Gram-negativa (DIVON, 2004).
Experiências de fotoinativação das bactérias Acinetobacter baumannii,
Acinetobacter calcoaceticus e a espécie mutante A. calcoaceticus Rec (-) com doses
baixas de TMPyP (0,73 µmol/L) e 4 J/cm
-2
de luz azul (407 nm a 420 nm) mostraram
que os principais danos se dão na membrana citoplasmática e ao DNA das células
bacterianas, sendo que observou-se a inatividade das espécies em até 60% e de 95
a 98% quando aumentou-se a dose do FS para 14,6 µmol/L (ASHKENAZI, 2005;
NITZAN; 2004).
56
Sabe-se que a agregação da porfirina pode ser um fator desfavorável a
formação de oxigênio singlete, porém, estudos realizados por Keiko et al. (2006),
utilizando agregados eletrostáticos entre a porfirina catiônica TMPyP e a porfirina
aniônica TPPS
4
numa razão de 1:1 evidenciam que na forma altamente agregada,
estes agregados são bons geradores da espécie citotóxica H
2
O
2
em solução
aquosa, porque são capazes de transferir elétrons para a molécula de O
2
,
produzindo o íon superoxido (O
2
-
) que leva a formação de H
2
O
2
pelas reações
ilustradas nas equações 3 e 4:
HO
2
.
+ HO
2
.
Î H
2
O
2
+ O
2
Equação (3)
HO
2
.
+ O
2
- + H+ Î H
2
O
2
+ O
2
Equação (4)
Em solução aquosa o O
2
-
está sempre em equilíbrio com seu ácido
conjugado HO
2
.
, o que permite a ocorrência das reações descritas.
O agregado eletrostático TMPyP-TPPS
4
é eficiente na produção de H
2
O
2
porque este se forma na superfície da fase sólida do agregado, o qual atua como um
semicondutor. Dessa forma percebe-se que embora os agregados formados por
essas porfirinas não sejam capazes de gerar
1
O
2
, podem levar a produção de outras
espécies citotóxicas, igualmente interessantes para TFD (KEIKO et al., 2006).
Essas duas porfirinas – TMPyP e TPPS
4
– também foram estudadas através
da ligação destas a materiais hidrogéis modificando suas superfícies. Ao ligar essas
porfirinas a copolímeros de HEMA (2-hidroximetil metacrilato), MAA (ácido
metacrílico) ou DEAEMA (2 – (dietilamino) etil metacrilato), esses hidrogéis
carregados mostraram alta interação eletrostática com a porfirina apropriada
57
catiônica ou aniônica, resultando em materiais que são usados para gerar
1
O
2
na
fotoexcitação e podem assim ser usados para reduzir infecções pós-operatório
intraocular de cirurgias de catarata para recolocar lentes com base em hidrogéis
(BRADY, et al, 2007)
A porfirina aquo-solúvel TMPyP também tem sido estudada extensivamente
por causa de suas propriedades físico-químicas que comandam a interação com o
ácido nucléico, bem como sua ação fototerapêutica. A formação de um complexo
entre TMPyP e DNA quadruplex G-paralelo, constituido por uma seqüência simples
de telômero humano d(TAGGG) tem sido estudado em um esforço de compreender
o modo de reconhecimento entre a TMPyP e o DNA (MITA, et al., 2006).
A porfirina TMPyP foi estudada em associação com o DIAGNOdent
®
,
utilizado no diagnóstico por fluorescência de lesões de cárie. Foi utilizada uma
solução de porfirina 0,2 mmo/L preparada em dimetil sulfóxido e água 1:1 associada
ao DIAGNOdent
®
para avaliar o desempenho no método de detecção de cáries em
superfície lisa ou oclusais, avaliar a capacidade de detecção precoce da
desmineralização e testar a capacidade do método em quantificar a perda mineral
de lesões de superfícies lisas. Verificou-se que a associação da porfirina ao
DIAGNOdent
®
proporcionou uma melhor performance na detecção de lesões
artificiais de caries de superfície lisa e na detecção precoce da desmineralização
causada pela carie dentária em dentes decíduos (MENDES, 2005).
1.9.3 ZnTPPS
4
A porfirina Zinco(II)-meso-tetrakis(4-sulfonatofenil) - ZnTPPS
4
- é um
fotossensibilizador de caráter aniônico em que quatro grupos sulfonatofenil
encontram-se ligados ao anel porfirínico, sendo que ao centro há um átomo de zinco
58
no estado de oxidação 2+, coordenado aos nitrogênios dos anéis pirrólicos (Figura
20).
N
N
N
N
SO
3
Na
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
Zn
Figura 20 – Estrutura química da porfirina ZnTPPS
4
A ligação de porfirinas e metaloporfirinas a modelos biomiméticos (micelas
de surfactantes) têm atraído interesse devido a possibilidade de entendimento de
muitos processos biológicos e fotoquímicos, tal como, fotossíntese, transporte de
oxigênio, oxidação e redução e transporte de elétrons (GANDINI; YUSHMANOV;
TABAK, 2001). Assim são encontrados muitos estudos da interação desses FS com
micelas de surfactantes (GANDINI; YUSHMANOV; TABAK, 2001; KADISH, 1989).
Gandini e colaboradores conduziram estudos com a metaloporfirina
ZnTPPS
4
em presença de micelas do surfactante zwiteriônico HPS, mostrando que
há interação dessas porfirinas com micelas de HPS devido sua carga negativa
interagir com a parte dipolo do surfactante, levando a um aumento considerável do
valor da constante de ligação micela/porfirina quando comparada com porfirinas
catiônicas em presença do mesmo surfactante (GANDINI et al, 2005).
Kadish e colaboradores estudaram as porfirinas aniônicas TPPS
4
, CuTPPS
4
e ZnTPPS
4
em soluções contendo micelas de CTAB (catiônica), SDS (aniônica) e
Triton X - 100 (neutra), visando o uso dessas porfirinas em TFD e ressonância
59
magnética de imagem, visto que a TPPS
4
é conhecida por localizar-se em tumores,
em alta concentração comparado com outros tecidos. As porfirinas Fe(III)TPPS
4
,
Mn(II)TPPS
4
e CuTPPS
4
também tem se mostrado úteis como agentes de contraste
por imagem de RMN para tumores (KADISH et al., 1989).
Ao analisar espectroscopicamente a porfirina ZnTPPS
4
na presença de
micelas dos referidos surfactantes, observou-se mudanças nas propriedades
espectrais da porfirina, com deslocamento da banda Soret para a região do
vermelho na presença de CTAB e Triton X - 100. O
max
da banda Soret que se
encontrava em 422 nm em água mudou para 427 nm na presença do surfactantes
CTAB e 428 na presença do Triton X - 100. O valor de absortividade molar das
bandas Q também sofreu alteração passando de 348 x 10
-3
L.mol
-1
.cm
-1
em água
para 426 x 10
-3
L.mol
-1
.cm
-1
em CTAB e 356 x 10
-3
L.mol
-1
.cm
-1
em Triton X - 100.
Nenhuma mudança foi observada em presença de SDS (KADISH et al., 1989).
No mesmo estudo, verificou-se através de espectros de RMN
1
H que
soluções da porfirina ZnTPPS
4
preparadas em D
2
O, na concentração de 6,0 x 10
-3
molL
-1
ou mais concentradas, mostram a presença de agregados. Contudo a adição
de surfactantes CTAB e Triton X-100 a essas soluções promove a desagregação da
porfirina devido a proteção que a micela do detergente promove às moléculas da
porfirina, visto que o espectro de RMN registrado para essas soluções mostrou-se
semelhante ao da porfirina em concentrações na ordem de 10
-4
, onde predomina
seu estado monomérico. Mais uma vez o surfactante SDS não mostrou interagir com
a porfirina de modo que ao adicionar esse detergente às soluções de ZnTPPS
4
o
espectro de RMN mostrou-se inalterado em relação ao espectro da espécie
agregada (KADISH et al., 1989).
60
Assim pode-se observar que porfirina ZnTPPS
4
, por ter caráter aniônico é
capaz de se solubilizar em micelas contendo cargas positivas ou neutras, mas não
em micelas que contem apenas carga negativa. Essa interação porfirina/micela é tão
efetiva que promoveu a desagregação da ZnTPPS
4
, mesmo em concentrações
relativamente altas. Esse efeito deve-se a fatores eletrostáticos, mas no caso do
surfactante neutro o efeito dominante é de interações hidrofóbicas (KADISH et al.,
1989).
Em estudo com as porfirinas Fe(III)TPPS
4
e ZnTPPS
4
, realizado na
presença de micelas iônicas e não iônicas em solução aquosa, a fim de avaliar
fatores como agregação e constante de ligação, através das técnicas de absorção
ótica, fluorescência, RLS e RMN
1
H, observou-se a presença de três espécies
diferentes da porfirina ZnTPPS
4
à pH 4,0 em presença de CTAC (cloreto de
cetiltrimetilamônio) de caráter catiônico: metaloporfirina livre, metaloporfirina
monomérica ou agregada ligada a micelas e na forma de agregado não micelar
porfirina/surfactante. A razão [CTAC]/[ZnTPPS
4
] para a formação do agregado
porfirina/surfactante foi de 8, independente do pH. Esses agregados não micelares
são formados devido à atração da porfirina com o surfactante e ocorre a
concentrações bem menores que a cmc do surfactante, na região de micromolar.
Quando a concentração de surfactante aumenta, atinge uma razão crítica
surfactante/metaloporfirina que possibilita a desagregação em favor da espécie
micela/porfirina (GANDINI; YUSHMANOV; TABAK, 2001).
No caso dos surfactantes HPS (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-
propanosulfonato) de caráter zwiteriônico, Brij-35 e Triton X-100, ambos não iônicos,
os agregados não micelares não foram observados em pH de 2,0 a 12,0, havendo
portanto apenas duas espécies nesses meios: porfirina livre com
max
= 422 nm para
61
banda Soret; 555 nm e 595 nm para as bandas Q; e as espécies ligadas a micelas
com
max
para banda Soret em 426 nm em HPS e 428 nm para o Brij-35 e Triton X-
100; 560 nm e 600 nm para as bandas Q em ambos os surfactantes. Na presença
desses surfactantes não há formação de agregados metaloporfirina/surfactante a
concentrações menores que a cmc, devido interações insuficientes entre as
moléculas dos mesmos. Contudo há valores maiores que a cmc dos detergentes,
observou-se a interação da ZnTPPS
4
com HPS devido à interação da carga negativa
da porfirina com a carga positiva do surfactante. Já com os surfactantes neutros a
interação tem caráter hidrofóbico (GANDINI; YUSHMANOV; TABAK, 2001; KADISH,
1989).
As constantes de ligação para a ZnTPPS
4
e os surfactantes foram
determinadas por absorção ótica e são da ordem de 10
4
, valor similar a outros
previamente obtidos para a porfirina na forma de base livre. Para os surfactantes
Brij-35 e Triton X-100 a constante foi um fator de 3 a 5 menor que aquele para CTAC
e HPS a pH 4,0. Ao contrario da porfirina FeTPPS
4
, não é observada a formação de
agregado “ponte” µ - oxigênio para a ZnTPPS
4
, nem mesmo em soluções ácidas
(GANDINI; YUSHMANOV; TABAK, 2001).
O fato de ter ocorrido mudanças espectroscópicas com a porfirina ZnTPPS
4
,
indica que a mesma é afetada pela presença dos surfactantes ocorrendo interação
entre essas espécies o que leva a concluir que metaloporfirinas carregadas podem
interagir com membranas celulares (GANDINI; YUSHMANOV; TABAK, 2001).
Também a relativa estabilidade dessa porfirina em diferentes pHs deve ser
considerada como um fator positivo, visto que sua integridade espectroscópica e por
conseqüência fotodinâmica será mantida.
62
A porfirina ZnTPPS
4
ligada a ciclodextrina hpCD, foi testada contra células
cancerosas de melanoma G361 in vitro. Nesse estudo foi comprovado o fotodano ás
células cancerosas na região visível do espectro, utilizando-se uma lâmpada de
halogênio (24 V/ 250 W) como fonte de radiação. Após 24 horas de incubação da
cultura de células com 10,0 µmol.L
-1
de ZnTPPS
4
, 1,0 µmol.L
-1
de ciclodextrina e
uma dose total de irradiação de 12,5 J/cm
-2
, foi comprovado o fotodano ao DNA das
células através do “ensaio de cometa” e usando microscópio de inversão de
fluorescência. Verificou-se ainda que o uso de doses de radiação visível na ausência
do FS não induziu danos ao DNA das células doentes (KOLAROVA et al., 2005).
A geração de
1
O
2
pela porfirina ZnTPPS
4
foi estudada por Garcia (2003),
onde verificou-se que o rendimento quântico dessa espécie é maior quando utiliza-
se soluções dessa porfirina na faixa de 10
-4
mol/L (GARCIA, 2003).
A quitosana (Figura 21) é um polímero natural e adequado para aplicações
em biomedicina e na elaboração de formulações farmacêuticas uma vez que
apresenta biodegradabilidade, baixa toxicidade e boa biocompatibilidade e por isso
muito utilizado como transportadora de fármacos (SOARES; AZZELLINI, 2007).
Figura 21 - Estrutura química da quitosana
Soares e Azzellini (2007) conduziram estudos com solução aquosa da
porfirina ZnTPPS
4
, em pH 4,5, fazendo a adição de quantidades crescentes de
quitosana. A interação entre o FS e a quitosana foi acompanhada fazendo o
63
espectro eletrônico de absorção e medidas de fluorescência durante a adição de
polímero. Dessa forma observou-se que a cada adição de quitosana a
intensidade de absorção diminuiu gradativamente tanto para a banda Soret quanto
para as bandas Q, sendo observados pontos isosbésticos bem definidos nas regiões
dessas bandas, assim também como a diminuição na emissão de fluorescência das
bandas Q, o que indica o estabelecimento de interações entre a ZnTPPS
4
e o
polímero de quitosana em solução (SOARES; AZZELLINI, 2007).
Essas interações são de natureza eletrostática visto que a pH 4,5 a
quitosana possui uma grande área de contato carregada positivamente, devido a
protonação dos grupos amino, favorecendo a interação com a ZnTPPS
4
aniônica.
Quando o pH do meio foi elevado para 7,0 observou-se uma recuperação gradual
das intensidades de absorção e emissão, indicando a dissociação da ZnTPPS
4
com
a quitosana. Assim, verificou-se que a interação entre o FS e o polímero de
quitosana pode ser controlado em função do pH do meio, uma vez que o caráter
eletrostático da interação é favorecido na condição de pH no qual os grupos amino
da quitosana encontram-se protonados. Este sistema parece promissor como
estratégia de liberação de FSs aniônicos já que a desprotonação da quitosana
ocorre em pHs próximos ao pH fisiológico (SOARES; AZZELLINI, 2007).
Estudos com a ZnTMPyP e o polímero quitosana sob a mesma condição de
pH, não mostraram as mesmas variações espectrais visto que nesse caso ambas as
substâncias são carregadas positivamente (SOARES; AZZELLINI, 2007).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
64
Estudar as porfirinas aquo-solúveis meso-tetrakis(4-metilpiridil)porfirina
(TMPyP) e zinco-meso-tetrakis-(4-sulfonatofenil)porfirina (ZnTPPS
4
), investigando
sua potencial utilização na terapia fotodinâmica.
2.2 Objetivos específicos
Estudar a interação das porfirinas ZnTPPS
4
com modelos biomiméticos,
através de medidas espectroscópicas no UV-Vis, das porfirinas em solução
dos detergentes dodecil sulfato de sódio, SDS; brometo de
cetiltrimetilamônio, CTAB; e N-hexadecil-N,N,dimetil-3-amônio-1-
propanosulfato, HPS na forma de micelas.
Analisar a capacidade de agregação dessas porfirinas em meios de
água/etanol.
Avaliar as propriedades foto-físicas e foto-químicas dos compostos, através
da ocorrência de reações de foto-branqueamento.
Avaliar a capacidade de geração de oxigênio singlete das porfirinas.
Testar a ação fotodinâmica das porfirinas analisadas in vitro, frente ao
microcrustáceo Artemia salina e com a bactéria Escherichia coli.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais e equipamentos
65
Para a realização deste trabalho, utilizou-se a porfirina catiônica cloreto de
meso-tetrakis(N-metil-4-piridil), TMPyP da Sigma (Figura 17).
Empregou-se ainda a porfirina zinco-meso-tetrakis-(4-sulfonatofenil)porfirina,
ZnTPPS
4
(Figura 20), que foi sintetizada pelo grupo de pesquisa da Professora
Shirley Nakagaki da Universidade Federal do Paraná, a qual nos disponibilizou a
mesma a fim de procedermos os estudos propostos.
As soluções de porfirina foram preparadas para que a concentração ficasse
na faixa de 10
-6
mol/L e absorbância registrada se encontrasse abaixo de 1,0 na
banda Soret. Os demais reagentes utilizados, são de qualidade PA e a água
utilizada no preparo de soluções foi destilada e deionizada.
As medidas de absorção ótica foram realizadas com espectrofotômetro Cary
100 Varian, utilizando-se cubeta de quartzo com duas faces polidas e caminho ótico
de 1,0 cm. As variações de pH foram registradas com pHmetro NovaTec, dotado de
um eletrodo de vidro Ag/AgCl.
3.2 Determinação do coeficiente de absortividade molar das porfirinas nos
solventes água e etanol
Para a determinação do coeficiente de absortividade molar () das porfirinas
TMPyP e ZnTPPS
4
, preparou-se soluções dessas porfirinas em etanol ou em água,
na concentração de 3,67 x 10
-4
e 2,98 x 10
-4
mol.L
-1
respectivamente, e fez-se a
diluição dessas soluções. Obteve-se o espectro de absorção ótica de cada solução
na faixa de 300 a 700 nm. Através do tratamento de dados dos valores de
absorbância em função da concentração, foi possível obter o coeficiente de
absortividade molar de cada porfirina em cada um dos solventes.
66
3.3 Estudo espectrofotométrico da porfirina ZnTPPS
4
sob variação de pH na
ausência e na presença de surfactantes.
Inicialmente, dissolveu-se uma pequena quantidade de porfirina ZnTPPS
4
em água destilada e deionizada, cuidando para que a absorbância registrada não
ultrapassasse 1,0 na banda Soret e mediu-se o pH da solução. Separou-se a
solução em duas alíquotas de 20 mL e iniciou-se a variação do pH. Com uma das
alíquotas utilizou-se soluções de HCl em diferentes concentrações para diminuir o
pH de 0,5 em 0,5 unidades até próximo de 0,0. A cada mudança de pH foi registrado
um espectro na faixa de 350 a 750 nm. Com a outra alíquota, procedeu-se da
mesma forma, porém, utilizando soluções de NaOH em diferentes concentrações,
sendo que os intervalos de pH foram de cerca de 0,5 em 0,5 unidades até próximo a
pH 14,0. Os espectros referentes a cada variação foram registrados na faixa de
comprimento de onda anteriormente citada. Os mesmos testes foram realizados em
solução acetato/fosfato 20 mmol.L
-1
, em triplicata.
Para analisar a interação da porfirina ZnTPPS
4
com membranas biológicas
foram utilizados modelos biomiméticos constituídos por micelas de detergentes,
dentre os quais utilizou-se dodecil sulfato de sódio (SDS), brometo de
cetiltrimetilamônio (CTAB), e N-hexadecil - N,N, dimetil- 3- amônio-1-
propanosulfonato (HPS). Estudo semelhante já havia sido realizado com a porfirina
TMPyP pelo grupo de pesquisa SCEOM da UEPG.
Para as medidas em presença das micelas as porfirinas foram preparadas
soluções dos surfactantes HPS, SDS e CTAB nas concentrações de 20 mmol/L para
os dois primeiros e 80 mmol/L para o último, em solução acetato/fosfato 20 mmol/L.
Separou-se as soluções de surfactantes em duas alíquotas de 20 mL e acrescentou-
se a cada delas uma pequena quantidade de porfirina na forma sólida, cuidando
67
para que a absorção da banda Soret não fosse superior a 1,0. Fez-se a medida do
pH da solução resultante e obteve-se seu respectivo espectro de absorção da faixa
de 350 a 750 nm. A uma das alíquotas acrescentou-se HCl em diferentes
concentrações, variando o pH de 0,5 em 0,5 unidades até próximo de pH 0,0,
enquanto à outra alíquota adicionou-se solução de NaOH em diferentes
concentrações, até próximo de pH 14,0, como descrito no item 3.3.
3.4 Análise da capacidade de agregação
Para analisar a capacidade de agregação das porfirinas TMPyP e ZnTPPS
4
preparou-se misturas de água/etanol variando a porcentagem de água em 0; 20; 30;
40; 50; 60; 80 e 100%. A essas misturas acrescentou-se 20 µL de solução de
porfirina TMPyP ou ZnTPPS
4
a 3,67 x 10
-4
e 2,98 x 10
-4
mol.L
-1
respectivamente, e
fez-se a leitura espectroscópica para cada uma das misturas, na faixa de 300 nm a
700 nm.
3.5 Reações de foto-branqueamento
Colocou-se 20 µL de solução de porfirina TMPyP ou ZnTPPS
4
, nas
concentrações acima citadas, em 4 mL de água destilada e deionizada. Após a
homogeneização dessa solução, transferiu-se para uma cubeta de quartzo e levou-
se ao espectrofotômetro onde fez-se a leitura de 300 a 700 nm. A solução de
porfirina foi posteriormente colocada em iluminação com sistema de seis LEDs
vermelhos em série (Figura 22), cada um com potência equivalente a 5 mW
totalizando 30 mW. A cada 5 minutos de iluminação, a solução foi levada ao
espectrofotômetro para novas leituras na mesma faixa de comprimento de onda,
totalizando um período de iluminação de 1 hora (SOARES, 2006).
68
Figura 22 – Sistema de LEDs, utilizado para iluminação das soluções de porfirina
3.6 Teste do ácido úrico
O teste do ácido úrico foi realizado de acordo com a metodologia
desenvolvida pelo grupo de pesquisa do Prof. Noboru Hioka, da Universidade
Estadual de Maringá e descrita por Soares (2006).
Para tanto, preparou-se uma solução de ácido úrico com concentração na
ordem de 10
-4
mol/L e numa alíquota de 5 mL de solução acrescentou-se 20 µL de
solução de porfirina TMPyP ou ZnTPPS
4
, para que a concentração destas ficasse na
ordem de 10
-6
mol/L. Transferiu-se esta solução contendo ácido úrico e porfirina para
uma cubeta de quartzo e fez-se a leitura espectroscópica na faixa de 200 a 800 nm.
O sistema foi transferido para o dispositivo mostrado na figura 23 e iluminado com
LEDs vermelhos. A cada 3 minutos de iluminação foi registrado um novo espectro,
até totalizar um período de 30 minutos. Através dos espectros de absorção foi
possível avaliar a atividade fotodinâmica das substâncias testadas, empregando os
valores obtidos na equação 5:
AF= ∆A
AU
x 10
5
/ W x t x A
Psλirr
Equação (5)
Onde:
AF: atividade fotodinâmica;
69
A
AU
: variação da absorbância a 293 nm do ácido úrico após o
tempo total de irradiação;
W: potência da luz (mW);
t: tempo de irradiação em segundos;
A
Psirr
: valor de absorbância do fotossensibilizador em solução de
ácido úrico no comprimento de onda da irradiação.
3.7 Ensaios biológicos in vitro
3.7.1 Toxicidade sobre Artemia salina (TAS)
O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina foi realizado, segundo a
metodologia de Meyer com adaptações (MEYER, 1982). Os ovos de microcrustáceo
são comercializados como alimento vivo para peixe e foram adquiridos em loja de
artigos para aquários.
Os ovos foram colocados para eclodir em solução aquosa de NaCl (3,8 g/L).
O recipiente utilizado para esse teste é dividido em dois compartimentos, sendo um
deles protegido da luz e o outro iluminado por uma lâmpada fria de 14 W (Figura 23).
Os ovos foram depositados no compartimento protegido da luz, sendo que após a
eclosão, os microcrustáceos migraram através dos orifícios, em direção a luz.
Após 48 horas foram coletados 20 microcrustáceos a temperatura média de
20 ºC e distribuídos em número fixo em tubos de ensaio, acrescentando 1,5 mL das
soluções de porfirinas TMPyP ou ZnTPPS
4
nas concentrações de 10, 30 e 50 ppm,
respectivamente, e completando com solução salina até 3 mL.
As amostras foram divididas em dois grupos: as submetidas à iluminação
com LEDs vermelhos por duas horas e as sem iluminação, incluindo o controle que
70
não possui solução das porfirinas, e ficou isento de luz. Após o tempo de irradiação
foi feita a contagem do número de camarões vivos e mortos em cada tubo de
ensaio. Os testes foram realizados em triplicata.
Figura 23 – Recipiente utilizado para eclosão dos ovos de Artemia salina
3.7.2 Ensaio in vitro: cultura bacteriana
Para realização desse teste utilizou-se a bactéria Escherichia coli 25922,
fornecidas pelo laboratório de microbiologia da UEPG. Foram preparadas
suspensões utilizando solução salina 0,9 % de NaCl (soro fisiológico) com a
bactéria, acompanhando-se a absorbância em um colorímetro Micronal a 580 nm até
que estas atingissem a absorbância próximo a 0,8, equivalente de cerca de 10
8
bactérias/mL.
Dessa suspensão pipetou-se 10 µL e depositou-se em tubos contendo 2 mL
de meio nutritivo Tripticase Soy Agar (TSA) e 40 µL de porfirina TMPyP, ficando a
solução com concentração de 10 ppm desse composto. Os tubos foram separados
em dois grupos: os submetidos à iluminação de LEDs vermelhos 30 mW (Figura 22),
e aqueles submetidos à iluminação de LEDs azuis de potência 650 mW/cm
2
e
emissão na faixa de 470 a 500 nm, utilizados em consultórios odontológicos como
polimerizador de resina.
71
Os tempos de iluminação em cada um dos sistemas de LEDs foi de 1; 2; 5 e
30 minutos. Fez-se ainda os seguintes controles: I) somente iluminação e sem
porfirina; II) presença de porfirina e sem iluminação e III) ausência de iluminação e
porfirina (controle geral). Decorrido o tempo de iluminação, fez-se a
homogeneização das soluções agitando-se por cerca de 15 segundos em um vortéx
Quimis e coletou-se 10 µL de cada um dos tubos semeando-se em placas de Petri
contendo Agar TSA. As placas foram incubadas por 24 horas em estufa a 37 ºC.
Após o tempo de incubação as placas referentes aos testes e aos controles
foram fotografadas com câmera digital Sony Cybershot DSC 707, com resolução de
5.0 megapixels e as colônias de bactérias foram contadas através do programa
analisador de Image-Pro Plus 4.5.0.29 (Media Cybernetics). O mesmo procedimento
foi empregado para avaliar a ação da porfirina ZnTPPS
4
sobre a E. coli. Todos os
testes foram feitos em triplicata.
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