( PDF ) Estudo das atividades citotóxica e antitumoral de vitafisilinas isoladas de Acnistus arborescens

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

DANILO DAMASCENO ROCHA

ESTUDO DAS ATIVIDADES CITOTÓXICA E

ANTITUMORAL DE VITAFISILINAS ISOLADAS DE

Acnistus arborescens

FORTALEZA

2008

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DANILO DAMASCENO ROCHA

ESTUDO DAS ATIVIDADES CITOTÓXICA E ANTITUMORAL DE

VITAFISILINAS ISOLADAS DE Acnistus arborescens

Dissertação submetida à Coordenação do

programa de Pós-Graduação em Farmacologia

do Departamento de Fisiologia e Farmacologia

da Universidade Federal do Ceará como

requisito parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Farmacologia.

Orientadora: Profª. Drª. Letícia Veras Costa

Lotufo

FORTALEZA

2008

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Ficha catalográfica

R572e Rocha, Danilo Damasceno

Estudo das atividades citotóxica e antitumoral de

vitafisilinas isoladas de Acnistus arborescens/ Danilo

Damasceno Rocha. – Fortaleza, 2008.

123 f. : il.

Orientadora: Profª. Drª. Letícia Veras Costa Lotufo

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará.

Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia.

1. Vitafisalina 2. Apoptose 3. Solanaceae I. Lotufo, Letícia

Veras Costa (orient.). II. Título.

CDD 615.32379

DANILO DAMASCENO ROCHA

ESTUDO DAS ATIVIDADES CITOTÓXICA E ANTITUMORAL DE

VITAFISILINAS ISOLADAS DE Acnistus arborescens

Dissertação submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia como parte

dos requisitos necessários para a obtenção do titulo de mestre em Farmacologia outorgado pela

Universidade Federal do Ceará.

Este documento encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca setorial as referida

universidade. A citação de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde que seja feita em

conformidade com as normas da ética científica.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________

Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves

Universidade Federal do Ceará

A Deus, que sempre me deu força e coragem,

não me deixando desanimar nos momentos

de angustia, tristeza e aflição.

AGRADECIMENTOS

À grande amiga e orientadora Profª Drª Letícia Veras Costa-Lotufo, por ter me

aceitado, incentivado e acreditado em meu trabalho desde o início; pela paciência, ajuda e por

todos os ensinamentos do dia-a-dia, e pela a orientação deste trabalho.

À Profª Drª Claudia do Ó Pessoa, pelo apoio, incentivo e pela amizade.

À Drª Raquel Carvalho Montenegro, por todos os auxílios e dicas essenciais, e pela

amizade.

Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes, pelo incentivo e contribuição à pesquisa

no Laboratório de Oncologia Experimental.

À Profª Drª Ana Paula Negreiros Nunes Alves, pela contribuição e auxílio nas

análises histopatológicas.

À Profª Drª Otília Deusdênia Loiola Pessoa e ao Prof. Dr. Edilberto Rocha

Silveira (esse é o prof., a parte do pai está lá em baixo), do Departamento de Química

Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará (UFC), junto aos pós-graduandos

Ana Isabel Maia e Maria Leopoldina Veras, pelo isolamento e caracterização química das

vitafisalinas aqui estudadas, e pela imensa colaboração neste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Oncologia Experimental: Arinice, Bruno, Carla,

Cecília, Daniel, Delano, Elthon, Eveline, Felipe, Hemerson, Ivana, Jersia, José Roberto,

Kristiana, Márcio, Marne, Michel, Patrícia Marçal, Paula e Washington pela ajuda,

amizade e momentos de descontração de todos os dias; em especial Diego e Gardênia, por

terem me passado um pouco de seus profundos conhecimentos e por todas as explicações

sobre as metodologias utilizadas no laboratório.

À Silvana pela imensurável paciência e ajuda neste trabalho.

Aos técnicos Adriano Santos, Luciana França e Maria de Fátima Teixeira cuja

dedicação é essencial para o laboratório.

Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia por todas as lições.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Adelânia, Sheila,

Aura, Chiquinho, Carlos e Íris que tentam resolver ou indicar o melhor caminho para os

problemas do dia a dia.

Ao meu sobrinho João Pedro, que com toda sua alegria e inocência me faz esquecer

dos problemas da vida de gente grande.

Às minhas irmãs Stephanie e Patrícia, que me fazem uma raiva danada, mas mesmo

assim eu as amo muito.

À minha mãe Veranisia Damasceno Rocha, pelo beijo, abraço, amor, carinho,

conforto, compreensão e paciência “muita” de todos os dias; TE AMO!

Ao meu pai Edilberto Rocha Silveira, que tem um jeito “ditador” especial de ser,

mas sempre se esforçou muito para me proporcionar as melhores condições de vida; sempre

me dizendo pra estudar (nem sempre eu escutava), e hoje eu agradeço pela insistência e

oportunidade de poder concluir e seguir em frente com os meus estudos; pelo exemplo de

“grande homem” que venceu na vida e chegou onde chegou; TE AMO!

À minha noiva e melhor amiga Carolinne Reinaldo Pontes, que sempre, sempre,

sempre esteve ao meu lado, me apoiando e me incentivando em todas as decisões e momentos

difíceis; pelo amor e carinho de todos os dias; TE AMO, TE AMO, TE AMO!!!

À todos que, diretamente ou indiretamente, contribuíram para a minha formação

pessoal e acadêmica ou para a execução deste trabalho.

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:

Banco do Nordeste do Brasil - BNB

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP

Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa - FUNCAP

Instituto Claude Bernard - InCb

RESUMO

As vitafisalinas são lactonas esteroidais (C

), estruturalmente baseadas no

esqueleto do ergostano, comumente encontradas em plantas da família Solanaceae. A fim de

avaliar as propriedades anticâncer desses compostos, cinco vitafisalinas [O, F, M, N e (17S,

20R, 22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepóxi β-4, 18 - diidróxi-1 - oxovita-3-24-enolido] isoladas da

Acnistus arborescens, planta típica do nordeste brasileiro, foram analisadas utilizando

diversos modelos biológicos. Todas as cinco vitafisalinas mostraram efeitos citotóxicos em

linhagens de células tumorais, sendo a vitafisalina O a mais potente e a vitafisalina (17S, 20R,

22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepóxi β-4, 18 - diidróxi-1-oxovita-3 - 24-enolido) a menos potente.

Ao compararmos as estruturas químicas das vitafisalinas e suas atividades, foi observado que

a ligação dupla entre os carbonos 2 e 3 é essencial para os efeitos citotóxicos desses

compostos. No entanto, as vitafisalinas (O, F e N) não mostraram qualquer especificidade

para linhagens tumorais, já que também apresentaram efeitos citotóxicos e genotóxicos,

semelhantes, em células leucêmicas (HL-60) e em células normais (PBMC). A viabilidade

celular e curvas de crescimento foram determinadas, para as linhagens de HL-60 e K-562,

utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripan. As vitafisalinas O, F, M e N reduziram o

número de células viáveis de modo dose e tempo dependente, apresentando valores de CI

variando de 0,7 a 3,5 µM após 72 horas de incubação. Nas mesmas linhagens leucêmicas, as

vitafisalinas também inibiram a síntese de DNA, causaram alterações morfológicas típicas de

apoptose, e apenas na linhagem HL-60 induziram a ativação da caspase-3. Além disso, foi

realizado, em células de HL-60, a análise da integridade da membrana celular, distribuição do

ciclo celular, fragmentação de DNA e o potencial transmembrânico de mitocôndria, utilizando

citometria de fluxo. Nestes experimentos, as vitafisalinas O e F, somente na concentração de

10 µM, reduziram o número de células viáveis para 60 e 40%, respectivamente. Na análise do

ciclo celular, ambas vitafisalinas, na concentração de 5 µM, causaram um acúmulo de células

na fase G2/M do ciclo celular. Ambas vitafisalinas também causaram um aumento

significativo do número de células apresentando fragmentação de DNA. Os resultados da

análise do potencial transmembrânico de mitocôndria mostraram um aumento na

despolarização de 4,7, 17,5 e 9,1% causado pela vitafisalina O e de 7,6, 16,6 e 5,6% pela

vitafisalina F. O efeito antitumoral (in vivo) da vitafisalina F foi analisado em camundongos

transplantados com o tumor Sarcoma 180, nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia por via

intraperitoneal e na dose de 20 mg/Kg/dia por via oral. O crescimento do tumor foi inibido em

mais de 76% na maior doses testada (20mg/Kg/dia), tanto por via intraperitoneal quanto por

via oral. A análise histopatológica dos órgãos dos animais mostraram que a vitafisalina F

provoca efeitos tóxicos moderados, principalmente no fígado e nos rins, mas esses podem ser

considerados como reversíveis. Tendo em vista todos estes dados, pode concluir-se que as

vitafisalinas podem ser consideradas como uma classe emergente de novos compostos

anticâncer.

Palavras-chave: Vitafisalina. Apoptose. Solanaceae.

ABSTRACT

Withaphysalins are C28-steroidal lactones structurally based on the ergostane skeleton

commonly found in Solanaceae species. In order to evaluate the anticancer properties of these

compounds, five withaphysalins [O, F, M, N and (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-

dihydroxy-1-oxowitha-24-enolide] isolated from Acnistus arborescens, a plant from the

northeastern Brazilian flora, were analyzed in several biological models. All five

withaphysalins showed cytotoxic effects against tumor cell lines, being withaphysalin O the

most potent and withaphysalin (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-dihydroxy-1-

oxowitha-24-enolide, the less potent. Based on these results, its shown that a double-bond

between carbons 2 and 3 is essential for the cytotoxic activity of withaphysalins.

Withaphysalins (O, F and N) did not show any specificity to tumor cell lines, showing similar

cytotoxic and genotoxic effects against leukemic cells (HL-60) and normal cells (PBMC).

Cell viability and growth curves of HL-60 and K-562 treated cells were determined using

trypan blue exclusion assay, where all withaphysalins reduced the number of viable cells in a

dose-and time-dependent fashion, with IC

values ranging from 0.7 to 3.5 µM after 72 h of

incubation. In HL-60 and K-562 cells, the withaphysalins inhibited DNA synthesis, induced

morphological alterations, typical of apoptosis, and only in the HL-60 cell line, and they

induced activation of caspase-3. Moreover, it was performed the analyzes of cell membrane

integrity, cell cycle distribution, DNA fragmentation and the mitochondrial membrane

potential using flow citometry. In these experiments, withaphysalins O and F, only at

concentration of 10µM, reduced the number of viable cells to 60 and 40% respectively. In the

cell cycle analysis, both withaphysalins led to a cell cycle arrest at G2/M, at the concentration

of 5µM. Cells treated with both withaphysalins also showed a significant increase in DNA

fragmentation when compared to the negative control. Results of the mitochondrial

transmembrane potential showed depolarization changes in accordance to the tested

concentration (2.5, 5 and 10µg/mL) with 4.7, 17.5 and 9.1% for withaphysalin O and 7.6, 16.6

and 5.6% for withaphysalin F, respectively. The in vivo antitumor effects of withaphysalin F

was performed in animals bearing the sarcoma 180 tumor, and at the highest dose tested

(20mg/Kg/day), growth tumor was inhibited in 77%. Histopatological analysis of mice organs

showed that withaphysalin F causes moderate toxic effects mostly in liver and kidney, but

they may be considered reversible effects. Taking in account all these data, it can be

concluded that withaphysalins could be considered as an emerging class of new anticancer

compounds.

Key words: Withaphysalin. Apoptosis. Solanaceae

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -

Tipos de câncer mais incidentes, estimados para o ano de 2008, na

população brasileira, sem pele não melanoma........................................... 18

Figura 2 -

Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100 mil

homes/mulheres, estimadas para o ano de 2008........................................ 19

Figura 3 -

Ilustração esquemática das fases do ciclo celular..................................... 21

Figura 4 -

Ilustração esquemática das fases do ciclo celular e respectivas ciclinas e

cdks............................................................................................................ 22

Figura 5 -

(A) Catharanthus roseus e (B) estruturas químicas da vimblastina (1)

vincristina (2), vindesina (3) e vinorelbina (4).......................................... 25

Figura 6 -

(A) Podophyllhum pelpatum L e (B) estruturas químicas da

podofilotoxina, (5), etoposídeo (6) e tenoposídeo (7)............................. 27

Figura 7 -

(A) Camptotheca acuminata e (B) estruturas químicas da camptotecina

(8), topotecan (9) e irinotecan (10).............................................................

Figura 8 -

A) Taxus baccata e (B) estruturas químicas do paclitaxel (11

) e

docetaxel (12)............................................................................................. 31

Figura 9 -

Estruturas químicas básicas dos sete grupos de vitaesteróides.................. 33

Figura 10 -

Acnistus arborescens L. Schlecht.............................................................. 35

Figura 11 -

Estruturas dos compostos Vitaferina A (13), Vitacnistina (14), 7β-

Acetóxivitanolido D (15), 7β,16α-Diacetóxivitanolido D (16), 4-Deóxi-

7β,16-α-diacetóxivitanolido D (17), Vitafisalina F (18), Vitafisalina M

(19) Vitafisalina N (20), Vitafisalina O (21) e Vitafisalina

(17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2-diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3-24-

enolido (22) isolados da A. arborescens.................................................... 36

Figura 12 -

Curva de crescimento celular da linhagem HL-60 (leucemia humana)

tratada com as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D). Viabilidade

celular......................................................................................................... 68

Figura 13 -

Curva de crescimento celular da linhagem K-562 (leucemia humana)

tratada com as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D). Viabilidade

celular......................................................................................................... 69

Figura 14 -

Curva de crescimento celular da linhagem HL-60 (leucemia humana)

tratada com as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D). Número de

células......................................................................................................... 70

Figura 15 -

Curva de crescimento celular da linhagem K-562 (leucemia humana)

tratada com as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D). Número de

células......................................................................................................... 71

Figura 16 -

Freqüência de dano das vitafisalinas O, M e N sobre células de PBMC

(A) e HL-60 (B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de

incubação....................................................................................................

Figura 17 -

Índice de dano das vitafisalinas O, M e N sobre células de PBMC (A) e

HL-60 (B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação... 74

Figura 18 -

Efeito das vitafisalinas O, M e N sobre células de (A) HL-60 e (B)

K562, analisado por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina após 24

horas de incubação..................................................................................... 77

Figura 19 -

Efeito das vitafisalinas O, M e N sobre a ativação da caspase-3 em

células de HL-60 após 24 horas de incubação 78

Figura 20 -

Morfologia de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24h de

incubação, coradas por Hematoxilina/Eosina e visualizadas por

microscopia óptica......................................................................................

Figura 21 -

Morfologia de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24h de

incubação, coradas por May-Grunwald-Giemsa e visualizadas por

microscopia óptica......................................................................................

Figura 22 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a viabilidade (integridade de

membrana) de células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de

fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação............. 82

Figura 23 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a concentracao de células

leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando

iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação........................................ 83

Figura 24 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a distribuição do ciclo celular (eixo

x: intensidade de fluorescência; eixo y: número de células) em células

leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando

iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação........................................

Figura 25 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a fragmentação de DNA de células

leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando

iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação........................................ 86

Figura 26 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre o potencial transmembrânico de de

células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo

utilizando rodamina 123 após 24 horas de incubação................................

Figura 27 -

Efeito da vitafisalina F nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia, i.p. e 20

mg/Kg/dia, v.o. sobre a proliferação tumoral de camundongos (Mus

musculos) Swiss transplantados com Sarcoma 180, após 7 dias de

tratamento...................................................................................................

Figura 28 -

Fotomicrografia dos tumores de camundongos (Mus musculus) Swiss

transplantados com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de

tratamento.................................................................................................. 92

Figura 29 -

Fotomicrografia do fígado de camundongos (Mus musculus) Swiss

transplantados com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de

tratamento...................................................................................................

Figura 30 -

Fotomicrografia dos rins de camundongos (Mus musculus) Swiss

transplantados com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de

tratamento..................................................................................................

Figura 31 -

Fotomicrografia do baço de camundongos (Mus musculus) Swiss

transplantados com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de

tratamento...................................................................................................

Figura 32 -

Estruturas químicas das vitafisalinas estudadas. As diferenças

estruturais entre os compostos se encontram em

destaque......................................................................................................

101

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Linhagens celulares tumorais utilizadas nos ensaios de citotoxicidade in

vitro............................................................................................................ 47

Tabela 2 -

Atividade citotóxica in vitro de vitafisalinas isoladas da Acnistus

arborescens em linhagens de células tumorais........................................... 65

Tabela 3 -

Atividade citotóxica in vitro de vitafisalinas isoladas da Acnistus

arborescens em PBMC............................................................................... 66

Tabela 4 -

Atividade citotóxica das vitafisalinas F, O, M e N em células leucêmicas

das linhagens HL-60 (leucemia promielocitica) e K562 (leucemia

mielocítica crônica).................................................................................... 72

Tabela 5 -

Efeito das vitafisalinas O, M e N na incorporação do 5-bromo-2´-

deoxyuridina (BrdU) em células leucêmicas de HL-60 e K562 depois de

24 horas de incubação................................................................................ 75

Tabela 6 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a distribuição do ciclo celular em

células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo

utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. ..................... 84

Tabela 7 -

Efeito das vitafisalinas F e O sobre a distribuição do ciclo celular em

células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo

utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação....................... 91

Tabela 8 -

Resumo dos resultados encontrados no estudo da atividade citotóxica

das vitafisalinas.......................................................................................... 96

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA

Analisys of Variance (Análise de variância)

BE/LA

Brometo de Etídio / Laranja de Acridina

BrdU

Bromodeoxiuridina

Concentração Inibitória Média

Dióxido de Carbono

DAB

Diaminobenzidina

DMSO

Dimetilsulfóxido

E.P.M.

Erro Padrão da Média

Hora

H/E

Hematoxilina/Eosina

Litro

µL

Microlitro

µM

Micromolar

min

Minuto

Miligrama

MTT

3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium

PBS

Phosphate Buffer Solution (Tampão Fosfato)

RPMI

Roswell Parrk Memorial Institute Medium

TBS

Tris Buffer Solution (Tampão Tris)

Unidade

Ultra-Violeta

i.p.

Via Intraperitoneal

v.o.

Via Oral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 17

1.1 Câncer........................................................................................................................... 17

1.2 Produtos naturais com atividade anticâncer.......................................................................23

1.3 Vitaesteróides................................................................................................................ 32

1.4 Acnistus arborescens L. Schlecht .................................................................................. 34

2 OBJETIVOS.................................................................................................................... 38

2.1 Geral............................................................................................................................. 38

2.2 Específicos.................................................................................................................... 38

3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................ 40

3.1 Materiais....................................................................................................................... 40

3.2 Métodos ........................................................................................................................ 46

3.2.1 Obtenção das vitafisalinas ......................................................................................... 46

3.2.2 Cultivo das células .................................................................................................... 46

3.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro – MTT ...................... 47

3.2.4 Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro – Alamar Blue............ 48

3.2.5 Avaliação da atividade antiproliferativa em células leucêmicas (Curva de crescimento

celular) - exclusão por azul de tripan.................................................................................... 49

3.2.6 Avaliação da atividade genotóxica em células normais e leucêmicas. ........................ 50

3.2.7 Inibição da síntese de DNA – BrDU.......................................................................... 52

3.2.8 Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina ............................ 53

3.2.9 Determinação da ativação da caspase-3 ..................................................................... 55

3.2.10 Análise morfológica – Coloração por Hematoxilina/Eosina (H/E) ............................. 56

3.2.11 Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-Giemsa ................................... 56

3.2.12 Determinação da Integridade da Membrana............................................................... 57

3.2.13 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA................................................... 58

3.2.14 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria .................................. 59

3.2.15 Avaliação da atividade antitumoral da vitafisalina F

em camundongos ...................... 60

3.2.15.1 Achados Histopatológicos ..................................................................................... 62

4 RESULTADOS ............................................................................................................... 64

4.1 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro – MTT .......................... 64

4.2 Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro – Alamar Blue................ 66

4.3 Avaliação da atividade antiproliferativa em células leucêmicas (Curva de crescimento

celular) - exclusão por azul de tripan.................................................................................... 66

4.4 Avaliação da atividade genotóxica em células normais e leucêmicas. ............................ 72

4.5 Inibição da síntese de DNA – BrDU.............................................................................. 75

4.6 Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina ................................ 75

4.7 Determinação da ativação da caspase-3......................................................................... 78

4.8 Análise morfológica – Coloração por Hematoxilina/Eosina (H/E) e May-Grunwald-

Giemsa................................................................................................................................. 79

4.9 Determinação da Integridade da Membrana.................................................................. 82

4.10 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA...................................................... 83

4.11 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria ..................................... 87

4.12 Atividade da atividade antitumoral da vitafisalina F em camundongos ......................... 88

4.12.1 Análise histopatológica dos órgãos........................................................................... 90

5 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 98

6 CONCLUSÃO............................................................................................................... 111

REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 113

Introdução

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

A palavra câncer se refere a uma variedade de doenças, em que sua característica

principal é o crescimento descontrolado das células. Existem mais de 100 tipos de câncer, que

diferem de acordo com o tipo de célula, tecido ou órgão em que ocorrem. Geralmente as

células cancerosas levam a formação de uma massa tumoral, podendo essa ser benigna ou

maligna (NATIONAL CANCER INSTITUTE, 2008).

As primeiras descrições sobre câncer em humanos datam de 3000-1500 a.C.

quando foram encontrados sete papiros no Egito, e entre estes, o de George Elbers e o de

Edwin Smith, descreviam oito casos de tumor ou ulceras de mama. (REDDY et al., 2003). No

Egito também foram encontradas as primeiras evidências de tumor em esqueletos de múmias

fossilizadas que viviam na Era do Bronze (1900-1600 a.C.).

Em torno de 460-370 a.C., ao

analisar vários tipos de tumor, Hipócrates comparava a morfologia destes com a forma de um

caranguejo, daí a criação do termo cancer em latim, que se refere ao termo grego karkinus

(caranguejo). O termo câncer foi usado pela primeira vez por Galeno (138-201 d.C.)

(AMERICAN CANCER SOCIETY, 2008).

Hoje em dia o câncer é uma das maiores causas de morte no mundo, atrás apenas

das mortes causadas por doenças cardiovasculares. Em 2005, de um total de 58 milhões de

mortes no mundo, 7,6 milhões (13%) foram causadas por câncer. No Brasil, o número de

mortes causadas por câncer em 2005 foi de 190.000, representando 14,8% do número total de

casos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008).

Para o ano de 2008, estimativas indicam que ocorrerão 466.730 novos casos de

câncer no Brasil, sendo 231.860 para o sexo masculino e 234.870 para o sexo feminino. O

tipo de câncer mais comum, em ambos os sexos, é o de pele não melanoma, com uma

incidência de 114 mil novos casos por ano. Sem levar em consideração o câncer de pele, os

cânceres de próstata, pulmão e estômago são os tipos mais comuns entre os homens (81.000

casos), enquanto que em mulheres os tipos mais comuns são os de mama e colo do útero

(68.000 casos). Apesar do câncer de próstata ter maior incidência entre os homens, o câncer

de pulmão ainda é o tipo que mais mata no mundo (Figuras 1 e 2) (BRASIL, 2007).

Fonte: (BRASIL, 2007)

Figura 1 - Tipos de câncer mais incidentes, estimados para o ano de 2008, na população

brasileira, sem pele não melanoma.

Homens

Mulheres

Fonte: (BRASIL, 2007)

Figura 2 - Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100 mil

homes/mulheres, estimadas para o ano de 2008, segundo a Unidade da Federação (todas as

neoplasias, exceto as de pele não melanoma).

O câncer é considerado uma doença genética, onde o agente carcinógeno quando

incide sobre uma célula normal, causa alterações na molécula de DNA. Essas alterações são

denominadas de mutação. Qualquer célula normal pode sofrer alterações no seu material

genético. Normalmente essa alteração é reparada, ou então a célula entra em processo de

morte. Na verdade, para que a mutação de fato ocorra, é necessário que o DNA alterado seja

replicado e passado para as células filhas. Na carcinogênese, não apenas uma mutação, mas

uma série de eventos acumulados ao longo dos anos é necessária para desencadear esse

processo (CORTNER; WOUDE, 1997).

O processo de carcinogênese inclui a iniciação, promoção e progressão tumoral. O

primeiro estágio envolve o contato entre o agente carcinógeno e o DNA das células, levando a

formação de uma célula transformada. A mutação, por si só, não é capaz de causar câncer,

podendo essa permanecer inativa e levar vários anos para se manifestar. O segundo estágio da

carcinogênese envolve a ação de substâncias promotoras de tumores, como os ésteres de

forbol, que induzem a expressão de genes envolvidos no crescimento celular. Aparentemente,

esses promotores só agem em células que já sofreram algum tipo de mutação e exigem um

contato por um período longo e contínuo para que essas células se tornem malignas. No

terceiro estagio, o de progressão, já começam a aparecer as primeiras manifestações clínicas

da doença, caracterizada pelo crescimento descontrolado das células mutadas e conseqüente

formação do tumor (DONNICI et al., 2005).

As células tumorais possuem defeitos nos mecanismos que regulam a proliferação

celular normal e a homeostase. Esses defeitos podem ser resumidos em seis alterações

características de células tumorais, como: auto suficiência na sinalização de fatores de

crescimento, insensibilidade à sinais para inibição do crescimento, evasão da morte celular

programada (apoptose), potencial de replicação ilimitado, angiogênese e a capacidade de

invasão e metastatização para outros tecidos (HANAHAN; WEINGER, 2000).

Muitas dessas alterações se devem, principalmente, às mutações que ocorrem em

dois tipos de genes especiais, denominados de oncogenes e genes supressores tumorais, os

principais reguladores da proliferação celular (BISHOP, 1987).

Os oncogenes são os responsáveis pelo controle do crescimento celular. Em

células normais os oncogenes, são chamados de proto-oncogenes, que ao sofrerem alguma

mutação passam a ter sua expressão aumentada. Uma característica dos oncogenes é que eles

agem de forma dominante na célula, onde uma mutação em um dos alelos já é suficiente para

alterar o funcionamento normal do gene (BISHOP, 1987). Já os genes supressores tumorais

necessitam que as duas cópias do gene sofram mutação, levando a perda da função destes

(BISHOP, 1987).

Dependendo da necessidade do organismo novas células podem ser formadas, seja

para o reparo de tecidos lesionados ou simplesmente para substituir células velhas e mortas.

Mas as vezes esse processo sofre alterações, e ocorre então a formação de novas células, sem

que estas sejam necessárias, ou então células velhas e/ou danificadas, que deveriam morrer,

por algum motivo não morrem. As mutações nos oncogenes e nos genes supressores tumorais

são as responsáveis por essa alteração no balanço entre proliferação e morte celular.

A proliferação das células dá-se através de uma seqüência ordenada de eventos,

em que ocorrem a duplicação do material genético e posterior divisão em duas células filhas.

Esses dois processos resumem as duas principais fases do ciclo celular, onde ocorre a

duplicação do DNA na fase S (S de síntese), e a divisão celular que ocorre na fase M (M de

mitose) (FISHER et al., 2004). Além dessas duas fases, existe também um intervalo entre as

fases M e S, chamada de fase G1, onde vai ocorrer a síntese de várias enzimas necessárias

para a fase S, e um intervalo entre as fases S e M, que é a fase G

, onde também irá ocorrer a

síntese de proteínas necessárias para a fase M. Assim, o ciclo celular é composto por quatro

fases seqüenciais, as fases G

, S, G

e M. Logo depois da divisão celular, na fase M, as células

podem entrar em um estado de quiescência, também chamada de fase G

onde a taxa

metabólica das células é mantida estável, aguardando por sinais extracelulares que sejam

favoráveis à sua proliferação (GUO; HAY, 1999) (Figura 3).

Ponto de checagem

em G

Mitose

Ponto de checagem

em G

-S

Preparação

para mitose

Síntese de DNA

Crescimento

celular

Figura 3 - Ilustração esquemática das fases do ciclo celular.

A progressão do ciclo celular é controlada por duas famílias de proteínas, as

ciclinas e as quinases dependentes de ciclina (cdks, cyclin dependent kinases). As cdks estão

expressas constitutivamente nas células, e como o próprio nome já diz, elas precisam estar

ligadas às ciclinas para se tornarem ativas. Por outro lado, as ciclinas são sintetizadas e

degradadas em cada fase do ciclo celular, de modo que o complexo ciclina-cdk se torne

específico pra cada uma dessas fases (COLLINS et al., 2005) (Figura 4).

Os fatores de crescimento estimulam a entrada das células no ciclo celular através

do aumento dos níveis da ciclina D, que se ligam as cdks 4 e 6, no início da fase G

. A ligação

da ciclina E a cdk2 promove a passagem da fase G

para a fase S. Durante a fase S a ciclina A

está ligada a cdk2, e na transição para G

se liga a cdk1. A ligação da ciclina B com a cdk1

surge no final da fase G

e continua até a entrada da célula em mitose (LUNDBERG;

WEINBERG, 1999).

Os complexos ciclinas-cdks controlam o ciclo celular através da regulação dos

chamados pontos de checagem (checkpoints). Qualquer dano no DNA e/ou mal

funcionamento de organelas e estruturas essenciais para o ciclo celular, ocasionam o atraso ou

a parada desse ciclo, para que o defeito possa ser reparado, caso contrario a célula entraria em

processo de morte (LUNDBERG; WEINBERG, 1999).

Ciclina A

cdk 2 e 1

Ciclina E

cdk 2

Ciclina B

cdk 1

Ciclina D

cdk 4 e 6

Figura 4 - Ilustração esquemática das fases do ciclo celular e respectivas ciclinas e cdks.

1.2 Plantas medicinais com atividade anticâncer

A milhares de anos, os produtos naturais vêm sendo utilizados na prevenção e

cura de doenças. Esses produtos naturais têm se originado de diversas fontes, incluindo um

grande número de plantas, animais e microorganismos (NEWMAN et al., 2000).

No período de 1981 a 2007, de todas as novas entidades químicas aprovadas pelo

‘US Food and Drug Administration (FDA), 63 % eram produtos naturais, derivados de

produtos naturais ou eram moléculas sintéticas com estruturas semelhantes as dos produtos

naturais, e muitos destes de grande valor agregado devido às suas aplicações como

medicamentos e cosméticos. (NEWMAN; CRAGG, 2007). Nos anos de 2001 e 2002,

aproximadamente 25 % dos medicamentos mais vendidos no mundo eram produtos naturais

ou derivados destes (BUTLER, 2004). Um estudo realizado, analisando as prescrições dos

médicos, mostrou que o uso desses medicamentos pode ser utilizado no tratamento de 87 %

de todas as doenças humanas como agentes antimicrobianos, anticâncer, anticoagulantes,

antiparasitários, entre outros (NEWMAN et al., 2003).

Na área do cancer, esses compostos tem sido de fundamental importancia, já que

60 % dos medicamentos anticancer utilizados na clínica sao de origem natural (NEWMAN,

2003). Dentre as diversas fontes de produtos naturais, as espécies vegetais têm contribuído de

forma bastante significativa para o fornecimento de novos compostos anticâncer. Entre esses

compostos estão a vimblastina, vincristina, os derivados da camptotecina, topotecan e

irinotecan, etoposideo derivado da podofilotoxina e o paclitaxel (Taxol®) (CRAGG;

NEWMAN, 2005).

A vimblastina (1) e a vincristina (2) foram isoladas da planta Catharanthus

roseus, conhecida como “pervinca” de Madagascar, pertencente a família Apocinaceae, que

durante anos vinha sendo utilizada na medicina popular por possuir vários efeitos

farmacológicos (Fig. 5). Peckolt (1910) reportou que, no Brasil, a infusão das folhas era

utilizada em dores de dente, no controle da hemorragia e na limpeza de ferimentos. Outras

espécies relacionadas também possuíam seu uso medicinal, como no tratamento de úlcera

diabética (NOBEL, 1958 apud JOHNSON et al., 1960)

como hipoglicemiante oral,

antimicrobiano e antihipertensivo (CHOPRA, 1959 apud JOHNSON et al., 1960).

Na década de 1950, Clark e Robert Nobel se interessaram pelas propriedades

farmacológicas da C. roseus, já que na Jamaica, na falta de insulina, as folhas da planta eram

utilizadas no tratamento da diabetes (CHOPRA, 1959 apud JOHNSON et al., 1960). Os

cientistas então observaram que quando os ratos eram tratados com extratos da planta C.

roseus para o tratamento de diabetes melitos, estes apresentavam granulocitopenia e

mielossupressão. Depois daí, Clark e Robert junto com o químico Charles T. Beer e Gordon

Svoboda, da indústria farmacêutica Lilly, conseguiram isolar dois alcalóides, a

vincaleucoblastina e a leurocristina, que depois tiveram seus nomes mudados para vimblastina

e vincristina respectivamente (Figura 5) (SVOBODA, 1961 apud JOHNSON et al., 1960).

Logo depois mais dois novos compostos foram semi-sintetizados, vindesina (3) e vinorelbina

(4) (Figura 5), que já fazem parte do tratamento quimioterápico do câncer, e mais

recentemente vinflunine, que está em estudos clínicos de fase 3 na Europa (FAHY et al.,

1997; KRZAKOWSKI et al., 2007).

Os alcalóides da vinca se ligam à tubulina, impedindo a polimerização dos

microtúbulos e conseqüente formação do fuso mitótico, resultando na parada do ciclo celular

durante a mitose.

Vimblastina (1) – R

= CH

; R

= CO

; R

= OCH

; R

= OH

Vincristina (2) – R

= COH; R

= CO

; R

= OCH

; R

= OH

Vindesina (3) – R

= CH

; R

= CONH

; R

= OH; R

= OH

Vinorelbina (4) – R

= CH

; R

= CO

; R

= OCH

; R

= H

Figura 5 - (A) Catharanthus roseus e (B) estruturas químicas da vimblastina (1) vincristina

(2), vindesina (3) e vinorelbina (4).

Podofilotoxinas são lignanas encontradas principalmente em plantas do gênero

Podophyllum (Podophyllaceae), que há séculos vem sendo utilizado devido suas propriedades

medicinais. Catersby, em 1731, foi o primeiro a descrever sobre plantas do gênero

Podophyllum, onde relata que a planta Podophyllhum peltatum L., também conhecida como

“mandrágora”, era utilizada pelos índios americanos devido a seus efeitos eméticos, catárticos

e anti-helmínticos (IMBERT, 1998)

A podofilotoxina (5) atua ao inibir a polimerização dos microtúbulos e também

a topoisomerase II (Fig. 6) (CORTESE et al., 1977). Com o pensamento de que a

podofilotoxina pudesse ser usada para o tratamento do câncer, vários ensaios clínicos foram

realizados, mas os efeitos tóxicos causados no sistema gastrintestinal não deixavam os

estudos irem adiante. Foi então que, à procura por derivados menos tóxicos, várias alterações

foram feitas na estrutura da podofilotoxina, levando a obtenção de dois compostos semi-

sintéticos, o VP-16 e o VM-26, que depois tiveram seus nomes modificados para etoposideo

(6) e tenoposideo (7), respectivamente (Figura 6) (STAHELIN et al., 1991). Essas

modificações também alteraram o mecanismo de ação desses dois compostos, que passaram a

possuir somente a atividade inibitória sobre a topoisomerase II, já que o anel trimetoxilado da

podofilotoxina, responsável pela ação sobre a tubulina, tinha um dos seus grupamentos

substituídos por uma hidroxila (SRIVASTAVA et al., 2005).

O etoposídeo (Vepesid) possui uma atividade de amplo espectro, se mostrando

ativo em uma grande variedade de cânceres, como: câncer de testículo, carcinoma de ovário,

diferentes tipos de câncer de pulmão, leucemias, linfomas, sarcomas, melanomas e câncer de

colon. O tenoposídeo (Vumon), que é mais potente que o etoposídeo, também possui um

amplo espectro de atividade, se mostrando ativo contra cânceres de cérebro, leucemia

linfocítica e linfoblástica, mieloma e linfoma non-Hodgkin (GORDALIZA et al., 2000).

OCH

Podofilotoxina (5) Etoposídeo (6) – R = CH

Tenoposídeo (7) – R =

Figura 6 - (A) Podophyllhum pelpatum L e (B) estruturas químicas da podofilotoxina, (5),

etoposídeo (6) e tenoposídeo (7).

A camptotecina (8) é um alcalóide isolado da Camptotheca acuminata, planta

nativa da China, também conhecida como “planta do amor” (WALL et al., 1966) (Fig. 7).

Esse composto logo despertou o interesse dos cientistas, por possuir forte efeito contra a

linhagem leucêmica L1210 de ratos (in vivo), mas logo apareceram problemas com a

insolubilidade da droga em água. Em 1970 alguns ensaios clínicos foram realizados com a

droga sendo solubilizada em solução salina, mas os efeitos observados não foram os mesmos

(GOTTLIEB et al., 1970). Em seguida, através de estudos de estrutura-atividade, descobriu-se

que um anel de lactona era importante para o seu efeito antitumoral, e que este estava sendo

quebrado quando a droga era dissolvida em solução salina, diminuindo o seu efeito e

aumentando sua toxicidade (MUGGIA et al., 1972). Em 1974 a camptotecina foi retirada dos

ensaios clínicos.

O interesse pela camptotecina voltou em 1985, quando descobriram que a enzima

topoisomerase I era o seu principal alvo na célula. As topoisomerases (tipo I e tipo II) são

enzimas responsáveis pelo relaxamento do DNA, e a camptotecina se liga a esse complexo

DNA-topoisomerase, deixando-o estável, e impedindo que as duas fitas do DNA se separem e

possam então ser replicadas e transcritas (HSIANG et al., 1985). Até então, a camptotecina

não era utilizada na clínica devido sua baixa solubilidade em água, mas algumas modificações

estruturais levaram a descoberta de dois análogos solúveis em água, o irinotecan (9)e o

topotecan (10) (SAWADA et al., 1991; KINGSBURY et al., 1991) (Figura 7).

Em 1996 o uso do topotecan (Hycantin, GlaxoSmithKline) foi aprovado pelo

FDA para uso na terapia contra câncer de ovário, e em 2000 o irinotecan (Camptosar, Pfizer)

foi aprovado para o uso no tratamento de câncer cólon retal (ULUKAN; SWAAN, 2002).

Camptotencina (8) – R

= H; R

= H

Topotecan (9) – R

= H; R

C N

Irinotecan (10) - R

N N

; R

= CH

Figura 7 - (A) Camptotheca acuminata e (B) estruturas químicas da camptotecina (8),

topotecan (9) e irinotecan (10).

O paclitaxel (Taxol



) (11), um diterpenoide isolado da planta Taxus brevifolia

Nutt. (Taxaceae), surgiu de um programa de “screening”, do NCI, em busca por novos

compostos com potencial atividade anticâncer (Figura 8). O paclitaxel foi isolado na sua

forma pura, pela primeira vez, em 1966, e em 1971 teve sua estrutura elucidada (WANI et al.,

1971). Apesar de, na época, o paclitaxel ter mostrado resultados promissores, alguns

problemas o impediam de entrar para os ensaios pré-clínicos. Um deles era o baixo

rendimento da substância pura que era extraído da planta, já que eram precisas mais de 4000

árvores para a obtenção de apenas 360g de taxol, e que seriam necessários mais 38000 árvores

para que se pudesse obter 25Kg de taxol para os testes clínicos. Isso gerou uma série de

discussões, tanto na população como entre os próprios cientistas, que questionavam entre a

conservação da natureza e o direito dos pacientes de receberem um novo tratamento, já que o

taxol era supostamente uma droga em potencial para se tornar um quimiterápico no

tratamento do câncer. Outro problema era o fato da estrutura do taxol ser bastante complexa

para que pudesse então ser sintetizada, além do fato de ser pouco solúvel em água. Apesar

desses problemas, os cientistas persistiram em testar o taxol em várias linhages de tumor

sólido de humanos, em ratos imunossuprimidos, incluindo linhagens de cólon e mama. Os

resultados desses testes foram impressionantes, o que fez com que os estudos se estendessem,

já prevendo o início dos ensaios clínicos (KINGSTON, 2007).

Em 1979, ocorreu uma das mais importantes descobertas na história do

desenvolvimento do paclitaxel, quando Susan Horwitz descobriu que esse composto agia

como um promotor da polimerização da tubulina (SCHIFF et al., 1979), o que despertou

ainda mais o interesse dos pesquisadores, já que outras drogas como a vinblastina e a

vincristina agiam justamente de modo oposto, inibindo a polimerização da tubulina

(ZAVALA et al., 1978)

Durante a década de 1980, o paclitaxel entrou para os testes clínicos de fase I, II e

III, o que levou a descoberta de seu potente efeito contra câncer de ovário. A partir daí mais

recursos eram necessários para tornar o paclitaxel em uma droga comercial, mas como isso

não era possível para o NCI, a droga foi entregue para uma indústria farmacêutica (Bristol-

Myers Squibb) por intermédio de uma cooperação (Cooperative Research and Development

Agreement- CRADA), e como o paclitaxel ainda não havia sido patenteado, foi concedida à

BMS 7 anos de exclusividade na comercialização do taxol (WALL; WANI, 1995)

No início da década de 1990, a dificuldade na obtenção de quantidade

suficiente de taxol foi resolvida, quando Portier e colaboradores conseguiram isolar da planta

Taxus baccata, uma planta abundante na Europa, o composto 10-diacetilbacatina, que podia

ser convertido em paclitaxel. Essa foi a planta escolhida pela BMS para a obtenção de

paclitaxel, em vez da T. Brevifolia (KINGSTON, 2007). A partir de então, várias alterações

foram feitas na estrutura do taxol em busca de compostos mais potentes, o que acabou

levando a descoberta do docetaxel (12), que logo entrou para os ensaios clínicos de fase I, e

em 1996 foi aprovado pelo FDA para o tratamento de câncer de mama, com o nome

comercial de Taxotere



(KINGSTON, 2007) (Figura 8).

OHR

AcO

OOH

ONHR

Paclitaxel (11) – R

= ; R

= COCH

Docetaxel (12) - R

= OC(CH

); R

= H

Figura 8 - (A) Taxus baccata e (B) estruturas químicas do paclitaxel (11) e docetaxel (12).

Com o passar dos anos, várias técnicas vem sendo utilizadas para a obtenção de

novos compostos, e os resultados dessas é o desenvolvimento de novas drogas com potencial

anticâncer. O grande problema desses compostos é a dificuldade de serem sintetizados, e de,

na maioria das vezes, apresentarem efeitos adversos severos, já que não possuem seletividade

pelas células tumorais e acabam que atingindo também as células normais.

Embora um grande número de drogas anticâncer, a partir de plantas ou derivados

deles, tenha sido desenvolvido, a busca por drogas mais seguras, econômicas e mais eficazes

ainda é um desafio.

1.3 Vitaesteróides

Os vitaesteróides constituem uma classe de lactonas esteroidais, pois possuem

uma função lactona em C

, com estruturas baseadas no esqueleto de ergostano. A estrutura

desses compostos é polioxigenada, o que leva as alterações naturais das cadeias carboxílicas e

também das cadeias laterais, resultando em diversos compostos com características estruturais

bem complexas (VERAS et al., 2004a). Devido a sua grande diversidade estrutural os

vitaesteróides foram subdivididos em seis grupos principais: vitanolídeos, vitafisalinas,

acnistinas, ixocarpalactonas, perulactonas e fisalinas (Figura 9).

Esses compostos têm sido isolados principalmente de plantas da família

Solanaceae, mas também das famílias Taccaceae e Leguminosae (LIU et al., 2006), assim

também como de alguns organismos marinhos (KSEBATI; SDCHMITZ, 1988). Os

vitaesteróides são os compostos mais abundantes em vários gêneros da família Solanaceae,

como: Physalis, Acnistus, Withania, Datura, Discopodium, Iochroma, Dunalia e Vassobia

(VERAS et al., 2004a).

Varias atividades biológicas tem sido atribuída aos vitaesteróides, como:

antiinflamatório (JAYAPRAKASAM; MURALEEDHRAN, 2003; WUBE et al., 2008)

imunossupressor (SOARES et al., 2003; 2006), antiparasitário (CHOUDHARY et al., 2006,

CARDONA et al., 2006; VIEIRA et al., 2008), anticolinesterásico (RIAZ et al., 2004;

CHOUDHARY et al., 2005), antimicrobiano (JANUÁRIO et al., 2002; SHANAZBANU et

al., 2006), citotóxica (ROCHA et al., 2006; HSIEH et al., 2007; MAGALHÃES et al., 2006a)

e antitumoral (DEVI et al., 1995; MAGALHÃES et al., 2006b).

HO O

Perulactona Fisalina

O O

Vitanolideo Vitafisalina

O O

Acnistina Ixocarpalactona

Figura 9 - Estruturas químicas básicas dos sete grupos de vitaesteróides.

1.4 Acnistus arborescens L. Schlecht

Acnistus arborescens L. Schlecht (sinonímia: Acnistus frutescens Bello, Atropa

arborescens L., Cestrum cauliflorum (Jacq.), Cestrum macrostemon Sassé & Moç., e Dunalia

arborescens (L.) Sleumer) é uma planta nativa das Américas do Sul e Central, sendo também

encontrada no México e nas Antilhas. No Brasil é encontrada principalmente na flora

nordestina, onde também é conhecida pelos nomes de “mariana”, “marianeira” e ”esporão de

galo de falso” (BARATA et al., 1970).

É uma árvore relativamente rara, ocasionalmente utilizada como planta

ornamental e cerca viva, já que, em sua idade adulta, se apresenta tanto na forma de arbusto

como de árvore de pequeno porte. As flores são pequenas, de cor branca e tons esverdeados, e

possui frutos amarelos semelhantes a pequenos tomates, podendo ser de cor alaranjada. A

época de floração e frutificação da A. arborescens varia de acordo com o local de origem, mas

ocorre geralmente entre os meses de maio e setembro (Figura 10).

A A. arborescens é uma planta de importante valor medicinal, sendo

popularmente utilizada no tratamento de câncer, hemorróidas e doenças relacionadas ao

fígado e baço, assim também como diurético (NITTALA; LAVIE, 1981). A maioria desses

efeitos farmacológicos é atribuída à presença dos vitaesteróides.

O primeiro relato sobre as propriedades farmacológicas dessa planta, foi quando

Kupchan et al. (1965), observaram que o extrato etanólico da A. arborescens possuía

atividade antitumoral (in vitro) em células de carcinoma de epiderme nasofaríngea de

humanos e (in vivo) em sarcoma 180 em camundongos. Logo depois, Kupchan et al. (1969)

isolaram dois compostos desse extrato, a vitaferina A (13) e a vitacnistina (14), as quais foram

atribuídas os efeitos antitumorais do extrato.

Desde então, poucos estudos haviam sido feitos com a A. arborescens, até que

Minguzzi et al. (2002) reportaram o isolamento de três vitanolideos (15, 16 e 17) dessa planta

e seus respectivos efeitos citotóxicos em várias linhagens tumorais (mama, pulmão, cólon,

carcinoma nasofaríngeo e próstata) (Figura 11).

Veras et al. (2004a, 2004b), reportou, pela primeira vez, o isolamento e os efeitos

citotóxicos de cinco vitafisalinas (18, 19, 20, 21 e 22) das folhas de A. arborescens. A

diferença básica entre esses compostos e os vitanolídeos é a presença de um anel lactonico de

cinco membros nas vitafisalinas (Figura 11).

Figura 10 - Acnistus arborescens L. Schlecht (Fotografadas por: Prof. Dr. Edilberto Rocha

Silveira)

O O

13 R = R

-OH; R

= R

= H 18 R = OEt; R

= H; ∆

14 R =

-OH; R

= OAc; R

= R

= H 19 R = β-OH; R

= H (18R); ∆

15 R = R

= OH; R

-OAc; R

= R

= H 19a R = H; R

= α-OH (18S); ∆

16 R = R

= OH; R

-OAc; R

= R

= H 20 R = O; ∆

17 R

-OAc; R

-OH; R = R

= R

= H 21 R = O

22 R = β-OH; R

= H (18R)

22a R = H; R

= α-OH (18S)

Figura 11 - Estruturas dos compostos Vitaferina A (13), Vitacnistina (14), 7β-

Acetóxivitanolido D (15), 7β,16α-Diacetóxivitanolido D (16), 4-Deóxi-7β,16-α-

diacetóxivitanolido D (17), Vitafisalina O (18), Vitafisalina F (19), Vitafisalina M (20),

Vitafisalina N (21) e Vitafisalina (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2-diepóxi-4β,18-diidróxi-1-

oxovita-3-24-enolido (22) isolados da A. arborescens.

Objetivos

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar as atividades citotóxica e antitumoral das vitafisalinas O, F, M, N e

(17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2-diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido isoladas da

planta Acnistus arborescens L. Schlecht em modelos experimentais in vitro e in vivo.

2.2 Específicos

- Determinar e comparar as atividades citotóxicas das vitafisalinas O, F, M, N e

(17S,20R,22R) - 5β,6β: 18,20-2- diepóxi-4β,18- diidróxi-1- oxovita-3-24- enolido em células

tumorais e normais (PBMC).

- Avaliar o mecanismo de ação das vitafisalinas O, F, M e N utilizando células da

linhagem HL-60 e K-562 como modelo.

- Avaliar a atividade antitumoral in vivo da vitafisalina F em camundongos (Mus

musculus) Swiss transplantados com o tumor Sarcoma 180.

- Analisar as características histopatológicas dos orgãos (rim, figado e baço) de

camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados por 7

dias com a vitafisalina F.

Materiais e Métodos

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Equipamentos

Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2

Agitador de tubo, Donner AD 8850

Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di

Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212

Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206

Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403

Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin

Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte mini

Espectrofotômetro de placa DTX-880, Beckman Coulter

Fluxo laminar, VECO

Incubadora de células, (CO

Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow

High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek 3000,

Beckman Coulter

Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070

Microondas, Panasonic

Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot

Microscópio de fluorescência, Olympus

Micrótomo, Slee Mainz

pHmetro, Micronal B474

Pipetas automáticas, Gilson

Sistema de Eletroforese Horizontal mini Submarine, Amersham Biosciences

Soluções, Reagentes e Fármacos

Ácido Acético - Vetec

Ácido Clorídrico

- Vetec

Álcool Etílico

70 % Vetec

Agarose 1 %

0,5 g de agarose

Água deionizada q. s. p. 50 mL

FMC -

Bioproducts

Agarose LMP 1,5 %

1,5 g de agarose

PBS q. s. p. 100 mL

Gibco®

Agarose NMP 0,5 %

0,5 g de agarose

PBS q. s. p. 100 mL

Gibco®

Alamar Blue

0,3 mg/mL Sigma®

1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma®

Anticorpo anti-BrdU

BSA 5 % q.s.p. 500 µL de solução Dako

Anticorpo biotinilidado anti-

imunoglobulina de camundongo

1 µL de anticorpo anti-imunoglobulina

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução

Sigma®

10 mg de azul de tripan Sigma®

Azul de tripan 10%

PBS q.s.p. 100 mL de solução -

BrdU 10mM

- Sigma®

1mg de brometo de etídeo Sigma®

Brometo de Etídio 100 µg/mL

PBS q.s.p 10 mL de solução -

Citrato de Sódio - Grupo Química

Cloreto de Sódio (NaCl)

- Labsynth®

5 µL de DAB

Immunotech

1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05M) pH= 7,6

Proquímios

Diaminobenzidina (DAB)

2 µL de H

Proquímios

Dimetilsulfóxido (DMSO) - Vetec®

Doxorrubicina –

fornecida pelo Instituto do

Câncer do Ceará – ICC

2,5 mg/mL

Zodiac®

EDTA - Qeel

0,5 g de Eosina

Doles

80 mL de Álcool etílico Vetec

0,5 mL de Ácido acético Vetec

Eosina 0,5%

20 mL de H

O -

0,2 g Eosina-Azul de Metileno

(May-Grunwald) Metanol q.s.p. 100 mL de solução

Reagen

Estreptavidina – peroxidase 1 µL de Estreptavidina – peroxidase Sigma®

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução Dako®

Ficoll - Sigma®

Fitohemaglutinina - Sigma®

Formaldeído 10 %

100 mL de formaldeído

O q. s. p. 1 L

Dinâmica®

Giemsa - Bioclin

0,5 g de Hematoxilina Doles®

10 mL de Glicerina Labsynth®

25 g de Sulfato de alumínio Labsynth®

0,1 g de Iodeto de potássio Labsynth®

Hematoxilina 0,1%

O q.s.p. 500 mL de solução -

Hidróxido de Sódio (NaOH) - Vetec®

1 mg de iodeto de propídeo Boehringer©

PBS q.s.p. 50 mL

Iodeto de propídeo 50 µg/mL

1 g de laranja de acridina (100 µg/mL) Fluka®

Laranja de Acridina

O q.s.p. 10 mL de solução -

Meio de cultura de células

RPMI 1640

Diluído em água deionizada e

esterelizada, filtrado em filtro millipore

(0,22 µm) e complementado com SBF

10 %, 1 % de glutamina, 1 % de

antibióticos, 1 % de bicarbonato de

sódio (0,75 %) e 25 mM de HEPES

Cultilab®

20 mg de MTT Sigma®

MTT

PBS q.s.p. 100 mL de solução -

N-Lauroylsarcosine - Sigma®

Penicilina 10.000 U.I./mL Cultilab®

Penicilina – estreptomicina

Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab®

Ringer-lactato

Cloreto de Sódio = 0,600g

Cloreto de Potássio = 0,030g

Cloreto de Cálcio 2H

O = 0,020g

Lactato de Sódio = 0,30g

Água q. s. p. 100 mL

Laboratórios

Biosintética®

Sulfato de Gentamicina -

Gentamicin

Novafarma®

Solução de Eletroforese

EDTA 1mM, NaOH 300 mM,

pH > 13

Solução de Lise

NaCl 2,5M, EDTA 100mM

Tris 10mM, N-Lauroyl sarcosine 1%

pH = 10, Triton X-100 1 %, DMSO 10

Solução de Neutralização Tris 0,4 M, pH = 7,5

Solução desnaturante

(para análise de incorporação de

BrdU)

Formamida 70 %

2x SSC (pH entre 6,5 e 7,5 a 70 °C)

Vetec®

Soro fetal bovino - Cultilab®

8,5 g de Cloreto de sódio (0,85 %) Labsynth®

1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) Reagen® Solução salina (para hemólise)

O q.s.p 1 L de solução -

SSC 10X

Cloreto de sódio 1,5 M

Citrato de sódio 0,15 M

Tampão de corrida 50 X (TAE)

242 g de TRIS

57,1 mL de ácido acético glacial

100 mL de EDTA 0,5 M

Tampão fosfato (PBS) 8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®

2,14 g de NaHPO4.7H

O Labsynth®

0,276 g de NaHPO4.H

0 Labsynth®

0 q.s.p. 1 L de solução (pH = 7,2) -

Tampão Tris (TBS) 10X Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®

Tris 0,5 M (pH= 7,6)

Proquímios®

O -

50 mL de Tripsina 2,5 % Cultilab®

0,125 g de EDTA Proquímios®

Tripsina 0,25%

450 mL de PBS -

Triton X -100 - Isofar

Xilol 10 %

100 mL de formaldeído

O q. s. p. 1 L

Dinâmica®

- -

Vitafisalina O - -

Vitafisalina F - -

Vitafisalina M - -

Vitafisalina N - -

Vitafisalina (17S,20R,22R)-

5β,6β:18,20-2.diepóxi-4β,18-

diidróxi-1-oxovita-3.24-enolido

- -

5- Fluorouracil 2,5 mg/1 mL

ICN

Farmacêutica®

Modelos biológicos

Camundongos albinos (Mus musculus) da linhagem Swiss

Linhagens celulares tumorais mantidas em cultura (Tabela 1)

Células mononucleadas de sangue periférico isoladas de voluntários sadios

3.2 Métodos

3.2.1 Obtenção das vitafisalinas

As folhas de A. arborescens foram coletadas em maio de 2004 na localidade de

Pico Alto, na Serra de Guaramiranga (Ceará). O material botânico foi identificado pelo Prof.

Edson P. Nunes do Departamento de Biologia – UFC, e encontra-se depositado no Herbário

Prisco Bezerra (EAC), sob nº 30.513. As folhas secas e trituradas (3,7 kg) foram extraídas

com EtOH à temperatura ambiente (2 × 8 L), em seguida o solvente foi evaporado sob

pressão reduzida resultando em 170 g de um extrato viscoso e escuro, o qual foi submetido a

fracionamento cromatográfico empregando gel de sílica com adsorvente e n-hexano (18,1 g),

(48,6 g), AcOEt (29,7 g) e MeOH (42,0 g) como eluentes.

Todas as frações foram avaliadas quanto à citotoxicidade frente a um pequeno

painel de células tumorais (Lu1-pulmão, LNCaP-próstata e MCF-7-mama), entretanto, apenas

a fração obtida por eluição com CH

mostrou atividade, sendo a mesma escolhida para dar

continuidade aos estudos. Esta fração foi submetida a sucessivos métodos clássicos de

cromatografias, resultando no isolamento das vitafisalinas O (18), F (19), M (20), N (21) e

(17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2.diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3.24-enolido (22) (VERAS et

al., 2004a; VERAS et al., 2004b; ROCHA, et al., 2006).

3.2.2 Cultivo das células

Nesse trabalho foram utilizados dois tipos de linhagem celular, as linhagens em

suspensão (HL-60 e K-562) e as linhagens aderidas (MDAMB-435, PC-3, SF-295 e NCI-

H460), todas obtidas através de doação do Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos

(Bethesda, MD) (Tabela 1). As células eram cultivadas em frascos plásticos para cultura

(Corning, 25 cm

, volume de 50 mL para células aderidas e 75 cm

, volume de 250 mL para

células em suspensão), utilizando o meio de cultura RPMI 1640 complementado com 10% de

soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas

em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO

e 95 % de umidade, seguido da observação do

crescimento celular com ajuda de microscópio de inversão a cada 24 horas.

Tabela 1 - Linhagens celulares tumorais utilizadas nos ensaios de citotoxicidade in vitro.

Linhagem Celular Tipo Histológico do Câncer/Origem

Concentração de

Plaqueamento

(céls/mL)

HL-60 Leucemia promielocítica humana 0,3 x 10

K-562 Leucemia mielocítica crônica humana 0,3 x 10

MDA-MB 435 Carcinoma de mama humano 0,1 x 10

PC-3 Carcinoma de próstata humano 0,1 x 10

SF-295 Glioblastoma humano 0,1 x 10

NCI-H460 Carcinoma de pulmão humano 0,1 x 10

3.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro – MTT

A citotoxicidade das vitafisalinas F, O, M, N e (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-

2.diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3.24-enolido foram avaliadas, através do método do MTT,

utilizando as seguintes linhagens tumorais: HL-60 (leucemia), MDAMB-435 (mama), PC-3

(próstata), SF-295 (sistema nervoso central) e NCI (pulmão).

O método consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-

(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium (MTT), de cor amarela, para o

formazan, composto de cor azul. Essa conversão do MTT em formazan só ocorre em células

viáveis e metabolicamente ativas, através da ação da enzima succinil-desidrogenase presente

nas mitocôndrias, o que permite desta forma a quantificação indireta da porcentagem de

células vivas (MOSMANN, 1983).

Procedimento experimental

As células em suspensão ou monocamadas foram plaqueadas em placas de 96

poços numa densidade de 0,3 x 10

células/mL, para células em suspensão e 0,1 x 10

células/mL para células aderidas. As vitafisalinas F, O, M, N e (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-

2.diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3.24-enolido foram incubadas juntamente com as células

durante 72 horas, em concentrações variando de 0,76 a 50 µM, em estufa a 37°C com

atmosfera de 5% de CO

e 95 % de umidade. Após o período de incubação, as placas foram

centrifugadas (1500 rpm / 15 min.) e o sobrenadante foi descartado. Em seguida em cada poço

foi adicionado 200 µL da solução de MTT (10% em meio RPMI 1640), e novamente

incubada por mais 3 horas. Após esse período, as placas foram centrifugadas (3000 rpm/10

min.) e tiveram o sobrenadante descartado, permanecendo somente o precipitado azul de

formazan. O precipitado foi então ressuspendido em 150 µL de DMSO e agitado por cerca de

10 minutos até sua completa dissolução. Para a quantificação do sal de MTT reduzido, as

absorbâncias foram medidas no espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de

595nm.

Análise dos dados

Os compostos foram testados em diluição seriada, em duplicata ou triplicata, e

suas CI

(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e

respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) foram determinados a partir de

regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 4.0 (GraphPad Software).

3.2.4 Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro – Alamar Blue

A citotoxicidade das vitafisalinas F, O e N, em células normais, foi avaliada

através do ensaio do alamar blue, utilizando células mononucleadas de sangue periférico

humano (PBMC - Peripheral blood mononuclear cells), que inclui linfócitos e monócitos. O

alamar blue, recentemente identificado como resazurina (O'Brien et al., 2000), é um indicador

fluorescente/colorimétrico, onde em sua forma oxidada apresenta uma coloração azul (não

fluorescente/célula não viável) e em sua forma reduzida uma coloração rósea

(fluorescente/célula viável). Assim como o MTT, o alamar blue reduz-se em células vivas, e

assim pode ser quantificado e utilizado para avaliar a viabilidade celular.

Procedimento experimental

As células mononucleadas foram obtidas do sangue periférico de voluntários

sadios após centrifugação em gradiente de Ficoll. As células foram removidas, lavadas com

tampão fosfato e ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal

bovino, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL estreptomicina para uma concentração final de

final 3 x 10

cels/mL. Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada para induzir a proliferação dos

linfócitos. Após 24 horas de incubação das células, as vitafisalinas F, O e N foram

adicionadas em cada poço durante 72 horas, em concentrações variando de 0,76 a 50 µM, em

estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO

e 95 % de umidade. Vinte e quatro horas antes de

completar o período de incubação, 10 µL da solução estoque (0,312 mg/mL) de alamar

blue foram adicionados em cada poço. Após 72 horas de incubação as absorbâncias foram

medidas no espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 570 nm (reduzido) e 595

nm (oxidado).

Análise dos dados

A proliferação celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % proliferação

= A

– (A

x R

) x 100. Onde, A

e A

são as absorbâncias no menor e maior

comprimento de onda, respectivamente. O R

foi calculado utilizando a seguinte fórmula:

=AO

/AO

. Onde, AO

e AO

são as absorbâncias do meio adicionado ao alamar

blue subtraído das absorbâncias do meio isolado nos comprimentos de onda menor e maior,

respectivamente. Os compostos foram testados em diluição seriada, em duplicata ou triplicata,

e suas CI

(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e

respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) foram determinados a partir de

regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 4.0 (GraphPad Software).

3.2.5 Avaliação da atividade antiproliferativa em células leucêmicas (Curva de

crescimento celular) - exclusão por azul de tripan

Este ensaio consiste em avaliar a cinética de crescimento de células leucêmicas

(HL-60 e K562) tratadas com as vitafisalinas F, O, M e N e assim poder avaliar o efeito de

várias concentrações destas em relação ao tempo de incubação.

O corante azul de tripan permite a distinção individual das células viáveis das

não-viáveis, onde o corante penetra em todas as células, porém somente as células viáveis

conseguem bombear o tripan pra fora, fazendo com que as células mortas apresentem uma

coloração azulada.

Procedimento experimental

Células das linhagens HL-60 e K-562 foram plaqueadas em placas de 24 poços,

na concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas com as vitafisalinas F, O, M e N nas

concentrações de 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 µM. Após cada período de incubação (3, 6, 12, 24, 36, 48,

60 e 72 horas) era retirada uma alíquota de 90 µL da suspensão de células e adicionado a 10

µL do azul de tripan. Em seguida uma alíquota de 10 µL foi colocada em uma câmara de

Newbauer e as células diferenciadas e contadas em viáveis e não viáveis.

Análise dos dados

O valor obtido para cada contagem foi plotado em um gráfico e construído uma

curva com as variáveis: porcentagem de células viáveis x log da concentração, para cada

tempo analisado, para a observação da cinética de crescimento das células tratadas. Foram

determinados também suas CI

(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do

efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de

regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 4.0 (GraphPad Software). Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os valores

das CI

foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido do teste Student-

Newman-Keuls, com nível de significância de 5 % (p < 0,05).

3.2.6 Avaliação da atividade genotóxica em células normais e leucêmicas.

O teste do cometa é um método simples, rápido, econômico e sensível que

permite a detecção de dano em DNA em células individualizadas. Ao expor a célula ao

composto para avaliação do possível efeito genotóxico, o dano pode ser visualizado através da

realização de uma eletroforese em lâmina, onde, fragmentos das fitas de DNA carregadas

negativamente começam a migrar afastando-se do núcleo, em direção ao anodo. Quando

corados com brometo de etídeo, cada núcleo e sua “cauda” de fragmentos associada remetem

a alusão de um cometa. O tamanho da cabeça e o comprimento da cauda são os padrões

avaliados para determinar a intensidade do dano (SINGH et al., 1988).

Procedimento Experimental

O teste do cometa é realizado de acordo como descrito por Singh et al. (1988)

com pequenas modificações (HARTMANN; SPEIT, 1997). Células de HL-60 e PBMC foram

plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas por

24 h com as vitafisalinas O, M e N nas concentrações de 1.8 e 14.3 µM, 20.1 e 21 µM e 9.6 e

11.8 µM respectivamente. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo.

Após o período de incubação de 24 horas foi retirada uma alíquota de 20 µL de

células, a qual foi adicionada a 110 µL de agarose de baixo ponto de fusão 0,5 % para preparo

das lâminas. As lâminas foram previamente cobertas por solução de agarose de ponto de fusão

normal 1,5 % a 60 °C e mantidas a temperatura ambiente por 24 h até a solidificação da

agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de

baixo ponto de fusão, a qual foi preparada previamente. Em seguida, foram cobertas com

lamínulas (24 x 60 mm) para uniformizar a distribuição das células e mantidas a 4 °C para

solidificação da agarose.

Após solidificação da agarose, a lamínula foi gentilmente removida e a lâmina

mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris, pH 10,0, 1%

Triton-X and 10% DMSO) a 4 ºC e protegida da luz, por no mínimo 1 hora antes da corrida

de eletroforese. Depois de removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas em uma

solução de neutralização (300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH > 13; 4ºC) por 15 minutos e

dispostas horizontalmente na cuba de eletroforese. A cuba foi mantida em banho de gelo para

a manutenção da temperatura em torno de 4 ºC, tendo sido acrescentada a solução de

eletroforese até completa imersão das lâminas.

Antes de iniciar a corrida de eletroforese, as lâminas ficaram em repouso por 20

min para permitir o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição

dos sítios álcali-lábeis. Posteriormente, a eletroforese foi conduzida em baixa luminosidade,

usando 25 V e corrente de 300 mA por 20 min. Após a eletroforese, as lâminas foram

retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização por 5 min, a fim de neutralizar a

alcalinidade. A fixação foi realizada com etanol 100 %. Posteriormente, as lâminas foram

coradas com 50 µl de solução de brometo de etídio (20 µg/mL) e analisadas em microscópio

de fluorescência.

Análise dos dados

A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente

determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (Figura 13). Foram contados

100 cometas por lâmina (n = 4) e classificados dentre as cinco categorias (0, 1, 2, 3 e 4), que

representam a percentagem de DNA na cauda do cometa, indicando o grau de dano sofrido

pela célula:

0 = sem danos ao DNA, portanto, sem cauda (< 5 %)

1 = baixo nível de danos, com a cauda menor que o diâmetro da cabeça (5-20 %)

2 = médio nível de danos, com a cauda representando 1-2x o diâmetro da cabeça

(20-40 %)

3 = alto nível de danos, com a cauda representando mais de 2x o diâmetro da

cabeça (40-95 %)

4 = dano total (> 95 %)

O índice de dano (ID) foi obtido pela seguinte fórmula: ID =

∑

, onde

é o

número de células com nível de dano

(0, 1, 2, 3 ou 4). A freqüência de dano (FD) representa

a porcentagem de células que sofreram danos no DNA.

Os dados foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos

independentes (n = 2). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por

Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).

3.2.7 Inibição da síntese de DNA – BrDU

A bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga a timina. Quando

as células estão sintetizando DNA o BrDU é incorporado no lugar da timina. A detecção do

BrDU incorporado nas células é feita por técnicas imunocitoquímicas, onde se ligam

anticorpos monoclonais e um cromógeno específico, a diaminobenzidina (DAB), que vai

conferir uma coloração marrom ao núcleo das células que incorporaram o BrDU.

(MATSUOKA et al., 1990).

Procedimento Experimental

Células de HL-60 e K562 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na

concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas O, M e N nas

concentrações de CI

(1.8 e 14.3 µM, 20.1 e 21 µM e 9.6 e 11.8 µM, para HL-60 e K-562

respectivamente) e metade da CI

. As concentrações utilizadas foram estimadas a partir dos

valores de CI

50,

encontradas no ensaio da curva de crescimento nestas duas linhagens no

período de 24 h de incubação. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo.

Três horas antes do período de incubação o BrdU (0,01 µM) foi adicionado em cada poço da

cultura de células. Após o período de incubação, lâminas foram preparadas em citocentrífuga

(cytospin) e postas para secar por 2 horas. Após o período de secagem foram fixadas em

metanol: ácido acético (7: 1,5) por 5 minutos. As células foram lavadas com tampão Tris

(TBS) e incubadas em solução desnaturante por 90 minutos a 70

C e pH 7,4. Após uma

segunda lavagem com TBS, as células foram circuladas com caneta hidrofóbica e incubadas

com anticorpo primário e deixadas na geladeira durante a noite em câmara úmida. As células

foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado por 20 minutos e, então, com a solução

de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos. Adicionou-se o cromógeno DAB por 1-5

minutos, o qual foi removido com água destilada. A hematoxilina foi utilizada como

contracorante.

Análise dos dados

Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom

(incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados foram expressos

como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de dois experimentos independentes

(realizados em duplicata). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

grupos, os dados foram comparados pelo teste χ

, utilizando o programa Prism versão 4.0

(GraphPad Software), com nível de significância de 5 % (p < 0,05).

3.2.8 Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina

O método de coloração pelo brometo de etídio / laranja de acridina permite

diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose através da

coloração diferencial por fluorescência com base em alterações morfológicas nucleares e

citoplasmáticas (McGAHON et al., 1995). A laranja de acridina consegue atravessar

membranas celulares intactas e se ligam ao DNA, conferindo uma aparência verde ao núcleo

das células. O brometo de etídio é incorporado principalmente por células com a membrana já

danificada (não viáveis), ligando-se ao DNA e corando-o de laranja. As células viáveis com

membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de verde pela LA. As células em

apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo

(condensação da cromatina) e não são marcadas por BE. Morfologicamente, observam-se

alterações da membrana em decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células

em necrose (lesão de membrana) apresentam um padrão de coloração uniforme, laranja-

avermelhada e não há formação de corpos apoptóticos. Possivelmente, as membranas

plasmáticas permaneçam intactas durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios

quando se tornam permeáveis aos solutos normalmente retidos.

Procedimento Experimental

Células de HL-60e K562 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na

concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas O, M e N nas

concentrações de CI

(1.8 e 14.3 µM, 20.1 e 21 µM e 9.6 e 11.8 µM, para HL-60 e K-562

respectivamente) e metade da CI

. As concentrações utilizadas foram estimadas a partir dos

valores de CI

50,

encontradas no ensaio da curva de crescimento nestas duas linhagens no

período de 24 h de incubação. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo.

Uma alíquota de 1 mL da suspensão de células foi transferida para um tubo eppendorf e

centrifugada por 5 min a 2000rpm. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas

em 20 µL de solução de PBS. Em seguida, 1 µL da solução de BE:LA foi adicionado a cada

tubo e uma alíquota dessas células transferido para uma lâmina, montado com lamínula, e em

seguida levadas ao microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares.

Análise dos dados

Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e

apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra. Os dados foram expressos como a

média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes. Para verificação

da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram

comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de Dunnet, utilizando o

programa Prism versão 4.0 (GraphPad Software), com nível de significância de 5 % (p <

0,05).

3.2.9 Determinação da ativação da caspase-3

As caspases pertencem a família de proteases cisteínas. A ativação da caspase-3

possui papel fundamental no mecanismo de apoptose, sendo responsável pela clivagem de

vários componentes celulares relacionados ao reparo e ao controle do DNA. Assim, a

quantificação dos níveis de caspase-3 permite avaliar os mecanismos de indução apoptótica

(MEHMET, 2002).

Procedimento Experimental

A atividade de caspase-3 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de protease,

de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na detecção

espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos substratos X-pNA,

onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por caspases especificas: Asp-

Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-3. Inicialmente, células HL-60 e K-562 (2 x 10

células/mL) foram incubadas por 24 horas com as vitafisalinas O, M e N nas concentrações de

(1.8 e 14.3 µM, 20.1 e 21 µM e 9.6 e 11.8 µM, para HL-60 e K-562 respectivamente) e

metade da CI

, em estufa úmida a 37 ºC e atmosfera contendo 5% de CO

. Após o período

de incubação as células foram centrifugadas e lisadas em gelo. A quantidade de proteína no

lisado foi determinada utilizando-se o ensaio para dosagem de proteína pelo método de

Bradford (BRADFORD, 1976). Em seguida, 100-200 µg de proteínas foram incubadas com o

substrato em placa de 96 cavidades. A densidade óptica das amostras foi medida em

comprimento de onda de 405 nm. A atividade de caspase nas amostras foi determinada em

relação ao controle negativo e expressa como atividade de caspase-3 especifica (UI/mg de

proteína).

Análise dos dados

Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de

dois experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas

entre os diferentes grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida pelo teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).

3.2.10 Análise morfológica – Coloração por Hematoxilina/Eosina (H/E)

A coloração por Hematoxilina/Eosina permite distinguir o citoplasma e o núcleo

das células, sendo possível analisar a célula quanto a sua integridade nuclear, bem como

alterações no citoplasma. A hematoxilina é um corante alcalino que tem maior afinidade pelas

proteínas nucleares, dando ao núcleo uma cor lilás. A eosina, por sua vez, liga-se ao

citoplasma conferindo-lhe uma coloração rósea.

Procedimento experimental

Células da linhagen HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na

concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas O e F nas

concentração de 2µM. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Para

observar a morfologia das células, lâminas foram preparadas, com 50µL da suspensão de

células, em citocentrífuga (cytospin) e fixadas com metanol 100% por 1 minuto. Em seguida,

as lâminas foram lavadas com água corrente, para retirada do excesso de metanol, e coradas

com hematoxilina de Harris 0,1%. Após nova lavagem, para a retirada do excesso de

hematoxilina, as lâminas foram coradas com eosina 0,5%.

Análise dos dados

As lâminas com as células coradas foram levadas ao microscópio para

avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle negativo (não-

tratado). O registro das alterações celulares foi feito através de fotografia.

3.2.11 Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-Giemsa

A coloração por May-Grunwald-Giemsa se baseia em interações eletrostáticas

entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul de metileno (corante básico),

eosina (corante ácido), entre outros componentes básicos que permite distinguir o citoplasma

e o núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua integridade nuclear, bem como

alterações no citoplasma.

Procedimento experimental

Células das linhagens HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na

concentração de 0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas O e F na

concentração de 2 µM. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Para

observar a morfologia das células, lâminas foram preparadas, com 50µL da suspensão de

células, em citocentrífuga (cytospin) e fixadas com metanol 100% por 1 minuto. Em seguida

as laminas foram coradas com May-Grunwald, por 10 seg, e em seguida com Giemsa por 10

seg.

Análise dos dados

As lâminas com as células coradas foram levadas ao microscópio para

avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle negativo (não-

tratado). O registro das alterações celulares foi feito através de fotografia.

3.2.12 Determinação da Integridade da Membrana

Este método consiste na capacidade do iodeto de propídeo (PI) se ligar ao DNA

de células cuja membrana plasmática esteja rompida, como nos casos de apoptose tardia e

necrose, emitindo uma alta fluorescência quando excitado pelo laser de argônio (488nm). Nas

células cuja membrana permanece íntegra (células viáveis), o PI não consegue penetrar e

portanto emitem uma fluorescência mais baixa, com isso as células vivas podem diferenciadas

das mortas.

Procedimento Experimental

Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de

0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas F e O nas concentrações de 2,

5 e 10 µM. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Após o período de

incubação uma alíquota de 50µL da suspensão de células foi transferida para um tubo

eppendorf e incubada por mais 5 minutos com 100µL de PI (50µg/mL). Em seguida as

amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (EasyCyte da Guava Tecnologies).

Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos

como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os grupos, os dados serão

comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de

significância de 5% (p < 0,05).

3.2.13 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA.

Esse método consiste na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA das

células, cuja membrana plasmática foi primeiramente lisada por um detergente para permitir a

entrada do corante no núcleo. O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G

, S, G

M. Durante o período de crescimento celular (fase G

) uma célula diplóide apresenta um

conteúdo 2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA nuclear, i.e.,

possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma nuclear (2-

4n) e na fase seguinte (fase G

) ocorre o segundo período de crescimento celular, durante o

qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida ocorre a mitose (fase M,

4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas células filhas, cada uma com um

conteúdo 2n em DNA. As células que não se encontram em divisão celular (G

) apresentam

um conteúdo 2n em DNA. Assim, as diferentes fases do ciclo celular podem ser determinadas

a partir do conteúdo de DNA que elas apresentam.

Quando as células se apresentam com a cromatina condensada e/ou DNA

fragmentado, a quantidade de PI incorporada é menor, e portanto emitem uma fluorescência

mais baixa.

Procedimento Experimental

Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de

0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas F e O nas concentrações de 2,

5 e 10 µM. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Após o período de

incubação uma alíquota de 50 µL da suspensão de células foi transferida para um tubo

eppendorf e incubada por mais 30 minutos com 100µL de uma solução de lise contendo PI

(50µg/mL), Triton X-100 (0,1%) e citrato de sódio (0,1%). Em seguida as amostras foram

analisadas em citômetro de fluxo (EasyCyte da Guava Tecnologies), onde foram obtidas

histogramas representando a quantidade de células em cada fase do ciclo celular (G

, S e

/M) e a quantidade de células com DNA fragmentado.

Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos

como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados

serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível

de significância de 5% (p < 0,05).

3.2.14 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria

A mitocôndria está envolvida em diversas vias apoptóticas intrínsecas. O

citocromo c liberado da membrana externa da mitocôndria irá contribuir para desdobramento

de rotas apoptóticas e o espaço liberado funcionará como poro. Através destes poros formar-

se-á um efluxo de íons H

, induzindo uma alteração de seu potencial transmembrânico. A

rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, é seqüestrado pra dentro da mitocôndria

quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado. Assim, as células viáveis

emitirão alta fluorescência verde devido a maior quantidade de rodamina ligada às cargas

positivas internas enquanto que as mitocôndrias das células apoptóticas terão menos afinidade

pelo corante, gerando eventos que emitirão menor fluorescência.

Procedimento Experimental

Células de HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de

0,3 x 10

células/mL, e incubadas por 24 h com as vitafisalinas F e O nas concentrações de 2,

5 e 10 µM. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Após o período de

incubação uma alíquota de 50 µL da suspensão de células foi transferida para um tubo

eppendorf e incubada por mais 15 minutos com 200µL de uma solução de rodamina 123 (1

µg/mL em PBS), na ausência de luz e a 37 ºC. Após o período de incubação as células foram

centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi ressuspendido em PBS e

reincubado por mais 30 minutos e analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte da Guava

Tecnologies).

Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos

como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados

foram comparados poranálise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível

de significância de 5% (p < 0,05).

3.2.15 Avaliação da atividade antitumoral da vitafisalina F

em camundongos

transplantados com Sarcoma 180

A avaliação da atividade antitumoral está relacionada à regressão total de tumores

nos animais, à redução no crescimento dos tumores e ao aumento da expectativa de vida

durante o tratamento, comparado com os animais não tratados. Schabel et al. (1977)

demonstrou que o melhor resultado desses fatores depende do procedimento do tratamento,

que deverá ser começado até 48 h após o transplante. Neste período, as células tumorais já

teriam iniciado a formação do nódulo tumoral. O tumor utilizado foi o Sarcoma 180, o qual

foi descoberto em 1914 no ‘Crocker Laboratory (Columbia University, New York)’, sendo

originalmente um tumor sólido, surgido espontaneamente na região axilar de camundongos.

Inicialmente o tumor foi classificado como um carcinoma mamário, mas por volta de 1919,

após a realização de vários transplantes subcutâneos, o tumor assumiu a forma de sarcoma, e

desde então se mantém inalterado.

Procedimento Experimental

Para a avaliação do efeito antitumoral da vitafisalina F foram utilizados

camundongos (Mus musculus Swiss) fêmeas provenientes do Biotério Central da

Universidade Federal do Ceará (BIOCEN - UFC). Esses animais foram divididos

aleatoriamente em 4 grupos (n = 8 para cada grupo) com pesos variando entre 22 e 25 g (p >

0,05).

O modelo tumoral - tumor sólido do tipo Sarcoma 180 - foi utilizado com 10 dias

de implantação na região axilar direita. O animal doador, ou da manutenção, foi sacrificado

por deslocamento cervical, sendo realizado assepsia com álcool iodado. Em seguida, foi

retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal e preparado uma suspensão de células com

5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico,

para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 10

céls/0,5

mL na região axilar esquerda dos camundongos. Após 24 h de inoculação, o tratamento foi

iniciado e realizado durante 7 dias consecutivos, utilizando como controle negativo, o veiculo

de diluição (DMSO 4 %) e como controle positivo, o quimioterápico 5-Fluoracil (25

mg/kg/dia). A vitafisalina F foi testada nas doses de 5, 10 e 20 mg/kg/dia, todas

administradas por via intraperitoneal (i.p.). A dose de 20 mg/kg/dia também foi administrada

por via oral (v.o.).

Todos os grupos foram mantidos sob as mesmas condições e sob regime de

ingestão ad libitum de ração comercial (Purina, São Paulo) e água clorada durante todo o

período do experimento.

No final do experimento, os animais foram sacrificados por deslocamento

cervical, sendo seus órgãos (rins, baço, fígado) e tumores dissecados para avaliação do peso

relativo e da atividade antitumoral, respectivamente.

O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:

IT (%) = [(A-B)/A] x 100

Onde: A = média dos pesos dos tumores no grupo controle.

B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.

Análise dos dados

Os resultados (peso relativo dos órgãos e peso dos tumores) foram expressos

como média ± E.P.M. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05).

3.2.15.1 Observações Histopatológicas

Imediatamente após a dissecção, os órgãos e os tumores foram fixados em

formol 10 % para posterior análise macroscópica em relação à coloração, tamanho,

consistência e aspecto superficiais e corte. Em seguida, os tecidos foram processados,

embebidos em parafina e secções de 3-5 µm de espessura foram preparadas em lâminas.

Depois de desparafinizadas em xilol por 15 min e desidratadas em álcool em crescentes

concentrações, as lâminas foram lavadas em água destilada, coradas com H/E e examinadas

em microscópio óptico (x400).

Resultados

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro – MTT

A avaliação da atividade citotóxica das vitafisalinas foi realizado pelo método do

MTT em cinco linhagens de células tumorais (MDA-MB-435 – melanoma, NCI-H460 -

pulmão, SF-295 – glioblastoma, HL-60 - leucemia promielocítica e PC-3 – próstata) após 72

horas de incubação. A tabela 2 apresenta os valores de CI

obtidos no ensaio.

Todas as vitafisalinas apresentaram efeitos citotóxicos nas cinco linhagens

testadas, com CI

variando de 0,7 a 15,8µM. A vitafisalina O foi a que apresentou maior

efeito citotóxico, com valores de CI

menores que 1,9µM em quatro das cinco linhagens

testadas, sendo a mais ativa de 0,7 µM na linhagem de HL-60 e a menos ativa de 3,2 µM na

linhagem SF-295. Já o composto menos ativo foi a vitafisalina (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2-

diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido, com valores de CI

variando entre 6,9 e 15,8

µM nas linhagens de HL-60 e SF-295 respectivamente. Para este ensaio, foram consideradas

ativas as substâncias que apresentaram CI

< 8 µM (BOIK, 2001)

Tabela 2 - Atividade citotóxica in vitro de vitafisalinas isoladas da Acnistus arborescens em

linhagens de células tumorais.

Linhagens tumorais

µM

Vitafisalina

MDA-

MB435

NCI SF-295 HL-60 PC-3

1,5

(1,1 – 1,9)

1,3

(0,9 – 1,8)

3,2

(1,9 – 5,5)

0,7

(0,6 – 0,7)

1,9

(1,2 – 2,9)

2,7

(1,3 – 4,6)

2,5

(0,6 – 8,9)

6,4

(2,7 – 8,3)

1,4

(1,3 – 1,7)

3,0

(1,8 – 4,7)

4,1

(2,6 – 6,4)

7,9

(5,8 – 8,4)

4,1

(2,6 – 6,0)

15,1

(10,1 – 20,0)

(17S,20R,22R)-

5β,6β:18,20-

2.diepóxi-

4β,18-diidróxi-

1-oxovita-3.24-

enolido

11,8

(6,2 – 21,3)

13,6

(7,4 – 22,6)

15,8

(10,8 – 21,6)

6,9

(5,6 – 8,2)

14,2

(9,4 – 20,6)

7,6

(3,4 – 16,0)

4,2

(0,8 – 19,0)

11,3

(6,8 –16,6)

5,5

(5,0 – 5,9)

6,3

(3,1 – 13,2)

Os dados são apresentados em valores de CI

µM e o intervalo de confiança de

95% de dois experimentos independentes realizado em triplicata pelo método do MTT após

72 horas de incubação para as linhagens MDA-MB435 (melanoma), NCI-H460 (pulmão), SF-

295 (glioblastoma), HL60 (leucemia) e PC-3 (próstata).

4.2 Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro – Alamar Blue

Para avaliar a seletividade em células normais humana, a atividade citotóxica das

vitafisalinas O, M e N foram avaliadas em PBMC, através do método do alamar blue após 72

horas de incubação. A tabela 3 apresenta os valores de CI

obtidos no ensaio.

A vitafisalina F foi a mais citotóxica em PBMC, com IC

de 1,2 µM. As

vitafisalinas O e M apresentaram IC

de 3,7 e 16,9 µM, respectivamente.

Tabela 3 - Atividade citotóxica in vitro de vitafisalinas isoladas da Acnistus arborescens em

PBMC.

Vitafisalina

PBMC

µM

3,7

(3,1 – 4,3)

1,2

(0,8 – 1,6)

16,9

(12,8 – 22,1)

Os dados são apresentados em valores de CI

µM e o intervalo de confiança de

95% de dois experimentos independentes realizado em triplicata pelo método do alamar blue

após 72 horas de incubação com células PBMC.

4.3 Avaliação da atividade antiproliferativa em células leucêmicas (Curva de

crescimento celular) - exclusão por azul de tripan

A construção da curva de crescimento foi utilizada para determinar a cinética de

crescimento de células leucêmicas (HL-60 e K562) sob efeito das vitafisalinas O, F, M e N

nos intervalos de tempo de 12h, 24h, 36h, 48h, 60h e 72h

As quatro vitafisalinas testadas

apresentaram uma redução significante no número de células viáveis, tanto na linhagem de

HL-60 como de K-562, e esses efeitos parecem ocorrer de modo concentração e tempo

dependente (Figuras 12, 13, 14 e 15).

Nas primeiras 12 horas de tratamento o único composto a apresentar efeito sobre a

viabilidade das células foi a vitafisalina O, na linhagem de HL-60, com valor de CI

de 6,2

µM. Os demais compostos, com exceção da vitafisalina M, começaram a reduzir a viabilidade

celular de ambas as linhagens a partir de 24 h de tratamento, onde as vitafisalinas O, F e N

apresentaram CI

de 1,7, 3,5 e 9,5 µM na linhagem de HL-60 e 14,4, 5,3 e 11,8 µM na

linhagem de K-562, respectivamente. Os primeiros efeitos da vitafisalina M, sobre a

viabilidade celular, começaram apenas depois de 36 h de incubação e se estenderam até o

final do período de tratamento, apresentando CI

de 2,3 e 3,5 µM para HL-60 e K-562,

respetivamente. A partir de 48 h até o final do período de 72 h de tratamento, houve pouca

variação nas CI

das vitafisalina O, F e N. Todos os valores de CI

estão apresentadas na

tabela 4.

A B

C D

Figura 12 - Curva de crescimento celular da linhagem HL-60 (leucemia humana) tratada com

as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D).

A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripan nos tempos de

24, 36, 48, 60 e 72 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três

experimentos independentes realizado em duplicata. Os resultados de 12 h de tratamento não

foram mostrados.

A B

C D

Figura 13 – Curva de crescimento celular da linhagem K-562 (leucemia humana) tratada com

as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D).

A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripan nos tempos de

24, 36, 48, 60 e 72 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três

experimentos independentes realizado em duplicata. Os resultados de 12 h de tratamento não

foram mostrados.

A B

C D

Figura 14 – Curva de crescimento celular da linhagem K-562 (leucemia humana) tratada com

as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D).

O número de células foi determinado por exclusão de azul de tripan nos tempos de

12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três

experimentos independentes realizado em duplicata.

A B

C D

Figura 15 – Curva de crescimento celular da linhagem K-562 (leucemia humana) tratada com

as vitafisalinas O (A), F (B), M (C) e N (D).

O número de células foi determinado por exclusão de azul de tripan nos tempos de

12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três

experimentos independentes realizado em duplicata.

Tabela 4 – Atividade citotóxica das vitafisalinas F, O, M e N em células leucêmicas das

linhagens HL-60 (leucemia promielocitica) e K562 (leucemia mielocítica crônica).

, média ± E.P.M., µM

Composto

Linhagem

celular

12 horas 24 horas 36 horas 48 horas 60 horas 72 horas

HL60 6,2 ± 2,8 1,8 ± 0,3 1,3 ± 0,1 0,8 ± 0,0 1,0 ± 0,1 0,7 ± 0,0

K562 > 19,7 14,4 ± 1,4 3,5 ± 0,7 2,1 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,2 ± 0,0

HL60 > 20,5 3,5 ± 1,7 3,3 ± 2,0 1,6 ± 0,8 1,2 ± 0,3 0,8 ± 0,1

K562 > 20,5 5,3 ± 4,9 3,3 ± 2,7 1,6 ± 0,8 1,2 ± 0,6 1,1 ± 0,4

HL60 > 20,7 19,4 ± 1,6 8,5 ± 0,7 6,2 ± 0,7 4,3 ± 0,2 2,3 ± 0,7

K562 > 20,7 > 20,7 7,3 ± 0,9 7,1 ± 0,5 3,8 ± 0,7 3,5 ± 0,4

HL60 > 20,7 9,2 ± 0,3 4,9 ± 0,3 2,1 ± 0,1 3,2 ± 0,1 2,7 ± 0,3

K652 > 20,7 11,8 ± 0,4 3,6 ± 0,1 2,2 ± 0,0 2,3 ± 0,1 1,7 ± 0,0

Os dados são apresentados em valores de CI

média ± E.P.M., µM de três

experimentos independentes realizados em duplicata.

4.4 Avaliação da atividade genotóxica em células normais e leucêmicas.

O potencial genotóxico das vitafisalinas O, M e N foi avaliado através do teste do

cometa, em células de HL-60 e PBMC, após 24 horas de incubação. As concentrações

utilizadas neste ensaio correspondem aos valores de CI

encontrados na curva de crescimento

em HL-60, a metade da CI

e o dobro da CI

Todas as vitafisalinas testadas aumentaram o índice de dano e a freqüência de

dano, tanto em PBMC quanto em HL-60 (Figura 16 e 17).

C D 0,9 1,8 3,6 9,7 19,4 38,8 4,6 9,2 18,4

100

O M N

µM

Frequência de dano (%)

C D 0.9 1.8 3.6 9.7 19.4 38.8 4.6 9.2 18.4

100

O M N

µM

Frequência de dano (%)

Figura 16 – Freqüência de dano das vitafisalinas O, M e N sobre células de PBMC (A) e HL-

60 (B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo; D:

Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Os dados correspondem à média ±

E.P.M. de dois experimentos independentes. * p < 0,05 comparado com o controle negativo

por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

C D 0.9 1.8 3.6 9.7 19.4 38.8 4.6 9.2 18.4

100

150

200

250

O M N

µM

Índice de dano

C D 0.9 1.8 3.6 9.7 19.4 38.8 4.6 9.2 18.4

100

200

300

µM

O M N

Índice de dano

Figura 17 - Índice de dano das vitafisalinas O, M e N sobre células de PBMC (A) e HL-60

(B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo; D:

Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Os dados correspondem à média ±

E.P.M. de dois experimentos independentes. * p < 0,05 comparado com o controle negativo

por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

4.5 Inibição da síntese de DNA – BrDU

Neste ensaio, foi avaliada a capacidade proliferativa de células tratadas em

comparação as não-tratadas pela incorporação de BrdU no DNA (Tabela 5). Os resultados

mostraram que as vitafisalinas O, M e N causam uma redução significativa da incorporação

do BrdU nas duas linhagens testadas.

A vitafisalina O, na concentração de 1,8 µM, causou uma inibição de 81% na

síntese de DNA nas células de HL-60, enquanto que em K-562 uma concentração sete vezes

maior (14,4 µg/mL) reduziu apenas 64%. As vitafisalinas M (19,4 µM) e N (9,2 µM) inibiram

em quase 100% a síntese de DNA em células de HL-60. Em células de K-562 as vitafisalinas

M (21,0 µM) e N (11,8 µM) reduziram em torno de 60% a incorporação de BrdU.

Tabela 5 - Efeito das vitafisalinas O, M e N na incorporação do 5-bromo-2´-deoxyuridina

(BrdU) em células leucêmicas de HL-60 e K562 depois de 24 horas de incubação.

Concentração µg/mL

(µM)

Células postivas (%) T/C

Composto

HL-60 K562 HL-60 K562 HL-60 K562

Controle - - 67% 56% - -

Doxorrubicina 0,5 0,5 35%

35%

0.51 0.62

0,9 7,1 50%

31%

0.74 0.55

1,8 14,4 13%

a,b

20%

0.19 0.36

9,7 10,4 37%

26%

0.55 0.46

19,4 21 5,0%

a,b

22%

0.06 0.39

4,6 5,9 36%

53%

0.55 0.95

9,2 11,8 3,0%

a,b

23%

0.05 0.40

Nota: Os dados correspondem a media de células positivas (%) de dois experimentos independentes. T/C =

tratado/controle.

p<0.05, χ2 comparado com o controle

p<0.05, χ2 comparado com a doxorrubicina

4.6 Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina

Após 24 horas de incubação, as três vitafisalinas testadas causaram uma redução

de modo dose-dependente, no número de células viáveis, e um aumento de células apoptóticas

e necróticas em ralação ao controle (p < 0,05). As células de HL-60 quando tratadas com a

vitafisalina O (1,8 µM), apresentaram 38,89% de células viáveis, enquanto que no controle

esse número foi de 95,89%. Conseqüentemente o número de células apoptóticas e necróticas

foi maior nas células tratadas com o composto (48,89 e 13,33%, respectivamente) do que no

controle (2,78 e 1,33%, respectivamente). Em relação ao controle, as vitafisalinas M e N

também causaram um aumento no número de células necróticas de HL-60 (29% e 34%,

respectivamente). As células tratadas com doxorrubicina apresentaram um aumento do

número de células apoptóticas (33,78%), assim como de células necróticas (13,33) (Figura

18A).

Já na linhagem de K-562 o efeito mais observado foi o aumento no número de

células apoptóticas. Enquanto que no controle a porcentagem de células apoptóticas era de

8%, nas células tratadas com as vitafisalinas O, M e N essa porcentagem aumentou para

73,89, 32,56 e 71,78% respectivamente (Figura 18B).

C D 0,9 1,8 9,6 19,4 4,6 9,2

100

Cél. viáveis

Cél. apoptóticas

Cél. necróticas

M N

µM

de células (%)

C D 7,2 14,6 10 20 5,8 11,4

100

M N

µM

de células (%)

Figura 18 - Efeito das vitafisalinas O, M e N sobre células de HL-60 (A) e K562 (B),

analisado por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina após 24 horas de incubação. C: controle

negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo. Os dados

correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. * p < 0,05 comparado

com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

4.7 Determinação da ativação da caspase-3

A ativação da caspase-3 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A doxorrubicina

(0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi

tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. Apenas as vitafisalinas O e N,

nas maiores concentrações testadas, induziram significativamente a ativação de caspase-3 em

células de Hl-60 (Figura 19). Em células de K-562, nenhuma das três vitafisalinas testadas

induziu ativação de caspase-3 (Dados não apresentados).

C D 0,9 1,8 10 20,1 4,8 9,6

µM

O M

Caspase (UI/mg proteina)

Figura 19 - Efeito das vitafisalinas O, M e N sobre a ativação da caspase-3 em células de HL-

60 após 24 horas de incubação. . C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada

como controle positivo. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos

independentes. Os resultados são expressos como atividade especifica. Os valores

correspondem à média ± E.P.M. de dois experimentos independentes realizados em triplicata.

*, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.8 Análise morfológica – Coloração por Hematoxilina/Eosina (H/E) e May-Grunwald-

Giemsa

Análises morfológicas das células de HL-60 tratadas com as vitafisalinas O e F

foram feitas por coloração de Hematoxilina/Eosina e de May-Grunwald-Giemsa com o

objetivo de visualizar as possíveis alterações decorrentes do tratamento com as vitafisalinas O

e F. Análises por microscopia óptica das células de HL-60, coradas, revelaram várias

diferenças entre as células tratadas e o controle negativo. As células de HL-60 do controle

negativo exibiram uma morfologia típica com membrana íntegra, células pleomórficas, nítida

visualização tanto da membrana plasmática quanto nuclear (Figuras 20A e 21A).

Nas células tratadas com as vitafisalinas O e F, os efeitos foram melhores

visualizados na coloração de May-Grunwald- Giemsa, onde a maioria das células apresentava

uma morfologia atípica, semelhante à figuras mitóticas da fase prófase (Figuras 21C e 21D).

Na análise das células coradas com H/E, apenas visualizamos discreta condensação da

cromatina (Figuras 20C e 20D). A doxorrubicina, por sua vez, induziu alterações compatíveis

com a morte celular por apoptose, incluindo fragmentação nuclear (Figuras 20B e 21B).

A B

C D

Figura 20 - Morfologia de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24h de incubação,

coradas por Hematoxilina/Eosina e visualizadas por microscopia óptica. (A): controle

negativo; (B): Doxorubicina (0,5 µg/mL) foi usada como controle positivo; (C): células

tratadas com a vitafisalina O na concentração de 2 µM; (D): células tratadas com a vitafisalina

F na concentração de 2 µM. Seta preta: condensação da cromatina; Seta branca: fragmentação

nuclear.

A B

C D

Figura 21 - Morfologia de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24h de incubação,

coradas por May-Grunwald-Giemsa e visualizadas por microscopia óptica. (A): controle

negativo; (B): Doxorubicina (0,5 µg/mL) foi usada como controle positivo; (C): células

tratadas com a vitafisalina O na concentração de 2 µM; (D): células tratadas com a vitafisalina

F na concentração de 2 µM. Seta branca: fragmentação nuclear; Seta preta pontilhada: pré-

prófase; Seta azul: mitose atípica.

4.9 Determinação da Integridade da Membrana

A avaliação da integridade de membrana serviu como parâmetro pra determinar a

viabilidade das células de HL-60 tratadas com as vitafisalinas F e O.

Como pode ser observado na figura 22, nenhuma das duas substâncias reduziu a

viabilidade celular na concentração de 2 µM. Na concentração de 5 µM, apesar de uma

pequena diferença de 5,11%, apenas a vitafisalina F mostrou redução significativa do número

de células viáveis em relação ao controle. Já na concentração de 10 µM tanto a vitafisalina F

quanto a O reduziram significativamente a viabilidade das células de HL-60 para 39,13 e

59,81%, respectivamente (Figura 22). Vale ressaltar que, apesar das células apresentarem

membranas íntegras, a concentração de células está reduzida, em todos as concentrações

testadas, relação ao controle negativo (Figura 23).

Figura 22 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre a viabilidade (integridade de membrana) de

células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo,

após 24 horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como

controle positivo. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos

independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05

comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

Figura 23 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre a concentracao de células leucêmicas de HL-

60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de

incubação. C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo.

Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. Cinco mil

eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo

por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.10 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA

A análise do ciclo celular das células de HL-60, tratadas com as vitafisalinas F e

O, foi feita através do programa ModFit LT 3.1. Os resultados mostraram que ambas

vitafisalinas alteram o ciclo celular já a partir da menor concentração testada (2 µM), onde a

quantidade de células na fase G

é maior do que no controle negativo, e na fase S menor.

Já na concentração de 5 µM as células aparecem acumuladas na fase G

/M do ciclo celular,

com 23,67% e 39,23%, para as vitafisalinas O e F, respectivamente, enquanto no controle o

número de células em G

/M foi de 8,3%. Na concentração de 10 µM a maioria das células se

encontram na fase S do ciclo celular. A doxorrubicina, que foi utilizada como controle

positivo, apresentou um acúmulo de 64,24% das células na fase G

/M do ciclo celular. As

porcentagens, referentes ao número de células presentes em cada fase do ciclo celular, estão

apresentadas na tabela 6.

Na figura 24 as fases do ciclo celular estão representadas sob a forma de

histogramas, onde é possível se observar o acúmulo em G

/M de células tratadas com a

doxorrubicina e as vitafisalinas F e O na concentração de 5 µM. É possível observar também

o aumento do numero de células na fase S nos tratamentos com 10 µM das duas vitafisalinas.

A vitafisalina F causou um aumento significativo da fragmentação de DNA, em

todas as concentrações testadas, enquanto no tratamento com a vitafisalina O esses efeitos só

foram observados nas duas maiores concentrações (Figura 25).

Tabela 6 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre a distribuição do ciclo celular em células

leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após

24 horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como

controle positivo.

Fase do ciclo celular (%)

Substâncias Concentração

S G

C - 41.34 50.36 8.30

D 0.5 7.91* 29.55* 64.24*

5 54.70* 41.74* 3.56

5 36.04 41.63* 23.67*

10 33.83* 57.25 8.87

2 55.65* 35.36* 10.03

5 24.51* 37.52* 39.23*

10 35.24* 60.51* 4.25

Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes.

Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o

controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

Figura 24 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre a distribuição do ciclo celular (eixo x:

intensidade de fluorescência; eixo y: número de células) em células leucêmicas (HL-60)

determinado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de

incubação. C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo.

Os histogramas foram obtidos no programa ModFit LT 3.1, e representam a média de três

experimentos independentes.

C D 2 5 10 2 5 10

µM

Fragmentação de DNA (%)

Figura 25 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre a fragmentação de DNA de células

leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após

24 horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorubicina (0,5 µM) foi usada como

controle positivo. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes

independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05

comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.11 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria

Ambas vitafisalinas testadas causaram alterações no potencial transmembrânico

das células de HL-60. Nas células tratadas com a vitafisalina F, já na concentração de 2 µM,

houve um aumento da despolarização mitocondrial (7,7 %) em relação ao controle (2,9 %).

Na concentração de 5 µM esse número foi de 16,6 %. No tratamento com a vitafisalina O os

efeitos só foram observados nas duas maiores concentrações testadas (5 e 10 µM), com 17,5 e

9.2 % de células apresentando despolarização de mitocôndria, respectivamente. A

doxorrubicina não apresentou efeito significativo em relação ao controle (Figura 26).

C D 2 5 10 2 5 10

µM

Despolarização de membrana (%)

Figura 26 - Efeito das vitafisalinas F e O sobre o potencial transmembrânico de de células

leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando rodamina 123 após 24

horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle

positivo. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes.

Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o

controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.12 Avaliação da atividade antitumoral da vitafisalina F em camundongos

transplantados com Sarcoma 180

A avaliação da atividade antitumoral da vitafisalina F foi realizada em

camundongos Mus musculus Swiss utilizando o modelo experimental do Sarcoma 180. A

vitafisalina F foi administrada nos animais pelas vias intraperitoneal (5, 10 e 20 mg/kg/dia) e

oral (20mg/kg/dia) durante 7 dias consecutivos. No 9

dia, os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical e dissecados para a retirada do tumor, fígado, baço e rins.

Em todas as doses testadas a vitafisalina F foi capaz de diminuir

significativamente o crescimento da massa tumoral em relação ao controle negativo (DMSO

4%). O peso médio dos tumores dos animais tratados com DMSO 4% foi de 1,83 + 0.45 g,

enquanto nos animais tratados com 5, 10 e 20 mg/kg/dia da vitafisalina F por via i.p. foi de

1,32 + 0,33g, 0,75 + 0,20 g e 0,37 + 0,10 g, respectivamente. Já nos animais tratados com a

vitafisalina F (20 mg/kg/dia) por via oral e nos animais tratados com 5-FU (25 mg/kg/dia), o

peso médio dos tumores foi de 0,53 + 0,09 g e 0,50 + 0,05 g, respectivamente. Dessa maneira

foi possível determinar os percentuais de inibição do crescimento tumoral. A vitafisalina F

administrada por via i.p. inibiu em 28,94, 56,95 e 77,50 % o crescimento do tumor nas doses

de 5, 10 e 20 mg/kg/dia, respectivamente. Quando administrada por via oral (20 mg/kg/dia) a

vitafisalina F inibiu em 76,30 % o crescimento tumoral. O 5-FU inibiu 70 % do crescimento

tumoral (Figura 27).

Figura 27 - Efeito da vitafisalina F nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia i.p. e 20 mg/Kg/dia

v.o. sobre a proliferação tumoral de camundongos (Mus musculos) Swiss transplantados com

Sarcoma 180, após 7 dias de tratamento. C: o controle negativo foi tratado com o veículo

usado para diluir a droga (DMSO 4%). 5-FU: o 5-Fluorouracil (25 mg/Kg/dia) foi utilizado

como controle positivo. Os valores correspondem à média ± E.P.M. de 8 animais. *, p < 0,05

comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

4.12.1 Análise histopatológica dos órgãos

Após o tratamento com diferentes doses de vitafisalina F, o peso relativo úmido

de alguns órgãos mostrou diferença estatística (p< 0,005) quando comparados com os órgãos

do grupo controle. Na dose de 20mg/Kg/dia v.o. não foram observadas nenhuma alteração

quanto o peso dos órgãos dos animais tratados. Já na dose de 20mg/Kg/dia i.p. todos os

órgãos analisados apresentavam peso maior em relação aos do controle negativo. Nas doses

de 5 e 10 mg/Kg/dia i.p. apenas o baço e o fígado apresentavam diferença significativa em

relação ao controle, respectivamente. No tratamento com 5-fluorouracil (25mg/Kg/dia) houve

uma redução significante no peso do baço (p < 0,05) e um aumento do peso do rim em relação

ao grupo controle (Tabela 7).

Histologicamente, os órgãos dos animais do grupo controle negativo (DMSO 4%)

não apresentaram sinais graves de toxicidade, com o fígado apresentando degeneração

hidrópica e balonizante, os rins com estrutura glomerular preservada e o baço apresentando

vários megacariócitos.

Na análise histopatológica dos órgãos dos animais tratados com a vitafisalina F

apenas no fígado e nos rins foram encontradas alterações histopatológicas (Figuras 28 e 29).

No fígado os efeitos foram um pouco mais severos, com a presença de focos de necrose de

hepatócitos, esteatose e tumefação celular. Já nos rins, foram encontrados cilindros hialinos e

hemorragia glomerular. Nos animais tratados com 5-FU também foram encontrados sinais de

toxicidade no fígado e nos rins, como: hiperplasia das células de Kupffer e alguns focos de

inflamação no fígado e intensa tumefação celular e a presença de cilindros hialinos nos rins.

Porém vale ressaltar que em nenhum dos grupos foi encontrado fibrose intersticial no fígado,

e nos rins todos os grupos apresentavam glomérulos preservados, o que indica que esses

efeitos podem ser passíveis de regeneração. No baço não foram encontradas nenhuma

alteração em relação ao controle negativo (Figura 30).

Na análise histopatológica do tumor, em todos os grupos foram encontrados

características de neoplasia maligna constituída por células redondas, binucleação, freqüentes

mitoses e diferentes graus de pleomorfismo celular e nuclear. Porém nos grupos tratados com

a vitafisalina F foram encontradas diversas áreas de necrose, sendo essas áreas mais

predominantes no grupo tratado com 20 mg/Kg/dia i.p. e acompanhadas de intensa rarefação

celular (Figura 31).

Tabela 7 – Efeito da vitafisalina F nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia i.p. e 20 mg/Kg/dia

v.o., sobre o peso relativo dos orgãos de camundongos (Mus musculos) Swiss transplantados

com Sarcoma 180, após 7 dias de tratamento. C: o controle negativo foi tratado com o veículo

usado para diluir a droga (DMSO 4%). 5-FU: o quimiotrápico 5-Fluorouracil (25 mg/Kg/dia)

foi utilizado como controle positivo.

Dose

(mg/kg/dia)

Baço

g/100g de

massa

corporea

Rim

g/100g de

massa

corpórea

Fígado

g/100g de

massa

corporea

0,35 ± 0,03 1,07 ± 0,06 4,64 ± 0,19

5-FU

25 i.p.

0,21* ± 0,04 1,30* ± 0,07 4,78 ± 0,24

5 i.p.

0,71* ± 0,04

1,07 ± 0,04 4,28 ± 0,22

10 i.p.

0,37 ± 0,03 1,11 ± 0,06 5,18* ± 0,28

20 i.p.

0,55*± 0,06 1,66* ± 0,08

5,55* ± 0,24

Vitafisalina F

20 v.o.

0,40 ± 0,04 1,20 ± 0,05 4,40 ± 0,23

Os valores correspondem à média ± E.P.M. de 8 animais. *, p < 0,05 comparado

com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

Figura 28 - Fotomicrografia do fígado de camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados

com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de tratamento. O controle negativo (A) foi

tratado com veículo de diluição da substância (DMSO 4 %). O quimioterápico 5-Fluorouracil

na dose de 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo (B). A vitafisalina F foi

administrada nas doses de 10 (C) e 20 (D) mg/kg/dia i.p. Coloração por hematoxilina/eosina e

visualização por microscopia óptica. Aumento = 400x.

Esteatose em

microgotas

Tumefação

celular

Esteatose em

microgotas

Figura 29 - Fotomicrografia dos rins de camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados

com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de tratamento. O controle negativo (A) foi

tratado com veículo de diluição da substância (DMSO 4 %). O quimioterápico 5-Fluorouracil

na dose de 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo (B). A vitafisalina F foi

administrada nas doses de 10 (C) e 20 (D) mg/kg/dia i.p. Coloração por hematoxilina/eosina e

visualização por microscopia óptica. Aumento = 400x.

Hemorragia

glomerular

Tumefação celular

Glomérulo

Figura 30 - Fotomicrografia do baço de camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados

com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de tratamento. O controle negativo (A) foi

tratado com veículo de diluição da substância (DMSO 4 %). O quimioterápico 5-Fluorouracil

na dose de 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo (B). A vitafisalina F foi

administrada nas doses de 10 (C) e 20 (D) mg/kg/dia i.p. Coloração por hematoxilina/eosina e

visualização por microscopia óptica. Aumento = 400x.

Megacariócito

Megacariócitos

Pigmentos de

hemossiderina

Figura 31 - Fotomicrografia dos tumores de camundongos (Mus musculus) Swiss

transplantados com Sarcoma 180 e sacrificados após 7 dias de tratamento. O controle

negativo (A) foi tratado com veículo de diluição da substância (DMSO 4 %). O

quimioterápico 5-Fluorouracil na dose de 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo (B).

A vitafisalina F foi administrada nas doses de 10 (C) e 20 (D) mg/kg/dia i.p. Coloração por

hematoxilina/eosina e visualização por microscopia óptica. Aumento = 400x.

Células tumorais

Mitose

Tabela 8 - Resumo dos resultados encontrados no estudo da atividade citotóxica das

vitafisalinas.

Estudo Resultados

Atividade citotóxica in vitro

Em células tumorais +++

Em células normais +++

Estudo do mecanismo de ação citotóxico

Inibição da síntese de DNA +++

Morfologia diferencial por Laranja de acridina/Brometo de

etídeo

Apoptose

Morfologia diferencial por Hematoxilina/Eosina C.R.

Morfologia diferencial por May-Grunwald-Giemsa C.R.

Integridade de membrana +

Análise do ciclo celular Parada em G

Indução de fragmentação do DNA +

Potencial trasmembrana de mitocondria +

Genotoxicidade

Em células de HL-60 +++

Em células normais +++

Atividade in vivo

Sarcoma 180 +++

Toxicidade sistêmica ++

(+) Efeito Fraco; (++) Efeito Moderado; (+++) Efeito Forte; (C.R.) Corrobora com os demais resultados.

Discussão

5 DISCUSSÃO

A utilização de plantas no tratamento, cura e prevenção de doenças, é uma das

mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. Hoje em dia as plantas são

consideradas uma fonte inesgotável de produtos naturais, com uma diversidade de mais de

250 mil espécies no mundo, onde apenas 10% destas têm sido estudadas quanto às suas

propriedades farmacológicas e fitoquímicas (BALLADRIN et al., 1993). Nos últimos 25

anos, de todos os compostos bioativos descobertos, 63% são produtos naturais, derivados

deles ou possuem estruturas baseadas em produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007).

Nos últimos 10 anos, plantas da família Solanaceae têm despertado um grande

interesse nos cientistas, pelo fato de muitas destas plantas serem utilizadas na medicina

popular. A Withania somnifera, popularmente conhecida como “ginseng indiano”, há séculos

vem sendo utilizada na medicina ayurvedica como antitumoral, antipirético, antiinflamatório,

imunomodulador, anticolinesterásico, em problemas cardiovasculares e obesidade e também

por seus efeitos anti-stress (SBOHAT et al., 1967; SHETI et al., 1970; BUDHIRAJA et al.,

1987; DEVI et al., 1992; AGARWAL et al., 1999; ARCHANA; NAMASIVAYAM, 1999;

JAYAPRAKASAM et al., 2003; SENTHIL et al., 2007). Muitos destes efeitos são atribuídos

à presença da vitaferina A, ou ainda, a outros vitaesteróides (JAYAPRAKASAM et al., 2003;

JAYAPRAKASAM; NAIR, 2003; MOHAN et al., 2004; YOKOTA et al., 2006; YANG et

al., 2007; BARGAGNA-MOHAN et al., 2007). A vitaferina A, por sua vez, foi isolada pela

primeira vez da Acnistus arborescens por Kupchan et al. (1965), que posteriormente atribuiu

o efeito antitumoral do extrato das folhas dessa planta à presença de vitaferina A (KUPCHAN

et al., 1969). Desde então, outros autores reportaram a ocorrência de vitaesteróides citotóxicos

nesta espécie incluindo as vitafisalinas (MINGUZZI et al., 2002; VERAS et al., 2004a;

2004b), contudo, não foi realizado um estudo detalhado dos mecanismos envolvidos nesta

citotoxicidade. Com isso, o presente trabalho visa estudar melhor a atividade dessas

vitafisalinas, e seus possíveis mecanismos de ação, utilizando células tumorais em modelos in

vitro e in vivo.

Inicialmente, foi avaliado o potencial citotóxico dessas vitafisalinas em 5

linhagens de células tumorais através do método do MTT. Estudos de “screening” utilizando

MTT tem sido uma ferramenta essencial e eficaz para avaliar o potencial citotóxico de

substâncias (ALLEY et al., 1988). O parâmetro utilizado para avaliar essa toxicidade é a

viabilidade celular, que no caso do MTT é determinada pela atividade de enzimas

mitocondriais. Ensaios de citotoxicidade in vitro são reprodutíveis, rápidos, baratos e

analisam vários compostos de uma só vez, e apesar de não permitirem identificar o

mecanismo de ação dos compostos, eles são os primeiros testes realizados para identificar

novos compostos com potencial anticâncer (TAKIMOTO, 2003; BERRIDGE et al., 1996).

Os efeitos citotóxicos das vitafisalinas O, M e N em linhagens tumorais de

pulmão (Lu1), próstata (LNCaP) e mama (MCF7) já haviam sido reportados em Veras et al.

(2004a), enquanto que os efeitos das vitafisalinas F e (17S, 20R, 22R)-5β, 6β:18,20-2-

Diepóxi-4β, 18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido foram previamente avaliados nas linhagens

B16 (melanoma), SF268 (sistema nervoso central), NCI-H-460 (pulmão), HCT-8 (colon),

HL-60 e CEM (leucemias) por Veras et al. (2004b).

No presente trabalho, o painel de linhagens testadas foi ampliado. As vitafisalinas

O, F, M e N foram citotóxicas nas linhagens tumorais testadas, com exceção das linhagens

PC-3 e SF-295 em que as vitafisalinas M e N apresentaram CI

acima de 10,0 µM,

respectivamente. Vale ressaltar que a vitafisalina N foi menos citotóxica do que a vitafisalina

M em todas as linhagens, com exceção da PC-3, onde esta última apresentou CI

de 14,6 µM

contra 6,2 µM da vitafisalina N. Os resultados também mostraram que a linhagem de HL-60

foi a mais sensível aos efeitos citotóxicos das vitafisalinas, onde inclusive a vitafisalina (17S,

20R, 22R)-5β, 6β:18,20-2-Diepóxi-4β, 18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido, a menos ativa

dentre as cinco testadas, apresentou CI

de 6,8 µM.

Ao fazermos uma análise estrutural das vitafisalinas estudadas, é possível

observar que existem apenas duas diferenças básicas entre elas, uma que se refere à ligação

dupla entre C2 e C3 e outra que se refere ao grupamento ligado ao C18 (Figura 32).

De acordo com trabalhos anteriores, a unidade 4β-hidroxi-2-en-1-ona, composta

por uma carbonila ligada ao C1, uma ligação dupla entre C2 e C3 e uma hidroxila no C4,

seriam requisitos estruturais necessários para os efeitos farmacológicos dos vitaesteróides

(CARDONA et al., 2006; SU et al., 2002; MISICO et al., 2002; KUROYANAGI et al., 1999;

DAMU et al., 2007). Essa ligação dupla entre C2 e C3 parece ser essencial para a atividade

citotóxica dos vitaesteróides, já que a quebra dessa ligação acarreta na perda de atividade

desses compostos (SU et al., 2002; VERAS et al., 2004b; MAGALHÃES et al., 2006;

DAMU et al., 2007). De fato esses achados corroboram com nossos resultados, já que as

vitafisalinas O, F e M, que apresentam a mesma unidade 4β-hidroxi-2-en-1-ona no anel A,

foram bem mais citotóxicas que as vitafisalinas N e (17S, 20R, 22R)-5β, 6β:18,20-2-Diepóxi-

4β, 18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido que não possuem a ligação dupla entre C2 e C3.

Além da unidade 4β-hidroxi-2-en-1-ona, a presença do anel epóxido em C5 e C6

também parece ser favorável a citotoxicidade dos vitaesteróides, pois quando esse anel é

100

quebrado ou os carbonos 5 e 6 se encontram ligados a outros grupamentos, a atividade

citotóxica desses compostos é bastante diminuída (SU et al., 2002; MAGALHÃES et al.;

2006; DAMU et al., 2007). De acordo com Damu et al. (2007) a quebra simultânea dessas

duas unidades (4β-hidroxi-2- en-1-ona e 5β,6β-epóxido) acarreta na perda total de

citotoxicidade dos vitaesteróides. De acordo com Gibson e Skett (2001), os epóxidos são

grupamentos eletrofílicos capazes de se ligar de modo irreversível aos ácidos nucléicos e a

várias proteínas celulares.

Em Cardona et al. (2006), esses dois grupamentos (cetona-α,β insaturada e 5β,6β-

epóxido) também foram relacionados como sendo os responsáveis pela atividade

antiparasitária de certos vitaesteróides (NAGAFUJI et al., 2004; ABE et al., 2006;

CHOUDARY et al., 2006; VIEIRA et al., 2008).

Levando-se em consideração a estrutura das três vitafisalinas mais potentes (O, F

e M), observamos que todas possuem a unidade 4β-hidroxi-2-en-1-ona e a única diferença

entre elas é o grupamento ligado ao carbono 18, onde a vitafisalina O, que mostrou ser a mais

citotóxica, possui uma etoxila, e as vitafisalinas F e M, que foram a segunda e terceira mais

potentes, possuem uma hidroxila e uma carbonila, respectivamente. Como mencionado

anteriormente, o que confere maior citotoxicidade a esses compostos é uma ligação dupla

entre C2 e C3, e esse efeito pode aumentar ou diminuir dependendo do grupamento ligado ao

C18. De acordo com o observado, a etoxila ligada ao C18 confere maior potência às

vitafisalinas, seguido da ligação de uma hidroxila e de uma carbonila. Contudo, muito há o

que se pesquisar para a maior compreensão da relação estrutura-atividade nesses compostos.

101

Vitafisalina O Vitafisalina F

VItafisalina M Vitafisalina N

Vitafisalina (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2.

diepóxi-4β,18-diidróxi-1-oxovita-3.24-enolido

Figura 32 - Estruturas químicas das vitafisalinas estudadas. As diferenças estruturais entre os

compostos se encontram em destaque.

O O

102

Um dos grandes problemas evidenciados no uso de quimioterápicos para o

tratamento do câncer são os seus efeitos colaterais. Grande parte desses efeitos se deve

principalmente a baixa seletividade desses fármacos por células tumorais, onde as células

normais mais afetadas são as que se proliferam rapidamente, como as células da pele, do trato

gastrintestinal, plaquetas, glóbulos vermelhos (hemácias) e brancos (leucócitos) (ANAZETTI

et al., 2003). Hoje em dia o objetivo principal da quimioterapia é destruir apenas as células

tumorais, tentando preservar as células normais.

A fim de avaliar se as vitafisalinas apresentavam alguma seletividade para células

normais ou tumorais, foram realizados testes utilizando células mononucleadas isoladas de

sangue periférico humano. Apenas as vitafisalinas O, F e N foram avaliadas quanto à

citotoxicidade sobre células PBMC, e os resultados mostraram que as vitafisalinas atuam

também sobre células normais. As vitafisalinas O e F foram as mais citotóxicas, com CI

3,8 e 1,2 µM respectivamente, já a vitafisalina N apresentou CI

de 16,4 µM. Ao

compararmos com os valores de CI

de HL-60 (0,7, 0,8 e 2,7 µM para vitafisalina O, F, e N

respectivamente) observamos que esses compostos não apresentam muita seletividade em

relação a células normais. Embora as CI

tenham sido 4x maiores do que em células

leucêmicas, esses valores ainda são considerados citotóxicos, levando–se em consideração

que são células normais.

O teste do cometa tem sido bastante utilizado para se avaliar a segurança de novos

fármacos (HARTMANN et al., 2003), uma vez que é considerado um método bastante

sensível, em relação à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO;

TICE, 2003). Os resultados deste teste mostraram que as vitafisalinas testadas (O, M e N)

causaram dano ao DNA tanto em células leucêmicas quanto em células normais, ressaltando a

baixa seletividade destes compostos.

A importância da avaliação genotóxica dos fármacos, resulta da possibilidade deles

próprios induzirem mutações, elevando desta forma o risco de formação de células

defeituosas. Se as células que sofreram danos em seu DNA sobreviverem, elas transmitirão

essas alterações às suas células filhas, o que pode acarretar no desenvolvimento de células

neoplásicas. Contudo, o ensaio do cometa não prevê necessariamente o potencial mutagênico

ou carcinogênico das substâncias testadas, uma vez que detecta alterações no DNA que

podem ou não ser reparadas eficientemente (ALBERTINI et al., 2000). Desta maneira, os

efeitos genotóxicos sobre as células normais não obrigatoriamente indicam um potencial

carcinogênico das vitafisalinas, mas ressaltam sua capacidade de induzir dano ao DNA das

células tratadas.

103

A fim de entender melhor os efeitos desses compostos, foi avaliado a cinética de

crescimento de duas linhagens leucêmicas, HL-60 e K-562, sob o efeito das vitafisalinas O, F,

M e N. O possível mecanismo pelo qual essas vitafisalinas exercem seu efeito citotóxico

também foi analisado em células das linhagens HL-60 e K-562, utilizando os seguintes

métodos: avaliação da síntese de DNA por incorporação de 5-BrdU, análise morfológica por

coloração com hematoxilina/eosina e acridina laranja/brometo de etídeo, ativação de caspase

e análises utilizando citometria de fluxo. Por último, foi avaliada a atividade antitumoral da

vitafisalina F em camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180.

Modelos celulares são ferramentas úteis e necessárias para observar a toxicidade

de um composto, traduzida, inicialmente, pela sua capacidade em induzir morte celular, onde

as linhagens HL-60 e K-562 são um dos modelos celulares mais utilizados (COLLINS, 1987;

GRZANKA et al., 2003.) As células da linhagem HL-60 são derivadas do sangue periférico

de um paciente com leucemia promielocítica aguda, tendo sido caracterizada e sua cultura

primeiramente estabelecida por Collins et al. (1977). Essa linhagem pode ser caracterizada

pela predominância de neutrófilos promielocíticos proeminentemente assincrônicos na relação

núcleo/citoplasma, diferenciação espontânea de 10% das células cultivadas para o estágio

monocítico e atividade fagocitária e quimiotática (GALLAGHER et al., 1979; COLLINS,

1987). A leucemia mielocítica crônica humana (LMC) é uma malignicidade hematológica

caracterizada pela translocação recíproca balanceada do protooncogene c-abl do cromossomo

9 para uma região do gene Bcr no cromossomo 22 (MARU, 2001). Isto leva à formação do

cromossomo Filadélfia (cromossomo Ph). A resistência de células das linhagens de LMC,

como por exemplo, K-562, à indução de apoptose por vários agentes antineoplásicos,

incluindo o etoposídeo e a cisplatina, é atribuida a essa presença do cromossomo Ph

(SLUPIANEK et al., 2000; Di BACCO et al., 2000; LIU et al., 2002).

A construção da curva de crescimento demonstra bem os efeitos das vitafisalinas

sobre a proliferação celular destas linhagens, e os resultados condizem com os do MTT, onde

a vitafisalina O foi a mais potente, agindo já nas primeiras 12 horas de tratamento, seguida

das vitafisalinas F, M e N, respectivamente. Interessantemente, assim como ocorreu com a

linhagem PC-3 no ensaio do MTT, a vitafisalina N se mostrou mais potente que a vitafisalina

M quanto à inibição da proliferação celular da linhagem K-562, o que mostra mais uma vez

que cada vitafisalina pode agir de modo específico em diferentes linhagens de células.

Todas as vitafisalinas testadas causaram efeitos tanto citotóxicos, como

citostáticos, dependente de concentração. Nas maiores concentrações testadas (em torno de 10

104

µg/mL) é possível observar o efeito citotóxico das vitafisalinas, através da redução do número

de células viáveis e aumento das não-viáveis, a partir de 24 h de tratamento, e se estendendo

até o final do tratamento. Já nas concentrações intermediárias (em torno de 2 µM) é possível

observar um efeito citostático, pois o número de células viáveis permanece praticamente

inalterado com o aumento do tempo de incubação, o que indica que as células não estão

proliferando.

Desta forma, as vitafisalinas foram então avaliadas, através do método de

incorporação do BrdU, quanto as suas capacidades em inibir a síntese de DNA. O ciclo

celular de células em proliferação é composto pelas fases G

, S, G

e M. Na fase S todo

material genético da célula precisa ser duplicado, para que as células filhas adquiram o

mesmo DNA da célula mãe, e como o BrdU é um análogo da timina, é nesse momento da

síntese do DNA que ele vai ser incorporado. Esse BrdU, então, pode ser detectado através de

anticorpos específicos e de técnicas de imunocitoquímica. Células que não estão se

proliferando não estão sintetizando DNA e portanto não irão incorporar o BrdU.

Nesse ensaio, as três vitafisalinas testadas (M, N e O) diminuíram de 81 a 99,5 %

a síntese de DNA na linhagem de HL-60 e em torno de 60 % na linhagem de K-562. Em

Veras et al. (2004b) também foi reportado os efeitos das vitafisalinas F e (17S, 20R, 22R)-5β,

6β:18,20-2-Diepóxi-4β, 18-diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido sobre a síntese de DNA de

células de HL-60, onde a vitafisalina F inibiu em 68% a síntese do DNA. Esses resultados

corroboram com a diminuição na proliferação observada na curva de crescimento.

A coloração por BE/AL permite analisar as características morfológicas das

células, podendo sugerir de que forma as vitafisalinas causam a morte celular, seja por

necrose ou apoptose.

A apoptose, uma das formas de morte celular programada, desempenha papel

fundamental na manutenção da homeostase em vários sistemas biológicos, regulando o

numero de células e eliminando células danificadas e senescentes. O mau funcionamento do

mecanismo de apoptose pode ocasionar diversas patologias, inclusive câncer (MAJNO;

JORIS, 1995; OPALKA et al., 2002). Células em apoptose apresentam algumas alterações

morfológicas e metabólicas características, como: diminuição do volume celular, condensação

da cromatina, fragmentação do DNA, alteração no potencial transmembrânico da mitocôndria

(Van CRUCHTEN; Van den BROECK, 2002). Diferentemente da apoptose, a morte por

necrose é caracterizada pelo aumento do volume celular seguido da perda da integridade da

membrana plasmática e consequente liberação dos componentes celulares e indução de

inflamação (WILLEY et al., 1980).

105

A análise morfológica, por BE/AL, das células (HL-60 e K-562) tratadas com as

vitafisalinas, mostrou alterações características tanto de apoptose como de necrose, onde mais

da metade das células já se encontravam em processo de morte. Embora tenha sido observado

um grande número de células necróticas, a apoptose parece ser o principal mecanismo de

morte das vitafisalinas, já que no final do processo de apoptose, também chamado de

apoptose tardia, as células passam a apresentar lesões em suas membranas, levando a necrose

secundária.

Para aprofundar os estudos dos efeitos celulares das vitafisalinas O e F, foram

realizados experimentos em HL60 utilizando citometria de fluxo. Nesses experimentos foram

avaliados os seguintes parâmetros: número de células, integridade de membrana,

despolarização mitocondrial, ciclo celular e fragmentação de DNA. Nesses experimentos,

também foi evidenciada uma diminuição significativa do número de células em todas as

concentrações testadas (2, 5 e 10 µM), corroborando os dados da curva de crescimento e da

inibição da incorporação de BrdU.

Já com relação a análise da integridade de membrana, na concentração de 5 µM,

apenas a vitafisalina F causou uma leve diminuição na viabilidade das células, enquanto que

na concentração de 10 µM, ambas vitafisalinas diminuíram o percentual de células com

membrana íntegra. Como dito anteriormente, a perda da integridade da membrana plasmática

é uma das característica da morte celular por necrose, ao passo que, a fragmentação de DNA

nas células com membrana íntegra seria uma alteração típica de um processo de apoptose. De

fato, o número de células com DNA fragmentado aumentou significativamente também

naquelas concentrações (2 e 5µM) onde a integridade de membrana não estava alterada, o que

é mais um indício da indução de apoptose por esses compostos.

A análise do ciclo celular também evidenciou um aumento do número de células

em G

/M, no tratamento com a concentração de 5 µM, indicando que o bloqueio da

proliferação ocorre posteriormente aos eventos envolvidos na síntese de DNA. Já na

concentração de 10 µM, houve uma diminuição do número de células na fase G

/M do ciclo

acompanhado de um aumento de ±11 % na fragmentação de DNA, o que provavelmente

aconteceu devido a morte das células e que se encontravam em G

/M por apoptose, levando a

uma diminuição do número de células.

Um outro indício da indução de apoptose pelas vitafisalinas, foi a diminuição do

potencial transmembrânico da mitocôndria, que pode ser observado com o uso da rodamina

123. A mitocôndria tem papel fundamental na deflagração da via intrínseca da apoptose.

Varias proteínas intracelulares participam da ativação dessa via de morte celular. As proteínas

106

próapototicas, da família Bcl-2, Bax e Bak se ligam a receptores na membrana externa da

mitocôndria causando o aumento da sua permeabilidade (HENGARTNER, 2000). Outras

proteínas proapoptóticas como a Bad e Bid, também da família Bcl-2, atuam ou inibindo o

efeito das proteínas antiapoptóticas (Bcl-2 ou Bcl-X

) ou se ligando diretamente às proteínas

Bax-simili ativando-as. Alguns estímulos podem causar a formação de poros na membrana

interna da mitocôndria, o que acarreta na passagem de água e de algumas moléculas para o

espaço intermembrana e conseqüentemente ruptura da membrana externa mitocondrial. Com

a membrana da mitocôndria rompida, uma das primeiras proteínas a serem liberadas no

citoplasma é o citocromo c. Na presença de ATP, esse citocromo c logo se liga a Apaf-1 e a

caspase 9, formando um complexo chamado de apoptossoma (LI et al., 1997). O

apoptossoma, então, é encarregado de ativar as caspases 3 e 7, também chamadas de caspases

efetoras, que por sua vez vão clivar outros substratos protéicos da célula resultando no

processo apoptótico.

Apesar de, tanto a fragmentação de DNA quanto a diminuição do potencial

transmembrânico de mitocôndria serem característicos da apoptose, esses efeitos também

podem ser encontrados em células em necrose, o que talvez colocasse em dúvida o verdadeiro

mecanismo citotóxico das vitafisalinas. No entanto a indução de apoptose pôde ser

confirmada pela capacidade das vitafisalinas induzirem a ativação da caspase 3, na linhagem

de HL-60, uma enzima essencial para o processo de apoptose e que até então não foi

evidenciada em células necróticas (DONG et al., 1997; SAIKUMAR et al., 1999; GUO;

HAY, 1999; apud Van CRUCHTEN; Van de BROECK, 2002). Nesse caso, após um período

de 24h de incubação com as vitafisalinas (O, M e N), apenas na linhagem de HL-60 é que

houve um aumento significativo da quantitadade de caspase 3, enquanto os níveis dessa

enzima permaneceram inalterados na linhagem K-562, nesse mesmo período de incubação.

Como mencionado anteriormente as células da linhagem K-562 são relativamente mais

resistentes à indução de apoptose por vários agentes antineoplásicos (McGAHON et al.,

1995), e Cao et al. (2004) demonstrou que a ativação de caspase 3 em células de HL-60 já é

evidente após as primeiras 4 horas de tratamento. No entanto, na linhagem de K-562 os níveis

dessa enzima permanecem constantes até 24 horas de tratamento, e só a partir daí vão

aumentando gradativamente após esse intervalo. Talvez isso explique a ausência de ativação

de caspase 3 em células de K-562 tratadas com as vitafisalinas por 24 horas.

Dados da literatura (SENTHIL et al., 2007) corroboram com os resultados

apresentados no presente trabalho, onde outro vitaesteróide, o vitanolídeos (5α-etoxi-1-oxo-

6β,14α,17β,20-tetrahidroxi-20S-22R-vita-2,24-dienolideo), também diminuiu a viabilidade de

107

células HL-60 através da ativação de caspases pela liberação do citocromo c da mitocôndria

Senthil et al. (2007) também observaram, por western blot, que as proteínas Bcl-2 estavam

sendo subexpressas e que havia um aumento na expressão das proteínas Bax pelas células

tratadas com esses vitaesteróides.

Apesar de vários autores ressaltarem os efeitos citotóxicos e antitumorais dos

vitaesteróides, o mecanismo de ação desses compostos ainda não foi completamente

elucidado.

Um dos mecanismos propostos para a vitaferina A é a sua interação com proteínas

do citoesqueleto (FALSEY et al., 2006; BARGAGNA-MOHAN et al., 2007). O citoesqueleto

está envolvido na locomoção e manutenção da morfologia celular, fagocitose, transporte

intracelular e formação do fuso mitótico durante a divisão celular (ALBERTS et al., 2004).

Yang et al. (2007) reportou que o alvo primário da vitaferina A poderia ser o

proteossoma das células. O proteossoma é um complexo de proteases que fazem parte de um

sistema de “controle de qualidade de proteínas”, cuja função principal é a degradação de

proteínas danificadas ou desnecessárias para a célula. O proteossoma tem um papel essencial

na regulação do ciclo celular. O ciclo celular é regulado por um complexo de ciclina-cdk, e

essas ciclina-cdks são especificas pra cada fase, de modo que elas são sintetizadas e

degradadas a cada ciclo. A degradação dessas ciclinas é feita pelo proteossoma,

especificamente a ciclina B, que está presente na fase M do ciclo celular, e é necessária sua

degradação para que o ciclo seja completado (CHESNEL et al., 2006).

Através de programas computacionais de modelagem molecular, Yang et al.

(2007) mostrou que as duas cetonas presentes na estrutura da vitaferina A (anel A e E) se

ligavam a hidroxila da porção 5β do proteossoma, inibindo desta forma sua ação de

quimotripsina. No tratamento in vitro, em células de PC-3 (câncer de próstata), foi observado

que, logo nas primeiras duas horas de tratamento com a vitaferina A, o proteossoma já era

inibido, e após 24h as células se apresentavam com alterações morfológicas características de

apoptose e ativação de caspase-3 (YANG et al., 2007).

Os mecanismos propostos (inibição do citoesqueleto e do proteossoma) para ação

da vitaferina A levam a efeitos semelhantes aos observados no presente trabalho para as

vitafisalinas. Como foi observado, as vitafisalinas O e F causaram um acúmulo de células na

fase G2/M do ciclo celular, o que talvez pudesse ser explicado pela inibição do proteossoma e

conseqüente não dissociação do complexo ciclina B – cdk1, ou mesmo, por interferência nos

elementos do citoesqueleto, o que acarretaria na parada do ciclo celular na mitose. A ativação

de caspase-3 e alterações morfológicas características de apoptose pelas vitafisalinas também

108

foram evidenciadas nesse trabalho. Todos esses achados aliados à semelhança estrutural

destes compostos, nos levam a sugerir que as vitafisalinas tenham alvos semelhantes a

vitaferina A. Entretanto, essa hipótese necessita de outras comprovações experimentais.

Nem sempre os efeitos observados in vitro podem ser extrapolados para modelos

in vivo, desta forma é necessário estudar o efeitos desses compostos em sistemas biológicos

completos. Animais de laboratório representam um poderoso sistema experimental para a

compreensão da intricada patogênese do câncer em seres humanos. De fato, a maioria dos

conceitos de tumorigênese atualmente aceitos é fortemente influenciada por modelos de

desenvolvimento do câncer em camundongos, uma vez que esses organismos são modelos

acessíveis e possuem sistemas, órgãos e genes semelhantes aos nossos (KAMB, 2005).

Kupchan et al. (1969) reportou pela primeira vez a atividade antitumoral de

vitanolídeos isolados da A. arborescens. Naquela ocasião a vitaferina A foi testada nos

modelos tumorais de Walker e sarcoma 180, em ratos e camundongos, respectivamente.

Numa dose de 20 mg/Kg, a vitaferina A inibiu em 62% o crescimento do tumor de ambos os

modelos testados.

As fisalinas B e D, isoladas da Physalis angulata, outra planta da família

Solanaceae, também mostraram possuir efeito antitumoral sobre células de sarcoma 180 in

vivo, inibindo o crescimento do tumor em torno de 45%, em relação ao controle negativo

(MAGALHÃES et al., 2006b).

Assim como em Kupchan et al. (1969) e em Magalhães et al. (2006b), o modelo

utilizado para avaliar o potencial antitumoral da vitafisalina F também foi o sarcoma 180, uma

das linhagens celulares mais utilizadas na pesquisa de atividade antitumoral in vivo (LEE et

al., 2003). A vitafisalina F foi administrada nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia por via

intraperitoneal e 20 mg/Kg/dia por via oral. Em todas as doses testadas a vitafisalina F foi

capaz de inibir significativamente o crescimento tumoral, mas foi na dose de 20 mg/Kg/dia,

tanto i.p. quanto v.o., que a inibição foi mais potente, chegando a inibir 77,5% e 76,4% do

crescimento tumoral, respectivamente.

As análises histopatológicas dos órgãos removidos dos animais tratados sugerem

que o fígado pode ser considerado como potencial alvo da toxicidade da vitafisalina F, já que

foi observado degeneração de hepatócitos com fragmentação nuclear, esteatose e pontos

focais de necrose. De qualquer modo, essas alterações hepáticas observadas nos animais

tratados com a vitafisalina F podem ser consideradas como alterações de caráter reversível

(SCHEUER; LEFKOWITCH, 2000; KUMAR, 2004; McGEE et al., 1992). Até quando há

necrose hepatocelular, mas o tecido conjuntivo permanece preservado, a regeneração do

109

fígado se da quase que por completa (SCHEUER; LEFKOWITCH, 2000; KUMAR, 2004).

Muitos achados em biópsias sugerem que os fármacos devem ser considerados como

possíveis causadores de qualquer lesão hepática in vivo, e a remoção ou ajuste na dosagem

destes fármacos normalmente leva a uma melhoria mais rápida e a uma diminuição destes

efeitos tóxicos (SCHEUER; LEFKOWITCH, 2000).

De qualquer modo, os resultados in vivo comprovam o potencial anticâncer dos

vitaesteróides, em que a vitafisalina F, juntamente com a vitaferina A, contribuem

expressivamente para a atividade antitumoral dos extratos de A. arborescens, justificando a

eficácia antitumoral desta espécie, conforme relatado na sabedoria popular. Vale a pena

também ressaltar que é extremamente importante o fato da atividade antitumoral da

vitafisalina F também ser observada após administração oral, já que este é o método mais

comum de administração de fármacos, por ser mais segura, econômica e mais conveniente

para os pacientes, o que pode representar um avanço significativo na sua qualidade de vida

(GEBBIA; PUOZZO, 2005). De fato, o produto natural não necessariamente precisa ser o

melhor composto para o uso na clínica. Esses compostos podem servir como protótipo para o

desenvolvimento de outros fármacos que apresentem melhores características como: o

aumento da atividade, a melhora das propriedades farmacocinéticas e principalmente o

aumento da seletividade e consequentemente da redução dos efeitos adversos (ORTHOLAND

et al., 2004).

Desta forma, os dados obtidos neste trabalho tornam as vitafisalinas F, O, M e N

compostos bastante promissores, onde estes resultados, tanto in vitro como in vivo, reforçam o

potencial anticâncer destes compostos estudados. Entretanto as vitafisalinas parecem atuar por

diferentes vias, inibindo a síntese de DNA, induzindo a ativação de caspases e acumulando

células na fase G

/M do ciclo celular, o que torna necessário a realização de estudos mais

detalhados para elucidar o verdadeiro mecanismo de ação destes compostos.

110

Conclusão

111

6 CONCLUSÃO

As vitafisalinas O, F, M, N e (17S,20R,22R)-5β,6β:18,20-2-diepóxi-4β,18-

diidróxi-1-oxovita-3-24-enolido isoladas da planta Acnistus arborescens possuem potente

atividade citotóxica, embora apresentem pouca seletividade para células tumorais. As

vitafisalinas O e F foram os compostos mais ativos dentre os cinco estudados, e a presença de

uma ligação dupla entre os carbonos 2 e 3

na estrutura molecular destes compostos é que

parece ser a responsável por essa maior atividade. Esses compostos causam um bloqueio na

fase G

/M do ciclo celular, levando à ativação das caspases pela via intrínseca de apoptose.

Além disso, a redução de 77 % no crescimento tumoral in vivo, pela vitafisalina F, e a

moderada toxicidade sistêmica, ressaltam o potencial antitumoral desses compostos.

112

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