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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
CLEYDE FERREIRA BARRETO
Estudo das alterações morfohistológicas em larvas de
Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) submetidas ao
extrato bruto etanólico de Sapindus saponaria Lin.
(Sapindaceae).
Orientador:
Prof. Dr. Ionizete Garcia da Silva
Co-orientadora:
Profª. Dr. Gláucia Maria Cavasin
Dissertação de Mestrado
Goiânia – GO, 2005
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2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
CLEYDE FERREIRA BARRETO
Estudo das alterações morfohistológicas em larvas de
Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) submetidas ao
extrato bruto etanólico de Sapindus saponaria Lin.
(Sapindaceae).
Orientador:
Prof. Dr. Ionizete Garcia da Silva
Co-orientadora:
Profª. Dr. Gláucia Maria Cavasin
Dissertação submetida à CPGMT/
IPTSP/UFG como requisito parcial
para obtenção do Grau de Mestre
em Medicina Tropical na área de
concentração em Parasitologia.
Goiânia – GO, 2005
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3
Ao meu querido esposo,
Adriano, maior
incentivador desta
conquista, dedico.
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por sua presença em todos os momentos de
minha vida.
Ao Dr. Ionizete Garcia da Silva, professor Titular do Departamento
de Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP), do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTESP), da
Universidade Federal de Goiás (UFG), pela orientação, apoio e incentivo;
A Dra. Heloísa Helena Garcia da Silva, professora do
DMIPP/IPTESP/UFG, pela amizade, convívio e prestabilidade em todas
as etapas deste trabalho;
Ao IPTESP e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
da UFG pela oportunidade;
A CAPES, pela bolsa concedida;
A Fundação de Apoio à Pesquisa (Funape), pelo apoio financeiro
prestado;
A Dra. Gláucia Maria Cavasin, pela amizade, confiança e pelo
valioso apoio na realização dos estudos histopatológicos;
Ao colega de pós-graduação do IPTESP, Júlio Henrique Oliveira,
pela simpatia e amizade, e pela importante colaboração no processo de
obtenção do extrato da planta;
A Carmeci Natalina Elias, Técnica de laboratório da Secretaria de
Estado da Saúde de Goiás/ Fundação Nacional de Saúde-GO, pelo grande
auxílio na realização deste trabalho e pela inestimável amizade;
Aos técnicos Edson de Castro, Girlene Sena de Assis e Taísia Izabel
Vieira, pelo apoio em todos os momentos deste trabalho;
5
Ao Instituto de Ciências Biológicas (ICB) e ao Departamento de
Morfologia, pela concessão do Laboratório de Histologia para a realização
dos cortes em historesina;
Aos funcionários técnicos do Departamento de Morfologia, Judth
Alves Barbosa e Otávio Cavalcante Barros, pelo auxílio na coloração e
montagens das lâminas;
A Professora Dra. Maria Helena Rezende por permitir o uso do
Fotomicroscópio do Laboratório de Botânica do Departamento de Biologia
Geral da UFG;
Aos meus queridos pais e irmãos, pelo amor e compreensão em todos os
momentos. A meu filho, Pedro, pelo amor incondicional mesmo durante os
períodos de ausência.
6
APRESENTAÇÃO
A dengue é um dos principais problemas de saúde pública, e ocorre
principalmente em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Suas
manifestações clínicas variam de uma síndrome viral, inespecífica e benigna,
até um quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque. A
Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 50 a 100 milhões de novos
casos ocorram anualmente em todos os continentes, exceto na Europa. O
Brasil passou cerca de 60
anos sem apresentar nenhum registro de casos de
dengue em seu território, porém, as más condições sócio-ambientais
favoreceram a expansão do mosquito vetor, o Aedes aegypti, desde a sua
reintrodução em 1976. Desde então, o país tem sofrido sucessivas epidemias
da doença, sendo a última mais grave ocorrida em 2002, com quase 800.000
casos.
As razões para o ressurgimento da dengue, não só no Brasil, mas em
todo mundo, ainda não são muito esclarecidas, no entanto, sabe-se que o
crescimento global da população e a urbanização não planejada e
descontrolada, especialmente nos países tropicais em desenvolvimento, têm
contribuído para a expansão do A. aegypti.
Este vetor tem uma grande capacidade de se adaptar ao ambiente
humano e uma extraordinária competência na busca e na escolha de locais
para a oviposição, colonizando os mais variados tipos de criadouros. Essa
incrível adaptação, associada à fatores como temperatura, umidade, altitude,
entre outros, dá ao A. aegypti totais condições de propagação territorial. A
disseminação desse vetor já alcançou tamanha proporção que, hoje, acredita-
se ser impossível uma nova erradicação do A. aegypti, falando-se apenas em
controle do vetor.
A luta contra o mosquito A. aegypti, também vetor da febre amarela
urbana, requer várias atividades de vigilância. Estas baseiam-se em
saneamento básico, inspeção e eliminação de reservatórios, através da ação
de guardas-sanitários que visitam periodicamente todas as edificações
urbanas, e em medidas de informação e educação, realizadas através das
campanhas nacionais de combate à dengue veiculadas nas principais vias de
comunicação (rádio, TV, jornais, revistas, etc.). Como 90% dos focos do
7
mosquito estão presentes nas residências é imprescindível a participação da
comunidade para tornar o combate ao mosquito eficaz e para evitar a sua
proliferação.
A principal estratégia de controle do A. aegypti tem sido o uso intensivo
de inseticidas químicos, principalmente o organofosforado temephos e o
piretróide cipermetrina. O uso indiscriminado desses inseticidas vem sendo
questionado quanto à sua real eficiência e quanto aos danos ambientais que
podem causar. Durante a vigência de uma epidemia, a aplicação espacial de
inseticida em ultra baixo-volume pode ser uma medida valiosa no extermínio do
vetor, porém pouco efetiva na manutenção de baixos índices de infestação
predial. Além disso, o uso freqüente de inseticidas tem levado ao
desenvolvimento de resistência do mosquito a estes compostos. No Brasil, já
foi detectada a resistência ao temephos em populações de A. aegypti em 12
Estados. A resistência resulta no aumento da freqüência de aplicação de
inseticidas, dosagens crescentes, rendimentos diminuídos, danos ambientais e
surgimento de novos casos da doença quando o vetor não pode ser controlado.
Em busca de novas alternativas para o controle do vetor da dengue
várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas no intuito de se encontrar um
inseticida menos tóxico ao meio ambiente, mais eficaz e com menos chances
de induzir resistência. Neste contexto, os bioinseticidas de origem botânica e
com atividade larvicida, vêm sendo amplamente estudados pelos cientistas.
Este trabalho demonstra o potencial larvicida da planta Sapindus
saponaria Lin. (Sapindaceae) frente às larvas de A. aegypti e seu mecanismo
de ação. Conhecida popularmente como sabonete-de-soldado, a planta
compreende mais de 140 gêneros distribuídos nos trópicos e subtrópicos de
todo o planeta. É uma espécie arbórea que, além de ser considerada
potencialmente medicinal, possui importância econômica na construção civil e
é amplamente usada no reflorestamento de áreas degradadas.
Os experimentos realizados com essa planta demonstraram uma
atividade larvicida eficaz contra o A. aegypti, sendo que o modo de ação do
extrato centralizou-se na destruição celular do tubo digestivo do inseto, com
alterações irreversíveis.
Diante da situação atual no Brasil, com epidemias anuais de dengue,
com risco eminente de introdução do vírus Den-4 no país e a diminuição da
8
susceptibilidade do inseto aos inseticidas químicos, a descoberta de um
bioinseticida eficiente, que não agrida o meio ambiente nem o homem, parece
ser uma forma racional no controle dos insetos vetores. Este trabalho procurou
esclarecer os mecanismos de ação e o potencial da planta S. saponaria como
um candidato inseticida a ser utilizado no controle de A. aegypti. A
demonstração do local de atuação e da forma de ação são de grande
importância para a potencialização de seus efeitos e o desenvolvimento do
produto inseticida.
9
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIAÇÕES.............................................................................. 11
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... 12
RESUMO......................................................................................................... 15
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16
1.1. Dengue e o Aedes aegypti ....................................................................... 16
1.2. Resistência do Aedes aegypti aos inseticidas químicos .......................... 18
1.3. Impacto na natureza................................................................................. 19
1.4. Inseticidas botânicos como alternativa no controle de vetores................. 20
1.5. Estudos morfohistológicos........................................................................ 22
1.6. Bioprospecção.......................................................................................... 23
1.7. Sapindus saponaria.................................................................................. 24
2. OBJETIVOS................................................................................................ 26
3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................... 27
3.1. Obtenção das larvas ................................................................................ 27
3.2. Bioensaios............................................................................................................28
3.3. Processamento histopatológico ................................................................ 29
3.4. Obtenção do extrato de S. saponaria....................................................... 30
3.4.1. Coleta, secagem e moagem.................................................................. 30
3.4.2. Extração................................................................................................ 30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 31
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 32
Artigo 1 – Submetido à Revista de Patologia Tropical ........................................
........................................................................................................................ 37
Estudo das alterações morfohistológicas em larvas de Aedes aegypti (Diptera,
Culicidae) submetidas ao extrato bruto etanólico de Sapindus saponaria Lin.
(Sapindaceae). ...........................................................................................................37
Resumo........................................................................................................... 37
Introdução ....................................................................................................... 38
Materiais e métodos........................................................................................ 41
Resultados ...................................................................................................... 44
10
Discussão........................................................................................................ 53
Referências bibliográficas ............................................................................... 59
ANEXO I.......................................................................................................... 66
ARTIGO I......................................................................................................... 66
11
LISTA DE ABREVIAÇÕES
1
μm
Micrômetro
C Cutícula
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CE Célula epitelial
CG Cecos gástricos
CL Concentração letal
CL
99
Concentração letal que mata 99% das larvas
cm Centímetro
DDT Diclorodifeniltricloroetano
e.b.e. Extrato bruto etanólico
ES Espaço subperitrófico
EtOH Etanol
FHD Febre hemorrágica da dengue
g Grama
GC Gas Cromatography
h Hora
HE Hematoxilina-eosina
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IC Intervalo de confiança
Kg Kilograma
L Luz intestinal
M Molar
MeOH Metanol
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetros
Mu Músculo
1
Algumas abreviações foram mantidas em inglês por já estarem estabelecidas na literatura e entre
pesquisadores.
12
N Núcleo
Nu Nucléolo
OMS Organização Mundial de Saúde
ppm parte por milhão
RA Região anterior do mesêntero
RM Região mediana do mesêntero
RMN
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1
RP Região posterior do mesêntero
SCD Síndrome do choque da dengue
T Traquéia
TM Túbulos de Malpighi
V Vesícula
VC Válvula cárdia
LISTA DE FIGURAS
Figuras da Apresentação
Figura 1 – Planta Sapindus saponaria. A – Árvore. B – Folhas. C – Frutos
maduros e sementes.................................................................... 26
Figura 2 – Alimentação de mosquitos adultos de Aedes aegypti - A:
Camundongos presos em tela de náilon usados na alimentação de
fêmeas de Aedes aegypti. B: absorvente interno feminino embebido
em água açucarada usado na alimentação dos machos de Aedes
aegypti.......................................................................................... 26
Figuras do Artigo
Figura 1. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em
Hematoxilina-eosina (HE), de larvas de 3° estádio de Aedes aegypti
do grupo controle. A. Vista geral. 50X. B. Região anterior. 400X. C.
Região mediana. 1000X. D. Região posterior. 1000X. E. Região
posterior evidenciando grande atividade secretora. 1000X.
13
RA=região anterior, RM= região mediana, RP=região posterior,
CG=cecos gástricos, VC= válvula cárdia, T=traquéia, CE=célula
epitelial, N=núcleo, seta=matriz peritrófica, cabeça de seta=bordo
em escova, Nu=nucléolo, ES=espaço subperitrófico, V=vesícula
secretora, L=luz intestinal............................................................. 47
Figura 2. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em HE, de
larvas de 3° estádio de Aedes aegypti mantidas por 9 h em
solução do e.b.e. de Sapindus saponaria a 50 ppm. A: Vista
geral.100X. B. Região anterior com aparente estratificação do
epitélio. 100X. C e D. Região mediana em intensa atividade
secretora e luz intestinal que se projeta em dobra em conseqüência
do encolhimento do tubo digestivo. 400X. E. Detalhe do
estreitamento na região posterior do mesêntero com aparência
recurvada (seta). 400X. RA=região anterior, RM=região mediana,
RP=região posterior, C=cutícula, CE=célula epitelial, Mu=músculo,
L=luz intestinal, V=vesícula secretora. ......................................... 49
Figura 3. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em HE, de
larvas de 3° estádio de Aedes aegypti mantidas por 3 h em
solução do e.b.e. de Sapindus saponaria a 75 ppm. A. Região
anterior do mesêntero mostrando constrição (seta). 200X. B.
Detalhe da constrição evidenciando células epiteliais com vesículas
apicais (V). 400X. Notar a transição do epitélio colunar para plano
(seta). 200X. C. Região mediana formada por epitélio pavimentoso.
400X. C=cutícula, T=traquéia, L=luz intestinal, Mu=músculo,
CE=células epiteliais. ................................................................... 50
Figura 4. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em HE, de
larvas de 3° estádio de Aedes aegypti mantidas por 3 h em
solução do e.b.e. de Sapindus saponaria a 100 ppm. A: Vista geral
evidenciando a divisão do mesêntero através de constrições. 50X.
B. Região anterior com células epiteliais vesiculadas (V) e
constrição formada logo após essa região (seta). 200X. C. Região
mediana formada por epitélio pavimentoso e detalhe das duas
14
constrições (cabeça de seta). 200X. RA= região anterior do
mesêntero, RM= região mediana, RP= região posterior, TM=túbulos
de Malpighi, Mu=músculo, C=cutícula, CE=células epiteliais....... 51
Figura 5. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em HE, do
mesêntero de larvas de 3°estádio de Aedes aegypti mantidas por
12 h em solução do e.b.e. de Sapindus saponaria a 75 ppm. A:
Vista geral da larva evidenciando o aspecto encolhido da larva
observado através das intensas dobras formadas na cutícula (C).
100X. B. Região anterior. 200X. Notar as curvas formadas na
parede celular que acompanham as dobras da cutícula. 200X.
Mu=músculo, CE=células epiteliais, T=traquéia, C=cutícula........ 52
Figura 6. Fotomicrografias de secções em historesina, coradas em HE, de
larvas de 3° estádio de Aedes aegypti mantidas por 20 h em
solução do e.b.e. de Sapindus saponaria a 100 ppm. A. Vista geral
mostrando a transição entre a região anterior (RA), mediana (RM) e
posterior (RP) do mesêntero. Notar a presença de constrição na
região posterior (seta). 50X. B. Região anterior. 100X. C. Detalhe
da vacuolização citoplasmática e da formação de vesículas (V) nas
células da região anterior. 400X. D. Transição entre epitélio
cilíndrico e pavimentoso (seta). 400X. E. Detalhe da obstrução na
luz intestinal na região posterior causada pela ocorrência de dobra
no mesêntero. 400X. VC=válvula cárdia, CG=cecos gástricos,
CE=célula epitelial, N=núcleo, L=luz intestinal, V=vesículas
secretora, Mu=músculo, TM=túbulos de Malpighi. ....................... 53
15
RESUMO
A dengue é hoje a arbovirose mais importante no mundo e o seu controle está
restrito, basicamente, ao combate do principal vetor, o Aedes aegypti. As ações
têm sido por inseticidas químicos sintéticos. Estes possuem ação rápida e
eficaz no combate, porém são altamente tóxicos aos mamíferos e ao meio
ambiente. Seu uso tem induzido ao desenvolvimento de resistência do
mosquito. Produtos naturais provenientes de plantas poderão ser candidatos
alternativos às medidas de controle pela baixa toxicidade aos mamíferos e sem
impacto ambiental. Neste estudo, apresentam-se as alterações
morfohistológicas e a atividade larvicida do extrato bruto etanólico (e.b.e.) da
casca do fruto de Sapindus saponaria sobre o A. aegypti, visando ao controle
desse mosquito. Larvas de 3° estádio foram submetidas a diferentes
concentrações do e.b.e., obtido da casca do fruto de S. saponaria, previamente
solubilizado em água, onde permaneceram por até 48 h. As larvas que
atingiram estado letárgico foram coletadas e fixadas em paraformoldeído,
incluídas em resina e as lâminas coradas pela técnica de hematoxilina-eosina e
analisadas por microscospia óptica. A CL
99
foi estabelecida em 134,1 ppm
(IC=93,8-223,8). Os efeitos tóxicos do e.b.e. da casca do fruto de S. saponaria
sobre larvas de A. aegypti foram observados em todas as três regiões do
mesêntero, com várias alterações histopatológicas, como a destruição total ou
parcial das células, alta vacuolização do citoplasma, hipersecreção das células
epiteliais e pavimentação do epitélio. Estas alterações celulares evidenciam o
mecanismo de ação do e.b.e. de S. saponaria sobre larvas de A. aegypti.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Dengue e Aedes aegypti
A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem e
constitui um sério problema de saúde pública no mundo. A Organização
Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de 2,5 bilhões de pessoas vivem
em áreas onde a dengue pode ser transmitida (OMS 2002). Essas áreas estão
centradas, especialmente, nos países de clima tropical, onde as condições do
meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do Aedes
aegypti, principal transmissor da doença. A dengue se manifesta como uma
doença febril aguda de evolução benigna na forma clássica, e grave, quando
se apresenta na forma hemorrágica. O agente etiológico da dengue é um
arbovírus, do gênero Flavivírus, pertencente à família Flaviviridae. São
conhecidos quatro sorotipos do vírus da dengue: Den-1, Den-2, Den-3 e Den-4
(MS 2002).
O quadro clínico da dengue clássica envolve sintomas como febre,
enxaqueca, mialgia, artralgia, fraqueza e anorexia; vômitos e diarréia
moderada são comuns. A forma hemorrágica é caracterizada por uma febre
súbita, náusea, vômitos, todos os tipos possíveis de manifestações
hemorrágicas, sinais de vazamento capilar difuso e queda da pressão arterial
(Marzochi 1994, Monath 1994). A taxa de fatalidade da dengue hemorrágica é
de 5%, mas nos países onde a fisiopatologia da doença é bem conhecida
pelos clínicos e as condições de atendimento ao paciente são boas, a taxa cai
para menos que 1% (Gubler 2004).
Os primeiros registros de dengue no mundo foram feitos no fim do
século XVIII, no Sudoeste Asiático, em Java, e nos Estados Unidos, na
Filadélfia. Mas a OMS só a reconheceu como doença neste século (MS 2002).
No Brasil, a história do mosquito A. aegypti provavelmente começa com
os navios negreiros. A partir de sua reintrodução em 1976 sua expansão toma
dimensões assustadoras, ao ponto de, no ano de 2002, ter sido relatada a
presença da doença em 24 unidades federadas do país (MS 2002).
Nos últimos anos, tem-se observado um aumento da circulação da
dengue no Brasil e no mundo, assim como a incidência de casos de dengue
hemorrágica. As razões para essa re-emergência da dengue ainda não são
17
completamente entendidas, mas está claramente relacionada com as
mudanças demográficas e da sociedade que ocorreram nos últimos 50 anos.
Os crescentes processos de urbanização, com o aumento da densidade
populacional nas grandes cidades contribuem para uma maior possibilidade de
transmissão do vírus. Além disso, as cidades crescem de forma desordenada,
sem infra-estrutura adequada, insuficiência de saneamento básico,
principalmente abastecimento de água e coleta de lixo. A produção de
recipientes plásticos descartáveis, cada vez maior, aumenta o número de
criadouros potenciais, ampliando a densidade do mosquito. O crescente fluxo
de pessoas que transitam pelas diversas áreas e países propicia a expansão
da dengue para áreas indenes (Marzochi 1994, Tauil 2001, Gubler 2004).
O mosquito A. aegypti é originário da África onde ainda mantém seus
hábitos silvestres, se alimentando, principalmente, em roedores e outros
animais selvagens. Foi disseminado por todo continente Americano pelo
próprio homem através do transporte dos seus ovos, larvas e até do mosquito
adulto em navios, aviões e veículos terrestres. No mundo moderno o A.
aegypti se adaptou facilmente às áreas urbanas e vive preferencialmente
dentro das casas ou perto delas, uma vez que lá encontra melhores condições
para sua reprodução: sangue humano e depósitos com água. As fêmeas
passaram a ovipor em ecótopos artificiais localizados no domicílio e
peridomicílio. Quase toda coleção de água limpa e parada (caixas d' água,
cisternas, latas, pneus, cacos de vidro e vasos de plantas) funciona como
criadouro potencial para sua proliferação. Alguns pesquisadores já relataram o
desenvolvimento do mosquito também em água poluída (Monath 1994, Silva et
al. 1999).
Os ovos não são colocados em contato com a água, mas na parede do
recipiente e podem permanecer viáveis por até 2 anos, bastando, depois disso,
apenas o contado com a água para ocorrer a eclosão (Silva et al. 1998). Esta
pode acontecer em diferentes intervalos de tempo, dando ao A. aegypti
maiores chances de sobreviver às adversidades do meio ambiente. A
quiescência e os diferentes períodos de eclosão dos ovos são adaptações do
mosquito que favorecem sua expansão e dificultam seu controle (Silva & Silva
1999, 2000).
18
A transmissão da dengue ao homem se faz pela fêmea do A. aegypti,
durante a hematofogia. A alimentação sanguínea é necessária para completar
o processo de amadurecimento do folículo ovariano. De oito a 12 dias após um
repasto de sangue infectado, o mosquito está apto a transmitir o vírus da
dengue (Monath 1994, Gubler 1998).
Infelizmente, ainda não se desenvolveu uma vacina eficaz na prevenção
da dengue. Até o momento, o controle do vetor se apresenta com a única
forma de controlar a doença. Esse controle é feito através da eliminação dos
criadouros potenciais dos mosquitos vetores, aplicação de larvicidas em
depósitos de água de consumo e uso de inseticidas para as formas adultas,
durante os períodos de transmissão (Tauil 2001).
Os inseticidas comumente usados são os organofosforados e
piretróides. Os principais problemas do uso destes inseticidas são o
aparecimento de populações resistentes de mosquitos a esses produtos e os
danos ambientais provocados por seu uso intensivo (Polanczyk et al. 2003,
Luna et al. 2004).
1.2. Resistência do Aedes aegypti aos inseticidas químicos
Por mais de 30 anos, e ainda hoje o organofosforado temephos é o
larvicida exclusivo usado no Brasil para controle do A. aegypti. Com as
epidemias de 1986, seu uso foi amplamente intensificado. Em pouco tempo,
casos de resistência ao temephos em diversas regiões do Brasil começaram a
surgir, levando à implantação de programas de monitoramento da
suscetibilidade do mosquito aos inseticidas químicos (Andrade & Modolo 1991;
Campos & Andrade 2001; Polanczyk et al. 2003; Braga et al. 2004; Carvalho et
al. 2004; Luna et al. 2004).
A existência de vetores resistentes a um determinado produto químico
pode ocorrer como resultado de fatores genéticos e operacionais, entre outros.
A resistência é uma característica genética que se insere numa população em
função do uso de inseticidas. Ou seja, quanto mais o inseticida for utilizado,
mais rápido e maior é a seleção de insetos resistentes na população e,
consequentemente, maior o nível de resistência atingido. A capacidade dos
insetos de tolerar concentrações inicialmente letais promove uma redução
19
gradual na eficácia dos inseticidas, até a sua completa ineficiência. Os fatores
operacionais também desempenham um importante papel na implantação da
resistência. Estes estão relacionados ao uso de inseticidas (classe, formulação
e concentração, método de aplicação, freqüência de tratamentos, etc.) e por
isso, podem ser perfeitamente controlados, fato que, na verdade, não ocorre
devido ao uso indiscriminado dos produtos (Cruz 2002, Carvalho et al. 2004).
No processo de desenvolvimento de resistência pode ocorrer um
fenômeno denominado de “resistência cruzada” (proteção contra mais de um
inseticida por apenas um mecanismo de ação; comum entre inseticidas
piretróides), onde toda a classe torna-se comprometida. E, dependendo do
mecanismo envolvido, a resistência a um determinado inseticida pode levar
também ao estabelecimento de resistência a inseticidas de outras classes,
dificultando a substituição do produto. Os principais problemas quando ocorre
suspeita de resistência são o emprego de maiores concentrações ou
quantidade do composto, na tentativa de recuperar sua eficácia e o aumento
da freqüência de aplicação e substituição do produto. Além dessas ações
serem ambientalmente negativas, não são eficazes no controle da expansão
territorial dos insetos vetores (Cruz 2002).
1.3. Impacto na natureza
Uma questão ainda mais séria se refere ao impacto ambiental. Devido a
existência de populações do mosquito resistentes ao produto, um número
maior de aplicações são utilizadas de forma irracional, de modo que, cada vez
mais quantidades desses produtos são colocados na natureza causando
grandes estragos. Um bom exemplo disto foi o uso do DDT
(diclorodifeniltricloroetano), um inseticida do grupo dos organoclorados, que foi
utilizado com grande sucesso a partir dos anos 40, no combate ao mosquito
etor da malária e em pragas agrícolas. Durante décadas, o produto foi
largamente usado no país até ser comprovado seu potencial cancerígeno e
seu extenso tempo de degradação (4 a 30 anos). O principal problema do DDT
é sua ação indiscriminada, que atinge tanto os insetos quanto o resto da fauna
e flora da área afetada (D’Amato et al. 2002).
20
A contínua utilização do controle químico no combate aos insetos
vetores pode causar grandes desequilíbrios ambientais mediante a eliminação
de insetos benéficos, a contaminação do meio ambiente (solo, água, atmosfera
e seres vivos), e intoxicações acidentais em pessoas devido à má utilização
dos inseticidas. Este último trazendo sérios problemas de saúde pública.
Generalizando, todas as substâncias químicas podem causar efeitos adversos
à saúde dependendo da dose e das condições às quais os indivíduos são
expostos a elas (Paumgartten 1993).
As maiores vítimas de intoxicações são os agentes de saúde que
trabalham no controle de vetores causadores de endemias.
Esses agentes,
normalmente, não têm treinamento adequado para o manuseio dos inseticidas
utilizados, trabalham sem os equipamentos de proteção individual necessários
e os aparelhos de mata-mosquito utilizados encontram-se em péssimo estado
de conservação. E, infelizmente, esse problema ainda se estende por diversos
municípios brasileiros. Os sintomas de intoxicação por inseticidas
organofosforados são lacrimejamento, salivação, sudorese, diarréia, tremores
e distúrbios cardiorrespiratórios. A intoxicação por inseticidas do grupo
piretróide são menos comuns, devido a sua baixa toxicidade aos mamíferos.
Reações alérgicas são os sintomas mais comumente encontrados, incluindo
dermatite, asma, rinite alérgica. As manifestações cutâneas mais freqüentes
são eritema, prurido, pápulas e vesículas (Cavaliere et al. 1996, Caldas 2000).
Todos esses fatores alertam a comunidade científica para a busca de
formas alternativas para o controle dos insetos vetores. Neste contexto, os
bioinseticidas ou inseticidas naturais apresentam-se como uma opção
econômica e ecologicamente viável.
1.4. Inseticidas botânicos como alternativa no controle de vetores
Em todo o mundo, a utilização doméstica de plantas com fins
medicinais, são hábitos comuns na cultura popular. Porém, seu uso no
combate aos mosquitos transmissores de doenças parece ser a grande
novidade em vigilância entomológica. As plantas, como organismos que co-
evoluem com insetos e outros microorganismos e que, portanto, desenvolvem
mecanismos de defesa contra predadores, são fontes naturais de substâncias
inseticidas e antimicrobianas. Estas também sintetizam inúmeros compostos
21
voláteis para atrair polinizadores e se defenderem de herbívoros (Simas et al.
2004). Desta forma, substâncias extraídas da casca do caule, das folhas e dos
frutos de diversas plantas têm demonstrado propriedades larvicidas no
controle de diversos culicídeos (Arruda et al 2003a, Gusmão et al. 2002, Silva
et al. 2003, Silva et al. 2004, Simas et al 2004).
Na agricultura, o uso de inseticidas botânicos trouxe enormes
vantagens, como a diminuição dos custos de produção e a preservação do
ambiente e dos alimentos da contaminação química, contribuindo para o
aprimoramento da qualidade de vida da população (Roel 2001).
A utilização dos bioinseticidas tem algumas vantagens quando
comparado ao emprego de inseticidas químicos: os inseticidas naturais são
obtidos de recursos renováveis e são rapidamente degradáveis, ou seja, não
persistem no ambiente; o desenvolvimento da resistência dos insetos a essas
substâncias, compostas da associação de vários princípios ativos, é um
processo que ocorre muito lentamente. Esses produtos agem de diversas
formas sobre os insetos provocando repelência, inibição de oviposição e da
alimentação, distúrbios no desenvolvimento, deformações, infertilidade e
mortalidade (Roel 2001).
Vários experimentos já demonstraram o efeito tóxico de substâncias
extraídas de plantas sobre diversos culicídeos. Investigações sobre a atividade
larvicida do Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e da Magonia pubescens
sobre A. aegypti demonstraram resultados consideráveis (Silva et al. 2004;
Simas et al. 2004). Para controle do mosquito Culex quinquefasciatus, vetor da
filariose bancroftiana, comprovou-se o efeito larvicida do óleo-resina de
Copaifera reticulata (Silva et al. 2003).
Os estudos sobre as propriedades inseticidas das plantas nos remete à
um possível controle vetorial com baixo impacto ambiental e baixo custo
econômico.
22
1.5. Estudos morfohistológicos
Embora existam pesquisas sobre a atividade larvicida de plantas (Silva
et al. 2003; Silva et al. 2004; Simas et al. 2004), e estudos morfohistológicos
(Gusmão et al. 2002; Arruda et al. 2003a,b), nenhum relata o mecanismo de
ação da atividade larvicida de S. saponaria.
Estudos de microscopia óptica e eletrônica de transmissão de larvas de
A. aegypti expostas ao extrato de Derris urucu mencionam as modificações
ocorridas na matriz peritrófica como uma forma da atividade larvicida do
extrato (Gusmão et al. 2002).
Os efeitos toxicológicos e morfológicos do extrato bruto etanólico de M.
pubescens, sobre larvas de A. aegypti foram analisados por Arruda et al.
(2003a,b) através da microscopia de luz e de testes histoquímicos onde as
alterações detectadas comprovaram sua ação, confirmando seu potencial
como inseticida.
Estudos similares foram realizados com larvas desse mosquito, usando
o diflubenzuron, um inseticida fisiológico, regulador de crescimento, que age
através da inibição da ecdise, evidenciando os mecanismos letais (Borges et
al., 2004). Esta investigação evidenciou o diflubenzuron como um promissor
candidato alternativo ao controle.
1.6. Bioprospecção
As plantas respondem a estímulos ambientais bastante variáveis, de
natureza física, química ou biológica. Fatores ambientais como tipo do solo,
umidade, radiação solar, vento, temperatura e poluição atmosférica, dentre
outros, podem influenciar e alterar a composição química dos vegetais. Além
desses, há interações e adaptações coevolutivas complexas produzidas entre
as plantas e o ecossistema. Nesta adaptação ao meio ambiente, são
produzidas substâncias importantes para sua manutenção e proteção. O
metabolismo primário das plantas é o responsável pela produção de celulose,
lignina, proteínas, lipídios, açúcares e outras substâncias responsáveis por
suas principais funções vitais. Do metabolismo secundário resultam
substâncias de baixo peso molecular, às vezes produzidas em pequenas
quantidades, como alcalóides, terpenóides e derivados de fenilpropanóides.
Tais estruturas funcionariam como agentes defensivos na luta contra
23
predadores, a exemplo de microorganismos patogênicos. Os fenilpropanóides
e, especialmente, os terpenóides são os principais constituintes que estão
envolvidos nas interações planta-inseto (Alves 2001).
Na busca de substâncias ativas de plantas, a medicina popular pode ser
fonte de importantes informações. Dados da literatura revelam a existência de
uma maior probabilidade de se encontrar atividade biológica em plantas
orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas escolhidas ao
acaso (Cechinel Filho & Yunes 1998). Para a análise das substâncias bioativas
de uma planta, deve-se primeiramente, escolher a espécie a ser estudada e
em seguida definir o local de coleta. A planta deve ser seguramente
identificada e, de cada espécime, deve-se coletar entre 3-5 Kg de material. A
secagem pode ser realizada ao sol, à sombra ou em estufa a 40°C, sempre
com circulação de ar. A armazenagem deve ser feita em sacos plásticos,
acondicionados em caixas de papelão guardadas em local seguro, com baixa
umidade e temperatura para a prevenção de reações de oxidação, hidrólise,
ataque de microorganismos, entre outros. A moagem só deverá ser efetuada
na ocasião da preparação dos extratos (Maciel et al. 2002).
Para a extração, a percolação é o processo preferencialmente utilizado,
pois apresenta menor risco de reações químicas, na formação de artefatos,
decorrentes da ação combinada entre solventes e temperaturas elevadas.
Para uma única extração (a frio ou a quente) usa-se geralmente o solvente
polar EtOH; para mais de uma extração utilizam-se três tipos de solventes:
apolar, de polaridade moderada e polar. No entanto, devido aos protocolos
internacionais que condenaram o uso de solventes clorados, proibindo sua
produção, estes solventes já não devem ser mais utilizados para a preparação
de extratos, sendo portando, mais indicado, uma única extração utilizando
EtOH (Maciel et al. 2002). Posteriormente, este extrato deve ser submetido a
um processo de partição líquido-líquido, com solventes de polaridades
diferentes ou a uma cromatografia de coluna (CC), visando uma semi-
purificação das substâncias através de suas polaridades (Cechinel Filho &
Yunes 1998).
Todos os extratos devem ser testados biologicamente e aquele que
apresentar atividade de interesse, deverá ter seus compostos isolados e
purificados através de procedimentos cromatográficos como a CC, CCD,
24
CCDP, GC ou HPLC. O tipo de extrato que se está trabalhando e as condições
de infra-estrutura do laboratório são fatores determinantes na escolha dos
métodos de separação (Maciel et al. 2002).
As pesquisas das propriedades medicinais das plantas requerem o
envolvimento de diversas áreas de conhecimento (biólogos, químicos, etc.). A
integração destas áreas conduz a um caminho promissor e eficaz para
descobertas de substâncias capazes de auxiliar o homem no controle de
várias doenças.
1.7. Sapindus saponaria
Estudos realizados no Laboratório de Biologia, Fisiologia de Insetos e
Xenodiagnóstico demonstraram o potencial larvicida do extrato bruto etanólico
(e.b.e.) de S. saponaria em larvas de A. aegypti. Houve o interesse em se
estudar o mecanismo de ação pelo qual essa substância causava mortalidade
nas larvas.
A planta S. saponaria é originária da América tropical e subtropical. No
Brasil ocorre desde o Pará até o Rio Grande do Sul. A casca, a raiz e o fruto
são utilizados na medicina popular como calmante, diurético, expectorante e
contra a tosse. A madeira possui importância econômica na construção civil,
na confecção de brinquedos, na caixotaria e no artesanato. Os frutos servem
para a lavagem de roupas, por possuírem saponina, substância com
propriedades similares às do sabão. Além disto, é amplamente utilizada na
arborização urbana e no reflorestamento de áreas degradadas (Lorenzi 1992).
A árvore pode medir até 9 m de altura (Figura 1A). As folhas pecioladas
possuem de 7 a 9 folíolos, ápice agudo, membranáceo. Apresentam a face
inferior mais pálida, com poucos pelos curtos e com nervuras proeminentes e
face superior glabra e brilhante (Figura 1B). As inflorescências são em
panículas terminais, com muitas flores curto-pediceladas, brancas e pequenas.
Os frutos multiglobosos com carpelos individualizados são amarelados quando
maduros e medem cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1C). As sementes são
globulosas, pretas e duras (Figuras 1C). As flores ocorrem durantes os meses
de maio a junho e os frutos de julho a dezembro (Lorenzi 1992).
25
Figura 1 – Planta Sapindus saponaria. A – Árvore. B – Folhas. C – Frutos
maduros e sementes.
Mesmo com a imensa biodiversidade brasileira muito pouco se conhece
sobre a capacidade terapêutica das plantas. O Brasil é o país com a maior
diversidade vegetal genética do mundo, contando com mais de 55.000
espécies catalogadas, mas poucas estão em estudo (Alves 2001). Apesar de
seu amplo uso na medicina popular, há poucos estudos toxicológicos,
químicos e biológicos sobre a S. saponaria. O presente trabalho vem
complementar os conhecimentos sobre as potencialidades desta planta.
26
2. OBJETIVOS
2.1. Gerais
Estudo da atividade inseticida do extrato bruto etanólico (e.b.e.) de S.
saponaria sobre larvas de terceiro estádio de A. aegypti, visando ao controle
desse mosquito.
2.2. Específicos
Evidenciar o mecanismo de ação do e.b.e. da casca do fruto de S.
saponaria através das análises, em microscopia óptica, das principais,
alterações celulares ocorridas no mesêntero de larvas de terceiro estádio de A.
aegypti submetidas a esse extrato.
27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Obtenção das larvas
As larvas do mosquito A. aegypti foram obtidas da criação do
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstico do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de
Goiás (UFG) mantida há mais de 10 anos. A criação do mosquito se processou
numa câmara biológica climatizada com temperatura de 28±1°C, umidade
relativa de 80±5% e fotoperíodo de 12 h de acordo com a metodologia de Silva
et al. (1998).
Nesta criação as fêmeas são alimentadas em camundongos
imobilizados em uma tela de náilon (Figura 2A) e os machos em algodão,
usando para isso um absorvente feminino interno (tipo o.b.) embebido em
água açucarada (Figura 2B) (Silva et al. 1998). Um recipiente de vidro âmbar
contendo água e um papel de filtro, do tipo coador de café, é colocado dentro
da gaiola para a realização de posturas pela fêmea. O papel contendo os ovos
é coletado diariamente, seco, e em seguida, acondicionado em sacos plásticos
e armazenado em uma ovoteca.
Figura 2 – Alimentação do mosquito adulto A. aegypti - A:
camundongos presos em tela de náilon usados na
alimentação de fêmeas de Aedes aegypti. B: absorvente
interno feminino embebido em água açucarada usado na
alimentação de machos de Aedes aegypti.
28
3.2. Bioensaios
Cartelas de papel de filtro contendo ovos de A. aegypti foram retiradas
da ovoteca e colocadas em bacias plásticas, com água proveniente da rede
pública de abastecimento. As larvas foram alimentadas com ração para gatos,
colocada diretamente nas bacias. À medida que ocorreram as eclosões, as
larvas eram retiradas e separadas em outras bacias, para dar continuidade ao
ciclo. Para o experimento foram utilizadas larvas de 3° estádio, imediatamente
após a muda, por se tratarem de larvas mais resistentes para tais estudos
(Silva et al. 1998).
Utilizou-se uma concentração máxima de 100 ppm. Para tanto, foi feita
a pesagem de 0,05 g do extrato em balança analítica, que foi dissolvido em
500 ml de água destilada. A concentração de 100 ppm foi, posteriormente,
diluída para concentrações de 75 ppm e 50 ppm.
Essas soluções foram distribuídas em copos de polietileno,
descartáveis. Nestes foram colocados 25 mL de cada uma das soluções e, em
seguida, 25 larvas. Foram feitos 4 experimentos, todos em duplicata e em
cada um foram utilizadas um total de 200 larvas de 3° estádio. Os grupos
experimentais utilizados foram: Grupo I= larvas em e.b.e. a 100 ppm; Grupo II
= larvas em e.b.e. a 75 ppm; Grupo III = larvas em e.b.e. a 50 ppm; Grupo IV
=larvas controle.
Larvas controle foram submetidas às mesmas condições do teste,
utilizando-se apenas água destilada. Todos os grupos foram alimentados com
ração para gato, triturada, segundo a metodologia de Silva et al. (1998).
As larvas foram deixadas no e.b.e por tempos variados, sendo
coletadas a cada 3 horas, por um período de 48 horas, para a verificação das
alterações. Para verificar a letalidade foram observadas a mobilidade das
larvas e a reação das mesmas a estímulos externos como foco de luz (luz de
lanterna) e mecânico (toque com estilete, toque com bastão de vidro na parte
externa do recipiente). As larvas foram observadas em estereomicroscópio
modelo MZS 250, e só foram coletadas as larvas que se apresentavam em
estado letárgico; as mortas foram descartadas. Após serem retiradas das
soluções teste e controle, as larvas foram imediatamente colocadas em
fixador.
29
3.3. Processamento histopatológico
As preparações em historesina foram realizadas no Laboratório de
Histologia do Departamento de Morfologia (DM) do Instituto de Ciências
Biológicas (ICB) da UFG.
Inicialmente foram realizados experimentos a fim de se obter o fixador
que melhor conservasse a integridade celular. Foram testados 2 fixadores: A)
paraformoldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2; B) fixador
de Bouin. Optou-se pelo fixador A, pois as células apresentaram melhor estado
de preservação.
As larvas foram fixadas em temperatura ambiente por um período de, no
mínimo, 2 horas, segundo metodologia utilizada por Arruda et al. (2003a).
Depois de fixadas, as larvas foram lavadas no mesmo tampão e submetidas à
desidratação através de soluções com concentrações crescentes de etanol
(50, 70, 80, 90 e 95%) por um período de 10 minutos em cada solução. Após a
desidratação, as larvas foram embebidas em resina (resina básica + ativador)
“Leica Historesin Embedding Kit”, por um período de 12 horas à temperatura
ambiente. Posteriormente à embebição, o material foi incluído em resina
(resina de embebição + catalisador), pertencente ao mesmo kit (soluções
preparadas segundo especificações do fabricante), utilizando-se para isso
moldes de silicone, colocando as larvas na posição desejada. Os moldes, com
o material, foram deixados à temperatura ambiente por aproximadamente 12
horas para total polimerização da resina.
Após a polimerização, os blocos de resina foram montados em suportes
de madeira com cola araldite, e posteriormente seccionados com navalha de
vidro, em micrótomo Leiz 1512, adaptado para cortes semifinos, com
espessura de 3 μm, pertencente ao DM do ICB-UFG. Os cortes foram
distendidos em uma cuba contendo água a temperatura ambiente e
transferidos para lâminas histológicas; em seguida corados em hematoxilina e
eosina (HE) como método de rotina segundo proposto por: Pearse (1961),
Gabe (1976); Melo & Vidal (1980), Filipe & Lake (1983), Prophet et al. (1992),
conforme a seguinte técnica:
1. Corar com Hematoxilina de Harris à temperatura ambiente por 5 minutos
2. Lavar em água corrente
30
3. Secar em estufa a 40°C
4. Corar com Eosina alcoólica por 20 segundos
5. Lavar imediatamente em água corrente
6. Secar e montar em entellan
As lâminas preparadas foram fotomicrografadas em Fotomicroscópio
modelo Zeiss Axioskop MC80 do laboratório de Botânica do Departamento de
Biologia Geral da UFG, utilizando filmes de 35 mm colorido Kodak ProImage
ISO 100. Todos os aumentos indicados nas ilustrações referem-se aos obtidos
nos negativos.
3.4. Obtenção do extrato de Sapindus saponaria
3.4.1. Coleta, secagem e moagem
Frutos maduros da planta S. saponaria foram coletados na região
central da cidade de Goiânia-GO e processados no Laboratório de
Bioatividade de Plantas e Entomologia do IPTSP/UFG. O material foi colocado
em estufa de fluxo de ar forçado a 40°C para secagem. Houve a separação
manual da casca e da semente e ambos foram moídos separadamente em
moinho elétrico de facas até atingirem baixa granulometria. A quantidade de
material obtido da casca foi aproximadamente o dobro do produto obtido da
semente.
3.4.2. Extração
Uma amostra de 1 litro do pó foi submetida à percoloção a frio, onde o
material foi colocado em um béquer, ao qual acrescentou-se etanol até atingir
aproximadamente quatro centímetros acima do produto. O béquer foi coberto
com papel alumínio e permaneceu em repouso por 72 horas. Após a
percolação, o filtrado foi recolhido e concentrado em evaporador rotativo. O
extrato bruto etanólico (e.b.e.) obtido foi transferido para placas de vidro e
dessecado em uma capela de exaustão com o auxílio de jato de ar quente até
a completa evaporação do solvente e, posteriormente, foi armazenado em
dessecador até a utilização nos testes de atividade larvicida.
O e.b.e. obtido da casca do fruto apresentou aparência pastosa e
31
escura, solúvel em água, enquanto que o extrato da semente caracterizou-se
por uma solução oleosa e sua dissolução só foi possível mediante uso de
diluentes químicos. Desta forma, optou-se pelo uso do extrato obtido a partir
da casca do fruto, devido à sua solubilidade em água, afastando assim, os
riscos de interferências dos diluentes químicos nos resultados deste trabalho.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados deste trabalho são apresentados no artigo 1.
32
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37
Artigo 1 – submetido à Revista de Patologia Tropical
ESTUDO DAS ALTERAÇÕES MORFOHISTOLÓGICAS EM LARVAS DE
Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) SUBMETIDAS AO EXTRATO
BRUTO ETANÓLICO DE Sapindus saponaria Lin. (SAPINDACEAE).
Cleyde Ferreira Barreto,
1/2
Ionizete Garcia da Silva
1
, Gláucia Maria Cavasin
2
RESUMO
Dengue é hoje a arbovirose mais importante no mundo e o seu controle,
basicamente está restrito ao combate ao principal vetor, o Aedes aegypti. As
ações têm sido por inseticidas químicos sintéticos que possuem ação rápida e
eficaz no combate, porém são altamente tóxicos aos mamíferos e ao meio
ambiente. Seu uso tem induzido ao desenvolvimento de resistência do
mosquito. Produtos naturais provenientes de plantas poderão ser candidatos
alternativos às medidas de controle pela baixa toxicidade aos mamíferos e
sem impacto ambiental. Neste estudo, apresentam-se as alterações
morfohistológicas e a atividade larvicida do extrato bruto etanólico (e.b.e.) da
casca do fruto de Sapindus saponaria sobre o A. aegypti, visando ao controle
desse mosquito. Larvas de 3° estádio foram submetidas a diferentes
concentrações do e.b.e., obtido da casca do fruto de S. saponaria,
previamente solubilizado em água, onde permaneceram por até 48 h. As
larvas que atingiram estado letárgico foram coletadas e fixadas em
paraformoldeído, incluídas em resina, secccionados e as lâminas coradas pela
técnica de hematoxilina-eosina e analisadas por microscospia óptica. A CL
99
encontrada do e.b.e. da casca d fruto de S. saponaria sobre larvas de A.
aegypti foi de 134,1 ppm. Os efeitos tóxicos desse e.b.e. foram observados
com concentrações subletais e as três regiões do mesêntero, apresentaram-se
com várias alterações histopatológicas, como a destruição total ou parcial das
células, alta vacuolização do citoplasma, hipersecreção das células epiteliais,
pavimentação do epitélio. Estas alterações celulares evidenciam o mecanismo
de ação do e.b.e. de S. saponaria sobre larvas de A. aegypti.
DESCRITORES: Aedes aegypti. Sapindus saponaria. Larvicida. Controle.
1 Laboratório de Biologia, Fisiologia/ Bioatividade de Plantas do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Públida da
Universidade Federal de Goiás.
2.Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás.
Endereço para correspondência: Ionizete Garcia da Silva. Rua Delenda Rezende de Melo esq. com a 1
ª
Avenida,
Setor Universitário Caixa Postal 131, CEP 74605-050, Goiânia, GO. E-mail
38
ABSTRACT
Dengue is reported as the most important viruses in the world. This
disease is controlled by combating the vector Aedes aegypti using chemical
insecticides. Although chemical insecticides have efficient action against the
mosquito A. aegypti, they are toxic to the humans and environment therefore
not recommended for controlling the mosquito spread. Products of botanic
origin may be an alternative to the insecticides to combat the mosquito
because they have low toxicity levels for the human life and cause less
environmental impact. The present study describes the morphological changes
and larvicidal activity of the ethanol extract, obtained from the peel of the fruit of
Sapindus saponaria, against 3
rd
larval instars of the A. aegypti. The larvae
were incubated in water solutions of the extracted at different concentrations up
to 48 hours and. The larvae in lethargic stages were colleted and fixed in
paraphormaldeyde and included in resin, after the laminas were colored using
hematoxilinaeosine technical and analyzed through optical microscopy. The
toxic effects of the ethanol extract of S. saponaria against larvae of A. aegypti
were observed in all three mesentery regions with several histopathological
changes, such as complete or partial cells destruction, high cytoplasm
vacuolization, hyper secretion of epithelial cells, and epithelia pavimentation.
The cellular changes demonstrate the action mechanism of the ethanol extract
of S. saponaria against A. aegypti.
Key-words: Aedes aegypti. Sapindus saponaria. Larvicidal. Control.
INTRODUÇÃO
A dengue constitui hoje a mais importante doença viral humana
transmitida por mosquitos, cujo agente é um Flavivirus, com quatro sorotipos
conhecidos (Den-1, Den-2, Den-3 e Den-4), podendo causar o dengue clássico
(DC) e a febre hemorrágica da dengue (FHD). Esta pode evoluir para uma
forma mais severa conhecida como síndrome do choque da dengue (SCD). A
infecção com um sorotipo provê imunidade vitalícia para aquele vírus, mas a
proteção cruzada para outro sorotipo é apenas passageira, assim, é possível
39
ocorrer uma infecção seqüente por outro sorotipo (Henchal & Putnak, 1990;
Monath, 1994; Schatzmayr, 2000; Derouich et al., 2003).
A transmissão da dengue ao homem ocorre através da picada da fêmea
de Aedes aegypti, infectada com um dos quatro sorotipos do vírus. Após 8 a12
dias ocorrem a incubação, replicação e disseminação do vírus por todo o corpo
do mosquito. A fêmea pode passar por ciclos de reprodução, durante o período
de incubação e replicação do vírus no mosquito, dando a oportunidade do
vírus entrar no ovo e de ser passado para a prole, através da transmissão
vertical (Monath, 1994).
O A. aegypti apresenta hábitos antropofílicos e as fêmeas realizam a
hematofagia em período diurno, com maior pico entre 16 e 18 h (Silva et al.,
2002). As fêmeas ovipõem em criadouros artificiais, geralmente em pequenas
coleções de água limpa e parada, localizados nas proximidades das casas.
Contudo, Silva et al. (1999) demonstraram que o A.aegypti também se
desenvolve em água poluída. A oviposição é feita nas paredes dos recipientes,
imediatamente acima da superfície da água, onde podem ser vistos como
pequenos pontos escuros. O desenvolvimento do mosquito ocorre por
metamorfose completa, passando por fase de ovo, quatro estádios larvais,
pupa e mosquito adulto (Marzochi, 1994; Gubler, 1998; Silva et al., 1998; Silva
et al., 1999; Silva et al., 2002; Forattini & Brito, 2003).
O A. aegypti encontrou no mundo moderno condições muito favoráveis
à sua rápida propagação como a crescente urbanização, a deficiência de
fornecimento, tratamento e armazenamento de água e o uso intensivo de
materiais descartáveis. Uma das conseqüências dessa situação é o aumento
do número de criadouros potenciais para o mosquito vetor (Guzman & Kouri,
1996; Tauil, 2001).
A dengue se dissemina conforme a expansão do A. aegypti, que hoje
ocupa praticamente toda a faixa cosmotropical da terra. No Brasil, a partir de
1986 ocorreram epidemias de dengue, sempre relacionadas à introdução de
um novo sorotipo do vírus, que se dissemina para as unidades federadas
(Uribe, 1983; Serufo et al., 1993; Marzochi, 1994; Monath, 1994; OPAS, 1997;
Gubler, 1998; Schatzmayr, 2000; Tauil, 2001; FUNASA, 2002).
Até o momento, não há uma vacina pronta para uso contra os quatro
sorotipos do vírus da dengue, embora pesquisas estejam em andamento
40
(Whitehead et al., 2003; Rothman, 2004). O controle do A. aegypti tem sido a
opção para combater a dengue. Inseticidas químicos sintéticos destacam-se
como os mais usados nas campanhas nacionais de combate ao dengue.
Contudo, problemas significativos têm surgido como o aparecimento de
resistência (OPAS, 1997; FUNASA, 2002; Campos & Andrade, 2001; Carvalho
et al., 2004; Luna et al., 2004).
Formas alternativas de controle de vetores vêm sendo avaliadas, com
destaque para o controle biológico com o Bacillus thuringiensis israelensis
(Bti), com possibilidade de uso integrado com os produtos sintéticos (Andrade
& Modolo, 1991; Polanczyk et al., 2003; Praça et al., 2004). Na busca de novas
alternativas de combate aos insetos vetores, substâncias extraídas de plantas,
têm recebido especial atenção. Desta forma, vários estudos vêm sendo
realizados com plantas com a finalidade do controle desse mosquito (Pizarro et
al., 1999; Aguilera et al., 2003; Silva et al. 2003; Silva et al., 2004; Cavalcanti
et al., 2004; Simas et al., 2004).
Assim procurou-se através da prospecção em plantas, substâncias com
potencial a serem candidatas alternativas ao controle de A. aegypti, bem
como, elucidar o seu mecanismo de ação, através de estudos de toxicidade
morfohistológicos.
Estudos morfológicos que elucidam os efeitos tóxicos de extratos de
plantas sobre larvas de A. aegypti auxiliam na compreensão das diversas
formas de ação desses produtos (Gusmão et al. 2002, Arruda et al. 2003ab). A
demonstração do local de atuação e da forma de ação são de grande
importância para a potencialização de seus efeitos e o desenvolvimento do
produto inseticida.
Apresenta-se a Sapindus saponaria planta com distribuição nas
Américas Central e Sul, desde a mata luxuriante até o Cerrado. No Brasil
ocorre do Pará ao Rio Grande do Sul. Sua madeira é amplamente utilizada na
indústria, construção civil, reflorestamento de áreas degradadas, e na
confecção de brinquedos e caixotaria. As sementes são usadas para
artesanato. A casca, a raiz e o fruto são utilizados na medicina popular como
calmante, adstringente, diurético, expectorante, tônico, depurativo do sangue e
contra tosse. A árvore é bastante ornamental, principalmente por sua copa
41
globosa, sendo amplamente empregada no paisagismo urbano (Lorenzi,
1992).
Estudos com o extrato da folha de S. saponaria demonstraram que essa
planta apresenta atividade neutralizadora de hemorragia provocada por
serpentes do gênero Bothrops, em animais de laboratório (Castro et al., 1999).
Esse extrato apresentou-se constituído por flavonóides capazes de inibir
atividade plaquetária e antitrombótica. Outros estudos demonstraram
propriedades cicatrizantes para úlceras, provocadas pelo stress em ratos
(Albiero et al., 2002). A administração dos extratos, reduziu significativamente
o número de ulcerações severas e moderadas nos ratos, além de
apresentarem atividade anti-secretora e citoprotetora.
A partir de uma seleção de plantas com propriedades larvicidas para A.
aegypti, realizadas no Laboratório de Bioatividade de Plantas e Entomologia
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, a S. saponaria
apresentou potencial, despertando o interesse de se conhecer o mecanismo
de ação em larvas desse mosquito.
Produtos naturais provenientes de plantas poderão ser candidatos
alternativos às medidas de controle por apresentarem baixa toxicidade aos
mamíferos, e pouco impacto ambiental. Neste estudo, apresentam-se a
atividade larvicida e as alterações morfohistológicas do extrato bruto etanólico
(e.b.e.) de S. saponaria sobre o A. aegypti, visando esclarecer os mecanismos
de ação sobre as larvas desse mosquito.
MATERIAIS E MÉTODOS
S. saponaria foi coletada em 12.09.2004, e após a identificação
botânica partes da planta foram guardadas no herbário da UFG com o n°
28528. Frutos dessa planta foram coletados na região central da cidade de
Goiânia-GO e processados no Laboratório de Bioatividade de Plantas e
Entomologia do IPTSP/UFG. O material foi colocado em estufa de fluxo de ar
forçado a 40°C para secagem. Houve a separação da casca e da semente e
ambos foram moídos separadamente até atingirem baixa granulometria. Em
seguida foram percolados a frio, colocando-se cerca de 1 litro do pó em um
béquer, ao qual acrescentou-se etanol até atingir aproximadamente quatro
centímetros acima do produto. O béquer foi coberto com papel alumínio e
42
permaneceu em repouso por 72 h. Após a percolação, o filtrado foi recolhido e
concentrado em evaporador rotativo. O extrato bruto etanólico (e.b.e.) obtido
foi transferido para placas de vidro e dessecado em uma capela de exaustão
com o auxílio de jato de ar quente até a completa evaporação do solvente e,
posteriormente, armazenado em dessecador até a utilização nos testes de
atividade larvicida.
As larvas do mosquito A. aegypti foram obtidas da criação do
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos do IPTSP/UFG. A criação do
mosquito se processou numa câmara biológica climatizada com temperatura
de 28±1°C, umidade relativa de 80±5% e fotoperíodo de 12 h de acordo com a
metodologia de Silva et al. (1998). Cartelas de papel de filtro contendo ovos de
A. aegypti foram colocadas em bacias plásticas, com água proveniente da rede
pública de abastecimento. À medida que ocorriam as eclosões, as larvas eram
retiradas e separadas em outras bacias, para dar continuidade ao ciclo. As
larvas foram alimentadas com ração para gato, triturada. Para o experimento
foram utilizadas larvas de 3° estádio, imediatamente após a muda, por se
tratarem de larvas mais resistentes para tais estudos (Silva et al., 1998; Silva
et al, 2003).
Utilizou-se uma concentração máxima de 100 ppm. Para tanto, foi feita
a pesagem de 0,05 g do extrato em balança analítica de precisão que em
seguida foi dissolvido em 500 mL de água destilada. A concentração de 100
ppm foi, posteriormente, diluída em concentrações menores de 75 ppm e 50
ppm. Essas soluções foram colocadas em frascos de 25 ml e em cada frasco
foram colocadas 25 larvas. Os experimentos foram feitos em duplicata
utilizando em cada um total de 200 larvas de 3° estádio. Os grupos
experimentais utilizados foram: Grupo I= larvas em e.b.e. a 100 ppm; Grupo II
= larvas em e.b.e. a 75 ppm; Grupo III = larvas em e.b.e. a 50 ppm; Grupo IV
=larvas controle.
As larvas controle foram submetidas às mesmas condições do teste,
utilizando apenas água destilada. Todos os grupos foram alimentados com
ração para gato, triturada, segundo a metodologia de Silva et al. (1998).
As larvas foram deixadas no e.b.e por tempos variados, sendo
coletadas a cada 3 h, por um período de 48 h, para a verificação das
alterações. Na concentração de 100 ppm obteve-se uma letalidade de 100%
43
das larvas tratadas nas 48 h em que se realizou o experimento; em 75 ppm
obteve-se 70% de letalidade e em 50 ppm apenas 40% das larvas morreram.
Para verificar a letalidade foram observadas a mobilidade das larvas e a
reação das mesmas a estímulos externos como foco de luz (luz de lanterna) e
mecânico (toque com estilete, toque com bastão de vidro na parte externa do
recipiente). As larvas foram observadas em estereomicroscópio modelo MZS
250 e coletadas apenas as que se apresentavam em estado letárgico. As
mortas foram descartadas. Após serem retiradas das soluções teste e controle,
as larvas foram imediatamente colocadas em fixador.
As preparações em historesina foram realizadas no Laboratório de
Histologia do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas
(ICB) da UFG.
Experimentos foram realizados para se obter o fixador que melhor
conservasse a integridade celular. Dois fixadores foram testados: A)
paraformoldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2; B) fixador
de Bouin. Optou-se pelo fixador A, pois as células apresentaram um melhor
estado de preservação.
As larvas foram fixadas a temperatura ambiente por um período de no
mínimo 2 h, segundo metodologia utilizada por Arruda et al. (2003a). Depois
de fixadas as larvas foram lavadas no mesmo tampão e submetidas à
desidratação utilizando soluções com concentrações crescentes de etanol (50,
70, 80, 90, e 95%) por um período de 10 minutos em cada solução. Após a
desidratação as larvas embebidas em resina (resina básica + ativador) “Leica
Historesin Embedding Kit”, por um período de 12 h à temperatura ambiente.
Posteriormente à embebição, o material foi incluído em resina (resina de
embebição + catalisador), pertencente ao mesmo kit (soluções preparadas
segundo especificações do fabricante), utilizando-se para isso moldes de
silicone, colocando as larvas na posição desejada. Os moldes com o material
foram deixados à temperatura ambiente por aproximadamente 12 h para total
polimerização da resina.
Após a polimerização, os blocos de resina foram montados em suportes
de madeira com cola araldite, e posteriormente seccionados com navalha de
vidro, em micrótomo modelo Leiz 1512, adaptado para cortes semifinos, com
espessura de 3 μm. Os cortes foram distendidos em uma cuba contendo água
44
a temperatura ambiente e transferidos para lâminas histológicas, em seguida
corados em hematoxilina e eosina (HE) como método de rotina encontrado nos
livros: Pearse, (1961); Gabe (1976); Melo & Vidal (1980); Filipe & Lake (1983);
Prophet et al. (1992), conforme a seguinte técnica:
1. Corar com Hematoxilina de Harris à temperatura ambiente por 5 minutos
2. Lavar em água corrente
3. Secar em estufa a 40°C
4. Corar com Eosina alcoólica por 20 segundos,
5. Lavar imediatamente em água corrente
6. Secar e montar em entellan
As lâminas preparadas foram fotomicrografadas em Fotomicroscópio
modelo MC80 do laboratório de Botânica do Departamento de Biologia Geral
da UFG, utilizando-se filmes de 35 mm colorido. Todos os aumentos indicados
nas ilustrações referem-se aos obtidos nos negativos.
Estudos realizados com inseticidas botânicos demonstraram que sua
principal ação ocorre ao nível do mesêntero das larvas, logo este trabalho
focou esta região do tubo digestivo para as análises morfohistológicas (Abed
2003, Arruda et al. 2003ab, Borges et al. 2004).
RESULTADOS
O e.b.e. da casca do fruto de S. saponaria apresentou aparência
pastosa e escura, sendo facilmente dissolvido em água. Embora a CL
99
tenha
sido de 134,1 ppm (IC = 93,8 – 223,8) utilizaram-se concentrações subletais
para evitar interferências da decomposição na análise histológica.
Durante os bioensaios algumas mudanças foram observadas no
comportamento das larvas. Houve diminuição gradativa dos movimentos
larvais quando comparadas às do grupo controle. As larvas do grupo I e II,
começaram a apresentar movimentos mais lentos após 30 minutos do início do
testes e tornaram-se lentas ou imóveis após 3 h. As do grupo III a partir de 2h
apresentavam-se mais lentas e com 6h algumas já estavam imóveis. Algumas
larvas já entravam em estado letárgico, permanecendo imóveis mesmo
quando estimuladas por toque. As larvas mortas eram descartadas,
caracterizadas pelo escurecimento da cápsula cefálica.
45
A Figura 1A mostra a morfologia do tubo digestivo das larvas de A.
aegypti do grupo controle. O proventrículo apresenta-se em perfeito estado de
conservação, internamente a ele observa-se a válvula cárdia, revestida por
uma camada quitinosa e em sua base os cecos gástricos associados às
células do mesêntero. Há também parte do tubo traqueal em volta da
superfície externa do tubo digestivo. No mesêntero identificam-se três regiões
distintas denominadas de anterior, mediana e posterior.
A região anterior (Figura 1B) caracteriza-se por células epiteliais
cilíndricas, algumas mais fracamente coradas que as outras, citoplasma
heterogêneo, acidofilia moderada, superfície apical com um fino bordo em
escova, núcleo esférico e basal com alta atividade, apresentando um ou mais
nucléolos. Nesta região, observou-se uma fina membrana refringente à luz que
envolve todo o conteúdo alimentar, denominada matriz peritrófica.
A mediana (Figura 1C), apresentou células epiteliais cilíndricas altas,
com citoplasma evidenciando áreas mais e outras menos acidófilas, núcleo
esférico e nucléolo evidente. Algumas células apresentaram-se agrupadas e
com maior basofilia, o bordo em escova mostrou-se mais espesso e mais
corado do que o encontrado na região anterior. A matriz peritrófica tão
evidente quanto na região anterior (Figura 1B).
A posterior (Figuras 1D, 1E), apresentou células cilíndricas, intensa
basofilia e núcleo esférico basal. A superfície apical mostrou-se com espesso
bordo em escova, levemente acidófilo, que provavelmente representa a grande
quantidade de microvilosidades existentes nesta região. O espaço
subperitrófico apresentou-se mais espesso, preenchido por substância
acidófila, tornando difícil a delimitação entre ele e o bordo em escova. Na parte
distal dessa região (Figura 1E), notou-se uma intensa atividade secretora,
onde as células cilíndricas apresentaram-se liberando sua porção apical em
forma de grandes vesículas.
As larvas de A. aegypti tratadas com o e.b.e. da S. saponaria mostraram
várias alterações. As análises basearam-se na concentração e no tempo de
exposição. Na concentração de 50 ppm as alterações celulares mais
46
46
47
relevantes foram observadas com 9 h, a 75 ppm, com 3 e 12 h, e a 100 ppm
com 3 e 20h.
A Figura 2A, mostra secções completas do mesêntero de larvas
expostas por 9 h ao e.b.e. a 50 ppm, evidenciando a presença de grandes
dobras na cutícula, basofilia na região mediana mais intensa do que na
anterior e posterior. Nas Figuras 2 B, C, D e E observam-se a estratificação do
epitélio e a pouca vacuolização celular na região anterior; alta basofilia,
estratificação do epitélio com intensa atividade secretora, formação de grandes
vesículas na superfície apical celular na região mediana. Ocorreu um
encolhimento do tubo digestivo através da luz intestinal que se projeta em
dobra (Figura 2D). A transição de epitélio cilíndrico para pavimentoso, ocorre
da região mediana para posterior do mesêntero. Essa transição é
acompanhada de um estreitamento do tubo digestivo na região posterior do
mesêntero com aparência recurvada (Figura E).
A Figura 3A evidencia a região anterior do mesêntero de larvas
submetidas à 3h de tratamento, a 75 ppm. Observou-se a formação de
constrição nessa região, onde as células mostraram-se cilíndricas e com
formações vesiculares apicais (Figura 3B). Além disso, essa figura evidencia o
momento de transição entre a região anterior e a mediana. As células da
região mediana (Figura 3C) apresentaram-se pavimentosas, com citoplasma
íntegro e núcleo de aspecto normal, evidenciando o estado de conservação
dessa região. A região posterior apresentou células epiteliais com aspecto
similar ao controle.
A Figura 4A mostra secções completas do mesêntero da larva
submetida ao e.b.e. a 100 ppm, por 3h. Nota-se claramente a divisão das
regiões do mesêntero separadas por constrições. As células da região anterior
(Figura 4B) apresentaram-se mais basófilas que as demais, com o citoplasma
vacuolizado, núcleo basal e nucléolo evidente e liberação de conteúdo
citoplasmático através das vesículas apicais. A constrição que a separa da
segunda região parece fechar a luz intestinal. A segunda e terceira regiões
(Figuras 4A e 4C) são formadas por um epitélio pavimentoso onde as células
epiteliais apresentaram-se muito baixas, sem formação de vesículas e sem
bordo em escova aparente. Entre as duas últimas regiões há a formação de
48
uma outra constrição (Figura 4C) com aspecto mais alongado que a primeira,
porém ambas apresentam as mesmas características morfológicas.
49
50
51
A Figura 5A mostra um aspecto geral do intestino de larvas submetidas
ao e.b.e. a 75 ppm por 12 h, evidenciando o aspecto encolhido e as intensas
dobras da cutícula. A região anterior do mesêntero (Figura 5B) mostrou-se
sinuosa acompanhando essas dobras.
A Figura 6A mostra todo o mesêntero da larva submetida ao e.b.e. a
100 ppm, por 20h de tratamento. A região anterior (Figura 6B) apresentou-se
com células epiteliais altamente vacuolizadas e com vesiculação apical (Figura
6C). Esta figura mostra também a vacuolização do citoplasma, núcleos mais
claros, porém com aspecto de alta atividade. Uma outra alteração destacada,
foi a transição de um epitélio cilíndrico simples (região anterior) para um
epitélio intensamente pavimentoso (região mediana e posterior do mesêntero),
sendo similar ao que aconteceu com 3h de exposição (Figuras 4A). Na
transição entre as duas últimas regiões houve a formação de uma dobra no
mesêntero com obstrução intestinal.
52
53
DISCUSSÃO
Nestes estudos constatou-se uma perda da atividade larvicida do
extrato conforme se prolongava o tempo de armazenamento do mesmo,
indicando uma degradação da parte ativa dfo e.b.e.
A primeira alteração causada pelo e.b.e. da planta S. saponaria às
larvas de A. aegypti diz respeito a sua movimentação. As larvas do grupo
controle apresentavam grande mobilidade e sua locomoção em meio líquido é
realizada através das contrações do corpo e da movimentação das escovas,
reagindo rapidamente a qualquer toque, o que está de acordo com Forattini
(1965). Porém, nas larvas submetidas ao e.b.e. na concentração de 50 ppm, a
perda da mobilidade teve início com 2 h de tratamento e o estado letárgico foi
estabelecido após 6 h de exposição. Mas as larvas submetidas às
concentrações de 75 e 100 ppm começaram a apresentar diminuição de seus
movimentos com 30 minutos de exposição e ficaram totalmente letárgicas com
3h.
A redução da mobilidade das larvas de A. aegypti, neste trabalho, está
de acordo com os resultados de Arruda et al. (2003b) com a M. pubescens. O
mesmo fato também ocorreu com larvas de Culex nigripalpus infectados por
um baculovirus, que se tornavam letárgicas após 72 h (Moser et al. 2001); com
A. aegypti e C. quinquefasciatus após meia hora de exposição ao Bacillus
thuringiensis e com larvas de Anopheles albimanus, após 2h. Esses trabalhos
evidenciam que a redução da mobilidade larval é o primeiro sinal da atividade
larvicida (Ruiz et al. 2004).
As larvas tratadas neste estudo, apresentaram-se menores, mais
franzinas e mais escuras que as larvas controle. O aspecto encolhido pode ser
notado através das grandes dobras ocorridas na cutícula. Resultados
semelhantes foram descritos por Salvador (2002), que evidenciou em larvas de
A. aegypti expostas ao temephos uma redução de cerca de 50% no
comprimento e o escurecimento devido à sobreposição das cutículas dos
segmentos abdominais. Borges et al. (2004), utilizando um inibidor de
crescimento, diflubezuron, com larvas desse mosquito, encontraram um menor
tamanho e aspecto alterado devido ao acúmulo de mudas incompletas.
54
Nas análises histopatológicas, larvas do grupo controle apresentavam
três regiões distintas no mesêntero, denominadas anterior, mediana e
posterior. Estas observações são compatíveis com as descritas por Snodgrass
(1935), Chapman (1982), Arruda et al. (2003a,b), Borges et al. (2004).
Nas preparações em resina, coradas por HE, todo o mesêntero
apresentou-se revestido por um epitélio cilíndrico simples. As células da região
anterior mostraram-se com citoplasma esponjoso e com superfície apical
coberta por um fino bordo em escova indicando se tratar de células absortivas.
Observou-se a presença de células coradas mais fracamente que as outras
dessa região. Observações semelhantes foram obtidas por Shahabuddin &
Pimenta (1998) com adultos de A. aegypti. A presença de células claras no
mesêntero de larvas desse mesmo mosquito foi também observada por Arruda
et al. (2003a), que, embora tenham realizado estudos histoquímicos, não
confirmaram uma função endócrina dessas células. Somente estudos
específicos poderão esclarecer sua funcionalidade.
A região mediana apresentou características de transição entre a região
anterior e posterior do mesêntero, isto está de acordo com Snodgrass (1935).
A região posterior evidenciou uma maior basofilia celular e um espesso bordo
em escova. Algumas células dessa região apresentaram uma intensa atividade
secretora com formação de vesículas apicais e liberação de parte do
citoplasma para a luz intestinal. De acordo com Snodgrass (1935), as células
digestivas do mesêntero de insetos em geral possuem participação ativa nos
processos de secreção e absorção e que o processo de desintegração dessas
células ocorre através do acúmulo de material granular na porção apical da
célula e a liberação desse material na luz intestinal do inseto. Foi observado,
na região apical das células de todo o mesêntero, um fino bordo em escova
(microvilosidades), provavelmente com função de absorção de nutrientes.
como demonstrado por Levy et al. (2004) em larvas de Lepdoptera.
Observou-se uma matriz peritrófica envolvendo todo o conteúdo
alimentar no tubo digestivo das larvas controle. Autores como Snodgrass
(1935) e Chapman (1982), afirmam que em Diptera ela seja secretada por
células especializadas da porção final da região anterior do mesêntero.
Contudo, Beerntsen et al. (2000), mencionam que a matriz peritrófica dos
mosquitos vetores funcione como um filtro semipermeável para as enzimas
55
digestivas e que a mesma possui função de proteção contra os alimentos
ingeridos e contra patógenos.
Os efeitos tóxicos do e. b. e. da casca de S. saponaria foram
observados em todo o mesêntero de larvas de A. aegypti, que apareceu
simultaneamente afetado, entretanto, as alterações das regiões anterior e
médiana mostraram-se mais claras e evidentes. Nos estudos realizados por
Arruda et al. (2003a), as alterações causadas pelo extrato de M. pubescens no
mesêntero de larvas do mesmo mosquito atingiram principalmente a região
anterior tornando-se progressivas para as outras regiões. Estudos
histopatológicos de larvas de Diptera submetidas ao biolarvicida B.
thuringiensis medellin (Cry11Bb) mostraram que o mesêntero posterior e os
cecos gástricos são os principais sítios de localização dessa toxina (Ruiz et al.
2004). Larvas de Culex nigripalpus infectados com um baculovirus também
tiveram os cecos gástricos e a região posterior do mesêntero com maiores
alterações citopatológicas (Moser et al. 2001).
As alterações deletérias causadas nas células do mesêntero incluíram
várias mudanças histopatológicas como alta vacuolização do citoplasma,
desintegração do bordo em escova, hipersecreção pelas células epiteliais, lise
celular, pavimentação do epitélio e aumento do número de camadas epiteliais
de forma irregular. O aumento dessas camadas pode ser devido à proliferação
de células regenerativas dando origem a novas células que também aparecem
com aspecto morfológico alterado.
Várias dessas alterações também foram observadas por Shahabuddin &
Pimenta (1998), estudando células do mesêntero de adultos de A. aegypti
infectado por P. gallinaceum. Estas não apresentaram as densas
microvilosidades comumente encontradas nas células colunares, o retículo
endoplasmático apresentou-se escasso e áspero e em sua maioria sem
grânulos de secreção elétron densos. Foi observado um grande número de
vacúolos claros localizados principalmente na porção apical celular. Moser et
al. (2001), em análises histológicas de larvas de C. nigripalpus infectados por
um baculovirus, relataram como sinais de infecção, a presença de células
arredondadas, citoplasma granular e denso, hipertrofia do núcleo e alta
vacuolização citoplasmática das células epiteliais do mesêntero dessas larvas.
Estas alterações são similares aos resultados encontrados no presente estudo.
56
Em estudos ultraestruturais realizados em larvas de A. aegypti
submetidas ao extrato de Derris urucu, Gusmão et al.(2002) observaram que a
mortalidade larval estava relacionada com o rompimento da estrutura da matriz
peritrófica e pela desintegração das células do mesêntero. Estas apresentaram
alterações de coloração com células menos coradas e algumas separadas da
lâmina basal. Os autores também relataram a presença de células colunares
do mesêntero expulsando o conteúdo citoplasmático no lúmen intestinal. De
fato, neste trabalho, alterações celulares também foram notadas nas larvas
submetidas à S. saponaria.
Arruda et al. (2003a), estudando larvas de A. aegypti submetidas ao
extrato da planta M. pubescens, descreveu várias alterações deletérias
provocadas nas células do mesêntero, como a alta vacuolização do
citoplasma, aparente aumento do número de camadas do epitélio, hipertrofia
das células, desintegração do bordo em escova e hipersecreção pelas células
epiteliais, o que também foi observado, em diferentes graus, pela ação do
extrato da planta S. saponaria. Por outro lado, Arruda et al. (2003b), em suas
observações, ainda evidenciaram a extrusão da matriz peritrófica, junto com o
conteúdo alimentar do tubo digestivo, indicando um processo de defesa da
larva ao tentar eliminar do seu interior agentes tóxicos do extrato, fato que não
foi notado neste estudo.
Ruiz et al. (2004), em estudos realizados em larvas de A. aegypti, A.
albimanus e C. quinquefasciatus expostas à toxina Cry11Bd de B. thunrigiensis
medellin, descreveu sérias mudanças histopatológicas, como vacuolização do
citoplasma, hipertrofia das células epiteliais e de seus núcleos, deterioração do
bordo em escova e desintegração celular, formação de vesículas apicais que
liberavam seu material no lúmen intestinal. Neste trabalho, o e.b.e. de S.
saponaria provocou alterações similares.
Outro aspecto observado nas preparações em resina foi a passagem de
um epitélio colunar, formado por células cilíndricas com diferentes graus de
destruição celular, para um epitélio pavimentoso desprovido de bordo em
escova. Nenhum relato bibliográfico foi encontrado neste sentido. A hipótese
mais provável é a de que o epitélio original tenha sido lesado pela ação
larvicida do extrato e rapidamente outro epitélio foi reposto na tentativa
imediata de proteger o tecido conjuntivo, porém as células epiteliais recém-
57
formadas apenas adquiriram a função de proteção e não absorção, talvez, por
esta razão apresentaram o aspecto achatado e a ausência das
microvilosidades. Conseqüência de uma rápida reação ao e.b.e. e sua ação
destrutiva.
Em algumas larvas tratadas, observou-se o estreitamento do tubo
digestivo com formações de constrições que ora separavam as regiões do
mesêntero, dando um aspecto segmentado ao mesmo, ora restringiam-se à
apenas uma região. Nenhuma referência foi encontrada com relação a
constrições formadas, porém, é provável que se trate de uma reação defensiva
utilizada pela larva, na tentativa de impedir um contato maior com o larvicida,
ou mesmo da realização de movimentos peristálticos pela larva para a
extrusão do agente agressor de seu tubo digestivo, ação similar ao mecanismo
relatado por Arruda et al. (2003b).
O isolamento do tubo digestivo em porções separadas por constrições
pode indicar um processo de defesa da larva, a fim de impedir a passagem
dos agentes tóxicos contidos no extrato para as outras porções do mesêntero,
assim a destruição celular se limitaria ao início do trato digestivo, diminuindo a
letalidade das lesões. Outra hipótese que justificaria a formação das
constrições seria o isolamento do extrato larvicida em porções do tubo
digestivo. O extrato, então, atingiria um segmento por vez, dando tempo de
recuperação de parte do epitélio antes que outra porção fosse destruída, assim
apenas parte do intestino ficaria lesada ao invés de todo o tubo, o que poderia
ser fatal para a larva. De qualquer forma, as constrições ao longo do
mesêntero larval parece ser uma tentativa de isolar o conteúdo alimentar
nocivo ao inseto, para posterior eliminação, de modo que o menor número de
danos celulares sejam provocados neste tubo.
Nas larvas submetidas ao extrato nas concentrações de 100 e 75 ppm,
a pavimentação do epitélio aparece atingindo o mesêntero médio e posterior,
enquanto que na concentração de 50 ppm essa alteração mantem-se restrita à
região posterior do mesêntero, indicando que essa seria a primeira região a
ser atingida pela ação do larvicida. Nesta concentração não notamos a
formação de constrições no mesêntero das larvas, fato que provavelmente só
ocorra em concentrações maiores.
58
Na literatura, há relatos de modificações ocorridas na estrutura da
matriz peritrófica de larvas de A. aegypti expostas ao extrato de D. urucu
(Gusmão et al. 2002), causando rompimento da mesma. Espessamento da
matriz peritrófica foi relatado nos trabalhos de Arruda et al. (2003a) como uma
forma de impedir o contato do extrato de M. pubescens com as células do
mesêntero de larvas de A. aegypti, demonstrando assim, a função de defesa,
porém, no presente estudo a matriz peritrófica não apresentou diferenças
significantes em sua estrutura entre larvas tratadas e larvas controles.
A toxicidade do e.b.e. de S. saponaria sobre as larvas de A. aegypti foi
demonstrada pelo estudo morfohistológico, sendo evidenciada pelos vários
danos às células do mesêntero, sinalizando que esse extrato botânico pode
ser um candidato larvicida alternativo ao controle do A. aegypti.
59
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