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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
ESTUDO DA VIRULÊNCIA E VARIABILIDADE FISIOLÓGICA E GENÉTICA
DO FUNGO Bipolaris sorokiniana
Alana Poloni
Bióloga – UFRGS
Março, 2008.
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
ESTUDO DA VIRULÊNCIA E VARIABILIDADE FISIOLÓGICA E GENÉTICA
DO FUNGO Bipolaris sorokiniana
Alana Poloni
Bióloga – UFRGS
Dissertação apresentada como requisito para obtenção do grau de Mestre em
Microbiologia Agrícola e do Ambiente
Orientador: Sueli T. Van Der Sand
Co-orientador: Ana Paula G. Frazzon
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
Março, 2008
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iii
Catalogação na Publicação
UFRGS/ICBS/Biblioteca Setorial
P778e Poloni, Alana
Estudo da virulência e variabilidade fisiológica e genética do fungo
Bipolaris sorokiniana / Alana Poloni. – 2008.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Porto Alegre, BR-RS, 2008.
Orientação: Profª Sueli Teresinha. Van Der Sand
Co-orientação: Profª Ana Paula Guedes Frazzon
1. Bipolaris sorokiniana. 2. Fungos. I. Sand, Sueli Teresinha Van Der,
orient. II. Frazzon, Ana Paula Guedes, co-orient. III. Título.
CDU 579.22(043)
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que tornaram possível a realização deste trabalho e de
forma especial:
À professora Sueli Van Der Sand pela orientação, confiança, paciência,
bom humor, amizade e apoio em todas as etapas deste trabalho e durante
esses cinco anos de convivência.
À professora Ana Paula Guedes Frazzon pela co-orientação, incentivo,
ensinamentos, sugestões e amizade.
Ao Igor S. Pessi pela preciosa ajuda na realização deste trabalho, pela
amizade, momentos engraçados e por buscar a água.
Às colegas do maravilhoso Laboratório 209-B Carolina Poletto, Franciele
Bucker, Jandora Poli, Juliana Mautone, Melissa Landell, Naiara Santestevan,
Roberta Brito e Taís Letícia Bernardi, pela amizade, conversas, comilanças e
risadas nas tardes do laboratório.
Aos amigos da Biologia pela valiosa amizade durante esses muitos anos.
Aos meus pais Marlene e Adriano, pelo amor, carinho e apoio.
À CAPES pelo apoio financeiro através da concessão da bolsa de
estudos.
v
ESTUDO DA VIRULÊNCIA E VARIABILIDADE FISIOLÓGICA E GENÉTICA
DO FUNGO Bipolaris sorokiniana
Autor: Alana Poloni
Orientador: Prof. Dr. Sueli T. Van Der Sand
Co-orientador: Prof. Dr. Ana Paula Guedes Frazzon
1
RESUMO
O fungo filamentoso Bipolaris sorokiniana é um fitopatógeno que causa
moléstias em cereais de inverno, tais como a mancha marrom, a ponta preta
dos grãos e a podridão comum da raiz. O controle deste fungo é dificultado
pelo fato do mesmo apresentar uma ampla variabilidade morfológica, fisiológica
e genética. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram estudar a
variabilidade fisiológica, genética e virulência de isolados de B. sorokiniana.
Foram utilizados 35 isolados de B. sorokiniana e um isolado de B. orizae,
provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e de outros países.
Inicialmente foi realizado o agrupamento dos isolados, conforme as
características morfológicas e a medida da taxa de crescimento dos mesmos,
separando-os em grupos morfológicos. Os isolados foram avaliados quanto à
atividade enzimática em meio sólido, a virulência em sementes e plântulas de
trigo e perfil de proteínas totais em gel SDS-PAGE. Com os resultados obtidos,
cinco grupos morfológicos foram formados, com diferenças na coloração
micelial e crescimento. Foram encontradas variações entre os isolados quanto
à atividade enzimática, sendo a esterase a enzima que apresentou os mais
altos índices de atividade. Os resultados do ensaio de virulência mostraram
diferenças na porcentagem de sementes e plântulas infectadas, entre isolados
da mesma região geográfica e grupo morfológico. O perfil de proteínas totais
apresentou uma variação no número e intensidade das bandas no gel, onde
algumas destas podem ser características da espécie. Também foi avaliada a
incompatibilidade vegetativa entre os isolados, a influência de diferentes meios
de cultivo sobre a incompatibilidade e a análise eletroforética de proteínas
totais dos isolados, quando crescidos isoladamente e em reações de
incompatibilidade e compatibilidade. Dos 31 cruzamentos de incompatibilidade
realizados, 18 mostraram-se totalmente incompatíveis e essas reações
apresentaram alterações nos diferentes meios de cultivo utilizados,
evidenciando a influência do substrato nesta reação. Alguns isolados quando
crescidos em condição de pareamento mostraram bandas mais intensas na
eletroforese, sugerindo que algumas proteínas poderiam ser expressas em
níveis mais elevados durante o co-cultivo.
1
Dissertação de mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Instituto de Ciências
Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
(101p.) Março, 2008.
vi
STUDY OF THE VIRULENCE AND PHYSIOLOGICAL AND GENETIC
VARIABILITY OF THE FUNGUS Bipolaris sorokiniana
Author: Alana Poloni
Advisor: Dr. Sueli T. Van Der Sand
Coadviser: Prof. Dr. Ana Paula Guedes Frazzon
2
ABSTRACT
Bipolaris sorokiniana is a phytopathogenic fungus that causes diseases in
cereal crops, such as leaf spot disease, black point of the grain and common
root rot. Because of its high morphological, physiological and genetic variability,
the fungus control is a difficult task. The aim of this work was to study the
physiological and genetic variability and the virulence of B. sorokiniana isolates.
For this, 35 B. sorokiniana and one B. orizae isolates were used, proceeding
from different geographic regions in Brazil and other countries. Initially, the
isolates were evaluated for their morphological variability, considering mycelia
color, sector formation, and growth rate. With this result the isolates were
grouped by their morphologic characteristics. Extra-cellular enzymatic activity
was analyzed in solid medium for all isolates, pathogenicity in wheat seeds and
seedlings and analysis of total proteins by SDS-PAGE was done. Five
morphological groups were formed with the results obtained with the
morphological and growth characteristics. Variations among the isolates were
found for enzymatic activity, and esterase was the enzyme that presented
highest activity indices. The results obtained from infection of seeds and
seedlings showed that isolates from the same geographic region and
morphologic group had different degrees of virulence. The total protein profile
presented by the isolates showed a variation in the bands number and intensity,
where some of them can be characteristic of the specie. The vegetative
incompatibility between the isolates was evaluated and the influences that
different media culture in this reaction. The total proteins profile of the isolates
was analyzed when the isolates were cultivated separately and in compatibility
and incompatibility reactions. Thirty one crossings were realized and 18 out of
them showed vegetative incompatibility, and theses reactions had presented
alterations with different media culture. This result strongly suggests the
influence of the substratum in this reaction. The isolates when pareated shown
more intense protein bands in SDS-PAGE, suggesting that some proteins could
be expressed in higher levels during co culture of the fungus.
2
Master of Science dissertation in Agricultural and Environmental Microbiology, Instituto de
Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS,
Brazil (101 p.) March, 2008.
vii
SUMÁRIO
RELAÇÃO DE TABELAS................................................................................ ix
RELAÇÃO DE FIGURAS................................................................................ x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.................................................... xi
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 04
2.1 Histórico, aspectos gerais e importância econômica da cultura de
trigo................................................................................................................. 04
2.2 Doenças fúngicas que atacam o trigo...................................................... 09
2.3 O fungo Bipolaris sorokiniana................................................................... 10
2.4 Moléstias, processo de infecção e epidemiologia.................................... 11
2.5 Métodos de controle de B. sorokiniana.................................................... 15
2.6 Variabilidade do fungo B. sorokiniana.................................................... 16
2.7Anastomose de hifas e incompatibilidade vegetativa................................ 21
2.8 Enzimas extracelulares............................................................................. 23
2.9 Padrões eletroforéticos de proteínas totais.............................................. 26
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 30
3.1 Origem e obtenção dos isolados.............................................................. 30
3.2 Obtenção de colônias monoconidiais....................................................... 31
3.3 Agrupamentos morfológicos..................................................................... 33
3.4 Taxa de crescimento micelial.................................................................... 33
3.5 Produção de enzimas extracelulares....................................................... 34
3.5.1 Amilases................................................................................................
34
3.5.2 Celulases............................................................................................... 34
3.5.3 Proteases............................................................................................... 35
3.5.4 Pectinases............................................................................................. 35
3.5.5 Esterases............................................................................................... 35
3.5.6 Lipases.................................................................................................. 36
3.5.7 Quantificação da atividade enzimática.................................................. 36
3.6 Avaliação da patogenicidade dos isolados.............................................. 36
3.7 Extração de proteínas e eletroforese em gel de
poliacrilamida.................................................................................................. 38
3.8 Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre isolados de Bipolaris
sorokiniana......................................................................................................
39
3.9 Influência de diferentes meios de cultivo na manifestação da
incompatibilidade............................................................................................ 40
3.10 Extração de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida.............. 40
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 42
4.1 Grupos morfológicos e taxa de crescimento............................................. 42
4.2 Atividade enzimática................................................................................. 50
4.3 Patogenicidade dos isolados a sementes e plântulas de trigo................. 61
4.4 Extração de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida................ 68
4.5 Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre isolados de Bipolaris
sorokiniana...................................................................................................... 71
viii
4.6 Influência de diferentes meios de cultivo na manifestação da
incompatibilidade............................................................................................ 76
5.CONCLUSÕES............................................................................................
80
6. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 81
7. APÊNDICES............................................................................................... 92
8. VITA............................................................................................................ 101
ix
RELAÇÃO DE TABELAS
Tabela 1 Isolados utilizados no estudo, origem geográfica e
agrupamento segundo as regiões ITS 1 e ITS2 do DNA
ribossomal...............................................................................
32
Tabela 2
Distribuição dos grupos morfológicos formados pelos trinta e
seis isolados de B. sorokiniana...............................................
44
Tabela 3
Virulência de isolados de B. sorokiniana em sementes e
plântulas de trigo..................................................................
67
Tabela 4
Isolados de B. sorokiniana cruzamentos conforme os
agrupamentos das regiões ITS e resultados dos testes de
incompatibilidade.....................................................................
72
Tabela 5
Cruzamentos de isolados de B. sorokiniana nos diferentes
meios de cultivo utilizados.......................................................
77
x
RELAÇÃO DE FIGURAS
Figura 1 Isolados representando os cinco agrupamentos
morfológicos de B. sorokiniana...............................................
43
Figura 2 Curva de crescimento dos isolados do Grupo I quando
cultivados em meio de cultura BDA, à temperatura de 25°C,
durante 5 dias.........................................................................
48
Figura 3 Curva de crescimento dos isolados do Grupo II quando
cultivados em meio de cultura BDA, à temperatura de 25°C,
durante 5 dias......................................................................... 48
Figura 4 Curva de crescimento dos isolados do Grupo III quando
cultivados em meio de cultura BDA, à temperatura de 25°C,
durante 5 dias.........................................................................
49
Figura 5 Curva de crescimento dos isolados do Grupo IV quando
cultivados em meio de cultura BDA, à temperatura de 25°C,
durante 5 dias.........................................................................
49
Figura 6
Curva de crescimento dos isolados do Grupo V quando
cultivados em meio de cultura BDA, à temperatura de 25°C,
durante 5 dias.........................................................................
50
Figura 7
Halo produzidos pela hidrólise de substratos pelas
enzimas...................................................................................
51
Figura 8
Relação halo/colônia (H/C) dos isolados de B. sorokiniana
para atividade de amilases.....................................................
52
Figura 9
Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para
atividade de carboximetilcelulases..........................................
53
Figura 10
Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para
atividade de proteases............................................................
54
Figura 11
Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para
atividade de pectinases...........................................................
55
Figura 12
Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para
atividade de esterases............................................................
56
Figura 13
Porcentagem de isolados com produção em cada
teste........................................................................................
58
xi
Figura 14
Médias da relação H/C de todos os isolados para cada
teste........................................................................................
58
Figura 15
Médias da relação H/C de cada isolado em todos os
testes.......................................................................................
59
Figura 16
Sintomas apresentados por sementes e
plântulas..................................................................................
62
Figura 17
Perfis protéicos dos isolados de B.
sorokiniana..............................................................................
69
Figura 18
Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre
isolados...........................................................
71
Figura 19
Anastomoses de hifas entre isolados de B.
sorokiniana..............................................................................
73
Figura 20
Perfis protéicos dos isolados de B. sorokiniana crescidos
isoladamente e cultivados em co-cultivo com outros isolados
do mesmo grupo ITS................................................
76
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
cm: Centímetro
DNA: Ácido desoxirribonucléico
mL: Mililitro
μL: Microlitro
µm: Micrômetro
pH: Logaritmo decimal do inverso da atividade de íons hidrogênio numa
solução
KDa; Kilo dalton
1
1. INTRODUÇÃO
O trigo é um dos principais constituintes da dieta humana, sendo
importante tanto na produção de alimentos como na geração de empregos na
agricultura, indústria e comércio. No entanto, o trigo que é produzido no Brasil não
é suficiente para suprir à demanda interna, sendo necessária a importação. Um
dos fatores responsáveis pela baixa produção é a ocorrência de doenças fúngicas,
que são favorecidas pelo clima quente e úmido do país. Dentre essas, destacam-
se a mancha marrom, a ponta preta dos grãos e a podridão comum da raiz
causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana. Este fungo apresenta uma
elevada variabilidade morfológica e fisiológica, o que dificulta seu diagnóstico e o
controle das moléstias. Aliado a isso, o período necessário para o
desenvolvimento das estruturas reprodutivas em laboratório é relativamente longo.
Diversas técnicas têm sido utilizadas para o estudo da variabilidade
genética em fungos fitopatogênicos. A incompatibilidade vegetativa é uma técnica
simples e rápida, baseada na formação ou não de heterocários estáveis entre
2
fungos de constituição genética similares. Outro método bastante utilizado é a
produção de enzimas extracelulares com a capacidade de degradar diversos
substratos. A taxa de crescimento micelial, assim como a atividade enzimática,
pode fornecer informações sobre a variabilidade fisiológica. O uso de técnicas
eletroforéticas como o SDS-PAGE pode ser mais um recurso no estudo da
variabilidade em fungos, sendo utilizado para a separação de enzimas e outras
proteínas e permitindo análises qualitativas e quantitativas. Aliado a tais métodos,
a avaliação da virulência em plantas traz informações importantes sobre a
variabilidade patogênica em fungos. Assim, estudos da variabilidade genética,
fisiológica e patogênica deste fungo são de grande importância, pois podem
fornecer valiosas informações de como o patógeno interage com a planta
hospedeira, permitindo a identificação de isolados hipoavirulentos ou avirulentos,
os quais poderiam contribuir para estratégias de controle das moléstias. Além
disso, tais informações contribuem para o desenvolvimento de outras técnicas que
permitam a identificação molecular do fungo, facilitando a identificação ainda na
semente, que é a principal forma de difusão da moléstia.
Desta forma, os objetivos deste estudo foram:
• Analisar a ocorrência de incompatibilidade vegetativa entre os isolados,
verificando a influência de diferentes meios de cultivo para a manifestação
da incompatibilidade;
3
• Avaliar a morfologia colonial, a taxa de crescimento e a atividade
enzimática dos isolados, buscando relacionar estas características à
patogenicidade;
• Obter e comparar os perfis protéicos dos diferentes isolados quando
crescidos isoladamente e quando confrontados no teste de
incompatibilidade vegetativa;
• Avaliar a virulência de B. sorokiniana em sementes e plântulas de trigo.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Histórico, aspectos gerais e importância econômica da cultura
de trigo
O trigo é um cereal de inverno originado da Ásia, que foi introduzido na
Índia, na China e na Europa há aproximadamente 500 mil anos A.C. Dados
arqueológicos sugerem que este cereal foi o segundo grão cultivado, permitindo
que a espécie humana abandonasse a caça e a pesca e se fixasse à terra,
formando cidades e povoados (Cunha et al., 1999). O trigo foi introduzido no Brasil
em 1634 por imigrantes portugueses que vieram colonizar a Capitania de São
Vicente (Osório, 1992). Seu cultivo de forma mais sistematizada iniciou por volta
de 1720, com a chegada ao sul do país de colonos açorianos, que implantaram
esta lavoura no estado do Rio Grande do Sul (Alves, 1991). No entanto, somente
no século XIX, com a imigração européia, ocorreu o aumento da produção de
trigo, com o conhecimento das técnicas de cultivo de trigo trazidas por estes
imigrantes e o aumento da demanda de alimentos derivados deste cereal (Osório,
1992).
5
As seleções e criações de novos cultivares no país tiveram início em
1919. Desde então, este cereal tem sido a cultura de inverno mais importante no
sul do Brasil. Os estados que mais produzem trigo no Brasil, por ordem de
produção, são: Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Mato Grosso do Sul,
São Paulo, Minas Gerais, Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso e Bahia (Sousa,
1997). Atualmente, o trigo brasileiro é conhecido por apresentar os melhores
genes para tolerância à acidez do solo e resistência à ferrugem da folha e outras
doenças fúngicas (Cunha et al., 1999).
O trigo é uma planta herbácea, monocotiledônea, fasciculada, com a
parte aérea formada por um conjunto de colmos, a sua inflorescência é terminal do
tipo espiga e o fruto é do tipo cariopse (Osório, 1992). Pertence à família
Graminae e ao gênero Triticum, possuindo diversas espécies. Para a classificação
das diferentes espécies de trigo, foram desenvolvidos trabalhos baseados no
número de cromossomos da planta, que morfologicamente podem ser
perfeitamente distinguidos. Foram encontradas 15 espécies de trigo que se
dividem em três grupos: o diplóide (14 cromossomos em dois grupos), o
tetraplóide (28 cromossomos em quatro grupos) e o hexaplóide (42 cromossomos
em seis grupos). As espécies de maior interesse comercial são Triticum aestivum
L. (trigo comum ou farinhento), usado na fabricação de pães, bolos, biscoitos e
produtos de confeitaria; Triticum compactum Host, usado em produtos de
confeitaria; e Triticum durum (trigo duro) usado no preparo de massas alimentícias
(Germani et al. 1998). A espécie T. aestivum L. corresponde a cerca de 90% da
área cultivada e 94% da produção de grãos colhidos no mundo, tendo a maior
6
média mundial de rendimento em grãos. China, Índia e Turquia são os mais
importantes produtores deste tipo de trigo. T. durum L., também chamado de
cristalino ou macarroneiro, é utilizado para fabricar macarrão tipo italiano e
representa cerca de 9% da área cultivada e 5% da produção mundial de grãos.
Sua produção está concentrada no Oriente Médio, Índia, Mediterrâneo, Oeste da
Ásia, Norte da África, Argentina, Chile, Rússia, México, Estados Unidos, Itália,
Espanha e Canadá (CIMMYT, 2008). O rendimento médio dos grãos de T. durum
é mais baixo do que o de T. aestivum, devido a tendência de cultivá-lo em climas
semi-áridos. Entretanto, os cultivares de T. durum podem ser plantados em
condições de irrigação, tendo, em geral, melhores preços no comércio
internacional do que os melhores trigos farinhentos (Hanson et al., 1985).
No Brasil, a Instrução Normativa Número 1, de 27 de janeiro de 1999,
do Ministério da Agricultura e do Abastecimento (MAA), denominada “Norma de
Identidade e Qualidade do Trigo”, estabelece a classificação e tipificação do trigo.
Esta instrução classifica o trigo em 4 classes: o trigo Brando, destinado à
fabricação de bolachas, biscoitos, produtos de confeitaria, pizzas, massa caseira e
ração; o trigo Pão, usado na panificação, massas alimentícias e em mesclas com
o trigo Brando; o trigo Melhorador, destinado à fabricação de massas alimentícias,
biscoitos e em mesclas com o trigo Brando para panificação; e o trigo para outros
usos, geralmente sendo aquele com grãos germinados, usados para ração. A
tipificação do trigo varia de 1 a 3, conforme o grau de umidade, impurezas e
danificação dos grãos (Cunha e Bacaltchuk, 2000). Este cereal é o mais
comercializado do mundo, ocupando aproximadamente 17% das terras cultivadas
7
e é, também, a segunda cultura de grãos em produção, sendo sobrepujado
apenas pelo milho (Indicações Técnicas da Comissão Sul-brasileira de pesquisa
de Trigo, 2005).
O Brasil consome anualmente cerca de 10,6 milhões de toneladas de
trigo, mas não conseguiu produzir nos últimos anos o suficiente para suprir a
demanda interna, tendo que importar trigo para suprir o consumo. A produção
brasileira de trigo foi de 1,66 milhões de toneladas, na safra 2000/01, 3,25 milhões
de toneladas na safra 2001/02, 2,94 milhões de toneladas na safra 2002/03 e
6,03 milhões de toneladas 2003/2004. Em contrapartida, o consumo interno
nestes períodos, respectivamente, foi de 9,324; 10,193; 9,940; 10,151 e 10,310
milhões de toneladas (Indicações Técnicas da Comissão Sul-brasileira de
pesquisa de Trigo, 2005). A estimativa da produção de trigo na atual safra
(2007/08) é de 3.831,4 mil toneladas, superior à safra anterior (2006/07) em 71,5%
(1.597,7 mil toneladas). O referido incremento deve-se à recuperação da
produtividade, já que na safra anterior essa cultura foi bastante castigada com a
estiagem, com a geada e o com excesso de chuva na colheita. No Rio Grande do
Sul, a partir da segunda quinzena de setembro, ocorreu chuva em excesso,
acompanhada de ventos fortes e granizo em algumas localidades, perdurando
esse quadro durante todo o mês de outubro. Com essa situação, ocorreu o
aparecimento de doenças fungicas em larga escala, afetando a produtividade e a
qualidade do grão que se encontravam no estádio de maturação e colheita
(CONAB, 2008).
8
Estima-se que em 2020 a demanda seja 40% maior daquela que é
necessária atualmente (CIMMYT, 2008). Segundo dados mundiais das últimas
cinco safras a China (com 14,5% da produção mundial), União Européia e os
EUA, aparecem como os maiores produtores de trigo e também com os melhores
índices de produtividade. A Argentina é um dos maiores exportadores de trigo a
nível mundial (7,346 milhões de toneladas), sobrepujada na ordem crescente, em
quantidades exportadas, pela Austrália (15,096 milhões de toneladas), pelo
Canadá (15,526 milhões de toneladas) e pelos Estados Unidos (32,287 milhões de
toneladas), no ano agrícola de 2003/4.
A produção brasileira de trigo tem sido insuficiente nas últimas décadas
e, mesmo que tenha apresentado uma pequena recuperação recente, representa
apenas 1% da produção mundial. As perdas na produção de trigo são
decorrentes da redução das áreas cultivadas, ocasionada pela baixa cotação do
produto no mercado interno e pela dificuldade de comercialização nas últimas
safras, e pela redução na produtividade dos grãos, devido às adversidades
climáticas que afetam os estados produtores (IBGE, 2005). As condições
climáticas estão relacionadas à precipitação pluvial e temperatura que, pela
ocorrência de chuvas frequentes e altas temperaturas, contribuem para o
desenvolvimento de doenças fúngicas, as quais são fatores limitantes tanto para a
produção como para a qualidade dos grãos colhidos (Reis e Casa, 1998).
9
2.2 Doenças fúngicas que atacam o trigo
Os fungos são os principais microrganismos presentes em sementes
armazenadas e constituem a causa central da deterioração e perdas durante o
armazenamento. Os danos causados por fungos (odor, descoloração, produção
de toxinas, diminuição de peso, aquecimento, mudanças bioquímicas e redução
do poder germinativo da semente) afetam substancialmente a qualidade,
contribuindo para a desvalorização do cereal e dos seus subprodutos. Os fungos
que comumente atacam as sementes de trigo são classificados como de campo e
de armazenamento. Os primeiros acometem a semente antes da colheita, durante
o seu período de crescimento e maturação, requerendo para o seu crescimento
90-95% de umidade relativa. Portanto, não se desenvolvem com o reduzido grau
de umidade das sementes e da temperatura durante o armazenamento, podendo,
no entanto, sobreviver durante anos em sementes armazenadas (Wetzel et al.,
1983). Depois de colhidas e armazenadas, as sementes estão sujeitas à invasão
de fungos de armazenamento, principalmente dos gêneros Aspergillus e
Penicillium, que se desenvolvem em sementes com graus de umidade entre 65-
90% UR. Geralmente os fungos do armazenamento não infestam as sementes
antes da colheita, sendo encontrados em sementes recém-colhidas numa
porcentagem muito baixa. Uma de suas características é justamente o seu alto
poder de propagação, pois embora presentes no campo em porcentagem
baixíssima, se multiplicam rapidamente em poucos dias, desde que encontrem
condições de ambiente favorável (Wetzel et al., 1983).
10
As doenças de maior importância, segundo Picinini & Fernandes
(2003), pelos danos que podem causar na cultura do trigo, são o oídio, causado
por Oidium monilioides (Nees) Link (teleomórfico Blumeria graminis f. sp. tritici
(Dc.) E.O. Speer); as ferrugens da folha e do colmo, causadas, respectivamente,
por Puccinia triticina Rob. ex. Desm e Puccinia graminis Pers. f. sp. tritici Heriks. &
Henn.; a mancha da gluma, causada por Stagonospora nodorum (Berk.) Cast. &
Germ. (teleomórfico Phaeosphaeria nodorum); a mancha amarela, causada por
Drechslera tritici-repentis Died. Shoemaker (teleomórfico Pyrenophora tritici-
repentis (Died.) Drechs.; a giberela, causada por Fusarium graminearum Schwabe
(teleomórfico Gibberella zeae (Schw.) Petch) e a mancha marrom causada por
Bipolaris sorokiniana (Sacc. In. Sorok) Shoem. (teleomórfico Cochliobolus sativus
(Ito & Kurib) Dreschs. Ex Dastur.).
2.3 O fungo Bipolaris sorokiniana
O gênero Bipolaris contém aproximadamente 45 espécies, das quais a
grande maioria é parasita de plantas, como Bipolaris oriyzae (arroz) e Bipolaris
saccari (cana-de-açucar). Algumas espécies, como Bipolaris australiensis,
Bipolaris hawaiiensis e Bipolaris spicifera, são patogênicas ao homem.
Bipolaris sorokiniana (Sacc.in Sorok) Shoemaker, 1959; (teleomorfo):
Cochliobolus sativus (Ito & Kuribayashi) Drechsl. Ex dastur, pertence à subdivisão
Deuteromycotina, classe Deuteromycetes, subclasse Hyphomycetidae, ordem
Moniliales, família Dematiaceae (Alexopoulos & Mims, 1985). É um fungo
filamentoso que apresenta conidióforos isolados ou em grupos, retos ou flexuosos,
11
algumas vezes geniculados, cor palha a marrom-escuros, septados, medindo
entre 100-400 µm x 6-8 µm ou, segundo Ellis (1971), acima de 220 µm de
comprimento e 6-10 µm de espessura. Os conídios jovens são sub-hialinos,
tornando-se amarelo-esverdeados a marrom-oliváceos escuros, apresentando
formas curvadas ou, freqüentemente, são retos, fusiformes ou ligeiramente
elipsóides quando em meio de cultura. Os conídios germinam por um ou ambos os
pólos, o primeiro septo é produzido delimitando 1/3 basal do conídio e o hilo é
externo, porém truncado (Muchovej et al., 1988).
Na fase sexual ou teleomórfica, o fungo passa a ser um ascomiceto
denominado Cochliobolus sativus (Ito & Kuribayashi) Drechsler ex Dastur. Este
apresenta pseudotécios pretos, globosos, com 300-400 µm de diâmetro e rostro
ereto com 50-200 µm de comprimento. Os ascos são clavados, medindo de 20-45
x 120-250 µm e contendo de 4 a 8 ascósporos encurvados em helicóide. Estes
são hialinos, filiformes, afilados nas extremidades e medem 6-9 x 160-360 µm
(Ellis, 1971; Mehta, 1978). A fase teleomórfica é de rara ocorrência na natureza e
foi encontrada apenas na Zâmbia em 1988 (Kumar et al., 2002). Contudo, esta
forma pode ser obtida em laboratório na presença de material vegetal e outras
condições especiais de cultivo (Ingram & Willians, 1988).
2.4 Moléstias, processo de infecção e epidemiologia
B. sorokiniana é um patógeno de especial importância nas culturas do
trigo e da cevada, causando moléstias que recebem diferentes denominações de
acordo com o órgão da planta que é afetado (Reis, 1982). Também são relatados
12
como cultivares suscetíveis a este fitopatógeno triticale, sorgo, festuca, azevém,
centeio, aveia amarela, branca e preta (Tinline, 1988).
As moléstias causadas por B. sorokiniana ocorrem em qualquer fase de
desenvolvimento da cultura, desde o estabelecimento desta até a sua colheita.
Quando o fungo ataca os órgãos verdes da planta, interferindo nos processos
fotossintéticos, a moléstia é denominada mancha marrom. Primeiramente, esta
doença se manifesta em plúmulas oriundas de sementes infectadas. O fungo
cresce a partir da semente e coloniza o coleóptilo, sobre o qual aparecem lesões
castanho-escuras. Caso o micélio penetre e se desenvolva no interior do
coleóptilo, as manchas poderão ser observadas sobre a plúmula que emergir.
Inicialmente, surgem lesões necróticas pardas, nas primeiras folhas, em virtude da
transmissão a partir das sementes. Nas demais folhas, as lesões podem ser
ovaladas a oblongas, com bordos definidos que variam em tamanho, podendo
crescer até coalescerem, formando grandes manchas com 0,5 a 1,0 cm de
comprimento e com coloração variável, desde cinza claro a negras, que cobrem
largas áreas do limbo foliar. As folhas ficam crestadas, secas e morrem
prematuramente (Reis & Casa, 1998). Nas espigas, as lesões nas glumas têm
centro claro e halo escuro. Os grãos que se formam nas espigas infectadas
podem expor o sintoma denominado ponta preta. Esse sintoma nem sempre se
manifesta, o que torna as sementes aparentemente sadias (Reis & Forcelini,
1993). Lesões de cor castanho-escuro aparecem nos nós e, às vezes, nos
entrenós, pela presença de conídios do fungo, sendo a doença denominada
carvão-do-nó. Tais lesões podem levar ao estrangulamento, com consequente
13
quebra e morte da planta. O fungo pode infectar também os órgãos subterrâneos
da planta, interferindo nos processos de absorção de água e nutrientes, moléstia
esta que recebe o nome de podridão comum da raiz (Reis & Casa, 1998). Os
sintomas mais comuns são as descolorações do tecido radicular, que, com o
tempo, torna-se acinzentado. Plantas adultas doentes apresentam lesões
pequenas, ovais e de coloração marrom nas raízes, nas bainhas das folhas
inferiores ou nos internódios da coroa da planta, próximo à superfície do solo (Reis
& Casa, 1998). Os danos na planta podem ultrapassar a 30 % e a partir dos 53
dias após a emergência, estes podem ser ainda maiores. A mancha marrom é
considerada uma doença de grande impacto econômico, com elevada incidência e
transmissão em sementes, podendo variar de 60 a 90% (CABI, 2000).
Levantamentos sanitários de sementes comercializadas no país têm revelado a
presença constante de B. sorokiniana, com percentuais variando conforme o ano,
o local e o cultivar, podendo chegar a 100% (Forcelini, 1995).
B. sorokiniana produz toxinas sesquiterpênicas sintetizadas a partir do
farnesol. O pré-helmintosporol é o composto mais abundante e ativo, exercendo
efeito inibitório sobre a ATPase e possuindo propriedades anfipáticas (Kumar et al,
2002). Outra toxina, o helmintosporol, afeta a permeabilidade da membrana,
fosforilação oxidativa, fotofosforilação e bombeamento de prótons através da
membrana plasmática (Kumar et al, 2002). Um outro composto, denominado
sorokianina, foi isolado de filtrados fúngicos, apresentando efeitos inibitórios sobre
a germinação de sementes de aveia (Nakajima, 1994).
14
De acordo com Prates & Fernandes (2001), quando a temperatura fica
entre 23 e 30 ºC, a taxa de expansão das lesões causadas por B. sorokiniana é
maior, fato que justifica a doença ser mais freqüente em regiões de clima tropical e
subtropical. Ensaio realizado por Luz & Bergstrom (1986) mostrou que, para
cultivares suscetíveis, a temperatura ótima está entre 20 e 28 ºC e para cultivares
moderadamente resistentes e resistestes 28 ºC. Quando o fungo infecta a
semente no momento em que ela germina, o parasita sai do estado de dormência.
Assim, o micélio, que se encontrava no endosperma, cresce até a superfície da
cariopse, atinge o coleóptilo e alcança a extremidade, fora do solo, onde passa a
esporular. Também pode ocorrer a infecção da plúmula pela penetração do
micélio no coleóptilo, o que determina o aparecimento de lesões na bainha após
sua emergência (Reis & Casa, 1998). Havendo condições favoráveis ao
estabelecimento da infecção pode ocorrer uma epidemia no início do estágio de
desenvolvimento do trigo. A esporulação do fungo sobre as lesões pode
disseminá-lo pelo vento sob condições de clima seco, atingindo outras folhas na
mesma planta ou em vizinhas, sendo responsável pelos ciclos secundários da
doença em órgãos aéreos.
As fontes de inóculo primário são as sementes, os restos culturais
infectados, as plantas voluntárias, os hospedeiros secundários e os conídios livres
dormentes no solo (Reis & Casa, 1998). No processo de infecção, o fungo passa
por uma fase biotrófica de crescimento sobre o hospedeiro, caracterizada pela
penetração da cutícula e parede celular, seguida do desenvolvimento de hifas
dentro das células da epiderme. Na fase necrotrófica ocorre a inversão do
15
mesófilo e morte das células (Kumar et al., 2002). As células internas de alguns
conídios que caem no solo se transformam em clamidósporos, auxiliando na
sobrevivência do patógeno diretamente no solo por longos períodos de tempo, o
que consiste em uma vantagem em relação a outros fitopatógenos que não
sobrevivem sem a presença de restos culturais (Meronux & Pepper, 1968).
2.5 Métodos de controle de B. sorokiniana
Os principais métodos de controle das doenças causadas por B.
sorokiniana são a rotação de culturas, eliminação de restos culturais, uso de
cultivares resistentes e fungicidas. Logo após seu lançamento, os novos cultivares
apresentam maior produtividade, já que ainda possuem resistência a doenças.
Porém, com o passar dos anos, novas raças e variantes de fungos surgem
quebrando a resistência e reduzindo a produtividade (Cunha & Trombini, 1999).
Os tratamentos de sementes com fungicidas eficientes, associados a
estratégias como a rotação de culturas e o uso de cultivares resistentes, podem
reduzir o número de aplicações de fungicidas no controle de doenças foliares em
trigo (Picinini & Fernandes, 2003). Lasca et al. (2001) testaram a eficiência de
vinte fungicidas no controle de B. sorokiniana e Pyricularia grisea em sementes de
trigo, sendo que os fungicidas iprodione e carbendazin foram os mais eficientes.
Fungicidas são bastante utilizados no controle de fitopatógenos deviado a sua
facilidade de aplicação e resultados imediatos. No entanto, o uso contínuo destes
produtos pode aumentar as chances de resistência de fungos fitopatogênicos.
Extensas áreas tratadas com o mesmo ingrediente ativo aumentam a pressão de
16
seleção e, além disso, quanto menor o tempo de geração do patógeno, mais
freqüente é a necessidade de exposição ao fungicida e maior o risco de
resistência (Ghini & Kimarti, 2002).
De acordo com Reis & Casa (1998) um plantio com uma espécie
vegetal não suscetível é suficiente para reduzir a incidência de B. sorokiniana, pois
foi demonstrado que a esporulação do fungo acompanha a curva de
decomposição dos restos culturais e não é detectada após 17 meses.
Alguns estudos recentes buscam a utilização de métodos alternativos
ao uso de fungicidas. Um exemplo é o uso de extratos vegetais, demonstrado em
estudos realizados por Rodriguez et al. (2006) com a planta medicinal Ocimum
gratissimum e por Salgado et al. (2003) com espécies de Eucaliyptus. Da mesma
forma, o controle biológico surge como uma estratégia interessante, por ser uma
medida atóxica e não provocar desequilíbrios ambientais. Trabalhos utilizando
microrganismos como Stenotrophomonas maltophilia (Zhang & Yuen, 1999),
Pseudomonas sp. (Hodges et. al., 1994), Bacillus sp. (Czaczyk et al., 2000) e
Trichoderma hamatum (Dall Bello et al., 1997) mostraram resultados satisfatórios
no controle de B. sorokiniana.
2.6 Variabilidade do fungo B. sorokiniana
Espécies fúngicas patogênicas de plantas ou animais exibem variações
em importantes aspectos, como na morfologia, síntese de metabólitos secundários
e virulência. Azevedo (1976) salienta que os mecanismos que conferem
variabilidade em fungos fitopatogênicos são a mutação, a parassexualidade, a
17
heterocariose e a recombinação somática em fungos imperfeitos e a
recombinação sexual em fungos de outras classes. A variabilidade na morfologia
impede a identificação do patógeno, enquanto a variabilidade fisiológica dificulta a
avaliação da patogenicidade. A correta identificação das espécies é uma
informação necessária para entender a relação patógeno-hospedeiro e possibilitar
que medidas de controle sejam tomadas.
Durante a interação patogênica entre fungos e plantas são expressos
diversos genes, os quais estão envolvidos na síntese de enzimas de degradação
da parede vegetal do hospedeiro e estruturas de infecção. Tais genes podem ser
expressos durante as fases de contato inicial com a planta ou na fase de necrose
(Kahmann & Basse, 2001). As populações de fitopatógenos são notoriamente
sensíveis ao genótipo do hospedeiro e as variações no meio ambiente.
Populações de plantas são com freqüência geneticamente polimórficas para a
resistência a patógenos, mas estes são polimórficos para os genes de virulência e
podem quebrar a resistência do hospedeiro. Esses dados sugerem que os
polimorfismos planta-patógeno são mantidos por um ciclo contínuo de coevolução
entre as populações, combinado com a migração ocasional de genes de virulência
e resistência oriundos de população distante (Frank, 1992). Alguns fungos
possuem cromossomos supranumerários que contribuem para a variação na
patogenicidade, pois carregam genes de virulência. Também já foram observados
elementos transponíveis, que podem ser transmitidos entre núcleos de um
heterocário e fatores genéticos citoplasmáticos, RNAs citoplasmáticos e
18
plasmídeos, que podem ser transferidos para diferentes linhagens por
mecanismos não mendelianos (Klister & Miao, 1992)
As características morfológicas, fisiológicas e genéticas de B.
sorokiniana já foram abordadas em muitos estudos. Os estudos com este fungo
iniciaram com Christensen (1925), que verificou a presença de grandes diferenças
morfológicas onde 37 fenótipos de B. sorokiniana foram observados em meio de
cultura. Hansen (1938) observou a instabilidade cultural de fungos fitopatogênicos
imperfeitos isolados da natureza, propondo a existência de dois estados
morfológicos: um estado conidial, com abundante produção de conídios e outro
micelial, com produção de poucos ou nenhum conídio e abundantes hifas aéreas.
Tal fenômeno foi atribuído à variação na proporção de núcleos do tipo micelial e
do tipo conidial no heterocário.
Tinline (1961) observou grande variabilidade em C. sativus, com
relação à cor dos esporos, pigmentação do micélio, virulência, esporulação e
outras características em meio de cultura. O autor sugeriu três mecanismos para
aumentar a variabilidade: mutação, heterocariose e hibridização. Guseva et al.
(1979) salientaram que a variabilidade pode ser responsável pela capacidade
infectiva do fungo, pois suplanta a resistência do hospedeiro. Mehta (1981)
estudou a patogenicidade de 96 isolados monoconidiais de Helminthosporium
sativum, oriundos de 41 municípios e 51 cultivares. O autor encontrou 32 raças
diferentes, sendo que 23 foram detectadas no Paraná, 4 em São Paulo, 3 no Rio
Grande do Sul, 1 no Mato Grosso e 1 no Distrito Federal.
19
Viegas et al. (1992) relataram variabilidade quanto ao crescimento e
morfologia de 60 isolados de C. sativus, cultivados em diferentes meios de cultura
e concluiram que as diferenças estavam relacionadas ao meio e características de
cada isolado. Valim-Labres et al. (1997) e Oliveira et al. (1998) investigaram a
variação morfológica e virulência de B. sorokiniana, onde os autores encontraram
variações quanto a essas características e não observaram relação entre a
variabilidade morfológica e virulência dos isolados. Berbee et al. (1999) avaliaram
a distribuição filogenética de espécies dos gêneros Cochliobolus, Bipolaris e
Curvullaria, utilizando as regiões do espaço transcrito interno ITS e o gene gpd,
que codifica a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, obtendo 2 grupos
filogenéticos. Almgren et al. (1999) estudaram a relação entre infecções em folhas
e raízes por diferentes isolados de B. sorokiniana em 11 cultivares de cevada,
onde taxas de infecção mais elevadas foram observadas nas folhas do que nas
raízes foram encontradas, sendo que tais reações foram diferenciadas conforme o
isolado utilizado.
Duveiller et al. (2000) estudaram a patogenicidade de 27 isolados de B.
sorokiniana da cidade do México, encontrando resultados que revelaram a alta
variação de infecções causadas por B. sorokiniana e que estas eram altamente
influenciadas por fatores ambientais. Zhong & Steffenson (2001) estudaram a
diversidade genética pela técnica de Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP) e patogenicidade de 22 isolados de B. sorokiniana, encontrando 3
patotipos. Destes, o patotipo 2 era extremamente virulento e ocorria apenas em
Dakota do Norte (USA). Quanto à diversidade genética, os autores verificaram que
20
muitos isolados oriundos de diferentes regiões geográficas agruparam-se em um
mesmo grupo pela técnica de AFLP, sugerindo que haveria ocorrido a migração
destes patógenos por estas regiões.
Weikert-Oliveira (2002) estudou a variabilidade de vinte amostras de 4
espécies de fungos, dentre as quais sete isolados de Bipolaris sorokiniana,
causadores de helmintosporiose em cereais, pelas técnicas de PCR-RFLP e
RAPD. A referida autora encontrou alto polimorfismo inter e intraespecífico. Os
perfis de RAPD obtidos revelaram ausência de correlação entre os fatores
climáticos e a origem geográfica dos isolados de B. sorokiniana. Arabi & Jawhar
(2004) analisaram a virulência de isolados de Cochliobolus sativus utilizando 10
diferentes genótipos de cevada, encontrando alta variação entre os isolados
quanto a patogenicidade. Muller et al. (2005) utilizaram a técnica de RAPD para
investigar a diversidade genética de 20 isolados de B. sorokiniana, dos quais 19
mostraram-se fortemente relacionados, com um coeficiente de similaridade de
78%.
Jaiswal et al. (2007) caracterizaram 155 isolados de B. sorokiniana
quanto a características morfológicas e patogênicas. Os autores agruparam os
isolados relacionando a coloração micelial à patogenicidade e encontrando alta
diversidade entre os isolados. Pandey et al. (2007) obtiveram 86 isolados clonais a
partir de um único isolado de B. sorokiniana, separando-os em três grupos
conforme características morfológicas. A amplificação do DNA genômico utilizando
RAPD revelou um fragmento presente em todos os isolados, que poderia ser
utilizado como marcador molecular para esta espécie. Nascimento & Van Der
21
Sand (2007), estudando isolados de B. sorokiniana utilizando a técnica de PCR-
RFLP das regiões ITS1 e ITS2 do DNA ribossomal, observaram polimorfismos
intra-específicos e interespecíficos. No entanto, não foi possível agrupar os
isolados de acordo com a região geográfica e tipo de hospedeiro.
2.7 Anastomose de hifas e incompatibilidade vegetativa
A anastomose é caracterizada pela fusão entre hifas, permitindo que
ocorra a comunicação entre os compartimentos das mesmas. Quando esta fusão
se dá entre hifas de organismos diferentes, há a formação de um heterocário, ou
seja, um único talo contendo dois ou mais núcleos de organismos geneticamente
distintos (Glass et al, 2000). Em fungos filamentosos, a formação de heterocário
está relacionada aos processos de recombinações parassexuais e sexuais. A
capacidade de formar heterocários intraespecíficos é uma característica bastante
comum em fungos filamentosos (Glass et al., 2000). Entretanto, um fungo
individualizado pode ser impedido de formar um heterocário estável com outro
fungo de constituição genética similar, por um mecanismo genético denominado
incompatibilidade vegetativa ou somática, que impõe uma barreira nos
cruzamentos entre organismos geneticamente semelhantes. Este mecanismo
contribui para a conservação genética dentro de uma população, além de restringir
a disseminação de partículas infecciosas, como microvírus ou organelas
debilitadas (Marek, 2003).
A anastomose de hifas é dividida em três etapas: pré-contato, pós-
contato e fusão. A etapa de pré-contato está relacionada com a difusão de
22
substâncias químicas no meio de cultura. Durante a fusão de hifas, há a
desestruturação das paredes celulares por ação de enzimas hidrolíticas na região
de encontro das hifas. Já no pós-contato, ocorrem à mistura de citoplasmas e
fusão de núcleos (Glass et al, 2000).
A variabilidade genética em fungos pode ser causada por mutações e
sistemas de recombinação, como o ciclo sexual e parassexual, que combinam
características de diferentes organismos em um mesmo indivíduo. O início destes
processos se dá com anastomoses de hifas de diferentes linhagens para a
formação de um heterocário estável, onde ocorrerá a fusão de núcleos e posterior
meiose. Assim, este processo é importante para o aumento e compreensão da
variabilidade genética apresentada por determinado organismo (Esposito &
Azevedo, 2004).
Muitos trabalhos têm reportado a existência de incompatibilidade
vegetativa em diferentes espécies fúngicas, como Verticillium dahlia (Bellahcene
et al., 2005), Amylostereum areolatum (Slippers et al., 2001), Fusarium
graminearum (McCallum et al., 2001), Neurospora crassa (Marek et al., 2003),
Phytophtora infestans (Cherepennikova-Anikina et al., 2002), Rhizoctonia solani
(Mahmoud et al., 2007), Colletotrichum gossipii (Roca et al., 2004), Sclerotinia
homeocarpa (Powell, 2001), Glomus mosseae (Giovanetti et al., 2003), Sclerotium
rolfsii (Sarma et al., 2002).
23
2.8 Enzimas extracelulares
A análise da presença de enzimas com a capacidade de degradar a
parede celular de plantas, animais e outros microrganismos, é um método
extensivamente usado na caracterização da variabilidade em fungos
fitopatogênicos. Neste processo, o patógeno é considerado um invasor passivo,
incapaz de desenvolver força para romper as barreiras estruturais do hospedeiro.
Desta forma, sendo o patógeno dependente de enzimas ou outros metabólitos
para sua patogenicidade, uma adequada produção destes é requerida. A interação
fungo-planta é determinada por mecanismos de ataque do patógeno e de defesa
da planta, sendo estes também influenciados por fatores ambientais (Bocchese,
2003). As enzimas produzidas pelos fungos têm papel importante no processo de
infecção do hospedeiro e na quebra de compostos orgânicos.
As enzimas têm sido utilizadas em diversos processos industriais e
bioquímicos e, atualmente, no estudo da relação entre patógeno e hospedeiro.
Muitas enzimas produzidas por fungos são importantes na digestão e transporte
de nutrientes para a célula, assim como no processo de patogênese,
principalmente em relação aos fungos necrotróficos, que matam as células do
tecido colonizado. Segundo Griffin (1994), enzimas que hidrolisam lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos são conhecidas, mas o efeito na patogenicidade
ainda não está bem esclarecido. Embora pouco estudadas quanto à participação
nos processos de penetração e colonização nos tecidos dos hospedeiros, várias
enzimas já foram detectadas em fungos através do cultivo em meios específicos.
24
Estas enzimas são potencialmente importantes na patogênese porque destroem o
plasmalema, componente da parede celular (Griffin, 1994).
Dentre as principais exoenzimas estudadas, destacam-se as amilases,
celulases, lipases, pectinases, proteases e esterases. Lipídeos são compostos
formados por ácidos graxos, sendo encontrados em diferentes formas nas células
vegetais: óleos e gorduras, principalmente nas sementes, ceras e cutículas; e
fosfolipídeos e glicolipídeos, nas membranas. Muitos microrganismos podem
degradar estes compostos utilizando enzimas lipolíticas e gerando ácidos graxos,
que podem ser utilizados diretamente pelos microrganismos (Pascholatti, 1995).
As lipases fúngicas têm sido extensivamente estudadas, pelo potencial de
aplicação em detergentes, óleos e indústrias alimentícias, já que estes organismos
as excretam extracelularmente, facilitando a extração em meios de fermentação.
Diversos fungos já foram estudados quanto à produção destas enzimas, como
Fusarium solani (Maia et al, 1999), Verticillium lecanii (Lopes-Llorca & Carbonell,
1999), Trichoderma sp. (Barbosa et al. , 2001).
O amido é um polímero de glicose que constitui o principal
polissacarídeo de reserva em células vegetais. Este polímero pode ser degradado
pela ação de enzimas amilases, que o convertem em moléculas de glicose que
são diretamente utilizáveis nas atividades metabólicas dos microrganismos
(Pascholatti, 1995).
A celulose é um polímero linear não ramificado contendo moléculas de
glicose, unidas por ligações glicosídicas tipo β-1,4, as quais são hidrolisadas por
25
enzimas celulolíticas. O fungo Fusarium oxisporum, causador de murcha em
plantas, foi estudado e expressou celulases em cultura e in vitro, mostrando a
importância destas enzimas na patogenicidade (Pascholatti, 1995). As enzimas
celulolíticas desempenham importante papel na patogenicidade, degradando a
celulose, principal constituinte da parede celular dos vegetais. As celulases
formam um complexo enzimático constituído por três enzimas: β-1,4 glucanase,
exo β-1,4 glucanases e β-1,4 glucosidase (Pascholati, 1995). Cada uma destas
enzimas atua de forma específica nos polímeros de celulose. A produção de
celulases por fungos já foi citada em Sclerotinia sp., Rhizoctonia solani Kühn,
Penicillium sp., Pythium ultimum Trow, Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum
(Atk.) Snyder & Hansen, entre outros fitopatógenos, exercendo papel significativo
na interação patógeno-hospedeiro (Piero & Pascholati, 2000).
Substâncias pécticas são polissacarídeos ácidos de alta massa molar
que formam parte das paredes celulares e da lamela média dos vegetais. Devido à
importância estrutural e à vulnerabilidade desses polímeros, as enzimas pécticas
podem causar maceração dos tecidos (separação das células), lise celular e
modificações da parede, permitindo a ação de outras enzimas despolimerizantes
que atuam sobre outros substratos, como celulose e lignina. Dentre as principais
enzimas pectinolíticas estão as esterases, que desesterificam os grupos metoxila
da pectina liberando ácido péctico; e as pectinases, que atacam a pectina
fortemente unida ao resto dos componentes da parede celular, liberando pectina
solúvel de alta massa molar (Esposito & Azevedo, 2004). Estas enzimas possuem
relevante importância na patogenicidade. O fungo geralmente apresenta uma ou
26
mais enzimas pectinolíticas pré-formadas, em baixos níveis. Quando este entra
em contato com os polímeros de ácido galacturônico na parede primária ou lamela
média do hospedeiro, libera monômeros ou oligômeros a partir destes polímeros,
que podem servir como sinais para síntese de pectinases (Pascholatti, 1995).
Proteases são enzimas responsáveis pela clivagem hidrolítica da
ligação amida entre os grupos carboxila e amina dos aminoácidos formadores de
ligação peptídica, constituindo um dos mais importantes grupos de enzimas
exploradas industrialmente, respondendo por cerca de 25% da produção de
enzimas disponíveis comercialmente (Esposito & Azevedo, 2004).
Uma das formas simples e práticas de se determinar a variabilidade de
espécies fúngicas consiste na seleção dos fungos através da produção de
enzimas hidrolíticas em substratos definidos. A produção de enzimas por fungos
em meio sólido é um meio rápido e simples para análise de variações genéticas
em uma população, detectando a presença ou ausência de enzimas específicas e
auxiliando em estudos ecológicos, taxonômicos e de patogenicidade (Hankin &
Anagnostakis, 1975)
2.9 Padrões eletroforéticos de proteínas totais
A eletroforese consiste em uma técnica relativamente simples, rápida e
com grande valor informativo, sendo amplamente utilizada para estudos
taxonômicos, fisiológicos e genéticos de microrganismos (Alfenas et al., 1991). A
possibilidade de se usar a técnica de eletroforese a fim de separar enzimas e
proteínas totais extraídas de microrganismos, objetivando a identificação de
27
fungos em nível de espécies ou mesmo subespécies, tem sido utilizada por um
grande número de pesquisadores. A eletroforese de proteínas e isoenzimas tem
ajudado na identificação de espécies fúngicas intimamente relacionadas, na
relação patógeno–hospedeiro, assim como na variabilidade genética das espécies
(Alfenas et al., 1991).
Os perfis de proteínas totais e isoenzimas são marcadores genéticos de
grande utilidade na identificação de fungos, sendo considerados de grande
importância para a identificação e taxonomia (Alfenas et al., 1991; Rosendahl &
Banker, 1998). Em trabalhos com eletroforese podem ser avaliadas as variações
no número, na intensidade e na mobilidade relativa das bandas apresentadas no
gel, permitindo visualizar grupos de similaridade entre os isolados de uma mesma
espécie. As análises de proteínas e isoenzimas em gel de poliacrilamida permitem
a diferenciação de espécies que apresentam difícil identificação, devido a grande
variabilidade ou a ausência de características morfológicas de importância para
um diagnóstico preciso (Hennerbert & Vancnneyt, 1998).
Diversos trabalhos relatam o uso de gel de eletroforese de proteínas
totais SDS-PAGE para auxiliar em estudos de classificação de fungos. Park et al.
(2000) compararam padrões eletroforéticos de proteínas totais e isoenzimas de
diferentes isolados do fungo Pythium sp., oriundos da Coréia e do Japão. Rad et
al. (2001) investigaram os padrões proteicos de dez isolados de Trichophyton
rubrum utilizando gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Gel de poliacrilamida e análise
numérica também foram utilizados por Hofling et al. (2001) para estudar proteínas
solúveis em doze cepas de leveduras orais, pertencentes a cinco espécies.
28
Jernejc & Cimerman (2001) estudaram as características morfológicas,
enzimáticas e padrões de proteínas intracelulares e extracelulares de cinco
espécies de Aspergillus.
Silveira & Alfenas (2001) caracterizaram isolados de Rhizoctonia solani
patogênicos a Eucalyptus, por meio de eletroforese de proteínas em gel de
poliacrilamida e de isoenzimas em gel de amido. Giovanetti et al. (2003)
estudaram a diversidade genética de isolados do fungo micorrízico Glomus
mosseae de diferentes regiões geográficas, através de compatibilidade vegetativa,
características morfológicas, RFLP-ITS, isoenzimas e padrões de proteínas totais.
Arabi & Jawhar (2004) avaliaram a variação genética de vinte e sete isolados de
Pyrenophora gramínea através de gel de proteínas SDS-PAGE. Ferreira (2005)
analisou a diversidade genética de isolados de Crinipellis perniciosa, oriundos de
diferentes regiões geográficas, por técnicas de compatibilidade somática,
velocidade de crescimento micelial, ensaio imunoenzimático ELISA, Western Blot
e eletroforese de proteínas totais. Mahmoud et al (2006) estudou a variabilidade
de isolados de Rhizoctonia solani utilizando gel de proteínas totais SDS-PAGE,
associado a outros métodos, como patogenicidade, incompatibilidade e
isoenzimas. De Brito (2006) também utilizou este gel, além de testes de atividade
enzimática e características morfológicas, para diferenciar isolados de Curvularia
eragrostidis.
Assim, diversas técnicas vêm sendo utilizadas no estudo da
variabilidade em fungos fitopatogênicos. No entanto, ainda são poucas as
informações sobre a variabilidade do fungo B. sorokiniana, o que dificulta
29
estratégias de controle contra o mesmo. Desta forma, torna-se evidente a
necessidade de que estudos que abordem a variabilidade deste fungo sejam
conduzidos, uma vez que os mesmos poderão gerar informações importantes para
o conhecimento desta espécie.
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no laboratório de Micologia Ambiental
do Departamento de Microbiologia, localizado no Instituto de Ciências Básicas da
Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS.
3.1 Origem e obtenção dos isolados
O presente estudo utilizou 35 isolados de Bipolaris sorokiniana e um
isolado de Bipolaris oryzae, obtidos a partir de sementes contaminadas
provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e de outros países
(Tabela 1) e pertencentes à coleção do laboratório de Micologia Ambiental. Dos
30 isolados de B. sorokiniana do Brasil, 27 foram obtidos através de sementes de
trigo contaminadas fornecidas pelo CNTP-Embrapa Passo Fundo e um foi isolado
de sementes de cevada fornecidas também pelo CNPT-Embrapa Passo Fundo.
Os isolados oriundos de outros países foram fornecidos pelo CIMMYT-México. O
31
isolado de Bipolaris oryzae foi fornecido pelo Instituto Riograndense de Arroz
(IRGA).
3.2 Obtenção de culturas monoconidiais
Para a obtenção de culturas monoconidiais de cada isolado, o micélio
aéreo das culturas policonidiais foi transferido com auxílio de uma alça de platina
para tubos de microcentrífuga contendo 2 mL de solução salina 0,85%. Os tubos
foram agitados para a liberação completa dos conídios e a suspensão depositada
em uma placa de Petri contendo meio agar-água. As placas foram mantidas em
repouso por 2 horas, para que os conídios pudessem se aderir ao meio. Após
este período, o excesso de água da placa foi removido cuidadosamente com o
auxílio de uma pipeta de maneira que os conídios permaneceram aderidos ao
meio de cultura na placa. Utilizando-se um estereomicroscópio com aumento de
40x, os conídios foram transferidos assepticamente, com auxílio de uma
microagulha de vidro, para tubos de ensaio contendo meio BDA inclinado. Os
tubos foram observados sob estereomicroscópio com a finalidade de confirmar a
transferência de apenas um conídio em cada tubo. Após, os tubos foram
incubados a 25ºC com fotoperíodo de 12 horas, até o desenvolvimento completo
das colônias. As amostras, após o desenvolvimento da colônia, foram
armazenadas sob refrigeração a 4ºC.
32
Tabela 1. Isolados utilizados no estudo, origem geográfica e agrupamento segundo as regiões ITS
1 e ITS2 do DNA ribossomal (Nascimento & Vand Der Sand, 2007)
Isolado Origem
Hospedeiro
Grupo
98003 Pelotas – RS Trigo 1
98004 Cruz Alta – RS Trigo 1
98006 Pelotas – RS Trigo 3
98007 Cruz Alta - RS Trigo 2
98010 Santa Rosa - RS Trigo 15
98011 Lagoa Vermelha– RS Trigo 4
98012 Lagoa Verm. - RS Trigo 15
98013 Vitória – PR Trigo 13
98014 Lagoa Vermelha - RS Trigo 1
98017 Samambaia_ PR Trigo 2
98018 Vitória – PR Trigo 3
98019 Taquá – PR Trigo 3
98021 Vitória - PR Trigo 16
98022 Selbach - RS Trigo 16
98023 Vitória - PR Trigo 15
98025 Piratini – RS Trigo 4
98026 Piratini – RS Trigo 2
98028 Pelotas – RS Trigo 14
98029 Piratini – RS Trigo 9
98030 Cruz Alta - RS Trigo 15
98032 Engenheiro Beltrão - PR Trigo 14
98033 Landoi - PR Trigo 20
98040 Piratini – RS Trigo 7
98041 Vitória - PR Trigo 14
98042 Piratini – PR Trigo 13
98043 Pelotas – RS Trigo 8
1992 Planaltina – GO Trigo 7
CV13 Guarapuava – PR Cevada 9
BO2002 Depressão Central – RS Arroz 8
BS6M1 Jalisco – México Trigo 12
BS18M2 Veracruz - México Trigo 19
BS52M1 NuevoLeon - México Trigo 19
BS16M1 Chiuaua - México Trigo 20
CS1004 Hanoi – Vietnan Trigo 12
CS1110 Bangladesh Trigo 19
1965 Dinamarca Trigo 12
33
EXPERIMENTO 1
3.3 Agrupamentos morfológicos
Os isolados foram observados e agrupados de acordo com a morfologia
da colônia. Para tanto, discos de micélio de colônias jovens foram repicados para
o centro de placas de Petri contendo o meio BDA, sendo cultivados em estufa tipo
BOD a 25ºC por 5 dias. A análise morfológica consistiu na observação da
coloração e textura do micélio, além da formação ou não de setores no mesmo.
Os isolados que apresentaram características semelhantes foram incluídos em um
mesmo grupo morfológico.
3.4 Taxa de crescimento micelial
Para a avaliação da taxa de crescimento, foram utilizadas placas de
Petri com sete centímetros de diâmetro contendo o meio de cultivo BDA, sendo
realizadas cinco repetições para cada isolado. Duas linhas perpendiculares (A e B)
foram traçadas no verso de cada placa e discos de micélio do fungo com 0,5cm de
diâmetro foram inoculados no centro de cada placa, no ponto onde as linhas se
interceptavam. As placas foram mantidas em estufa BOD a 24 ºC ± 2, com
fotoperíodo de 12 horas. As medidas da taxa de crescimento foram realizadas a
cada 24 horas, por um período de 120 horas, utilizando um paquímetro. Os
resultados para cada isolado foram expressos pelas médias das taxas de
crescimento das 5 repetições. Os diferentes grupos foram comparados quanto ao
crescimento pela análise de variância e pós-teste de Tuckey, quando necessário.
34
3.5 Produção de enzimas extracelulares
Os isolados de B. sorokiniana e o isolado de B. oryzae foram avaliados
quanto à sua capacidade de produzir enzimas extracelulares em meio sólido. Para
tanto, discos de 5mm de diâmetro do micélio de cada isolado foram transferidos
individualmente para placas de Petri contendo meio mínimo acrescido do
substrato da enzima a ser avaliada, e mantidas por 5 dias a 25ºC em estufa BOD
com fotoperíodo de 12 horas. Todos os experimentos foram realizados em
triplicata.
3.5.1 Amilases
A produção de amilases foi observada em meio mínimo
acrescentando-se 1% de amido solúvel ao meio de cultura. Após o crescimento do
fungo, foi adicionado lugol à placa de Petri. O halo formado ao redor da colônia,
em contraste com o meio escurecido, indicou a atividade amilolítica.
3.5.2 Celulases
Para avaliar a produção de celulases, foi acrescentado 1% de
carboximetilcelulose (CMC) ao meio mínimo. Após o crescimento fúngico, a
produção de celulase extracelular foi detectada adicionando-se na placa solução
de vermelho-congo por 15 minutos. Posteriormente o corante foi removido
utilizando-se uma solução de NaCl 4N. A produção de celulases foi detectada
pela formação de um halo alaranjado em contraste com o meio avermelhado.
35
3.5.3 Proteases
Para a produção de proteases foi utilizado 4% de gelatina como
substrato, adicionado ao meio mínimo. Após o período de incubação, foi
adicionada solução saturada de (NH
4
)
2
SO
4
, cujo precipitado torna o ágar mais
opaco, revelando as zonas claras ao redor das colônias, onde ocorreu a
degradação da gelatina.
3.5.4 Pectinases
Para detectar a atividade pectinolítica foi utilizado meio mínimo
modificado para pectinases acrescido de 1% de pectina cítrica. Após o
crescimento do fungo, foi adicionado solução de brometo de
hexadeciltrimetilamônia a 1%. O halo transparente formado ao redor da colônia,
em contraste com o meio esbranquiçado, indicou a atividade pectinolítica.
3.5.5 Esterases
Para a análise de esterases, foi utilizado meio mínimo suplementado
com 1% de Tween 20 (monooleato de polioxietileno sorbitan), o qual foi
autoclavado separadamente e adicionado ao meio momentos antes de vertê-lo às
placas de Petri. Após o crescimento fúngico, as placas foram refrigeradas a 4ºC
por 48h. A produção de esterases foi detectada pela formação de um halo
esbranquiçado, visível devido à formação de cristais de sais de cálcio, em
contraste com o meio transparente.
36
3.5.6 Lipases
Para avaliação da atividade lipásica, o meio foi suplementado com óleo
de oliva a 2,5% e solução de Rodamina B a 0,001%. Os isolados lipolíticos
apresentaram uma fluorescência laranja ao redor das colônias ou no interior das
mesmas, quando observados sob radiação UV de 350 nm
3.5.7 Quantificação da atividade enzimática
A atividade enzimática foi quantificada pela análise da relação H/C,
obtida pela divisão da média do diâmetro do halo (H) nas 3 repetições pela média
do diâmetro da colônia (C), exceto para lipases, onde foi somente observado a
produção ou não da enzima. Os resultados foram analisados utilizando-se o teste
de análise de variâncias fator único (ANOVA one way), com um nível de
significância (α) de 0,01, seguido do pós-teste de Tukey, com α igual a 0,05,
quando necessário.
3.6 Avaliação da virulência dos isolados
A avaliação da virulência dos isolados de B. sorokiniana foi realizada
utilizando-se sementes de trigo do cultivar BRS Buriti, fornecidas pela Embrapa
Trigo e classificadas como moderadamente suscetíveis a B. sorokiniana. Para
produção de inóculo, discos de micélio de cada isolado foram transferidos para
placas de Petri contendo meio BDA e incubados em estufa BOD, a 25ºC e
fotoperíodo de 12h, até que as colônias atingissem um tamanho próximo ao
diâmetro total da placa.
37
As sementes foram inoculadas pelo método descrito por Tanaka e
Menten (1991), modificado para o experimento em questão. Foram utilizadas 200
sementes por isolado fúngico, divididas em 4 parcelas de 50 sementes, conforme
recomendado pelas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992). Cada
parcela de sementes foi mantida por 24h em placas de Petri com meio de cultura
BDA colonizado pelo isolado fúngico a ser testado, em estufa BOD a 25ºC com
fotoperíodo de 12 horas. A testemunha constou de 200 sementes mantidas em
contato apenas com meio BDA, mantidas nas mesmas condições das demais
inoculações. Após 24h, as sementes colonizadas foram retiradas das placas e
semeadas em bandejas plásticas. O substrato utilizado foi do tipo Plantmax®,
esterilizado em autoclave e irrigado antes da semeadura. Cada bandeja constou
de uma repetição de 50 sementes, sendo utilizadas 4 bandejas por fungo. As
bandejas semeadas foram mantidas em estufa BOD a 25ºC, por 10 dias, até a
avaliação. A avaliação da patogenicidade foi realizada contando-se o número de
sementes germinadas (emersão da folha bandeira com o dobro do tamanho da
semente) e não germinadas, com lesões nas folhas (manchas ou cloroses), no
colo e podridão de sementes. Os dados obtidos foram submetidos à análise de
variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
significância.
38
3.7 Extração de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida
Para extração de proteínas, os fungos foram inoculados em placas de
Petri contendo meio BDA, que foram mantidas em estufa BOD a 25 ºC por 10
dias. Após, o micélio foi raspado com o auxílio de uma espátula e macerado com
Nitrogênio líquido, até a obtenção de um pó fino. Amostras de 10 mg de micélio
triturado foram depositadas em tubos do tipo Eppendorf, aos quais foram
adicionados 0,2 mL de tampão de extração (SDS1%, 9M Uréia, 25mM Tris-HCl pH
6,8, 1mM EDTA, 0,7M β-mercaptoetanol). Os tubos foram homogeneizados,
fervidos em banho de água por 2 minutos, homogeneizados novamente e fervidos
por um mais um minuto. Os tubos foram, então, centrifugados a 20000g por 20
minutos e o sobrenadante foi coletado. Foram utilizados 30μl de extrato protéico
acrescido de 10μl de tampão de amostra (Tris-HCl 0,06 M pH 6,8, glicerol 20%,
SDS 2%, β-mercaptoetanol 2% e azul de bromofenol 0,005%). As corridas foram
realizadas em gel e poliacrilamida SDS-PAGE a 4% (gel concentrador) e 15% (gel
separador). O sistema tampão gel-eletrodo utilizado foi o Tris-Glicina pH 8,9. As
corridas eletroforéticas foram efetuadas a 150 V por 3 horas. Após a eletroforese,
os géis foram fixados em solução fixadora por 2 horas, corados em solução
aquosa de Comassie Blue a 1% por 4 horas, descorados em solução descorante
por 2 horas, secos e fotoarquivados.
39
EXPERIMENTO 2
3.8 Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre isolados de
Bipolaris sorokiniana
Para a avaliação da incompatibilidade vegetativa, pareamentos entre as
colônias de diferentes isolados foram realizados, conforme os agrupamentos
obtidos por Nascimento et al., (2007) para as regiões ITS1 e ITS2 do DNA
ribossomal destes isolados, buscando-se desta forma trabalhar com a menor
variabilidade possível. Para tanto, discos de micélio com aproximadamente 0,5 cm
de diâmetro foram retirados de colônias jovens e repicados para placas de Petri
contendo meio BDA, sendo combinados dois a dois, a uma distância de 5cm um
do outro. Os experimentos foram realizados utilizando-se 3 placas para cada
combinação. Para acompanhamento da anastomose das hifas, as placas foram
mantidas em estufa do tipo BOD, com temperatura de 25ºC, por 40 dias. As
análises de ocorrência de incompatibilidade vegetativa foram realizadas aos 20 e
40 dias, por avaliações visuais das regiões de encontro. As avaliações foram
realizadas de acordo com o comportamento na área de encontro das hifas em
cada combinação. Estas foram classificadas em três grupos, conforme a
classificação estabelecida por Roca et al. (2004). No primeiro grupo, foram
considerados os isolados que tiveram seu crescimento inibido pela presença das
hifas de outro isolado, não ocorrendo portanto o encontro de hifas, sendo
considerados incompatíveis vegetativamente. O segundo grupo caracterizou-se
por isolados que cresceram normalmente, sem nenhuma inibição pela presença
40
de hifas de outro isolado, sendo denominados compatíveis vegetativamente. Já no
terceiro grupo, foram incluídos os isolados que apresentaram comportamento
intermediário, ou seja, apresentaram um crescimento que foi afetado pela
presença de outro isolado, porém não completamente inibido.
3.9 Influência de diferentes meios de cultivo na manifestação da
incompatibilidade
Para verificação da influência do meio de cultivo sobre a
incompatibilidade vegetativa dos isolados, foram escolhidos 5 isolados,
pertencentes a diferentes grupos das regiões ITS, buscando-se selecionar os
isolados mais distantes geneticamente. Neste teste, foram utilizados cinco
diferentes meios de cultivo: BDA, Saboraud dextrose, ágar Czapek, ágar extrato
de malte e ágar-água. Os isolados foram pareados da mesma forma como citado
acima, utilizando-se todos os pareamentos possíveis para estes cinco isolados. As
análises de incompatibilidade foram realizadas da mesma maneira descrita
anteriormente.
3.10 Extração de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida
Buscando estudar a incompatibilidade vegetativa à nivel molecular,
foram escolhidos 4 agrupamentos testados no teste de incompatibilidade
vegetativa, sendo três caracterizados como incompatíveis e um compatível.
Destes, foram extraídas proteínas dos isolados crescendo isoladamente e
crescendo na presença do outro isolado. As extrações e corridas se deram da
41
mesma maneira citada anteriormente. Após as corridas, o gel foi fixado com
solução fixadora por 1 hora e lavado com etanol 50% por 1 hora. Ao gel foi
acrescentado 0,02% de tiossulfato de sódio por 1 minuto, sendo após lavado com
água corrente por 1 minuto. Após, foram adicionados 100 mL de solução de
coloração fresca, sendo o gel mantido no escuro por 20 minutos. Novamente, o
gel foi lavado em água corrente por 1 minuto e a este foi acrescentada solução de
revelação até o surgimento das bandas. A reação foi interrompida com ácido
acético 1%.
42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
EXPERIMENTO 1
4.1 Grupos morfológicos e taxa de crescimento
Os 36 isolados estudados neste trabalho foram caracterizados em
relação às suas características morfologicas e crescimento micelial. A análise da
morfologia colonial foi realizada considerando-se as cores e texturas exibidas pelo
micélio, presença ou ausência de setores e tipo de crescimento, quando cultivado
em meio BDA. Os isolados analisados apresentaram grande variabilidade,
formando cinco grupos morfologicamente distintos (figura 1), sendo classificados
como: a) negros de crescimento afeltrado com setores brancos (grupo I), b)
negros de crescimento aveludado com ausência de setores (grupo II), c)
cinzentos de crescimento algodonoso com ausência de setores (grupo III), d)
brancos de crescimento algodonoso com ausência de setores (grupo VI) e e)
brancos de crescimento suprimido com ausência de setores (grupo V).
43
98004 98011 98012 19/92
BS6M1 BS18M2 98007 98025
CV13 CS110 98029 98043
98006 98040
Figura 1- Isolados representando os cinco agrupamentos morfológicos de B. sorokiniana. Grupo I –
Isolados 98004, 98011 e 98012. Grupo II – Isolados 19/92, BS6M1, BS18M2. Grupo III – Isolados
98007, 98025 e CV13. Grupo IV – Isolados CS110, 98029 e 98043. Grupo V – Isolados 98006 e
98040
44
Os grupos I e III foram predominantes, com 38,88% e 36,11% dos
isolados, respectivamente. Os menos freqüentes foram os grupos VI, II e V, com
11,11%, 8,33% e 5,55% dos isolados, respectivamente (tabela 2).
Tabela 2 – Distribuição dos grupos morfológicos formados pelos trinta e seis isolados de B.
sorokiniana
Grupo Características Número de
Isolados
Porcentagem Código dos Isolados
I Negros de
crescimento
afeltrado com
setores brancos
14 38,88% 98004,98011, 98012,
98013, 98014,
98018,98021, 98022,
98023, 98026, 98030,
98033, 98041, 1965
II Negros de
crescimento
aveludado com
ausência de
setores
4 8,33% 19/92, BS6M1
*
,
BS18M2
*
III Cinzentos de
crescimento
algodonoso com
ausência de
setores
13 36,11% 98003, 98007, 98010,
98017, 98025, 98028,
98032, 98042,
BO2002, CV13
*
,
CS1004
*
, BS52M1
*
,
BS16M1
*
VI Brancos de
crescimento
algodonoso com
ausência de
setores
4 11,11% 98019, 98029, 98043,
CS1110
*
V Brancos de
crescimento
suprimido com
ausência de
setores
2 5,55% 98006, 98040
* Isolados oriundos de outros países ( Cedidos pelo CYMMIT)
45
A taxa de crescimento micelial foi avaliada em intervalos de vinte e
quatro horas, por um período de 5 dias, pela medição do diâmetro da colônia em
dois sentidos diametralmente opostos e realizado o cálculo da média por placa.
Sempre se mantiveram constantes durante o cultivo dos isolados as condições de
fotoperíodo, temperatura e pH. Nas figuras 2 a 6 encontram-se as curvas de
crescimento dos isolados, conforme o grupo morfológico a que pertencem,
considerando-se as médias das medidas das cinco repetições para cada isolado.
Diferenças nas velocidades de crescimento dos isolados puderam ser observadas
nas primeiras 24 horas após a inoculação.
As curvas de crescimento dos isolados do Grupo I mostraram-se
semelhantes quanto ao seu crescimento micelial, entrando em fase estacionária,
em sua maioria, no quinto dia de cultivo. Destes, o isolado 98033 foi o que
apresentou o maior crescimento, enquanto o menor crescimento foi o do isolado
98018 (figura 2). No grupo II, o isolado 19/92 apresentou uma taxa de crescimento
bastante superior aos demais isolados, ainda estando em fase logarítmica no
quinto dia de cultivo (figura 3). O Grupo III foi caracterizado por isolados de
crescimento bastante heterogêneo, apresentando grandes variações a partir do
terceiro dia de cultivo. Os isolados com maior crescimento no grupo e também
considerando todos os grupos, foram, respectivamente, BO2002, 98017 e 98003,
sendo que o menor crescimento foi apresentado pelo isolado 98028 (figura 4). No
Grupo IV, o isolado 98043 apresentou o maior crescimento, enquanto o menor
crescimento foi verificado para o isolado 98019 (figura 5). Os isolados do Grupo V
caracterizaram-se por escassa formação e crescimento micelial, apresentando
46
curvas de crescimento semelhantes (figura 6). O fato de estes isolados
apresentarem crescimento extremamente lento pode sugerir que provavelmente
estes apresentam outras habilidades que não são expressas in vitro, as quais
permitem a estes microrganismos competirem com outros fungos em igualdade
dentro do hospedeiro. Carrol (1995) ressalta que fungos de crescimento rápido
sempre serão predominantes. No entanto, pouco se sabe sobre o comportamento
competitivo das espécies dentro do hospedeiro e também na presença de outros
microrganismos.
Os testes estatísticos de análise de variância (ANOVA) e Tukey foram
realizados, a fim de verificar a existência de diferenças significativas entre os
grupos morfológicos. Diferenças significativas foram observadas entre os grupos
III e V, enquanto os demais grupos não diferiam entre si.
A variabilidade entre os isolados, verificada pela formação de grupos
morfológicos e diferentes taxas de crescimento, pode ser explicada pela
diversidade geográfica de origem e hospedeiros dos mesmos, características
fisiológicas, condições de cultivo, tempo de manutenção no laboratório e sucessão
de repiques. Rosa & Menezes (2001) relataram tal variabilidade, observando
diferenças no processo de crescimento, em função das condições de cultivo e das
características dos próprios isolados. Quando os isolados são analisados em
diferentes meios de cultivo ou até mesmo em um mesmo substrato, como relatado
neste estudo, observa-se uma grande variabilidade de comportamento em relação
ao crescimento micelial. Artigiani Filho & Bedendo (1996) relatam que o
comportamento dos isolados pode estar relacionado aos componentes de cada
47
meio de cultivo, mostrando variação no crescimento e na coloração da colônia,
entre outras características específicas.
Ao considerar a origem geográfica dos isolados, observa-se que o
crescimento micelial foi também variável, mesmo entre aqueles provenientes de
uma mesma região. Uma possível explicação para tais observações pode estar no
fato de que alguns isolados, embora provenientes de um mesmo estado, foram
obtidos a partir de plantas produzidas em localidades com características
edafoclimáticas distintas nas regiões geográficas amostradas ou em lavouras com
manejos diferentes. Assim, pode-se afirmar que a taxa de crescimento micelial
não foi suficiente para estabelecer qualquer correlação entre essa variável e a
origem geográfica dos isolados, sugerindo que outros fatores poderiam estar
relacionados com a variabilidade.
Valim-Labres et al. (1997) apontam que a diversidade de
microrganismos não é ocasionada unicamente por pressões do ambiente
decorrentes de diferenças geográficas, como temperatura, umidade relativa do ar
e fotoperíodo. Da mesma forma, Nascimento & Van Der Sand (2007), estudando a
variabilidade de isolados de B. sorokiniana pelas regiões ITS do DNA ribossomal,
não observaram correlação
entre grupos de similaridade genética e origem
geográfica de isolados de B. sorokiniana, inferindo que dificilmente a expressão
dos aspectos morfofisiológicos seria condicionada por genes únicos. Assim, esta
variabilidade poderia ser atribuída às interações entre informação genética e
condições ambientais.
48
0
1
2
3
4
5
012345
Tempo de cultivo (dias)
Crescimento micelial (cm)
98004 98011 98012 98013 98014
98018 98021 98022 98023 98026
98030 98033 98041 1965
Figura 2 - Curva de crescimento dos isolados do Grupo I quando cultivados em meio de cultura
BDA, à temperatura de 25°C, durante 5 dias.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
012345
Tempo de cultivo (dias)
Crescimento micelial (cm)
19/92 BS6M1 BS18M2
Figura 3 – Curva de crescimento dos isolados do Grupo II quando cultivados em meio de cultura
BDA, à temperatura de 25°C, durante 5 dias.
49
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
012345
Tempo de cultivo (dias)
Crescimento micelial (cm)
98003 98007 98010 98017
98028 98032 98042 Bo2002
CS1004 BS52M1 BS16M1
Figura 4 – Curva de crescimento dos isolados do Grupo III quando cultivados em meio de cultura
BDA, à temperatura de 25°C, durante 5 dias.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
012345
Tempo de cultivo (dias)
Crescimento micelial (cm)
98019 98029 98043 CS1110
Figura 5 – Curva de crescimento dos isolados do Grupo IV quando cultivados em meio de cultura
BDA, à temperatura de 25°C, durante 5 dias.
50
0
1
2
3
012345
Tempo de cultivo (dias)
Crescimento micelial (cm)
98006 98040
Figura 6 – Curva de crescimento dos isolados do Grupo V quando cultivados em meio de cultura
BDA, à temperatura de 25°C, durante 5 dias.
4.2 Atividade enzimática
Os isolados de B. sorokiniana foram avaliados quanto à capacidade de
produzirem enzimas extracelulares, sendo a produção avaliada através de halos
de degradação presentes em meios sólidos específicos (figura 7). A atividade
enzimática tem sido bastante utilizada no estudo da variabilidade fisiológica em
fungos fitopatogênicos. A maior ou menor capacidade dos fungos em produzirem
enzimas em substratos específicos permite diferenciar isolados de uma mesma
espécie de forma simples. Além disso, conforme Hancock & Millar (1965), a
atividade patogênica de alguns fungos está diretamente relacionada com sua
capacidade de produzir enzimas degradadoras de parede celular.
51
Figura 7 - Halos produzidos pela hidrólise de substratos pelas enzimas. a) amilases; b) celulases;
c) proteases; d) pectinases; e)esterases; f) lipases
Em relação à atividade amilolítica, o isolado BS18M2 apresentou o
maior índice de atividade enzimática (Fig. 8), expresso pela relação halo/colônia
de degradação de amido que neste isolado foi de 1,35, enquanto a menor
detecção se deu para o isolado CS1110 (H/C = 0,42).
Fungos podem utilizar o amido como fonte de energia para o
crescimento e esporulação (Griffin, 1994). Segundo Nwufo & Fajola (1988), a
produção de amilases por fungos filamentosos varia de acordo com o gênero e a
espécie envolvida.
bc
d
e
f
a bc
d
e
f
bc
d
e
f
a
52
De acordo com Dianese (1990), as amilases são comuns em fungos,
causando a hidrólise de amido, mas pouco se sabe sobre a sua importância na
patogênese. Estudos realizados por Almeida et al. (1998), com variedades de
cacau, demonstraram que a quantidade de amido existentes nestas plantas
poderia estar associada com o seu grau de tolerância ao fungo Crinipellis
perniciosa, causador da vassoura-de-bruxa. Produtos da hidrólise do amido
poderiam aumentar o potencial osmótico das células, impedindo o crescimento
das hifas ou serem usadas em rotas bioquímicas para defesa da planta.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
CS1110
98032
BS52M1
19/92
98022
98028
BS6M1
98042
1965
CS1004
98021
98041
98007
98026
98013
98018
98043
98029
98030
98033
98025
98014
98011
98012
98010
98023
98006
CV13
98004
BO2002
98003
BS16M1
98019
98017
98040
BS18M2
ISOLADOS
RELAÇÃO H/C
Figura 8 – Relação halo/colônia (H/C) dos isolados de B. sorokiniana para atividade de amilases
53
Na figura 9 encontram-se as relações halo/colônia para a atividade de
carboximetilcelulases. O isolado 98029 foi o maior produtor desta enzima
(H/C=1,36), sendo a menor capacidade encontrada para o isolado 19/92
(H/C=0,83). Pascholati (1995) estudou a produção de celulases em isolados de
Fusarium oxysporum e comprovou a produção in vivo e in vitro destas enzimas.
Celulases também já foram citadas em Sclerotinia sp., Rhizoctonia solani Kühn,
Penicillium spp. e Pythium ultimum Trow (Piero & Pascholati, 2000). Sugere-se
que estas enzimas desempenhem importante papel na patogenicidade, já que a
celulose é o principal constituinte da parede celular vegetal
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
19/92
98028
CS1110
98003
CS1004
98017
BO2002
98041
98019
1965
BS16M1
BS6M1
98007
98021
CV13
98043
98026
98032
98025
98033
98042
98040
98030
98004
98023
98010
98013
98014
BS18M2
BS52M1
98011
98006
98022
98018
98012
98029
ISOLADOS
RELAÇÃO H/C
Figura 9 - Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para atividade de
carboximetilcelulases
54
A enzima protease tornou-se evidente durante a degradação do meio
específico, sobre o qual vinte e sete isolados testados mostraram atividade desta
enzima (Fig. 10), destacando-se o isolado CS110 (H/C= 1,04) que apresentou o
maior halo de degradação. Os isolados 98003, 98006, 98011, 98014, 98025,
98028, 98032, 98033 e 98042 não foram capazes de produzir esta enzima.
Possivelmente, um maior período fosse necessário para que estes isolados
expressassem a produção de proteases. Couto (2002) verificou que isolados de
Curvullaria. musae obtidos de banana demonstraram maior atividade proteolítica
que amilolítica, celulolítica e lipolítica, sugerindo que esta enzima poderia estar
correlacionada a patogenicidade neste organismo.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
98003
98006
98011
98014
98025
98028
98032
98033
98042
98017
98040
98026
98022
19/92
CS1004
98023
98043
BO2002
98018
98010
CV13
98029
98004
98041
1965
98021
BS52M1
98019
98012
BS16M1
98007
BS6M1
BS18M2
98030
98013
CS1110
ISOLADOS
RELAÇÃO H/C
Figura 10 - Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para atividade de proteases
55
Vinte e dois isolados foram capazes de produzir pectinases (Fig.11).
Destes, o isolado 98025 foi o maior produtor (H/C= 1,36), seguido do isolado
98040 (H/C=1,21). As enzimas pectinolíticas estão entre as mais estudadas
quanto ao papel na patogenicidade. Uma das razões para tal interesse deve-se ao
tratamento de tecidos vegetais com pectinases purificadas, o que ocasiona na
separação e morte das células. Este processo ocorre durante o desenvolvimento
de muitas doenças, principalmente nas podridões moles, onde os tecidos perdem
a rigidez. No entanto, Pascholati (1995) ressalta que a produção de pectinases
por microrganismos não se constitui em prova definitiva da importância das
mesmas no processo de patogenicidade. A indução poderia estar mais ligada à
obtenção de nutrientes do que a patogenicidade.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
CS1004
BS18M2
BS52M1
98010
1965
98014
98017
98026
98028
98030
98032
98041
98042
19/92
98006
BS6M1
BO2002
98003
CS1110
CV13
98033
98013
98043
98018
98019
BS16M1
98007
98022
98004
98023
98011
98012
98021
98029
98040
98025
ISOLADOS
RELAÇÃO H/C
Figura 11 - Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para atividade de pectinases
56
A enzima esterase apresentou os mais altos índices de H/C, que foram
de 2,95 para o isolado 98017. Segundo Lealem & Gashe (1994), são
recomendados valores de índice de atividade enzimática maior ou igual a 2 para
comprovar a habilidade de um microrganismo em degradar substratos em meio
sólido. Considerando este valor, apenas no teste de esterase foram encontrados
tais índices, para os isolados 98017, CS1110 e 98011. De acordo com Gillespie &
Langley (1974) a esterase se encontra em um grupo de enzimas que utilizam
substratos múltiplos, freqüentemente de origem externa, e que respondem
diretamente à diversidade ambiental.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
98041
BO2002
19/92
CV13
98042
98032
98007
98003
98025
CS1004
1965
98028
98022
98030
BS6M1
98004
98033
98014
BS52M1
98026
98018
98012
98019
98029
98010
98021
98040
98013
BS16M1
98043
98023
BS18M2
98006
98011
CS1110
98017
Isolados
RELAÇÃO H/C
Figura 12 - Relação halo/colônia dos isolados de B. sorokiniana para atividade de esterases
57
McKeen (1974), trabalhando com o fungo Botrytis cinerea Pers e
Nicholson et al. (1972), em estudos com o fungo Venturia inaequalis (Cke.) Wint.
demonstraram, através de estudos histoquímicos, a presença de atividade
esterásica próximo ao sítio de penetração das células hospedeiras. Já Pascholati
et al. (1992), analisando a ultraestrutura da interação patógeno/hospedeiro,
relacionaram a presença de esterase junto aos esporos de Erysiphe graminis D.C.
f.sp. hordei Marchal, durante a penetração destes nas células hospedeiras
A enzima lipase foi detectada pela presença de fluorescência
alaranjada sobre as colônias, sendo classificada como positiva ou negativa e,
portanto, não quantificada. Esta foi positiva apenas para os isolados BS6M1,
CS1110, 98006, 98007, 98019, 98029, 98032 e 98040. Segundo Kolattukudy
(1985), existem evidências de que a cutinase, uma lipase capaz de degradar a
cutina, esteja diretamente envolvida na penetração do fungo pela cutícula,
desempenhando papel importante na patogenicidade.
Considerando os resultados para todas as enzimas testadas, apenas as
enzimas amilases e celulases foram produzidas por todos os isolados. O teste
para lipases foi o que apresentou a menor porcentagem de isolados com resultado
positivo, cerca de 22% (Fig.13). As médias da relação H/C de todos os isolados
para cada teste variaram de 0,89 em proteases a 1,34 em esterases (Fig.14),
considerando apenas os isolados com resultado positivo e excluindo lipases, que
não foram quantificadas. As médias da relação H/C de cada isolado em todos os
testes variaram de 0,91 a 1,5 (Figura 15).
58
0
20
40
60
80
100
LIPASES PECTINASES PROTEASES ESTERASES CELULASES AMILASES
% DE ISOLADOS
Figura 13 - Porcentagem de isolados com produção em cada teste.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
PROTEASES AMILASES PECTINASES CELULASES ESTERASES
RELAÇÃO H/C
Figura 14 - Médias da relação H/C de todos os isolados para cada teste
59
As médias da relação H/C de cada isolado em todos os testes variaram
de 0,91 a 1,5 (Figura 15). Considerando-se estas médias, o isolado 98017 foi o
que apresentou a maior atividade enzimática.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
19/92
98041
BO2002
BS6M1
CS1004
98032
1965
98026
98007
98028
CV13
98022
BS52M1
98042
98043
98018
98003
98021
98033
98030
98004
98010
98013
BS16M1
98019
98023
98012
98014
98040
98029
CS1110
98025
98006
BS18M2
98011
98017
ISOLADOS
RELAÇÃO H/C
Figura 15 - Médias da relação H/C de cada isolado em todos os testes
Comparando-se os isolados entre si, verificou-se grande variabilidade
quanto à produção enzimática. Muitos isolados apresentaram boas atividades para
determinadas enzimas, porém baixas atividades em outras. Como exemplo cabe
citar o isolado 98017, que obteve, quando comparado aos demais isolados, altos
índices de atividade de esterases e amilases, porém não apresentando atividade
de pectinases e lípases. Da mesma forma, o isolado CS110 esteve entre os
maiores produtores de proteases e esterases, mas não foi capaz de produzir
60
amilases. Quanto aos diferentes agrupamentos morfológicos, não foi possível
correlacionar a atividade enzimática com o grupo morfológico, encontrando-se
diferenças entre os isolados independentemente da coloração e taxa de
crescimento.
Para testar se a diferença observada nas atividades enzimáticas de
cada teste realizado teria significância estatística, foi realizado o teste de análise
de variância (ANOVA), pelo qual foram constatadas que as diferenças observadas
eram significativas. Para identificar quais médias que, quando tomadas duas a
duas, diferiam entre si, foi feito o pós-teste de Tukey. Para um nível de
significância de 0,05, foi observado que a média da produção de esterases diferia
significativamente de todas as outras, enquanto que as outras não diferiam entre
si. Pode-se afirmar, portanto, que os isolados analisados apresentam uma
atividade enzimática maior para esterases do que para as outras enzimas
testadas. Isto poderia ser explicado pela extrema importância de tais enzimas na
fase inicial do processo de aderência e invasão do tecido vegetal por fungos
fitopatógenos. Além disso, como muitas delas são ativas sobre uma gama de
substratos, supõe-se que elas facilitem o acesso de organismos às fontes de
carbono, participando de seu catabolismo (Jaeger & Reetz, 1998).
As médias da relação H/C de cada isolado em todos os testes variaram
de 0,91 a 1,5 (Figura 15). Desta vez, o teste ANOVA foi realizado a fim de verificar
se as diferenças observadas nas atividades enzimáticas de cada isolado testado
teriam significância estatística. O valor calculado de F foi de 0,710, enquanto que
61
o valor tabelado de F para um nível de significância de 0,01 era de 1,807,
aceitando-se, assim, a hipótese nula.
4.3 Virulência dos isolados a sementes e plântulas de trigo
Os isolados foram avaliados quanto à capacidade de produzir sintomas
das moléstias causadas por B. sorokiniana em trigo. Na tabela 3 encontram-se os
resultados da ação dos 35 isolados do fungo sobre sementes e plântulas de trigo.
De acordo com o isolado inoculado, foram observadas distintas ações sobre a
porcentagem de emergência de plântulas totais, de plântulas sem sintomas e de
plântulas com sintomas. Também se encontram as porcentagens de sementes
germinadas e não germinadas que apresentaram sintomas, bem como as
porcentagens de sintomas na parte aérea e colo. Ressalta-se, entretanto, que as
condições deste teste são hipotéticas, onde todas as sementes foram infectadas
ou infestadas pelos fungos, o que não ocorre na natureza.
Os sintomas foram classificados como mancha foliar ou clorose na
parte área, mancha no colo e podridão de semente. Na parte aérea, os sintomas
foram caracterizados pela formação de pequenos pontos que evoluíram para
lesões ovaladas de coloração marrom-escuro e halo amarelado, com intensa
esporulação no local (figura 16-d) ou por clorose em algumas regiões da folha. No
colo, as lesões foram bastante semelhantes às encontradas nas folhas,
espalhando-se por toda a extensão do mesmo (figura 16-e) e sendo este o
sintoma mais freqüente. Já as sementes foram caracterizadas por intensa
62
esporulação na ponta dos grãos (figura 16-a), que em casos mais graves se
estenderam por toda a semente, apodrecendo-a (figura 16-c). Em alguns casos foi
observado crescimento micelial na semente (figura 16-b). Os isolados negros
(Grupos I e II) tiveram sua infecção caracterizada por intensa esporulação na
semente, enquanto os cinzentos e brancos (Grupos III, VI e V), ao contrário,
caracterizaram-se por pouca esporulação e intenso crescimento micelial. É
importante salientar que a variável mais importante para a patogenicidade é a
porcentagem de emergência, pois esta não pode ser modificada. Os sintomas, ao
contrário, podem ser recuperados e, portanto, não afetar a formação de plantas
vigorosas.
Figura 16 – Sintomas apresentados por sementes e plântulas. a) Semente com ponta preta, b)
sementes com esporulação e crescimento micelial, c) semente apodrecida com intensa
esporulação, d) mancha marrom na parte aérea, e) mancha no colo
a
b
c
d
e
63
As raízes, em sua maioria, mostraram pouca ou nenhuma infecção
(dados não apresentados). Essa ausência de sintomas infere que a maior fonte de
contaminação das raízes pode não ser oriunda de sementes infectadas e sim de
solos contaminados. Segundo Reis (1982), o inoculo da podridão comum de
raízes provem principalmente de conídios presentes no solo.
Com base nos resultados obtidos, foram observadas diferenças quanto
à virulência entre os isolados. Os isolados considerados de mais alta virulência
foram 98003 e 98010, ambos do grupo III, que resultaram em apenas 2% de
emergência, das quais 100% das plântulas apresentaram sintomas típicos de
infecção. Seguidos a estes vieram os isolados 98030 e 98012, pertencentes ao
grupo I, com 4% e 5% de germinação. Estes dados não se relacionaram aos
encontrados para a atividade enzimática, já que os isolados que apresentaram
mais alta virulência não foram os melhores produtores de nenhuma das enzimas
analisadas. Isolados como 98017 e CS1110, ao contrário, mostraram boa
produção enzimática e baixos níveis de infecção, se comparados aos demais. Os
isolados menos virulentos foram CS1110 e 98006, que apresentaram,
respectivamente, 86% e 80% de emergência, das quais todas as plântulas não
apresentaram sintomas. Estes isolados apresentavam micélio branco e não
produziram estruturas reprodutivas em meio de cultura. A ausência de melaninas
poderia ser um fator importante na baixa patogenicidade destes isolados, já que
esses pigmentos, embora não estejam diretamente relacionados à
patogenicidade, são importantes na proteção dos organismos no meio ambiente.
64
Além disso, é relatada em alguns fungos fitopatogênicos a necessidade de
apressórios melanizados para a invasão do hospedeiro (Henson et al., 1999).
Segundo Bettiol & Ghini (2002), estes isolados de baixa virulência
seriam importantes, uma vez que de acordo com estes autores linhagens
avirulentas ou hipovirulentas poderiam ser utilizadas na indução da resistência
sistêmica, pois podem colonizar a planta sem causar doenças, sendo
reconhecidos pela planta, que ativaria o seu sistema de defesa, impedindo o
estabelecimento de patógenos. Também poderia haver competição com o
patógeno pelo nicho ecológico, diminuindo a chance da linhagem patogênica
colonizar o hospedeiro. Isto já vem sendo utilizado em alguns vegetais, como o
tomateiro, onde o patógeno Fusarium oxisporum é controlado por linhagens
avirulentas que colonizam endofiticamente o hospedeiro, impedindo a entrada de
linhagens virulentas (Esposito & Azevedo, 1998).
Os isolados de coloração cinza e crescimento algodonoso (grupo III) e
os de coloração negra com setores (grupo I) mostraram-se os mais patogênicos.
Oliveira et al. (1998) desenvolveram um estudo da variabilidade patogênica e
morfológica de B. sorokiniana, encontrando diferenças quanto a patogenicidade,
porém esta não pôde ser correlacionada às características morfológicas. Jaiswall
et al. (2007) obtiveram resultados semelhantes ao presente estudo, encontrando
correlação entre a patogenicidade e a morfologia colonial, no qual os isolados de
coloração negra também mostraram-se mais patogênicos. Da mesma forma,
Pandey et al. (2007) estudaram a variabilidade clonal de isolados de B.
65
sorokiniana, onde também foi possível relacionar a variabilidade morfológica com
a patogenicidade.
Os resultados sugerem que o local de origem pode ser um fator
importante na variação da virulência entre os isolados do fungo, visto que os
isolados mais virulentos foram obtidos de variedades do Rio Grande do Sul,
enquanto os isolados provenientes de outros países mostraram-se menos
virulentos. Cabe ainda ressaltar que as sementes de trigo utilizadas para o teste
da virulência pertenciam ao cultivar BRS Buriti, própria para o plantio de trigo no
Rio Grande do Sul. As exceções para tais observações foram os isolados 98006 e
98040 que, embora provenientes do Rio Grande do Sul, apresentaram os menores
níveis de virulência.
Assim, as avaliações indicam que há variação quanto à virulência de
isolados de diferentes hospedeiros, de diferentes regiões geográficas e até
mesmo da mesma cultura. Tais observações podem ser explicadas por fatores
externos, como as diferenças edafoclimáticas das regiões de onde os isolados
procederam, ou internos, em que um isolado dentro da mesma espécie difere de
outro devido à sua composição genética. Lilly & Barnett (1951) afirmam que entre
fungos a diversidade é uma norma, enquanto a uniformidade é uma exceção em
relação ao comportamento entre espécies e isolados. O fato do isolado de um
determinado hospedeiro mostrar-se pouco agressivo para o mesmo hospedeiro
pode ser explicado pela variação da cultivar, do local de origem do isolado em
relação a do hospedeiro testado e da variabilidade genética entre isolados obtidos
do mesmo hospedeiro.
66
Arabi & Jawhar (2004) estudaram diferenças na virulência de isolados
de Cochliobolus sativus, encontrando três diferentes patótipos, sendo um deles
extremamente virulento. Os autores atribuíram tais diferenças às interações
genotípicas e aos diferentes genes de virulência operando nos patossistemas.
Farias et al. (2005) realizaram uma avaliação dos fungos causadores de
helmintosporiose em aveia. Dentre seis espécies, B. sorokiniana foi o mais
agressivo, tanto na redução da germinação como na morte de plâtulas inoculadas.
Independente de B. sorokiniana ser um fungo de reprodução predominantemente
assexuada, haplóide e heterocariótico, a variabilidade observada na virulência dos
isolados estudados sugere que ocorre uma extensiva troca genética nesta
espécie. Isto pode ser justificado por este fungo possuir vários núcleos, tanto no
micélio quanto nos conídios.
Desta forma, características diferenciadas poderiam ser expressas
dependendo da informação genética contida nos núcleos presentes em cada
célula heterocariótica do patógeno, interagindo com um determinado genótipo do
hospedeiro. Além disso, a variação pode ser gerada quando a troca de núcleos é
seguida pela fusão nuclear, recombinação somática e conseqüente rearranjo dos
cromossomos pela haploidização.
67
Tabela 3 - Virulência de isolados de B. sorokiniana em sementes e plântulas de trigo.
PLÂNTULAS (%) SEMENTE FOLHA
ISOLADO
EMERGÊNCIA
(%)
COM
SINTOMAS
SEM
SINTOMAS
NÃO
GERMINADA
GERMINADA
MANCHA
MARROM
CLOROSE
COLO
98003
2 100 0 100 100 100 0 100
98004
66 61 39 100 58 6 0 61
98006
80 0 100 100 0 0 0 0
98007
10 90 10 100 100 90 0 100
98010
2 100 0 100 100 100 0 100
98011
50 72 28 100 72 20 16 11
98012
5 80 20 100 80 80 40 80
98013
74 78 22 100 57 0 0 62
98014
25 72 28 100 72 24 8 12
98017
48 63 37 100 63 0 2 4
98018
56 100 0 100 100 16 0 64
98019
68 21 79 100 15 0 1 0
98021
42 90 10 100 90 38 0 86
98022
34 71 29 100 71 24 6 47
98023
11 64 36 100 64 36 27 45
98025
44 95 5 100 95 41 9 77
98026
74 51 49 100 38 5 5 41
98028
56 100 0 100 79 16 11 79
98029
26 100 0 100 62 38 19 92
98030
4 75 25 100 100 100 0 100
98032
54 100 0 100 89 17 13 59
98033
20 70 30 96 70 10 0 25
98040
68 56 44 100 35 0 0 38
98041
10 90 10 98 90 10 0 90
98042
40 100 0 100 90 33 25 85
98043
34 100 0 100 38 29 24 88
19/92
72 22 78 100 40 0 0 22
CV13
44 100 0 100 100 18 2 86
BS6M1
68 68 32 100 68 0 0 0
CS1004
70 83 17 100 77 3 0 54
1965
76 61 39 100 61 5 0 42
BS18M2
40 95 5 100 100 55 25 95
BS52M1
50 92 8 100 76 16 0 56
CS1110
86 0 100 100 0 0 0 0
BS16M1
46 90 10 100 90 26 4 61
controle
99 0 100 0 0 0 0 0
68
O teste de análise variância (ANOVA) foi realizado com o objetivo de
verificar se os diferentes grupos diferiam estatisticamente quanto aos efeitos na
germinação e na porcentagem de plântulas com sintomas e sem sintomas. Os
resultados mostraram que a diferença observada na emergência não era
significativa, enquanto que em plântulas com e sem sintomas, houve diferença
estatística. Para estes dados, foi realizado o pós-teste de Tuckey, onde os grupos
3 e 5 diferiram tanto pelo efeito em plântulas com sintomas, como para plântulas
sem sintomas.
4.4 Extração de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida
Os géis de poliacrilamida SDS-PAGE foram analisados com base no
número, tamanho e intensidade da coloração das bandas de proteínas no gel,
sendo selecionadas apenas as bandas de intensidades fortes e reprodutíveis.
Os padrões de bandas relativos aos diferentes isolados de B.
sorokiniana e ao isolado de B. oryzae mostraram variação quanto ao número e
intensidade das bandas (Figura 17). Diferenças foram encontradas entre isolados
pertencentes ao mesmo grupo morfológico e também de mesma região
geográfica. Os perfis proteicos dos isolados provenientes de outros países foram
bastante distintos, com exceção dos isolados 1965 e CS110, provenientes,
respectivamente, da Dinamarca e Bangladesh, que apresentaram perfis bastante
semelhantes (figura 17-c).
69
Entre os isolados, foram verificadas bandas em comum, mostrando
uma relação intraespecífica. Duas bandas entre 43 e 41Kda ou quatro bandas
entre 43 e 35 KDa foram comuns a grande parte dos isolados brasileiros de B.
sorokiniana, além de duas bandas entre 19 e 17 KDa (figura 17-a e 17-b),
podendo ser uma característica dessa espécie.
O isolado 98006 apresentou crescimento lento nas condições de cultivo
de 10 dias utilizadas neste estudo. Para solucionar este problema, a mesma
proporção de micélio em tampão de extração foi mantida. Entretanto, a pouca
disponibilidade de massa micelial dificultou os procedimentos de extração de
proteínas totais deste isolado. O isolado de BO2002 de B. oryzae se distinguiu dos
demais por apresentar uma banda de cerca de 32 kDa de intensidade forte, a qual
não foi observada em nenhum dos isolados de B. sorokiniana.
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14
Fig. 17-a Perfis protéicos dos isolados de B. sorokiniana oriundos do Brasil. (M) marcador de peso
molecular, (1) 98003, (2)98004, (3) 98006, (4)98007, (5)98010, (6)98011, (7)98012, (M)marcador
de peso molecular, (8)98013, (9)98014, (10)98017, (11)98018, (12)98019, (13)98021, (14)98022
66,2 Kda -------
37,6 Kda---------
28,5 Kda---------
70
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15
Fig. 17-b Perfis protéicos dos isolados de B. sorokiniana e do isolado de B. orizae, ambos oriundos
do Brasil (M) marcador de peso molecular, (1)98023, (2)98025, (3)98026, (4)98028, (5)98029,
(6)98030, (7)98032, (M)marcador de peso molecular, (8)98033, (9)98040, (10)98041, (11)98042,
(12)98043, (13)19/92, (14)CV13, (15)BO2002
M 1 2 3 4 5 6 7
Fig. 17-c Perfis protéicos dos isolados de B. sorokiniana oriundos de outros países (M) marcador
de peso molecular, (1)BS6M1, (2)BS16M1 (3)BS18M2, (4)BS52M1, (5)CS1004, (6)1965, (7)CS110
66,2 Kda -----
66,2 Kda --------
37,6 Kda-------
37,6 Kda---------
28,5 Kda-----
28,5 Kda-------
71
4.5 Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre isolados de
Bipolaris sorokiniana
O teste de incompatibilidade vegetativa foi realizado em meio BDA
utilizando-se os cruzamentos entre isolados de B. sorokiniana conforme os
agrupamentos obtidos por Nascimento e Van Der Sand (2007), baseados na
similaridade genética utilizando PCR-RFLP das regiões ITS1 e ITS2 do DNA
ribossomal, procurando, com isso, minimizar a variabilidade entre os isolados.
Foram realizados trinta e um cruzamentos entre os isolados, sendo as
avaliações realizadas pela observação da região de encontro das hifas. Foram
observados três diferentes comportamentos na região de encontro das hifas, o
que permitiu classificar os cruzamentos em incompatíveis, compatíveis ou
parcialmente compatíveis (figura 18). Dos 31 cruzamentos realizados, 18 foram
classificados como totalmente incompatíveis, 4 como compatíveis e 9 como
parcialmente compatíveis, como observado na Tabela 4.
Fig. 18 - Avaliação da incompatibilidade vegetativa entre isolados A – Cruzamento incompatível
entre os isolados BS52M1 e BS18M2, B- Cruzamento incompatível entre os isolados 98006 e
98019, C- Cruzamento parcialmente compatível entre os isolados CS1004 e 1965, D- Cruzamento
compatível entre os isolados 98043 e BO2002.
a
b
c
d
72
Tabela 4 - Resultados dos testes de incompatibilidade dos isolados de B. sorokiniana com os
cruzamentos realizados conforme os agrupamentos de similaridade das regiões ITS do DNA
ribossomal baseados em PCR-RFLP
Isolados cruzados Resultado
98003 - 98004 Incompatível
98003 - 98014 Incompatível
98004 - 98014 Incompatível
98007 - 98017 Parcialmente Compatível
98007 - 98026 Incompatível
98017 - 98026 Parcialmente Compatível
98006 - 98018 Compatível
98006 - 98019 Compatível
98018 - 98019 Incompatível
98011 - 98025 Incompatível
98040 - 19/92 Compatível
98043 - BO Compatível
98029 - CV13 Incompatível
BS6M1 - CS1004 Incompatível
BS6M1 - 1965 Incompatível
CS1004 - 1965 Incompatível
98013 - 98042 Incompatível
98028 - 98032 Parcialmente Compatível
98028 - 98041 Incompatível
98032 - 98041 Incompatível
98010 - 98012 Parcialmente Compatível
98010 - 98023 Parcialmente Compatível
98010 - 98030 Parcialmente Compatível
98012 - 98023 Parcialmente Compatível
98012 - 98030 Incompatível
98023 - 98030 Parcialmente Compatível
98021 - 98022 Incompatível
BS18M2 - BS52M1 Incompatível
BS18M2 - CS1110 Incompatível
BS52M1 - CS1110 Parcialmente Compatível
98033 - BS16M1 Incompatível
73
Nos cruzamentos compatíveis foi possível observar a superposição das
colônias e o encontro das hifas. Na analise sob o estereomicroscópio, foi
visualizado a anastomoses de hifas. A fusão das hifas ocorria entre as hifas
principais e secundárias, sendo observada também entre hifas paralelas,
formando a estrutura do tipo H (Figuras 19-a e 19-c).
As anastomoses também ocorreram entre as extremidades de hifas e
entre a extremidade de uma hifa e a parede lateral de outra (Figura 19-b). Além
disso, também foram visualizadas fusões entre extremidades de hifas diferentes.
Nos casos de cruzamentos compatíveis, considera-se que exista uma similaridade
genética entre os isolados e uma provável origem geográfica comum, além haver
também semelhantes atributos biológicos, fisiológicos e patogênicos (Glass et al.,
2000).
Fig. 19 - Anastomoses de hifas entre isolados de B. sorokiniana. a) anastomose do tipo H, b)
anastomose entre extremidades hifais, c) anastomose do tipo H.
a b
c
74
Já os cruzamentos incompatíveis foram caracterizados por zonas de
aversão entre isolados, com a formação de halos entre os mesmos e sem
encontro de hifas, indicando possível dissimilaridade genética. Glass et al. (2000)
afirmam que um fungo filamentoso é limitado de formar um heterocário com outro
fungo de constituição genética similar. Neste trabalho, os isolados cruzados
apresentavam constituição genética semelhante, de acordo com os agrupamentos
testados e foram impossibilitados de formarem heterocário. Fato interessante é
que dentre diversas combinações realizadas entre isolados de B. sorokiniana, a
grande maioria foi incompatível, enquanto os isolados BO2002 (B. orizae) e
98043, sendo de diferentes espécies, mostraram-se compatíveis quando
cruzados, exibindo anastomoses. Os resultados encontrados neste estudo estão
de acordo com o trabalho realizado por Slippers et al. (2001), que analisaram a
incompatibilidade e ressaltam que reações antagônicas são comuns entre
organismos mais relacionados do que entre organismos geneticamente mais
distantes ou isolados geograficamente distantes.
Outra importante característica observada em cruzamentos entre
fungos filamentosos incompatíveis é a fusão imperfeita, caracterizada por
granulações citoplasmáticas das hifas fusionadas (Aimi et al., 2002). No presente
estudo, não foram observadas granulações no citoplasma das hifas que
apresentaram fusão celular.
Os resultados encontrados sobre a alta variabilidade e baixa ocorrência
de anastomoses de hifas neste fungo evidenciam a importância de futuros estudos
sobre a fase sexual deste microrganismo, já que a fusão de hifas é a fase que
75
precede a formação do heterocário, estrutura na qual ocorrem os processos de
recombinação sexual e parassexual, responsáveis pela variabilidade genética em
fungos filamentosos.
A fim de verificar geneticamente a incompatibilidade vegetativa foi
realizada uma caracterização molecular das proteínas totais dos fungos. Após a
eletroforese das proteínas totais em gel SDS-PAGE, as bandas foram analisadas
e os perfis das proteínas comparados entre os isolados crescidos separadamente
e na presença do outro isolado conforme grupo de similaridade de ITS 1 e 2
(Tabela 1). Foram selecionados 4 agrupamentos, sendo três formados por
cruzamentos caracterizados como incompatíveis (Grupo 16, composto pelos
isolados 98021 e 98022; grupo 13, composto pelos isolados 98013 e 98042 e
grupo 9, composto pelos isolados 98029 e CV13) e 1 por cruzamentos
classificados como compatíveis (grupo 8, formado pelos isolados 98043 e
BO2002).
Analisando-se os perfis protéicos dos isolados, não foram observados
polimorfismos das bandas dos isolados que cresceram isoladamente ou na
presença de outro isolado. Porém, foram observadas bandas mais intensas nos
isolados 98042 e 98013 quando cultivados na presença um do outro, sugerindo
que algumas proteínas poderiam ser expressas em níveis mais elevados durante
o co-cultivo dos isolados (figura 20)
76
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Fig. 20 - Perfis protéicos dos isolados crescidos isoladamente (I) e cultivados em co-cultivo com
outros isolados do mesmo grupo ITS (CC). (M) marcador de peso molecular, (1)98021 CC,
(2)98021 I, (3)98022 CC, (4)98022 I, (5)BO2002 CC, (6)BO2002 I, (7)98043 CC, (8)98043 I,
(9)98042 CC, (10)98042 I, (11)98013 CC, (12)98013 I, (13)Cv13 CC, (14) Cv53 I, (15)98029 CC,
(16)98029 I
4.6 Influência de diferentes meios de cultivo na manifestação da
incompatibilidade
A influência do meio de cultivo na reação de incompatibilidade foi
testada nos isolados 98003, 98010, 98033, BS52M1 e 19/92, provenientes de
diferentes agrupamentos das regiões ITS do DNA ribossomal. Para este ensaio,
os isolados foram confrontados em todas as combinações possíveis entre os
isolados, com cinco diferentes meios de cultivo: BDA, Saboraud dextrose, ágar
Czapek, ágar extrato de malte e agar-água. Como no teste anterior, as placas
foram avaliadas na região de encontro das hifas e classificadas nas três reações
discutidas anteriormente. Os resultados dos cruzamentos estão representados na
tabela 5.
66,2 Kda --------
37,6 Kda---------
28,5 Kda-----
77
Analisando-se os resultados, foram verificados diferentes
comportamentos entre os cruzamentos, conforme o meio de cultivo que foi
utilizado. Entre todas as combinações realizadas nos diferentes meios de cultivo,
nenhuma se apresentou totalmente compatível. Esse fato poderia ser explicado
pela variabilidade genética entre os isolados, que foram provenientes de diferentes
agrupamentos e, portanto, apresentavam uma grande distância genética entre si.
Tabela 5 - Cruzamentos de isolados de B. sorokiniana nos diferentes meios de
cultivo utilizados.
Isolados
Cruzados
Saboraud
dextrose
Extrato de
malte
Czapeck BDA Agar - água
98003 - 98010 PC PC PC I I
98003 - 98033 PC PC PC PC I
98003 - BS52M1 PC PC PC I I
98003 - 19/92 PC PC PC PC I
98010 - 98033 PC PC I I I
98010 - BS52M1 PC PC I I I
98010 - 19/92 PC PC PC I I
98033 - BS52M1 PC PC I I I
98033 - 19/92 PC PC PC PC I
BS52M1 - 19/92 PC PC PC I I
PC- Parcialmente compatível, I- Incompatível
Para entender a relação entre o meio de cultivo e a incompatibilidade, é
necessário conhecer as características nutricionais e fisiológicas dos isolados e as
características nutricionais dos substratos presentes nos meios de cultivo. O
equilíbrio de fontes de C, N, P, vitaminas e micronutrientes na composição do
78
meio de cultura são fatores importantes para o crescimento, esporulação e
manifestação ou não de determinadas características.
Os meios Saboraud dextrose e ágar extrato de malte apresentaram
cruzamentos parcialmente compatíveis para todos os cruzamentos realizados. Já
o meio ágar Czapek apresentou, entre os dez cruzamentos testados, três
incompatíveis. O meio BDA, ao contrário, apresentou sete cruzamentos
incompatíveis, enquanto todos os cruzamentos realizados no meio agar-água
foram incompatíveis. Os isolados podem responder de formas distintas a
diferentes meios de cultura, o que poderia justificar a resposta diferencial da
incompatibilidade nos isolados nos meios de cultivo utilizados. Essa hipótese é
seguida por Griffin (1994), que sugere que os diferentes nutrientes poderiam ser
metabolizados em vias diferentes, levando à síntese de macromoléculas
diferenciais, cujos compostos ou produtos poderiam interagir com o mecanismo de
controle de biossíntese de moléculas.
O meio Saboraud é um substrato rico em açúcar e proteínas, tendo na
sua composição glicose, peptona e ágar, o que favorece o crescimento micelial.
Em contrapartida, a esporulação não foi favorecida neste meio, talvez pela
ausência de algum fator necessário à formação de conídios. No fungo Alternaria
alternata, a peptona, que contém todos os aminoácidos essenciais, já foi relatada
como inibidora da formação de conídios (Silva & Melo, 1999).
O meio ágar extrato de malte é composto por extrato de malte, peptona
e ágar, sendo, portanto, rico em açúcares como maltose e glicose, além de
dextrina, proteínas, vitaminas e minerais. Já o meio ágar Czapek apresenta em
79
sua composição sacarose, nitrato de sódio, fosfato dipotássio, sulfato de magnésio
cloreto de potássio, sulfato de ferro e ágar, sendo, portanto, um meio salino com
limitada disponibilidade de nutrientes. Da mesma forma, o meio BDA, composto
por batata, dextrose e ágar, caracteriza-se por permitir uma rápida esporulação.
Isto, de certa forma poderia explicar ao reduzido crescimento micelial no meio
BDA uma vez que a glicose do meio, embora sendo uma molécula prontamente
utilizável, pode ter um efeito repressor e inibitório na utilização de outras fontes de
carbono. Também a solanina presente no meio poderia estar afetando os
processos de digestão, transporte e subseqüente metabolização dos demais
compostos desse meio, ocasionando o retardo do crescimento do micélio. Já o
meio ágar-água seria o menos nutritivo dos cinco meios testados, fato evidenciado
pelo baixo crescimento dos isolados e incompatibilidade na maioria dos
cruzamentos
.
Desta forma, pode-se sugerir que a incompatibilidade vegetativa, além
de ter um caráter determinado geneticamente, seria também influenciada pela
disponibilidade de nutrientes no meio de cultivo. No meio ambiente, isto teria
fundamental importância, sugerindo que organismos que estivessem em um
habitat rico em nutrientes poderiam não expressar a incompatibilidade. Em
contrapartida, fungos que estivessem em ambientes estressantes
fisiologicamente, competindo por nutrientes com outros microrganismos ou
indivíduos da mesma espécie, poderiam utilizar este mecanismo para sua própria
proteção, evitando a troca de informações genéticas que poderiam ser
prejudiciais para os mesmos.
80
5. CONCLUSÕES
1) Foram obtidos 5 diferentes agrupamentos morfológicos com
características e taxas de crescimento diferenciadas, sendo que os isolados
dos grupos I e III mostraram-se os mais virulentos;
2) Os isolados apresentaram atividades enzimáticas distintas,
que não puderam ser correlacionadas à virulência, sendo a enzima
esterase a que apresentou os mais altos índices de atividade;
3) Foi encontrada uma alta freqüência de reações de
incompatibilidade vegetativa entre os isolados, que foi influenciada pelo
meio de cultivo utilizado;
4) A análise do perfil proteico mostrou maior similaridade entre
isolados de B. sorokiniana oriundos do Brasil do que entre isolados
oriundos de outros países.
81
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7. APÊNDICES
7.1 Listagem e composição dos meios de cultivo utilizados.
Meio de cultivo Composição
Ágar batata dextrose (BDA) 4 g/L Infusão de batata, 20g/L dextrose,
15g/L ágar
Saboraud dextrose 40 g/L dextrose, 10g/L peptona, 15 g/L ágar
Ágar Czapek 30 g/L sacarose, 2 g/L NaNO
3
, 1 g/L K
2
HPO
4
,
0,5 g/L MgSO
4
, 0,5 g/L KCl, 0,01 g/L FeSO
4
,
15 g/L ágar
Ágar extrato de malte 30 g/L extrato de malte, 5 g/L peptona, 15 g/L
ágar
Ágar água 15 g/L ágar
Meio mínimo 6 g/L NaNO
3
, 0,5 g/L KCl, 1,5 g/L KH
2
PO
4
,
0,5 g/L MgSO
4
. 7H
2
O, 0,01 g/L ZnSO
4
, 0,01
g/L FeSO
4
, 15 g/L ágar
Meio mínimo modificado para
produção de pectinases
7 g/L K
2
HPO
4,
2 g/L KH
2
PO
4,
1g/L
(NH4)2SO4, 0,1 g/L MgSO4.7H2O, 15 g/L
ágar
7.2 Listagem e composição das soluções utilizadas
Solução Composição
Brometo
hexadeciltrimetilamônia a 1%
1 g Brometo hexadeciltrimetilamônia, 100 mL água
Vermelho congo a 0,1 % 1 g vermelho congo, 100 mL água
Lugol 10 g iodeto de potássio, 5 g cristais de iodo, 100 mL
água destilada
solução saturada de
(NH
4
)
2
SO
4
7,7g de (NH
4
)
2
SO
4,
10 mL água
Rodamina B a 0,001%. 0,01 g Rodamina B, 1L água
Dodecil sulfato de sódio
(SDS) a 10%
10 g de SDS, 100 mL água
Persulfato de Amônio (APS)
a 10%
10 g APS, 100 mL água
Tris-HCl 121,14 g Tris-base, 1000 mL água
93
Ácido
etilenodiaminotetracético
(EDTA) a 0,5 M
29,22 g EDTA ácido, 200 mL água
Tampão de extração de
proteínas
SDS1%, 9M Uréia, 25mM Tris-HCl pH 6,8, 1mM
EDTA, 0,7M β-mercaptoetanol
Tampão de amostra 5X 0,2 mL Tris-HCl 1,5 M pH 6,8, 0,2 mL glicerol, 2%
SDS, 0,1 mL bromophenol blue 1%, 1,5 mL água
Tampão de corrida 5X 9 g Tris, 43,2 g glicina, 3 g SDS, 1000mL água.
Acrilamida
30 g acrilamida, 1 g bisacrilamida, 100 mL água
Gel SDS-PAGE (separador)
a 15%
7,5 mL acrilamida, 7 mL Tris-HCl pH 8,8, 0,190 μL
SDS, 0,094 μL APS a 10%, 0,018 μL TEMED, 3,9 mL
água
Gel SDS-PAGE
(concentrador) a 4%
1,34 mL acrilamida, 1,3 mL Tris-HCl pH 6,8, 0,100 μL
SDS, 0,050 μL APS a 10%, 0,010 μL TEMED, 7,2 mL
água
Solução de fixação
50 mL de metanol, 12 mL de ácido acético, 50 μL de
formaldeído, 38 mL de água
Solução aquosa de
Comassie Blue a 1%
50% metanol, 0,05% comassie blue, 10% ácido
acético, 40% água
Solução descorante 5% metanol, 7% ácido acético, 88% água
Solução de coloração de
nitrato de prata
0,1 g AgNO
3,
38 μL formaldeído, 50 mL água
Solução de revelação
3 g carbonato de sódio, 25μL formaldeído, 1 mL
tiossulfato de sódio 0,02%, 49 mL água
94
7.3 Análise de variâcia (ANOVA) – Virulência
EMERGÊNCIA
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
GRUPO I 14 547 39,07142857 734,9945055
GRUPO 2 3 180 60 304
GRUPO 3 12 466 38,83333333 486,8787879
GRUPO 4 4 214 53,5 801
GRUPO 5 2 148 74 72
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 3582,97619 4 895,7440476 1,493438141 0,229069649 2,689627574
Dentro dos grupos 17993,59524 30 599,7865079
Total 21576,57143 34
PLÂNTULAS COM SINTOMAS
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
GRUPO I 14 1035 73,92857143 172,3791209
GRUPO 2 3 185 61,66666667 1362,333333
GRUPO 3 12 1113 92,75 119,6590909
GRUPO 4 4 221 55,25 2743,583333
GRUPO 5 2 56 28 1568
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 10301,97619 4 2575,494048 4,804848346 0,004082496 2,689627574
Dentro dos grupos 16080,59524 30 536,0198413
Total 26382,57143 34
95
PLÂNTULAS SEM SINTOMAS
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
GRUPO I 14 365 26,07142857 172,3791209
GRUPO 2 3 115 38,33333333 1362,333333
GRUPO 3 12 87 7,25 119,6590909
GRUPO 4 4 179 44,75 2743,583333
GRUPO 5 2 144 72 1568
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 10301,97619 4 2575,494048 4,804848346 0,004082496 2,689627574
Dentro dos grupos 16080,59524 30 536,0198413
Total 26382,57143 34
7.4 TESTE DE TUCKEY - Patogenicidade
PLÂNTULAS COM
SINTOMAS
GRUPO
3 1 2 4 5
MÉDIA
92,75 73,93
61,6
7
55,2
5
28
TAMANHO
12 14 3 4 2
COMPARAÇÃO
XA -
XB
nA:n
B
EP
qcal
c
Q0,05;5
;30
Conclusão
3 x 5 64,75 12:02
12,4
7
5,19 4,1 DIFERE
3 x 4 37,5 12:04 9,4 3,99 4,1 NÃO DIFERE
3 x 2 31,08 12:03
10,4
8
2,97 4,1 NÃO DIFERE
3 x 1 18,82 12:14 6,34 2,97 4,1 NÃO DIFERE
96
1 x 5 45,93 14:02
12,3
6
3,72 4,1 NÃO DIFERE
1 x 4 18,68 14:04 9,26 2,02 4,1 NÃO DIFERE
1 x 2 12,26 14:03
10,3
5
1,18 4,1 NÃO DIFERE
2 x 5 33,67 03:02
14,9
1
2,26 4,1 NÃO DIFERE
2 x 4 6,42 03:04
12,4
7
0,51 4,1 NÃO DIFERE
4 x 5 27,25 04:02
14,1
8
1,92 4,1 NÃO DIFERE
PLÂNTULAS SEM SINTOMAS
GRUPO
3 1 2 4 5
MÉDIA
92,75 73,93
61,6
7
55,2
5
28
TAMANHO
12 14 3 4 2
COMPARAÇÃO
XA -
XB
nA:n
B
EP
qcal
c
Q0,05;5
;30
Conclusão
5 x 3 64,75 12:02
12,4
7
5,19 4,1 DIFERE
5 x 1 45,93 14:02
12,3
6
3,72 4,1 NÃO DIFERE
5 x 2 33,67 03:02
14,9
1
2,26 4,1 NÃO DIFERE
5 x 4 27,25 04:02
14,1
8
1,92 4,1 NÃO DIFERE
4 x 3 37,5 12:04 9,4 3,99 4,1 NÃO DIFERE
4 x 1 18,68 14:04 9,26 2,02 4,1 NÃO DIFERE
4 x 2 6,42 03:04
12,4
7
0,51 4,1 NÃO DIFERE
2 x 3 31,08 12:03
10,4
8
2,97 4,1 NÃO DIFERE
2 x 1 12,26 14:03
10,3
5
1,18 4,1 NÃO DIFERE
1 x 3 18,82 12:14 6,34 2,97 4,1 NÃO DIFERE
97
7.5 Análise de variância (ANOVA) – Atividade enzimática (comparação entre
enzimas)
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
AMILASES 36 36,41295228 1,011470897 0,028681859
CELULASES 36 38,3781019 1,066058386 0,008466812
PROTEASES 27 24,05471446 0,89091535 0,005151001
PECTINASES 22 22,47757144 1,021707793 0,015849937
ESTERASES 34 45,66954896 1,343222028 0,160582752
ANOVA
Fonte da
variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 3,570797699 4 0,892699425 18,95003585 1,25E-12 3,446745
Dentro dos
grupos 7,066208993 150 0,04710806
Total 10,63700669 154
7.6 Teste de Tukey – Atividade enzimática (comparação entre enzimas)
GRUPO
ESTERASES CELULASES PECTINASES AMILASES PROTEASES
MÉDIA
1,34 1,07 1,02 1,01 0,89
TAMANHO
34 36 22 36 27
COMPARAÇÃO XA - XB nA:nB EP qcalc Q0,05;5;150 CONCLUSÃO
EST X PRO 0,45 34-27 0,04 11,250 3,917 DIFERE
EST X AMI 0,33 34-36 0,037 8,919 3,917 DIFERE
EST X PEC 0,32 34-22 0,042 7,619 3,917 DIFERE
EST X CEL 0,27 34-36 0,037 7,297 3,917 DIFERE
CEL X PRO 0,18 36-27 0,039 4,615 3,917 DIFERE
CEL X AMI 0,06 36-36 0,037 1,622 3,917 NÃO DIFERE
CEL X PEC 0,05 36-22 0,042 1,190 3,917 NÃO DIFERE
PEC X PRO 0,13 22-27 0,044 2,955 3,917 NÃO DIFERE
PEC X AMI 0,01 22-36 0,042 0,238 3,917 NÃO DIFERE
AMI X PRO 0,12 36-27 0,039 3,077 3,917 NÃO DIFERE
98
7.7 Análise de variância (ANOVA) – Atividade enzimática (comparação entre os
diferentes isolados)
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
BS6M1 5 4,877719197 0,975543839 0,016037265
CS1110 5 5,677358494 1,135471699 0,495468656
98003 4 4,201371814 1,050342954 0,011950745
CS1004 4 3,935076884 0,983769221 0,015459843
980044 5 5,292086073 1,058417215 0,009998571
BS16M1 5 5,390604826 1,078120965 0,023836082
BS18M2 4 5,118190705 1,279547676 0,082323494
98006 4 4,783777026 1,195944256 0,166558095
BS52M1 4 4,083998279 1,02099957 0,029181495
980077 5 5,040161575 1,008032315 0,00675004
98010 4 4,263394317 1,065848579 0,021834341
98011 4 5,502335148 1,375583787 0,307622669
1965 4 3,991664141 0,997916035 0,011818401
98012 5 5,516659309 1,103331862 0,016909757
98013 5 5,345625127 1,069125025 0,017992553
98014 3 3,355885948 1,118628649 0,006242225
98017 4 5,99882997 1,499707492 0,998032802
98018 5 5,249928544 1,049985709 0,023090416
98019 5 5,467682975 1,093536595 0,029832567
98021 5 5,264415896 1,052883179 0,019009664
98022 5 5,098672284 1,019734457 0,022738263
98023 5 5,497415177 1,099483035 0,043190721
98025 4 4,584788638 1,14619716 0,022826314
98026 4 4,003388922 1,00084723 0,025561936
98028 3 3,02431312 1,008104373 0,016199393
98029 5 5,631661173 1,126332235 0,035573439
98030 4 4,230220711 1,057555178 0,00595526
98032 3 2,981436224 0,993812075 0,025947069
98033 4 4,211659195 1,052914799 0,0084275
98040 5 5,605208451 1,12104169 0,054957201
98041 3 2,857371643 0,952457214 0,002522715
98042 3 3,112980769 1,037660256 0,010414741
98043 5 5,237914559 1,047582912 0,042461366
19/92 4 3,648791192 0,912197798 0,018547737
CEV13 5 5,047303576 1,009460715 0,009138583
BO2002 4 3,862997154 0,965749289 0,010342822
99
ANOVA
Fonte da
variação
SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 1,837083466 35 0,052488099 0,709788441 0,878263 1,806926
Dentro dos
grupos 8,799923226 119 0,073948935
Total 10,63700669 154
7.8 Análise de variância (ANOVA) – Taxa de crescimento
RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
GRUPO 1 14 10,2553 0,732521429 0,02023698
GRUPO 2 3 2,6249 0,874966667 0,376239363
GRUPO 3 13 13,2252 1,017323077 0,152374084
GRUPO 4 4 3,8438 0,96095 0,068263263
GRUPO 5 2 0,632 0,316 0,00060552
ANOVA
Fonte da
variação
SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 1,178589959 4 0,29464749 2,99532401 0,033593 2,678668
Dentro dos
grupos 3,049443783 31 0,098369154
Total 4,228033742 35
100
7.9 Teste de Tukey – Taxa de crescimento
GRUPO 3 4 2 1 5
MÉDIA 1,017323 0,96095 0,874967 0,732521 0,316
n 13 4 3 14 2
COMPARAÇÃO XA - XB nA:nB EP qcalc qcrítico CONCLUSÃO
3 X 4 0,056373 13:04 0,1269 0,444232 4,102 NÃO
3 X 2 0,142356 13:03 0,1421 1,001804 4,102 NÃO
3 X 1 0,284802 13:14 0,0854 3,334914 4,102 NÃO
3 X 5 0,701323 13:02 0,1685 4,162155 4,102 DIFERE
4 X 2 0,085983 04:03 0,5357 0,160507 4,102 NÃO
4 X 1 0,228429 04:14 0,1257 1,817252 4,102 NÃO
4 X 5 0,64495 04:02 0,1921 3,357366 4,102 NÃO
2 X 1 0,142445 03:14 0,1411 1,009534 4,102 NÃO
2 X 5 0,558967 03:02 0,2025 2,760329 4,102 NÃO
1 X 5 0,416521 14:02 0,2443 1,704959 4,102 NÃO
101
8. VITA
8.1 DADOS PESSOAIS
Nome: Alana Poloni
Nascimento: 25/01/1983, Caxias do Sul/RS – Brasil
Filiação: Marlene Gallina Poloni e Adriano Poloni
Email: [email protected]
8.2 FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
2006-2008 - Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, RS, Brasil.
2001-2005 - Graduação em Ciências Biológicas.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brasil.
1998-2000 - Ensino Médio (2º grau).
Escola Estadual de 1° e 2° Santa Catarina, RS, Brasil.
1990-1997 - Ensino Fundamental (1º grau).
Escola Estadual de 1° e 2° Alexandre Zattera, RS, Brasil.
8.3 EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL
2003-2005 – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Estagiária de Iniciação Científica no Laboratório de Micologia Ambiental
2005 - Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde, FEPPS
Estagiária do Laboratório de Análises Microbiológicas de Água e Alimentos
2002 – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Estagiária do Laboratório de Embriologia comparada
Livros Grátis
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