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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
Estudo da variabilidade genotípica de
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari,
Ixodidae) de diferentes regiões geográficas do Brasil
Leonardo Burlini Soares
2008
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i
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENOTÍPICA DE
Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI, IXODIDAE) DE
DIFERENTES REGIÕES GEOGRÁFICAS DO BRASIL
LEONARDO BURLINI SOARES
Sob a Orientação da Professora
Kátia Maria Famadas
e Co-orientação da Professora
Kátia Regina dos Santos Teixeira
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias, no
Curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, Área de Concentração
em Parasitologia Veterinária
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2008
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ii
595.429081
S676e
T
Soares, Leonardo Burlini, 1981-
Estudo da variabilidade genotípica de
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806)
(Acari, Ixodidae) de diferentes regiões
geográficas do Brasil / Leonardo Burlini
Soares. – 2008.
35f. : il.
Orientador: Kátia Maria Famadas.
Dissertação (mestrado) – Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto
de Veterinária.
Bibliografia: f. 30-33.
1. Carrapato – Brasil – Teses. 2.
Rhipicephalus sanguineus – Brasil – Teses.
3. Rhipicephalus sanguineus – Distribuição
geográfica – Brasil – Teses. I. Famadas,
Kátia Maria, 1961-. II. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro. Instituto
de Veterinária. III. Título.
iv
Aos meus pais Jorge e Sheila.
A minha irmã Patrícia.
A minha avó Licéia.
Ao meu avô Victório, in memoriam.
A minha namorada Daianna.
Aos amigos.
Aos carrapatos, por existirem.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e pela saúde física e mental, além da luz, força e serenidade
concedidas, mais uma vez, para continuar e concluir mais esta etapa da minha vida.
À professora KÁTIA MARIA FAMADAS, pela oportunidade, incentivo, participação
e orientação.
À professora KÁTIA REGINA DOS SANTOS TEIXEIRA, pela valiosa co-
orientação, dedicação e auxílio durante o curso.
Aos pesquisadores ALESSANDRA SCOFIELD AMARAL, CARINA ELISEI,
FÁBIO BARBIERI, ISABELLA MARTINS, LÍGIA BORGES, MATIAS PABLO JUAN
SZABÓ, RENATA MADUREIRA e SILVIA MARIA MENDES AHID, pelo fornecimento
do material biológico.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, pelos
ensinamentos.
Ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, pela oportunidade a apoio.
Aos meus pais, à minha irmã e à minha avó, pelo incentivo, apoio, confiança,
compreensão e presença de sempre.
A minha querida namorada DAIANNA RAMOS MIQUELOTTI, pela paciência,
carinho, companheirismo e Amor, e por me proporcionar alguns dos melhores momentos de
minha vida.
Aos amigos CLARISSA PIMENTEL DE SOUZA e GUILHERME GOMES
VEROCAI, pelo incentivo, apoio e ajuda durante a realização deste trabalho.
Aos demais amigos, pela paciência e ajuda.
Aos colegas de turma da Pós-Graduação, pelo agradável e instrutivo convívio, e
companheirismo na realização das atividades.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
auxílio financeiro durante a realização do curso.
E a todos aqueles que não foram citados nominalmente mas que foram indispensáveis
para minha formação, e de alguma forma me ajudaram a seguir em frente e contribuíram para
a realização deste trabalho.
Muito obrigado !
vi
BIOGRAFIA
Leonardo Burlini Soares, filho de Jorge Vieira Soares e Sheila Burlini Soares, nascido
em 22 de outubro de 1981, na cidade do Rio de Janeiro, estado do Rio de Janeiro.
Cursou o primário na Escola de Primeiro e Segundo graus Fundação Bradesco e os
ensinos fundamental e médio no Colégio Pedro II – Unidade Humaitá, ambos localizados na
cidade do Rio de Janeiro.
No ano de 1997, ainda cursando o ensino médio, ingressou no Programa de Vocação
Científica – Iniciação da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), onde permaneceu no período
de agosto de 1997 a junho de 1998.
No ano de 1998, ainda cursando o ensino médio, ingressou como bolsista no Programa
de Vocação Científica – Avançado da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), onde
permaneceu no período de agosto de 1998 a dezembro de 1999.
No ano de 2000 ingressou no Curso de graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, diplomando-se em outubro de 2005.
Foi estagiário na Área de Anatomia Animal desta Instituição no período de dezembro
de 2000 a maio de 2001; no Programa de Extensão em Fazendas na Região Sul Fluminense,
com o Programa Integrado de Orientação e Assistência Técnica aos Produtores de Leite, no
período de outubro de 2001 a outubro de 2002; do Hospital Veterinário de Grandes Animais
desta Instituição no período de dezembro de 2002 a março de 2003; e do Hospital Veterinário
de Pequenos Animais desta Instituição no período de abril a outubro de 2003.
Foi bolsista do Programa de Estágio Curricular (PEC-FIOCRUZ), no período de
agosto de 2003 a agosto de 2005.
Além disso, ainda fez estágio supervisionado na Clínica Veterinária Eqüina (Jockey
Club Brasileiro) no período de outubro de 2001 a novembro de 2005 e estagio na área de
Parasitologia Animal da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Foi aprovado no processo de seleção para o Curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, àrea de concentração em Parasitologia Veterinária, do Instituto de Veterinária
desta instituição, ao nível de mestrado, onde ingressou em março de 2006, sob orientação da
professora Dra. Kátia Maria Famadas. Foi bolsista de pós-graduação do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) no período de março de 2006 a fevereiro
de 2008.
vii
RESUMO
BURLINI, Leonardo. Estudo da variabilidade genotípica de Rhipicephalus sanguineus
(Latreille, 1806) (Acari, Ixodidae) de diferentes regiões geográficas do Brasil. 2008. 35p.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária). Instituto de
Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
O posicionamento taxonômico de carrapatos do grupo Rhipicephalus sanguineus é de difícil
determinação por métodos fenotípicos e tem sido objeto de freqüentes revisões e debates
contínuos. A diferenciação das espécies dentro desse grupo é de importância clínica,
especialmente em medicina veterinária, devido a transmissão de diferentes patógenos. O
estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genética de Rhipicephalus sanguineus
provenientes de diferentes regiões geográficas do Brasil e preencher algumas lacunas no
estudo da espécie. Este trabalho foi realizado nos laboratórios de: Ixodologia da Estação para
Pesquisas Parasitológicas W. O. Neitz, Biologia Molecular e Acarologia, pertencentes ao
Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro; e nos laboratórios de: Genética e Bioquímica, e Genoma da
EMBRAPA – Agrobiologia (RJ). Foram comparados fragmentos de DNA mitocondrial
(DNA-mt) de R sanguineus do Espírito Santo (ES), Goiás (GO), Pará (PA), Rondônia (RO),
Mato Grosso do Sul (MS), Rio de Janeiro (RJ) e Rio Grande do Norte (RN). Os resultados
mostram que larvas em jejum, preservadas em etanol, das diferentes localidades apresentaram
variabilidade genotípica considerando-se os genes 12S e 16S DNAr-mt. Para o gene 12S
DNAr-mt, a amostra do Espírito Santo apresentou a maior diversidade genética em
comparação às demais amostras brasileiras; já para o gene 16S DNAr-mt, o destaque pode ser
dado à amostra do Rio de Janeiro, que apresentou os maiores valores de divergência em
relação às demais seqüências. A variabilidade intraespecífica detectada entre os isolados
variou de 0 a 6,6% em relação ao gene 12S DNAr-mt e de 0 a 2,7% em relação ao 16S DNAr-
mt. Por outro lado, uma forte relação genética foi detectada entre os isolados brasileiros e
R. sanguineus asiáticos (0-5,8% de variabilidade para 12S, e 0-1,3% para 16S DNAr-mt) e
entre as amostras brasileiras e Rhipicephalus turanicus africanos (2,2-7,6% de diferença para
12S) enquanto populações de R. sanguineus da Argentina e Uruguai se relacionaram com
R. sanguineus da França (seqüências de 12S idênticas); no tocante ao 16S, R. sanguineus de
Israel apresentou moderada distância dos isolados brasileiros (3,6-5,8%). Esses resultados
mostraram que as diferenças entre esses isolados brasileiros são grandes e até mesmo maiores
do que poderia se esperar entre alguns deles, e que a sistemática de carrapatos R. sanguineus,
tanto da América Latina quanto de países de outros continentes deve ser melhor e mais
estudada. Amplas variações como estas podem justificar as diferenças mundiais relatadas para
diversos parâmetros biológicos nessa espécie.
Palavras-chave: variabilidade genotípica, Rhipicephalus sanguineus, Brasil.
viii
ABSTRACT
BURLINI, Leonardo. Genotipic variability study of Rhipicephalus sanguineus (Latreille,
1806) (Acari, Ixodidae) from different geografic regions of Brazil. 2008. 35p. Dissertation
(Master Science in Veterinary Sciences, Veterinary Parasitology). Instituto de Veterinária,
Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Seropédica, RJ, 2008.
The taxonomic status of ticks of the Rhipicephalus sanguineus group is difficult to be
determined by phenotypic methods and has been object of frequent revisions and ongoing
debate. The differentiation of species within this group has clinical importance, especially in
veterinary medicine due to transmission of different pathogens. The objective of this study
was to evaluate de genetic variability of Rhipicephalus sanguineus from different geografic
regions of Brazil and fill in some gaps in the species study. This work was conducted in the
laboratories of: Ixodology of the W. O. Neitz station for parasitologic research, Molecular
Biology and Acarology, of the Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de
Veterinária, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro; and in the laboratories of:
Genetic and Biochemistry, and Genome of EMBRAPA – Agrobiologia (RJ). Mitochondrial
DNA (mt-DNA) fragments of R sanguineus from Espírito Santo (ES), Goiás (GO), Pará (PA),
Rondônia (RO), Mato Grosso do Sul (MS), Rio de Janeiro (RJ) e Rio Grande do Norte (RN)
were compared. The results showed that fasting larvae, preserved in ethanol, from the
different localities presented genotipic variability considering the 12S and 16S mt-rDNA
genes. To 12S, the Espírito Santo strain presented the highest genetic diversity in comparison
with the other brazilian strains; to 16S, the distinction can be given to the Rio de Janeiro
strain, which presented the highest divergence values in regarding the other strains. The
intraspecific variability detected between the isolates ranged from 0 to 6.6% regarding the
12S gene and from 0 to 2.7% regarding the 16S. On the other hand, a strong genetic
relationship was detected between brazilian isolates and asian R. sanguineus (0-5.8% of
variability for 12S, and 0-1.3% for 16S) and between the brazilian strains and african
Rhipicephalus turanicus (2.2-7.6% of difference to 12S) while R. sanguineus populations
from Argentina and Uruguai appeared to be related to French R. sanguineus (identic 12S
sequences); considering 16S, R. sanguineus from Israel presented moderate distance from the
brazilian isolates (3.6-5.8%). These results showed that the differences between these
brazilian isolates are great and to a certain extent greater than should be expected between
some of them, and that the systematic of R. sanguineus ticks from Latin America as much as
of countries of other continents should be better and more studied. Wide variations, such as
these might account for the reported worldwide differences in several biological parameters in
this species.
Key words: genotipic variability, Rhipicephalus sanguineus, Brazil.
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Origem dos espécimes de Rhipicephalus sanguineus do Brasil.
11
Tabela 2: Seqüências de DNAr-mt 12S e 16S e seus respectivos códigos de acesso no
GenBank, e dados das publicações referentes a Rhipicephalus sanguineus e
Rhipicephalus turanicus.
14
Tabela 3: Comprimento dos fragmentos dos genes 12S e 16S RNAr de larvas de
Rhipicephalus sanguineus de diferentes localidades do Brasil e respectivos códigos de
depósito no GenBank.
17
Tabela 4: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de
divergência de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo
Kimura-2-parâmetros, do gene 12S RNAr-mt dos 7 isolados de R. sanguineus de
diferentes estados.
18
Tabela 5: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de
divergência de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo
Kimura-2-parâmetros, do gene 16S RNAr-mt dos 7 isolados de R. sanguineus de
diferentes estados.
19
Tabela 6: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de
divergência de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo
Kimura-2-parâmetros, do gene 12S RNAr-mt de 24 isolados de R. sanguineus (R.s) e
R. turanicus (R.t) de diferentes origens.
21
Tabela 7: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de
divergência de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo
Kimura-2-parâmetros, do gene 16S RNAr-mt de 15 isolados de R. sanguineus (R.s) e
R. turanicus (R.t.) de diferentes origens.
22
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Extratos de DNA total de larvas de Rhipicephalus sanguineus. M) Marcador
de pares de bases – 1 Kb Ladder; N) controle negativo. Amostras analisadas de
diferentes estados do Brasil: ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
15
Figura 2: Produtos de amplificação de DNA de larvas de Rhipicephalus sanguineus com
iniciadores do gene 12S RNAr. M) Marcador de pares de bases – 1 Kb Plus DNA
Ladder; N) controle negativo da reação sem DNA. Amostras analisadas de diferentes
estados do Brasil: ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
16
Figura 3: Produtos de amplificação de DNA de larvas de Rhipicephalus sanguineus com
iniciadores do gene 16S RNAr. M) Marcador de pares de bases – 1 Kb Plus DNA
Ladder; N) controle negativo da reação sem DNA. Amostras analisadas de diferentes
estados do Brasil: ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
16
Figura 4: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos (5`- 3`) do gene 12S RNAr de
R. sanguineus de diferentes regiões do Brasil. Um ponto indica que a seqüência nesse
ponto é idêntica à seqüência do topo. Um hífen indica um “gap” no alinhamento.
17
Figura 5: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos (5`- 3`) do gene 16S RNAr de
R. sanguineus de diferentes regiões do Brasil. Um ponto indica que a seqüência nesse
ponto é idêntica a seqüência do topo. Um hífen indica um “gap” no alinhamento.
18
Figura 6: Árvore “neighbor-joining” (sem raíz) do gene 12S RNAr, usando distância
Kimura-2-parâmetros. Os números representam a percentagem de suporte de
“bootstrap”.
23
Figura 7: Árvore “neighbor-joining” (sem raíz) do gene 16S RNAr usando distância
Kimura-2-parâmetros. Os números representam a percentagem de suporte de
“bootstrap”.
24
Figura 8: Árvore baseada em análise de máxima parsimônia (sem raíz), do gene 12S
RNAr. Os números representam a percentagem de 1000 réplicas “bootstrap”.
34
Figura 9: Árvore baseada em análise de máxima parsimônia (sem raíz), do gene 16S
RNAr. Os números representam a percentagem de 1000 réplicas “bootstrap”.
35
xi
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
AFLP Polimorfismo de Comprimentos de Fragmentos Amplificados – “Amplified
Fragment Lenght Polymorphism”
DALP “Direct Amplification of Length Polymorphism”
DNA Ácido desoxirribonucleico – “Deoxyribonucleic acid”
DNA-mt DNA mitocondrial
DNAr DNA ribossomal
DNAr-mt DNA ribossomal mitocondrial
DNAr-n DNA ribossomal nuclear
Dr. Doutor
Dra. Doutora
ES Espírito Santo
GO Goiás
ITS espaço interno transcrito - “internal transcribed spacer”
ITS1 Primeiro espaço interno transcrito
ITS2 Segundo espaço interno transcrito
Kpb Quilopar de bases
mA Miliamperes
mg Miligramas
MgCl
2
Cloreto de Magnésio
ml Mililitro
mM Milimolar
MS Mato Grosso do Sul
ng Nanogramas
PA Pará
pb pares de bases
PBS solução salina de tampão fosfato
PCR Reação de Polimerase em Cadeia - “Polymerase Chain Reaction”
RJ Rio de Janeiro
RAPD Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso – “Random Amplification of
Polymorphic DNA”
RFLP Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição – “Restriction
Fragment Length Polymorphism”
RN Rio Grande do Norte
RNAr RNA ribossomal
RNAr-mt RNA ribossomal mitocondrial
RO Rondônia
rpm Rotações por minuto
SSCP Polimorfismo de conformação de fita simples – “Single Strand Conformation
Polymorphism”
UV Ultravioleta
≈
Aproximadamente
µl Microlitros
xii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1
2 REVISÃO DE LITERATURA
4
2.1 Breve Consideração Sobre a Introdução de R. sanguineus na América do Sul e Brasil 4
2.2 Aspectos Taxonômicos Gerais do Grupo 4
2.3 Marcadores Moleculares 6
2.3.1 Genes mitocondriais 6
2.3.2 Genoma mitocondrial de carrapatos 7
2.4 Aplicação de Técnicas Moleculares para Estudos dos Ixodida 7
3 METODOLOGIA
11
3.1 Locais de Desenvolvimento da Pesquisa 11
3.2 Origem das Fêmeas e Obtenção das Larvas de R. sanguineus 11
3.2.1 Origem dos espécimes 11
3.2.2 Obtenção das larvas 11
3.3 Obtenção das Sequências de DNA Ribossomal Mitocondrial (DNAr-mt) 12S e 16S
das Larvas de R. sanguineus
12
3.3.1 Extração do DNA 12
3.3.2 Amplificação do DNA 12
3.3.3 Seqüenciamento do DNA 13
3.3.4 Alinhamento das seqüências e inferências sobre variabilidade 13
4 RESULTADOS
15
4.1 Extração do DNA de Larvas de R. sanguineus 15
4.2 Amplificação do DNA de Larvas de R. sanguineus 15
4.3 Sequenciamento 16
4.4 Comparação das Seqüências de 12S e 16S DNAr-mt dos Isolados de Carrapatos de
Diferentes Localidades do Brasil
17
5 DISCUSSÃO
25
6 CONCLUSÕES
28
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
29
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
30
ANEXO
34
Árvores Baseadas em Análise de Máxima Parsimônia (MP)
34
1
1 INTRODUÇÃO
Das 35.000 descritas e cerca de 1.000.000 de espécies não descritas de ácaros, os
carrapatos (Ixodida) compreendem um grupo de aproximadamente 899 espécies (BARKER e
MURRELL, 2004), divididas em três famílias: Argasidae (carrapatos moles), Ixodidae
(carrapatos duros) e Nutalliellidae. Destas, Ixodidae, a de maior diversidade de espécies,
compreende dois grandes grupos: Prostriata e Metastriata, com 5 subfamílias e 13 gêneros
(HOOGSTRAAL, 1985). Das 4 subfamílias que compõem os Metastriata, Rhipicephalinae
Banks, 1908, onde encontramos Rhipicephalus Koch, 1844, possui aproximadamente 115
espécies em 7 gêneros. Com muitos problemas de classificação devido à plasticidade de
caracteres, não há como precisar o número de espécies dentro de Rhipicephalus, mas Barker e
Murrel (2004) listaram 79 espécies como válidas. Essas espécies estão distribuídas em
subgêneros e agrupadas em complexos.
No chamado complexo ou grupo Rhipicephalus sanguineus encontramos
R. sanguineus (Latreille, 1806) sensu stricto, Rhipicephalus turanicus Pomerantsev, 1936,
Rhipicephalus rossicus Yakimov e Kol-Yakimova, 1911, Rhipicephalus pumilio Schluze,
1935, Rhipicephalus leporis Pomerantsev, 1946, Rhipicephalus schulzei Olenev, 1929,
Rhipicephalus pussillus Gil Collado, 1936, Rhipicephalus sulcatus Neumann, 1908,
Rhipicephalus guilhoni Morel e Vassiliades, 1963, Rhipicephalus moucheti Morel, 1965,
Rhipicephalus bergeoni Morel e Balis, 1976 e Rhipicephalus camicasi Morel, Mouchet e
Rodhain, 1976 (apud ZAHLER et al., 1997), e todos os representantes dessas espécies são
endêmicos nas regiões tropical e subtropical (BERNASCONI et al., 2002).
Sabe-se que os carrapatos são vetores de uma variedade maior de microorganismos do
que qualquer outro único táxon dentro de Arthropoda, incluindo mosquitos (OLIVER Jr,
1989), como resultado, eles detém um dos maiores volumes de dados na literatura quando
comparado a outros grupos dentro de Acari.
Doenças determinadas por microrganismos transmitidos por carrapatos em diversas
espécies de hospedeiros variam de assintomáticas a fatais, dependendo das espécies
envolvidas e suas interações. Nesse contexto, Rhipicephalus está entre os ixodídeos mais
importantes, por algumas de suas espécies transmitirem agentes causadores de doenças aos
animais e humanos.
Como único representante do gênero no Brasil, R. sanguineus, comumente chamado
de “carrapato do canil” ou “carrapato marron do cão”, é transmissor de agentes etiológicos
como Babesia canis (Piana e Galli-Valério, 1895), Ehrlichia Moroshkowsky, 1945 e
Hepatozoon canis (James, 1905) para caninos, e Rickettsia da Rocha Lima, 1916 para
humanos. Em relação a este último, R. sanguineus tem ganhado bastante destaque no que
concerne a sua presença nas áreas de foco de Febre Maculosa no Brasil. Seu papel na
epidemiologia dessa Riquetsiose ainda não está bem esclarecido, mas pesquisas estão sendo
desenvolvidas nesse sentido.
Os carrapatos são conhecidos como vetores competentes de numerosos patógenos para
os animais e humanos. Além disso, há evidências de diferentes potenciais bióticos entre
populações de carrapatos no que concerne a eficiência de vetoração de patógenos. Neste
contexto, um esclarecimento da posição biossistemática e da relação filogenética entre seus
membros não é somente um mero interesse acadêmico, pois é importante e fundamental que
vetores artrópodes e os agentes que eles transmitem sejam identificados corretamente.
Tendo supostamente o continente africano como centro de origem, R. sanguineus se
encontra amplamente distribuído pela África, América, Europa, Ásia e Austrália e é
provavelmente a mais prevalente entre todas as espécies de ixodídeos. Sua linha de
distribuição parece estar entre os paralelos 50
o
norte e 35
o
sul, e uma vez que se estabeleça em
2
uma localidade, rapidamente se propaga (PEGRAM et al., 1987 a, b).
Acredita-se que R. sanguineus sensu stricto é o único representante do gênero na
América do Sul. No entanto, no Brasil, algumas importantes diferenças regionais foram
inicialmente detectadas em meados dos anos 90, quando Ribeiro et al. (1996) observaram
variações morfológicas entre R. sanguineus de vários estados no Brasil. Após um hiato a este
respeito, mais recentemente, foram registradas variações morfológicas, biológicas e genéticas
quando confrontaram uma amostra do Brasil com uma da Argentina. Tal fato gerou
questionamentos, levando inclusive a suposição de que poderia haver outra espécie de
Rhipicephalus na América do Sul.
Vale ressaltar que as prováveis diferenças existentes entre populações podem
significar, além da presença de uma outra espécie, diferenças no potencial biológico dessas
populações de R. sanguineus em transmitir agentes patogênicos para os animais e humanos e
potencialidade para transmissão de outros bioagentes.
Rhipicephalus sanguineus compreende um complexo de espécies cujo “status”
taxonômico é, na maioria dos casos, mal definido. Deve-se considerar, porém, que a
determinação e diferenciação de espécies de carrapatos é tradicionalmente baseada em
características morfológicas e ecológicas. Técnicas fenotípicas baseadas em tais
características são substancialmente limitadas por variações intraespecíficas em caracteres
diagnóstico.
As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar
pontos de referência nos cromossomos, que são tecnicamente denominados “marcadores
moleculares” e definidos como todo e qualquer fenótipo molecular ou dado genético oriundo
de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento específico de DNA
(correspondente a regiões expressas ou não do genoma).
Hoje há disponibilidade de várias técnicas de biologia molecular para a detecção de
variabilidade genética ao nível de sequência de DNA, ou melhor, de polimorfismo genético.
Estas técnicas também permitem a obtenção de um número virtualmente ilimitado de
marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo, os quais podem ser utilizados
para as mais diversas aplicações.
O desenvolvimento na área de marcadores moleculares tem sido fascinante e
extremamente rápido. A tecnologia de DNA recombinante e a amplificação dos segmentos de
DNA via PCR (reação de polimerase em cadeia ou, em inglês, “Polymerase Chain Reaction”)
abriram caminho para uma mudança no paradigma genético básico: da inferência do genótipo
a partir do fenótipo, onde Mendel foi o pioneiro, para a análise genética direta da variação na
sequência de DNA.
Tecnologias de análise molecular mais acessíveis e eficientes estão constantemente
sendo aprimoradas. Métodos estatísticos tem acompanhado este desenvolvimento e permitido
a manipulação de enormes quantidades de dados. Tudo isso tem sido e pode ser aplicado a
estudos dos carrapatos, de forma geral, e tem produzido uma enorme quantidade de
informações. É importante dizer que, embora de grande valia, mesmo com o uso das
ferramentas moleculares não se tem conseguido sanar todas as dúvidas referentes a esse
grupo.
Nesse contexto, deve-se aplicar métodos que distinguam espécies e populações com
precisão. Isto é essencial para gerar informações para complementar o conhecimento da
epidemiologia e da biologia desses parasitos, em vista das dificuldades em aplicar técnicas
morfológicas e ecológicas, bem como da inconclusividade de análises bioquímicas e dos
problemas práticos em conduzir e interpretar experimentos de cruzamento, especialmente
aqueles sem progenie (ZAHLER et al., 1997).
Considerando-se diferenças já relatadas entre populações de R. sanguineus, sua
importância, e o fato de que, de modo geral, nas espécies de ampla distribuição geográfica é
3
esperado que ocorra variação fenotípica e/ou genotípica ao longo de sua área de distribuição,
é interessante uma avaliação mais acurada dessas variações. Isso pode ser realizado através da
comparação de sequências de fragmentos de DNA de genes como o 12S e 16S de RNA
ribossomal mitocondrial (RNAr-mt). Tal conhecimento talvez possa contribuir para o
entendimento de diferenças regionais na epidemiologia de doenças transmitidas por
R. sanguineus, bem como diferentes níveis de susceptibilidade a acaricidas.
Em função de algumas hipóteses já aventadas sobre R. sanguineus no Brasil, como
ocorrência de diversidade entre populações e possível presença de outra espécie do complexo
R. sanguineus no país, é especialmente interessante comparar populações de diferentes áreas
geográficas. Tal estudo permitiria determinar se essas populações possuem características
genéticas intermediárias, e/ou ainda se estão posicionadas alopatricamente ou, eventualmente,
em simpatria. A partir daí, será possível iniciar a verificação, aceitação ou não, de nossas
hipóteses formuladas de que há divergência genética entre populações de R. sanguineus
oriundas de diferentes regiões do Brasil e de que R. sanguineus stricto sensu pode não ser a
única espécie do gênero presente no país.
Com objetivo de preencher algumas dessas lacunas, num aspecto geral, realizou-se o
estudo de variabilidade genética de R. sanguineus provenientes de sete diferentes localidades
e quatro regiões geográficas do Brasil, através da comparação de fragmentos dos genes 12S e
16S RNAr-mt, e ainda avaliou-se a divergência genética entre essas amostras e algumas
seqüências de DNA de interesse depositadas no GenBank.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Breve Consideração Sobre a Introdução de R. sanguineus na América do Sul e Brasil
O carrapato R. sanguineus foi introduzido na América no Sul durante as colonizações,
provavelmente junto com seu hospedeiro habitual, o cão. Conforme bem lembrado por Szabó
et al. (2005), diferentes rotas estiveram envolvidas na colonização deste “subcontinente”.
A presença de R. sanguineus no Brasil foi registrada no início do século XX e,
segundo Aragão (1936), em 1907 esta espécie era rara no Rio de Janeiro e não existia em São
Paulo, em Minas Gerais e nos estados do Sul, mas já era conhecida nos estados do Norte e
Nordeste, do Pará até a Bahia; de 1907 a 1936 tornou-se abundante no Rio de Janeiro, em
Minas Gerais, em São Paulo e nos estados do sul do país, e espalhou-se por todos os demais
Estados onde até então não era encontrado.
Na Argentina sua presença foi assinalada, na cidade de Buenos Aires, em 1938
(ROVEDA, 1954), e o primeiro registro no Chile ocorreu em Santiago em 1974 (TAGLE,
1976).
2.2 Aspectos Taxonômicos Gerais do Grupo
Entre os Ixodidae, a sistemática de Rhipicephalus é provavelmente uma das mais
complexas. Cerca de 32 das, aproximadamente, 79 espécies de Rhipicephalus têm sido
incluídas em 8 grupos ou complexos de espécies – grupo R. simus, grupo R. sanguineus,
grupo R. appendiculatus, grupo R. cliffordisenegalensis, grupo R. pravus, grupo R. evertsi,
grupo R. kochi e grupo R. tricuspis (MURRELL et al., 1999). O posicionamento de vários
taxa dentro do complexo R. sanguineus tem estado entre as mais controversas e confusas
questões nesse gênero, e nesse grupo ou complexo há vários questionamentos sobre a
validade dos taxa (PEGRAM e WALKER, 1988 apud BEATI e KEIRANS, 2001). Por isso,
esse complexo tem sido sujeitado a debate contínuo e freqüentes revisões.
Pegram et al. (1987a, b) revisaram criticamente a literatura sobre esse complexo,
ilustraram a morfologia e distribuição geográfica, bem como forneceram listas de hospedeiros
de seis das espécies de carrapatos do complexo, incluindo R. sanguineus sensu stricto.
Segundo estes autores, R. turanicus se parece rigorosamente com R. sanguineus.
As espécies do complexo R. sanguineus, que tem R. sanguineus sensu stricto como
espécie tipo, têm como características comuns entre os machos e as fêmeas os seguintes
fenótipos descritos a seguir. Machos com processo coxal não visível dorsalmente; olhos
planos, sem sulco, que podem ser circundados por poucos grandes pontos; sulcos laterais
variáveis, mas geralmente marcados com pontos; sulcos marginais geralmente profundos e
contendo pontos largos e profundos; sulcos posteromediais e paramediais largos, bastantes
curtos, mas sempre distintos; quatro fileiras quase regulares de pontos largos, profundos e
pilíferos, indo do nível dos olhos até os sulcos posteriores, geralmente distinguíveis; pontos
intersticiais variáveis em tamanho e densidade; ventralmente, placas espiraculares variáveis
(mas muito útil caracter diagnóstico); placas adanais geralmente em dois e amplas (mas muito
variável intraespecificamente para ser de valor diagnóstico). Fêmeas com escudo geralmente
mais longo do que largo; pontos escutais variáveis como no macho, a densidade total
geralmente parece maior comparativamente; sulcos laterais geralmente pronunciados e
contornados com pontos largos; área cervical mais densamente pontuada, mas raramente de
superfície granular; ventralmente, sendo a abertura genital e placas espiraculares caracteres
diagnóstico muito variáveis (PEGRAM et al., 1987b).
Walker et al. (2000) reforçaram que, devido a estas observações, R. sanguineus
compreende um complexo de espécies cujo posicionamento taxonômico da maioria delas
5
ainda é muito difícil de ser determinado e que tal fato leva a identificações errôneas. Na
Europa, por exemplo, onde R. sanguineus e R. turanicus são simpátricos, esses podem
facilmente ser confundidos devido a características morfológicas similares, já que pertencem
ao mesmo complexo. Entretanto estas espécies têm características próprias quanto aos seus
hospedeiros preferenciais e distribuição, e na morfologia. R. turanicus possuem maior
quantidade de pontuações no escudo e a abertura genital da fêmea é geralmente em forma de
“U” mais estreito quando comparada com o formato em “U” mais largo dos representantes de
R. sanguineus; ambos os sexos de R. turanicus têm placas espiraculares com caudas largas
como o festão adjacente, enquanto em R. sanguineus são mais estreitas (WALKER et al.,
2003).
Outra confusão taxonômica diz respeito a R. pusillus, que foi considerado por um
longo tempo como uma pequena variedade de R. sanguineus, até sua aceitação como espécie
válida por Pegram (1984) e Pegram et al. (1987a) (apud MANGOLD et al., 1998a).
Estudando índices numéricos de caracteres diagnósticos para diferenciação entre
R sanguineus e R. turanicus, Ioffe-Uspensky et al. (2005) comentaram sobre a possível
presença de R. camicasi em Israel, visto que esta espécie habita países no entorno, e
chamaram a atenção para o fato de que Beati (em comunicação pessoal) teria encontrado um
espécime de R. camicasi ao analisar amostras de R. turanicus de Israel.
Some-se a toda esta complexidade de diferenciação entre espécies do complexo
R. sanguineus o fato de que ainda há dúvidas sobre a validação de algumas das espécies
pertencentes ao gênero Rhipicephalus (BARKER, 1998), em função de que algumas de suas
espécies apresentam problemas de classificação pela dificuldade de serem determinadas por
métodos fenotípicos, para termos uma visão bastante crítica e cautelosa durante os estudos
taxonômicos e uso de índices de caracteres para diferenciação de indivíduos deste grupo de
carrapatos, inclusive relacionados a marcadores moleculares disponíveis ou em estudo.
As maiores dificuldades de diagnóstico dentro do complexo R. sanguineus ocorrem,
particularmente, entre R. sanguineus e R. turanicus, duas espécies bastante próximas, que
habitam as mesmas áreas e os mesmos habitats, onde coexistem, e que podem ser encontradas
nos mesmos hospedeiros. Essas dificuldades de distinção são tão marcantes que, conforme
reportado por Zahler et al. (1997), R. sanguineus e R. turanicus já foram temporariamente
sinonimizados por Zumpt. Além disso, experimentos de cruzamentos realizados por Paperna e
Giladi (1974), entre indivíduos representativos destas espécies, sustentam a indicação de
conspecificidade de R. sanguineus e R. turanicus, o que foi constatado por Zahler et al.
(1997), através de dados moleculares, a partir de análise da ITS2 (“second internal transcribed
spacer” ou segundo espaço interno transcrito).
Em relação a R. sanguineus no Brasil, Ribeiro et al. (1996) realizando estudo da
morfologia dos adultos, detectaram, entre oito amostras estudadas, variações, tanto intra
quanto inter-específicas, nas placas adanais e placas estigmáticas dos machos, nas placas
estigmáticas de fêmeas, quanto a fileira de cerdas ventro-internas dos palpos e na abertura
genital das fêmeas. Embora os autores tenham observado tais variações, essas ocorreram de
forma aleatória de modo a não dar suporte a hipótese da presença de outra espécie do gênero
no país.
Posteriormente, ao comparar dados já publicados, Szabó et al. (2005) observaram que
fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus do Brasil pesavam cerca de 50% menos que fêmeas dos
Estados Unidos e Japão. Em função dessas e outras observações, Szabó et al. (2005) e
Oliveira et al. (2005) compararam uma população de R. sanguineus oriunda de Jaboticabal,
São Paulo, Brasil com uma de Rafaela, Santa Fé, Argentina. Oliveira et al. (2005) observaram
diferenças na morfologia externa de fêmeas semi-ingurgitadas (tamanho do corpo, forma do
poro genital e estruturas sensoriais, por exemplo), através de microscopia eletrônica, enquanto
Szabo et al. (2005), em trabalho mais complexo, destacaram diferenças biológicas,
6
genotípicas e morfológicas dando suporte mais consistente de que as duas populações
poderiam pertencer a espécies diferentes.
2.3 Marcadores Moleculares
A aplicação de marcadores moleculares para o estudo de carrapatos tem produzido
novas idéias dentro de estrutura de populações e relações taxonômicas. Carrapatos têm sido
estudados ao nível individual, populacional e de espécies.
Variações populacionais também têm sido estudadas em outros artrópodes de
importância e os métodos usados para estudar esses organismos têm muito em comum. Ao
nível individual eles variam de proposições gerais, tais como polimorfismo de comprimento
do fragmento amplificado (AFLP), RAPD ou “direct amplification of length polymorphism”
(DALP), a análises de microsatélites altamente específicas. Embora esses marcadores também
trabalhem ao nível de populações e espécies, análises adicionais de genes nucleares e
mitocondriais específicos têm sido conduzidas também por RFLP e sequenciamento.
Aplicações moleculares têm tido sucesso particular em facilitar a identificação de
espécies difíceis taxonomicamente, no entendimento de estruturas de populações e elucidando
relações filogenéticas.
No fim do século 20, o advento das técnicas moleculares gerou o potencial para
investigar o DNA no par de base individual. Essa é claramente uma forma muito mais direta
de mensurar e quantificar a variação genética dentro e entre espécies.
Para resolver questões filogenéticas entre espécies e populações pode-se destacar o
sequenciamento do DNAr-n, incluindo o ITS, e DNAr-mt. Como vantagens, o DNAr-n
apresenta pequenas regiões entre genes conservados úteis para iniciadores (“primers”) de PCR
e são altamente variáveis. Considerando o DNAr-mt, algumas das vantagens são a estrita
herança maternal, a ausência de recombinação e a possibilidade da estrutura populacional
poder ser definida ao nível geográfico. Além disso, o genoma mitocondrial se desenvolve
mais rapidamente do que o genoma nuclear tanto que frequentemente se detecta variação
intraespecífica (SIMON et al., 1994; NORRIS et al., 1996). Sendo assim, o ideal é a utilização
de ambos, DNAr-mt e DNAr-n, de forma complementar (NAVAJAS e FENTON, 2000).
2.3.1 Genes mitocondriais
O genoma mitocondrial (DNA-mt) é circular e têm 37 genes na maioria dos metazoa:
13 genes codificadores de proteína, 2 genes RNA ribossomais, 22 genes RNA de transferência
e uma região não codificadora. É uma molécula de dupla fita de DNA, simples, que, na
maioria dos metazoa, incluindo os carrapatos que já foram estudados, varia em tamanho de
14-16 kb (BARKER e MURRELL, 2004). Já em 1998 a maior parte ou todo o DNA-mt tinha
sido seqüenciado em mais de 50 metazoa (BLACK IV e ROEHRDANZ, 1998).
Genes mitocondriais têm sido amplamente utilizados em sistemática molecular.
Devido ao elevado número de cópias, torna-se mais fácil trabalhar com esses genes do que
com cópias simples de genes nucleares, além de sua estrita herança maternal, já mencionada,
particularmente útil ao nível intraespecífico.
Os genes mitocondriais se dividem em duas categorias principais: genes ribossomais e
genes codificadores de proteínas. Os dois genes ribossomais são o 12S e o 16S DNAr, que
não são separados por ITS. Esses genes já foram e continuam sendo usados em uma série de
estudos de genética de populações (SIMON et al., 1994; NORRIS et al., 1996; SZABÓ et al.,
2005).
Norris et al. (1999) consideram os genes 12S e 16S DNAr mais convenientes para
resolver relações ao nível intraespecífico ou entre taxa mais próximos.
7
De acordo com Murrell et al. (1999), o 12S DNAr tem ajudado a resolver algumas
relações dentro de Rhipicephalinae e dentro do gênero Rhipicephalus.
Segundo Mangold et al (1998a), o gene 16S parece ser um bom marcador para o
estabelecimento de relação genética entre espécies próximas de carrapatos. Isso poderia ser
devido ao alto nível de homoplasia encontrado em genes que se desenvolvem rapidamente
como os do RNA mitocondrial.
2.3.2 Genoma mitocondrial de carrapatos
O genoma mitocondrial de onze espécies de carrapatos já foi seqüenciado inteiramente
(os códigos de acesso no GenBank são dados entre parânteses): (1) R. sanguineus e
Ixodes hexagonus (AF081829 e AF081828; BLACK IV e ROEHRDANZ, 1998); (2)
Haemaphysalis flava, Cario capensis e Ornithodorus moubata (AB075954, AB075953 e
AB073679; SHAO et al., 2004); (3) I. persulcatus, I. holocyclus e I. uriae (AB073725,
AB075955 e AB087746; SHAO et al., 2005); (4) Amblyomma triguttatum (AB113317;
FUKUNAGA, não publicado); (5) Haemaphysalis flava (AB075954; SHAO et al., 2004) e (6)
O. porcinus (AB105451; MITANI et al., 2004). O genoma de R. sanguineus é rico em AT e
contém 14.710 pb com uma composição de nucleotídeo de 37,6% de adenina, 9,9% de
guanina, 12,1% de citosina e 40,3% de timina (BLACK IV e ROEHRDANZ, 1998).
Além disso, se sabe o arranjo de genes no genoma mitocondrial de
R. (Boophilus) microplus (CAMPBELL e BARKER, 1998, 1999) e parte da organização
desses genes em outras 51 espécies de carrapatos duros e moles (BLACK E ROEHRDANZ,
1998; CAMPBELL e BARKER, 1998; MURRELL et al., 2003; ROEHRDANZ et al., 2002).
A disponibilização dessas sequências é de grande importância e muito pode contribuir
para a definição e (re)validação de espécies de Ixodidae e de outros carrapatos.
2.4 Aplicação de Técnicas Moleculares para Estudos dos Ixodida
A biologia molecular tem fornecido instrumentos que muito têm auxiliado nos estudos
taxonômicos de espécies e populações de carrapatos, como a eletroforese de proteína, análise
de hidrocarboneto cuticular (MANGOLD et al.,1998a), estudo de polimorfismo no
comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) e sequenciamento do DNAr, por exemplo.
Em alguns estudos o DNAr é escolhido como alvo porque acumula mutações de uma
maneira muito regular. Outra vantagem é a presença de regiões “spacer” que não codificam
para RNAr e que se desenvolvem ainda mais rapidamente (ZAHLER et al., 1997).
A análise da seqüência do DNA tem fornecido maiores e melhores informações para a
caracterização de espécies e populações e sua aplicação tem provido dados importantes para
estudos filogenéticos de carrapatos.
Como é sabido, a variação genética ao nível de nucleotídeos proporciona a mais alta
resolução disponível para estudos da sistemática e análises filogenéticas (MANGOLD et
al.,1998b).
Sequências de DNAr nuclear (DNAr-n) de espaços internos transcritos (“internal
transcribed spacers”) (ITS1 e ITS2) foram usadas para investigar a validação de espécies de
carrapatos. O DNAr-mt (12S e 16S) e o DNAr-n (18S e 28S) já foram e continuam sendo
usados em estudos filogenéticos de carrapatos e em genéticas de população de espécies de
Ixodes (WESSON et al., 1993; McLAIN et al., 1995; ZAHLER et al., 1995, 1997; BLACK e
PIESMAN, 1994; CRAMPTON et al., 1996; BLACK et al., 1997; MANGOLD et al., 1998a,
b; RICH et al., 1995; NORRIS et al., 1999). Black e Piesman (1994) usaram sequências de
16S DNAr-mt na primeira análise molecular de filogenia de carrapatos e proporcionaram o
primeiro exame objetivo das classificações tradicionais de Ixodidae usando sequências de 450
8
pares de bases (pb) da extremidade 3` do gene 16S RNAr-mt (MANGOLD et al., 1998a).
Norris et al. (1996) examinaram a variação da sequência nos genes 12S e 16S de
DNAr-mt para determinar a relação genética entre coleções de Ixodes scapularis Say, 1821
de várias localidades dentro da sua área de distribuição nos Estados Unidos. Para isso, os
autores utilizaram análise de polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) de 300 bp
da molécula de 16S, identificaram 11 haplótipos diferentes e estimaram suas frequências
relativas entre 198 carrapatos. Os diferentes haplótipos detectados foram sequenciados em
alguns espécimes, em um total de 462 pb do gene 16S e 420 do 12S, para revelar sítios de
informação.
Segundo Norris et al. (1996), referenciando Avise (1986), a análise do DNAr-mt se
tornou uma poderosa ferramenta no estudo de populações de animais. No referido estudo,
sugere-se que existe uma grande variação no DNAr-mt de I. scapularis. Análises filogenéticas
evidenciaram que pelo menos 2 linhagens mitocondriais principais existem na população de
I. scapularis. Análises do polimorfismo do fragmento de DNA amplificado ao acaso (RAPD)
de amostras de PCR examinadas entre membros dos dois grupos sugeriram que I. scapularis
surgiu no Sul dos Estados Unidos, mas uma grande separação geográfica deu origem a duas
linhagens distintas. Essas linhagens agora reproduzem-se entre si e são parcialmente
simpátricas. Além disso, variações genéticas estavam presentes entre carrapatos de diferentes
populações mesmo dentro dos mesmos estados (por exemplo, Georgia, Carolina do Norte e
Oklahoma) (OLIVER Jr., 1996).
Em estudo realizado por Zahler et al. (1997), buscando determinar quantitativamente
as diferenças nos respectivos genótipos, e para usar essa informação para estabelecer sua
relação filogenética, foi utilizada uma seqüência alvo, de 250 a 274 pb, dentro do gene ITS2
de RNAr, de seis espécies pertencentes ao complexo R. sanguineus: R. sanguineus sensu
stricto, R. turanicus, R. rossicus, R. pumilio, R. pussilus e R. camicasi e de R. evertsi, onde
R. sanguineus sensu stricto e R. turanicus assim como R. pumilio e R. rossicus apresentaram
íntima relação genética, compatível com conspecificidade. R. sanguineus sensu stricto
(Azerbaijão e Burkina Faso) e R. turanicus (Turquemenistão) apresentaram seqüências
idênticas (mesmo genótipo), assim como R. pumilio e R. rossicus, sugerindo serem, cada par,
uma única espécie. Inversamente, R. pussilus apresentou a relação mais distante com as outras
espécies. A seqüência utilizada por Zahler et al. (1997) corresponde a 22% do ITS2 de
R. evertsi e provavelmente a uma porção similar desse gene para os outros membros do
gênero, porque todas as espécies de Rhipicephalinae estudadas até aqui têm ITS2 de mais de
1Kpb (1000 pares de bases) (BARKER, 1998). Porém, esses resultados não estão de acordo
com algumas publicações baseadas em morfologia, biologia e seqüências moleculares de
R. turanicus e R. sanguineus coletados em Israel (BLACK e PIESMAN, 1994; IOFFE-
USPENSKY et al., 1997, 2005; NORRIS et al., 1999), como pode ser visto a seguir.
Para as duas mesmas espécies (R. sanguineus sensu stricto e R. turanicus) em Israel,
Norris et al. (1999) observaram 5,7% e 4,3% de divergência na seqüência dos genes 12S e
16S RNAr-mt, respectivamente (MANGOLD et al., 1998a).
Também utilizando o ITS2 da região codificadora para RNAr, Barker (1998) estudou
16 populações de carrapatos Rhipicephalinae para elucidar problemas de classificação e
validação de espécies. Cada uma das 16 populações apresentou sua seqüência própria, mas a
maior quantidade de variação dos nucleotídeos ocorreu entre espécies e gêneros. O ITS2
RNAr pôde ser usado para distinguir as populações e espécies de R. (Boophilus) e
Rhipicephalus desse estudo.
No referido estudo, houve variação de 22 nucleotídeos de 1161 sítios (1,9%) em
B. microplus (4 populações), 41 de 1161 sítios (3,5%) em R. appendiculatus (6 populações), e
10 de 686 sítios (1,5%) em R. zambeziensis (3 populações). A distância absoluta média entre
populações foi de 1,0% (variando de 0,8 – 1,1%) para R. (Boophilus) microplus, 1,1% (0,6 –
9
1,5%) para R. appendiculatus, e 1,0% (0,7 – 1,2%) para R. zambeziensis. Para
Dermacentor reticulatus, a distância absoluta média entre populações foi de 0,4% (3
populações), ao passo que essa figura foi de 1,3% (13 populações) para I. scapularis, i.e.,
I. scapularis mais I. damini, e 4,2% (4 populações) para I. pacificus.
Black e Piesmam (1994) encontraram 4-5 % de divergência entre R. sanguineus e
R. turanicus de Israel usando uma porção do 16S DNAr como seqüência alvo.
Mangold et al. (1998a) baseado na seqüência genética de um fragmento de 16S de
DNAr, observou uma alta porcentagem de similaridade (98,7%) entre as seqüências de
R. sanguineus e R. turanicus da Espanha, sugerindo que essas espécies podem ter divergido
recentemente dentro do gênero Rhipicephalus.
Segundo Szabó et al. (2005), que compararam o DNAr-mt de duas populações de
R. sanguineus dentro da América do Sul, uma da cidade de Jaboticabal, São Paulo, Brasil e
outra de Rafaela, Santa Fé, Argentina, existe uma alta divergência do 12S DNAr-mt de
R. sanguineus do Brasil e da Argentina. Além disso, uma forte relação genética foi detectada
entre populações de R. sanguineus da Europa e da Argentina, enquanto a população do Brasil
pareceu estar mais relacionada a R. turanicus africano. Além do mais, o cruzamento de
carrapatos desses países (Brasil e Argentina) originaram híbridos não férteis. A diferença
absoluta de nucleotídeos entre as sequências de R. sanguineus (Brasil e Argentina) foi de 27
(8%). As variações na sequência entre populações de R. sanguineus e R. turanicus variaram
entre 0 e 8,3%. As menores variações intraespecíficas foram observadas entre R. sanguineus
da Argentina, França e Egito (variação, 0-0,6%) e entre R. turanicus de Israel e Turquia
(0,3%). Por outro lado, a maior divergência intraespecífica foi detectada entre R. sanguineus
do Brasil e de Israel (8,3%). No entanto, a variação na sequência observada entre
R. sanguineus do Brasil e R. turanicus do Zimbabwe foi somente de 2,4%. Os resultados
providenciaram um forte suporte (99%) para o grupo contendo R. sanguineus argentino e
outros R. sanguineus mediterrâneos. Um alto valor de “bootstrap” (100%) apoiou a relação
próxima entre R. sanguineus do Brasil e R. turanicus do Zimbabwe. Esses resultados
mostraram que diferenças entre as populações são maiores do que as assumidas previamente e
que o status biossistemático de R. sanguineus da América Latina deve ser reavaliado (SZABÓ
et al., 2005). Todas essas observações, morfológicas, moleculares e biológicas, juntas,
segundo Oliveira et al. (2005), indicam que carrapatos Rhipicephalus do Brasil são
exatamente R. turanicus.
Além disso, Bernasconi et al. (2002) já haviam observado uma forte relação entre a
sequência 12S DNAr-mt de um carrapato coletado de um cachorro em Costa Rica
(classificado como R. turanicus) e a sequência correspondente de R. turanicus do Zimbabwe
(AF150017), também utilizado no estudo de Szabó et al. (2005). Sendo assim, de alguma
forma, segundo Szabó et al. (2005), parece haver pelo menos duas espécies do complexo
R. sanguineus na América Latina, mas ainda é prematuro nomear tais espécies até que seja
feita uma exaustiva revisão mundial sobre R. sanguineus e R. turanicus e sobre outras
espécies relacionadas.
Também considerando o gene 12S DNAr, o nível de variabilidade intraespecífica de
seqüências entre carrapatos R. sanguineus da Espanha, Portugal, França e Zimbabwe pareceu
ser extremamente baixo (BEATI e KEIRANS, 2001), enquanto Bernasconi et al. (2002)
observaram variabilidade genética de 1,5% entre R. sanguineus de uma área relativamente
pequena como Ticino (Suíça). Especificamente, todas as seqüências 12S DNAr de
R. sanguineus analisadas por Beati e Keirans (2001) foram idênticas. No entanto, as
seqüências de espécimes de R. turanicus da Grécia, Zimbabwe, Israel e França foram
caracterizadas por uma faixa de variabilidade que variou entre 1,5 e 7,7%. Interessantemente,
a seqüência de R. turanicus francês diferiu somente em 2,4% da seqüência de R. sanguineus
(BEATI e KEIRANS, 2001). Segundo os autores, R. turanicus de Israel, Grécia e Zimbabwe
10
pertencem a um grupo (“clade”) distinto do grupo de R. sanguineus e R. turanicus franceses.
Desde que R. sanguineus tem sido considerado como único representante do gênero na
América do Sul, houve, até agora, pouco incentivo para se procurar outras espécies. Tal tarefa
parece ser complicada visto que a seqüência de DNAr 12S de espécies morfologicamente
praticamente idênticas a R. sanguineus, como R. turanicus, são caracterizadas por um alto
nível de variabilidade, indicando que a morfologia parecida com a de R. turanicus pode
mascarar um espectro de espécies distintas (BEATI e KEIRANS, 2001).
As descobertas recentes de que algumas populações de R. sanguineus da América do
Sul apresentam relação com R. turanicus e R. sanguineus de outros países (OLIVEIRA et al.,
2005; SZABÓ et al., 2005) levantam mais intriga sobre esse problema obscuro. Isso significa
que o “status” taxonômico de R. sanguineus nas Américas se tornou mais questionável desde
que é possível que a linhagem que se estabeleceu tenha derivado de R. turanicus
possivelmente introduzido nessas regiões com os cães (IOFFE-USPENSKY et al., 2005).
11
3 METODOLOGIA
3.1 Locais de Desenvolvimento da Pesquisa
Este trabalho de pesquisa foi desenvolvido nos seguintes laboratórios. Laboratório de
Ixodologia (LABIXOD) da Estação para Pesquisas Parasitológicas W. O. Neitz,
Laboratório de Biologia Molecular (LABMOL) e Laboratório de Acarologia, todos esses
pertencentes ao Departamento de Parasitologia Animal (DPA), do Instituto de Veterinária
(IV), da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), localizada na Rodovia BR
465, km 7, Rio de Janeiro – Brasil. Laboratório de Genética e Bioquímica e Laboratório de
Genoma da EMBRAPA - Agrobiologia localizada no km 7 da Rodovia BR 465, Rio de
Janeiro – Brasil.
3.2 Origem das Fêmeas e Obtenção das Larvas de R. sanguineus
3.2.1 Origem dos espécimes
Os espécimes, fêmeas ingurgitadas vivas ou larvas já preservadas em etanol 70% (no
caso de Rondônia), foram gentilmente encaminhados por SEDEX por vários colegas
pesquisadores de diferentes localidades do país (Tabela 1). As fêmeas ingurgitadas foram
coletadas após se desprenderem naturalmente de cães domésticos (Canis familiaris), ou
retiradas diretamente dos animais.
A identidade dos carrapatos foi confirmada morfologicamente seguindo-se as chaves
dicotômicas de Rageau (1953), Gil-Collado et al. (1979) e Walker et al. (2000).
Tabela 1: Origem dos espécimes de Rhipicephalus sanguineus do Brasil.
ESTADO / REGIÃO LOCALIDADE COORDENADAS COLETOR DATA
1
o
17` 49`` S Pará / Norte Castanhal
47
o
55` 19`` W
Dra. Alessandra Scofield Amaral 22/03/07
5
o
11` 15`` S Rio Grande do Norte / Nordeste Mossoró
37
o
20` 38`` W
Dra. Silvia Maria Mendes Ahid 14/03/07
8
o
45` 34`` S Rondônia / Norte Porto Velho
63
o
54` 24`` W
Dr. Fábio Barbieri 27/03/07
16
o
40` 46`` S Goiás / Centro-Oeste Goiânia
49
o
15` 18`` W
Dra. Lígia Borges 20/03/07
20
o
26` 40`` S Mato Grosso do Sul / Centro-Oeste Campo Grande
54
o
38` 51`` W
Dra. Carina Elisei e Dra. Renata
Madureira
16/02/07
20
o
45` 46`` S Espírito Santo / Sudeste Alegre
41
o
32` 01`` W
Dra. Isabela Martins 11/05/07
22
o
53` 59`` S Rio de Janeiro / Sudeste Rio de Janeiro
43
o
34` W
Leonardo Burlini e Graziela Savastano 29/04/07
3.2.2 Obtenção das larvas
As fêmeas após terem sido lavadas em solução de hipoclorito de sódio a 2%, e
posteriormente em H
2
O destilada corrente, e secas, foram acondicionadas em placas de Petri e
mantidas em câmara climática tipo BOD a temperatura de 27±1
º
C e umidade relativa de
80±10% para efetuarem postura. As larvas, após 15 dias da eclosão, em jejum, foram fixadas
e preservadas em frascos de vidro contendo etanol 70% onde permaneceram em temperatura
ambiente. Foram utilizados 100 mg de larvas em jejum provenientes de fêmeas ingurgitadas
de R. sanguineus.
12
3.3 Obtenção das Sequências de DNA Ribossomal Mitocondrial (DNAr-mt) 12S e 16S
das Larvas de R. sanguineus.
3.3.1 Extração do DNA
O DNA foi extraído de uma amostra de 100 mg de larvas (≈ 500 larvas) de
R. sanguineus de uma única fêmea por localidade. As amostras foram individualizadas em
tubos de microcentrífuga tipo eppendorf de 1,5 ml e procederam-se duas lavagens por
centrifugação a 1500 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos com 500 µl de solução
salina de tampão fosfato (PBS) gelada (pH 7,2), em microcentrífuga (eppendorf, Centrifuge
5415D). Após a lavagem, a solução sobrenadante de PBS foi retirada do tubo por aspiração;
posteriormente adicionou-se 180 µl de tampão de lise (Buffer ATL) do kit de extração
QIAamp
®
DNA Mini Kit (Qiagen). Posteriormente, as larvas foram maceradas dentro do tubo
com auxílio de uma ponteira estéril de 1 ml com a ponta queimada, que serviu de pistilo, e
nitrogênio líquido. Para isso, o tubo contendo as larvas em tampão de lise era tampado,
rapidamente submerso em nitrogênio líquido e posteriormente o material congelado dentro do
tubo era macerado com o “pistilo”. Este procedimento foi repetido até que o conteúdo do tubo
se tornasse turvo e homogêneo, indicando a maceração da maioria das larvas. Em seguida
adicionou-se 20 µl de proteinase K aos tubos, para digestão proteolítica. Procedeu-se então
rápida agitação em vortex e então as amostras foram incubadas a 56
º
C “overnight”. A partir
deste ponto, o DNA total foi isolado com o kit de extração QIAamp
®
DNA Mini Kit
(Qiagen), seguindo-se as recomendações do fabricante. A extração de DNA foi avaliada
através de eletroforese em gel de agarose 0,7% (durante aproximadamente 1 hora a 100 volts,
140 mA e 13 watts), utilizando-se 2 µl de tampão de aplicação (“loading”) mais 3 µl de 1 Kb
Plus DNA Ladder (Life Technologies, USA) (≈ 250 ng) ou 5 µl de amostra de DNA. Os
ácidos nucleicos foram corados com brometo de etídeo por 5 minutos e depois o gel foi
deixado por 20 minutos em bandeja com H
2
O destilada em agitador para descorar. O gel foi
visualizado sob iluminação ultravioleta (UV) e fotografado (Gel Logic 100 Imaging System,
Kodak 1D 3.6).
3.3.2 Amplificação do DNA
A amplificação do DNA pela reação de polimerase em cadeia (PCR) foi utilizada para
amplificar regiões dos genes 12S e 16S DNAr-mt, utilizados como marcadores. Foram
utilizados 2 iniciadores (“primers”) para cada gene (F forward, R reverse) e as posições
descritas correspondem a sequência do DNA mitocondrial de R. sanguineus
(AF081829/NC002074), que contém 14.710 pb (BLACK IV e ROEHRDANZ, 1998). Para o
gene 12S DNAr-mt, os iniciadores utilizados para a amplificação de um fragmento, entre as
posições 8089 e 8483 pares de bases (pb) do genoma mitocondrial, de aproximadamente 400
pb, o que representa aproximadamente 57% do tamanho total do gene que é de 686 pb, foram:
F, 5`-AAA CTA GGA TTA GAT ACC CTA TTA TTT TAG-3`; R, 5`-CTA TGT AAC GAC
TTA TCT TAA TAA AGA GTG-3` (SZABÓ et al., 2005). Para o gene 16S DNAr-mt, os
iniciadores utilizados para a amplificação de um fragmento de aproximadamente 340 pb, entre
as posições 7333 e 7670, o que representa aproximadamente 28% do tamanho total do gene
que é de 1189 pb, foram: F, 5`-CTG CTC AAT GAT TTT TTA AAT TGC TGT GG-3`; R,
5`-TTA CGC TGT TAT CCC TAG AG-3` (BLACK IV e PIESMAN, 1994). Todas as
reações de PCR foram processadas em um volume final de 50 µl. O protocolo da PCR e as
condições dos ciclos foram as seguintes. Cada 50 µl de solução de reação continha 5 µl de
tampão 10X, 4µl de dNTP (representando 10 mM, 2,5 mM de cada dNTP), 1 µl de cada
iniciador (a 10 pmol/µl), 0,25 µl de Taq DNA polimerase 5 U, e 5 µl de DNA extraído de
13
carrapato, além de água de PCR, para ajustar até o volume final de reação, e MgCl
2
(25 mM).
As amplificações foram processadas em tubos de reação de 0,5 ml usando o termociclador
Mastercycler Gradient (eppendorf, Hamburg, Alemanha). Uma fase inicial de desnaturação do
DNA a 94
º
C por 2 minutos foi seguida por 35 ciclos de 45 segundos a 94
º
C, 45 segundos, para
anelamento dos iniciadores, a 55
º
C e 45 segundos, para extensão dos iniciadores, a 72
º
C. Uma
fase final de extensão de 7 minutos a 72
º
C foi realizada ao final dos 35 ciclos. Controles
negativos, sem DNA, sempre foram processados simultaneamente. Cinco microlitros da
solução de reação foram examinados por eletroforese em gel de agarose a 1% (100 volts por
45 minutos) corado com brometo de etídeo. O marcador (1 Kb Plus DNA Ladder) e o tampão
de corrida (“load”) foram utilizados da mesma forma (quantidade) como descrito no item
Extração do DNA, assim como o gel foi corado, visualizado e fotografado.
3.3.3 Seqüenciamento do DNA
O DNA amplificado foi sequenciado diretamente do produto da PCR após
precipitação do mesmo pelo seguinte protocolo de purificação para sequenciamento. Utilizou-
se 32 µl do produto da PCR, 8 µl de NaCl (5M) e 40 µl de PEG 8000 (22%), em tubos de 1,5
ml, a solução foi homogeneizada suavemente através de movimentos de inversão do tubo e
acondicionada em geladeira a 4
º
C por uma noite. No dia seguinte, o material foi centrifugado
a 13.200 rpm por 15 minutos a 4
º
C, descartou-se o sobrenadante e lavou-se os tubos com 500
µl de etanol 70%, eliminando-se o etanol ao final. Por fim, ressuspendeu-se o precipitado em
20 µl de H
2
O para PCR e estocou-se a -20
º
C.
Antes do sequenciamento, 2 µl da ressuspensão referida acima foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídeo, da mesma forma que para
a PCR.
A sequência de DNA foi determinada pelo sequenciamento em seqüenciador Mega
Bace 1000 com o kit de seqüenciamento DYEnamic TM ET Dye terminator (Pharmacia
Biotech) usando os mesmos iniciadores da PCR (1 µl na concentração de 5 pmol/µl).
3.3.4 Alinhamento das seqüências e inferências sobre variabilidade
Após o seqüenciamento dos fragmentos dos genes 12S e 16S RNAr, as seqüências
obtidas (“forward” e “reverse”), para cada um dos genes, foram alinhadas a fim de obtermos
uma seqüência consenso. As seqüências consenso foram obtidas através das análises diretas
dos eletroferogramas pelo programa Phred phrap ou manualmente utilizando as seqüências
disponibilizadas pelo seqüenciador Mega Bace 1000 usando o MEGA para montar o
consenso.
As seqüências consenso obtidas das amostras em estudo, previamente depositadas em
banco de dados públicos (GenBank) através da utilização do programa de computador Sequin
Application (versão 7.90), e as seqüências de DNAr-mt 12S e 16S de outros ixodídeos
disponíveis no GenBank que também foram usadas para análises comparativas (tabela 2)
foram alinhadas usando-se Clustal W (THOMPSON et al., 1994).
As relações de semelhança foram analisadas usando-se métodos de distância
(“neighbor-joining”) e máxima parsimônia. Todas as análises de distância foram realizadas
com o programa de computador MEGA 4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão
4.0, TAMURA et al., 2007). Foram geradas árvores pelo método “neighbor-joining”
(SAITOU e NEI, 1987) de medidas de distância de Kimura-2-parâmetros (KIMURA, 1980)
também usando MEGA. O método Kimura-2-parâmetros foi usado seguindo-se as diretrizes
de Jin e Nei (1990) e Kumar et al. (1993), que é recomendado quando d < 0.30, como
aconteceu para todas as comparações das sequências com “pairwise deletion”. Também foram
14
examinadas as topologias das árvores geradas por “neighbor-joining” usando distâncias
Tamura-Nei (TAMURA e NEI, 1993) e correções gama (α = 0.5) para a distância Tamura-
Nei. O suporte para a topologia do “neighbor-joining” foi testado por “bootstrapping” sobre
1000 replicações (FELSENSTEIN, 1985) e uso do teste do erro padrão de comprimentos de
ramo interior (RZHETSKY e NEI, 1992; KUMAR et al., 1993).
As análises de máxima parsimônia também foram realizadas, usando o programa de
computador MEGA 4, apenas para confrontar com os dados gerados por “neighbor-joining” e
confirmá-los.
Tabela 2: Seqüências de DNAr-mt 12S e 16S e seus respectivos códigos de acesso no
GenBank, e dados das publicações referentes a Rhipicephalus sanguineus e
Rhipicephalus turanicus.
ESPÉCIES GENE FONTE ORIGEM
GEOGRÁFICA
C
ÓDIGO DE ACESSO NO
GENBANK
R
EFERÊNCIA
R. sanguineus 12S DNAr-mt Canis familiaris França AF150020 Beati e Keirans,
2001
R. sanguineus 12S DNAr-mt Jerusalem, Israel U95915 Norris et al., 1999
R. sanguineus 12S DNAr-mt Canis familiaris/colônia Argentina AY559841 Szabó et al., 2005
R. sanguineus 12S DNAr-mt Canis familiaris/colônia São Paulo, Brasil AY559842 Szabó et al., 2005
R. sanguineus 12S DNAr-mt Colônia de laboratório Cairo, Egito AF133056 Murrell et al.,
2000
R. sanguineus 12S DNAr-mt Taiwan e Kinmen DQ003004 Tsai, 2006
R. sanguineus 12S DNAr-mt Tailândia AY987377 Matsumoto et al.,
2005
R. sanguineus 12S DNAr-mt Uruguai AY559843 Szabó et al., 2004
R. turanicus 12S DNAr-mt Hospedeiro desconhecido Israel AF150015 Beati e Keirans,
2001
R. turanicus 12S DNAr-mt Hospedeiro desconhecido Israel AF150014 Beati e Keirans,
2001
R. turanicus 12S DNAr-mt Hospedeiro desconhecido Israel AF150013 Beati e Keirans,
2001
R. turanicus 12S DNAr-mt Capra hircus Zimbabwe AF150017 Beati e Keirans,
2001
R. turanicus 12S DNAr-mt Equus caballus França AF150018 Beati e Keirans,
2001
R. turanicus 12S DNAr-mt Jerusalem, Israel U95916 Norris et al., 1999
R. turanicus 12S DNAr-mt Konya, Turquia AF133057 Murrell et al.,
2000
R. turanicus 12S DNAr-mt Zâmbia DQ849232 Mtambo et al.,
2007
R. sanguineus 16S DNAr-mt Jerusalem, Israel L34302 Norris et al., 1999
R. sanguineus 16S DNAr-mt Colônia de laboratório Espanha Z97884 Mangold et al.,
1998ª
R. sanguineus 16S DNAr-mt Taiwan e Kinmen AY883880 Tsai, 2005
R. sanguineus 16S DNAr-mt Taiwan e Kinmen AY883863 Tsai, 2005
R. sanguineus 16S DNAr-mt Tailândia DQ016293 Matsumoto et al.,
2005
R. turanicus 16S DNAr-mt Jerusalem, Israel L34303 Norris et al., 1999
R. turanicus 16S DNAr-mt Colônia de laboratório Espanha Z97885 Mangold et al.,
1998a
R. sanguineus DNAr-mt completo Oklahoma, EUA AF081829/NC002074 Black IV e
Roehrdanz, 1998
15
4 RESULTADOS
4.1 Extração do DNA de Larvas de R. sanguineus
A extração do DNA de larvas de R. sanguineus consistiu em uma das etapas
fundamentais deste estudo, apesar dos conhecimentos disponíveis na literatura. A maioria dos
estudos moleculares com carrapatos utiliza formas adultas e portanto descreve a metodologia
considerando esse estágio de desenvolvimento do carrapato. Ao trabalhar com larvas, alguns
dos procedimentos descritos na metodologia precisaram ser testados e padronizados para
produzirem resultados satisfatórios, como a quantidade de larvas a ser utilizada e a questão da
maceração das mesmas, por exemplo. O DNA total extraído a partir de amostras de larvas,
apresentado na figura 1, foi observado para posterior realização da PCR.
Vale comentar que também recebemos amostra de larvas, já fixadas em etanol 70%, de
Jaboticabal, São Paulo, enviada pelo Dr. Matias Pablo Juan Szabó; mas infelizmente, mesmo
após diversos testes com diferentes protocolos de extração de DNA, não foi possível extraí-lo.
Em função disso, resolvemos excluir a amostra do estudo.
GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
1.650
2.000
1.000
500
ESMN
GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
1.650
2.000
1.000
500
ESMN
Figura 1: Extratos de DNA total de larvas de Rhipicephalus sanguineus. M) Marcador de
pares de bases – 1 Kb Ladder; N) controle negativo. Amostras analisadas de diferentes
estados do Brasil: ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
4.2 Amplificação do DNA de Larvas de R. sanguineus
O DNA extraído de todas as amostras de larvas de R. sanguineus foi amplificado com
sucesso na presença dos iniciadores.
A análise dos produtos de amplificação por eletroforese mostrou a presença de bandas
de aproximadamente 390 pb para o gene 12S (figura 2) e 331 pb para o gene 16S (figura 3).
16
ES GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
2.000
1.650
1.000
500
M
12S DNAr
390 pb.
N
ES GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
2.000
1.650
1.000
500
M
12S DNAr
390 pb.
N
Figura 2: Produtos de amplificação de DNA de larvas de Rhipicephalus sanguineus com
iniciadores do gene 12S RNAr. M) Marcador de pares de bases – 1 Kb Plus DNA Ladder; N)
controle negativo da reação sem DNA. Amostras analisadas de diferentes estados do Brasil:
ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
ES GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
2.000
1.650
1.000
500
M
16S DNAr
331 pb.
N
ES GO PA RO MS RJ RN
pb
12.000
5.000
2.000
1.650
1.000
500
M
16S DNAr
331 pb.
N
Figura 3: Produtos de amplificação de DNA de larvas de Rhipicephalus sanguineus com
iniciadores do gene 16S RNAr. M) Marcador de pares de bases – 1 Kb Plus DNA Ladder; N)
controle negativo da reação sem DNA. Amostras analisadas de diferentes estados do Brasil:
ES, GO, PA, RO, MS, RJ e RN.
4.3 Sequenciamento
Após o seqüenciamento dos fragmentos dos genes 12S e 16S RNAr, foram obtidas
quatro seqüências (duas “forward” e duas “reverse”) para cada um dos genes, que deram
origem a uma seqüência consenso.
De todas as sete amostras de R. sanguineus do Brasil que amplificaram anteriormente,
foi possível a obtenção de seqüências de DNA para ambos os genes amplificados. O
comprimento médio das seqüências consenso foi de 348,7 pb para o gene 12S RNAr e 287,6
pb para o gene 16S RNAr. O comprimento das seqüências obtidas no presente estudo está
compatível com o daquelas relatadas por outros autores (NORRIS et al., 1996, 1999;
BERNASCONI et al., 2002; SZABÓ et al., 2005).
Na tabela 3 podem ser vistos os tamanhos em número de bases das seqüências obtidas
no presente estudo e os códigos de depósito no GenBank.
17
Tabela 3: Comprimento dos fragmentos dos genes 12S e 16S RNAr de larvas de
Rhipicephalus sanguineus de diferentes localidades do Brasil e respectivos códigos de
depósito no GenBank.
ORIGEM GENE PARES DE BASES CÓDIGO DE DEPÓSITO NO GENBANK
12S RNAr 324 pb EU346676 Espírito Santo
16S RNAr 300 pb EU346683
12S RNAr 390 pb EU346681 Goiás
16S RNAr 331 pb EU346688
12S RNAr 332 pb EU346677 Mato Grosso do Sul
16S RNAr 227 pb EU346684
12S RNAr 383 pb EU346679 Pará
16S RNAr 328 pb EU346686
12S RNAr 322 pb EU346680 Rio de Janeiro
16S RNAr 242 pb EU346687
12S RNAr 352 pb EU346678 Rio Grande do Norte
16S RNAr 269 pb EU346685
12S RNAr 338 pb EU346675 Rondônia
16S RNAr 316 pb EU346682
4.4 Comparação das Seqüências de 12S e 16S DNAr-mt dos Isolados de Carrapatos de
Diferentes Localidades do Brasil
As seqüências consensos de parte dos genes 12S e 16S DNAr-mt estão apresentadas
nas figuras 4 e 5.
Figura 4: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos (5`- 3`) do gene 12S RNAr de
R. sanguineus de diferentes regiões do Brasil. Um ponto indica que a seqüência nesse ponto é
idêntica à seqüência do topo. Um hífen indica um “gap” no alinhamento.
18
Figura 5: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos (5`- 3`) do gene 16S RNAr de
R. sanguineus de diferentes regiões do Brasil. Um ponto indica que a seqüência nesse ponto é
idêntica a seqüência do topo. Um hífen indica um “gap” no alinhamento.
As diferenças entre as seqüências consenso de 12S RNAr de R. sanguineus das
diferentes regiões podem ser observadas na tabela 4; vale destacar que a amostra de
R. sanguineus oriunda do Espírito Santo apresentou maior diversidade genética, de 5,5 a 6,6%
(correspondente a variação de 15 a 18 nucleotídeos) em comparação às demais amostras
brasileiras.
As diferenças entre as seqüências consenso de 16S RNAr de R. sanguineus das
diferentes regiões estão na tabela 5.
Quando utilizado o gene 16S RNAr, a amostra do Espírito Santo apresentou menor
divergência em relação as demais localidades (Tabela 5). Neste gene, o destaque pode ser
dado à amostra do Rio de Janeiro que apresentou os maiores valores para diferenças absolutas
de nucleotídeos (4-6) em relação às demais seqüências. O número de seqüências com
identidade de 100% foi maior que o obtido com o gene 12S RNAr, conforme pode ser visto
na tabela 5.
Vale destacar que em ambas as análises as amostras do Rio Grande do Norte e do Pará
apresentaram 100% de similaridade entre si.
Tabela 4: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de divergência
de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo Kimura-2-
parâmetros, do gene 12S RNAr-mt dos 7 isolados de R. sanguineus de diferentes estados.
Amostras de 12S RNAr de R. sanguineus oriundos
de diferentes Estados
ES GO PA RO MS RJ RN
Espírito Santo (ES) 0.065 0.055 0.065 0.066 0.055 0.055
Goiás (GO)
18
0.007 0.011 0.022 0.011 0.011
Pará (PA)
15 2
0.011 0.015 0.004 0.000
Rondônia (RO)
18 3 3
0.018 0.007 0.015
Mato Grosso do Sul (MS)
18 6 4 5
0.011 0.015
Rio de Janeiro (RJ)
15 3 1 2 3
0.004
Rio Grande do Norte (RN)
15 3 0 4 4 1
19
Note-se que as seqüências 12S oriundas do Pará e do Rio Grande do Norte não
apresentam divergência na análise realizada, já a amostra do Espírito Santo é a com maior
divergência em comparação a todas as demais.
Tabela 5: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de divergência
de seqüências (em itálico), com comparações “pairwise” e uso do logaritmo Kimura-2-
parâmetros, do gene 16S RNAr-mt dos 7 isolados de R. sanguineus de diferentes estados.
Amostras de 16S RNAr de R. sanguineus oriundos
de diferentes Estados
RJ RO MS PA ES GO RN
Rio de Janeiro (RJ) 0,018 0,022 0,027 0,022 0,027 0,027
Rondônia (RO)
4
0,004 0,009 0,009 0,013 0,009
Mato Grosso do Sul (MS)
5 1
0,004 0,004 0,009 0,004
Pará (PA)
6 2 1
0,000 0,004 0,000
Espírito Santo (ES)
5 2 1 0
0,000 0,000
Goiás (GO)
6 3 2 1 0
0,004
Rio Grande do Norte (RN)
6 2 1 0 0 1
Quando as seqüências das amostras de diferentes localidades do Brasil foram
comparadas com algumas de R. sanguineus e R. turanicus depositadas no GenBank, foi
notado, de uma forma geral, que as variações entre as seqüências 12S DNAr e 16S DNAr dos
isolados de R. sanguineus e R. turanicus de diversos países variaram entre 0 e 15,9% (tabela
6) e 0 e 9,8% (tabela 7), respectivamente.
Em relação ao gene 12S, não houve variação entre as seqüências de R. sanguineus do
Rio de Janeiro, São Paulo, Tailândia e Taiwan (0%) e entre as populações do Uruguai, França
e Argentina (0%), sendo em valores percentuais as menores variações intraespecíficas
registradas entre as amostras do Rio Grande do Norte e Rio de Janeiro, São Paulo, Tailândia e
Taiwan (0,4%).
No que se refere às amostras de R. turanicus, através da comparação do gene 12S,
também não houve diferença entre aquelas do Zâmbia e Zimbabwe (0%), sendo observado o
valor de 0,4 % entre os isolados de Israel e Turquia.
Quando as variações interespecíficas foram analisadas em função do gene 12S,
verificou-se um valor de 2,2% entre uma amostra de R. sanguineus do Brasil, Rio Grande do
Norte, e os isolados de R. turanicus africanos (Zambia e Zimbabwe) (tabela 6). Vale ressaltar
que a maior divergência intraespecífica observada foi de 15,9% entre R. sanguineus do
Espírito Santo e a seqüência de Israel. Note-se também, através da tabela 6, que as seqüências
de R. sanguineus oriundas de Taiwan, Tailândia, São Paulo e Rio de Janeiro; as de
R. turanicus de Zâmbia e Zimbabwe; e aquelas oriundas de R. sanguineus da França,
Argentina e Uruguai não apresentam divergência na análise realizada entre estes. Por outro
lado, R. sanguineus de Israel e do Espírito Santo apresentaram a maior divergência em
comparação a todas as demais.
As análises por “neighbor-joining” para o gene 12S produziram a árvore mostrada na
figura 6. Também foram feitas análises baseadas em máxima parsimônia produzindo árvore
com topologia e suporte para as ramificações interiores similares ao encontrado na árvore
produzida por “neighbor-joining” (figura 8, Anexo).
Considerando o gene 16S, as menores variações intraespecíficas foram observadas
entre as seqüências de R. sanguineus do Rio Grande do Norte e Espírito Santo, Pará e Goiás
(0,5%); Pará e Espírito Santo (0,4%); Rio Grande do Norte e Mato Grosso do Sul, Tailândia e
Taiwan (0,4%). Não foram observadas diferenças entre as seqüências de Goiás e Espírito
20
Santo; entre a de Mato Grosso do Sul, Tailândia e Taiwan; entre a de Tailândia e Taiwan; e
entre a dos Estados Unidos e Espanha.
A maior divergência intraespecífica detectada foi entre R. sanguineus do Rio de
Janeiro e as seqüências dos Estados Unidos e Espanha (9%). Vale ressaltar que variações
entre seqüências interespecíficas, como por exemplo, entre R. sanguineus do Rio Grande do
Norte e R. turanicus espanhol (7,7%), obtiveram valores inferiores (tabela 7). As análises por
“neighbor-joining” considerando o gene 16S produziram a árvore mostrada na figura 7.
Também foram feitas análises baseadas em máxima parsimônia produzindo árvore com
topologia e suporte para as ramificações interiores similares ao encontrado na árvore
produzida por “neighbor-joining” (figura 9, Anexo).
21
Tabela 6: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de divergência de seqüências (em itálico), com comparações
“pairwise” e uso do logaritmo Kimura-2-parâmetros, do gene 12S RNAr-mt de 24 isolados de R. sanguineus (R.s) e R. turanicus (R.t) de
diferentes origens.
ORIGEM DOS
ISOLADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1. R. s. (ES) 0,065 0,072 0,065 0,065 0,058 0,058 0,058 0,054 0,054 0,076 0,076 0,116 0,108 0,112 0,141 0,123 0,138 0,138 0,138 0,141 0,138 0,138 0,159
2. R. s. (GO)
18
0,014 0,011 0,022 0,011 0,011 0,011 0,011 0,011 0,029 0,029 0,069 0,061 0,065 0,094 0,076 0,091 0,091 0,091 0,094 0,098 0,091 0,112
3. R. s. (PA)
20 4
0,018 0,029 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,036 0,036 0,076 0,069 0,072 0,101 0,083 0,098 0,098 0,098 0,101 0,105 0,098 0,119
4. R. s. (RO)
18 3 5
0,018 0,007 0,007 0,007 0,007 0,014 0,032 0,032 0,072 0,065 0,069 0,098 0,080 0,094 0,094 0,094 0,098 0,102 0,094 0,116
5. R. s. (MS)
18 6 8 5
0,011 0,011 0,011 0,011 0,014 0,036 0,036 0,076 0,069 0,073 0,102 0,084 0,099 0,099 0,099 0,102 0,106 0,099 0,120
6. R. s. Taiwan
16 3 5 2 3
0,000 0,000 0,000 0,004 0,025 0,025 0,065 0,058 0,061 0,091 0,072 0,087 0,087 0,087 0,091 0,095 0,087 0,108
7. R. s. Tailândia
16 3 5 2 3 0
0,000 0,000 0,004 0,025 0,025 0,065 0,058 0,061 0,091 0,072 0,087 0,087 0,087 0,091 0,095 0,087 0,108
8. R. s. (SP)
16 3 5 2 3 0 0
0,000 0,004 0,025 0,025 0,065 0,058 0,061 0,091 0,072 0,087 0,087 0,087 0,091 0,095 0,087 0,108
9. R. s. (RJ)
15 3 5 2 3 0 0 0
0,004 0,025 0,025 0,065 0,058 0,062 0,091
0,073 0,087 0,087 0,087 0,091 0,095 0,087 0,109
10. R. s. (RN)
15 3 5 4 4 1 1 1 1
0,022 0,022 0,062 0,054 0,058 0,087 0,069 0,084 0,084 0,084 0,087 0,091 0,084 0,105
11. R. t. Zâmbia
21 8 10 9 10 7 7 7 7 6
0,000 0,047 0,047 0,051 0,080 0,062 0,083 0,083 0,083 0,087 0,091 0,076 0,097
12. R. t.
Zimbabwe
21 8 10 9 10 7 7 7 7 6 0
0,047 0,047 0,051 0,080 0,062 0,083 0,083 0,083 0,087 0,091 0,076 0,097
13. R. t. Israel 35
32 19 21 20 21 18 18 18 18 17 13 13
0,014 0,018 0,051 0,033 0,054 0,054 0,054 0,061 0,065 0,047 0,072
14. R. t. Turquia
30 17 19 18 19 16 16 16 16 15 13 13 4
0,004 0,047 0,025 0,043 0,043 0,043 0,051 0,054 0,036 0,061
15. R. t. Israel 1
31 18 20 19 20 17 17 17 17 16 14 14 5 1
0,047 0,025 0,047 0,047 0,047 0,054 0,058 0,040 0,065
16. R. t. Israel
39 26 28 27 28 25 25 25 25 24 22 22 14 13 13
0,014 0,073 0,073 0,073 0,080 0,084 0,069 0,083
17. R. t. Israel 63
34 21 23 22 23 20 20 20 20 19 17 17 9 7 7 4
0,058 0,058 0,058 0,065 0,069 0,055 0,076
18. R. s. França
38 25 27 26 27 24 24 24 24 23 23 23 15 12 13 20 16
0,000 0,000 0,007 0,011 0,022 0,054
19. R. s.
Argentina
38 25 27 26 27 24 24 24 24 23 23 23 15 12 13 20 16 0
0,000 0,007 0,011 0,022 0,054
20. R. s. Uruguai
38 25 27 26 27 24 24 24 24 23 23 23 15 12 13 20 16 0 0
0,007 0,011 0,022 0,054
21. R. s. Egito
39 26 28 27 28 25 25 25 25 24 24 24 17 14 15 22 18 2 2 2
0,011 0,029 0,054
22. R. s. EUA
28 27 29 28 29 26 26 26 26 25 25 25 18 15 16 23 19 3 3 3 3
0,033 0,065
23. R. t. França
38 25 27 26 27 24 24 24 24 23 21 21 13 10 11 19 15 6 6 6 8 9
0,061
24. R. s. Israel
44 31 33 32 33 30 30 30 30 29 27 27 20 17 18 23 21 15 15 15 15 18 17
22
Tabela 7: Matriz de diferenças absolutas de nucleotídeos (em negrito) e matriz de divergência de seqüências (em itálico), com comparações
“pairwise” e uso do logaritmo Kimura-2-parâmetros, do gene 16S RNAr-mt de 15 isolados de R. sanguineus (R.s) e R. turanicus (R.t.) de
diferentes origens.
ORIGEM DOS ISOLADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1. R. s. (RJ)
0,009 0,013 0,013 0,013 0,013 0,018 0,022 0,027 0,018 0,058 0,090 0,090 0,094 0,098
2. R. s. (RO)
2
0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,013 0,018 0,013 0,049 0,086 0,086 0,090 0,094
3. R. s. Tailândia
3 2
0,000 0,000 0,000 0,009 0,009 0,009 0,004 0,040 0,076 0,077 0,081 0,085
4. R. s. Taiwan/Kinmem
3 2 0
0,000 0,000 0,009 0,009 0,009 0,004 0,040 0,076 0,077 0,081 0,085
5. R. s. Taiwan/Kinmem
3 2 0 0
0,000 0,009 0,009 0,009 0,004 0,040 0,077 0,077 0,081 0,085
6. R. s. (MS)
3 2 0 0 0
0,009 0,009 0,009 0,004 0,040 0,076 0,077 0,081 0,085
7. R. s. (PA)
4 2 2 2 2 2
0,004 0,009 0,005 0,041 0,077 0,077 0,081 0,086
8. R. s. (ES)
5 3 2 2 2 2 1
0,000 0,005 0,041 0,077 0,078 0,082 0,086
9. R. s. (GO)
6 4 2 2 2 2 2 0
0,005 0,045 0,077 0,078 0,082 0,086
10. R. s. (RN)
4 3 1 1 1 1 1 1 1
0,036 0,072 0,072 0,077 0,081
11. R. s. Israel
13 11 9 9 9 9 9 9 10 8
0,054 0,054 0,058 0,063
12. R. s. Espanha
20 19 17 17 17 17 17 17 17 16 12
0,000 0,022 0,081
13. R. s. EUA-Oklahoma
20 19 17 17 17 17 17 17 17 16 12 0
0,023 0,077
14. R. t. Espanha
21 20 18 18 18 18 18 18 18 17 13 5 5
0,072
15. R. t. Israel
22 21 19 19 19 19 19 19 19 18 14 18 17 16
23
R. sanguineus (ES) EU346676
R. sanguineus (GO) EU346681
R. sanguineus (PA) EU346679
R. sanguineus (RO) EU346675
R. sanguineus (MS) EU346677
R. sanguineus Taiwan/Kinmen DQ003004
R. sanguineus Tailândia AY987377
R. sanguineus (SP) Brasil AY559842
R. sanguineus (RJ) EU346680
R. sanguineus (RN) EU346678
R. turanicus Zâmbia DQ849232
R. turanicus Zimbabwe AF150017
R. turanicus Israel 35 AF150014
R. turanicus Turquia AF133057
R. turanicus Israel 1 AF150015
R. turanicus Israel U95916
R. turanicus Israel 63 AF150013
R. sanguineus França AF150020
R. sanguineus Argentina AY559841
R. sanguineus Uruguai AY559843
R. sanguineus Egito AF133056
R. sanguineus EUA AF081829
R. turanicus França AF150018
R. sanguineus Israel U95915
R. sanguineus (ES) EU346676
R. sanguineus (GO) EU346681
R. sanguineus (PA) EU346679
R. sanguineus (RO) EU346675
R. sanguineus (MS) EU346677
R. sanguineus Taiwan/Kinmen DQ003004
R. sanguineus Tailândia AY987377
R. sanguineus (SP) Brasil AY559842
R. sanguineus (RJ) EU346680
R. sanguineus (RN) EU346678
R. turanicus Zâmbia DQ849232
R. turanicus Zimbabwe AF150017
R. turanicus Israel 35 AF150014
R. turanicus Turquia AF133057
R. turanicus Israel 1 AF150015
R. turanicus Israel U95916
R. turanicus Israel 63 AF150013
R. sanguineus França AF150020
R. sanguineus Argentina AY559841
R. sanguineus Uruguai AY559843
R. sanguineus Egito AF133056
R. sanguineus EUA AF081829
R. turanicus França AF150018
R. sanguineus Israel U95915
Figura 6: Árvore “neighbor-joining” (sem raíz) do gene 12S RNAr, usando distância Kimura-
2-parâmetros. Os números representam a percentagem de suporte de “bootstrap”.
As análises através dos parâmetros utilizados para construção da árvore apresentada na
figura 6 proporcionaram uma forte sustentação (97%) para o grupamento (“cluster”) contendo
R. sanguineus argentino, uruguaio, francês, americano e outros R. sanguineus mediterrâneos.
Um alto valor de “bootstrap” (100%) sustentou a relação próxima entre R. sanguineus
brasileiros e R. sanguineus da Tailândia e Taiwan e confirmou a proximidade dos isolados
brasileiros com R. turanicus africanos. Além disso, há dois grupos formados por seqüências
obtidas de quatro diferentes populações de R. turanicus de Israel e uma da Turquia. É notável
também a formação de quatro agrupamentos distintos dos isolados brasileiros, sendo as
seqüências de Goiás, Pará e Rondônia pertencentes a um grupo; Mato Grosso do Sul, São
Paulo e Rio de Janeiro mais as amostras asiáticas de R. sanguineus, outro grupo; enquanto que
seqüências oriundas do Espírito Santo e Rio Grande do Norte mantiveram-se cada uma em
um ramo isolado.
24
R. sanguineus (RJ) EU346687
R. sanguineus (RO) EU346682
R. sanguineus Tailândia DQ016293
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883880
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883863
R. sanguineus (MS) EU346684
R. sanguineus (PA) EU346686
R. sanguineus (ES) EU346683
R. sanguineus (GO) EU346688
R. sanguineus (RN) EU346685
R. sanguineus Israel L34302
R. sanguineus Espanha Z97884
R. sanguineus EUA-Oklahoma AF081829
R. turanicus Espanha Z97885
R. turanicus Israel L34303
R. sanguineus (RJ) EU346687
R. sanguineus (RO) EU346682
R. sanguineus Tailândia DQ016293
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883880
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883863
R. sanguineus (MS) EU346684
R. sanguineus (PA) EU346686
R. sanguineus (ES) EU346683
R. sanguineus (GO) EU346688
R. sanguineus (RN) EU346685
R. sanguineus Israel L34302
R. sanguineus Espanha Z97884
R. sanguineus EUA-Oklahoma AF081829
R. turanicus Espanha Z97885
R. turanicus Israel L34303
Figura 7: Árvore “neighbor-joining” (sem raíz) do gene 16S RNAr usando distância Kimura-
2-parâmetros. Os números representam a percentagem de suporte de “bootstrap”.
Na análise usando o gene 16S, os resultados proporcionaram uma forte sustentação
(100%) para o agrupamento (“cluster”) contendo R. sanguineus oriundos do Brasil junto com
aqueles de origem asiática, e evidenciaram uma proximidade de R. sanguineus e R. turanicus
de origem espanhola.
Deve ser notado que a seqüência oriunda do Rio Grande do Norte, quando analisada
em relação a ambos os genes (12S e 16S), manteve-se isolada das demais seqüências do
Brasil, bem como das de outros países.
25
5 DISCUSSÃO
Em relação ao gene 12S DNAr-mt, a variabilidade genética entre R. sanguineus de
algumas regiões do Brasil e em especial entre regiões relativamente próximas do Rio de
Janeiro e Espírito Santo (5,5%) parece ser alta e, de algum modo, surpreendente quando
comparada com o nível de variabilidade intraespecífica das seqüências de R. sanguineus da
Espanha, Portugal, França e Zimbabwe (0%), como observado no trabalho de Beati e Keirans
(2001). Essas observações podem ser interpretadas como uma indicação que carrapatos de
diferentes origens geográficas foram introduzidos em diferentes momentos nessas regiões, e
que esses espécimes foram capazes de se adaptar aos diferentes ambientes.
De acordo com Beati e Keirans (2001), considerando o gene 12S, a divergência
genética limítrofe para aceitação de variações no nível intraespecífico é de 7,8%, valores
superiores indicam relações de caráter interespecífico. Nesse contexto, todos os isolados
brasileiros comparados entre si apresentaram variações menores que 7,8%, podendo ser então,
de acordo com Beati e Keirans (2001), considerados da mesma espécie. Como exemplo, a
diferença entre R. sanguineus do Espírito Santo e Mato Grosso do Sul (6,6%) foi a maior
entre os isolados brasileiros, e de forma comparativa é tão grande quanto a diferença entre
isolados de R. sanguineus de países vizinhos como Egito e Israel (5,4%).
A comparação da diversidade genética entre R. sanguineus brasileiros (0 a 7%) e entre
R. sanguineus de Ticino, Suíça (0 a 1,5%) (BERNASCONI et al., 2002), por Tamura-3-
parâmetros e considerando o gene 12S DNAr, mostra que no Brasil não há uma
homogeneidade genética tão evidente entre as diferentes localidades quanto aquela observada
em Ticino. Essa maior variabilidade de certa forma já era esperada considerando-se a escala
geográfica do Brasil e a grande diversidade de ecosistemas; no entanto, esses resultados se
contrapõem ao que foi observado por Beati e Keirans (2001), ou seja, as populações dos
quatro países estudados eram homogêneas. Uma possível explicação para o fato seria a
origem comum das populações de R. sanguineus estudadas por Beati e Keirans (2001), já que
os fragmentos de gene amplificados pelos autores possuem aproximadamente os mesmos
comprimentos que os amplificados por nós e correspondem a uma porção com características
semelhantes.
Quando analisadas em função do gene 16S RNAr, as amostra de R. sanguineus
brasileiras não apresentam mais tão marcada distância como em relação ao gene 12S RNAr,
possivelmente pelo menor tamanho dos fragmentos amplificados, alinhados e comparados do
gene 16S RNAr, que corresponderam a apenas aproximadamente 28% do tamanho total do
gene, enquanto os fragmentos do gene 12S RNAr corresponderam a aproximadamente 57%
do tamanho total do gene. Também são escassos os depósitos ou publicações de seqüências
16S RNAr de populações de espécies do complexo R. sanguineus, não permitindo portanto
maiores discussões.
Considerando isolados de R. turanicus, além dos isolados de R. sanguineus do Brasil,
vale atentar para alguns pontos. Para R. sanguineus e R. turanicus, oriundos de Jerusalém
(Israel), a divergência de 5,7% entre seqüências do gene 12S RNAr-mt observados por Black
e Piesmam (1994) e Norris et al. (1999) são bem inferiores aos 14,1% observados entre
R. sanguineus do Espírito Santo (Brasil) e R. turanicus de Jerusalém (Israel), por exemplo, o
que ressalta a distância geográfica como possível fator determinante para essa diferença.
Também é importante considerar que a diversidade genética entre R. sanguineus e
R. turanicus de Ticino (BERNASCONI et al., 2002) é menor do que a diversidade observada
entre os isolados de R. sanguineus de diferentes localidades do Brasil, o que é um contra-
senso.
26
A alta porcentagem de similaridade (98,7%), para o gene 16S RNAr, observada entre
R. sanguineus e R. turanicus da Espanha por Mangold et al. (1998a), não foi observada
quando R. sanguineus brasileiros e asiáticos foram comparados com R. turanicus espanhol e
israelense. No entanto, uma alta porcentagem de similaridade (97,7%) pode ser observada
entre R. turanicus espanhol e R. sanguineus de Oklahoma (EUA).
Comparando com Black e Piesmam (1994) e Norris et al. (1999), que observaram
4,3% de divergência entre seqüências do gene 16S RNAr-mt de R. sanguineus e R. turanicus
de Jerusalém (Israel), podemos observar um valor maior na porcentagem de divergência
(9,8%) entre R. sanguineus do Rio de Janeiro (Brasil) e R. turanicus de Jerusalém (Israel),
possivelmente em função da geografia.
Alta divergência intraespecífica de 12S DNAr-mt foi detectada entre isolados de
R. sanguineus do Brasil e isolados da Argentina e Uruguai (GenBank). Por outro lado, uma
forte relação genética foi detectada entre o isolado françês de R. sanguineus e os isolados
argentino e uruguaio, enquanto os isolados brasileiros apareceram mais relacionados com
R. sanguineus asiáticos e R. turanicus africano. Estes resultados corroboram com as
observações relatadas por Szabó et al. (2005), quando trabalharam com isolados de São Paulo
e Argentina, e as complementa. Essa relação genética entre as populações francesa, argentina
e uruguaia pode indicar uma origem comum européia, segundo o autor.
Novamente considerando 7,8% como limítrofe para variações no nível intraespecífico,
estabelecido por Beati e Keirans (2001), considerando o gene 12S, vale enfatizar que
R. turanicus de Zâmbia e Zimbabwe também apresentaram variações menores que 7,8%
quando comparados com R. sanguineus brasileiros, indicando grande proximidade, inclusive
compatível com variação intraespecífica. Por exemplo, a diferença entre a seqüência do Rio
Grande do Norte a as seqüências africanas de R. turanicus há pouco citadas é de apenas 2,2%,
fazendo-os parecem ser de uma única espécie. Já níveis de variabilidade maior que 7,8%
ocorreram, por exemplo, entre isolados do Brasil e de R. turanicus de Israel (U95916) e
França; entre o isolado do Espírito Santo e R. turanicus da Turquia; entre o isolado do
Espírito Santo e R. turanicus de Israel (AF150015, AF150014 e U95916 mais marcadamente
com 14,1%); e entre isolados de Rondônia, Espírito Santo, Mato Grosso do Sul, Pará e
R. turanicus de Israel (AF150013). Esses níveis também ocorreram entre isolados
previamente identificados como sendo representantes de R. sanguineus e a diferença entre as
seqüências (12S rDNA) do Espírito Santo e Israel foi de 15,9%, a maior observada entre todos
os isolados deste estudo.
Vale ainda lembrar e comentar que Zahler et al. (1997) encontraram íntima relação
genética entre R. sanguineus e R. turanicus, compatível com conspecificidade, e diferença de
somente 3 mutações entre espécies bem distintas dentro do complexo R. sanguineus,
indicando que apenas poucas mutações já podem representar barreira de espécies dentro do
complexo R. sanguineus, genotipicamente. Se considerarmos esta afirmação, alguns de nossos
isolados podem ser considerados de espécies diferentes. No entanto, Zahler et al. (1997)
utilizaram um fragmento de gene diferente do que usamos, impossibilitando maior
comparação entre seus dados e os nossos. Porém, o fragmento de gene por ele utilizado
(ITS2) parece ser menos conservado que os que nós utilizamos (12S e 16S), devendo
apresentar maior variabilidade entre isolados.
Segundo Beati e Keirans (2001), todas essas observações, e a já sabida complexidade
para caracterização de espécies dentro do complexo R. sanguineus, sugerem que muitas
espécies crípticas (incluindo R. sanguineus) podem possuir morfologia similar a de
R. turanicus e vice-versa. Sendo assim, a extensão da variabilidade genética e morfológica
dessas linhagens relativamente recentemente desenvolvidas merece ser melhor e mais
estudada, de forma especial e bem cuidadosa na América do Sul, e complementada por
estudos biológicos.
27
Como já abordado anteriormente, diferenças na colonização de países e regiões podem
ter levado a introdução de carrapatos do complexo R. sanguineus de origens diferentes em
cada um(a) deles(as). Por outro lado, condições climáticas e ambientais de cada país e/ou
região podem ter favorecido a sobrevivência de carrapatos de diferentes origens geográficas.
Por último, mas não menos importante, a América do Sul pode ser favorável para especiação
com uma divergência sobre o tempo nas populações introduzidas com a colonização (SZABÓ
et al., 2005).
Os fatos apresentados, junto com uma ampla divergência nas seqüências 12S DNAr
indicam que alguns isolados, previamente identificados como R. sanguineus podem pertencer
a R. turanicus ou vice-versa e essa confirmação se torna bastante difícil uma vez que, em
geral, espécies de Rhipicephalus não apresentam grande quantidade de caracteres
discriminatórios, principalmente essas duas em foco (BEATI e KEIRANS, 2001).
As diferenças entre R. sanguineus e R. turanicus, a princípio identificados como tal, de
várias partes do mundo indicam que existe uma considerável confusão para uma definição
precisa de ambas as espécies. Além do mais, simpatria de R. sanguineus e R. turanicus é
provável ocorrer, como foi descrito no sul da Suíça por Bernasconi et al. (2002).
É possível que certa quantidade de carrapatos esteja sendo introduzida, circulando, se
reproduzindo e se adaptando a viver em áreas onde antes não eram encontrados, como
conseqüência da mobilidade aumentada tanto de pessoas quanto de seus animais de
estimação, em particular cães, pelo mundo, e mudanças climáticas (BERNASCONI et al.,
2002); podendo levar a essa confusão taxonômica e diversidade genética.
Por fim, as diferenças observadas entre os isolados de R. sanguineus do Brasil e
isolados de R. sanguineus e R. turanicus de outros países são algumas vezes maiores e outras
menores do que poderiam previamente ser assumidas e sustentam que o “status”
biossistemático de R. sanguineus, especialmente na América Latina, e de R. turanicus deve
ser visto com cautela e reavaliado de forma mais abrangente utilizando maior número de
informações disponíveis, tanto morfológicas quanto biológicas e moleculares. Assim,
necessitando que um maior número de amostras seja utilizado, maiores estudos de
variabilidade intraespecífica deverão ser levados em consideração.
28
6 CONCLUSÕES
Em decorrência dos resultados obtidos podemos concluir:
Pela primeira vez foram geradas seqüências de fragmentos dos genes 12S e 16S DNAr-mt
de R. sanguineus dos estados brasileiros do Espírito Santo (EU346676 e EU346683),
Goiás (EU346681 e EU346688), Mato Grosso do Sul (EU346677 e EU346684), Pará
(EU346679 e EU346686), Rio de Janeiro (EU346680 e EU346687), Rio Grande do Norte
(EU346678 e EU346685) e Rondônia (EU346675 e EU346682).
As seqüências 12S e 16S DNAr-mt produziram resultados diferentes em relação a
comparação entre os isolados, porém indicam que os representantes de R. sanguineus
presentes nas diversas regiões do Brasil estudadas apresentam relação filogenética com as
sequências de R. sanguineus de Taiwan e Tailândia.
Há diversidade genética entre populações de R. sanguineus oriundas de diferentes regiões
do Brasil.
Embora tenha havido confirmação de distanciamento genético entre R. sanguineus do
Brasil e Argentina pelo 12S DNAr-mt, e relações contrastantes entre as diferentes
populações brasileiras e algumas daquelas depositadas no Genbank, ainda não há
subsídios suficientes para afirmar que R. sanguineus não é a única espécie do gênero
presente no Brasil.
29
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo, através do sequenciamento de fragmentos dos genes 12S e 16S DNAr-mt de
R. sanguineus de diversas regiões do território nacional e do depósito dessas seqüências,
enriqueceu o universo de informações moleculares de isolados brasileiros e irá contribuir para
futuras pesquisas relacionadas a taxonomia, filogenia e estudos de populações dentro do
gênero Rhipicephalus.
Também se deve evidenciar que a descrição genética facilita o diagnóstico objetivo de
espécies, o que é especialmente benéfico para espécies do complexo R. sanguineus, onde
similaridades morfológicas e variações fenotípicas dentro de espécies podem impedir ou
mesmo excluir um diagnóstico de espécie acurado, um problema complicado em estágios pré-
adultos.
Seja qual for o real posicionamento taxonômico de R. sanguineus no Brasil e, em
maior escala, na América do Sul, diferentes populações podem estar associadas com
diferenças no comportamento, biologia e capacidade vetorial do carrapato. A consciência e o
conhecimento dessas diferenças são importantes, já que tal conhecimento pode ser necessário
para o controle de carrapatos e de doenças por eles transmitidas, e é crucial para o
entendimento da epidemiologia e etiologia dos patógenos causadores das doenças em
diferentes localidades.
Por fim, mais estudos envolvendo dados morfológicos, biológicos e moleculares
coletados de um amplo número de amostras de diferentes localidades geográficas são
necessários para clarificar a sistemática de R. sanguineus, especialmente em comparação a
R. turanicus, pois a biologia molecular sozinha, em função da especificidade de informação
que gera, pode muitas vezes tornar certas questões ainda mais complexas e sem resposta clara.
30
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARAGÃO, H. B. Ixodidas brasileiros e de alguns países limítrofes. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 31, n. 4, p. 759-843, 1936.
AVISE, J. C. Mitochondrial DNA and the evolutionary genetics of higher animals.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, v.
313, p. 325-342, 1986.
BARKER, S. C. Distinguishing species and populations of Rhipicephaline ticks with ITS 2
ribosomal RNA. Journal of Parasitology, v. 84, n. 5, p. 887-892, 1998.
BARKER, S. C.; MURRELL, A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus
and species names. Parasitology, v. 129, n. 1, p. S15–S36, 2004.
BEATI, L.; KEIRANS, J.E. Analysis of the systematic relationships among ticks of the
genera Rhipicephalus and Boophilus (Acari: Ixodidae) based on mitochondrial 12S ribosomal
DNA gene sequences and morphological characters. Journal of Parasitology, v. 87, n. 1, p.
32-48, 2001.
BERNASCONI, M. V.; CASATI, S.; PÉTER, O.; PIFFARETTI, J. C.; Rhipicephalus ticks
infected with Rickettsia and Coxiella in Southern Switzerland (Canton Ticino). Infection,
Genetics and Evolution, v. 2, p. 111 – 120, 2002.
BLACK, W. C.; PIESMAN, J. Phylogeny of hard- and soft-tick taxa (Acari: Ixodida) based
on mitochondrial 16S rDNA sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, v. 91, p. 10034-10038, 1994.
BLACK, W. C.; KLOMPEN, J. S. H.; KEIRANS, J. E. Phylogenetic relationships among tick
subfamilies (Ixodida: Ixodidae: Argasidae) based on the 18S nuclear rDNA gene. Molecular
Phylogenetics and Evolution, v. 7, p. 129-144, 1997.
BLACK IV, W. C.; ROEHRDANZ, R. L. Mitochondrial Gene Order is Not Conserved in
Arthropods: Prostriate and Metastriate Tick Mitochondrial Genomes. Molecular Biology and
Evolution, v. 15, n. 12, p. 1772-1785, 1998.
CAMPBELL, N. J. H; BARKER, S. C. An unprecedented major rearrangement in an
arthropod mitochondrial genome. Molecular Biology and Evolution, v. 15, p. 1786–1787,
1998.
CAMPBELL, N. J. H.; BARKER, S. C. The novel mitochondrial gene arrangement of the
cattle tick, Boophilus microplus: five fold tandem repetition of a coding region. Molecular
Biology and Evolution, v. 16, p. 732–740, 1999.
CRAMPTON, A.; McKAY, Y.; BARKER, S. C. Phylogeny of ticks (Ixodida) inferred from
nuclear ribosomal DNA. International Journal for Parasitology, v. 26, p. 511-517, 1996.
FELSENSTEIN, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution, v. 39, p. 783-791, 1985.
GIL-COLLADO, J.; GUILLEN-LLERA, J. L.; ZAPATERO-RAMOS, L. M. Claves para la
identificación de los Ixodoidea españoles. Revista Ibérica de Parasitología, v. 39, p. 107 –
118, 1979.
HOOGSTRAAL, H. Argasid and nuttalliellid ticks as parasites and vectors. Advances in
parasitology, v. 24, p. 135-238, 1985.
IOFFE-USPENSKY, I.; USPESKY, I.; MUMCUOGLU, K.Y.; GALUN, R.
31
Rhipicephalus sanguineus and R. turanicus (Acari: Ixodidae): Numerical indices for
distinguishing between adults of closely relates species in Israel. 5
th
International Conference
on Ticks and Tick-Borne Pathogens. Neuchâtel, Switzerland, 29/08 – 02/09/2005.
IOFFE-USPENSKY, I.; MUMCUOGLU, K.Y.; USPESKY, I.; GALUN, R.
Rhipicephalus sanguineus and R. turanicus (Acari: Ixodidae): Closely Related Species with
Different Biological Characteristics. Jounal of Medical Entomology, v. 34, n. 1, p. 74-81,
1997.
JIN, L.; NEI, M. Limitations of the Evolutionary Parsimony Method of Phylogenetic
Analysis. Molecular Biology and Evolution, v. 7, n. 1, p. 82-102, 1990.
KIMURA, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, v. 16,
n. 2, p. 111-120, 1980.
KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA: molecular evolutionary analysis, version 1.01.
Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, 1993.
MANGOLD, A.J.; BARGUES, M.D.; MAS-COMA, S. Mitocondrial 16S rDNA sequences
and phylogenetic relationship of species of Rhipicephalus and other tick genera among
Metastriata (Acari:Ixodidae). Parasitology Research, v.84, p.478-484, 1998a.
MANGOLD, A.J.; BARGUES, M.D.; MAS-COMA, S. 18S rRNA gene sequences and
phylogenetic relationships of European hard-tick species (Acari: Ixodidae). Parasitology
Research, v.84, p.31-37, 1998b.
McLAIN, D. K.; WESSON, D.; OLIVER, J. H.; COLLINS, F. Variation in ribosomal DNA
internal transcribed spacer I among eastern populations of Ixodes scapularis (Acari:
Ixodidae). Jounal of Medical Entomology, v. 32, p. 351–360, 1995.
MITANI, H.; TALBERT, A.; FUKUNAGA, M. New World Relapsing Fever Borrelia Found
in Ornithodoros porcinus Ticks in Central Tanzania. Microbiology and Immunology, v. 48, n.
7, p. 501-505, 2004.
MURRELL, A. CAMPBELL, N. J. H. BARKER, S. C. Mitochondrial 12S rDNA Indicates
That the Rhipicephalinae (Acari: Ixodida: Ixodidae) Is Paraphyletic. Molecular Phylogenetics
and Evolution, v.12, p.83-86, 1999.
MURRELL, A.; CAMPBELL, N. J. H.; BARKER, S. C. Phylogenetic Analyses of the
Rhipicephaline Ticks Indicate That the Genus Rhipicephalus Is Paraphyletic. Molecular
Phylogenetics and Evolution, v. 16, n. 1, p. 1-7, 2000.
MURRELL, A.; CAMPBELL, N. J. H.; BARKER, S. C. The value of idiosyncratic markers
and changes to conserved tRNA sequences from the mitochondrial genome of hard ticks
(Acari: Ixodida: Ixodidae) for phylogenetic inference. Systematic Biology, v. 52, p. 296–310,
2003.
NAVAJAS, M.; FENTON, B. The application of molecular markers in the study of diversity
in acarology: a review. Experimental and Applied Acarology, v. 24, p. 751–774, 2000.
NORRIS, D. E.; KLOMPEN, J. S. H.; BLACK W. C. Comparison of the mitochondrial 12S
and 16S ribosomal DNA genes in resolving phylogenetic relationships among hard ticks
(Acari : Ixodidae). Annals of the Entomological Society of America, v. 92, n. 1, p. 117-
129, 1999.
NORRIS, D. E.; KLOMPEN, J. S. H.; KEIRANS, J. E.; BLACK IV, W. C. Population
Genetics of Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) Based on Mitochondrial 16S and 12S Genes.
32
Journal of Medical Entomology, v. 33, n. 1, p. 78-89, 1996.
OLIVEIRA, P.R.; BECHARA, G.H.; DENARDI, S.E.; SAITO, K.C.; NUNES, E.T.;
SZABÓ, M.P.J.; MATHIAS, M.I.C. Comparison of external morphology of
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari:Ixodidae) ticks from Brazil and Argentina.
Veterinary Parasitology, v.129, p. 139-147, 2005.
OLIVER Jr, J. H.. Biology and systematics of ticks (Acari: Ixodida). Annual Review of
Ecology and Systematics, v. 20, p. 397-430, 1989.
OLIVER Jr., J. H. Importance of systematics to public health : microbs, and disease. Annals
of the Missouri Botanical Garden, v. 83, n. 1, p. 37-46, 1996.
PAPERNA, I.; GILADI, M. Morphological variability, host range and distribution of ticks of
the Rhipicephalus sanguineus complex in Israel. Annales de ParasitoIogie (Paris), v. 49, n. 3,
p. 357-367, 1974.
PEGRAM, R. G. Biosystematic studies on the genus Rhipicephalus: the R. sanguineus and
R. simus groups (Ixodoidea: Ixodidae). PhD Thesis, Brunel University, Uxbridge, England.
1984.
PEGRAM, R. G.; CLIFFORD, C. M.; WALKER, J. B.; KEIRANS, J. E. Clarification of the
Rhipicephalus sanguineus group (Acari: Ixodoidea: Ixodidae). I. R. sulcatus Neumann, 1908
and R. turanicus Pomerantsev, 1936. Systematic Parasitology, v. 10, p. 3-26, 1987a.
PEGRAM, R. G.; KEIRANS, J. E.; CLIFFORD, C. M.; WALKER, J. B. Clarification of the
Rhipicephalus sanguineus group (Acari: Ixodoidea: Ixodidae). II. R. sanguineus (Latreille,
1806) and related species. Systematic Parasitology, v. 10, p. 27-44, 1987b.
RAGEAU, J. Clés pour l´identification dês tiques du Cameroun. Annales de Parasitologie
Humaine et Comparée, v. 28, p. 5-6, 1953.
RIBEIRO, A.L.; FACCINI, J.L.H.; DAEMON, E. Estudo das variações morfológicas de
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari:Ixodidae) no Brasil. Revista Universidade
Rural Série Ciências da Vida, v.18, n.1-2, p. 25-33, 1996.
RICH, S. M.; CAPORALE, D. A.; TELFORD, S. R.; KOCHER, T. D.; HARTL, D. L.;
SPIELMAN, A. Distribution of the Ixodes ricinus-like ticks of eastern North America.
Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v. 92, p.
6284-6288, 1995.
ROEHRDANZ, R. L.; DEGRUGILLIER, M. E.; BLACK, W. C. IV. Novel rearrangements
of arthropod mitochondrial DNA detected with long-PCR: applications to arthropod
phylogeny and evolution. Molecular Biology and Evolution, v. 19, p. 841–849, 2002.
ROVEDA, R. J. Ixodoidea. Contribución biológica. Revista de Medicina Veterinaria (Buenos
Aires), v. 36, p. 105-119, 1954.
RZHETSKY, A.; NEI, M. A simple method for estimating and testing minimum evolution
trees. Molecular Biology and Evolution, v. 9, p. 945-967, 1992.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, v. 4, n. 4, p. 406-425, 1987.
SHAO, R.; AOKI, Y.; MITANI, H.; TABUCHI, N.; BARKER, S. C.; FUKUNAGA, M. The
mitochondrial genomes of soft ticks have an arrangement of genes that has remained
unchanged for over 400 million years. Insect Molecular Biology, v. 13, n. 3, p. 219–224,
2004.
33
SHAO, R.; BARKER, S. C.; MITANI, H.; AOKI, Y.; FUKUNAGA, M. Evolution of
Duplicate Control Regions in the Mitochondrial Genomes of Metazoa: A Case Study with
Australasian Ixodes Ticks. Molecular Biology and Evolution, v. 22, n. 3, p. 620-629, 2005.
SIMON, C.; FRATI, F.; BECKENBACH, A.; CRESPI, B.; LIU, H.; FLOOK, P. Evolution,
weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and compilation of
conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of
America, v. 87, p. 651-701, 1994.
SZABÓ, M.P.J.; MANGOLD, A.J.; JOÃO, C.F.; BECHARA, G.H.; GUGLIELMONE, A.A.
Biological and DNA evidence of two dissimilar populations of the Rhipicephalus sanguineus
tick group (Acari:Ixodidae) in South America. Veterinary Parasitology, v. 130, p. 131-140,
2005.
TAGLE, I. Presencia accidental de Rhipicephalus sanguineus en un perro de Santiago de
Chile. Agricultura Técnica (Chile), v. 36, p. 137, 1976.
TAMURA, K.; DUDLEY, J.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution,
10.1093/molbev/msm092, 2007.
TAMURA, K.; NEI, M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control
region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution,
v. 10, p. 512-526, 1993.
THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-
specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, n. 22, p. 4673-4680,
1994.
WALKER, J.B.; KEIRANS, J.E.; HORAK, I.G. The genus Rhipicephalus (Acari:Ixodidae): A
guide to the brown ticks of the world. Cambridge: Cambridge University Press, 643 pp, 2000.
WALKER, A. R.; BOUATTOUR, A.; CAMICAS, J.-L.; ESTRADA-PENÃ, A; HORAK, I.
G.; LATIF, A. A.; PEGRAM, R. G.; PRESTON, P. M. Ticks of Domestic Animals in África.
A Guide to Identification of Species. The University of Edinburgh, Bioscience Reports, 221
pp, 2003.
WESSON, D. M.; McLAIN, D. K.; OLIVER, J. H.; PIESMAN, J. Investigation of the
validity of species status of Ixodes dammini (Acari: Ixodidae) using rDNA. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 90, p. 10221-10225,
1993.
ZAHLER, M.; FILIPPOVA, N. A.; MOREL, P. C.; GOTHE, R.; RINDER, H. Relationships
between species of the Rhipicephalus sanguineus group: a molecular approach. Journal of
Parasitology, v. 83, n. 2, p. 302-306, 1997.
ZAHLER, M.; GOTHE, R.; RINDER, H. Genetic evidence against a morphologically
suggestive conspecificity of Dermacentor reticulatus and D. marginatus (Acari: Ixodidae).
International Journal for Parasitology, v. 25, p. 1413-1419, 1995.
34
ANEXO
Árvores Baseadas em Análise de Máxima Parsimônia (MP)
R. sanguineus (ES) EU346676
R. sanguineus (RN) EU346678
R. sanguineus (GO) EU346681
R. sanguineus (PA) EU346679
R. sanguineus (RO) EU346675
R. sanguineus (MS) EU346677
R. sanguineus Tailândia AY987377
R. sanguineus Taiwan/Kinmen DQ003004
R. sanguineus (RJ) EU346680
R. sanguineus (SP) Brasil AY559842
R. turanicus Zâmbia DQ849232
R. turanicus Zimbabwe AF150017
R. sanguineus França AF150020
R. turanicus Israel U95916
R. turanicus Israel 63 AF150013
R. turanicus Turquia AF133057
R. turanicus Israel 1 AF150015
R. turanicus Israel 35 AF150014
R. sanguineus Argentina AY559841
R. sanguineus Uruguai AY559843
R. sanguineus Egito AF133056
R. sanguineus EUA AF081829
R. sanguineus Israel U95915
R. turanicus França AF150018
R. sanguineus (ES) EU346676
R. sanguineus (RN) EU346678
R. sanguineus (GO) EU346681
R. sanguineus (PA) EU346679
R. sanguineus (RO) EU346675
R. sanguineus (MS) EU346677
R. sanguineus Tailândia AY987377
R. sanguineus Taiwan/Kinmen DQ003004
R. sanguineus (RJ) EU346680
R. sanguineus (SP) Brasil AY559842
R. turanicus Zâmbia DQ849232
R. turanicus Zimbabwe AF150017
R. sanguineus França AF150020
R. turanicus Israel U95916
R. turanicus Israel 63 AF150013
R. turanicus Turquia AF133057
R. turanicus Israel 1 AF150015
R. turanicus Israel 35 AF150014
R. sanguineus Argentina AY559841
R. sanguineus Uruguai AY559843
R. sanguineus Egito AF133056
R. sanguineus EUA AF081829
R. sanguineus Israel U95915
R. turanicus França AF150018
Figura 8: Árvore baseada em análise de máxima parsimônia (sem raíz), do gene 12S RNAr.
Os números representam a percentagem de 1000 réplicas “bootstrap”.
35
R. sanguineus (RJ) EU346687
R. sanguineus (RO) EU346682
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883880
R. sanguineus Tailândia DQ016293
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883863
R. sanguineus (MS) EU346684
R. sanguineus (PA) EU346686
R. sanguineus (RN) EU346685
R. sanguineus (ES) EU346683
R. sanguineus (GO) EU346688
R. sanguineus Israel L34302
R. sanguineus Espanha Z97884
R. sanguineus EUA-Oklahoma AF081829
R. turanicus Espanha Z97885
R. turanicus Israel L34303
R. sanguineus (RJ) EU346687
R. sanguineus (RO) EU346682
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883880
R. sanguineus Tailândia DQ016293
R. sanguineus Taiwan/Kinmen AY883863
R. sanguineus (MS) EU346684
R. sanguineus (PA) EU346686
R. sanguineus (RN) EU346685
R. sanguineus (ES) EU346683
R. sanguineus (GO) EU346688
R. sanguineus Israel L34302
R. sanguineus Espanha Z97884
R. sanguineus EUA-Oklahoma AF081829
R. turanicus Espanha Z97885
R. turanicus Israel L34303
Figura 9: Árvore baseada em análise de máxima parsimônia (sem raíz), do gene 16S RNAr.
Os números representam a percentagem de 1000 réplicas “bootstrap”.
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