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RESUMO
Os vírus dengue representam o mais importante arbovirus transmissor de doença em
humanos, resultando em progressivas manifestações clínicas tais como febre da dengue, febre
hemorrágica da dengue e síndrome do choque da dengue. O controle desta infecção é feito
apenas pelo controle do vetor, pois não existe até o momento, nenhuma vacina que proteja os
indivíduos desta infecção e nenhum antiviral para o controle da replicação viral. Na tentativa
de se entender se poderia haver interferência de drogas na replicação do vírus dengue, células
C6/36 e Vero foram cultivadas e as monocamadas confluentes foram infectadas com vírus
dengue-2, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. Para confirmação da replicação
viral, um ensaio de imunofluorescência indireta foi realizado sobre células infectadas. A
análise da inibição da replicação viral pelas drogas que interferem na homeostase celular foi
realizada em monocamadas de células Vero e C6/36 tratadas, concomitante e após a infecção
viral, com cloroquina (aumenta o pH endossomal), brefeldina A (inibe o fluxo vesicular de
proteínas) e citocalasina B (desestabiliza os filamentos de actina). Sobrenadantes de células
infectadas foram coletados após períodos de 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas da
infecção viral. Foi realizada a extração do RNA total do sobrenadante e a replicação viral foi
analisada através da quantificação dos vírus produzidos pela detecção do número de cópias de
RNA do vírus dengue-2. Esta quantificação foi realizada através da PCR em tempo real onde
a região 3' não-codificadora do genoma dengue-2 foi analisada utilizando primers específicos
para o vírus dengue-2 e usando-se o SYBR GREEN® One-Step RT-PCR Master Mix
Reagents Kits (Applied Biosystems). Para verificar a ação das drogas in vivo no sentido de
investigar o seu possível uso em humanos, grupos de cinco camundongos Swiss de 4 semanas
de idade foram desafiados com uma injecção intracerebral de uma cepa virulenta do dengue-
2, e tratados ou não 2 horas ou 3 dias após a infecção com as drogas por via intraperitoneal. A
cloroquina foi administrada em intervalos de 24 horas durante sete dias, enquanto que a
brefeldina A e a citocalasina B foram dose única. Os animais foram observados durante 21
dias. A porcentagem de sobrevivência no grupo de camundongos infectados com vírus e
tratados com cloroquina 2 horas após infecção foi melhor do que nos outros grupos (tratadas
ou com brefeldina A ou com citocalasina B ou cloroquina 3 dias após infecção) já que houve
um desvio da curva de sobrevivência e um deles sobreviveu enquanto nos outros grupos,
todos morreram. Todos os animais que não foram tratados morreram por volta do 10° dia. A
transcrição reversa por PCR em tempo real mostrou que, comparado as células controle,
houve uma diminuição estatisticamente significante na replicação viral em células Vero
quando tratadas com cloroquina, brefeldina A e citocalasina B; resultados que foram
confirmados por ensaio de placa (PFU). Em células C6/36, a cloroquina induziu um aumento
estatisticamente significante na replicação viral a partir de 12 horas quando comparado as
células controle, mostrando que este vírus usa uma via diferente de penetração nessas células
onde o resultado foi confirmado por ensaio de placa (PFU). A cloroquina mostrou-se eficiente
na inibição da replicação do vírus dengue-2 in vivo (camundongos) 2 horas após infecção e in
vitro (Vero), enquanto que com a brefeldina A, citocalasina B e cloroquina 3 dias após
infecção não tivemos resultados satisfatórios in vivo, porém in vitro essas drogas mostraram-
se eficientes. Este trabalho mostra que algumas drogas poderão ter um papel importante no
tratamento da dengue em um futuro próximo.
Palavras-chave: Dengue-2, Cloroquina, Brefeldina A, Citocalasina B, Quantificação.