( PDF ) Estudo da relação estrutura-atividades e de propriedades do Hb40-61a, uma hemocidina sintética

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

ELAINE NOGUEIRA

Estudo da relação estrutura–atividade

e de propriedades do Hb40-61a,

uma hemocidina sintética

São Paulo

2007

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ELAINE NOGUEIRA

Estudo da relação estrutura–atividade

e de propriedades do Hb40-61a,

uma hemocidina sintética

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Mestre em Ciências

(Bioquímica)

Orientadora: Profa. Dra. Maria Terêsa Machini de Miranda

São Paulo

2007

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Elaine Nogueira

Estudo da relação estrutura–atividade e de propriedades do Hb40-61a, uma

hemocidina sintética

Dissertação apresentada ao Instituto

de Química da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Mestre em

.........................................................................

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

À minha família e amigos, com imenso carinho

AGRADECIMENTOS

Gostaria de oferecer os meus sinceros agradecimentos a todos que me ajudaram, direta ou

indiretamente, na realização deste trabalho. E à Deus, por tudo.

À minha orientadora Profa. Dra. Maria Terêsa Machini de Miranda pela orientação, apoio, amizade e por todo o

aprendizado adquirido.

À nossa colaboradora Dra. Alessandra Machado pela amizade e auxílios inestimáveis durante

o desenvolvimento do projeto.

À Profa. Dra. Sirlei Daffre pela colaboração na realização e interpretação dos bioensaios.

Ao Prof. Dr. Antônio de Miranda por possibilitar o uso do equipamento para obtenção dos

espectros de dicroísmo circular e à Dra. Luciana Malavolta Quaglio pela assistência na coleta

destes. Ao Dr. Alberto Spisni por alguns conselhos a respeito.

Ao Dr. Nílton Lincopan pela amizade, paciência e colaboração na realização de alguns

ensaios biológicos.

À Profa. Dra. Iolanda M. Cuccovia e Dra. Kátia R. P. Daghastanli pelo estudo colaborativo da

interação do Hb40-61a com lipossomos.

À Fernanda M. Prado pela ajuda durante as análises por espectrometria de massas.

Ao Dr. Cleber pelas análises de aminoácidos.

Aos amigos do laboratório do IQ, dos quais guardarei boas recordações: Carolina, Cleber,

Dóris, Nícolas, Patrícia, Ivanilde, e em especial, a Carina e César, por todo estímulo, atenção,

sugestão e carinho recebidos.

Aos amigos do laboratório do ICB: Aline, Carolina, Carlos, Diego, Eliane, Felipe. Fernanda,

Rafael e Suzana pela ajuda durante a realização dos bioensaios e pela boa companhia.

Aos antigos amigos da faculdade, aos novos que fiz na pós-graduação e aos amigos do Coral

Ana Néri, pelo apoio nos momentos difíceis.

Aos meus familiares, dentre eles, meus pais Arisson e Midian e às minhas irmãs e amigas

Gisele, Gislene, Ellen (pela imensa ajuda e paciência) e Deise pelo incentivo e amor sempre

presentes.

À USP e ao IQ pela oportunidade.

Ao CNPq e a FAPESP pela bolsa e financiamento do projeto, respectivamente.

Muito obrigada.

RESUMO

NOGUEIRA, E. Estudo da relação estrutura-atividade e de propriedades do Hb40-61a, uma

hemocidina sintética. 2007. 108p. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

A hemoglobina (Hb) é uma fonte reconhecida de peptídeos com funções biológicas

diversas. O fragmento 33-61 da cadeia α da Hb, isolado do trato gastrointestinal do carrapato

Boophilus microplus, foi o primeiro a ser descrito com ação antimicrobiana. O seu análogo

sintético amidado, Hb33-61a, mostrou-se ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos [Fogaça

et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. O estudo de análogos do Hb33-61 nas formas amidada

e com carboxila livre revelou que a amidação provoca aumento significativo da atividade frente a

Candida albicans. Por apresentar propriedades biológicas e estruturais idênticas às do Hb33-61a,

o Hb40-61a pareceu ser a sua porção mínima ativa [Sforça et al. (2005) Biochemistry 44, 6440-

51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. Para comprovar tal sugestão, no presente

trabalho, sintetizamos, purificamos e caracterizamos novos análogos do Hb33-61a, bem como os

avaliamos quanto às suas atividades frente a C. albicans e Micrococcus luteus. Os resultados

confirmaram a sugestão apenas para a ação antifúngica. O análogo Hb40-61a também se mostrou

ativo frente a C. albicans resistente a fluconazol. A sua atividade antifúngica se mostrou

fortemente dependente da força iônica do meio. A sua baixa atividade hemolítica foi confirmada

mesmo em meio de baixa força iônica. O peptídeo Hb40-61a não apresentou sinergismo com o

fluconazol frente a C. albicans. A cinética de morte celular mostrou que ele mata a levedura de

forma rápida. Portanto, esta hemocidina sintética pode apresentar valor comercial se a via de

administração for tópica ou se o seu uso envolver meios de baixa força iônica. Além disso, ela é

um modelo valioso para o estudo do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos com

características estruturais similares e pode servir de base para o desenho de novos agentes

antibióticos.

Palavras-chave: peptídeo antimicrobiano, hemocidina sintética, Candida albicans, Micrococcus

luteus, relação estrutura-atividade.

ABSTRACT

NOGUEIRA, E. An investigation of the structure-activity relationship and the properties

of Hb40-61a, a synthetic hemocidin. 2007. 108p. Master Thesis - Graduate Program in

Biochemistry. Programa de Pós-Graduação em Ciências. Instituto de Química, Universidade

de São Paulo, São Paulo.

It is well known that hemoglobin (Hb) is a source of biologically active peptides. The fragment

33-61 of bovine hemoglobin α-chain, isolated from the gut contents of the tick Boophilus

microplus, was the first identified with antimicrobial activity . Its amidated analogue, Hb33-61a,

showed to be active against Gram-positive bacteria and fungi strains [Fogaça et al. (1999) J. Biol.

Chem. 274, 25330-4]. The study of a series of carboxyl-free and amidated synthetic analogues of

Hb33-61 revealed that C-terminus amidation enhances the activity against Candida albicans.

Since Hb33-61a and Hb40-61a presented identical biological and structural properties, it seemed

that Hb40-61a was Hb33-61a minimal active motif [Sforça et al. (2005) Biochemistry 44, 6440-

51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26].

To test this suggestion, in the present study

we synthesized, purified and characterized Hb40-61a analogues and assayed them against C.

albicans and Micrococcus luteus. The results confirmed the suggestion only for the antifungal

activity. When tested against fluconazole-resistant C. albicans, Hb40-61a was also active. Its

antifungal activity showed to be dependent on the ionic strength of the medium. Its low hemolytic

activity was confirmed even under low ionic strength conditions. Hb40-61a had no synergic effect

with fluconazole on C. albicans. In vitro time-kill assays demonstrated that Hb40-61a kills the

yeast rapidly. Therefore, this synthetic hemocidin may be of commercial interest for topical

application or other uses involving low ionic strength medium. Moreover, it can serve as a

template for the study of the mechanism of action of structurally related antimicrobial peptides or

for the design of novel antibiotic drugs.

Keywords: antimicrobial peptide, synthetic hemocidin, Candida albicans, Micrococcus luteus,

structure-activity relationship.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Código de uma e três letras para os vinte aminoácidos usuais

A Ala

alanina

M Met

metionina

C Cys

cisteína

N Asn

asparagina

D Asp

ácido aspártico

P Pro

prolina

E Glu

ácido glutâmico

Q Gln

glutamina

F Phe

fenilalanina

R Arg

arginina

G Gly

glicina

S Ser

serina

H His

histidina

T Thr

treonina

I Ile

isoleucina

V Val

valina

K Lys

lisina

W Trp

triptofano

L Leu

leucina

Y Tyr

tirosina

H-RMN

ressonância magnética nuclear de hidrogênio

ACN

acetonitrila

BOP

hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino) fosfônio

1 dicroísmo circular

CLSI

2 Clinical and Laboratory Standards Institute

DCM

diclorometano

DIC

N,N-diisopropilcarbodiimida

DIPEA

N,N-diisopropiletilamina

DMF

dimetilformamida

DMSO

dimetilsulfóxido

EDT

1,2-etanoditiol

fosfatidilcolina

FDA

3 Food and Drug Administration

Fmoc

fluorenilmetóxicarbonil

GUVs

vesículas unilamelares gigantes

Ácido fluorídrico

HOBt

N-hidroxibenzotriazol

IGP

tampão de fosfato isotônico

LC/ESI-MS

Cromatografia líquida de fase reversa acoplada a espectrômetro de massas

(fonte de ionização por "electrospray")

LPC

lisofosfatidilcolina

LPS

lipopolissacarídeo

LUVs

vesículas unilamelares grandes

MBHA

4-metilbenzidrilamina

MeOH

metanol

NMP

N-metilpirrolidona

PAM

ácido 4-hidroximetilfenilacético

bactopeptona

PBS

tampão fosfato de sódio

PDB

potato dextrose broth (caldo de dextrose de batata)

Rink amida

resina 4-(2’, 4’-Dimetóxifenilaminometil)-fenóximetil

RP-HPLC

cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa

SDS

dodecil-sulfato de sódio

SPFS

Síntese de peptídeos em fase sólida

t-Boc

terc-butilóxicarbonil

TBTU

tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametilurônio

TEA

trietilamina

TEAP

fosfato de trietilamina (mistura H

/TEA)

TFA

ácido trifluoroacético

TIS

triisopropilsilano

UFC

unidades formadoras de colônias

Wang

resina álcool p-benziloxibenzil

YNB

yeast nitrogen base

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 11

1.1 Peptídeos antibióticos .............................................................................................. 11

a) Potencialidade de uso ........................................................................................... 15

b) Dificuldades de uso .............................................................................................. 17

c) Vantagens de uso .................................................................................................. 19

1.2 Fragmento 33-61 da cadeia α da hemoglobina bovina ........................................... 21

1.3 Métodos de síntese de peptídeos ............................................................................. 24

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 29

3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 30

3.1 Materiais .................................................................................................................. 30

3.2 Métodos preparativos .............................................................................................. 32

3.3 Métodos analíticos e de caracterização dos peptídeos ............................................ 37

3.4 Bioensaios ............................................................................................................... 38

a) Atividade antifúngica ........................................................................................... 38

b) Atividade antibacteriana ....................................................................................... 40

c) Efeito da força iônica do meio nas atividades do Hb40-61a frente a C. albicans

e M. luteus ................................................................................................................ 41

d) Efeito da associação do fluconazol e do Hb40-61a no crescimento celular ........ 41

e) Ensaio Hemolítico ................................................................................................ 42

f) Cinética de morte celular ...................................................................................... 43

3.5 Análises por dicroísmo circular .............................................................................. 43

4 RESULTADOS ............................................................................................................... 46

4.1 Síntese, purificação e caracterização química dos peptídeos .................................. 46

4.2 Bioensaios ............................................................................................................... 67

a) Atividade antifúngica ........................................................................................... 67

b) Atividade antibacteriana ....................................................................................... 70

c) Efeito da força iônica do meio nas atividades dos peptídeos estudados frente a

C. albicans e M. luteus ............................................................................................. 71

d) Efeito da associação de dois antimicrobianos no crescimento celular ................. 72

e) Ensaio de hemólise com o Hb40-61a ................................................................... 72

f) Cinética de morte celular causada pelo Hb40-61a ............................................... 72

4.3 Estudos preliminares por dicroísmo circular ........................................................... 73

5 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 75

5.1 Desenho dos peptídeos estudados ........................................................................... 75

5.2 Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos estudados ............................... 77

5.3 Ensaios biológicos ................................................................................................... 78

5.4 Análise por dicroísmo circular ................................................................................ 89

6 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 90

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 92

CURRICULUM VITAE .................................................................................................... 106

1 INTRODUÇÃO

1.1 Peptídeos antibióticos

Os peptídeos com ação antibiótica podem ser divididos em peptídeos não-

ribossômicos e ribossômicos (HANCOCK; CHAPPLE, 1999). Os não-ribossômicos

(chamados de antibióticos) são produtos do metabolismo secundário sintetizados mediante

catálise por um sistema multi-enzimas presente em certas bactérias e fungos, as sintetases de

peptídeos não ribossômicos. Entre eles estão peptídeos utilizados atualmente na clínica como,

por exemplo: a gramicidina S (peptídeo cíclico; GAUSE; BRAZHNIKOVA, 1944), a

polimixina B (lipopeptídeo, STORM et al., 1977) e a vancomicina (glicopeptídeo;

FAIRBROTHER; WILLIAMS, 1956, HANCOCK, 1997).

Os peptídeos ribossomais (chamados neste texto de peptídeos antimicrobianos) são

encontrados em uma grande variedade de seres vivos, sendo reconhecidos como parte

importante do sistema imune inato de vertebrados, invertebrados e plantas (TABER et al.,

2002, BULET et al., 2004, NISSEN-MEYER; NES, 1997). A atividade antimicrobiana foi a

primeira a ser atribuída a estes peptídeos, porém outras funções foram descritas, tais como a

de participação no sistema adaptativo e a habilidade de modular a resposta imune em

mamíferos (BOWDISH et al., 2005, HANCOCK; SAHL, 2006). Assim, cada peptídeo

antimicrobiano poderia apresentar duas ações, ou seja, antimicrobiana e imunomoduladora, ou

ter predomínio de uma delas. Por exemplo, além de as α- e β-defensinas de mamíferos

apresentarem atividade antimicrobiana, estas são capazes de atrair linfócitos T (CHERTOV et

al., 1996, RAJ; DENTINO, 2002, YANG et al., 2002). Entretanto, quando os testes

antimicrobianos in vitro são realizados em condições ditas fisiológicas (usando alta

concentração salina), essas defensinas são pouco ativas, levando ao questionamento de se esta

atividade seria a função mais importante in vivo (YANG et al., 2002). Por outro lado, as

atividades antimicrobianas das defensinas poderiam ocorrer dentro de vacúolos de fagócitos e

na superfície da pele e mucosas, onde a força iônica é baixa (Figura 1 abaixo; YANG et al.,

2002). Estas razões explicam, portanto, o termo “peptídeos de defesa do hospedeiro” usado na

literatura (SAHL et al., 2005).

Figura 1. Funções biológicas dos peptídeos de defesa do hospedeiro (HPD) em mamíferos. PMN:

neutrófilos polimorfonucleares

. Extraído de Hancock e Sahl (2006).

Os primeiros peptídeos antimicrobianos descritos são aqueles produzidos por bactérias

(JENSSEN et al., 2006). Desde então, centenas deles foram isolados e caracterizados ou

tiveram as suas seqüências preditas a partir das seqüências dos genes que os codificam

(BULET et al., 2004, BECHINGER; LOHNER, 2006). Esses peptídeos podem ser produzidos

constitutivamente, como as histatinas (VANDERSPEK et al., 1989) ou ser induzidos pelo

contato com microorganismos, como a cecropina (BREY et al., 1993).

Apesar da baixa similaridade nas suas seqüências de aminoácidos, a maioria dos

peptídeos antimicrobianos é catiônica (TABER, 2002). Em geral, eles contêm 12-50 resíduos

de aminoácidos e são anfipáticos, com aproximadamente 50% dos resíduos sendo

hidrofóbicos (HANCOCK, 1997). Quanto à atividade biológica, eles apresentam amplo

espectro de ação contra bactérias, fungos e vírus (HANCOCK, 2001). Entretanto, é sabido

Morte celular direta

Imunomodulador

Monócito

PMN

Linfócito

HDP

Lise de membranas

Alvos internos

Recrutamento de células

do sistema imune

Controle da

inflamação

Aumento da

eliminação das

bactérias

que os peptídeos antimicrobianos provenientes de eucariotos apresentam, em geral, espectro

de ação mais amplo do que alguns produzidos por bactérias (DIEP; NES, 2002, JENSSEN et

al., 2006). Por outro lado, os últimos são geralmente mais ativos (apresentam MICs em

nanomolar).

Várias são as classificações feitas para os peptídeos antimicrobianos. Uma delas se

baseia na estrutura primária e secundária (BROGDEN, 2005):

1) Aniônicos, como a maximina H5 de anfíbios (LAI et al., 2002);

2) Catiônicos lineares que formam α-hélices, como por exemplo, as magaininas isoladas em

pele de sapo (Zasloff, 1987);

3) Catiônicos ricos em determinados aminoácidos, como, por exemplo, a acantoscurrina,

peptídeo rico em glicina presente na hemolinfa da aranha Acanthoscurria gomesiana

(LORENZINI et al., 2003) e as histatinas, peptídeos ricos em histidina presentes na saliva

humana (RAJ et al., 1990);

4) Catiônicos ou aniônicos que contém cisteína e formam pontes dissulfeto, como, por

exemplo, as defensinas (RAJ; DENTINO, 2002);

5) Catiônicos ou aniônicos resultantes de proteólise de proteínas como, por exemplo, a

lactoferricina (KIM et al., 2000) e o fragmento 33-61 da cadeia α da hemoglobina bovina

(FOGAÇA et al., 1999, SFORÇA et al., 2005, MACHADO et al., 2007).

Vários são os mecanismos propostos para explicar a ação destes peptídeos. Eles se

baseiam na permeabilização da membrana plasmática ou na interação com um alvo

intracelular (JENSSEN et al., 2006). No que se refere à atividade antibacteriana, que é a mais

estudada, a permeabilização pode ocorrer pelos modelos mecanísticos denominados

agregação, formação de poro toroidal, ripas de barril e carpete e os alvos intracelulares podem

ser o DNA, enzimas e processos intracelulares (Figura 2; BROGDEN, 2005). Quanto à

licação

Transcrição

Tradução

Enovelamento

roteínas

Enzimas envolvidas na

modificação de

aminoglicosídeos

Síntese da

arede celular

Figura 2. Mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos frente a bactérias. Amarelo:

icamada lipídica bacteriana. Cilindros bicolores: peptídeos, com representação da porção hidrofílica

(rosa) e hidrofóbica (azul). Cilindros azuis: peptideoglicanos. (A)-(D): modelos de.permeabilização da

membrana. (A): agregação; (B): formação de poro toroidal; (C): ripas de barril e (D): carpete; (E) a (I):

modelos de ação para peptídeos com alvos internos. (E): inibição da síntese de DNA, RNA; (F):

inibição da síntese de proteínas; (G): inibição de enzimas envolvidas no enovelamento de proteínas;

(H): inibição de enzimas envolvidas na modificação de aminoglicosídeos que levam à resistência dessa

classe de antibióticos; (I): inibição da síntese da parede celular. (Extraído de JENSSEN et al., 2006).

atividade antifúngica, alguns mecanismos já foram propostos (DE LUCCA; WALSH, 1999,

JENSSEN et al., 2006), tais como permeabilização da membrana do fungo (LEE et al., 2001,

JANG et al., 2006), ação sobre mitocôndria com liberação de ATP que culminaria na morte

da célula (KAVANAGH; DOWD, 2004), lise da membrana causada pela interação do

peptídeo com os esteróis (por exemplo, o ergosterol) nela presentes (DE LUCCA et al., 1998)

e formação de espécies reativas e diminuição do nível de tióis (LUPETTI et al., 2002). Em

relação à atividade antiviral, foram sugeridos (JENSSEN et al., 2006): ação direta no

envelope viral (ROBINSON et al., 1998), influência nas etapas intracelulares da infecção

celular (ALBIOL MATANIC; CASTILHA, 2004), prevenção da entrada do vírus na célula

pela interação do peptídeo com heparam sulfato (ANDERSEN et al., 2004) ou com receptores

virais (que estão presentes nas células do hospedeiro; MURAKAMI et al., 1997) ou com

glicoproteínas presentes no envelope viral (YASIN et al., 2004).

Seguem abaixo algumas considerações adicionais em relação aos peptídeos com ação

antibiótica:

a) Potencialidades de uso

Um uso evidente destes peptídeos é na terapêutica como agentes antimicrobianos

alternativos aos de natureza orgânica não peptídica, já que eles exibem um amplo espectro de

ação, apresentam uma capacidade menor do que a dos antibióticos não peptídicos de induzir

resistência e causam a morte rápida dos microorganismos (HANCOCK, 1997, HANCOCK;

SAHL, 2006). Esses peptídeos poderiam ser utilizados sozinhos (monoterapias) ou em

combinação com outros antibióticos; neste último caso, se buscaria o efeito sinérgico entre

eles (GORDON et al., 2005).

Nas duas últimas décadas, vários peptídeos com ação antibiótica ou seus derivados

foram estudados extensamente até a fase de testes clínicos (relativamente poucos em relação

ao grande número já descoberto) (GORDON et al., 2005). Entretanto, até agora, apenas dois

se mostraram suficientemente eficazes (HANCOCK; SAHL, 2006): 1) o Pexiganan (Genaera

Plymouth Meeting, EUA), que é um derivado da magainina 2 (peptídeo isolado da pele do

sapo africano Xenopus laevis); entretanto, não foi aprovado pelo FDA por não ser superior à

ofloxacina para o tratamento do pé diabético; 2) o Omiganan (Microbiologix Biotech

Vancouver, BC, Canadá), que é um derivado da indolicidina (peptídeo obtido de grânulos de

neutrófilos bovinos) capaz de reduzir a colonização de microorganismos em cateteres e está

na fase IIIb de testes (GORDON et al., 2005, HANCOCK; SAHL, 2006). Outros como o

XMP.629 [XOMA US, Berkeley, EUA, derivado da proteína bactericida/aumentadora de

permeabilidade (BPI), encontrada em grânulos de leucócitos humanos] e Iseganan [derivado

da protegrina que está presente em leucócitos de porcos (Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc.

Mountainview, EUA)] também foram estudados, mas não se mostraram eficientes nas fases II

e III dos testes clínicos, respectivamente (GORDON et al., 2005, HANCOCK; SAHL, 2006).

A grande maioria dos estudos já realizados envolve monoterapia e visa à aplicação tópica

(HANCOCK; SAHL, 2006). Um fator limitante para a administração sistêmica é que em

estudos com animais certos peptídeos, como a magainina, apresentaram doses eficazes altas e

geralmente próximas às doses tóxicas (Zasloff, 2002).

Os peptídeos com ação antibiótica também poderiam ser empregados como agentes

imunomoduladores, tais como:

i) neutralizadores de produtos ou componentes bacterianos tóxicos na prevenção do choque

séptico. Já foi demonstrado que várias proteínas (como a proteína bactericida/aumentadora de

permeabilidade; BPI; GAZZANO-SANTORO et al., 1992) e peptídeos (como o MBI-27 e o

MBI-28) se ligam ao LPS in vitro (PIERS et al., 1994) e protegem espécies animais da sepse

em modelos experimentais (GOUGH et al., 1996);

ii) compostos recrutadores de células do sistema imune (tais como neutrófilos, monócitos,

mastócitos e linfócitos T auxiliares), estimuladores de degranulação de mastócitos,

promotores de angiogênese e cicatrização (FINLAY; HANCOCK, 2004).

O uso mais freqüente destes compostos tem sido o científico, já que o conhecimento

das propriedades químicas, biológicas e estruturais de um peptídeo com ação antibiótica é

extremamente valioso. Além disso, a exploração da relação estrutura-atividade e o

entendimento dos seus mecanismos de ação podem levar a análogos e compostos novos com

propriedades mais interessantes do que os compostos de partida (KIM et al., 2002) ou à

descoberta de outras ações, tais a como inibição de enzimas, promoção de absorção cutânea

para administração tópica de fármacos, imobilização de células com diferentes afinidades

sobre superfícies sólidas ou, ainda, incorporação à embalagem de alimentos (GREGORY;

MELLO, 2005, MILTZ et al., 2006, KIM et al., 2007).

b) Dificuldades de uso

Assim como outras classes de compostos, os peptídeos antimicrobianos apresentam

vários entraves em sua utilização como fármacos (GOOTZ, 1990). Estes entraves estão

descritos a seguir juntamente com as possíveis soluções.

Influência da força iônica do meio na atividade antimicrobiana de um peptídeo

Independentemente do mecanismo de ação proposto é, em geral, aceito que ocorra

uma interação eletrostática inicial entre o peptídeo catiônico e as estruturas carregadas

negativamente do microorganismo. Deste modo, é esperado que a força iônica do meio

(cátions) afete a sua atividade e que este efeito seja dependente do meio, do microorganismo e

do peptídeo (LEE et al., 1997a). Neste contexto, deduz-se que os peptídeos isolados de

animais marinhos, como as clavulinas, sejam geralmente ativos em soluções de altas

concentrações salinas (LEE et al., 1997b). Dedução idêntica não pode ser feita para aqueles

isolados de animais não marinhos.

Algumas definições de peptídeos antimicrobianos só abrangem aqueles que são ativos

em condições fisiológicas (HANCOCK; SAHL, 2006). Entretanto, esta abordagem é muito

rígida, já que para exibir a sua ação eles podem: 1) se envolver em outras interações in vivo,

não previsíveis facilmente, como uma ação sinérgica com outros compostos (VAN’T HOF et

al., 2001); 2) exercer ação compartimentalizada ou em tecidos específicos como, por

exemplo, fazem as defensinas dentro de vacúolos de fagócitos, na superfície da pele e em

mucosas, onde a força iônica é baixa (YANG et al., 2002).

Por outro lado, também é necessário lembrar que análogos de ação menos suscetível à

presença de sais podem ser concebidos a partir de resultados de estudos da relação estrutura-

atividade dos peptídeos antibióticos (TAM et al., 2000, SHIN et al., 2002).

Susceptibilidade dos peptídeos antimicrobianos à proteólise

Os peptídeos são bastante susceptíveis à degradação enzimática. Para contornar esse

problema, têm sido propostas: 1) modificações químicas que levam a análogos alquilados no

nitrogênio da ligação peptídica (OSTRESH et al., 1996), amidados no C-terminal, ciclizados

(MONROC et al., 2006), D-isômeros, peptídeos retroinvertidos e miméticos de peptídeos

(BESSALLE et al., 1990); 2) mudanças na formulação, como a seu encapsulamento em

lipossomos (HANCOCK; SAHL, 2006).

Custo alto

Este é o principal entrave para a introdução dos peptídeos como fármacos, pois a sua

produção custa de cinco a vinte vezes mais do que a dos antibióticos usuais (LEE et al., 1998;

VAN’T HOF et al., 2001, HANCOCK; SAHL, 2006). As metodologias mais utilizadas para

síntese de peptídeos antimicrobianos são a síntese química e a tecnologia do DNA

recombinante (ver ítem 1.2). A síntese química é mais trabalhosa e versátil, pois permite o uso

de aminoácidos não usuais ou D-aminoácidos e a introdução de modificações químicas na

molécula (HANCOCK, 1997, MACHADO et al., 2004). Apesar de mais barata, a síntese via

tecnologia do DNA recombinante apresenta alguns inconvenientes, como a possibilidade de

morte do microorganismo durante a expressão de alguns peptídeos antimicrobianos (VAN’T

HOF et al., 2001), a impossibilidade de incorporação de aminoácidos não usuais ou D-

aminoácidos, a maior dificuldade para a obtenção de peptídeos modificados (MACHADO et

al., 2004).

Toxicidade moderada

Muitos peptídeos com ação antibiótica apresentam certo grau de toxicidade a células

de mamíferos, tais como a melitina (OREN; SHAI, 1997), a protegrina I (STORICI;

ZANETTI, 1993), a indolicidina (SELSTED et al., 1992) e a gomesina (FÁZIO et al., 2006).

Esta toxicidade, na maioria das vezes, é avaliada por meio do ensaio hemolítico. Por outro

lado, alguns estudos da relação estrutura-atividade de peptídeos permitiram a dissociação das

atividades antimicrobiana e tóxica ou que a última fosse reduzida (OREN; SHAI, 2000,

FRECER et al., 2004, FÁZIO et al., 2007). Esses e outros estudos permitiram algumas

generalizações como, por exemplo, a de que em peptídeos com estrutura em α-hélice

anfipática, o aumento da hidrofobicidade leva a um aumento da atividade hemolítica (DATHE

et al., 1997).

c) Vantagens do uso

Pelas razões descritas no item 1b, a maioria dos peptídeos antimicrobianos simples

conhecidos não tem sido aprovada em testes clínicos (HANCOCK; SAHL, 2006). Por outro

lado, a busca por novos peptídeos antimicrobianos e o seu estudo continuam sendo relevantes

devido, principalmente, às seguintes razões:

1. em geral, os peptídeos são facilmente metabolizáveis e, relativamente, menos tóxicos para

animais e plantas do que outros antibióticos não peptídicos (VAN´T HOF et al., 2001);

2. como por milhares de anos eles foram e continuam sendo ativos, eles poderiam se tornar

uma nova classe de antibióticos utilizados na terapêutica contra microorganismos que

apresentam resistência aos antibióticos convencionais, ou ainda, ser empregados por vias

alternativas à via oral (como, por exemplo, enxágüe bucal ou para o tratamento tópico da

candidíase; CHAN et al., 2006, PATRZYKAT; DOUGLAS., 2003). De fato, apesar de o

aparecimento de resistência dos microorganismos aos antibióticos utilizados ser um problema

mundial, somente três novas classes (oxazolidinonas, lipopeptídeos cíclicos e

estreptograminas) foram introduzidas nos últimos 40 anos (PARISIEN et al., 2008). Além

disso, os novos antibióticos comercializados são, na sua maioria, análogos de outros que já

estavam no mercado, como por exemplo, novas gerações de fluoroquinolonas, ou novas

associações deles (CHRISTOFFERSEN, 2006; SILVEIRA et al., 2006);

3. os estudos da relação estrutura-atividade de peptídeos antimicrobianos são de fundamental

importância, pois estes podem apresentar determinadas características que limita o seu uso e

que podem ser melhoradas como, por exemplo, o seu espectro de ação, a sua potência, os seus

parâmetros farmacocinéticos, incluindo estabilidade in vivo e índice terapêutico. No caso de

peptídeos, como já citado acima, esses estudos podem levar a análogos menos sensíveis à

força iônica do meio (PARK et al., 2004) e/ou proteólise e de menor toxicidade (SHIN et al.,

1999) e também à elucidação das suas porções e/ou aminoácidos responsáveis pela atividade

(SHIN et al., 1999). Essas informações podem, ainda, gerar dados para o desenho de novas

drogas não peptídicas;

4. os estudos de mecanismo de ação dos peptídeos antibióticos podem levar a um melhor

entendimento da permeabilização de membranas biológicas e descobrimento de novos alvos

para serem usados contra os microorganismos patogênicos;

5. vários estudos relatam peptídeos que apresentam sinergismo com outras drogas (PARK et

al., 2006, BARBOSA et al., 2007) ou que podem translocar membranas celulares servindo de

carregadores de compostos polares biologicamente ativos como ácidos nucléicos, peptídeos,

proteínas, oligonucleotídeos e DNA (TEMSAMANI; VIDAL, 2004).

1.2 Fragmento 33-61 da cadeia α da hemoglobina bovina

Desde que, com a colaboração de nosso grupo de pesquisa, um peptídeo com atividade

antimicrobiana foi isolado do conteúdo intestinal do carrapato Boophilus microplus e sua

seqüência mostrou 100% de identidade com a seqüência 33-61 da cadeia α da hemoglobina

bovina (Hb33-61; FOGAÇA et al., 1999), outros grupos relataram a geração de fragmentos da

hemoglobina in vivo (NAKAJIMA et al., 2003, MAK et al., 2004, SONENSHINE, 2005,

NEDJAR-ARROUME et al., 2006) e in vitro (FROIDEVAUX et al., 2001, PARISH et al.,

2001; LIEPKE et al., 2003; DAOUD et al., 2005). Anteriormente, já era bem estabelecido que

fragmentos desta proteína apresentam funções biológicas variadas, tais como: ação opióide,

imunomodulação e atividade liberadora de hormônios (IVANOV et al., 1997). Entretanto, o

peptídeo Hb33-61 foi o primeiro relatado a exibir ação antimicrobiana (FOGAÇA et al.,

1999).

Sabendo que a amidação no C-terminal de um peptídeo pode levar a uma maior

resistência a proteases (ANDREU; RIVAS, 1998) e a uma potencialização de sua atividade

(CHRISTENSEN et al., 1979), foi sintetizado o análogo amidado do Hb33-61, o Hb33-61a.

Este análogo mostrou-se ativo em concentrações micromolares contra algumas bactérias

Gram-positivas (Micrococcus luteus A270, Micrococcus luteus e Staphylococcus epidermidis)

e contra alguns fungos (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus nidulans;

FOGAÇA et al., 1999).

Estudos estruturais por CD e

H-RMN do peptídeo Hb33-61a (SFORÇA et al., 2005)

mostraram posteriormente que: 1. assim como outros peptídeos de baixa massa molar como a

cecropina (HOLAK et al., 1988), este também apresenta conformação randômica em solução

aquosa pH 5,1 contendo 20 µM de peptídeo; 2. apesar de não interagir com micelas

zwiteriônicas de LPC, em presença de micelas de SDS, o peptídeo Hb33-61a exibe uma

conformação definida e caracterizada pela presença de uma dobra β na porção N-terminal

(Lys

-Phe

) e por uma dobra β (Ser

-Ser

) seguida de uma α-hélice no C-terminal (Ala

Ala

), sendo as duas dobras conectadas por uma alça flexível espacialmente organizada

(Pro

-Leu

; Figura 3). Este tipo de estruturação da cadeia carbônica é bastante semelhante

àquela adquirida pela porção 33-61 na cadeia α da hemoglobina bovina; mas com alguns

grupos pertencentes a cadeias laterais em diferente orientação (Figura 4).

Figura 3. Visão esteroespacial do modelo de mínima energia do Hb33-61a obtida por RMN em

presença de micelas de SDS, pH 4,0 a 37°C. Extraído de Sforça et al. (2005).

Figura 4. Sobreposição das porções Ala

-Lys

(a) e de Tyr

-Phe

(b). Hb33-61a (azul), com a

região correspondente na estrutura cristalina da cadeia α da hemoglobina bovina (vermelho)

. Extraído

de Sforça et al. (2005).

a) b)

C-terminal

N-terminal

Assim, fragmentos truncados do Hb33-61

a nas formas acetiladas, amidadas ou com

carboxilas livres foram desenhados, sintetizados, purificados e testados por nós frente a C.

albicans MDM8. Esta levedura foi escolhida pela sua relevância clínica (GUPTE et al., 2002).

Os resultados obtidos nesta etapa inicial do estudo da relação estrutura-atividade antifúngica

do peptídeo Hb33-61a (Tabela 1; MACHADO et al., 2007) mostraram que: 1) os análogos

amidados tinham maior atividade antifúngica em relação aos com carboxila livre, o que

corrobora dados anteriores obtidos para outros peptídeos antimicrobianos (WU; HANCOCK,

1999, CAO et al., 2005, ROTEM et al., 2006); 2) a deleção da porção 53-61 (correspondente

α-hélice da porção C-terminal) ou 33-47 (contendo a dobra β na porção N-terminal e parte

da alça flexível terminal espacialmente organizada) levou à redução significativa da atividade;

3) o fragmento Hb40-61

a apresentou a mesma atividade antifúngica do Hb33-61a, mas a

acetilação dos seu grupo N-terminal causou a redução dessa atividade (MACHADO et al.,

2003, MACHADO et al., 2007 e dados não publicados).

Tabela 1. Atividade dos análogos do Hb33-61a frente a C.albicans MDM8 (MACHADO et al., 2007;

dados não publicados)

Peptídeo Seqüência

MIC (µM)

Hb33-61a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

3,12-6,25

Hb33-61a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK 12,5-25,0

Hb33-52

a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGS- NH

50,0-100,0

Hb48-61

a LSHGSAQVKGHGAK-NH

>200,0

Hb40-61a KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

3,12-6,25

Hb40-61a KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK 12,5-25,0

Ac-Hb40-61 Ac-KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK

100,0-200,0

Ac-Hb40-61

a Ac-KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

12,5-25,0

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração

testada no qual o microorganismo cresceu e [b] é a mais baixa concentração que causou total inibição

do crescimento (EHRET-SABATIER et al., 1996).

Análises por CD e

H-RMN dos peptídeos Hb40-61a, Hb40-61, Hb33-52a, Hb48-61a

sintéticos mostraram que, em presença de micelas SDS, o fragmento Hb40-61a apresenta uma

estrutura muito similar à encontrada para o Hb33-61a e que, assim como este último, ele

preserva os elementos principais de estrutura secundária e terciária presentes na porção 33-61

da cadeia

α da hemoglobina bovina (Figura 5; MACHADO et al., 2007).

Figura 5. Sobreposição dos resíduos Ala

-Lys

(a) e de Tyr

-Phe

(b). Hb40-61a (azul), com a

região correspondente na estrutura cristalina da cadeia α da hemoglobina bovina (vermelho)

. Extraído

de Machado et al. (2007).

Além disso, ensaios adicionais com os peptídeos Hb33-61

a e Hb40-61a mostraram

que na faixa 1-50

µM ambos hemolisam apenas 15% do total de células testadas, que ambos

apresentam atividades fungicidas em 6,25

µM e permeabilizam a membrana plasmática de C.

albicans MDM8 em 62,5 µM (MACHADO et al.,2007). Assim, o fragmento Hb40-61a

pareceu representar a porção mínima ativa do Hb33-61

a e apresentar potencial de uso

terapêutico [por ter baixa atividade hemolítica e ser ativo contra C. albicans, um organismo

oportunista causador de várias doenças, entre elas a candidíase (GUPTE et al., 2002)] o que

justificava a sua dissecção e busca de informações adicionais sobre as suas propriedades.

1.3 Métodos de síntese de peptídeos

Há três metodologias para sintetizar peptídeos: 1. Síntese química, que pode ser em

solução (ou clássica) ou em fase sólida; 2. Síntese enzimática ou biocatalisada, que pode ser

cineticamente ou termodinamicamente controlada; 3. Síntese via tecnologia do DNA

recombinante.

Apesar de muito diferentes, todas as três requerem a ativação do grupo carboxila do

aminoácido que funcionará como doador de acila na reação de formação de ligação peptídica.

Na síntese química (em solução e em fase sólida), um reagente químico (chamado reagente

ativador ou acoplador) ativa este grupo, possibilitando um ataque nucleofílico do aminoácido

aceptor de acila. Na síntese enzimática, a enzima ativa o doador de acila, formando um

intermediário acil-enzima altamente reativo. Na síntese que utiliza a maquinaria ribossomal,

o tRNA faz esse papel ligando-se no grupo carboxila do aminoácido e posteriormente a

porção C-terminal da cadeia polipeptídica nascente.

Cada uma dessas metodologias apresenta vantagens e desvantagens e, portanto, a

escolha deve levar em consideração a quantidade requerida e a natureza do peptídeo

[tamanho, seqüência, presença de aminoácidos não usuais, amidação, sulfatação, fosforilação,

ciclização (LLOYD-WILLIAMS,1997, MACHADO et al., 2004)]. Apesar de ainda

apresentar problemas não resolvidos, a SPFS é dominante na área de síntese de peptídeos; de

fato, atualmente, a maioria dos peptídeos é sintetizada por este método (LLOYD-

WILLIAMS, 1997).

A síntese de peptídeos em fase sólida, que rendeu a Bruce Merrifield o Prêmio Nobel de

Química em 1984 por sua concepção e desdobramentos (MERRIFIELD, 1963), utiliza um

suporte polimérico (resina) que é funcionalizado por um ligante no qual o grupo carboxila do

aminoácido que corresponde ao resíduo C-terminal da cadeia peptídica desejada (protegido

no grupo

α-amino e na cadeia lateral reativa) se liga por meio de uma função amida ou éster.

A síntese é continuada com ciclos sucessivos de desproteção do grupo

α-amino protetor da

aminoacil- ou peptidil-resina e acoplamento do próximo aminoácido devidamente protegido

(

Esquema 1).

De acordo com os tipos de protetores empregados, a estratégia de síntese química de

peptídeos em solução ou em fase sólida, pode ser dividida em dois tipos: t-Boc (que emprega

Esquema 1: Síntese de peptídeos em fase sólida passo a passo. O esquema representa a síntese de

um peptídeo com n resíduos de aminoácidos (adaptado de ANDREU; RIVAS, 2002)

: refere-se

apenas à estratégia

t-Boc.

o grupamento

t-butiloxicarbonila para proteger o grupo α-amino dos aminoácidos e derivados

benzílicos para bloquear as cadeias laterais reativas,

Figura 6A) e a Fmoc (que emprega a 9-

fluorenilmetoxicarbonila e derivados t-butilícos para os mesmos fins, Figura 6B). Na

estratégia t-Boc, todos os protetores são lábeis a ácidos inorgânicos fortes. Na estratégia

Ligante

acilação

desproteção

Ligante

neutralização

acoplamento

Ligante

n-2 vezes

Ligante

n-2

desproteção total

clivagem do

peptídeo da resina

Ligante

neutralização

acoplamento

desproteção

Legenda

Suporte sólido

Ligante

Resíduo de aminoácido

Grupo protetor N-terminal

Grupo protetor de cadeias

laterais reativas

Ligante

- -

Fmoc, o grupo Fmoc é lábil a bases orgânicas, especialmente as secundárias e os protetores

de cadeias laterais são lábeis a TFA.

A escolha da resina a ser utilizada leva em consideração: 1. a estratégia a ser utilizada,

ou seja, a ligação peptídeo-resina deve ser estável às condições de remoção do protetor do

grupo

α-amino, 2. se o grupo C-terminal será obtido após a clivagem do peptídeo da resina

na forma amidada ou carboxila livre.

Há vários procedimentos para se realizar a clivagem do peptídeo da resina e a

desproteção total. Na maioria das vezes, esta etapa envolve acidólise (JUBILUT et al., 1999).

Na estratégia t-Boc, as peptidil-resinas são expostas a ácidos inorgânicos como o HF

condensado, altamente tóxico que necessita de um aparato próprio para a sua utilização

(STEWART; YOUNG, 1997). Na estratégia Fmoc, entretanto, as peptidil-resinas são

submetidas a tratamento com o TFA (Esquema 1, FIELDS; NOBLE, 1990).

Figura 6. Exemplos de peptidil-resinas obtidas pelas estratégias t-Boc (A) e Fmoc (B). (a)

protetor do grupo α-amino lábil a TFA, Boc, (A) ou a bases orgânicas, Fmoc, (B); (b) bloqueadores

das cadeias laterais reativas dos aminoácidos lábeis a HF (A) ou TFA (B); (c) ligação da cadeia

peptídica com a resina lábil a HF (A) ou TFA (B); (d).ligante. O círculo negro se refere ao suporte

polimérico. Extraído de Andreu e Rivas (2002).

A utilização de captores de espécies reativas (em inglês,

scavengers) é de

fundamental importância nesta etapa, já que estes impedem que carbocátions produzidos

durante a remoção de grupos alquil protetores de cadeias laterais, alquilem resíduos de

aminoácidos susceptíveis. Os scavengers mais usados são: anisol, p-cresol e tióis, como o

1,2-etanoditiol (EDT) (LLYOD- WILLIAMS, 1997), embora derivados de silano, como o

(A) (B)

TIS, possam também ser utilizados (SOLÉ et al., 1992). A escolha depende da natureza dos

grupos protetores e das cadeias laterais não protegidas. O Reagente R [TFA (90%), tioanisol

(5%), EDT (3%) e anisol (2%) (ALBERICIO et al., 1990)], por conter o EDT, um dos

scavengers mais eficientes para seqüências que possuem aminoácidos sensíveis (por

exemplo, His, Gln, Ser, Asn, Thr, Tyr e Cys), é indicado para todas as seqüências (LLYOD-

WILLIAMS, 1997).

A SPFS tem como vantagens a simplicidade, rapidez de execução e possibilidades de

automação e de obtenção de múltiplas seqüências: isto porque os reagentes são eliminados por

filtração, evitando as etapas de isolamento, purificação e caracterização dos produtos

intermediários do processo sintético. Uma vez que as etapas da SPFS não são quantitativas e

que um grande número de reações secundárias pode ocorrer simultaneamente,

invariavelmente é necessário purificar os peptídeos sintéticos brutos obtidos. Para isso, podem

ser empregadas: HPLC de troca-iônica e a de fase inversa (MANT; HODGES, 1991,

MIRANDA et al., 1993a, KIYOTA et al.e 2003).

Os produtos purificados devem ser analisados por uma das diferentes modalidades de

espectrometria de massas, de preferência aquelas que podem ser acopladas ao equipamento

de HPLC, e submetidos à hidrólise total seguida de análise de aminoácidos. Além da

identificação, esta última permite a elucidação do conteúdo peptídico, ou seja, a porcentagem

em massa do peptídeo na amostra seca, uma vez que, mesmo após liofilização, esta contém

contra-íons e moléculas de água no seu retículo cristalino. Esse dado é imprescindível quando

os produtos purificados se destinam a ensaios biológicos ou que envolvam análises

quantitativas. O seqüenciamento via degradação de Edman ou por espectrometria de massas

com fragmentação é opcional, porém obrigatório para seqüências longas (acima de 25-30

resíduos). A ressonância magnética nuclear é outra técnica analítica para a caracterização dos

peptídeos sintéticos curtos (MACHADO et al., 2004).

2 OBJETIVOS

1. Determinar se o fragmento Hb40-61a é a porção mínima do Hb33-61a capaz de expressar a

sua atividades total frente a C. albicans e M. luteus, o que seria verificado pelo (a):

a. desenho de novos análogos do Hb40-61a e do Hb33-61a com base nas informações

geradas anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa e grupos colaboradores;

b. síntese, purificação e caracterização química dos novos análogos;

c. determinação da ação antifúngica e antibacteriana dos novos análogos purificados;

d. análise por CD em água e na presença de 200 mM de SDS dos novos análogos

purificados.

2. Avaliar o potencial de uso da hemocidina sintética Hb40-61

a através da determinação

do(a):

a. atividade antimicrobiana frente a outras cepas de C. albicans, incluindo uma resistente

a fluconazol;

b. efeito da força iônica do meio na atividade antimicrobiana;

c. toxicidade do peptídeo frente a células de mamíferos, medida por ensaio hemolítico;

d. efeito da associação com outro antifúngico não peptídico utilizado na terapêutica;

e. cinética de morte celular de

C albicans causada pelo peptídeo.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Resinas

A peptidil-resina Hb40-61-MBHA (MACHADO et al., 2007) e os peptídeos Hb33-61a,

Hb33-52a, Hb48-61a foram sintetizados anteriormente em nosso laboratório. As seguintes

resinas foram adquiridas: Boc-Lys (2-Cl-Z)-PAM [200-400 mesh, grau de substituição 0,4-0,7

mmol/g (Bachem Califórnia Inc., EUA)], Fmoc-Ala-Wang [100-200 mesh, grau de

substituição 0,45 mmol/g (Bachem Califórnia Inc., EUA)] e Rink amida [100-200 mesh, de

graus de substituição 0,3-0,6 mmol/g (Calbiochem-Novabiochem Corp., EUA) e 0,35 mmol/g

(Bachem Califórnia Inc., EUA)].

Derivados de aminoácidos e reagentes acopladores

Com exceção da Fmoc-Gly-OH, os Boc-aminoácidos e os Fmoc-aminoácidos utilizados

foram adquiridos da Bachem Califórnia Inc., EUA. O Fmoc-Gly-OH foi adquirido da

Advanced Chemtech, EUA. Os reagentes acopladores utilizados foram: DIC (Sigma

Chemical Co., EUA), HOBt (Protein Research Foundation, Japão), TBTU (Advanced

ChemTech, EUA) e BOP (Advanced ChemTech, EUA).

Solventes, ácidos, bases e detergentes

Os solventes DCM, DMF, MeOH e 2-propanol (isopropanol), o DMSO, o EDT, a TEA,

o TFA, o ácido ortofosfórico e o SDS vieram da Merck KGaA (Alemanha). O anisol e o

tioanisol foram provenientes da Sigma Chemical Co. (EUA). O triisopropilsilano era da

Aldrich Chemical Co. (EUA). A ACN era da Vetec Química Fina Ltda. (Brasil). O anidrido

acético, a piperidina, a DIPEA, NMP e as soluções fenol/etanol 76% (m/m), cianeto de

potássio/piridina 0,0002 M e ninidrina/etanol 0,28 M utilizados eram da Applied Biosystems

(EUA). O HF utilizado era de procedência da Quírios Produtos Químicos Ltda.

Todos eles eram de grau analítico ou para síntese, com exceção da ACN e TFA

empregados nas análises por RP-HPLC, que eram de grau cromatográfico.

Meios de cultura

Para os ensaios biológicos foram utilizados: meio PDB (pH 5,1 ± 0,2) da Sigma-Aldrich

(EUA), peptona (Merk AG, Alemanha), ágar bacteriológico (GIBCO BRL, EUA), cloreto de

sódio (Synth, Brasil), D-glicose (Gibco BRL, EUA) e meio YNB (pH 5,4 ± 0.2; contém os

seguintes sais: fosfato de magnésio monobásico 1,0 g/L, sulfato de magnésio 0,5 g/L, cloreto

de sódio 0,1 g/L e cloreto de cálcio 0,1 g/L) da Difco, EUA.

Microorganismos

As cepas de C. albicans foram obtidas da Coleção Americana de Tipos de Cultura

(ATCC 90028), da coleção do Instituto Adolfo Lutz, Brasil (IAL2151) e da Coleção do

Departamento de Microbiologia do ICB-USP, Brasil (MDM8). As duas primeiras nos foram

doadas pela Profa. Dra. Elsa M. Mamizuka do Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas da FCF-USP e pelo Dr. Nilton Lincopan, atualmente no nosso Departamento e

Instituto.

A cepa

Micrococcus luteus A270 foi obtida da coleção do Instituto Pasteur, França.

Colunas para HPLC

Para RP-HPLC, foram utilizadas as colunas Vydac C

analítica [0,46 cm x 25,0 cm, 5

µm e 300 Å] e semi-preparativa (1,1 cm x 25,0 cm, 5 µm e 300 Å).

Para HPLC de troca iônica, foram utilizadas uma coluna de troca aniônica AminoPac

PA10 da Dionex (2,0 x 25,0 cm, 8,5

µm, <10 Å) e uma coluna de troca catiônica da Beckman

do tipo poliestireno sulfonada (0,4 x 12,0 cm).

3.2 Métodos preparativos

Síntese das peptidil-resinas

A síntese das peptidil-resinas foi realizada manualmente pelo método da fase sólida

convencional utilizando a estratégia t-Boc ou Fmoc (STEWART; YOUNG, 1984,

ATHERTON; SHEPPARD, 1989, VARANDA; MIRANDA, 1997; Esquema 1 do item 1.3).

A etapa inicial, que consiste de lavagem e filtração da resina com solventes de

diferentes polaridades, e as etapas posteriores de desproteção, lavagem/filtração e de

acoplamento, lavagem/filtração foram realizadas de acordo com os protocolos descritos nas

Tabelas 2 e 3 adaptados (VARANDA; MIRANDA, 1997, PROTI et al., 2007). Para o

monitoramento das etapas de desproteção e acoplamento foi realizado o teste de ninidrina

(KAISER et al., 1970). Novas desproteções ou reacoplamentos foram feitos quando os testes

de ninidrina não foram aceitáveis.

Tabela 2: Protocolo de síntese convencional de peptídeos pela estratégia t-Boc (adaptado

de Varanda; Miranda, 1997)

Etapa I: Lavagem Inicial Etapa III: Acoplamento/Reacoplamento

DCM

10% TEA/DCM 2,5 eq. Boc-aa + [(2,5 eq. HOBt +2,5 eq. DIC

MeOH em DCM)] ou [2,5 eq. TBTU +2,5 eq. DIPEA

DCM (pH 9-10) em DMF] por 60 min.

Teste de ninidrina*

(negativo)

Etapa II: Desproteção

DCM

50% TFA/DCM +1% de anisol por 20 min) MeOH

DCM DCM

1% anisol/isopropanol Teste de ninidrina*

(negativo)

DCM

10% TEA/DCM

MeOH

DCM Repetição das Etapas II e III até introduzir o

Teste de ninidrina*

(positivo) último resíduo de aminoácido e retirar o Boc.

* Kaiser et al. (1970).

Tabela 3: Protocolo de síntese convencional de peptídeos pela estratégia Fmoc (adaptado

de Varanda; Miranda, 1997)

Etapa I: Lavagem Inicial Etapa III: Acoplamento/Reacoplamento

DCM

MeOH

DCM

Teste de ninidrina*

(negativo)

2,5 eq. Fmoc-aa + [(2,5 eq. HOBt +2,5 eq. DIC em

DCM)] ou [2,5 eq. TBTU +2,5 eq. DIPEA (pH 9-10)

ou 2,5 eq. BOP+ 1 eq. HOBt + 7,5 eq. DIPEA em

DMF] por 60 min.

DMF

Etapa II: Desproteção

MeOH

20% piperidina/DMF (10 min) DCM

DMF MeOH

MeOH DCM

DCM Teste de ninidrina* (negativo)

MeOH

Teste de ninidrina* (positivo) Repetição das etapas II e III até introduzir o

último resíduo de aminoácido e retirar o Fmoc.

* Kaiser et al. (1970).

Nas peptidil-resinas Hb40-61a-MBHA e Hb40-61-PAM foram introduzidos grupos

acetil em seus N-terminais, após remoção do Boc do último resíduo de aminoácido, através do

tratamento com 10% de anidrido acético em DCM por 10 min. Após lavagens com DCM e

MeOH, as peptidil-resinas foram submetidas ao teste de ninidrina (negativo; KAISER et al.,

1970).

Ao final das sínteses, as peptidil-resinas foram secas a vácuo e estocadas a 4°C.

Estratégia Boc: clivagem do peptídeo da resina e desproteção total

As peptidil-PAM ou Ac-Hb40-61-MBHA foram tratadas com a mistura de 10 mL de

HF condensado e anisol (10%) por 120 min a 0°C. Após remoção total do HF, o peptídeo

livre foi precipitado com éter diisopropílico e extraído com aproximadamente 50 mL de

solução de 0,1% TFA/H

O e 50 mL de solução de 60% ACN/TFA 0,09%/H

O. As soluções

resultantes foram misturadas e liofilizadas. O peptídeo bruto seco foi pesado, analisado e

purificado por RP-HPLC.

Estratégia Fmoc: clivagem do peptídeo da resina e desproteção total

Testes preliminares em escala piloto foram feitos para a escolha da melhor mistura

contendo TFA a ser utilizada em escala semi-preparativa. Nestes testes, a peptidil-resina Hb40-

58-Rink amida foi empregada como modelo.

As seguintes misturas reacionais foram testadas: a) TFA (95%)/H

O (GUY; FIELDS,

1997); b) Reagente R = TFA (90%), tioanisol (5%), EDT (3%) e anisol (2%) (ALBERICIO et

al., 1990); c) TFA (94%), anisol (5%) e EDT (1%) (GUY; FIELDS, 1997). Resumidamente,

10 mg de peptidil-resina foram incubadas em 100

µL de cada mistura a 37°C. Alíquotas da

solução reacional foram retiradas e analisadas por RP-HPLC nos tempos 0, 2, 4, 6, 8 e 24 h,

após os quais, o peptídeo livre em solução foi precipitado pela adição de éter diisopropílico.

Após centrifugação, o sobrenadante foi decantado. Esta operação foi repetida por mais duas

vezes e o resíduo sólido foi seco por passagem de nitrogênio gasoso. O peptídeo foi então

dissolvido pela adição de 1 mL de solvente A ao sólido, a solução foi filtrada e analisada por

RP-HPLC (equipamento descrito no

item 3.3, solvente A: 0,1% TFA/H

O, solvente B: 60%

ACN/0,09% TFA/H

O, λ: 210 nm, fluxo: 1,0 mL min e gradiente linear: 5 a 95% de B em 30

min) e por LC-ESI/MS (Condições LC: solvente A: 0,1% TFA/H

O, solvente B: 60%

ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210nm, fluxo: 1,0 mL/min e gradiente linear: 5 a 95% de A em

30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de ionização: ES

As reações em escala preparativa foram realizadas utilizando as melhores condições

encontradas na escala piloto (em alguns casos, o EDT foi substituído pelo TIS):

Peptidil-resina /massa (mg) Mistura reacional

Volume

(mL)

Tempo

(h)

Hb40-61-Rink amida/ 298 95% TFA/2,5%TIS/2,5% H

O 3,0 6

Hb40-56-Rink amida/ 262 Reagente R 2,6 5

Hb35-56-Rink amida/ 243 Reagente R 2,4 5

[Ala

]Hb40-58-Rink amida/ 255 95 %TFA/2,5% TIS/2,5% H

O 2,6 6

Hb40-63-Wang/ 149 95 %TFA/2,5% TIS/2,5% H

O 1,5 6

Nestes casos, os peptídeos brutos foram solubilizados em aproximadamente 50 mL de

solução de 0,1% TFA/H

O e 50 mL de solução 60% ACN/0,09% TFA/H

O. As soluções

resultantes foram liofilizadas e os peptídeos secos foram pesados, analisados e purificados por

RP-HPLC.

Purificação dos peptídeos brutos por RP-HPLC (KIYOTA et al., 2003)

As purificações foram feitas por RP-HPLC em uma etapa (para os peptídeos Hb40-

58a e [Ala

]Hb40-58a) ou em duas etapas (para os peptídeos AcHb40-61a, AcHb40-61,

Hb40-61

a, Hb40-56a, Hb35-56a e Hb40-63) conforme o Esquema 2.

Para os peptídeos purificados em duas etapas, a primeira empregou as seguintes

condições:

λ: 220 nm, fluxo: 10,0 mL/min e gradiente linear com variação de 30 % de B em

90 min utilizando a mistura H

/TEA (TEAP) em pH 2,2-2,4 como solvente A e 40%

ACN/TEAP (AcHb40-61a e AcHb40-61) ou 45% ACN/TEAP (Hb40-56a e Hb35-56a) ou

60% ACN/TEAP (Hb40-61a) como solvente B. Após esta etapa, as melhores frações

(analisadas em condições isocráticas previamente determinadas) foram juntadas e liofilizadas.

O sólido obtido foi dissolvido na solução de 0,1% TFA/H

O e dessalinizado na segunda etapa

da purificação que empregou o mesmo gradiente da etapa anterior e 0,1% TFA/H

O como

solvente A e 60% ACN/0,09% TFA/H

O como solvente B.

Nas purificações em uma única etapa, foi empregado o sistema que contém TFA.

Os seguintes instrumentos foram utilizados: a) Waters 600E composto de bomba

600E, controlador 600, injetor manual Rheodyne 7725i, detector 2487 e registrador Servogor

124 da LEM Norma GmbH; b) Beckman Instruments, modelo System Gold composto de

bombas module 126 e detector module 166, controlador NEC PC-8300, registrador de 2

canais KBL 2210.

Esquema 2. Rotina para as purificações dos peptídeos sintéticos por RP-HPLC.

1) Análise das frações

por RP-HPLC em

condições isocráticas;

2) Seleção das frações

Peptídeo Bruto

(obtido da clivagem da resina/desproteção total)

Análise por RP-HPLC

em dois sistemas de solventes (TEAP e TFA)

Purifica

ão

Fra

ões

Liofilização das

frações

selecionadas

Cortes manuais

Dessalinização

Liofilização das

frações

selecionadas

Determinação das condições experimentais para

purificação e monitoramento das frações obtidas

Em sistema TEAP

Fra

ões

Frações principal e

secundária

Em sistema TFA

1) Análise das frações

por RP-HPLC em

condições isocráticas;

2) Seleção das frações

3.3 Métodos analíticos e de caracterização dos peptídeos

Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC)

As análises dos peptídeos brutos e purificados por RP-HPLC foram feitas em um

cromatógrafo LDC Analytical composto por um detector SpectroMonitor 3100, bombas

ConstaMetric 3200 e 3500, um injetor manual Rheodyne 7125, um integrador DataJet e um

detector UV (MILTON ROY, Spectromonitor 3100). Estas análises foram feitas em dois

sistemas de solventes: o primeiro que utiliza 0,1% TFA/H

O como solvente A e 60%

ACN/0,09% TFA/H

O como solvente B e outro que utiliza TEAP em pH 2,2-2,4 como

solvente A e 45-60% ACN/TEAP como solvente B. Foram empregados dois tipos de

gradientes lineares: rápido= 5 a 95% em 30 min (3% de B/min); lento= 1% de B/min em

30 min.

RP-HPLC acoplada à espectrometria de massas (LC-ESI/MS)

Os peptídeos brutos e purificados obtidos também foram analisados e caracterizados

num equipamento multi-usuário do nosso Departamento do tipo triplo quadrupolo da

Micromass, modelo Quattro II, com fonte de ionização por electrospray (ESI-MS), que é

acoplado a um sistema de HPLC da Shimadzu composto por duas bombas Shimadzu LC-

10AD, um detetor Shimadzu SDP-10AV e injetor Rheodyne 7125.

Os peptídeos Hb40-61

a e Hb40-56a purificados também foram analisados por ESI-

MS na Central Analítica do IQ-USP no equipamento Esquire 3000 Plus com separador de

íons do tipo íon-trap.

Hidrólise total e análise de aminoácidos

As hidrólises totais dos peptídeos purificados foram realizadas em uma estação de

trabalho PicoTag da Waters. Para isso, 10

µL de uma solução 1 mmol/L do peptídeo

purificado foram submetidos à hidrólise ácida gasosa em presença de HCl 6 mol/L e cristais

de fenol, sob atmosfera de N

, a 110°C por 24 h. As composições molares dos aminoácidos

nos hidrolisados obtidos foram determinadas nos seguintes analisadores automáticos:

a) Beckman Instruments Inc., modelo 7300, acoplado a um computador que utiliza o

programa System Gold 406 para controle e aquisição de dados. Este equipamento emprega o

método de derivatização pós-coluna, no qual os aminoácidos são separados por HPLC de

troca catiônica e detectados a 440 a 570 nm como produtos da reação com ninidrina

(SMILLIE; NATTRISS, 1991);

b) Dionex BioLC

Chromatography System, que é composto por bombas GS50, detector

eletroquímico ED50 e forno cromatográfico LC25 e é acoplado a um computador que utiliza a

plataforma “Chromeleon” para controle e aquisição dos dados. Este equipamento faz a

detecção direta dos aminoácidos por amperometria pulsada (IPAD - Integrated Pulsed

Amperometric Detection), após separação por HPLC de troca iônica.

A proporção molar dos aminoácidos foi determinada utilizando soluções-padrão

Os dados obtidos permitiram estimar os conteúdos peptídicos dos materiais

purificados e esses foram considerados ao preparar as soluções de concentrações definidas

que foram empregadas nos bioensaios e análises conformacionais.

3.4 Bioensaios

a) Atividade antifúngica

Esta foi medida frente a C. albicans pelo método da microdiluição em caldo descrito

por Fehlbaum et al., 1994 (Figura 7). Resumidamente, em cada um dos 96 poços de uma

microplaca foram colocados 10

µL de cada solução de uma série de diluições do peptídeo em

água (0,78-200

µM) e 80 µL de uma suspensão de células de C. albicans MDM8

(concentração final 1 x 10

células/mL de 1,2% de PDB). A cada poço foi adicionada água

Figura 7. Esquema do procedimento utilizado para a determinação das MICs frente a C.

albicans e M. luteus.

Refere-se à atividade antifúngica;

Refere-se à atividade antibacteriana

para um volume final de 100

µL. Depois de 18 h de incubação a 30°C, as concentrações

inibitórias mínimas do crescimento (MICs) dos peptídeos sintéticos foram determinadas em

leitor de microplaca IEMS (LABSYSTEM

) a 595 nm pela diminuição dos valores de

Incubação a 30 ou 37°C

por 18 ou 48 h

Inóculo (80 µL

ou 90 µL

) + água (10 µL

)

+ diluições seriadas do peptídeo ou água

(controles, 10 µL

)

Leitura a 595 nm

Interpretação dos resultados

enda

Controles positivos (sem peptídeo)

Controle negativo (água)

Controles negativos (meio)

Poços contendo peptídeo

1 2 3 4 5 876

109

1 2 3 4 5 876

109

enda

, e Sem crescimento

Com crescimento

absorbância representativos de 50% de crescimento em relação aos controles (sem peptídeo).

A MIC foi expressa como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] era a maior

concentração testada na qual o microorganismo cresceu e [b] era a menor concentração

testada na qual ocorreu inibição do crescimento de

C. albicans (Segundo EHRET-

SABATIER et al., 1996). Os ensaios foram realizados em triplicata.

A atividade do peptídeo Hb40-61a frente a C. glabrata ATCC 90030, C. krusei ATCC

6258, C. parapsilosis ATCC 22019 e outras cepas de C. albicans (ATCC 90028, cepa

sensível ao fluconazol, e IAL 2151, resistente a fluconazol) foi também determinada

utilizando o método de referência de microdiluição em caldo segundo documento M27-A2 do

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute Available from:

<http://www.anvisa.gov.br/reblas/reblas_publicacoes_terapia_antifung.pdf>, acesso em

01/10/07) com substituições para os seguintes meios de cultura: o PDB 1,2% sem adição de

sal e YNB. Resumidamente, 50

µL de cada solução de uma série de diluições do peptídeo em

água

(0,78-200 µM) foram adicionados a 50 µL de uma suspensão de levedura de

concentração final na faixa 1 x 10

- 5 x 10

UFC/mL. Após incubação por 48 h a 37°C, as

MICs foram determinadas como descrito acima. Estes ensaios foram realizados uma única

vez.

b) Atividade antibacteriana

A atividade frente a M. luteus foi realizada pelo método da microdiluição em caldo

descrito por Bulet et al., 1993 (Figura 7). Resumidamente em cada um dos 96 poços de uma

microplaca foram colocados 10

µL de cada solução de uma série de diluições do peptídeo

(0,78-100

µM) e 90 µL de uma suspensão de M. luteus A270 (concentração final de 1 x 10

células/mL de meio pobre em nutrientes [PB: 1% Peptona contendo 34,2 mM de NaCl; pH

7,4]. Aos poços sem peptídeo foi adicionada água para um volume final de 100

µL. Depois de

18 h de incubação a 30°C, a MIC foi determinada como descrito acima. Os ensaios foram

realizados em triplicata. A determinação da atividade do peptídeo Hb40-61

a frente a S.

epidermidis, B. megaterium e S. marcescens foi realizada pelo método descrito acima em

meio PB contendo 86 mM de NaCl. Estes ensaios foram realizados uma única vez.

c) Efeito da força iônica do meio nas atividades do peptídeo Hb40-61a frente a C.

albicans e a M. luteus

As atividades foram medidas pelo método da microdiluição em caldo segundo

Fehlbaum et al. (1994), conforme descrito acima, na presença de diferentes concentrações de

NaCl para o peptídeo Hb40-61a (0,0; 34,2; 68,5 e 137,0 mM).

d) Efeito da associação do fluconazol e do peptídeo Hb40-61a no crescimento celular

Em uma dimensão de uma microplaca de 96 poços foram colocados em cada poço

µL de cada solução de uma série de diluições do peptídeo Hb40-61a em água (0,78-25

µM). Em uma segunda dimensão, foram colocados em cada poço 10 µL de uma série de

diluições de fluconazol em água (0,06-8

µg/mL). Cada poço foi inoculado com 80 µL de uma

suspensão de células de

C. albicans ATCC 90028 (concentração final 1 x 10

células/mL). A

cada um foi adicionada água para um volume final de 100

µL. A placa foi incubada por 18 h a

30°C e submetida à leitura em 595 nm.

A MIC foi considerada a menor concentração do agente que inibiu o crescimento do

organismo. Estes valores foram utilizados para calcular a concentração inibitória fracionária

(FIC), definida como a razão do MIC entre o agente utilizado em combinação e o MIC do

agente antimicrobiano sozinho. O índice FIC (FICI) foi considerado como a soma dos FIC de

cada agente nas suas concentrações mais efetivas (ou seja, o menor FICI obtido foi utilizado;

BONAPACE et al., 2002):

A / MIC

+ B / MIC

= FIC

FIC

= Índice FIC (FICI)

A é a menor concentração inibitória do agente antimicrobiano em combinação. MIC

é a MIC do

agente antimicrobiano sozinho. FIC

é a concentração inibitória fracionária do agente antimicrobiano

A. B, FIC

são definidos da mesma maneira. FICI é a soma dos FIC de cada agente antimicrobiano.

Extraído de Eliopoulos e Moellering (1996).

Os dados foram analisados segundo o seguinte critério FICI≤0,5: sinergismo; 0,5-4,0:

sem interação e >4,0: antagonismo (ODDS, 2003). O ensaio foi realizado em duplicata.

e) Ensaio Hemolítico (modificado de FÁZIO et al., 2006)

Amostras de aproximadamente 8 mL de sangue de doadores saudáveis foram coletadas

em tubo a vácuo contendo heparina como anticoagulante. Os eritrócitos foram separados por

centrifugação por 5 min a 4°C a 300 x g e lavados 3 vezes com tampão fosfato de sódio (PBS:

HPO

10 mM, contendo 140 mM de NaCl e 2,7 mM de KCl, pH 7,4; 313 mOsm/kg de

água, medida pelo osmômetro OSMETTE A (Precision systems Inc, modelo 5002, EUA). O

concentrado de células foi suspenso em PBS e depois diluído para uma concentração de

eritrócitos de 0,44% em PBS ou em tampão fosfato isotônico (IGP: tampão fosfato de

potássio 1mM suplementado com 287 mM de glicose; pH 7,4, 314 mOsm/kg de água, medida

pelo osmômetro descrito acima; WEI; BOBEK, 2004).

Em alguns dos 96 poços de uma microplaca (TPP código 92096, Suíça), 90

µL da

suspensão 0,44% de eritrócitos de PBS foram adicionados a 10

µL de soluções de

concentrações variadas de Hb40-61

a em água (0,20-50 µM). Controles positivos (SDS 0,1%

em PBS) e negativos (água sem peptídeo) também foram feitos. Nos outros poços foram

colocados 180

µL da suspensão 0,44% de eritrócitos em IGP, aos quais foram adicionados

µL de soluções de concentrações variadas de Hb40-61a em IGP (0,20-50 µM). Controles

positivos (SDS 0,1% em IGP) e negativos (IGP) também foram feitos. Após incubação por 1

h a 37°C e centrifugação a 300 x g a 4°C por 5 min, 50

µL dos sobrenadantes foram

transferidos para uma microplaca de 96 poços que foi submetida a leitura em 405 nm (

Figura

8).

A porcentagem de hemólise foi calculada usando a fórmula:

[(Abs peptídeo – Abs controle negativo)/(Abs controle positivo - Abs controle negativo)]

Os ensaios foram realizados em dois experimentos independentes em triplicatas.

f) Cinética de morte celular (modificado de DESTOUMIEX-GARZÓN et al., 2001)

Em cada um dos 96 poços de uma microplaca (TPP código 92096, Suíça) foram

colocados 10

µL de solução aquosa de Hb40-61a em água (25,0 µM ou 62,5 µM) e 80 µL da

suspensão de células de

C. albicans MDM8 na fase log de crescimento (concentração final: 1

x 10

células/mL de 1,2% PDB isento de NaCl). A cada poço foi adicionada água para um

volume final de 100

µL. Controles contendo água sem peptídeo foram feitos. A incubação foi

realizada a 30°C. Alíquotas de 10

µL dos controles foram retiradas nos tempos 0, 10, 20, e

40 min, 1 h, 2 h e 4 h e diluídas (100x, 1000x e 10000x em 1,2% PDB). Alíquotas de 50 µL

dos poços contendo peptídeo foram retiradas nos mesmos tempos e diluídas (5x, 10x ou 80x

em 1,2% PDB). Um volume de 50

µL destas suspensões sem diluição ou com diluição foi

inoculado em ágar Sabouraud e incubado por 24 h a 37°C para a contagem posterior das

colônias desenvolvidas.

3.5 Análises por dicroísmo circular

O dicroísmo circular é uma técnica espectroscópica baseada na diferença de absorção

de moléculas opticamente ativas da luz circularmente polarizada à direita e à esquerda e que

pode ser utilizada para determinar a estrutura secundária de proteínas e peptídeos em solução

(FORATO et al., 1998; GREENFIELD, 1999; SANTOS et al., 2007). Através dessa técnica

se obtém os valores de elipticidade:

onde

AE e AD são, respectivamente, absorbância da luz circularmente polarizada à esquerda e à

direita.

Os diferentes motivos estruturais apresentam espectros de CD característicos na região

do ultravioleta distante (178-250

nm): por exemplo, α-hélices apresentam banda negativa a

222 e 208 nm e positiva a 193 nm; folhas

β apresentam banda larga negativa próxima a 218

nm e banda larga positiva próxima a 195 nm; banda larga negativa a 200 nm e larga positiva a

217 nm indicam ausência de estruturação (estrutura randômica; GREENFIELD, 1999). O

espectro de uma dada molécula permite avaliar a sua estrutura secundária, pois este será a

soma dos espectros de seus elementos estruturais (GREENFIELD, 1999).

Massas dos peptídeos Hb40-61a, Hb35-56a, Hb40-56a, [Ala

]Hb40-58a e Hb40-63

foram dissolvidos em água, pH 4,0 ou água contendo 200 mM de SDS, pH 4,0, produzindo

soluções de diferentes concentrações. Essas soluções foram submetidas ao registro dos

espectros a 20°C em espectropolarímetro Jasco J-810 (JASCO International Co. Ltd., Tokyo,

Japan) acoplado a um controlador de temperatura (Peltier Jasco PFD-425S) do Departamento

de Biofísica da UNIFESP. Foram realizadas oito acumulações na faixa de comprimento de

onda 190-250 nm. Os dados obtidos em elipticidade,

θ, foram convertidos a elipticidade

molar média [

θ] (deg.cm

dmol

-1

Figura 8. Esquema para realização do ensaio hemolítico para os peptídeos estudados. A placa

mostra o ensaio em triplicata.

Ensaio em PBS

Ensaio em IGP.

Leitura a 405nm

Interpretação dos resultados

Centrifugação a 300g a 4°C

Incubação por 1h a 37°C

Suspensão de

eritrócitos

Diluições seriadas

do peptídeo

1% SDS (controle positivo) ou

água

ou IGP

(controle negativo)

90µL

180µL

10µL

20µL

10µL

20µL

L sobrenadante

Controles positivos

Controles negativos

3 4 5 876

109

Controle

negativo

Controle

postivo

Concentrações variadas do peptídeo

1ha37

300 x g a 4°C

405 n

4 RESULTADOS

4.1 Síntese, purificação e caracterização química dos peptídeos

a) Considerações gerais

Os dados quantitativos de síntese, purificação e caracterização química dos

peptídeos estudados estão descritos nas Tabelas 4 e 5.

A síntese dos peptídeos Ac-Hb40-61, Ac-Hb40-61

a, Hb40-61a, Hb40-58a,

[Ala

]Hb40-58a, Hb40-56a, Hb35-56a e Hb40-63 ocorreu sem grandes problemas até o

acoplamento da Leu-47, a partir do qual parte das novas etapas de desproteção e acoplamento

tiveram de ser repetidas.

Apesar de não ter havido problemas nas purificações dos peptídeos brutos, os

rendimentos foram bastante baixos, o que pode ser explicado pela presença de contaminantes

de comportamentos cromatográficos similares aos dos peptídeos desejados.

b) Peptídeo Ac-KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

(Ac-Hb40-61a)

O rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total para fornecer o

peptídeo bruto foi de 45%. Os perfis de RP-HPLC do peptídeo bruto nos sistemas de

solventes contendo TFA (

Figura 9A) e TEAP (Figura 9B) revelaram a presença de diversos

componentes. A análise por LC-ESI/MS (Figura 9C) indicou que o peptídeo desejado era o

componente majoritário (pico 3) e os picos 1 e 4 correspondiam aos seguintes subprodutos da

síntese: o análogo deletado em uma Phe e o análogo contendo uma Ala adicional,

respectivamente. O componente correspondente ao pico 2 não foi identificado.

O rendimento total de obtenção do peptídeo, com pureza superior a 95%, foi de 2%

(

Figuras 10A e 10B). A composição de aminoácidos e a massa molar obtidas confirmaram a

Tabela 4. Resultados quantitativos das sínteses e purificações dos peptídeos estudados

Construção da cadeia peptídica

Clivagem do peptídeo da resina/

desproteção total

Purificação

Peptídeo

Resina (mg)/ GS (mmol/g) Peptidil-resina (mg) Peptidil-resina (mg) Peptídeo bruto

(mg) Peptídeo purificado (mg)

Ac-Hb40-61a - - 269,9 148,0

6,7 (fração 1

ária

)

2,1 (fração 2

ária

)

297,8 87,0

16,5 (fração 1

ária

)

5,6 (fração 2

ária

)

237,4 79,0

7,1 (fração 1

ária

)

6,2 (fração 2

ária

)

Hb40-61a 1000/0,35 1000

150,0

50,0 6,0 (fração 1

ária

)

300,3 162,9

1,9 (fração 1

ária

)

0,7 (fração 2

ária

)

Ac-Hb40-61 400/0,52 432

131,7 51,0 0,4 (fração 1

ária

)

Hb40-58a 500/0,22 703 295,2 147,3

2,9 (fração 1

ária

)

29,3 (fração 2

ária

)

[Ala

]Hb40-58a 600 /0,30 669 255,3 89,6

6,5 (fração 1

ária

)

6,9 (fração 2

ária

)

Hb40-56a 800/0,35 922 261,8 84,02 25,3 (fração 1

ária

)

243,0 88,8

1,5 (fração 1

ária

)

1,8 (fração 2

ária

)

Hb35-56a 380/0,35 380

137,0 15,3 <1 (fração 1

ária

)

Hb40-63 300 /0,45 317 149,0 58,6

7,2 (fração 1

ária

)

0,8 (fração 2

ária

)

GS: grau de substituição ou aminoacilação.

refere-se também à quantidade de material submetido à purificação.

Tabela 5. Caracterização química dos peptídeos sintetizados

Pureza (%)

Peptídeo

Sistema

contendo TFA

Sistema

contendo TEAP

Massa

molecular

obs. (calc.)

(u)

Composição molar de aminoácidos

obs. (calc.)

Conteúdo

Peptídico

(%)

Ac-Hb40-61a 99

2454,52

(2453,77)

K: 2,87 (3); A: 2,20 (2); T: 0,93 (1); G: 3,10 (3); V: 0,87 (1); S: 1,73 (2); P: 1,10 (1);

L: 1,00 (1); H: 2,97 (3); F: 2,17 (2); Q: 1,07 (1); D: 1,07 (1); Y: 0,97 (1).

Hb40-61a 100

100

2412,50

(2411,73)

K: 2,65 (3); A: 2,53 (2); T: 0,93 (1); G: 3,14 (3); V: 1,00 (1); S: 2,18 (2); P:1,15 (1);

L: 1,39 (1); H:2,30 (3); F: 2,05 (2); Q:1,16 (1); D: 1,36 (1); Y: 0,69 (1).

Ac-Hb40-61 96

100

2455,18

(2454,75)

K:2,72 (3); A: 1,86 (2); T: 0,94 (1); G: 2,40 (3); V: 1,00 (1); S: 1,66 (2); P: 1,09 (1);

L: 0,96 (1); H: 2,70 (3); F: 2,00 (2); Q: 1,09 (1); D: 1,19 (1); Y: 1,41 (1).

Hb40-58a 94

100

2156,08

(2155,42)

K: 1,93 (2); A: 1,09 (1); T: 0,90 (1); G: 1,88 (2); V: 1,00 (1); S: 1,46 (2); P: 0,98 (1);

L: 0,88 (1); H: 2,47 (3); F:1,86 (2); Q: 0,98 (1); D: 1,08 (1); Y: 1,25 (1)

[Ala

]Hb40-58a 98

2169,5

(2169,45)

K: 1,97 (2); A: 2,54 (2); T: 1,00 (1); G: 1,29 (1); V: 1,00 (1); S: 0,34 (2); P: 1,13 (1);

L: 1,12 (1); H: 1,88 (3); F:1,54 (2); Q: 1,02 (1); D: 1,09 (1); Y: 0,76 (1).

Hb40-56a 88

1961,70

(1961,23)

K: 2,26 (2); A: 1,33 (1); T: 0,47 (1); G: 1,09 (1); V: 1,00 (1); S: 0,91 (2); P: 0,61 (1);

L: 0,86 (1); H: 2,01 (2); F: 1,52 (2); Q: 0,90 (1); D: 0,85 (1); Y: 0,97(1).

Hb35-56a 100

100

2495,60

(2494,91)

K: 1,69 (2); A: 1,01 (1); T: 0,85 (3); G: 1,08 (1); V: 1,00 (1); S: 1,64 (2); P: 1,25 (2);

L: 0,82 (1); H: 0,62 (2); F: 2,28 (3); Q: 1,72 (1); D: 0,58 (1); Y: 0,22 (1).

Hb40-63 100

2583,00

(2582,93)

K: 2,00 (3); A: 3,05 (3); T: 0,80 (1); G: 2,65 (3); V: 2,00 (2); S: ND (2); P: 0,90 (1);

L: 0,80 (1); H: 2,10 (3); F: 1,90 (2); Q: 1,10 (1); D: 1,10 (1); Y: 1,10 (1).

Condições de análise por RP-HPLC: coluna Vydac C

, λ: 210 nm, fluxo: 1 mL/min, (a): solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, gradiente linear:

30 a 60% de B em 30 min; (b): solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, gradiente linear: 28 a 58% de B em 30 min; (c): solvente A:

0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min; (d):

solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O ,

gradiente linear: 32 a 62% de B em 30 min; (e): solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min; (f): solvente A: TEAP, solvente

B: 60%ACN/TEAP e gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min; (g): solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP e gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min; (h):

solvente A: TEAP, solvente B: 60%ACN/TEAP, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min; (i) Os erros observados são toleráveis neste tipo de análise; (j) porcentagem em

massa do peptídeo na amostra seca.

Figura 9. Perfis de RP-HPC e LC/ESI-MS do Ac-Hb40-61a bruto. (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1), (2), (3) e (4): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e

(C): coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min,

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS

: capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo

de ionização ES

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20 30

100

3,0

13,

14,

16,

25 30

(A)

(B)

(C)

1 00

(1)

(2)

Abundância relativa (%)

100

(3)

(4)

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

662,3

993,0

957,7

792,7

769,1

638,9

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

793,3

1226,0

1028,9

993,3

816,9

686,0

662,5

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1262,1

1227,4

842,0

818,6

632,0

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1298,4

1263,6

866,2

841,8

632,0

Figura 10. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Ac-Hb40-61a purificado. (A), (B) e (C): perfis

de RP-HPLC, (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210nm,

fluxo: 1,0mL/min

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) ou 5 a 95% de B em 30 min (C),

B: coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min,

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

50 kV, modo de ionização: ES

Tempo (min)

Absorbância relativa (%)

100

10 15

(C)

Abundância relativa (%)

Absorbância

(

AUFS

)

0 10 20 30 0 10 20 30

(A) (B)

100

(1)

500 1000 1500 2000 2500

1637,3

1228,0

819,0

614,4

[M+2H]

[M+3H]

[M+4H]

sua identidade (

Tabelas 4 e 5).

c) Peptídeo KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

(Hb40-61a)

Neste caso, o rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção

total, que forneceu o peptídeo bruto, foi de 35%. Os perfis de RP-HPLC do peptídeo bruto nos

sistemas de solventes contendo TFA (Figura 11A) e TEAP (Figura 11B) e a análise por

LC/ESI-MS mostraram que o produto principal era o peptídeo desejado (Figura 11C).

O rendimento total de obtenção do peptídeo com pureza de praticamente 100% segundo

a Figura 12 foi de 7%. A composição de aminoácidos e a massa molar obtidas concordam

com os valores teóricos e os erros observados são toleráveis (Tabela 5).

d) Peptídeo Ac-KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK

(Ac-Hb40-61)

O rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção, para a

obtenção do peptídeo bruto, foi de 46%. Os perfis de RP-HPLC nos sistemas de solventes

contendo TFA e TEAP estão mostrados nas Figuras 13A e 13B. O peptídeo desejado foi

identificado por LC-ESI/MS como correspondente ao pico 4 na Figura 13C. Os outros

componentes (picos 1 e 2) foram identificados como isômeros do subproduto Ac-

HGSAQVKGHGAK. O componente correspondente ao pico 3 não foi identificado.

O rendimento total, de obtenção do peptídeo com pureza superior a 95% (

Figuras 14A

e 14B

), foi de 0,6%. A composição de aminoácidos e a massa molar obtidas concordaram

com os valores teóricos (Tabela 5).

e) Peptídeo KTYFPHFDLSHGSAQVKGH-NH

(Hb40-58a)

O rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total, que

forneceu o peptídeo bruto, foi de 72%. Analisado nos sistemas de solventes contendo TFA

(Figura 15A) e TEAP (Figura 15B), este apresentou um pico majoritário que demonstrou

ser o peptídeo desejado por LC-ESI/MS (pico 2 na Figura 15C). O componente correspondente

Figura 11. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-61a bruto. (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C): coluna

Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm, fluxo: 1,0

mL/min

, gradiente linear: 28 a 58% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C), (B): coluna

Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210nm, fluxo: 1,0mL/min, gradiente

linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS

: capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização ES

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

10 15

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

840,0

1206,6

804,7

758,9

603,79

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

0 10

20 30

10 15

25 30

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1207,4

805,3

604,2

805,3

[M+3H]

[M+2H]

Figura 12. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-61a purificado. (A), (B) e (C): perfis d

RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 28 a 58% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

37 kV

modo de ioniza

ão ES

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

(1)

(2)

100

Abundância relativa (%)

Figura 13. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Ac-Hb40-61 bruto. (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1), (2), (3) e (4): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e

(C): coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210

nm, fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min

(C), (B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

37 kV

modo de ioniza

ão ES

500 1000 1500 2000 2500

452,9

678,5

1219,1

609,9

500 1000 1500 2000 2500

614,4

864,5

1227,8

818,9

100

(3)

(4)

500 1000150020002500

1219,1

610,2

500 1000150020002500

773,4

625,14

549,2

1248,7

832,8

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 14. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Ac-Hb40-61 purificado. (A), (B) e (C): perfis

de RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

50 kV

modo de ioniza

ão ES

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

615,0

1228,8

819,7

[M+4H]

[M+3H]

[M+2H]

(B)

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

(1)

(2)

Abundância relativa (%)

100

Figura 15. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-58a bruto (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1), (2), (3) e (4): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e

(C): coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min,

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone: 20 kV, modo

de ioniza

ão ES

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

654,9

553,4

681,5

1021,34

829,4

712,3

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1436,4

1078,5

719,2

539,7

ao pico 1 foi identificado como o subproduto da síntese Ac-FDLSHGSAQVKGH-NH

(Ac-Hb46-58a).

O rendimento total de obtenção do peptídeo com grau de pureza superior a 90%

(Figuras 16A e 16B) foi de 1%. A Figura 16C mostra os resultados de sua análise por RP-

HPLC e LC-ESI/MS. A massa molar e a composição molar de aminoácidos obtida permitiram

confirmar a identidade do mesmo (Tabela 5).

f) Peptídeo KTYFPHFDLSHGSAQVKAH-NH

([Ala

]Hb40-58a)

Neste caso, o rendimento de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total, que

forneceu o peptídeo bruto, foi de 60%. As análises por RP-HPLC nos sistemas de solventes

contendo TFA (Figura 17A) e TEAP (Figura 17B) revelaram a presença de dois

contaminantes, já que o peptídeo desejado foi identificado por LC-ESI/MS como

correspondente ao pico 2 na Figura 17C.

O rendimento total de obtenção do peptídeo, com grau de pureza superior a 95%

(Figuras 18A e 18B), foi de 4%. A composição de aminoácidos e a massa molar obtidas

concordaram com as teóricas (Tabela 5).

g) Peptídeo KTYFPHFDLSHGSAQVK-NH

(Hb40-56a)

O rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total para

fornecer o peptídeo bruto foi de 54%. Quando foi analisado nos sistemas de solventes

contendo TFA (

Figura 19A) e TEAP (Figura 19B), este apresentou um componente (pico 1)

identificado por LC-ESI/MS como correspondente ao peptídeo desejado (Figura 19C).

O rendimento total de obtenção do peptídeo Hb40-56a, com grau de pureza superior a

85% (

Figuras 20A e 20B), foi de 16%. A massa molar e a composição de aminoácidos

obtidas concordaram com os valores teóricos (

Tabela 5). Os erros observados na análise de

aminoácidos são toleráveis.

(1)

Abundância relativa (%)

100

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1078,3

719,1

539,3

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

10 15

25 30

(C)

100

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

0 10 20

20 30

(A)

(B)

[M+4H]

[M+3H]

[M+2H]

Figura 16. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-58a purificado. (A), (B) e (C): perfis de

RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C): coluna

Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm, fluxo: 1,0

mL/min

, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C), (B): coluna

Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 40%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min, gradiente

linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS

: capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ioniza

ão ES

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

(1)

(2)

Abundância relativa (%)

100

Figura 17. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do [Al

]Hb40-58a bruto (A), (B) e (C): perfis de

RP-HPLC. (1) e (2): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e

(C): coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210

nm, fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min

(C), (B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV,

cone: 20 kV

modo de ioniza

ão ES

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

1176,7

624,2

588,8

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

732,1

1085,8

724,2

543,3

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 18. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do [Al

]Hb40-58a purificado. (A), (B) e (C):

perfis de RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A)

(C): coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210

nm, fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 mi

(C), (B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV,

cone: 37 kV

modo de ioniza

ão ES

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

543,3

1446,8

1085,2

723,8

[M+4H]

[M+3H]

[M+2H]

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 19. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-56a bruto (A), (B) e (C): perfis de RP-HPLC.

(1), (2), (3) e (4): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm, fluxo:

1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C), (B): coluna

Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min, gradiente

linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS

: capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de ionização

500 1000 1500 2000 2500

654,9

981,8

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 20. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb 40-56a purificado. (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C): coluna Vydac

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210nm, fluxo: 1,0 mL/min,

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C), (B): coluna Vydac C

solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210nm, fluxo: 1,0mL/min

, gradiente linear: 30

60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone: 20 kV, modo de ionização ES

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1307,4

981,2

654,4

h) Peptídeo SFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVK-NH

(Hb35-56a)

Neste caso, a peptidil-resina Hb40-56-Rink amida foi alongada pela introdução de

mais cinco resíduos. Como se pode observar, a qualidade do peptídeo bruto piorou muito, o

que foi indicado pela presença de vários picos no perfil por RP-HPLC (Figuras 21A e 21B).

Em uma nova tentativa, foram feitas modificações no protocolo de síntese, tais como a troca

do reagente acoplador e a utilização de solventes contendo sais caotrópicos (THALER;

SEEBACH, 1991). No entanto, estas alterações não levaram a um peptídeo bruto de melhor

qualidade (dados não mostrados).

O rendimento de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total que levou ao

peptídeo bruto foi de 42%. Os perfis por RP-HPLC do peptídeo bruto apresentaram diversos

componentes (

Figuras 21A e 21B), sendo que o peptídeo desejado foi identificado por LC-

ESI/MS como correspondente ao componente majoritário 2 (Figura 21C). O componente

correspondente ao pico 3 foi identificado como sendo um subproduto que contém um resíduo

de Pro adicional; o componente 1 não pôde ser identificado.

O rendimento total de obtenção do purificado, com grau de pureza superior a 95%

(

Figuras 22A e 22B), foi de 0,3%. Este foi caracterizado por LC-ESI/MS (Figura 22C) e

análise de aminoácidos. Os resultados obtidos concordaram com os valores teóricos (os erros

observados na análise de aminoácidos são toleráveis).

i) Peptídeo KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAKVA (Hb40-63)

O rendimento da etapa de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total, que

forneceu o peptídeo bruto, foi de 36%. O peptídeo bruto obtido, analisado nos sistemas de

solventes contendo TFA (

Figura 23A) e TEAP (Figura 23B), mostrou conter o peptídeo

desejado identificado por LC-ESI/MS como correspondente ao pico 2 na

Figura 23C. O

componente correspondente ao pico 1 não foi identificado.

O rendimento total de obtenção do peptídeo purificado [grau de pureza superior a 95%

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

(1)

(2)

Abundância relativa (%)

(3)

100

Figura 21. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb35-56a bruto (A), (B) e (C): perfis de RP-

HPLC. (1), (2), (3): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 32 a 62% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min,

gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone: 20 kV, modo

de ionização ES

500 1000 1500 2000 2500

2367,3

1830,0

1053,4

1002,8

832,8

668,9

500 1000 1500 2000 2500

1665,1

1248,6

832,8

624,7

500 1000 1500 2000 2500

649,0

1297,2

864,7

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 22. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb35-56a purificado. (A), (B) e (C): perfis de

RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C): coluna

Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm, fluxo: 1,0

mL/min

, gradiente linear: 32 a 62% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C), (B): coluna

Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 45%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo: 1,0mL/min, gradiente

linear: 30 a 60% de B em 30 min. Condições de ESI-MS

: capilar: 3 kV, cone: 20 kV, modo de

ioniza

ão ES

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1247,5

624,3

832,2

[M+4H]

[M+3H]

[M+2H]

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(B)

(C)

(1)

(2)

Abundância relativa (%)

100

Figura 23. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-63 bruto (A), (B) e (C): perfis d

RP-

HPLC. (1), (2): espectros de massa dos componentes em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 60%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

37 kV

modo de ioniza

ão ES

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

1210,8

1043,7

926,4

807,5

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

819,2

1292,3

861,9

(A)

(

Figuras 24A e 24B)] foi de 4%. A massa molar e a composição de aminoácidos obtidas

confirmaram sua identidade (Tabela 5).

4.2 Bioensaios

a) Atividade antifúngica

As MICs dos peptídeos antimicrobianos frente a C. albicans MDM8 estão descritas na

Tabela 6.

Tabela 6. Nomes, seqüências e MICs frente a C. albicans MDM8 dos peptídeos estudados.

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração testada na

qual o microorganismo cresceu e [b] é a menor que causou total inibição do crescimento. A atividade antifúngica

foi determinada utilizando o método de dliuição em caldo segundo Fehlbaum et al. (1994), em meio PDB sem

adição de NaCl.

Como se pode observar, dentre os peptídeos estudados, o peptídeo Hb40-61a é o

análogo que representa a porção mínima capaz de expressar a atividade antifúngica do Hb33-

61a. De fato, a acetilação do grupo N-terminal levou a uma redução de 4 vezes da MIC; a

retirada de três e cinco resíduos do C-terminal levou a análogos menos ativos: Hb40-58a (2

vezes) e Hb40-56a (32 vezes). A adição da porção Val

-Ala

no C-terminal substituiu o

efeito da amidação. A troca da Gly

por Ala

para dar o análogo [Ala

]Hb40-58a não causou

alteração na MIC do Hb40-58

a. A introdução da porção Ser

-Thr

no peptídeo Hb40-56a,

levou ao Hb35-56

a, que foi não ativo.

Com base nesses resultados, testes antifúngicos frente a outras cepas de C. albicans

Peptídeos Seqüência

MIC (µM)

Hb33-61a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSA QVKGHGAK-NH

3,12-6,25

Hb40-61a KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

3,12-6,25

AcHb40-61a Ac-KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

12,5-25,0

Hb40-58

a KTYFPHFDLSHGSAQVKGH-NH

6,25-12,50

[Ala

]Hb40-58a KTYFPHFDLSHGSAQVKAH-NH

6,25-12,50

Hb40-56

a KTYFPHFDLSHGSAQVK-NH

100-200

Hb35-56a SFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVK-NH

>200

Hb40-63 KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAKVA 3,12-6,25

Tempo (min)

Absorbância (AUFS)

Absorbância relativa (%)

Tempo (min)

0 10 20

20 30

10 15

(A)

(B)

(C)

100

(1)

Abundância relativa (%)

100

Figura 24. Perfis de RP-HPLC e LC/ESI-MS do Hb40-63 purificado. (A), (B) e (C): perfis de

RP-HPLC. (1): espectro de massa do componente em (C). Condições de RP-HPLC

: (A) e (C):

coluna Vydac C

, solvente A: 0,1%TFA/H

O, solvente B: 60%ACN/0,09%TFA/H

O, λ: 210 nm,

fluxo: 1,0 mL/min

, gradiente linear: 30 a 60% de B em 30 min (A) e 5 a 95% de B em 30 min (C),

(B): coluna Vydac C

, solvente A: TEAP, solvente B: 60%ACN/TEAP, λ: 210 nm, fluxo:

1,0mL/min

, gradiente linear: 20 a 50% de B em 30 min. Condições de ESI-MS: capilar: 3 kV, cone:

37 kV

modo de ioniza

ão ES

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

1291,9

861,7

[M+3H]

[M+2H]

foram realizados com o peptídeo Hb40-61

a e este se mostrou ativo como mostrado na Tabela

7 .

Tabela 7. Atividade antifúngica do peptídeo Hb40-61a frente a outras cepas de C. albicans.

Cepa MIC (µM)

ATCC 90028 6,2-12,5

IAL 2151 6,2-12,5

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração testada na

qual o microorganismo cresceu e [b] é a menor que causou total inibição do crescimento. A atividade antifúngica

foi determinada utilizando o método de dliuição em caldo segundo Fehlbaum et al. (1994), em meio PDB sem

adição de NaCl.

Os testes preliminares frente a outras espécies do gênero Candida, feitos de acordo

com a CLSI com algumas modificações usando a anfotericina B como controle e referência

forneceram os resultados mostrados na

Tabela 8.

Tabela 8. Atividade antifúngica do peptídeo Hb40-61a e anfotericina B frente a espécies do

gênero Candida.

MIC (µg/mL/µM)

Anfotericina B Hb40-61a

Meio de Cultura

Microorganismo

YNB PDB YNB PDB

C. albicans ATCC 90028

>2,0 / >2,2

1,0-2,0 /

1,1-2,2

>482,6/

>200,0

241,3-482,6/

100,0-200,0

C. albicans IAL2151

- -

>482,6/

>200,0

60,3-120,6/

25,0-50,0

C. glabrata ATCC 90030

- - -

>482,6/

>200,0

C. krusei ATCC 6258

- - -

60,3-120,6/

25,0-50,0

C. parapsilosis ATCC 22019

- - -

120,6-241,3/

50,0-100,0

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração testada na

qual o microorganismo cresceu e [b] é a menor que causou total inibição do crescimento. A atividade antifúngica

foi determinada utilizando o método de microdiluição em caldo segundo CLSI, com modificações, em meio

PDB sem adição de sal ou em YNB (contém fosfato de magnésio monobásico 1,0 g/L, sulfato de magnésio 0,5

g/L, cloreto de sódio 0,1 g/L e cloreto de cálcio 0,1 g/L); (-): não determinado.

Como se observa, o peptídeo não se mostrou ativo frente às duas cepas de C. albicans

testadas no meio YNB e à C. glabrata ATCC 90030 no meio PDB. Ele, porém, apresentou

baixa atividade no meio PDB frente a

C. albicans ATCC 90028 e C. parapsilosis ATCC

22019 no meio PDB, mas foi ativo frente à cepa com resistência a fluconazol e C. krusei.

Estas atividades, entretanto, foram muito inferiores às da anfotericina B frente a C. albicans

ATCC 90028 em meio PDB.

b) Atividade antibacteriana

As MICs dos peptídeos estudados frente a M. luteus A270 estão descritos na Tabela 9.

Tabela 9. Nomes, seqüências e MICs frente a M. luteus A270 dos peptídeos estudados.

Peptídeos Seqüência

MIC (µM)

Hb33-61a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

1,6-3,1

Hb33-52a FLSFPTTKTYFPHFDLSHGS-NH

>100,0

Hb40-61

a KTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK-NH

6,2-12,5

Hb40-58a KTYFPHFDLSHGSAQVKGH-NH

25,0-50,0

[Ala

]Hb40-58a KTYFPHFDLSHGSAQVKAH-NH

25,0-50,0

Hb40-56a KTYFPHFDLSHGSAQVK-NH

>100,0

Hb48-61

a LSHGSAQVKGHGAK-NH

50,0-100,0

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração testada na

qual o microorganismo cresceu e [b] é a menor que causou total inibição do crescimento. A atividade antifúngica

foi determinada utilizando o método de microdiluição em caldo segundo Bulet et al. (1993), em meio PB com

adição de 34,25 mM de NaCl.

Os análogos com redução do N-terminal Hb40-61a e Hb48-61a foram 4 e 32 vezes

menos ativo do que o Hb33-61a, respectivamente. A redução maior da região C-terminal para

dar o análogo Hb40-58

a causou a redução de 16 vezes na atividade antibacteriana. O análogo

Hb40-56

a não foi ativo nas concentrações testadas. A troca da Gly-57 por uma Ala para dar o

peptídeo [Ala

]Hb40-58a não causou a alteração da atividade do Hb40-58.

Em resumo, nestes casos o peptídeo Hb40-61a não se comportou como porção ativa

mínima do Hb33-61a.

Testes preliminares do peptídeo Hb40-61a frente a outras bactérias Gram-positivas S.

epidermidis e B. megaterium

e a Gram-negativa S. marcescens foram feitos em meios

contendo 86 mM de NaCl. Nas condições dos testes, ele não se mostrou ativo (

Tabela 10).

Tabela 10. Atividade antibacteriana do Hb40-61a frente a bactérias.

Espécie MIC (µM)

S. epidermidis >200,0

B. megaterium >200,0

S. marcescens >200,0

: MIC: concentração inibitória mínima. A atividade antifúngica foi determinada utilizando o método de dliuição

em caldo segundo Bulet et al. (1993), em meio PB com adição de 86 mM de NaCl.

c) Efeito da força iônica do meio nas atividades dos peptídeos estudados frente a C.

albicans e M. luteus

Os peptídeos testados não foram ativos quando os ensaios frente a C. albicans foram

feitos em alta concentração de NaCl (Tabela 11).

Tabela 11. Efeito da salinidade na atividade frente a C. albicans MDM8.

Peptídeo

MIC (µM)

Hb35-56a >200,0

Hb40-56a >200,0

Hb40-58a >200,0

[Ala

]Hb40-58a >200,0

Hb40-61a >200,0

Ac-Hb40-61

a >200,0

: MICs: Concentração inibitória mínima. A atividade antifúngica foi determinada utilizando o método de

dliuição em caldo segundo Fehlbaum et al. (1994), em meio PDB com adição de 137mM NaCl.

A Tabela 12 mostra o efeito da concentração de NaCl nas MICs do Hb40-61a frente a

C. albicans MDM8 e M. luteus A270.

Tabela 12. Efeito da concentração de NaCl nas MICs do peptídeo Hb40-61a frente a C. albicans

MDM8 (A) e M. luteus A270 (B).

NaCl (mM)

MIC (µM)

0,0 3,1-6,2 -

34,2 25,0-50,0 6,2-12,5

68,5

≈200,0

25,0-50,0

137,0 >200,0 >200,0

: MICs foram expressos como o intervalo de concentrações [a]-[b], onde [a] é a maior concentração testada na

qual o microorganismo cresceu e [b] é a menor que causou total inibição do crescimento. A atividade antifúngica

foi determinada utilizando o método de microdiluição em caldo segundo Fehlbaum et al., 1994, em meio PB. A

atividade antibacteriana foi determinada utilizando o método de microdiluição em caldo segundo Bulet et al.

(1993), em meio PDB.

Como se pode observar, a concentração de sal afeta negativamente as atividades

antifúngicas e antibacterianas, que se extinguem em condições tidas como próximas à dita

fisiológica (120-150 mM NaCl). Entretanto, quando o ensaio frente a

M. luteus foi realizado

sem adição de NaCl, os resultados não foram reprodutíveis.

d) Efeito da associação de dois agentes antimicrobianos no crescimento celular

Como mostra a Tabela 13, com a combinação com o fluconazol, as MICs foram

reduzidas em 2 vezes. A consideração dos critérios discutidos na mesma tabela permitiu

concluir que não ocorreu interação entre eles, já que o índice FIC (FICI) foi de 1,0.

Tabela 13. Possibilidade de interação entre Hb40-61a e fluconazol frente a C. albicans ATCC

90028 investigada pelo método do “chequerboard” (WEI e BOBEK, 2004).

MIC (µg/mL)

Agente

Antimicrobiano

Sozinho Combinação

FIC

FICI

Hb40-61a 30,2 15,1 0,5

Fluconazol 1 0,5 0,5 1,0

: MICs: Concentração inibitória mínima.;

FIC (concentração inibitória fracionária): razão do MIC do

agente utilizado em combinação pelo MIC do agente utilizado sozinho;

FICI (índice FIC): soma do

FIC de cada agente; os dados foram analisados segundo o critério estabelecido por Odds (2003):

FICI≤0,5: sinergismo; 0,5-4,0: sem interação e >4,0: antagonismo.

e) Ensaio de hemólise com o Hb40-61a

Como descrito no item 3.4, o ensaio foi realizado em dois tampões: PBS, de alta força

iônica e o IGP, de baixa força iônica. Os resultados obtidos se encontram na

Figura 25. Neste

caso, observa-se que, em ambos os casos, a atividade hemolítica foi baixa.

f) Cinética de morte celular causada pelo Hb40-61a

Os resultados obtidos em concentrações 2 e 10 vezes superior a MIC do peptídeo (25,0

e 62,5 µM, respectivamente) estão na Figura 26. Eles indicaram que o peptídeo é de ação

rápida, pois nas concentrações 2 x MIC e 10 x MIC já não havia mais células viáveis com 4 h

e 1 h de incubação, respectivamente.

Figura 25. Atividade do Hb40-61a sobre eritrócitos humanos. Resultados de dois ensaios

realizados em triplicata. PBS:

tampão fosfato de sódio. IGP: tampão fosfato isotônico.

Figura 26. Cinética de morte de C. albicans MDM8 na presença do Hb40-61a.

4.3 Estudos preliminares por dicroísmo circular

Em solução aquosa, todos os peptídeos apresentaram espectros típicos de estrutura

randômica [presença de banda negativa em 197nm (Figura 27)].

Nos espectros obtidos na presença de 200 mM de SDS, observou-se: 1) um

deslocamento da banda em 197 nm para a região do vermelho; 2) a banda na região de 220

0 1020304050

100

% Hemólise

Hb40-61a (µM)

PBS

Glicose

IGP

0 100 200 300 400 500

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

Log UFC/mL

Tempo (min)

Sem peptídeo

Hb40-61a 2xMIC

Hb40-61a 10xMIC

nm que apresenta valores negativos em relação ao espectro em água, o que sugere uma

aquisição de estrutura secundária (

Figura 28). Além disso, os espectros dos análogos com

encurtamento do C-terminal (Hb40-58a e Hb40-56a) diferiram daquele do Hb40-61a. O

análogo com substituição da Gly

por Ala parece ter se estruturado em α-hélice, no entanto,

o seu espectro apresenta bandas (205 e 220 nm) bastante semelhantes às presentes naquele do

Hb40-58

190 200 210 220 230 240 250 260

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

[θ]x10

-3

(deg cm

dmol

-1

)

λ (nm)

Hb40-61a

Hb40-58a

Hb40-56a

Hb35-56a

[Ala

]Hb40-58a

Hb40-63

Figura 27. Espectros de CD do Hb40-61a (20µM), Hb35-56a (20µM), Hb40-56a (20µM), [Ala57]

Hb40-58a (8µM) e Hb40-63 (12µM) em água, pH 4,0 a 20°C.

190 200 210 220 230 240 250 260

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

[θ]x10

-3

(deg cm

dmol

-1

)

λ (nm)

Hb40-61a

Hb40-58a

Hb40-56a

Hb35-56a

[Ala

]Hb40-58a

Hb40-63

Figura 28. Espectros de CD do Hb40-61a (20µM), Hb35-56a (20µM), Hb40-56a (20µM), [Ala57]

Hb40-58a (20µM) e Hb40-63 (20µM) em 200mM de SDS, pH 4,0 a 20°C.

5 DISCUSSÃO

5.1 Desenho dos peptídeos estudados

A escolha dos peptídeos estudados neste trabalho levou em consideração os dados de

Machado et al. (2003), Sforça et al. (2005) e Machado et al. (2007) obtidos no estudo da

relação estrutura-atividade antifúngica do peptídeo Hb33-61, os quais demonstraram que: 1)

em geral, a amidação da porção C-terminal levou a análogos mais ativos frente a

C. albicans

(

Tabela 1 do item 1.2); 2) os peptídeos Hb33-61a e Hb40-61a, na presença de micelas de

SDS, apresentam estruturas muito similares – presença de uma dobra na porção N-terminal

(Lys

-Phe

), uma alça flexível espacialmente organizada na porção Pro

-Leu

e uma outra

dobra na porção C-terminal (Ser

-Ser

) seguida por uma α-hélice (Ala

-Ala

), Figura 3 do

item 1.2; 3) a α-hélice C-terminal é essencial, mas não suficiente, para a expressão da

atividade antifúngica do Hb33-61

a e Hb40-61a (Tabela 1 do item 1.2); 4) na presença de

micelas de SDS, há uma única família de estruturas para o peptídeo Hb40-61a, pois o

hidrogênio do grupo amida terminal (Lys

) no Hb40-61a participa de uma ligação de

hidrogênio intramolecular com o oxigênio do resíduo de Gly

, restringindo a liberdade

conformacional desta porção, o que não ocorre para o análogo Hb40-61 que apresenta duas

famílias de estruturas; uma delas (família I) se assemelha a do Hb40-61

a (Figura 29); 5) o

peptídeo Hb40-61a apresentou a mesma MIC, igual capacidade de permeabilização da

membrana plasmática de C. albicans e hemólise que o Hb33-61a, sugerindo que ele fosse a

porção ativa deste último.

Os análogos Hb40-58a e Hb40-56a (Tabela 6 do item 4.2a) correspondem a análogos

do Hb40-61

a com encurtamento da α-hélice C-terminal em 3 e 5 resíduos, respectivamente, e

permanência de pelo menos 4 resíduos participantes da

α-hélice. O análogo com a troca da

Figura 29. Sobreposição das porções Lys

-Phe

(a) e de Ser

-Ser

(b) do Hb40-61a e das

famílias I e II de estruturas do Hb40-61 obtidos por RMN. Extraído de Machado et al. (2007).

Gly

por Ala, [Ala

]Hb40-58a, foi concebido visando estabilizar a porção correspondente à

α- hélice terminal deletada, já que a Ala tem sido descrita capaz de estabilizar esse tipo

de estrutura secundária (PACE; SCHOLTZ, 1998; SCOTT et al., 2007). O análogo amidado

do fragmento 33-56 da cadeia

α da hemoglobina humana (Hb35-56a) foi desenhado com base

no trabalho de Mak et al. (2004), os quais descreveram ter encontrado o Hb35-56 em sangue

menstrual humano (MIC>300mM frente a

C. albicans). Além disso, esse análogo ia de

encontro com os nossos objetivos, pois ele corresponde ao Hb33-52

a (Tabela 1 do ítem 1.2)

estudado por Machado et al. (2007) alongado no C-terminal ou ao Hb40-56a alongado no N-

terminal.

O fragmento Hb33-63 também pode estar presente no conteúdo intestinal do carrapato,

pois ensaios de substratos fluorogênicos com proteases purificadas do conteúdo intestinal ou

de um homogenato de células digestivas do carrapato de boi

B. microplus (realizados pelo

grupo de pesquisa colaborador do ICB; projeto de Doutoramento de C. E. CRUZ) apontam

Hb40-61a

Hb40-61

Família I Família II

Hb40-61

Família I Família II

um sítio de clivagem da cadeia

α da hemoglobina bovina entre os resíduos Ala

-Ala

. Assim

sendo, o

análogo Hb40-63 também foi incluído neste trabalho e corresponde ao análogo

Hb40-61 alongado em dois resíduos de aminoácidos na porção correspondente à

α-hélice.

Como também era interesse investigar a relação estrutura-atividade do peptídeo Hb33-

a frente a M. luteus, todos os análogos descritos acima foram testados. Nestes testes

também foram incluídos os seguintes análogos previamente estudados: a) o Hb33-52a,

análogo que contém as porções envolvidas nas dobras (Lys

-Phe

e Ser

-Ser

) e alça

flexível (Pro

-Leu

) do Hb33-61a; b) o Hb48-61a, análogo que contém a porção

correspondente a

α-hélice (Ala

-Ala

) do Hb33-61a; c) os Ac-Hb40-61a e Ac-Hb40-61, que

permitiram examinar o parâmetro carga líquida dos Hb40-61

a e Hb40-61.

5.2 Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos estudados

Os peptídeos Ac-Hb40-61a e Ac-Hb40-61 foram sintetizados manualmente pela

estratégia t-Boc e os demais pela estratégia Fmoc. A troca de estratégia t-Boc pela Fmoc foi

feita para: 1) tentar superar os problemas nas sínteses que empregaram a primeira

(MACHADO et al., 2007); 2) evitar o emprego do HF, substância de alta toxicidade e grande

poder corrosivo (LLYOD-WILLAMS et al., 1997). Os resultados obtidos mostraram que as

duas estratégias de síntese se mostraram igualmente aplicáveis para esta finalidade, já que os

peptídeos desejados foram os compostos majoritários nos perfis de RP-HPLC para a maioria

dos peptídeos brutos obtidos (

Figuras 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 do item 4.1). Por outro

lado, a estratégia Fmoc se mostrou superior em relação a t-Boc, pois como pode ser observado

nos perfis por RP-HPLC dos peptídeos brutos do Hb40-61a e Ac-Hb40-61a (Figuras 9A, 9B,

11A e 11B), esta forneceu produtos de melhor qualidade. Este dado concorda com outros

relativos a peptídeos sintéticos obtidos pelas duas estratégias, como por exemplo, antagonistas

da neurocinina A e análogos de colecistocinina que mostraram que a estratégia Fmoc foi

superior à t-Boc (ROVERO et al., 1991; MIRANDA et al., 1993a; MIRANDA et al., 1993b).

A purificação por RP-HPLC permitiu obter peptídeos finais de alto grau de pureza,

suficientes para a realização dos ensaios biológicos e análises por CD. Entretanto, os

rendimentos finais foram baixos, o que não é surpreendente para peptídeos contendo mais de

15 resíduos de aminoácidos obtidos pela SPFS. De fato, a seqüência e o tamanho determinam

a qualidade do peptídeo a ser purificado; é muito comum o componente majoritário não ser o

peptídeo desejado (BRAY, 2003).

5.3 Ensaios biológicos

Há diversos relatos de fragmentos da hemoglobina, que foram isolados de tecidos de

animais, com funções distintas da molécula original. Dentre as funções relatadas estão as de:

liberação de hormônios (SCHALLY et al., 1971, SCHALLY et al., 1978, CHANG et al.,

1980), analgesia (TAKAGI et al., 1979, FUKUI et al., 1983), constrição coronária

(BARKHUDARYAN et al., 1992, GALOYAN, 1998), produção de células sangüíneas

(IVANOV et al., 1992) e de inibição da enzima conversora de angiotensina (LANTZ et al.,

1991). A atividade antimicrobiana de um fragmento de hemoglobina foi descrita pela primeira

vez em 1999 (FOGAÇA et al., 1999) e posteriormente, por outros grupos (NAKAJIMA et al.,

2003; MAK et al., 2004; SONENSHINE, 2005, NEDJAR-ARROUME

et al., 2006).

Por outro lado, a digestão in vitro da hemoglobina produz peptídeos que apresentam

atividade opióide-like (BRANDTL et al., 1986), que potencializam a ação da bradicinina

(PIOT et al., 1992) ou que têm atividade antimicrobiana (MAK et al., 2000). Estes últimos

autores relataram que as proteínas hemoglobina, citocromo C e mioglobina não apresentavam

atividade bactericida e fungicida, mas se desprovidas do grupo heme e parcialmente

desnaturadas, as suas cadeias polipeptídicas passavam a exibir atividade frente a

microorganismos em concentrações bastante baixas (

µM). A informação que a hemoglobina

nativa não é ativa

per se concorda com ensaios realizados por nós (FOGAÇA et al., 1999);

entretanto, outros grupos descreveram que a hemoglobina intacta apresenta atividade

antimicrobiana (HOBSON; HIRSCH, 1958, PARISH et al., 2001). Essas diferenças poderiam

ser atribuídas ao uso de diferentes protocolos empregados nos diferentes laboratórios (a

manipulação poderia levar à desnaturação ou perda do grupo heme).

O nome “hemocidinas” (

HEMOglobin microbiCIDAL peptides) foi sugerido para os

fragmentos derivados de proteínas que contêm heme que apresentam atividade antimicrobiana

(MAK et al., 2000). Os fragmentos até agora descritos derivados de hemoglobina estão

listados na Tabela 14. Além disso, há duas patentes depositadas na PCT (Patent Cooperation

Treaty) de fragmentos de hemoglobina de répteis (WO99/17785) e mamíferos (WO99/17786)

com atividade antimicrobiana.

Tabela 14. Seqüências e modos de obtenção dos fragmentos derivados da hemoglobina com

atividade antimicrobiana

Peptídeo

Fragmento Obtenção Referência

FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK

α (33-61)

bovina

Conteúdo

intestinal do

carrapato de

boi

microplus

Fogaça et al.,

1999

VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERM

α (1-32)

humana

FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNA-

VAHVDDM

α (33-76)

humana

PNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL-

PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR

α (77-141)

humana

VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYP-

WTQRFLESFGDLSTPDAVM

β (1-55)

humana

GNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSEL-

HCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQ-

AAYQKVVAGVANALAHKYH

β (56-146)

humana

Clivagem

por brometo

cianogênio

VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALER

α (1-31)

humana

MFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALT-

NAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLR

α (32-92)

humana

VDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKF-

LASVSTVLTSKYR

α (93-141)

humana

VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGR

β (1-30)

humana

Digestão

por Arg-C

Mak et al.,

2000

Peptídeo

Fragmento Obtenção Referência

LLVVYPWTQR

β (31-40)

humana

FFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLA-

HLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFR

β (41-104)

humana

LLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANA-

LAHKYH

β (105-146)

humana

VLSAADKGNVKAAWGKVGGHAAE

(1-23)

bovina

Digestão por

pepsina

Froidevaux et

al., 2001

FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTN-

AVAHVDDM

α (33-76)

humana

VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSF-

PTTKTYF-PHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVA-

HVDDMR

α (1-76)

humana

PNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLP-

AEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR

α (77-141)

humana

VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYP-

WTQRFFESFGDLSTPDAVM

β (1-55)

humana

GNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSEL-

HCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQ-

AAYQKV-VAGVANALAHKYH

β (56-146)

humana

Clivagem

por brometo

cianogênio

Parish et al.,

2001

VLSPADKTNIK

α (1-11)

coelho

SPADKTNIKTAWEKIGS

α (3-19)

coelho

Conteúdo

intestinal do

carrapato de

coelho

Ornithodorus

moubata

Nakajima et

al., 2003

VCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH

β (111-146)

humana

WQKMVTAVASALSSRYH

γ (130-146)

humana

Placenta

humana

Liepke et al.,

2003

SFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVK

α (35-56)

humana

AHHFGKEFTPPVQAAYQKV-VAGVANALAHKYH

β (115-146)

humana

Sangue

menstrual

humano

Mak et al.,

2004

VTLASHLPSDFTPAVHASLDKFLANVSTVL

α (107-136)

bovina

Digestão por

pepsina

Daoud et al.,

2005

Mak et al.,

2000

Digestão

por Arg-C

Peptídeo

Fragmento Obtenção Referência

VTLASHLPSDFTPAVHASLDKFLANVSTVLTSKYR

(107-141)

bovina

STVLTSKYR

α (133-141)

bovina

TSKYR

(137-141)

bovina

QADFQKVVAGVANALAHRYH

β (126-145)

bovina

Digestão por

pepsina

Nedjar-

Arroume

al.,

2006

Neste trabalho, demos continuidade ao estudo da relação estrutura-atividade de uma

hemocidina sintética, o Hb33-61

a, frente a C. albicans que foram iniciados por Machado et

al. (2007). Uma vez sintetizados, purificados e caracterizados quimicamente os novos

análogos truncados sintéticos, passamos a testá-los. A C. albicans foi novamente escolhida

por nós pela sua importância na área da saúde.

Os resultados dos bioensaios (realizados em colaboração com a Profa. Dra. Sirlei

Daffre do Departamento de Parasitologia do ICB-USP e com a Profa. Dra. Elsa M. Mamizuka

do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da FCF-USP e o Dr. Nilton Lincopan

do IQ-USP) descritos nos

itens 4.2 permitiram concluir que, para a ação antifúngica, o

peptídeo Hb40-61a é a porção mínima do Hb33-61a. A menor atividade dos análogos Hb40-

58a e Hb40-56a pode ser devida à desestruturação da porção Ala

-Ala

que nos peptídeos

Hb33-61

a e Hb40-61a está envolvida na formação da α-hélice C-terminal; ela ressalta a

importância da porção correspondente à

α-hélice para a atividade. Pelos dados de CD, o

[Ala

]Hb40-58a pareceu ter se estruturado em α-hélice, entretanto, a diferença de interação

desse análogo com SDS em relação àquela do peptídeo Hb40-61

a poderia explicar a diferença

de atividades entre eles. Além das mudanças conformacionais apontadas, os novos análogos

apresentam em pH 5,1 (no qual foi realizado o ensaio frente à levedura) cargas líquidas

inferiores às dos análogos mais ativos (+6). Incluído entre eles está o Ac-Hb40-61

a, 4 vezes

menos ativo do que o Hb40-61a.

O M. luteus é uma espécie comumente utilizada para a detecção de compostos

antimicrobianos que nos últimos anos foi reconhecido como um agente causador de

meningite, bacteremia e choque séptico em pacientes imunodeprimidos (YANG et al., 2001).

Com relação à atividade frente a este microorganismo, os dados obtidos no presente estudo

(

Tabela 9 do item 4.2b) indicaram que: 1) a região C-terminal sozinha não é suficiente para

expressar a atividade total (assim como para a atividade antifúngica; Tabela 6 do item 4.2a);

2) uma redução expressiva da atividade ocorreu com a deleção da porção 33-47 (contendo a

dobra

β na porção N-terminal e parte da alça flexível espacialmente organizada) ou 53-61

(correspondente à

α-hélice da porção C-terminal), sendo o efeito mais acentuado nesta última;

3) apesar de o fragmento Hb40-61

a apresentar uma estrutura muito similar à encontrada para

o Hb33-61a pelos estudos de CD e

H-RMN em presença de micelas de SDS, este não é a

porção mínima frente a M. luteus. O fato da porção mínima ativa para a atividade antifúngica

não ser a mesma para a atividade antibacteriana de um peptídeo antimicrobiano é esperado e

concorda com observações anteriores feitas para diversos outros peptídeos, tais como a

protegrina-1 [no qual a deleção de quatro resíduos na porção N-terminal e dois na porção C-

terminal forneceu o análogo PC-17, que teve a sua atividade frente a

C. albicans diminuída,

enquanto a antibacteriana foi mantida (CHO et al., 1998)], a tanatina [na qual a remoção dos

três resíduos da porção N-terminal não influenciou a atividade antibacteriana, mas reduziu a

antifúngica (FEHLBAUM et al., 1996)]. As estrutura e composição de membrana desses

microorganismos são muito distintas e podem explicar os diferentes requisitos estruturais do

peptídeo necessários à expressão destes dois tipos atividades.

A diminuição da atividade frente ao aumento da força iônica do meio tem sido

observada para vários peptídeos antimicrobianos catiônicos, inclusive para algumas

hemocidinas (GANZ; LEHRER, 1995, TAM et al., 1999, MAK et al., 2000, ROTHSTEIN et

al., 2001). Algumas hipóteses para explicar essa redução na atividade em meios de alta força

iônica já foram levantadas. Dentre elas, o enfraquecimento da interação eletrostática inicial

entre as cargas positivas presentes nos peptídeos catiônicos e as cargas negativas de estruturas

da membrana do microorganismo (os LPS nas bactérias Gram-negativas, o ácido lipoteicóico

na maioria das bactérias Gram-positivas e a lipomanana no

M. luteus) resultaria em uma

diminuição/perda de atividade (DE LILLO et al., 1997, TAM et al., 2002). Outra hipótese é

que a sensibilidade a sais de certos peptídeos está relacionada às mudanças de estrutura

tridimensional. Park et al. (2004) mostraram que o análogo com a adição de motivos “helix

capping” nos N- e C-terminais ao peptídeo estruturado em

α- hélice — [RLLR]

— manteve

a estrutura e atividade em concentração elevada de sais, ao contrário do composto de partida,

que perdeu a estrutura e reduziu sua atividade nessas condições. Esses autores sugeriram que

a propriedade de estabilidade da hélice seria responsável pela integridade estrutural e

insensibilidade a sais em alta força iônica. Tam et al. (2002) estudando peptídeos com

motivos em folha

β estabilizados por pontes dissulfeto, relataram aumento da sensibilidade a

sais quando os mesmos foram linearizados. Essa influência da força iônica nas atividades dos

peptídeos representa um entrave para a introdução dos peptídeos antimicrobianos na clínica e

justifica o desenho de análogos com menor sensibilidade a sais (FRIEDRICH et al., 1999, YU

et al., 2000, TAM et al., 2000). No presente trabalho, as atividades antimicrobianas de todos

os peptídeos estudados foram influenciadas pela força iônica do meio (

Tabelas 8, 11 e 12 do

item 4.2), sugerindo que a busca por análogos menos suscetíveis deva ser perseguida ou que

os mais ativos, até agora o Hb40-61a, sejam submetidos a testes objetivando uso tópico ou

meios de baixa força iônica.

Os casos de infecções sistêmicas causadas por fungos que ocorrem principalmente em

pacientes imunodeprimidos têm aumentado nos últimos anos em decorrência do aumento do

uso de medicamentos imunossupressores, da infecção por HIV e do avanço na idade da

população (LUPETTI et al., 2002, WEI; BOBEK, 2004, RUHNKE, 2006). Por outro lado, as

infecções superficiais (de pele e mucosas) também são causadas por esses microorganismos

em pessoas saudáveis e imunocomprometidas (LUPETTI et al., 2002). Os fungos causam, por

exemplo, candidíase vulvovaginal em mulheres sadias e candidíase oral e esofágica em

pacientes portadores de HIV (REX et al., 1998). Nestas infecções, a

C. albicans continua

sendo a espécie mais prevalente, embora o número de isolados não-albicans tenha aumentado

(REX et al., 2000). Entre os fármacos utilizados para o tratamento dessas infecções estão os

antifúngicos poliênicos (como a anfotericina B), a 5-flucitosina e os inibidores da síntese do

ergosterol (dentre eles estão os derivados azólicos, como o fluconazol; WHITE et al., 1998,

SHEEHAN et al., 1999, REX et al., 2000). Entretanto, dificuldades como o aparecimento de

resistência a fluconazol de vários isolados do gênero

Candida, sobretudo nos portadores de

HIV, bem como problemas como toxicidade da anfotericina B, tem impulsionado a busca por

novos antifúngicos (LUPETTI et al., 2002). Portanto, o fato do Hb40-61a ter sido ativo frente

à cepa de C. albicans resistente a fluconazol abre novas perspectivas para o uso deste

peptídeo (

Tabela 7 do item 4.2a). Além disso, indica que o peptídeo tem um mecanismo

diferente daquele do fluconazol.

Vários trabalhos mostraram que peptídeos apresentam sinergismo com outros

compostos de ação antimicrobiana. Este é o caso da combinação do peptídeo “MUC-7 12-

mer” com outro peptídeo “Hsn5 12-mer” ou miconazol frente a

Cryptococcus neoformans

(WEI e BOBEK, 2004) e do peptídeo gomesina com o fluconazol frente ao mesmo

microorganismo (BARBOSA et al., 2007). Além disso, a associação de P18 e vancomicina

apresentou sinergismo frente a Enterococcus faecium resistente à vancomicina (VREF).

Neste contexto, decidimos investigar a possibilidade do Hb40-61a, que em trabalho anterior

se mostrou capaz de permeabilizar a membrana plasmática de

C. albicans a 62,5 µM

(MACHADO et al., 2007) e que interage com lipídeos presentes neste tipo de membrana,

poderia facilitar a entrada na célula de um outro antimicrobiano. O fluconazol, cujo alvo é

uma enzima envolvida na biossíntese do ergosterol que está presente no citoplasma (WHITE

et al., 1998), foi o escolhido. Infelizmente, os dados obtidos nos ensaios realizados não

confirmaram qualquer ação sinérgica do Hb40-61

a com o fluconazol, já que o índice

fracional de concentração inibitória (index FIC) foi 1,0 (Tabela 13 do item 4.2), indicando

ausência de sinergismo.

Em trabalho recente, relatamos que na faixa de concentrações 6,25-50,0

µM, os

peptídeos Hb33-61

a e Hb40-61a eram igualmente capazes de, após incubação por 18 h,

causar a morte de

C. albicans MDM8 e que em concentração 62,5 µM, após incubação por

1h, ambos foram capazes de permeabilizar a membrana plasmática deste fungo (MACHADO

et al., 2007). Anteriormente, também havíamos relatado que em 50,0

µM o peptídeo Hb33-

a causou 100% de morte de M. luteus em 25 min (FOGAÇA, 2003). A ação antimicrobiana

rápida é condizente com o observado para grande parte dos peptídeos antimicrobianos

descritos (HANCOCK, 2001), sugerindo uma atuação via permeabilização de membranas

celulares (FERNANDEZ-LOPEZ et al., 2001). No presente trabalho, a ação do peptídeo

Hb40-61

a frente a C. albicans MDM8 foi analisada em função do tempo (Figura 26 do item

4.2f

). A taxa de morte de C. albicans causada pelo peptídeo foi alta e comparável a outros

agentes peptídicos e não-peptídicos que, assim como o Hb40-61a, apresentam atividade

fungicida como, por exemplo, a anfotericina B (BARTIZAL et al., 1997, HONG et al, 1999).

Além disso, esta foi concentração-dependente, causando 100% de morte em 1h e 4h nas

concentrações de 2 e 10 x MIC do peptídeo, respectivamente. Na concentração de 2 x MIC do

peptídeo, apesar de uma redução inicial de 1 log de UFC/mL, ocorreu um período lag que

durou aproximadamente 100 min, sugerindo que o crescimento da levedura seja necessário

para ocorrer morte celular. De fato, o período de maior redução de células viáveis na presença

do peptídeo, também foi a de maior crescimento do controle. Portanto, outros mecanismos de

ação como inibição de síntese de macromoléculas (que sejam essenciais para a sobrevivência

da levedura) não podem ser descartados.

A determinação dos mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos é de

fundamental importância, uma vez que essa informação pode ser utilizada para o desenho de

novas drogas antibióticas e/ou mais específicas (MUÑOZ et al., 2006). Os primeiros

mecanismos de ação descritos tinham como alvo a membrana plasmática, mas devido à

diversidade desses compostos se tornou claro que este não era o único mecanismo possível

(ver

item 1.1). Como as hemocidinas são provenientes de proteínas com domínios de alto

conteúdo de

α-hélice de natureza anfipática, Mak et al. (2000) sugeriram que a morte de

microorganismos pelas hemocidinas envolvia a destruição da integridade da membrana

plasmática pelo modelo carpete. Além disso, pelos ensaios de permeabilidade de membrana

celular, Sforça et al. (2005) e Machado et al. (2007) sugeriram que o Hb40-61

a é um peptídeo

antimicrobiano de ação rápida que tem a membrana celular como alvo (HANCOCK; ROZEK,

2002). Para tentar obter mais indícios que fortaleçam esta suposição, o efeito do peptídeo

Hb40-61a sobre modelos de membranas biológicas está sendo investigado em um projeto em

colaboração com a Profa. Dra. Iolanda M. Cuccovia e da Dra. Kátia R. P. Daghastanli, do

nosso Departamento. Inicialmente, nossas colaboradoras realizaram experimentos de

vazamento de carboxifluoresceína encapsulada em lipossomos de fosfatidilcolina de ovo e

cardiolipina (7:3 p/p, relação peptídeo/lipídeo (mol/mol) = 153/30). Nessa concentração

testada, a adição do peptídeo Hb40-61

a a essas LUVs não ocasionou o vazamento do

marcador fluorescente para o meio que apresentava uma alta força iônica (tampão acetato

10mM, pH 5,1, contendo 300 mM de NaCl, concentração essa necessária para garantir o

equilíbrio iônico entre o meio interno e externo das vesículas). Estes resultados, porém,

concordam com aqueles obtidos nos ensaios microbiológicos (perda de atividade do peptídeo

Hb40-61

a em alta força iônica). Assim, as Dras. Cuccovia e Daghastanli realizaram

experimentos para investigar a interação do peptídeo com os mesmos lipossomos [relações

peptídeo/lipídeo (mol/mol) testadas: 1/30, 2/30, 4/30, 8/30, 16/30] nos quais a turvação da

mistura (devida à agregação dos lipossomos induzida pelo peptídeo) em várias concentrações

de NaCl (0, 25, 50 e 100 mM) foi acompanhada em 400 nm. Os resultados já obtidos

indicaram que a adição de peptídeo leva à agregação dos lipossomos, a qual diminui à medida

que a força iônica aumenta (a partir de 50mM de NaCl). A capacidade do peptídeo de causar

agregação de vesículas com carga negativa é uma indicação de que as interações eletrostáticas

são essenciais para a atividade antimicrobiana desse peptídeo e que o sal pode antagonizar

essa interação. Em colaboração com a Dra. Karin A. Riske, do Departamento de Biofísica da

UNIFESP, também foram realizados experimentos de microscopia óptica envolvendo GUVs

constituídas de fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol de ovo (7:3 p/p) e o peptídeo Hb40-61

(relações peptídeo/lipídeo (mol/mol) testadas: 1/10, 1/20 e 1/100). Na ausência de sal, pH 5-6,

somente na maior relação peptídeo/lipídeo testada, o peptídeo foi capaz de interagir com as

GUVs provocando a formação de um “poro” e o extravasamento do conteúdo interno da

vesícula (

Figura 30). Com base nos resultados apresentados, não pudemos comprovar as

sugestões prévias de Sforça et al. (2005) e Machado et al. (2007). Novos ensaios, essenciais

para a continuidade do projeto, já foram programados pelas colaboradoras.

Muitos peptídeos com ação antibiótica apresentam certo grau de toxicidade a células

de mamíferos. A toxicidade do peptídeo Hb40-61

a foi medida pela determinação da sua

atividade hemolítica. Neste caso, o peptídeo apresentou baixa hemólise em tampões de alta

(PBS) e baixa força iônica (IGP). Análises anteriores de CD mostraram que os peptídeos

Hb33-61a e Hb40-61a interagiam com o lipídeo de carga negativa SDS, mas não com o

lipídeo zwitteriônico LPC (SFORÇA et al., 2005, MACHADO et al., 2007). Essa seletividade

de ação sobre as bactérias em relação a células de mamíferos pode ser explicada por uma

Figura 30. Microscopia óptica utilizando vesículas gigantes (GUVs) constituídas de

fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol de ovo (7:3 p/p) e o Hb40-61a.

(A): injeção do peptídeo; (B),

sal.

diferença na composição dos lipídeos dessas membranas (ZASLOFF, 2002, TOKE, 2005,

GLUKHOV, 2005). Enquanto as membranas de eucariotos apresentam predomínio de

lipídeos zwitteriônicos na face externa das bicamadas lipídicas (por exemplo, a

fosfatidilcolina), as membranas externas das bactérias apresentam além de lipídeos

zwitteriônicos (como por exemplo, fosfatidiletanolamina), 20 a 25% de lipídeos com carga

negativa (por exemplo, o fosfatidilglicerol e a cardiolipina) (ZASLOFF, 2002, TOKE, 2005,

GLUKHOV, 2005).

A observação de que o Hb40-61

a foi pouco ativo em tampões de alta (PBS) e baixa

força iônica (IGP) confirmou que a sua baixa atividade hemolítica, anteriormente relatada por

Machado et al (2007), não era devida à alta força iônica do meio de medida da atividade

hemolítica. Em outras palavras, o Hb40-61a é, de fato, um peptídeo antimicrobiano de baixa

toxicidade.

5.4 Análise por dicroísmo circular

Na tentativa de correlacionar os resultados obtidos nos bioensaios com os

comportamentos conformacionais dos peptídeos estudados, foram feitas análises preliminares

em presença de 200 mM de micelas de SDS (meio anteriormente empregado para a

determinação das estruturas dos peptídeos Hb33-61

a e Hb40-61a por H

-RMN). Para tanto,

contamos com o auxílio da Dra. Luciana M. Quaglio.

Como descrito no

item 4.3, foram observadas diferenças entre o comportamento

conformacional do Hb40-61a e os dos seus análogos menos ativos. Infelizmente, não houve

tempo hábil para o registro de novos espectros e análise detalhada destas diferenças, o que

será feito na continuação do estudo da relação estrutura-atividade antimicrobiana do

Hb40-61a.

6 CONCLUSÕES

A busca por novos compostos com ação antibótica ou informações que permitam

compreender o modo com eles a exibem é uma preocupação atual devido ao aparecimento

crescente de resistência microbiana aos antibióticos usuais. Além disso, é esperado que o

número de infecções causadas por microorganismos oportunistas, tais como

C. albicans,

aumentem com o avanço do número de pacientes imunocomprometidos pela AIDS, idade e

transplantes. Por estas razões, os peptídeos antimicrobianos constituem uma classe de

compostos atraente, pois, têm como características: promover a rápida morte de

microorganismos, induzir menor aparecimento de resistência, poder apresentar amplo

espectro de ação contra vírus, bactérias, fungos e parasitas e servir de modelos para o

desenvolvimento de novos fármacos, tais como análogos peptídicos e peptidomiméticos

(HANCOCK, 2001, HELMERHORST

et al., 1999).

Neste trabalho, demonstramos que o Hb40-61a é a porção mínima ativa do Hb33-61a

frente a C. albicans, confirmando as suposições de Machado et al. (2007), os quais detectaram

a presença dos mesmos motivos estruturais em ambos os peptídeos. Também evidenciamos

que o Hb40-61

a, não é a porção ativa do Hb33-61a frente a M. luteus, sugerindo que os

requisitos estruturais para a exibição da atividade total frente aos dois microorganismos sejam

diferentes. Além disso, coletamos novos dados que corroboram os anteriormente obtidos e

sugerem que a ação antifúngica/fungicida desta hemocidina sintética ocorre pela perturbação

da integridade da membrana plasmática de

C. albicans.

Por ser linear, de médio tamanho, ativo em baixas concentrações contra C. albicans

(inclusive frente a cepa resistente a fluconazol) e

M. luteus e, além disso, apresentar ação

fungicida rápida e baixa toxicidade frente a células de mamíferos, pode se tornar: 1) um

composto de interesse comercial, desde que o seu uso seja tópico ou limitado a meios de baixa

força iônica (água doce, por exemplo); 2) um modelo de estudos: i- para a elucidação de

mecanismo de ação de antimicrobianos de mesmas características estruturais; ii- da interação

com modelos membranares; iii- de possibilidades de diminuição da influência da força iônica

na sua atividade antimicrobiana.

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