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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
MARIANA GROCHOSKI
ESTUDO DA REGULAÇÃO EPIGENÉTICA POR METILAÇÃO DO RECEPTOR DE
QUIMIOCINAS CXCR4 NO CÂNCER DE MAMA
CURITIBA
2008
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1
MARIANA GROCHOSKI
ESTUDO DA REGULAÇÃO EPIGENÉTICA POR METILAÇÃO DO RECEPTOR DE
QUIMIOCINAS CXCR4 NO CÂNCER DE MAMA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia, Área de concentração em Patologia,
Departamento de Patologia Básica, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas.
Orientadora:
Dra. Giseli Klassen - Departamento de Patologia
Básica, UFPR.
Co-orientador:
Dr. Emanuel Maltempi de Souza - Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, UFPR.
CURITIBA
2008
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3
À minha família, pessoas que amo, respeito e
confio...por serem minha vida...
4
AGRADECIMENTOS
À Profª Giseli Klassen, Depto. de Patologia Básica/UFPR, pela orientação,
pelas críticas e pelo empenho em desenvolver este trabalho.
Ao Profº Emanuel M. de Souza, Depto. de Bioquímica e Biologia
Molecular/UFPR, pela co-orientação, pelo apoio e por permitir o acesso aos
equipamentos e aos laboratórios.
Às colegas de laboratório Gerusa, Edneia, Simone, Cristiane e Gleize pela
paciência, pelos momentos agradáveis e pela ajuda nos momentos mais difíceis.
Ao Profº. Dr. Iglenir Cavalli e à Profª. Dra. Enilze Ribeiro, Depto. de
Genética/UFPR, por fornecerem as amostras tumorais de mama. Ao Dr. Rubens,
HC/UFPR, pelo auxílio na coleta dos dados clínicos das pacientes.
Ao Profº. Dr. Sílvio Zanata, Depto. de Patologia Básica/UFPR, à Profª. Dra.
Guilhermina Noleto, Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular/UFPR, por
disponibilizarem a estufa de CO
2
para o cultivo das linhagens celulares de mama.
À Profª. Dra. Anamaria Camargo, do Instituto Ludwig/SP, por ceder as
linhagens de mama, e, por permitir o acesso ao Laboratório de Biologia Molecular e
Genômica para desenvolvimento de algumas etapas deste trabalho.
Aos alunos dos Laboratórios de Biologia Molecular, Depto. de Biologia
Celular e Molecular/UFPR, de Cultivo Celular, Depto. de Bioquímica e Biologia
Molecular/UFPR, pelo convívio, pela ajuda e por dividir o espaço e equipamentos.
Aos alunos dos Laboratórios de Genética Molecular Humana e do LIGH,
Depto. de Genética/UFPR, por auxiliarem na quantificação das amostras de RNA e
DNA, na coleta das amostras tumorais de mama e das informações clínico-
patológicas das pacientes.
Ao Valter Antonio de Baura, Depto. de Bioquímica/UFPR, pelas conversas,
pela paciência e pelo apoio, principalmente na etapa do sequenciamento.
Ao Dr. Roberto Andreattini, Depto. de Farmacologia/UFPR, pelo auxílio na
análise estatística.
Aos meus pais, Antonio e Rosicler, aos meus irmãos Daniel, Ana Paula e
Mariângela, pelo incentivo, pela força, pela confiança, pela presença, por serem tão
especiais e fundamentais na minha vida.
À CAPES, pelo suporte financeiro e pela bolsa de Mestrado de um ano
concedida.
5
"O degrau de uma escada não serve
simplesmente para que alguém permaneça em
cima dele, destina-se a sustentar o pé de um
homem pelo tempo suficiente para que ele
coloque o outro um pouco mais alto".
Thomas Huxley
6
RESUMO
A maioria das quimiocinas e seus receptores estão envolvidos com o
desenvolvimento e a progressão do câncer. O fator derivado de estroma 1 (SDF-1
ou CXCL12) interage com seu receptor, CXCR4, desencadeando a adesão,
sobrevivência, proliferação e migração celular. Este receptor é superexpresso em
vários tipos de câncer, inclusive de pulmão, pâncreas, cérebro e mama. No câncer
de pâncreas e em melanomas demonstrou-se que a expressão poderia ser regulada
pela metilação da região promotora deste gene. Diante deste contexto, objetivou-se
avaliar a participação da metilação do DNA no controle da expressão do gene
CXCR4 em linhagens tumorais de mama para posterior correlação com aspectos
clínico-patológicos de tumores primários de mama. Para isso, foi avaliada a
expressão do gene CXCR4 por RT-PCR. As linhagens PMC-42, MCF-7 e MDA-MB-
436 apresentaram superexpressão do gene em estudo quando comparado com o
gene de expressão constitutiva GAPDH. Por outro lado, observou-se que a linhagem
MDA-MB-435 apenas expressou este gene após tratamento com agente
desmetilante 5'-aza-2'-deoxicitidina, sugerindo que em tumores de mama poderia
ocorrer a regulação da expressão gênica por metilação da região promotora do
gene. Para confirmar essa hipótese e analisar o perfil de metilação, um fragmento de
184 pb da ilha de CpG-2 presente na região promotora do gene CXCR4 foi clonada
das linhagens após tratamento do DNA com agente deaminante bisulfito de sódio.
Os clones obtidos foram seqüenciados e a partir da análise dos dados concluiu-se
que as linhagens que superexpressaram o CXCR4 apresentaram uma densidade de
metilação inferior a 20%; enquanto a linhagem MDA-MB-435, que não expressou o
CXCR4, apresentou um percentual de metilação superior a 90%. Os dados de
sequenciamento foram confirmados através da técnica de digestão com enzima de
restrição (COBRA). A partir do perfil de metilação obtido pelo seqüenciamento, foram
escolhidos os dinucleotídeos 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, que se
apresentaram diferencialmente metilados entre as linhagens que expressaram e não
expressaram o gene CXCR4. Em seguida, empregou-se a técnica de MSP
(Methylation Specific PCR) para analisar a metilação em DNA de tumores primário
de mama. Observou-se que todas as 76 amostras de tumores de mama foram
positivas para a reação não metilada e 36% das amostras foram positivas também
para a reação metilada. Não foi observada correlação com valor estatístico entre a
metilação da região promotora do gene CXCR4 e o estadio (p=0,514), tamanho do
tumor (p=0,273), expressão de ER (p=0,514), expressão de PR (p=0,539),
ocorrência de metástase e óbito (p=0,505), tipo de tumor (p=0,189), grau de
diferenciação histológico (SBR) (p=0,267), comprometimento de linfonodos
(p=0,793), expressão do fator de crescimento ERBB2 (p=0,838), ocorrência de
recidiva (p=1,000). A freqüência de metilação para todas estas características
clínico-patológicas variou de 27 a 47%. Estes resultados sugerem a regulação
epigenética do gene CXCR4 por metilação do DNA no câncer de mama, como
observado em carcinomas primários de pâncreas e melanomas.
Palavras-chave: câncer de mama, receptor de quimiocinas CXCR4, metilação do
DNA.
7
ABSTRACT
Many chemokines and chemokine receptors are involved in the cancer development
and progression. The human stromal cell-derived factor-1 (SDF-1 or CXCL12)
interacts with its receptor, CXCR4, promoting adhesion, survival, proliferation and
migration. This receptor is up-regulated in several types of tumors, including lung,
pancreas, brain and breast. In the pancreas and in melanomas was demonstrated
that the expression could be regulated by methylation of promoter region of CXCR4
gene. In this context, we aimed to evaluate the role of cytosine methylation in the
regulation of CXCR4 gene expression in breast cancer cell lines and to verify if there
is a correlation with clinic-pathologic aspects of primary breast tumor. Thus, was
evaluated the CXCR4 expression in breast cancer lines through Reverse
Transcription PCR (RT-PCR). It was verified that MCF-7, PMC-42 and MDA-MB-436
cell lines presented up-regulation of CXCR4 when compared with the constitutive
expression gene GAPDH. On the other hand, it was verified that the lineage MDA-
MB-435 just expressed CXCR4 mRNA after treatment with 5'-aza-2'-deoxycitidine,
suggesting that in breast tumors could exist regulation of gene expression through
methylation of promoter region. To confirm this hypothesis and to analyze the
methylation pattern, an 184 pb-fragment of CpG island-2 within promoter region of
CXCR4 gene was cloned after treatment of DNA with bisulfite sodium. The clones
were sequenced and the analyzes of these data demonstrated that the lines that
express CXCR4 presented methylation density less that 20%. The line MDA-MB-435,
that didn't express CXCR4, presented a methylation percentage higher to 90%.
These results were confirmed by Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA).
For the methylation status obtained by sequencing was choosing the dinucleotides 1,
2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, 14,15 and 16, which showed differential methylation between
the lines that expressed and didn’t express the CXCR4 gene. Following, was used
Methylation Specific PCR for methylation analysis of primary breast tumor samples.
We observed that all 76 breast cancer samples were positive for methylated reaction
and 35,6% were also positive for unmethylated reaction. We didn’t found correlation
significant between methylation and unmethylation status of promoter region of
CXCR4 gene with stage (p=0,514), tumor size (p=0,273), ER expression (p=0,514),
PR expression (p=0,539), occurrence of metastasis an death (p=0,505), tumor type
(p=0,189), histology differentiation grade (SBR) (p=0,267), lymph node involvement
(p=0,793), growth factor expression ERBB2 (p=0,838), recurrence (p=1,000). The
frequency of methylation for all these characteristics range of 27 to 47%. These
results suggest the epigenetic regulation of CXCR4 gene by DNA methylation in
breast cancer, as observed previously in pancreas carcinomas and melanomas.
Key words: breast cancer, chemokine receptor CXCR4, DNA methylation.
8
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - A) ESTIMATIVA PARA 2008 DOS TIPOS DE CÂNCER COM
MAIOR INCIDÊNCIA NA POPULAÇÃO BRASILEIRA. (B)
REPRESENTAÇÃO DAS TAXAS BRUTAS DE INCIDÊNCIA
DO CÂNCER DE MAMA POR 100 MIL MULHERES,
ESPERADAS PARA O MESMO ANO......................................
14
FIGURA 2 - ESQUEMA DA MODIFICAÇÃO COVALENTE DO DNA.........
19
FIGURA 3 - TOPOLOGIA GERAL DE UM RECEPTOR DE
QUIMIOCINAS..........................................................................
25
FIGURA 4 - ESQUEMA DO GENE CXCR4 MOSTRANDO A POSIÇÃO
DAS QUATRO ILHAS DE CpG E DOS FRAGMENTOS (F1 e
F2) ESTUDADOS......................................................................
34
FIGURA 5 - ESQUEMA REPRESENTATIVO DO MAPA DE RESTRIÇÃO
DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR NESTED............
47
FIGURA 6 - RESULTADO OBTIDO PELO PROGRAMA CpGPLOT..........
51
FIGURA 7 - RT-PCR SEMI-QUANTITATIVO DOS GENES CXCR4 E
GAPDH COM 30, 35 E 38 CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO........
53
FIGURA 8 - RT-PCR PARA OS GENES GAPDH E CXCR4 COM 35
CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO...................................................
55
FIGURA 9 - RESULTADO DA ANÁLISE POR COBRA OBTIDO PARA
OS FRAGMENTOS 1 (ILHA DE CpG-2) E 2 (ILHA DE CpG-
3/4) DO GENE CXCR4..............................................................
60
FIGURA 10 - AMOSTRAS DE DNAs EXTRAÍDOS DOS TUMORES
PRIMÁRIOS DE MAMA............................................................ 62
FIGURA 11 - NESTED PCR DO GENE SATR1 COM OS DNAs
TUMORAIS................................................................................ 63
FIGURA 12 - PADRONIZAÇÃO DA REAÇÃO DE MSP COM AS
LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA....................................... 63
FIGURA 13 - AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE MSP
REAÇÃO U E M DO GENE CXCR4......................................... 64
FIGURA 14 - REAÇÃO DE MSP COM AMOSTRAS DE
FIBROADENOMAS................................................................... 65
FIGURA 15 - REAÇÃO DE MSP COM AMOSTRAS DE TUMORES
PRIMÁRIOS DE MAMA............................................................ 66
FIGURA 16 - LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES UTILIZADOS NAS
REAÇÕES DE RT-PCR PARA OS GENES CXCR4 (A) E
GAPDH (B)................................................................................ 96
9
LISTA DE QUADROS, TABELAS E ESQUEMAS
QUADRO 1 - FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DA MAMA...........
15
QUADRO 2 - CARACTERÍSTICAS DOS INICIADORES ESPECÍFICOS
PARA AS REAÇÕES DE RT-PCR......................................... 35
TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO CATEGÓRICA DOS DADOS CLÍNICOS
DAS PACIENTES ANALISADAS E A FREQÜÊNCIA DE
METILAÇÃO DO GENE CXCR4............................................
70
ESQUEMA 1 - LOCALIZAÇÃO DOS INICADORES PARA NESTED PCR
DO FRAGMENTO 1 DA ILHA DE CpG-2 DO GENE
CXCR4....................................................................................
39
ESQUEMA 2 - LOCALIZAÇÃO DOS INICADORES PARA NESTED PCR
DO FRAGMENTO 2 DAS ILHAS DE CpG 3-4 DO GENE
CXCR4.................................................................................... 40
ESQUEMA 3 - LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES ESPECÍFICOS PARA
REAÇÃO DE MSP..................................................................
49
ESQUEMA 4 - PERFIL DE METILAÇÃO OBTIDO PARA O FRAGMENTO
DE 184 pb DA ILHA DE CpG-2 DO GENE CXCR4, PARA
A LINHAGEM MDA-MB-436 (A), MCF-7 (B), PMC-42 (C) E
MDA-MB-435 (D)....................................................................
58
10
LISTA DE ABREVIATURAS
5-Aza-CdR - 5-aza-2’-deoxicitidina
AJCC - do inglês American Joint Committee on Cancer
BLAT - do inglês BLAST-Like Alignment Tool
BRCA1 - do inglês Breast Cancer Gene 1
COBRA – do inglês Combined Bisulfite Restriction Analysis
DNMT - DNA metiltransferase
EMBL – do inglês European Bioinformatics Institute
ERBB2 – receptor do fator de crescimento epidermal humano
GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
GPCR - receptor acoplado à proteína G
HAT - histona acetiltransferase
HDAC - histonas desacetilase
HUVEC - célula endotelial vascular umbilical humana
JAK – do inglês Janus Kinase
LICR-SP - Instituto Ludwig de Pesquisa em Câncer de São Paulo
LOI - perda de imprinting
MGMT - do inglês O
6
-methylguanine-DNA methyltransferase
MSP – do inglês Methylation Specific PCR
NCBI - do inglês National Center of Biotechnology Info
Nr - do inglês Non-redundant
PCNA - antígeno nuclear de proliferação celular
Rb - proteína retinoblastoma
RE - receptor de estrógeno
RP - receptor de progesterona
RPMI - do inglês Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR - do inglês Reverse Transcription PCR
SATR1 - seqüência satélite 1
SBR - sistema de Scarff-Bloom e Richardson – Sistema de graduação histológica
para tumores de mama
SPSS - do inglês Statistical Package for Social Science
STAT – do ingles Signal Transducer and Activator of Transcription
11
TAM - macrófago associado ao tumor
TDG - timina DNA glicosilase
TMA - do inglês tissue microarray
TNM - do inglês Tumor Node Metastasis - Sistema de Classificação Tumoral
TSA – tricostatina A
UDG - uracil DNA glicosilase
UICC - do francês Union Internationale Contre le Cancer
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular
VHL - gene supressor de tumor von Hippel-Lindau
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................14
1.1 CÂNCER DE MAMA ...........................................................................................14
1.1.1 Principais tipos de câncer de mama.................................................................15
1.1.2 Fatores de risco................................................................................................15
1.1.3 Prognóstico, diagnóstico e tratamento do câncer de mama.............................16
1.1.4 Estadiamento e marcadores moleculares do câncer de mama........................17
1.2 EPIGENÉTICA ...................................................................................................19
1.2.1 Metilação e câncer ...........................................................................................21
1.2.2 Terapêutica anti-tumor e metilação .................................................................23
1.3 RECEPTOR DE QUIMIOCINAS CXCR4 ............................................................24
1.3.1 Importância do par CXCR4-CXCL12 no câncer...............................................26
2. OBJETIVOS..........................................................................................................30
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................30
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...............................................................................30
3 MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................31
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO .....................................................................................31
3.1.1 Linhagens celulares de mama..........................................................................31
3.1.1.1 Cultivo celular................................................................................................32
3.1.1.2 Teste para detecção de contaminação por Mycoplasma hominis.................32
3.1.2 Amostras tumorais de mama............................................................................33
3.2 IDENTIFICAÇÃO DAS ILHAS DE CpG PRESENTES NO GENE CXCR4..........33
3.3 AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DO GENE CXCR4 EM
LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA ........................................................................34
3.3.1 Extração de RNA total das linhagens celulares de mama................................35
3.3.2 Síntese da primeira fita de cDNA .....................................................................36
3.3.3 Semi-Quantitative Reverse Transcription-PCR- RT-PCR Semi-Quantitativo do
gene CXCR4 .............................................................................................................37
3.3.4 Tratamento com agente desmetilante 5-Aza-2-deoxicitidina (5-Aza-CdR).......37
3.4 CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO PROMOTOR DO GENE
CXCR4......................................................................................................................38
3.4.1 Desenho de iniciadores específicos para Nested PCR ....................................38
3.4.2 Extração de DNA das linhagens e das amostras de tumores primários de
mama ........................................................................................................................41
3.4.2.1 Extração de DNA das linhagens de mama....................................................42
3.4.2.2 Extração de DNA das amostras de tumores primários de mama..................42
3.4.3 Tratamento do DNA extraído das linhagens e dos tumores primários de mama
com bissulfito de sódio ..............................................................................................43
3.4.4 Amplificação dos fragmentos das ilhas de CpG do gene CXCR4....................43
3.4.5 Clonagem e seqüenciamento do fragmento 1 da ilha de CpG-2 do gene
CXCR4 ......................................................................................................................44
3.4.6 COmbined Bisulfite Restriction Analysis- COBRA dos fragmentos das Ilhas de
CpG do gene CXCR4................................................................................................46
3.4.6.1 Eletroforese em géis de poliacrilamida..........................................................47
3.4.7 Análise da metilação em amostras de tumores de mama por Methylation
Specific PCR- MSP ...................................................................................................48
3.4.7.1 Reações de MSP ..........................................................................................49
13
3.4.7.2 Correlação entre o padrão de metilação do gene CXCR4 nos tumores
primários de mama e os dados clínico-patológicos das pacientes............................50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................51
4.1 ANÁLISE IN SILICO DO GENE CXCR4 .............................................................51
4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE CXCR4 NAS LINHAGENS TUMORAIS
DE MAMA..................................................................................................................52
4.3 ANÁLISE DA METILAÇÃO DO GENE CXCR4 EM LINHAGENS TUMORAIS DE
MAMA .......................................................................................................................56
4.3.1 Análise da metilação pelo método de COBRA .................................................60
4.4 ANÁLISE DA METILAÇÃO EM AMOSTRAS DE TUMORES PRIMÁRIOS DE
MAMA .......................................................................................................................62
4.4.1 Análise estatística dos dados clínico-patológicos correlacionados com a
metilação da região promotora do gene CXCR4.......................................................68
5 CONCLUSÃO........................................................................................................75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................76
ANEXOS...................................................................................................................92
ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO ............................................................92
ANEXO 2 - ESTADIAMENTO CLÍNICO....................................................................93
ANEXO 3 – LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES ESPECÍFICOS PARA RT-PCR...96
ANEXO 4 - QUADRO DOS DADOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS DAS 76 PACIENTES
E DOS RESULTADOS DE MSP ...............................................................................97
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER DE MAMA
O câncer de mama é a principal neoplasia que acomete o sexo feminino e
representa um dos maiores problemas de saúde pública em todo o mundo
(MONTEIRO et al., 2003). Para o ano de 2008 foram estimados mais de 180 mil
novos casos entre as mulheres e aproximadamente 40 mil mortes decorrentes do
câncer de mama nos EUA (JEMAL et al., 2008). Para o Brasil, estima-se que neste
mesmo ano o câncer de mama corresponda à terceira neoplasia de maior incidência
na população (FIGURA 1), com 49.400 novos casos e com um risco estimado de 51
casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2007).
Homens
Mulheres
N° de casos
A B
Próstata Pulmão
Cólon
Reto
Estômago Mama
Colo do
útero
FIGURA 1 – (A) ESTIMATIVA PARA 2008 DOS TIPOS DE CÂNCER COM MAIOR
INCIDÊNCIA NA POPULAÇÃO BRASILEIRA. (B) TAXAS BRUTAS
DE INCIDÊNCIA DO CÂNCER DE MAMA POR 100 MIL MULHERES,
ESPERADAS PARA O MESMO ANO.
FONTE: INCA, 2007.
NOTA: No gráfico indicado em (A) não está representada a neoplasia mais incidente na população
brasileira, que é o câncer de pele não-melanoma. No mapa indicado pelo item B, pode-se observar
que nas regiões sul e sudeste o câncer de mama é a neoplasia mais incidente e freqüente entre as
mulheres.
15
1.1.1 Principais tipos de câncer de mama
Os carcinomas correspondem ao principal tipo de câncer de mama e podem
acometer as estruturas ductais e lobulares da glândula mamária, manifestando-se
na forma in situ, microinvasiva ou invasiva. Em função dos adenocarcinomas serem
referidos como carcinomas nos trabalhos descritos na literatura, foi adotado neste
estudo o último termo. O carcinoma in situ corresponde a uma fase inicial do
processo de tumorigênese e se caracteriza pela proliferação epitelial maligna
confinada aos tecidos mamários. Nos carcinomas microinvasivos, as células
neoplásicas se estendem além da membrana basal, invadindo o estroma mamário,
sem formar focos tumorais maiores do que 0,1 cm em sua maior dimensão. Os
tumores microinvasivos, embora representem uma forma inicial de invasão tumoral,
possuem prognóstico tão favorável quanto os tumores in situ. Por fim, os tumores
invasivos ocorrem em estadios mais avançados, quando as células tumorais
rompem a membrana basal e infiltram o tecido adjacente (FILHO, 2000; HODA, et
al., 2001). O carcinoma ductal invasivo representa a maioria (aproximadamente
75%) dos casos de câncer de mama e, em seguida, tem-se o carcinoma lobular
invasivo, o qual representa cerca de 10% dos casos (FARIA, 1999; FILHO, 2000).
1.1.2 Fatores de risco
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de mama
estão listados no quadro 1, a seguir.
FATORES DE RISCO
MAGNITUDE
DO RISCO
Idade avançada (superior a 45 anos) ++
História familiar de câncer de mama ++
Estimulação estrogênica prolongada: menopausa tardia (depois dos
54 anos), primeira gestação tardia (após 30 anos), menarca precoce
(antes dos 12 anos) e nuliparidade
++
Doenças genéticas: síndrome de Li-Fraumeni (mutações do gene
p53 em células germinativas), mutações em genes BRCA1 e 2
++
16
FATORES DE RISCO
MAGNITUDE
DO RISCO
Exposição à radiação ionizante ++
Terapia de reposição hormonal, uso de contraceptivos orais +
Obesidade pós-menopausa +
Consumo de álcool, dieta +
QUADRO 1 - FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER DA MAMA.
FONTE: DUMITRESCU; COTARLA, 2005.
++ Aumento moderado a elevado no risco de desenvolver câncer de mama
+ Baixo a moderado aumento no risco de desenvolver câncer de mama
1.1.3 Prognóstico, diagnóstico e tratamento do câncer de mama
O acometimento dos linfonodos axilares, o tamanho do tumor, o tipo e o grau
histológico, os níveis de expressão de receptores de progesterona (RP) e estrógeno
(RE), constituem os principais parâmetros empregados para a determinação do
prognóstico do câncer de mama (FARIA, 1999; FILHO, 2000; VIANA; MARTINS;
GEBER, 2001).
A constatação de linfonodos axilares afetados ratifica o potencial metastático
do tumor. A dimensão do tumor está associada, em geral, à sobrevida das pacientes
e ao comprometimento de linfonodos. Certos tipos histológicos fornecem um
prognóstico favorável, como o carcinoma tubular, colóide e papilar, ou o oposto,
como o carcinoma inflamatório, considerado o tipo de câncer de pior prognóstico.
Quanto à diferenciação histológica, os tumores mais diferenciados (graus I e II)
possuem melhor prognóstico. Por fim, tumores que expressam receptores hormonais
(RE+ e RP+) são mais diferenciados, apresentam melhor prognóstico e geralmente
estão associados à maior sobrevida (FARIA, 1999; FILHO, 2000; VIANA; MARTINS;
GEBER, 2001).
O diagnóstico precoce do câncer de mama é fundamental para o sucesso
do tratamento e para a cura da doença. Quando o tumor é detectado em estadios
iniciais a taxa de cura da doença é superior a 90%. No Brasil, aproximadamente
70% dos casos de câncer de mama ainda são diagnosticados tardiamente
(HOSPITAL DO CÂNCER AC CAMARGO, 2008).
Os métodos de detecção do câncer de mama comumente usados incluem o
auto-exame das mamas, a mamografia e o ultra-som. A prática do auto-exame é
17
considerada relevante, pois, segundo Morales, Pinedo e Vigil (1994), cerca de 90%
das patologias mamárias são detectadas nas fases iniciais pelas próprias pacientes.
A mamografia de alta resolução é apontada como o principal método diagnóstico do
câncer de mama em estadio inicial, capaz de detectar alterações ainda não
palpáveis, favorecendo assim o tratamento precoce, mais efetivo e menos agressivo.
Recomenda-se a mamografia anual para mulheres com idade superior a 40 anos
(HOSPITAL DO CÂNCER AC CAMARGO, 2008). O ultra-som apresenta baixa
especificidade e altos índices de falsos positivos e negativos. É um exame que
complementa a mamografia e é também empregado para guiar punções citológicas
ou histológicas (VIANA; MARTINS; GEBER, 2001).
Para confirmação do diagnóstico são utilizados outros exames, incluindo a
biópsia. A cintilografia, tomografia computadorizada e ressonância magnética
possibilitam determinar o estadiamento da doença bem como a ocorrência de
metástases (VIANA; MARTINS; GEBER, 2001).
A cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia são as intervenções terapêuticas
tradicionais no tratamento do câncer. Recentemente, também tem sido utilizada a
imunoterapia e hormonioterapia para modulação da resposta biológica no câncer de
mama (VIANA; MARTINS; GEBER, 2001).
1.1.4 Estadiamento e marcadores moleculares do câncer de mama
O sistema TNM, criado pelo AJCC (The American Joint Committee on
Cancer), é o mais utilizado e está baseado na avaliação do tamanho do tumor
primário (T), no envolvimento de linfonodos (N) e na presença de metástases
distantes (M). Geralmente, cada letra é acompanhada por um número para indicar a
extensão da doença. Este sistema pode empregar critérios clínicos, cTNM, baseado
nas evidências obtidas antes do tratamento, a partir de biópsia, por exemplo; ou
patológicos, pTNM, fundamentado na análise histopatológica pós-cirurgia (INCA,
2004). Os valores possíveis para T, N e M, bem como a classificação dos tumores
em estadios estão expostos no item ANEXO 2.
O estadiamento do câncer e a expressão de marcadores moleculares são
fundamentais na definição do tratamento, para fornecer indicações de prognóstico e
de possibilidade de recuperação da paciente (INCA, 2004; HOSPITAL DO CÂNCER
AC CAMARGO, 2008).
18
Dentre os principais marcadores moleculares no câncer de mama estão o
oncogene ERBB2 e os receptores de estrógeno e progesterona (RE e PR).
O proto-oncogene ERBB2 codifica uma glicoproteína transmembrana
contendo 185 kDa, semelhante ao receptor do fator de crescimento epidermal e que
possui atividade tirosina quinase em sua porção carboxiterminal (OLIVEIRA et al.,
2004). Este gene encontra-se superexpresso em aproximadamente 20% a 25% dos
carcinomas ductais de mama, mas estes índices podem aumentar para 40% em
casos de pacientes linfonodo positivo (L+) (HAN et al., 1997, apud SILVA; SADDI;
MOMOTUK, 2002). Em geral, mulheres com carcinoma ERBB2 positivo (ERBB2+)
possuem uma doença mais agressiva, com pior prognóstico, menor sobrevida e
maior probabilidade de reincidência (HENRY; HAYES, 2006).
A oncoproteína ERBB2 é alvo de imunoterapia específica utilizando o
anticorpo monoclonal Herceptin, também designado de trastuzumabe. Este
anticorpo, desenvolvido em 1992, se liga com grande afinidade ao domínio
extracelular do ERBB2, impedindo a sinalização de crescimento desencadeada pela
interação entre este receptor e seu ligante (OLIVEIRA et al., 2003).
O receptor de estrógeno também é importante no contexto do câncer de
mama, por mediar os efeitos do estrógeno. Dois terços de todos os tumores são
receptor de estrógeno positivo (RE+) (OSBPRNE, 1998, apud GRUVBERGER et al.,
2001). Os REs, após ligação ao estrógeno, mudam de conformação e se ligam
diretamente ao DNA, controlando a transcrição de genes específicos (LEADER et
al., 2006). Tumores mais agressivos, com pouca diferenciação celular, apresentam
pouca ou nenhuma expressão de RE (MILLIS, 1980; CLARKE et al., 1994).
Pacientes com tumor RE+ são tratadas com drogas anti-estrogênicas ou
inibidores da aromatase. O tamoxifeno é um modulador seletivo do RE que bloqueia
os efeitos do estrógeno por se ligar competitivamente ao RE. Os inibidores de
aromatase possuem um mecanismo de ação diferente. Estes reduzem os níveis de
estrógenos por impedir a síntese deste hormônio através da reação de aromatização
dos andrógenos, nos tecidos periféricos. A maioria dos tumores RE+ são
inicialmente responsivos ao tamoxifeno, mas muitas pacientes desenvolvem
resistência ao tratamento. Nestes casos, são indicados os inibidores de aromatase,
tais como o anatrazol e letrozol. Entretanto, existem pacientes que se tornam
resistentes a essas duas abordagens de tratamento (IKEDA; INOUE, 2004).
19
O receptor de progesterona também é um marcador molecular importante e
a perda da expressão deste receptor e do RE constitui um potencial mecanismo de
resistência à terapia hormonal (LIU et al., 2004).
1.2 EPIGENÉTICA
O termo epigenética foi introduzido na década de 1940 por Conrad e
Waddington e inicialmente foi definido como o processo no qual a informação
genética de um organismo interage com o ambiente, definindo seu fenótipo
(MURREL et al., 2005). Atualmente, a epigenética é caracterizada como um
fenômeno que envolve a alteração herdável da expressão gênica que não implica
uma alteração da seqüência de nucleotídeos e sim, uma modificação da
conformação do DNA (VERMA; SRIVASTAVA, 2002; FAZZARI; GREALLY, 2004).
Um dos principais mecanismos que acarretam a alteração da estrutura
tridimensional da molécula de DNA é a modificação covalente do DNA, comentada a
seguir (WAGGONER, 2007).
O processo de metilação do DNA (FIGURA 2) envolve a adição covalente do
grupo metil (CH
3
), que advém do doador S-adenosilmetionina, ao carbono 5’ da
citosina, formando a quinta base do DNA humano, a 5-metilcitosina, identificada em
1948 (SINGAL; GINDER, 1999). As citosinas metiladas correspondem a 0,75-1% do
total de bases do DNA (WORM; GULBERG, 2002).
FIGURA 2 - ESQUEMA DA MODIFICAÇÃO EPIGENÉTICA DO DNA.
FONTE: Adaptado de RODENHISER; MANN, 2006.
Em geral, as citosinas adjacentes a uma guanina (no contexto 5’CG3’),
portanto, pertencentes aos dinucleotídeos CpGs (a letra p entre as bases citosina e
guanina denota o grupo fosfato), são passíveis de serem metiladas (BIRD, 2002).
20
Os dinucleotídeos CpGs são pouco representados ao longo do genoma e a
grande maioria destes (cerca de 70% a 90%), com exceção dos CGs presentes nas
ilhas de CpGs, encontra-se metilado no homem e na maioria dos vertebrados
(SINGAL; GINDER, 1999; NAKAO, 2001; HELLEBREKERS; GRIFFIOEN;
ENGELAND, 2007).
Os dinucleotídeos são encontrados em maiores concentrações nas ilhas de
CpG, as quais estão geralmente presentes na região 5’UTR dos genes,
especialmente no promotor e no primeiro exon. As ilhas são regiões com cerca de
1 kb de tamanho, que ocorrem em média a cada 100 kb e possuem freqüência de
dinucleotídeos CpG aproximadamente 10 vezes maior que o restante do genoma.
Estas possuem uma razão de CpG para GpC de pelo menos 60% e ocorrem em
mais da metade dos genes em humanos (ROBERTSON; JONES, 2000; BIRD, 2002;
DAS; SINGAL, 2004).
A metilação é catalisada por um grupo de enzimas, denominadas de DNA
metilases ou DNA metiltransferases (DNMTs). Dentre elas citam-se: DNMT1 e
DNMT3, com suas isoformas.
A DNMT1 reconhece preferencialmente substratos de DNA que se
apresentam metilados em apenas uma fita (o que se denomina de DNA
hemimetilado), possibilitando que, durante a replicação, ocorra a propagação do
padrão de metilação às fitas recém sintetizadas (BIRD, 2002). A DNMT3a e a
DNMT3b metilam com igual eficiência o DNA hemimetilado e não metilado, in vitro e
in vivo e são altamente expressos em células tronco-embrionárias (YANG; YAN;
DAVIDSON, 2001). Estas enzimas geralmente atuam no processo de metilação de
novo, adicionando grupos metil em locais do DNA em que não existe metilação,
mesmo na fita oposta (DAS; SINGAL, 2004).
Ao contrário das DNMTs, as desmetilases atuam ativamente promovendo a
desmetilação do DNA. A 5-metilcitosina glicosilase, por exemplo, remove a citosina
metilada do DNA e, através do mecanismo de reparo o resíduo de citosina é
novamente adicionado (DAS; SINGAL, 2004).
A metilação do DNA é importante nos processos de silenciamento do
cromossomo X inativo das mulheres, no imprinting genômico e também está
vinculada ao mecanismo de silenciamento gênico (BAYLIN, 2005).
A metilação da citosina pode afetar a expressão dos genes por impedir
estericamente a ligação de fatores de transcrição a seus sítios de reconhecimento
21
presentes na região reguladora de seus respectivos genes. Por exemplo, a
metilação inibe a ligação dos fatores de transcrição AP-2, myc, E2F e NF-κβ, que
reconhecem seqüências que apresentam dinucleotídeos CpGs (SINGAL; GINDER,
1999). A inativação gênica também pode decorrer do recrutamento de complexos
contendo repressores transcricionais e HDACs (histonas desacetilases) ao DNA
metilado (DAS; SINGAL, 2004). A MeCP2, uma proteína de ligação ao grupo metil
(MBP), por exemplo, possui um domínio de interação com as citosinas metiladas e
também se associa com o co-repressor transcricional Sin3, o qual pode se ligar
diretamente às HDACs 1 e 2 (ROBERTSON; JONES, 2000). Tem sido verificado,
inclusive, que as DNMTs podem suprimir a atividade transcricional dos genes por
recrutar diretamente as HDACs (ROUNTREE et al., 2001).
Os padrões de metilação são estabelecidos nas fases iniciais do
desenvolvimento embrionário pelas metilases de novo DNMT3a e DNMT3b e são
copiados nas células somáticas pela DNMT1 de manutenção (BIRD, 2002;
TURKER, 2002). Após ocorrer a fertilização, inicia-se uma onda de desmetilação
durante a clivagem, seguido pela metilação de novo do genoma principalmente após
a implantação do blastocisto e, esse processo pode continuar lentamente durante o
restante do desenvolvimento (TURKER, 2002; JAENISCH; BIRD, 2003). Acredita-se
que esse processo de desmetilação-remetilação converte os padrões de metilação
específicos dos gametas para os específicos de tecidos somáticos (BIRD, 2002).
Assim, com a diferenciação do embrioblasto, genes tecidos específicos são
desmetilados de maneira tecido-específica, enquanto os genes constitutivos
permanecem desmetilados (YANG; YAN; DAVIDSON, 2001; TURKER, 2002).
1.2.1 Metilação e câncer
Acredita-se que os mecanismos epigenéticos são importantes para a
iniciação da tumorigênese e para a manutenção do estado alterado das células
tumorais. Embora o padrão de metilação seja estabelecido durante o
desenvolvimento embrionário e seja mantido durante a vida do indivíduo, sabe-se
que a idade, bem como a dieta, podem modificar esse padrão, comprometendo o
controle normal da expressão dos genes e levando à instabilidade genética (YOO;
JONES, 2006). Uma dieta pobre em folato, por exemplo, tem sido associada à
22
indução de câncer de fígado vinculado à hipometilação genômica e aumento da
expressão de oncogenes, como o kras e o myc (JAENISCH; BIRD, 2003).
A neoplasia é epigeneticamente caracterizada pela desmetilação global do
DNA, com hipermetilação localizada de genes específicos (WILSON; POWER;
MOLLOY, 2007; YOO; JONES, 2006).
A avaliação do nível total de 5-metilcitosina após análise por Southern
Blotting do DNA tumoral digerido com enzimas que reconhecem sítios de restrição
contendo citosinas metiladas, forneceu a primeira evidência de que o genoma das
células neoplásicas encontra-se hipometilado em relação às células normais
(FEINBERG; VOLGSTEIN, 1983).
Muitos dos efeitos globais da desmetilação decorrem da ativação de
elementos transponíveis, normalmente dormentes, e de seqüências retrovirais
presentes no genoma humano. A expressão bialélica de genes imprintados
resultante da hipometilação também pode favorecer o desenvolvimento de tumores.
A LOI (perda de imprinting) do gene IGF-2 (fator de crescimento tipo insulina-2), por
exemplo, torna os indivíduos mais susceptíveis ao desenvolvimento do câncer
colorretal (WILSON; POWER; MOLLOY, 2007).
Ao contrário da hipometilação, a hipermetilação adquiriu destaque no
contexto do câncer somente a partir da metade da década de 80. O silenciamento
gênico decorrente da metilação aberrante foi demonstrado em 1986 com a
calcitonina, a qual é um marcador para o câncer de pulmão de pequenas células.
Este tipo de tumor maligno apresenta alta capacidade metastática, que está
fortemente relacionada ao tabagismo, visto que apenas 1% dos casos ocorre em
indivíduos não-fumantes. É caracterizado por apresentar células epiteliais
geralmente pequenas, arredondadas ou ovais, que crescem em aglomerados e são
capazes de secretar hormônios polipetídicos (BAYLIN et al., 1986; COTRAN;
KUMAR; ROBBINS, 1996).
O silenciamento epigenético pode predispor a eventos mutacionais durante a
progressão do câncer, por exemplo, através da inativação de genes de reparo do
DNA. O gene de reparo MLH1 (homóloga à proteína codificada em E. coli, pelo gene
mutL) é freqüentemente hipermetilado em tumores que possuem instabilidade de
microssatélite, como o colorretal (NAKAGAWA et al., 2001, apud JONES; BAYLIN,
2002). O gene de reparo MGMT (O
6
-metilguanina-DNA metiltransferase) também é
23
silenciado por hipermetilação em tumores, como o de cólon, pulmão, linfóide, entre
outros (ESTELLER et al., 1999, 2000, 2001, apud JONES; BAYLIN, 2002).
A hipermetilação pode também silenciar genes supressores de tumor, como
o gene VHL (Von Hippel-Lindau), no carcinoma de rim (HERMAN et al., 1994, apud
ROBERTSON; JONES, 2000); Rb (retinoblastoma), no retinoblastoma (STIRZAKER
et al., 1997, apud ROBERTSON; JONES, 2000), APC (polipose adenomatosa do
cólon), no carcinoma colorretal (HILTUNEN et al., 1997, apud ROBERTSON;
JONES, 2000), etc.
A metilação pode influenciar a tumorigenicidade por aumentar a
probabilidade da ocorrência de mutações de transição CÆT, como verificado com o
gene supressor de tumor p53, em que 50% das mutações pontuais incidem nas
citosinas metiladas (JONES; BAYLIN, 2002). Tais mutações ocorrem em função dos
resíduos de 5-metilcitosina serem mais susceptíveis à deaminação. A deaminação
da citosina forma a uracila, a qual é rapidamente reconhecida e reparada pela uracil
DNA glicosilase (UDG); mas, a deaminação da 5-metilcitosina gera timina, que, por
ocorrer naturalmente no DNA é mais difícil de ser detectada e reparada pela timina
DNA glicosilase (TDG) (JIRICNY, 1996, apud ROBERTSON; JONES, 2000; YANG;
YAN; DAVIDSON, 2001).
No câncer de mama, os genes que codificam os receptores ovarianos (RE e
RP), o gene supressor de tumor BRCA1 e outros genes envolvidos com regulação
do ciclo celular (p16
INK4a
), detoxificação (GSTP1) e metástase (E-caderina, TIMP-3)
são os mais freqüentemente metilados (YAN, DAVIDSON, 2001).
1.2.2 Terapêutica anti-tumor e metilação
O estudo da metilação pode ser muito útil para o diagnóstico precoce e para
definição do tratamento de vários tipos de tumores. O perfil de metilação permite
distinguir entre tipos e sub-tipos de tumores e auxilia na escolha do agente
quimioterapêutico para o tratamento. A metilação do gene de reparo MGMT, por
exemplo, aumenta a sensibilidade dos gliomas ao tratamento com agentes
alquilantes (ESTELLER et al., 2000, apud DAS; SINGAL, 2004).
Como a metilação das ilhas de CpG é mais freqüente nas células tumorais,
pois, como dito anteriormente, em geral, nas células normais os dinucleotídeos
encontram-se desmetilados, a metilação pode ser um alvo importante na terapia
24
anti-tumoral (BAYLIN, 2005). Além disso, ao contrário das alterações genéticas, a
possibilidade de reverter as modificações epigenéticas torna viável o tratamento
epigenético do câncer (YOO; JONES, 2006; HELLEBREKERS; GRIFFIOEN;
ENGELAND, 2007).
Dentre as substâncias empregadas na terapia do câncer estão os inibidores
de metilação, que incluem os análogos de nucleosídeos e os não análogos de
nucleosídeos. Os primeiros podem ser divididos em análogos ribonucleosídeos ou
desoxirribonucleosídeos. Ambos possuem o carbono 5 do anel da citosina
modificado e são metabolizados por quinases que os convertem a nucleotídeos
trifosfato para posterior incorporação ao RNA ou DNA, respectivamente (YOO;
JONES, 2006).
O principal análogo desoxirribonucleosídeo usado no tratamento do câncer é
o 5-Aza-2’-deoxicitina (5-Aza-CdR). Este é capaz de inibir a metilação do DNA
mesmo em concentrações micromolares, mas, apresenta-se instável em soluções
aquosas, dificultando sua administração (KOPELOVICH; CROWELL; FAY, 2003;
YOO; JONES, 2006). Apesar de amplamente empregado no tratamento anti-câncer
apresenta efeitos tóxicos e pode ser mutagênico in vivo. Além disso, demonstrou-se
que é capaz de ativar transcricionalmente genes sem promotores metilados e de
promover modificação da estrutura da cromatina, aumentando a acetilação e a
metilação da Lys4 da histona H3 (SOENGAS et al., 2001, NGUYEN et al., 2002,
apud LAIRD, 2005). O principal mecanismo de inibição da metilação mediada pelo 5-
Aza-CdR decorre da formação do complexo covalente droga-DNMT (YOO; JONES,
2006).
1.3 RECEPTOR DE QUIMIOCINAS CXCR4
O gene CXCR4, localizado no cromossomo humano 2q21.3, apresenta uma
região promotora, contendo cerca de 2,6 kb, e dois exons separados por uma
seqüência intrônica de aproximadamente 2,1 kb. O primeiro exon possui 104 pb e
codifica os cinco primeiro aminoácidos da proteína e a região 5’UTR. O segundo
exon possui aproximadamente 1,6 kb, dentre os quais 1044 pb codificam os 347
aminoácidos restantes da proteína que possui 352 resíduos (CARUZ et al., 1998;
WEGNER et al., 1998).
25
Duas isoformas de proteínas CXCR4, derivadas de splices transcricionais
alternativos, têm sido caracterizadas. O variante transcricional 1 (NM_001008540),
também conhecido como CXCR4-Lo, representa o maior transcrito e codifica a
isoforma mais extensa (isoforma a) (ENTREZ GENE, 2008).
O gene CXCR4 foi inicialmente clonado de leucócitos (LOETSCHER et al.,
1994), mas, é também constitutivamente expresso em tecidos não hematopoiéticos,
incluindo coração, intestino, brônquios, cérebro, dentro outros (LAVI et al. 1997;
DWINELL et al., 1999; EDDLESTON et al., 2002; FURUYA et al., 2007).
O CXCR4 é um receptor de quimiocinas que possui sete domínios
hidrofóbicos transmembrana em alfa-hélice (7-TMR) (FIGURA 3) e também é
designado de receptor acoplado à proteína G (GPCR), em função de seu
mecanismo de sinalização, que envolve a ligação dos loops intracelulares à proteína
G heterotrimérica (αβγ) (ROLLINS, 1997). O terminal carboxi do receptor contém
resíduos de serina e treonina, que são passíveis de serem fosforilados após
interação ligante-receptor e estão envolvidos na transdução de sinais bem como na
dessensibilização (FUTASHI et al., 2007).
FIGURA 3 - TOPOLOGIA GERAL DE UM RECEPTOR DE QUIMIOCINAS.
N-terminal
ECL1
ECL2
ECL3
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM7 TM6
FONTE: Adaptado de FERNANDEZ; LOLIS, 2002.
NOTA: A extremidade aminoterminal e três loops ficam expostos para fora da célula, enquanto três
loops e a extremidade carboxiterminal ficam voltados para o compartimento citoplasmático. ECL:
loops extracelulares; TM: domínios transmembrana.
O receptor de quimiocinas CXCR4 desencadeia seus efeitos biológicos
através da interação com a quimiocina ligante, CXCL12 (fator derivado de célula de
estroma-1, SDF-1). As quimiocinas, também designadas de citocinas quimiotáticas
ou quimioatraentes, constituem um grupo de pequenas proteínas solúveis e básicas,
26
cujo peso molecular varia, em geral, de oito a 10 kDa. Estas moléculas são
classificadas a partir do arranjo dos dois primeiros, dos quatro, resíduos
conservados de cisteína, adjacentes à extremidade aminoterminal. Os dois maiores
grupos são as quimiocinas CXC que apresentam um aminoácido entre duas
cisteínas e as quimiocinas CC que possuem duas cisteínas adjacentes (ROLLINS,
1997; BAJETTO et al., 2001; FERNANDEZ, LOLIS, 2002; BALKWILL, 2004; KULBE
et al., 2004; LAURENCE, 2005).
A nomenclatura dos receptores e das quimiocinas consiste da família,
seguida da letra “R” ou “L”, para denotar receptor ou ligante, respectivamente, e por
último, um número de identificação que indica a ordem de descoberta. Assim,
CXCL12 é uma quimiocina pertencente à família CXC, número 12. O mesmo vale
para o receptor, pois a sistemática está baseada na estrutura de seu ligante
(MURPHY et al., 2000).
O CXCR4 tem como ligante único o CXCL12, ao contrário do que é
verificado para a maioria das quimiocinas e dos receptores de quimiocinas. Em
geral, uma quimiocina pode se ligar a vários receptores e um receptor pode ter
várias quimiocinas ligantes, estabelecendo uma relação denominada de
“promíscua”. A especificidade da interação CXCR4-CXCL12 foi demonstrada em
estudos com ratos knockout para o CXCR4 ou para o CXCL12, em que se
verificaram defeitos no coração, no sistema nervoso, na hematopoiese e na
formação dos vasos sangüíneos do intestino (ZOU et al., 1998).
A ligação entre o CXCR4 e seu ligante induz uma mudança de conformação
deste receptor, que resulta na ativação da proteína G. Resumidamente, essa
ativação produz mensageiros lipídicos secundários, como o fosfatidilinositol trifosfato
e diacilglicerol, desencadeando o aumento transiente da concentração de cálcio
citosólico e a ativação de proteínas quinases, respectivamente. As quinases, por sua
vez, fosforilam moléculas efetoras, como as proteínas quinases ativadas por
mitógenos (MAPKs) ativando, na maioria dos casos, a via ERK1/2 (MAJKA et al.,
2000; SORIANO et al., 2002; LEE et al., 2004; PENG et al., 2005).
1.3.1 Importância do par CXCR4-CXCL12 no câncer
A interação CXCR4-CXCL12 ativa vias de sinalização intracelulares que
desencadeiam inúmeros efeitos biológicos, como sobrevivência, proliferação e
27
invasão celular, contribuindo com o desenvolvimento do câncer. Estes efeitos podem
resultar de uma ação autócrina, parácrina ou indireta (LUKER; LUKER, 2006).
O CXCL12 pode apresentar um efeito indireto no câncer através do
recrutamento de leucócitos, especialmente dos macrófagos associados ao tumor
(TAMs) (ORIMO et al., 2006). As implicações dos leucócitos no câncer são
divergentes. Em princípio, poderiam reconhecer e atuar contra as células tumorais,
mas, poderiam também fornecer sinais (como expressar fatores de crescimento e
angiogênicos, metaloproteínases, etc.) que favorecem o desenvolvimento tumoral
(BEN-BARUCH, 2006; ROLLINS, 2006). Esta quimiocina também pode ser
secretada pelas próprias células tumorais, via autócrina, ou pelas células do
estroma, via parácrina, atuando diretamente sobre a massa tumoral. De forma
parácrina, a proteína CXCL12 secretada pelos fibroblastos presentes no estroma
tumoral também conferem vantagens de crescimento ao tumor via angiogênese
(LAURENCE, 2005; BEN-BARUCH, 2006; ORIMO et al., 2005).
A proteína CXCR4 é o receptor de quimiocinas mais freqüentemente
expresso por células tumorais, estando expresso em mais de 20 tipos de tumores
(ZLOTNIK, 2004).
Jordan et al. (1999) verificaram que a proteína CXCR4 esteve expressa em
células de adenocarcinoma de cólon (HT-29). Majka et al. (2000) e Crazzolara et al.
(2000) também constataram superexpressão deste receptor em células de Jurkat
(de leucemia de célula T) e em células ATL-2 (de linfoma de célula T).
A elevada expressão do receptor CXCR4 também foi constada em células
tumorais de rim VHL negativo, de carcinoma de ovário (CAOV3) e de câncer de
mama (MCF-7), quando expostas à hipóxia. Isto decorre em parte da ativação da via
HIF-1/hipóxia. Foi demonstrado que, em baixas concentrações de oxigênio, ocorre o
recrutamento do fator de transcrição HIF-1 (fator indutor de hipóxia-1) ao promotor
do CXCR4, o qual regula positivamente a expressão deste gene (SCHIOPPA et al.,
2003; STALLER et al., 2003). A superexpressão do gene CXCR4 pela ação de
fatores de transcrição foi observada ainda na linhagem de tumor de próstata, PC-3.
Com estas células foi demonstrado que o fator nuclear-κβ (NF-κβ) regula
positivamente a transcrição deste gene. Além disso, verificou-se que, sob estímulo
da proteína CXCL12, ocorre a ativação deste fator. Isso porque o inibidor de
proteínas κβ (Iκβ) é inativado pela fosforilação via MAP quinase dependente de
CXCL12 (KUKREJA et al., 2005).
28
Em 2001, Muller et al., pioneiros na pesquisa de marcadores moleculares de
metástases, forneceram uma importante contribuição para o entendimento dos
mecanismos pelos quais o par CXCR4-CXCL12 atuam. Além de mostrar a migração
direcionada de células tumorais de mama, que superexpressam a proteína CXCR4,
à órgãos-alvo de metástase (pulmão, linfonodo, etc.), que expressam altos níveis de
CXCL12, constataram que esta quimiocina induz a polimerização da actina e, que a
incubação das células tumorais com anticorpo anti-CXCR4 ou anti-CXCL12
bloqueavam a capacidade de quimiotaxia e invasão mediada pelo CXCL12.
Alguns antagonistas da proteína CXCR4 que bloqueiam ou diminuem os
efeitos da interação receptor-ligante também foram descobertos. Tamamura et al.
(2003) constataram que análogos de T140 (TC14012, TE14005 e 4F-benzoil-
TN14003) são capazes de inibir a migração induzida pelo CXCL12 em células
tumorais de mama (MDA-MB-231), de linfoma de célula T (Sup-T1) e de células
endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECs). Além disso, verificaram a
redução de metástases pulmonares em ratos SCID-MDA-MB-231+ tratados com 4F-
benzoil-TN14003. O AMD3100 também é um antagonista do CXCR4 capaz de inibir
a proliferação, migração e invasão (JIANG et al., 2007).
No câncer de mama e em outros tipos de tumores malignos, o perfil de
expressão do receptor CXCR4 foi bastante estudado por imunohistoquímica.
Cabioglu et al. (2005) constataram a expressão predominantemente citoplasmática
desta proteína em tumores linfonodo positivo, embora essa associação não tenha
atingido relevância estatística. Em tumores linfonodo negativo a expressão mais
comum do CXCR4 foi a nuclear.
Salvucci et al. (2006), ao analisar diversos tipos histológicos de câncer de
mama, invasivos e pré-invasivos, também constataram a expressão da proteína
CXCR4. Eles notaram inclusive o aumento na proporção de células com alta
marcação nuclear para este receptor com a progressão do câncer, de forma que foi
constatada a expressão nuclear da proteína CXCR4 em 22% de células normais,
45% dos tumores ductais in situ e 67% dos carcinomas invasivos. A elevada
expressão nuclear do CXCR4 esteve associada com metástase à linfonodos, e, a
forte marcação citoplasmática de CXCR4 esteve associada a tumores de maior grau
histológico, RE negativo, RP negativo e ERBB2 positivo. Também foi observada
menor sobrevida em pacientes com forte expressão nuclear e citoplasmática deste
receptor (SALVUCCI et al., 2006).
29
Em carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas de esôfago
também foi observada a expressão da proteína CXCR4. Gockel et al. (2006)
constataram maior expressão deste receptor em amostras pT3-4, pN+, pM0, para os
dois tipos histológicos considerados.
A funcionalidade deste receptor após estímulo com a proteína CXCL12 foi
demonstrada em vários trabalhos. A atividade do receptor CXCR4 foi constatada
através do aumento dos níveis de cálcio citosólico, da migração e proliferação
celular, da ativação de vias intracelulares (como a AKT e PI-3K), dentre outros
(JORDAN et al.,1999; MAJKA et al., 2000; CRAZZOLARA et al., 2001; PENG et al.,
2005).
O papel do CXCR4 no desenvolvimento e na progressão do câncer, bem
como sua participação em outros processos, como de infecção pelo HIV, tornaram-
no um possível alvo-terapêutico e o foco de muitas pesquisas.
Estudos com linhagens celulares de melanomas, linhagens tumorais de
pâncreas e amostras de adenocarcinoma ductais pancreáticos demonstraram a
correlação entre a expressão do CXCR4 e a metilação do seu promotor (SATO et
al., 2005; MORI et al., 2005). Além disso, Sato et al. (2005) também lançaram a
hipótese de que linhagens tumorais de mama poderiam ter o gene CXCR4 regulado
por esse mesmo mecanismo. Assim, neste trabalho nos propomos a estudar uma
ilha de CpG do gene CXCR4 ampliando o conhecimento desse mediador na
tumorogênese no câncer de mama.
30
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a participação da metilação do DNA no controle da expressão do gene
CXCR4 em linhagens tumorais de mama para posterior correlação dos achados de
metilação em tumores primários com aspectos clínico-patológicos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Analisar o padrão de expressão do receptor de quimiocina CXCR4 em
linhagens tumorais de mama, através de RT-PCR;
• Tratar com agente desmetilante 5-Aza-CdR a linhagem tumoral que não
expressou o gene CXCR4 a fim de verificar que a inativação deste receptor decorre
da metilação da citosina;
• Clonar e seqüenciar um fragmento da ilha de CpG presente no promotor deste
gene, para identificar os dinucleotídeos CG diferencialmente nas linhagens de
estudo;
• Correlacionar o padrão de metilação obtido para o fragmento da ilha de CpG
estudada com o padrão de expressão gênica encontrado nas linhagens celulares;
• Confirmar o perfil de metilação obtido pelo seqüenciamento através da análise
de restrição combinada com bissulfito de dois fragmentos de diferentes ilhas de CpG
presentes no gene CXCR4;
• Estudar o padrão de metilação do gene CXCR4, através de MSP, em amostras
de tumores primários de mama, a fim de confirmar que o perfil de metilação obtido
para as linhagens também é verificada em amostras de tumor de mama;
• Correlacionar os dados de metilação das amostras tumorais com os dados
clínico-patológicos das pacientes a fim de determinar o envolvimento deste gene nos
processos de formação e progressão tumoral em mama.
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1 Linhagens tumorais de mama
Neste estudo foram utilizadas as linhagens tumorais de mama humana
MCF-7 (linhagem de referência, ATCC HTB-22™), PMC-42 (WHITEHEAD et al.,
1984), MDA-MB-435 (ATCC HTB-129™) e MDA-MB-436 (ATCC HTB-130™),
gentilmente cedidas pelo Instituto Ludwig de Pesquisa em Câncer de São Paulo
(LICR-SP).
A MCF-7 é uma célula epitelial RE+ de adenocarcinoma de mama, obtida a
partir de efusão pleural de pacientes (ATCC, 2008). A PMC-42 é uma linhagem de
carcinoma de mama, RE+ e RP+, com característica de célula-tronco, o que justifica
sua capacidade de formar organóides com diferentes tipos morfológicos, capazes de
secretar proteínas do leite, em cultura (WHITEHEAD et al., 1984; ACKLAND;
MICHALCZYK; WHITEHEAD, 2001). A MDA-MB-436 é uma célula pleomórfica ER-
de adenocarcinoma de mama, também obtida a partir de efusão pleural de pacientes
(ATCC, 2008). A MDA-MB-435 foi inicialmente descrita em 1978 como uma
linhagem metastática de câncer de mama e foi depositada no ATCC como MDA-MB-
435S (CAILLEAU; OLIVE; CRUCIGER, 1978). Esta linhagem é altamente agressiva,
assim como a MDA-MB-436, não expressa RE e E-caderina. A origem desta célula
foi muito discutida, pois esta linhagem não expressa alguns genes típicos do epitélio
mamário (pS2, mamaglobina e proteína indutora da prolactina), mas, por outro lado,
expressa genes típico de melanócitos (receptor retinóide X, ACP-5, tirosinase,
proteína relacionada à tirosina). Apesar desta característica, designada de
infidelidade de linhagem (expressão de marcadores de diferentes linhagens),
admite-se que a MDA-MB-435 é uma linhagem de mama. Como esta linhagem é
bastante invasiva, portanto, associada a tumores mais avançados, pressupõe-se
que esta célula pode sofrer, devido à instabilidade genética, dediferenciação,
perdendo alguns marcadores típicos da mama e ganhando outros marcadores
(ELLSION et al., 2002; SELLAPPAN et al., 2004).
32
3.1.1.1 Cultivo celular
As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD,
USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino- SFB (Cultilab, Campinas, SP,
Brasil), 2 mM de glutamina (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), garamicina 40 µg/mL
(Schering-Plough, Rio da Janeiro, RJ, Brasil), ciprofloxacina 10 μg/mL (Halexlstar,
Goiânia, Goiás, Brasil) e anfotericina B 2,5 µg/mL (Cristalia, Itapira, SP, Brasil). As
linhagens PMC-42, MDA-MB-435 e MDA-MB-436 também receberam
suplementação do hormônio insulina 5 µg/mL (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)
e a PMC-42 também foi cultivada na presença de hidrocortisona 5 µg/mL (União
Química, SP, Brasil).
Alíquotas de linhagens com aproximadamente 10
6
células/mL, congeladas
em SFB 40% e DMSO 10%, foram retiradas do nitrogênio líquido (-196°C),
descongeladas a 37°C, transferidas dos tubos criogênicos para garrafas com área
de cultivo igual a 25 cm
2
, contendo o meio de cultura devidamente suplementado, e,
incubadas a 37°C e 5% de CO
2
. O meio foi trocado regularmente e o crescimento
celular foi acompanhado. Quando se obteve uma monocamada de células aderidas
à garrafa com aproximadamente 80-90% de confluência, efetuou-se a amplificação
da cultura para posterior extração de RNA ou DNA e para estoque. A expansão da
cultura foi efetuada através do tratamento com tripsina 0,25% (TrypLE
TM
Express,
Gibco, Gaithersburg, MD, USA).
3.1.1.2 Teste para detecção de contaminação por Mycoplasma hominis
A fim de verificar a ocorrência de contaminação da cultura por Mycoplasma
hominis efetuou-se uma reação de PCR para detectar DNA genômico deste
microrganismo no cultivo.
Para tanto, no momento da troca de garrafa foi coletado aproximadamente
1 mL da suspensão de células, estas foram concentradas por centrifugação e uma
pequena quantidade de célula foi coletada com um palito e adicionada ao sistema
contendo um volume final de 15 μL e 1X tampão de Taq Polimerase (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), 2,5 mM de MgCl
2
, 100 μM de dNTPs, 0,6 U de Taq polimerase
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e 1,25 pmoles de iniciadores específicos (MycoA F
5´GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG 3´ e MycoB R 5´CGG ATA ACG CTT GCG
33
ACC TAT G 3´). As condições de amplificação foram: desnaturação por 5 minutos a
94ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95
o
C por 1 minuto, anelamento a 60ºC
por 1 minuto e extensão a 72
o
C por 1 minuto. Ao final da ciclagem as moléculas
foram extendidas por 7 minutos a 72ºC. Os produtos da reação foram aplicados em
gel de poliacrilamida 8%, corado com nitrato de prata 10% (item 3.4.6.1). Foi
utilizada como controle uma amostra de DNA contaminada proveniente do Instituto
Ludwig. No caso de haver contaminação por M. hominis seria verificado um
fragmento de 455 pares de bases. Para evitar contaminação foi feita suplementação
com antibiótico ciprofloxacina como descrito acima.
3.1.2 Amostras tumorais de mama
Foram utilizadas 76 amostras de tumores primários de mama, dentre elas 51
amostras de carcinomas ductais invasivos, uma amostra de carcinoma ductal in situ,
21 amostras de carcinomas lobulares invasivos e três amostras de fibroadenomas.
Todas as amostras foram gentilmente cedidas pela Dra. Enilze S. F. Ribeiro e pelo
Dr. Iglenir João Cavalli, responsáveis pelo Banco de Tumores do Laboratório de
Citogenética Humana e Oncogenética, do Depto. de Genética/UFPR. As amostras
catalogadas neste banco de tumores foram obtidas mediante consentimento
informado das pacientes (ANEXO 1) e aprovação do Comitê de Ética, processo
nº 25000.007020/2003-93; registro no CONEP: 7220 e parecer nº 251/2003, de
20/02/2003, do Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba-PR (proveniência das
amostras sob responsabilidade do Dr. Rubens Silveira Lima).
Os laudos foram obtidos de pacientes internadas no Hospital de Clínicas da
UFPR e no Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba-PR. A idade das pacientes
variou de 15 a 84 anos (média de 58 anos, desvio padrão de 15 anos).
3.2 IDENTIFICAÇÃO DAS ILHAS DE CpG PRESENTES NO GENE CXCR4
Para a identificação da região promotora do receptor CXCR4 descrito para
humano, foi obtida a seqüência do RNAm (seqüência de referência NM_003467.2)
deste gene pelo programa Unigene (Hs.593413) disponível no site do National
Center of Biotechnology Info- NCBI (UNIGENE, 2008). Esta foi então submetida à
análise no programa Human Blat Search (HUMAN BLAT, 2008). Neste site foi
34
possível obter a localização do gene no cromossomo e a seqüência de nucleotídeos
que representava desde a região promotora até o segundo intron do gene CXCR4
(2,6 Kb antes e 1,7 kb após o nucleotídeo +1 descrito por Wegner et al., 1998).
A presença de ilhas de CpG neste fragmento foi determinado com auxílio do
recurso CpGPlot, disponível na página do grupo European Boinformatic Institut-
EMBL (CpGPLOT, 2008). Esta análise seguiu os parâmetros estipulados pelo
CpGPlot que considera como ilhas de CpG os fragmentos com mais de 200 pb,
contendo pelo menos 50% de G+C e uma razão entre a freqüência observada e a
esperada de dinucleotídeos CG superior ou igual a 0,6 (GARDINER-GARDEN;
FROMMER, 1987). Na região analisada constatou-se a presença de quatro ilhas de
CpG no gene CXCR4 (FIGURA 4).
FIGURA 4 – ESQUEMA DO GENE CXCR4 MOSTRANDO A POSIÇÃO DAS
QUATRO ILHAS DE CpG E DOS FRAGMENTOS (F1 e F2)
ESTUDADOS.
NOTA: F1 e F2 (indicados pelos quadrados em rosa) são as regiões do gene CXCR4 analisadas
neste trabalho. O nucleotídeo +1 corresponde resíduo G presente no começo do exon 1 (segundo
Wegner et al., 1998). A localização da região 5’UTR, dos exons e dos introns em relação ao
nucleotídeo +1 está indicado acima; enquanto a localização das ilhas de CpG está exposta logo
abaixo do esquema.
3.3 AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DO GENE CXCR4 EM
LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA
Neste estudo o padrão de expressão do gene CXCR4 nas linhagens
tumorais de mama foi analisado ao nível de transcrito, através da técnica de RT-
PCR.
Para as reações de RT-PCR foram utilizados iniciadores específicos que
anelavam entre os exons 1 e 2, na região 3′ do gene de estudo, e, entre os exons 7
e 8, da região 3’ do gene de expressão constitutiva, gliceraldeído-3-fosfato-
desidrogenase (GAPDH), usado como controle (ANEXO 3). Os iniciadores
35
planejados foram avaliados pelo programa OLIGOTECH (OLIGOTECH, 2008) e
suas seqüências, bem como o tamanho dos fragmentos esperados na amplificação
são mostrados no quadro 2.
INICIADORES
TM (°C)
OLIGOTECH
FRAGMENTO
ESPERADO
FRAGMENTO COM
DNA
CONTAMINANTE
EXON+INTRON
F GAPDH
5’ CTG CAC CAC CAA CTG CTT A 3’
67,6
R GAPDH
5’ CAT GAC GGC AGG TCA GGT C 3’
71,9
296 pb 489 pb
F CXCR4
5’ CAG CAG GTA GCA AAG TGA 3’
64,5
R CXCR4
5’ AGC GTG ATG ACA AAG AGG 3’
64,5
396 pb 2488 pb
QUADRO 2 - CARACTERÍSTICAS DOS INICIADORES ESPECÍFICOS PARA AS
REAÇÕES DE RT-PCR.
3.3.1 Extração de RNA total das linhagens celulares de mama
Para isolar o RNA total das linhagens celulares foi utilizado o reagente
TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), segundo especificações do fabricante. A
purificação de RNA com tal reagente é uma adaptação do método desenvolvido por
Chomczynski e Sacchi (1987).
Em resumo, efetuou-se a lise das células com o reagente TRIzol®, seguida
da separação da fase aquosa com clorofórmio (Merck, Whitehouse Station, NJ,
USA), precipitação com isopropanol absoluto (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA),
lavagem com etanol 75% em água DEPC e ressuspensão em água DEPC. Os RNAs
extraídos foram armazenados a -80°C.
A integridade do RNA total extraído foi inferida através da aplicação de 1 μg
de cada amostra em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo 0,2 µg/mL e
visualizado em luz UV (TFX-35-M, Life Technologies, V03-6608/DP-001-FDC, Vilber
Lourmat, Deutschland). Antes de ser aplicado, o RNA total foi desnaturado a 65ºC
por 5 minutos, e mantido em condição desnaturante, em tampão de amostra
contendo 7 M de uréia e 30% de glicerol. A qualidade do RNA foi avaliada a partir
36
das intensidades relativas das bandas 28S e 18S dos RNAs ribossômicos. Foram
considerados íntegros os RNAs que apresentaram tais bandas bem evidentes, tendo
a primeira o dobro da intensidade da segunda.
A quantificação de RNA foi efetuada por espectrofotometria, em
comprimento de onda de 260 nm, considerando-se que 1 DO
260nm
equivale a
40 μg/mL de RNA. O grau de contaminação com proteínas foi estimado a partir da
relação entre as leituras efetuadas a 260 e 280 nm, devendo o valor variar de 1,6 a
1,8. Foi utilizado o espectrofotômetro GeneQuantII (Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ).
3.3.2 Síntese da primeira fita de cDNA
O cDNA foi sintetizado a partir da transcrição reversa de aproximadamente
500 ng de RNA total, na presença de 200 U da enzima transcriptase reversa
(Superscript II, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) segundo instruções do
fabricante.
A primeira fita de cDNA foi gerada em uma reação com volume final de
20 µL contendo 500 µM de dNTP (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA), 25 µg/mL de
OLIGO dT (IDT, Coralville, IA, USA), 1X solução tampão de primeira fita (GibcoBRL,
Gaithersburg, MD, USA), 40 U de inibidor de RNase (rRNasin, Promega, Madison,
WI, USA), 10 µM de DTT (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) e a enzima
Superscript II (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA). Inicialmente, a mistura de RNA,
água e iniciador foi incubada a 65°C por 5 minutos para promover a abertura de
possíveis estruturas secundárias. A reação de síntese de cDNA foi realizada a 42
o
C
por 60 minutos e a 72ºC por 15 minutos. O cDNA sintetizado foi estocado a -20ºC.
Para verificar a eficiência de síntese e a qualidade do cDNA utilizou-se como
controle a amplificação por PCR de um fragmento de 296 pb do gene de expressão
constitutiva GAPDH. Para isto empregou-se 1 μL do cDNA em reações de volume
final de 20 μL, contendo 1X tampão de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA), 1,5 mM de MgCl
2
, 200 μM de dNTPs, 1 U de Taq Platinum (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) e 8 pmoles de iniciadores específicos. As condições de
amplificação usadas foram: desnaturação inicial do cDNA por 10 minutos a 95ºC,
seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 45 segundos, anelamento a 63ºC
por 45 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto, e extensão final a 72ºC por 5
37
minutos. Os dados sobre os iniciadores utilizados para o gene GAPDH estão
expostos no quadro 2, item 3.3. Para todas as reações de PCR foi utilizado um
controle interno, denominado de no. No sistema do tubo no eram colocados todos os
reagentes da reação de PCR, com exceção do DNA. Assim, a amplificação de
fragmentos no no era um indicativo de que havia contaminação com DNA exógeno.
Quando se verificavam bandas neste controle, a reação era repetida. Os fragmentos
amplificados foram visualizados em gel de agarose 1%, corado com brometo de
etídeo.
3.3.3 Semi-Quantitative Reverse Transcription-PCR- RT-PCR Semi-Quantitativo do
gene CXCR4
Para o estudo do padrão de expressão do gene CXCR4 foi utilizada a
técnica de RT-PCR Semi-Quantitativo.
As reações foram feitas em duplicatas para o gene em estudo e para o gene
GAPDH, utilizado como controle. Nos sistemas com volume final de 20 μL foram
adicionados 1-2 μL do cDNA sintetizado, 1X tampão de Taq Platinum (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), 1,5 mM de MgCl
2
, 200 μM de dNTPs, 1 U de Taq Platinum
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e 8 pmoles de iniciadores específicos. As condições
da reação para o gene CXCR4 foram: desnaturação do cDNA a 95ºC por
10 minutos, seguido de ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento à
58°C por 1 minuto, extensão a 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, com extensão final
de 72ºC por 10 minutos. As ciclagens utilizadas foram: 30, 35, 38. As condições de
amplificação para o gene controle foram detalhadas no item 3.3.2. Os dados sobre
os iniciadores utilizados para o gene CXCR4 estão expostos no quadro 2, item 3.3.
Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídeo.
3.3.4 Tratamento com agente desmetilante 5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-CdR)
Para confirmar o papel da metilação na regulação da expressão do gene
CXCR4, a linhagem MDA-MB-435, que não expressou o RNAm deste gene, foi
tratada com o agente desmetilante 5-Aza-CdR.
38
Em resumo, uma quantidade de 10
6
células/mL, foi transferida para uma
garrafa média de 75 cm² e cultivada por 24 horas em meio devidamente
suplementado. Após a adesão das células na garrafa, estas foram cultivadas por
cinco dias consecutivos em meio apropriado acrescido de 1 µM de 5-Aza-CdR
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). O meio e a droga foram trocados diariamente.
Após este período, efetuou-se a extração do RNA total (item 3.3.1) da linhagem,
para síntese de cDNA (item 3.3.2) e análise de expressão por RT-PCR, cujas
condições foram descritas no item 3.3.3. O produto de PCR foi visualizado em gel de
agarose 1%, corado com brometo de etídeo.
3.4 CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO PROMOTOR DO GENE
CXCR4
A análise do padrão de metilação do gene CXCR4 foi feita inicialmente com
linhagens tumorais de mama e, posteriormente, com amostras de tumores primários
de mama. Em princípio efetuou-se o crescimento das linhagens tumorais para, em
seguida, efetuar a extração do DNA destas, através do método de fenol:clorofórmio.
O DNA purificado foi submetido ao tratamento com o reagente bissulfito de sódio e,
este DNA modificado foi então utilizado como molde em reações de nested PCR,
com iniciadores específicos para amplificação dos fragmentos F1 e F2 das ilhas de
CpG. Os produtos amplificados foram purificados, mas, apenas o fragmento 1 foi
clonado e seqüenciado. Em paralelo, efetuou-se a confirmação dos resultados
obtidos pelo seqüenciamento através da análise da restrição combinada com
bissulfito (COBRA) dos dois fragmentos (F1 e F2).
Quanto às amostras tumorais, o DNA extraído das células tumorais e tratado
com bissulfito de sódio foi analisado pela técnica MSP (Methylation Specific PCR).
3.4.1 Desenho de iniciadores específicos para Nested PCR
A nested PCR é uma técnica que envolve duas reações de PCR, com dois
pares de iniciadores distintos: um flanqueando a região de interesse (iniciadores
nested, ou internos) e outro mais externo a esta região (primeiro par de iniciadores,
iniciadores externos). A primeira reação é feita com os iniciadores externos em
condições menos específicas, visto que o DNA tratado com bissulfito de sódio fica
39
bastante degradado. O produto de PCR gerado nesta etapa inicial é utilizado como
molde para uma segunda reação de PCR, designada de nested. Nesta PCR os
iniciadores amplificam o fragmento de interesse, aumentando a especificidade da
técnica.
Neste trabalho foram amplificados por nested PCR dois fragmentos (F1 e
F2) de diferentes ilhas de CpG. Os iniciadores para estas regiões foram planejados
a partir da seqüência de nucleotídeos após o tratamento com bissulfito. Para isso
utilizou-se os programas Methprimer (METHPRIMER, 2008) e Oligotech
(OLIGOTECH, 2008).
O fragmento 1 está presente na ilha de CpG-2, a qual possui 389 pb e está
localizada entre os nucleotídeos –334 e +55 (considerando-se o início de transcrição
descrito por Wegner et al., 1998). Este fragmento possui 184 pb e está localizado
entre os nucleotídeos -173 e +11. No esquema 1 estão mostrados os iniciadores
usados para amplificar esta região e a localização dos mesmos no gene CXCR4.
2281 GCATTCCCAGGTCTGGAATTCCATCCACTTTAGCAAGGATGGACGCGCCACAGAGAGACG
|:|||:::||||:|||||||::||::|:|||||:|||||||||++++::|:|||||||++
2281 GTATTTTTAGGTTTGGAATTTTATTTATTTTAGTAAGGATGGACGCGTTATAGAGAGACG
2341 CGTTCCTAGCCCGCGCTTCCCACCTGTCTTCAGGCGCATCCCGCTTCCCTCAAACTTAGG
++||::|||::++++:||:::|::|||:||:|||++:||::++:||:::|:|||:|||||
2341 CGTTTTTAGTTCGCGTTTTTTATTTGTTTTTAGGCGTATTTCGTTTTTTTTAAATTTAGG
AGG
2401 AAATGCCTCTGGGAGGTCCTGTCCGGCTCCGGACTCACTACCGACCACCCGCAAACAGCA
|||||::|:||||||||::|||:++|:|:++||:|:|:||:++|::|::++:|||:||:|
2401 AAATGTTTTTGGGAGGTTTTGTTCGGTTTCGGATTTATTATCGATTATTCGTAAATAGTA
AAATGTTTTTGGGAGGTTTTG F1 (Tm= 68,8°C) AGTA
2461 GGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCT
||||::::||||:||:::|||:++++:|::|:|:++:::++::::||++:::|::||::|
2461 GGGTTTTTTGGGTTTTTTAAGTCGCGTATTTTTTCGTTTCGTTTTTGCGTTTTTTTTTTT
GGGTTTTTTGGGTTTTTTAAGT F2 (Tm= 68,7°C)
2521 CGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCC
++++|:||::::|:|:::::|:::++::||:|:::|:::++::::||++|++:|||++:+
2521 CGCGTTTGTTTTTTTTTTTTATTTCGTTTTTTTTTTTTTCGTTTTAGCGGCGTATGCGTC
2581 GCGCTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCT
+++:|++|||++|||||||||||||||:++|:++++|::|||||:||:||||||||||:|
2581 GCGTTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTTCGGTCGCGGTTAGAAATTTTAGTTTGTTGGTT
CCAATCTTTAAAATCAAACAACCAA
R2 (Tm= 66°C)
2641 GCGGCAGCAGGTAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTG
|++|:||:||||||:|||||||++:++||||::||||||:|::|||||::|:++:||:||
2641 GCGGTAGTAGGTAGTAAAGTGACGTCGAGGGTTTGAGTGTTTTAGTAGTTATCGTATTTG
40
2701 GAGAACCAGCGGTTACCATGGAGGGGATCAGTGTAAGTCCAGTTTCAACCTGCTTTGTCA
|||||::||++||||::|||||||||||:|||||||||::|||||:||::||:|||||:|
2701 GAGAATTAGCGGTTATTATGGAGGGGATTAGTGTAAGTTTAGTTTTAATTTGTTTTGTTA
CCCTAATCACATTCAAATCAAAA R1 (Tm= 64,6°C)
ESQUEMA 1 - LOCALIZAÇÃO DOS INICADORES PARA NESTED PCR DO
FRAGMENTO 1 DA ILHA DE CpG-2 DO GENE CXCR4.
FONTE: METHPRIMER, 2008.
NOTA: No esquema acima está representada a seqüência de nucleotídeos antes (primeira linha) e
após (segunda linha) conversão pelo tratamento com bissulfito de sódio. O desenho dos iniciadores
foi baseado na seqüência inferior. Em azul, estão indicados os iniciadores universal (F1) e reverso
(R1) da primeira reação e os destacados em amarelo são os iniciadores universal (F2) e reverso (R2)
da reação nested. Entre parênteses estão indicados os Tms obtido a partir do Oligotech. Em
vermelho estão destacados os nucleotídeos G (posição 2296) e A (posição 2684) que correspondem,
respectivamente, ao começo e término da ilha. Em rosa está destacado o nucleotídeo G (posição
2571) que representa o início de transcrição +1 e em cinza está destacado o ATG que codifica o
primeiro aminoácido da proteína CXCR4. Em verde estão destacados os dinucleotídeos CG
presentes nesta ilha de CpG.
O outro fragmento do gene CXCR4 compreende o final da ilha 3
(+317/+1359) e o início da ilha 4 (+1317/+1647). Esta região analisada está
localizada entre os nucleotídeos +1188 e +1467 presente no íntron deste gene e
possui 280 pb (ESQUEMA 2).
3721 AAACCTTTTGAAACCCTCTTGCTAGGGAGTTTTTGGTTTCCTGCAGCGGCGCGCAATTCA
|||::||||||||:::|:|||:|||||||||||||||||::||:||++|++++:||||:|
3721 AAATTTTTTGAAATTTTTTTGTTAGGGAGTTTTTGGTTTTTTGTAGCGGCGCGTAATTTA
GTTAGGGAGTTTTTGGTT F1 (Tm= 59,9°C)
3781 AAGACGCTCGCGGCGGAGCCGCCCAGTCGCTCCCCAGCACCCTGTGGGACAGAGCCTGGC
||||++:|++++|++|||:++:::|||++:|::::||:|:::|||||||:||||::|||+
3781 AAGACGTTCGCGGCGGAGTCGTTTAGTCGTTTTTTAGTATTTTGTGGGATAGAGTTTGGC
GTATTTTGTGGGATAGAG F2
(Tm= 59,9°C)
3841 GTGTCGCCCAGCGGAGCCCCTGCAGCGCTGCTTGCGGGCGGTTGGCGTGGGTGTAGTGGG
+|||++:::||++|||::::||:||++:||:|||++||++|||||++|||||||||||||
3841 GTGTCGTTTAGCGGAGTTTTTGTAGCGTTGTTTGCGGGCGGTTGGCGTGGGTGTAGTGGG
3901 CAGCCGCGGCGGCCCGGGGCTGGACGACCCGGCCCCCCGCGTGCCCACCGCCTGGAGGCT
:||:++++|++|::++|||:||||++|::++|:::::++++||:::|:++::||||||:|
3901 TAGTCGCGGCGGTTCGGGGTTGGACGATTCGGTTTTTCGCGTGTTTATCGTTTGGAGGTT
3961 TCCAGCTGCCCACCTCCGGCCGGGTTAACTGGATCAGTGGCGGGGTAATGGGAAACCACC
|::||:||:::|::|:++|:++||||||:|||||:|||||++|||||||||||||::|::
3961 TTTAGTTGTTTATTTTCGGTCGGGTTAATTGGATTAGTGGCGGGGTAATGGGAAATTATT
4021 CGGGAGAGTGAGGAAATGAAACTTGGGGCGAGGACCACGGGTGCAGACCCCGTTACCTTC
++|||||||||||||||||||:||||||++||||::|++||||:|||:::++|||::||:
4021 CGGGAGAGTGAGGAAATGAAATTTGGGGCGAGGATTACGGGTGTAGATTTCGTTATTTTT
CAATAAAAA
4081 TCCACCCAGGAAAATGCCCCGCTCCCTAACGTCCCAAACGCGCCAAGTGATAAACACGAG
|::|:::|||||||||:::++:|:::|||++|:::|||++++::||||||||||:|++||
41
4081 TTTATTTAGGAAAATGTTTCGTTTTTTAACGTTTTAAACGCGTTAAGTGATAAATACGAG
AAATAAATCCTTTTAC R2 (Tm= 61,1°C) CTC
4141 GATGGCAAGAGACCCACACACCGGAGGAGCGCCCGCTTGGGGGAGGAGGTGCCGTTTGTT
|||||:||||||:::|:|:|:++||||||++::++:|||||||||||||||:++||||||
4141 GATGGTAAGAGATTTATATATCGGAGGAGCGTTCGTTTGGGGGAGGAGGTGTCGTTTGTT
CTACCATTCTCTAA R1 (Tm= 58,7°C)
4201 CATTTTCTGACACTCCCGCCCAATATACCCCAAGCACCGAAGGGCCTTCGTTTTAAGACC
:|||||:|||:|:|::++:::||||||::::|||:|:++|||||::||++||||||||:+
4201 TATTTTTTGATATTTTCGTTTAATATATTTTAAGTATCGAAGGGTTTTCGTTTTAAGATC
4261 GCATTCTCTTTACCCACTACAAGTTGCTTGAAGCCCAGAATGGTTTGTATTTAGGCAGGC
+:|||:|:||||:::|:||:||||||:||||||:::|||||||||||||||||||:|||+
4261 GTATTTTTTTTATTTATTATAAGTTGTTTGAAGTTTAGAATGGTTTGTATTTAGGTAGGC
ESQUEMA 2 - LOCALIZAÇÃO DOS INICADORES PARA NESTED PCR DO
FRAGMENTO 2 DAS ILHAS DE CpG 3-4 DO GENE CXCR4.
FONTE: METHPRIMER, 2008.
NOTA: Em azul, estão indicados os iniciadores universal (F1) e reverso (R1) da primeira reação e os
destacados em amarelo são iniciadores universal (F2) e reverso (R2) da reação nested. Entre
parênteses estão indicados os Tms obtido a partir do OLIGOTECH. Destacado em vermelho está o
nucleotídeo A (posição 3988) que marca o final da ilha 3 (posição 2946-3988) e, em amarelo escuro
estão destacados os nucleotídeos G (posição 4000) e A (posição 4276) que correspondem,
respectivamente ao começo e término da ilha 4. Em verde estão destacados os dinucleotídeos CG
presentes nesta ilha de CpG.
Pode-se observar que os iniciadores não alinham sobre nenhum
dinucleotídeo CG. Essa característica é importante para que a reação de PCR seja
capaz de amplificar a mesma região em estudo, tanto em amostras altamente
metiladas, quanto em amostras desmetiladas.
3.4.2 Extração de DNA das linhagens e das amostras de tumores primários de
mama
O perfil de metilação da região promotora do gene CXCR4 foi avaliado
através do tratamento do DNA com o agente deaminante bissulfito de sódio. Para
tanto, efetuou-se a extração do DNA genômico das diferentes linhagens e das
amostras de tumores primários de mama através do método convencional de
fenol:clorofórmio.
42
3.4.2.1 Extração de DNA das linhagens tumorais de mama
A extração de DNA das linhagens foi feita através do método
fenol:clorofórmio, como descrito por Costa et al. (2006).
Em síntese, as células foram digeridas durante a noite em tampão TES
(1 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,5 M EDTA e 10% SDS), contendo 200 µg/mL de
proteinase K (Sigma, St. Louis, MO, USA) e 200 µg/mL de RNAse A (GibcoBRL,
Gaithersburg, MD, USA). Em seguida, efetuou-se a extração com 1 volume de
fenol:clorofórmio (Invitrogen/Merck; Carlsbad, CA, USA/Whitehouse Station, NJ,
USA) até a obtenção de uma fase aquosa transparente livre de proteínas. Após
recuperação da fase aquosa, o DNA foi precipitado com 1/10 do volume de acetato
de sódio 3 M, pH 5; e 2 volumes de etanol absoluto (Merck, Whitehouse Station, NJ,
USA). Após centrifugação, o precipitado de DNA foi lavado com etanol 70%,
ressuspenso em água ultra-pura estéril e armazenado a 4°C.
A qualidade e quantidade do DNA purificado foram avaliadas através de
eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. A presença de
uma banda única foi indicativo de que o DNA estava bem dissolvido e não estava
degradado. O DNA extraído foi quantificado por espectrofotometria (NanoDrop ND-
1000 UV-VIS, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA), disponível no LICR-
SP.
3.4.2.2 Extração de DNA dos tumores primários de mama
Para extração do DNA dos tumores, um fragmento de aproximadamente
1 cm de cada amostra foi picotado com auxílio de um bisturi e digerido a 55
o
C em
500 µL de tampão TES (10 mM TrisHCl, 50 mM EDTA, 2,7% SDS), contendo
62,5 µg/mL de Proteínase K (Sigma, St. Louis, MO, USA) e 100 µg/mL de RNAse A
(GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA). Após dissolução completa da massa tumoral,
efetuou-se a extração segundo protocolo descrito por Costa et al. (2006).
A qualidade e quantidade do DNA purificado também foram avaliadas
através de eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. O
DNA extraído foi quantificado no espectrofotômetro GeneQuant II (Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ, USA).
43
3.4.3 Tratamento do DNA extraído das linhagens e dos tumores primários de mama
com bissulfito de sódio
Os DNAs devidamente quantificados foram submetidos ao tratamento com o
bissulfito de sódio. Este agente promove a deaminação de citosinas não metiladas
em uracilas, as quais após a reação de PCR são convertidas em timinas. Por outro
lado, as citosinas metiladas permanecem como citosinas, pois o grupamento metila
protege contra a reação de deaminação. O método empregado para tratar o DNA
com bissulfito de sódio corresponde a uma adaptação do método de Jerónimo et al.
(2001).
O tratamento de DNA com bissulfito de sódio foi feito utilizando o EpiTect
®
Bissulfite kit (Qiagen, Valencia, California, USA), segundo protocolo fornecido pelo
fabricante. Basicamente, este tratamento consistiu na conversão mediada pelo
bissulfito de sódio das citosinas não-metiladas; ligação do DNA tratado à sílica
presente na membrana de uma coluna; lavagem e dessulfonação do DNA ligado à
membrana; lavagem para remoção do agente de dessulfonação (hidróxido de sódio)
e eluição do DNA convertido pelo bissulfito. O DNA tratado foi armazenado a -80°C.
Para avaliar a qualidade do tratamento, efetuou-se uma reação de PCR com
o gene da seqüência repetitiva denominado SATR1, como descrito por Costa et al.
(2006).
3.4.4 Amplificação dos fragmentos das ilhas de CpG do gene CXCR4
Os fragmentos das ilhas de CpGs do gene CXCR4 foram amplificados por
nested PCR. As reações foram realizadas em um volume final de 25 µL contendo
1X tampão de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1,5 mM de MgCl
2
,
200 µM de dNTPs, 1 U de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 pmoles
de iniciadores e 1-5 µL de DNA (0,02-0,1 µg/µL) previamente tratado com bissulfito
de sódio. As reações nested foram realizadas nas mesmas condições utilizando-se
1-5 µL do produto da primeira reação.
As reações foram efetuadas com incremento de 2ºC na temperatura de
anelamento após o primeiro ciclo e com aumento de mais 2ºC após o sexto ciclo,
seguindo com esta temperatura de anelamento até o final da reação. Para o
fragmento 1, foi utilizada na primeira reação uma temperatura inicial de anelamento
44
igual a 53ºC e para a reação nested a temperatura incial foi igual a 57°C. Para o
fragmento 2, a temperatura inicial da primeira reação foi 47°C e a da reação nested
foi 51°C. As condições de amplificação tanto na primeira reação como na reação
nested foram: desnaturação inicial do DNA por 12 minutos a 94ºC; seguida por
1 ciclo de desnaturação a 94ºC por 3 minutos, anelamento por 3 minutos e extensão
a 72°C por 2 minutos; seguida por 5 ciclos de desnaturação a 94ºC por 3 minutos,
anelamento por 3 minutos e extensão a 72°C por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento por 1 minuto e extensão a 72°C por
1 minuto. Ao final da ciclagem as moléculas foram estendidas por 7 minutos a 72ºC.
Os dados sobre os iniciadores utilizados para as reações de nested PCR estão
expostos no item 3.4.1. A análise da amplificação foi feita em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídeo.
3.4.5 Clonagem e seqüenciamento do fragmento 1 da ilha de CpG-2 do gene
CXCR4
Inicialmente, o fragmento 1 da ilha de CpG-2 do gene CXCR4 amplificado
por nested PCR foi purificado em gel de agarose 1%, utilizando o QIAquick® Gel
Extraction Kit (Qiagen, Valencia, California, USA), seguindo as especificações do
fabricante. Em seguida, efetuou-se a ligação do amplicon de 184 pb ao vetor
pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) em uma reação com um volume final
de 10 µL, contendo 1X tampão de ligação (Promega, Madison, WI, USA), 50 ng de
pGEM®-T Easy, 3 U de T4 DNA ligase (Promega, Madison, WI, USA) e
aproximadamente 9 ng do produto de PCR preparado no mesmo dia. Esse sistema
foi incubado durante a noite à 4°C e armazenado a -20°C.
Esse sistema permite a clonagem de produtos de PCR que possuem
adeninas nas extremidades 3’, adicionadas por algumas polimerases termoestáveis,
como a enzima Taq polimerase. O vetor linearizado possui timinas nas pontas 3’,
aumentando a eficiência de ligação com o produto de PCR. Como o fragmento que
se deseja clonar se insere no gene lac, que codifica a β-galactosidase, é possível
identificar os clones recombinantes a partir da coloração das colônias na presença
de X-Gal. Nas células que possuem o vetor sem inserto a enzima cliva este
substrato produzindo uma coloração azulada.
45
O produto de ligação foi então utilizado para transformação de bactérias
DH10B eletrocompetentes, preparadas conforme descrito por Sambrook e Russel,
(2001). Após eletroporar o plasmídeo recombinante nesta estirpe bacteriana e de
recuperar as células em meio SOC, a suspensão de células foi plaqueada em meio
LA contendo estreptomicina 20 μg/mL, ampicilina 250 µg/mL, IPTG 45 μg/mL e
X-Gal 25 μg/mL. Esse meio proporciona o isolamento de clones por alfa
complementação. As colônias brancas em sua maioria entre colônias azuis devem
ter o inserto clonado no vetor.
Para a confirmação da clonagem foram selecionadas 12 colônias isoladas
de cada placa. Cada colônia foi coletada com um palito estéril e semeada para uma
nova placa (placa mãe). Com o mesmo palito foram inoculadas células bacterianas
em um tubo contendo a mistura da reação de PCR.
As reações de PCR de colônia foram realizadas em um volume final de 20 µl
contendo tampão 1X de Taq Polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1,5 mM de
MgCl
2
, 200 µM de dNTPs, 1 U de Taq polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e
8 pmoles de iniciadores F2 e R2 (item 3.4.1). As condições de amplificação foram:
desnaturação por 5 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94
o
C
por 1 minuto, anelamento a 61ºC por 1 minuto e extensão a 72
o
C por 1 minuto. Ao
final da ciclagem as moléculas foram extendidas por 7 minutos a 72ºC. Os produtos
amplificados foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de
etídeo.
Após constatar os clones que possuíam o vetor recombinate, efetuou-se a
extração de DNA plasmidial com o QIAprep® Miniprep Kit (Qiagen, Valencia,
California, USA). Resumidamente, uma colônia isolada foi inoculada em meio LB,
contendo os antibióticos adequados, e incubada a 37°C, 180-220 rpm (C25Incubator
Shaker, New Brunswick Scientific, NJ, USA), durante a noite. A cultura crescida foi
aliquotada, as células foram concentradas por centrifugação e, em seguida, lisadas
sob condições alcalinas, na presença de RNase A. O lisado foi neutralizado e o DNA
plasmidial foi ligado à membrana de sílica de uma coluna. A coluna foi lavada e o
DNA foi eluído em tampão com baixa concentração de sal ou com água ultra-pura,
pH 7,0-8,5. A qualidade e a quantidade de DNA plasmidial foi inferida em gel de
agarose 1%, corado com brometo de etídeo, comparando as amostras a 100 ng de
pGEM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O produto da miniprep foi
armazenado a -20°C.
46
A partir do DNA plasmidial extraído de cada um dos oito clones, efetuou-se a
reação de seqüenciamento. O seqüenciamento foi realizado segundo a técnica de
terminação com dideoxinucleotídeos descrita por Sanger, Nicklen e Coulson (1977)
utilizando-se o Big Dye® Terminator Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA),
segundo as instruções do fabricante.
A reação de seqüenciamento foi realizada em um sistema de 10 µL
contendo 2 µL de Big Dye Terminator v3.0 100RR, 1 µL de tampão Save Money
2,5X (200 mM TrisHCl, pH 8,5; 5 mM MgCl
2
), 5 pmol/µL de iniciador universal ou
reverso M13 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e aproximadamente 250 ng de DNA
plasmidial. As condições utilizadas foram: desnaturação inicial de 96°C por 1 minuto,
seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos e anelamento a
60°C por 2 minutos e 30 segundos. Os produtos amplificados foram precipitados em
isopropanol 75%, lavados em etanol 65%, secos a 37°C. O DNA plasmidial
precipitado foi ressuspenso em tampão contendo formamida deionizada e corante
BlueDextran/EDTA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), na razão de 5:1. Por
fim, as amostras foram submetidas à eletroforese por capilaridade no seqüenciador
automático de DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), no
ILCR-SP ou no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, da UFPR.
3.4.6 COmbined Bisulfite Restriction Analysis- COBRA dos fragmentos das ilhas de
CpG do gene CXCR4
Os dois fragmentos das duas ilhas de CpG presentes no gene CXCR4 foram
submetidos à análise de restrição combinada com bissulfito (XIONG; LAIRD, 1997).
Esta técnica, utilizada para confirmar os dados obtidos por seqüenciamento, permite
uma análise mais limitada, visto que somente é possível inferir o perfil de metilação
dos dinucleotídeos presentes nos sítios de restrição da enzima BstU1. Assim, a
digestão completa do DNA ocorre somente se os dinucleotídeos CpGs contidos nos
sítio CGCG que a aludida enzima reconhece, mantiverem-se não modificados após
tratamento com bissulfito de sódio.
Brevemente, cerca de 50 ng do produto de PCR purificado foi digerido com
2 U da enzima BstU1 (New England Biolabs, Hertfordshire, England, UK), por 4
horas em um sistema com volume final de 20 µL contendo 2 µL de 1X tampão Neb
47
buffer 2 (New England Biolabs, Hertfordshire, England, UK). Os produtos de
digestão foram aplicados em géis de poliacrilamida 12% (item 3.4.6.1).
Na figura 5 estão representados os mapas de restrição para o fragmento 1
da ilha de CpG-2 e para o fragmento 2 das ilhas 3/4 do gene CXCR4.
A
B
FIGURA 5 - ESQUEMA REPRESENTATIVO DO MAPA DE RESTRIÇÃO DOS
FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR NESTED. (A) FRAGMENTO 1
E (B) FRAGMENTO 2.
3.4.6.1 Eletroforese em géis de poliacrilamida
O perfil de digestão da enzima BstU1 bem como os produtos de MSP,
detalhado a seguir, foram avaliados por eletroforese em géis de poliacrilamida 12%
e 8%, respectivamente.
Os géis foram preparados utilizando-se uma solução de poliacrilamida e bis-
acrilamida (proporção 29:1), 0,1% de persulfato de amônio (Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA) e 0,025% de TEMED (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). A
eletroforese foi conduzida em aparato de gel médio, a 100-120 V, por
aproximadamente 1 hora.
Os géis foram corados com nitrato de prata (SANGUINETTI et al., 1994).
Para tanto, o gel com aproximadamente 56 cm
2
foi incubado por três minutos em
50 mL de solução fixadora (0,75% ácido acético glacial, 10% etanol absoluto), sob
agitação suave, à temperatura ambiente. A esta solução foi adicionado 1 mL de
nitrato de prata 10% e manteve-se o gel incubado sob agitação suave por
10 minutos. Após impregnação do DNA com prata, o gel foi lavado com água ultra-
pura, foram adicionados 50 mL de revelador (3% hidróxido de sódio,
0,5% formaldeído) e manteve-se agitando por pelo menos 5 minutos, à temperatura
ambiente, até visualização das bandas. Após a revelação, o gel foi incubado em
48
solução fixadora por 10 minutos, lavado com água ultra-pura e seco em papel
celofane.
3.4.7 Análise da metilação em amostras de tumores de mama por Methylation
Specific PCR- MSP
A partir do perfil de metilação do fragmento 1 (referente à ilha de CpG-2)
obtido para todas as linhagens através do seqüenciamento foi possível determinar
quais dinucleotídeos se apresentaram diferencialmente metilados. Foram escolhidos
os CpGs 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16 que se apresentaram
predominantemente metilados na linhagem que não expressou o gene CXCR4 e que
se apresentaram predominatemente desmetilados nas linhagens que expressaram
tal gene. Sobre estes dinucleotídeos foram desenhados os iniciadores utilizados nas
reações de MSP com as amostras de tumores primários de mama. Além desse
critério, ressalta-se que não foi possível desenhar os iniciadores para MSP em outra
região.
A técnica de MSP é bastante importante porque permite analisar o perfil de
metilação de uma amostra sem ter que efetuar os passos de clonagem e
seqüenciamento. Esta metodologia se baseia na diferença entre a seqüência do
DNA metilado e não metilado após tratamento com bissulfito de sódio e, como não é
possível saber se o DNA das amostras tumorais está ou não metilado são
desenhados dois pares de iniciadores utilizados, um para a condição metilada (gene
desligado por metilação) e outra para a não metilada (gene ativo). Assim, efetuam-
se duas reações de PCR, cada qual com um par de iniciadores específicos.
Os iniciadores para as reações de MSP com o gene CXCR4 foram
desenhados sobre os CpGs diferencialmente metilados citados anteriomente, com
auxílio dos programas Methprimer (METHPRIMER, 2008) e Oligotech (OLIGOTECH,
2008). A localização dos iniciadores no gene, para a situação metilada e não-
metilada, segue exposta no esquema 3.
49
2461 GGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCT
||||::::||||:||:::|||:++++:|::|:|:++:::++::::||++:::|::||::|
2461 GGGTTTTTTGGGTTTTTTAAGTCGCGTATTTTTTCGTTTCGTTTTTGCGTTTTTTTTTTT
CGCGTATTTTTTCGTTTCG FM (Tm= 63,2°C)
AAGTTGTGTATTTTTTTGTTTTG FU (Tm= 61,1°C)
2521 CGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCC
++++|:||::::|:|:::::|:::++::||:|:::|:::++::::||++|++:|||++:+
2521 CGCGTTTGTTTTTTTTTTTTATTTCGTTTTTTTTTTTTTCGTTTTAGCGGCGTATGCGTC
AATCGCCGCATACGCAG
ACATACACAA
2581 GCGCTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCT
+++:|++|||++|||||||||||||||:++|:++++|::|||||:||:||||||||||:|
2581 GCGTTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTTCGGTCGCGGTTAGAAATTTTAGTTTGTTGGTT
C RM(Tm= 69,1°C)
CACAAACCTCAC RU(Tm= 67,6°C)
ESQUEMA 3 – LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES ESPECÍFICOS PARA
REAÇÃO DE MSP.
FONTE: METHPRIMER, 2008.
NOTA: Em azul, estão destacados os nucleotídeos CG considerados diferencialmente metilados
após seqüenciamento. Ao lado da seqüência de cada iniciador está indicado o Tm obtido pelo
programa Oligotech. FM: iniciador universal para a reação metilada; FU: iniciador universal para a
reação não metilada; RM: iniciador reverso para a reação metilada; RU: iniciador universal para a
reação não metilada. Os iniciadores para a situação metilada geram um amplicon de 99 pb e para a
situação não metilada gera um fragmento de 110 pb.
3.4.7.1 Reações de MSP
A padronização da técnica de MSP foi feita utilizando-se como controle os
DNAs extraídos de duas linhagens celulares: MDA-MB-436, utilizada como controle
positivo para a reação não metilada e MDA-MB-435, usada como controle positivo
para a reação metilada. As reações de MSP foram padronizadas variando-se a
temperatura e o tempo de anelamento, a concentração final de MgCl
2
, o número e o
tempo de duração dos ciclos.
Para as reações de MSP foi empregado 1 μL de DNA tumoral tratado com
bissulfito de sódio. Os sistemas para condição não metilada (U) apresentavam um
volume final de 20 µL contendo 1X tampão de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA), 1,5 mM de MgCl
2
,
200 µM de dNTPs, 0,2 µM de cada iniciador e 1U de
Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). As condições de amplificação foram:
10 minutos a 95°C para ativação da enzima, seguido por 35 ciclos de desnaturação
a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 15 segundos, extensão a 72°C por
30 segundos, e, um ciclo para extensão final de 72°C por 5 minutos.
50
Os sistemas para condição metilada (M) apresentavam um volume final de
20 µL contendo 1X tampão de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 3,5
mM de MgCl
2
,
200 µM de dNTPs, 8 pmoles de cada iniciador e 1U de Taq Platinum
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). As condições de amplificação foram: 10 minutos a
95°C para ativação da enzima, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 45
segundos, anelamento a 61°C por 15 segundos, extensão a 72°C por 45 segundos,
e, um ciclo para extensão final de 72°C por 5 minutos.
As reações foram analisadas em géis de poliacrilamida 8% corados com
nitrato de prata (item 3.4.6.1).
3.4.7.2 Correlação entre o padrão de metilação do gene CXCR4 nos tumores
primários de mama e os dados clínico-patológicos das pacientes
Foram levantados os dados clínico-patológicos de todas pacientes através
da análise dos laudos das biópsias dos tumores primários e dos prontuários do
Hospital Nossa Senhora das Graças e do Hospital de Clínicas, com o auxílio do Dr.
Rubens Silveira Lima.
Os dados clínicos levantados foram: idade da paciente na data do
diagnóstico da doença, estadiamento do tumor segundo a classificação TNM da
União Internacional contra o Câncer (UICC) (ANEXO 2), tamanho do tumor,
classificação do grau histológico tumoral conforme SBR (Scarff-Bloom-Richardson),
comprometimento linfonodal, presença dos marcadores moleculares RE, PR e
ERBB-2, presença de metástase no momento e no seguimento terapêutico da
paciente, e aparecimento de recidivas e óbito.
A análise da associação entre as variáveis qualitativas foi realizada
utilizando o programa Statistical Package for Social Science (SPSS 12.0), através do
teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Foi estabelecido um erro de 5%,
dessa forma, os resultados foram considerados estatisticamente significativos
quando p<0,05.
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ANÁLISE IN SILICO DO GENE CXCR4
Para analisar a existência de ilhas de CpG no gene CXCR4, a seqüência de
RNAm foi submetida à análise no programa Human Blat através do qual foi possível
adquirir a seqüência que englobava desde a região promotora até o intron do gene
(2,6 kb antes e 1,7 kb após o início da transcrição). Esta seqüência, por sua vez, foi
submetida à análise no programa CpGPlot. Na figura 6 está exposto o gráfico obtido
por este programa, que permite verificar a existência de quatro ilhas de CpG no
gene CXCR4.
A
B C D
FIGURA 6 - RESULTADO OBTIDO PELO PROGRAMA CpGPLOT. (A) RAZÃO
ENTRE O OBSERVADO/ESPERADO DA FREQÜÊNCIA DE
DINUCLEOTÍDEOS CG; (B) PORCENTAGEM DE CG; (C)
LOCALIZAÇÃO DAS ILHAS DE CpG.
FONTE: CpGPLOT, 2008.
NOTA: No terceiro gráfico (C) estão indicadas as quatro ilhas de CpG presentes no gene CXCR4. A
ilha de CpG-1 possui 524 pb (A), a ilha 2 possui 389 pb (B), a terceira ilha possui 1043 pb (C) e a
última ilha possui 277 pb (D).
52
O gráfico superior mostra a razão entre o número observado e o esperado
de dinucleotídeos CpG. O número esperado de dinucleotídeos é calculado pela
seguinte fórmula: Esperado = (número de cistosinas x número de guaninas)/
comprimento da ilha. No segundo gráfico, está exposto, em porcentagem, o
conteúdo de guaninas + citosinas. E, no último gráfico estão expostas as ilhas de
CpG presentes neste gene. O programa CpGPlot define como ilha de CpG a região
com mais de 200 pb, contendo pelo menos 50% de G+C e uma razão entre a
freqüência observada e a esperada de dinucleotídeos CG superior ou igual a 0,6
(GARDINER-GARDEN; FROMMER, 1987).
4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE CXCR4 NAS LINHAGENS TUMORAIS
DE MAMA
A análise da expressão do gene CXCR4 foi efetuada através de RT-PCR.
Para isso, o RNA total das linhagens tumorais foi extraído com o reagente TRIzol®,
analisado qualitativamente em gel de agarose 1% e quantificado (item 3.3.1). Após
corrida eletroforética, pode-se constatar que as amostras de RNA total extraídas
tinham boa qualidade, visto que as bandas 18S e 28S, correspondentes ao RNA
ribossômico, estavam bem visíveis. Além disso, parecia haver quantidade suficiente
de RNA e ausência de contaminação com DNA genômico. A eficiência da
purificação foi confirmada após análise em espectofotometria, em que se observou
que os valores de concentração das amostras variaram de 473,6 a 758,0 ng/μL e a
razão 260/280 nm variou de 1,5 a 1,69. As concentrações obtidas, embora
representem apenas uma estimativa, permitem pressupor que as amostras
possuíam quantidades satisfatórias e, apesar da razão DO
260
/DO
280
obtida sugerir
que os RNA totais não estavam muito puros (visto que os valores foram inferiores a
1,8), os contaminantes presentes não atrapalharam as reações subseqüentes.
Após quantificação, foram utilizados aproximadamente 500 ng de RNA total
em reações de transcrição reversa com iniciadores oligo dT, para síntese da primeira
fita de cDNA (item 3.3.2). Para verificação da eficiência desta síntese foi empregado
como controle o gene GAPDH.
Os resultados de RT-PCR com o gene de expressão constitutiva mostraram
o fragmento esperado de 296 pb em todas as linhagens, como observado na figura
7. Com este resultado constatou-se que o cDNA sintetizado tinha boa qualidade e
53
quantidade e, conseqüentemente, pode-se deduzir que a extração de RNA também
foi eficiente. Além disso, pode-se verificar que o cDNA sintetizado não apresentava
contaminação com DNA genômico; uma vez que, não foi observado o fragmento de
489 pb, que representariam a presença do íntron.
Uma vez constatada qualidade e quantidade adequadas de cDNA, este foi
utilizado como molde em reações de RT-PCR semi-quantitativo com 30, 35 e 38
ciclos de amplificação para o CXCR4 e o GAPDH (item 3.3.3). Comparando-se o
perfil de amplificação do gene CXCR4 com o perfil de expressão do GAPDH foi
possível inferir se existia regulação da expressão do gene de estudo (FIGURA 7).
GAPDH
PMC-42 MCF-7
MDA-
MB-436
MDA-
MB-435
30 35 38 30 35 38 30 35 38 30 35 38
CXCR4
396 pb
296
p
b
FIGURA 7 - RT-PCR SEMI-QUANTITATIVO DOS GENES CXCR4 E GAPDH COM
30, 35 E 38 CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO.
NOTA: Gel de agarose 1% representando o perfil de expressão do gene de estudo CXCR4 e do gene
controle GAPDH nas linhagens tumorais de mama PMC-42, MCF-7, MDA-MB-436, MDA-MB-435.
Os níveis de expressão do gene CXCR4 variaram entre as linhagens
celulares, conforme se pode constatar na figura acima. A confirmação dessa
variabilidade poderia ser confirmada com experimentos de PCR em tempo real, que
não puderam ser realizados. Entretanto, mesmo sem quantificar, podemos verificar
que o gene CXCR4 tem expressão aumentada nas linhagens PMC-42, MCF-7 e
MDA-MB-436, quando comparado com o gene GAPDH. Este resultado concorda
com outros trabalhos descritos na literatura em que se verificou a aumentada
expressão do CXCR4 em linhagens tumorais de mama e em outros tipos de câncer.
Muller et al. (2001), Kang et al. (2005), Lee et al. (2004) e Holland et al.
(2006) também constataram a superexpressão do gene ou da proteína CXCR4
através de RT-PCR ou Western Blotting, respectivamente, em linhagens tumorais de
mama, como a MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-436, BT-549, MDA-MB-453, MDA-
MB-134 e DU4475. Este mesmo resultado foi confirmado em linhagens celulares de
outros tipos de câncer, como IGROV e CAOV-3 (câncer de ovário), ATL-2 e células
54
de Jurkat (linfoma), PC-3 e LNCaP (câncer de próstata) e em IGR-N91, SH-SY5Y
(neuroblastoma) (SCOTTON et al., 2001; SINGH et al., 2004; MEIER et al., 2007).
Holland et al. (2006) atentaram para um detalhe muito importante que trata
da relação entre funcionalidade e expressão do receptor CXCR4. Estes observaram
uniformidade de expressão do transcrito e da proteína CXCR4, bem como similar
afinidade de ligação à proteína CXCL12 entre linhagens de câncer de mama não
invasivas e metastáticas (MDA-MB-231, BT-549 e MDA-MB-453, MDA-MB-134). No
entanto, somente nas células altamente invasivas foi observada a ativação deste
receptor em resposta ao CXCL12. Majka et al. (2000) também constataram, em
plaquetas, que o elevado nível de expressão do gene CXCR4 não esteve
relacionado com a funcionalidade deste receptor. Assim, pode-se concluir que
embora uma célula possua altos níveis de expressão da proteína CXCR4, não
significa que este receptor vai estar ativo e desencadeando seus efeitos biológicos
via interação com a proteína CXCL12.
A inativação do receptor CXCR4 pode ocorrer pelo bloqueio da sinalização
intracelular (HOLLAND et al., 2006). Soriano et al. (2002) mostraram que, em células
de mieloma (IM-9), a superexpressão da SOCS3 (proteína supressora de
sinalização de citocina 3) acarreta a inativação funcional do CXCR4 por impedir a
associação da subunidade Gα da proteína G e do complexo JAK/STAT ao CXCR4,
bloqueando assim tais vias.
No câncer de mama o aumento da expressão do gene CXCR4 pode ser
induzida por variados fatores, como NF-κB, VEGF (BACHELDER, WENDT,
MERCURIO, 2002; HELBIG et al., 2003), IFN-γ (ZHANG et al., 2007) e pela hipóxia
característica do microambiente de tumores sólidos (SCHIOPPA et al., 2003; SHIM
et al., 2006). O CXCL12 também pode estimular a superexpressão do CXCR4 via
autócrina (derivado da célula tumoral) ou parácrina (derivada das células do
estroma) (BURGER, KIPPS, 2006). Por outro lado, a proteína CXCL12 também
pode acarretar a diminuição temporária dos níveis de CXCR4 de superfície celular,
pois após o receptor ser ativado por esta quimiocina ele é internalizado e geralmente
degradado (FUTASHI et al., 2007). A expressão autócrina e parácrina do CXCL12
confere vantagens à célula tumoral. A ausência ou a redução da expressão desta
quimiocina nesta célula e a elevada expressão em órgãos distantes poderia
promover a atração das células tumorais a possíveis órgãos-alvo de metástase,
conferindo uma vantagem seletiva em termos de aquisição de potencial metastático.
55
Por outro lado, a expressão de CXCL12 pelas células tumorais poderia favorecer a
retenção celular no tumor primário, promovendo a proliferação e sobrevivência
celular (WENDT et al., 2007).
Também está bem estabelecido que a expressão gênica pode ser regulada
epigeneticamente, tanto pelo mecanismo de metilação das citosinas, quanto de
acetilação das histonas. Em tumores de pâncreas e em melanomas foi constatado
que a expressão do CXCR4 pode ser regulada pela metilação do DNA (MORI et al.,
2005; SATO et al., 2005).
Do painel de células analisadas neste trabalho a MDA-MB-435 foi a única
linhagem que apresentou o gene CXCR4 inativo. Neste caso, a fim de verificar se o
silenciamento decorria da metilação das citosinas presentes na ilha de CpG, foi
efetuado o tratamento desta célula com 5-Aza-CdR (item 3.3.4). A avaliação da re-
expressão do transcrito após tratamento com tal agente desmetilante também foi
feita através de RT-PCR (FIGURA 8). Da mesma forma como citado anteriormente,
a qualidade do RNA total extraído desta linhagem foi analisado após corrida
eletroforética em gel de agarose 1% e a concentração, bem como a pureza da
amostra, foi estimada por espectrofotometria. A amostra apresentou concentração
igual a 283,9 ng/μL e a razão 260/280 nm foi igual a 1,875. Estes valores sugerem
quantidade satisfatória de RNA total e ausência de contaminação com proteínas e
fenol.
.
CXCR4
GAPDH
5Aza-CdR
- +
396 pb
296 pb
FIGURA 8 - RT-PCR PARA OS GENES GAPDH E CXCR4 COM 35 CICLOS DE
AMPLIFICAÇÃO.
NOTA: Gel de agarose 1% representando a expressão do gene CXCR4 antes (-) e após (+) o
tratamento com 5-Aza-CdR.
O resultado obtido por RT-PCR foi muito importante, porque, conforme
exposto na figura acima, é possível observar que o gene CXCR4 voltou a ser
expresso após o tratamento com agente desmetilante, sugerindo que pelo menos
56
em linhagens tumorais de mama tal gene está sendo regulado pelo mecanismo de
metilação. Esta afirmativa é reforçada por outros trabalhos descritos na literatura os
quais demonstraram que, embora a re-expressão do gene após o tratamento com
5-Aza-CdR seja um forte indicativo de que existe regulação da expressão gênica
devido à metilação do DNA, nem sempre a célula volta a expressar o gene após
este tratamento, pois, a expressão gênica pode ser regulada por outro tipo de
mecanismo, por exemplo, através do remodelamento da cromatina. Neste caso, o
tratamento com outras substâncias, como a tricostatina A (inibidor de desacetilases)
pode promover a expressão gênica (YOO; JONES, 2006).
Sato et al. (2005) constataram maior expressão do gene CXCR4 após
tratamento de células tumorais de pâncreas com tricostatina A e 5-Aza-CdR. A
resposta de cada linhagem ao tratamento foi variada. Em três células (AsPC1,
BxPC3 e MiaPaCa2) tanto o 5-Aza-CdR quanto a TSA promoveram superexpressão
do gene CXCR4, enquanto na célula Capan1, densamente metilada, somente a
administração conjunta das duas drogas foi capaz de induzir a forte expressão do
RNAm deste gene. Esta célula também foi tratada com acetato de forbol miristato
(PMA), o qual é um ativador do promotor do gene CXCR4, e constatou-se, que
mesmo adicionando tal substância, o aumento na expressão do gene em questão só
ocorria quando também era administrado TSA e 5-Aza-CdR. Com melanomas, isso
também foi confirmado. Mori et al. (2005) mostraram que a administração combinada
de 5-Aza-CdR com TSA aumentou a expressão do gene CXCR4. Mas, eles
demonstraram que a superexpressão do gene CXCR4 foi transiente, uma vez que,
após 72 h do tratamento observou-se uma diminuição a níveis praticamente basais
do RNAm do gene CXCR4. O aumento da expressão da proteína CXCR4 pelo
tratamento com 5-Aza-CdR foi verificado ainda em células de adenocarcinoma
endometrial Ishikawa ER+ e ER-. Neste trabalho constatou-se que a elevada
expressão da proteína CXCR4 foi devida à depleção completa da DNMT1 e à
significativa depleção da DNMT3B promovida pelo 5-Aza-CdR (KUBAREK;
JAGODZINSKI, 2007).
4.3 ANÁLISE DA METILAÇÃO DO GENE CXCR4 EM LINHAGENS TUMORAIS
A análise do perfil de metilação do gene CXCR4 foi feita através do
seqüenciamento e confirmado pelo método de COBRA.
57
Para isto, o DNA das linhagens tumorais foi extraído pelo método do
fenol:clorofórmio (item 3.4.2.1). A qualidade dos DNAs purificados foi determinada
através de eletroforese em gel de agarose 1%, em que se pode constatar ausência
de degradação, de contaminação com RNA e correta diluição das amostras. Por
espectrofotometria pode-se constatar que as amostras não possuíam contaminação
com proteínas e fenol, uma vez que os valores da razão 260nm/280nm variaram de
1,89 a 1,94. Pelos valores estimados de concentração (entre 57,7 e 361,8 ng/μL)
pode-se supor que havia quantidade suficiente de DNA para efetuar a próxima etapa
deste trabalho, relacionada ao tratamento com bissulfito de sódio.
Uma vez quantificado, 1μg de DNA extraído das linhagens foi submetido ao
tratamento com o agente deaminante bissulfito de sódio (item 3.4.3). Para verificar a
eficiência deste procedimento foi feita uma reação de nested PCR com o gene
SATR1, o qual se encontra hipometilado em mama. Após corrida eletroforética em
gel de agarose 1%, verificou-se a amplificação do fragmento de 690 pb esperado em
todas as linhagens, indicando que o tratamento com bissulfito foi eficiente, pois os
DNAs tratados não estavam muito degradados e apresentavam quantidade
suficiente para amplificação dos fragmentos das ilhas de CpG do gene CXCR4.
Após amplificação dos fragmentos 1, de 184 pb, e 2, de 280 pb, do gene
CXCR4, por nested PCR (item 3.4.4) constatou-se a ausência de bandas expúrias e
a presença de quantidade suficiente de DNA para digestão com a enzima BstU1 e
para efetuar a reação de ligação do inserto (fragmento 1) ao vetor de clonagem.
Assim, após amplificação do fragmento 1, este foi ligado ao vetor
pGEM®-T Easy e o produto de ligação foi eletroporado em DH10B eletrocompetente
tratada com glicerol 15%. Em seguida, através de PCR de colônia foram detectados
os clones que continham o vetor recombinante desejado (item 3.4.5).
Após tal triagem, os clones de interesse foram cultivados para posterior
extração de DNA plasmidial através do método da lise alcalina (item 3.4.5). Em géis
de agarose 1% foi possível observar que a técnica de minipreparação plasmidial foi
eficiente, pois parecia haver quantidade adequada de amostra para efetuar a reação
de seqüenciamento. A presença de várias bandas era um indicativo de que a
amostra não estava muito limpa, mas isso não afetou a etapa seguinte.
A reação de seqüenciamento foi feita com pelo menos oito clones de cada
linhagem, utilizando o protocolo do Big Dye® Terminator Kit e o seqüenciador ABI
58
Prism 377 (item 3.4.5). O perfil de metilação obtido para cada linhagem a partir dos
dados de seqüenciamento segue exposto no esquema 4A, B, C, D.
DINUCLEOTÍDEOS CpGs
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
C
L
O
N
E
S
8
7
6
5
4
3
2
1
A
B
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
C
L
O
N
E
S
8
6
7
4
5
3
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
DINUCLEOTÍDEOS CpGs
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
C
L
O
N
E
S
DINUCLEOTÍDEOS CpGs
59
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
8
7
1
2
3
4
5
6
DINUCLEOTÍDEOS CpGs
C
L
O
N
E
S
D
ESQUEMA 4 - PERFIL DE METILAÇÃO OBTIDO PARA O FRAGMENTO DE
184 pb DA ILHA DE CpG-2 DO GENE CXCR4, PARA AS
LINHAGENS MDA-MB-436 (A), MCF-7 (B), PMC-42 (C) E
MDA-MB-435 (D).
NOTA: Na vertical estão representados os 19 dinucleotídeos CpGs presentes neste fragmento, e na
horizontal estão indicados os clones analisados. Azul- CpG metilado; Branco- CpG desmetilado.
A partir dos esquemas acima foi possível constatar uma variação no perfil de
metilação do fragmento de 184 pb entre as linhagens analisadas. Em todas as
linhagens constatou-se que o perfil de metilação teve correlação com a expressão
gênica.
A linhagem MDA-MB-435 apresentou o fragmento da ilha de CpG-2
densamente metilado, com 91,4% de metilação. Nesta linhagem constatou-se que a
maioria dos dinucleotídeos CpGs presentes no fragmento analisado encontraram-se
metilados, pois os resíduos de citosinas foram mantidos após tratamento com
bissulfito de sódio. A elevada densidade de metilação das citosinas justifica a
inativação do CXCR4 na linhagem MDA-MB-435, conforme visto por RT-PCR e
confirma o resultado obtido pelo tratamento com 5-Aza-CdR.
As demais linhagens tumorais apresentaram menor densidade de metilação,
visto que grande parte das citosinas foi convertida em timinas após o tratamento
com bissulfito de sódio. A MCF-7 e PMC-42 apresentaram semelhante porcentagem
de metilação (20,3% e 17%, respectivamente). A linhagem MDA-MB-436 apresentou
o menor nível de metilação (9%). A presença de um maior número de dinucleotídeos
CpGs desmetilados pode explicar a superexpressão do gene CXCR4 nestas células,
conforme verificado por RT-PCR, e pela ausência de digestão pela BstU1, detalhado
adiante.
60
Pelo perfil de metilação obtido e comparando-se as linhagens que
expressam (MCF-7, PMC-42 e MDA-MB-436) e não expressam (MDA-MB-435) o
gene CXCR4 pode-se observar que os principais dinucleotídeos que são
diferencialmente metilados e que provavelmente regulam o silenciamento do gene
são: 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.
No trabalho desenvolvido por Sato et al. (2005) com linhagens tumorais de
pâncreas, um fragmento da ilha de CpG-1 (-1143 a -797, considerando o
nucleotídeo +1 descrito por Wegner et al., 1998) foi amplificado, tratado com
bissulfito e seqüenciado. Nesta pesquisa também foi observado que as linhagens
tumorais apresentaram variado perfil de metilação, sendo que algumas linhagens,
como a Capan2 e CFPAC1, apresentaram todos os dinucleotídeos desmetilados,
enquanto outras se apresentaram parcialmente metiladas (AsPC1 e BxPC3),
predominantemente ou completamente metiladas (Capan1, PL3 e PL12). Essa
região estudada parece ter sido utilizada para estudo de MSP com tumores
primários de pâncreas.
4.3.1 Análise da metilação pelo método de COBRA
A fim de confirmar os dados de metilação obtidos pelo seqüenciamento foi
utilizado o método COBRA (item 3.4.6). A partir do DNA modificado pelo tratamento
com bissulfito, foram amplificados os fragmentos das diferentes ilhas de CpG (2;3/4)
do gene CXCR4 por nested PCR. Em seguida, os produtos foram purificados e
digeridos com 2 U da enzima BstU1, a qual reconhece o sítio CGCG.
O perfil de digestão obtido para os fragmentos das ilhas 1 e 2 segue exposto
na figura 9A,B, respectivamente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
184 pb
184 pb
61
B
280 pb
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
280 pb
FIGURA 9 - RESULTADO DA ANÁLISE POR COBRA OBTIDO PARA OS
FRAGMENTOS 1 (ILHA DE CpG-2) E 2 (ILHA DE CpG-3/4) DO
GENE CXCR4.
NOTA: Gel de poliacrilamida 12% representando o perfil de digestão da enzima BstU1 no fragmento
de 184 pb (A) e 280 pb (B).
LEGENDA: 1,13,18. 100 bp; 2, 14. MCF-7 SEM DIGERIR; 3,15. MCF-7 APÓS DIGESTÃO; 4,16.
PMC-42 SEM DIGERIR; 5,17. PMC-42 APÓS DIGESTÃO; 6. 10 bp; 7,19. MDA-MB-436 SEM
DIGERIR; 8,20. MDA-MB-436 APÓS DIGESTÃO; 9,21. MDA-MB-435 SEM DIGERIR; 102,22. MDA-
MB-435 APÓS DIGESTÃO.
Por tal metodologia, pôde-se observar que a digestão somente ocorreu na
linhagem MDA-MB-435. Este resultado era esperado, pois, a partir do perfil de
metilação obtido pelo seqüenciamento foi constatado que os dinucleotídeos 1/2, 6/7,
13/14 e 18/19, que correspondem aos sítios de restrição CGCG desta enzima,
encontraram-se densamente metilados. O mesmo foi observado para o outro
fragmento, o que sugere a presença de metilação dos dinucleotídeos 8/9 e 14/15.
Este dado corrobora os resultados obtidos por RT-PCR, em que foi verificado
silenciamento do CXCR4, e também os dados de sequenciamento.
Para as linhagens MCF-7, PMC-42 e MDA-MB-436 não foi constatada a
digestão nos dois fragmentos estudados. Conforme verificado por seqüenciamento,
no fragmento 1 os CpGs presentes no sítio de restrição da BstU1 estiveram
predominantemente desmetilados na PMC-42 e MCF-7 e totalmente desmetilados
na MDA-MB-436. Da mesma forma, a análise da digestão do outro fragmento
também sugere a presença de níveis reduzidos ou a ausência de metilação dos
dinucleotídeos CGs presentes no sítio de restrição da enzima. Estes dados
corroboram os resultados obtidos por RT-PCR, em que se verificou superexpressão
do CXCR4 nestas linhagens.
O perfil de metilação do promotor do gene CXCR4 também foi estudado por
Sato et al., em 2005. Eles verificaram por COBRA com a enzima BsmI, a qual
62
reconhece o sítio 5’ GAATG↓C 3’, que um fragmento da ilha de CpG-1 também se
apresentava metilado em algumas linhagens tumorais de pâncreas (em nove das 20
linhagens consideradas). E, ainda avaliaram o perfil de metilação do gene CXCR4
através da mesma técnica, em linhagens de câncer de mama. Estes constataram
que dez das 21 linhagens apresentaram metilação, dentre elas, a MDA-MB-435.
Estes dados são consistentes com o resultado obtido em nosso experimento e
mostram que a linhagem MDA-MB-435 tem o promotor do gene CXCR4 metilado.
4.4 ANÁLISE DA METILAÇÃO EM AMOSTRAS DE TUMORES PRIMÁRIOS
Após a análise de seqüenciamento dos DNAs das linhagens tumorais de
mama foi possível escolher os dinucleotídeos do fragmento de 184 pb da ilha de
CpG-2 do gene CXCR4, que seriam importantes para a regulação da expressão do
gene CXCR4. Assim, os iniciadores desenhados para as reações de MSP
englobaram os dinucleotídeos 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Apesar desses
dinucleotídeos não serem totalmente metilados ou não metilados, foi a melhor região
encontrada para desenhar os iniciadores.
Para verificar se o padrão de metilação obtido para linhagens tumorais de
mama também era detectado em amostras de tumores primários de mama foram
feitas reações de MSP. Para isso, efetuou-se a extração dos DNAs dos tumores pelo
método do fenol-clorofórmio (item 3.4.2.2) (alguns deles já haviam sido extraídos
pelo grupo do departamento de Genética) e, em seguida, foi feito o tratamento com
bissulfito de sódio (item 3.4.3) (FIGURA 10).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
± 200 ng
FIGURA 10 – AMOSTRAS DE DNAs EXTRAÍDOS DOS TUMORES PRIMÁRIOS
DE MAMA.
NOTA: Gel de agarose 1% mostrando o perfil de extração dos DNAs tumorais.
LEGENDA: 1. DNA MASS LADDER; 2-9. Amostras de DNA de tumores primários.
63
A figura 10 mostra o aspecto de alguns DNAs tumorais extraídos. Percebe-
se que quase todas as amostras têm um arrastado abaixo da banda, indicando que
os DNAs estavam um pouco degradados, ou seja, os DNAs apresentavam quebras
em pontos múltiplos. A perda integridade do DNA se deve à conservação
inadequada das peças tumorais. Apesar desta degradação foi possível analisar a
metilação dos tumores pela técnica de MSP. Observa-se ainda neste gel, uma
banda formada acima do arrastado que indica a existência de DNA genômico íntegro
nas amostras.
A eficiência do tratamento com bissulfito de sódio foi comprovada após
reação de nested PCR com o gene SATR1 (FIGURA 11).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
690 pb
FIGURA 11 – NESTED PCR DO GENE SATR1 COM OS DNAs TUMORAIS.
NOTA: Gel de poliacrilamida 8% mostrando a eficiência do tratamento com bissulfito de sódio.
LEGENDA: 1. 100 bp; 2. NO (controle interno da reação, sem DNA tumotal); 3-10. Padrão de
amplificação do gene SATR1 em diferentes amostras tumorais.
Os DNAs tumorais tratados com bissulfito de sódio que obtiveram eficácia no
tratamento foram utilizados nas reações de MSP (item 3.4.7.1). Inicialmente foi
efetuada a padronização das reações para a situação metilada (M) (FIGURA 12A) e
não metilada (U) (FIGURA 12B) com as linhagens tumorais da mama.
A
B
99 bp
110 bp
7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6
FIGURA 12 - PADRONIZAÇÃO DA REAÇÃO METILADA (A) E NÃO METILADA
(B) COM AS LINHAGENS TUMORAIS DE MAMA.
NOTA: Gel de poliacrilamida 8% representando a padronização das reações de MSP.
LEGENDA: 1. 100 bp; 2. NO M (controle interno da reação – sem DNA); 3. MCF-7 M; 4. PMC-42 M;
5. MDA-MB-436 M; 6. MDA-MB-435 M; 7. 100 bp; 8. NO U (controle interno da reação – sem DNA); 9.
MCF-7 U; 10. PMC-42 U; 11. MDA-MB-436 U; 12. MDA-MB-435 U.
Foi possível observar que os resultados obtidos estão de acordo com os
resultados do seqüenciamento. Nas linhagens MCF-7, PMC-42 e MDA-MB-436
constatou-se a amplificação do fragmento de 110 pb referente à situação não
metilada, enquanto que para a linhagem MDA-MB-435 observou-se a amplificação
64
do fragmento de 99 pb referente à situação metilada. Como as linhagens MCF-7,
PMC-42 e MDA-MB-436 possuem alguns dinucleotídeos metilados e, em função da
alta sensibilidade desta técnica, também foi verifiada a amplificação do fragmento
referente à situação metilada. Devido a este resultado, em todas as reações foi
utilizado, além do controle interno da reação (no), um controle negativo
(MDA-MB-436); quando neste controle amplificava a banda referente à condição
metilada a reação era repetida e, se novamente fosse verificada amplificação no
controle negativo, a análise era feita a partir da comparação entre a intensidade das
bandas do controle negativo com as demais amostras. A amostra era considerada
positiva quando apresentava intensidade maior que o controle negativo.
Após padronizar as reações metilada e não metilada determinou-se a
sensibilidade da técnica através de diluições seriadas (1:0, 1:10, 1:100, 1:1000,
1:10000). Para a condição metilada, foi utilizado o DNA da linhagem tumoral
MDA-MB-435, que apresentava os dinucleotídeos predominatemente metilados e,
para a reação não metilada, foi empregado o DNA da MDA-MB-436, que apresentou
CpGs predominantemente desmetilados. A sensibilidade obtida para as condições U
e M segue exposta na figura 13.
1 2 3 4 5 6 7 8
A
110 pb
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9
99 pb
B
FIGURA 13 - AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE MSP REAÇÃO
U (A) E M (B) DO GENE CXCR4.
NOTA: Géis de poliacrilamida 8% mostrando as diluições utilizadas para detectar a sensibilidade
deste teste.
LEGENDA: (A) 1. 100 bp; 2. NO U (controle interno da reação – sem DNA); 3. AMOSTRA MDA-MB-
435 (controle negativo); 4. MDA-MB-436 SEM DILUIÇÃO; 5. MDA-MB-436 DILUIÇÃO 1:10; 6. MDA-
MB-436 DILUIÇÃO 1:100; 7. MDA-MB-436 DILUIÇÃO 1:1000; 8. MDA-MB-436 DILUIÇÃO 1:10.000.
(B) 1. 100 bp; 2. NO M (controle interno da reação – sem DNA); 3. AMOSTRA MDA-MB-436 (controle
negativo); 4. MDA-MB-435 SEM DILUIÇÃO; 5. MDA-MB-435 DILUIÇÃO 1:10; 6. MDA-MB-435
DILUIÇÃO 1:100; 7. MDA-MB-435 DILUIÇÃO 1:1000; 8. MDA-MB-435 DILUIÇÃO 1:10.000; 9. MDA-
MB-435 DILUIÇÃO 1:100.000.
65
Herman et al. (1996), ao descrever a técnica de MSP, relatou uma
sensibilidade de 0,1%, ou seja, seu método foi capaz de detectar até 1 alelo
metilado em meio a 1000 alelos não metilados. Nós também atingimos esta
sensibilidade para a reação não metilada. No entanto, a reação metilada foi ainda 10
vezes mais sensível.
Em seguida, efetuou-se a análise da metilação dos DNAs tumorais. Para
representar o tecido mais próximo do normal de mama foram utilizadas três
amostras de fibroadenomas. Estas amostras apresentaram-se desmetiladas, pois
apenas a reação não metilada foi positiva (FIGURA 14). As reações para a situação
metilada foram negativas e não estão expostas.
1 2 3 4 5
110 bp
FIGURA 14 – REAÇÕES DE MSP PARA A SITUAÇÃO NÃO METILADA COM
AMOSTRAS DE FIBROADENOMAS.
NOTA: Gel de poliacrilamida 8% representando o perfil de metilação em amostras de fibroadenomas.
LEGENDA: 1. 100 bp; 2. NO (controle interno da reação – sem DNA); 3-5. Amostras de
fibroadenomas.
A presença do amplicon de 110 pb correspondente à reação não metilada
em todas as amostras se deve ao fato de que lesões pré-malignas podem expressar
o gene CXCR4 (SCHIMID et al., 2004). Além disso, células normais (removidas junto
com o tumor, uma vez que não foi feita microdissecção) também podem expressar
tal gene, mesmo que em níveis reduzidos.
Em seguida, efetuaram-se reações de MSP com as amostras de tumores
primários de mama. Em todas as 76 amostras constatou-se positividade para a
reção não metilada e 26 destas também foram positivas para a reação metilada.
Nas figuras abaixo estão expostos os géis de alguns tumores primários em
que se pode visualizar a banda de 110 pb referente à condição metilada em todas as
amostras (15A) e, em algumas amostras, pode-se constatar também a banda de
99 pb referente à situação metilada (15B).
66
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
B
110 bp
99 bp
FIGURA 15 - REAÇÃO DE MSP COM AMOSTRAS DE TUMORES PRIMÁRIOS DE
MAMA.
NOTA: Gel de poliacrilamida 8% mostrando o produto da reação de MSP para a situação não
metilada (A) e metilada (B).
LEGENDA: (A) 1. 100 bp; 2. NO U(controle interno da reação – sem DNA); 3. MDA-MB-435 (controle
negativo); 4-10. tumores primários não metilados. (B) 1. 100 bp; 2. NO M (controle interno da reação
– sem DNA); 3. MDA-MB-436 (controle negativo); 4,7,10. tumores primários metilados.
O fato do CXCR4 estar predominantemente expresso (seja ao nível de
proteína ou de transcrito) nas células tumorais justifica a positividade para a reação
não metilada observada em todos os tumores. Ou seja, esse resultado já era
esperado porque esse é o padrão de expressão do receptor CXCR4 no câncer de
uma forma geral.
Vários estudos têm demonstrado que o CXCR4 ativo é capaz de
desencadear a proliferação, sobrevivência, migração, dentre outros efeitos
biológicos que contribuem para a agressividade tumoral (GANJU et al., 1998;
MAJKA et al., 2000; SORIANO et al., 2002; LEE et al., 2004; PENG et al., 2005).
Além disso, este receptor parece ser fundamental para o desenvolvimento
metastático para órgãos onde a proteína CXCL12 está expressa. No câncer de
próstata, por exemplo, foi verificada a migração de células tumorais que expressam
a proteína CXCR4 a órgãos, como a medula óssea, que expressam seu ligante
(TAICHMAN, 2002 apud ZLOTNIK, 2004). No câncer de mama também se justifica a
metástase à órgãos-distantes, como linfonodos, medula e pulmão, em função da
expressão localizada deste par (MULLER et al., 2001).
Embora a proteína CXCR4 desencadeie estes efeitos biológicos que
favorecem o desenvolvimento do tumor, foi observado no nosso trabalho que cerca
de 36% dos tumores analisados foram positivos para a reação metilada,
corroborando outros dados da literatura. Em carcinomas primários de pâncreas
verificou-se que a metilação do CXCR4 ocorreu em 46% dos tumores, e, em
67
melanomas, a metilação aberrante deste gene foi detectada em aproximadamente
73% das linhagens (SATO et al., 2005; MORI et al., 2005).
Um dos fatores de risco bastante importante para o desenvolvimento de
câncer é a metilação aberrante em função da idade. A incidência de neoplasias
aumenta drasticamente com a idade. No câncer de mama, antes dos 25 anos o
número de casos novos é pequeno (menos de 10 casos por 100 mil mulheres), mas
aumenta em 100 vezes após os 45 anos (HULKA; MOORMAN, 2001). No nosso
trabalho foi detectado que, entre as 26 amostras positivas para a reação metilada,
23 mulheres (88%) têm idade superior a 45 anos. A metilação relacionada à idade
também foi observada na mucosa colorretal. Os genes MyoD (fator de transcrição
que regula a diferenciação de células da linhagem miogênica) e N33 (candidato à
gene supressor de tumor) começam a ser metilados na mucosa normal,
especialmente em indivíduos com mais de 60 anos, e se tornam hipermetilados no
câncer colorretal (AHUJA et al., 1998). A metilação no câncer de mama também
pode ser devido à elevada expressão das DNMTs. Girault et al. (2003) mostraram a
expressão moderada das DNMT1 e DNMT3a em algumas células tumorais e a
superexpressão da DNMT3b em 39 das 130 amostras (30%) de tumor de mama.
Apesar da metilação afetar tipicamente genes supressores de tumor, tem
sido constatada a inativação de outros oncogenes no câncer de mama e em outros
tumores. Os proto-oncogenes Her-1 (receptor para o fator de crescimento epidermal
1), COX2 (ciclooxigenase 2) e hTRT (subunidade catalítica da transcriptase reversa
da telomerase) também apresentam regulação da expressão pela metilação do
DNA. O Her-1 encontra-se hipermetilado em linhagens tumorais de mama (CAMA1,
MDA-MB-453 e MDA-MB-435), de osteossarcoma (SAOS-2), de glioma (SF-539), e,
em tumores sólidos primários de mama, pulmão, cabeça e pescoço e colorretal. A
alta densidade de metilação do gene COX2, foi verificada em linhagens de próstata,
mama, cólon, estômago, leucemia mielóide aguda, e, em amostras de tumor
colorretal primário, e de mama. E, por fim, foi verificado em fibroblastos (SUSM-1)
que o promotor do gene hTRT que codifica a subunidade catalítica da telomerase
também se apresenta altamente metilado (DEVEREUX et al., 1999; TOYOTA et al.,
2000; SONG et al., 2001; MA et al., 2003; MONTERO et al., 2006).
A importância da metilação dos oncogenes no câncer ainda é pouco
compreendida. A inativação destes genes provavelmente deve conferir uma
desvantagem seletiva para a célula tumoral, comprometendo a sobrevivência desta
68
célula e afetando negativamente a carcinogênese (DEVEREUX et al., 1999;
TOYOTA et al., 2000; SONG et al., 2001; MONTERO et al., 2006).
Muller et al. (2001) mostraram que em células mamárias normais o gene
CXCR4 não é expresso ou é expresso em níveis basais. De fato, em outros tumores
isso também foi confirmado. Singh et al. (2004) observaram que o transcrito e a
proteína CXCR4 tiveram uma expressão significativamente maior em linhagens
celulares de câncer de próstata (PC3 e LNCaP) do que em células epiteliais de
próstata normal (PrEC). O mesmo foi verificado por Meier et al. (2007), que
detectaram em linhagens de neuroblastoma invasivas (IGR-N91, SH-SY5Y)
elevados níveis de expressão de CXCR4, enquanto a célula IGR-NB8 não invasiva
expressou níveis muito reduzidos deste receptor.
Esses dados podem sugerir que, em princípio, existem nas células normais
mecanismos, inclusive a metilação do DNA, que reduzem a expressão do CXCR4 e,
com a progressão do câncer ocorre a desmetilação deste gene em certas células
tumorais favorecendo-a seletivamente. No entanto, apesar de nem todas as células
tumorais expressarem este receptor, o câncer pode ainda se desenvolver porque
outras moléculas podem, através de uma reação cruzada, ativar as vias de
sinalização desencadeadas pelo par CXCR4-CXCL12. Este é o caso da
oncoproteína BCR/ABL, que á capaz de ativar as vias PI-3K bem como a via RAS-
MAPK em células hematopoiéticas transformadas (PTASZNIK et al., 2002). Além
disso, muitos tumores expressam outros receptores de quimiocinas, os quais podem
suprir a sinalização mediada pelo CXCR4. Em melanoma as células tumorais
CXCR4+ podem também expressar os receptores CCR7 e CCR10, os quais estão
envolvidos com a ocorrência de metástase aos principais sítios deste tipo de câncer:
os linfonodos e a pele (MURAKAMI; CARDONES; HWANG, 2004).
4.4.1 Análise estatística dos dados clínico-patológicos correlacionados com a
metilação da região promotora do gene CXCR4
Neste estudo foram analisadas 76 amostras de tumores de mama. Os dados
clínicos das pacientes e os resultados de MSP do gene CXCR4 estão expostas no
quadro do item ANEXO 5.
Na tabela 1, abaixo, estão expostos os dados da análise estatística e a
correlação entre a metilação e as variáveis clínicas. Do total de amostras tumorais,
69
14 (20,0%) foram diagnosticadas como estadio 0/1, 33 (47,1%) como estadio II, 13
(18,6%) como estadio III e 10 (14,3%) como estadio IV, sendo que 3 amostras não
foram classificadas para esta variável. O tamanho do tumor foi avaliado em 73
amostras, das quais 20 (27,4%) foram classificadas como T1 (tumor menor ou igual
a 2 cm), 38 (52,1%) foram classificadas como T2 (tumor maior que 2 cm e menor ou
igual a 5 cm), 8 foram classificadas como T3 (tumor maior que 5 cm) e 7 foram
classificadas como T4 (tumor de qualquer tamanho com extensão para parede
torácica e/ou edema, ou ulceração da pele, ou carcinoma inflamatório). O
comprometimento linfonodal foi avaliado em 71 amostras, dentre as quais 37
(52,1%) apresentaram linfonodos comprometidos. Além disso, foi verificado que 11
(16,4%) de 67 pacientes apresentaram metástases à distância com óbito. As
recidivas locais foram avaliadas em 69 amostras, aparecendo em 6 (8,7%)
pacientes. Quanto à expressão de receptores hormonais, 58 (82,9%) das 70
amostras foram RE+, enquanto, do total de 61 amostras, 46 (75,4%) foram RP+. A
expressão de ERBB2 foi detectada em 22 (33,8%) das 65 amostras. Por fim, a
última variável considerada foi o tipo de tumor. A maioria das mostras era de
carcinoma ductal invasivo (70,8%).
A freqüência de metilação nas amostras analisadas foi de 26 (35,6%) em 73.
Esta freqüência não variou significativamente entre os diferentes estadios (0/I=
21,4%, II= 36,4%, III/IV= 39,1%). Um leve aumento da freqüência de metilação foi
observado em tumores T3 e T4, quando comparado aos tumores de tamanhos
menores, porém essa diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,273). As
freqüências de metilação obtidas para os tamanhos T1 e T2 foram 30,0% e 31,6%,
respectivamente, enquanto que, para tumores T3/4 foi observada uma freqüência de
metilação igual a 53,3%. Outras variáveis que apresentaram freqüência de metilação
ligeiramente aumentada foram a expressão de RE, RP e ocorrência de metástase e
óbito. As amostras RE+, RP+ e metástase/óbito+ apresentaram, respectivamente,
uma freqüência de metilação igual a 39,7%, 39,1%, 45,5%. Quanto ao tipo de tumor,
constatou-se uma freqüência de metilação igual a 41,2% nas amostras de carcinoma
ductal invasivo, e igual a 23,8% nas amostras de carcinoma lobular invasivo.
Também não foi constatada diferença com valor estatístico quanto ao perfil de
metilação do fragmento da ilha-2 analisado e as variáveis: expressão de RE, RP,
ocorrência de metástase/óbito e tipo de tumor (p=0,514; p=0,539; p=0,505; p=0,189,
respectivamente).
70
Além disso, não foram observadas em nossas amostras correlações
estatisticamente significativas entre a metilação do fragmento da ilha de CpG-2 do
gene CXCR4 e o grau de diferenciação histológico (SBR) (p=0,267), o
comprometimento de linfonodos (p=0,793), a expressão do fator de crescimento
ERBB2 (p=0,838) e a ocorrência de recidiva (p=1,000). A freqüência de metilação
para todas estas variáveis ficou em torno de 27 a 47%.
TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO CATEGÓRICA DOS DADOS CLÍNICOS DAS
PACIENTES ANALISADAS E A FREQÜÊNCIA DE METILAÇÃO
NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE CXCR4 AVALIADAS PELO
TESTE DO QUI-QUADRADO OU TESTE EXATO DE FISCHER.
METILAÇÃO
VARIÁVEL
PACIENTES
NÚMERO (%)
SIM (%) NÃO (%)
p
Estádio
0/I 14 (20,0) 3 (21,4) 11 (78,6)
II 33 (47,1) 12 (36,4) 21 (63,6)
III/IV 23 (32,9) 9 (39,1) 14 (60,9)
0,514
Tamanho do tumor
pT1/pTis 20 (27,4) 6 (30,0) 14 (70,0)
pT2 38 (52,1) 12 (31,6) 26 (68,4)
pT3/pT4 15 (20,5) 8 (53,3) 7 (46,7)
0,273
SBR
I 19 (27,1) 9 (47,4) 10 (52,6)
II 33 (47,1) 9 (27,3) 24 (72,7)
III 18 (25,7) 8 (44,4) 10 (55,6)
0,267
Comprometimento de linfonodo
Negativo 34 (47,9) 13 (38,2) 21 (61,8)
Positivo 37 (52,1) 12 (32,4) 25 (67,6)
0,793
Receptor de Estrógeno (ER)
Negativo 12 (17,1) 3 (25,0) 9 (75,0)
Positivo 58 (82,9) 23 (39,7) 35 (60,3)
0,514
ERBB2
Negativo 43 (66,2) 16 (37,2) 27 (62,8)
Positivo 22 (33,8) 8 (36,4) 14 (63,6)
0,838
71
METILAÇÃO
VARIÁVEL
PACIENTES
NÚMERO (%)
SIM (%) NÃO (%)
p
Receptor de progesterona (PR)
Negativo 15 (24,6) 4 (26,7) 11 (73,3)
Positivo 46 (75,4) 18 (39,1) 28 (60,9)
0,539
Metástase/óbito
Negativo 56 (83,6) 19 (33,9) 37 (66,1)
Positivo 11 (16,4) 5 (45,5) 6 (54,5)
0,505
Recidiva
Negativo 63 (91,3) 23 (36,5) 40 (63,5)
Positivo 6 (8,7) 2 (33,3) 4 (66,7)
1,000
Tipo de tumor
Carcinoma Ductal Invasivo 51 (70,8) 21 (41,2) 30 (58,8)
Carcinoma Lobular Invasivo 21 (29,2) 5 (23,8) 16 (76,2)
0,189
Apesar de não ter sido encontrada nenhuma diferença com valor estatístico
entre o perfil metilado e não metilado do gene CXCR4 com relação às diferentes
características clínico-patológicas citadas na tabela 4, observou-se que, grande
parte das 26 amostras positivas para a reação metilada estavam associadas a
tumores de melhor prognóstico: 88% dos casos eram RE+, 81% eram RP+, 67%
eram ERBB2-. Além disso, a metilação também esteve associada com a maioria dos
casos sem recidiva (92%), sem ocorrência de metástase (76%) e de óbito (79%).
Dentre os casos CXCR4-M+, 46% foram RE+, RP+ e ERBB2- e 38% foram RE+,
RP+, ERBB2- e metástase-.
Assim como o perfil de metilação (metilado e não metilado), a expressão do
receptor CXCR4 também não parece ter correlação com muitas características
clínico-patológicas. No entanto, a partir dos resultados citados no parágrafo anterior,
pode-se sugerir uma relação entre a presença de metilação e tumores de melhor
prognóstico.
A grande maioria dos trabalhos que estuda a relação entre a elevada
expressão do gene CXCR4 com características clínico-patológicas dos mais
diversos tipos de câncer não obteve correlação estatisticamente significativa com a
72
maioria dos dados clínicos. E, em geral, nestes trabalhos a técnica utilizada para
avaliar a expressão deste receptor foi a imunohistoquímica.
Andre et al. (2006) não encontraram correlação entre a expressão da
proteína CXCR4 e a expressão de ERBB2 e RE, idade, grau e tamanho do tumor,
número de linfonodos envolvidos, tempo de sobrevida geral e tempo de vida livre da
doença em tumores de mama. Além destes parâmetros, Kato et al. (2003), Kang et
al. (2005), Su et al. (2006), Holm et al. (2007) e Woo et al. (2008) também não
constataram relação com o status de menopausa (pré- ou pós-menopausa), tipo e
grau histológico, invasão linfovascular, expressão de RP e estadio tumoral.
Alguns poucos trabalhos descritos na literatura encontram correlação entre a
expressão do CXCR4 e a ocorrência de metástase. Mas, este dado é ainda muito
contraditório, visto que em outras pesquisas essa relação não é encontrada.
Por exemplo, embora André et al. (2006) tenham constatado que a
expressão do CXCR4 se relacionou significativamente com a ocorrência de
metástase ao fígado, isso não foi confirmado no trabalho de Sue e colaboradores
(2006), pois, este grupo não encontrou corrrelação com metástases distantes. Woo
et al. (2008), por outro lado, detectaram uma associação significativa entre a elevada
expressão nuclear do CXCR4 com a ocorrência de metástase à linfonodos, e,
segundo este trabalho, tumores CXCR4+/L+ estiveram associadas (de forma
estatisticamente significativa) com a negatividade do RE e do RP. Kato et al. (2003)
e Holm et al. (2007), por sua vez, não observaram correlação estatisticamente
significativa entre a expressão do CXCR4 e a ocorrência de metástases à linfonodos
ou distantes. Mas, eles observaram que tumores tipo focal (tumores com marcação
heterogênea para a proteína CXCR4, possuindo desde células de carcinoma que
não expressavam o CXCR4 até células positivas segregadas em algumas áreas
focais) tinham maior potencial para metastatizar à linfonodos, pois apresentavam o
comprometimento de maior número de linfonodos do que os tumores tipo difuso
(caracterizados pela marcação homogênea com anticorpo anti-CXCR4). Kang et al.
(2005) não encontraram correlação com sobrevida geral e tempo de vida livre da
doença, mas demonstraram a associação entre elevados níveis de expressão da
proteína CXCR4 em tumores linfonodo positivo, e, essa diferença atingiu relevância
estatística. Apesar da expressão do CXCR4 ser maior também entre os pacientes
com metástases à distância, não foi encontrada correlação estatisticamente
significativa com este fator.
73
A inexistência de correlação entre expressão do CXCR4 em tumores
metastáticos de linfonodos foi explicada por Shim et al. (2006). Eles observaram a
elevada expressão de membrana da proteína CXCR4 em tumores primários,
enquanto que, na maioria dos tumores secundários de linfonodos foi detectada a
expressão citoplasmática deste receptor. A redução da expressão de CXCR4 de
superfície celular pode ser justificada pela elevada expressão da proteína CXCL12
em linfonodos. Esta quimiocina estimula a internalização e posterior degradação do
CXCR4 em lisossomos. Além disso, foi constatada (com valor estatístico) que a
expressão do HIF-1α é maior em tumores primários que em amostras de tumores
metastáticos de linfonodos e, como comentado no início deste trabalho (item 1.3.1) o
HIF-1α aumenta a expressão do CXCR4 ao nível transcricional.
Embora o CXCR4 apareça geralmente correlacionado com a ocorrência de
metástase, sugerindo seu papel como potencial fator preditivo de metástase, outros
trabalhos mostraram que a expressão deste receptor não está restrita às formas
mais malignas e com um estadio mais avançado e agressivo do câncer de mama.
Schimid et al. (2004) demonstraram que a proteína CXCR4 também está expressa
em células pré-malignas (de hiperplasia ductal atípica) e estes sugerem que a
expressão do receptor CXCR4 pode conferir habilidade de resposta a eventuais
sinais quimiotáticos desencadeados pela proteína CXCL12, contribuindo para a
obtenção de um fenótipo invasivo e, portanto, mais agressivo.
Em outros tipos de tumores também foi verificado a inexistência de
correlação entre a expressão do CXCR4 e grande parte das características clínicas.
A superexpressão do gene CXCR4 em células de carcinoma renal, em
carcinoma de células escamosas de esôfago e em adenocarcinoma de esôfago não
teve correlação com o grau de diferenciação, estadio tumoral, idade, gênero,
localização do tumor e com as categorias TNM (STALLER et al., 2003; GOCKEL et
al.,2006). Por outro lado, Staller et al. (2003) observaram a associação
estatisticamente relevante entre a forte expressão do gene CXCR4 e menor
sobrevida global no câncer de rim. Embora não tenha alcançado diferença com
relevância estatística, em carcinoma de células escamosas foi verificado que
pacientes com forte expressão do CXCR4 tinham menor sobrevida após cirurgia do
que pacientes com fraca expressão. Também foi observado que tumores graus 3 e 4
estiveram associados à fraca expressão do CXCR4; enquanto os tumores graus 1 e
2 estiveram relacionados com a forte expressão do CXCR4 (GOCKEL et al.,2006).
74
Resumidamente, nossos dados mostram, pela primeira vez, que ocorre
regulação da expressão do gene CXCR4 em tumores primários de mama pelo
mecanismo de hipermetilação da região promotora do gene. A inativação do gene
associado a 35,6% das amostras pode estar relacionada a um bom prognóstico.
Entretanto, a confirmação dessa hipótese só poderá ser feita por análise de
sobrevida global e sobrevida livre de doença. No momento, no banco de tumores
não estão disponíveis os dados para se efetuar esta análise.
75
5 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados deste estudo podemos chegar às seguintes
conclusões:
• O gene CXCR4 apresenta-se superexpresso nas linhagens tumorais de mama
PMC-42, MCF-7 e MDA-MB-436 e está totalmente silenciado em apenas uma
linhagem analisada, MDA-MB-435;
• A hipermetilação da região promotora do gene CXCR4 promove o silenciamento
gênico ao nível de RNAm, na linhagem MDA-MB-435;
• Em todas as 76 amostras de tumores primários de mama foi verificada
positividade para a reação não metilada (U); e, em 26 amostras (cerca de 36%),
também foi constatada a positividade para a reação metilada (M);
• Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre a presença ou
ausência de metilação da região promotora do gene CXCR4 com as variáveis
clínico-patológicas: grau tumoral (SBR), estadio clínico (TNM), tamanho do tumor,
presença de RE, RP e ERBB2, acometimento de linfonodos, metástase e recidiva e
tipo de tumor;
• A presença de metilação do gene CXCR4 pode estar associada a tumores de
melhor prognóstico. Dentre os 26 casos positivos para a reação metilada, 88% eram
RE+, 81% eram RP+, 67% eram ERBB2-. Além disso, a metilação também esteve
associada com a maioria dos casos sem recidiva (92%), sem ocorrência de
metástase (76%) e de óbito (79%).
76
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACKLAND, M. L.; MICHALCZYK, A.; WHITEHEAD, R. H. PMC42, a novel model for
the differentiated human breast. Exp Cell Res., v. 263, n. 1, p. 14-22, fev. 2001.
AHUJA, N.; LI, Q.; MOHAN, A. L.; BAYLIN, S. B.; ISSA, J. P. J. Aging and DNA
Methylation in Colorectal Mucosa and Cancer. Cancer research, v. 58, p. 5489-
5494, dez. 1998.
ALBERT, P. R.; ROBILLARD, L. G protein specificity: traffic direction required. Cell
Signal, v. 14, p. 407-418, 2002.
ALLEN, S. J.; CROWN, S. E.; HANDEL, T. M. Chemokine: receptor structure,
interactions and antagonism. Annu. Rev. Immunol., v. 25, p. 787-820, 2007.
ANDRE F, CABIOGLU N, ASSI H, SABOURIN JC, DELALOGE S, SAHIN A,
BROGLIO K, SPANO JP, COMBADIERE C, BUCANA C, SORIA JC,
CRISTOFANILLI M. Expression of chemokine receptors predicts the site of
metastatic relapse in patients with axillary node positive primary breast cancer. Ann
Oncol., v. 17, n. 6, p. 945-951, jun. 2006.
ATCC - THE AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION. Disponível no site:
<http://www.atcc.org/>. Acesso em: 28/04/2008.
BAGGIOLINI, M. Chemokine and leukocyte traffic. Nature, v. 392, n. 6676, p. 565-
568, abr. 1998.
BAJETTO, A.; BARBIERI, F.; DORCARATTO, A.; BARBERO, S.; DAGA, A.;
PORCILE, C.; RAVETTI, J. L.; ZONA, G.; SPAZIANTE, R.; CORTE, G.; SCHETTINI,
G.; FLORIO, T. Expression of CXC chemokine receptors 1-5 and their ligands in
human glioma tissues: role of CXCR4 and SDF1 in glioma cell proliferation and
migration. Neurochem Int., v. 49, n. 5, p. 423-432, out. 2006.
BAJETTO, A.; BONAVIA, R.; BARBERO, S.; FLORIO, T.; SCHETTINI, G.
Chemokines and their receptors in the central nervous system. Frontiers in
Neuroendocrinology, v. 22, n.
3, p. 147-184, jul. 2001.
BALKWILL, F. Cancer and the chemokine network. Nature, v. 4, n. 7, p. 540-550, jul.
2004.
77
BAYLIN, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical
Pratice, v. 2, supl. 1, p. S4-S11, dez. 2005.
BAYLIN, S. B.; HÖPPENER, J. W.; DE BUSTROS, A.; STEENBERGH, P. H.; LIPS,
C. J.; NELKIN, B. D. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung
cancers and lymphomas. Cancer Res., v. 46, n. 6, p. 2917-2922, jun. 1986.
BEN-BARUCH, A. The multifaceted roles of chemokines in malignancy. Cancer
Metastasis Rev., v. 25, n. 3, p. 357-371, set. 2006.
BIRD, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development,
v. 16, n. 1, p. 6-21, jan. 2002.
BURGER, J. A.; KIPPS, T. J. CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor
cells and their microenvironment. Blood, v.107, n. 5, p.1761-1767, mar. 2006.
CABIOGLU, N.; YAZICI, M. S.; ARUN, B.; BROGLIO, K. R.; HORTOBAGYI, G. N.;
PRICE, J. E.; SAHIN, A. CCR7 and CXCR4 as novel biomarkers predicting axillary
lymph node metastasis in T1 breast cancer. Clin. Cancer Res., v. 11, n. 16, p.
5686-5693, ago. 2005.
CARUZ, A.; SAMSOM, M.; ALONSO, J. M.; ALCAMI, J.; BALEUX, F.; VIRELIZIER,
J. L.; PARMENTIER, M.; ARENZANA-SEISDEDOS, F. Genomic organization and
promoter characterization of human CXCR4 gene. FEBS Letters, v. 426, n. 2, p.
271-278, abr. 1998.
CHOMCZYNSKI, P.; SACCHI, N. The single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.
Nature Protocols, v. 1, n. 2, p. 581-585, 2006.
CLARKE, R.; SKAAR, T.; BAUMANN, K.; LEONESSA, F.; JAMES, M.; LIPPMAN, J.;
THOMPSON, E. W.; FRETER, C.; BRUNNER, N. Hormonal carcinogenesis in breast
cancer: cellular and molecular studies of malignant progression. Breast Cancer Res
Treat, v. 3, n. 2-3, p. 237-248, 1994.
COLOBRAN, R.; PUJOL_BORRELL, R.; ARMENGOL, M. P.; JUAN, M. The
chemokine network. I. How the genomic organization of chemokines contains clues
for deciphering their functional complexity. Clinical and Experimental Immunology,
v. 148, n. 2, p. 208-217, maio. 2007.
78
COSTA, F. F.; PAIXÃO, V. A.; CAVALHER, F. P.; RIBEIRO, K. B.; CUNHA, I. W.;
RINCK, J. A. JR.; O'HARE, M.; MACKAY, A.; SOARES, F. A.; BRENTANI, R. R.;
CAMARGO, A. A. SATR-1 hypomethylation is a common and early event in breast
cancer. Cancer Genet Cytogenet., v. 165, n. 2, p.135-143, mar. 2006.
COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROLLINS, S. L. Patologia Estrutural e Funcional. 5. ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan: 2000, p.643-644.
CpG PLOT. Disponível no site: <http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/>. Acesso em:
25/04/2006.
CRAZZOLARA, R.; KRECZY, A.; MANN, G.; HEITGER, A.; EIBL, G.; FINK, F. M.;
MÖHLE, R.; MEISTER, B. High expression of the chemokine receptor CXCR4
predicts extramedullary organ infiltration in childhood acute lymphoblastic leukaemia.
Br J Haematol., v. 115, n. 3, p. 545-553, dez. 2001.
DAS, P. M.; SINGAL, R. DNA methylation in cancer. Journal of Clinical Oncology,
v. 22, n. 22, p. 4632-4642, nov. 2004.
DEVEREUX, T. R.; HORIKAWA, I.; ANNA, C. H.; ANNAB, L. A.; AFSHARI, C. A.;
BARRETT, J. C. DNA methylation analysis of the promoter region of the human
telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. Cancer Res., v. 59, n. 24, p. 6087-
6090, dez. 1999.
DONTU G, ABDALLAH WM, FOLEY JM, JACKSON KW, CLARKE MF, KAWAMURA
MJ
, WICHA MS. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary
stem/progenitor cells.
Genes Dev., v. 17, n. 10, p. 1253-1270, maio 2003.
DUMITRESCU, R. G.; COTARLA, I. Understanding breast cancer risk- whre do we
stand in 2005? J. Cell. Mol. Med., v. 9, n. 1, p. 208-221, 2005.
DWINELL, M. B.; ECKMANN, L.; LEOPARD, J. D.; VARKI, N. M.; KAGNOFF, M. F.
Chemokine receptor expression by human intestinal epithelial cells.
Gastroenterology, v. 117, n. 2, p. 359-367, ago. 1999.
EBERHARTER, A.; BECKER, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive
and permissive chromatin. European Molecular Biology Organization, v. 3, n.3, p.
224-229, 2002.
79
EDDLESTON, J.; CHRISTIANSEN, S. C.; ZURAW, B. L. Functional expression of
the C-X-C chemokine receptor CXCR4 by human bronchial epithelial cells: regulation
by proinflammatory mediators. J Immunol., v. 169, n. 11, p. 6445-6451, dez. 2002.
ELLISON, G.; KLINOWSKA, T.; WESTWOOD, R. F.; DOCTER, E.; FRENCH, T.;
FOX, J. C. Further evidence to support the melanocytic origin of MDA-MB-435. Mol
Pathol., v. 55, n. 5, p. 294-299, out. 2002.
ENTREZ GENE. CXCR4 chemokine (C-X-C motif) receptor 4 [ Homo sapiens ].
Disponível no site: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retri
eve&dopt%20=Graphics&list_uids=7852>. Acesso em: 15/05/2006.
EMBL - EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY. Disponível no site:
<http://www.ebi.ac.uk/>. Acesso em: 15/04/2006.
FARIA, J. L. Patologia especial com complicações clínicas. 2. ed., Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
FAZZARI, M. J.; GREALLY, J. M. Epigenomics: beyond CpG islands. Nature, v. 5, n.
6, p. 446-445, jun. 2004.
FEINBERG, A. P.; TYCKO, B. The history of cancer epigenetics. Nature, v. 4, n. 2, p.
143-153, fev. 2004.
FEINBERG, A. P.; VOLGESTEIN, B. Hypomethylation distinguishes genes of some
human cancers from their normal counterparts. Nature, v. 301, p. 89-92, 1983.
FERNANDEZ, E. J.; LOLIS, E. Structure, function and inhibition of chemokines.
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., v. 42, p. 469–499, 2002.
FILHO, G. B. Bogliolo Patologia. 6. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
FURUYA, M.; SUYAMA, T.; USUI, H.; KASUYA, Y.; NISHIYAMA, M.; TANAKA, N.;
ISHIWATA, I.; NAGAI, Y.; SHOZU, M.; KIMURA, S. Up-regulation of CXC
chemokines and their receptors: implications for proinflammatory microenvironments
of ovarian carcinomas and endometriosis. Hum Pathol., v. 38, n. 11, p. 1676-1687,
nov. 2007.
80
FUTAHASHI, Y.; KOMANO, J.; URANO, E.; AOKI, T.; HAMATAKE, M.; MIYAUCHI,
K.; YOSHIDA, T.; KOYANAGI, Y.; MATSUDA, Z.; YAMAMOTO, N. Separate
elements are required for ligand-dependent and -independent internalization of
metastatic potentiator CXCR4. Cancer Sci., v. 98, n. 3, p. 373-379, mar. 2007.
GANJU, R.K.; BRUBAKER, S. A.; MEYER, J.; DUTT, P.; YANG, Y.; QIN, S.;
NEWMAN, W.; GROOPMAN, J. E. The alpha-chemokine, stromal cell-derived factor-
1alpha, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and
activates multiple signal transduction pathways. J Biol Chem., v. 273, n. 36, p.
23169-23175, set. 1998.
GARDINER-GARDEN, M.; FROMMER, M. CpG islands in vertebrate genomes. J.
Mol. Biol., v. 196, n. 2, p. 261-282, 1987.
GIRAULT, I.; TOZLU, S.; LIDEREAU, R.; BIÈCHE, I. Expression Analysis of DNA
Methyltransferases 1, 3A, and 3B in Sporadic Breast Carcinomas. Clinical Cancer
Research, v. 9, p. 4415-4422, out. 2003.
GOCKEL, I.; SCHIMANSKI, C. C.; HEINRICH, C.; WEHLER, T.; FRERICHS, K.;
DRESCHER, D.; VON LANGSDORFF, C.; DOMEYER, M.; BIESTERFELD, S.;
GALLE, P. R.; JUNGINGER, T.; MOEHLER, M. Expression of chemokine receptor
CXCR4 in esophageal squamous cell and adenocarcinoma. BMC Cancer, v. 6, dez.
2006.
GODINHO, E. R.; KOCH, H. A. Rastreamento do câncer de mama: aspectos
relacionados ao médico. Radiologia Brasileira, v. 37, n. 2, p. 91-99, 2004.
GRUVBERGER, S.; RINGNÉR, M.; CHEN, Y.; PANAVALLY, S.; SAAL, L. H.; BORG,
A.; FERNÖ, M.; PETERSON, C.; MELTZER, P. S. Estrogen receptor status in breast
cancer is associated with remarkably distinct gene expression patterns. Cancer
Research, v. 61, n. 16, p. 5979-5984, ago. 2001.
HELLEBREKERS, D. M. E. I.; GRIFFIOEN, A. W.; ENGELAND, M. V. Dual targeting
of epigenetic therapy in cancer. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1775, n. 1, p.
76-91, jan. 2007.
HENRY, N. L.; HAYES, D. F. Uses and abuses of tumor markers in the diagnosis,
monitoring, and treatment of primary and metastatic breast cancer. The oncologist,
v. 11, n. 6, p. 541-552, jun. 2006.
81
HERMAN, J. G.; GRAFF, J. R.; MYÖHÄNEN, S.; NELKIN, B. D.; BAYLIN, S. B.
Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.
Proc Natl Acad Sci U S A, v. 93, n. 18, p. 9821-9826, set. 1996.
HODA, R. S.; CHIU, A.; HODA, S. A. Microinvasive Carcinoma of Breast
A Commonly Misdiagnosed Entity. Arch Pathol Lab Med, v. 125, set. 2001.
HOLLAND, J. D.; KOCHETKOVA, M.; AKEKAWATCHAI, C.; DOTTORE, M.; LOPEZ,
A.; MCCOLL, S. R. Differential functional activation of chemokine receptor CXCR4 is
mediated by G proteins in breast cancer cells. Cancer Res., v. 66, n. 8, p. 4117-
4124, abr. 2006.
HOLM, N. T.; BYRNES, K.; LI, B. D.; TURNAGE, R. H.; ABREO, F.; MATHIS, J. M.;
CHU, Q. D.
Elevated levels of chemokine receptor CXCR4 in HER-2 negative breast
cancer specimens predict recurrence. J Surg Res., v. 141, n. 1, p. 53-59, jul. 2007.
HOSPITAL DO CÂNCER AC CAMARGO. Disponível no site: <http://www.hcanc.org.
br/>. Acesso em: 07/12/2008.
HULKA, B. S.; MOORMAN, P. G. Breast cancer: hormones and other risk factors.
Maturitas, v. 38, p. 103-113, 1993.
HUMAN BLAT SEARCH. Disponível no site: <http://genome.ucsc.edu>. Acesso em:
16/05/2006.
IKEDA, K and INOUE S. Estrogen receptors and their downstream targets in cancer.
Archi. Histol. Cytol., v. 67, n. 5, p. 435-442, dez. 2004.
INCA. BRASIL, Ministério da Saúde. Estimativas 2008: Incidência de Câncer no
Brasil. Rio de Janeiro: INCA, 2007.
INCA. BRASIL, Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto
Nacional do Câncer. Câncer. Disponível no site: <http://www.inca.gov.br>. Acesso
em: 04/11/2004.
ISSA, J. P. CpG island methylator phenotype in cancer. Nature, v. 4, n. 12, p. 988-
993, dez. 2004.
82
JAENISCH, R.; BIRD, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome
integrates intrinsic and environmental signals. Nature, v. 33, p. 245-254, mar. 2003.
JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, HAO Y, XU J, MURRAY T, THUN MJ. Cancer
Statistics, 2008. CA Cancer J Clin, v. 58, n. 2, p. 71-96, 2008.
JERÓNIMO, C.; USADEL, H.; HERIQUE, R.; OLIVEIRA, J.; LOPES, C.; NELSON,
W.G.; SIDRANSKY, D. Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic
tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma. J. Natl. Cancer Inst., v. 93, p.
1747-1752, 2001.
JIANG, Y. P.; WU, X. H.; XING, H. Y.; DU, X.Y. Role of CXCL12 in metastasis of
human ovarian cancer. Chinese Medical Journal, v. 120, n. 14, p. 1251-12555, jul.
2007.
JONES, P. A.; BAYLIN, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer.
Nature, v. 3, n. 6, p. 415-428, jun. 2002.
JORDAN, N. J.; KOLIOS, G.; ABBOT, S. E.; SINAI, M. A.; THOMPSON, D. A.;
PETRAKI, K.; WESTWICK, J. Expression of functional CXCR4 chemokine receptors
on human colonic epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation, v. 104, n.
8, p. 1061-1069, out. 1999.
KANG, H.; WATKINS, G.; DOUGLAS-JONES, A.; MANSEL, R. E.; JIANG, W. G. The
elevated level of CXCR4 is correlated with nodal metastasis of human breast cancer.
Breast, v. 14, n. 5, p. 360-367, out. 2005.
KATO, M.; KITAYAMA, J.; KAZAMA, S.; NAGAWA, H. Expression pattern of CXC
chemokine receptor-4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive
ductal carcinoma.
Breast Cancer Res., v. 5, n. 5, p. R1440-R1450, 2003.
KNUDSON, A. G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Natl
Acad Sci U S A, v. 68, n. 4, p. 820-823, abr. 1971.
KOPELOVICH, L.; CROWELL, J. A.; FAY, J. R. The epigenome as a target for
cancer chemoprevention. Journal of the National Cancer Institute, v. 95, n. 23, p.
1747-1757, dez. 2003.
COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Patologia Estrutural e Funcional. 6. ed.,
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
83
KUBAREK, L.; JAGODZINSKI, P. P. Epigenetic up-regulation of CXCR4 and
CXCL12 expression by 17β-estradiol and tamoxifem is associated with formation of
DNA methyltransferase 3B4 splice variant in Ishikawa endometrial adenocarcinoma
cells. FEBS Letters, v. 581, n. 7, p. 1441-1448, abr. 2007.
KUKREJA, P.; ABDEL-MAGEED, A. B.; MONDAL, D.; LIU, K.; AGRAWAL, K. C. Up-
regulation of CXCR4 expression in PC-3 cells by stromal-derived factor-1alpha
(CXCL12) increases endothelial adhesion and transendothelial migration: role of
MEK/ERK signaling pathway-dependent NF-kappaB activation. Cancer Res., v. 65,
n. 21, p. 9891-988, nov. 2005.
KULBE, H.; LEVINSON, N. R.; BALKWILL, F.; WILSON, J. L. The chemokine
network in cancer – much more than directing cell movement. Int. J. Dev. Biol., v.
48, n. 5-6, p. 489-496, 2004.
LAIRD, P. W. Cancer epigenetics. Human Molecular Genetics, v. 14, n. 1, R65-
R76, 2005.
LAURENCE, A. D. J. Location, movement and survival: the role of chemokines in
haematopoiesis and malignancy. British Journal of Haematology, v. 132, n. 3, p.
255-267, fev. 2005.
LAVI, E.; STRIZKI, J. M.; ULRICH, A. M.; ZHANG, W.; FU, L.; WANG, Q.;
O'CONNOR, M.; HOXIE, J. A.; GONZÁLEZ-SCARANO, F. CXCR-4 (Fusin), a co-
receptor for the type 1 human immunodeficiency virus (HIV-1), is expressed in the
human brain in a variety of cell types, including microglia and neurons. Am J Pathol.,
v. 151, n. 4, p. 1035-1042, out. 1997.
LEADER, J. E.; WANG, C.; FU, M.; PESTELL, R. G. Epigenetic regulation of nuclear
steroid receptors. Biochemical Pharmacology, v. 72, n. 11, p.1589-1596, nov.
2006.
LEE, B. C.; LEE, T. H.; AVRAHAM, S.; AVRAHAM, H. K. Involvement of the
chemokine receptor CXCR4 and its ligand stromal cell-derived factor 1α in breast
cancer cell migration through human brain microvascular endothelial cells. Mol.
Cancer Res., v. 2, n. 6, p. 327-338, jun. 2004.
LIU, Z. J.; ZHANG, X. B.; ZHANG, Y.; YANG, X. Progesterone receptor gene
inactivation and CpG island hypermethylation in human leukemia cancer cells. FEBS
Letters, v. 567, n. 2-3, p. 327-332, jun. 2004.
84
LOETSCHER, M.; GEISER, T.; O’REILLY, T.; ZWAHLENT, R.; BAGGIOLINI, M.;
MOSER, B. Cloning of a human seven-transmembrane domain receptor, LESTR,
that is highly expressed in leukocytes. The Journal of Biological Chemistry, v. 269,
n. 1, p. 232-237, 1994.
LU, Q.; QIU, X.; HU, N.; WEN, H.; SU, Y.; RICHARDSON, B. C. Epigenetics,
disease, and therapeutic interventions. Ageing Research Reviews, v. 5, n. 4, p.
449-467, nov. 2006.
MA, X.; YANG, Q.; WILSON, K. T.; KUNDU, N.; MELTZER, S. J.; FULTON, A. M.
Promoter methylation regulates cyclooxygenase expression in breast cancer. Breast
Cancer Res., 2004; v. 6, n. 4, p. R316-321, 2004.
MAJKA, M.; RATAJCZAK, J.; KOWALSKA, M. A.; RATAJCZAK, M. Z. Binding os
ftromal derived factor 1α (SDF-1α) to CXCR4 chemokine receptor in normal human
megakaryoblasts but not in platelets induces phosphorylation of mitogen-activated
protein kinase p42/44 (MAPK), ELK-1 transcription factor and serine/threonine kinase
Akt. European Journal of Haematology, v. 64, n. 3, p. 164-172, mar. 2000.
MEIER, R.; MÜHLETHALER-MOTTET, A.; FLAHAUT, M.; COULON, A.; FUSCO, C.;
LOUACHE, F.; AUDERSET, K.; BOURLOUD, K. B.; DAUDIGEOS, E.; RUEGG, C.;
VASSAL, G.; GROSS, N.; JOSEPH, J. M. The chemokine receptor CXCR4 strongly
promotes neuroblastoma primary tumour and metastatic growth, but not invasion.
PLoS ONE., v. 2, n. 10, e1016, out. 2007.
MENKE, C. H.; BIAZÚS, J. V.; XAVIER, N. L.; CAVALHEIRO, J. A.; RABIN, E. G.;
BITTELBRUNN, A.; CERICATTO, R. Rotinas em mastologia. 2.ed. Porto Alegre:
Artmed, 2007. p. 149-155.
METHPRIMER. Disponível no site: >http://www.urogene.org/methprimer/index1.
htmL<. Acesso em: 12 ago. 2007.
MILLÁN, J.; RIDLEY, A. J. Rho GTPases and leucocyte-induced endothelial
remodeling. Biochem. J., v. 385, Pt 2, p. 329-337, jan. 2005.
MILLIS, R. R. Correlation of hormone receptors with pathological features in human
breast cancer. Cancer, v. 46, supl. 12, p. 2869-2871, dez. 1980.
MONTEIRO, A. P. S.; ARRAES, E. P. P.; PONTES, L. B.; CAMPOS, M. S. S.;
RIBEIRO, R. T.; GONÇALVES, R. E. B. Breast self-examination: frequency of
85
knowledge, practice and associated factors. Revista Brasileira de Ginecologia e
Obstetrícia, v. 25, n. 3, p. 201-205, abr. 2003.
MONTERO, A. J.; DÍAZ-MONTERO, C. M.; MAO, L.; YOUSSEF, E. M.; ESTECIO,
M.; SHEN, L.; ISSA, J. P. Epigenetic inactivation of EGFR by CpG island
hypermethylation in cancer. Cancer Biol Ther., v. 5, n. 11, p. 1494-501, nov. 2006.
MORALES; O. Q.; PINEDO, R. T.; VIGIL, R.C. Autoexamen de mama em pacientes
con patologia mamária. Acta cancerologica, v. 24, n. 4, p. 31-35, 1994.
MORI, T.; KIM, J.; YAMANO, T.; TAKEUCHI, H.; HUANG, S.; UMETANI, N.;
KOYANAGI, K.; HOON, D. S. Epigenetic up-regulation of C-C chemokine receptor 7
and C-X-C chemokine receptor 4 expression in melanoma cells. Cancer Res., v. 65,
n. 5, p.1800-1807, mar. 2005.
MOSER, B. Chemokines: role in immune cell traffic. Eur Cytokine Netw., v.14, n. 4,
p. 204-210, dez. 2003.
MULLER, A.; HOMEY, B.; SOTO, H.; GE, N.; CATRON, D.; BUCHANAN, M. E.;
McCLANAHAN, T.; MURPHY, E.; YUAN, W.; WAGNER, S. N.; BARRERA, J. L.;
MOHAR, A.; VERÁSTEGUI, E.; ZLOTNIK, A. Involvement of chemokine receptors in
breast cancer metastasis. Nature, v. 410, n. 6824, p. 50-56, mar. 2001.
MURAKAMI, T.; CARDONES, A. R.; HWANG, S. T. Chemokine receptors and
melanoma metastasis.
J Dermatol Sci., v. 36, n. 2, p. 71-78, nov. 2004.
MURDOCH C, FINN A. Chemokine receptors and their role in inflammation and
infectious diseases. Blood, v. 95, n. 10, p. 3032-3043, maio. 2000.
MURPHY PM, BAGGIOLINI M, CHARO IF, HÉBERT CA, HORUK R, MATSUSHIMA
K, MILLER LH, OPPENHEIM JJ, POWER CA. International union of pharmacology.
XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol Rev., v. 52, n. 1, p.145-76,
mar. 2000.
MURRELL, A.; RAKYAN, V. K.; BECK, S. From genome to epigenome. Human
Molecular Genetics, v. 14, n. 1, p. R3-R10, 2005.
NAKAO, M. Epigenetics: interaction of DNA methylation and chromatin. Gene, v.
278, p. 25-31, 2001.
86
NCBI - NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Disponível
no site: >http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/<. Acesso em: 15/04/2006.
OLIGOTECH. Disponível no site: >http://www.oligosetc.com/analysis.php#TECH
ANALYSIS<. Acesso em: 15/03/2006.
OLIVEIRA, M. A.; SANTOS, G. C.; KANAMURA, C. T., et al. Imunoexpressão da
proteína Her-2 em punção aspirativa com agulha fina de carcinoma de mama:
correlação com os achados da peça cirúrgica. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., v. 25,
n.1, p. 23-28, fev. 2003.
OPDENAKKER, G.; DAMME, J. V. The countercurrent principle in invasion and
metastasis of câncer cell. Recent insights on the roles of chemokines. Int. J. Dev.
Bio., v. 48, n. 5-6, p. 519-527, 2004.
ORIMO, A.; GUPTA, P. B.; SGROI, D. C.; ARENZANA-SEISDEDOS, F.;
DELAUNAY, T.; NAEEM, R.; CAREY, V. J.; RICHARDSON, A. L.; WEINBERG, R. A.
Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor
growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell, v. 121, n.
3, p. 335-348, maio 2005.
PAGE, D. L.; ANDERSON, T. J. Diagnostic histopathology of the breast cancer.
New York: Churchill Livingstone, 1987.
PENG, S. B.; PEEK, V.; ZHAI, Y.; PAUL, D. C.; LOU, Q.; XIA, X.; EESSALU, T.;
KOHN, W.; TANG, S. Akt activation but not extracellular signal-regulated kinase
activation, is required for SDF-1α/CXCR4- mediated migration of epitheloid
carcinoma cells. Mol. Cancer Res., v. 3, n.4, p. 227-236, abr. 2005.
PTASZNIK, A.; URBANOWSKA, E.; CHINTA, S.; COSTA, M. A.; KATZ, B. A.;
STANISLAUS, M. A.; DEMIR, G.; LINNEKIN, D.; PAN, Z. K.; GEWIRTZ, A. M.
Crosstalk between BCR/ABL oncoprotein and CXCR4 signaling through a Src family
kinase in human leukemia cells. J Exp Med., v. 196, n. 5, p. 667-678, set. 2002.
ROBERTSON, K. D.; JONES, P. A. DNA methylation: past, present and future
directions. Carcinogenesis. v. 21, n. 3, p. 461-467, mar. 2000.
RODENHISER, D.; MANN, M. Epigenetics and human disease: translating basic
biology into clinical applications.
CMAJ, v. 174, n. 3, p. 341-348, jan. 2006.
87
ROLLINS, B. J. Chemokines. Blood, v. 90, n. 3, p. 909-928, ago. 1997.
ROLLINS, B. J. Inflammatory chemokines in cancer growth and progression.
European Journal of Cancer, v. 42, n.6, p. 760-767, abr. 2006.
ROSSI, D.; ZLOTNIK, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu. Rev.
Immunol., v. 18, p. 217-242, 2000.
ROUNTREE, M. R.; BACHMAN, K. E.; HERMAN, J. G.; BAYLIN, S. B. DNA
methylation, chromatin inheritance, and cancer. Oncogene, v. 20, n. 24, p. 3156-
3165, maio. 2001.
RUBIE, C.; FRICK, V. O.; WAGNER, M.; WEBER, C.; KRUSE, B.; KEMPF, K.;
KÖNING, J.; RAU, B.; CHILLING, M. Chemokine expression in hepatocellular
carcinoma versus colorectal liver metastases. World Journal of Gastroenterology,
v. 12, n. 41, p. 6627-6633, nov. 2006.
SALVUCCI, O.; BOUCHARD, A.; BACCARELLI, A.; DESCHENES, J.; SAUTER, G.;
SIMON, R.; BIANCHI, R.; BASIK, M. The role of CXCR4 receptor expression in
breast cancer: a large tissue microarray study. Breast Cancer Research and
Treatment, v. 97, n. 3, p. 275-283, jun. 2006.
SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3.ed.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 74, n. 12, p. 5463-5467, dez.
1977.
SANGUINETTI, C.J.; DIAS NETO, E.; SIMPSON, A.J. Rapid silver staining and
recovery of PCR products separated on polyacrilamide gels. Biotechniques, v. 17,
n. 5, p. 914-921, nov.1994.
SATO, N.; MATSUBAYASHI, H.; FUKUSHIMA, N.; GOGGINS, M. The chemokine
receptor CXCR4 is regulated by DNA methylation in pancreatic cancer. Cancer
Biology and Therapy, v. 4, n. 1, p. 70-76, jan. 2005.
SCHIMID, B. C.; RUDAS, M.; REZNICZEK, G. A.; LEODOLTER, S.; ZEILLINGER,
R. CXCR4 is expressed in ductal carcinoma in situ of the breast and in atypical
ductal hyperplasia. Breast Cancer Res Treat., v. 84, n. 3, p. 247-250, abr. 2004.
88
SCHIOPPA, T.; URANCHIMEG, B.; SACCANI, A.; BISWAS, S. K.; DONI, A.;
RAPISARDA, A.; BERNASCONI, S.; SACCANI, S.; NEBULONI, M.; VAGO, L.;
MANTOVANI, A.; MELILLO, G.; SICA, A. Regulation of the chemokine receptor
CXCR4 by hypoxia. J Exp Med., v. 198, n. 9, p. 1391-1402, nov. 2003.
SCOTTON, C. J.; WILSON, J. L.; MILLIKEN, D.; STAMP, G.; BALKWILL, F. R.
Epithelial cancer cell migration: a role for chemokine receptors? Cancer Res., v. 61,
n. 13, p. 4961-4965, jul. 2001.
SELLAPPAN, S.; GRIJALVA, R.; ZHOU, X.; YANG, W.; ELI, M. B.; MILLS, G. B.; YU,
D. Lineage infidelity of MDA-MB-435 cells: expression of melanocyte proteins in a
breast cancer cell line. Cancer Res., v. 64, n. 10, p. 3479-3485, maio. 2004.
SHIM, H.; LAU, S. K.; DEVI, S.; YOON, Y.; CHO, H. T.; LIANG, Z. Lower expression
of CXCR4 in lymph node metastases than in primary breast cancers: potential
regulation by ligand-dependent degradation and HIF-1alpha. Biochem Biophys Res
Commun., v. 346, n. 1, p. 252-258, jul. 2006.
SILVA, D. M.; SADDI, V. A.; MOMOTUK, E. G. Marcadores moleculares associados
ao câncer de mama não metastático. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 48, n.
1, p. 39-48, 2002.
SINGAL, R.; GINDER, G. D. DNA methylation. Blood, v. 93, n. 12, p. 4059-4070,
jun. 1999.
SINGH, S.; SINGH, U. P.; GRIZZLE, W. E.; LILLARD, J. W. JR. CXCL12-CXCR4
interactions modulate prostate cancer cell migration, metalloproteinase expression
and invasion. Lab Invest., v. 84, n. 12, p. 1666-1676, dez. 2004.
SLETTENAAR, V. I. F.; WILSON, J. L. The chemokine network: a target in cancer
biology? Advanced Drug Delivery Reviews, v. 58, n. 8, p. 962-974, out. 2006.
SONG, S. H.; JONG, H. S.; CHOI, H. H.; INOUE, H.; TANABE, T.; KIM, N. K.; BANG,
Y. J. Transcriptional silencing of Cyclooxygenase-2 by hyper-methylation of the 5'
CpG island in human gastric carcinoma cells. Cancer Res., v. 61, n. 11, p. 4628-
4635, jun. 2001.
SORIANO, S. F.; HERNANZ-FÁLCON, P.; RODRÍGUEZ-FRADE, J. M.; ANA, A. M.;
GARZÓN, R.; CARVALHO-PINTO, C.; VILA-CORO, A. J.; ZABALLOS, A.;
BALOMENOS, D.; MARTÍNEZ-A, C.; MELLADO, M. Functional inactivation of CXC
89
chemokine receptor 4- mediated responses through SOCS3 up-regulation. The
Journal of Experimental Medicine, v. 196, n. 3, p. 311-321, ago. 2002.
STALLER, P.; SULITKOVA, J.; LISZTWAN, J.; MOCH, H.; OAKELEY, E. J.; KREK,
W. Chemokine receptor CXCR4 downregulated by von Hippel-Lindau tumour
suppressor pVHL. Nature, v. 425, n. 6955, p. 307-311, set. 2003.
STERNER, D. E.; BERGER, S. L. Acetylation of histones and transcription-related
factors. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 64, n. 2, p. 435-459, jun.
2000.
STRIETER, R. M.; BURDICK, M. D.; MESTAS, J.; GOMPERTS, B.; KEANE, M. P.;
BELPERIO, J. A. Cancer CXC chemokine networks and tumor angiogenesis.
European Journal of Cancer, v. 42, n. 6, p. 768-778, abr. 2006.
SU YC, WU MT, HUANG CJ, HOU MF, YANG SF, CHAI CY. Expression of CXCR4
is associated with axillary lymph node status in patients with early breast cancer.
Breast, v. 15, n. 4, p. 533-539, ago. 2006.
TAKANAMI, I. Overexpression of CCR7 mRNA in nonsmall cell lung cancer:
correlation with lymph node metastasis. Int J Cancer, v. 105, n. 2, p.186-189, jun.
2003.
TAMAMURA, H.; HORI, A.; KANZAKI, N.; HIRAMATSU, K.; MIZUMOTO, M.;
NAKASHIMA, H.; YAMAMOTO, N.; OTAKA, A.; FUJII, N. T140 analogs as CXCR4
antagonists identified as anti-metastatic agents in the treatment of breast cancer.
FEBS Letters, v. 550, n. 1-3, p. 79-83, ago. 2003.
TOYOTA, M.; SHEN, L.; OHE-TOYOTA, M.; HAMILTON, S. R.; SINICROPE, F. A.;
ISSA, J. P. Aberrant methylation of the Cyclooxygenase 2 CpG island in colorectal
tumors. Cancer Res., v. 60, n. 15, p. 4044-4048, ago. 2000.
TURKER, M. S. Gene silencing in mammalian cells and the spread of DNA
methylation. Oncogene, v. 21, n. 35, p. 5388-5393, ago. 2002.
TYCKO, B. Epigenetic gene silencing in cancer. The Journal of Clinical
Investigation, v. 105, n. 4, p. 401-407, fev. 2000.
UNIGENE. Disponível no site: >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search
&db=unigene<. Acesso em: 03/05/2006.
90
VERMA, M.; SRIVASTAVA, S. Epigenetics in cancer: implications for early detection
and prevention. The Lancet Oncology, v. 3, n. 12, p. 755-763, dez. 2002.
VIANA, L. C.; MARTINS, M.; GEBER, S. Ginecologia. 2. ed., Rio de Janeiro: Medsi,
2001.
VICARI, A. P.; CAUX, C. Chemokines in cancer. Cytokine Growth Factor Rev., v.
13, n. 2, p. 143-154, abr. 2002.
WAGGONER, D. Mechanisms of disease: epigenesis. Seminars in Pediatric
Neurology, v. 14, n. 1, p. 7-14, mar. 2007.
WANG, J. M.; DENG, X.; GONG, W.; SU, S. Chemokines and their role in tumor
growth and metastasis. Journal of Immunological Methods, v. 220, n. 1, p. 1-17,
nov. 1998.
WEGNER, S. A.; EHRENBERG, P. K.; CHANG, G.; DAYHOFF, D. E.; SLEEKER, A.
L.; MICHAEL, N. L. Genomic organization and functional characterization of the
chemokine receptor CXCR4, a major entry co-receptor for human immunodeficiency
virus type 1. J Biol Chem., v. 273, n. 8, p. 4754-4760, fev. 1998.
WENDT, M. K.; COOPER, A. N.; DWINELL, M. B. Epigenetic silencing of CXCL12
increases the metastatic potencial of mammary carcinoma cells. Oncogene, 2007.
WILSON, A. S.; POWER, B. E.; MOLLOY, P. L. DNA hypomethylation and human
diseases. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1775, n. 1, p. 138-162, jan. 2007.
WOO, S. U.; BAE, J. W.; KIM, C. H.; LEE, J. B.; KOO, B. W. A significant correlation
between nuclear CXCR4 expression and axillary lymph node metastasis in hormonal
receptor negative breast cancer. Ann Surg Oncol., v. 15, n. 1, p. 281-285, jan. 2008.
WORM, J.; GULDBERG, P. DNA methylation: an epigenetic pathway to cancer and a
promising target for anticancer therapy. J Oral Pathol Med., v. 31, n. 8, p. 443-449,
set. 2002.
XIONG, Z.; LAIRD, P. W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation
assay. Nucleic Acids Res., v. 25, n. 12, p. 2532-2534, jun. 1997.
91
YANG, X.; YAN, L.; DAVIDSON, N. E. DNA methylation in breast cancer.
Endocrine-Related Cancer, v. 8, n. 2, p. 115-127, jun. 2001.
YOO, C. B.; JONES, P. A. Epigenetic therapy of cancer: past, present, future.
Nature, v. 5, n. 1, p. 37-50, jan. 2006.
ZHANG, L.; YEGER, H.; DAS, B.; IRWIN, M. S.; BARUCHEL, S. Tissue
microenvironment modulates CXCR4 expression and tumor metastasis in
neuroblastoma. Neoplasia, v. 9, n. 1, p. 36-46, jan. 2007.
ZHANG, Y.; REINBERG, D. Trancription regulation by histone methylation: interplay
between different covalent modifications of the core histone tails. Genes &
Development, v. 15, p. 2343-2360, 2001.
ZLOTNIK, A. Chemokines in neoplastic progression. Seminars in Cancer Biology,
v. 14, n. 3, p. 181-185, jun. 2004.
ZOU YR, KOTTMANN AH, KURODA M, TANIUCHI I, LITTMAN DR. Function of the
chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development.
Nature, v. 393, n. 6685, p. 595-599, jun. 1998.
92
ANEXOS
ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO
Concordo em participar livremente deste estudo, entendo que serei
entrevistado e submetido a uma avaliação laboratorial (exame de sangue). E,
entendo que os riscos de minha participação nesta pesquisa são mínimos.
Entendo que minha participação é inteiramente voluntária, podendo me recusar a
responder qualquer questão ou retirar o meu consentimento em participar neste
estudo a qualquer hora, sem nenhum prejuízo ao meu tratamento atual ou futuro.
Eu,__________________________________________, após ter lido e
entendido todas as informações e esclarecido todas as minhas dúvidas referentes a
este estudo, concordo voluntariamente em participar do mesmo. Atesto também o
recebimento das “Informações ao doador”, necessário para a minha compreensão
do estudo.
__________________________________________ Data: __/__/__
Assinatura (do doador ou responsável) ou impressão datiloscópica
Eu, Prof. Dr. Iglenir João Cavalli, declaro que forneci todas as informações
referentes ao estudo ao doador.
_____________________________________________ Data: __/__/__
Prof. Dr. Iglenir João Cavalli
93
ANEXO 2 - ESTADIAMENTO CLÍNICO
Para nortear as ações de saúde no câncer da mama, uniformizando as condutas, foram criados
critérios de estadiamento. Esses critérios procuram estabelecer uma relação entre a doença e o seu
prognóstico e, para isso, os casos são colocados em grupos, estadiados de I a IV,formando uma
hierarquia importante para o médico que trata de câncer de mama. A União Internacional Contra o
Câncer (UICC), a partir dos anos 60, introduziu o sistema TNM (Tumor, Nodes, Metastasis, em inglês)
e periodicamente o vem revisando, a fim de incorporar os avanços no prognóstico e no tratamento da
neoplasia. Outras classificações foram propostas, como o ABCD de Haagensen, que foi bastante
usada nas décadas de 60 e 70, e a da American Joint Committee on Cancer (AJCC). Esta última
acabou se fundindo com a classificação da UICC e passou a ser padrão no mundo inteiro.
CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA - TNM
Baseia-se no diâmetro máximo do tumor (T), na presença ou não de linfonodos metastáticos na axila
(N) e nas metástases à distância, ausentes ou não (M). Para fins de orientação, transcrevemos a
classificação da UICC, 6ª edição, publicada em 2003 (Tabela17.1).Essa nova classificação trouxe em
seu bojo os recentes conhecimentos adquiridos com a padronização da técnica do linfonodo
sentinela, como o conceito de micrometástases e de células tumorais isoladas, incluindo, também,
omodo de detecção destas, se por imuno-histoquímica ou por métodos moleculares.Considerando a
classificação da UICC, são estabelecidos grupos por estadio, constituindo a classificação clínica
{Tabela17.2).Ela só se aplica a carcinomas e a tumores primários, virgens de tratamento.
Classificação clínica (cTNM) 6ª edição (UICC), 2003
cT Tumor primário
Tx Tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
Carcinoma ductal in situ
Carcinoma lobular in situ
Doença de Paget da papila sem tumor associado
T1
Tumor menor ou igual a 2 cm
T1mic Carcinoma microinvasor
T1a Tumor maior que 0,1 cm e menor ou igual a 0,5 cm
T1b Tumor maior que 0,5 cm e menor ou igual a 1 cm
T1c Tumor maior que 1cm e menor ou igual a 2 cm
T2 Tumor maior que 2 cm e menor ou igual a 5 cm
T3 Tumor maior que 5 cm
T4
Tumor de qualquer tamanho com extensão para
T4a Parede torácica
T4b Edema ou ulceração da pele
T4c 4a + 4b
T4d Carcinoma inflamatório
Obs.: Parede torácica inclui arcos costais, músculos intercostais e músculo serrátil anterior, mas não
o músculo peitoral. Doença de Paget associada a tumor é classificada de acordo com o tamanho do
tumor.
cN Linfonodos regionais
Nx Linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Ausência de metástase para linfonodos regionais
N1 Metástase para linfonodos axilares ipsilaterais móveis
N2
N2a Metástase para linfonodos axilares coalescentes ou aderidos a estruturas
adjacentes
N2b Metástase clinicamente aparente na mamária interna na ausência de metástase
axilar
94
N3
N3a Metástase para linfonodo infraclavicular
N3b Metástase para linfonodo da mamária interna e axilar
N3c Metástase para linfonodo supraclavicular
cM Metástase à distância
Mx Metástase à distância não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástase à distância
M1 Presença de metástase à distância
Classificação patológica (pTNM) 6ª edição (UICC)
pT Tumor primário
pTx Tumor primário não pode ser avaliado
pT0 Não há evidência de tumor primário
pTis Carcinoma in situ
Carcinoma ductal in situ
Carcinoma lobular in situ
Doença de Paget do mamilo sem tumor associado*
pT1 Tumor menor ou igual a 2 cm
pT1mic Carcinoma microinvasor
pT1a Tumor maior que 0,1 cm e menor ou igual a 0,5 cm
pT1b Tumor maior que 0,5 cm e menor ou igual a 1 cm
pT1c Tumor maior que 1 cm e menor ou igual a 2 cm
pT2 Tumor maior que 2 cm e menor ou igual a 5 cm
pT3 Tumor maior que 5 cm
pT4 Tumor de qualquer tamanho com extensão para
pT4a Parede torácica
pT4b Edema ou ulceração da pele
pT4c 4a + 4b
*Doença de Paget associada com tumor é classificada de acordo com o tamanho da lesão.
pN Linfonodos regionais
pNx Linfonodosregionaisnão podem ser avaliados
pN0 Ausênciade metástasepara linfonodos regionais
pN0 (i -/+)**
pN0 (MOL -/+)**
pN1 pN1mi Micrometástase (maior que 0,2 mm e menor ou igual a 2 mm) em axila ou CMI
pN1a 1 a 3 linfonodos axilares ipsilaterais comprometidos incluindo pelo menos uma
metástase maior que 2 mm
pN1b Linfonodos da mamária interna com metástase microscópica identificada em
linfonodo sentinela, mas não clinicamente aparente
pN1c 1 a 3 linfonodos axilares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase
maior que 2 mm e linfonodos da mamária interna com metástase microscópica
sem linfonodos sentinela, mas não clinicamente aparente
pN2 pN2a 4 a 9 linfonodos axilares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase
maior que 2 mm
pN2b Linfonodos da mamária interna clinicamente aparentes na ausência de
comprometimento axilar
pN3 pN3a 10 linfonodos axilares comprometidos incluindo pelo menos uma metástase
maior que 2 mm
ou
-- Linfonodo infraclavicular ipsilateral comprometido
pN3b Linfonodos da mamária interna clinicamente comprometidos na presença de
comprometimento de linfonodos axilares
ou
-- Mais de 3 linfonodos axilares comprometidos e linfonodos da mamária interna
com metástase microscópica identificada em linfonodo sentinela, mas não
clinicamente aparente
pN3c Linfonodo(s) supraclavicular ipsilateral comprometido
** Casos em que a metástase linfonodal consiste em apenas células tumorais isoladas ou formando
agrupamentos menores que 0,2 mm, que, em sua maioria, são detectados pela imunoistoquímica (i)
95
ou por biologia molecular (MOL), são classificados como pN0, pois tipicamente não mostram
evidência de atividade metastática.
pM Metástase a distância
pMx Metástase à distância não pode ser avaliada
pM0 Ausência de metástase à distância
pM1 Presença de metástase à distância
Resumo
Classificação por estadios
Estadio 0 Tis N0 M0 Estadio IIIA T0 N2 M0
Estadio I T1* N0 M0 T1* N2 M0
Estadio IIA T0 N1 M0 T2 N2 M0
T1* N1 M0 T3 N1, N2 M0
T2 N0 M0 Estadio IIIB T4 N0,N1, N2, M0
Estadio IIB T2 N1 M0 Estadio IIIC Qualquer T N3 M0
T3 N0 M0 Estadio IV Qualquer T, Qualquer N M1
*T1 inclui T1 mic.
GRAU TUMORAL (SBR)
O estadiamento tumoral, especialmente quando realizado por patologistas treinados,
correlaciona-se bem com o prognóstico clínico. Os sistemas de estadiamento mais utilizados para o
câncer de mama são a classificação de Scarff-Bloom-Richardson (SBR), o qual foi modificado pelo
grupo de Nottingham.
O grau de diferenciação é avaliado de acordo com a habilidade do tumor em originar formações
tubulares, glandulares ou papilares. O pleomorfismo descreve a forma do núcleo. O índice mitótico
avalia o número de mitoses encontrados na amostra do tumor. A soma dos pontos dos três
componentes determina os graus: 1 (bem diferenciado), 2 (moderadamente diferenciado) e 3
(fracamente diferenciado). Pacientes com um escore de SBR de 3 apresentam um risco relativo de
4,4 comparado com aquelas com um escore de SBR de 1 para tempo livre de doença por cinco anos.
O grau histológico é aplicável a todos os carcinomas mamários. Ele tende a aumentar junto com o
tamanho tumoral e o acometimento linfonodal, com importante influência negativa no prognóstico.
FONTE: MENKE et al., 2007.
96
ANEXO 3 – LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES ESPECÍFICOS PARA RT-PCR
A
Genomic chr 2
CATGCGCCGC GCTCGGAGCG TGTTTTTATA AAAGTCCGGC CGCGGCCAGA 136592196
AACTTCAGTT TGTTGGCTGC GGCAGCAGGT AGCAAAGTGA CGCCGAGGGC 136592146
CTGAGTGCTC CAGTAGCCAC CGCATCTGGA GAACCAGCGG TTACCATGGA 136592096
GGGGATCAGT GTAAGTCCAG TTTCAACCTG CTTTGTCATA AATGTACAAA 136592046
...
GCTGAATTGG AAGTGAATGT CCATTCCTTT GCCTCTTTTG CAGATATACA 136589946
CTTCAGATAA CTACACCGAG GAAATGGGCT CAGGGGACTA TGACTCCATG 136589896
AAGGAACCCT GTTTCCGTGA AGAAAATGCT AATTTCAATA AAATCTTCCT 136589846
GCCCACCATC TACTCCATCA TCTTCTTAAC TGGCATTGTG GGCAATGGAT 136589796
TGGTCATCCT GGTCATGGGT TACCAGAAGA AACTGAGAAG CATGACGGAC 136589746
AAGTACAGGC TGCACCTGTC AGTGGCCGAC CTCCTCTTTG TCATCACGCT 136589696
TCCCTTCTGG GCAGTTGATG CCGTGGCAAA CTGGTACTTT GGGAACTTCC 136589646
B
Genomic chr 12
AAGCGGCCAG CCTGGCACCC TATGGACACG CTCCCCTGAC TTGCGCCCCG 6516717
CTCCCTCTTT CTTTGCAGCA ATGCCTCCTG CACCACCAAC TGCTTAGCAC 6516767
CCCTGGCCAA GGTCATCCAT GACAACTTTG GTATCGTGGA AGGACTCATG 6516817
GTATGAGAGC TGGGGAATGG GACTGAGGCT CCCACCTTTC TCATCCAAGA 6516867
CTGGCTCCTC CCTGCCGGGG CTGCGTGCAA CCCTGGGGTT GGGGGTTCTG 6516917
GGGACTGGCT TTCCCATAAT TTCCTTTCAA GGTGGGGAGG GAGGTAGAGG 6516967
GGTGATGTGG GGAGTACGCT GCAGGGCCTC ACTCCTTTTG CAGACCACAG 6517017
TCCATGCCAT CACTGCCACC CAGAAGACTG TGGATGGCCC CTCCGGGAAA 6517067
CTGTGGCGTG ATGGCCGCGG GGCTCTCCAG AACATCATCC CTGCCTCTAC 6517117
TGGCGCTGCC AAGGCTGTGG GCAAGGTCAT CCCTGAGCTG AACGGGAAGC 6517167
TCACTGGCAT GGCCTTCCGT GTCCCCACTG CCAACGTGTC AGTGGTGGAC 6517217
CTGACCTGCC GTCTAGAAAA ACCTGCCAAA TATGATGACA TCAAGAAGGT 6517267
GGTGAAGCAG GCGTCGGAGG GCCCCCTCAA GGGCATCCTG GGCTACACTG 6517317
FIGURA 16 - LOCALIZAÇÃO DOS INICIADORES UTILIZADOS NAS REAÇÕES
DE RT-PCR PARA OS GENES CXCR4 (A) E GAPDH (B).
FONTE: HUMAN BLAT, 2008.
NOTA: O exon está indicado em azul, íntron em preto e, destacado em amarelo, estão os
nucleotídeos escolhidos para o desenho dos iniciadores. (E) exon, (F) iniciador universal, (R) iniciador
reverso. Abaixo da seqüência de nucleotídeos, está exposto um esquema dos genes, em que é
possível notar que os iniciadores foram desenhados na região 3’, entre exons distintos.
E1 E2 E3 E4
E5
E6
E7
E8 E9
Chr 12
F
R
F
E1 E2
R
Chr 2
128
126
97
ANEXO 4 – QUADRO DOS DADOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS DAS 76 PACIENTES E DOS RESULTADOS DE MSP
Amostra Fibroadenoma Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio recidiva metástase óbito MSP U MSP M
1 CP163 44 12 - nd nd nd nd - - - + -
2 CP179 18 48 nd nd nd nd nd + - - + -
3 CP235 15 28 - nd nd nd nd - - - + -
Amostra CD ´in situ´ Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio recidiva metástase óbito MSP U MSP M
4 CP025 79 Tis nd nd nd nd 0 nd nd nd + -
Amostra CDI - GI Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
5 CP162 49 T1 - + + nd I - - - + +
6 CP287 83 T1 - + + nd I - - - + -
7 CP323 50 T2 - + nd - IIA - - - + +
8 CP332 30 T2 - + + + IIA - - - + +
9 CP402 68 T2 + + + - IIB - - - + -
10 CP408 60 T2 - + + - IIA - - - + +
11 CP425 72 T2 - + + + IIA - - - + -
12 CP456 75 T1 - + + + I - - - + -
13 CP460 66 T1 - + + + I - - - + -
14 CP471 52 T2 + + + - IIB - - - + +
15 CP515 63 T1 - + + - I - - - + +
16 CP528 42 T1 - + + - I - - - + +
Amostra CDI - GII Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
17 CP172 68 T2 + + + - IV - + + + -
18 CP174 51 T3 + + + + IV - + + + +
Continua...
129
98
ANEXO 4 – QUADRO DOS DADOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS DAS 76 PACIENTES E DOS RESULTADOS DE MSP
19 CP197 66 T1 + - - + IIA - - - + -
20 CP271 47 T2 + + nd - IIB - - + + -
21 CP290 71 T1 nd + nd - pT1,pNX,pMx - - - + +
22 CP314 74 T2 - + + + IIA - - - + -
23 CP337 62 T2 - + + - IV - + + + -
24 CP341 73 T2 + + + - IIB - - - + -
25 CP365 39 T2 + + - - IIB - - - + -
26 CP366 63 T2 - + - + IIA - - - + -
27 CP413 83 T2 + + + - IIB - - - + +
28 CP487 68 T1 - + + - I - - - + -
29 CP497 45 T1 + + + - IV - + - + -
30 CP520 71 T4 + + + + IIIC - - - + +
31 CP527 53 T2 + - - + IIIA - - - + -
32 CP532 56 T2 + + + - IIIC - - - + -
33 CP536 40 T2 + + + + IIIC - - - + -
34 CP542 40 T2 + + + + IIA - - - + -
35 CP547 54 T2 + + + - IIIA - - - + -
36 CP556 63 T2 - + + - IIA - - - + +
37 CP562 49 T2 + + + + IIIA - - - + -
38 CP427 55 T1 + + + + IV - + nd + +
Amostra CDI - GIII Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
39 CP243 48 T4 + + + - IIIB nd + + + -
Continua...
130
99
ANEXO 4 – QUADRO DOS DADOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS DAS 76 PACIENTES E DOS RESULTADOS DE MSP
40 CP310 56 T1 + + + + IIA - - - + +
41 CP338 44 T2 - - - - IIA - - - + +
42 CP399 82 T2 + + + - IIB - - - + -
43 CP422 75 T4 - + + - IV + + + + +
44 CP424 63 T2 + + - - IIB - - - + +
45 CP432 66 T4 + + + - IIIB - - - + +
46 CP434 59 T2 + - - - IV - + + + -
47 CP470 67 T2 - + + - IIA - - - + +
48 CP505 72 T4 + - - + IV + + + + +
49 CP525 45 T3 + + + - IIIA - - - + -
50 CP537 69 T2 - - - + IIB + - - + -
51 CP539 55 T1 + - - + IIA - - - + -
52 CP545 27 T3 - - - - IIB - - - + -
53 CP558 51 T1 - + + + I - - - + -
54 CP559 79 T2 - - - + IV - + + + +
55 CP430 54 T4 + - nd nd IIIB - - - + -
Amostra CLI - GI Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
56 CP319 68 T2 - + + - IIA - - - + -
57 CP389 84 T2 - nd nd nd IIA - - - + -
58 CP476 71 T3 + + nd nd nd nd nd nd + +
59 CP485 59 T1 - + + - I - - - + -
Continua...
131
ANEXO 4 – QUADRO DOS DADOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS DAS 76 PACIENTES E DOS RESULTADOS DE MSP
100
60 CP501 53 T1 - + + - I - - - + -
61 CP300 65 T1 - + + - I + - - + -
62 CP339 53 T2 + + nd - IIB - + + + +
Amostra CLI - GII Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
63 CP256 55 T2 + + + - IIB - - - + -
64 CP390 44 T1 - + + - I - - - + -
65 CP420 52 T2 - + + - IIA - - - + +
66 CP445 46 T3 + + + - IIIA - - - + +
67 CP506 55 T3 + + + - IV - + + + -
68 CP535 79 T1 - + - - I - - - + -
69 CP297 76 T3 - + + - IIA + nd nd + -
70 CP412 42 T2 - + nd - IIA - - - + -
71 CP574 45 T2 + - - - nd - - - + -
72 CP585 66 T2 + + - - IIB - - - + -
73 CP529 46 T3 - + + + IIIA - - - +
+
Amostra CL - GIII/nd Idade Tamanho Linfonodos RE RP ERBB2 Estadio Recidiva Metástase Óbito MSP U MSP M
74 CP202 55 T2 + + nd nd IIB - - - + -
75 CP196/nd 77 T4 - - nd + IIIB + + + + -
76 CP340/nd 55 T2 + nd nd nd IIB nd nd nd + -
Legenda: CD: carcinoma ductal; CDI carcinoma ductal invasivo; CLI: carcinoma lobular invasivo; G: grau histológico (SBR); CP:
número do cadastro da paciente no Banco de Tumores; RE: receptor de estrógeno; RP: receptor de progesterona; ERBB2:
receptor de fator de crescimento epidermal humano; MSPM: tumor metilado; MSPU: tumor não metilado; nd: não determinado.
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