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Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia
Programa de Pós Graduação em Engenharia Química
Estudo da Produção de Ácido Clavulânico por Streptomyces
clavuligerus em Diferentes Concentrações de Lipídios e de
Fontes Complexas de Nitrogênio
Sheila Cristiane Alves Ortiz
Orientador: Prof. Dr. Carlos Osamu Hokka
SÃO CARLOS – SP
2005
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia
Programa de Pós Graduação em Engenharia Química
Estudo da Produção de Ácido Clavulânico por Streptomyces
clavuligerus em Diferentes Concentrações de Lipídios e de
Fontes Complexas de Nitrogênio
Sheila Cristiane Alves Ortiz
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Engenharia
Química da Universidade Federal de São Carlos
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Engenharia
Química, área de concentração Pesquisa e
Desenvolvimento de Processos Químicos.
Orientador:
Prof. Dr. Carlos Osamu Hokka
São Carlos – SP
2005
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
O77ep
Ortiz, Sheila Cristiane Alves.
Estudo da produção de ácido clavulânico por
Streptomyces clavuligerus em diferentes concentrações de
lipídios e de fontes complexas de nitrogênio / Sheila
Cristiane Alves Ortiz. -- São Carlos : UFSCar, 2005.
88 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2005.
1. Fermentação. 2. Lipídios. 3. Ácido clavulânico. 4. Soja
- produtos. I. Título.
CDD: 660.28449 (20
a
)
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE SHEILA
CRISTIANE ALVES ORTIZ APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
ENGENHARIA QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS EM 29 DE
AGOSTO DE 2005.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Osamu Hokka
PPG-EQ/ UFSCar
Prof. Dr. Alberto Colli Badino Junior
PPG-EQ/ UFSCar
Prof. Drª. Maria Lúcia Gonsales da Costa Araújo
IQ/UNESP Araraquara
Olhos abertos
O longe é perto
O que vale é o sonho
(Desgarrados - Sérgio Napp/ Mário Barbará Dornelles)
Ao Gui
À minha Família
AGRADECIMENTOS
Aos professores Dr. Carlos Osamu Hokka e Dr. Alberto Colli Badino Junior pela
orientação.
Aos colegas do Laboratório de Engenharia Bioquímica e em especial, Álvaro, Marcel,
Luciana Futiwaki e Juliana, pela importante contribuição em algumas etapas desse trabalho.
Ao técnico Amadeus que esteve sempre disposto a ajudar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pela bolsa
concedida.
Ao DEQ-UFSCar pela infra-estrutura fornecida.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................... iii
NOMENCLATURA....................................................................................................................... iv
RESUMO....................................................................................................................................... v
ABSTRACT.................................................................................................................................. vi
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................................... 3
2.1. Antibióticos β-Lactâmicos ................................................................................................... 3
2.2. Ácido Clavulânico................................................................................................................ 5
2.3. Biossíntese.......................................................................................................................... 6
2.4. Streptomyces clavuligerus .................................................................................................. 8
2.5. Regulação do Metabolismo Secundário ........................................................................... 10
2.5.1. Regulação por Fonte de Nitrogênio.............................................................................. 10
2.5.1.1. Metabolismo dos Aminoácidos e o Ciclo da Uréia ........................................ 12
2.5.2. Regulação por Fonte de Fosfato .................................................................................. 16
2.5.3. Regulação por Fonte de Carbono................................................................................. 16
2.5.3.1. Óleos como Fonte de Carbono...................................................................... 17
2.5.3.2. Metabolismo dos Lipídios .............................................................................. 18
2.5.3.3. Lipases........................................................................................................... 23
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................................... 26
3.1. Materiais............................................................................................................................ 26
3.1.1. Microrganismo............................................................................................................... 26
3.1.2. Meios de Cultura........................................................................................................... 26
3.1.2.1. Meio de Cultura de Reativação...................................................................... 26
3.1.2.2. Meios de Cultura de Produção ...................................................................... 27
A) Ensaios Preliminares em Mesa Incubadora Rotativa ............................................ 27
B) Ensaios em Biorreator de Bancada........................................................................ 28
3.2. Equipamentos ................................................................................................................... 29
3.2.1. Câmara Asséptica......................................................................................................... 29
3.2.2. Autoclaves..................................................................................................................... 29
3.2.3. Ultrafreezer ................................................................................................................... 29
3.2.4. Mesa Incubadora Rotativa ............................................................................................ 30
3.2.5. Centrífuga Refrigerada ................................................................................................. 30
3.2.6. Medidor de pH............................................................................................................... 30
3.2.7. Reômetro ...................................................................................................................... 30
3.2.8. Biorreator de Bancada .................................................................................................. 30
3.2.9. Cromatógrafo ................................................................................................................ 31
3.3. Metodologia Analítica........................................................................................................ 31
3.3.1. Análise da Concentração de Ácido Clavulânico........................................................... 31
A) Método Espectrofotométrico (Bird et al., 1982)...................................................... 31
B) Método Cromatográfico (Foulstone e Reading, 1982)........................................... 33
3.3.2. Análise de Glicerol ........................................................................................................ 34
3.3.3. Avaliação do Crescimento Celular................................................................................ 34
3.3.4. Determinação da Concentração de Lipídios................................................................. 35
3.3.5. Determinação de Carboidratos Totais .......................................................................... 35
3.4. Procedimento Experimental.............................................................................................. 36
3.4.1. Ensaios em Mesa Incubadora Rotativa ........................................................................ 36
3.4.2. Experimentos em Biorreator Convencional de Bancada.............................................. 37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................. 39
4.1. Ensaios em Mesa Incubadora Rotativa ............................................................................ 39
A) Avaliação da Fonte e Concentração de Nitrogênio............................................................. 39
4.1.1. Ensaio BS1 ................................................................................................................... 39
4.1.2. Ensaio BS2 ................................................................................................................... 40
4.1.3. Ensaio BS3 ................................................................................................................... 42
4.1.4. Ensaio BS4 ................................................................................................................... 45
4.1.5. Comparação dos ensaios BS1, BS2, BS3 e BS4......................................................... 46
B) Avaliação da Concentração de Lipídios.............................................................................. 47
4.1.6. Ensaio BS5 ................................................................................................................... 48
4.1.7. Ensaio BS6 ................................................................................................................... 49
4.2. Ensaios em Biorreator....................................................................................................... 50
4.2.1. Ensaio BF1.................................................................................................................... 50
4.2.2. Ensaio BF2.................................................................................................................... 51
4.2.3. Ensaio BF3.................................................................................................................... 52
4.2.4. Ensaio BF4.................................................................................................................... 54
4.2.5. Ensaio BF5.................................................................................................................... 55
4.2.6. Ensaio BF6.................................................................................................................... 56
4.2.7. Comparação dos Cultivos em Biorreator de Bancada.................................................. 58
4.2.8. Correlação entre Concentrações de Farinha de Soja (C
FS
) e de Óleo de Soja (C
OS
) e
Produção de Ácido Clavulânico .............................................................................................. 63
4.2.9. Modelagem Qualitativa do Processo de Produção de Ácido Clavulânico.................... 65
5. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 68
6. SUGESTÕES .......................................................................................................................... 69
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 70
Lista de Figuras
__________________________________________________________________
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1.
Subgrupos de antibióticos β-lactâmicos, exemplo de antibióticos e
microrganismos produtores (Brakhage, 1998)
04
Figura 2.2.
Fórmula estrutural do ácido clavulânico 05
Figura 2.3.
Rota biossintética do ácido clavulânico e outros clavams (Elkins et
al., 2002)
08
Figura 2.4.
Degradação de aminoácidos (Voet et al., 2000) 13
Figura 2.5.
Ciclo da uréia (Voet et al.., 2000) 15
Figura 2.6.
β- oxidação da Acil-Coa graxa (Voet et al., 2000)
22
Figura 2.7.
Reação de hidrólise do triacilglicerol catalisada por lipases (Stryer,
1996)
23
Figura 2.8.
Atuação da lipase (Muralidhar et al., 2002) 24
Figura 3.1.
Curva de calibração para determinação da concentração de AC 32
Figura 3.2.
Esquema experimental para os cultivos em mesa incubadora
rotativa
37
Figura 3.3.
Esquema experimental para os cultivos em biorreator de bancada 38
Figura 4.1.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
), carboidratos totais (C
CT
) e índice de consistência
(K) do ensaio BS1
39
Figura 4.2.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS2
41
Figura 4.3.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS3
42
Figura 4.4.
Comparação dos resultados de concentração de ácido clavulânico
pelos métodos de Bird et al., (1982) e Foulstone e Reading, (1982)
43
Figura 4.5.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS4
45
Figura 4.6.
Perfis de concentração de AC pra os cultivos BS1, BS2, BS3 e
BS4 em mesa incubadora rotativa
47
Figura 4.7.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS5
48
Figura 4.8.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS6
49
Lista de Figuras
__________________________________________________________________
ii
Figura 4.9.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de
oxigênio dissolvido (OD) do ensaio BF1
50
Figura 4.10.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de
oxigênio dissolvido (OD) do ensaio BF2
52
Figura 4.11.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de
oxigênio dissolvido (OD) do ensaio BF3
53
Figura 4.12.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de
oxigênio dissolvido (OD) do ensaio BF4
54
Figura 4.13.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BF5
55
Figura 4.14.
Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido
clavulânico (C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BF6
57
Figura 4.15.
Perfis dos índices de consistência (K) dos ensaios BF1, BF2, BF3,
BF4, BF5 e BF6
58
Figura 4.16.
Perfis de concentração de ácido clavulânico (C
AC
) dos ensaios
BF1, BF2, BF3, BF4, BF5 e BF6
59
Figura 4.17.
Perfis de consumo de lipídios (C
LIP
) dos ensaios BF1, BF2, BF3,
BF4, BF5 e BF6
60
Figura 4.18.
Produtividade de AC dos ensaios BF1, BF2, BF3, BF4, BF5 e BF6 62
Figura 4.19.
Comparação entre os valores experimentais e calculados de
C
ACmax
65
Lista de Tabelas
__________________________________________________________________
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1.
Alguns exemplos de ácidos graxos, com seus nomes comuns e fórmulas
adaptada de Stryer (1996)
20
Tabela 3.1.
Meio de cultura para reativação do microrganismo 26
Tabela 3.2.
Meios de cultura de inóculo e produção para avaliação da fonte e da
concentração de nitrogênio
27
Tabela 3.3.
Meios de cultura de produção para avaliação da concentração de óleo de
soja utilizado como fonte de carbono.
28
Tabela 3.4.
Meios de cultura de produção para avaliação das concentrações da fonte
de nitrogênio e de óleo de soja utilizado como fonte de carbono
29
Tabela 4.1.
Comparação entre valores de produção (C
AC
) e produtividade (P
AC
)
máximas em AC publicados na literatura
63
Tabela 4.2.
Comparação entre os valores de Cac
max
experimentais e calculados pela
Equação 4.1
64
Nomenclatura
__________________________________________________________________
iv
NOMENCLATURA
K = índice de consistência (dina.cm
-2
.s
n
)
n = índice de comportamento de escoamento
Abs = Absorbância
AC = ácido clavulânico
MOPS = ácido morfolino propano sulfônico
C
AC
= concentração de ácido clavulânico (mg.L
-1
)
Cac
Max =
concentração de ácido clavulânico máxima (mg.L
-1
)
P
AC
= produtividade em ácido clavulânico (mg.L
-1
.h
-1
)
C
GLI
= concentração de glicerol (g.L
-1
)
C
LIP
= concentração de lipídios (g.L
-1
)
C
CT
= concentração de carboidratos totais (g.L
-1
)
OD = Oxigênio dissolvido
C
FS
: concentração de farinha de soja (g.L
-1
)
C
OS
: concentração de óleo de soja (g.L
-1
)
Letras gregas
τ = tensão de cisalhamento (dina.cm
-2
)
γ = velocidade de cisalhamento ou gradiente de velocidade (s
-1
)
λ = comprimento de onda (nm)
RESUMO
O ácido clavulânico (AC), produto do metabolismo secundário da bactéria filamentosa
Streptomyces clavuligerus, é um potente inibidor de enzimas β-lactamases, sendo utilizado
pela indústria farmacêutica em conjunto com outros antibióticos β-lactâmicos, na formulação de
medicamentos que diminuem a resistência de muitas bactérias patogênicas a estes
antibióticos. Estudos de composição de meio de cultura, assim como o modo que cada
componente é adicionado ao caldo é de vital importância nos processos fermentativos, tanto no
que se refere à obtenção de alta produtividade do produto desejado, assim como na facilidade
de manipulação, separação e purificação do produto final. Os lipídios apresentam-se como uma
alternativa a ser utilizada em processos para produção de ácido clavulânico, uma vez que
constituem uma fonte concentrada de energia lentamente assimilável pelos microrganismos.
Quanto à fonte de nitrogênio, derivados de soja como farinhas e hidrolisados têm sido
utilizados com sucesso na produção de AC, fornecendo precursores para biossíntese deste
composto, no entanto, a quantidade adequada desse nutriente não foi ainda estabelecida em
meios de cultura até o momento. O presente trabalho teve como objetivo geral o estudo da
composição do meio de cultura para produção de ácido clavulânico por Streptomyces
clavuligerus em biorreator de bancada, utilizando fontes complexas de nitrogênio e lipídios
como fonte de carbono suplementar. Em ensaios preliminares em mesa incubadora rotativa
para determinação das concentrações da fonte/ teor de nitrogênio utilizando farinha de soja e
Samprosoy 90NB nas concentrações 1,6, e 3,2 g.L
-1
de nitrogênio total e concentração de óleo
de soja (16, 23 e 30 g.L
-1
), os resultados obtidos mostraram que quando as concentrações de
óleo de soja e farinha de soja iniciais foram 23 g.L
-1
e
20 g.L
-1
, respectivamente, a produção de
AC obtida foi
700 mg.L
-1
em 132 horas de cultivo, e que valores de pHs acima de 7,0
prejudicam o processo de produção. Nos ensaios em biorreator de bancada convencional, em
condições de controle de pH por adição de ácido e base, todos os cultivos foram marcados
pela alta produção e produtividade de AC ocorrendo aparente pequena degradação do produto.
A composição de meio de cultura que gerou os melhores resultados de produção de AC nas
seguintes condições: 800 rpm, 0,5 vvm e pH 6,8, foi o que apresentou farinha de soja e óleo de
soja nas concentrações de 40 g.L
-1
e 16 g.L
-1
, respectivamente, na composição do meio de
produção, alcançando a produção máxima de 906 mg.L
-1
de AC em 84 horas de cultivo.
ABSTRACT
Clavulanic acid (CA), a secondary metabolite from Streptomyces clavuligerus, is a
potent inhibitor of β-lactamases, being formulated by pharmaceutical industries with other β-
lactams antibiotics to produce drugs that overcome the resistance to antibiotics of many
pathogenic bacteria. Studies on culture medium composition, as well as how each component is
added to the broth are essential for improving and developing fermentation processes both in
obtaining high productivity, as well as in simplifying the separation and purification of the final
product. The lipids become an interesting alternative to be used in CA production process, once
they constitute a concentrated source of energy slowly assimilated by microorganisms. With
relation to the nitrogen source, soybean derivatives, as flours and protein isolates, have been
used successfully in the production of CA, by supplying precursors for its biosynthesis; however,
the appropriate amount of this nutrient in culture media has not been properly established so
far. The general objective of the present work was to study the culture medium composition on
the improvement of CA production by S. clavuligerus in bench scale bioreactor, using complex
nitrogen sources, and lipids as supplementary carbon source. In preliminary cultivations in
shake flasks, the effects of nitrogen source and concentration, using soybean flour and
Samprosoy 90NB (soybean protein isolate), were studied. The total nitrogen concentrations of
1.6 and 3.2 g.L
-1
, and soybean oil concentration of 16, 23 and 30 g.L
-1
were tested. The results
obtained showed that, when the concentrations of soybean oil and initial soybean flour were 23
g.L
-1
and 20 g.L
-1
, respectively, the CA production obtained was 700 mg.L
-1
in 132 hours
cultivation, and at pH values above 7.0 the production process was severely harmed. In
conventional bioreactor cultivations, under pH control with acid or base addition, all the
cultivations were marked by the high CA production and productivity, accompanied by small
degradation of the product. The culture medium composition and cultivation conditions that
generated best results, concerning CA production, were as follows: 800 rpm, 0.5 vvm and pH
6.8, soybean flour and soybean oil concentrations of 40 g.L
-1
and 16 g.L
-1
, respectively. Under
these conditions, a maximum production of 906 mg.L
-1
of CA in 84 hours cultivation was
obtained.
Introdução
___________________________________________________________________
1
1. INTRODUÇÃO
A penicilina, um antibiótico descoberto por Fleming em 1929, representou um grande
avanço no tratamento de várias doenças infecciosas causadas por bactérias, assim como suas
limitações de uso impulsionaram os estudos para a descoberta de um amplo número de
compostos com maior, mais estável e diferenciado espectro de ação antibacteriana.
(Kurylowicz et al., 1981).
Os compostos com atividade antibacteriana conhecidos atualmente podem ser
classificados de acordo com a sua estrutura química. Os β-lactâmicos compõem um importante
e altamente valorizado grupo de antibióticos. São caracterizados pela presença de um anel β-
lactâmico em sua estrutura, que lhe confere atividade antibacteriana e poucos efeitos
colaterais.
A resistência de alguns microrganismos a estes antibióticos está relacionada com a
capacidade de algumas bactérias produzirem β-lactamases, que clivam o anel β-lactâmico
destituindo-os da atividade bacteriana.
A utilização de inibidores de β-lactamases, juntamente com antibióticos β-lactâmicos, é
reconhecidamente uma estratégia para diminuir as concentrações mínimas de inibição para
bactérias resistentes a estes antibióticos (Kurylowicz et al., 1981).
Dentre os inibidores de β-lactamases conhecidos, o ácido clavulânico, (AC), produto do
metabolismo secundário de Streptomyces clavuligerus, se destaca pela habilidade de inibir
irreversivelmente uma grande gama de β-lactamases (Baggaley et al.,1997).
Como ocorre com outros metabólitos secundários, a produção de ácido clavulânico
depende do tipo e da quantidade das fontes de carbono, nitrogênio e fosfato presentes no meio
de cultivo, que agem como fatores reguladores, assim como fatores de processo, tais como
temperatura, pH e concentração de oxigênio dissolvido (Maranesi et al., 2005).
Conforme relatado por Aharonowitz e Demain (1978), Streptomyces clavuligerus possui a
incapacidade de assimilar carboidratos simples como a glicose, necessitando de fontes de
carbono alternativas para crescimento e produção de metabólitos secundários.
Introdução
___________________________________________________________________
2
Os lipídios apresentam-se como uma alternativa a ser utilizada em processos para
produção de ácido clavulânico, uma vez que constituem uma fonte concentrada de energia
lentamente assimilável pelos microrganismos.
Ainda, quanto à fonte de nitrogênio, derivados de soja como farinha de soja e hidrolisados
têm sido utilizados com sucesso na produção de AC, no entanto, a quantidade adequada
desse nutriente não foi ainda estabelecida em meios de cultura até o momento.
Em face do apresentado, o presente trabalho teve como objetivo geral o estudo da
composição do meio de cultura para produção de ácido clavulânico por Streptomyces
clavuligerus em biorreator de bancada, utilizando fontes complexas de nitrogênio e lipídios
como fonte de carbono suplementar.
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________________________
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Antibióticos β-Lactâmicos
Os compostos β-lactâmicos compreendem um importante e altamente valorizado grupo
de drogas usadas no tratamento de doenças infecciosas. Eles incluem as penicilinas e
cefalosporinas naturais e semi-sintéticas. Este grupo é caracterizado por possuir o anel β-
lactâmico em sua estrutura, que lhe confere atividade antibacteriana.
O grupo dos β-lactâmicos pode ser dividido em cinco subgrupos, dependendo do
segundo anel ligado ao anel β-lactâmico. Na Figura 2.1 estão demonstrados os subgrupos dos
compostos β-lactâmicos, com os respectivos microrganismos produtores.
Atualmente os antibióticos β-lactâmicos estão perdendo a sua eficiência no tratamento
de várias doenças provocadas por bactérias, em função da resistência adquiridas por estas.
A resistência de muitas cepas bacterianas aos antibióticos β-lactâmicos é
freqüentemente devida a uma enzima produzida por elas que hidrolisa o anel β-lactâmico. A β-
lactamase é produzida por cepas Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformes, Mycobacterium sp.) bem como Gram-
negativas (Escherichia coli, Proteus sp., Klebsiella aerogenes, enterobacter cloacae,
Pseudomonas aeruginosa), algumas das quais produzem uma ou mais β-lactamases com
variações nas propriedades químicas, físicas e enzimáticas (Kurylowicz et al., 1981).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________________________
4
Classes dos
β-lactâmicos
Antibióticos
Microrganismos produtores
Penam
Penicilinas
Penicillium chrysogenum
P. notatum
Aspergillus nidulans
Ceph-3-em
Cefalosporinas
Cefamicinas
Cefabacinas
Cephalosporium acremonium
Paelomyces persinucus
Streptomyces clavuligerus
Nocardia lactamdurans
Flavobacterium sp.
Lysobacter lactamgenus
Clavam
Ácido clavulânico
Streptomyces clavuligerus
Carbapenem
Tienamicinas
Ácido olivânico
Streptomyces clavuligerus
S. olivaceus
Erwinia carotovora
Seratia sp.
Monolactam
Nocardicinas
Monobactams
Nocardia uniformis
Subsp. Tsuyamanensis
Agrobacterium radiobacter
Pseudomonas acidophila
Figura 2.1. Subgrupos de antibióticos β-lactâmicos, exemplo de antibióticos e
microrganismos produtores (Brakhage, 1998)
Os compostos que inibem a atividade de β-lactamases são chamados bloqueadores ou
inibidores. Ao reagir com o centro ativo da enzima, os inibidores a inativam e a destituem de
sua ação sobre os antibióticos β-lactâmicos (Kurylowicz et al., 1981).
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________________________
5
2.2. Ácido Clavulânico
Devido ao aumento da resistência de algumas bactérias aos antibióticos β-lactâmicos
ao longo dos anos, houve a necessidade de encontrar inibidores de β-lactamases para serem
utilizados em conjunto com esses antibióticos visando melhorar a sua eficiência. Atualmente,
pode-se citar como inibidores de β-lactamases o valclavan, as clavamicinas e o ácido
clavulânico, sendo todos do subgrupo “clavam” do grupo dos β-lactâmicos (Baggaley et al.,
1997).
O ácido clavulânico é formado pelos anéis β-lactâmico e oxazolidino, tal como visto na
Figura 2.2.
Figura 2.2. Fórmula estrutural do ácido clavulânico
O ácido clavulânico foi identificado como um inibidor de β-lactamase, através de
estudos realizados por Brown et al. (1976), pesquisadores da Glaxo SmithKline a partir de
culturas de Streptomyces clavuligerus. Estes estudos descrevem as quantidades mínimas de
ampicilina, na presença e na ausência de acido clavulânico, para o antibiótico agir efetivamente
contra uma colônia de bactérias produtoras de β-lactamases. No caso em que houve a adição
do inibidor de β-lactamase, observou-se a necessidade de uma concentração de 0,1 mg.L
-1
de
ampicilina para agir efetivamente e, no caso em que não houve a adição do ácido clavulânico,
a concentração necessária de antibiótico foi de 500 mg.L
-1
para se obter o mesmo resultado.
De acordo com Butterworth (1984), o ácido clavulânico possui uma baixa atividade
bactericida e é normalmente utilizado junto com outro antibiótico, geralmente uma penicilina.
Com isso, o ácido clavulânico é encontrado em medicamentos na forma de sais de metais
alcalinos, como o clavulanato de potássio, em conjunto com antibióticos, como a amoxicilina.
N
O
O
OH
O
OH
H
2
3
5
6
7
8
9
10
A
nel β lactâmico
_
Anel oxazolidino
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6
A amoxicilina, p-hidroxi-α-aminobenzilpenicilina, é um dos antibióticos mais largamente
utilizados devido ao fato de que a resistência bacteriana ao medicamento é limitada e também
é aplicado contra uma grande variedade de infecções bacterianas (Davidson, 1999). Ela é
análoga à ampicilina e também apresenta um amplo espectro de atividade antibacteriana
contra muitos organismos gram-positivos e gram-negativos. Como outros membros desta
classe de antibióticos, a amoxicilina exerce sua atividade biológica inibindo a biossíntese da
parede celular das células bacterianas. Infelizmente, a amoxicilina não é resistente à
penicilinase (β-lactamase) de forma que ela não é efetiva contra bactérias produtoras destas
enzimas segundo Davidson (1999).
Atualmente, a combinação de ácido clavulânico com amoxicilina é o mais bem
sucedido exemplo do uso de tradicionais antibióticos β-lactâmicos sensíveis às β-lactamases
juntamente com substâncias inibidoras dessas enzimas (Mayer e Deckwer, 1996).
2.3. Biossíntese
Devido à similaridade entre as estruturas químicas do ácido clavulânico e penicilinas e
cefalosporinas, também produzidas por Streptomyces clavuligerus, foi sugerido inicialmente
que estes antibióticos β-lactâmicos teriam um mesmo intermediário em comum (Butterworth,
1984).
Fawcet et al. (1976) apud Butterworth (1984), propôs que o tripeptídio δ(L-α-
aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina seria o precursor direto da biossíntese das cefalosporinas e
penicilinas, o que não pode ser aplicado ao ácido clavulânico devido às diferenças entre a sua
estrutura e dos demais antibióticos β-lactâmicos.
Vários estudos têm sido realizados para a elucidação da rota biossintética do ácido
clavulânico, tanto no que se refere aos precursores para formação dos anéis β-lactâmicos e
oxazolidino, assim como as enzimas envolvidas na biossíntese.
Elson et al. (1984) apud Butterworth (1984), sugeriram que parte da estrutura do ácido
clavulânico seria oriunda do ácido glutâmico, e o glicerol seria o precursor do anel β-lactâmico
(carbonos C5, C6 e C7 da Figura 2.2), sem qualquer rearranjo intermediário dos três carbonos.
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7
Gutman et al. (1985) propuseram que o ácido clavulânico seria oriundo da junção entre
a molécula de ácido β-hidroxipropiônico e de um aminoácido apropriado, que poderia ser o
ácido glutâmico ou a ornitina.
Romero et al. (1986) avaliaram a influência da arginina, do ácido glutâmico e da
ornitina na produção de ácido clavulânico e sugeriram que os três carbonos do anel β-lactâmico
seriam originários do glicerol e os carbonos C2, C3, C8, C9 e C10 seriam derivados da ornitina,
podendo esta ser sintetizada a partir da arginina ou do ácido glutâmico através do ciclo da
arginina.
Valentine et al. (1993) concluíram em seus trabalhos que os carbonos C2, C3, C8, C9 e
C10 são derivados da arginina. Baseando-se no fato de que um microrganismo incapaz de
produzir arginina, a partir da ornitina, não produz ácido clavulânico e concluíram então, que a
arginina seria o último precursor biossíntese de produção de ácido clavulânico.
Ives e Bushell (1997) descreveram em seus trabalhos que os carbonos C5, C6 e C7 do
ácido clavulânico seriam oriundos do piruvato, um produto resultante do metabolismo do
glicerol.
Pitlik e Towsend (1997) sugerem em seus estudos que o piruvato seria o último
precursor responsável pela formação dos carbonos C5, C6 e C7 ao invés do glicerol.
Bagalley et al. (1999), mostraram em seus estudos que a arginina é o precursor
imediato do acido clavulânico, juntamente com um composto de três carbonos, possivelmente
um intermediário da via glicolítica.
Os primeiros passos da biossíntese do AC foram finalmente elucidados em 1999, nos
estudos de Jensen et al. (Patente US 08/134,018). Esses autores utilizaram combinações de
técnicas genéticas e bioquímicas e descobriram os genes que codificam as enzimas envolvidas
no início da biossíntese. Em particular, a enzima carboxietilarginina sintetase (CEAS),
envolvida na condensação da arginina e que utiliza o gliceraldeído 3- fosfato como substrato
(Jensen et al., 2000).
Na Figura 2.3 estão representados os precursores e as enzimas envolvidas na
biossíntese do AC conhecidos até o momento.
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8
Figura 2.3. Rota biossintética do ácido clavulânico e outros clavams (Elkins et al., 2002)
CEAS: N-carboxietilarginina sintase, BLS: β-lactam sintetase, CAS: clavaminato sintase, PAH:
proclaminato amidino hidrolase, CAD: clavaldeído desidrogenase
2.4. Streptomyces clavuligerus
Streptomyces clavuligerus é uma bactéria filamentosa Gram-positiva, aeróbia estrita,
pertencente ao grupo dos actinomicetos, é predominantemente encontrada no solo
(Lechevalier, 1981), e a maioria das espécies do gênero Streptomyces cresce a uma
temperatura de 28 a 45ºC (Ballows et al., 1991).
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Esses microrganismos apresentam um ciclo de vida complexo, que inicia com a
germinação de esporos, dando origem a um micélio vegetativo formado por hifas ramificadas
(primárias) que penetram no substrato, metabolizando fontes orgânicas como polissacarídios,
proteínas, lipídios e compostos aromáticos (Balows et al., 1991) pela ação de enzimas
extracelulares (Padilla, 1998 apud Pamboukian, 2003). Do micélio vegetativo é originado o
micélio aéreo (hifas aéreas). As hifas aéreas passam por um processo de diferenciação
morfológica que pode incluir septação e formação de esporos. Nessa fase, ativa-se o
metabolismo secundário em que são produzidos principalmente antibióticos (Demain, 1989).
Romero et al. (1984) destacam que a característica mais importante da bactéria
filamentosa Streptomyces clavuligerus é a sua capacidade de produzir antibióticos. Atualmente,
sabe-se que esta bactéria é capaz de produzir cerca de 21 metabólitos secundários, incluindo
vários compostos β-lactâmicos como a penicilina N, a cefamicina C, a desacetoxicefalosporina
C e o ácido clavulânico.
Embora seja capaz de degradar compostos mais complexos, espécies de
Streptomyces necessitam somente de uma fonte de carbono orgânico, fonte de nitrogênio
inorgânico ou orgânico e alguns sais minerais (Balows et al., 1991). Também não requerem
vitaminas ou fatores de crescimento.
Os estreptomicetos, assim como outros actinomicetos, apresentam uma forma
característica de instabilidade genética. Várias características, como formação de micélio aéreo
e de esporos, produção de antibiótico e resistência, são irreversivelmente perdidas em uma
freqüência de 0,1 a 1% na progênie de colônias plaqueadas. A perda de função é resultado de
deleção de grandes regiões de DNA (Lancini e Lorenzetti, 1993 apud Inoue, 2001).
O metabolismo geral dos actinomicetos pode estar relacionado com as condições de
limitação de nutrientes dos solos, onde são freqüentemente expostos a várias situações de
desequilíbrio quanto à disponibilidade de nutrientes, variações de temperatura e dissecação.
Em resposta as variações ambientais a que estão sujeitos, estes microrganismos
desenvolveram estratégias como formação de esporos ou acúmulo de componentes de
reserva, com o intuito de permitir sua sobrevivência sob estas condições. As substâncias de
reserva servem como fonte de carbono e energia durante períodos de carência de nutrientes
que normalmente predominam nestes ambientes (Alvarez et al., 2002).
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10
Os triacilgliceróis são excelentes materiais de reserva devido as suas propriedades
hidrofóbicas, que permitem seu acúmulo em grandes quantidades na célula sem mudar a
osmolaridade do citoplasma, e a oxidação dos triacilgliceróis produz um maior rendimento de
energia em comparação com outros componentes de reserva tais como carboidratos e ácido
polihidroxialcanóico (PHA), desde que os átomos de carbono da metade acil dos triacilgliceróis
estejam na sua forma reduzida (Alvarez et al., 2002).
2.5. Regulação do Metabolismo Secundário
As atividades metabólicas associadas ao crescimento celular compõem o metabolismo
primário, onde os metabólitos produzidos (conhecidos como metabólitos primários) são
principalmente enzimas, ácidos orgânicos e etanol, entre outros. No entanto, em muitos
microrganismos, verifica-se a síntese de compostos não essenciais ao crescimento, os quais
são produzidos no final da fase de crescimento ou durante a fase estacionária, esses
compostos são denominados metabólitos secundários, sendo produzidos por diversos tipos de
microrganismos (Vining, 1986).
A produção de metabólitos secundários geralmente é maior em condições de limitação
de um ou mais nutrientes e os fatores envolvidos no controle do metabolismo secundário são
complexos e de pouca compreensão (Demain e Fang, 1995).
A biossíntese de metabólitos secundários está intimamente relacionada ao
metabolismo primário da célula produtora. Os precursores dos metabólitos secundários são,
usualmente, metabólitos primários normais ou modificados (Martín e Liras, 1986).
2.5.1. Regulação por Fonte de Nitrogênio
As fontes de nitrogênio usualmente favoráveis ao crescimento, como os sais de
amônio, apresentam efeito negativo sobre o metabolismo secundário (Fang e Demain,1995). A
presença de amônia ou íon amônio em quantidade suficientemente elevada, isto é, não
limitante, reprime as enzimas envolvidas na assimilação de outras fontes de nitrogênio, tais
como aminoácidos e uréia, entre outros (White, 1995).
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11
Butterworth (1984) relata que a farinha de soja é o nutriente mais importante na
biossíntese de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus.
Estudos realizados por Romero et al. (1984), indicam que concentrações acima de 10
mM de sais de amônio e ácido glutâmico reduziriam a biossíntese de ácido clavulânico por
Streptomyces clavuligerus. O uso de aminoácidos em meios de cultura foi sugerido para suprir
as necessidades de nitrogênio do microrganismo.
Em 1986, os mesmos autores realizaram estudos sobre a adição de ácido glutâmico,
arginina e ornitina em meios de cultura, onde se relata a baixa produção de ácido clavulânico
na presença de ácido glutâmico, em contraste com uma melhor produção observada na
presença de ornitina e arginina, em torno de 20 mg.L
-1
.
Lebrihi et al. (1992) estudaram a inibição da enzima valina desidrogenase por íons
amônio, na produção do antibiótico espiramicina por Streptomyces ambofaciens, verificando
que o aumento da concentração de íons amônio causava a inibição desta enzima, envolvida no
catabolismo de valina, leucina e isoleucina, aminoácidos que fornecem precursores para a
biossíntese do antibiótico em questão.
Mayer e Decker (1996) descreveram a utilização de meios de cultura com farinha de
soja ou extrato de farinha de soja como fontes de nitrogênio, na produção de ácido clavulânico.
Nos cultivos em que se utilizou extrato de farinha de soja, a produção teve início já na trofofase.
Já nos cultivos em que se utilizou farinha de soja, esta fonte mais complexa de nitrogênio fez
com que a produção se iniciasse mais tarde, no entanto, as concentrações finais de ácido
clavulânico foram superiores.
Jones et al. (1997) descreveram a não ocorrência de produtos oriundos de
metabolismo secundários em cultivos de Streptomyces clavuligerus quando este é realizado
sob condições de limitação de nitrogênio.
Valentine et al. (1999) descrevem em seus estudos o acúmulo de uréia oriunda da
biossíntese do AC, mas também de outras fontes e que a presença de amônia em quantidades
elevadas reprime as enzimas envolvidas na produção de AC.
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12
2.5.1.1. Metabolismo dos Aminoácidos e o Ciclo da Uréia
Os aminoácidos livres originam-se da degradação das proteínas celulares e, na sua
maioria são desaminados por transaminação, que é a transferência do seu grupo amino a um
α-cetoácido para produzir o α-cetoácido do aminoácido original e um novo aminoácido. O
grupo aceptor predominante é o α-cetoglutarato, produzindo glutamato e o novo α-cetoácido.
As enzimas que catalisam a reação são as transaminases. O glutamato é desaminado
oxidativamente produzindo amônia e regenerando o α-cetoglutarato para uso em reações
adicionais (Voet et al., 2000)
Os aminoácidos são degradados a compostos que podem ser metabolizados até CO
2
e
H
2
O, ou usados na glicogênese.
Os aminoácidos padrões podem ser divididos em dois grupos, tendo como base suas rotas
metabólicas:
a) Aminoácidos glicogênicos, os quais são degradados a piruvato, α-cetoglutarato,
succinil-CoA, fumarato ou oxaloacetato, sendo, portanto, precursores da glicose
b) Aminoácidos cetogênicos, os quais são degradados a acetil-CoA ou acetoacetato e
podem, então, ser convertidos em ácidos graxos ou em corpos cetônicos
Alguns aminoácidos são precursores tanto de carboidratos como de corpos cetônicos. A
demonstração dos principais produtos da degradação de aminoácidos está ilustrada na Figura
2.4.
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13
Figura 2.4. Degradação de aminoácidos (Voet et al., 2000)
As principais vias do metabolismo de ácidos graxos e carboidratos, a β-oxidação e a
glicólise, respectivamente, são gerais para todos os organismos, o que nem sempre acontece
com o metabolismo dos aminoácidos em função de suas múltiplas e complexas rotas
metabólicas.
No geral, os organismos vivos excretam o excesso de nitrogênio proveniente da quebra
metabólica de aminoácidos valendo-se de uma entre três maneiras possíveis: podem
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simplesmente excretar amônia; ou converter a amônia em produtos menos tóxicos, como a
uréia e ácido úrico (Voet et al., 2000).
No ciclo da uréia são convertidos dois grupos amino, um da amônia e outro proveniente
do aspartato, e um átomo de carbono proveniente do CO
2
ao produto relativamente atóxico,
que é a uréia, conforme demonstrado na Figura 2.5.
As atividades das enzimas do ciclo da uréia são controladas pelas concentrações de
seus substratos, e quando uma delas se torna deficiente, o substrato correspondente é
acumulado, aumentando a velocidade da reação deficiente de maneira que a velocidade de
produção de uréia seja normal. No entanto, o acúmulo anômalo de substrato é aumentado ao
longo de todas as etapas do ciclo até a amônia, resultando numa alta concentração desse
composto. Já a ausência total de alguma enzima reguladora do ciclo da uréia é letal (Voet et
al., 2000).
O ciclo da uréia não é comum em procariotos e é requerido para remover a amônia das
células nas concentrações em que esta é tóxica para as mesmas. Em 1996, Mendez e Hazell
verificaram a presença e atividade das enzimas envolvidas no ciclo da uréia em suspensões
celulares, preparados de lisados e membranas da bactéria Helicobacter pylori, sugerindo que
esta bactéria usa o ciclo da uréia como um mecanismo efetivo para excretar o excesso de
nitrogênio do interior delas.
Romero et al. (1986), reportaram a atividade de arginase em Streptomyces
clavuligerus, sugerindo a existência do ciclo da uréia. Os autores indicam que o ciclo da uréia
promove a biossíntese de arginina, que é usada como precursora na biossíntese de ácido
clavulânico.
Valentine et al. (1999) detectaram o acúmulo de uréia em caldos de fermentação para
produção de ácido clavulânico, e mencionaram a ocorrência de dois picos no perfil de pH
durante os cultivos: primeiramente pela desaminação de aminoácidos que acarreta liberação
de amônia, e o segundo pico corresponderia a desrepressão da enzima urease, que converte a
uréia em amônia, elevando novamente o pH do meio de cultura.
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Figura 2.5. Ciclo da uréia (Voet et al., 2000)
Enzimas: (1) carbamoil-fosfato-sintetase, (2) ornitina transcarbamoilase, (3) arginino
succionato-sintetase (4) arginino succinase e (5) arginase.
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2.5.2. Regulação por Fonte de Fosfato
A importância da presença de fosfato no meio de cultura reside no fato de que este
nutriente controla a síntese de ácidos nucléicos (DNA, RNA) e proteínas, o metabolismo de
carboidratos, a respiração celular e os níveis de ATP (Martín, 1977 apud Inoue, 2001).
Geralmente a sua fonte principal são os fosfatos inorgânicos, mas os microrganismos
também podem metabolizar alguns compostos orgânicos que contém fosfato (Moo-Young,
1985).
A presença de níveis elevados de fosfato no meio favorece o crescimento celular,
influenciando de forma negativa a síntese de metabólitos secundários, limitando a síntese de
indutores das vias biossintéticas de antibióticos.
Lebrihi et al. (1987) estudaram a influência do fosfato na produção de cefamicina C e
ácido clavulânico e verificaram a repressão pelo fosfato, dos sistemas enzimáticos de
biossíntese de ácido clavulânico e cefamicina C pelo fosfato.
2.5.3. Regulação por Fonte de Carbono
A glicose, que é uma eficiente fonte de carbono para crescimento microbiano, tem
efeito negativo sobre a síntese de diversos metabólitos secundários (Vining, 1986). Fontes de
carbono e energia de fácil assimilação favorecem o crescimento celular e os produtos do
catabolismo acabam por reprimir as enzimas responsáveis pela biossíntese de metabólitos
secundários (Drew e Demain, 1977). Polissacarídeos, oligossacarídeos e óleos constituem,
freqüentemente, fontes de carbono mais eficientes para a produção destes metabólitos (Inoue,
2001).
Zhang e Demain, (1992) relatam que uma peculiaridade do Streptomyces clavuligerus
é a sua incapacidade de assimilar glicose. Tal fato é devido à incapacidade deste
microrganismo de transportá-la através de sua membrana.
Diversos estudos têm sido realizados utilizando outras fontes de carbono e energia
como o glicerol, óleos e amido para a síntese de antibióticos utilizando este microrganismo.
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2.5.3.1. Óleos como Fonte de Carbono
Óleos são fontes de carbono de lenta assimilação, além de constituírem uma eficiente
fonte de energia (Stanbury et al., 1995).
Lipídios e óleos são considerados componentes essenciais do meio na indústria de
antibióticos porque possuem propriedades naturais como antiespumantes, por apresentarem-
se como uma fonte alternativa de carbono e, segundo Large et al. (1999), também podem
aumentar a produção de metabólitos secundários.
Diversos pesquisadores tentaram elucidar a atuação dos óleos e seus ácidos graxos na
produção de antibióticos.
Maccarty et al. (1955) estudaram os efeitos de óleos e ácidos graxos na produção de
fungicromina por Streptomyces cellulosae. Ao realizarem experimentos em incubador rotativo,
verificaram que quando o meio de cultivo apresentava glicose como fonte de carbono, a
produção de antibiótico foi de aproximadamente 100 mg.L
-1
e quando utilizaram óleo de soja na
mesma concentração, a concentração final de antibiótico foi de 1000 mg.L
-1
, no entanto, o uso
simultâneo de óleo de soja e glicose resultou em uma concentração final de antibiótico de
aproximadamente 2000 mg.L
-1
. Nos ensaios em fermentador, foi possível acumular produto
somente quando foram utilizados glicose e óleo de soja, simultaneamente. Quanto aos ácidos
graxos insaturados, os autores concluíram que o ácido linoléico e o ácido ricinoléico foram
tóxicos nas condições empregadas e que somente o ácido oléico e seus ésteres foram efetivos
na substituição do óleo de soja. Dentre os ácidos graxos saturados, apenas o ácido palmítico
foi eficaz no aumento de produção, quando resultou num acúmulo de 600 mg.mL
-1
do
antibiótico fungicromina.
Park et al. (1994a), estudaram a influência do óleo de soja na produção de cefamicina
C por Streptomyces sp P6621, e observaram que elevadas concentrações iniciais de óleo de
soja resultavam numa baixa produção, obtendo a máxima produção de cefamicina C
(1,99 g.L
-1
) na menor concentração inicial de óleo estudada (7 g.L
-1
), que os autores
relacionaram com o acúmulo de ácidos graxos livres no meio.
Park et al. (1994b) relatam que os produtos de decomposição do óleo de soja (glicerol
e ácidos graxos insaturados) podem ser parcialmente consumidos pelas células e grande parte
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é acumulada, agindo como inibidores na produção de Cefamicina C. Os autores identificaram o
ácido linoléico como o mais tóxico para o microrganismo. Verificaram que concentrações de
ácido linoléico acima de 0,2 g.L
-1
inibiam completamente o crescimento celular. Com isso,
obtiveram uma linhagem mutante de Streptomyces sp com tolerância a concentrações maiores
de ácido linoléico, verificando nos ensaios realizados uma produção 55% maior do que aquela
resultante da linhagem selvagem.
Lee & Ho (1996), estudaram a utilização de várias fontes de carbono na produção de
ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064), onde foi verificada
uma maior produtividade de ácido clavulânico na presença de óleo de palma, como fonte de
carbono e energia, na composição do meio de cultura.
Inoue (2001) estudou a influência da concentração inicial de óleo de soja e de seus
principais ácidos graxos na produção de salinomicina através de fermentação submersa de
Streptomyces albus. O autor constatou que nas condições iniciais empregadas (6,10,12%
(p/v)), não foi verificada diferença significativa no crescimento celular e na concentração final
do antibiótico, mas constatou que na concentração inicial de 6%, a quantidade de óleo
consumido foi aproximadamente 16% menor em relação às demais concentrações iniciais,
levando a um maior fator de conversão global de óleo em salinomicina.
Maranesi et al. (2005) estudou a influência de óleos vegetais (soja, milho e girassol)
na produção de AC por S. clavuligerus em incubador rotativo verificando melhores resultados
em termos de produção e produtividade em ácido clavulânico quando utilizou óleo de soja. Em
seus experimentos, atingiu a produção de 722 mg.L
-1
de ácido clavulânico em 120 horas de
cultivo quando o meio de cultura continha 23 g.L
-1
óleo de soja e glicerol como fonte de
carbono suplementar.
2.5.3.2. Metabolismo dos Lipídios
Os lipídios são substâncias caracterizadas pela baixa solubilidade em solventes
polares, e alta solubilidade em solventes apolares. São vulgarmente conhecidos como
gorduras e suas propriedades físicas estão relacionadas com a natureza hidrofóbica de suas
estruturas, sendo todos sintetizados a partir da acetil-CoA.
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São encontradas diversas classificações para os lipídios na literatura especializada,
entretanto, todas as classificações propostas baseiam-se em características comuns às
diversas moléculas de lipídios existentes na natureza. Uma das classificações existentes seria
quanto à presença ou não de ácidos graxos na sua composição.
Os lipídios com ácidos graxos em sua composição são saponificáveis, pois reagem
com bases formando sabões. São as biomoléculas mais energéticas, fornecendo acetil-CoA
para o ciclo de Krebs.
Os acilgliceróis (compostos com uma a três moléculas de ácidos graxos esterificados
ao glicerol) e os fosfolipídios são os principais representantes deste grupo, seguidos por ceras,
esfingolipídios e glicolipídios.
Os lipídios que não contêm ácidos graxos em sua composição não são saponificáveis.
As vitaminas lipossolúveis e o colesterol são os principais representantes destes lipídios que
não são energéticos porém desempenham funções fundamentais no metabolismo.
Os lipídios apresentam diversas funções biológicas: são elementos estruturais, atuam
como modificadores de proteínas, constituem reserva enérgica e derivados de ácidos graxos
atuam como hormônios ou mensageiros intracelulares (Stryer, 1996). Os triglicerídios
constituem fonte de energia bastante concentrada, pois se encontram na forma anidra e em
baixo grau de oxidação (Stryer, 1996). A combustão completa de um óleo típico leva à
liberação de 8880 kcal/kg de óleo, enquanto a oxidação de glicose leva à liberação de 3722
kcal/kg (Bader et al, 1984).
Os ácidos graxos presentes nos sistemas biológicos apresentam, em geral, um número
par de átomos de carbono, sendo mais comuns os ácidos graxos com 16 a 18 átomos de
carbono (Stryer, 1996). Alguns exemplos são apresentados na Tabela 2.1.
Revisão Bibliográfica
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Tabela 2.1. Alguns exemplos de ácidos graxos, com seus nomes comuns e fórmulas adaptada
de Stryer (1996).
Átomos de
Carbono
Ligações
Duplas
Nome Comum Fórmula
12 0 Ácido Láurico CH
3
(CH
2
)
10
COOH
14 0 Ácido Mirístico CH
3
(CH
2
)
12
COOH
16 0 Ácido Palmítico CH
3
(CH
2
)
14
COOH
18 0 Ácido Esteárico CH
3
(CH
2
)
16
COOH
16 1 Ácido Palmitoleico CH
3
(CH
2
)
5
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
18 1 Ácido Oléico CH
3
(CH
2
)
7
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
18 2 Ácido Linoléico CH
3
(CH
2
)
4
(CH=CHCH
2
)
2
(CH
2
)
6
COOH
18 3 Ácido Linolênico CH
3
CH
2
(CH=CHCH
2
)
3
(CH
2
)
6
COOH
20 4 Ácido Araquidônico CH
3
CH
2
(CH=CHCH
2
)
4
(CH
2
)
2
COOH
As propriedades dos ácidos graxos dependem do comprimento da cadeia, do seu grau
de saturação e da presença ou não de ramificações. Os ácidos graxos insaturados apresentam
menor ponto de fusão que os ácidos saturados com mesmo comprimento de cadeia. Os ácidos
graxos de cadeia menor apresentam menor ponto de fusão, assim como os ácidos graxos de
cadeia ramificada (White, 1995; Stryer, 1996).
A maioria dos triglicerídios naturais são mistos, isto é, apresentam dois ou três
diferentes ácidos graxos por molécula.
Para que o lipídio seja utilizado como fonte de energia e carbono, é preciso que ocorra
a hidrólise do triacilglicerol pela ação de lipases.
O glicerol liberado na hidrólise é fosforilado e oxidado à dihidroxiacetona fosfato, que
então é isomerizado à gliceraldeído 3-fosfato. Este é um intermediário da vias glicolítica e
glicogênica. Então o glicerol pode ser convertido à glicose ou piruvato, desde que em presença
de enzimas apropriadas. O processo inverso também pode ocorrer, glicerol e intermediários
glicolíticos são prontamente interconvertidos (Voet et al., 2000).
Os ácidos graxos liberados na hidrólise do triacilglicerol são degradados numa
seqüência de quatro reações, conhecida como β-oxidação.
Primeiramente ocorre a ativação do ácido graxo, numa reação ATP-dependente,
catalisada pela acil-coA sintetase, formando a Acil-CoA graxa.
Revisão Bibliográfica
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21
A Acil-CoA graxa formada é então degradada via β-oxidação, conforme demonstrado
na Figura 2.6. A degradação ocorre de 2 em 2 carbonos e o produto obtido pode ser submetido
a ciclos subseqüentes até que se complete a oxidação.
A primeira reação da degradação é a oxidação da Acil-CoA graxa catalisada pela
flavoenzima Acil-CoA desidrogenase, levando a formação do enoil-CoA com uma ligação dupla
trans entre os carbonos α e β.
O próximo passo é a hidratação da dupla ligação entre os carbonos α e β pela enoil-
CoA hidratase para formar a L-3-hidroxiacil-CoA.
A reação de oxidação pela L-3-hidroxiacil desidrogenase converte o grupo hidroxila do
carbono β num grupo cetônico com geração de NADH.
Na última reação da β-oxidação, ocorre a clivagem entre os carbonos α e β numa
reação de tiólise com CoA, catalisada pela β-cetoacil-Coa tiolase para formar acetil-CoA e uma
nova Acil-CoA contendo dois carbonos a menos que no início da β-oxidação.
Ácidos graxos insaturados (tais como o oléico) são submetidos às mesmas reações até
que se forme o cis-∆
3
enoil-CoA que é então isomerizado a trans-∆
2
enoil-CoA pela ação de
hidratase específica (Meirelles, 1997).
Revisão Bibliográfica
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22
Figura 2.6. β- oxidação da Acil-Coa graxa (Voet et al., 2000)
Revisão Bibliográfica
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23
2.5.3.3. Lipases
Para investigar a ligação entre os lipídios exógenos na fermentação e os precursores
na síntese de antibióticos é preciso obter informações sobre as enzimas envolvidas no
metabolismo dos lipídios.
Lipases (glicerol éster hidrolase EC 3.1.1.3) são enzimas capazes de catalisar a
hidrólise de ligações éster de triacilgliceróis de cadeias longas de ácidos graxos, formando
ácidos graxos livres, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol (Brocherhoff e Jensen, 1974,
apud Meirelles, 1997).
Figura 2.7. Reação de hidrólise do triacilglicerol catalisada por lipases (Stryer, 1996)
Uma vez incorporados pelas células, os ácidos graxos entram no ciclo de β-oxidação para
liberar acetil ou propionil coenzima A (CoA), que são precursores na formação de muitos antibióticos.
Ainda, tal processo de hidrólise libera gradativamente moléculas de glicerol, que são consumidas
como fonte de carbono e energia sem a ocorrência de repressão catabólica (Large et al , 1999).
As lipases atuam na interface óleo – água, onde o primeiro substrato (S) reage com a
enzima (E
s
*) num passo de acilação para formar uma acil-enzima (E*) e o primeiro produto (P). O
segundo substrato (S
w
), que geralmente é a água, então reage com a acil-enzima numa etapa de
desacilação para formar o produto (P
w
) e a enzima livre. A representação da atuação das lipases está
expressa na Figura 2.8.
Revisão Bibliográfica
___________________________________________________________________
24
Figura 2.8. Atuação da lipase (Muralidhar et al., 2002)
(E: lipase dissolvida inativa; E*: lipase dissolvida ativa; E
s
*: lipase adsorvida ativa; E
is
*: lipase
adsorvida inativa; S
w
: substrato solúvel em água; S: substrato insolúvel em água; E*S
w
e E
s
*S:
complexos lipase-substrato; Pw e P: produto na fase aquosa e lipídica, respectivamente).
Devido as lipases agirem na interface óleo-água, a velocidade de hidrólise é uma função
direta da área superficial da interface. Em microrganismos onde a atividade da lipase está associada à
célula, a interface seria a própria superfície celular e os ácidos graxos poderiam ser transportados
diretamente para o interior da célula. Sob estas condições, não haveria acúmulo de ácidos graxos no
caldo fermentativo, reduzindo os problemas de toxidade.
O pH ótimo de atuação das lipases microbianas é entre 5,6 e 8,5 (Alford & Pierce, 1961), e
a maioria das lipases tem temperatura ótima entre 30 e 40ºC. Nos ensaios de Large et al. (1999), foi
verificada a máxima atuação da lipase de Streptomyces clavuligerus em pH 7,4, sob condições de
temperatura constante a 28ºC.
Em termos de química enzima-substrato, a atividade das lipases pode ser dividida em
tiposeletividade (habilidade para hidrolisar um tipo particular de éster de ácido graxo),
regioseletividade (habilidade para hidrolisar grupos éster carboxílicos nas posições sn-1 e sn-3
quando comparadas com a posição sn-2) e estereoseletividade (habilidade para diferenciar dois
enantiomeros num substrato racêmico).
Revisão Bibliográfica
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25
Os mecanismos envolvidos na indução da atividade das lipases foram amplamente
estudados (Gilbert et al., 1991). Sabe-se que, qualquer que seja o microrganismo envolvido ou
a localização da lipase, a fonte de carbono é essencial para a atividade da enzima, estimulando
ou inibindo esta atividade. Gilbert et al. (1999) relata ainda que na composição do meio de
cultura, a fonte de carbono a base de lipídios mostrou-se necessária para a produção de
lipases, embora seu papel na síntese e estimulação destas enzimas não seja ainda bem
entendido.
Nos estudos de Large et al. (1999), a atividade das lipases em Streptomyces clavuligerus foi
detectada somente na presença de óleos. Os estudos ainda mostraram que se somente lipídio for
usado como fonte de carbono, a atividade das lipases é detectada imediatamente, diferentemente da
situação na qual o meio de produção não contém óleos, em que nenhuma atividade foi detectada,
sugerindo, assim, que óleos induzem a síntese ou estimulam a atividade das lipases.
Peacock et al. (2003), também verificaram esse comportamento em cepas de Streptomyces
lividans quando estudaram a produção do antibiótico actinorhodin utilizando glicose e trioleína como
fontes de carbono.
A atividade das lipases é um fator importante para o desempenho do processo, pois, quando
elevada, leva ao acúmulo de ácidos graxos livres no meio, os quais, acima de determinada
concentração, podem levar à inibição do crescimento e da produção (Park et al., 1994).
Com base nas informações da literatura citada quanto ao emprego de lipídios em
caldos de fermentação para produção de diversos metabólitos secundários, o estudo do cultivo
em batelada de Streptomyces clavuligerus para a produção de AC empregando essa fonte de
carbono aliada à concentração ideal de fontes de nitrogênio presentes no meio de cultura de
produção representa uma grande contribuição para o estudo do processo de produção deste
importante fármaco.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado neste trabalho foi Streptomyces clavuligerus ATCC 27064,
conservado na forma de células vegetativas a –70°C e suspensas em solução crioprotetora
contendo 10% v/v de glicerol.
3.1.2. Meios de Cultura
3.1.2.1. Meio de Cultura de Reativação
Em todos os ensaios foi utilizado o meio de cultura de reativação proposto por Rosa et
al. (2001), descrito na Tabela 3.1. O pH foi ajustado em 6,8 e o meio de cultura foi esterilizado
a 121ºC por 15 minutos.
Tabela 3.1. Meio de cultura para reativação do microrganismo
Concentração
Glicerol (g.L
-1
) 15
Peptona bacteriológica (g.L
-1
) 10
Extrato de levedura (g.L
-1
) 1
Extrato de malte (g.L
-1
) 10
MOPS (g.L
-1
) 21
K
2
HPO
4
(g.L
-1
) 2,5
MgSO
4
.7H
2
0 (g.L
-1
) 0,75
Solução de sais
(1)
(1mL.L
-1
) 1
(1)
Composição (g.L
-1
):
MnCl
2
.4H
2
O, 1,0; FeSO
4
.7H
2
O, 1,0; ZnSO
4
.7H
2
O, 1,0; água
destilada, q.s.p 1L.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
27
3.1.2.2. Meios de Cultura de Produção
A) Ensaios Preliminares em Mesa Incubadora Rotativa
Inicialmente foram utilizados quatro meios de cultura de produção para verificar a influência
da fonte e da concentração de nitrogênio, na produção de ácido clavulânico por Streptomyces
clavuligerus (Tabela 3.2). O pH de cada meio de cultura foi ajustado em 6,8 e, então, estes
foram esterilizados a 121ºC por 15 minutos.
Tabela 3.2. Meios de cultura de inóculo e produção para avaliação da fonte e da concentração
de nitrogênio.
BS1 BS2 BS3 BS4
(1)
Farinha de soja desengordurada (NT g.L
-1
) 1,6 3,2 - -
Samprosoy 90NB - - 1,6 3,2
Glicerol (g.L
-1
) 10 10 10 10
Óleo de soja (g.L
-1
) 23 23 23 23
MOPS (g.L
-1
) 21 32,5 21 32,5
(2)
Solução de sais (10 mL.L
-1
) 1 1 1 1
K
2
HPO
4
(g.L
-1
) 1,2 1,2 1,2 1,2
(1)
Composição em nitrogênio total,
(2)
Composição vide Tabela 3.1
Como a farinha de soja desengordurada utilizada nestes ensaios apresenta em sua
composição 50% p/p de proteína total e o hidrolisado protéico de soja, 92% p/p, foi fixada a
concentração de nitrogênio total em 1,6 g.L
-1
para os meios de cultura BS1 e BS3; e para os
meios de cultura BS2 e BS4, essa concentração foi fixada em 3,2 g.L
-1
.
Este procedimento foi adotado para garantir que os resultados em termos de produção de
ácido clavulânico fossem exclusivamente em função da fonte e concentração de nitrogênio
total empregados nos meios de cultura.
Numa segunda etapa, foram realizados dois ensaios em mesa incubadora rotativa, para
avaliar a influência de concentração de lipídios na produção de ácido clavulânico. Nestes
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
28
ensaios, os meios de cultura de inóculo foram iguais ao do meio de cultura BS1. Após
preparação do meio de cultura, o pH foi ajustado em 6,8, com posterior esterilização a 121ºC
por 15 minutos. As composições dos meios de cultura de produção dos ensaios BS5 e BS6
estão descritos na Tabela 3.3.
Tabela 3.3. Meios de cultura de produção para avaliação da concentração de óleo de soja
utilizado como fonte de carbono.
BS5 BS6
(1)
Farinha de soja desengordurada (NT g.L
-1
) 1,6 1,6
Glicerol (g.L
-1
) 10 10
Óleo de soja (g.L
-1
) 16 30
MOPS (g.L
-1
) 21 21
(2)
Solução de sais (10mL.L
-1
) 1 1
K
2
HPO
4
(g.L
-1
) 1,2 1,2
(1)
Composição em nitrogênio total,
(2)
Composição vide Tabela 3.1
B) Ensaios em Biorreator de Bancada
Foram realizados seis cultivos em biorreator convencional de bancada, sendo que os
meios de cultura de inóculo e produção estão representados na Tabela 3.4. Esses cultivos
tiveram o objetivo de se avaliar a influência da concentração de nitrogênio e de lipídios em
condições de agitação e aeração que assegurassem boa mistura ao meio reacional bem como
suficiência de oxigênio aos microrganismos.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
29
Tabela 3.4. Meios de cultura de inóculo e de produção para avaliação das concentrações da
fonte de nitrogênio e de óleo de soja utilizado como fonte de carbono.
BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF6
(1)
Farinha de soja desengordurada (NT g.L
-1
) 1,6 2,4 3,2 2,4 1,6 3,2
Glicerol (g.L
-1
) 10 10 10 10 10 10
Óleo de soja (g.L
-1
) 23 23 23 16 16 16
(3)
MOPS (g.L
-1
) 21 21 21 21 21 21
(2)
Solução de sais (10mL.L
-1
) 1 1 1 1 1 1
K
2
HPO
4
(g.L
-1
) 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
(4)
Anti-espumante (g.L
-1
) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
(1)
Composição em nitrogênio total,
(2)
Composição vide Tabela 3.1,
(3)
utilizado somente
na etapa de inóculo,
(4)
utilizado somente na etapa de produção.
3.2. Equipamentos
3.2.1. Câmara Asséptica
Para garantir uma manipulação asséptica do microrganismo, foi utilizada uma câmara
asséptica de fluxo laminar da marca VECO, contendo um bico de Bunsen e lâmpada germicida
UV, em todas as etapas em que se fizeram necessárias.
3.2.2. Autoclaves
Alguns materiais envolvidos na realização dos processos de fermentação, tais como
meio de cultura, soluções e suspensões diversas, vidraria, reator, etc., foram esterilizados em
autoclaves marca FABBE, por 15 minutos a 121°C.
3.2.3. Ultrafreezer
As amostras para análise de ácido clavulânico e glicerol bem como os criotubos
contendo os microrganismos foram armazenados em um biofreezer FORMA SCIENTIFIC a
uma temperatura de –70°C.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
30
3.2.4. Mesa Incubadora Rotativa
Ensaios preliminares, bem como as etapas de reativação e crescimento do
microrganismo, foram realizados em mesa incubadora rotativa marca NEW BRUNSWICK
SCIENTIFIC, INC., modelo G-25 com controles de temperatura e de freqüência de rotação.
3.2.5. Centrífuga Refrigerada
As amostras dos cultivos foram centrifugadas em centrífuga com refrigeração modelo
5403 da marca EPPENDORF, com capacidade para seis tubos, podendo conter até 35 mL
cada um.
3.2.6. Medidor de pH
Os valores de pH foram medidos com o uso de pH-metro de bancada marca ORION
YSP710.
3.2.7. Reômetro
Para as medidas reológicas foi utilizado o reômetro LV-DVIII+ de cilindros concêntricos
marca BROOKFIELD ENGINEERING.
3.2.8. Biorreator de Bancada
Os experimentos foram realizados em biorreator de bancada da NEW BRUNSWICK
SCIENTIFIC, INC., modelo BIOFLO III com 4L de volume útil, com controle de temperatura, pH,
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
31
oxigênio dissolvido e rotação, bem como rotâmetro para aeração e bombas para a alimentação
de meio de cultivo, adição de antiespumante e soluções de ácido e de base.
3.2.9. Cromatógrafo
Para a realização das análises de glicerol e ácido clavulânico foram utilizados dois
sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência da marca WATERS.
A) Análise de glicerol: Sistema contendo duas bombas modelo 510, refratômetro W410 e injetor
Rheodyne 7125.
B) Análise de ácido clavulânico: Sistema com duas bombas modelo 515, detector PDA W996,
injetor automático com controle de temperatura modelo W717Os.
3.3. Metodologia Analítica
3.3.1. Análise da Concentração de Ácido Clavulânico
A) Método Espectrofotométrico (Bird et al., 1982)
A concentração de ácido clavulânico foi analisada através do método químico
proposto por Bird et al. (1982). O método consiste na análise espectrofotométrica (λ=311 nm)
do produto da derivatização de ácido clavulânico com imidazol.
O procedimento experimental foi o seguinte:
• Foram preparadas duas soluções diferentes (A e B) em tubos de ensaio, com uma dada
amostra.
Solução A: adicionou-se 5 mL solução de imidazol (6 g em 100 mL, pH 6,8) a 1
ml de amostra, sendo o branco composto pela solução resultante da mistura de 5 mL de
imidazol e 1 mL de água.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
32
Solução B: adicionou-se 5 mL de água destilada a 1 mL de amostra, sendo o
branco a água destilada.
• As soluções foram aquecidas por 15 min a 30°C.
•
Resfriou-se as soluções e mediu-se as absorbâncias (λ=311 nm) das soluções A e B.
É importante ressaltar que a relação entre as diferenças de absorbâncias e a
concentração de ácido clavulânico é linear até 50 mg.L
-1
. Logo, as amostras tiveram que ser
diluídas adequadamente para ficarem dentro desta faixa.
Para obtenção da curva de calibração, ilustrada na Figura 3.1, foram preparadas soluções
padrões de clavulanato de potássio de 10, 20, 30, 40 e 50 mg.L
-1
. Os valores experimentais de
concentração de ácido clavulânico (C
AC
) e de diferenças de absorbância (Abs) foram
relacionados por regressão linear, obtendo-se a seguinte equação de calibração (Equação 3.1):
C
AC
(mg.L
-1
) = 42,277* Abs + 0,1197 (R
2
= 0,9996) 3.1
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
10
20
30
40
50
Concentração de AC (mg.L
-1
)
Absorbância
Figura 3.1. Curva de calibração para determinação da concentração de AC
Procedendo-se experimentalmente da mesma forma para as amostras, pôde-se obter
os respectivos valores de concentração de ácido clavulânico (C
AC
) ao longo dos cultivos.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
33
As amostras antes de serem analisadas foram submetidas à centrifugação a 4°C e
11000 rpm por 15 minutos, e a análise das mesmas se deu a partir do sobrenadante obtido.
B) Método Cromatográfico (Foulstone e Reading, 1982)
Esse método baseia-se na determinação de um composto oriundo da derivatização
do ácido clavulânico com imidazol, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Para a separação do composto derivatizado utilizou-se, como fase estacionária, uma
coluna C-18 µ-Bondapak de 300 mm da Waters e uma fase móvel composta de 6% (v/v) de
metanol e 94% (v/v) de tampão fosfato (0,1 M de KH
2
PO
4
; pH=3,2), a uma vazão de 1,0
mL.min
-1
. Os picos foram detectados no comprimento de onda de 311 nm e tempo de retenção
próximo à 5 minutos. As concentrações de ácido clavulânico foram determinadas a partir de
uma curva de calibração obtida de solução estoque 50 mg.L
-1
de clavulanato de potássio em
água (50, 75 e 100% v/v), oriundo do medicamento CLAVULIN
®
da Glaxo SmithKline
Farmacêutica, disponível comercialmente.
Adotou-se o seguinte procedimento para cada amostra:
• A amostra foi centrifugada a 4°C e 11000 rpm por 15 minutos, e o
sobrenadante obtido foi congelado a -70°C para análise após o término do cultivo.
• Após o término do cultivo, descongelou-se as amostras, dilui-se em tampão
acetato (pH 4,5, 1:2) e novamente centrifugou-se a 4°C, 11000 rpm por 15 minutos, para
retirada de sólidos em suspensão.
• Retirou-se uma alíquota de 0,5 mL da amostra e adicionou-se a 0,5 mL de
imidazol ( 8,25 g em 50 mL, pH 6,8).
• A mistura reacional foi aquecida por 15 min a 30°C.
• Após a reação, a solução foi filtrada em membranas de 0,22 µm.
• Colocou-se os tubos das amostras e da curva padrão no carrossel do
cromatógrafo, sendo o sistema previamente estabilizado, no mínimo com 4 horas de
antecedência.
• Os picos foram detectados a 311 nm e, de posse da curva padrão gerada,
obteve-se os valores de concentração de ácido clavulânico para cada amostra.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
34
C
AC
(mg.L
-1
) = 2,71.10
-4
* Área do pico (R
2
= 0,999) 3.2
3.3.2. Análise de Glicerol
O glicerol foi quantificado também por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC),
utilizando-se uma coluna Shodex KS 802 Lonpak (WATERS), água Milli-Q como fase móvel e
um refratômetro como detector. O equipamento foi operado a 80º C com uma vazão de 1
mL.min
-1
. A curva de calibração foi obtida com solução de glicerol em água com concentrações
crescentes até 1 g.L
-1
. As amostras analisadas foram diluídas em água para ficarem nesta faixa
de concentração e filtradas em membranas de 0,22 µm de diâmetro de poro.
3.3.3. Avaliação do Crescimento Celular
Devido à existência de sólidos insolúveis no meio de cultura, a concentração celular
foi avaliada indiretamente a partir de medidas reológicas do caldo fermentativo utilizando um
reômetro BROOKFIELD ENGINEERING modelo LV-DVIII+. Com os dados obtidos e da relação
entre a tensão (τ) e a velocidade de cisalhamento (γ), dada pela equação 3.3, pôde-se traçar
gráficos de τ por γ e, através de um método de regressão não linear, determinar K (índice de
consistência) e n (índice de comportamento de escoamento), que são os parâmetros utilizados,
neste caso, para se avaliar o crescimento celular a partir de correlações entre essas duas
variáveis.
n
K.
γτ
=
3.3
De posse dos valores de K, que é diretamente proporcional à concentração celular,
(Cx), é possível se ter uma estimativa do crescimento microbiano, isto é, quanto maior o valor
de K, maior a concentração celular.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
35
3.3.4. Determinação da Concentração de Lipídios
Os lipídios totais presentes no meio de produção foram quantificados pelo método
baseado na reação da sulfofosfovanilina (Postma e Stroes,1968). Neste método, os lipídios da
amostra reagem com ácido sulfúrico, formando o íon “carbonium”, que reage com o
grupamento carbonil ativado do reagente de cor (acido fosfórico e vanilina), produzindo um
complexo de cor rosa, estabilizado por ressonância, cuja absorbância medida em 537 nm é
diretamente proporcional à concentração de lipídios na amostra.
O procedimento consistiu em adicionar a tubos de ensaio com 0,2 mL de amostra, 4
mL de ácido sulfúrico concentrado. Essa mistura foi homogeneizada e colocada em banho
fervente por 10 minutos, seguido de resfriamento em água gelada por mesmo período. A
mistura foi novamente homogeneizada e transferiu-se uma alíquota de 0,2 mL para tubos de
ensaio (para o branco foram adicionados 0,2 mL de ácido sulfúrico concentrado), com posterior
adição de 4 mL solução de ácido fosfórico 85% p/v e 1 mL de vanilina 0,6% p/v (reagente de
cor). Os tubos foram agitados e colocados em banho a 37ºC por 15 minutos.
Foram lidas as absorbâncias em 537 nm e a curva de calibração foi obtida com o meio
de cultura de produção utilizado em cada ensaio, com concentrações crescentes de óleo de
soja comercial até 30 g.L
-1
.
3.3.5. Determinação de Carboidratos Totais
Os carboidratos totais foram determinados pelo método fenol-sulfúrico (Dubois et al.,
1956). Este método consiste na adição de fenol e ácido sulfúrico concentrado que resultam
numa coloração alaranjada na presença de carboidratos.
Transferiu-se 1 mL de amostra para tubos de ensaio, seguido de adição de 1 mL de
fenol 5% p/v e ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram deixados em repouso por 15
minutos e depois colocados em banho com aquecimento a 30ºC por 15 minutos. A absorbância
foi lida em 488 nm e a curva de calibração foi obtida com solução de lactose em água com
concentrações variando de 10 a 160 mg.L
-1
.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
36
3.4. Procedimento Experimental
3.4.1. Ensaios em Mesa Incubadora Rotativa
Inicialmente foram realizados ensaios em mesa incubadora rotativa para a
determinação de meio de cultivo apropriado para a continuidade do trabalho em biorreator de
bancada.
O procedimento para a realização dos experimentos foi descrito por Rosa et al.(2002).
Os ensaios consistiram em três etapas: reativação do microrganismo, crescimento e produção.
Primeiramente, 3,5 mL de suspensão de células vegetativas de S. clavuligerus
mantidos em criotubos foram inoculados em Erlenmeyers de 500 mL contendo 50 mL de meio
de reativação e estes então foram incubados por 24 horas a 28°C e 250 rpm.
Posteriormente, 5 mL de suspensão foram transferidos para Erlenmeyers de 500 mL
contendo 45 mL de meio de cultura de inóculo, de mesma composição do meio de cultura
principal. Esta etapa foi realizada a 28°C e 250 rpm por 24 horas.
Na etapa de produção, transferiu-se o volume de suspensão de inóculo numa relação
de 10% v/v, para um balão de 3 L contendo o meio de cultura de produção. Volumes de 50 mL
foram bombeados individualmente para erlenmeyers de 500 mL e mantidos em agitação em
mesa incubadora rotativa a 28°C e 250 rpm, dando início aos ensaios. O esquema
experimental dos ensaios em mesa incubadora rotativa está representado na Figura 3.2.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
37
Figura 3.2. Esquema experimental para os cultivos em mesa incubadora rotativa
Os cultivos tiveram aproximadamente 168 horas de duração, retirando-se amostras de
12 em 12 horas, que foram analisadas quanto às concentrações de glicerol, ácido clavulânico,
lipídios totais, bem como a realização das caracterizações reológicas do mesmo.
3.4.2. Experimentos em Biorreator Convencional de Bancada
Foram realizados experimentos em biorreator convencional de bancada de 4 L de
volume útil. As condições utilizadas durante os cultivos foram: 800 rpm, 28°C, 0,5 vvm e pH
6,8.
Materiais e Métodos
___________________________________________________________________
38
O procedimento para a realização dos ensaios em biorreator foi semelhante ao descrito
para os ensaios em mesa incubadora rotativa, somente diferenciado pelos volumes de meio de
cultura no reator (3,6 L) e de inóculo (0,4 L) e pelo controle de pH por adição de soluções de
HCl (2M) e NaOH (1M) já que o meio de cultura utilizado no biorreator foi isento de MOPS.
O procedimento experimental pode ser visualizado na Figura 3.3
Figura 3.3. Esquema experimental para os cultivos em biorreator de bancada
As amostras foram coletadas do biorreator em intervalos de 6 a 8 horas, onde foram
realizadas as caracterizações reológicas da mesma e análises de concentração de ácido
clavulânico, glicerol e lipídios totais após centrifugação. Salienta-se que as análises de ácido
clavulânico foram realizadas imediatamente após cada amostragem, sendo este o parâmetro
determinante para o término do cultivo. As amostras provenientes dos cultivos para análise de
concentração de ácido clavulânico, lipídios totais e glicerol foram centrifugadas a 4°C, 11000
rpm por 15 minutos. As amostras que não puderam ser prontamente analisadas, foram
congeladas a -70 °C para posterior análise.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Ensaios em Mesa Incubadora Rotativa
Conforme descrito no item 3.1.2.2, estes ensaios foram realizados preliminarmente
com o intuito de definir a concentração e a fonte de nitrogênio, bem como a concentração ideal
de óleo de soja do meio de cultura de produção para a etapa posterior de cultivos, realizados
em biorreator de bancada.
A) Avaliação da Fonte e Concentração de Nitrogênio
4.1.1. Ensaio BS1
Os resultados encontrados estão ilustrados no gráfico da Figura 4.1. Neste ensaio
utilizou-se 20 g.L
-1
de farinha de soja (equivalente a 1,6 g.L
-1
de nitrogênio total) e 23 g.L
-1
de
óleo de soja na composição do meio de cultura.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
100
200
300
400
500
600
700
800
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) ,
C
GLI
(g.L
-1
), C
CT
(g.L
-1
)
Tempo (h)
K C
LIP
C
GLI
C
CT
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Figura 4.1. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
), carboidratos totais (C
CT
) e índice de consistência (K) do ensaio BS1
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
40
Analisando a Figura 4.1, verifica-se que a produção de ácido clavulânico teve início
quando a concentração de glicerol se encontrava em valores baixos, esgotando-se por volta de
30 horas.
Em relação à concentração de ácido clavulânico, o valor máximo alcançado foi de 700
mg.L
-1
em 132 horas de cultivo. Esse resultado é o melhor obtido até o presente momento na
literatura em cultivos em mesa incubadora rotativa, acima do encontrado por Wang et al.
(2004), cerca de 670 mg.L
-1
em cultivo com adição do aminoácido ornitina.
Quanto à concentração de carboidratos totais presentes na farinha de soja, pode-se
observar que não houve consumo durante o cultivo, evidenciando que as fontes de carbono
preferenciais foram glicerol e óleo e que o principal papel da farinha de soja foi servir como
fonte de nitrogênio no meio de cultura.
Neste ensaio, o consumo de lipídios pelo microrganismo se deu após o término do
glicerol, ou quando este se encontrava em pequenas concentrações. Isto evidencia um
comportamento diáuxico no processo fermentativo, ocorrendo inicialmente o uso da fonte de
carbono de fácil assimilação para o crescimento celular e a ativação do metabolismo
secundário, e a subseqüente utilização de uma fonte complexa, no caso o óleo de soja, para
crescimento, manutenção celular e produção do composto desejado.
O índice de consistência, K, que representa de forma relativa o crescimento celular,
apresentou um perfil marcado por altos valores, chegando a 35 dina.cm
-2
.s
n
em 84 horas e
mantendo-se acima de 20 dina.cm
-2
.s
n
até o final do cultivo.
4.1.2. Ensaio BS2
No cultivo BS2, cujos resultados estão ilustrados no gráfico da Figura 4.2, verificou-se
um comportamento semelhante ao cultivo BS1 em todos os parâmetros avaliados, durante as
primeiras 40 horas do processo fermentativo.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
41
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
20
40
60
80
100
120
140
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
Tempo (h)
K C
LIP
C
GLI
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Figura 4.2. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS2
Principalmente no que se refere à concentração de glicerol presente no meio de
cultura, o consumo foi semelhante ao verificado no cultivo BS1, evidenciando uma preferência
de consumo por fonte de carbono de fácil assimilação no início da fase de crescimento celular.
Neste cultivo, novamente houve consumo de óleo de soja pelas células, mesmo que
menor, resultando numa grande quantidade de óleo residual. Este fato pode estar associado ao
baixo crescimento celular, com um valor de K máximo em torno de 20 dina.cm
-2
.s
n
em 40
horas, seguido de pronunciada queda até o final do cultivo, evidenciando acentuado declínio da
concentração celular.
Apesar da adição de uma maior concentração do tampão MOPS, 32 g.L
-1
na
composição do meio de cultura de produção, não foi possível assegurar a manutenção do pH
em 6,8, considerado ótimo para crescimento de Streptomyces clavuligerus e produção de ácido
clavulânico, o que refletiu principalmente na baixa produção de ácido clavulânico (100 mg.L
-1
),
seguida de acentuada degradação.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
42
4.1.3. Ensaio BS3
No cultivo BS3, a fonte de nitrogênio original foi substituída por Samprosoy 90NB, um
hidrolisado protéico de soja, na mesma concentração de nitrogênio total do cultivo BS1. Os
resultados estão expressos na Figura 4.3.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
K C
LIP
C
GLI
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Tempo (h)
Figura 4.3. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS3
De acordo com a Figura 4.3, pode-se verificar que a máxima concentração obtida de
ácido clavulânico foi 338 mg.L
-1
em 110 horas, decrescendo depois desse período. Este
resultado foi em torno de 50% do máximo obtido na mesma concentração de nitrogênio total
quando empregou-se a farinha de soja como fonte de nitrogênio, demonstrado no ensaio BS1.
Apesar da menor concentração de ácido clavulânico verificada neste ensaio, o perfil de
crescimento celular, indicado pelo índice de consistência, K, foi muito semelhante ao do cultivo
BS1, indicando que as condições do cultivo foram favoráveis ao crescimento.
O perfil de concentração de lipídios no meio foi similar aos anteriores, com início do
consumo após o término do glicerol, com um residual de aproximadamente 14 g.L
-1
no final do
cultivo.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
43
Conforme anteriormente mencionado, o cultivo BS3 apresentou na sua composição
uma concentração de nitrogênio total de 1,6 g.L
-1
, diferenciando-se do cultivo com meio BS1,
apenas pela fonte de nitrogênio empregada.
Em trabalhos anteriores realizados no DEQ-UFSCar, a utilização de Samprosoy 90NB
gerou bons resultados, sendo adotado como fonte de nitrogênio padrão para os ensaios de
produção de ácido clavulânico.
Neste trabalho, na presença de óleo de soja, apresentou rendimento muito inferior em
contraste com os ótimos resultados obtidos com a farinha de soja.
Foi então proposta a confirmação dos dados de concentração de ácido clavulânico pelo
método proposto por Foulstone e Reading (1982), (HPLC), reconhecidamente confiável e
amplamente utilizada em trabalhos de produção de ácido clavulânico reportados na literatura
atual. Os resultados comparativos estão expressos no gráfico da Figura.4.4.
Figura 4.4. Comparação dos resultados de concentração de ácido clavulânico pelos
métodos de Bird et al., (1982) e Foulstone e Reading, (1982)
Analisando-se o gráfico da Figura 4.4, pode-se perceber que os resultados de
concentração de ácido clavulânico quando foi empregada a metodologia proposta por Bird et
al. (1982) foram ligeiramente superiores àquelas obtidas quando empregou-se a metodologia
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
50
100
150
200
250
300
350
400
C
AC
(mg.L
-1
)
Tempo (h)
BIRD FR
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
44
proposta por Foulstone e Reading, (1982), e a diferença foi maior para as amostras com maior
concentração de ácido clavulânico.
Cabe ressaltar alguns pontos importantes quanto à curva apresentada:
As análises pelo método espectrofotométrico foram realizadas imediatamente após a
amostragem, sem congelamento das mesmas, exceto para os dois pontos correspondentes as
96 e 120 horas de cultivo. Essas amostras foram inicialmente analisadas pelo método de Bird
et al. (1982), depois foram preservadas congeladas até o final do cultivo, sendo depois a
analisadas pelo método cromatográfico. Depois de realizada análise cromatográfica, e as
amostras terem sido novamente congeladas, foi verificado que a diluição empregada na análise
inicial (espectrofométrico) estava incorreta, devido a alta concentração de sólidos em
suspensão presente nestas amostras, resultando em altas absorbâncias, fora da faixa de
linearidade da curva padrão. Então a amostra foi novamente descongelada, diluída e re-
analisada pelo método do Bird et al. (1982).
O efeito da degradação do ácido clavulânico pelo congelamento da amostra, mesmo
que pequeno, ficou evidente quando o último ponto da curva foi coincidente, justamente porque
nesse momento foi possível realizar a análise simultaneamente pelas duas metodologias, sem
a necessidade de congelar a amostra para preservação.
Os resultados desse cultivo nem poderiam ser diferentes, observando-se que as duas
metodologias baseiam-se no mesmo princípio de derivatização do ácido clavulânico com
imidazol, gerando um produto estável cuja absorbância pode ser lida em 311 nm e relacionada
com a concentração de ácido clavulânico presente na amostra.
Com base nesses resultados e levando em consideração a facilidade de manuseio das
amostras com um menor número de etapas e pela possibilidade de realizar as análises
prontamente após a amostragem, sem a necessidade de congelamento, foi adotada a
metodologia de Bird et al. (1982) como padrão para todos os ensaios, sem qualquer
necessidade de confirmação por HPLC, observando necessariamente alguns cuidados.
Para evitar a repetição de erros na diluição das amostras pelo método
espectrofotométrico, foi adotada a diluição padrão 1:25 para todas as amostras. Essa diluição
mostrou-se adequada, pois no inicio do cultivo onde há menores concentrações de ácido
clavulânico, há também uma maior concentração de sólidos em suspensão, elevando as
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
45
leituras de absorbância do branco e da amostra. Já ao longo do cultivo, com menores
concentrações de insolúveis, há o aumento da concentração de ácido clavulânico, que a
absorbância pode ser lida dentro da faixa de linearidade da curva. A necessidade de diluir a
amostra numa maior razão deverá observar a máxima absorbância lida na curva padrão, no
caso para concentração de 50 mg.L
-1
de ácido clavulânico.
4.1.4. Ensaio BS4
Os resultados do ensaio BS4, equivalente em concentração de nitrogênio total do
cultivo BS2, no entanto utilizando proteína isolada em substituição à farinha de soja, estão
expressos na Figura 4.5.
Figura 4.5. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS4
Neste ensaio, os perfis de concentrações de lipídios, glicerol e de índice de
consistência apresentaram o comportamento similar aos anteriores, porém a concentração
máxima de ácido clavulânico, em torno de 50 mg.L
-1
em 60 horas, foi marcadamente inferior a
todos os cultivos, o que pode ter ocorrido por diversos motivos, entre eles a inibição pela
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
10
20
30
40
50
60
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
Tempo (h)
K C
LIP
C
GLI
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
46
concentração de nitrogênio presente no meio, a degradação do ácido clavulânico em pHs
alcalinos e até mesmo limitação por oxigênio dissolvido em cultivos em mesa incubadora
rotativa.
4.1.5. Comparação dos ensaios BS1, BS2, BS3 e BS4
Nos cultivos BS2 e BS4 em mesa incubadora rotativa, o principal problema foi a
manutenção do pH em 6,8, o valor ótimo para a produção de ácido clavulânico. Nesses cultivos
o pH permaneceu por mais horas de cultivo na faixa de pH alcalino. Mayer e Decker (1996)
relataram que o pH é um dos fatores de maior influência no bioprocesso de produção de ácido
clavulânico, devido a esse produto degradar em grande velocidade em pHs ácidos e alcalinos.
Comportamento similar com flutuações de pH foi verificado por Chen et al. (2003),
quando foi investigada a produção de ácido clavulânico em mesa incubadora rotativa com
arginina e ornitina na composição do meio de cultura. No trabalho citado, foi utilizado extrato
protéico de soja, com alimentações de ornitina (0,25 mmol) e arginina (0,25 mmol) em
intervalos de 12 horas e os autores relacionaram o aumento do pH com a possível produção de
amônia pelas células.
Os resultados dos quatro cultivos quanto à concentração de ácido clavulânico estão
expressos na Figura 4.6.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
47
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
100
200
300
400
500
600
700
C
AC
(mg.L
-1
)
Tempo (h)
BS1 BS2 BS3 BS4
Figura 4.6. Perfis de concentração de AC pra os cultivos BS1, BS2, BS3 e BS4 em mesa
incubadora rotativa
Analisando-se o gráfico da Figura 4.6, observa-se o melhor desempenho do cultivo
BS1. Este meio de cultura com farinha de soja na menor concentração de nitrogênio total
avaliada (1,6 g.L
-1
), possibilitou a manutenção do pH em valores próximos a 6,8 ao longo de
todo o cultivo, apresentou também um bom crescimento microbiano, gerando uma maior
produção de ácido clavulânico, sendo, portanto, o meio de cultura adotado como padrão para
ser utilizado na segunda etapa do trabalho, em cultivos em biorreator de bancada.
B) Avaliação da Concentração de Lipídios
Definido o meio de cultura de produção para o prosseguimento do trabalho (BS1),
foram avaliadas diferentes concentrações de óleo de soja, para verificação desta variável na
produção de ácido clavulânico.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
48
4.1.6. Ensaio BS5
A Figura 4.7. ilustra o gráfico dos resultados encontrados no cultivo BS5 em que se
utilizou o meio de cultura com 20 g.L
-1
de farinha de soja (1,6 g.L
-1
de nitrogênio total) e óleo de
soja na concentração de 16 g.L
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
Tempo (h)
K C
LIP
C
GLI
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Figura 4.7. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS5
Foi observado que no cultivo BS5, com menor concentração de óleo de soja, (16 g.L
-1
),
o índice de consistência, K, alcançou valores pouco abaixo dos que foram observados no
experimento BS1, indicando um bom crescimento microbiano.
Quanto ao consumo total de lipídios, este foi de apenas 8 g.L
-1
, ou seja, a concentração
de óleo residual foi similar à verificada nos cultivos anteriores, com maior concentração inicial
de óleo (23 g.L
-1
).
Como neste cultivo apresentava composição similar ao cultivo BS1, com 1,6 g.L
-1
de
nitrogênio total, a concentração do tampão MOPS adicionada foi de 21 g.L
-1
, que ao contrário
do que foi verificado no cultivo BS1, não foi suficiente para manutenção do pH em 6,8.
A máxima produção de ácido clavulânico obtida foi de 165 mg.L
-1
em 144 horas,
seguida de acentuada degradação, em consonância com o máximo valor de índice de
consistência 23 dina.cm
-2
.s
n
.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
49
4.1.7. Ensaio BS6
No cultivo BS6 foi avaliada a influência da maior concentração de óleo de soja (30 g.L
-
1
) na produção de ácido clavulânico, sendo os resultados ilustrados no gráfico da Figura 4.8.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
Tempo (h)
K C
LIP
C
GLI
C
AC
(mg.L
-1
)
C
AC
Figura 4.8. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BS6
No cultivo BS6, o índice de consistência (K) alcançou maiores valores do que o
verificado no cultivo BS5, o que mostra um bom crescimento do microrganismo. Quanto à
concentração máxima de ácido clavulânico, em torno de 225 mg.L
-1
(168 horas), nota-se que
está bem abaixo daquele observado no cultivo BS1. Novamente houve problemas na
manutenção do pH em 6,8. Houve um consumo maior de óleo de soja (18 g.L
-1
)
e o pH
alcançou maiores valores no final do cultivo, quando a concentração de óleo residual
apresentou valores constantes. Isso pode evidenciar que os ácidos graxos livres liberados no
meio podem ajudar na manutenção do pH, mas ao longo do cultivo, o acúmulo destes pode
causar efeitos de inibição, reduzindo a biossíntese do ácido clavulânico.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
50
4.2. Ensaios em Biorreator
Partindo-se da condição da composição do meio de cultura do cultivo BS1, com farinha
de soja como fonte de nitrogênio, foram realizados cultivos em biorreator de bancada, variando-
se concentrações de fonte de nitrogênio e de óleo de soja para avaliação de produção de AC
em condições controladas de pH por adição de ácido e base.
4.2.1. Ensaio BF1
Os resultados do cultivo BF1, com meio de cultura com 20 g.L
-1
de farinha de soja e 23
g.L
-1
de óleo de soja estão ilustrados no gráfico da Figura 4.9. Neste cultivo foi empregado o
mesmo meio de cultura de produção BS1, com o intuito de verificar a produção de ácido
clavulânico do meio de cultura que gerou os melhores resultados em mesa incubadora rotativa.
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
ODx10
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
), OD*10
Figura 4.9. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de oxigênio dissolvido (OD)
do ensaio BF1
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
51
Observando-se a Figura 4.9, pode-se verificar que o consumo de glicerol pelas células
se deu nas primeiras 30 horas de cultivo, evidenciando o comportamento apresentado em
todos os cultivos em mesa incubadora rotativa.
Foi verificado também que a concentração de oxigênio dissolvido (OD) teve seu valor
mínimo coincidente com a exaustão do glicerol. Após esse período, a concentração de OD
voltou a aumentar chegando até o máximo de 94%, e novamente diminui durante a fase de
consumo de óleo de soja, permanecendo em torno de 80% até o final do cultivo, indicando que
não houve limitação por falta de oxigênio dissolvido.
O máximo valor do índice de consistência (k) obtido foi 25 dina.cm
-2
.s
n
, permanecendo
por longo período acima de 20 dina.cm
-2
.s
n
. Este perfil de crescimento celular foi verificado no
ensaio em mesa incubadora rotativa com mesma composição do meio de cultura (BS1).
O consumo de lipídios, como verificado nos cultivos anteriores, se deu imediatamente
após o consumo do glicerol, sem que fosse necessária qualquer adaptação do microrganismo
para o consumo desse substrato. Este comportamento também foi verificado por Large et al.
(1999).
A concentração de óleo residual foi em torno de 10 g.L
-1
, semelhante ao que foi
verificado em mesa incubadora rotativa, com consumo total em torno de 13 g.L
-1
.
A produção máxima de ácido clavulânico obtida (670 mg.L
-1
) foi similar ao verificado
em ensaio em mesa incubadora rotativa, no entanto em 94 horas de cultivo, evidenciando que
com essa composição de meio de cultura, a produção em mesa incubadora rotativa foi
prejudicada pela falta de oxigênio fazendo com que a produção máxima fosse alcançada num
tempo maior de cultivo.
4.2.2. Ensaio BF2
O ensaio BF2 foi realizado utilizando meio de cultura com 30 g.L
-1
de farinha de soja
(2,4 g.L
-1
de nitrogênio total) e 23 g.L
-1
de óleo de sojas estando os resultados apresentados no
gráfico da Figura 4.10.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
52
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 20406080
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
ODx10
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
), OD*10
Figura 4.10. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de oxigênio dissolvido
(OD) do ensaio BF2
Este cultivo foi marcado pela alta viscosidade do caldo de fermentação, com um K
máximo próximo de 42 dina.cm
-2
.s
n
, permanecendo por um longo período acima de
30 dina.cm
-2
.s
n
.
O aumento da concentração de farinha de soja refletiu diretamente no crescimento
celular, mas não influenciou no consumo de óleo de soja, resultando numa alta concentração
de óleo residual, em torno de 13 g.L
-1
.
A produção de ácido clavulânico máxima obtida foi de 657 mg.L
-1
em 72 horas,
representando uma antecipação de 20 horas em comparação com o cultivo BF1, para se obter
semelhante produção máxima.
4.2.3. Ensaio BF3
No ensaio BF3 utilizou-se meio de cultura contendo 40 g.L
-1
de farinha de soja (3,2 g.L
-1
de nitrogênio total) e 23 g.L
-1
de óleo de soja Os resultados desse cultivo estão ilustrados no
gráfico da Figura 4.11.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
53
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 20406080
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
ODx10
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
), OD*10
Figura 4.11. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de oxigênio dissolvido
(OD) do ensaio BF3
Este ensaio, foi uma reprodução do ensaio BS3 em biorreator de bancada, agora em
condições favoráveis de controle de pH, que foi determinante para os ensaios em mesa
incubadora rotativa com emprego de altas concentrações de nitrogênio total na composição do
meio de cultura.
A maior concentração de nitrogênio total (3,2 g.L
-1
) não influenciou no consumo de
glicerol, que foi completamente exaurido entre 24 e 30 horas de cultivo, no entanto, o
crescimento celular foi nitidamente inferior ao cultivo BF2, quando foi empregada uma menor
concentração de farinha de soja.
Uma peculiaridade do perfil de K representado neste cultivo, foi a pronunciada queda
do índice de consistência, K, logo após curto período de máximo crescimento, sugerindo que o
consumo rápido de altas concentrações de nitrogênio, gera produtos de degradação que são
altamente tóxicos para as células, causando excessiva fragmentação das hifas.
O consumo de lipídios se deu numa maior velocidade entre 24 e 30 horas, logo após a
exaustão do glicerol. Pode-se notar um aumento da concentração de lipídios no caldo após
esse período, que pode ser indicadora do momento que ocorreu a acentuada morte celular.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
54
Uma vez que os ácidos graxos podem ser usados como fonte imediata de energia e também
como componentes de reserva energética, altas velocidades de lise celular podem gerar um
acúmulo destes componentes no caldo de fermentação.
Neste ensaio, mesmo em condições de menor crescimento celular, a produção máxima
de ácido clavulânico obtida foi de 796 mg.L
-1
em 74 horas de cultivo.
4.2.4. Ensaio BF4
O ensaio BF4 foi realizado utilizando meio de cultura contendo 30 g.L
-1
de farinha de
soja (2,4 g.L
-1
de nitrogênio total) e 16 g.L
-1
de óleo de soja. Como no cultivo BF2, obteve-se
bom crescimento celular, objetivou-se nesse cultivo obter menor concentração residual de óleo
de soja. Os resultados obtidos estão representados no gráfico da Figura 4.12
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 20406080
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
ODx10
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
), OD*10
Figura 4.12. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
), índice de consistência (K) e concentração de oxigênio dissolvido
(OD) do ensaio BF4
Com vista à alta concentração de óleo de soja residual do meio BF2, quando foi
empregada a concentração de 23 g.L
-1
de óleo de soja, investigou-se então a influência na
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
55
produção de ácido clavulânico quando empregada uma menor concentração de óleo de soja
inicial, no caso 16 g.L
-1
.
Neste ensaio foi verificado que mesmo em menor concentração de óleo de soja, o
cultivo apresentou alta densidade celular, representado pelo valor de K, acima de 30 dina.cm
-
2
.s
n
, por longo período durante o cultivo.
Apesar de apresentar uma concentração de óleo residual menor, em torno de 5 g.L
-1
, o
consumo foi similar ao cultivo BF2.
Em termos de produção de ácido clavulânico, comparativamente com os cultivos
anteriores, este gerou os melhores resultados em termos de produção de AC em biorreator de
bancada, com a concentração máxima de 840 mg.L
-1
em 79 horas de cultivo.
4.2.5. Ensaio BF5
Neste ensaio denominado BF5, o meio de cultura apresentou na sua composição 20
g.L
-1
de farinha de soja (1,6 g.L
-1
de nitrogênio total) e 16 g.L
-1
de óleo de soja, dando seqüência
aos experimentos com menor concentração de óleo de soja visando uma menor concentração
residual desse substrato. Os resultados desse cultivo estão representados na Figura 4.13.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 20406080100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
)
Figura 4.13. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BF5
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
56
Pode-se verificar que semelhante ao cultivo BF1, com mesma concentração de
nitrogênio total, que o valor máximo do índice de consistência (K) atingido ao longo do cultivo
foi de 28 dina.cm
-2
.s
n
, evidenciando uma relação direta entre a concentração de farinha de soja
e o crescimento celular. Diferentemente do que ocorreu em todos os ensaios anteriores, ao
final do cultivo foi verificado um aumento do índice de consistência, até aproximadamente 22
dina.cm
-2
.s
n
, no entanto, nesse momento do cultivo a produção de ácido clavulânico já
apresentava um perfil de queda, provavelmente pela exaustão de outros nutrientes aliada ao
acúmulo de subprodutos indesejáveis no caldo.
Quanto ao consumo de óleo de soja, este substrato foi quase completamente exaurido,
apresentando no final do cultivo uma concentração residual de óleo de soja de apenas
1 g.L
-1
.
A produção máxima de ácido clavulânico obtida foi de 742 mg.L
-1
em 78 horas de
cultivo, valor superior ao alcançado no cultivo BF1 com maior concentração de óleo de soja na
composição do meio de cultura de produção.
4.2.6. Ensaio BF6
Nesse cultivo a composição do meio de cultura de produção continha 40 g.L
-1
de
farinha de soja ( 3,2 g.L
-1
de nitrogênio total) e 16 g.L
-1
de óleo de soja. Os resultados deste
ensaio estão expressos na Figura 4.14.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
57
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 20406080100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
K C
LIP
C
GLI
Tempo (h)
C
AC
K (dina.cm
-2
.s
n
) , C
LIP
(g.L
-1
) , C
GLI
(g.L
-1
)
C
AC
(mg.L
-1
)
Figura 4.14. Perfis de concentração de lipídios (C
LIP
), glicerol (C
GLI
), ácido clavulânico
(C
AC
) e índice de consistência (K) do ensaio BF6
Como observado nos cultivos anteriores, o glicerol presente no meio de cultura foi
completamente consumido em aproximadamente 30 horas, coincidindo com o início do
consumo do óleo de soja.
A alta concentração de farinha de soja empregada neste ensaio favoreceu um alto
crescimento celular, confirmado pelo alto valor de K máximo alcançado, em torno de 45
dina.cm
-2
.s
n
em 42 horas.
Apesar da alta concentração celular verificada neste cultivo, o óleo de soja não foi
completamente consumido, apresentando um residual 2 g.L
-1
.
A concentração máxima de ácido clavulânico obtida neste experimento (906 mg.L
-1
em
84 horas) foi a maior de todos os ensaios realizados, seguida de acentuada degradação no
final do cultivo.
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
58
4.2.7. Comparação dos Cultivos em Biorreator de Bancada
Os perfis de crescimento celular em termos de índice de consistência (K) para os
cultivos em biorreator estão expressos no gráfico da Figura 4.15.
0 102030405060708090100
0
10
20
30
40
50
BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF6
K (dina.cm
-2
.s
n
)
Tempo (h)
Figura 4.15. Perfis dos índices de consistência (K) dos ensaios BF1, BF2, BF3, BF4, BF5
e BF6
Verifica-se pela Figura 4.15 que nos cultivos com mesma composição de nitrogênio
total (nas concentrações de 1,6 e 2,4 g.L
-1
), os perfis de K se sobrepõem, independentemente
da concentração de óleo de soja adicionada. Este comportamento não foi verificado para os
cultivos com maior concentração de farinha de soja (BF3 e BF6).
Pode-se verificar também que na menor concentração de nitrogênio total, quando se
empregou 20 g.L
-1
de farinha de soja, o valor máximo de K foi de 25,8 dina.cm
-2
.s
n
. Valor
semelhante foi verificado no cultivo BF3 (27,8 dina.cm
-2
.s
n
), com 40 g.L
-1
de farinha de soja na
composição do meio de cultura de produção. Inicialmente acreditava-se que no cultivo BF1 a
concentração de farinha de soja empregada poderia ter sido insuficiente e que no cultivo BF3
esta teria sido adicionada em excesso, hipótese que não se comprovou com os resultados
obtidos no cultivo BF6, que apresentou um alto valor de K máximo (45 dina.cm
-2
.s
n
). O
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
59
crescimento celular no cultivo BF3 pode ter sido afetado, possivelmente por outros fatores
como, por exemplo, o estado fisiológico das células do inóculo transferidas ao fermentador ou
mesmo pelo cisalhamento excessivo do micélio, e não pela concentração de farinha de soja
propriamente dita presente no meio de cultura.
A presença de altas concentrações de nitrogênio no meio de cultura pode desencadear
alta velocidade de desaminação de proteínas, gerando alta concentração de substâncias
tóxicas no caldo, supostamente amônia, ocasionando lise celular ou fragmentação dos
micélios. Como demonstrado na Figura 4.13, a diminuição da densidade celular foi mais
acentuada nos cultivos em que foram empregadas maiores concentrações de farinha de soja.
O cultivo que gerou os melhores resultados quanto à produção de ácido clavulânico foi
o cultivo com maior concentração de nitrogênio total na composição do meio de cultura de
produção (3,2 g.L
-1
) e 16 g.L
-1
de óleo de soja, onde foi obtida a produção máxima de 906
mg.L
-1
de AC em 84 horas, como verificado no gráfico da Figura 4.16.
0 102030405060708090100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF6
C
AC
(mg.L
-1
)
Tempo (h)
Figura 4.16. Perfis de concentração de ácido clavulânico (C
AC
) dos ensaios BF1, BF2,
BF3, BF4, BF5 e BF6
Verificou-se que o incremento na concentração de ácido clavulânico se deu lentamente
no cultivo BF1, quando a produção de AC máxima obtida foi de 670 mg.L
-1
em 94 horas, sendo
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
60
que foram necessárias apenas 64 horas para se obter a mesma concentração de AC no cultivo
BF2, com a maior concentração de farinha de soja.
No cultivo BF3, com concentração de farinha de soja de 30 g.L
-1
(3,2 g.L
-1
de nitrogênio
total), a produção máxima de AC foi 795 mg.L
-1
em 74 horas, concentração inferior à obtida no
cultivo BF4, que rendeu uma maior produção de AC, 840 mg.L
-1
, quando no meio de cultura
continha menor concentração de lipídios.
Em todos os cultivos foi verificada pouca degradação do produto, mantendo a
concentração de AC em patamares altos até o final dos cultivos, mesmo quando os valores de
K estavam muito baixos, evidenciando que os fatores que causaram a diminuição na
viscosidade do caldo, provavelmente pela fragmentação do micélio, não ocasionaram
degradação do produto.
Nos cultivos realizados, independentemente da concentração de óleo de soja
empregada, não houve exaustão desse substrato. Os perfis de concentração de lipídios nos
cultivos realizados estão apresentados na Figura 4.17.
0 102030405060708090100
0
5
10
15
20
25
30
BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF6
C
LIP
(g.L
-1
)
Tempo (h)
Figura 4.17. Perfis de consumo de lipídios (C
LIP
) dos ensaios BF1, BF2, BF3, BF4, BF5 e
BF6
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
61
Conforme ilustrado na Figura 4.17, não houve consumo de lipídios nas primeiras horas
do cultivo, quando a fonte de carbono preferencial foi o glicerol, consumido durante esse
período. Após o consumo do glicerol, a concentração de lipídios começou a decrescer
imediatamente, sem necessidade de qualquer adaptação das células para consumo do novo
substrato.
Peacock et al. (2003) em estudos sobre utilização de substratos mistos em cultivos
com Streptomyces lividans também verificaram esse comportamento diáuxico. Os autores
relataram que quando o meio de cultura continha apenas trioleína, a atividade da lipase era
rapidamente detectada. Diferentemente do que ocorria quando o meio de cultura continha
glicose e trioleína como fontes de carbono, onde as atividades da lipase e a β-oxidação
(principal via do metabolismo lipídico) só eram detectadas após a exaustão da glicose. A
presença de glicose no caldo aparentemente reprimia a atividade da lipase, necessária para
degradação da trioleína.
Independente da velocidade de consumo do óleo de soja, a concentração residual
deste substrato foi semelhante em todos os cultivos com mesma concentração inicial.
Para os ensaios BF4, BF5 e BF6, quando foram empregadas menores concentrações
de óleo de soja, apesar de menor concentração de óleo residual, o consumo deste substrato foi
semelhante aos outros cultivos, em torno de 12 g.L
-1
.
A ocorrência de óleo residual em processos fermentativos em que são utilizados esses
substratos insolúveis é amplamente reportada na literatura e alguns autores tentaram elucidar
as razões dessa ocorrência, principalmente no que se refere às condições de aeração,
agitação e atuação de lipases no caldo.
A aeração e agitação mecânica desempenham um importante papel na utilização de
lipídios em cultivos com microrganismos filamentosos, uma vez que os meios de cultura são
caracterizados por altas viscosidades com requerimento de altas concentrações de oxigênio
(Large et al. 1998), e o acúmulo de óleo na forma de gotas insolúveis acarretam problemas de
transferência de massa (Choi et al. 1996).
Como a lipase atua na interface óleo-água, o emprego de condições de aeração e
agitação adequadas, suficientes para fragmentar as gotas de óleo sem cisalhamento excessivo
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
62
dos micélios, aumentaria a área interfacial gerando um incremento na disponibilidade do
substrato lipídico, diminuindo a sua concentração residual.
Todos os ensaios foram marcados pela alta produtividade de AC, conforme
apresentado no gráfico da Figura 4.18.
0 102030405060708090100
0
2
4
6
8
10
12
14
16
BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF6
Produtividade AC (mg.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Figura 4.18. Produtividade de AC dos ensaios BF1, BF2, BF3, BF4, BF5 e BF6
Nos cultivos BF3 e BF6, realizados com maior concentração de farinha de soja
(40 g.L
-1
), a produtividade máxima de 12,50 mg.L
-1
.h
-1
foi alcançada em 48 horas, e esse
mesmo valor foi alcançado em 61 horas no cultivo com 30 g.L
-1
de farinha de soja e 16 g.L
-1
de
óleo de soja.
Os maiores valores de produtividade em ácido clavulânico foram alcançados nos
cultivos com menor concentração de lipídios, e no cultivo BF6 esta permaneceu por longo
período em torno de 12 mg.L
-1
.h
-1
.
As altas produções e produtividades em AC obtidas neste trabalho foram superiores
àquelas obtidas em cultivos de Streptomyces clavuligerus visando produção de AC reportadas
na literatura, sem adição de óleo de soja, mesmo quando empregadas estratégias diferentes
de condução de processos fermentativos como batelada alimentada, cultivos contínuos ou
mesmo em reatores de configuração diferenciada. Para fins comparativos, alguns resultados de
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
63
produção e produtividade em AC em trabalhos que utilizaram linhagem selvagem de S.
clavuligerus e meios de cultura contendo glicerol e derivados de soja estão relatados na Tabela
4.1.
Tabela 4.1. Comparação entre valores de produção (C
AC
) e produtividade (P
AC
) máximas em
AC publicados na literatura
Concentração máxima
de AC
(mg. L
-1
)
Tempo de
cultivo (h)
Produtividade
máxima de AC (mg.
L
-1
.h
-1
)
Mayer e Deckwer (1996)
1
500 95 5,3
Teodoro (2004)
1
680 96 7,1
Chen et al. (2002)
1
240 70 3,4
Baptista–Neto (2005)
2
579 23* 21,0
Cerri (2005)
3
450 54 8,4
Presente trabalho 906 84 12,5
1
cultivo em batelada alimentada,
2
cultivo contínuo,
3
cultivo em biorreator airlift, *tempo de
residência hidráulico.
As altas concentrações de AC, aliadas a altas produtividades obtidas no presente
trabalho, quando foram operados cultivos em batelada em biorreator convencional com
linhagem selvagem de Streptomyces clavuligerus, sugerem que o óleo de soja constitui uma
eficiente fonte de carbono e energia, promovendo o aumento da produção do composto de
interesse.
4.2.8. Correlação entre Concentrações de Farinha de Soja (C
FS
) e de
Óleo de Soja (C
OS
) e Produção de Ácido Clavulânico
Numa tentativa que relacionar as concentrações de farinha e de óleo de soja com a
produção máxima de AC (Cac
max
) nos ensaios em biorreator, bem como avaliar a influência
dessas variáveis, foi proposta uma correlação que expressa pela Equação 4.1.
c
OS
b
FS
CCaCac ××=
max
R
2
= 0,90 4.1
onde:
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
64
C
FS
: concentração de farinha de soja (g.L
-1
)
C
OS
: concentração de óleo de soja (g.L
-1
)
e os parâmetros estudados tiveram os seguintes resultados:
a: 1071,5 ± 362,9
b: 0,281 ± 0,059
c: -0,435 ± 0,092
De acordo com os parâmetros obtidos pode-se avaliar que nessa faixa de condições
experimentais, um aumento na concentração de farinha de soja refletiu num aumento da
produção de AC. Influência diferente pode ser constatada para o parâmetro referente à
concentração de óleo de soja, que pelo seu valor negativo evidencia que a máxima produção
do produto de interesse é obtida quando é empregada uma menor concentração desse
substrato nas condições estudadas. As influências das duas variáveis estudadas (C
FS
e C
OS
) na
produção de AC apresentaram a mesma ordem de grandeza, no entanto, a influência de C
OS
na produção de AC foi superior.
O bom ajuste da correlação pode ser observado pelos resultados expressos na Tabela
4.2, em que se contrastam os valores experimentais e calculados pela correlação e na Figura
4.19.
Tabela 4.2. Comparação entre os valores de Cac
max
experimentais e calculados pela Equação
4.1
C
FS
(g.L
-1
) C
OS
(g.L
-1
)
Cac
max
experimental
(mg.L
-1
)
Cac
max
calculada
(mg.L
-1
)
Desvio (%)
BF1 20 23 657 635,3 -3,30
BF2 30 23 670 712,9 6,40
BF3 40 23 796 773,6 -2,81
BF5 20 16 742 744,8 0,38
BF4 30 16 840 835,7 -0,51
BF6 40 16 906 906,8 0,09
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
65
Pelo maior valor do parâmetro referente à influência da concentração de óleo de soja
(-0,440), o ajuste foi claramente superior para os cultivos quando foi empregado 16 g.L
-1
na
composição do meio de cultura.
500 600 700 800 900 1000
500
600
700
800
900
1000
-10%
Experimental C
max
CA
(mg.L
-1
)
Calculated C
max
CA
(mg.L
-1
)
+10%
Figura 4.19. Comparação entre os valores experimentais e calculados de Cac
max
Observando os resultados da Tabela 4.2 e Figura 4.19, pode-se notar o excelente
ajuste da correlação proposta (Equação 4.1) mesmo para o pequeno número de pontos
experimentais, pois todos os desvios ficaram abaixo de 6,5% sendo a maioria abaixo de 3%.
Pela qualidade do ajuste pode-se assegurar que a correlação obtida é de grande utilidade para
prever a produção máxima de AC em outras condições de cultivo utilizando essas fontes de
carbono e de nitrogênio.
4.2.9. Modelagem Qualitativa do Processo de Produção de Ácido
Clavulânico
Face aos resultados obtidos no presente trabalho relacionados com a produção de AC
em cultivos utilizando-se meio de cultura contendo glicerol e óleo de soja como fontes de
carbono e às discussões acerca das influências desses substratos na produção de AC, neste
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
66
item do trabalho são apresentadas algumas hipóteses para basear uma proposta de modelo
que descreva a produção de AC.
O glicerol, um dos substratos utilizados neste trabalho, consiste numa eficiente fonte de
C para crescimento de linhagens selvagens de Streptomyces clavuligerus e desempenha um
importante papel como precursor na produção de AC, no entanto, quando presente em meios
de cultura em concentrações acima de 15 g.L
-1
pode inibir ou mesmo reprimir a produção de
AC (Romero et al.; 1984, Chen et al. 2002).
Os ácidos graxos presentes no óleo de soja fornecem material de reserva energética
que podem ser consumidos pela bactéria filamentosa e de acordo com Large et al. (1999) são
responsáveis pela produção de metabólitos secundários, incluindo vários compostos β-
lactâmicos.
O uso de um meio de cultura composto de glicerol e óleo de soja como fontes de
carbono representa uma estratégia para, inicialmente, favorecer o crescimento celular pelo
consumo do glicerol até a exaustão. Posteriormente, assegura a demanda da manutenção
celular e favorece a produção de AC com o consumo do óleo de soja, pois sua hidrólise
disponibiliza lenta e gradativamente glicerol e ácidos graxos às células. A lipase em
Streptomyces clavuligerus se encontra aderida às células e os produtos da hidrólise são então
transportados diretamente para o interior das mesmas, minimizando efeitos de repressão ou
inibição por estes substratos.
Levando em consideração o consumo diáuxico dos substratos, a velocidade de
consumo de glicerol proveniente do óleo de soja é controlada pela hidrólise e esta, então, pode
ser considerada a etapa controladora do processo.
Quando a lipase está ativa em substratos solúveis, a atividade dessa enzima segue
modelos cinéticos normais à maioria das enzimas (Muralidhar et al., 2002). Assumindo o
modelo clássico de Michaelis-Menten, a velocidade de hidrólise é proporcional à concentração
de lipídio (substrato) e à área interfacial das gotas de óleo que estão em contato com o micélio,
que é função das condições de agitação e aeração impostas ao caldo de fermentação.
O processo em batelada com óleo como substrato mimetiza um processo em batelada
alimentada, cuja velocidade de disponibilização de glicerol e ácidos graxos é controlada pela
concentração de óleo e pelas condições de cultivo. Sendo isto verdade, desta forma, a
Resultados e Discussão
___________________________________________________________________
67
velocidade de produção de AC é controlada pela velocidade de consumo de lipídio num cultivo
em batelada e pela velocidade de alimentação de glicerol e ácidos graxos num eventual cultivo
em batelada alimentada.
Com base nessas suposições, pode-se num trabalho seguinte elaborar um modelo
cinético baseado numa estequiometria que considere o crescimento celular, a hidrólise do
lipídio e a produção de AC.
Conclusões
___________________________________________________________________
68
5. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos em ensaios preliminares em mesa incubadora
rotativa, o meio de cultura com farinha de soja na menor concentração de nitrogênio total
avaliada (1,6 g.L
-1
), possibilitou a manutenção do pH em valores próximos a 6,8 ao longo de
todo o cultivo, apresentando também um bom crescimento microbiano, gerando uma maior
produção de ácido clavulânico (700 mg.L
-1
em 132 horas de cultivo), sendo, portanto, o meio de
cultura adotado como padrão utilizado na segunda etapa do trabalho, em cultivos em biorreator
de bancada.
Os cultivos em biorreator de bancada apresentaram alta concentração celular e
consumo incompleto de óleo de soja, obtendo altas produções e produtividade em AC. No
cultivo com concentração de farinha de soja de 30 g.L
-1
e 16 g.L
-1
, a produção máxima de AC
foi de 840 mg.L
-1
em 79 horas, concentração inferior apenas à obtida no cultivo BF6 com 40
g.L
-1
de farinha de soja e 16 g.L
-1
de óleo de soja, em que se obteve uma maior produção de
AC, 906 mg.L
-1
em 84 horas.
Os resultados sugerem que a velocidade de hidrólise, função de concentração de
lipídios, seja determinante na produção de AC, pois o sistema se comportou como um cultivo
em batelada alimentada a volume constante onde a disponibilidade dos substratos (glicerol e
ácidos graxos) é definida pela concentração de lipídios no caldo de fermentação.
Sugestões
___________________________________________________________________
69
6. SUGESTÕES
Como sugestões de continuidade do trabalho propõe-se:
- realização de cultivos complementares com outras concentrações de farinha de soja e óleo de
soja para identificar melhores condições para a produção de AC.
- proposta de um modelo para prever a produção de AC em meio contendo glicerol e lipídio
como fontes de carbono e energia e farinha de soja como fonte de nitrogênio.
- estudo da produção de AC em batelada alimentada utilizando glicerol, AG e óleo de soja
hidrolisado ou não no meio de cultura suplementar.
Referências Bibliográficas
___________________________________________________________________
70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AHARONOWITZ, Y. E DEMAIN, A.L. Carbon catabolite regulation of cephalosporin
production in Streptomyces clavuligerus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy
, v.14,
p.159-164, 1978.
ALFORD, J. A., PIERCE, D.A. Lipolytic activity of microorganisms at low and intermediate
temperatures below O ºC. Journal of Food Science
, v.26, n.5, p.518-524, 1961.
ALVAREZ, H.M; STEINBÜCHEL, A. Triacylglycerols in procaryotic microorganisms. Applied
Microbiology and Biotechnology, v. 60, p.367-376, 2002.
BADER, F. G.; BOEKELOO, M. K.; GRAHAM, H. E.; CAGLE, J. W.; Sterilization of oils:
data to support the use of a continuous point-of-use sterilizer. Biotechnology and
Bioengineering, v. 26, p.848-856, 1984.
BAGGALEY, K.H.; BROWN, A. G.; SCHOFIELD, C. J. Chemistry and biosynthesis of
clavulanic acid and another clavams. Natural Product Report
, p.309-333, 1997.
BAPTISTA-NETO, A.; Estudo do processo de produção de ácido clavulânico por
Streptomyces clavuligerus em cultivos contínuos com alta concentração celular. Tese
de Doutorado, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, 206p., 2005.
BIRD, A.E.; BELLIS, J.M.; GASSON, B.C. Spectrophotometric assay of clavulanic acid by
reaction with imidazole. Analyst
, v.107, p.1241-1245, 1982.
BRAKHAGE, A. A. Molecular Regulation of β-lactam biosynthesis in Filamentous Fungi.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.62, n.3, p.547-585, 1998.
BROWN, A. G.; BUTTERWORTH, D.; COLE, M.; HANSCOMB, G.; HOOD, J. D.;
READING, C.; ROINSON, G. N. Naturally occurring β-lactamase inhibitors with
antibacterial activity, The Journal of Antibiotics
, v.29, n.6, p.668-669, 1976.
BUTTERWORTH, D. Clavulanic acid: properties, biosynthesis, and fermentation. In:
Biotechnology of Industrial Antibiotics
, Ed. E.J. Vandamme, New York, by Marcel
Decker, Inc., p.225-235, 1984.
CERRI, M. O.; Avaliação de transferências de calor e massa em biorreator airlift de
bancada para a produção de ácido clavulânico, Dissertação de Mestrado, Universidade
Federal de São Carlos, São Carlos, SP, 116p., 2005.
CHEN, K.; LIN, Y.; TSAI, C.; HSIEH, C.; HOUNG, J. Optimization of glycerol feeding for
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus with glycerol feeding,
Biotechnology Letters
, v.24, p.455-458, 2002.
CHEN K.; LIN, Y; WU, J.; HWANG, S. J. Enhancement of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus with ornithine feeding. Enzyme and Microbial Technology
,
v.32, p.152-156, 2003.
CHOI., D. B; TAMURA, S.; PARK, Y. S; OKABE, M; SERIU, Y.; TAKEDA, S.; Efficient
tylosin production from Streptomyces fradiae using rapeseed oil, Journal of
Fermentation and Bioengineering, v. 82, n.2, p.183-186, 1996.
DEMAIN, A. L.; FANG, A.; Emerging concepts of secondary metabolism in actinomycetes.
Actinomycetologica
, v.9, p.98-117, 1995.
Referências Bibliográficas
___________________________________________________________________
71
DEMAIN, A. L. Induction of microbial secondary metabolism. International Microbiology
, v.1,
p.259–264, 1998.
DREW, S.W. e DEMAIN, A.L. Effect of primary metabolites on secondary metabolism.
Annual Review Microbiology
, v.31, p.343-356, 1977.
DUBOIS, M; GILLES, K. A; HAMILTON, J. K; REBERS, P. A; Smith, F. Colorimetric method
for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry
v.28; n.3,
p.350-355, 1956.
ELKINS, J. M.; CLIFTON, I. J.; HERNANDEZ, H., DOAN, L. X.; HEWITSON, K. S.
Oligomeric structure of proclavaminic acid amidino hydrolase: evolution of a hydrolytic
enzyme in clavulanic acid biosynthesis. Biochemical Journal
, v.366, 423-434, 2002.
FANG, A.; DEMAIN; A. L.; Dependence of nitrogen- and phosphorous-regulation of b-
lactam antibiotic production by Streptomyces clavuligerus on aeration level, Journal of
Industrial Microbiology, v.15, p.407-410, 1995.
FOULSTONE, M.; READING, C. Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components
of augmentin, in biological fluids with high performance chromatography. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, v.22. p.753-762, 1982.
GILBERT, E.J.; CORNISH, A.; JONES, C.W. Purification and properties of extra cellular
lipases from Pseudomonas aeruginosa EF2. Journal of General Microbiology
, v.137,
p.2215-21, 1991.
GUTMAN, A. L.; RIBON, V. AND BOLTANSKI, A. Incorporation of β-lactam residue of
clavulanic acid, Journal of the Chemical Society
, Chemical Communication, n.22,
p.1627-1629, 1985.
INOUE, O. O. Estudo da Influência da concentração e dos componentes do óleo de soja
sobre a produção de salinomicina. Dissertação de Mestrado, Departamento de
Engenharia Química, Escola Politécnica da Universidade de São Paulo, São Paulo-
Brasil, 152p. 2001.
IVES, P. R. AND BUSHELL, M. E.; Manipulation of the physiology of clavulanic acid
production in Streptomyces clavuligerus, Microbiology
, v.143, p.3573-3579, 1997.
JENSEN, S. E.; ELDER, K. J.; AIDOO, K. A.; PARADKAR, A. S. Enzymes catalyzing the
early steps of clavulanic acid biosynthesis are encoded by two sets of paralogous genes
in streptomyces clavuligerus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy
, Mar., p.720-726,
2000.
JONES, C.; THOMPSON, A. AND ENGLAND, R. Guanosine 5’-diphosphate 3’-diphosphate
(ppGpp) and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus, World Journal of
Microbiology & Biotechnology, v.13, p.633-636, 1997.
KURYLOWICZ, W. Antibióticos: Uma revisão critica
, Recife: Guanabara Koogan, 1981,
p.120-140.
LARGE, K.P.; ISON, A.; WILLIAMS, D.J. The effect of agitation rate on lipid utilisation and
clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus. Journal of Biotechnology
, v.63,
p.111-119, 1998.
LARGE, K.P.; MIRJALILI, N.; OSBORNE, M.; PEACOCK, L.M.; ZORMPAIDIS, V.; WALSH,
M.; CAVANAGH, M.E.; LEADLAY, P.F.; ISON, A.P. Lipase activity in Streptomycetes.
Enzyme. and Microbiology Technology
, v.25, p.569-575, 1999.
Referências Bibliográficas
___________________________________________________________________
72
LEBRIHI, A.; GERMAIN, P.; LEFEBVRE, G. Phosphate repression of cephamycin and
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. Applied Microbiology and
Biotechnology, v.26, p.130-135, 1987.
LEBRIHI, A.; LAMSAIF, D.; LEFEBVRE, G.; GERMAIN, P. Effect of ammonium ion on
spiramycin biosynthesis in Streptomyces ambofaciens. Applied Microbiology and
Biotechnology, v.37, n.3, p.382-387, 1992.
LECHEVALIER, H. A. ; LECHEVALIER, M. P. Introduction to the order Actinomycetales
, In:
Starr, M. P.; Stalp, H.; Tryper, H. G.; Balawi, A.; Schlegel, H. G.; The prokaryotes: a
handbook on habitats, isolation, and identification of bacteria. New York, Springer-
Verlag, 1981.
LEE, P.C.; HO, C.C. Production of clavulanic acid and cephamycin C by Streptomyces
clavuligerus in palm-oil medium, World. Journal of .Microbiology
and Biotechnology,
v.12, p.73-75, 1996.
MACCARTHY, F. J.; FISHER, W. P.; CHARNEY, J.; TYTELL, A. A. Effects of oils and fatty
acids on the production of fungichromin, Antibiotics Annual
, p. 719-723, 1995.
MARANESI, G.L.; BAPTISTA-NETO, A.; HOKKA, C.O.; BADINO, A.C. Utilization of
vegetable oil in the production of clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus ATCC
27064. World Journal of Microbiology and Biotechnology
, V.21, N.4 p.509-514, 2005.
MARTÍN, J. F; LIRAS, P.; Biosynthetic pathways of secondary metabolites in industrial
microorganisms. In: Rehm, H. J.; Reed, G.; eds. Biotechnology
. Weinheim, VCH. v.1,
p.211-33; 1986.
MAYER, A.F.; DECKWER, W.D.; Simultaneous production and decomposition of clavulanic
acid during Streptomyces clavuligerus cultivations. Applied Microbiology and
Biotechnology, v.45, p.41-46, 1996.
MEIRELLES, F.V.P. Produção de lipases por Yarrowia lipolytica. Rio de Janeiro, Tese de
Doutorado, Departamento de Bioquímica -Instituto de Química da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, 1997.
MENDEZ, G. L.; HAZELL, S. L.; The urea cycle of Helicobacter pylori. Microbiology
, v.142,
p.2959-296, 1996.
MOO-YOUNG, M., Comprehensive biotechnology: The principles, applications &
regulations of biotechnology in industry, agriculture and medicine, Oxford, U.K.,
Pergamon Press, v.1, 688p., 1985.
PAMBOUKIAN, C. R. D. Produção do antitumoral retamicina por Streptomyces olindensis
em processos descontinuo, alimentado e contínuo. Tese de Doutorado, Escola
Politécnica da Universidade de São Paulo, São Paulo, 163p, 2003.
PARK, Y.S.; MOMOSE I.; TSUNODA K.; OKABE M. Enhancement of cephamycin C
production using soybean oil as the sole carbon source. Applied Microbiology and
Biotechnology, v.40, p.773-779, 1994a.
PARK, Y. S.; INOUE, K.; YAHIRO, K; OKABE, M. Improvement of cephamycin C
production by a mutante resistant to linoleic acid, Journal of Fermentation and
Bioengineering, v. 78, p.88-92, 1994b.
PEACOCK, L.; WARD, J.; RATLEDGE, C.; DICKINSON, F. M.; ISON, A.; How
Streptomyces lividans uses oils and sugars as mixed substrate, Enzyme and Microbial
Technology, v.32; p.157-166, 2003.
Referências Bibliográficas
___________________________________________________________________
73
PITLIK, J. AND TOWSEND, C. A.; The fate of [2,3,3-
2
H
3
,1,2-
13
C
2
]- D, L-glycerate in
clavulanic acid biosynthesis, Chemical Communication, n.2, p.225-226, 1997.
POSTMA, T; STROES, J. A. P. Lipid Screening in Clinical Chemistry; Clinica Chimjca Acta
,
v.22, p.569-578, 1968.
ROMERO, J.; LIRAS, P.; MARTÍN, J.F. Dissociation of cephamycin and clavulanic acid
biosynthesis in Streptomyces clavuligerus. Applied Environment Microbiology
, v.20,
p.318-325, 1984.
ROMERO, J.; LIRAS, P.; MARTÍN, J.F.; Utilization of ornithine and arginine as specific
precursors of clavulanic acid., Applied Environment Microbiology
, v.52, p.892-897,
1986.
ROSA, J.C.; BADINO-JR., A.C.; BAPTISTA-NETO, A.; HOKKA, C.O. Cisalhamento e
transferência de oxigênio na produção de ácido clavulânico por Streptomyces
clavuligerus. I Congresso da Sociedade Brasileira de Biotecnologia, Trabalho 68
(disponível em CD-Rom), São Paulo-SP, 2001.
STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation Technology. 2
ed. Oxford, Pergamon Press, p.93-122, 1995.
STRYER, L. Bioquímica. 4 ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, p.571-95, 1996.
TEODORO, J. C. Influência das condições de alimentação do meio suplementar na
produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus em batelada alimentada.
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, 89p.,
2004.
VALENTINE, B. P.; BAILEY, C. R.; DOHERTY, A.; MORRIS, J.; ELSON, S. W.;
BAGGALEY, K. H.; NICHOLSON, N. H. Evidence that arginine is a later metabolic
intermediate than ornithine in the biosynthesis of clavulanic acid by Streptomyces
clavuligerus. Journal of Chemical Society
, Chemical Communications, v.15, p.1210-
1211, 1993.
VALENTINE, B. P.; JEFFKINS; P. A.; HOLMS, W. H.; MOUSDALE; D. M. Process for the
fermentative preparation of clavam derivaties whereby the levels of ammonia and urea
in the fermentation medium kept low. U.S. Patent 5,985,624, 1999.
VINING, L.C. Secondary metabolism. In: Rehn, H.J.; Reed, G., eds. Biotechnology.
Weinheim, VCH, v. 4, p.19-38, 1986.
VOET, D.; VOET, J. G. e PRATT, C.W. Fundamentos de Bioquímica
. Porto Alegre: Artmed
Editora, 2000.
WANG, Y.; YANG, B.; DONG, M.; LIANG, D.; XU, A.
, Optimization of medium composition
for the production of clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus, Process
Biochemistry, v.40, ed.3-4, p.1161-1166, 2005.
WHITE, D. The physiology and biochemistry of prokaryotes. New York, Oxford University
Press; p.187-94, 1995.
ZHANG, J.; DEMAIN, A. L., Regulation of ACV synthetase activity in the beta-lactam
biosynthetic pathway by carbon source and their metabolites, Archives of Microbiology
,
v.158, p.364, 1992.
Livros Grátis
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