ads:
TESE DE DOUTORADO
ESTUDO DA PRODUÇÃO DE PECTINASES
POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO
SÓLIDO UTILIZANDO PEDÚNCULO DE
CAJU COMO SUBSTRATO
Sharline Florentino de Melo Santos
Orientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
Co-Orientador: Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato da Silva
Natal / RN
Dezembro / 2007
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia Química
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Sharline Florentino de Melo Santos
ESTUDO DA PRODUÇÃO DE PECTINASES POR
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
UTILIZANDO PEDÚNCULO DE CAJU COMO
SUBSTRATO.
Tese apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em
Engenharia Química da
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte
dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Doutor.
Natal / RN
Dezembro / 2007.
ads:
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN
Biblioteca Central Zila Mamede
Santos, Sharline Florentino de Melo.
Estudo da produção de pectinase por fermentação em estado
sólido utilizando pedúnculo de caju como substrato / Sharline
Florentino de Melo Santos. – Natal, RN, 2007.
151 f.
Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo.
Co-orientador: Flávio Luiz Honorato da Silva.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química.
1. Processo biotecnológico – Tese. 2. Fermentação – estado sólido
– Caju – Pedúnculo – Tese. 3. Pectinases – Tese. 4.
Poligalacturonase. 5. Aspergilus niger. I. Macedo, Gorete Ribeiro de.
II. Silva, Flávio Luiz Honorato da. III. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BCZM CDU 663.15(043.2)
ii
SANTOS, Sharline Florentino de Melo - Estudo da produção de pectinases por fermentação em
estado sólido utilizando pedúnculo de caju como substrato. Tese de Doutorado, UFRN, Programa
de Pós-graduação em Engenharia Química. Área de concentração: Alimentos e Biotecnologia,
Natal/RN Brasil.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Gorete Ribeiro de Macedo
Co-orientador: Prof
o
Dr
o
Flávio Luiz Honorato da Silva
RESUMO - As enzimas pectinolíticas ou pectinases formam um grupo heterogêneo de enzimas
que hidrolisam as substâncias pécticas, são usadas na extração de suco de fruta e sua clarificação,
tratamento de fibra têxtil e extração de óleo vegetal. O objetivo deste trabalho foi o estudo da
produção de pectinases (cinética fermentativa) através da fermentação em estado sólido, usando
como substrato o pedúnculo de caju seco e como agente da fermentação o microrganismo
Aspergillus niger CCT 0916. Utilizando a metodologia do planejamento experimental fatorial e
análise de superfície de resposta estudou-se a influência da umidade inicial do meio, suplementação
do meio com fonte de nitrogênio e fonte de fósforo. Como fonte de nitrogênio foi utilizado o
sulfato de amônia e como fonte de fósforo o fosfato de potássio monobásico. Estudou-se, também,
a melhor condição de extração da enzima produzida do meio de fermentação. Neste caso, foram
estudadas as variáveis: razão volume de solvente/gramas de meio fermentado e tempo de contato
entre as fases, utilizando-se dois sistemas de extração com e sem agitação. Como meio de cultivo
foram utilizados dois resíduos do pedúnculo de caju: resíduo sem lavar e resíduo lavado. Estes
resíduos diferem devido ao tratamento dado antes da secagem. O sem lavar foi obtido secando o
resíduo após a extração do suco, enquanto que o lavado, foi obtido lavando-se com água, cinco
vezes, após a extração do suco, na proporção 1 kg de bagaço para 2 litros de água. A caracterização
físico-química dos resíduos mostrou composições diferentes, principalmente em relação aos teores
de açúcares redutores e pectina. Durante o cultivo foram analisados, em intervalos de
aproximadamente 12 horas, umidade do meio, pH, teor de proteína, açúcares redutores, atividade
da poligalacturonase (PG) e o percentual de redução de viscosidade. Para o resíduo sem lavar o
pico de atividade foi com 40% de umidade e 1% de nitrogênio, sem adição de fósforo, com 30
horas de cultivo sendo 16 U/g de atividade de PG e 82% de redução de viscosidade. As equações
empíricas obtidas fornecem valores bem próximos aos experimentais nas mesmas condições de
processo, 15,55 U/g de PG e 79,57% de redução de viscosidade para o resíduo sem lavar. Assim
como para o resíduo sem lavar, para o resíduo lavado os picos de produção da enzima ocorreram
para as mesmas condições de processo: umidade de 40%, nitrogênio de 1%, sem adição de fósforo,
com 22 horas de cultivo. Nesta condição, obteve-se atividade da poligalacturonase de 9,84 U/g e
percentual de redução de viscosidade de 81,36%. Estes valores estão bem próximos aos valores
experimentais que foram de 10,1 U/g de PG e 81%, respectivamente. Na extração da PG o sistema
que apresentou os melhores resultados de atividade foi o operado com agitação e a melhor
condição de extração foi com o tempo de contato solvente com o meio de fermentação de 100
minutos e a razão volume de solvente com o meio fermentado 5 (mL/g).
Palavras-chave: Processo biotecnológico, fermentação estado sólido, pedúnculo de caju,
pectinases, poligalacturonase, Aspergillus niger.
Banca Examinadora:
Presidente: Prof
a
. Dr
a
. Gorete Ribeiro de Macedo (UFRN)
Membros: Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato da Silva (UFCG)
Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos (UFRN)
Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (UFRN)
Prof. Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto (EMBRAPA/CE)
Prof
a
. Dr
a
. Sueli Rodrigues (UFC)
iii
ABSTRACT
Pectinases production by solid-state fermentation using cashew apple as
substrate
Pectinolytic enzymes, or simply pectinases, are complex enzymes that degrade pectic
polymers. They have many uses, such as fruit juice extraction and purification, textile fiber
treatment and vegetal oil extraction. The aim of this work was to study the kinetics of
pectinases production by solid-state fermentation, using dry cashew apple residue as
substrate and the microorganism Aspergillus niger CCT 0916. The influence of the initial
medium moisture and medium supplementation with a source of nitrogen and phosphorus
was evaluated using the factorial experimental planning and response surface
methodology. Ammonia sulphate and potassium phosphate were used as nitrogen and
phosphorus source, respectively. The variables time of contact (T) and ratio volume
solvent/fermented medium (RZ), in systems with and without agitation, were evaluated in
order to study the best extraction condition of the produced enzyme. Washed and
unwashed cashew apple residues were tested as the growth medium. The unwashed residue
was obtained by drying the residue after the extraction of the juice, while the washed
residue was obtained by water washing 5 times using the proportion of 1 kg pulp/2 liters of
water. Samples were taken every 12 hours for moisture content, pH, protein, reducing
sugars, polygalacturonase activity (PG) and viscosity reduction. The physical-chemical
composition of the residues had different sugar and pectin levels. For the unwashed
residue, the peak activity was reached with 40% of initial moisture content, 1% of nitrogen
supplementation without phosphorus addition after 30 hours of process. These conditions
led to 16 U/g of PG activity and 82% of viscosity reduction. The calculated models
reached similar values to the experimental ones in the same process conditions: 15.55 U/g
of PG and 79.57% of viscosity reduction. Similarly, the greatest enzyme production for
washed residue was reached with 40% initial moisture content, 1% nitrogen
supplementation without phosphorus addition after 22 hours of cultivation. In this
condition it was obtained polygalacturonase activity of 9.84 U/g and viscosity reduction of
81.36%. These values are close to experimental values that were of 10.1 U/g and 81%,
respectively. The conditions that led to the best PG activity results was the agitated one and
the best extraction condition was obtained with 100 minutes of solvent/medium contact
and RZ of 5 (mL/g).
Keywords: Process, solid-state fermentation, cashew apple, pectinases, polygalacturonase,
Aspergillus niger.
iv
As minhas filhas Catarina e Cecília
Dedico
v
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................................
ii
ABSTRACT...............................................................................................................
iii
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................
viii
LISTA DE TABELAS..............................................................................................
xi
NOMENCLATURA.................................................................................................
xiii
1. Introdução Geral ..................................................................................................
1
2. Aspectos Teóricos .................................................................................................
5
2.1 – Fermentação em estado sólido..................................................................... 6
2.1.1 – Breve histórico da FES....................................................................... 8
2.1.2 – Fatores que influenciam o processo ................................................... 9
2.2 – Biorreatores para FES ................................................................................. 19
2.2.1 – Biorreatores em escala de laboratório................................................. 20
2.2.2 – Biorreatores em escala piloto e industrial........................................... 26
2.3 – Microrganismos usados em FES.................................................................. 29
2.3.1. Aspergillus............................................................................................ 30
2.3.2. Estimativa da biomassa......................................................................... 33
2.4 – Substratos..................................................................................................... 35
2.4.1. Caju....................................................................................................... 37
2.5 – Enzimas microbianas................................................................................... 40
2.6 – Substâncias pécticas..................................................................................... 42
vi
2.7 – Enzimas pectinolíticas................................................................................. 44
2.7.1 – Aplicações das pectinases................................................................... 46
3. Estado da Arte.......................................................................................................
49
3.1 - Produção de pectinase por FES ................................................................... 50
3.2 – Microrganismos usados na produção de pectinase ..................................... 55
4. Metodologia Experimental...................................................................................
58
4.1 – Preparo do resíduo....................................................................................... 59
4.1.1 - Caracterização dos resíduos................................................................ 60
4.1.1.1 - Granulometria.......................................................................... 60
4.1.1.2 - Densidade aparente................................................................... 61
4.1.1.3 - pH............................................................................................. 61
4.1.1.4 – Umidade .................................................................................. 61
4.1.1.5 - Cinzas...................................................................................... 61
4.1.1.6 - Teor de sólidos solúveis (ºBrix)............................................... 62
4.1.1.7 - Teor de açúcares redutores (AR).............................................. 62
4.1.1.8 - Proteína bruta............................................................................ 63
4.1.1.9 – Pectinas.................................................................................... 66
4.1.2 – Relação entre umidade e Aa dos resíduos frente à adição de água .... 67
4.2 – Microrganismo ............................................................................................ 68
4.3 – Meio de cultura e manutenção do fungo ..................................................... 68
4.4 – Obtenção da suspensão de esporos ............................................................. 69
vii
4.5 – Estudo das condições de fermentação na síntese de pectinases .................. 70
4.6 - Processo fermentativo ..................................................................................
71
4.7 – Extração da enzima ..................................................................................... 71
4.8 - Atividade da poligalacturonase ....................................................................
72
4.9 – Percentual de redução de viscosidade ......................................................... 73
4.10 - Influência das condições de extração da enzima........................................ 73
5. Resultados e Discussão .........................................................................................
75
5.1 – Caracterização dos resíduos secos .............................................................. 76
5.1.2 - Relação umidade e Aa dos resíduos frente à adição de água ..............
78
5.2 – Variáveis de processo estudadas.................................................................. 80
5.2.1 - Pedúnculo de caju sem lavar ...............................................................
81
5.2.1.1 – Avaliação do comportamento do processo através da
metodologia de superfície de resposta para o resíduo sem lavar ........... 89
5.2.2 – Pedúnculo de caju lavado ...................................................................
96
5.2.2.1 – Avaliação do comportamento do processo através da
metodologia de superfície de resposta para o resíduo lavado ................
102
5.2.3 – Avaliação do processo através da metodologia de superfície de
resposta usando os picos de produção de enzima ..........................................
110
5.3 – Estudo das condições de extração da PG .................................................... 114
6.Conclusão ..............................................................................................................
118
Referências bibliográficas........................................................................................
121
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Típico reator de coluna em escala de laboratório................................... 21
Figura 2.2. Fotografia e esquema de um reator estéril em escala de laboratório....... 22
Figura 2.3. Sistema para a condução das fermentações em estado sólido utilizando
T. aurantiacus.......................................................................................... 23
Figura 2.4. Biorreator de tambor giratório................................................................. 24
Figura 2.5. Biorreator de tambor perfurado............................................................... 25
Figura 2.6. Fotografia de um misturador de paleta horizontal................................... 25
Figura 2.7. Diagrama esquemático de uma sala típica de koji operando em escala
industrial com biorreator de bandeja..........................................................................
27
Figura 2.8. Esquema geral do reator de leito empacotado com agitação intermitente
e aeração forçada.........................................................................................................
28
Figura 2.9. Morfologia representativa de espécies do gênero Aspergillus.................. 31
Figura 2.10. Estrutura da parede celular vegetal, contendo as moléculas de pectina 43
Figura 2.11. Pontos de ataque das pectinases na molécula de pectina....................... 45
Figura 4.1. Resíduo do pedúnculo de caju................................................................. 59
Figura 4.2. Resíduo seco do pedúnculo de caju lavado............................................. 60
Figura 5.1. Distribuição granulométrica dos resíduos do pedúnculo de caju seco.... 78
Figura 5.2. Relação da Aa (A) e umidade (B) para diferentes volumes de água
destilada adicionados aos resíduos.............................................................................
79
Figura 5.3. Relação linear entre % de Umidade e Volume de água destilada
adicionada aos resíduos.............................................................................................. 80
ix
Figura 5.4. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P..................................... 81
Figura 5.5. Ensaio 2, 60% de umidade, 0% de N e 0% de P..................................... 83
Figura 5.6. Ensaio 3, 40% de umidade, 1% de N e 0% de P..................................... 84
Figura 5.7. Ensaio 4, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.................................. 85
Figura 5.8. Ensaio 6, 60% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.................................. 85
Figura 5.9. Ensaio 8, 60% de umidade, 1% de N e 0,6% de P.................................. 86
Figura 5.10. Ensaio 5, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P................................. 87
Figura 5.11. Ensaio 7, 40% de umidade, 1% de N e 0,6% de P................................ 87
Figura 5.12. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P...................... 88
Figura 5.13. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P...................... 88
Figura 5.14. Diagrama de Pareto para atividade da PG (resíduo sem lavar)............. 92
Figura 5.15. Diagrama de Pareto para o percentual de redução de viscosidade........ 93
Figura 5.16. Influência da adição das fontes de N e P na atividade da PG para 30
horas de fermentação, fixando-se a umidade em 40% (nível -1)...............................
94
Figura 5.17. Influência da adição das fontes de N e P no percentual de redução de
viscosidade para umidade inicial de 40% (nível -1) com 30 horas de fermentação..
95
Figura 5.18. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P................................... 97
Figura 5.19. Ensaio 2, 60% de umidade, 0% de N e 0% de P................................... 97
Figura 5.20. Ensaio 3, 40% de umidade, 1% de N e 0% de P................................... 98
Figura 5.21. Ensaio 5, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P................................ 99
Figura 5.22. Ensaio 7, 40% de umidade, 1% de N e 0,6% de P................................ 99
Figura 5.23. Ensaio 4, 60% de umidade, 1% de N, 0% de P..................................... 100
x
Figura 5.24. Ensaio 6, 60% de umidade, 0% de N e 0,6% de P................................ 100
Figura 5.25. Ensaio 8, 60% de umidade, 1% de N e 0,6% de P................................. 101
Figura 5.26. Ensaios 9,10 e 11, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P............... 102
Figura 5.27. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 22 horas
de fermentação (resíduo lavado)................................................................................ 105
Figura 5.28. Influência da adição de nitrogênio e fósforo na atividade da
poligalacturonase para umidade fixa em 40%............................................................ 107
Figura 5.29. Diagrama de Pareto para percentual de redução de viscosidade com 22
horas de fermentação (resíduo lavado)....................................................................... 108
Figura 5.30. Influência da adição das fontes de nitrogênio e fósforo com umidade
fixa em 40%............................................................................................................... 109
Figura 5.31. Atividade da poligalacturonase variando N e P para umidade fixa em
40% (resíduo sem lavar)............................................................................................. 111
Figura 5.32. Efeito da adição de sulfato de amônia e fósforo no % de redução de
viscosidade, para umidade fixa em 40%.................................................................... 112
Figura 5.33. Percentual de redução de viscosidade variando N e P com 40% de
umidade, resíduo lavado............................................................................................. 114
Figura 5.34. Efeito das condições de extração na atividade poligalacturonásica
(PG) nos sistemas com e sem agitação...................................................................... 116
Figura 5.35. Efeito da razão solvente meio fermentado na extração da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitação.................................................. 117
Figura 5.36. Efeito do tempo de contato solvente meio fermentado na extração da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitação.................................................. 117
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Classificação e principais características do Aspergilluas niger............. 32
Tabela 2.2. Composição química média do caju vermelho........................................ 39
Tabela 3.1. Ocorrência de enzimas pécticas em alguns microrganismos.................. 56
Tabela 4.1. Curva de calibração para análise de proteína.......................................... 65
Tabela 4.2. Composição do meio básico.................................................................. 68
Tabela 4.3. Matriz do planejamento fatorial 2
3
+ 3 repetições no ponto central...... 70
Tabela 4.4. Matriz do planejamento experimental fatorial 2
2
com três repetições no
ponto central e pontos axiais................................................................................. 74
Tabela 5.1. Caracterização dos resíduos do pedúnculo de caju seco......................... 76
Tabela 5.2. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonásica
para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar..........................................................
89
Tabela 5.3. Resultado experimental em termos do percentual de redução de
viscosidade para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar......................................
90
Tabela 5.4. Modelo de primeira ordem obtido para a atividade poligalacturonásica
(PG) por hora de fermentação para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar.........
90
Tabela 5.5. Modelo de primeira ordem obtido para percentual de redução de
viscosidade (RV) por hora de fermentação para o resíduo do pedúnculo de caju
sem lavar................................................................................................................... 91
Tabela 5.6. Análise de variância para atividade da poligalacturonase com 30 horas
de fermentação (resíduo sem lavar)........................................................................... 92
Tabela 5.7. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade com 30
horas de fermentação (resíduo sem lavar)............................................................. 93
xii
Tabela 5.8. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonásica
para o resíduo do pedúnculo de caju lavado..............................................................
103
Tabela 5.9. Resultado experimental em termos do percentual de redução de
viscosidade para o resíduo do pedúnculo de caju lavado...........................................
103
Tabela 5.10. Modelo linear obtido para a atividade poligalacturonásica (PG) por
hora de fermentação para o resíduo de pedúnculo de caju lavado.............................
104
Tabela 5.11. Modelo linear obtido para percentual de redução de viscosidade (RV)
por hora de fermentação para o resíduo de pedúnculo de caju lavado.......................
104
Tabela 5.12. Análise de variância para atividade da poligalacturonase com 22 horas
de fermentação (resíduo lavado).......................................................................
106
Tabela 5.13. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade com
22 horas de fermentação (resíduo lavado)..................................................................
108
Tabela 5.14. Análise de variância para atividade da poligalacturonase, pedúnculo
de caju sem lavar........................................................................................................
110
Tabela 5.15. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade,
pedúnculo de caju sem lavar......................................................................................
111
Tabela 5.16. Análise de variância para atividade da poligalacturonase do resíduo
lavado.........................................................................................................................
113
Tabela 5.17. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade para o
resíduo lavado.........................................................................................................
113
Tabela 5.18. Variação da atividade poligalacturonásica em função das condições de
extração.................................................................................................................
115
xiii
NOMENCLATURA
° Brix Percentual de sólidos solúveis
Aa Atividade de água
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
abs Absorbância
ACC Amêndoa da castanha de caju
AR Açúcares redutores
ATP Adenosina trifosfato
C/N Carbono / nitrogênio
CCT Centro de ciências e tecnologia
DNS ácido 3,5 – dinitro-salicílico
EMPARN Empresa de pesquisa agropecuária do Rio Grande do Norte
F Parâmetro estatístico
FBB Fundação Banco do Brasil
FES Fermentação em estado sólido
FS Fermentação submersa
FSS Fermentação semi-sólida
GL Graus de liberdade
gms Gramas de meio sólido
h Hora
LCC Resina líquida cáustica da castanha de caju
min Minutos
MQ Média quadrática
N Nitrogênio
P Fósforo
xiv
p/v Peso por volume
Pa pressão de vapor de água do substrato
PA Pureza analítica
Pa
0
pressão de vapor da água pura
PG Poligalacturonase
PGL poligalacturonato liase
PMG Polimetilgalacturonase
PMGL polimetilgalacturnato liase
Prot. Proteína
R
2
Coeficiente de determinação
rpm Rotações por minuto
RV Percentual de redução de viscosidade
RZ Razão volume de solvente por gramas de meio fermentado
SQ Soma quadrática
T Tempo
U/g Unidade de atividade por grama de meio
U Umidade
U.I. Unidades internacionais
UR% Umidade relativa de equilíbrio
UV Ultravioleta
v/v Volume por volume
Capítulo 1
Introdução Geral
Ca pít u lo 1 – I n t r odu ç ã o G e r al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
2
1. Introdução Geral
O capítulo 1 apresenta os aspectos gerais sobre os temas abordados na tese, como
definição do processo de fermentação em estado sólido e sua utilização na produção de
enzimas, o que são pectinases e suas principais aplicações. Apresenta também os objetivos
deste trabalho.
A economia brasileira é uma das mais importantes economias do mundo baseadas na
agricultura, produzindo e exportando café, açúcar de cana, soja, mandioca, frutas, entre
outros. Entretanto, a grande produção desses produtos agrícolas gera uma grande quantidade
de resíduos. Nos últimos anos houve um aumento na tentativa de tornar mais eficientes à
utilização desses resíduos, cuja disposição no meio ambiente causa sérios problemas de
poluição (Soccol & Vandenberghe, 2003).
Umas das aplicações em potencial desses resíduos pode ser sua utilização como fonte de
carbono em bioprocessos para obtenção de produtos de maior valor agregado, como enzimas,
álcoois, proteínas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólicos secundários biologicamente
ativos e compostos de aroma (Uenojo & Pastore, 2007). Processos biotecnológicos,
especialmente a técnica de fermentação em estado sólido, vem contribuindo enormemente
para tal utilização (Soccol & Vandenberghe, 2003).
O termo fermentação em estado sólido (FES), ou fermentação semi-sólida, ou
fermentação em meio semi-sólido aplica-se aos processos onde há crescimento de
microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida, onde a quantidade de líquido
apresenta um nível de atividade de água que possa garantir o crescimento e metabolismo dos
microrganismos, mas não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz
sólida (Pinto et al. 2006).
A fermentação em estado sólido apresenta diversas vantagens em relação à fermentação
submersa principalmente quando os agentes de transformação são fungos filamentosos. Uma
delas é que as condições de cultivo são mais parecidas com o habitat natural dos fungos
filamentosos, com isto os fungos estão mais adaptados para crescer e excretar maior
quantidade de enzimas (Pandey, 2003). A concentração dos produtos após extração é maior
que os obtidos no processo de fermentação submersa e gera menos resíduo líquido. Este
processo desperta maior interesse econômico em regiões com abundância em biomassa e
Ca pít u lo 1 – I n t r odu ç ã o G e r al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
3
resíduos agroindustrial, que representa material barato e abundante (Castilho, Alves,
Medronho, 2000).
A produção de pedúnculos de caju no Brasil é estimada em torno de 1,8 milhão de
toneladas/ano concentrando-se basicamente na região Nordeste e com aproveitamento
industrial de apenas 15 % do total
(Kiss, 2005). A quantidade desperdiçada apresenta elevada
concentração de nutrientes que têm potencial de uso para conversão por microrganismos, na
obtenção de produtos de alto valor agregado como enzimas.
As enzimas pectinolítica ou pectinases formam um grupo heterogêneo de enzimas que
hidrolisam as substâncias pécticas (Jayani, Saxena, Gupta, 2005). Podem ser produzidas, em
diferentes combinações, por plantas e por microrganismos como fungos, leveduras e bactérias
(Silva et al., 2005). As pectinases microbianas respondem por 25% das vendas de enzimas
para alimentos (Jayani, Saxena, Gupta, 2005) e são muito utilizadas nas indústrias de sucos de
frutas para reduzir viscosidade, melhorar e aumentar a eficiência de filtração e de clarificação;
no tratamento preliminar da uva em indústrias vinícola; para melhorar a extração de óleos
vegetais e no tratamento e degomagem de fibras naturais para indústria têxtil e de papel
(Uenojo & Pastore, 2007).
A poligalacturonase é a enzima com função hidrolítica principal. Para maioria dos usos
industrial, as poligalacturonases produzidas por fungos provam ser útil pela alta atividade e
atividade ótima em faixa de pH baixa servindo para grande parte das aplicações em processos
com frutas e vegetais (Zheng & Shetty, 2000).
Um grande número de microrganismos produz enzimas pectinolíticas. Fungos são
geralmente usados como fonte das preparações comerciais. Aspergillus e Rhizopus são
espécies freqüentemente usadas pela alta atividade pectinolítica exibida dos membros gerados
(Fawole & Odunfa, 2003).
A produção de pectinases por microrganismos é influenciada pelas condições de cultivo,
em particular pelo meio de cultura, tipo e concentração da fonte de carbono, pH e temperatura
do cultivo além de outros fatores (Bravo et al., 2000). Um aspecto importante na fermentação
em estado sólido é a recuperação adequada dos metabólitos produzidos. A eficiência de
extração é um fator crítico que determina a viabilidade econômica da FES para produção de
enzima. Temperatura e tipo de solvente são conhecidos como importantes parâmetros na
extração de solutos de sólidos. Adicionalmente, ao lidar com enzimas, é necessário levar em
conta a estabilidade térmica da enzima, que é função do tempo de exposição (Castilho, Alves,
Ca pít u lo 1 – I n t r odu ç ã o G e r al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
4
Medronho, 2000).
Devido a estes fatores, o objetivo deste trabalho foi o estudo da produção de pectinases
(cinética fermentativa) através da fermentação em estado sólido, usando como substrato o
pedúnculo de caju seco e como agente da fermentação o microrganismo Aspergillus niger
CCT 0916. Utilizando a metodologia do planejamento experimental fatorial e análise de
superfície de resposta estudou-se a influência da umidade inicial do meio, suplementação do
meio com fonte de nitrogênio e fonte de fósforo. Também visou estudar a melhor condição de
extração da enzima produzida do meio de fermentação. Neste caso, foram estudadas as
variáveis: razão volume de solvente/gramas de meio fermentado e tempo de contato entre as
fases, utilizando dois sistemas de extração com e sem agitação.
Capítulo 2
Aspectos Teóricos
Capítulo 2
Aspectos Teóricos
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
6
2. Aspectos Teóricos
Este capítulo apresenta a fundamentação teórica sobre os assuntos abordados na tese.
O processo de fermentação em estado sólido, os fatores que influenciam o processo, os
biorreatores utilizados e características dos microrganismos e substratos empregados, bem
como as características das enzimas pectinolíticas e seu emprego industrial.
2.1 - Fermentação em estado sólido
A fermentação em estado sólido (FES), ou fermentação semi-sólido (FSS), conforme
definida por Pandey (2002), é um processo fermentativo que ocorre na ausência ou próximo
da ausência de água livre, usando um sólido natural como substrato ou suporte inerte.
Segundo Durand, Boise, Blachère (1988), a fermentação em estado sólido é definida
como um sistema com matriz de partículas sólidas, uma fase líquida ligada a elas e uma fase
gasosa entre as mesmas. Este processo envolve o crescimento de microrganismos em
materiais sólidos nos quais não há líquido livre. O teor de água presente no meio está na
forma complexada ou absorvida na matriz sólida (Correia, 2004).
Outras definições mais detalhadas descrevem a FES como uma técnica de crescimento
de microrganismos sobre e no interior de partículas porosas úmidas (suporte ou matriz sólida)
na qual o conteúdo de líquido contido na matriz sólida deve ser mantido em valores de
atividade de água que assegure o conveniente crescimento e metabolismo celular, mas que
não exceda a capacidade máxima de retenção de água na matriz. A matriz sólida pode ser
classificada em duas categorias: 1) as partículas são, ao mesmo tempo, suporte e substrato
(materiais orgânicos e lignocelulósicos); 2) a matriz sólida é apenas um suporte e deve ser
acrescida de nutrientes (Palma, 2003).
Na FES, o meio de cultura é composto de substratos sólidos, com um determinado teor
de umidade. Assim, a água torna-se um fator limitante do processo, o que não ocorre na
fermentação líquida (submersa), onde há abundância da fase aquosa (Andrade, 1999). O teor
de umidade do substrato deve variar entre 12% até cerca de 80%. Abaixo do limite mínimo,
os microrganismos não se desenvolvem. O limite superior é fixado em função da capacidade
de absorção de água pelo material empregado.
As fermentações submersas (FS) incluem uma variedade grande de processos
microbianos onde a biomassa é completamente rodeada pelo meio de cultivo líquido. Ramana
Murthy, Karanth, Raghava Rao (1993) descreveram que a diferença entre os dois
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
7
bioprocessos refere-se a utilização, na FES, do substrato sólido úmido, o qual é insolúvel em
água e não se encontra suspenso no líquido, ao contrário da FS, onde se utilizam substratos
sólidos dissolvidos ou submersos no líquido. Gervais & Molin (2003) relataram que a
principal diferença entre a FS e FES está na capacidade de mistura dos sistemas. As FS são
reações de mistura perfeita onde, em teoria, cada parte do reator contém, ao mesmo tempo, a
mesma quantidade de microrganismos, nutrientes e metabólitos. No entanto, nos cultivos em
meio sólido, encontram-se sistemas com alta viscosidade, sendo que, para se chegar a
homogeneidade, seria necessária excessiva agitação, o que levaria a ruptura celular. Assim, os
autores concluem que os sistemas de cultivo em meio sólido caracterizam-se por serem meios
heterogêneos, em termos de população microbiana e concentração de soluto (Palma, 2003).
É tarefa difícil generalizar vantagens relacionadas aos processos submersos, ou em
estado sólido, sabendo-se que cada microrganismo pode melhor se adequar a um ou outro
processo, bem como produzir complexos enzimáticos diferentes. Abaixo são citadas algumas
características da FES quando comparada à fermentação submersa.
* Menores riscos de contaminação, devido à baixa umidade do meio.
* Simplicidade no preparo do meio de fermentação, pois se necessita normalmente apenas
do ingrediente principal e de água para umedecer.
* Possibilidade de emprego de resíduos abundantes e de custo reduzido como matéria-
prima, especialmente em países como o Brasil.
* Menor necessidade de espaço.
* O crescimento celular ocorre em condições mais próximas aos dos habitats naturais.
* O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos não estão completamente acessíveis
ao microrganismo.
* Maiores rendimentos e concentração mais alta do produto desejado.
* Baixo consumo de água.
O processo em estado sólido apresenta algumas limitações, que devem ser consideradas.
Neste contexto, destaca-se a dificuldade de remoção do calor gerado pelo metabolismo
microbiano. Além disto, a heterogeneidade da mistura na FES dificulta o controle do
crescimento celular e de parâmetros como temperatura, pH, agitação, aeração e concentração
de nutrientes e produtos, o que torna complicado controlar e automatizar o processo (Palma,
2003).
Pandey, Soccol, Leon (2001) acreditam que a tecnologia de FES não deve ser encarada
como uma técnica que substitui a fermentação submersa. Na verdade, cada uma destas
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
8
técnicas possui suas potencialidades e particularidades. No entanto, existe o consenso da
necessidade de investigação contínua dos fatores relacionados à FES para permitir que o
pleno potencial desta tecnologia seja utilizado.
A maior diferença conhecida entre FES e FS é esporulação de fungo. É muito fácil de
obter esporos de fungo por FES. Cultura de superfície sólida é o habitat natural dos fungos, o
que torna mais fácil de conservar e controlar o ciclo morfológico deles por FES, que por FS.
Uma aplicação prática deste fato é o uso de FES como um procedimento apropriado de
produzir esporos para vários tipos de aplicações industriais. Por exemplo, produção de
inóculo de Penicillium roquefortii para queijos azuis e Camembert, produção de Beauveria
bassiana para uso como biopesticida e a produção de inóculo fresco para começar um novo
processo de FES ou FS.
2.1.1 - Breve histórico da FES
A fermentação em meio semi-sólido vem sendo utilizada desde a antiguidade. O uso do
molho de soja na China é reportado desde 3000 a.C e no Japão e sudoeste da Ásia desde 1000
a.C (Araújo, 2004).
A produção de ácido glucônico, ácido cítrico e enzimas começaram a serem
desenvolvidas entre as décadas de 1920 a 1940. Entre 1940 e 1950 o desenvolvimento de
processos de cultivo semi-sólido aconteceu muito rapidamente.
A partir de 1940, os países ocidentais direcionaram seus esforços para o
desenvolvimento e aprimoramento dos processos de FS, dando pouca ou nenhuma
importância à FES. Depois da 2
a
Guerra Mundial, os processos de FS tornaram-se muito
conhecidos, impulsionados pelo sucesso na fabricação de penicilina, tornando-se modelos
tecnológicos para a produção de qualquer composto por fermentação. Assim, o progresso no
desenvolvimento da tecnologia de FS levou a uma estagnação de FES nos países ocidentais.
Alguns trabalhos isolados, fazendo uso da FES, foram realizados entre 1950 e 1960,
objetivando a transformação de esteróides por culturas de fungos e, entre 1960 e 1970, para a
produção de micotoxinas. No entanto, foi o enriquecimento protéico de rações animais a
principal atividade que motivou a utilização da FES nos países Ocidentais após 1940, pois
tratava-se de um processo que permitia a utilização de resíduos agroindustriais, agregando
valor a um material de baixo custo e, em alguns casos, minimizando a poluição causada por
estes resíduos (Pandey, 2003). Este aspecto, característico da FES, é de interesse global e,
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
9
devido a isto, há um contínuo aumento do número de estudos relativos a este processo, que
teve um grande avanço na última década.
Zheng & Shetty (1999) consideram que a partir da década de 80, os avanços
relacionados aos processos em meio sólido incluem a diversificação no emprego de novos
microrganismos, melhorias do desempenho dos biorreatores, utilização de novos subprodutos
e a descoberta de novos produtos.
Embora a FES tenha sido desenvolvida para a manufatura de produtos tradicionais,
como alimentos e bebidas fermentadas, sua aplicação, atualmente, tem se estendido às
indústrias farmacêuticas e bioquímicas, destacando-se alguns produtos e processos como
enzimas, ácidos orgânicos, etanol, biogás, antibióticos, surfactantes, toxinas, agentes de
biorremediação, cogumelos comestíveis, polissacarídeos microbianos, biopesticidas,
enriquecimento protéico de alimentos fermentados, pré-digestão de rações animais, e
variações dos tradicionais alimentos fermentados. De uma forma geral, a aplicação comercial
dos processos de FES podem ser divididos em dois tipos: 1) aplicações sócio-econômicas
como compostagem de resíduos, ensilagem e aproveitamento de resíduos agroindustrias; 2)
aplicações lucrativas, economicamente, como produção de enzimas, ácidos orgânicos e
alimentos fermentados (Palma, 2003).
Alguns processos de FES, para obtenção de insumos de valor industrial, já se encontram
em níveis de grande escala como a produção de ácido cítrico, que está sendo feita,
comercialmente, na Tailândia e na Indonésia, utilizando-se recursos naturais como substratos.
Recentemente, o Alltech’s European Bioscience Center iniciou a produção, em larga escala,
no México, da enzima fitase, também utilizando processo de FES (Palma, 2003).
2.1.2 - Fatores que influenciam o processo
As condições ambientais como temperatura, pH, atividade de água, nível de oxigênio e
concentração de nutrientes e produtos afetam significativamente o crescimento celular e a
formação de produto. Na FS o controle das condições ambientais é relativamente simples
devido à homogeneidade da suspensão de células microbianas e a solução de nutrientes e
produtos na fase líquida. O baixo conteúdo de umidade na FES possibilita um pequeno
volume de reator por massa de substrato usado quando comparado com a FS e, também,
simplifica a separação do produto. No entanto, existem sérios problemas com respeito à
mistura, troca de calor, transferência de oxigênio, controle de umidade, formação de
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
10
gradientes de pH, nutrientes e produtos como conseqüência da heterogeneidade do sistema
(Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Segundo Gutierrez Rojas et al. (1998) todos os processos de fermentação em estado
sólido, necessitam das seguintes etapas: seleção cuidadosa da matéria-prima ou substrato,
escolha de um microrganismo específico, controle dos parâmetros da fermentação
propriamente dita, separação em alguns casos e a purificação dos produtos.
Segundo Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) e Pandey (2002) o controle de
determinadas variáveis se faz necessário para a obtenção de produtos com características
constantes e uniformes.
Umidade e atividade de água (Aa)
O nível de umidade do substrato é um dos fatores que mais influenciam o processo e
varia de acordo com a natureza do substrato, tipo de produto final e necessidade do
microrganismo. Um nível de umidade muito alto resulta em diminuição da porosidade, baixa
difusão de oxigênio, aumento no risco de contaminação, redução no volume de gás e redução
de troca gasosa. Baixos níveis de umidade levam a um crescimento baixo em relação ao ótimo
e baixo grau de substrato realmente utilizado (Losane et al., 1985).
A umidade nos processos de FES geralmente varia entre 30 e 85%. A umidade ótima
para o cultivo do microrganismo em FES é dependente da capacidade do substrato em reter
água. Por exemplo, o nível de umidade ótimo para o cultivo de Aspergillus niger em arroz é
de 40%, entretanto, para polpa de café é de 80%. Isto ilustra a insegurança de usar a umidade
como parâmetro do crescimento do microrganismo. O requerimento de água pelo
microrganismo deve ser definido em termos de atividade de água (Aa) do meio em lugar da
umidade do substrato sólido (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
A atividade de água do meio (Aa) é definida de acordo com a Equação 1. A umidade
revela a concentração de água existente em determinado material, sendo expresso
normalmente em termos percentuais. Por sua vez, a atividade de água determina a quantidade
de água livre do meio, prontamente utilizável pelo microrganismo, influenciando o
crescimento microbiano, processos bioquímicos e enzimáticos. A atividade de água exerce
papel de maior importância para a atividade fisiológica microbiana do que aquele exercido
pelo teor de umidade do meio (Correia, 2004).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
11
0
Pa
Pa
100
%UR
Aa ==
(1)
Onde:
UR% = umidade relativa de equilíbrio
Pa = pressão de vapor de água do substrato
Pa
0
= pressão de vapor da água pura
A relação entre a umidade e a atividade de água é extensivamente estudada por
cientistas de alimentos e são publicados estudos com as isotermas de adsorção em alimentos.
Apesar destas isotermas serem construídas para substratos usados em processos de FES,
muitas isotermas retratam relações com Aa abaixo de 0,9 e 25% de umidade, condições
geralmente não usadas em FES. São limitados os dados sobre a relação entre Aa e a umidade
na faixa usada em FES (30-85%), em geral esta relação não é linear havendo grande variação
de umidade nesta faixa para pequenas variações de Aa. Além disto, histerese é observada em
grande número de isotermas de sorção determinadas experimentalmente em que água é
adicionada ao substrato (adsorção) diferentemente de quando a água é removida (dessorção)
(Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Na fermentação em estado sólido, o microrganismo possui um limite de água para suas
atividades metabólicas e seu crescimento. A atividade de água ótima para fungos é por volta
de 0,7; para leveduras 0,8 e para bactérias 0,9. Uma pequena flutuação nestes valores ótimos
causa um grande distúrbio no crescimento e metabolismo dos microrganismos (Andrade,
1999).
Para cada espécie de microrganismo utilizado, existe um valor ótimo de umidade do
substrato para o crescimento celular, que pode não coincidir com o melhor valor para a
expressão do produto que se pretende obter no processo, como por exemplo, enzimas. Esta
constatação foi feita por Narahara
et al
. (1982) que estudaram o efeito da umidade do
substrato sobre a atividade de proteases e amilases produzidas por
Aspergillues oryzae
. Os
autores observaram que as atividades específicas diminuíram nos cultivos realizados com o
substrato mais úmido, condição que, no entanto, foi favorável ao crescimento celular. Os
autores concluem que há um valor de umidade ótimo para a produção de enzimas em
substratos sólidos o qual, não necessariamente coincide com o valor correspondente para a
obtenção da máxima concentração celular. Assim, o controle da umidade do sistema pode
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
12
aumentar as produtividades enzimáticas nas FES’s. Han, Gallagher, Wilfred (1987)
confirmam esta conclusão mostrando, em seu trabalho que, a mínima umidade necessária para
o crescimento de
Aspergillus ficuum
não é a mesma para produção de fitase, no cultivo em
estado sólido, a partir de grãos de cereais e sementes de leguminosas. Os autores obtiveram
que, para a produção da enzima, a umidade necessária esteve entre 25 e 35%, enquanto para o
crescimento celular os valores deveriam estar acima de 50%. Neste estudo, o nível da
atividade de fitase foi sensivelmente reduzido quando o conteúdo de umidade do substrato
excedeu os 40%, além de se observar que a faixa ótima de umidade para a produção da
enzima (20 a 35%) foi muito mais estreita do que para o crescimento celular (maior que 50%).
A explicação para estes resultados, segundo os autores, pode estar no fato de que, baixas
umidades do substrato resultam em cultivos com extensa fase lag, havendo tempo suficiente
para se alcançar valores máximos de produção enzimática (Palma, 2003).
Castilho (1997) considerando a produção de poligalacturonase por
Aspergillus niger
em
função da produtividade atingida nos diferentes tempos de fermentação, com umidade
variando de 25 a 70%, concluiu que as maiores produtividades ocorreram em torno de 22
horas, com teores iniciais de umidade iguais a 40% e 55%.
Em substratos sólidos, a proporção de água ligada e não-ligada varia de acordo com a
temperatura e sendo a atividade de água considerada como medida da água disponível, esta
decresce com o aumento da temperatura (Andrade, 1999).
De acordo com Correia (2004), o preparo e a seleção do substrato devem levar em conta
os níveis de atividade de água e umidade ideais. A adição de água ou solução de nutrientes ao
meio pode ser utilizada de forma a alcançar os níveis ideais para o desenvolvimento do
cultivo.
Temperatura e transferência de calor
Os processos fermentativos caracterizam-se por serem exotérmicos. Durante a FES
grandes quantidades de calor são liberadas, sendo estas diretamente proporcionais à atividade
metabólica do microrganismo. Em fungos filamentosos, a temperatura influencia diretamente
a germinação dos esporos, crescimento e formação de produtos. Praticamente em todas as
FES, a temperatura é um fator crítico, devido ao acúmulo do calor metabólico gerado, pois,
além da dificuldade de mistura do meio sólido, a maioria dos substratos utilizados possui
baixa condutividade térmica, o que pode gerar gradientes de temperatura no biorreator (Pinto,
2003).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
13
No início da fermentação, tanto a temperatura como a concentração de oxigênio, são os
mesmos em qualquer ponto do leito. No entanto, com o progresso da fermentação, o oxigênio
se difunde, permitindo que as reações metabólicas aconteçam, fato que, por sua vez, libera
calor, o qual não é facilmente dissipado devido à baixa condutividade térmica do substrato e a
dificuldades na condução através do leito da fermentação. Sendo assim, são formados
gradientes de temperatura e de concentração de oxigênio, que podem se tornar excessivos
dependendo dos parâmetros de controle do sistema. Nesse caso podem ser formadas zonas de
alta temperatura e baixa concentração de oxigênio, que afetam negativamente a produtividade
em termos de formação de biomassa e metabólitos desejáveis (Palma, 2003).
Um dos pontos limitantes no controle da transferência de calor na FES é que as técnicas
e conceitos usados para esta finalidade nas fermentações submersas não são facilmente
adaptados para as fermentações conduzidas em meio sólido. Para remoção do calor gerado
durante a FES, o método do resfriamento evaporativo, injetando-se ar parcialmente saturado,
à baixa temperatura é um dos mais promissores (Palma, 2003).
Várias estratégia para remoção do calor podem ser adotadas:
o Aeração forçada com ar úmido remove calor por condução
o Aeração forçada com ar seco remove calor por evaporação
o Resfriamento da superfície externa do biorreator, com jaqueta de água
o Circulando água resfriada através de um trocador de calor interno
o Colocar o biorreator em uma sala com temperatura controlada ou em
um banho com água (pequena escala)
Estes métodos podem ser usados de forma combinada. Remover calor por evaporação é
o método mais eficiente e pode remover 80% do calor gerado. No entanto, a perda de
umidade nesta escala representa um sério problema na FES onde o conteúdo de umidade já é
baixo. Neste caso, o resfriamento por evaporação pode ser acompanhado por reposição de
umidade.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) apresentam a taxa de produção de proteínas por
Aspergillus niger
em relação à temperatura empregada no processo. Observaram que a
temperatura de 40ºC apresentou menor tempo na fase lag, mas à 35ºC obteve maiores valores
de produção de proteína. Para a temperatura equivalente a 45ºC houve uma perda sensível na
eficiência do processo.
Rizzato, Alegre, Gomes (2005) estudaram as variações de temperatura, a influência da
densidade aparente do leito semi-sólido na produção de poligalacturonase por
Penicillium
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
14
italicum IZ1587,
utilizando bagaço de laranja em reatores de coluna encamisados e
perceberam ao longo do processo que a temperatura no centro do reator se elevou de 28°C
para 31,9ºC com densidade de 430g/L e 36,2°C no leito com densidade aparente de 760g/L. O
crescimento celular foi menor nos meios com maior densidade aparente levando a uma menor
atividade enzimática.
Ghildyal
et al
. (1981) estudaram a produção em larga escala de enzimas pectinolíticas
por FES em farelo de trigo por
Aspergillus carbanerius
CFTRI1048, em um fermentador de
bandeja comercial, com capacidade para 96 bandejas e controle de umidade, temperatura e
circulação de ar, perceberam que quando o controle de temperatura não foi empregado, a
temperatura do meio aumentou desde 25ºC até 45,2ºC devido à geração de calor durante a
fermentação, resultando em diminuição de cerca de 12% na produção da enzima.
pH
Embora o pH seja um fator relevante para a otimização dos processos em estado sólido
o controle e monitoramento deste parâmetro, durante as FES’s, não é fácil de ser realizado
(Pandey, 2003).
Alguns eletrodos têm sido utilizados para medidas do pH diretamente da superfície do
substrato sólido, mas a medida na suspensão aquosa ou no extrato, preparado a partir da
amostra sólida, é o procedimento mais comum. Entretanto, a forma da água nos substratos
sólidos constitui um obstáculo para a medida do pH. Na maioria dos casos mede-se o pH após
colocar, em suspensão, uma parte da amostra sólida em 3 a 4 partes de água. Este método
permite medir o pH global, todavia não é totalmente representativo dos valores de pH nos
micro ambientes, localizados no filme aquoso, onde se passam, na realidade, as reações
bioquímicas. Sendo assim, a determinação exata do pH, em substratos sólidos é feita, com
precisão, somente no início e no final do processo fermentativo (Palma, 2003).
Como tentativa de amenizar o efeito de uma variação brusca do pH, utilizam-se
substratos com boa capacidade tamponante ou a adição de soluções-tampão durante a etapa de
umidificação do substrato (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
O pH é uma variável importante em qualquer processo biológico, havendo valores de
pH mínimo, ótimo e máximo para o desenvolvimento de cada microrganismo. Geralmente os
fungos preferem pH baixo (4,5 – 5,0) e as bactérias pH próximos à neutralidade (6,5 – 7,0). O
pH do meio afeta o metabolismo dos microrganismos por alterar seu conjunto enzimático
(Perazzo Neto, 1999).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
15
O pH de um cultivo varia devido às reações que ocorrem durante as atividades
metabólicas do microrganismo. Quando ácidos orgânicos são secretados, como ácidos acético
ou láctico, causam o decréscimo do pH. Entretanto, o consumo destes ácidos quando presente
no meio causa o aumento do pH. A utilização de fonte de nitrogênio causa variação de pH.
Com sais de amônia o pH geralmente decresce durante o crescimento celular, devido a
formação do íon hidrogênio durante o consumo da amônia. Quando nitrato serve de fonte de
nitrogênio o pH tende a subir (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Inóculo
Araújo (2004) ressalta a necessidade de se otimizar a concentração de inóculo para as
fermentações em substratos sólidos, afirmando que uma concentração baixa de inóculo pode
favorecer o desenvolvimento de contaminantes e formar pouca biomassa. Por sua vez, um
inóculo com elevada concentração de esporos pode exaurir o meio para a formação de
biomassa, reduzindo a quantidade do produto que se deseja obter. Caso se deseje a produção
de biomassa é recomendado o emprego de inóculo elevado para evitar contaminantes, porém
deve-se ter o cuidado para não se elevar muito o custo de produção com a preparação do
inóculo.
Terzi
et al
. (2003) estudaram a influência da concentração de inóculo do
A. niger
3T5B8 e da umidade do meio de fermentação sobre a produção de poligalacturonase em
colunas aeradas, variando a relação solução/substrato em 0,06 e 0,08 L para cada 100 g de
meio e a concentração do inoculo em 10
5
e 10
7
conídios/g de farelo, concluíram que, a
relação de 0,06 e a concentração de conídios de 10
7
foram as condições mais favoráveis para
a síntese de PG com produção máxima de 33,08U/mL em 64 horas de fermentação.
Requerimentos nutricionais
Os meios fermentativos devem conter todos os elementos imprescindíveis à síntese de
material celular e formação de produto, além de serem economicamente viáveis. Quando o
produto desejado é biomassa, a definição do meio deve permitir velocidades de crescimento
elevadas. Por outro lado, quando o interesse recai num metabólito celular, como enzimas, a
situação é mais complexa, haja vista que a constituição do meio se associa, sempre, ao
comportamento de produção desta substância em relação ao crescimento celular. Se a
formação de produto estiver associada ao crescimento, o meio deve satisfazer tanto as
necessidades para a multiplicação celular quanto para a geração do metabólito. No caso em
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
16
que o produto é formado, sobretudo, numa fase pós-exponencial, o meio deve ser desenhado
de forma a controlar a composição nutritiva e os fatores ambientais, a fim de que a duração do
período de formação do produto seja controlada (Correia, 2004).
Os microrganismos necessitam de carbono, nitrogênio, minerais, água, eventualmente
fatores de crescimento e, caso seja aeróbio, oxigênio, para formar biomassa e impulsionar
reações de biossíntese e manutenção celular. Os substratos ricos em carboidratos são os
melhores e as mais baratas fontes de carbono, uma vez que podem ser adquiridos a baixo
custo como resíduo da indústria alimentícia ou atividades agrícolas.
Normalmente os carboidratos são as principais fontes de carbono acessíveis aos fungos,
são metabolizados proporcionando energia, atuando também como precursores na síntese do
material celular. Outras fontes de carbono utilizadas pelos fungos incluem álcool e
hidrocarboneto.
Ao lado da fonte de carbono, outros nutrientes utilizados na composição do meio podem
ser muito importantes para o desempenho do processo (Macedo, 1998).
Pandey
et al.
(1994) cita que o nitrogênio corresponde, em média, a 8-14% do peso seco
de uma bactéria ou fungo e que uma grande variedade de compostos nitrogenados orgânicos e
inorgânicos é utilizada para suprir as necessidades desse elemento durante a biossíntese. A
amônia representa a forma inorgânica de nitrogênio mais assimilável pelos microrganismos.
Quanto ao fósforo, este é utilizado nas reações biossintéticas e também pode ser
polimerizado para manter o nível de fosfato celular e promover o crescimento da célula. O
fosfato inorgânico é a fonte de fósforo necessária ao metabolismo de microrganismos, este é
hidrolisado por fosfatases. Numa célula fúngica cerca de 0,4 a 4,5% da massa seca
corresponde ao fósforo, embora o requerimento para cada microrganismo possa ser variável.
A concentração ótima de fosfatos depende de fatores tais como fontes de carbono, nitrogênio
e O
2
(Macedo, 1998).
Hennis (1996) estudou o efeito da concentração de sais nutrientes, para obtenção de
pectinases em bagaço de laranja usando
Penicillium italicum
e concluiu que as concentrações
que proporcionam os maiores níveis de produção de pectinases foram: 1,20g de NH
4
NO
3
,
0,08 de KH
2
PO
4
e 0,12 MgSO
4
.7H
2
O por 20 gramas de bagaço de laranja. Triplicando estas
concentrações o crescimento do fungo foi quase imperceptível, indicando que houve inibição.
Aeração e transferência de oxigênio
Correia (2004) citou que a aeração cumpre funções básicas, a saber:
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
17
a) Manter condições aeróbicas;
b) Eliminar o dióxido de carbono formado;
c) Regular a temperatura do substrato;
d) Ajustar o nível de umidade.
Os sistemas de FES têm caráter heterogêneo e a transferência de oxigênio é limitada por
um filme líquido na superfície do substrato. Como não existe água livre no meio, a área
interfacial e a pressão parcial de oxigênio tornam-se fatores cruciais. A transferência de
oxigênio acontece, fundamentalmente, em duas instâncias: transferência interpartículas e
transferência intrapartículas.
A maioria dos cultivos semi-sólidos permite o livre acesso do oxigênio atmosférico ao
substrato, já que o oxigênio é capaz de se difundir, com rapidez, pelo filme líquido superficial
formado nas partículas do substrato.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) relataram que há diferentes maneiras para se obter
uma movimentação do ar por entre o substrato, permitindo assim uma melhor transferência de
oxigênio, quer seja pela utilização do material poroso medianamente granulado ou fibroso,
pelo uso de pequena espessura da camada de substrato, pela utilização de bandejas perfuradas
ou reatores com fundo de tela de arame, pela agitação do substrato ou ainda pela introdução
de ar forçado estéril dentro do reator.
A passagem de ar através do leito permite elevadas taxas de crescimento e
produtividade, mas, pode levar ao desenvolvimento do fenômeno de secagem que faz com
que a transferência de nutrientes e metabólitos sejam lentas ou nulas, que a pressão osmótica
do meio aumente e se acelere o processo de esporulação. Para controlar ou minimizar este
problema, o ar deve ser saturado em vapor de água ou próximo da saturação.
A taxa de aeração ótima nos processos de FES é determinada pela natureza do
microrganismo usado, do requerimento particular de oxigênio para o crescimento e síntese de
produtos, da quantidade de calor metabólico gerado, do grau de CO
2
e outros metabólitos
voláteis que devem ser eliminados, da espessura e densidade aparente do meio e da umidade
(Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Agitação
Melhoria na troca de gás pode ser alcançado pela mistura do substrato. A mistura ajuda
a manter a biomassa homogênea, quanto a distribuição de água, nutrientes e inóculo, facilita a
remoção de calor e a aeração. Entretanto, o acesso ao oxigênio é melhor na mistura periódica
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
18
que na mistura constante. Porém, devido à fragmentação mecânica do micélio, pode interferir
na formação dos esporos e no desenvolvimento natural do microrganismo, podendo causar
também a compactação do meio e a danificação das hifas (Correia, 2004).
O processo de FES pode ser dividido em três grupos de acordo com o regime de mistura
usado: estático, periodicamente agitado e agitação contínua. A agitação facilita a manutenção
de condições homogêneas no biorreator, especificamente com respeito à temperatura e
aeração. Facilita também a distribuição uniforme de qualquer aditivo que pode ser adicionado
durante o processo. Pode ser de vital importância quando nutrientes são periodicamente
adicionados ou quando água é adicionada para o controle da umidade ou se tampões, ácidos
ou alcalinos são adicionados para o controle de pH. Dependendo das propriedades do
substrato, a agitação previne ou facilita a aglomeração dos sólidos.
A falta de agitação influencia profundamente à quantidade de substrato que pode ser
usado. Na FES estática têm-se observado que o gradiente de temperatura pode subir 3°C por
centímetro. Se a aeração forçada não for usada na FES estática, o oxigênio no espaço entre as
partículas pode cair ao nível limite e a concentração de dióxido de carbono subir a nível
inibitório.
Na FES periodicamente agitada, a agitação serve para preencher os espaços entre
partículas com ar fresco. A freqüência de mistura requerida depende da fração de vazios do
substrato. A fração de vazios depende das propriedades do substrato como tamanho e forma
das partículas. Também depende da umidade, o excesso de umidade pode deslocar o ar. A
freqüência de mistura é também governada pela necessidade de resfriar o substrato, que é
conseqüência da taxa de crescimento que está associada à produção de calor metabólico.
Entretanto, a mistura do substrato sólido também pode causar danos à fermentação,
incluindo efeito adverso na porosidade do substrato, rompimento da fixação do
microrganismo ao substrato e causar danos ao micélio do fungo devido, às forças causadas
pela abrasão entre as partículas. Fungos filamentosos são particularmente susceptíveis a estas
forças. Hifas aéreas são esmagadas sobre a superfície do substrato, resultando em inibição da
esporulação.
A agitação estimula o crescimento inicial ao ponto em que o calor metabólico liberado
não pode ser removido facilmente, conduzindo ao superaquecimento do substrato. O balanço
entre as vantagens e desvantagens dos efeitos de mistura é diferente para diferentes sistemas
substrato-microrganismo-reator na FES. Em todo caso, a agitação só deve ser provida se for
necessária e a agitação periódica é normalmente suficiente.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
19
2.2 – Biorreatores para FES
Nos processos de fermentação, o biorreator deve criar um ambiente adequado para o
crescimento e atividade dos microrganismos. Para isto, o biorreator deve ser projetado de
forma a impedir a entrada de substâncias estranhas ao ambiente, bem como permitir o estreito
contato entre o meio e o microrganismo, ao longo de todo o cultivo (Pandey, Soccol, Leon,
2001).
De maneira geral, o biorreator ideal deve ter várias características:
* O material de construção deve ser não tóxico e capaz de suportar alta pressão, geralmente
vapor pressurizado para esterilização.
* Não deve ser afetado pela corrosão química.
* Possuir sistema para aeração/agitação bem como permitir a retirada de amostras
periódicas, sem comprometer o processo.
* Um mecanismo de resfriamento para controlar a energia gerada pelo metabolismo na
forma de calor.
* Ser capaz de operar sob condições assépticas, embora alguns dos processos, exemplo
compostagem, podem ser tratados como não-estéril (inóculo natural).
Embora haja numerosos projetos para fermentadores industriais usando fermentação
submersa, houve um desenvolvimento limitado para processos usando fermentação semi-
sólida (Pandey, Soccol, Leon, 2001).
Os reatores, a serem utilizados nos processos de FES, devem ser projetados levando-se
em consideração, não apenas os aspectos gerais de operação, mas também as particularidades
inerentes a este tipo de processo. A variedade de materiais que podem ser utilizados como
suportes ao crescimento e suas características como composição, tamanho, resistência
mecânica, porosidade e capacidade de retenção de água, somados ao fato da baixa umidade do
substrato que conferem problemas de transferência de calor ao sistema, devem ser levados em
consideração no projeto e nas estratégias de controle de um reator que vai operar em um
cultivo em estado sólido. A morfologia do fungo, no que diz respeito à presença de hifas
septadas ou não (o que confere maior ou menor resistência mecânica à eventual agitação do
meio), e a necessidade, ou não, da esterilidade no processo são outros fatores que influenciam
o projeto dos biorreatores para FES (Durand, 2003).
Muitos parâmetros do processo não podem ser acompanhados
on-line
, devem ser
retiradas amostras periodicamente para análise
off-line
. Em sistemas não agitados os
parâmetros do processo certamente variarão dento do biorreator, assim, é quase impossível
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
20
obter uma amostra representativa. Então, devem ser constituídos vários pontos de amostragem
que permitem retirar amostra de vários locais. A mesma consideração se aplica ao
posicionamento de sondas
on-line
como termopares e, eventualmente, eletrodos de pH.
Muitos problemas referentes à condução do processo em estado sólido podem ser
minimizados, ou até mesmo solucionados, pela escolha correta do reator. Durand (2003) fez
uma simples classificação destes biorreatores separando-os em: a) reatores em escala de
laboratório, que permitem a utilização de poucas gramas ou, até mesmo, poucos quilos de
matéria sólida seca; b) reatores em escala piloto ou escala industrial, nos quais podem ser
utilizados muitos quilos e, até, toneladas de material. Para o primeiro caso, segundo o autor,
existe uma grande diversidade de configurações, mais ou menos sofisticadas, sendo mais
comumente utilizados os reatores de bandeja, de leito fixo ou de coluna e de tambor rotativo,
e suas variáveis, o que é confirmado nos trabalhos de Pandey (1991) e Ramana Murthy,
Karanth, Raghava Rao (1993).
2.2.1 - Biorreatores em escala de laboratório
Para estudos de laboratório tem se usado geralmente frascos, placas de Petri e jarras ou
colunas de vidro. Erlenmeyer de boca larga oferece facilidade de manipulação e é empregado
comumente para processo de FES sem qualquer agitação e aeração (Pandey, Soccol, Leon,
2001). Fáceis de usar em grandes quantidades, eles são bem adaptados particularmente para a
escolha do substrato ou microrganismos nos primeiros passos de uma pesquisa e programa de
desenvolvimento.
Um das unidades em escala de laboratório interessante é o equipamento desenvolvido e
patenteado por uma equipe da ORSTOM entre 1975 e 1980. É composto de pequenas colunas
(diâmetro de 4 cm, comprimento 20 cm) cheio com um meio previamente inoculado e
colocado em um banho de água termoregulado (Figura 2.1). Ar saturado com água atravessa
cada coluna. Este equipamento é extensamente usado por pesquisadores e oferece a
possibilidade para aerar o cultivo e também analisar a respiração de microrganismo
conectando as colunas a um cromatógrafo a gás com um classificador automatizado que
analisa cada coluna. Este equipamento é conveniente para estudos preliminares, otimização da
composição do meio e a medida da produção de CO
2
.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
21
Figura 2.1. Típico reator de coluna em escala de laboratório. Várias colunas, detalhada na
parte direita da figura, ficam situadas em um banho de água para controle de temperatura.
Fonte: Durand (2003).
A quantidade pequena de meio (poucos gramas) usado e a geometria da coluna de vidro
são satisfatórias para manter a temperatura nos reatores (a remoção de calor pela parede é
suficiente). O projeto deste reator, porém, não permite retirar amostra durante fermentação e
assim é necessário sacrificar uma coluna inteira para cada análise durante o processo. Este
equipamento, com suas vantagens (aeração forçada, barato, relativamente fácil de usar), pode
constituir um primeiro passo na pesquisa (Durand, 2003).
Uma geração nova de reatores pequenos foi desenvolvida por um grupo da INRA na
França alguns anos depois. Como mostrado na Figura 2.2, este reator tem volume de
funcionamento de cerca de 1 litro.
Comparado ao primeiro modelo, as mudanças principais foram a introdução de uma
sonda de umidade relativa, um circuito de resfriamento no circuito de ar e uma cobertura de
aquecimento para o recipiente. Estas mudanças melhoraram o controle do conteúdo de água
durante o processo. Como para as colunas de ORSTOM, os reatores estão cheios com um
meio previamente inoculado em um ambiente estéril. Cada reator é automaticamente
controlado por computador. Além disso, amostras podem ser retiradas abrindo a cobertura na
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
22
presença de chama sem problema de contaminação. Neste tipo de reator, a temperatura e a
umidade do meio podem ser monitoradas por meio do sensor da temperatura, umidade
relativa e taxa de fluxo de ar que atravessa a camada de substrato. Perfis diferentes para a
temperatura do ar que entra e taxa de fluxo podem ser elaboradas e geradas informações úteis
na ampliação de escala (Durand, 2003).
Figura 2.2. Fotografia e esquema de um reator estéril em escala de laboratório. (1) Tampa
aquecedora, (2) sonda da temperatura do meio, (3) tela de aço inoxidável, (4) medidor de
temperatura do ar de entrada, (5) sonda de umidade relativa, (6) resistência de aquecimento,
(7) sonda de temperatura da água, (8) medidor do fluxo mássico, (9) medidor de nível, (10)
isolamento térmico.
Fonte: Durand (2003)
A vantagem dos biorreatores de leito fixo é que são relativamente simples e permitem
um melhor controle que os de bandeja. Consequentemente, têm sido relatados muitos estudos
com biorreatores de leito fixo. As desvantagens associadas com os biorreatores de leito fixo
incluem dificuldades para esvaziar o biorreator ao final do processo, não uniformidade no
crescimento celular e baixa remoção de calor em grande escala (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
23
Santos, Ender, Palma, (2005) avaliaram alguns parâmetros do processo de produção de
xilanase por
Thermoascus aurantiacus
em reator de coluna. Os ajustes feitos no sistema de
produção incluem a montagem de um novo sistema de umidificação no qual foram acoplados
trocadores de calor para aquecer o ar que entra no reator de coluna. Foram necessários três
trocadores de calor (trocador de tubo-carcaça, serpentina de cobre e coluna de bolhas,
identificados como 1, 2 e 3, respectivamente da Figura 2.3.
Figura 2.3. Sistema para a condução das fermentações em estado sólido utilizando
T
.
aurantiacus.
Fonte: Santos, Ender, Palma, (2005).
Esta série de trocadores permitiu aumentar o tempo de residência do ar no sistema de
aquecimento e umidificação. A montagem experimental da unidade de aquecimento e
umidificação do ar foram feitas acoplando-se um trocador de calor com configuração tipo
tubo-carcaça a uma serpentina de cobre (aproximadamente 2m) e um outro feito com duas
colunas de bolhas, objetivando aquecer e umidificar o ar, conforme ilustrado na Figura 2.3. O
ar passa primeiro pelo trocador de tubo-carcaça, em seguida, passa pela serpentina, que está
imersa no banho termostático. Então, é borbulhado em duas colunas de água, com
temperatura controlada, montadas em série. Estas colunas de bolhas têm as mesmas
dimensões do biorreator. Após estas etapas, o ar aquecido e umidificado segue para a terceira
coluna (identificação 4 da Figura 2.3) na qual é executado o processo de fermentação.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
24
Os reatores de coluna foram construídos de vidro encamisado, tendo como dimensões
altura de 50 cm e diâmetro de 6 cm, correspondendo a um volume de 1,4 litros, equivalendo a
utilização de 500 g de substrato úmido. Esta modificação permitiu manter a umidade do meio
durante 10 dias à temperatura de 45
o
C nos cultivos. A partir destes ajustes foi possível
observar um melhor crescimento celular no reator e, conseqüentemente, maior produtividade
da enzima em estudo. Foi obtido produção máxima de xilanase de 6260 U/gms no cultivo de
T. aurantiacus
.
Outro conceito foi desenvolvido baseado na agitação contínua do meio sólido. Os
biorreatores podem ser de tambor giratório (Figura 2.4), ou tambor perfurado (Figura 2.5) ou
um misturador de paleta horizontal (Figura 2.6). Com ou sem uma jaqueta de água, este tipo
de reator requer mistura constante para aumentar o contato entre a parede do reator e o meio
sólido e também para prover oxigênio ao microrganismo.
Figura 2.4. Biorreator de tambor giratório. (1) entrada de ar, (2) junta giratória, (3) acoplador,
(4) nozzles de ar, (5) linha de ar, (6) rolos, (7) tambor giratório, (8) meio sólido,
(9) aro.
Fonte: Durand (2003)
Para biorreatores de tambor giratório, com um cilindro horizontal, a mistura é provida
pelo movimento de desmoronamento do meio sólido.
A aglomeração de partículas de substrato durante o crescimento do micélio pode levar
ao aumento da dificuldade de regular a temperatura do meio sólido. Além disso, a
transferência de oxigênio dentro destas bolas de meio, aglomeradas pelas hifas do fungo e
também muito freqüentemente pela viscosidade do substrato usado, pode ser muito baixa ou
nula. Além disto, de um ponto de vista de engenharia, uma jaqueta de água no movimento do
biorreator causa problemas na ampliação de escala (Durand, 2003).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
25
Figura 2.5. Biorreator de tambor perfurado.
Fonte: Durand (2003)
Um misturador contínuo de paleta horizontal (Figura 2.6) foi desenvolvido por um
grupo holandês na Universidade de Wageningen. Este fermentador asséptico foi usado para
diferentes propósitos e promove o controle simultâneo de temperatura e umidade. Embora o
transporte de calor pela parede do biorreator seja melhor, este dispositivo fica ineficiente para
volume maior.
Figura 2.6. Fotografia de um misturador de paleta horizontal. Esquema de um biorreator de
mistura horizontal. (1) entrada de ar, (2) temperatura sonda, (3) jaqueta de água, (4) paletas,
(5) saída de ar, (6) motor de agitação, (7) reator, (8) meio sólido, (9) haste de agitação.
Fonte: Durand (2003)
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
26
Geralmente, uma agitação contínua, até mesmo suave, modifica a estrutura do meio
sólido a uma textura pastosa. Dependendo da natureza das partículas, grânulos de barro como
suporte, por exemplo, esta agitação também pode ser abrasiva e assim prejudicial para o
micélio especialmente se a hifa não for septada.
2.2.2 - Biorreatores em escala piloto e industrial
O número de tipos de reator usados em escala piloto e industrial é menor devido a
importantes razões como:
* A utilização de grande quantidade de substrato gera dificuldade na remoção de calor,
a compactação do meio e a formação de caminhos preferenciais. Todos estes fatores
afetam a transferência de calor e massa.
* Devido a fragilidade do microrganismo à mistura há formação de gradientes de
temperatura e oxigênio causando prejuízos as atividades metabólicas dos
microrganismos.
* De acordo com a natureza do substrato pode haver necessidade de preparo como
adição de água, nutriente e esterilização, bem como procedimentos apropriados para
a inoculação sem haver contaminação do meio.
* Controle de problemas como a facilidade de encher, esvaziar e limpar o reator.
O problema de transferência de calor e massa identifica uma aeração insuficiente. Este
problema pode ser resolvido usando as estratégias seguintes: (i) o ar circula ao redor da
camada de substrato ou (ii) passa por ela. Dentro da segunda estratégia, três possibilidades
estão disponíveis: não mistura, com mistura intermitente ou de mistura contínua.
Biorreator de Bandeja (sem mistura)
São os mais simples biorreatores usados em FES. As bandejas podem ser construídas
usando: madeira, metal (ferro ou alumínio) ou plástico. Se for de ferro deve ser de aço
inoxidável ou deve ser pintado para evitar corrosão. O fundo da bandeja deve ser perfurado de
modo a sustentar o substrato e permitir a aeração. A Figura 2.7 apresenta a operação de um
típico biorreator de bandeja.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
27
Figura 2.7 – Diagrama esquemático de uma sala típica de koji operando em escala industrial
com biorreator de bandeja. 1. sala de koji; 2. válvula de água; 3. tubo germicida UV; 4, 8, 13.
soprador de ar; 5, 11. filtros de ar; 6. saída de ar; 7. humidificador; 9. aquecedor; 10
recirculação de ar; 12. entrada de ar; 14. bandejas; 15. suporte de bandejas.
Fonte: Durand (2003).
Usualmente as bandejas são organizadas umas sobre as outras com espaçamento
adequado entre elas, a camada de meio sólido é de no máximo 15 cm. São colocadas em uma
câmara onde o ambiente é criado para manter a temperatura e umidade durante a fermentação.
A temperatura é geralmente controlada pela circulação de ar. A fermentação do koji é
tradicionalmente feita em biorreatores de bandeja desde que começou a ser produzido em
escala comercial. Muitas modificações na estrutura têm sido propostas e usadas de modo a
melhorar a eficiência do processo e melhorar a manipulação. Biorreatores de bandeja têm sido
usadas no estudo em escala de laboratório, de planta piloto e em escala industrial (Pandey,
Soccol, Leon, 2001).
Entretanto, requerem uma área operacional grande e trabalho intensivo. Este modelo
não permite a manipulação mecânica. O substrato é esterilizado separado. Por estas razões
não é de uso atrativo.
Biorreator de mistura intermitente com circulação de ar forçado
Em geral, estes biorreatores podem ser descritos como de leito empacotado onde ar
passa através do leito. Um dispositivo de agitação é usado para misturar o leito
periodicamente e ao mesmo tempo, água é borrifada se necessário.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
28
Similar ao reator estéril usado no processo de malte da cevada, foi construído um
equipamento para o processo de fabricação de molho de soja. Um compartimento contém os
sólidos estáticos no biorreator que é geralmente retangular com vários metros de
comprimento. O substrato é preparado e inoculado em uma malha de arame e ar condicionado
é forçado através do leito. Um agitador rolante mistura periodicamente o meio sólido. Embora
este tipo de reator seja muito simples e básico, é extensamente usado por muitos fabricantes
asiáticos de molho de soja.
Um grupo da INRA em Dijon (França) desenvolveu um processo não estéril com
estratégia baseada neste princípio (Figura 2.8).
Figura 2.8. Esquema geral do reator de leito empacotado com agitação intermitente e
aeração forçada. (Te, URe e FAe) respectivamente a temperatura, umidade relativa, e taxa de
fluxo do ar na entrada, (Ts, URs e FAs), respectivamente,a temperatura, umidade relativa e
taxa de fluxo de ar na saída, (Tm) temperatura do meio sólido, (Am) quantidade de água do
meio sólido, (Mg) massa total do meio sólido, (A) agitação, (E)
spray
de água.
Fonte: Durand (2003)
A temperatura (Tm) e a umidade (Am) do meio são mantidos por um regulador de
temperatura e pela umidade relativa e taxa de fluxo do ar de entrada. Também é necessário
borrifar água (E) e agitar periodicamente. O volume de água borrifado é calculado de medidas
on-line
da massa total do meio (Mg) e estimativa das perdas de massa devido à respiração
(CO
2
).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
29
2.3 – Microrganismos usados em FES
Bactérias, leveduras e fungos filamentosos podem crescer em substratos sólidos.
Contudo, são os fungos filamentosos os microrganismos mais adaptáveis a este tipo de
processo. Os fungos são capazes de crescer em baixos valores de atividade de água e altas
pressões osmóticas. O próprio modo de crescimento dos fungos gera uma vantagem sobre os
microrganismos unicelulares. A combinação de prolongamento da região apical e a geração
de novas hifas permitem aos fungos uma rápida colonização dos substratos sólidos, além de
uma melhor utilização dos nutrientes disponíveis. De forma coordenada ao crescimento, os
metabólicos excretados pelo microrganismo permitem a penetração das hifas nas partículas
sólidas, o que aumenta o contato e a disponibilidade dos substratos macromoleculares, bem
como a assimilação e metabolização dos nutrientes (Pinto, 2003).
Como exemplos, podem ser citados o uso de culturas de
Rhizopus, Trichoderma,
Penicilliu
m ou
Aspergillus
para obtenção de enriquecimento protéico e produção de enzimas,
Mucor
ou
Rhizopus
na produção de renina microbiana,
Penicillium
para a produção de
penicilina e
Fusarium
ou
Giberella
para obtenção de ácido giberélico. Também pode ser
citada a utilização das bactérias
Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus e Streptococcus
thermophilus
para produção de ácido lático (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
A escolha do microrganismo adequado é importante no sucesso da produção desejada.
A amilase pode ser produzida por 28 tipos diferentes de culturas microbianas. O
Aspergillus
niger
, por exemplo, tem a capacidade de produzir 19 tipos diferentes de enzimas, dependendo
da indução e/ou do substrato.
A reprodução dos fungos filamentos pode acontecer pelos esporos, que são germinados,
formando estruturas filamentosas chamadas hifas, cujo crescimento é limitado na sua porção
terminal. É importante ressaltar que, um mesmo micélio, formado pelo conjunto das hifas,
apresenta diferentes estágios fisiológicos, uma vez que as hifas próximas à extremidade, que
apresentam crescimento, são mais jovens que as demais, localizadas no interior do micélio,
onde não se detecta crescimento. Como as hifas de extremidade são proporcionalmente muito
menores em relação à fração interna do micélio, pode-se dizer que a proporção de biomassa
nova em relação à massa total diminui com o avanço da cultura (Palma, 2003).
Na FES o crescimento acontece pela extensão das pontas das hifas sobre a superfície
sólida, sendo a direção e a velocidade do crescimento determinadas pela disponibilidade dos
nutrientes, bem como pelas características do substrato (Losane
et al.
, 1985). As hifas
crescem ao longo da superfície da partícula sólida úmida utilizando o filme líquido como
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
30
fonte de umidade e nutrientes e os poros do substrato como espaço para o crescimento em
busca de novos nutrientes.
Palma (2003) cita em seu trabalho uma representação do crescimento dos fungos
filamentosos em FES, no qual são apresentados dois tipos de hifas, assim denominadas: 1)
hifas aéreas; 2) hifas penetrativas. As hifas aéreas aparecem sobre a interface ar-líquido e as
hifas penetrativas estão em contato direto com o substrato. As hifas penetrativas podem
desempenhar um importante papel na disponibilidade do substrato pois, na maioria das vezes,
estes são polímeros insolúveis em água que precisam ser degradados em frações
monoméricas, solúveis em água, para serem, então, consumidos pelos fungos. Portanto, esta
degradação enzimática do substrato, pela fração penetrativa das hifas, é um fator determinante
para o processo, pois, a partir daí, os fragmentos difundem-se até a superfície das partículas,
sendo transformados, pela ação de outras enzimas, em compostos metabolizáveis.
As hifas aéreas parecem ser responsáveis pelo consumo do oxigênio, uma vez que esta
fração do micélio não tem contato direto com o substrato. A adesão dos fungos filamentosos
às partículas do substrato, durante o crescimento é uma importante propriedade destes
microrganismos uma vez que favorece a absorção dos nutrientes. No entanto, esta forte
ligação a uma matriz sólida implica na impossibilidade de separação entre o micélio e o
substrato e, consequentemente, na determinação, de forma direta, da biomassa formada
(Palma, 2003).
2.3.1. Aspergillus
Trata-se do gênero mais comum dos fungos filamentosos, além de ser um dos mais bem
estudados. As espécies que compõe este gênero têm ampla distribuição mundial estando
presente na superfície, no ar e na água, tanto em organismos vegetais bem como em animais,
além de estarem associadas com a deterioração de materiais vegetais e alimentos,
principalmente em regiões de clima tropical e sub-tropical. Muitas das espécies de
Aspergillus
são utilizadas para a obtenção de enzimas, na biossíntese química e na transformação de
compostos. Há espécies patogênicas para o homem, para os animais e há aquelas que durante
seu metabolismo produzem tóxicos. A taxonomia atual reconhece 150 espécies do gênero
Aspergillus
, entretanto somente 30 destas são bem definidas e atualmente facilmente
distinguíveis (Rosa, Campos, Baroni, 2002).
As colônias geralmente têm crescimento rápido e exuberante, inicialmente são brancas,
amarelas, passando para marrom ou para o negro. A colônia é composta por micélio aéreo
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
31
com conidióforos eretos, densamente distribuídos sobre a superfície do meio e farta produção
de conídeos.
As estruturas morfológicas são características importantes para a sua classificação. As
espécies pertencentes a este grupo produzem tipicamente o “aspergillum” ou “cabeça
aspergillar”, que consiste de uma haste (estipede) asseptado que termina em uma vesícula,
sobre a qual nascem às células conidiogênicas (fiálides e métulas). As fiálides produzem os
conídeos com diferentes pigmentações e ornamentações. Uma cabeça aspergillar simples
(uniseriada) é formada por uma vesícula, total ou parcialmente coberta por uma série de
células alongadas (fiálides) que geram os conídeos. Quando se diz que a cabeça aspergillar é
bisseriada, é porque, antes da camada de fiálides, esta apresenta uma camada de células que as
geraram, chamadas de métulas. A anatomia da cabeça aspergillar, forma da estrutura
anamórfica que caracteriza o gênero esta apresentada na Figura 2.9. A estrutura inteira,
incluindo a cabeça aspergillar, a haste (ou estipede) e a célula pé, é chamada de conidióforo.
Figura 2.9. Morfologia representativa de espécies do gênero
Aspergillus.
Fonte: Rosa
et al.
(2002)
Os conidióforos são formados por uma estípede originada em uma célula pé (célula
podal), não ramificada, e termina em uma vesícula. A parede da estípede pode ser lisa ou
rugosa.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
32
As fiálides são diretamente inseridas sobre a vesícula (monoseriados) ou a partir das
métulas que estão inseridas diretamente a partir da vesícula (bisseriados). As estruturas
conidiogênicas (métulas ou fiálides) podem estar distribuídas sobre toda a superfície da
vesícula ou somente no extremo dela.
Os conídeos são formados a partir das fiálides e se dispõem em cadeias curtas
compactas colunares ou de forma radiada. Estes são unicelulares, lisos ou rugossos, hialinos
ou pigmentados.
O conjunto de estruturas reprodutivas, isto é, estípede, vesícula, métulas, fiálides e
cadeias de conídeos, recebem o nome de Cabeça Aspergillar.
A classificação e principais características do
Aspergillus niger
são apresentadas na
Tabela 2.1.
Tabela 2.1. Classificação e principais características do
Aspergilluas niger
.
CLASSIFICAÇÃO PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS
Reino Fungi
Divisão Eumycota
Tipicamente micelial, algumas vezes
unicelular.
Subdivisão Deuteromycotina
Talo micelial e septado ou unicelular;
reprodução sexual ausente, mas a parasexual
pode ocorrer.
Classe Hyphomycetes
Formas miceliais estéreis ou produzindo
conídios em hifas separadas ou agregadas na
ausência de conidiomata.
Ordem Moniliales
Micélio hialino, contendo conidióforos livres,
que se projetam do micélio de forma irregular.
Família Moniliaceae
Os conidióforos são solitários livres, que se
projetam do micélio de forma irregular.
Gênero
Asperillus
Micélio septado. Conidióforo erecto com
terminais globosos dos quais emergem fiálides
com conídios arredondados unicelulares e de
coloração negra, esverdeada ou amarela.
Espécie
niger
Conídios globulosos de aspecto rugoso, com
equinulações verdadeiras, coloração negra,
medindo em torno de 4 a 5 µm de diâmetro.
Fonte: Couri (1993)
O
Aspergillus niger
se caracteriza por colônia de 4-5 cm de diâmetro, quando
desenvolvida em agár Czapek a 25
o
C por 7 dias. Consiste de uma base compacta branca ou
amarela, com uma densa camada de conidióforos marrom escuro ou preta. A cabeça tem
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
33
forma radiada, preta, e composta de cadeias de conídeos que tendem a se dividir com a idade.
Os conidióforos são formados por estípede liso hialino, também de coloração marrom,
vesículas globulares com 50-100 µm de diâmetro, fialides ou métula com 7,0-9,5 µm x 3-4
µm, métulas hialina ou marrom, muitas vezes septada com 15-25 x 4,5-6,0 µm, conídia
globular com 3,5-5 µm de diâmetro, marrom, ornamentadas com verrugas, lombadas e cume.
Tem como importante metabólito tóxico
naphtho-T-pyrones, malformins
(Samson
et al.,
1995).
2.3.2. Estimativa da biomassa
Em todo bioprocesso, a biomassa constitui um parâmetro fundamental na caracterização
do crescimento celular. Os bioprocessos podem ser divididos em dois tipos, o primeiro tipo
aponta a produção de biomassa, enquanto o segundo tipo envolve produção de metabólitos
(primário ou secundário). No primeiro caso, a medida de biomassa é muito importante,
porque é o objetivo principal do processo submerso ou de fermentação em estado sólido. Na
produção de metabólitos estes podem ser proporcionais à quantidade de biomassa. Então, para
aperfeiçoar a produção de metabólitos, especialmente um metabólito secundário, é necessário
aperfeiçoar o crescimento celular.
Em FES, existem três fases, uma matriz sólida (orgânico, mineral ou sintético), uma
fase líquida, ligada a matriz, e uma fase gasosa. O microrganismo está presente a todas estas
fases. Então, diferente da fermentação submersa, a determinação direta da biomassa em FES é
difícil, devido a problemas de separação do microrganismo da fase insolúvel. Não obstante,
em alguns casos que envolvem esporos e microrganismos unicelulares (bactérias e leveduras),
esta separação é possível. Porém, quando o crescimento de fungos estiver na forma de
micélio, é impossível, porque as hifas do fungo penetram dentro da matriz sólida, ligando o
micélio à fase sólida (Durand
et al.
1993).
Devido a este fato são utilizados métodos indiretos para estimação da biomassa. Os
métodos indiretos podem ser classificados em:
* Baseados nos constituintes celulares como glicosamina, ergosterol, ácidos nucléicos
e proteínas;
* Baseados na atividade biológica como ATP e consumo de oxigênio e/ou produção
de CO
2
;
* Baseados no consumo de algum componente do meio (nutrientes).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
34
O método de dosagem do conteúdo de glicosamina tem por princípio a quantificação de
um constituinte majoritário da parede celular dos fungos, a quitina, um polímero linear
insolúvel, constituído por ligações α-1,4 de acetilglicosamina. O método de dosagem do
monômero baseia-se na despolimerização da molécula de quitina, seguida pelo ensaio, por
espectrofotometria, da quantidade de glicosamina liberada (Palma, 2003).
Em seu trabalho experimental Degranges
et al.
(1991) avaliaram o teor de biomassa
pela análise da glicosamina como constituinte celular. A análise foi efetuada em duas etapas:
hidrólise e extração. O principal problema, neste procedimento, segundo os autores, é a
reprodutibilidade e a quantificação da glicosamina. Os dados mostraram que a glicosamina
apresenta comportamento constante, mas a análise deste constituinte sofre influência do meio
de cultivo. Assim, os autores afirmam que a glicosamina é um bom indicador do
desenvolvimento da biomassa devendo ser usada, no entanto, para estudos que visem otimizar
a concentração de nutrientes nos meios.
O consumo de oxigênio, durante o metabolismo dos fungos aeróbios, está associado ao
crescimento celular e tem sido utilizado para a estimativa de biomassa em FES. A medida do
oxigênio é simples, rápida e pode ser feita diretamente no sistema fermentativo, utilizando-se
um analisador de oxigênio paramagnético ou um cromatógrafo gasoso. Entretanto, para a
estimativa da biomassa, a partir destes dados, é necessário que se estabeleça uma correlação
matemática entre o consumo do oxigênio e a formação de biomassa. Alguns modelos foram
propostos por Sato
et al
. (1983), Soccol
et al.
(1994) e Goudar & Ellis (2001). Os métodos
baseados na composição dos constituintes celulares dos fungos são utilizados para determinar
a correlação nos modelos e, dentre estes, a medida de glicosamina é a mais utilizada. Os
trabalhos de Nagel
et al.
(2000) e Rosenblitt
et al.
(2000) relatam dados positivos acerca desta
associação na construção dos modelos.
Sargantanis
et al.
(1993) estimaram o valor da biomassa através da determinação de
proteína; assumiram que 1,0 grama de células de
Rhizopus oligosporus
continha 0,2758g de
proteína.
Embora muitos métodos de estimativa de biomassa indireta existam para FES, nenhum
é idealmente usado para todas as situações, porque praticamente todos os componentes da
biomassa variam de acordo com a fase de crescimento, a natureza do meio e a relação de C/N
para um mesmo meio. Porém, em alguns casos, como o enriquecimento de proteína de um
subproduto, é importante saber a quantidade de proteína produzida, e, assim, a estimativa de
biomassa no sentido restrito, não é de interesse. Da mesma maneira, a otimização da produção
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
35
de uma enzima que é relacionada ao crescimento do microrganismo pode ser realizada sem a
medida de biomassa (Durand, 2003).
2.4 - Substratos
Compostos naturais e sintéticos podem ser usados como substrato do cultivo semi-
sólido. Normalmente são substâncias insolúveis em água, nos quais a água absorvida é
aproveitada pelo microrganismo para crescimento e atividade metabólica. Exemplos destas
matérias são resíduos de frutas, farelo de soja e materiais porosos como argila.
Materiais sintéticos como o poliestireno, podem ser usados como suporte inerte, mas,
atualmente, os resíduos agroindustriais são os substratos mais pesquisados. Em geral são
baratos e abundantes. Além do mais, têm estrutura polimérica e composição rica em amido,
lignocelulose e pectina. Estes materiais orgânicos, em sua maioria insolúvel em água, são
fontes de carbono e nitrogênio, atuando como suporte para o crescimento de microrganismos.
Normalmente são materiais particulados, e a água presente no meio encontra-se complexada
na matriz sólida, onde pode ser aproveitada pela cultura microbiana. Bactérias e leveduras
crescem na superfície, enquanto que a estrutura miceliar de fungos filamentosos penetra nas
partículas do substrato (Correia, 2004).
Atualmente os esforços concentram-se no emprego de subprodutos agroindustriais
como substrato, buscando obter produtos de alto valor comercial e baixo custo de produção.
Os grupos de pesquisa existente ao redor do mundo tiram proveito de substratos naturalmente
abundantes em sua região. Vários resíduos agroindustriais podem ser utilizados como
substrato, como o bagaço de laranja, farelo de trigo e de arroz, farelo de soja, polpa de maça,
polpa de café, quirela do milho, bagaço de cana, bagaço de abacaxi, pedúnculo de caju etc.
Na FES o substrato sólido não apenas fornece os nutrientes para os microrganismos,
mas também serve de suporte para o crescimento destes (Pandey, 2002). Aqueles materiais
que fornecem todos os nutrientes necessários ao crescimento celular são considerados
substratos ideais. Entretanto, em muitos casos, alguns nutrientes encontram-se em
concentrações abaixo da mínima, sendo necessária suplementação do meio.
Pode-se incorporar soluções de nutrientes ao substrato sólido, visando adequá-lo melhor
às condições nutricionais do microrganismo para a fermentação desejada. Como no caso de
enriquecimento protéico, quando são utilizadas fontes de nitrogênio tais como amônia, uréia
ou soluções sintéticas como o sulfato de amônia. As pectinases comerciais são enzimas
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
36
indutíveis e substratos com altos teores de pectina, como polpa de beterraba, casca de cítricos
e polpa de maçã estimulam a produção destas enzimas.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) afirmam que o substrato necessita de um pré-
tratamento para se adequar às condições necessárias ao crescimento e metabolismos dos
microrganismos. Recomendam os seguintes processos para facilitar a atuação dos
microrganismos sobre o meio:
1- Esmagamento, quebra, moagem e peneiramento visando adequar o meio a
granulometria mais adequada ao processo;
2 - Suplementação de nutrientes e correção de pH, para suprir a falta de algum
nutriente ou adequar as melhores condições de crescimento microbiano;
3 - Hidrólise ácida ou alcalina de material celulósico, visando facilitar a atuação
enzimática;
4 - Embebição, para regular o teor de umidade inicial do processo;
5- Vaporização ou aquecimento, visando a gelatinização ou expansão de substrato;
6 - Adição de agente seqüestrante, com o objetivo de retirar íons metálicos do meio,
que podem diminuir o rendimento do processo;
7 - Processo de esterilização, que visa à diminuição ou eliminação de possíveis
contaminações.
A esterilização do substrato pelo calor, além de ser dispendioso pelo alto consumo de
energia, pode causar modificações nas características do substrato, tais como textura ou
qualidade nutricional. Alguns autores mostram que, a partir da adição de uma quantidade
grande de inóculo que visa evitar ou abrandar o problema de contaminações, a esterilização
do meio não é necessária.
O substrato deve ter algumas características que possibilitem o maior rendimento do
processo. A principal peculiaridade é o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o
meio e, para tanto, de suas características mais importantes destacam-se a porosidade, o
tamanho e o formato das partículas (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
A maior parte dos substratos é de origem agroindustrial, variando entre grãos, raízes,
resíduos ou subprodutos. Alguns substratos demandam pré-tratamento mas, em geral, sofrem
apenas corte ou moagem, o que gera material formado por partículas de tamanho diverso.
Partículas de tamanho reduzido oferecem maior área superficial ao ataque dos
microrganismos, mas ao mesmo tempo, tendem a compactar-se facilmente. Neste caso, a
respiração e aeração do sistema são dificultadas. Partículas maiores, por sua vez, promovem
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
37
maior espaço interpartículas, embora possuam área superficial menor, segundo Pandey,
Soccol, Leon (2001).
Quanto à porosidade, a principal qualidade desta característica é a capacidade de
absorção de água, que facilita o transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os
microrganismos.
Echevarria, Rodrigues Leon, Espinosa (1991) realizaram um estudo sobre o
enriquecimento protéico de cana-de-açúcar, através do microrganismo
Aspergillus niger,
onde
o substrato utilizado era composto de partículas de 1,4 mm, proporcionando um bom
rendimento do produto fermentado. O que leva-se a acreditar que cada processo apresenta um
tamanho de partícula ideal, dependendo do tipo de substrato e biorreator utilizado.
2.4.1. Caju
O cajueiro (
Anacardium occidentale
L.) é uma planta perene, nativa do Brasil. Sua
exploração econômica é atividade relativamente nova, dos anos 1950 e 1960. A quase
totalidade (94%) da produção está concentrada no Nordeste brasileiro.
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a produção
nacional de castanha de caju em junho de 2007 foi superior a 250 mil toneladas. Os estados
com maior produção são: Ceará, com 136,7 mil toneladas, Piauí, com 64,1 mil toneladas, o
Rio Grande do Norte, com 49,7 mil toneladas e a Bahia, com 6,6 mil toneladas (Assessoria de
Comunicação FBB, 2007).
Estudos da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) mostram que cada
quilo de castanha corresponde a 9 quilos de polpa. Assim, a estimativa da produção da polpa,
em 2007, é de 2,3 milhões de toneladas. Calcula-se que é utilizado apenas de 15% a 20% da
polpa na fabricação de doces, sucos, vinho ou consumo
in natura
, sendo que 80% é
desperdiçado, ou seja, 1,9 milhões de toneladas são resíduos, tratados como lixo.
O caju é um fruto de especial interesse botânico, sendo conhecido pela sua castanha de
alta qualidade. O fruto do cajueiro, a castanha, é definido como um aquênio reniforme
pendente do pedúnculo floral, hipertrofiado, carnoso e suculento, denominado comumente de
caju. A castanha é constituída basicamente de três partes: a casca, a película e a amêndoa. A
proporção entre estes três componentes é de 65,4% de casca, 2,5% película e 32,1% de
amêndoa (Faria, 1994).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
38
A média da massa do pedúnculo situa-se na faixa de 70 a 90 gramas, com comprimento
em torno de 6 a 10 cm. A boa aceitabilidade e o consumo de caju
in natura
estão relacionados
a dois aspectos principais: adstringência e coloração da casca (Faria, 1994).
Internamente o Brasil consome pedúnculos do fruto, amêndoa da castanha e o líquido
da castanha. O Brasil exporta quase a totalidade da sua produção do líquido da castanha (LCC
– resina líquida cáustica) e amêndoa da castanha (ACC).
São conhecidas cerca de vinte variedades de caju, classificadas segundo a consistência
da polpa, o formato, o paladar e a cor da fruta (amarela, vermelha ou roxo-amarelada,
dependendo da variedade).
Várias pesquisas foram desenvolvidas para a obtenção de genótipos de cajueiro que
permitissem não só o aumento de produtividade, como também a melhoria da qualidade da
castanha para a indústria e o aproveitamento do pedúnculo. Desse modo, a recuperação no
campo vem sendo feita com o uso de clones, cultivados dentro das normas técnicas de
produção (Pereira
et al
., 2005).
Entretanto, o pedúnculo também é importante pois constitui proveitosa fonte alimentícia
no Nordeste do Brasil, na forma
in natura
ou processada. O mercado consumidor para
pedúnculo
in natura
é crescente e exigente em frutos que apresentem alta resistência ao
manuseio, formato piriforme e frutos de coloração laranja e vermelha (Moura
et al.,
2001).
Até muito recentemente, os pedúnculos eram vendidos exclusivamente em feiras locais,
porém hoje alcançam supermercados em outras partes do País, podendo ser mantidos em boas
condições por até quinze dias após a colheita, devido ao desenvolvimento de técnicas
adequadas de manuseio e conservação pós-colheita (Moura
et al
., 2001).
O valor nutritivo do pedúnculo de caju revela-se sob a forma de vitaminas e sais minerais.
A Tabela 2.2 apresenta a composição média do pedúnculo.
O conteúdo de vitamina C do pedúnculo é superior ao da goiaba, do mamão, do limão e
do tomate, que apresentam, respectivamente, 175 a 236, 75 a 91, 48 a 57, 32 a 38 e 26 a
30mg.100g
-1
, o que o coloca como grande fornecedor desta vitamina. Além desta, destaca-se
ainda a vitamina A e sais minerais como cálcio, ferro e fósforo (Simões
et al.,
2001).
A composição físico-química do pedúnculo varia largamente em função da variedade,
do estado de maturação, do tamanho, da duração da colheita e de variações ambientais
regionais, entre outros fatores.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
39
Tabela 2.2. Composição química média do caju vermelho
Discriminação Pedúnculo de caju
Umidade (%) 86,07
° Brix 10,98
Açúcares totais (%) 8,38
Açúcares redutores (%) 8,00
Proteínas (Nx6,25)(%) 0,74
Extrato etéreo (%) 0,39
Amido 1,33
Tanino (%) 0,40
Àc. Total (% àc. Málico) 0,34
Àc. Ascóbico (mg/100g) 204,00
pH 4,48
Carotenóides 0,22
Vitamina A (U.I.) 11,32
Cinzas (%) 0,38
Cálcio (mg/100g) 14,70
Ferro (mg/100g) 0,35
Fósforo (mg/100g) 32,55
Fonte: Faria (1994).
Sob o ponto de vista social, a cajucultura ainda se caracteriza como uma das principais
atividades da população rural. Em quase sua totalidade ela é cultivada por pequenos
produtores. Deste modo, a produção acontece na época da seca, justamente no período de
entressafra das demais espécies cultivadas na região.
Esta peculiaridade demonstra a relevância da cultura para a manutenção da mão-de-obra
e a fixação do homem no campo. No decorrer do ano, a atividade emprega cerca de 40 mil
pessoas no campo e 15 mil na indústria.
A ocupação de mão-de-obra temporária nos trabalhos de colheita que ocorre no período
de setembro a dezembro chega a 200 mil pessoas. Estratificando estes números entre os
principais Estados produtores, vê-se que no Ceará são gerados 30.000 empregos diretos e
100.000 indiretos. No Piauí a atividade proporciona 28.300 trabalhadores rurais permanentes
e 56.700 temporários (Moura, 2007).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
40
Com uma área plantada em torno de 120 mil hectares, o Rio Grande do Norte é o
terceiro produtor nacional de castanhas de caju, representando divisas superiores a 20 milhões
de dólares e oferta de 159 mil empregos diretos e indiretos. Objetivando aumentar a
produtividade da cultura e melhorar a qualidade de castanhas e aproveitamento de pedúnculos
de caju, de forma a tornar a atividade mais competitiva, a EMPARN vem desenvolvendo
atividades de pesquisas nas áreas de fertilidade dos solos, melhoramento genético, manejo
cultural, propagação vegetativa e aproveitamento do resíduo da indústria de sucos na
alimentação animal. O resíduo da indústria de suco, depois de enriquecido, pode ser usado
como ingrediente de rações, representando até 45% da formulação de concentrado para
ruminantes e até 30% para aves caipiras.
Na tentativa de minimizar os desperdícios da produção e industrialização do pedúnculo
de caju, o Laboratório de Engenharia Bioquímica, CCT/UAEQ/UFCG, vem desenvolvendo
pesquisas com a finalidade de valorizá-lo, utilizando o suco para a produção de fermentado,
vinagre e aguardente e aumentar o valor agregado do bagaço do pedúnculo, através do seu
enriquecimento protéico por leveduras. Com o acréscimo de microrganismos, esse resíduo
pode aumentar seu valor nutricional em proteínas, vitaminas, fosfato e cálcio, importantes
fatores de crescimento para os animais, podendo posteriormente ser utilizado como fonte
alternativa de alto potencial protéico, em ração animal, tornando-se uma boa estratégia para
solucionar alguns dos problemas relacionados às limitações e desperdícios de alimentos,
principalmente na região Semi-árida do Nordeste (Campos
et al
., 2005).
2.5 – Enzimas microbianas
Enzimas são catalisadores orgânicos efetivos, responsáveis por milhares de reações
bioquímicas coordenadas, envolvidas nos processos biológicos dos sistemas vivos. São
macromoléculas pertencentes à classe das proteínas globulares (Couri, 1993).
Uma das características notáveis das enzimas quando comparadas com catalisadores
químicos são a especificidade pelo substrato e a especificidade em promover somente uma
reação bioquímica com seu substrato, em condições brandas de reação e menores problemas
ambientais e toxicológicos.
As enzimas são divididas em seis grandes classes, baseadas no tipo de reação que elas
catalisam. As seis classes representativas das enzimas industriais são: oxiredutases,
transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
41
A produção e uso de enzimas tem se tornado uma área de grande interesse da indústria
biotecnológica. As enzimas têm sido usadas pelo homem por vários séculos, mesmo antes do
conhecimento de sua natureza. A fabricação de queijo usando estômago de bezerro como um
catalisador foi provavelmente o primeiro exemplo, sendo seu uso tão antigo que a data de seu
descobrimento é desconhecida.
As enzimas são componentes de todos os tipos de células, animal, vegetal e microbiana.
Os organismos superiores foram os primeiros utilizados como fontes de enzimas. O efeito do
amaciamento da carne por mamão (papaína) levou a um expressivo cultivo da planta com
propósito de produzir a enzima papaína da família das proteases. Outras enzimas são extraídas
de órgãos animais, como, tripsina e quimotripsina do pâncreas de porco. Essas fontes
apresentam algumas desvantagens tais como: o tecido utilizado na extração da enzima pode
sofrer limitações de suprimento quando a demanda aumenta, requer cultivos de grandes áreas
e estão sujeitas a intempéries (Couri, 1993).
Reconhecidamente, as células microbianas são importantes produtoras de enzimas,
oferecendo uma série de vantagens: a produção pode ser aumentada facilmente, apresenta
natureza diversa permitindo a produção de várias enzimas, são relativamente fáceis de serem
cultivadas em ambiente controlado e são altamente sensíveis à alterações genéticas, o que
permite obtenção de linhagens melhoradas quanto a produção e qualidade da enzima. O
processo fermentativo permite também a produção de enzimas com consistente produtividade
e menor custo.
O desenvolvimento do processo de produção de enzimas, em escala industrial, de
qualidade satisfatória e custos que permitam sua comercialização, requer um trabalho
laborioso, caro e interdisciplinar. Faz-se necessário o conhecimento técnico-econômico da
relação entre linhagem, o meio de produção, o processo de fermentação, os métodos de
recuperação e a demanda de mercado.
O mercado mundial de enzimas apresenta valor comercial de US$ 2 bilhões de dólares
anuais e vem crescendo a cada ano com taxas de 8 a 10%. Deste total, o Brasil participa com
5% do mercado através de importações, que segundo dados de 2005 do Ministério do
Desenvolvimento chegaram a US$ 100 milhões de dólares. A indústria de alimentos é a que
mais tem se beneficiado como uso das enzimas, sendo utilizadas em 15% dos processos
industriais. Além disso, este setor está em crescente expansão faturando aproximadamente R$
1 trilhão em 2005, o quer representa um crescimento de 9,2% em relação a 2004. Desse total,
a indústria de sucos naturais teve uma produção de 111 milhões de litro entre janeiro e março
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
42
de 2007 representando um crescimento de 12,6% em relação ao mesmo período de 2006.
Considerando que 25% do mercado mundial de enzimas correspondem às enzimas pectinases,
percebe-se uma grande oportunidade de negócio (Aquino, 2007).
As enzimas pectinolíticas consumidas pela indústria brasileira são importadas por
alguns laboratórios tais como: Miles, Novo Nordisk, Biocon e Novozymes. O consumo
interno ainda é pequeno, porém, o mercado potencial é muito grande considerando que o
Brasil é um dos maiores produtores de suco de laranja do mundo e significante produtor de
vinhos.
2.6 – Substâncias pécticas
Substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular que
formam o maior componente da lamela média das paredes primárias de células de vegetais
superiores. Quimicamente são um complexo coloidal de polissacarídeos ácidos, composto de
resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações α- 1,4, parcialmente esterificados por
grupos metil e parcial ou completamente neutralizadas por uma ou mais bases (íons sódio,
potássio ou amônio) (Uenojo & Pastore, 2007).
Baseado nos tipos de modificações da cadeia principal, as substâncias pécticas são
classificadas em (Martins, 2006):
A- protopectina: é o termo usado para descrever as substâncias pécticas insolúveis em
água, das quais se originam as substâncias pécticas solúveis.
B- ácido péctico: são os ácidos poligalacturônicos cujos grupos carboxílicos não
apresentam esterificados com grupos metila.
C- ácido pectínico: são os ácidos poligalacturônicos que contêm quantidades variáveis
de grupos metoxílicos. Estes compostos apresentam a propriedade de formar gel na presença
de açúcares e cátions divalentes.
D- pectina: é o nome genérico de misturas pécticas que contêm ácido pectínico como
maior componente.
As substâncias pécticas são os maiores componentes da lamela média e parede celular
primária das células vegetais, estando interligadas a outros polissacarídeos estruturais, como a
celulose e a hemicelulose (Figura 2.10).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
43
Figura 2.10. Estrutura da parede celular vegetal, contendo as moléculas de pectina.
Fonte: Martins (2006)
Além da função adesiva que exercem nas paredes celulares das plantas superiores, estas
também são responsáveis pelas diferenças de textura das frutas e dos vegetais durante o seu
crescimento, amadurecimento e armazenamento. A pectina tem sido indicada ainda como
importante fator de interação entre plantas e seus patógenos (Martins, 2006).
As substâncias pécticas são usadas na indústria de alimentos como agentes geleificantes
e como fibras nutricionais. Por outro lado, podem representar um problema nas várias etapas
do processamento de frutas e vegetais, visto que seu arraste, após o rompimento da parede
celular, pode causar turbidez em sucos ou incrustações em tubulações e reatores industriais
.
O grau de esterificação, o grau de polimerização, a proporção de açúcares neutros, o
peso molecular, são os principais fatores de heterogeneidade entre as substâncias pécticas de
diferentes origens. Isso torna improvável a existência de pectinas idênticas.
A pectólise, ação das enzimas pectinolíticas, é um fenômeno associado com vários
processos biológicos da planta, tais como alongamento, crescimento celular e maturação do
fruto. A microbiana tem um importante papel na patogenicidade da planta, simbiose,
decomposição de depósitos da planta, fermentação de resíduos da agricultura e da indústria de
alimentos, processos de maceração de vegetais e clarificação de sucos (Couri, 1993).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
44
2.7 – Enzimas pectinolíticas
As enzimas pectinolíticas, ou pectinases são as responsáveis pela degradação das
substâncias pécticas, sendo produzidas somente por vegetais e microrganismos. Elas estão
envolvidas nos processos fisiológicos dos vegetais e são empregadas em nível industrial
destacando-se por serem as enzimas mais utilizadas pelas indústrias de processamento de
frutas (Hennies, 1996).
A classificação destas enzimas é baseada nos modos de ataque à molécula dos
polímeros pécticos. São descritos três grupos de enzimas: as protopectinases, as esterases
(pectinesterases) e as despolimerases (hidrolases e liases) (Martins, 2006).
Protopectinases: são enzimas que degradam a protopectina insolúvel gerando a pectina
polimerizada altamente solúvel.
Esterases: catalisam a desesterificação da pectina por remoção do grupo metoxil das
substâncias pécticas, formando ácido péctico. A pectina de baixa metoxilação liberada pode
ser hidrolisada pela poligalacturonase. As pectinesterases (PE) são produzidas por fungos,
bactérias, leveduras e plantas superiores e estão presentes em praticamente todos os
preparados comerciais.
Despolimerases: catalisam a quebra das ligações glicosídicas α(1→4) entre os
monômeros do ácido D – galacturônico da cadeia de galacturonana. Essas enzimas atuam em
pectinas por mecanismos de hidrólise (poligalacturonase), catalisando a quebra da ligação
glicosídica pela introdução de água, ou por transeliminação (liases), quebrando a ligação
glicosídica por reação de transeliminação do H, formando dupla ligação entre os carbonos 4 e
5 do ácido galacturônico.
As enzimas despolimerizantes são classificadas de acordo com a clivagem hidrolítica
(hidrolases) ou transeliminativa (liases) das ligações glicosídicas; mecanismos endo-
(randômica) ou exo- (a partir do final da molécula) de ação e preferência por ácido péctico ou
pectina como substrato. Envolvem as hidrolases (catalisam a hidrólise de ligações α-1,4) e as
liases (catalisam β-eliminação) (Uenojo, 2003). Os pontos de ataque das enzimas pécticas na
molécula de pectina estão representados na Figura 2.11.
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
45
Figura 2.11. Pontos de ataque das pectinases na molécula de pectina.
Fonte: Martins (2006)
Hidrolases - As hidrolases incluem as polimetilgalacturonases e as poligalacturonases, podem
apresentar ação endo- (hidrólise randômica) ou exo- (hidrólise seqüencial).
A polimetilgalacturonase (PMG) presumivelmente hidrolisa ligações α-1,4 de
polimetilgalacturonatos. Apesar de ser citada em algumas literaturas, sua existência é
questionada por alguns autores.
A poligalacturonase (PG) hidrolisa α-1,4 ligações glicosídicas entre dois resíduos do
ácido péctico. As poligalacturonases fúngicas são úteis pela alta atividade enzimática e possui
pH ótimo de atividade na região levemente ácida e temperatura ótima entre 30 e 50°C (Zheng
& Shetty, 2000; Uenejo & Pastore, 2007).
Liases - As liases, também chamadas transeliminases, rompem ligações glicosídicas
resultando em galacturonídeos com uma ligação insaturada entre os carbonos 4 e 5 do final
não redutor do ácido galacturônico formado. Podem apresentar ação endo- (hidrólise
randômica) ou exo- (hidrólise seqüencial).
A pectina liase (polimetilgalacturnato liase, PML) quebra as ligações por
transeliminação do hidrogênio dos carbonos das posições 4 e 5 da porção aglicona do
substrato (pectina).
A pectato liase (poligalacturonato liase, PL) catalisa a clivagem de ligações α-1,4 de
ácido péctico e requerem Ca
2+
para atividade (Uenojo, 2003).
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
46
Os preparados enzimáticos que se encontram no mercado são um complexo enzimático
contendo todas as enzimas do grupo pectinolítico além de celulase, hemicelulase, ou seja,
possuem diversos tipos de atividade (Couri, 1993).
A síntese destas enzimas sofre influência dos componentes do meio de cultivo,
particularmente da fonte de carbono, presença de indutores (pectina e derivados) e das
condições de cultivo, como pH, temperatura, aeração, agitação e tempo de incubação. Com
relação às estratégias para o processo de produção, a fermentação em estado sólido
geralmente é preferida por permitir a produção de enzimas brutas mais concentradas e,
conseqüentemente, com menores custos de extração e purificação (Uenojo & Pastore, 2007).
2.7.1 – Aplicações das pectinases
As pectinases foram às primeiras enzimas a serem utilizadas comercialmente, tendo sido
introduzida na década de 30 na produção familiar de sucos de frutas. São aplicadas
industrialmente na extração e clarificação de sucos de frutas, na maceração de vegetais e
frutas e na extração de óleos essenciais.
Uenojo & Pastore (2007) relataram algumas aplicações industriais importantes de
pectinases bem como suas vantagens citadas a seguir:
Indústrias de sucos de frutas
As substâncias pécticas são responsáveis pela consistência, turbidez e aparência dos
sucos das frutas, e sua presença causa um aumento considerável na viscosidade do suco,
dificultando a filtração e a concentração. A adição de enzimas pectinolíticas nos purês de
frutas e vegetais resulta na degradação da pectina e outros componentes de alto peso
molecular, diminuindo a viscosidade e aumentando o rendimento dos sucos ocasionando uma
aparência cristalina no produto final e reduzindo em até 50% o tempo de filtração.
A combinação de pectinases, celulases e hemicelulases, chamadas coletivamente de
enzimas de maceração, é usada na extração e clarificação de sucos de frutas e vegetais. O
tratamento enzimático conduz a uma extensa degradação da lamela média e da pectina das
paredes celulares por ação de poligalacturonase, pectina metil esterase e pectina liase. O efeito
sinergístico da combinação de pectinases e celulases é um processo crucial no tratamento
enzimático da polpa para uma quase completa liquefação das frutas e dos vegetais. A hidrólise
enzimática das paredes celulares aumenta o rendimento de extração, a polpa resultante tem
baixa viscosidade e a quantidade de resíduos da polpa é reduzida. O uso de enzimas de
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
47
maceração aumenta o rendimento da extração e melhora o processamento, sem aumento de
custos. Essas enzimas são utilizadas após o corte da matéria-prima, para macerar a polpa até a
liquefação parcial ou total da fruta, diminuindo o tempo de processamento e melhorando a
extração dos componentes da fruta. Após a extração, pectinases são adicionadas para
clarificação e diminuição de viscosidade para facilitar a filtração e concentração.
Recuperação de óleos essenciais
Os óleos essenciais estão localizados especialmente no albedo de frutas cítricas e
contêm hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos), compostos oxigenados (aldeídos, ésteres,
álcoois, cetonas e fenóis) e resíduos não voláteis (ceras, flavonóides e ácidos graxos). Após a
extração do suco, as partículas de albedo e a emulsão óleo-água são separadas. Esta emulsão é
passada em um ciclone e, a seguir, centrifugada para produzir uma emulsão rica em óleo, que
é concentrada. A aplicação de pectinases hidrolisa os complexos de pectina-proteína,
liberando o óleo, aumentando o rendimento, diminuindo o tempo de processo e melhorando a
qualidade do produto final.
Indústrias de vinhos
Pectinases, em conjunto com β-glucanases e hemicelulases, têm sido utilizadas na
produção de vinho. As vantagens do uso das três enzimas são: melhor maceração da casca e
aumento da extração de pigmentos, facilita a clarificação e a filtração do mosto e aumenta a
qualidade e a estabilidade do vinho. A adição de pectinases durante o esmagamento das uvas
ou no mosto de vinho melhora a extração do suco, reduz o tempo de clarificação e aumenta o
conteúdo de terpenos no vinho. Preparações comerciais de pectinases com alta atividade de
pectina liase e baixa atividade de pectina metil esterase são preferidas por minimizarem a
liberação de metanol dos ácidos poligalacturônicos metilados durante a produção de vinho.
Extração de óleos vegetais
Óleos de canola, coco, semente de girassol, palma e oliva são tradicionalmente
produzidos por extração com solventes orgânicos, mais comumente o hexano. A degradação
da parede celular por enzimas pectinolíticas permite seu uso para extração de óleo vegetal em
processo aquoso, pela liquefação dos componentes estruturais das paredes celulares das
sementes que contêm óleo. Preparações comerciais enzimáticas contendo pectinases, celulases
e hemicelulases começaram a ser utilizadas para extração de óleo de oliva, sendo adicionadas
Ca pít u lo 2 – A spec t o s Te ó ric os
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
48
durante a prensagem das azeitonas para melhorar o processo de extração. O uso de enzimas de
maceração aumenta a quantidade de agentes anti-oxidantes e de vitamina E em óleo de oliva
extravirgem, reduz a indução ao ranço, aumenta a extração, melhora o fracionamento na
centrifugação e produz óleo com baixo teor de umidade.
Indústria têxtil
Enzimas pectinolíticas podem ser usadas nas indústrias têxteis para degradar a camada
de pectina que recobre as fibras de celulose, liberando-as para posterior processamento, no
tratamento do resíduo líquido e na degomagem das fibras naturais. Pectinases alcalinas são
utilizadas para maceração das fibras vegetais, como linho, cânhamo e juta, na biopreparação
de algodão e no polimento enzimático de tecidos mistos de juta e algodão. Em algodão cru, a
remoção da pectina, cera e agentes de goma com a utilização de pectinases em conjunto com
amilases, lipases e hemicelulases em condições adequadas, substitui o uso da soda cáustica e
gera produtos de alta qualidade, para posterior tingimento e processo de tecelagem com
menor consumo de energia.
Indústria de papel e celulose
Durante a fabricação de papel, pectinases podem despolimerizar substâncias pécticas e,
subseqüentemente, diminuir a demanda catiônica das soluções pécticas e do filtrado
resultantes do branqueamento com peróxido, solucionar problemas de retenção no
branqueamento mecânico da celulose e no tratamento dos efluentes dos moinhos de papel.
Ração animal
Pectinases são utilizadas em conjunto com outras enzimas para reduzir a viscosidade da
ração animal, a fim de aumentar a absorção e a liberação de nutrientes através da hidrólise das
fibras não biodegradáveis e dos nutrientes bloqueados pelas fibras.
Capítulo 3
Estado da Arte
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
50
3. Estado da Arte
O capítulo três discorre sobre estudos de produção de enzimas, em especial pectinase,
por fermentação em estado sólido, quais os avanços em termos de meios, condições de cultivo
e os principais microrganismos utilizados.
3.1 - Produção de pectinase por FES
A fermentação em estado sólido (FES), associada a diferentes organismos, sempre
representou um importante instrumento para a obtenção de produtos de interesse econômico.
Este processo tem-se mostrado muito promissor no desenvolvimento de vários bioprocessos,
como na biorremediação e biodegradação de compostos tóxicos, desintoxificação de resíduos
e subprodutos agroindustriais, biotransformação de resíduos de colheitas para enriquecimento
nutricional e na obtenção de produtos de alto valor agregado, como metabólitos secundários
(antibióticos, alcalóides, fatores de crescimento vegetal, etc), ácidos orgânicos, biopesticidas,
biocombustíveis, compostos aromáticos e enzimas (Martins, 2006).
Nos últimos anos, houve uma crescente tendência em se utilizar o processo de
fermentação em estado sólido para obtenção de enzimas, considerando a maior produção,
menor repressão catabólica e, ainda, esse processo geralmente permite a obtenção de
proteínas com maior termoestabilidade e tolerância ao pH (Martins, 2006).
Solís-Pereira
et al.
(1993) compararam a produção de pectinases por
Aspergillus niger
em FS e FES utilizando diferentes fontes de carbono, avaliando o efeito da adição de glicose,
sacarose e ácido galacturônico sobre a produção da enzima. As atividades das enzimas endo-
poligalacturonase e exo -poligalacturonase em FS foram inferiores àquelas obtidas em FES.
Além disso, altas concentrações de glicose estimularam a produção das enzimas em FES,
enquanto que em FS levaram à repressão catabólica.
Zheng & Shetty (2000) mostraram que a produção de pectinases por FES, a partir de
resíduos das indústrias que processam frutas, levou a obtenção de enzimas com características
de resistência a valores de pH ideais para aplicação industrial. Os autores ressaltaram que, o
pH naturalmente ácido dos substratos, levou a este resultado. A enzima se mostrou estável a
temperaturas até 50°C sendo completamente inativada a 85°C por 20 minutos e a pH na faixa
de 3,0 a 6,5.
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
51
A seleção do substrato para os processos de FES depende de vários fatores,
principalmente aqueles relacionados ao seu custo e eficiência. Neste contexto, a utilização de
subprodutos agroindustriais torna-se um atrativo para este processo. A aplicação destes
materiais em bioprocessos tornou-se importante sob o ponto de vista ambiental, reduzindo
problemas relacionados ao seu manejo inadequado e conseqüentes danos ambientais. Além
disso, seu baixo custo e grande disponibilidade fazem dos mesmos excelentes matérias-primas
alternativos para vários processos industriais (Silva
et al
., 2005). Para a seleção do substrato
duas considerações são importantes. A primeira é que este deve ter boa disponibilidade e
agregar valor ao produto de interesse. A outra é que o mesmo deve proporcionar uma boa
produção do produto desejado (Pandey, 2002). Nos estudos de produção de pectinases,
inúmeros subprodutos agrícolas e agroindustriais têm sido testados como substratos
alternativos.
A seleção do substrato para produção de pectinase foi centrada basicamente na
utilização de resíduos tropicais da colheita e agroindústria. Os mais estudados foram: farelo
de trigo, farelo de arroz, resíduos de maçã, bagaço de laranja e bagaço de cana-de-açúcar.
Fatores como as fontes de carbono e nitrogênio e suas concentrações sempre foram de
interesse da indústria biotecnológica, sempre com o interesse de baixar o custo do meio.
Estima-se que 30% a 40% do custo da produção industrial de enzimas é devido ao meio
(Ustok, Tari, Gogus, 2006).
A síntese de enzimas pectinolíticas é fortemente influenciada pelo substrato,
especialmente as fontes de carbono e nitrogênio, presença de pectina e temperatura (Linde
et
al
., 2007). Fontana, Salvador, Silveira (2005) relataram que a pectina pode ser usada pelo
A.
niger
como substrato para crescimento além de indutor na produção da poligalacturonase.
Estes resultados são suportados com Maldonado & Strasser Saad (1998) que verificaram o
crescimento miceliar e produção de pectinase por
A. niger
usando exclusivamente pectina
como fonte de carbono.
A falta de atividade pectinolítica em culturas com glicose como única fonte de carbono
reflete a natureza de indução das enzimas pécticas pelo fungo
Aspergillus niger.
Entretanto,
quando diferentes concentrações de glicose são adicionadas ao meio contendo pectina, a
produção de enzimas pécticas é inibida em altas concentrações enquanto que baixas
concentrações de glicose estimulam a produção de enzimas (Fawole & Odunfa, 2003).
Fawole & Odunfa (2003) estudaram alguns efeitos da produção de pectinase por
Aspergillus niger
. Com relação à fonte de nitrogênio observaram que o sulfato de amônia e o
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
52
nitrato de amônia são boas fontes de nitrogênio enquanto usando glicina e triptofano não
houve atividade da poligalacturonase nem da polimetilgalacturonase. A maior produção de
enzimas pécticas ocorreu usando o sistema de fermentação em estado sólido, substrato
contendo pectina, suplementado com sulfato de amônia em fermentador estacionário a 40°C e
pH 5, por 5 dias.
Patil & Dayanand (2006) testaram como fontes de nitrogênio o sulfato de amônia e o
nitrato de amônia nas concentrações de 0,1-0,5% na produção de pectinase por
Aspergillus
niger
usando girassol como substrato, observaram que as duas fontes aumentam a produção
de enzimas, sendo o maior valor obtido com 0,3% de uma das fontes, a atividade foi um
pouco maior quando o sulfato de amônia foi usado.
As observações de Hours, Voget, Ertola (1998) sugerem que baixos níveis de sulfato de
amônia (0,16%) e fosfato de potássio (0,1%) adicionados ao meio não influenciam no
rendimento em enzimas.
Ustok, Tari, Gogus (2006) estudaram a produção da poligalacturonase por
Aspergillus
sojae
ATCC 20235 em milho esmagado e observaram que a maior produção foi com valores
de inóculo de 2x10
7
com tempo de fermentação de 5-6 dias sendo de 29,1 U/g de PG.
Silva
et al
. (2002) estudaram a produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG)
por cepa de
Penicillium viridicatum
Rfc3 em FES usando bagaço de laranja, tegumento de
milho, farelo de trigo e casca de manga e banana como fontes de carbono. Quando os resíduos
foram utilizados isoladamente, o valor máximo de atividade de PG (30 U/g) foi observado em
farelo de trigo, enquanto o valor máximo de PL (2000 U/g) foi obtido em bagaço de laranja.
Misturas de casca de banana ou de manga com bagaço de cana-de-açúcar (1:1) resultaram em
aumento na produção tanto de PL quanto de PG, quando comparado com os experimentos nos
quais esses materiais foram usados isoladamente. A mistura de bagaço de laranja e farelo de
trigo elevou a produção de PG e PL para 55U/g e 3540 U/g, respectivamente. A adição de
material fibroso, como bagaço de cana, aumentou os espaços entre as partículas,
possibilitando elevação na aeração e difusão de nutrientes e enzimas.
Couri
et al.
(2000) testaram casca de banana, casca de manga, farelo de mandioca e
farelo de trigo como substratos na produção de enzimas hidrolíticas pelo
Aspergillus niger
3T5B8. O uso de farelo de trigo as 42 horas de fermentação apresentou os melhores
resultados com 30,75 U/mL (76,9 U/g) da poligalacturonase, 30,62 U/mL de xilanase e 5,27
U/mL de protease. Com casca de manga obtiveram 4,20 U/mL (10,5 U/g) de PG em 72 horas
de processo com adição de 0,3% de celobiose. A casca de manga agiu como inibidor na
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
53
síntese de protease, o que é bom, pois a presença de protease aumenta a instabilidade da
mistura enzimática.
Malvessi & Silveira (2004) estudaram a influencia do pH inicial do meio (2 a 7) na
produção de PG por
Aspergillus oryzae
por FS. Observaram que o pH do meio influencia
fortemente a produção da poligalacturonase. A máxima atividade ocorreu quando o pH inicial
do meio foi de 4. O pH ótimo de desenvolvimento dos fungos
Aspergillus
é 4 enquanto a
maior atividade da PG ocorre em pH 3. Para valores de pH entre 2-3 o crescimento do fungo é
menor e a atividade de PG também é menor, para valores de pH inicial de 4-6; favorece o
crescimento do fungo nas primeiras 24 horas resultando em elevados valores de atividade da
PG. O pH 7 favorece a ação das proteases, com capacidade para degradar as pectinases do
meio.
Martin
et al
. (2004) usaram os fungos
Moniliella
sp SB9 e
Penicillium
sp EGC5 na
produção da poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL) usando substrato composto de bagaço
de laranja, bagaço de cana e farelo de trigo (1:1:1), a maior produção foi obtida entre o
terceiro e quarto dia de processo, com a máxima atividade de PG 26 U/g e PL 19400 U/g com
seis dias usando
Moniliella
sp SB9.
Linde
et al.
(2007) estudaram a produção de poliglacturonase por FES testando os
microrganismos
A. niger
e
A. oryzae
, substrato farelo de trigo e farelo de arroz
desengordurado e como fonte de nitrogênio sulfato de amônia e uréia e também a utilização
de pectina. Concluíram que o microrganismo e a pectina influenciam o processo, sendo a
maior produção obtida usando-se
A. niger
e pectina. Apesar do meio e fonte de nitrogênio não
serem estatisticamente significativas para o processo os maiores valores de atividade da
enzima foram obtidos com farelo de arroz desengordurado e com o sulfato de amônia como
fonte de nitrogênio.
Conforme Botella
et al
. (2006) o bagaço de uva é uma fonte promissora de enzima
hidrolíticas por
Aspergillus awamori
. O tamanho da partícula do substrato não tem efeito na
produção da enzima, enquanto a adição de uma fonte extra de carbono, glicose, e o teor de
umidade influenciam extremamente a produção das enzimas.
A produtividade da FES, conforme Nigam & Singh (1994), é afetada significativamente
pelo nível de umidade do meio. González
et al
. (1988) mostrou que em FES, entre todas as
condições de cultura o nível de umidade inicial é um dos mais críticos. Ramana Murthy,
Karanth, Raghava Rao (1993) explicam que o conteúdo inicial de umidade impacta em dois
fatores afetando o crescimento celular e formação de produto. Primeiro, determina a atividade
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
54
de água (Aa) do meio, ou seja, a disponibilidade de água no substrato. Segundo, o inchaço
causado no substrato facilita a penetração do micélio para utilização de efetiva do substrato.
Raimbault & Alazard (1980) estudaram a influência de diferentes níveis de umidade
iniciais no crescimento de
Aspergillus niger
. Os melhores resultados foram obtidos para
meios com conteúdos de umidade que variam de 50% a 55%. Eles mostraram o efeito
negativo dos conteúdos de umidade mais altos no crescimento, devido à redução na
porosidade do meio e difusão de oxigênio no material sólido.
Castilho, Medronho, Alves (2000) observaram redução na formação de enzima por
Aspergillus niger
com alto nível de umidade (70%), mas também baixos níveis de umidade
25% resultam em pouca produção de pectinase. Conforme Acuña-Arguelles
et al
. (1994), em
meios com baixa disponibilidade de água os fungos sofrem modificações na membrana
celular, conduzindo a limitações de transporte e afetando o metabolismo microbiano.
Berovic & Ostroversnik (1997) usando o
Aspergillus niger
para fermentar uma mistura
de bagaço de maçã, farinha de soja, farelo de trigo e farelo de milho, relatam que o alto
conteúdo de umidade, 50-73% reduz a produção de enzimas, não promove o crescimento do
fungo e aumenta a possibilidade de contaminações bacterianas, principalmente na coleta de
amostra, apresentando contaminações por
Bacillus subtilis
. Com umidade baixa, entre 12-
23% o crescimento da biomassa e a penetração do micélio são reduzidos, consequentemente
diminuindo a produção de enzimas e prolongando o tempo de processo. Observaram também
que após 70 horas de processo há um decréscimo da atividade enzimática, devendo ser
associada ao consumo de algum componente essencial ou a produção de inibidor.
Patil & Dayanand (2006) citam que geralmente o período de fermentação para síntese
de pectinase fúngica varia entre 48-72 horas.
Hours, Voget, Ertola (1998) obtiveram 1062 U/g de pectinase usando resíduo de maçã
com uma fonte adequada de nitrogênio orgânico e o
Aspergillus foetidus
. Bladino
et al
.
(2002) obtiveram 25 U/g de atividade da poligalacturonase usando trigo e
Aspergillus
awamori
. Galiotou-Panaytou & Kapantai (1993) obtiveram 14,5 U/mL da poligalacturonase
por
Aspergillus niger
em meio suplementado com pectina cítrica. Patil & Dayanand (2006)
obtiveram 45,9 U/g de poligalacturonase usando girassol, suplementado com glicose e sulfato
de amônia por
Aspergillus niger.
Segundo Ustok, Tari, Gogus (2006) a comparação direta dos
valores de atividade enzimática não é prudente, pois nem todas as condições são idênticas,
podendo ser usada como uma avaliação grosseira da produção de enzimas.
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
55
3.2 – Microrganismos usados na produção de pectinase
A composição dos complexos pectinolíticos de origem microbiana varia de acordo com
a espécie do microrganismo produtor e, dessa forma, a seleção de isolados capazes de
sintetizar enzimas com propriedades adequadas a cada processo é fundamental para a
utilização industrial das mesmas. Bactérias, leveduras e fungos filamentosos são de grande
interesse na produção de enzimas em virtude das inúmeras vantagens apresentadas por estes
organismos, tais como: o crescimento é rápido, não requerem amplos espaços para o seu
crescimento; são capazes de degradar variados substratos, inclusive resíduos e subprodutos
agro- industriais (Martins, 2006).
As preparações de pectinases mais comumente utilizadas são de origem fúngica,
principalmente de
Aspergillus e Penicillium
(Pandey, Soccol, Mitchell, 2000; Guammadi &
Panda, 2003). No entanto, o estudo de outros microrganismos produtores é fundamental para
a obtenção de enzimas com características distintas, adequadas a materiais e processos
industriais específicos.
Segundo Fogarty & Ward (1972), a produção de pectinases em larga escala é feita
basicamente por fungos, particularmente do gênero
Aspergillus
. Dentre estes, linhagens de
Aspergillus
niger, Aspergillus
oryzae, Aspergillus wentii
e
Aspergillus
flavus
são algumas das
mais adequadas. As características das enzimas obtidas a partir destas fontes as tornam ideais
para o processamento de frutas, sendo esta sua principal aplicação. Os preparados enzimáticos
comerciais de origem fúngica normalmente contêm uma mistura de enzimas pectinolíticas. A
Tabela 3.1 mostra a ocorrência das enzimas pécticas em alguns microrganismos.
A seleção do microrganismo capaz de produzir a enzima em níveis adequados é o
primeiro passo para a produção de qualquer produto microbiano comercial. Esta seleção
normalmente é resultado da investigação da capacidade de centenas de espécies e linhagens
em produzir a enzima desejada. A linhagem selecionada pode sofrer ainda melhoramento
genético para atingir níveis de produção mais elevados. A cultura pura do microrganismo é
mantida sob condições rigidamente controladas, através de cultura em ágar inclinado e
armazenamento como cultura liofilizada. Exames detalhados da cultura são realizados
periodicamente para assegurar que ela está livre de contaminantes, garantindo assim a
uniformidade da produção da enzima (Couri, 1993).
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
56
Tabela 3.1. Ocorrência de enzimas pécticas em alguns microrganismos
MICRORGANISMO PE PG PL PMG PL
Aspergillus niger
+ + + +
Aspergillus sojae
+
Aspergillus saito
+
Bacillus sp
+
Bacillus subtilis
+
Bacillus polymixa
+
Bacillus pumilus
+
Bacillus sphaericus
+
Bacillus stearothermophilus
+
Cercocpora arachidicola
+
Cephalosporium sp
+
Clostridium multifermentans
+ +
Clostridium aurantibutyricum
+ +
Clostridium felsineum
+ +
Cytophaga johnsonii
+
Cytophaga deprimata
+
Cytophaga albogilva
+
Erwinia aroideae
+ + +
Erwinia carotovora
+ +
Fusarium culmorum
+
Fusarium oxysporum
+
Fusarium solani
+ +
Penicillium expansum
+
Penicillium italicum
+
Penicillium digitatum
+ + +
Penicillium chrysogenum
+ +
Pseudomonas sp
+
Pseudomonas fluorescens
+
Pseudomonas marginalis
+ + +
Rhizoctania fragariae
+
Rhizoctania solani
+ +
Rhizopus arrhizus
+
Streptomyces nitrosporeus
+
Trichoderma koningii
+
Trichoderma pseudokoningii
+
Xanthomonas sp
+ +
Xanthomonas campestris
+ +
Xanthomonas cyanopsidis
+
PE: pectina esterase, PG: poligalacturonase, PL: poligalacturonato liase, PMG:
polimetilgalacturonase, PL: polimetilgalacturonato liase. Fonte: Uenojo & Pastore (2007).
Ca pít u lo 3 – E stad o d a Ar t e
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
57
Couri & Farias (1987) isolaram 49 linhagens de fungos filamentosos de fontes naturais
e selecionaram uma de
A. niger
van Tieghem, da pimenta do reino, para produção de enzimas
pectinolíticas por fermentação semi-sólida.
Maldonado
et al
.
(1986) isolaram uma linhagem de
Aspergillus
sp de limão podre e
verificaram a produção de pectinases usando como fonte de carbono, casca de limão pré-
tratada e pectina como padrão. A produção de PE foi maior com casca de limão enquanto que
a de PG não foi alterada.
Castilho (1997) citou que o estudo da manipulação genética de microrganismos, para
seleção de linhagens mutantes que sejam mais produtivas e que não estejam sujeitas à
repressão catabólica ou que sintetizem grandes quantidades de enzimas sem a necessidade de
uma substância indutora, pode ser de grande interesse para a produção comercial. Um
exemplo de êxito em pesquisas nesta área foi obtido por Couri & Farias (1995). Os autores
utilizaram técnicas de manipulação genética com etilmetanosulfonato (EMS) e radiação UV
para obtenção de linhagens mutantes de
A. niger
com elevada capacidade de sintetizar
pectinases em FES. A linhagem mutante selecionada,
A. niger
3T5B8, produziu atividade
pectinolítica 282% e atividade poligacturonásica 56% superior à linhagem selvagem.
Capítulo 4
Metodologia
Experimental
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
59
4. Metodologia Experimental
O capítulo quatro apresenta os materiais utilizados no presente trabalho, bem como os
métodos empregados. Neste capítulo descrevem-se a obtenção dos resíduos utilizados nos
ensaios de fermentação em estado sólido para obtenção de pectinase e sua caracterização
físico-química. O microrganismo empregado no processo, o modo de preservação e cultivo.
Apresenta também a matriz do planejamento experimental em que se basearam os
experimentos, com o objetivo de identificar as melhores condições do processo em termos de
umidade inicial, adição de fonte de nitrogênio e adição de fonte de fósforo ao meio, para
produção da poligalacturonase. Detalhes do processo fermentativo e as análises realizadas
durante os experimentos. Por fim, apresenta matriz do planejamento experimental realizado
para identificar as melhores condições de extração da poligalacturonase.
4.1 – Preparo do resíduo
Como meio de cultivo no processo de fermentação em estado sólido para obtenção de
pectinase, foram utilizados dois resíduos do pedúnculo de caju: o resíduo do pedúnculo de
caju não lavado e resíduo do pedúnculo de caju lavado.
O resíduo do pedúnculo de caju sem lavar foi obtido a partir do pedúnculo de caju
adquirido no comércio da cidade de Campina Grande-PB. Os frutos estavam maduros e
apresentavam coloração vermelha.
Os cajus foram lavados em água corrente, e depois separou-se os pedúnculos da
castanha. O pedúnculo limpo foi triturado e peneirado para separação do suco. O bagaço
úmido foi disposto em bandejas de alumínio cobertas com polietileno e levados a estufa com
circulação de ar a temperatura de 60ºC por um período de 30 horas em camadas de
aproximadamente 0,5 cm, para chegar-se ao resíduo seco do pedúnculo. A Figura 4.1 mostra
o aspecto do resíduo do pedúnculo de caju seco.
Figura 4.1. Resíduo do pedúnculo de caju.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
60
O resíduo do pedúnculo de caju lavado foi fornecido pela Embrapa Agroindústria
Tropical, com sede em Fortaleza-CE. O bagaço de pedúnculo de caju foi cedido por uma
indústria de suco de fruta de Fortaleza. Ao chegar à Embrapa o bagaço foi lavado com água
cinco vezes, na proporção 1 kg de bagaço para 2 litros de água, e seco em estufa com
circulação de ar a 50°C por 24 horas. A Figura 4.2 apresenta o resíduo seco do pedúnculo de
caju lavado.
Os resíduos secos obtidos foram triturados em moinho e armazenados em recipientes
fechados à temperatura ambiente.
Figura 4.2. Resíduo seco do pedúnculo de caju lavado.
4.1.1 - Caracterização dos resíduos
A caracterização físico-química dos resíduos quanto à granulometria, densidade
aparente, pH, umidade, cinzas, sólidos solúveis, açúcares redutores, proteína e pectina, foi
realizada conforme procedimentos descritos a seguir.
4.1.1.1 - Granulometria
Pesou-se 100 gramas (balança analítica) de cada resíduo que foram transferidos,
separadamente, para o agitador de peneiras Contengo-Pavitest durante dez minutos, em jogo
constituído por quatro peneiras, seguindo as recomendações da Associação Brasileira de
Normas Técnicas (ABNT): 20 mesh (0,84 mm), 24 mesh (0,71mm), 35 mesh (0,45mm) e 48
mesh (0,297mm). O material retido em cada peneira foi pesado e os resultados expressos
percentualmente em relação ao peso do material original (Correia, 2004).
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
61
4.1.1.2 - Densidade aparente
Para determinação da densidade aparente pesou-se 100 gramas dos resíduos que foram
colocados em proveta para determinar o volume ocupado, sem haver compactação (Correia,
2004). A densidade aparente é expressa conforme Equação (2).
(
)
( )
mLocupadovolume
gmassa
aparenteDensidade
=
(2)
4.1.1.3 - pH
Preparou-se uma suspensão com 10mL de água destilada e 1,0 g da amostra sólida.
Após homogeneização a suspensão foi deixada em repouso por um período de 30 minutos,
depois o pH foi mensurado em potenciômetro digital, previamente calibrado com as soluções
padrões (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
4.1.1.4 - Umidade
Para análise de umidade pesou-se de 3 a 5 gramas da amostra em cadinho de alumínio
previamente seco e tarado. Os cadinhos foram colocados em estufa a 105ºC por 24 horas
(Correia, 2004).
( )
100
amostradainicialpeso
)amostradafinalpesoinicialpeso(
%Umidade
×
−
= (3)
4.1.1.5 - Cinzas
Cadinhos de porcelana vazios foram depositados em mufla e deixados a 550°C, durante
15 minutos. Depois foram deixados em dessecador até atingir a temperatura ambiente e
pesados vazios e com cinco gramas da amostra. Logo após pesagem os cadinhos foram
levados à mufla durante cinco horas, a 550ºC, até obter cinza clara. Foram então deixados no
dessecador até a temperatura ambiente e novamente pesada (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
( )
100
amostradainicialpeso
amostradafinalpeso
%Cinzas
×=
(4)
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
62
4.1.1.6 - Teor de sólidos solúveis (ºBrix)
A concentração de sólidos solúveis medida em ºBrix é uma medida relacionada com a
quantidade de açúcares presentes na amostra. Foram adicionados 9 mL de água destilada a 1g
do resíduo e, após homogeneização, deixou-se a suspensão em repouso por 30 minutos, com
agitação intermitente. Após este período a suspensão foi filtrada com algodão realizada a
leitura em refratômetro, o resultado foi multiplicado por dez, devido à diluição, afim de
determinar o teor de sólidos solúveis do resíduo (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
4.1.1.7 - Teor de açúcares redutores (AR)
Para a determinação dos açúcares redutores utilizou-se uma modificação do método do
DNS, originalmente proposto por Miller (1959), de acordo com protocolo da Embrapa
Agroindústria Tropical. O método do DNS (ácido 3,5-dinitro salicílico) baseia-se na redução
deste a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, concomitantemente com a oxidação do grupo aldeído
do açúcar a grupo carboxílico. Após aquecimento, a solução torna-se avermelhada, sendo lida
no espectrofotômetro a 540 nm.
Solução reagente:
Preparo de 100 mL de NaOH 2 normal
: em becker de 250 mL foram pesados 8g de NaOH PA
e dissolvido com 50 mL de água destilada em banho com água fria. A solução foi transferida
para balão volumétrico de 100 mL e aferida com água destilada.
Preparo de 500 mL de DNS
: foram pesados 5g de DNS (ácido 3,5 – dinitro-salicílico) e
adicionados 100 mL de NaOH 2 normal, em becker de 250mL. Em um becker de 500 mL
foram pesados 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio e dissolvidos em 250 mL de água
destilada. A solução foi levada para aquecimento até dissolver completamente e a ela foi
adicionado à solução de DNS sob aquecimento até dissolver completamente. Deixou-se
esfriar, e aferiu-se em balão de 500 mL com água destilada. A solução foi armazenada em
frasco escuro sob condições mínimas de luz.
Curva padrão:
Na construção da curva padrão foram pesados 100 mg (0,1 g) de glicose e
dissolvido em 100 mL de água destilada em balão volumétrico. Após agitação vigorosa para
homogeneizar, transferiu-se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mL da solução-mãe para tubos de ensaio e
o volume foi completado para 10 mL com água destilada. Os tubos foram homogeneizados e
de cada tubo transferiu-se 1 mL para tubos com 1 mL de DNS (em duplicata). Os tubos foram
aquecidos a 100°C por cinco minutos, tendo-se o cuidado de não colocar os tubos antes de
aquecimento vigoroso do banho e então resfriados em banho com água a temperatura
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
63
ambiente por três minutos. A cada tubo foram adicionados 8 mL de água destilada, após
homogeneizado, a absorbância foi lida a 540 nm. Com os valores de absorbância, foi
construída a curva de absorbância versus concentração.
Análise das amostras:
Inicialmente foi determinada a quantidade inicial de amostra que
resultasse em leitura dentro da faixa da curva padrão. As diluições necessárias foram usadas
no cálculo para determinação do teor de açúcar da amostra desconhecida. Depois de dissolver
determinada quantidade de amostra em um volume definido de água, transferiu-se 1mL para
tubos de ensaio contendo 1mL de solução DNS. A seguir, os tubos foram levados para banho
de água fervente por exatos 5 minutos. Após este intervalo, os tubos foram retirados do banho
de água quente e colocados em banho de água fria por três minutos, até completo
resfriamento. Em cada tubo foi adicionado 8 mL de água destilada e feita à leitura
imediatamente a 540 nm. A curva padrão foi usada para transformar a leitura de absorbância
em miligramas de açúcares redutores por mililitro de solução. Efetuaram-se os cálculos para
expressar os resultados em miligramas de açúcares redutores por grama de amostra inicial
(mg AR/g amostra).
4.1.1.8 - Proteína bruta
Inicialmente para análise de proteína testou-se o método do Biureto. Durante a etapa de
extração das proteínas do resíduo sólido, usando 0,5 g da amostra, 1 mL de hidróxido de sódio
0,5 normal e 10 mL de água destilada em banho de água fervente por 5 minutos, a solução
obtida ficava muito escura. Devido a isto as leituras de absorbância eram muito elevadas
levando a resultados de proteína inconsistentes. Assim métodos em que a extração da proteína
é feita usando solução de hidróxido de sódio como, método do Biureto e Lowry, foram
descartados.
Desta forma, adotou-se o método usado para análise de proteína do Laboratório de
Solos e Nutrição de Plantas da Embrapa Algodão, localizada em Campina Grande – PB, nele
as proteínas são digeridas pelo método do Kjeldahl e o nitrogênio formado é quantificado
usando o Reativo de Nessler.
No método de Kjeldahl determina-se o nitrogênio protéico propriamente dito e outros
compostos nitrogenados não protéicos, tais como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas e
aminoácidos. Neste caso, o resultado é dado como proteína bruta. O termo proteína bruta
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
64
envolve um grande grupo de substâncias com estruturas semelhantes, porém com funções
biológicas diferentes.
Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%,
introduz-se o fator empírico 6,25 para transformar o número de gramas de nitrogênio
encontrado em número de gramas de proteína (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
Pelo método Kjeldahl as proteínas e outros compostos nitrogenados são decompostos
na presença de ácido sulfúrico concentrado, a quente, com produção de sulfato de amônio. O
sulfato de potássio ou de sódio é adicionado, a fim de aumentar o ponto de ebulição do ácido
sulfúrico, apressando a digestão. O sulfato de amônia resultante, neste caso, foi quantificado
usando o Reagente de Nessler, conforme descrito a seguir.
Preparo do Reativo de Nessler
Pesava-se 45,5 g de HgI em um becker (1) de 500 mL adicionava-se 200 mL de água
destilada e misturava-se bem.
Pesava-se 34,9 g de KI e dissolvia-se em um pouco de água destilada. Adicionava-se ao
becker com solução de HgI e misturava-se para dissolver bem.
Pesava-se 112 g de KOH e dissolvia-se em aproximadamente 200 mL de água destilada, em
banho com água fria. Após completa dissolução esperava-se esfriar e adicionava-se ao becker
(1) com agitação constante para não queimar.
O conteúdo do becker era transferido para balão volumétrico de 1000 mL e aferindo-se o
balão com água destilada.
Transferia-se a solução para um becker e agitava-se, com agitador magnético por 4 horas.
Após este período, se houvesse necessidade a solução era filtrada e guardada em frasco
escuro.
Digestão sulfúrica
Pesava-se 0,1 g da amostra em tubo de ensaio grande.
Colocava-se 50 mg de sulfato de sódio.
7 a 10 gotas de sulfato de cobre a 5% (0,5 mL).
5 mL de ácido sulfúrico.
Fazia-se uma prova em branco.
Fazia-se uma pré-digestão (±12 horas) a frio.
Aquecia-se em bloco digestor a temperatura de 350º C, aumentando gradativamente a
temperatura do bloco: 50°C por uma hora, 100°C por uma hora, 150°C após 30 minutos e
assim sucessivamente até 350°C.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
65
Retirava-se do bloco digestor quando toda matéria orgânica estava destruída (ficava uma cor
clara – esverdeada).
Deixava-se esfriar.
Transferia-se o material para um balão volumétrico de 100 mL, lavando bem o tubo de ensaio.
Fazia-se o aferimento do balão quando estava frio. – extrato (1)
Preparo da curva padrão
A curva padrão foi feita utilizando uma solução 10 ppm de cloreto de amônia, como ppm
corresponde a mg/L preparava-se uma solução usando 1g de NH
4
Cl e dissolvia-se em balão
volumétrico de 1000 mL, obtendo-se assim uma solução de 1000 ppm.
Da solução anterior, tomava-se 1 mL e transferia-se para balão volumétrico de 100 mL,
obtendo uma solução 10 ppm.
Numerava-se 6 balões volumétricos de 50 mL e adicionava-se um pouco de água destilada.
Seguia-se os valores da Tabela 4.1 para fazer a curva padrão.
Tabela 4.1. Curva de calibração para análise de proteína
Concentração de
N (ppm)
NH
4
Cl 10 ppm
(mL)
NaOH 10%
(mL)
Silicato de Sódio
20% (mL)
Reagente de
Nessler (mL)
0 0 1 1 2
0,2 1 1 1 2
0,4 2 1 1 2
0,6 3 1 1 2
0,8 4 1 1 2
1,0 5 1 1 2
Completava-se o volume de cada balão para 50 mL com água destilada.
Deixava-se em repouso por 30 minutos.
Fazia-se leitura no espectrofotômetro a 410 nm.
Preparo das amostras:
Colocava-se 1 mL do extrato(1) em um balão volumétrico de 50 mL.
Adicionava-se um pouco de água destilada.
Adicionava-se 1 mL de hidróxido de sódio a 10%.
Adicionava-se 1 mL de silicato de sódio a 20 %.
Adicionava-se 2 mL do Reativo de Nessler.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
66
Completava-se o volume para 50 mL.
Deixava-se em repouso por 30 minutos.
Fazia-se leitura em espectrofotômetro com o comprimento de onda de 410nm.
Com auxílio da curva padrão obtinha-se o teor de proteína bruta, pela Equação 5.
% Proteína = ABS(amostra-branco)*valor da curva*5*6,25
(5)
4.1.1.9 - Pectinas
Certo número de substâncias relacionadas ao ácido péctico (C
17
H
24
O
16
) recebe esta
designação. Pectinas são componentes de muitas frutas; na presença de açúcares e ácidos,
apresentam a tendência a formar um gel, de onde a sua grande importância nos produtos de
frutas. Os métodos de determinação de pectinas se baseiam na sua extração por água quente
seguida por precipitação com álcool e, após purificação, pesagem na forma de pectato de
cálcio ou ácido livre.
Inicialmente foram preparadas as seguintes soluções:
Ácido acético 1 normal
: Diluía-se 30 mL de ácido acético glacial para 500mL com água
destilada.
Cloreto de cálcio 1 normal
: Dissolvia-se 27,5g de cloreto de cálcio anidro em 500mL de água
destilada.
Nitrato de prata a 1%
: Dissolvia-se 1g de nitrato de prata em 100mL de água destilada.
Ácido clorídrico 0,05 normal
: Diluía-se 4,5 mL de ácido clorídrico para 1000mL com água
destilada.
Pesava-se 20 g da amostra em um becker de 1000 mL, adicionando-se 400mL de
solução de HCl 0,05 normal e leva-se para aquecimento por duas horas a 80-90°C,
recolocando-se a água destilada perdida por evaporação. Após este período a suspensão era
resfriada até a temperatura ambiente e então transferida para uma proveta de 500mL
completando-se o volume com água destilada. Filtrava-se com auxílio de algodão.
Do extrato filtrado media-se em proveta 200mL e transferia-se para um becker de 1000mL,
acrescentando-se 250mL de água destilada. A solução era então neutralizada com NaOH 1
normal, usando papel indicador de pH. Após neutralização, adicionava-se 10mL de NaOH 1
normal em excesso, com agitação constante. Em seguida era deixada em repouso por uma
noite. No dia seguinte adicionava-se 50mL de ácido acético 1 normal e após 5 minutos
acrescentava-se 25mL de solução de cloreto de cálcio 1 normal com agitação. A solução era
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
67
levada à ebulição por 2 minutos e deixada em repouso por 3 horas. Após esse período era
filtrada através de papel de filtro preparado antecipadamente (molhava-se o papel de filtro
com água destilada, secava-se em estufa a 105ºC por 2 horas, resfriava-se em dessecador e
pesava-se). O precipitado era lavado com água destilada quase fervendo, até que ficasse livre
de cloretos, para isto fazia-se o teste usando nitrato de prata no filtrado. O papel de filtro
contendo o pectado de cálcio era seco na estufa a 105ºC até peso constante Rangana (1979). A
pectina era expressa em %de pectato de cálcio através da expressão:
amostradapesofiltradodomL
100500cálciodepectatodopeso
cálciodePectato%
×
×
×
=
(6)
4.1.2 – Relação entre umidade e atividade de água dos resíduos frente à adição de água
O preparo e a seleção do substrato devem levar em conta os níveis de atividade de água
e umidade ideais. A adição de água ou solução de nutrientes ao meio pode ser utilizada de
forma a alcançar os níveis ideais para o desenvolvimento do processo de fermentação.
Para os dois resíduos utilizados foram analisadas as atividades de água na temperatura
do processo (30°C) e a umidade relativa de equilíbrio.
Para a determinação da atividade de água do substrato foram pesadas amostras com 10g
do resíduo seco com a adição de diferentes quantidades de água, de modo a simular as
condições de incubação. As amostras foram armazenadas em recipientes fechados por um
período de 2 horas, e então analisadas diretamente em equipamento
Thermoconstanter
Novasina
. As amostras foram colocadas em cubetas apropriadas e inseridas no aparelho.
Transcorrido o tempo necessário para equilíbrio das mesmas era feita leitura direta da
atividade de água. Após leitura de atividade de água as amostras foram levadas à estufa para
determinação da umidade relativa de equilíbrio.
Com os valores das atividades de água e umidade relativa de equilíbrio foram
construídas curvas que relacionam os valores de atividade de água e umidade ao volume de
água adicionada ao resíduo, com o objetivo de avaliar a quantidade de água a ser adicionada
ao substrato, inicialmente, assim como definir o comportamento do resíduo frente à adição de
água.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
68
4.2 - Microrganismo
O microrganismo empregado foi o
Aspergillus niger
CCT 0916, selecionado por ser
uma linhagem produtora de pectinases por FES, cedido pela Embrapa Agroindústria Tropical,
com sede em Fortaleza-CE. Os esporos da linhagem foram preservados em tubos de ensaio
com tampas rosqueadas contento solo estéril e estocados a -18 °C.
4.3 – Meio de cultura e manutenção do fungo
Os microrganismos foram ativados em duas etapas de transferência conforme
procedimento adotado por Couri (1993), usando um meio básico conforme Tabela 4.2. Neste
meio a pectina é a única fonte de carbono induzindo o crescimento de organismos produtores
de pectinases.
O meio foi preparado dissolvendo a pectina em água destilada sob agitação vigorosa.
Em seguida, os outros componentes foram adicionados, e o volume do balão aferido. O meio
foi então levado à fervura para cozimento do agar e depois distribuído em tubos de ensaio
(18x180 mm), nos quais foram adicionados 20 mL do meio e tampados com rolhas de
algodão envolvidos em gaze. O meio foi esterilizado por 20 minutos a 0,5 atm e, ainda
quente, inclinados.
Os esporos foram transferidos dos tubos com solo para o meio e incubados por cinco
dias em estufa a 30°C, constituindo o primeiro repique. O segundo repique foi obtido de
modo semelhante ao primeiro, partindo dos esporos de primeiro repique.
Tabela 4.2. Composição do meio básico
COMPONENTES
(grau p.a.)
CONCENTRAÇÃO
(g/L)
Pectina cítrica 10,00
NaNO
3
3,00
KH
2
PO
4
1,00
MgSO
4
0,50
KCl 0,50
FeSO
4
7H
2
O 0,01
Agar-Agar 20,00
Água destilada q.s.p.
Fonte: Couri (1993)
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
69
Os esporos de segundo repique foram utilizados para obtenção de grande quantidade de
esporos no meio de sabugo de milho. Cada repique pode ser mantido sob refrigeração por um
período de quatro meses. Segundo este procedimento cada tubo de ensaio contendo o
microrganismo no solo só era usado 4 ou 5 vezes, e descartado. Deste modo se assegura que a
linhagem não sofreu mutação, sendo a mesma linhagem usada em todos os experimentos.
O meio de sabugo foi preparado de acordo com protocolo da Embrapa Agroindústria de
Alimentos, no qual primeiro prepara-se as seguintes soluções:
Solução A: pesa-se 20 g de fosfato de potássio monobásico e dissolve-se em água
destilada, transfere-se para balão volumétrico de 100 mL e afere-se.
Solução B: Pesa-se 3,96g de sulfato de zinco e dissolve-se em um pouco de água
destilada. Adiciona-se 4,60g de sulfato de ferro, 0,01g de sulfato de manganês e 0,5mL de
ácido sulfúrico (95-97%). Após completa dissolução avoluma-se a 100 mL com água
destilada.
Solução umidificante: pesa-se 2,8g de peptona e dissolve-se em um pouco de água
destilada, transfere-se para balão volumétrico de 50 mL. Adiciona-se 0,19 mL da solução A e
0,025 mL da solução B, avoluma-se e homogeneíza-se.
Para cada Erlenmeyer de 125 mL foram pesados 4,6 g de sabugo de milho seco e moído
e adicionado 6 mL da solução umidificante. O frasco foi tampado com tampão de algodão
envolvido com gaze, homogeneizado e esterilizado em autoclave por 1 hora a 1 atm.
Para inoculação do meio de sabugo de milho foram transferidos 10 mL de uma solução
0,3% (v/v) de Tween 80 para tubos com os microrganismos de segundo repique. Com auxílio
de uma alça de platina os microrganismos foram suspensos e transferiu-se 1 mL para cada
frasco com o sabugo. Os frascos foram agitados e incubados em estufa a 30ºC por um período
de 5 dias. Após este período os frascos foram armazenados sob refrigeração e utilizados como
inóculo nos ensaios de fermentação.
4.4 – Obtenção da suspensão de esporos
Nos frascos de sabugo com esporos foram adicionados 40 mL de solução 0,3% v/v de
Tween. Após agitação vigorosa os esporos foram transferidos para Erlenmeyer com auxílio de
gaze estéril. A quantificação da suspensão assim obtida foi feita através de contagem dos
esporos em Câmara de Neubauer espelhada. O volume de suspensão de esporos adicionado ao
meio de fermentação foi ajustado de modo a ter-se uma concentração de 10
7
esporos por
grama de substrato sólido.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
70
4.5 – Estudo das condições de fermentação na síntese de pectinases
Com o objetivo de verificar a influência das variáveis: umidade inicial, suplementação
com uma fonte de nitrogênio e suplementação com uma fonte de fósforo na produção da
poligalacturonase foi elaborado uma planejamento experimental fatorial 2
3
, sendo então três
fatores e dois níveis para cada fator com três repetições no ponto central, como mostra a
Tabela 4.3.
Como variáveis de resposta (dependentes) foram avaliadas a atividade da
poligalacturonase e o percentual de redução de viscosidade.
Os níveis das variáveis independentes utilizadas em ordem crescente (-1, 0, +1) foram
40%, 50% e 60% para umidade inicial, 0%; 0,5% e 1,0% para nitrogênio e 0%, 0,3% e 0,6%
para o fósforo, todos calculados em base úmida. Como fonte de nitrogênio foi utilizado o
sulfato de amônia e como fonte de fósforo o fosfato de potássio monobásico. Quando as
fontes de nitrogênio e fósforo eram adicionadas ao meio, estas após serem pesadas eram
diluídas no volume de água a ser adicionada ao meio.
Tabela 4.3. Matriz do planejamento fatorial 2
3
+ 3 repetições no ponto central
Experimento
Umidade(%)
N (%) P (%)
1
-1(40) -1(0) -1(0)
2
+1(60) -1(0) -1(0)
3
- 1(40) +1(1) -1(0)
4
+1(60) +1(1) -1(0)
5
-1(40) -1(0) +1(0,6)
6
+1(60) -1(0) +1(0,6)
7
-1(40) +1(1) +1(0,6)
8
+1(60) +1(1) +1(0,6)
9
0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)
10
0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)
11
0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
71
4.6 - Processo fermentativo
As fermentações foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL contendo 20 gramas do
meio úmido. Para garantir a uniformidade das amostragens o meio foi preparado, de acordo
com a matriz do planejamento, em becker de polipropileno, adicionando-se lentamente água
destilada ao resíduo de caju e homogeneizando-se. Após homogeneização o meio foi
distribuído nos Erlenmeyer, que foram tampados com tampão de algodão envolvido com gaze
e levados a autoclave; 0,5 atm por 5 minutos.
A umidade inicial do meio foi ajustada através da Equação (7) para o resíduo do
pedúnculo de caju sem lavar e Equação (8) para o resíduo do pedúnculo de caju lavado, que
dá o volume de água a ser adicionado ao meio, tendo por base 10 gramas de resíduo seco e
apresentando um coeficiente de correlação de 0,96 ambas. Estas equações foram obtidas a
partir do estudo da atividade de água e umidade relativa de equilíbrio frente à adição de água
ao resíduo detalhado no item 4.1.2.
Volume água adicionado - sem lavar (mL) = 0,3779
x
(umidade desejada) – 10,388
(7)
Volume água adicionado – lavado (mL) = 0,3528
x
(umidade desejada) – 8,1578 (
8)
Ao meio de fermentação frio foram inoculados 10
7
esporos/grama de meio e incubados
a 30°C em estufa, sendo então processo estático. As amostras foram retiradas em períodos de
tempo regular durante o processo para realização das análises de pH, umidade, açúcares
redutores (AR) e proteína, segundo metodologias descritas nos itens: 4.1.1.3, 4.1.1.4, 4.1.1.8 e
4.1.1.8, respectivamente. A extração do complexo enzimático também era realizada e nela
media-se a atividade da poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade. Para cada
amostragem um Erlenmeyer era retirado da estufa, estando todos nas mesmas condições
iniciais do processo.
4.7 – Extração da enzima
A extração do complexo enzimático foi realizada adicionando-se 2,5 mL/grama de
meio fermentado de tampão acetato 200mM (pH 4,5) em temperatura ambiente (30°C). Após
adição do tampão as amostras foram homogeneizadas com auxílio de bastão de vidro e
deixadas por 1 hora em banho-maria com controle automático de temperatura a 30°C, depois
foram filtradas, usando papel de filtro qualitativo e funil de vidro. O filtrado foi estocado em
tubos de polietileno com tampa e armazenados a temperatura de -18°C.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
72
4.8 - Atividade da poligalacturonase
A atividade da poligalacturonase do extrato enzimático foi baseada no aumento dos
grupos redutores formados por ação da enzima. Em tubos de ensaio contendo 4mL de solução
de ácido poligalacturônico 0,25% (p/v) preparada em tampão acetato 200mM (pH 4,5),
previamente aclimatado a 35ºC, adicionou-se 0,25mL de extrato enzimático, prosseguindo a
reação enzimática por 30 minutos a 35°C. Terminada a reação, transferiu-se 0,25mL da
mistura reacional para tubos de ensaio contendo 1mL do reagente de DNS, após
homogeneização adicionava-se 0,75mL de água destilada e seguia-se o procedimento para
análise dos grupos redutores descrita no item 4.1.1.8.
Os ensaios foram feitos em duplicatas, nos ensaios em branco (também em duplicata),
a enzima foi adicionada ao ácido poligalacturônico e imediatamente transferida para os tubos
contendo o DNS. A curva padrão foi feita com solução de ácido galacturônico na faixa de 0 a
1 mg/mL.
Uma unidade de atividade corresponde à quantidade de enzima que libera 1 µmol de
ácido galacturônico por minuto de reação, nas condições de reação. Assim, o cálculo da
atividade é feito de acordo com a Equação 9. Os resultados foram expressos em unidades de
atividade por grama de meio fermentado (U/g).
(
)
3016,212
5,2417fAbsAbs
ATIV
brancoamostra
×
×
×
×
×
−
=
(9)
Onde:
ATIV
→
Atividade da poligalacturonase (U/g)
Abs
amostra
→
Absorbância da amostra
Abs
branco
→
Absorbância do branco
f
→
Fator de conversão da curva padrão de ácido galacturônico (mg/L)
17
→
Diluição da enzima no meio reacional
4
→
Diluição dos grupos redutores no reagente DNS
212,16
→
Peso molecular do ácido galacturônico (g/mol)
30
→
Tempo de reação (min.)
2,5
→
Razão solvente/meio usado na extração (mL/g)
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
73
4.9 – Percentual de redução de viscosidade
A atividade do complexo pectinolítico foi também dosada através do método
viscosimétrico, conforme procedimento adotado por Castilho (1997), sendo expressa na forma
de % de redução de viscosidade.
Em tubos de ensaio contendo 10 mL de pectina cítrica 1% (p/v) preparada em tampão
acetato de sódio 200 mM (pH 4,5) adicionou-se 1 mL do extrato enzimático prosseguindo a
reação por 10 minutos a 35ºC. Completado este tempo, ainda à mesma temperatura, a
viscosidade da mistura reacional foi medida usando viscosímetro de bola da marca “Schott”,
modelo 52013.
Foram realizados ensaios em branco, nos quais 1 mL de tampão acetato 200 mM (pH
4,5) foi adicionado à solução de pectina, ao invés do extrato enzimático. Todas as análises
foram realizadas em duplicata. Com os valores da viscosidade do ensaio em branco e daquele
com extrato enzimático, calculava-se a redução percentual de viscosidade devida à ação
enzimática.
4.10 - Influência das condições de extração da enzima
Para verificar a influência das condições de extração foram realizados experimentos em
que se variou o tempo de contato do meio fermentado com o tampão e a razão volume de
tampão/gramas de meio fermentado, de acordo com a matriz do planejamento experimental
mostrada na Tabela 4.4. Nestas condições foram testados dois sistemas um agitado e outro
sem agitação. A agitação foi feita colocando-se o Erlenmeyer em mesa agitada com rotação
de 200 rpm.
Neste caso, usou-se o meio fermentado nas seguintes condições: resíduo do pedúnculo
de caju lavado, umidade inicial de 40% e tempo de fermentação de 16 horas. As fermentações
foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL contendo 20 gramas do meio. Para garantir a
uniformidade das amostragens ao resíduo do pedúnculo de caju lavado foi adicionada água
destilada, de modo a atingir a umidade de 40%, conforme Equação (8), em becker de
polipropileno. Após homogeneização o meio foi distribuído nos Erlenmeyer e autoclavados a
0,5 atm por 5 minutos. Depois de frio o meio foi inoculado com os esporos do
Aspergillus
na
concentração de 10
7
esporos por grama de meio.
Ca pít u lo 4 – Met o dol o gi a Expe rime n t al
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
74
Transcorrida às dezesseis horas de fermentação o extrato enzimático foi extraído
conforme matriz do planejamento, filtrado e congelado para posterior análise da atividade
enzimática.
A atividade da poligalacturonase foi quantificada de acordo com o item 4.8.
Tabela 4.4. Matriz do planejamento experimental fatorial 2
2
com três repetições no ponto
central e pontos axiais.
Experimentos
Tempo de
contato (min)
Razão volume tampão/
massa de meio(mL/g)
1
-1 (30) -1 (2,5)
2
+1 (90) -1 (2,5)
3
-1 (30) +1 (7,5)
4
+1 (90) +1 (7,5)
5
0 (60) 0 (5)
6
0 (60) 0 (5)
7
0 (60) 0 (5)
8
+α (100) 0 (5)
9
-α (20) 0 (5)
10
0 (60) +α (8,5)
11
0 (60) -α (1,5)
Capítulo 5
Resultados e
Discussão
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
76
5. Resultados e Discussão
O capítulo cinco apresenta os resultados obtidos nos experimentos e a discussão sobre
os mesmos. Primeiro são apresentados os resultados da caracterização físico-química do
resíduo do pedúnculo de caju, seguidos dos relativos à influência da umidade inicial do meio
e presença do sulfato de amônia e fosfato de potássio monobásico no meio, sobre a produção
de pectinases em processo de fermentação em estado sólido. No final do capítulo é
apresentado um estudo sobre as condições de extração da poligalacturonase.
5.1 – Caracterização dos resíduos secos
A caracterização dos resíduos secos do pedúnculo de caju sem lavar e lavado, utilizados
como meio na produção de pectinases por fermentação em estado sólido estão apresentadas na
Tabela 5.1, os dados estão em base úmida. Como se observa, os resíduos apresentam variação
na sua composição de acordo com o tratamento dado antes da secagem.
Tabela 5.1. Caracterização dos resíduos seco do pedúnculo de caju
Parâmetros Analisados Unidade Sem Lavar Lavado
Umidade % 7,70 ± 1,57 10,20 ± 0,53
Cinzas % 2,05 ± 0,02 0,86 ± 0,02
Proteína % 6,83 ± 0,40 12,94 ± 1,42
Sólidos solúveis °Brix 46,40 ± 3,5 0,00 ± 0,00
AR % 35,45 ± 0,73 0,21 ± 0,01
Pectinas % 7,31 ± 0,20 13,41 ± 0,49
pH - 4,15 ± 0,01 4,51 ± 0,01
Densidade aparente g/mL 0,6 ± 0,05 0,56 ± 0,00
A produção de pectinase por
Aspergillus niger
é induzida pela presença de pectina no
meio de cultura. Assim, a caracterização dos resíduos secos do pedúnculo de caju visa
conhecer a composição dos resíduos com respeito ao conteúdo de nutrientes, que são
importantes na síntese da enzima como percentual de pectina, açúcares redutores e proteína,
bem como os parâmetros que afetam o processo como pH e a densidade aparente.
Os valores de pH estão de acordo com os determinados por Campos (2003) para o
pedúnculo fresco, (4,5). O pH é uma variável importante em qualquer processo biológico,
havendo valores de pH mínimo, ótimo e máximo para o desenvolvimento de cada
microrganismo. Geralmente os fungos tem como condição favorável de desenvolvimento pH
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
77
baixo (4,5 – 5,0) e as bactérias pH próximos à neutralidade (6,5 – 7,0). Na faixa de pH
encontrada, 4,15 para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar e 4,51 para o lavado,
associado ao baixo teor de umidade, os resíduos foram armazenados em temperatura ambiente
sem problemas de contaminação.
Para o processo de fermentação em estado sólido o pH do meio é um parâmetro
importante mais de difícil controle. A padronização do pH do substrato pode se dar durante a
sua preparação. Há componentes com capacidade tamponante, os quais podem ser
adicionados ao meio de modo a evitar flutuações drásticas de pH. A adição pode ser efetuada
desde que a substância não exerça nenhum papel deletério sobre a atividade biológica
(Pandey, Soccol, Leon, 2001). Os valores de pH observados nos resíduos são considerados
ideais como relatado por Malvessi & Silveira (2004) na produção da poligalacturonase. Eles
estudaram meios com pH inicial variando 2 a 7 e observaram máxima atividade da enzima
com pH inicial do meio de 4, usando o
Aspergillus oryzae
.
A maior parte das pectinases comerciais são enzimas indutíveis e substratos com alto
teor de pectina estimulam a produção da enzima. Os resíduos aqui estudados apresentam alto
teor de pectina sendo de 7% para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar e de 13% para o
lavado.
Com relação ao teor protéico, os valores encontrados foram de 6,83 para o resíduo do
pedúnculo de caju sem lavar e de 12,94 para o resíduo do pedúnculo de caju lavado. Assim
como o percentual de pectina para proteína percebe-se um aumento dos valores percentuais
sendo no resíduo lavado superior ao resíduo sem lavar, isto se deve ao fato de como durante
as lavagens houve arraste dos componentes solúveis, proporcionalmente houve aumento dos
componentes insolúveis em água.
Apresentam valores de sólidos solúveis também diferentes sendo para o resíduo sem
lavar de 46,4°Brix e zero para o lavado; estes valores estão de acordo com os valores de
açúcares redutores, pois para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar foi de 35,5% e de
0,21% para o lavado. Esta diferença está associada ao fato que as lavagens feitas no resíduo
do pedúnculo de caju retiraram praticamente todos os açúcares solúveis.
A densidade aparente (0,6 g/mL) revela que os resíduos tendem a não se compactarem
completamente, fator propício ao desenvolvimento de microrganismo, visto que os espaços
vazios criados pelo resíduo geram espaços suficientes para a circulação de ar. O que é muito
positivo, tendo em vista que o material será utilizado como substrato para o processo de
fermentação em estado sólido.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
78
A estrutura do substrato, sobretudo, tamanho e porosidade, determinam a área
superficial acessível ao microorganismo e à enzima (Correia, 2004). Partículas de tamanho
reduzido oferecem maior área superficial ao ataque microbiano, mas ao mesmo tempo, tende
a compactar-se facilmente. Neste caso, a respiração e aeração do sistema são dificultadas.
Partículas maiores, por sua vez, promovem maior espaço interpartículas, embora possua área
superficial menor. Para reduzir e uniformizar as partículas, após secagem os resíduos foram
moídos.
Como pode ser observado na Figura 5.1 os resíduos secos apresentam granulometria
cerca de 70% de partículas com Tyler de 20-35 o que corresponde a dimensões entre 0,42-
0,84mm. Correia (2004) estudando o enriquecimento protéico do bagaço de abacaxi trabalhou
com partículas de tamanho maior que 0,42 mm. Hennies (1996) trabalhando com bagaço de
laranja para produção de pectinases usou partículas com tamanho igual ou inferior a 0,71 mm.
0
10
20
30
40
50
20 (0,840 mm) 24 (0,710 mm) 35 (0,425 mm) 48 (0,297 mm) Fundo (<0,297
mm)
Tyler
% peso retido
Sem Lavar
Lavado
Figura 5.1. Distribuição granulométrica dos resíduos do pedúnculo de caju seco.
5.1.2 - Relação umidade e Aa dos resíduos frente à adição de água
O nível de umidade do substrato é um dos fatores que mais influenciam o processo e
varia de acordo com a natureza do substrato, tipo de produto que se deseja sintetizar e
necessidade do microrganismo. Níveis de umidade muito altos resultam numa diminuição da
porosidade, baixa difusão de oxigênio, aumento no risco de contaminação, redução no volume
de gás e redução de troca gasosa. Por outro lado, baixos níveis de umidade levam a um
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
79
crescimento baixo em relação ao ótimo, baixo grau de utilização do substrato e um
crescimento na tensão da água.
A atividade de água está relacionada à quantidade de água disponível para o
desenvolvimento do microrganismo (água livre). O teor de água do meio (umidade) revela a
concentração de água existente em determinado material, sendo expresso normalmente em
termos percentuais. A Figura 5.2 apresenta os valores de atividade de água e umidade
correspondente ao valor de água adicionada aos resíduos secos do pedúnculo de caju.
Como pode ser visto pela Figura 5.2 B a relação entre o volume de água adicionado e a
umidade não é linear para os valores estudados, que vão de 10-70% de umidade. Com o
objetivo de obter uma equação linear entre o volume de água a ser adicionado no resíduo para
obter uma umidade inicial definida, foram construídas curvas para os valores de umidade
entre 30-70%, Figura 5.3.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 14
A
a
Vol. água adicionado (mL/10 g)
lavado
sem lavar
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4 6 8 10 12 14
U
m
i
d
a
d
e
(
%
)
Vol. água adicionado (mL/10 g)
lavado
sem lavar
Figura 5.2. Relação da Aa (A) e umidade (B) para diferentes volumes de água destilada
adicionados aos resíduos.
A Figura 5.3 apresenta as equações para o cálculo do volume de água a ser adicionado a
cada resíduo. Os modelos lineares apresentam coeficientes de correlação de 0,96. Com o
auxílio destas curvas foi possível ajustar o valor de umidade inicial do meio para os dois
resíduos, pela adição de um volume definido de água.
A
B
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
80
y = 0,377x - 10,38
R² = 0,963
y = 0,352x - 8,157
R² = 0,964
0
4
8
12
16
20
20 30 40 50 60 70
Vol. água adicionado (mL/10g)
Umidade (%)
Sem lavar
Lavado
Figura 5.3. Relação linear entre % de Umidade e Volume de água destilada adicionada aos
resíduos.
A literatura cita diversos teores iniciais de umidade para a produção de pectinases por
Aspergillus niger
em fermentação semi-sólida. Couri & Farias (1995) empregaram um meio a
base de farelo de milho e soja, contendo 37,5% de umidade. Castilho (1997) usando farelo de
trigo e soja realizou testes para teores iniciais de umidade de 25%, 40%, 55% e 70%; com Aa
correspondente a 0,90; 0,95; 0,98 e 0,99; respectivamente, verificou que teores entre 40 e 55%
são os mais propícios à síntese de pectinases pelo fungo. Antier
et al
(1993), para selecionar
linhagens mutantes de
A. niger
para produção de pectinases por fermentação semi-sólida,
utilizaram meios com Aa = 0,96. Assim, no presente trabalho, a umidade inicial do meio
variou de 40%, 50% e 60% o que representa valores de atividade de água no resíduo sem
lavar de 0,90; 0,92 e 0,94 e para o resíduo lavado de 0,95; 0,96 e 0,97, respectivamente.
5.2 – Variáveis de processo estudadas
As variáveis de processo estudadas foram: umidade inicial do meio, suplementação com
uma fonte de nitrogênio (sulfato de amônia) e suplementação com uma fonte de fósforo
(fosfato de potássio monobásico), para os resíduos do pedúnculo de caju sem lavar e o resíduo
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
81
do pedúnculo de caju lavado, de acordo com a matriz do planejamento mostrado na Tabela
4.3 (Capítulo 4).
Durante o processo fementativo (72 horas) foram analisadas, em intervalos de
aproximadamente 12 horas, a umidade do meio, o pH, açúcares redutores, a atividade da
poligalacturonase e o percentual de redução de viscosidade. Os resultados para cada resíduo
estudado, estão mostrados a seguir.
5.2.1 - Pedúnculo de caju sem lavar
O primeiro ensaio teve como condições iniciais umidade de 40%, e não houve adição de
fontes de nitrogênio (N) e fósforo (P). A Figura 5.4 mostra a variação dos parâmetros
analisados ao longo de 72 horas de fermentação. A umidade se mantém praticamente
constante durante o processo. O pH inicial é 4,01 e cai lentamente durante o processo, às 47
horas de processo o pH é 2,89 mantendo-se nesta faixa ate às 72 horas de fermentação.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 8 23 32 47 56 72
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% Red. Viscosidade,
Umidade (%), AR (%)
pH
PG
Prot.
U
AR
%RV
Figura 5.4. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P.
A concentração de açúcares redutores no início do processo é de 27%, estes açúcares
são consumidos de modo mais acentuado até 23 horas do processo, chegando ao valor de
13,9%. Neste instante surge o primeiro pico do percentual de redução de viscosidade,
indicando a produção de pectinases pelo microrganismo. A atividade da poligalacturonase
ainda é zero neste instante, ou seja, há formação de outras enzimas do grupo. No intervalo 23
a 47 horas de cultivo o consumo de açúcares é lento variando de 13,9 para 11,9. É possível
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
82
que esteja ocorrendo o consumo da pectina como fonte de carbono resultando na produção da
poligalacturonase (PG) a partir de 23 horas de processo.
A maior produção de PG acontece às 47 horas de cultivo atingindo, nas condições
estudadas, 3 U/g. Este valor se mantém até 56 horas do processo, quando há novamente um
maior consumo de açúcares. Botella
et al.
(2006) estudando a produção da poligalacturonase
por
Aspergillus awamori
com bagaço de uva observaram, com a adição de 6% de glicose,
aumento de atividade, mas quando utilizou 8% de glicose houve diminuição da atividade
enzimática. Concluiu que a adição de glicose até certa concentração exerce efeito positivo na
síntese da enzima, mas quando em excesso tem efeito repressivo.
No início tem-se uma concentração de proteína de 5,6%, este valor aumenta atingindo
um pico em 23 horas de cultivo (8,6%) coincidindo com o maior pico de percentual de
redução de viscosidade. Após este período há uma leve queda (6,8%) justamente na fase de
menor consumo de açúcares. Considerando-se o teor de proteína como uma indicação da
concentração celular, pode-se dizer que a queda de açúcares é decorrente do crescimento
celular, mas quando a concentração de açúcares é limitante o microrganismo reduz sua
velocidade de crescimento e começa a produção de PG.
Este fato também foi citado por Fawole & Odunfa (2003), alta concentração de glicose
presente no meio satisfaz as exigências de crescimento do organismo sendo desnecessária ou
mínima a quebra da molécula de pectina, resultando assim em baixa atividade de enzimas
pectinolíticas. Porém, a baixas concentrações de glicose, surge a necessidade da quebra da
molécula de pectina de modo que possa ser utilizada levando a alta atividade pectinolítica.
No segundo ensaio adotou-se umidade do meio em 60%, sem adição de fontes de
nitrogênio e fósforo. A Figura 5.5 apresenta a cinética do processo para este ensaio.
Nota-se que com 60% de umidade praticamente não houve formação de PG durante o
processo. O maior pico do percentual de redução de viscosidade ocorreu em 23 horas de
cultivo (25%), em seguida mantendo valores em torno 16% até o fim do processo. Neste
instante a concentração de açúcares redutores era de 9%. Fazendo uma associação do
consumo de açúcares e da produção de proteína com o crescimento celular, pode-se observar
uma fase lag durante as primeiras oito horas, onde foi baixo o consumo de açúcares e o teor
de proteína se manteve constante (2,8-2,9%). Entre 8 e 32 horas o crescimento é exponencial,
com consumo acelerado de açúcares e produção de proteína. Das 32-47 horas pode-se
observar uma fase estacionária, sem variações de açúcares redutores ou proteína. Após 47
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
83
horas de processo ocorre a fase de declínio, onde o teor de proteína cai (10,1-4,5%) e o
percentual de açúcares redutores se mantém em torno de 1%.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 8 23 32 47 56 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), AR
(%), pH, Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Umidade (%), % Red.
Viscosidade,
pH
PG
AR
Prot.
U
%RV
Figura 5.5. Ensaio 2, 60% de umidade, 0% de N e 0% de P.
O pH do meio tem leve queda até 32 horas de processo depois começa a subir (2,6-4,6).
Botella
et al
. (2006) observaram o mesmo fato associando o decréscimo do pH a produção de
ácidos orgânicos pelo microrganismo. Quando a concentração de açúcares é mínima, o pH
aumenta, provavelmente pela assimilação dos ácidos orgânicos pelos microrganismos. Neste
momento a umidade também se eleva (58,9-70,5%).
O ensaio 3 tem como condição inicial umidade de 40%, com adição de 1% de
nitrogênio e sem adição da fonte de fósforo. Difere do ensaio 1 pela adição de 1% de sulfato
de amônia como fonte de nitrogênio. A Figura 5.6 mostra a cinética do processo nesta
condição. A umidade do meio se mantém praticamente constante durante as 71 horas de
processo.
A concentração de açúcares redutores no início do cultivo é 26%, caindo rapidamente
nas primeiras 7 horas, chegando a 19,1% e depois passa a cair mais lentamente entre 7 e 22
horas de processo (19,1-18,8%). Às 22 horas de cultivo observa-se o início da produção de
pectinases, apresentando 72,2% de redução de viscosidade com 4,9 U/g de PG. No intervalo
entre 22 a 30 horas quase não há consumo de açúcares redutores (18,8-18,1%) indicando um
possível consumo de pectina para a produção de pectinases por indução, sendo o máximo de
atividade observado às 30 horas de processo, 16U/g de PG e 82,3% de redução de
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
84
viscosidade. Às 46 horas de processo a concentração de açúcares redutores caiu bastante,
chegando a 3,7%. Neste instante vê-se um aumento da concentração de proteína (10,9-17,2%)
indicando um crescimento celular, mas com queda da atividade enzimática, ou seja, o
microrganismo consome açúcares redutores preferencial para crescimento.
O pH do meio cai lentamente até 30 horas de processo (3,93-3,33), atingindo 2,76 às 46
horas de cultivo.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
0 7 22 30 46 55 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g),
AR(%), pH, Proteína
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Umidade (%), % Red.
Viscosidade
pH
PG
AR
Prot .
%RV
U
Figura 5.6. Ensaio 3, 40% de umidade, 1% de N e 0% de P.
Comparando o ensaio 3 com o ensaio 1 pode-se observar que a adição da fonte de
nitrogênio traz benefícios para produção de PG passando de 3 U/g com 47 horas de cultivo
para 16 U/g com 30 horas de cultivo. Este fato pode estar associado a um maior equilíbrio da
relação C/N do meio onde no experimento 1 apresentava 27% de açúcares redutores e 6% de
proteínas, já no experimento 2 havia 26% de açúcares redutores e 9% de proteína no início do
processo.
Quando adotou-se 60% de umidade não houve produção significativa de PG o que pode
ser observado nas Figuras 5.7, 5.8 e 5.9 com maiores picos de produção de PG 0,41; 1,15 e
0,54 U/g, representando respectivamente as cinéticas dos ensaios 4, 6 e 8.
O ensaio 4 foi conduzido com 60% de umidade inicial, 1% de sulfato de amônia sem
adição da fonte de fósforo. A cinética deste cultivo está apresentada na Figura 5.7. Vê-se que
o consumo de açúcares redutores é alto até as 22 horas de cultivo (18,6-3,0%), com queda do
pH (3,92-2,76). O percentual de redução de viscosidade cresce com o tempo, atingindo o pico
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
85
às 46 horas de cultivo (38%), indicando haver produção de outras enzimas do complexo
pectinolítico.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 8 22 30 46 56 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%), AR(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%Red. Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
AR
Prot .
U
%RV
Figura 5.7. Ensaio 4, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.
O ensaio 6 (Figura 5.8) foi conduzido com umidade inicial de 60%, adição de 0,6% de
fosfato de potássio monobásico e sem adição da fonte de nitrogênio. Já o ensaio 8 (Figura 5.9)
foi conduzido com mesma umidade mas com adição de 1% de N e 0,6% de P.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 7 21 30 46 54 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g),
AR(%), pH, Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
%Red. Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
AR
Prot.
U
%RV
Figura 5.8. Ensaio 6, 60% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
86
Nestes ensaios pode-se verificar o crescimento exuberante do microrganismo com 21
horas de cultivo o que mostra condições ideais de crescimento, pois com alta umidade os
açúcares se encontram dissolvidos no meio, facilitando o transporte do interior para o exterior
da partícula do sólido, assim o microrganismo se desenvolve sem necessidade de utilização de
outra fonte de carbono, não havendo necessidade de produção de enzimas pectinolíticas.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 18 21 32 48 55 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Ar (%), Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
AR
U
%RV
Prot.
Figura 5.9. Ensaio 8, 60% de umidade, 1% de N e 0,6% de P.
No ensaio 5 adotou-se umidade inicial do meio de 40%, sem adição da fonte de
nitrogênio e com 0,6% de fosfato de potássio monobásico. A Figura 5.10 apresenta a cinética
do processo nestas condições. Observa-se que com 22 horas de processo obtém-se o máximo
de atividade de PG de 11,58 U/g com 70% de redução de viscosidade.
A adição da fonte de fósforo também apresenta benefícios para o processo com 40% de
umidade. Comparando com a condição onde houve adição da fonte de N, apresentada na
Figura 5.3, vê-se que o maior pico de PG acontece com 22 horas de cultivo (11,6 U/g)
enquanto que o com adição de N ocorreu às 30 horas (16U/g) de cultivo. Apresentando,
entretanto, a mesma produtividade 0,53 U/g.h.
Comparando os ensaios 5 e 7 observa-se que apresentam cinéticas de cultivo
semelhantes, ou seja, quando as duas fontes (N e P) estão presentes no meio, ensaio 7, a
cinética de cultivo e a produção de PG e quase igual ao cultivo onde somente a fonte de
fósforo está presente. Neste caso (ensaio 7) a fermentação aconteceu com umidade inicial de
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
87
40%, com 1% de N e 0,6% de P. Aqui também o maior pico de PG ocorreu com 22 horas de
processo sendo de 11,85 U/g, com percentual de redução de viscosidade de 71%.
Para os ensaios 3, 5, e 7, todos com umidade de 40%; os maiores picos de percentual de
redução de viscosidade foram com 30 horas de processo, sendo de 82%, 74% e 73%
respectivamente. Então, para a atividade do complexo pectinolítico como um todo, a adição
de 1% de nitrogênio com 40% de umidade é a melhor condição e os picos de percentual de
redução de viscosidade são atingidos às 30 horas de processo.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
0 8 22 31 48 55 72
Tempo (h)
Atividade PG (U/g),
AR(%), pH, Proteína
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
AR
Prot .
U
%RV
Figura 5.10. Ensaio 5, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
Atividade PG (U/g),
AR(%), pH, Proteína
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
AR
Prot.
U
%RV
Figura 5.11. Ensaio 7, 40% de umidade, 1% de N e 0,6% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
88
Tendo como uma das finalidades verificar a reprodutibilidade dos dados, foram
realizados ensaios em triplicata na condição 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P. As
Figuras 5.12 e 5.13 apresentam as cinéticas do processo para estes ensaios. Os parâmetros de
processo: umidade, pH, açúcares redutores e o teor de proteína, apresentam desvios pequenos
sendo 1,4; 0,2; 1,1 e 1,0 respectivamente, Figura 5.12.
0
5
10
15
20
25
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
AR (%), Proteína (%)
,
pH
0
10
20
30
40
50
60
70
Umidade (%)
pH
AR
U
Prot.
Figura 5.12. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.
Para a atividade enzimática os desvios são apresentados na Figura 5.13. No início os
dados são bem reproduzidos, apresentando desvio zero, isso ocorre porque ainda não
começou a produção de enzimas. Às 21 horas de processo tem-se a maior produção de
enzima, apresentado um desvio padrão grande, mas que se repete nas duas análises de
enzimas, havendo variação destes desvios para cada hora de fermentação analisada.
0
1
2
3
4
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
Atividade PG (U/g)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
%Red. Viscosidade
PG
%RV
Figura 5.13. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
89
5.2.1.1 – Avaliação do comportamento do processo através da metodologia de superfície
de resposta para o resíduo sem lavar
Utilizando a ferramenta do planejamento experimental e análise de superfície de
resposta para o resíduo sem lavar é possível investigar a influência das variáveis em um
processo e a forma de interação entre estas variáveis, bem como obter o valor das variáveis
que otimizem
os resultados.
As Tabelas 5.2 e 5.3 mostram respectivamente os resultados experimentais da atividade
poligalacturonásica e do percentual de redução de viscosidade quando se faz variar os fatores:
percentual inicial de umidade (U), adição de uma fonte de nitrogênio (N) e adição de uma
fonte de fósforo (P). Os resultados estão apresentados para cada istante do processo analisado.
Tabela 5.2. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonásica para o
resíduo do pedúnculo de caju sem lavar
Atividade PG por horas de fermentação (U/g)
Exp.
7 22 30 46 54 70
1
0,0
0,0 1,7 3,0 3,1 2,1
2
0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,5
3
1,7
4,9 16,0 4,7 1,8 0,1
4
0,0
0,4 0,2 0,0 0,0 0,0
5
1,8
11,6 3,2 1,3 3,5 1,8
6
0,0
0,0 0,0 1,2 0,9 0,0
7
0,0
11,9 0,0 1,7 0,0 0,3
8
0,0
0,0 0,5 0,2 0,1 0,3
9
0,0
2,6 1,1 1,3 0,3 0,2
10
0,0
3,7 1,2 0,0 0,3 0,0
11
0,0
3,2 0,9 0,8 0,6 0,3
Com os resultados experimentais obtidos para cada instante de fermentação, a partir do
planejamento fatorial, é possível ajustar os dados para obter um modelo de primeira ordem
que relacione a atividade enzimática com os parâmetros estudados. É bom lembrar que os
modelos obtidos são empíricos sendo aplicáveis apenas na região estudada. Os modelos
obtidos para a atividade da poligalacturonase (PG) estão apresentados na Tabela 5.4, junto
com os coeficientes de determinação (R
2
) e os valores de F. Os parâmetros em negrito são os
estatisticamente significativos ao nível de 95% de confiança.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
90
Tabela 5.3. Resultado experimental em termos do percentual de redução de viscosidade
para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar
% Redução viscosidade por horas de fermentação
Exp. 7 22 30 46 54 70
1
0 74 76 61 46 37
2
0
26 21 17 18 18
3
0
72 82 69 43 31
4
11
19 28 38 15 40
5
1
70 74 63 52 38
6
0
23 20 9 6 4
7
0
61 73 59 43 21
8
19
16 15 22 8 54
9
0
46 38 30 19 13
10
0
37 37 27 23 11
11
0
32 37 38 24 36
Tabela 5.4. Modelo de primeira ordem obtido para a atividade poligalacturonásica (PG) por
hora de fermentação para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar
Modelo Atividade da Poligalacturonase R
2
(%) F
PG (7h) = 0,32-0,44U-0,01N+0,01P+0,01UN-0,01UP-0,44NP+0,44UNP 91,7 0,5
PG (22h) = 3,48-3,5U+0,7N+2,28P-0,6UN-2,38UP-0,63NP+0,53UNP 99,5 9,3
PG (30h) = 2,25-2,52U+1,48N-1,77P-1,30UN+1,85UP-2,15NP+2,23UNP 97,3 1,8
PG (46h) = 1,29-1,16U+0,14N-0,41P-0,39UN+0,76UP-0,29NP+0,04UNP 89,9 0,4
PG (54h) = 0,90-0,90U-0,72N-0,07P+0,48UN+0,28UP-0,35NP+0,20UNP 84,3 0,3
PG (70h) = 0,53-0,44U-0,45N-0,03P+0,41UN-0,01UP+0,15NP+0,04UNP 90,9 5,3
O coeficiente de determinação ou explicação R
2
quantifica a qualidade do ajuste, pois
fornece uma medida da proporção da variação explicada pela equação de regressão em
relação à variação total das respostas. Varia de 0 a 100% (Rodrigues & Iemma, 2005).
O teste F apresenta a razão entre o F calculado e o F tabelado. Sempre que esta relação
for maior que 1 a regressão é estatisticamente significativa havendo relação entre as variáveis
independentes e dependentes. Para que uma regressão seja não apenas estatisticamente
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
91
significativa, mas também útil para fins preditivos, o valor da razão deve ser no mínimo maior
que quatro (Barros Neto
et al
., 1996).
Da mesma forma, para o percentual de redução de viscosidade foram obtidos os
modelos apresentados na Tabela 5.5.
Tabela 5.5. Modelo de primeira ordem obtido para percentual de redução de viscosidade (RV)
por hora de fermentação para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar
Modelo Percentual de Redução de Viscosidade R
2
F
RV (7h) = 2,82+3,63U+3,63N+1,13P+3,88UN+0,88UP+0,88NP+1,13UNP 91,7 0,5
RV (22h) = 43,27-24,13U-3,13N-2,63P-0,38UN+1,13UP-0,88NP+0,88UNP 96,0 1,2
RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-0,38UN-0,38UP-2,38NP-0,63UNP 95,7 1,1
RV (46h) = 39,36-20,75U+4,75N-4,00P+3,75UN-2,00UP-2,50NP+0,50UNP 92,7 0,6
RV (54h) = 27,00-17,13U-1,63N-1,63P+1,38UN-3,13UP-0,13NP+1,38UNP 95,5 1,0
RV (70h) = 27,55-1,38U+6,13N-1,13P+11,88UN+1,13UP+2,13NP+4,88UNP 73,1 0,9
De acordo com os dados experimentais os maiores valores de atividade enzimática
foram obtidos às 30 horas de fermentação. Assim, será apresentada a seguir a análise
estatística detalhada para 30 horas de fermentação.
O modelo obtido para a atividade da poligalacturonase (PG) é apresentado pela Equação
(10) e para o percentual de redução de viscosidade na Equação (11). Os parâmetros em
negrito são os estatisticamente significativos ao nível de 95% de confiança.
PG (30h) = 2,25-2,52U+1,48N-1,77P-1,30UN+1,85UP-2,15NP+2,23UNP (10)
RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-0,38UN-0,38UP-2,38NP-0,63UNP (11)
Neste caso o modelo apresentado na Equação (10) tem 97,3% das variações obtidas
explicadas pelo modelo e com um valor de F de 1,8; indicando que o modelo é
estatisticamente significativo com 95% de confiança.
De acordo com o Diagrama de Pareto apresentado na Figura 5.14, para o modelo de
atividade da poligalacturonase, a maioria dos efeitos são estatisticamente significativos ou
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
92
estão bem próximos de 95% de confiança, neste caso a retirada de algum parâmetro não
melhora a qualidade do ajuste, então se estudou o modelo com todos os parâmetros. A Tabela
5.6 apresenta a análise de variância completa.
-2,63986
2,994882
-3,59842
3,750576
-4,36426
4,516413
-5,11995
p=,05
Atividade da poligalacturonase (30 horas)
1by2
(2)N
(3)P
1by3
2by3
1*2*3
(1)U
Figura 5.14. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 30 horas de
fermentação (resíduo sem lavar).
Tabela 5.6. Análise de variância para atividade da poligalacturonase com 30 horas de
fermentação (resíduo sem lavar).
Fonte variação
SQ GL MQ Teste F
Regressão 211,12 7 30,16
15,50
Resíduo 5,83 3 1,94
F.ajuste 5,79 1
Erro puro 0,04 2
Total 216,95 10
%R² 0,97
F tabelado= 8,89 F5%=
1,75
Para o percentual de redução de viscosidade o Diagrama de Pareto (Figura 5.15) mostra
que a única variável estatisticamente significativa é a umidade. Neste caso a retirada de alguns
efeitos de menor valor contribui para um melhor ajuste do modelo.
O modelo com a retirada de algums coeficientes é:
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
93
RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-2,38NP (12)
A Tabela 5.7 apresenta a análise de variância para o percentual de redução de
viscosidade com 30 horas de fermentação. Com o novo ajuste o valor de F passa de 1,1 para
7,26 sendo agora o modelo não só estatisticamente significativo, mas também preditivo, sem
haver alterações no valor de R
2
, que era de 95,7% fica 95,6%.
-,110014
-,110014
-,183357
,2567004
-,696758
-,916787
-8,1044
p=,05
1by3
1by2
1*2*3
(2)N
2by3
(3)P
(1)U
Figura 5.15. Diagrama de Pareto para o percentual de redução de viscosidade.
Tabela 5.7. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade com 30 horas de
fermentação (resíduo sem lavar).
Fonte variação
SQ GL
MQ Teste F
Regressão 6234,50
4 1558,62
32,90
Resíduo 284,23 6 47,37
F.ajuste 283,56 4
Erro puro 0,67 2
Total 6518,73
10
%R² 0,96
F tabelado = 4,53
F5%=
7,26
Como observado nas Figuras 5.14 e 5.15 a umidade é o efeito de maior importância
para o processo, estando com valor negativo, então, o maior valor de atividade enzimática é
atingido para os menores valores de umidade.
Com base nesta informação as superfícies de resposta foram construídas mantendo-se o
valor de umidade fixa em 40% (menor umidade), variando os valores das fontes de nitrogênio
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
94
e fósforo. A superfície de resposta é a descrição gráfica do modelo, o que facilita a
interpretação dos resultados.
A Figura 5.16 apresenta a superfície construída para a atividade da poligalacturonase.
Nela observa-se que a máxima produção da poligalacturonase, 15,55 U/g, ocorre para valores
de nitrogênio de 1% e de fósforo 0%. Este valor está próximo do valor experimental obtido
nas mesmas condições, pois experimentalmente a atividade obtida nestas condições foi de 16
U/g. Como discutido anteriormente a adição das fontes de nitrogênio e fósforo trazem
benefícios para o processo. No entanto esta influência é observada quando apenas um dos
componentes é adicionada ao meio, sendo o valor de atividade da poligalacturonase maior
quando apenas nitrogênio é adicionada (16 U/g) do que quando apenas fósforo está presente
(11,6 U/g).
Figura 5.16. Influência da adição das fontes de nitrogênio e fósforo na atividade da
poligalacturonase para 30 horas de fermentação, fixando-se a umidade em 40% (nível -1).
Para o percentual de redução de viscosidade, Figura 5.17, nota-se que a adição das
fontes de nitrogênio e fósforo têm pouca influência no processo, mantendo valores de
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
95
percentual de redução de viscosidade superior a 70% para quase toda faixa de valores
estudadas, quando se mantém fixa a umidade em 40%.
Assim como para atividade da poligalacturonase, os maiores valores de percentual de
redução de viscosidade ocorrem para a condição de 40% de umidade, 1% de nitrogênio e não
adição da fonte de fósforo, chegando-se a 79,57% de redução de viscosidade, próximo do
valor obtido experimentalmente nas mesmas condições, 82%.
Figura 5.17. Influência da adição das fontes de nitrogênio e fósforo no percentual de redução
de viscosidade para umidade inicial de 40% (nível -1) com 30 horas de fermentação.
De acordo com os resultados obtidos, a concentração inicial de umidade é a variável de
maior importância para o processo, estando sempre os maiores valores de atividade
enzimática associada a baixos valores de umidade, 40%. Este resultado está de acordo com o
encontrado por Botella
et al.
(2006) que estudou a influência da umidade inicial na produção
de poligalacturonase usando resíduo da indústria de vinho (bagaço de uva), variando a
umidade inicial de 45-80%. Concluiu que a atividade enzimática decresce para valores de
umidade superior a 65%, atribuindo o fato ao decréscimo da porosidade, alterações na
estrutura da partícula e baixa transferência de oxigênio.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
96
A melhor condição de fermentação encontrada foi 40% de umidade, 1% de nitrogênio e
sem adição de fonte de fósforo, atingindo assim atividade da poligalacturonase de 15,55 U/g e
79,6% de redução de viscosidade às 30 horas de cultivo. Este valor de atividade é superior aos
citados na literatura para poligalacturonase obtida a partir de resíduos de frutas sendo 12 U/g
para bagaço de laranja, 5 U/g para casca de manga e 7,5 U/g para casca de banana, utilizando
Penicillium viridicatum
RFC3, atividades estas atingidas em 4 dias de fermentação (Silva
et
al
., 2002).
Zheng & Shetty (2000) encontraram atividade de 29,4 U/g e 20,1 U/g para bagaço de
morango e maçã, mas usando suplementação com ácido poligalacturônico, que aumenta o
custo do processo, e estes valores foram obtidos após 40 dias de fermentação usando
Lentinus
edodes
. Então, em termos de produtividade dentre estes resíduos o bagaço de caju ainda
apresenta-se como melhor substrato para a produção de pectinases.
5.2.2 – Pedúnculo de caju lavado
Igualmente para o resíduo de pedúnculo de caju sem lavar, para o resíduo do pedúnculo
de caju lavado foram realizados ensaios variando a umidade inicial, a adição de sulfato de
amônia (N) e a adição de fosfato de potássio monobásico (P) ao meio, Tabela 4.3.
O primeiro ensaio foi realizado com 40% de umidade, sem adição das fontes de N e P.
A Figura 5.18 apresenta a cinética do processo nestas condições. No início o pH do meio é de
4,54 e vai caindo lentamente devido aos metabólicos formados. O pico de atividade de PG se
dá no início do processo, logo com 8 horas, chegando a 9,34 U/g. O percentual de redução de
viscosidade também se apresenta no inicio do processo, mas, seu maior pico ocorre às 23
horas (81%), indicando a produção de outras enzimas do complexo pectinolítico.
No início do processo há uma queda no teor de proteína até as 23 horas de processo
(11,4-8,6%), depois deste período o teor de proteína começar a se elevar. Como o teor de
proteína é uma medida indireta da biomassa pode-se dizer que no início do processo as
condições de crescimento não são favoráveis, pois o resíduo não possui açúcares redutores,
sendo a pectina a fonte de carbono disponível, tal fato, associado ao baixo teor de umidade,
que dificulta o transporte de nutrientes para as extremidades da partícula; deste modo os
microrganismos são induzidos a produzir a enzima para que a pectina seja hidrolisada à
componentes fermentescíveis. Após as 23 horas de cultivo, maior pico de percentual de
redução de viscosidade, supõe-se que a fonte de carbono já está disponível ao microrganismo
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
97
e ele a utiliza para seu crescimento. Após este período a umidade do meio que se mantinha
constante começa a cair, tendo-se ao final do processo a umidade em 31%.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 8 23 32 47 56 72
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot.
U
%RV
Figura 5.18. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P.
No ensaio 2 em que a umidade inicial do meio é de 60%, o microrganismo encontra
condições de crescimento favorável ao desenvolvimento, e se percebe o aumento do teor de
proteína logo após as oito horas de processo.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 8 23 32 47 56 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot .
U
%RV
Figura 5.19. Ensaio 2, 60% de umidade, 0% de N e 0% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
98
O maior pico do percentual de redução de viscosidade ocorre às 32 horas de cultivo
(36%) sendo um valor bem inferior ao obtido com 40 % de umidade. Então, quando o
microrganismo encontra condições favoráveis ao seu crescimento, este se desenvolve sem a
necessidade de produção de grandes quantidades de enzimas pectinolíticas. Em condições
desfavoráveis ele é obrigado a produzir enzimas para o seu desenvolvimento. Caso típico de
produção de enzimas por indução do substrato.
Os ensaio 3, 5 e 7 foram realizados com 40% de umidade inicial do meio, sendo o
ensaio 3 com a adição de 1% de N, o ensaio 5 com 0,6% de P e o ensaio 7 com 1% de N e
0,6% de P. As Figuras 5.20, 5.21 e 5.22 mostram a cinética do processo de cada um destes
ensaios respectivamente.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 7 22 30 46 55 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot.
U
%RV
Figura 5.20. Ensaio 3, 40% de umidade, 1% de N e 0% de P.
A máxima atividade de PG (10,13 U/g) e percentual de redução de viscosidade (81%)
no ensaio 3 ocorreu com 22 horas de processo. Comparando o ensaio 1 com o ensaio 3 vê-se
que a adição da fonte de nitrogênio não alterou o percentual de redução de viscosidade mas, a
atividade de PG teve um pequeno aumento (9,34-10,13 U/g). Em termos de produtividade
houve uma queda de 1,2 U/g.h no ensaio 1 para 0,5 U/g.h no ensaio 3. Então, para este
resíduo a adição da fonte de nitrogênio não é interessante, isto pode estar associado ao fato
deste resíduo (lavado-12,94%) apresentar o dobro de proteína que o contido no resíduo sem
lavar (6,83%), não sendo necessária a adição de N.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
99
Com 40% de umidade a adição de fósforo também não trouxe benefícios ao processo.
Neste caso o maior pico de PG também ocorreu às 22 horas de cultivo sendo de 6,64 U/g e
80% de redução de viscosidade, como mostra a Figura 5.21. A ação dos dois sais no meio
pode ser vista na Figura 5.22. Nela vê-se que o maior pico de PG é agora com 30 horas de
processo (7,21) com 68% de redução de viscosidade, sendo esta a condição menos favorável à
produção de enzimas pectinolíticas, com baixa umidade.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 8 22 31 48 55 72
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%Red.Viscosidade,
Umidade(%)
pH
PG
Prot .
U
%RV
Figura 5.21. Ensaio 5, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot.
U
%RV
Figura 5.22. Ensaio 7, 40% de umidade, 1% de N e 0,6% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
100
Os ensaios 4, 6 e 8 foram conduzidos com 60% de umidade, sendo o ensaio 4 com
adição de 1% de N, o ensaio 6 com 0,6% de P e o ensaio 8 com a adição de 1% de N e 0,6 de
P. As cinéticas do processo estão apresentadas nas Figuras 5.23, 5.24 e 5.25 respectivamente.
Assim como no ensaio 2, nos ensaios 4 e 8 praticamente não há atividade da
poligalacturonase. Então, assim como para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar, a
umidade de 60% não favorece a produção de enzimas pécticas.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 8 22 30 46 56 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
%Red. Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot.
U
%RV
Figura 5.23. Ensaio 4, 60% de umidade, 1% de N, 0% de P.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 7 21 30 46 54 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot .
U
%RV
Figura 5.24. Ensaio 6, 60% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
101
Com 60% de umidade a adição da fonte de fósforo aumentou a produção de PG, que no
ensaio 2, sem fósforo era de 1,17 U/g para 10,41 U/g com 21 horas de processo, ensaio 6.
Estes valores são semelhantes aos obtidos com 40% de umidade e 1% de N, condição
aplicada no ensaio 3.
A interação das fontes de nitrogênio e fósforo no meio (Figura 5.25) é a condição menos
favorável à produção de enzimas pectinolíticas para o resíduo lavado, como dito
anteriormente ao se analisar a ação conjunta dos sais com 40% de umidade. A cinética de
produção é semelhante ao obtido no ensaio 4 com 60% de umidade e 1% de N.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 18 21 32 48 55 71
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
Prot.
U
%RV
Figura 5.25. Ensaio 8, 60% de umidade, 1% de N e 0,6% de P.
A reprodutibilidade dos dados é apresentada na Figura 5.26 que apresenta os resultados
das médias e desvios padrões de três ensaios realizados com 50%de umidade, 0,5% de sulfato
de amônia e 0,3% de fosfato de potássio monobásico. Os desvios com relação a umidade, pH
e proteína são pequenos, 0,1; 4,2 e 1,4 respectivamente, apenas o desvio para umidade às 54
horas de cultivo é grande (13,6), o que pode ser justificado pelo toque da amostra nas paredes
úmidas do Erlenmeyer, no instante da retirada de amostra.
O percentual de redução de viscosidade e a atividade PG também apresentam pequenos
desvios, variando conforme a amostra analisada, sendo em média 5,1 e 0,6 respectivamente.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
102
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
Atividade PG (U/g), pH,
Proteína (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
%Red.Viscosidade,
Umidade (%)
pH
PG
U
%RV
Prot.
Figura 5.26. Ensaios 9,10 e 11, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.
5.2.2.1 – Avaliação do comportamento do processo através da metodologia de superfície
de resposta para o resíduo lavado
Assim como para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar agora será feita uma
avaliação do processo de produção de pectinase por fermentação em estado sólido utilizando a
ferramenta do planejamento experimental e análise de superfície de resposta para o resíduo do
pedúnculo de caju lavado.
As Tabelas 5.8 e 5.9 apresentam os resultados experimentais para atividade da
poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade respectivamente para cada instante
de fermentação analisada. Vale lembrar que os experimentos 10 e 11 foram realizados nas
mesmas condições do experimento 9, estando as variáveis no ponto central, 50% de umidade,
0,5% de nitrogênio e 0,3% de fósforo.
A partir da matriz do planejamento, pode-se analisar a influência dos parâmetros
(variáveis independentes): umidade inicial, adição da fonte de nitrogênio e adição da fonte de
fósforo no processo. Com os resultados experimentais para cada instante de fermentação, é
possível ajustar os dados para obter um modelo de primeira ordem que relacione a atividade
enzimática com os parâmetros estudados.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
103
Tabela 5.8. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonásica para o
resíduo do pedúnculo de caju lavado
Atividade PG por horas de fermentação (U/g)
EXP
7 22 30 46 54 70
1
9,3 6,2 6,2 7,0 3,9 1,8
2
0,0 0,1 1,2 1,2 0,5 0,0
3
3,7
10,1 10,0 4,2 3,6 4,4
4
0,0
0,0 0,0 0,2 0,0 0,5
5
2,9
6,6 6,8 4,0 3,7 2,8
6
0,7
10,4 0,6 2,5 0,6 0,4
7
1,6
0,1 7,2 7,0 6,4 4,8
8
0,2
0,8 0,0 0,0 1,3 0,5
9
0,5
3,2 2,0 2,1 2,6 2,1
10
1,1
3,0 3,5 2,0 3,2 2,0
11
0,9
2,9 1,3 1,3 0,7 0,9
Tabela 5.9. Resultado experimental em termos do percentual de redução de viscosidade para o
resíduo do pedúnculo de caju lavado
Redução de viscosidade por horas de
fermentação (%)
EXP
7 22 30 46 54 70
1
53
81 79 70 63 58
2
0 24 32 36 24 25
3
61
81 74 62 68 62
4
32
22 35 50 31 48
5
45
80 77 67 63 58
6
13
82 23 12 9 5
7
21
29 68 61 70 68
8
17
9 39 67 70 49
9
20
51 53 38 41 31
10
19
55 50 50 41 36
11
48
51 46 47 45 42
As Tabelas 5.10 e 5.11 apresentam os modelos codificados para a atividade da
poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade para cada hora de fermentação
analisada. Os valores em negrito correspondem aos efeitos estatisticamente significativos ao
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
104
nível de 95% de confiança. Nela também é possível observar o valor do coeficiente de
explicação R
2
, que dá o percentual da variação explicada pelo modelo e o valor do teste F que
diz se o modelo é estatisticamente significativo para F maior que 1 e preditivo para valores de
F maior que 4.
Tabela 5.10. Modelo linear obtido para a atividade poligalacturonásica (PG) por hora de
fermentação para o resíduo de pedúnculo de caju lavado
Modelo Atividade da Poligalacturonase R
2
F
PG(7h)=1,90-2,08U-0,93N-0,96P+0,81UN+1,18UP+0,48NP-0,61UNP 93,4
0,7
2
PG(22h)= 3,94-1,47U-1,54N+0,19P-0,88UN+2,60UP-2,49NP+0,10UNP 97,7 2,0
PG(30h)= 3,52-3,55U+0,30N-0,35P-0,75UN+0,20UP-0,35NP+0,50UNP 92,3 0,6
PG(46h)=2,86-2,29U-0,41N+0,12P-0,46UN+0,16UP+0,53NP-0,91UNP 91,5
0,5
0,5
PG(54h)=2,41-1,90U+0,33N+0,51P-0,28UN-0,15UP+0,52NP-0,22UNP 90,9
0,5
8,4
PG(70h)= 1,93-1,54U+0,66N+0,23P-0,51UN-0,13UP-0,13NP+0,03UNP 99,8 8,5
Tabela 5.11. Modelo linear obtido para percentual de redução de viscosidade (RV) por hora
de fermentação para o resíduo de pedúnculo de caju lavado
Modelo Percentual de Redução de Viscosidade R
2
F
RV(7h)= 27,36-14,75U+2,50N-6,25P+6,50UN+5,75UP-7,50NP+0,50UNP 92,8 0,6
RV(22h)=
51,36-16,75U-15,75N-1,00P-3,00UN+12,25UP-15,25NP-2,50UNP
99,8
24,
0
RV(30h)= 52,36-21,13U+0,63N-1,63P+4,13UN+0,38UP+1,13NP+2,13UNP 98,6
3,3
3
RV(46h)= 53,09-11,88U+6,88N-1,38P+10,38UN-0,38UP+5,38NP+4,88UNP 95,7 1,1
RV(54h)=47,73-16,25U+10,00N+3,25P+7,00UN+2,75UP+7,00NP+6,50UNP 97,0 1,5
RV(70h)= 44,00
-14,88U+10,13N-1,63P+6,63UN-3,13UP+3,38NP+1,88UNP
3,25
91,6 0,2
Assim como para os modelos obtidos utilizando o resíduo do pedúnculo de caju sem
lavar, os modelos aqui obtidos apresentam bons coeficientes de explicação estando todos
acima de 90%, mas os valores de F mostram que os modelos com todos os parâmetros não é o
melhor ajuste para maioria dos casos.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
105
Pelos modelos obtidos percebe-se que, assim como para o resíduo do pedúnculo de
caju sem lavar, a umidade é a variável que tem maior influência no processo, e que os
menores valores de umidade correspondem quase sempre aos maiores valores de atividade
encontrados.
Usando os dados experimentais vê-se que os maiores valores de atividade da
poligalacturonase e de percentual de redução de viscosidade foram às 22 horas de
fermentação. A partir desta observação, será feito o estudo estatístico para obter modelos que
sejam significativos e preditivos e assim identificar e quantificar o efeito das variáveis para o
processo. É importante lembrar que as equações aqui apresentadas são empíricas e só devem
ser aplicadas dentro da faixa dos valores estudados.
Para 22 horas de fermentação o modelo para atividade da poligalacturonase apresenta
um F de 2,0 que indica um modelo significativo, mas não preditivo. Usando o diagrama de
Pareto mostrado na Figura 5.27 é possível identificar que os efeitos do fósforo e da interação
das três variáveis não são significativos, então a retirada destes parâmetros pode melhorar a
qualidade do modelo.
,2727869
,496275
-2,31047
-3,86832
-4,03922
-6,5436
6,826246
p=,05
Estimativa Efeitos (Valor Absoluto)
1*2*3
(3)P
1*2
(1)U
(2)N
2*3
1*3
Figura 5.27. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 22 horas de
fermentação (resíduo lavado).
Com a retirada destes parâmetros os efeitos de umidade e fonte de nitrogênio passam a
ser significativos, o novo modelo é apresentado na Equação (13).
PG(22h)= 3,94-1,47U-1,54N-0,88UN+2,60UP-2,49NP (13)
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
106
A Tabela 5.12 apresenta a análise de variância para este modelo, percebe-se que o
coeficiente de explicação quase não se alterou passando de 97,7 para 97,4; mas que o valor de
F passou de 2,0 para 7,5; de onde se conclui que o modelo agora é significativo e preditivo.
Tabela 5.12. Análise de variância para atividade da poligalacturonase com 22 horas de
fermentação (resíduo lavado).
Fonte variação SQ GL MQ Teste F
Regressão
146,22 5 29,24 38,05
Resíduo 3,84
5 0,77
F.ajuste
3,80 3
Erro puro
0,05 2
Total 149,69
10
%R² 0,97
F tabelado =
5,05
F5%=
7,50
De acordo com a Figura 5.27, os efeitos de maior significância estatística são as
interações da umidade com a adição da fonte de fósforo e a interação das fontes de nitrogênio
e fósforo.
Para interação umidade e fósforo a maior atividade de PG é atingida quando ambas
estão em seus níveis máximo ou mínimo. Já a interação nitrogênio e fósforo mostra que a
máxima atividade de PG é atingida quando apenas uma das fontes está presente no meio.
Assim, para umidade de 60% a maior atividade é atingida para fósforo de 0,6% (9,98 U/g)
sem adição de nitrogênio; ou com 40% de umidade, 1% de nitrogênio sem adição de fósforo
(9,84 U/g).
A Figura 5.28 mostra a superfície de reposta construída com base neste modelo para
umidade fixa em 40%. Vê-se que o maior valor de atividade da poligalacturonase é obtido
com a adição de 1% de sulfato de amônia (9,84 U/g). A atividade da poligalacturonase cai
bastante quando os dois sais estão presentes no meio, sendo esta a condição menos favorável
à produção da poligalacturonase.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
107
Figura 5.28. Influência da adição de nitrogênio e fósforo na atividade da poligalacturonase
para umidade fixa em 40%.
Para percentual de redução de viscosidade, com 22 horas de fermentação, o modelo
com todos os parâmetros e não só estatisticamente significativo como também altamente
preditivo com um F de 24, Equação 14.
RV(22h)= 51,36-16,75U-15,75N-1,00P-3,00UN+12,25UP-15,25NP-2,50UNP (14)
Pelo diagrama de Pareto, Figura 5.29, a única variável que não é estatisticamente
significativa é a adição da fonte de fósforo. Mais uma vez confirma-se que a umidade do meio
é a variável mais importante para o processo. A análise de variância para este modelo está
apresentada na Tabela 5.13.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
108
-1,28452
-3,21131
-3,85357
15,73541
-19,589
-20,2312
-21,5158
p=,05
(3)P
1*2*3
1by2
1by3
2by3
(2)N
(1)U
Figura 5.29. Diagrama de Pareto para percentual de redução de viscosidade com 22
horas de fermentação (resíduo lavado).
Tabela 5.13. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade com 22 horas de
fermentação
Fonte variação SQ GL MQ Teste F
Regressão
7420,00 7 1060 218,63
Resíduo 14,55
3 4,85
F.ajuste
3,88 1
Erro puro
10,67 2
Total 7434,55
10
%R²
0,998
4
F tabelado =
8,89 24,59
A Figura 5.30 mostra a superfície construída para percentual de redução de
viscosidade às 22 horas de fermentação mantendo-se a umidade fixa em 40% e variando a
adição da fonte de nitrogênio e da fonte de fósforo. Assim como para a atividade da
poligalacturonase os maiores percentual de redução de viscosidade são atingidos quando
apenas uma das fontes está presente no meio, sendo a condição mais desfavorável quando as
duas fontes estão no meio de fermentação.
Os valores das variáveis que maximizam a produção de enzimas pécticas para o
resíduo do pedúnculo de caju lavado, com tempo de fermentação de 22 horas são: umidade de
40% (-1), nitrogênio de 1% (1) e fósforo de 0% (-1). Com estes valores foi obtido atividade da
poligalacturonase de 9,84 (U/g) e percentual de redução de viscosidade de 81,36%. Estes
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
109
valores estão bem próximos aos valores experimentais que foram de 10,1 (U/g) para atividade
da poligalacturonase e de 81% de redução de viscosidade.
Figura 5.30 – Influência da adição das fontes de nitrogênio e fósforo com umidade fixa em
40%.
Para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar a melhor condição de fermentação foi
com umidade de 40%, nitrogênio 1% e sem necessidade da adição da fonte de fósforo às 30
horas de processo atingindo-se atividade da poligalacturonase de 15,55 U/g e 79,6% de
redução de viscosidade.
Os dois resíduos apresentam as mesmas condições de máxima produção de enzima,
sendo que em tempos de fermentação diferentes. Por não conter açúcares redutores, no
resíduo lavado, o microrganismo é induzido a produzir enzimas nas primeiras horas e
fermentação, por isso o pico de atividade enzimática se dá em tempo de fermentação menor
neste resíduo. Apesar de necessitar de um tempo de fermentação mais longo o resíduo sem
lavar apresenta maior atividade da poligalacturonase. Em termos de produtividade também é
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
110
maior, 0,52 U/g*h para o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar e de 0,45 U/g*h para o
resíduo do pedúnculo de caju lavado.
5.2.3 – Avaliação do processo através da metodologia de superfície de resposta
usando os picos de produção de enzima
Usando o planejamento experimental também é possível fazer uma análise do processo
fermentativo a partir dos dados de pico de produção da enzima para cada experimento,
diferente do feito anteriormente analisando cada instante de fermentação individualmente.
Assim, analisando os dados das Tabelas 5.2 e 5.3, que apresentam os valores de
atividade da poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade para os experimentos
com o resíduo do pedúnculo de caju sem lavar, é possível fazer um estudo de verificação das
faixas que as variáveis de entrada (umidade inicial, adição das fontes de nitrogênio e fósforo),
usando o maior pico de atividade de cada experimento (resposta), aplicando a ferramenta do
planejamento experimental e análise de superfície de resposta para otimizar o processo, ou
seja, buscar operações das variáveis de entrada que maximizem a produção de
poligalacturonase.
Os modelos de primeira ordem obtidos foram:
PG = 4,97 – 5,00U + 1,55N – 1,75UN - 1,65NP + 1,50UNP (15)
RV = 51,73 – 20,25U + 6,25N + 5UN + 3,00UNP (16)
As Tabelas 5.14 e 5.15 apresentam a análise de variância para a atividade da
poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade respectivamente para os modelos
obtidos. Observa-se que os valores de F indicam que os modelos são estatisticamente
significativos com 95% de confiança.
Tabela 5.14. Análise de variância para atividade da poligalacturonase, pedúnculo de caju sem
lavar
Fonte variação
SQ GL MQ Teste F
Regressão 283,80 5 56,76
14,73
Resíduo 19,20 5 3,84
Total 303,0 10
%R² 0,94
F tabelado = 5,05 F5%=
2,93
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
111
Tabela 5.15. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade, pedúnculo de
caju sem lavar
Fonte variação
SQ GL MQ
Teste
F
Regressão 3865,00
4 966,25
8,82
Resíduo 657,18 6 109,53
Total 4522,18
10
%R² 0,85
F tab. 4,53 F5%=
1,93
Pelos modelos, verifica-se que a variável de maior importância para o processo é a
umidade, como dito anteriormente, estando os maiores valores de atividade associada a
valores de umidade de 40%. A adição da fonte de nitrogênio tem seu efeito mais expressivo
para a atividade da poligalacturonase. As Figuras 5.31 e 5.32 apresentam as superfícies de
resposta construídas para valores de umidade fixos em 40%, variando-se as variáveis fontes
de nitrogênio (N) e fósforo (P).
Figura 5.31. Atividade da poligalacturonase variando N e P para umidade fixa em 40%
(resíduo sem lavar).
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
112
Para otimizar o processo (maximizar a produção de enzima-maior valor de atividade da
poligalacturonase), deve-se fixar a umidade inicial em 40%, adição de 1% em nitrogênio e
sem necessidade de adição da fonte de fósforo. Operando-se com estes valores obtém-se
16,42 U/g de atividade da poligalacturonase, valor próximo ao máximo experimental que é de
16 U/g. Para o percentual de redução de viscosidade as variáveis estudadas não apresentaram
efeito significativos, o maior valor de atividade nas condições acima é de 76,23% de redução
de viscosidade, valor abaixo do experimental (82%), isto pode ser devido ao baixo valor do
coeficiente de correlação mostrado na Tabela 5.15, de 0,85.
Figura 5.32. Efeito da adição de sulfato de amônia e fósforo no % de redução de viscosidade,
para umidade fixa em 40%.
Do mesmo modo, para o resíduo do pedúnculo de caju lavado, usando os valores dos
picos de cada experimento apresentados nas Tabelas 5.8 e 5.9 usando a ferramenta do
planejamento experimental, obteve-se as Equações (17) e (18) para atividade da
poligalacturonase e percentual de redução de viscosidade, respectivamente.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
113
PG = 5,13 – 2,51U – 1,37UN + 1,93UP – 1,10NP (17)
RV = 64,45 – 9,25U + 6,75P + 9,75UP – 4,5NP (18)
As Tabelas 5.16 e 5.17 apresentam a análise de variância para as equações de primeira
ordem obtidas. Os valores do coeficiente de correlação são considerados baixos, pois só
explicam 76% das variações em relação ao valor experimental. O valor de F indica que o
modelo para o percentual de redução de viscosidade é estatisticamente significativo. Para
atividade da poligalacturonase o modelo não é estatisticamente significativo, não sendo,
portanto indicado à construção da superfície.
Tabela 5.16. Análise de variância para atividade da poligalacturonase do resíduo lavado
Fonte variação
SQ GL MQ Teste F
Regressão 104,77 4 26,20
4,42
Resíduo 35,56 6 5,93
Total 140,33 10
%R² 0,75
F tabelado = 4,53 F5%=
0,98
Tabela 5.17. Análise de variância para percentual de redução de viscosidade para o resíduo
lavado
Fonte variação
SQ GL MQ Teste F
Regressão 1971,50
4 492,88
4,87
Resíduo 607,23 6 101,20
Total 2578,73
10
%R² 0,76
F tabelado = 4,53 F5%=
1,08
As Equações (17) e (18) confirmam que a umidade inicial é a variável de maior
significado para o processo. Para o percentual de redução de viscosidade usando o resíduo do
pedúnculo de caju sem lavar, a adição das fontes de nitrogênio e fósforo juntas é a condição
menos favorável ao processo, como já dito anteriormente. Os maiores valores de percentual
de redução de viscosidade para este resíduo são obtidos quando apenas uma das fontes é
adicionada.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
114
A Figura 5.33 apresenta a superfície construída com base neste modelo com a umidade
fixa em 40%. Os maiores valores de atividade são para umidade de 40% com 1% de
nitrogênio e sem adição da fonte de fósforo, chegando a valores de 81,2% de redução de
viscosidade. Este valore é próximo do valor experimental de 81%.
Figura 5.33. Percentual de redução de viscosidade variando N e P com 40% de umidade,
resíduo lavado.
5.3 – Estudo das condições de extração da PG
No estudo das condições de extração da enzima do meio fermentado foi feito um
planejamento experimental 2
2
mais configuração estrela com três repetições no ponto central.
As variáveis de entrada foram: tempo de contato (T) e a razão volume solvente/gramas
de meio fermentado (RZ), testando os sistemas com e sem agitação. Como variável de
resposta usou-se à atividade da poligalacturonase, Tabela 5.18.
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
115
Os experimentos foram realizados usando o resíduo lavado, com 40% de umidade e
com tempo de fermentação de 16 horas.
Tabela 5.18. Variação da atividade poligalacturonásica em função das condições de extração
Atividade PG (U/g)
Exp. T (min)
R Z
(mL/g)
Com agitação
Sem agitação
1 -1 (30) 7,2 4,3
2 +1 (90)
-1 (2,5)
-1 (2,5)
6,8 5,5
3 -1 (30) +1 (7,5) 5,5 5,3
4 +1 (90) +1 (7,5) 9,1 5,7
5 0 (60) 0 (5) 10,6 9,0
6 0 (60) 0 (5) 13,1 9,4
7 0 (60) 0 (5) 12,0 9,7
8 +α (100)
0 (5) 16,1 12,4
9 -α (20) 0 (5) 8,2 9,7
10 0 (60) +α (8,5) 12,2 11,1
11 0 (60) -α (1,5) 6,7 5,3
A análise estatística dos dados, pela metodologia do planejamento fatorial, mostrou não
haver diferença significativa das variáveis de entrada, nos níveis estudados, sobre o processo
apresentando coeficientes de correlação muito baixos de 0,4 sem agitação e 0,6 com agitação.
Isto impossibilita a construção de modelos empíricos e a obtenção das superfícies de resposta,
mas não inviabiliza o estudo pontual dos experimentos.
Os experimentos 5, 6 e 7 com valores de 10,6; 13,1 e 12 U/g no sistema com agitação e
9; 9,4 e 9,7 U/g sem agitação, mostram a reprodutibilidade dos dados usando o ponto central.
Apresentam valores de atividade PG com média de 11,9 (U/g) e desvio padrão de 1,2 no
sistema com agitação e média de 9,4 (U/g) e desvio padrão de 0,3 no sistema sem agitação
Na Figura 5.34 é possível ver que o sistema que apresentou os melhores resultados de
atividade foi o sistema com agitação. A melhor condição de extração é com o tempo de
contato solvente meio de fermentação de 100 minutos e com a razão volume de solvente meio
fermentado 5 (mL/g), sendo a atividade da poligalacturonase de 16,1 U/g. Comparando a
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
116
atividade mais alta 16,1 U/g em relação ao resultado mais baixo de atividade 4,3 U/g, no
sistema sem agitação, com 30 minutos de contato, e 2,5 de razão solvente/meio; houve um
ganho em atividade de 4 vezes, mudando-se apenas as condições de extração.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Experimento
Atividade PG (U/g)
com
sem
Figura 5.34. Efeito das condições de extração na atividade poligalacturonásica (PG) nos
sistemas com e sem agitação.
A Figura 5.35 apresenta o efeito da razão solvente (tampão acetato) massa de meio
fermentado na extração da poligalacturonase. Mostra que para razões entre 1,5 e 5 o aumento
da razão possibilita uma maior extração da enzima, mas que na faixa entre 5-8,5 não há
variação significativa, principalmente no sistema com agitação.
A Figura 5.36 mostra o efeito do tempo de contato solvente meio de fermentação na
atividade poligalacturonásica. Nela percebe-se que quanto maior o tempo maior a extração da
poligalacturonase. Para o sistema sem agitação não há variação significativa para tempos de
contato de 20-60 minutos.
Castilho (1997) estudando a influência do tempo de contato na extração da
poligalacturonase em sistema agitado por agitador mecânico, encontrou um perfil parabólico
no comportamento dos extratos enzimáticos obtidos entre 10 e 50 minutos. O crescimento da
curva de 10-30 minutos indica que o período de 10 minutos é insuficiente para a total
solubilização das enzimas presentes no sólido fermentado. O decréscimo decorrido após 30
minutos foi atribuído à perda de atividade enzimática decorrente de fatores como maior
extração de agentes desnaturantes, aumento da formação de espuma e adsorção de enzima às
Ca pít u lo 5 – R e s u lta d o s e Dis c u ss ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
117
partículas sólidas mais finas. No caso aqui estudado a agitação foi realizada em mesa agitada
não ocorrendo formação de espuma.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10
Razão solvente/meio fermentdo (m L/g)
Atividade PG (U/g)
com
sem
Figura 5.35. Efeito da razão solvente meio fermentado na extração da poligalacturonase nos
sistemas com e sem agitação.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100 120
Tem po de contato (m in.)
Atividade PG (U/g)
com
sem
Figura 5.36. Efeito do tempo de contato solvente meio fermentado na extração da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitação.
Capítulo 6
Conclusão
Ca pít u lo 6 – Co nc l us ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
119
6. Conclusão
Caracterização:
*
A caracterização dos resíduos secos do pedúnculo de caju lavado e sem lavar mostrou
que os resíduos apresentam nutrientes que podem ser utilizados para síntese de
pectinase, com valores de açúcares redutores, proteína e pectina de 35,5; 6,8 e 7,3
respectivamente, para o resíduo sem lavar e 0,2; 13,4 e 12,9 para o resíduo lavado.
*
O pH dos resíduos secos é considerado ideal como pH inicial do meio utilizado na
produção de pectinases por
Aspergillus niger
.
*
Com a secagem os resíduos ficaram com umidade de 7,7; resíduo sem lavar e 10,2;
resíduo lavado. Estes valores de umidade associados ao pH dos resíduos, por volta de
4,0; permitiram que os resíduos fossem armazenados em temperatura ambiente durante
o decorrer dos experimentos.
Para o resíduo sem lavar:
*
Os maiores valores de atividade da poligalacturonase foram obtidos para umidade
inicial de 40%.
*
Em geral, a adição das fontes de nitrogênio e fósforo foi favorável para o processo.
*
O pico de atividade foi com 40% de umidade e 1% de nitrogênio sem adição de fósforo
às 30 horas de processo, sendo 16 U/g de atividade de PG e 82% de redução de
viscosidade.
*
Os modelos matemáticos obtidos fornecem valores bem próximos aos experimentais
nas mesmas condições de processo, 15,55 U/g de PG e 79,57% de redução de
viscosidade.
Para o resíduo lavado:
*
A adição das fontes de nitrogênio e fósforo é favorável ao processo, sendo o efeito do
nitrogênio mais pronunciado com 40% de umidade e o do fósforo com 60% de
umidade.
Ca pít u lo 6 – Co nc l us ã o
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
120
*
Com 60% de umidade e 0,6% de fósforo, sem nitrogênio, às 22 horas de processo
obtém-se 10,4U/g de PG e 82% de redução de viscosidade. O modelo fornece nestas
condições 9,98U/g e 82,36% respectivamente.
*
Com 40% de umidade e 1% de nitrogênio, sem fósforo, às 22 horas obtém-se 10,1 U/g
de PG e 81% de redução de viscosidade. Pelo modelo tem-se 9,84 U/g e 81,37%
respectivamente.
*
A condição menos favorável à produção de enzimas pectinolítica é quando as duas
fontes, de N e P, estão presentes no meio.
*
Em termos de produtividade da poligalacturonase o resíduo sem lavar apresenta melhor
condição, ou seja, com 40% de umidade e sem adição das fontes de nitrogênio e
fósforo, obtendo-se, às 8 horas de processo, 9,34 U/g de PG. Enquanto para o resíduo
sem lavar o pico foi de 16 U/g de PG, às 30 horas de processo, com 40% de umidade e
1% de nitrogênio, sem adição de fósforo. Então, obteve-se, para o resíduo lavado,
produtividade de 1,2 U/g.h de PG e para o sem lavar 0,52 U/g.h de PG.
*
Comparando os dados aqui obtidos com os apresentados na literatura percebe-se que o
bagaço do pedúnculo de caju é um substrato promissor na produção da
poligalacturonase.
Condição de extração da PG:
*
Os experimentos para melhor condição de extração mostram a boa reprodutibilidade
dos dados.
*
Para extração da poligalacturonase o sistema operado com agitação mostrou-se mais
eficiente que o sistema sem agitação, obtendo-se maiores atividades.
*
A melhor condição de extração da PG foi com o tempo de contato, solvente meio de
fermentação, de 100 minutos e com a razão, volume de solvente meio fermentado, 5
(mL/g).
Referências
Bibliográficas
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
122
Referências bibliográficas
Assessória de Comunicação Fundação Banco do Brasil. Projeto Caju é apresentado ao
presidente Lula. Imprensa - Pautas de agosto 2007. Disponível em:
http://www.planalto.gov.br/consea/exec/pauta_meses.cfm?cod=16229&mes=8&ano=2007
.
Acesso em 18/10/2007.
ACUÑA-ARGUELLES, M.; GUTIERREZ-ROJAS, M.; VINIEGRA-GONZALEZ, G.;
FAVELA-TORRES, E. Effect of water activity on exo-pectinase production by
A. niger
CH4
in solid state fermentation.
Biotechnology Letters
, v.16, p.23-28, 1994.
ANDRADE, A.T.
Estudo da atividade de água na produção de amiloglicosidase fúngica
utilizando resíduo do beneficiamento de arroz.
1999. Dissertação (Mestrado) – Centro de
Estudos Ambientais, Programa de Pós-graduação em Conservação e Manejo de Recursos,
Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP.
ANTIER, P. H., MINJARES, A., ROUSSOS, S., RAIMBAULT, M., VINIEGRA-
GONZÁLEZ, G. Pectinase hyperproducing mutants of
Aspergillus niger
C28B25 for solid
state fermentation of coffee pulp.
Enzyme and Microbial Technology
, v.15, n.3, p.254-260,
1993.
AQUINO, L. Produção de pectinase e lípase a partir de um agente biológico. FAPEMIG.
Instituto Inovação. Disponível em:
http://www.institutoinovacao.com.br/downloads/Producao_enzimas.pdf. Acesso em
20/10/2007.
ARAÚJO, L. F.
Enriquecimento Protéico do Mandacaru sem Espinhos e Palma Forrageira
por Fermentação Semi-Sólida
. 2004. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-graduação em
Engenharia de Processos, Universidade Federal de Campina Grande, Campina Grande, PB.
BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E.
Planejamento e otimização de
experimentos.
Editora da Unicamp, 1996, 297p.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
123
BEROVIC, M.; OSTROVERSNIK, H. Production of
Aspergillus niger
pectolytic enzymes
by solid state bioprocessing of apple pomace.
Journal of Biotechnology
, v.53, p.47-53, 1997.
BLANDINO, A.; IQBALSYAH, T.; PANDIELLA, S. S.; CANTERO, D.; WEBB, C.
Polygalacturonase production by
Aspergillus awamori
on wheat in solid-state fermentation.
Appl. Microbiol. Biotechnol
, v.58, p. 164–169, 2002.
BOTELLA, C.; DIAZ, A.; ORY, I.; WEBB, C.; BLANDINO, A. Xilanase and pectinase
production by
Aspergillus awamori
on grape pomace in solid state fermentation.
Process
Biochemistry.
4p. 2006.
BRAVO, C. E. C.; CARVALHO, E. P.; SCHWAN, R. F.; GÓMEZ, R. J. H.; PILON, L.
Determinação de condições ideais para produção de poligalacturonase por
Kluyveromyces
marxianus. Ciênc. Agrotec.,
v.24, p.137-152, 2000.
CAMPOS, A. R. N.
Enriquecimento protéico do bagaço do pedúnculo de caju (Anarcadium
occidentale L.) por fermentação semi-sólida
. 2003. 85f. Dissertação (mestrado em Engenharia
Química). Centro de Ciências e Tecnologia, Programa de Pós-graduação em Engenharia
Química, Universidade Federal de Campina Grande, Campina Grande, PB.
CAMPOS, A. R. N.; SANTANA, R. A. C.; DANTAS, J. P.; OLIVEIRA, L. S. C.; SILVA, F.
L. H. Enriquecimento protéico do bagaço do pedúnculo de caju por cultivo semi-sólido.
Revista de Biologia e Ciências da Terra
, v.5, n.2, 2005.
CASTILHO, L. R.
Recuperação de pectinases produzidas por Aspergillus niger em
fermentação semi-sólida.
1997. Tese (Mestrado) – Coordenação dos Programas de Pós-
graduação de Engenharia. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, RJ.
CASTILHO, L. R.; ALVES, T. L. M.; MEDRONHO, R. A. Recovery of pectolytic enzymes
produced by solid state culture of
Aspergillus niger. Process Biochemistry
, v. 34, p. 181-186,
1999.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
124
CASTILHO, L. R.; MEDRONHO, R. A.; ALVES, T. L. M. Production and extraction of
pectinases obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with
Aspergillus
niger. Bioresource Technology
, v.71, p. 45-50, 2000.
CORREIA, R. T. P.
Estudo do cultivo semi-sólido em resíduo de abacaxi por Saccharomyces
cereviseae e Rhizopus oligosporus
. 2004. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-graduação em
Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN.
COURI, S. FARIAS, A. X. Fermentação semi-sólida. Isolamento e seleção de fungos
filamentosos produtores de enzimas pectinolíticas. In: SHEB, 3, 1987. Anais ... Maringá:
UEM, 1987.
COURI, S.
Efeito de cátions na morfologia do agregado e na produção de poligalacturonase
por Aspergillus niger mutante 3T5B8
. 1993. 198f. Tese (Doutorado em Ciências). Pós-
graduação em Tecnologia de Processos Bioquímicos. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Rio de Janeiro.
COURI, S.; FARIAS, A. X. Genetic manipulation of
Aspergillus niger
for increased
synthesis of pectinolytic enzymes.
Revista de Microbiologia
, v.26, n.4, p. 314-317, 1995.
COURI, S.; TERZI, S. C.; PINTO, G. A. S.; FREITAS, S. P.; COSTA, A. C. A. Hydrolytic
enzyme production in solid-state fermentation by
Aspergillus niger
3T5B8.
Process
Biochemistry
, v.36, p.255-261, 2000.
DEL BIANCHI, V. L., MORAES, I. O., CAPALBO, D. M. F.
Biotecnologia industrial
:Fermentação em Estado Sólido.
São Paulo: Ed. Edgard Blücher, 2001. vol.2.
DESGRANGES, C.; VERGOIGNAN, C.; GEORGES, M.; DURAND, A. Biomass
estimation in solid state fermentation.
Applied and Microbiology Biotechnology
, v.35, p.200 –
205, 1991.
DOELLE, H. W; MITCHELL, D. A; ROLZ, C. E.
Solid substrate cultivation
. Elsevier
Science Publishers LTD, 1992.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
125
DURAND, A.; BROISE, D. de la ; BLACHÈRE, H. Laboratory scale bioreactor for solid
state processes.
Journal of Biotechnology
, v.8, p.59 – 66, 1988.
DURAND, A.; RENAUD, R.; ALMANZA, S.; MARATRAY, J.; DIEZ, M.;
DESGRANGES. Solid State Fermentation Reactors: From Lab Scale to Pilot Plant.
Biotechnology Advances
, v.11, p.591 – 597, 1993.
DURAND, A. Bioreactor designs for solid state fermentation.
Biochemical Engineering
Journal
, v.13, p.113–125, 2003.
ECHEVARRIA, J.; RODRlGUES LEON, J. A.; ESPINOSA, M. E. Optimization of solid
state fermentation of sugar cane by
Aspergillus niger
considering particles size effect.
Acta
Biotechnol,
v.11, n.1, p.15–22, 1991.
FARIA, F.S.E.D.V.
Influência de duas linhagens de Saccharomyces cereviseae na
elaboração de fermentados de caju (Anacardium occidentale, L.) em diferentes condições de
fermentação.
1994. 99f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos). Universidade
Federal do Ceará, Fortaleza.
FAWOLE, O. B.; ODUNFA, S. A. Some factors affecting production of pectic enzymes by
Aspergillus niger.
International biodeterioration & Biodegradation,
v.52, p.223-227, 2003.
FOGARTY, W. M.; WARD, O. P. Pectic substances and pectinolytic enzymes.
Process
Biochemistry
, p. 13-17, 1972.
FONTANA, R. C.; SALVADOR, S.; SILVEIRA, M. M. Influence of pectin and glucose on
growth and polygalacruronase production by
Aspergillus niger
in solid-state cultivation.
J.
Ind. Microbiol.Biotechnol.
, v.32, n.8, p.371-377, 2005.
GALIOTOU-PANAYOTOU, M. P. R.; KAPANTAI, M. Enhanced polygalacturonase
production by
Aspergillus niger
NRRL-364 grown on supplemented citrus pectin.
Lett. Appl.
Microbiol
., v.17, p.145–148, 1993.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
126
GERVAIS, P.; MOLIN, P. The role of water in solid-state fermentation.
Biochemical
Engineering Journal
, v.13, p.85-101, 2003.
GHILDYAL, N. P.; RAMAKRISHNA, S. V.; NIRMALA DEVI, P.; LOSANE, B. K.;
ASTHANA, H. N. Large scale production of pectolytic enzyme by solid state fermentation.
Journal of Food Science and Tecnology,
v.18, p 248-251, 1981.
GONZALEZ, J. B.; TOMASINI, A.; VINIEGRA-GONZALEZ, G.; LOPEZ, J. Penicillin
production by solid-state fermentation.
Biotechnology Letters
, v.10, p.793-798, 1988.
GOUDAR, C.T.; ELLIS, T.G. Explicit oxygen concentration expression for estimation extant
biodegradation kinetics from respirometric experiments.
Biotechnology and Bioengineering
,
v.75, n.1, p.74 – 81, 2001.
GUAMMADI, S.N.; PANDA, T. Purification and biochemical properties of microbial
pectinases – A review.
Process Biochemistry,
v.38, p.987–996, 2003.
GUTIERREZ-ROJAS, M.; FAVELA-TORRES, E.; CORDOVA-LOPES, J. GARCIA-
RIVERO, M. Kinetics of growth of
Aspergillus niger
during submerged, agar surface and
solid state fermentation.
Process Biochemistry
, v.33, n.2, p.103-103, 1998.
HAN, Y.W.; GALLAGHER, D.J.; WILFRED, A. G. Phytase production by
Aspergillus
ficuum
on semi solid substrate.
Journal of Industrial Microbiology
, v.2, p.195 – 200, 1987.
HENNIES, P. T. Produção de pectinases de
Penicillium italicum
através de fermentação em
meio semi-sólido. 1996. 68f. Tese (Mestrado). Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Universidade Estadual de Campinas. Campinas, SP.
HOURS, R.A.; VOGET, C.E.; ERTOLA, R.J. Some factors afecting pectinase production
from apple pomace in solid-state-cultures.
Biol. Wastes
, v.24, p.147–157, 1998.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ.
Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz
:
métodos químicos
e físicos para análise de alimentos
. 3 ed. São Paulo: 1985.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
127
JAYANI R, S.; SAXENA, S.; GUPTA, R. Microbial pectinolytic enzymes: A review.
Process Biochemistry
. v.40, p.2931-2944, 2005.
KISS, J. Reforma na casa.
Revista Globo Rural
, v.233, p.58-63, 2005.
LINDE, G. A.; MAGAGNIN. G.; COSTA, A. V.; BERTOLIN, T. E. B.; COLOUTO, N. B.
Column bioreactor use for optimization of pectinase production in solid substrate cultivation.
Brazilian Journal of Microbiology
, v.38, p.557-562, 2007.
LOSANE, B. K.; GHIDYAL, N. P.; BUDIATMAN, S.; RAMAKRISHNA, J. Engineering
aspects of solid-state fermentation.
Enz. Microbiol. Technol
., v.7, p.285-265, 1985.
MACEDO, G. R. 1998.
Estudo dos processos descontínuos e descontínuos com puldo para
síntese de glicoamilase por Aspergillus awamori
NRRL 3112
. 1998. Tese (Doutorado em
Engenharia Química). Escola Politécnica da Universidade de São Paulo. São Paulo, SP.
MALDONADO, M. C.; STRASSER DE SAAD, A. M. Production of pectinesterase and
polygalacturonase by
Aspergillus niger
in submerged and solid state system.
J. Ind.
Microbiol. Biotechnol.
, v.20, p.34-38, 1998.
MALVESSI, E.; SILVEIRA, M. M. Influence of medium composition and pH on the
production of polygalacturonase by
Aspergillus oryzae. Brazilian Archives of Biology and
Technology
, v.47, n.5, p.693-702, 2004.
MARTIN, N.; SOUZA, S. R.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Pectinase production by fungal
of
strains in solid – state fermetation using agro – industrial bioproduct.
Brazilian Archives
Biology and Technology
, v. 47, p. 813 – 819, 2004.
MARTINS, E.
Purificação e caracterização bioquímica de poligalcturonases termoestáveis
produzidas pelo fungo Thermoascus aurantiacus
através de fermentação submersa e
fermentação em estado sólido.
2006. 108f. Tese (Doutor em Ciências Biológicas) – Instituto
de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista. Rio Claro.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
128
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analitical Chemistry
, v.31, p.426 – 428, 1959.
MOURA, C. F. H.; ALVES, R. E.; INNECCO, R.; FILGUEIRAS, H. A. C.; MOSCA, J. L.;
PINTO, S. A. A. Características físicas de pedúnculos de cajueiro para comercialização
in
natura.
Rev. Bras. Frutic., v.23, n.3, Jaboticabal, Dec. 2001.
MOURA, D. Castanha de caju - proposta de preço mínimo - safra 2006/2007. Disponível em:
http://www.conab.gov.br/conabweb/download/precos_minimos/proposta_de_precos_minimos
_safra_2006_07_castanha_de_caju.pdf. Acesso em: 19/10/2007.
NAGEL, F.J.J.I.; TRAMPER, J.; BAKKER, M.S.N.; RINZEMA, A. Temperature control in
a continuously mixed bioreactor for solid-state fermentation.
Biotechnology and
Bioengineering
, v.72, n.2, p. 219 – 230, 2000.
NARAHARA, H.; KOYAMA, Y.; YOSHIDA, T.; PICHANGKURA, S.; UEDA, R.;
TAGUCHI, H. Growth and enzyme production in a solid-state culture of A
spergillus oryzae
.
Journal Fermentation Technology
, v.60, n.4, p.311 – 319, 1982.
NIGAM, P.; SINGH, D. Solid-state (substrate) fermentation systems and their applications in
biotechnology.
Journal of Basic Microbiology,
v.6, p.405-423, 1994.
PALMA, M. B.
Produção de xilanases por Thermoascus aurantiacus em cultivo em estado
sólido.
2003. 169f. Tese (Doutorado em Engenharia Química), - Centro Tecnológico, Curso
de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis.
PANDEY, A. Aspects of fermenter design for solid-state fermentations.
Process
Biochemistry
, v.26, p.355 – 361, 1991.
PANDEY, A.; ASHAKUMARY, L.; SELVAKUMAR, P. e VUAYLAKSHMI, K.S.
Influence of water activity on growth and activity of
Aspergillus niger
for glycormylase
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
129
production solid-state fermentation.
World Journal of Microbiology e Biotecnology
, v. 10, p.
485–486, 1994.
PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; MITCHELL, D. New developments in solid state
fermentation: I-bioprocesses and products.
Process Biochemistry
, v.35, p.1153 – 1169, 2000.
PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; LEON, J. A. R.
Solid–state fermentation in biotechonogy:
fundamentals and applications.
New Delhi: Asiatech, 2001.
PANDEY, A. Solid-state fermentation.
Biochemical Engineering Journal,
v.3636, p.1-4,
2002.
PANDEY, A. Solid-state fermentation.
Biochemical Engineering Journal
. v.13, n.2, p.81-84,
2003.
PATIL, S. R.; DAYANAND, A. Production of pectinase from deseeded sunflower head by
Aspergillus niger
in submerged and solid-state conditions.
Bioresouce Technology
, v.97,
p.2054-2058, 2006.
PERAZZO NETO, A.
Determinação de parâmetros para o enriquecimento protéico da
palma (Opuntia fícus - indica Mill) e vagens de algaroba (Prosopis juliflora) com Aspergillus
niger.
1999. Tese (Doutorado). Escola de Química. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, RJ.
PEREIRA, M. C. T.; CORREA, H. C. T.; NIETSCHE, S.; MOTA, W. F.; MARQUES, S. V.
Caracterização físico-química de pedúnculos e castanhas de clones de cajueiro-anão precoce
nas condições do norte de Minas Gerais.
Bragantia
, v.64, n.2, Campinas, 2005.
PINTO, G. A. S.
Produção de tanase por Aspergillus niger.
2003. 180f. Tese (Doutor em
ciências). Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-
graduação de Tecnologia de Processos. Rio de Janeiro.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
130
PINTO, G. A. S.; BRITO, E. S.; SILVA, F. L. H.; SANTOS, S. F. M.; MACEDO, G. R.
Fermentação em estado sólido uma alternativa para o aproveitamento e valorização de
resíduos agroindustriais.
Rev. Quím. Ind
., n.724, p.17-20, 2006.
RAIMBAULT, M., ALAZARD, D. Culture method to study fungal growth in solid
fermentation.
European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology
, v.9, p. 199-209,
1980.
RAMANA MURTHY, M. V.; KARANTH, N. G.; RAGHAVA RAO, K. S. M. S.
Biochemical engineering aspects of solid-state fermentation.
Advances in Applied
Microbiology
, v.38, p.99-147, 1993.
RANGANA, S.
Manual of analysis of fruit and vegetable products
. New Delhi: Tata
McGraw- Hill, 1979.
RIZZATO, M. L.; ALEGRE, R. M.; GOMES, E. Produção de enzimas pectinolíticas em
reator de coluna por
Penicillium italicum
IZ1584. Anais: SINAFERM 2005, Recife-PE.
RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F.
Planejamento de experimentos e otimização de
processos.
Editora Casa do Pão, 2005, 326.
ROSA, C. A. R.; CAMPOS, S. G.; BARONI, F. A.;
Práticas de micologia veterinária.
UFRRJ. Instituto de Veterinária. Departamento de Micologia e Imunologia Veterinária.
Micologia Veterinária. Prática 8. Seropédica, 2002.
ROSENBLITT, A; AGOSIN, E.; DELGADO, J.; PEREZ-CORREA, R. Solid substrate
fermentation of Monoascus purpureus: growth, carbon balance, and consistency analysis.
Biotechnol. Prog
., v.16, p.152 – 162, 2000.
SAMSON, R. A.; HOEKSTRA, E. S.; FRISVAD, J. C.; FILTENBORG, O.
Introduction to
food-borne fungi.
Centraalbureau voor schimmelcultures barn delft, fourth edition. 322
p.1995.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
131
SANTOS, F.; ENDER, L.; PALMA, M. B. Avaliação do processo de produção de xilanase
por cultivo em estado sólido utilizando-se reator de coluna. Anais: SINAFERM 2005, Recife-
PE.
SARGANTANIS, J.; KARIM, M.N.; MURPHY, V.G.; RYOO, D. Effect of Operating
Conditions on Solid Substrate Fermentation.
Biotechnology and Bioengineering
, v.42, p.149 –
158, 1993.
SATO, K.; NAGATANI, M.; NAKAMURA, K.; SATO, S. Growth estimation of
Candida
lipolytica
from oxygen uptake in a solid state culture with forced aeration.
Journal of
Fermentation Technology,
v.61, n.6, p.623 – 629, 1983.
SILVA, D.; MARTINS, E. S.; SILVA, R.; GOMES, E. Pectinase production by
Penicillium
viridicatum
RFC3 by solid state fermentation using agricultural wastes and agro-industrial by-
products.
Brazilian Journal of Microbiology
, v.33, p.318-324, 2002.
SILVA, D.; TOKUIOSHI, K.; MARTINS, E. S.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Production of
pectinase by solid-state fermentation with
Penicillium viridicatum
RFC3.
Process
Biochemistry
, v.40, p.285-289, 2005.
SIMÕES, A. N.; MENEZES, J. B.; ANDRADE, J. C.; FREITAS, D. F.; COSTA, F. B.;
SOUZA, P. A. Caracterização química de pedúnculos de caju CCP-76 em diferentes estádios
de desenvolvimento.
Caatinga
, Mossoró-RN, v.14, p.75-78, dez. 2001.
SOCCOL, C. R.; MARIN, B.; RAIMBAULT, M.; LEBEAULT, J. M. Breeding and growth
of
Rhizopus
in raw cassava by solid state fermentation.
Applied Microbiology Biotechnology
,
v.41, p.330 – 336, 1994.
SOCCOL, C. R.; VANDENBERGHER, L. P. S. Overview of applied solid-state
fermentation in Brazil.
Biochemical Engineering Journal
, v.13, p.205-218, 2003.
Re ferê n ci a s bibl i ogr á fi c a s
Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.
132
SOLIS-PEREYRA S.; FAVELA-TORRES E.; VINIEGRA GONZÁLES G.; GUTIÉRREZ-
ROJAS, M. Effect of different carbon sources on the synthesis of pectinase by
Aspergillus
niger
in submerged and solid state fermentations.
Appl. Microbiol. Biotechnol.
, v.41, p.36-41,
1993.
TERZI, S. C.; CARVALHO, C. V. P.; OLIVEIRA, A. C. P.; COURI, S. Influência da
variação da concentração de inoculo do
Aspergillus niger
3T5B8 e da umidade do meio de
fermentação sobre a produção de enzima poligalacturonase. Anais: SINAFRM, 14, 2003. ...
Florianópolis.
UENOJO, M.
Produção e caracterização de aromas de frutas por microrganismos
pectinolíticos utilizando-se resíduos agroindustriais.
2003. 113f. Dissertação (Mestrado em
Ciência dos Alimentos). Faculdade de Engenharia de Alimentos. Universidade Estadual de
Campinas. Campinas.
UENOJO, M.; PASTORE, G.M. Pectinases: aplicações industriais e perspectivas.
Química
Nova
, v.30, n.2, 388-394, 2007.
USTOK, F. I.; TARI, C.; GOGUS, N. Solid-state production of polygalacturonase by
Aspergillus sojae
ATCC20235.
Journal of Biotechnology,
v.4391, 2006.
ZHENG, Z.; SHETTY, K. Cranberry processing waste for solid state fungal inoculant
production.
Proc. Biochem
., v.33, pp.323-329, 1999.
ZHENG Z.; SHETTY, K. Solid state production of polygalacturonase by
Lentinus edodes
using fruit processing wastes.
Process biochemistry
, v.35, p.825-830, 2000.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
