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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
Estudo da freqüência de polimorfismos nos genes da
Apolipoproteína C3 (apoC3) e da Apolipoproteína A5 (apoA5)
em pacientes dislipidêmicos
Janice da Silva Karpinski
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular
Orientadora: Drª. Cláudia Dornelles da Silva
Co-orientador: Dr. Moacir Wajner
CANOAS
2007
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2
DEDICATÓRIA
Ao meu marido, Osni Karpinski,
pelo amor, dedicação, carinho e
compreensão.
A minha mãe, Araci, pelo apoio e
incentivo na conquista deste título.
Aos meus filhos, Rodrigo e Juliana,
pelo carinho, pela paciência e pela
compreensão nos momentos
ausentes.
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3
AGRADECIMENTOS
A Dra. Cláudia Dornelles da Silva, minha orientadora, pela compreensão,
carinho e pela orientação nestes anos de pesquisa.
Ao Dr. Moacir Wajner, meu co-orientador, por viabilizar a realização desse
trabalho.
A Dra. Nadine Clausell do Serviço de Cardiologia do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre pela colaboração e auxílio na realização dessa pesquisa.
Ao Doutorando Andry Fiterman Costa, coordenador do Ambulatório de
Dislipidemia do Hospital de Clínica de Porto Alegre, por ter disponibilizado o
acesso aos pacientes, aos dados clínicos e bioquímicos e pelo auxílio nas
análises estatísticas.
A minha colega de trabalho Fernanda Bertissolo, pelo apoio e colaboração.
Aos meus familiares, agradeço pelo carinho, paciência e pela
compreensão nos momentos ausentes.
À amiga e colega de mestrado Maristela Flores, pelo companheirismo,
carinho e colaboração na pesquisa.
Aos colegas bolsistas do laboratório de Genética Molecular da ULBRA,
Millene Coelho, Paulo Perizzolo, Carlos Pitroski e Gabriel Bampi pela dedicação,
carinho e auxílio na realização dos testes, bem como o acesso às instalações e
materiais do laboratório.
À Fernanda Chulla, pela colaboração na coleta e extração de DNA das
amostras.
4
Ao Coordenador do Programa de Pós-graduação em Diagnóstico Genético
e Molecular, Prof. Daniel Simon, e aos professores pelo incentivo à pesquisa.
A todas as pessoas que, mesmo não mencionadas, contribuíram de
alguma forma para a realização deste trabalho.
5
“A arte mais difícil e simultaneamente mais útil, é a de saber educar.”
(Persichetti)
6
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... 7
LISTA DE TABELAS .......................................................................................
8
LISTA DE FIGURAS........................................................................................
9
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................
13
1.1 Doença Arterial Coronariana e Dislipidemias........................................ 13
1.2 Metabolismo Lipídico ............................................................................ 14
1.3 Estrutura e Funções das Lipoproteínas Plasmáticas ........................... 15
1.4 Aterogênese ......................................................................................... 20
1.5 Epidemiologia........................................................................................ 21
1.6 Componente Genético ..........................................................................
22
1.6.1 Apolipoproteína C3 (apoC3) ...................................................... 23
1.6.2 Apolipoproteína A5 ( apoA5)...................................................... 27
1.7 Tratamento das dislipidemias .............................................................. 32
2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 34
3. OBJETIVOS ............................................................................................... 36
4. METODOLOGIA ......................................................................................... 37
4.1 Delineamento do estudo .......................................................................
37
4.2 População do estudo ............................................................................ 37
4.2.1 Seleção da amostra .....................................................................
37
4.2.2 Coleta de dados .......................................................................... 37
4.3 Dosagens bioquímicas e Extração de DNA.......................................... 38
4.4 Reação de PCR ....................................................................................
38
4.5 Detecção dos fragmentos de DNA amplificados .................................. 39
4.6 Genotipagem por RFLP ........................................................................
39
4.7 Análises moleculares............................................................................ 41
4.7.1 Análises moleculares do polimorfismo SstI no gene apoC3........ 41
4.7.2 Análises moleculares do gene apoA5 ........................................ 42
4.8 Análises Estatísticas ............................................................................ 42
4.9 Considerações éticas ........................................................................... 42
5. RESULTADOS ........................................................................................... 44
5.1 Análise descritiva da amostra .............................................................. 44
5.2 Análises moleculares da amostra estudada ........................................ 47
5.3 Freqüências dos polimorfismos analisados ..........................................
47
5.3.1 Freqüências genotípicas, alélicas e haplotípicas ........................ 47
5.3.2 Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em
relação à raça .................................................................................................
48
5.3.3. Freqüências genotípicas de acordo com sexo e com níveis de
lipídicos ...........................................................................................................
49
6. DISCUSSÃO e CONCLUSÕES.................................................................. 51
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 56
8. ANEXOS .....................................................................................................
65
7
LISTA DE ABREVIATURAS
apo: Apolipoproteína
apo C3: Gene da apolipoproteína C3
apo A5: Gene da apolipoproteína A5
DAC: Doença Arterial Coronariana
DCV: Doença cardiovascular
DM: Diabetes mellito
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
HA: Hipertensão arterial
HAS: Hipertensão arterial sistêmica
HDL: Lipoproteína de Alta Densidade
HDL-C: HDL-Colesterol
HL: Lípase hepática
HPP: hiperglicemia pós-prandial
IDL: Lipoproteína de densidade intermediária
IM: Infarto do Miocárdio
IMC: Índice de massa corporal
LDL: Lipoproteína de baixa densidade
LDL-C: LDL-Colesterol
PAD: Pressão Arterial Diastólica
PAS: Pressão Arterial Sistólica
pb: Pares de bases
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
QM: Quilomícrons
RFLP: Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição
SNP: Polimorfismo de Nucleotídeo Único
TG: Triglicérides
VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade
VLDL-C: VLDL-Colesterol
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Valores de Referência dos Lipídios Plasmáticos Adotados no
Brasil segundo as III Diretrizes Brasileiras de Dislipidemias e
Prevenção da Aterosclerose 2001 ..............................................
18
Tabela 2.
Principais classes e características de lipoproteínas
plasmáticas ..........................................................................................
19
Tabela 3.
Freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo SstI do
gene apoC3 ..............................................................................
27
Tabela 4.
Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos S19W do
gene apoA5 ...............................................................................
32
Tabela 5.
Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR
dos genes apoC3 e apoA5 ........................................................
38
Tabela 6.
Descrição dos reagentes e concentrações usadas para
amplificação dos genes apoC3 e apoA5 ....................................
39
Tabela 7.
Análise descritiva da amostra ......................................................
46
Tabela 8.
Perfil bioquímico da amostra........................................................
46
Tabela 9.
Freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos SstI e
S19W investigados nos genes apoC3 e apoA5 ......................
48
Tabela 10.
Freqüências haplotípicas dos polimorfismos Sst
I e S19W
presentes nos gene apoC3 e apoA5 .......................................
48
Tabela 11.
Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em
relação à raça ..............................................................................
49
Tabela 12.
Freqüências genotípicas dos polimorfismos SstI e S19W
investigados nos genes apoC3 e apoA5 de acordo com sexo e
com níveis de lipídicos .............................................................
50
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura das Lipoproteínas .....................................................
19
Figura 2. Formação da placa de ateroma na parede de uma artéria .....
21
Figura 3. Estrutura da região genômica que codifica os genes ApoC3
e ApoA5 ..................................................................................
24
Figura 4. Estrutura e posição relativa de 5 SNPs no lócus do gene de
ApoA5 .....................................................................................
28
Figura 5. Tamanho dos fragmentos da apoC3 após o processo de
clivagem com a enzima SstI ...................................................
40
Figura 6. Tamanho dos fragmentos da apoA5 após o processo de
clivagem com a enzima EagI. ..................................................
41
10
RESUMO
As dislipidemias contribuem para o desenvolvimento e a expressão clínica
da aterosclerose que provoca um estreitamento do leito arterial devido à
formação de lesões ateromatosas por depósitos de lipídios, colágeno células
inflamatórias e musculares lisas. A aterosclerose é uma condição patológica
extremamente complexa associada a fatores ambientais e genéticos. No
presente estudo foram analisadas as freqüências dos polimorfismos SstI no
gene da apolipoproteína C3 (apoC3) e do polimorfismo S19W no gene da
apolipoproteína A5 (apoA5) em
116 pacientes dislipidêmicos. As variáveis
genéticas foram comparadas com dados clínicos, bioquímicos e
antropométricos. Dessa população, 51 eram homens e 65 mulheres, com idade
média de 61,8 anos e com freqüência de 77,6% brancos. O tabagismo e álcool
foram mais freqüentes nos indivíduos do sexo masculino.
Nossos resultados
mostraram que as freqüências dos genótipos
S1S1, S1S2 e S2S2 no gene da
apoC3
foram 0,61, 0,39 e 0,00, respectivamente. Para os genótipos SS, SW e
WW no gene da apoA5, as freqüências encontradas foram 0,48, 0,40 e 0,12,
respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas nas
freqüências genotípicas entre homens e mulheres. Verificamos também que a
distribuição do
polimorfismo S19W está em equilíbrio de Hardy-Weinberg, ao
contrário do polimorfismo SstI. Os genótipos S1S1 e SS foram os mais
freqüentemente encontrados na amostra estudada. Não foi observado
desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos SstI e S19W (χ
2
= 0,007, p =
0,93). Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre os níveis
lipídicos e os genótipos do gene apoC3 e do gene apoA5 na população de
indivíduos dislipidêmicos.
Foi encontrada uma associação estatisticamente
significativa entre o genótipo S1S2 e a raça (p = 0,022), sendo que indivíduos
que se autodeclararam não brancos apresentaram a maior freqüência desse
genótipo. Nossos resultados também mostraram diferenças significativas entre a
presença do genótipo S1S2 do gene apoC3 e aumento dos níveis de triglicérides
em ambos os sexos, bem como diferenças significativas na redução dos níveis
11
de colesterol total (p= 0,026), colesterol-LDL (p=0,005) e colesterol não HDL (p=
0,029) em homens.
12
ABSTRACT
The dyslipidemias contribute to the development and clinical expression of
atherosclerosis, which provokes a narrow of the body arteries due to the
formation of ateromas which are characterized by lipid deposit. Atherosclerosis is
an extremely complex pathological condition with environmental and genetic
factors. In the present study we analyzed the frequencies of SstI polymorphisms
in the gene apoC3 and the polymorphism S19W in the gene apoA5 in 116
dyslipidemic patients. The genetic variables were compared with clinical,
biochemistry and anthropometric data. From this population, 51 were men and
65 women, with mean age of 61.8 years old and prevalence of 77.6% whites.
Tobacco and alcohol intake were higher in male individuals than in female. Our
results showed that the frequencies of genotypes S1S1, S1S2 and S2S2
(apoC3) were 0.61, 0.39 and 0.00, respectively. For the genotypes SS, SW and
WW in the gene apoA5, the frequencies found were 0.48, 0.40 and 0.12,
respectively. Significant differences in the genotype frequencies between men
and women were not observed. We also verified that the distribution of the
polymorphism S19W is in Hardy-Weinberg equilibrium, in contrast to
polymorphism SstI. The genotypes S1S1 and SS were the most frequently found
in the sample studied. Linkage disequilibrium between the polymorphisms SstI
and S19W (χ
2
= 0.007, p = 0.93) was not observed. Significant differences
between lipids levels and genotypes of the gene apoC3 and apoA5
were not
observed.
However, statistically significant associations were found between
race and the genotype S1S2 (p = 0.022). Furthermore, our results show
significant
differences between the presence of genotype S1S2 from the gene
apoC3, increase of triglyceride levels in both genders, and reduction of total
cholesterol (p = 0.026), cholesterol LDL (p = 0,005) and cholesterol non-HDL (p =
0.029) levels in men.
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença Arterial Coronariana e Dislipidemias
A doença arterial coronariana (DAC) é uma das desordens
cardiovasculares mais importantes e a principal causa de morte em muitos
países, sendo responsável por aproximadamente 50% de todas as mortes
provocadas por doenças cardiovasculares (BARONI et al., 2003).
As recentes diretrizes do Programa Nacional de Educação sobre o
colesterol dos EUA (ATP III) reconhecem ainda, outros marcadores de risco
coronariano, classificados como fatores de risco relacionados aos hábitos de
vida (obesidade, tabagismo, sedentarismo e dieta aterogênica) e aos fatores de
risco emergentes, tais como: níveis de lipoproteínas, homocisteína, marcadores
da trombose e inflamação, glicemia em jejum alterada e evidência de
aterosclerose subclínica. A síndrome metabólica que tem como base a
resistência insulínica tem sido proposta para explicar anormalidades lipídicas,
hemostáticas e inflamatórias, predispondo os indivíduos à DAC prematura (IZAR
et al., 2003).
As doenças cardiovasculares incluem a DAC e a doença vascular
periférica. Todas resultam de alterações no funcionamento do sistema
circulatório, formado pelo coração, vasos sangüíneos e vasos linfáticos. Essas
doenças apresentam padrão de herança multifatorial, devido à complexa
interação entre diferentes genes e o ambiente. A variação interindividual em
resposta aos fatores ambientais determina a suscetibilidade à doença
(BRESLOW, 2000).
14
1.2 Metabolismo Lipídico
Os lipídios da dieta incluem triglicérides, colesterol e fosfolipídios. Um
fator que complica a digestão dos lipídios é sua insolubilidade em água (sua
hidrofobicidade). Como o trato gastrintestinal é fundamentalmente líquido
aquoso, os lipídios devem ser solubilizados de alguma forma para serem
digeridos e absorvidos. A digestão dos lipídios da dieta começa no estômago,
com ação da lipase lingual e é completada no intestino delgado, pelas ações das
enzimas pancreáticas – lipase pancreática, hidrolase dos ésteres do colesterol e
fosfolipase A2. Os lipídios são digeridos a monoglicerídios, ácidos graxos,
colesterol e lisolecitina pelas enzimas pancreáticas. Os produtos da digestão
lipídica são solubilizados em micelas com ácidos biliares. Na membrana apical
das células epiteliais intestinais, os lipídios são liberados das micelas, difundindo
para as células. No interior das células, eles são empacotados nos quilomícrons
e transferidos para os vasos linfáticos por exocitose (COSTANZO, 1999).
Os lipídios presentes no plasma mais importantes do ponto de vista
fisiológico e clínico são os ácidos graxos, os triglicérides, referidos também
como triacilgliceróis, os fosfolipídios e o colesterol. Os ácidos graxos podem ser
saturados (sem duplas ligações entre seus átomos de carbono), mono ou
poliinsaturados – com uma ou mais duplas ligações em sua cadeia. Os
triglicérides são a forma de armazenamento energético mais importante no
organismo, constituindo depósitos no tecido adiposo e muscular. Os fosfolipídios
têm, entre outras, a função primordial de formar a bicamada que é a estrutura
básica das membranas celulares. O colesterol é precursor dos hormônios
esteróides, dos ácidos biliares, da vitamina D, além de ter importantes funções
nas membranas celulares, influenciando na sua fluidez e no estado de ativação
de enzimas ligadas a membranas (III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e
Prevenção da Aterosclerose 2001).
15
Sabe-se que a principal fonte de colesterol no organismo é oriunda de
síntese endógena. O retículo endoplasmático liso é um importante local para a
síntese de colesterol e para a sua conversão em outros esteróides. A maior
parte do colesterol é formada no fígado, o principal local de sua síntese em
mamíferos, e convertida a ácidos biliares como o colato e o glicolato. Esses
compostos ajudam na digestão de lipídios, emulsionando-as e fazendo-as mais
acessíveis para o ataque de enzimas lipolíticas. O colesterol é o precursor dos
hormônios esteróides que, independentemente de sua natureza química, servem
com sinais externos a uma célula e regulam processos metabólicos no seu
interior (CAMPBELL, 2001).
1.3 Estrutura e Função das Lipoproteínas Plasmáticas
As lipoproteínas são partículas globulares de alto peso molecular
responsáveis pelo transporte dos lipídios no plasma e são compostas por lipídios
e proteínas, as chamadas apolipoproteínas (“apo”). As apolipoproteínas fazem
parte das lipoproteínas (apoB100 e B48), além de se ligarem a receptores da
membrana que as captam para o interior da célula (apoB100 e apoE) ou de
servirem como co-fatores enzimáticos (apos C2, C3 e A1). Através da
eletroforese, é possível separar e caracterizar quatro classes de lipoproteínas:
Lipoproteínas de Alta Densidade (HDL), Lipoproteínas de Muito Baixa
Densidade (VLDL), Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL) e quilomícrons
(QM) (DUQUE, 1998; III Diretrizes de Dislipidemias e Prevenção da
Aterosclerose, 2001).
As HDL são sintetizadas no fígado, sendo constituídas por 50% de
proteínas, 30% de fosfolipídios, 20% de colesterol e de traços de triglicérides. As
HDLs podem ser divididas em duas subclasses: HDL2 e HDL3. Estas estão
envolvidas na remoção e no transporte do colesterol dos tecidos e vasos para o
fígado, onde ele é metabolisado. As lipoproteínas de muito baixa densidade
(VLDL) são sintetizadas no fígado de onde transportam triglicérides, colesterol e
16
lipoproteínas. As VLDL são as mais importantes lipoproteínas ricas em
triglicérides. Presume-se que o aumento dos níveis sangüíneos dos triglicérides
pós-prandial, apresente uma relação nítida com a trombo e aterosclerose. As
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) contém mais colesterol e menos
triglicérides que as HDL, sendo responsáveis pelo transporte do colesterol para
o interior das células. Presume-se que seu aumento seja altamente aterogênico.
Os quilomícrons (QM) são sintetizados pelas células epiteliais do intestino e
transportadores dos triglicérides provenientes da alimentação (DUQUE, 1998).
A Diretriz Brasileira de Prevenção de Aterosclerose classificam as
dislipidemias segundo análises laboratoriais em:
A. Hipercolesterolemia isolada – Elevação isolada do colesterol total (CT), em
geral representada por aumento das lipoproteínas de colesterol de baixa
densidade (LDL).
B. Hipertrigliceridemia isolada – Elevação isolada dos triglicérides (TG), em
geral representada por aumento das lipoproteínas de muito baixa densidade
(VLDL), ou dos quilomícrons (QM), ou de ambos.
C. Hiperlipidemia mista - Valores aumentados do CT e dos triglicérides.
D. HDL- baixo (Lipoproteínas de alta densidade)- isolado ou em associação
com aumento de LDL-C e/ou de triglicérides.
Baseado na etiologia é possível ainda classificar as dislipidemias em
primária ou secundária. As primárias são conseqüências de causas genéticas
e/ou ambientais, sendo que algumas só se manifestam com influência
ambiental, devido à dieta inadequada e/ou ao sedentarismo. As hiperlipidemias
primárias englobam a hipercolesterolemia familiar, dislipidemia familiar
combinada, hipercolesterolemia poligênica, hipertrigliceridemia familiar e
síndrome da quilomicronemia (WAGNER e PEREZ, 2000).
17
As dislipidemias secundárias podem ser causadas por fatores como,
hipotireoidismo,
diabetes mellitus, síndrome nefrótica, insuficiência renal crônica,
obesidade, alcoolismo, icterícia obstrutiva, uso de doses altas de diuréticos,
betabloqueadores, corticosteróides e anabolizantes
(III Diretriz Brasileira Sobre
Dislipidemias, 2001).
O papel dos lipídios como importante fator na patogênese da DAC está
solidamente estabelecido. A maioria dos exames de avaliação de perfil lipídico
inclui colesterol total, LDL, HDL e triglicérides. Os níveis elevados de colesterol
total e de LDL, bem como HDL baixo, caracterizam pacientes de alto risco para
o desenvolvimento de DAC. A hipertrigliceridemia reflete os níveis elevados de
triglicérides contidos em lipoproteínas como VLDL, Lipoproteínas de Densidade
Intermediária (IDL) e quilomícrons. Níveis de triglicérides elevados estão
associados à alterações metabólicas pró-aterogênicas e fisiológicas como o
aumento de LDL, baixos níveis de HDL e o aumento dos níveis de moléculas
pró-coagulantes. Além disso, níveis elevados de triglicérides em jejum são
fortemente preditivos de anormalidades no metabolismo pós-prandial das
lipoproteínas (FREITAS, 2004). A tabela 1 apresenta os valores de referência
dos lipídios plasmáticos, segundo a III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e
Prevenção da Aterosclerose no Brasil (2001).
18
Tabela 1. Valores de Referência dos Lipídios Plasmáticos Adotados no Brasil
segundo a III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose
(2001).
Valores de referência dos lipídios para indivíduos >20 anos de
idade
lipídios Valores (mg ⁄ dl) Categorias
< 200 Ótimo
CT 200-239 Limítrofe
≥ 240 Alto
< 100 Ótimo
LDL-C 100-129 Desejável
130-159 Limítrofe
160-189 Alto
≥ 190 Muito Alto
HDL-C < 40 Baixo
> 60 Alto
< 150 Ótimo
Triglicérides 150 - 200 Limítrofe
200 - 499 Alto
>500 Muito alto
Fonte:
III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (2001).
As apolipoproteinas apoA, apoB, apoC e apoE diferem quanto ao
tamanho, densidade e composição química. Além de contribuírem para a
"solubilização" de lipídios no plasma, constituem sítios de reconhecimentos que
permitem a ligação das lipoproteínas a receptores da superfície celular de
tecidos específicos (MARZZOCO e TORRES, 1999). A tabela 2 apresenta as
principais classes e características de lipoproteínas plasmáticas. A figura 1
mostra a estrutura das lipoproteínas.
19
Tabela 2. Principais classes e características de lipoproteínas plasmáticas.
Principais classes e características das lipoproteínas plasmáticas
Lipoproteínas
Densidade
(g/dl)
Diâmetro
(Â)
Composição
(%)
CE CL TG FL PR
Apolipoproteínas
Quilomícrons < 0.95 800 -5.000
5 2 84
7 2 B-48; E; C A-I; A-
II; A-IV
VLDL <1.006 30 - 800 12
7 55
18
8 B -100; E; C
IDL 1.006-1.019
250 - 350 23
8 32
21
16 B-100; E; C
LDL 1.020-1.063
180 - 280 38
10
9
22
21 B- 100
HDL2 1.064-1.125
90 - 120 16
6 4
30
44 A-I; A-II
HDL3 1.126-1.210
50 -90 12
3 4
26
55 A-I; A-II
CE- colesterol esterificado; CL – colesterol livre; TG- triglicérides; FL-
fosfolípides;
PR- proteínas HDL2, HDL3 – frações de HDL
Fonte:
III Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (2001).
Figura 1. Estrutura das Lipoproteínas
Fonte: medmovie.com
20
1.4 Aterogênese
A aterosclerose é um processo patológico de longa duração que se inicia
muito precocemente na vida humana, que se torna aparente como uma entidade
patológica, somente em estágio muito avançado. À medida que aumentam os
depósitos de gordura, o diâmetro das artérias coronárias se torna
progressivamente mais estreito. Em alguns casos de aterosclerose, há a
produção de um coágulo sangüíneo na área estenosada, freqüentemente
levando a um bloqueio completo da artéria. A aterosclerose pode envolver
qualquer porção das artérias, porém em graus diferentes. No mesmo indivíduo,
algumas artérias podem ser muito ou mesmo completamente obstruídas,
enquanto que outras artérias podem ser totalmente normais (CHUNG, 1986).
Embora o conhecimento sobre dados etiológicos seja incompleto, está claro que
não existe um único fator responsável para o desenvolvimento da aterosclerose
(CHUNG, 1978).
A maioria das evidências indica que um nível elevado de LDL é a mais
importante anomalia lipídica na predisposição à aterosclerose, seguida de níveis
anormalmente baixos de HDL. A partícula LDL circulante e os níveis de
colesterol refletem o balanço entre o influxo (consumo de produtos animais e
síntese endógena pelo fígado e outros tecidos) e a remoção hepática desses,
pela conversão a ácidos biliares e excreção de LDL rica em colesterol, com apo
B agindo como sinal de reconhecimento (CONNOR e FERGUSSON-SMUITH
1993).
A aterosclerose está relacionada com alterações no metabolismo de
lipídios. O acúmulo de lipídios desencadeia processos químicos intermediários
que auxiliam na formação de ateromas na íntima dos vasos arteriais que,
conseqüentemente, podem obstruir parcial ou totalmente. Os principais alvos
das placas de ateromas são a aorta, as coronárias e os vasos cerebrais, levando
ao infarto do miocárdio e ao infarto cerebral, respectivamente (YOKOYAMA,
21
2000). A figura 2 apresenta a formação da placa de ateroma na parede de uma
artéria.
Figura 2. Formação da placa de ateroma na parede de uma artéria
1.5 Epidemiologia
A DAC representa uma das principais causas de morte nos países
desenvolvidos e também nas grandes cidades brasileiras, despertando interesse
especial por atingirem grandes contingentes populacionais, além de representar
elevados custos sociais e econômicos. Esses dados reforçam a importância da
DAC, exigindo a adoção de medidas
preventivas primárias e secundárias
efetivas. A mortalidade por DAC e acidente vascular encefálico (AVE)
corresponde a 80% dos óbitos por doenças cardiovasculares (BRANDÃO,
2000).
22
A DAC está associada à importante morbidade. A necessidade de
internações hospitalares, procedimentos diagnósticos e terapêuticos,
acompanhamento médico e tratamento farmacológico continuado determinam
um impacto econômico expressivo, segundo fontes governamentais (RIBEIRO et
al., 2005).
Aos 55 anos de idade, um em cada 60 homens e uma em cada 90
mulheres terão evidências de doença cardíaca isquêmica, e a prevalência sobe
rapidamente a partir desta idade, correspondendo de um modo geral, a uma em
cada quatro mortes em adultos (CONNOR e FERGUSON-SMITH, 1993).
1.6 Componentes Genéticos
Os níveis de lipídios séricos são determinados por um grande número de
fatores genéticos e ambientais. Variações em um grande número de genes
envolvidos na síntese de proteínas estruturais e relacionados ao metabolismo
lipídico têm sido associadas às dislipidemias. Nenhum gene atua isoladamente
sobre uma característica, quando a etiologia da característica é poligênica, o
resultado no indivíduo é um somatório de pequenos efeitos de vários genes
(ANDRADE e HUTZ, 2002).
Sabe-se que a colesterolemia sofre a influência de fatores não somente
ligados a idade, sexo, hábitos de vida, uso de alguns medicamentos,
determinadas doenças, mas também a fatores genéticos. Dentre os últimos,
destacam-se as mutações (modificações estruturais na seqüência do DNA –
ácido desoxirribonucléico – que envolvem alterações em um único ou múltiplos
nucleotídeos) e polimorfismos (mutações freqüentes nas quais o alelo mutado se
apresenta com freqüência superior a 1%) que podem alterar a estrutura e função
de proteínas envolvidas na síntese, homeostase e no metabolismo do colesterol,
como as apolipoproteínas, receptores e enzimas (FORTI et al., 2003).
23
Alguns estudos têm revelado que fatores genéticos representam um papel
de 40% a 70% na determinação da concentração de HDL. Ainda assim, poucos
estudos têm sido realizados nesta área com o objetivo de determinar
exatamente quais os genes responsáveis por esta modulação (ANDRADE e
HUTZ, 2002).
A identificação de fatores genéticos e ambientais que influenciam os
níveis de lipídios no plasma representa um grande passo voltado ao
desenvolvimento de estratégias para prevenção e tratamento de doenças
cardiovasculares (LAI et al., 2003).
1.6.1 Apolipoproteína C3 (apoC3)
Estudos epidemiológicos têm mostrado que os níveis de apoC3 e sua
distribuição entre frações de lipoproteínas do plasma parecem ser de grande
importância na progressão da DAC (WATERWORTH et al., 2003).
A apoC3 é uma longa glicoproteína de 79 aminoácidos, sintetizada
predominantemente no fígado e em menor quantidade no intestino. In vitro, a
apoC3 inibe a lipoproteína lipase (LPL), limitando a taxa da enzima que faz a
hidrólise de triglicérides. O conteúdo de apoC3 em partículas de HDL tem sido
descrito como um fator de predisposição na progressão de placas aterogênicas
em pacientes tratados com drogas hipolipemiantes (RUSSO et al., 2001,
CHHABRA et al., 2004).
O gene de apoC3 foi mapeado no braço longo do cromossomo 11, perto
dos genes apoA4 e apoA1 Diversos sítios polimórficos têm sido detectados
dentro e nas proximidades do gene apoC3. O polimorfismo mais amplamente
estudado no gene apoC3 é conhecido como SstI e está localizado na região 3’
não traduzida (3’ UTR) do gene. Esta substituição é uma transversão da base C
para G. (RUSSO et al., 2001).
24
Dados da literatura mostram que a freqüência do alelo (S2) é maior em
indivíduos com hipertrigliceridemia associados à aterosclerose, variando entre
diferentes grupos étnicos, sendo de 0,08 em caucasianos e 0,25 em Japoneses.
Vários estudos têm sugerido a associação do alelo raro S2 com níveis elevados
de triglicérides, níveis de apoC3 e DAC, uma vez que este sítio localiza-se em
uma seqüência envolvida na expressão do gene apoC3. Estudos recentes têm
reportado que indivíduos com hiperlipidemia familiar combinada, portadores do
alelo S2 têm elevados níveis de apoC3 e triglicérides no plasma
(GROENENDIJK et al., 1999; RUSSO et al., 2001; CHHABRA et al., 2004). A
figura 3 apresenta a região do genoma que codifica os genes ApoC3 e ApoA5.
Figura 3. Estrutura da região genômica que codifica os genes apoC3 e
apoA5 (WRIGHT et al., 2005).
A predisposição genética para hipertriglicidemia é relativamente comum
na população. Elevados níveis de triglicérides têm sido mostrados em muitos
estudos como sendo um fator de risco para DAC. Muitos pacientes com
hipertriglicidemia têm síndrome do X (Síndrome anginosa ou angina like),
também caracterizada pela redução de HDL-C, resistência à insulina,
hipertensão, obesidade e aumento da incidência de infarto do miocárdio
(DAMMERMAN et al., 1993).
Na maioria dos casos, as bases genéticas para hipertriglicidemia são
pouco conhecidas. Diferentes linhas de evidências têm relacionado apoC3 e,
especialmente o aumento da expressão dessa proteína, a hipertriglicidemias
primárias, devido a uma relação diretamente proporcional que tem sido
observada entre os diferentes níveis de triglicérides e de apoC3. O aumento da
expressão do gene apoC3 humano é suficiente para causar hipertriglicidemia
25
em camundongos transgênicos. A apoC3 pode desempenhar um importante
papel na composição de partículas ricas em triglicérides e suas remanescentes
no fígado. Em camundongos transgênicos, níveis elevados de apoC3 causam
deslocamento da proteína apoE de partículas de VLDL e diminuição das VLDL
removidas do plasma (DAMMERMAN et al., 1993).
A apoC3 modula a lipólise e a liberação hepática de triglicérides do
plasma pela inibição da atividade da lipoproteína lipase (HOFFER et al., 1998).
KOSUGE et al. (2005) demonstraram que concentrações de triglicérides
em jejum podem ser estimadas pelas concentrações de Apo C3 e HDL-C pós-
prandial.
Estudos têm descrito uma relação direta entre níveis de triglicérides no
plasma e apoC3, com o genótipo S1S2, bem como, um aumento da freqüência
do alelo S2 em populações hiperlipidêmicas.
Análises de seqüências da região promotora do gene apoC3 em
pacientes com disbetalipoproteinemia familiar revelaram seis diferentes trocas
de pares de bases. Uma dessas variantes está dentro de um elemento de
resposta à insulina. Camundongos deficientes de insulina parecem ter níveis
aumentados de apoC3 hepática e triglicérides de plasma. Portanto, estas
mutações localizadas nas posições -482 e -455 também podem ser associados
a hipertrigliceridemia (SHOULDERS et al., 1996; HOFFER et al., 1998) .
Pacientes com reduzida tolerância à glicose e diabete mellito apresentam
grande risco de desenvolvimento de aterosclerose. A freqüência do alelo S2 do
gene apoC3 é maior em pacientes com hipertriglicidemia e diabete tipo 2.
Estudos sugerem que os níveis de apoC3 constituem fator de risco
independente para doença aterosclerótica em Chineses com diabete tipo 2.
Ultra-sons de alta resolução da artéria carótida têm sido usados para comprovar
26
o reflexo histopatológico da aterosclerose, tendo uma razoável relação com a
DAC, angiograficamente verificada (CHEN et al., 2004).
Especialistas em nutrição têm elaborado recomendações alimentares
direcionadas a redução da incidência da DAC, através da normalização das
concentrações de lipoproteínas do plasma. Uma dessas recomendações tem
sido limitar o consumo de alimentos ricos em colesterol, na tentativa de diminuir
as concentrações de colesterol total e colesterol LDL. Entretanto, diversos
trabalhos têm relatado que nem todos os indivíduos respondem de forma
homogênea a ingestão de colesterol, dificultando com isso predizer o impacto da
dieta com o risco cardiovascular. Variações interindividuais em resposta a dieta
podem ser atribuídas em parte a fatores tais como sexo, idade, etnia, níveis
hormonais e obesidade. Entretanto, estas variações podem estar sujeitas a um
componente genético, mediado em parte por genes candidatos envolvidos no
metabolismo de lipoproteínas. A presença de variantes alélicas deve influenciar
o metabolismo de nutrientes. O polimorfismo SstI do gene apoC-III também tem
sido relacionado, em diferentes estudos, a resposta a lipídios da dieta, bem
como sua associação com hipertrigliceridemia em homens com obesidade
visceral (HERRON et al., 2006).
HERRON et al. (2006), demonstraram que embora não tenham sido
encontradas diferenças significantes entre as concentrações de LDL-C e HDL-C,
portadores heterozigotos do alelo S2 tiveram mais altos níveis plasmáticos de
triglicérides e apoC3, independentemente do gênero ou da dieta. Além disso, o
polimorfismo SstI tem sido relacionado por diversos estudos como tendo um
papel na resposta lipídica à dieta e estando associado à hipertrigliceridemia em
homens obesos .
OLIVIERI et al. (2002) não encontraram nenhum indivíduo homozigoto
para o alelo raro S2, sendo que a distribuição dos heterozigotos S1S2 foi similar,
tanto em portadores como em pacientes livres de DAC. Na tabela 3 são
27
apresentadas as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo SstI
presente no gene apo C3 descritas na literatura.
Tabela 3. Freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo SstI do gene
apoC3
População Freqüências
genotípicas
Freqüências
alélicas
Referências
S1S1
S1S2
S2S2 S1 S2
Italianos com DAC
82,4 17,6 0,0 - -
Italianos sem DAC
85,2 14,8 0,0 - -
OLIVIERI et al. (2002)
Crianças Brasileiras
75,4 21,7 2,9 0,862
0,138
FRANÇA et al. (2005)
Coreanos
- - - 0,635
0,365
HONG et al. (1997)
Chineses
32,0 51,0 17,0 0,58 0,42
YU-LIN KO et al. (1997)
Indianos
48,6 43,5 7,9 0,704
0,296
CHHABRA et al. (2003)
Americanos Africanos
- - - 0,832
0,168
Americanos Brancos
- - - 0,905
0,095
HALLMAN et al. (2006)
Brasileiros
diabéticos
86,5 13,5 0,0 0,93 0,07
Brasileiros não
diabéticos
79,0 21,0 0,0 0,89 0,11
RELVAS et al. (2005)
1.6.2 Apolipoproteína apoA5
Um novo gene de apolipoproteína, apoA5, foi recentemente identificado
próximo ao grupo dos genes apoA1/C3/A4, a uma distância de
aproximadamente 27 Kb do gene apoA4 no cromossomo humano 11. O gene
humano apoA5 é composto por 4 éxons, codificando uma proteína de 369
aminoácidos, sendo expressa exclusivamente no fígado. Este gene está
envolvido na regulação da concentração de triglicérides do plasma. Em
camundongos, a apoA5 tem sido identificada em frações de VLDL e HDL.
28
Camundongos transgênicos e knockout têm sido usados na avaliação da
importância desse gene para determinação dos níveis de triglicérides do plasma.
Estudos nesses animais indicam que um transgene apoA5 conduz a uma
redução de aproximadamente 65% nos níveis de triglicérides, uma vez que
camundongos knockout têm níveis de triglicérides, quatro vezes mais altos que
os controles (TALMUD et al., 2002; HUBACEK et al., 2004a). A figura 4
apresenta a estrutura e relativa posição de 5 polimorfismos de um único
nucleotídeo no lócus do gene da apoA5.
Figura 4. Estrutura e posição relativa de cinco polimorfismos de um nucleotídeo
(SNPs) no lócus do gene da apoA5 (PENNACCHIO et al., 2002).
Os SNPs no gene de apoA5 têm sido associados com diferentes níveis de
triglicérides no plasma humano, hiperlipidemia familiar combinada e aumento do
risco de doença cardiovascular. Como apoA5 é uma apolipoproteína com alta
afinidade lipídica e baixa elasticidade, tem sido proposto que apoA5 pode
prejudicar a segunda etapa da construção de VLDL pela ligação com lipídios e
membranas celulares e, portanto, reduzir a produção de VLDL no fígado. Por
outro lado, apoA5 pode servir como um receptor de ligação ou ponte de
lipoproteínas ricas em triglicérides para proteoglicanos do tipo heparan sulfato,
aumentando assim a retirada de partículas remanescentes dos tecidos (LEE et
al., 2004).
Camundongos que expressam um transgene de apoA5 humano têm um
terço dos níveis de triglicérides dos controles. Similarmente, o aumento da
expressão de apoA5 foi associada com um decréscimo de 70% nos níveis de
triglicérides atribuídos à redução do conteúdo de triglicérides de lipoproteínas de
29
muito baixa densidade (VLDL). Além disso, níveis de colesterol foram diminuídos
em todas as frações de lipoproteínas com a grande redução de massa da fração
de HDL, o que sugere que apoA5 pode ter um papel não apenas na regulação
dos níveis de triglicérides, mas também nos do colesterol (LEE et al., 2004).
A apoA5 pode, ainda, acelerar a alteração de partículas ricas em
triglicérides, pela ativação direta da lipoproteína lipase ou pela interferência na
concentração ou função de outras lipoproteínas, como por exemplo apoC3. Em
camundongos geneticamente modificados, níveis plasmáticos de apoA5 são
inversamente proporcionais aos níveis de triglicérides. A apolipoproteína A5
acelera a hidrólise de lipoproteínas ricas em triglicérides pela ligação de
proteoglicanos com a lipoproteína lipase sem influenciar a taxa de produção.
Como apoC3 e apoA5 têm efeitos opostos nos níveis de triglicérides, tem sido
proposto que os efeitos da apolipoproteína apoA5 podem ser mediados pela
apoC3, uma vez que camundongos geneticamente modificados no lócus de
apoA1/C3/A4/A5 freqüentemente apresentam alterações na expressão de genes
vizinhos (MERKEL et al., 2005).
Recentemente, uma alteração polimórfica que promove a troca de um
aminoácido serina (S) por um triptofano (W) no códon 19 da proteína apoA5 foi
descrita. Portadores do alelo W19 apresentam altos níveis de triglicérides, sendo
esta associação observada, tanto em homens, como em mulheres com
diferentes etnias. Recentemente, TALMUD et al. (2004) mostraram uma
tendência para o aumento da progressão de aterogênese em portadores da
variante W19 na apoA5 (HUBACEK et al., 2004a; DALLONGEVILLE et al.,
2006).
Com relação ao polimorfismo S19W, o alelo raro W19 apresentou-se
significantemente mais comum em indivíduos com altos níveis de triglicérides,
sendo sistematicamente associado com aumento de concentrações de
triglicérides em três grupos étnicos diferentes. A deficiência de apoA5 foi
30
associada ao aumento das concentrações de triglicérides de plasma, propondo
que os haplótipos C-1131 e W19 influenciam os níveis de triglicérides pela
redução da função de apoA5. Como esses haplótipos foram relativamente
freqüentes, estudos de associação entre os mesmos e a DAC podem mostrar o
papel dos genes sobre a trigliceridemia (PENNACCHIO et al., 2002).
Embora os mecanismos pelo qual as variações nos genes de apoA5
influenciam os níveis de triglicérides ainda não sejam bem conhecidos,
resultados sugerem que o mesmo seja o mais importante determinante genético
das concentrações de triglicérides no plasma até hoje conhecido (HUBACEK et
al., 2004b).
Segundo MARTINELLI et al. (2007), portadores do alelo raro W19 da apo
A5 apresentam níveis plasmáticos de triglicérides e apoC3 aumentados, e
pacientes homozigotos WW possuem níveis maiores de colesterol total, LDL-C e
apoB que pacientes portadores do genótipo SS ou SW. Ainda, todos os
pacientes homozigotos WW, além de apresentarem lipídios aumentados, são
afetados por DAC. No mesmo estudo, ficou evidenciado o desequilíbrio de
ligação entre os polimorfismos S19W de apoA5 e -455 T>C da apoC3.
DALLONGEVILLE et al. (2006) demonstraram associação entre a
alteração S19W da apoA5 e os níveis de triglicérides em uma amostra de
homens franceses. Porém, a associação desta com DAC não foi claramente
evidenciada. Conseqüentemente, esses resultados sugerem que, embora a
variante W19 de apoA5 tenha um maior impacto nos níveis de triglicérides, este
efeito não aumenta significativamente o risco de DAC em homens franceses.
Hipertrigliceridemia é um fator de risco independente para o
desenvolvimento de doença cardiovascular. Apesar do efeito dos triglicérides no
31
plasma, o papel da apoA5 no desenvolvimento da doença cardiovascular
permanece controverso.
O estudo LOCAT (Lipid Coronary Angiography Trial) mostrou uma
tendência para aumento da progressão de aterogênese em homens portadores
do alelo raro W19, porém não apresentou nenhum efeito no sexo feminino. No
mesmo estudo foi mostrado que, embora o alelo raro da variante S19W tenha
sido associado com HFC e a distribuição do perfil lipídico, nenhuma associação
com doença cardiovascular ou infarto agudo do miocárdio foram evidenciadas
(VLEUTEN et al., 2007).
TALMUD (2007) relata que em todos os casos publicados, mutações
raras em apoA5 não são suficientes para causar hipertrigliceridemia.
Outra variação comum de um único nucleotídeo no gene apoA5,
polimorfismo -1131T>C, tem sido associada ao tamanho das partículas de LDL,
confirmando a ligação dessa com níveis de triglicérides e, possivelmente, com
níveis plasmáticos da apolipoproteína B (apoB) (AUSTIN et al., 2004).
WARD et al. (2003) mostraram que variações no gene de apoA-V alteram
as concentrações de triglicérides na gravidez. Os alelos -1131T>C e S19W
foram previamente associados ao aumento das concentrações de triglicérides
em mulheres caucasianas não grávidas. Em mulheres, portando, a presença de
pelo menos um dos alelos W19 ou C-1131 pode gerar um aumento de risco de
complicações durante a gravidez pelo aumento de triglicérides. Na tabela 4 são
apresentadas as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo S19W
presente no gene apoA5 descritas na literatura.
32
Tabela 4. Freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo S19W presente no
gene apoA5
População Freqüências
genotípicas
Freqüências
alélicas
Referências
SS SW WW S W
Chineses com
DAC
90,9 8,9 0,2 0,953 0,047
LIU et al. (2005)
Japoneses
Americanos
99,3 0,7 0,0 0,006 0,004
AUSTIN et al.(2004)
Franceses com
DAC
85,78
13,05
1,16 0,923 0,077
Franceses sem
DAC
90.39
9.60 0,0 0,952 0,048
DALLONGEVILLE et
al. (2006)
Mulheres
tchecoslovacas
76,7 21,3 2,0 - -
Homens
tchecoslovacos
79,8 18,6 1,6 - -
HUBACEK et al.
(2004a)
Mulheres
Afroamericana
86,1 13,2 0,7 0,927 0,073
Homens
Afroamericanos
86,5 13,1 0,4 0,931 0,069
Mulheres
Caucasianas
87,4 12,2 0,4 0,934 0,066
Homens
Caucasianos
89,2 10,8 0,0 0,946 0,054
PENNACCHIO et
al. (2002)
Irlandeses com
triglicérides alto
71,0 25,0 4,0 0,837 0,163
WRIGHT et al.
(2005)
1.7 Tratamento das dislipidemias
A dislipidemia é um dos problemas mais freqüentes na prática diária do
médico, sendo também um dos fatores mais importantes no desenvolvimento da
doença aterosclerótica. Sabe-se que esta doença deve ser tratada e o controle
da dislipidemia leva a uma redução comprovada na incidência da DAC, da
doença cerebrovascular e da doença vascular periférica (LUZ et al., 1990).
33
O objetivo do tratamento das dislipidemias, portanto, é normalizar as
alterações lipídicas presentes para reduzir o risco aterogênico ao qual está
exposto o paciente. Os principais recursos para alcançar esses objetivos são a
dieta, modificações no estilo de vida, tais como parar de fumar e aumentar a
atividade física, visto que essas modificações contribuem para o aumento do
HDL, manutenção do peso e atividade da lípase lipoprotéica diminuindo a
insulino-resistência, melhorando a utilização periférica da glicose e os fármacos
hipolipemiantes (COMISIÓN DE DISLIPEMIAS , 2001).
As drogas escolhidas para o tratamento das hipertrigliceridemias são os
fibratos, que depois de absorvidas são metabolizadas pelo fígado. Essas drogas
têm um importante papel no controle das dislipidemias mistas. Estudos clínicos
revelaram que os fibratos podem reduzir o risco de DAC em pacientes com
hipercolesterolemia (XAVIER, 2005).
34
2. JUSTIFICATIVA
A maioria das doenças cardiovasculares é resultado da complexa
combinação entre fatores genéticos e ambientais, onde os primeiros
desempenham um importante papel no desenvolvimento dessas doenças. A
aterosclerose é um processo dinâmico, evolutivo, a partir do dano endotelial de
origem multifatorial, com característica de reparação tecidual. O efeito de alguns
polimorfismos, no entanto, só se manifestará em um contexto dependente de
variáveis ambientais que predisponham a dislipidemia.
Não existem dúvidas que as seqüelas clínicas da aterosclerose
representam uma cifra expressiva dos gastos em saúde e que a redução do
colesterol pode diminuir significativamente muitos desses eventos, uma vez que
os níveis elevados de colesterol na corrente sanguínea aumentam
progressivamente o risco de desenvolvimento de doença arterial coronariana.
A possibilidade de prever o risco de progressão de lesões ateroscleróticas
através da análise genética pode ser de grande importância no controle de
pacientes com doença arterial coronariana. Avanços nas estratégias
terapêuticas têm derivado de estudos farmacogenômicos. Muitos genes tem sido
identificados como potenciais moduladores de resposta a estatinas.
A identificação de polimorfismos nos genes das apolipoproteínas apoC3
e apoA5 pode auxiliar na identificação de indivíduos com predisposição genética
ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, uma vez que estes genes
possuem relação com o metabolismo e o transporte de lipídios.
Os avanços obtidos na área da biologia molecular têm revolucionado o
estudo da fisiopatogenia e o diagnóstico de doenças. Além disso, a identificação
de determinados polimorfismos poderá trazer importantes informações sobre o
risco genético de desenvolvimento de doenças cardiovasculares.
35
No Brasil, as publicações referentes aos aspectos clínico-epidemiológicos
da DAC e alterações do perfil lipídico são relativamente escassas e restritas a
resultados obtidos em alguns grupos sociais selecionados.
Diante disso, a presente proposta de pesquisa teve como objetivos:
investigar a presença de polimorfismos nos genes apoC3 e apoA5 em pacientes
com dislipidemia, visando contribuir para o conhecimento da freqüência de
polimorfismos na população estudada.
Apesar de muitos estudos nos genes da apolipoproteína apoC3 e
apolipoproteína apoA5 já terem sido conduzidos em várias regiões geográficas
mundiais, são poucos os estudos desse tipo na população do Rio Grande do
Sul.
36
3. OBJETIVOS
A presente proposta de pesquisa possui os seguintes objetivos:
A. Investigar a presença do polimorfismo
SstI presente no gene que
codifica a Apolipoproteína C3 em pacientes com dislipidemia, visando
contribuir para o conhecimento da freqüência dos polimorfismos na
população estudada.
B. Investigar a presença do polimorfismo
S19W presente no gene que
codifica a Apolipoproteína A5 em pacientes com dislipidemia, visando
contribuir para o conhecimento da freqüência dos polimorfismos na
população estudada.
C. Associar as alterações gênicas encontradas no presente estudo com
dados clínicos, bioquímicos e antropométricos, visando contribuir para
uma melhor definição da relação entre genótipo e fenótipo da
dislipidemia.
37
4. METODOLOGIA
4.1 Delineamento do estudo
Este é um estudo da prevalência de polimorfismos genéticos em
pacientes dislipidêmicos, tipo transversal, observacional com base em uma
população clínica de pacientes que procuram o ambulatório de Dislipidemia do
HCPA.
4.2 População do estudo
A população do estudo foi composta por amostras de conveniência com
seleção consecutiva dos indivíduos que buscam atendimento no Ambulatório de
Dislipidemia, Serviço de Cardiologia, do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(HCPA), e que apresentam dislipidemia documentada.
4.2.1 Seleção da Amostra
Critérios de inclusão: Homens e mulheres com dislipidemia. Todos os
pacientes preencheram os critérios de elegibilidade e assinaram o termo de
consentimento e participação do estudo (anexo I).
Critérios de exclusão: pacientes em uso de anti-retrovirais, gestantes e
pacientes com idade inferior a 18 anos.
4.2.2 Coleta de dados
Foram coletados dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos com
base em outro projeto de pesquisa que está em andamento no Ambulatório de
Dislipidemia do HCPA (anexo 2). Subseqüentemente a consulta, o paciente era
encaminhado ao setor de coleta do HCPA para a retirada de 10 ml de sangue
em condições estéreis para as análises moleculares e bioquímicas. As análises
bioquímicas foram realizadas como parte da rotina de diagnóstico laboratorial
38
oferecida aos pacientes que buscam atendimento no HCPA. As amostras para
análise molecular foram guardadas em geladeira, por no máximo uma semana,
até o momento em que foram retiradas e levadas ao laboratório de biologia
molecular da ULBRA, onde foram processadas.
4.3 Dosagens bioquímicas e Extração de DNA
Os níveis de colesterol total, HDL-colesterol, LDL, VLDL e triglicerídios
foram dosados no plasma por métodos enzimáticos em indivíduos com 12 horas
em jejum (anexo 2).
O DNA de cada amostra foi extraído a partir de sangue total através da
técnica descrita por Miller et al. (1989).
4.4 Reação de PCR
As condições para a realização da técnica molecular, conhecida como
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), estão descritas nas Tabelas 5 e 6.
Tabela 5. Descrição dos primers e condições de amplificação por PCR dos
genes apoC3 e apoA5
Genes
Primers (5’ – 3’)
Condições de
amplificação
Referências
apoC3
5’-GGTGACCGATGGCTTCAGTTCCCTGA-3’
5’-CAGAAGGTGGATAGAGCGCTGGCCT-3’
95°C– 5’
95°C – 1'
58°C – 40" 35 X
72°C – 40"
72ºC – 10'
RUSSO et al. (2001)
apoA5
5'- TGCTCACCTGGGCTCTGGCTCTTC-3'
5'-CCAGAAGCCTTTCCGTGCCTGGGCGGC-3'
96°C–2'
94°C -15"
70°C -20" 30 X
72°C- 30’'
72°C – 10”
PENNACCHIO et al.
(2002)
39
Tabela 6. Descrição dos reagentes e concentrações usadas para amplificação
dos genes apoC3 e apoA5
Genes
Reagentes
Concentrações
Referências
apoC3
Primer F
Primer R
MgCl2
Tampão 10X
DNTPs
DMSO
H2O
Tac DNA polimerase
0,5
0,5
3,0
5,0
8,0
5,0
26,0
1,0
RUSSO et al. (2001)
apoA5
Primer F
Primer R
MgCl2
Tampão 10X
DNTPs
H2O
Tac DNA polimerase
0,98
0,98
1,96
4,9
7,84
31,36
0,98
PENNACCHIO et al.
(2002)
4.5 Detecção dos fragmentos de DNA amplificados
Os fragmentos de DNA amplificados durante a reação de PCR foram
visualizados em luz ultravioleta após eletroforese em gel de agarose (1%, para
apoC3 e 3% para apoA5) e o tamanho das bandas avaliado com um marcador
de peso molecular.
4.6 Genotipagem por RFLP
Os produtos de PCR amplificados das regiões polimórficas do gene APO
C3 foram genotipados através da técnica de RFLP (análise de polimorfismos do
comprimento dos fragmentos de restrição), utilizando a enzima de restrição SstI,
40
gerando fragmentos de 308 pb e 120 pb para o alelo G e 428 pb para o alelo C
(ausência do sítio de restrição), segundo RUSSO et al. (2001).
Através dos tamanhos diferenciais dos produtos de PCR clivados do gene
da apoC3 , a presença dos genótipos S1S1 (428 pb), S1S2 (428, 308 e 120 pb)
ou S2S2 (308 e 120 pb) foram analisados em gel de agarose 1% (RUSSO et al.,
2001). Os registros dos dados foram feitos conforme anexo 3. O tamanho dos
fragmentos da apoC3, após o processo de clivagem com a enzima SstI estão
esquematizados na figura 5.
Figura 5. Tamanho dos fragmentos da apoC3, após o processo de clivagem
com a enzima SstI
PCR
5’...GAGCT C...3’
3’…CTCGA G...5’
428
308
120
Para o polimorfismo S19W no gene de ApoA5, os produtos amplificados
foram genotipados por RFLP utilizando a enzima de restrição EagI, gerando
fragmentos de 151 e 28 pb para o alelo S (presença do sítio de restrição) e 179
pb para o alelo raro W (ausência do sítio de restrição), segundo PENNACCHIO
et al. (2002).
41
Através dos tamanhos diferenciais dos produtos de PCR clivados do gene
da apoA5, a presença dos genótipos SS (151, 28 pb) SW (151, 28 e 179 pb) ou
WW (179 pb), (PENNACCHIO et al., 2002) ), foram analisados em gel de
acrilamida a 10%. Os registros dos dados foram feitos conforme anexo 3. O
tamanho dos fragmentos da apoA5 após o processo de clivagem com a enzima
EagI, estão demonstrados na figura 6.
Figura 6. Tamanho dos fragmentos da apoA5 após o processo de clivagem
com a enzima EagI
PCR
5’...C GGCCG...3’
3’...G CCGGC...5’
151
28
179
4.7 Análises moleculares
4.7.1 Análises moleculares do polimorfismo SstI no gene apoC3
O processo de genotipagem foi realizado através de eletroforese em gel
de agarose a 1%. Os fragmentos de DNA do polimorfismo
SstI
no gene apoC3
foram corados com brometo de etídeo e visualizados em transluminador UV
.
42
4.7.2 Análises moleculares do gene apoA5
O processo de genotipagem foi realizado através de eletroforese em gel
de acrilamida a 10%. Os fragmentos de DNA do polimorfismo
S19W
no gene
apoA5 foram corados com brometo de etídeo e visualizados em transluminador
UV.
4.8 Análises estatísticas
Os dados coletados foram inseridos no programa de análise estatística
SPSS 12.0 e analisados com base em um intervalo de confiança de 95%, p<
0,05. As variáveis controladas foram idade, sexo, dados clínicos, bioquímicos e
antropométricos.
Teste qui-quadrado ou exato de Fisher, quando indicado, foi utilizado para
comparar as variáveis categóricas com a presença ou não do desfecho.
Teste t-Student ou não paramétrico correspondente foi utilizado para
comparar as variáveis contínuas com a presença ou não do desfecho, com
intervalo de confiança de 95% e p < 0,05.
O programa Arlequim (versão 2000) foi usado para as análises de
combinações haplotípicas dos genes apoC3 e apoA5.
4.9 Considerações éticas
O presente estudo foi projetado de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisa envolvendo Seres Humanos (resolução
196/1996 do Conselho Nacional de Saúde), aprovado pelo Comitê de Ética do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre no dia 09 de dezembro de 2004 com n° do
protocolo 04300 e aprovado também pelo Comitê de Ética da ULBRA. Os
pacientes foram informados do presente estudo e ao concordarem em participar,
assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido conforme anexo 1. Os
43
participantes receberam informações detalhadas sobre os objetivos do estudo,
bem como dos procedimentos realizados. Os pacientes que não conseguiram ler
o termo foram informados através de leitura em voz alta.
44
5. RESULTADOS
Os resultados da freqüência de polimorfismos presentes nos genes que
codificam as proteínas apoC3 e apoA5 foram obtidos a partir de análises
moleculares, utilizando a técnica de PCR-RFLP. Os estudos foram realizados
em pacientes dislipidêmicos, após seleção consecutiva dos indivíduos que
buscaram atendimento no Ambulatório de Dislipidemia, Serviço de Cardiologia
do HCPA.
5.1 Análise descritiva da amostra
A amostra estudada foi composta por 116 pacientes da região
metropolitana de Porto Alegre (RS – Brasil), sendo 51 homens (44,4%) e 65
mulheres (55,6%), todos dislipidêmicos com idade de 61,8 ± 11,2 anos, sendo
78,6 % brancos. Do total de pacientes analisados, 23,9% apresentaram histórico
familiar em 1° grau para dislipidemia. Os perfis clínico, bioquímico e
antropométricos da amostra estão descritos nas tabelas 7 e 8.
A tabela 7 mostra as características gerais da amostra estudada.
Podemos observar que entre os hábitos de vida, o tabagismo e consumo de
álcool foi maior no sexo masculino em relação ao feminino, já o sedentarismo foi
maior em mulheres. A idade média, o consumo de estatinas no início do
tratamento, doenças concomitantes, níveis de pressão arterial foram
semelhantes entre homens e mulheres.
Em relação aos dados clínicos da amostra em estudo, observa-se uma
freqüência elevada de indivíduos com hipertensão arterial (76,1%), o que
ressalta a importância deste fator de risco na população em estudo.
45
Em relação as variáveis antropométricas, o que deve ser ressaltado nesta
amostra foi a freqüência elevada (67,5%) de indivíduos com IMC acima do
normal (28,96 ± 5,3), sendo que desses, 4,3% foram obesos mórbidos. De
acordo com a
OMS ou WHO (1997), as medidas de IMC são classificadas como:
IMC < 25 Kg/m² como normal, IMC ≥ 25 Kg/m² como sobrepeso, ≥ 30 Kg/m²
como obesidade e ≥ 40 Kg/m² obesidade mórbida.
Em relação aos parâmetros
IMC não observamos diferenças entre homens e mulheres.
De acordo com a tabela 8, podemos observar que o perfil lipídico de uma
forma geral na amostra estudada não está dentro dos valores de referência para
pessoas acima de 20 anos, segundo a III Diretriz Brasileira de Dislipidemia,
apresentados na introdução deste trabalho. A média dos valores de colesterol
total 235,6 mg/dI está acima do limite que se considera desejável (<200 mg/dI) e
os níveis de LDL colesterol 147,1 mg/dI também estão acima do limite
considerado desejável (100 – 129 mg/dI). A média de triglicérides (249,9 mg/dI)
encontrada nesta amostra pode ser considerada alta (>200 mg/dI). Quanto aos
valores médios de HDL (47,9 mg/dI), observamos que ficou entre a categoria
baixa (< 40 mg/dI) e alta (> 60 mg/dI), observa-se ainda que as mulheres
apresentaram níveis lipídicos maiores que os homens.
Além disso, os níveis de glicose analisados nesta população (124,7
mg/dI) estão acima dos valores considerados normais (70 a 99 mg/dI),
predispondo os pacientes ao desenvolvimento de diabetes, outro fator de risco
de grande importância no desenvolvimento de DAC.
46
Tabela 7. Análise descritiva da amostra
Características Total Mulheres
Homens
N (%) 116 65 (55,6) 51 (44,4)
Idade ª 61,8 ± 11,2 62,83 ± 11,51 60,54 ± 10,99
Sedentarismo % 56,9 67,3 49,0
Tabagismo %
Tabagista atual 12,4 7,8 18,4
Não tabagista 48,7 59,4 34,7
Ex tabagista 38,9 32,8 46,9
Raça %
Brancos 77,6 67,7 90,2
Não Brancos 22,4 32,3 9,8
Alcoolismo %
Consumo de álcool 18,0 6,5 32,7
Não consome 61,3 83,9 32,7
Consumo no passado 20,7 9,7 34,7
Medicação %
Usava 45,3 49,2 59,6
Não usava 54,7 50,8 40,4
Perfil clínico %
Diabete melito 35,0 36,9 32,7
Cardiopatia isquêmica 35,0 32,3 38,5
Hipertensão arterial 76,1 80,0 71,2
PAS (mmHg)ª 144,2 ± 22,5
149,5 ± 23,2 138,0 ± 20,1
PAD (mmHg)ª 87,1 ± 12,2 88,71 ± 12,0 85,30 ± 12,4
Medidas antropométricasª
IMC, kg/m
2
28,96 ± 5,3 29,89 ± 6,2 27,75 ± 3,5
Cintura (cm) 101,1 ± 11,0
100,1 ± 11,0 102,27 ± 9,7
ª valores apresentados como média (
±
)
Tabela 8. Perfil bioquímico da amostra estudada.
Total Mulheres
n=65
Homens
n=51
COL total 235,6 ± 52,3 243,9 ± 54,7 225,6 ± 47,8
HDL-c 47,9 ± 9,9 50,5 ± 10,1 44,8 ± 8,7
LDL-c 147,1 ± 46,3 151,3 ± 47,7 141,9 ± 44,4
Triglicerídeos 249,9 ± 204,9 257,6 ± 208,9 240,6 ± 201,7
COL não-HDL 187,7 ± 50,7 193,4 ± 51,6 180,8 ± 49,3
Glicose 124,7 ± 52,4 124,2 ± 50,6 125,3 ± 48,7
Valores bioquímicos expressos como média (
±)
em mg/dI
47
5.2. Análises moleculares da amostra estudada
As análises dos polimorfismos nos genes apoC3 e apoA5 foram feitas em
duplicata (duas amplificações e duas clivagens) e sempre pelo pesquisador
responsável, sendo este um teste cego para os resultados das avaliações
clínicas, bioquímicas e antropométricas dos pacientes em estudo.
5.3. Freqüências dos polimorfismos analisados
5.3.1. Freqüências genotípicas, alélicas e haplotípicas
As freqüências genotípicas, alélicas e haplotípicas dos polimorfismos
estudados na amostra de 113 pacientes dislipidêmicos para o polimorfismo SstI
e 116 para o S19W , estão apresentadas nas tabelas 9 e 10.
De acordo com a tabela 9, não foram encontradas diferenças
significativas entre as freqüências alélicas e genotípicas entre homens e
mulheres nos polimorfismos SstI e S19W investigados nos genes apoC3 e
apoA5, respectivamente. A distribuição do polimorfismo S19W está em equilíbrio
de Hardy-Weinberg. Entretanto, o polimorfismo SstI não está em equilíbrio de
Hardy-Weinberg.
A tabela 10 apresenta as freqüências haplotípicas dos polimorfismos
presentes nos sítios SstI e S19W dos genes apoC3 e apoA5. O haplótipo mais
freqüente foi o S1S com 50,8% de freqüência. Não foi observado desequilíbrio
de ligação entre os sítios investigados (χ
2
= 0,007, p = 0,93).
48
Tabela 9. Freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos SstI e S19W
investigados nos genes apoC3 e apoA5
Polimorfismo
Total
n = 113
Mulheres
n = 64
Homens
n = 49
P
apoC3 (SstI)
Alelos
S1 (C) 0,8
S2 (G) 0,2
Genótipos
S1S1 69 37 32
S1S2 44 27 17
S2S2 0 0 0
0,270
apoA5 (S19W)
Total
n=116
Mulheres
n= 65
Homens
n= 51
Alelos
S (C) 0,68
W (G) 0,32
Genótipos
SS 56 33 23
SW 46 24 22
WW 14 8 6
0,788
Tabela 10. Freqüências haplotípicas dos polimorfismos SstI e S19W presentes
nos gene apoC3 e apoA5
Haplótipos
S1S S1W S2S S2W Total
N
115 67 41 3 226
%
50,8 30,0 18,0 1,2 100
5.3.2 . Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em relação à raça.
A tabela 11 mostra a comparação das freqüências genotípicas dos
polimorfismos estudados em relação à raça. Foi observada uma significância
estatística entre os genótipos do gene da apoC3 e a raça (p= 0,022). No entanto,
49
entre os genótipos da apoA5 não foi observada nenhuma diferença
estatisticamente significativa (p= 0,619).
Tabela 11.
Freqüências genotípicas dos polimorfismos estudados em relação à
raça.
Raça
Genótipos Brancos
n= 88
Não Brancos
n= 24
p
apoC
3
S1S1
59
10
S1S2
29
14
S2S2 0 0
0,022*
Genótipos
Brancos
n= 90
Não Brancos
n= 25
p
apoA
5
SS
41
14
SW
38
8
WW
11
3
0,619
Dados expressos em percentual, * p para valores estatisticamente significativos
5.3.3. Freqüências genotípicas de acordo com sexo e com níveis de lipídicos
É possível observar na tabela 12 uma diferença estatisticamente
significativa entre os genótipos da apoC3 e os níveis de triglicérides (p= 0,012)
em mulheres. Ainda, na tabela 12, observa-se uma diferença estatisticamente
significativa entre os níveis colesterol total (p= 0,026), LDL (p= 0,005), Col não
HDL (p= 0,029) e triglicérides (p= 0,016) em homens e os genótipos da apoC3.
No entanto, em relação aos genótipos do gene da apoA5 não foi observada
nenhuma diferença estaticamente significativa.
50
Tabela 12. Freqüências genotípicas dos polimorfismos SstI e S19W investigados nos genes apoC3 e apoA5 de acordo
com sexo e com níveis de lipídicos
Genótipos apoC3 (polimorfismo SstI)
Mulheres (n = 61) Homens (n = 48)
S1S1 S1S2 p S1S1 S1S2
*
p
Col total
239,4 ± 51,1 248,8 ± 60,5 0,495 227,3 ± 54,4 222,7 ± 32,5
0,026
*
HDL
48,4 ± 10,1 53,0 ± 9,7 0,809 44,8 ± 8,3 44,2 ± 10,3 0,210
TG
226,4 ± 136,9 301,0 ± 278,6
0,012
*
215,4 ± 151,4 298,3 ± 277,9
0,016
*
LDL
153,0 ± 45,9 147,8 ± 52,3 0,575 144,8 ± 51,9 134,2 ± 24,9
0,005
*
não HDL
191,0 ± 47,4 195,8 ± 58,5 0,374 182,5 ± 55,8 177,4 ± 35,6
0,029
*
Genótipos apoA5 (polimorfismo S19W)
Mulheres (n= 62) Homens (n= 50)
SS SW WW p SS SW WW p
Col total
236,0 ± 54,9 257,8 ± 57,4 230,0 ± 32,1 0,276 239,3 ± 48,4
216,3 ± 47,9
218,8 ± 39,1
0,259
HDL
50,8 ± 11,9 49,8 ± 6,6 51,7 ± 12,9 0,905
44,0 ± 9,0
46,2 ± 9,4
42,5 ±5,9
0,586
TG
239,9 ± 211,9 271,6 ± 205,9
296,3 ± 232,7 0,768 267,4 ± 217,9
228,9 ± 204,0
210,5± 150,8
0,756
LDL
148,3 ± 51,8
160,0 ± 43,8
133,2 ± 37,6
0,480 155,8 ± 45,1
131,9 ± 43,4
138,5 ± 44,7
0,258
não HDL
185,3 ± 50,5
208,0 ± 54,6
178,3 ± 35,7
0,202 195,2 ± 50,7
170,1 ±49,2
176,3± 37,8
0,233
Os valores bioquímicos estão expressos como média (
±)
em mg /dI, *p para valores estatisticamente significativos entre
genótipos e níveis bioquímicos
51
6. DISCUSSÃO e CONCLUSÕES
A procura de genes relacionados à susceptibilidade a dislipidemia e a
DAC tem sido objeto de intensas pesquisas, devido ao grande impacto dessas
condições na sociedade moderna. Na população brasileira, em especial,
considerada miscigenada, estudos de polimorfismos podem auxiliar na busca de
particularidades, através de associações entre fatores de risco ambientais e
variáveis genéticas.
No presente estudo, as freqüências dos polimorfismos SstI (gene apoC3)
e S19W (gene apoA5) foram investigadas em uma população de pacientes
dislipidêmicos e comparadas com parâmetros bioquímicos, clínicos e
antropométricos.
Na população de pacientes dislipidêmicos investigada verificamos as
seguintes características e freqüências (tabela 7): histórico familiar (23,9%),
idade (média 62 anos), sedentarismo (56,9%), tabagismo (ex tabagista e
tabagista atual, 51,4 %), diabetes (35,0%), hipertensão (76,1 %), IMC (média
28,9 kg/m2) e cintura aumentada (média 101 cm), refletindo a presença de
vários
fatores de risco para DCV, dados esses que conferem com os relatos já
bem definidos na literatura (LUSIS, 2000; SU et al., 2002; III Diretriz Brasileira
sobre Dislipidemias, 2001).
A maior freqüência observada de tabagismo, consumo de álcool em
indivíduos do sexo masculino em nossa amostra reflete a sociedade ocidental
que faz com que os homens apresentem perfis de risco diferenciados
(aumentado) para o desenvolvimento de doença cardiovascular em relação às
mulheres. Segundo dados da literatura, os riscos cardiovasculares relacionados
às mulheres estão associados com irregularidades no ciclo menstrual e perdas
na gravidez, sugerindo que funções ovarianas anormais durante os anos de pré-
52
menopausa podem aumentar o risco para DCV (de KLEIJN et al., 1999;
SOWERS et al., 2006; TUMUR et al., 2007).
De acordo com a tabela 8 é possível observar que o perfil lipídico em
ambos os sexos estão acima dos valores de referência para pessoas com mais
de 20 anos (III Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias, 2001), condição essa pré-
requisito para a seleção da população estudada.
As freqüências encontradas dos alelos S1 (0,8) e S2 (0,2) investigados no
gene apoC3 são similares às encontradas por outros autores, sendo o alelo S2 o
mais raro (FRANÇA et al., 2005; HALLMAN et al., 2006), porém menor que as
freqüências encontradas por CHHABRA et al. (2003) e YU-LIN-KO et al. (1997).
Segundo a tabela 9, as freqüências dos alelos S (0,68) e W (0,32) do
polimorfismo S19W da apoA5 diferem das freqüências observadas por outros
autores que encontraram freqüências bem menores para o alelo W
(PENNACCHIO et al., 2002; AUSTIN et al, 2004; WRIGHT et al., 2005). Uma
explicação para a maior freqüência do alelo W no presente estudo necessita de
maiores investigações.
Os genótipos S1S1 (69%) do gene apoC3 e SS (56%) da apoA5 foram
os mais freqüentes na amostra estudada. Esses dados estão de acordo com
achados da literatura (OLIVIERI et al., 2002; CHHABRA et al., 2003; AUSTIN et
al., 2004; FRANÇA et al., 2005; LIU et al., 2005; WRIGHT et al., 2005
DALLONGEVILLE et al., 2006).
Na literatura, a freqüência do alelo S2 é bastante baixa em diferentes
populações. No presente estudo, nenhum genótipo S2S2 foi encontrado,
provavelmente devido ao pequeno número de pacientes incluídos na amostra.
Neste contexto, entretanto, HOFFER et al. (1998), OLIVIERI et al. (2002) e
53
RELVAS et al. (2005) em seus estudos também não encontraram nenhum
indivíduo homozigoto para o alelo S2.
Não houve diferença significativa entre genótipos e sexo em ambos os
genes analisados, dados que concordam com os encontrados por outros autores
que também não observaram diferenças significativas entre essas variáveis
(DALLINGA-THIE et al., 1997; DALLONGUEVILLE et al., 2000; RUSSO et al.,
2001; HUBACEK et al., 2004a
;
PENNACCHIO et al., 2005;).
Não foi observado desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos SstI e
S19W (χ
2
= 0,007, p = 0,93). Esses dados conferem com os resultados
encontrados por TALMUD et al. (2002).
Verificamos também que em ambos os sexos, a distribuição do
polimorfismo S19W está em equilíbrio de Hardy-Weinberg, dados que
concordam com os encontrados por outros autores (AUSTIN et al., 2004; LEE et
al., 2004; MARTINELLI et al., 2007).
Nossos resultados também mostraram que o polimorfismo SstI não está
em equilíbrio de Hardy-Weinberg, distintamente do que foi encontrado em outros
estudos, onde foi demonstrado que esse polimorfismo apresentava-se em
equilíbrio (HONG et al., 1997; OLIVIERI, et al., 2002; IZAR et al., 2003; CHEN et
al., 2004; CHHABRA et al., 2004; HERRON et al., 2006). Entretanto, HOFFER et
al. (1998) mostraram que este polimorfismo não estava em equilíbrio de Hardy-
Weinberg em um grupo de pacientes hipertrigliceridêmicos. Uma explicação
para o desequilíbrio encontrado no presente estudo ainda necessita de maiores
investigações.
A tabela 11 mostra que foi encontrada uma associação estatisticamente
significativa entre pacientes que se autodeclararam não brancos e a presença
do alelo S2 (p= 0,022) no polimorfismo SstI da apoC3. Esse achado está de
acordo com outro trabalho que também encontrou diferença estatisticamente
54
significativa entre a presença deste alelo e diferentes populações de não-
caucasianos (CHHABRA et al., 2003). Neste contexto, ZENG et al. (1995)
encontraram maiores freqüências do alelo S2 em Japoneses, do que em
Caucasianos, sugerindo que a presença do alelo S2 seja um bom marcador de
raça.
Em nosso estudo, nenhuma associação estatisticamente significativa foi
observada entre a raça e o polimorfismo S19W, este dado é corroborado por
outros autores (WARD et al., 2003; HUBACEK et al., 2004b).
No presente estudo, foi encontrada uma associação estatisticamente
significativa entre níveis aumentados de triglicérides, tanto em homens, como
em mulheres portadores do alelo raro S2 da apoC3 (tabela 12). Esses
resultados estão de acordo com outros trabalhos relatados por diferentes
autores que associaram significativamente a presença do alelo raro S2 do
polimorfismo SstI do gene apoC3 a mulheres com altos níveis de triglicérides
(OLIVIERI et al., 2002; DALLONGUEVILLE et al. 2006).
Neste estudo observou-se que homens portadores do alelo S2
apresentaram níveis estatisticamente menores de colesterol total, colesterol LDL
e colesterol não HDL. Este dado é ainda controverso na literatura, tendo autores
que também não encontraram nenhuma relação estaticamente significativa entre
esses parâmetros bioquímicos e os diferentes genótipos de apoC3 (OLIVIERI et
al., 2002; CHHABRA et al., 2004). Outros autores, entretanto, demonstraram em
seus estudos níveis significantemente aumentados de col total e col LDL em
homens portadores do alelo raro S2 do polimorfismo SstI (HONG et al., 1997;
FRANÇA et al., 2005).
Embora a associação do polimorfismo S19W e o aumento nas
concentrações séricas de triglicérides já tenha sido estabelecida, neste trabalho
não houve diferença significativa entre este analito e o polimorfismo S19W
estudado. Esses resultados não estão de acordo com a literatura, pois diversos
estudos encontraram diferenças estatisticamente significativas entre altos níveis
55
de triglicérides e a presença do alelo raro 19W da apoA5 (PENNACCHIO, et al.,
2002, WARD et al., 2003; LAI et al., 2003; HUBACEK et al., 2004a). Portanto,
maiores estudos são necessários para determinar a existência de associação
entre o polimorfismo S19W e altos níveis de triglicérides nesse gênero.
Finalmente, devemos enfatizar que no presente estudo muitos resultados
com ausências de associações podem ter sido devidos ao número relativamente
pequeno de pacientes incluídos na amostra, ficando claro esse fato, quando
comparados com outros estudos relacionados.
56
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AUSTIN, M.A., TALMUD P.J., FARIN F.M., NICKERSON D.A., EDWARDS K.L.,
LEONETTI D., MCNEELY. M.J., VIERNES H., HUMPHRIES S.E., FUJIMOTO
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65
ANEXOS
66
ANEXO 1
CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇAO DO PROJETO DE PESQUISA
Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da Apolipoproteína C3
(apoC3) e da Apolipoproteína A5 (apoA5) em pacientes dislipidêmicos
Objetivos do Estudo
As doenças do coração representam um problema de saúde pública no
mundo. Existem diversos fatores de risco responsáveis pelo aparecimento
dessas doenças, os quais podem ser divididos em imutáveis e mutáveis. Fatores
imutáveis são aqueles que não podemos mudar e, por isso, não podemos tratá-
los, são eles: hereditariedade (herança genética herdada de nossos pais), idade
e sexo (homens têm maiores chances de ter um ataque cardíaco). Os fatores
mutáveis são aqueles sobre os quais podemos influir, mudando, prevenindo ou
tratando, são eles: fumo, colesterol elevado (HDL é o bom colesterol e o LDL é o
mau colesterol), pressão arterial elevada, dieta (ingestão de alimentos
gordurosos), vida sedentária (falta de exercícios físicos), obesidade (excesso de
peso) e estresse (tensão emocional). O colesterol elevado é um dos fatores de
risco mais importantes para o surgimento das doenças do coração e sua
diminuição está comprovadamente ligada a uma diminuição desse risco. O
presente estudo tem como objetivo conhecer uma região do seu material
genético (DNA) que pode estar influenciando o aparecimento de colesterol alto
e, conseqüentemente, as doenças do coração.
Procedimentos
Durante a visita ao consultório, algumas perguntas como idade, sexo,
escolaridade e dieta serão realizadas. Serão obtidas também medidas como
peso, altura e comprimento do quadril.
Após, será realizada uma coleta de sangue para dosar os níveis de
colesterol e realizar as análises genéticas. Outras duas coletas serão
67
necessárias após 3 e 6 meses, a partir dessa consulta. As consultas deverão ser
devidamente marcadas.
Essas coletas serão feitas apenas para este estudo e em nada
influenciarão o tratamento. A coleta não vai causar nenhum problema, exceto o
pequeno incômodo de dor no momento da introdução da agulha para a retirada
do sangue.
Riscos e Desconfortos:
Os riscos e desconfortos aos pacientes deste estudo são aqueles
associados aos procedimentos da coleta de sangue. Essa quantidade é
pequena (10 mL) e, por isso, dificilmente causará algum mal-estar geral (1 em
cada 1000 pessoas), no entanto, poderá haver dor no local da coleta e,
eventualmente, um pequeno hematoma.
Benefícios:
Os benefícios da participação nesse estudo estão relacionados aos
exames oferecidos e ao acompanhado recebido para verificar as condições do
coração paciente. O paciente também estará contribuindo com informações
fundamentais que ampliarão o conhecimento da relação entre a hereditariedade
e o medicamento usado no tratamento da doença arterial coronariana.
Alternativa:
Se o paciente escolher não participar, não haverá nenhuma diferença,
quanto ao acompanhamento médico.
Custos:
Não será cobrado algum pagamento pela participação no estudo.
Dúvidas:
68
Alguma dúvida referente ao estudo poderá ser esclarecida pela Dra.
Nadine Clausell, telefone 21018657 (Serviço de Cardiologia).
Confidencialidade:
Todas as informações e os resultados advindos dos procedimentos
realizados serão considerados confidenciais e serão conhecidos somente da
equipe envolvida. Todos os questionários e materiais coletados serão
identificados através de um código criado na entrada do estudo. Este código
será a única identificação no banco de dados, sendo utilizado para análise dos
dados e divulgação dos mesmos no meio científico.
Participação voluntária:
Uma cópia desse documento será fornecida, caso desejar. Se houver
desistência em algum momento do estudo, nenhuma diferença quanto ao
acompanhamento e tratamento será observado.
Significado de sua assinatura:
A sua assinatura abaixo significa que você entendeu a informação que lhe
foi fornecida sobre o estudo e sobre o termo de consentimento. Se você assinar
este documento significa que você concorda em participar do mesmo.
_____________, _____ de ____________ de
____
Nome completo:_______________________________________________ _
_
Endereço completo:___________________________________________
___
Número do telefone:_____________________________
_________________
Assinatura do Paciente: ___________________________________________
Data: ________________________________________________________ _
Nome da Pessoa que obteve o consentimento: ________________________
Assinatura: _____________________________________________________
69
ANEXO 2
Título do projeto: Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da
Apolipoproteína C3 (apo C3) e da Apolipoproteína A5 (apo A5) em pacientes
dislipidêmicos
70
71
72
73
74
75
ANEXO 3
Título do projeto: Estudo de freqüência de polimorfismos nos genes da
Apolipoproteína C3 (apo C3) e da Apolipoproteína A5 (apo A5) em pacientes
dislipidêmicos
Número de controle:_____________________________________________
Número do paciente no HCPA:______________________________________
FICHA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Gene Genótipo
S1S1
S1S2
ApoC3
S2S2
SS
SW
ApoA5
WW
Observação:______________________________________________________
________________________________________________________________
______________________
______________ _____________
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