ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MÁRIO ROGÉRIO LIMA MOTA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E
ANTINOCICEPTIVA DA LECTINA ISOLADA DE
SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth.
Tese apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Farmacologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Orientador (a): Profª. Dra. Nylane Maria Nunes
de Alencar
Fortaleza
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E
ANTINOCICEPTIVA DA LECTINA ISOLADA DE SEMENTES
DE Lonchocarpus sericeus (POIR.) KUNTH.
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Parte desta tese
está publicada no International Immunopharmacol,
V. 7, P. 824-835, 2007
(ver em anexo).
MÁRIO ROGÉRIO LIMA MOTA
ads:
M871e Mota, Mário Rogério Lima
Estudo da atividade anitinflamatória e antinociceptiva da
lectina isolada de sementes de Lonchocarpus sericeus (Poir.)
Kunth / Mário Rogério Lima Mota; orientador: Nylane Maria
Nunes de Alencar. – Fortaleza, 2008.
139f. il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina, 2008.
1. Mediadores da Inflamação 2. Dor 3. Nociceptores 4.
Lectinas de Plantas 5. Fabaceae I. Alencar, Nylane Maria Nunes
de (Orient.) II. Título
CDD: 615.783
3
MÁRIO ROGÉRIO LIMA MOTA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DA
LECTINA ISOLADA DE SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth.
Tese apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Farmacologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
________________________________
Prof. Dra. Nylane Maria Nunes de Alencar (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
______________________________
Prof. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy
Universidade Estadual do Ceará – UECE
_______________________________
Prof. Dra. Cláudia Ferreira Santos
Universidade Estadual do Ceará – UECE
_______________________________
Prof. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves
Universidade Federal do Ceará – UFC
__________________________________
Prof. Dra. Flávia Almeida Santos
Universidade Federal do Ceará – UFC
I
4
A Deus, minha mãe, Maria das Dores
Lima Mota, a minha orientadora, Nylane Maria
Nunes Alencar e aos meus amigos, Ana Vaneska,
Nilson e Ana Paula, pelo apoio nos momentos
difíceis dessa caminhada.
Dedico este Trabalho
II
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, que sempre me deu forças para perseverar e continuar, diante de
qualquer obstáculo que surgisse.
Aos meus familiares, em especial minha mãe, Maria das Dores Lima Mota
que sempre me ensinou a discernir o certo do errado, e se empenhou ao máximo
para dar-me escolaridade e educação. Muito obrigado pelo carinho, compreensão,
apoio incondicional, educação e incentivo.
À Profª Nylane Maria Nunes de Alencar minha atual orientadora, agradeço
tudo, principalmente, da maneira amiga que me recebeu e me ensinou. Ela apostou
no meu crescimento, e sempre se importou com minha vivência científica, me
guiando e alertando para a importância da ciência. Sempre lembrarei dela como
exemplo de pesquisadora e professora.
A Profª. Ana Maria Sampaio Assreuy, minha orientadora de mestrado, por
me ajudar na minha formação científica desde o início, sempre com confiança,
compreensão, dedicação, paciência e profissionalismo. Muito obrigado por ter
confiado em mim, se não fosse por isso, nada disso teria acontecido.
Ao Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada pela confiança em nos conceder a
lectina e ferramentas que foram os objetos imprescindíveis desse trabalho.
Ao Prof Dr. Marcelo Henrique Napimoga por ter realizado parte destes
experimentos e por ter me recebido em Uberaba de maneira extremamente amiga,
além de ter me ensinado e contribuído para minha formação.
À Profª Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, por ela tenho grande
admiração, me acolheu gentilmente no curso de odontologia e me ensinou sempre
com muita propriedade e paciência. Muito obrigado por ter confiado em mim e no
meu trabalho, por me ensinar tanto e por ter me dado esta oportunidade.
À Prof Dr. Fabrício Bitú, me acolheu no curso de odontologia sempre
disposto a me ajudar e ensinar. Agradeço pela grande amizade, com certeza
duradoura e de grande valor.
III
6
Ao Prof. Marcus Raimundo Vale por contribuir sempre com idéias
pertinentes, criativas e construtivas.
Aos amigos Ana Vaneska Passos Meireles, Nilson Vieira Pinto e Ana
Paula Passos Meireles, pela ajuda constante em todos os momentos da elaboração
deste trabalho, e pela amizade fiel que com certeza seguirá durante todos os anos
da minha vida. Vocês estarão para sempre no meu coração não importa o tempo
que passe.
Aos meus grandes amigos da pós-graduação Jozi e Flávio sempre tão
competentes e dispostos a me ajudar, além de proporcionar um ambiente alegre e
descontraído para trabalhar. Eles sempre tiveram grande força de vontade e
determinação me ajudando em vários experimentos. Agradeço pela amizade e
companherismo e com certeza serão eternos.
À Ingrid que juntamente com o Flávio e a Jozi fizeram parte muito
importante desta caminhada, obrigado pela motivação, conselhos e amizade que
com certeza levarei comigo.
Aos meus colegas de laboratório: Ítalo, Patrícia, Michael, Priscila, Carla,
Cinthia, Cibele, Elmadan, Ingridizinha e todos os outros que fazem parte desta
grande família do laboratório de bioquímica da pós-graduação em farmacologia.
Com certeza todos me ajudaram no desenvolvimento desse trabalho e me
prporcionaram grandes momentos de aprendizado e companhia.
Aos integrantes do Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas, do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC, principalmente aqueles
responsáveis pelo brilhante trabalho árduo, de isolar e purificar a lectina utilizada
neste trabalho.
Aos professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pessoas
que sempre se mostraram interessadas em me ensinar e ajudar a desenvolver este
trabalho.
Ao Laboratório de Inflamação e Dor da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP, representado pela pessoa do
prof. Dr. Fernando Cunha.
VI
7
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho a minha gratidão.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Muito Obrigado!
V
8
“Quanto maior for a crença em seus objetivos,
mais depressa você os conquistará”
MAXWELL MALTZ
VI
9
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO
21
3
1.1 RESPOSTA INFLAMATÓRIA 21
1.1.1 Eventos vasculares 22
1.1.2. Eventos celulares 23
1.1.3. Mediadores inflamatórios 26
1.2 NOCICEPÇÃO E DOR 32
1.2.1. Classificação dos diferentes tipos de dor 33
1.2.2. Fisiopatologia da dor 34
1.2.3. Sistemas modulatórios da dor 36
1.2.4. Dor inflamatória 38
1.2.5 Mediadores com ação nos nociceptores 39
1.3 LECTINAS 41
1.3.1. Lectinas: Definição e Classificação 42
1.3.2. Efeitos biológicos de lectinas vegetais 43
1.3.3. Lonchocarpus sericeus 45
1.4 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 48
2 OBJETIVOS
51
2.1 OBJETIVO GERAL 51
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 51
2.2.1 Relacionados a atividade antiinflamatória 51
2.2.2 Relacionados a atividade antinociceptiva 51
2.2.3 Relacionados a toxicidade e a investigação de possíveis efeitos
centrais
52
VII
10
3 MATERIAIS E MÉTODOS
54
3.1 LECTINA 54
5
3.2 DROGAS E REAGENTES 54
3.3 EQUIPAMENTOS E MATERIAIS 56
3.4 ANIMAIS EXPERIMENTAIS 57
3.5 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA LECTINA DE
Lonchocarpus sericeus – LSL: EFEITO SOBRE A MIGRAÇÃO DE
NEUTRÓFILOS
58
3.5.1 Avaliação do efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus
sericeus sobre a migração de neutrófilos para cavidade peritoneal
induzida por carragenina (Cg)
58
3.5.1.1 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre
rolamento e adesão dos leucócitos induzidos por Cg na
microcirculação mesentérica (modelo de microscopia intravital)
59
3.5.1.2 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a
liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas na cavidade
peritoneal estimulada com Cg
60
3.5.1.3 Envolvimento do óxido nítrico no efeito antiinflamatório da lectina de
sementes de Lonchocarpus sericeus
61
3.5.1.3.1 Dosagem do óxido nítrico (NO) no soro dos animais pré-tratados e.v.
com lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
61
3.5.1.3.2 Efeito de Inibidores da Síntese de NO sobre a Inibição da migração de
neutrófilos pela lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
62
3.5.2 Avaliação do efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus
sericeus sobre a migração de neutrófilos para cavidade peritoneal
induzida por Ovalbumina (OVA) em animais pré-imunizados
62
3.5.2.1 Elisa para IgG (imunoglobulina G) anti-OVA 63
3.5.3 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a
quimiotaxia in vitro de neutrófilos
64
3.6 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA LECTINA DE
Lonchocarpus sericeus – LSL
65
3.6.1 Modelo de nocicepção induzida por ácido acético: contorções
abdominais
65
3.6.2 Modelo de nocicepção induzida por formalina 65
3.6.3 Modelo de nocicepção induzida por elevação da temperatura:
Teste da Placa quente
66
3.6.4 Modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina e
prostaglandina E
2
(PGE
2
)
66
VIII
11
3.6.4.1 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a
migração de neutrófilos na hipernocicepção induzida por
carragenina
67
3.6.4.2 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a
liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas na
hipernocicepção induzida por carragenina
68
3.6.5 Modelo de hipernocicepção mecânica induzida por OVA em
animais pré-imunizados
68
3.7 AVALIAÇÃO DE AÇÕES DA LECTINA DE Lonchocarpus sericeus
SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL: MODELOS DE
COMPORTAMENTO ANIMAL
69
3.7.1 Avaliação da atividade motora 69
3.7.1.1 Teste do rota rod 69
3.7.1.2 Teste do campo aberto 69
3.7.2 Avaliação da atividade depressora: Teste do nado forçado 70
3.8 TOXICIDADE AGUDA 70
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 71
4 RESULTADOS 73
4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA 73
4.1.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos
induzida por carragenina em camundongos
73
4.1.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus inibe o rolamento e a adesão
dos leucócitos no endotélio vascular de animais estimulados
com carragenina.
73
4.1.3 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de citocinas
(TNF-α e IL-1β) no exsudato peritoneal de camundongos
estimulados com carragenina.
76
4.1.4 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de quimiocinas
(MIP-1, KC) no exsudato peritoneal de camundongos estimulados
com carragenina
76
4.1.5 O tratamento e.v. com a lectina de sementes de Lonchocarpus
sericeus induz aumento nos níveis sanguíneos de óxido nítrico
(NO)
79
4.1.6 Inibidor específico da iNOS inibe a atividade antiinflamatória da
lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus na peritonite
induzida por carragenina
79
4.1.7 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos
para a cavidade peritoneal induzida por OVA em camundongos
imunizados.
81
XI
12
4.1.8 Lectina de Lonchocarpus sericeus não interefere na quimiotaxia
induzida por MIP-2 in vitro
81
4.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINOCICEPTIVA 84
4.2.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a freqüência de
contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongos.
84
4.2.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus apresenta atividade
antinociceptiva somente na fase inflamatória do teste da
formalina
84
4.2.3 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus não interefer no
tempo de reação dos camundongos no modelo da placa quente
86
4.2.4 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a hipernocicepção
mecânica induzida por carragenina em camundongos, mas não
por Prostaglandina E
2
(PGE
2
)
88
4.2.5 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos
induzida por carragenina na pata de camundongos
88
4.2.6
Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de TNF-α e IL-1β
nas patas de camundongos estimulados com carragenina
91
4.2.7 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis MIP-1 e KC nas
patas de camundongos estimulados com carragenina.
91
4.2.8 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a hiperalgesia mecânica
induzida por OVA em camundongos imunizados.
94
4.3 ESTUDO DA ATIVIDADE DA Lonchocarpus sericeus SOBRE O
SISTEMA NERVOSO CENTRAL
96
4.3.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus não modificou a coordenação
motora de camundongos no teste de rota rod.
96
4.3.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus não modificou a locomoção
espontânea de camundongos no teste de campo aberto.
96
4.3.3 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus não alterou o
tempo de imobilização dos camundongos no teste de nado
forçado.
97
4.4 EFEITO DO TRATAMENTO AGUDO COM LECTINA DE SEMENTES
DE Lonchocarpus sericeus EM CAMUNDONGOS.
100
5 DISCUSSÃO 103
6 CONCLUSÃO 116
7 REFERÊNCIAS 118
ANEXO – Artigo publicado (International Immunopharmacol, v. 7, p. 824-
835, 2007)
141
X
13
LISTA DE SIGLAS
AAS = Ácido acetilsalicílico
ALT = Alanina aminotransferase
AMPA = Ácido alfa-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazoil propiônico
AMPc = Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA = Análise de Variância
AST = Aspartato aminotransferase
ATP = Adenosina trifosfato
BioMoLab = Laboratório de Moléculas biologicamente ativas
BK = Bradicinina
BSA = Albumina sérica bovina
Ca
++
= Íon cálcio
CFA = Adjuvante de freund’s completo
CGPR = Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CPA = Substância cinzenta periaquedutal
E.P.M. = Erro padrão da média
ELISA = Ensaio imunoabsorbante por enzima ligada “enzime-linked
imunosorbent assay”
ENA-78 = Peptídeo ativador de neutrófilos derivado de células epiteliais
e.v. = Endovenoso
FMN = Flavina adenina mononucleotídeo
GABA = Ácido gama-aminobutírico
GMPc = Guanosina monofosfato cíclico
HE = Hematoxilina Eosina
FI = Falso imunizado
IASP = Associação internacional para estudo da dor
ICAM Moléculas de adesão intercelular-1 e 2 (do inglês: Intercellular
Adhesion Molecule)
IFN-α =
Interferon alfa
IFN-γ =
Interferon gama
IGg = Imunoglobulina G
IL-1 = Interleucina 1
IL-2 = Interleucina 2
IL-3 = Interleucina 3
IL-4 = Interleucina 4
XI
14
IL-5 = Interleucina 5
IL-6 = Interleucina 6
IL-8 = Interleucina 8
IL-10 = Interleucina 10
IL-13 = Interleucina 13
i.p. = Intraperitoneal
i.v. = Intravascular
L. sericeus Lonchocarpus sericeus
LSL = Lectina de Lonchocarpus sericeus
L-NAME = L-nitroarginina metil éster
mAb = Anticorpo monoclonal
MCP-1 = Proteína quimiotática para monócitos um
MCP-2 = Proteína quimiotática para monócitos dois
MCP-3 = Proteína quimiotática para monócitos três
MCP-4 = Proteína quimiotática para monócitos quatro
Morf. = Morfina
MPO = Mieloperoxidase
NaCl = Cloreto de sódio
NaPO
4
= Fosfato de sódio
NAD = Niconinamida adenina dinucleotídeo
NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
Nalox. = Naloxona
NAP-2 = Peptídeo ativador de neutrófilos dois
NFKβ =
Fator de transcrição nuclear kappa beta
NGF = Fator de crescimento do nervo
NK = Matadores naturais “natural killers”
NMDA = N-metil-D-aspartato
NO = Óxido nítrico
NOS = Óxido nítrico sintase
NOSi = Óxido nítrico sintase induzida
NOSn = Óxido nítrico sintase neuronal
NOSe = Óxido nítrico sintase endotelial
NO
2
-= Nitrito
NO
3
-= Nitrato
OVA = Ovalbumina
XII
15
PAF Fator de agregação plaquetária
PBS = Tampão salina fosfato
PCAM Molécula de adesão de célula endotelial e plaqueta
PG = Prostagandina
PGE
2
= Prostaglandina E
2
PF-4 = Fator plaquetário quatro
PKC = Proteína quinase C
s.c. = Subcutâneo
SNC = Sistema nervoso central
SP = Substância P
TGF-β =
Fator de crescimento transformador beta
THB4 = Tetrahidrobiopterina
TNF-α =
Fator de necrose tumoral alfa
VCAM Molécula de adesão vascular (do inglês: vascular adhesion
molecule)
XIII
16
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Foto de um espécimen de Lonchocarpus sericeus (a). Destaque
para frutos (b) e inflorescências (c).
45
Figura 2 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) inibe a
migração neutrofílica (MN) induzida por carragenina (Cg) para a
cavidade peritoneal de camundongos.
74
Figura 3 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) diminui a
adesão e o rolamento de leucócitos nas células endoteliais
75
Figura 4 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os
níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) no exudato peritoneal em
camundongos estimulados com carragenina.
77
Figura 5 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os
níveis de quimiocinas (MIP-1 e KC)) no exsudato peritoneal em
camundongos estimulados com carragenina.
78
Figura 6 Lectina de Lonchocarpus sericeus (LSL) induz aumento de NO
no sangue de camundongos.
80
Figura 7 Aminoguanidina diminuio efeito antiinflamatório da lectina de
lonchocarpus sericeus (LSL) no modelo de peritonite induzida
por Cg.
80
Figura 8 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz
migração de neutrófilos (MN) induzida por ovoalbumina (OVA)
em camundongos imunizados.
82
Figura 9 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus não inibe
quimiotaxia de neutrófilos induzida por MIP-2 in vitro.
83
Figura 10 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz o
número de contorções abdominais induzidas por ácido acético
em camundongos.
85
Figura 11 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) inibe a
segunda fase do teste de formalina em camundongos.
85
Figura 12 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) não
apresenta efeito no teste da placa quente em camundongos.
87
Figura 13 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz
hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, mas não
por PGE.
89
Figura 14 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz o
influxo de neutrófilos na pata de camundongos estimulados com
carragenina.
90
Figura 15 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os
níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) na pata de camundongos
estimulados com carragenina.
92
XIV
17
Figura 16 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os
níveis de MIP-1 e KC na pata de camundongos estimulados com
carragenina.
93
Figura 17 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz a
hipernocicepção induzida por ovoalbumina (OVA).
95
Figura 18 A coordenação motora de camundongos não é afetada pela
administração de lectina de sementes de Lonchocapus sericeus
(LSL)
98
Figura 19 A locomoção espontânea de camundongos não é afetada com a
administração de lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
(LSL).
98
Figura 20 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) não
provoca depressão em camundongos.
99
Figura 21 Representação esquemática da hipótese do efeito
antiinflamatório da lectina de Lonchocarpus sericeus.
107
Figura 22 Representação esquemática da hipótese do efeito
antinociceptivo da lectina de Lonchocarpus sericeus.
112
Tabela 1 Tratamento agudo de camundongos com Lonchocarpus sericeus
não induz toxicidade sistêmica
101
XV
18
RESUMO
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DA
LECTINA ISOLADA DE SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth.
Mário Rogério Lima Mota. Orientadora: Profª. Dra. Nylane Maria Nunes de
Alencar. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do
Ceará (UFC), 2008.
Lectinas são (glico)proteínas de origem não imune e que podem reconhecer e se ligar
reversivelmente a carboidratos ou a outras substâncias derivadas de açúcares. A lectina de
sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) apresenta massa molecular aparente de 23555 ±
15 Da e especificidade de ligação a N-acetil-glicosamina e α-metil-glicopiranosídeo. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antiinflamatória e antinociceptiva da Lectina de
sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL). Para tal, utilizamos camundongos Swiss albinos
(25-35g). No estudo da atividade antiinflamatória, LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos)
inibiu a migração (rolamento e adesão de neutrófilos) para a cavidade abdominal de animais
estimulados com carragenina (Cg), e este efeito parece estar relacionado com a redução
dos níveis de citocinas (TNF-α and IL-1β) e quimiocinas (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]) por
esta lectina. O efeito inibitório da LSL sobre a migração de neutrófilos, parece também
envolver o aumento nos níveis sistêmicos de óxido nítrico (NO), pois LSL (10 mg/kg; e.v.) foi
capaz de aumentar os níveis de NO no soro de animais, e o pré-tratamento de
camundongos com aminoguanidina (inibidor da óxido nítrico sintase induzida) foi capaz de
reverter o efeito aniinflamatório desta lectina sobre a migração de neutrófilos. Ainda em
relação à atividade antiinflamatória, LSL foi capaz de inibir a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal de animais imunizados e estimulados com ovoalbumina (OVA), porém,
esta mesma lectina foi ineficaz em inibir a migração de neutrófilos in vitro estimulada por
MIP-2, demonstrando então um papel indireto da LSL (redução de citocinas e quimiocinas)
na inibição da migração. No estudo da atividade antinociceptiva, LSL (10 ou 100 mg/kg; e.v.;
15 minutos) reduziu as contorções abdominais induzidas por ácido acético e diminuiu
somente a segunda fase do teste da formalina, demostrando uma atividade sobre a dor
inflamatória. No teste da placa quente, LSL não apresentou efeito. Para avaliar a dor
inflamatória realizaram-se estudos de atividade antihipernociceptiva. Assim, LSL (3 ou 10
mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a hipernocicepção mecânica induzida por administração
intraplantar de carragenina e ovalbumina (animais imunizados) mas não a induzida por
prostaglandina E
2
(PGE
2
). Este efeito foi correlacionado ao bloqueio do influxo de
neutrófilos, sugerido pela redução dos níveis de mieloperoxidase (MPO) nas patas de
animais pré-tratados com LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) e estimulados com
carragenina. Este efeito antihiperalgésico parece também depender da redução dos níveis
de citocinas (TNF-α and IL-1β) e quimiocinas (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]), uma vez que
LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu os níveis destes mediadores no tecido da pata
de animais estimulados com Cg (intraplantar). Em relação a uma possível atividade central,
LSL (10 mg/kg; e.v.) não alterou a atividade motora e nem provocou depressão nos animais.
A toxicidade aguda foi avaliada pelo tratamento de camundongos com LSL (10 mg/kg; e.v.),
durante sete dias consecutivos, através de vários parâmetros: funções do rim (peso úmido,
dosagem de uréia) e do fígado (peso úmido, avaliação da cinética da aspartato amino
transaminase e alanina amino transaminase), coração (peso úmido), estômago (peso úmido
e avaliação visual de possíveis lesões), variação de massa corporal dos animais tratados e
leucograma. Os resultados obtidos não mostraram qualquer alteração dos parâmetros
avaliados, demonstrando que a LSL não apresenta nenhuma toxicidade nos animais. Em
conclusão, a atividade antiinflamatória e antinociceptiva da LSL está associada com a
inibição da migração de neutrófilos, que provavelmete é reflexo da inibição da liberação de
citocinas e quimiocinas e do aumento na liberação de NO. Adicionalmente, esta lectina não
apresenta efeitos centrais nem toxicidade aguda.
XVI
19
ABSTRACT
STUDY OF ANTIINFLAMMATORY AND ANTINONOCICEPTIVE ACTIVITIES OF
LECTIN FROM Lonchocarpus sericeus SEEDS (POIR.) KUNTH. Mário Rogério
Lima Mota. Supervisor: Profª. Dra. Nylane Maria Nunes de Alencar. Department
of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceara (UFC), 2008.
Lectins are non-immune (glyco)proteins that can recognize and reversibly bind to
carbohydrates or other substances derived from sugars. Lonchocarpus sericeus seeds (LSL)
shows a molecular mass of 23555 ± 15 Da and a α-metyl glucopyranoside and N-acetyl-
glucosamine binding specificity. The aim of this work was to evaluate the antinoceptive and
antiinflammatory activity of lectin from Lonchocarpus sericeus seeds (LSL). To do so, we
used swiss mice (25-35g). In the antiinflammatory activity studying, LSL (10 or 100 mg/kg;
i.v.; 15 minutes) inhibited the migration (neutrophil rolling and adhesion) to the peritoneal
cavities of animals stimulated with carrageenan (Cg), and the effect seems to be related to
the cytokines (TNF-α and IL-1β) and chemokines (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]) level
reduction induced by this lectin. The LSL inhibitory effect on the neutrophil migration seems
to be also related to the nitric oxide (NO) systemic levels increasing. LSL was effective on
the NO increasing on animals’ serum. The pretreatment of mice using aminoguanidin (nitric
oxide reduced synthase inhibitor) reversed the antiinflammatory effect of lectin on the
neutrophil migration. Still referring to the anti-inflammatory activity, LSL was effective on
inhibiting the neutrophil migration to the peritoneal cavities of animals immunized and
stimulated with ovalbumin (OVA), but the lectin was unable to inhibit an in vitro neutrophil
migration induced by MIP-2, showing an indirect action of LSL (cytokines and chemokines)
on the migration inhibition. In the antinoceptive study, LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 30 minutes)
reduced abdominal contortion induced by acetic acid and only decreased the second phase
of formalin test, showing an activity on the inflammatory pain. In the hot plate test LSL didn’t
show any effects. To evaluate the anti-inflammatory pain, we did a study based on the
anthihypernociceptive activity. Thus, LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) inhibited the
mechanical hypernociception induced by carrageenan and ovalbumin (immunized animals)
intraplantarly administration, but not induced by prostaglandin E
2.
(PGE
2
). This effect was
correlated to the block of neutrophil influx, suggested by the reduction of myeloperoxidase
(MPO) levels on animal’s paws pretreated with LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 15 minutes) and
stimulated with carregeenan. This antihyperalgesic effect seems to be highly dependent of
the cytokines (TNF-α and IL-1β) and chemokines (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]) level
decreasing, since LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) reduced these mediators’ levels on
animal’s paws pretreated with Cg (intraplantar). Corresponding to the possible central
activity, LSL (10 mg/kg; i.v.) did not alter the motor activity and not provoked depression on
animals. LSL acute toxicity was evaluated by treating the rats with LSL (10 mg/kg; i.v.) during
seven days analyzing several parameters of the animals: kidney functions (wet weight, urea
dosage), liver functions (wet weight, kinetic evaluation of aspartate aminotransferase and
alanine aminotransferase), heart (wet weight) stomach (wet weight and visual evaluation of
possible lesions), variation in body weight of treated animals and leukogram. The obtained
results didn’t show any alteration on the evaluated parameters suggesting that LSL doesn’t
show any toxicity on animals. In conclusion, the antinoceptive and antihyperalgesic activity of
LSL are associated to the inhibition of the neutrophil migration; it is probably a reflection of
an inhibition on cytokines and chemokines free flowing and for the increasing of NO free
flow. Additionally, this lectin doesn’t show acute toxicity and central effects.
XVII
20
INTRODUÇÃO
XVIII
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 RESPOSTA INFLAMATÓRIA
O termo inflamação ou flogose (do latim, inflamare e do grego phlogos,
que significa pegar fogo) retratam como os povos mais primitivos comparavam uma
região inflamada com algo relativo a chamas, quente ou ardido. Historicamente, as
quatro manifestações clínicas da inflamação (rubor, dor, calor e tumor) foram
descobertas por Cronelius Celsus no inicio da era cristã e o grego Virchow adicionou
o quinto sinal: a perda da função. Segundo Vilcek e Feldman (2004) a inflamação é
um conjunto de alterações (nos vasos sanguíneos, nos tecidos e nos fluidos
internos) provocadas por lesões, infecções, substâncias nocivas ou distúrbios
orgânicos e está estreitamente interligada ao processo de reparação.
Assim, a reação inflamatória consiste num evento complexo que envolve
o reconhecimento do agente/estímulo lesivo, para sua posterior destruição e
tentativa de reconstruir o tecido danificado. O reconhecimento desencadeia a
ativação e a amplificação do sistema imune resultando na ativação de células e na
liberação de diversos mediadores responsáveis pela resposta inflamatória. No
entanto, se a destruição do agente agressor e o processo de reparo não ocorrem de
maneira eficiente e sincronizada, a resposta inflamatória pode levar a uma lesão
tecidual persistente induzida pelo acúmulo de leucócitos, colágeno entre outras
substâncias que podem ser prejudiciais ao organismo (NATHAN, 2002).
O processo inflamatório é didaticamente dividido em dois momentos. O
primeiro que é desencadeado logo após a instalação do agente agressor
(inflamação aguda), sendo caracterizado por infiltrado predominantemente
neutrofílico, associado ao aumento de permeabilidade vascular com exsudação de
plasma e proteínas plasmáticas, edema, dor e necrose. O outro momento que
depende ou não da resolução do processo na fase aguda (inflamação crônica), é
caracterizado pela presença de macrófagos e linfócitos, além de angiogênese e
proliferação de tecido conjuntivo (BAUHMANN; GAUDIE, 1994).
O processo inflamatório compreende dois eventos que ocorrem
simultaneamente durante o curso evolutivo desta reação (eventos vasculares e
celulares).
22
1.1.1 Eventos vasculares
Microscopicamente a inflamação envolve uma série de eventos complexos
nos qual a mudança vascular é a que se inicia rapidamente e desenvolve-se durante
as primeiras horas. Mudanças vasculares são reguladas por fatores que controlam a
exsudação, as quais ocorrem principalmente nas vênulas pós-capilares. Esta fase
ocorre ou concomitantemente é desenvolvida em associação entre neutrófilos e o
endotélio nas vênulas pós-capilares, a qual contribui para uma fase mais prolongada
de aumento da permeabilidade vascular. O exsudato é absorvido para dentro dos
vasos linfáticos, aonde deslocam-se para os nódulos linfáticos ou tecido linfático
onde uma reação imune pode então ser iniciada (CIRINO et al.; 2003).
Inicialmente, ocorre uma vasoconstrição transitória seguida de
vasodilatação, que é responsável pelo aumento do fluxo sanguíneo, o que provoca
calor e eritema. Posteriormente, ocorre a estase sanguínea advinda do aumento de
permeabilidade da microvasculatura, uma vez que o extravasamento de líquidos e
proteínas para o interstício provoca hemoconcentação, aumentando a viscosidade
sanguínea e gerando o alentecimento da circulação. Esses eventos são
desencadeados por vários mediadores químicos, incluindo-se a bradicinina, a
serotonina, a histamina e as prostaglandinas da série E e da série I e óxido nítrico
(NO). Já foi demonstrado que o óxido nítrico (NO) é um dos EDRFs liberados pelas
células endoteliais (PALMER et al., 1988; MONCADA et al., 1991), que participa do
controle do fluxo sangüíneo (FORTES et al., 1994), da expressão de moléculas de
adesão e do aumento da permeabilidade vascular induzida pelo fator ativador de
plaquetas (PAF) e pela própria bradicinina (MAYHAN, 1992).
O aumento da permeabilidade vascular pode ocorrer por diferentes
mecanismos, dependendo dos receptores ativados na célula endotelial ou da lesão
provocada no vaso sanguíneo. Propõe-se que a histamina e leucotrienos causam
contração endotelial; interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
participam da reorganização citoesquelética endotelial; leucócitos ou agentes
agressores provocam lesão vascular direta e extravasamento de fluidos; fator de
crescimento endotelial vascular gera aumento da transcitose e neovascularização,
que também provoca extravasamento de fluidos. O exsudato contém vários
mediadores que influenciam as células adjacentes e os próprios vasos sanguíneos e
23
incluem os componentes de quatro cascatas enzimáticas do plasma: sistema do
complemento, sistema da coagulação, sistema fibrinolítico e sistema das cininas
(ROBBINS et al., 2005).
1.1.2 Eventos celulares
Uma maneira eficiente do hospedeiro defender-se contra agentes
agressores é através do infiltrado leucocitário, onde as células imunológicas
alcançam o foco da lesão e fagocitam, degradam e matam antígenos estranhos.
Muitas vezes, num processo inflamatório prolongado estas células imunes podem
agredir os próprios tecidos do hospedeiro, lesionando células normais. Além do que
o próprio infiltrado celular pode contribuir para a amplificação dos eventos
vasculares e celulares da resposta inflamatória, através da liberação de mediadores
vasoativos e quimiotáticos (BEVILACQUA et al., 1994; WEDMORE; WILLIAMS,
1981).
Diversas são as células envolvidas no processo inflamatório, algumas
células já estão presentes no tecido afetado, tais como: células endoteliais,
mastócitos e células mononucleares residentes. Enquanto outras como os leucócitos
polimorfonucleares (PMN) (neutrófilos, basófilos e eosinófilos) e mononucleares
(monócitos e linfócitos) migram para o local da lesão. Os leucócitos são atraídos
para a região afetada por um processo conhecido como quimiotaxia. Os macrófagos
residentes participam de vários eventos da inflamação são responsáveis pela
fagocitose do agente agressor, pela liberação de vários mediadores desencadeando
outros eventos inflamatórios como edema e dor (FERREIRA, 1980). Eles atuam na
iniciação da mobilização de neutrófilos em direção ao local agredido.
De um modo geral, a migração de leucócitos ocorre nas seguintes etapas:
1. marginação; 2. rolamento (adesão fraca); 3. adesão firme; 4. diapedese e 5.
quimiotaxia.
Após a quebra do fluxo laminar sanguíneo provocado pelos eventos
vasculares, os leucócitos começam a migrar para a região vascular periférica,
fenômeno chamado de marginação. Posteriormente, essas células interagem com
24
moléculas de adesão (selectinas, integrinas e imunoglobulinas), que são
extremamente importantes na modulação da migração, pois possibilitam uma
adesão do leucócito ao endotélio (McEVER,1991).
As selectinas têm sido extensivamente estudadas, são lectinas que
interagem com açúcares e/ou glicoproteínas, são responsáveis pela adesão de
leucócitos ao endotélio vascular na cascata precoce de eventos que levam aos
processos de inflamação. Elas são necessárias para a migração de leucócitos,
sendo o passo inicial na seqüência dos eventos que resultará no extravasamento
dos neutrófilos nos sítios de injúria. A interação das selectinas com seus ligantes
resulta num declínio dramático da velocidade dos neutrófilos, o que permite que as
proteínas conhecidas como integrinas promovam ligamentos firmes dos neutrófilos
com o endotélio. O processo de adesão do leucócito vascular se dá através dessas
proteínas. As moléculas de adesão conferem à célula um “endereçamento”. Elas
podem ancorar células em tecidos específicos ou "endereçar" células migrantes a
determinadas regiões do corpo. Estruturalmente, as selectinas apresentam, um
domínio lectínico (responsável pela sua propriedade adesiva) e uma série de
domínios semelhantes às proteínas do complemento (CRONSTEIN;
WEISSMAN,1993; ROSSITER et al., 1997).
Embora as lectinas endógenas (selectinas) estejam envolvidas no
processo de adesão, elas não são as únicas a participarem deste, pois outras
moléculas como as imunoglobulinas e as integrinas também contribuem para o
mesmo. No entanto, demonstrou-se que as selectinas estão principalmente
envolvidas com a fase de rolamento dos leucócitos (PANÉS et al., 1999).
Os três tipos de selectinas conhecidos foram denominados de acordo com
o tecido no qual eles foram identificados:
• As L-selectinas são encontradas nos leucócitos e são responsáveis pelo
endereçamento (i.e., homing) durante a interação com ligantes endoteliais
(KANSAS, 1996);
• As E-selectinas aparecem nas células endoteliais após terem sido ativadas por
citocinas inflamatórias, sendo que uma pequena quantidade encontrada em vários
leitos vasculares parecem ter significado importante para a migração dos leucócitos
(KANSAS, 1996) ;
25
As P-selectinas são armazenadas em alfa-grânulos das plaquetas e
corpos de Weibel-Palade (i.e., vesículas intracitoplasmáticas) das células
endoteliais, e são prontamente posicionadas na membrana plasmática após uma
estimulação específica (KANSAS, 1996).
Conforme já mencionado, o tipo de leucócito que migra varia com o
estímulo e com a fase do processo inflamatório (GRANGER; KUBES, 1994). Por
exemplo, na inflamação aguda, os neutrófilos polimorfonucleares predominam no
infiltrado leucocitário durante as primeiras 6-12 horas, sendo substituídos por
mononucleares entre 24 e 48 horas. Esta seqüência pode ser explicada pela
ativação de diferentes moléculas de adesão e fatores quimiotáticos específicos para
cada tipo celular.
À medida que o leucócito rola, as L-selectinas se despreendem e suas
integrinas são ativadas por pelo menos uma variedade de quimiocinas e citocinas
quimiotáticas associadas à superfície endotelial.
Após o rolamento, segue-se a adesão firme mediada por imunoglobulinas
e β-2 integrinas. Essas últimas são proteínas presentes na membrana dos leucócitos
e que podem ter sua expressão aumentada após a ativação destas células por
mediadores inflamatórios como o PAF ou outras citocinas. As ICAMs
(imunoglobulinas de adesão) são moléculas que estão presentes no endotélio,
sendo que as mais ligadas ao processo de migração são: ICAM-1 (Moléculas de
adesão intercelular-1), ICAM-2 (Moléculas de adesão intercelular-2), VCAM-1
(molécula de adesão vascular) e PCAM-1 (molécula de adesão de célula endotelial e
plaqueta). Mediadores inflamatórios liberados por células residentes ativadas podem
agir aumentando a avidez de ligação entre as moléculas de integrinas e
imunoglobulinas, favorecendo a adesão firme (CRONSTEIN; WEISSMAN, 1993;
PANÉS, 1999).
Após a firme fixação ocorre o achatamento da célula, reduzindo a
exposição às forças decorrentes do fluxo sangüíneo vascular, aumentando-se desta
forma a área de contato com a superfície endotelial vascular. Finalmente o leucócito
migra entre as células endoteliais da região apical para a superfície basolateral
(diapedese) em direção ao extravascular. Assim, após o extravasamento, os
leucócitos emigram nos tecidos em direção à região de agressão por um processo
26
denominado de quimiotaxia ou locomoção através de um gradiente químico. Esse
processo é controlado por agentes quimiotáticos, tanto de origem endógena, que
são aqueles liberados pelas próprias células do hospedeiro (componentes do
sistema complemento, produtos da lipoxigenase, citocinas etc.), quanto de origem
exógena, que são aqueles advindos do próprio agente agressor (produtos
bacterianos de origem lipídica) (RIBEIRO et al.,1991; 1996).
1.1.3 Mediadores inflamatórios
Os mediadores inflamatórias atuam nos vasos sanguíneos e células
inflamatórias modulando os principais eventos relacionados a inflamação:
vasodilatação, opsonização, quimiotaxia para células inflamatórias, destruição
tecidual e dor, como também febre e mal estar. Os mediadores da inflamação são
classificados como de origem plasmática (advindo das cascatas das cininas,
coagulação, fibrinólise e complemento) ou tecidual (aminas vasoativas,
eicosanóides, enzimas lisossomais, radicais livres derivados do oxigênio, fator
ativador de plaquetas, citocinas, quimiocinas, óxido nítrico e fatores de crescimento).
(LANSEN; HENSON, 1993; SIQUEIRA; DANTAS, 2000).
A histamina e a serotonina estão envolvidas na vasodilatação e aumento
da permeabilidade vascular no local da inflamação. A liberação de histamina pelos
mástocitos e basófilos é desencadeada por injuria tecidual, complexo antígeno-
anticorpo e pelo sistema do complemento (YOKOYAMA et al.; 1989). Segundo
Yokoyama e seus colaboradores (1989), o Sistema de cininas tem como função a
ativação das plaquetas e produção de bradicinina e calicreína. A bradicinina um
potente agente vasoativo, produz vasodilatação, causando dilatação induzindo a
liberação de fatores de óxido nítrico (NO), contração da musculatura lisa e produção
de dor. A Calicreína um agente quimiotático para neutrófilos. O Sistema do
complemento participa da resposta imune adaptativa, porém pode ser ativado por
uma via alternativa a partir de endotoxinas (lipossacarídeos de parede bacteriana) e
por outros sistemas de enzimas plasmáticas (cascata das calicreínas, cascata da
coagulação e cascata da fibrinólise). Tem função de opsonização de
microorganismos e promove a degranulação de mastócitos e age como fator
quimiotático de fagócitos.
27
As prostaglandinas originadas da conversão do ácido araquidônico
também agem como importantes substâncias vasodilatadoras. A liberação do ácido
araquidônico ocorre como conseqüência da estimulação específica de receptores da
superfície celular e da subseqüente ativação de fosfolipases do tipo A
2
. Vários tipos
de células liberam ácido araquidônico em resposta a diferentes estímulos tais como
bradicinina, angiotensina II, vasopressina, trombina, colágeno, adrenalina, ADP,
peptídios quimiotáticos e histamina (CARVALHO et al., 1996).
Duas grandes rotas do metabolismo em células de mamíferos
correspondem a via da ciclooxigenase e a via da lipoxigenase. A fosfolipase A
2
induz
liberação de ácido araquidônico, o qual pode ser substrato da ciclooxigenase
(responsável pela produção de prostanóides incluindo prostaglandinas e tromboxano
A
2
), e da 5-lipoxigenase (responsável pela produção de leucotrienos) (YOSHIKAI,
2001).
A via da ciclooxigenase conduz a geração de prostaglandinas que
incluem PGE
2
, PGD
2
, PGF
2α
, PGI
2
(prostaciclina) e tromboxano (TXA
2
), todos
derivados da ação de enzimas específicas (ROBBINS et al., 2005).
As prostaglandinas podem participar de reações alérgicas. Efeito
biológico de prostaglandinas produzido durante a reação de mastócitos em tecidos
incluem a modulação da musculatura lisa e contração, permeabilidade vascular,
sensação de prurido e dor e agregação plaquetária (WHITE, 1999).
Na via da lipoxigenase a 5-lipoxigenase é a enzima predominante dos
neutrófilos. O produto principal, a HETE, que é quimiotática para neutrófilos é
convertida em uma série de compostos conhecidos como leucotrienos. Dentre os
leucotrienos mais importantes está o LTB
4
, que causa aderência de neutrófilos ao
endotélio das vênulas pós-capilares, sendo também um potente agente quimiotático
para neutrófilos. O LTC
4
, LTD
4
e LTE
4
causam vasoconstrição, broncoespasmo e
aumento da permeabilidade vascular (SIQUEIRA; DANTAS, 2000).
Outra classe de mediador, as citocinas, são importantes substâncias
produtoras não só de inflamação, mas de uma grande variedade de efeitos
biológicos. Citocinas atuam através de mecanismos autócrinos e parácrinos, na
célula-alvo, ligam-se a receptores específicos e de alta afinidade, ativando-os; na
maioria dos casos, são supra-regulados na célula quando são estimulados. A
28
maioria das citocinas exerce ação em receptores ligados à quinase, que regulam
cascatas de fosforilação afetando assim sua expressão gênica (PHILIP et al., 2004).
As citocinas são classificadas em subgrupos, como: interleucinas, fatores
de crescimento, quimiocinas, interferons e fatores estimuladores de colônia ou ainda
podem ser classificadas conforme sua atividade biológica como, por exemplo: pró-
inflamatórias (IL-1, IL-6, TNFα e TGFβ) e antiinflamatórias (IL-1Ra, IL-4 e IL-10)
(CAVAILLON, 2001).
Segundo Robins et al. (2005), além de ações diretas sobre as células,
algumas citocinas induzem a formação de outras citocinas (formando uma cascata
de amplificação), enquanto algumas induzem a expressão dos receptores de outras
citocinas e também podendo apresentar interações sinérgicas ou antagônicas com
outras citocinas. A IL-6, por exemplo, é uma citocina multifatorial secretada por todas
as células quando lesadas ou ativadas por IL-1 e/ou TNF-α. De outro modo,
citocinas como a IL-4, IL-6, IL-10, IL-13 e IFN- α são eficientes em inibir in vitro a
síntese de IL-1 e TNF-α. As citocinas incluem peptídeos tanto pró-inflamatórios e
algogênicos, quanto antiinflamatórios e analgésicos.
O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que apresenta papel chave em
diversos processos, como a inflamação, imuno-modulação, crescimento,
angiogênese, citotoxidade e dor. Está bem descrito na literatura, a participação do
TNF-α no recrutamento de neutrófilos para o sítio inflamatório. Embora, o TNF-α não
seja considerado um fator quimiotático clássico, uma vez que não induz migração de
neutrófilos in vitro, este promove a síntese e liberação de fatores quimiotáticos,
como as quimiocinas, tanto pelas células endoteliais quanto pelas células
residentes, além de participar da expressão de moléculas de adesão, endoteliais e
da interação entre estas moléculas (selectinas, integrinas e imunoglobulinas)
(FACCIOLI et al., 1990).
Outra citocina importante na inflamação é a IL-1, com funções
semelhantes ao TNF-α, participando como mediador da resposta inflamatória do
hospedeiro frente a infecções e outros estímulos inflamatórios. A IL-1 possui duas
formas chamadas de IL-1α e IL-1β, com 30% de homologia entre elas,
compartilhando os mesmos receptores e ações biológicas. Em baixas concentrações
a IL-1 (ambas) age como um mediador local da inflamação, aumentando a
29
expressão de moléculas de adesão na superfície das células endoteliais. Em altas
concentrações a IL-1 (ambas) chega ao sistema circulatório e passa a exercer
efeitos endócrinos como febre e indução da síntese de proteínas plasmáticas de
fase aguda pelo fígado (FACCIOLI et al., 1990).
As quimiocinas são um grande grupo de proteínas (citocinas) que atuam
induzindo quimioatração de diversos tipo celulares (leucócitos, fibroblastos, células
neoplásicas, células pluripotentes sanguíneas). Até o momento já foram descritas
mais de 50 quimiocinas e 18 receptores para as mesmas, estas moléculas
pertencem a uma família de proteínas homólogas (60 a 80 aminoácidos) com pesos
moleculares variando de 7 a 15Kda (KAPP et al., 1994; ELSNER et al., 1996).
Os genes que codificam estas proteínas se encontram nos cromossomos
humanos 4 e 17. As quimiocinas são divididas em quatro sub-grupos, baseado no
número e posição dos resíduos de cisteínas presentes na proteína: CXC ou β-
quimiocinas (quando a quimiocina possui os dois primeiros resíduos de cisteínas
separados por um aminoácido simples); CC ou α-quimiocinas (quando a quimiocina
possui os dois primeiros resíduos de cisteína adjacentes); XC ou γ-quimiocinas
(quando a qumiocina perdeu um dos resíduos de cisteína); CX
3
C ou δ-quimiocinas
(quando a quimiocina possui os dois primeiros resíduos de cisteína separados por
três aminoácidos) (LUSTER, 1998; MURPHY, 2001; LIOTTA, 2001; KULBE et al.,
2004; ZOLTNIK, 2004; KAKINUMA; HWANG, 2006)
As duas maiores subfamílias de quimiocinas são as do grupo CXC e CC,
cujas atividades biológicas diferem quanto à capacidade de estimular diferentes
tipos de células efetoras. As quimiocinas CXC como a IL-8, o peptídeo ativador de
neutrófilos (NAP)-2, o fator plaquetário(PF)-4, o peptídeo ativador de neutrófilos
derivado de células epiteliais (ENA)-78, atraem preferencialmente neutrófilos para o
sítio inflamatório (FIGARELLA-BRANGER et al., 2003) enquanto que as quimiocinas
CC (α-quimiocinas) como a eotaxina, a citocina regulada sob ativação (RANTES)
que é expressa e secretada por células T normais e a proteína quimiotática para
monócitos (MCP)-4 ativam predominantemente eosinófilos, basófilos, linfócitos e
monócitos.
Considerando a capacidade destas quimiocinas em promover quimiotaxia
em outros tipos leucocitários, encontramos que quimiocinas CXC como as GRO-a, -
30
b e g. Quimiocinas pertencentes à classe XC e CX3C possuem maior seletividade
para linfócitos, monócitos, linfócitos T e células NK (“Natural Killer"). (KAPP et al.,
1994; ELSNER et al., 1996; ELSNER et al., 1998; PETERING et al., 1998; SYRBE;
SIEKEVE, 1999; KAPLAN, 2001; FIGARELLA-BRANGER et al., 2003).
Dentre as quimiocinas CXC em humanos, a IL-8 é considerada como uma
das mais importantes para quimiotaxia e ativação de neutrófilos. Além de ter sido
detectada em humanos, esta quimiocina também foi detectada em outras espécies
de animais tais como coelhos e cães, entretanto, não foi encontrada em roedores
como ratos e camundongos. Nesses animais, a CINC-1 em ratos e as quimiocinas
KC e MIP-2 em camundongos, apresentam acentuada homologia com a seqüência
de aminoácidos da IL-8 e das GRO humanas. Com relação aos camundongos,
trabalhos demonstram que as quimiocinas KC e MIP-2 apresentam potente atividade
quimiotática tanto em modelos experimentais in vivo como in vitro (FIGARELLA-
BRANGER et al., 2003).
Uma importante característica encontrada particularmente na família das
quimiocinas CXC é a presença da seqüência de três aminoácidos (glutamato-
leucina-arginina; ELR) localizados próximo ao N-terminal, precedendo a primeira
cisteína. A presença desta seqüência (“motif”) parece estar intimamente relacionada
com a especificidade quimiotática sobre neutrófilos. Entre as quimiocinas CXC-ELR+
destacam-se a IL-8, o grupo das GRO, o ENA-78, o GCP-2, MIP-2, KC entre outras
(ROLLINS, 1997; LAING; SECOMBES, 2004).
Muitas destas quimiocinas ao interagirem com receptores acoplados a
proteína G produzem reorganização do citoesqueleto, firme adesão com células
endoteliais e migração direcional. Acredita-se que estas proteínas agem
coordenadamente com proteínas de superfície celular (integrinas) direcionando as
células para sítios anatômicos específicos (MURPHY, 2001; LIOTTA, 2001; KULBE
et al., 2004).
Apesar de um grande número de citocinas atuar amplificando a
inflamação e a dor, existem citocinas que agem modulando negativamente estes
processos, desta forma, estas citocinas (antiinflamtórias e inibidoras de hiperalgesia)
servem como agentes que equilíbrio durante o desenvolvimento de respotas
31
nocivas. Dentres estas citam-se: IL1-4; IL-6; IL-10; IL-13, TGF-β; INF-γ
(CAVAILLON, 2001).
O óxido nítrico (NO) é um mediador inflamatório bastante versátil,
apresentando efeitos pró e antiinflamatórios. O NO é um radical livre formado
endogenamente por uma família de enzimas, óxido nítrico sintases (NOS)
(EISERICH et al., 1998), através da conversão de L-arginina em L-citrulina. Nos
líquidos orgânicos, o NO produzido se oxida produzindo ânions nitrito (NO
2
-
) e nitrato
(NO
3
-
), sequencialmente (IGNARRO et al., 1987, MONCADA et al., 1991). Foram
identificadas três diferentes isoformas de NOS em células de mamíferos (produtos
de diferentes genes): NOS endotelial (eNOS ou NOS III) encontrada em células
endoteliais, epiteliais e miócitos cardíacos; NOS neuronal (nNOS ou NOS I)
encontrada em neurônios, células musculares esqueléticas e neutrófilos
(GREENBERG, et al., 1998) e a NOS induzida (iNOS ou NOS II), encontrada em
macrófagos, hepatócitos, células musculares lisas (TITHERADGE,1999).
A eNOS e nNOS são classificadas como enzimas constitutivas e
dependentes de cálcio, enquanto que a iNOS é classificada como uma enzima
induzida, cujas ações independem de cálcio. A ativação de todas as enzimas NOS
necessita dos seguintes cofatores: calmodulina, flavina adenina dinucleotídeo (FAD),
flavina adenina mononucleotídeo (FMN), tetrahidrobiopterina (THB4) e nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) (TITHERADGE, 1999).
O óxido nítrico tem efeitos disseminados em repostas fisiológicas e
inflamatória. Nas células endoteliais, o NO produzido, difunde-se rapidamente para
fora das células de origem para as células musculares lisas subjacentes,
provocando relaxamento e, conseqüentemente, vasodilatação (IGNARO et al., 1987;
PALMER et al., 1988). A vasodilatação que ocorre no processo inflamatório,
induzida por diferentes agentes flogísticos (bradicinina, histamina, substância P,
serotonina e trombina), é dependente da liberação de óxido nítrico (SICKER et al.,
2001; STOWE et al., 2001; KARABUCAK et al., 2005; WOTHERSPOON et al., 2005;
YOUSIF, 2005).
Além de promover o relaxamento da musculatura lisa, o NO desempenha
outros papéis importantes na inflamação. Reduz a agregação e adesão plaquetária,
é citotóxico para determinados microorganismos e células tumorais (ROBBINS et al.,
32
2005). Células endotelias produzem e liberam NO, após a estimulação por citocinas
como MCP-1, IL-6, M-CSF, ICAM-1 e VCAM-1 (TEDGUI; MALLAT, 2001).
A expressão de NOSi é regulada via fator de transcrição nuclear, dentre
eles cita-se o fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) (ALDERTON et al., 2001).
Esta enzima pode ser induzida em células como macrófagos, células endoteliais,
células da musculatura lisa vascular e miócitos cardíacos, após estímulo por LPS,
citocinas (IL-1β, TNFα, IFN-γ, IL-6), entre outros (CHAN; FISCUS, 2004).
1.2 DOR E NOCICEPÇÃO
A palavra dor representa uma categoria de fenômenos que compreende
uma diversidade de experiências diferentes e únicas, tendo causas diversas e
caracterizadas por qualidades distintas, variando com um certo número de critérios:
somatosensoriais, viscerais, afetivos, culturais e cognitivos. Pelo fato de ser a dor
uma sensação íntima e pessoal, é impossível conhecer com exatidão a dor do outro.
Assim, pela diversidade das experiências dolorosas, explica-se porque tem sido
muito difícil, até hoje, encontrar uma definição definitiva e satisfatória da dor
(MELZAC; LOESER, 1999; RAINVILLE, 2002; ALMEIDA et al., 2004).
Apesar de ser uma reação complexa e de difícil definição, o conceito
desta enfermidade vem evoluindo ao longo dos anos, e as grandes entidades de
estudos com dor tentam criar conceitos cada vez mais completos e abrangentes. A
Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP), definia dor em 1979 como uma
experiência sensorial e emocional desagradável, associada o dano tecidual real ou
potencial ou mesmo a nenhuma lesão, embora ainda assim descrita como termos
sugestivos de que o dano tecidual tivesse de fato ocorrido. A mesma entidade
reformulou o conceito que é aceito atualmente, e postula que a dor é uma
experiência sensorial e emocional desagradável, associada o dano tecidual real ou
potencial, ou descrita em termo de tal lesão (MELZAC; LOESER, 1999; RAINVILLE,
2002; ALMEIDA et al., 2004).
A dor é um sintoma de muitas desordens clínicas e afeta grande parte da
população, estudos demonstram que a dor afeta os mais variados domínios da
33
qualidade de vida humana, desde os físicos até os emocionais. O efeito da dor está
relacionado com características individuais como: intensidade, extensão, duração,
significado dentre outros fatores. (BESSON; DICKENSON, 1997; NIV; KREITLER,
2001).
Apesar de ter sido considerado desde a antiguidade uma das grandes
preocupações do ser humano, a dor é uma característica cardinal dos mecanismos
protetores fisiológicos normais e uma das suas funções é preservar o organismo,
evitando o dano tecidual. O sistema nervoso informa sobre a ocorrência ou perigo de
injúria, e a sensação de dor contribui para esta função, estando portanto relacionado
as reações de fuga e esquiva (BESSON; DICKENSON, 1997; RIEDEL; NEECK,
2001).
1.2.1 Classificação dos diferentes tipos de dor
Em termos temporais a dor pode ser classificada como (GRAEFF, 1984;
TEIXEIRA; PIMENTA, 1994):
1) Aguda: tem função de alerta e caracteriza-se pela combinação de lesão
tecidual, dor e ansiedade. Possui lapso de tempo muito curto, entre o
afrontamento com a causa do ferimento e a preparação para o
restabelecimento, geralmente, está associada com uma lesão identificável e
desaparece após resolução deste processo patológico.
2) Crônica: É de longa duração e persiste mesmo após o tempo de cura da
lesão, algumas vezes pode estar associada a uma lesão crônica que causa
dor contínua e recorrente ou ainda pode estar associada a fatores ambientais
e psicopatológicos. Geralmente, conduz a estresse, debilidade, alterações de
sono, humor e apetite, podendo também gerar depressão profunda. Esta
alteração nem sempre é associada à lesão evidente.
Quanto à fisiopatologia a dor também pode ser classificada em (RANG et al., 2003):
34
1) Nociceptiva – ocorre quando existe um traumatismo nos receptores
nociceptivos, devido a alterações na sua estrutura anátomo-funcional com
liberação de substâncias algogênicas nos tecidos.
2) Neurogênica – é aquela que ocorre com o dano diretamente sobre as
inervações.
3) Neuropática – resultante do processamento somatossensorial anormal ao
nível periférico ou central, como, por exemplo, a dor do membro fantasma.
4) Inflamatória – caracterizada pela sensibilização dos neurônios produzida
pela ativação da cascata de citocinas, as quais são substâncias de natureza
peptídica, liberadas no tecido inflamatório e de células do sistema
imunobiológico.
5) Dor psicogênica – é aquela que não possui causa orgânica, mas se
expressa em conseqüências de problemas psicológicos (MENEZES, 1999).
1.2.2 Fisiopatologia da dor
A transmissão da dor está associada à atividade elétrica nas fibras
nervosas aferentes primárias, que possuem terminações livres no tecido periférico
(pele, músculos, articulações, vísceras, conjuntivo dentre outros) (RANG et al., 1991;
JULIUS; BASBAUM, 2001)
Estas terminações nervosas livres são receptores sensoriais
especializados chamados de nociceptores (ativados por estímulos nocivos). Estes
receptores possuem alto limiar de ativação sendo então ativados por estímulos
intensos que são danosos ou potencialmente danosos aos tecidos, e, portanto não
são recrutados em estímulos inócuos (CAILLIET, 1993; DJOUHRI; LAWSON, 2004).
Estes receptores sensoriais são representados por terminações livres de
fibras mielínicas delgadas (fibras do tipo Aδ ou tipo III) e fibras nervosas amielínicas
(fibras tipo C ou tipo IV). As fibras Aδ conduzem sinais de forma rápida (dor aguda e
rápida), enquanto que as fibras tipo C apresentam condução lenta destes impulsos
(dor lenta; queimação), onde esta última respondem a uma ampla variedade de
estímulos (mecânicos, químicos, térmicos e isquêmicos), sendo portanto também
35
denominados de nociceptores polimodais (NESS; GEBHART, 1990; GUYTON;
HALL, 1997; RAJA et al., 1999).
Sugere-se ainda que além dos nociceptores polimodais, um grupo
adicional denominado de nociceptores “silenciosos” (silent nociceptors) encontrados
em articulações e vísceras são ativados durante estímulos químicos (processos
inflamatórios) e térmicos, o que os torna responsivos até a estímulos
somatosensoriais inócuos (RAJA, 1999; CERVERO, 2002; PORTO, 2004).
As fibras Aβ mielinizadas de grande diâmetro respondem aos estímulos
inócuos (táteis, térmicos e proprioceptivos). Estas fibras apesar de não detectarem
estímulos nocivos; são capazes de modular a percepção da dor pelos nociceptores
(JULIUS; BASBAUM, 2001; BASBAUM; JESSELL, 2003).
A estimulação dos nociceptores periféricos faz com que a informação
nociceptiva seja levada através das fibras aferentes ao SNC. Os longos axônios das
fibras nociceptivas que se localizam em nervos periféricos estendem-se de seus
corpos celulares contidos em uma estrutura denominada gânglio da raiz dorsal.
Após emergir de seu corpo celular, o axônio aferente primário bifurca-se para enviar
prolongamentos à medula espinhal e outro para inervar os tecidos corporais
(MILLAN, 1999).
Na medula espinhal o corno dorsal é dividido em lâminas de acordo com
as características citológicas dos neurônios e da divisão anatômica. A lâmina I
contém neurônios que respondem a estímulos nocivos, a lâmina II é formada por
interneurônios (excitatórios e inibitórios), a lâmina III e IV recebem aferências não
nociceptivas das fibra Aβ e a lâmina V recebe aferências das fibras Aβ, Aδ e C e de
estruturas não viscerais (BASBAUM; JESSELL, 2003) .
A transmissão sináptica entre os neurônios aferentes primários e os
neurônios do corno dorsal da medula espinhal é mediada, principalmente, pelo
glutamato atuando em receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) e AMPA (α-amino-3-
hidroxil-5-metil-4-isoxazoil ácido propiônico), além disso, diversas outras substâncias
podem modular a transmissão na medula (ATP, prostaglandinas, substância P)
(DOUBELL et al., 1999).
Na medula, a transmissão dos sinais dolorosos após a liberação dos
neurotransmissores envolve a participação de canais iônicos que quando modulados
36
geram correntes que despolarizam ou hiperpolarizam a membrana celular dos
neurônios causando excitação ou inibição neuronal, assim facilitando ou dificultando
a passagem do impulso para as vias ascendentes medulares (ALTIER; ZAMPONI,
2004). Os principais canais envolvidos nesses efeitos são os canais de sódio, os
canais de cálcio operados por voltagem e os canais de potássio (LEE et al., 2005).
Os neurônios do corno dorsal originam dois grupos de vias nociceptivas
ascendentes. A via do grupo lateral: formada pelos tratos neoespinotalâmico,
neotrigeminotalâmico, espinocervicotalâmico e sistema pós-sináptico da coluna
dorsal, e a via do grupo medial: formada pelos tratos paleoespinotalâmico,
paleotrigeminotalâmico, espinoreticular e espinomesencefálico. Todas essas vias
convergem para o tálamo, que é capaz de receber e integrar parcialmente estas
informações dolorosas e enviá-las para o córtex somatosensorial, que junto com o
giro cingular (sistema límbico) e o córtex insular (sistema autonômico) processam a
informação nociceptiva (MACHADO, 1988; CRAIG; DOSTROVSKY, 1999;
BASBAUM; JESSELL, 2003).
1.2.3 Sistemas modulatórios da dor
A dor pode ser controlada por mecanismos centrais, uma vez que o
sistema nervoso possui circuitos modulatórios que modificam a percepção da dor. O
local principal desta modulação é a medula espinhal, onde a interconexão entre vias
nociceptivas e não-nociceptivas podem controlar a transmissão da informação
nociceptiva para os centros supra-espinhais (BASBAUM; JESSELL, 2003).
Em 1965, Melzac e Wall hipotetizaram a teoria da comporta, na qual
sugeriram que a inibição pré-sináptica das vias nociceptivas na medula pode ser
feita por interneurônios inibitórios presentes na substância gelatinosa do corno
dorsal da medula espinhal. A ativação destes neurônios geraria potenciais negativos
nas raízes sensoriais dificultando o aparecimento de potenciais nociceptivos
capazes de serem transmitidos para o corno dorsal da medula espinhal.
Estruturas encefálicas também participam da analgesia, uma vez que a
estimulação de regiões como a substância cinzenta periaquedutal produz analgesia
profunda e seletiva sem comprometer outras formas de sensibilidade. A substância
37
cinzenta periaquedutal recebe aferências de diversas regiões (hipotálamo, córtex
frontal e insular, amígdala, núcelo cuneiforme, locus ceruleus, tálamo, formação
reticular e corno dorsal da medula espinhal), e ao ser estimulada ativa seus
neurônios (ricos em encefalina, substância P e GABA-ácido γ-aminobutírico) que se
projetam para o bulbo ventromedial dorsal (núcleo magno da rafe e formação
reticular) onde neurônios descendentes ricos em serotonina e encefalinas inibem a
transmissão nociceptiva (BEHBEHANI; FIELDS, 1979; URBAN; SHIMIT, 1994;
VANEGAS; SCHAIBLE, 2004).
Além disso, neurônios noradrenérgicos do locus ceruleos e de outros
núcleos bulbares e ponte bloqueiam os neurônios eferentes das lâminas I e V por
ações indiretas e diretas, e estes mecanismos também interagem com circuitos
opióides endógenos existentes no corno dorsal da medula espinhal (BASBAUM;
JESSELL, 2003).
Desta forma, o corno dorsal da medula espinhal é o local onde estes
neurônios eferentes serotoninérgicos e/ou noradrenérgicos fazem sinapses com os
neurônios de projeção e interneurônios inibitórios encefalinérgicos, ainda nesta
região a ativação de interneurônios inibitórios gabaérgicos inibe a liberação de
neurotrasmissores nociceptivos excitatórios (glutamato, substância P, peptídeo
relacionado ao gene da calcitonina) por neurônios de projeção (MALCANGIO;
BOWERY, 1996).
Estes circuitos modulatórios são complexos e inúmeros, e além dos
neurotransmissores já citados, agonistas de receptores D2 dopaminérgicos, de
receptores serotoninérgicos 5-HT
1A
e de receptores muscarínicos M
2
e M
4
também
estão envolvidos na modulação inibitória das vias ascendentes da transmissão
nociceptiva (GAO et al., 2001; MA et al., 2001).
Adicionalmente, a lesão tecidual ou nervosa acarreta a ativação de fibras
aferentes primárias que aumentam a sensibilidade dos neurônios espinhais,
desenvolvendo um fenômeno chamado de sensibilização central. Esta sensibilização
resulta a ativação de vias intracelulares neuronais mediadas por proteína quinase C
(PKC) e/ou tirosinas quinases, que atuam fosforilando e aumentando a atividade dos
receptores NMDA, assim facilitando a transmissão sináptica (DOUBELL et al., 1999).
Em geral, a sensibilização central persiste até o término do estímulo nociceptivo
38
periférico, entretanto em alguns casos este processo pode se prolongar mesmo
após o desaparecimento deste estímulo nociceptivo (DWORKIN et al., 2003).
O fenômeno de sensibilização central juntamente com o de sensibilização
periférica medeia os processos de hiperalgesia e alodínia (TREEDE et al., 1992). A
hiperalgesia é a resposta excessiva a estímulos nocivos, enquanto que a alodinía é
a resposta nociceptiva a estímulos não nocivos (KIDD; URBAN, 2001). Além da
sensibilização central, a sensibilização periférica contribui bastante para estas
alterações. O processo inflamatório é o principal responsável pela sensibilização
periférica, pois a liberação de diversos mediadores inflamatórios interfere na
atividade das fibras sensoriais aferentes (ativando diretamente o nociceptor ou
reduzindo o seu limiar de ativação),
1.2.4 Dor inflamatória
Diversos mediadores químicos são liberados por células não neuronais e
neuronais no local da injúria (substância algogênicas) e surgem em decorrência de
processos inflamatórios traumáticos ou isquêmicos. Estes mediadores não
neuronais são comumente histamina, serotonina, bradicinina, citocinas,
eicosanóides dentre outros, já os mediadores neuronais são principalmente a
substância P (SP) e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGPR), sendo
estes mediadores neuronais liberados do pericário (corpo celular) para a periferia.
Dependendo da natureza e concentração do mediador ele pode ativar diretamente o
nociceptor e/ou reduzir seu limiar de ativação. As fibras mais associadas a este tipo
de ativação são as fibras polimodais do tipo C e os nociceptores “silenciosos”
(DAVIS et al., 1989; HANDWERKER et al., 1989; MCMAHON; KOLTZENBURG,
1990; FERREIRA 1993a).
Neste contexto as células residentes (principalmente macrófagos e
mastócitos) parecem ter papel primordial neste processo, pois estas células
sinalizam a presença de injúria ou material estranho, através da liberação de
variados mediadores inflamatórios, que além de atuar no nociceptor, recrutam
células inflamatórias (polimorfonucleares, linfócitos) que produzem um efeito
amplificador na inflamação e nocicepção (FERREIRA 1993a).
39
1.2.5 Mediadores com ação nos nociceptores
Dentre os mediadores algogênicos diretos (estimulam diretamente o
nociceptor) a bradicinina apresenta efeitos bastante versáteis, além de atuar
diretamente nos nociceptores, também apresenta efeitos hiperalgésicos. Existem
quatro subtipos de receptores de bradicinina (BK1-BK4). Os receptores BK2 foram
associados a ativação direta das fibras aferentes, além da estimulação da síntese de
uma cascata de citocinas capazes de gerar a produção de mediadores
hiperalgésicos (prostaglandinas e aminas simpatomiméticas) (FERREIRA et al.,
1993b). Os receptores BK1 parecem estar associados com a ativação direta do
nociceptor, porém estes receptores parecem ser capazes de interagir com os
receptores BK2 (TONUSSI; FERREIRA, 1997.)
A histamina encontrada, principalmente, no interior de mastócitos parece
atuar diretamente no noiciceptor induzindo sensação de dor e prurido (FERREIRA et
al., 1990). Adicionalmente, outros mediadores são capazes de atuar diretamente no
nociceptor tais como: ATP (adenosina trifosfato), serotonina, substância P e prótons
(RANG et al., 1991).
Outros mediadores porém podem alterar o potencial de repouso destes
neurônios periféricos facilitando a formação de um potencial de ação por outros
estímulos, sendo chamados de mediadores hiperalgésicos.
As substâncias hiperalgésicas parecem ser capazes de aumentar a
concentração intracelular de AMPc e Ca
++
gerando uma redução no limiar de
ativação das fibras nociceptivas periféricas. Assim, prostaglandinas e aminas
simpatomiméticas (dopamina e noradrenalina) atuam através deste mecanismo. Isso
foi justificado por estudos que demonstram que a administração de prostaglandinas
ou agonistas adrenérgicos produzem efeito hiperalgésico, e que a administração de
antagonistas destas substâncias diminuem este efeito (FERREIRA 1972;
WEISENFELD-HALLIN; HALLIN, 1984; FOLLENFANT et al., 1990).
Além disso, substâncias capazes de induzir a formação de
prostaglandinas e aminas simpatomiméticas (IL-1; IL-8; TNF-α) podem ser também
considerados mediadores hiperalgésicos. (NAKAMURA; FERREIRA 1987;
40
FERREIRA et al. 1978a; FERREIRA et al., 1993a). TNF-α é capaz de induzir a
síntese de IL-1, IL-6 e IL-8, estas citocinas por sua vez induzem a síntese de
mediadores hiperalgésicos como prostaglandinas e aminas simpatomiméticas
(CUNHA et al., 1991; 1992; DUARTE et al.,1988; THOMAZZI, 1996). TNF-α e IL-1
também induzem a síntese e secreção de quimiocinas e citocinas, provocando
indiretamente a migração de neutrófilos para o foco inflamatório e algogênico.
Adicionalmente, IL-1 induz diretamente a produção dos mediadores hiperalgésicos já
citados (prostaglandinas e aminas simpatomiméticas) (FACCIOLI et al., 1990;
PERRETTI; FLOWER, 1993)
O óxido nítrico também apresenta atividades significantes na nocicepção,
a estimulação da guanilato ciclase com aumento da produção de GMP
c
(guanosina
monofosfato cíclico) parece ser capaz de produzir dessensibilização dos
nociceptores, e a descoberta da via L-arginina/Oxido nítrico/GMP
c
estimulou a
investigação da participação do óxido nítrico como substância antinociceptiva
(FERREIRA et al., 1991).
Os dados a respeito da ação do óxido nítrico na atividade nociceptiva são
bem contraditórios, foi demonstrado que inibidores de NOS como o L-NAME (L-nitro
arginina metil éster) produz efeitos antinociceptivos centrais e periféricos (MOORE et
al., 1991; ROCHA, 2002). Entretanto outros estudos tem demonstrado que o óxido
nítrico é um modulador negativo da resposta nociceptiva, e que a administração de
NO causa analgesia acompanhada de aumento na produção de GMP
c
nos
neurônios sensoriais periféricos primários (FERREIRA et al., 1991; DUARTE et al.,
1992). Ferreira et al. (1999) demonstraram que a administração de doadores de
óxido nítrico bloqueia a hiperalgesia induzida por PGE
2
, e esse efeito é revertido por
L-NAME (L-nitro arginina metil éster) e azul de metileno (inibidor de guanilato
ciclase). Ferreira et al. (1991) proporam ainda que opióides e analgésicos periféricos
como dipirona e diclofenaco causam analgesia por estimular a via L-arginina/óxido
nítrico/ GMP
c
.
Assim, diversos mediadores do processo inflamatório apresentam
atividades diferenciadas e complexas nos nociceptores, isso implica em uma grande
interação entre o processo inflamatório e a dor, além de justificar a pesquisa de
substâncias antiinflamatórias em processos algogênicos.
41
1.3 LECTINAS
Carboidratos agem como intermediários na comunicação celular em
vários sistemas biológicos e podem influenciar fenômenos de diferenciação,
proliferação e interações entre células em condições fisiológicas e patológicas. As
informações presentes na estrutura dos oligossacarídeos conjugados a proteínas ou
lipídios na superfície das células são reconhecidas por um grupo especializado de
proteínas, denominadas lectinas (SANZ-APARICIO et al., 1997).
Os carboidratos apresentam grande versatilidade de ligação, inclusive
com outras moléculas de natureza distinta (lipídios, proteínas, grupos funcionais,
como fosfato, sulfato, acetil). Esta capacidade de ligação permitiu estas estruturas
originarem uma grande variedade de moléculas, fazendo com que este grupo de
biomoléculas desenvolvessem capacidade de codificar diversos processos celulares
(SCHMIDT, 1987). As lectinas são capazes de se ligar e reconhecer a informação
contida nestas moléculas, modulando desta forma diversos processos biológicos nas
mais diferentes espécies (LAINE 1994; BREWER et al., 2002).
Atividades biológicas lectinas foram descritas por Stillmark (1988), que
observou a aglutinação de hemácias quando estudava o efeito tóxico de extratos de
semente de mamona (Ricinus communis) sobre o sangue, sendo que
posteriormente se confirmou que o material responsável pela hemaglutinação era
uma proteína, a qual foi chamada posteriormente de ricina. Atualmente, se sabe que
a ricina é na verdade uma complexa mistura de moléculas tóxicas e lectinas não-
tóxicas.
Estas proteínas têm sido encontradas em larga escala, em uma variedade
de formas de vida – microrganismos, mamíferos e vegetais - sendo que aquelas
encontradas nos vegetais superiores têm sido as mais estudadas (OTTENSOOSER
et al, 1974).
42
1.3.1 Lectinas: Definição e Classificação
O termo lectina é derivado da palavra, do latim, “legere” que significa
capaciade de escolher. Este termo foi sugerido por lembrar o aspecto seletivo de
ligação dessas proteínas aos eritrócitos humanos (BOYD; SHAPLEIGH, 1954).
Atualmente, o conceito mais aceito para lectinas é proposto por Peumans
e Van Damme (1995), na qual lectinas são (glico) proteínas de origem não imune
que possuem no mínimo um domínio não-catalítico e que se ligam reversivelmente e
especificamente a um mono ou a um oligossacarídeo. Essa ligação a resíduos de
carboidratos pode ser de alta especificidade sem, contudo alterar a estrutura
química dos ligantes (GRANJEIRO, 1996).
Outros autores como Sharon e Lis (1972) definiram lectinas, como sendo
proteínas aglutinadoras de células com especificidade de reconhecimento por
carboidratos. Ainda, Goldstein et al (1980) confirmou esse conceito, e acresentou
que lectinas são proteínas/glicoproteínas de origem não imune com especificidade
de ligação a carboidratos, e capazes de aglutinar células e/ ou precipitar
glicoconjugados.
O termo que classifica as lectinas como proteínas de origem não imune
distingue as lectinas de anticorpos anti-carboidratos que também são capazes de
aglutinar células. Enquanto, as lectinas diferem em vários aspectos como a
composição e seqüência de aminoácidos, peso molecular, requerimento de metais e
estrutura tridimensional, os anticorpos são estruturalmente similares a estas estas
lectinas, porém sem estes aspectos. Além disso, as lectinas também são
encontradas em plantas e bactérias, que não possuem sistema imune (MOREIRA et
al., 1991).
Peumans e Van Damme (1995), além de propor uma definição para as
lectinas, lançaram a classificação atualmente aceita para essas proteínas, de acordo
com seus sítios de atividade biológica, dividindo-as em três grupos: Merolectinas,
Hololectinas e Quimerolectinas.
As merolectinas são biomoléculas que apresentam apenas um domínio
lectínico, sendo assim incapazes de aglutinar células ou precipitar glicoconjugados.
43
Como representantes dessa classe tem-se as lectinas de orquídea, específicas para
manose.
As hololectinas são proteínas que apresentam mais de um sítio de ligação
para carboidratos, estando aptas a aglutinar células ou precipitar conjugados, tendo
como representante a maioria das lectinas vegetais.
As quimerolectinas são lectinas que possuem um ou mais sítios de
ligação a carboidratos, além de possuir outro sítio não lectínico com atividade
biológica. As proteínas inativadoras de ribossomos tipo 2 (RIPs) e as quitinases
podem ser citadas como exemplos dessa classe.
Posteriormente, Peumans e Van Damme (1998) adicionaram a essa
classificação o conceito de Superlectina. Esse termo é reservado a algumas lectinas,
como a lectina de tulipa que apresenta dois ou mais sítios lectínicos, porém com
especificidades a carboidratos diferentes.
1.3.2 Efeitos biológicos de lectinas vegetais
Acredita-se que uma das principais funções de lectinas vegetais seja, em
condições normais, a estocagem de proteínas, transporte de carboidratos e
prováveis funções de defesa contra agressores exógenos. Quando algumas lectinas
são ingeridas podem causar no trato gastrintestinal sensações de náusea, vômitos,
processos alérgicos e inflamatórios, fazendo com que possíveis predadores evite
ingerí-las. Algumas lectinas também apresentam efeitos inseticidas e inibidor do
desenvolvimento de larvas (MURDOCK et al., 1990).
Classicamente, lectinas são utilizadas em estudos como a “tipificação” de
eritrócitos, carreamento de agentes quimioterapêuticos para células tumorais
específica, agentes mitógenos. Essas biomoléculas possuem capacidade de
aglutinar eritrócitos, linfócitos, fibroblastos, espermatozóides, fungos, bactérias e
células vegetais (GOLDSTEIN et al., 1980).
Carboidratos, glicoconjugados e lectinas são de fundamental importância
para a adesão, colonização e patogênese em diversos processos celulares
(bactérias, células cancerígenas). Desta forma, Beuth et al. (1995) conseguiram
inibir a adesão de Streptococcus pneumoniae em pulmão de camundongos com a
44
administração de Glc-Nac. Shlyakhovenko et al. (1995) sugeriram que lectinas
promovem adesão de células tumorais a tecidos alvos e favorecem metástases.
Posteriormente, Alguns autores também demonstraram atividade anti-tumoral
(ANDRADE et al., 2004) e indução de apoptose em células tumorais por lectinas
vegetais (HOSTANSKA et al., 2003).
Com relação à atividade imunoestimulante e pró-inflamatória lectinas
estão associadas com diversas atividades: mitose em linfócitos humanos e indução
de produção de interferon-γ (BARRAL-NETO et al., 1992; MACIEL et al., 2004);
liberação de histamina por mastócitos peritoneais de ratos (GOMES et al., 1994); e
migração de leucócitos e formação de edema de pata (ALENCAR et al., 2003, 2004,
2007; ALENCAR et al., 2005b, 2005c, 2005d), e produção de óxido nítrico por
células peritoneais murinas e por tecido obtido de aortas de ratos isoladas in vitro
(KLEHA et al., 1991; ANDRADE 1999; LIMA et al., 2004; GADELHA et al., 2005).
Apesar do bem comprovado potencial pró-inflamatório, resultante da
administração local de lectinas, nosso grupo já demonstrou que, lectinas vegetais
administradas endovenosamente apresentam potente ação antiinflamatória
(ASSREUY et al., 1997, ALENCAR et al., 1999, 2005a; MOTA et al., 2006; SANTI-
GADELHA et al., 2006). Além da inibição de eventos inflamatórios agudos,
demonstrou-se ainda que estas lectinas previnem a lesão urotelial no modelo de
cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida em camundongos (ASSREUY et al.,
1999).
No tocante a nocicepção, poucos trabalhos têm relacionado efeitos
antinociceptivos de lectinas. Somado a isso, estes trabalhos são realizados com
lectinas de algas. Recentemente, Neves et al. (2007) demonstraram atividade
antinociceptiva em camundongos de uma lectina de alga de Amansia multifida
administrada por via intraperitonial e oral em modelos de ácido acético, formalina e
placa quente, este efeito parece ser mediado, parcialmente, pelo sistema opióide.
Atualmente, Bitencourt et al. (2008) demonstraram efeitos antinociceptivos e
antiinflamatórios de uma lectina de alga vermelha Hypnea cervicornis nos mesmos
modelos (contorções induzidas por ácido acético, teste da formalina e teste da placa
quente), e este efeito parece estar envolvido com a redução da migração de
neutrófilos para o sítio da injúria.
45
1.3.3 Lonchocarpus sericeus
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth é uma angiosperma dicotiledônea
(figura 1) da subclasse Archichlamydeae que pertence à ordem Rosales e à família
Leguminosae papilionaceae (EVANS, 2002). A família Leguminosae é a segunda
maior família de plantas floríferas, possuindo cerca de 600 gêneros e 12.000
espécies. Esta família é dividida em três subfamílias: Mimosoideae, Caesalpinoideae
e Papilionaceae, contendo, respectivamente, cerca de 40, 133 e 377 gêneros
(EVANS, 2002). Sua distribuição é bastante ampla nas zonas tropicais e
subtropicais, estendendo-se ainda às regiões temperadas. Contudo, sua maior
diversidade encontra-se nos trópicos americanos e africanos (MARTINS DE SOUSA,
2003).
A
46
Figura 1 – Foto de um espécimen de Lonchocarpus sericeus (a). Destaque para frutos (b) e
inflorescências (c).
No Brasil, L. sericeus (Poir.) Kunth é encontrada no norte (Pará); nordeste
(Alagoas, Paraíba, Ceará, Bahia, Maranhão, Pernambuco, Piauí); centro-oeste
(Goiás e Mato-grosso); sudeste (Espírito Santo e Rio de Janeiro). Além disso, é
encontrada na África, América central, Ásia, Austrália, Colômbia e Caribe
(AZEVEDO-TOZZI, 1989; INTERNATIONAL LEGUME DATABASE &
INFORMATION SERVICE, 2004).
A L. sericeus é uma espécie caducifólia com flores muito vistosas e
perfumadas (na América e África), sendo freqüentemente visitadas por insetos,
especialmente abelhas. Esta espécie possui tamanho variando de 2 a 30 m. Sua
casca é amarelada e rugosa e sua copa é ampla densa e difusa. O fruto é verde ou
marron e densamente revestido por indumento ferruginoso, apresentando
constricções de tamanhos variados entre as sementes (Figura 1) (AZEVEDO-TOZZI,
1989).
No sertão nordestino a espécie é conhecida por ingazeiro (DUCKE, 1953)
e em Fortaleza, no Ceará, por ingá ou ingá-bravo (MARTINS DE SOUSA, 2003).
Ainda no Ceará, a espécie é chamada de ingá-de-bucha, ingáim, ingá-pena-de-
buchas, ingareira-piaba e guará-timbó. Também nominado vulgarmente de
cabelouro (Bahia), imburana, muxiba ou muxibeira (Maranhão), ingá-hi (Espírito
Santo), ingarana (Piauí), piaca (Pernambuco) e priaca (Paraíba) (AZEVEDO-TOZZI,
1989). Outras denominações como carrapato, embira de carrapato, imbira de sapo,
B C
47
tamboril (PIO CORRÊA, 1974), angelim, cabelouro da caatinga e timbó, também são
usadas no Brasil.
L. sericeus (Poir.) Kunth é encontrada com freqüência à margem de
cursos d’agua, onde deve apresentar uma freqüência mediana ou alta. Ocorre em
formações florestais, como mata de galeria, mata costeira, mata virgem e alta, mata
secundária, mata de várzea ou de terra firme, floresta estacional semidecidual.
Coletada também em estepe arbórea aberta, carnaubal, restinga debastada,
caatinga, capoeira e savana. Citada em mata seca e sertão nordestino (DUCKE,
1953) e baixadas pantanosas da Amazônia (DUCKE, 1925; 1949). Parece
interessante mencionar que as árvores mais altas (20 – 30 m de altura) devem ser
provavelmente, mais velhas e foram localizadas em matas virgens altas e fechadas
no Pará, Venezuela e Costa Rica.
Apesar do gênero Lonchocarpus ser extremamente estudado e rico em
alcalóides, flavonóides, inclusive chalconas, na literatura especializada, poucos
trabalhos mostram que a L. sericeus tenha sido estudada farmacologicamente.
Alguns estudos relatam à presença de um alcalóide isolado da raiz da mesma (2,5-
Dihidroximetil- 3,4-dihidroxipirrolidina) capaz de inibir o processamento de
glicoproteínas (ELBEIN et al., 1984). Segundo estudos realizados na Universidade
Federal do Ceará (UFC), a L. sericeus contém os seguintes flavonóides (chalconas):
Derricina, Lonchocarpina, 2,3-Diidrolonchocarpina e Isolonchocarpina, sendo que as
duas primeiras chalconas são seus constituintes majoritários (MARTINS DE SOUSA,
2003). Algumas destas substâncias isoladas da raiz deste vegetal já apresentam
atividade farmacológica, descrita, como as chalconas que apresentaram atividade
citotóxica em diversos tipos celulares (CUNHA et al., 2003b).
A lectina utilizada neste estudo é um tetrâmero com 100 Ka isolada de
sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL). LSL apresenta um N-terminal majoritário
com uma cadeia α de 23555±15 Da (PAGE-SDS). Esta lectina é rica em resíduos de
asparaginina, glutamina e leucina e não apresenta resíduos de cisteína e tirosina,
além disso, apresenta afinidade de ligação por N-acetil-glicosamina e α-metil-
glicopiranosideo (SÉRVULO, 2004). LSL possui efeitos farmacológicos já
demonstrados na literatura. Alencar et al. (1999) apresentaram o primeiro efeito
biológico desta lectina, destacando sua habilidade em inibir o edema de pata
(carragenina) e a migração de neutrófilos (carragenina) para a cavidade peritoneal
48
de ratos. Esta mesma lectina também apresentou atividade antiinflamatória (inibição
da migração de neutrófilos) e antimicrobiana (redução do número de bactérias
viáveis) em modelo de peritonite infecciosa (ligação e punção cecal) em ratos
(ALENCAR et al., 2005a).
1.4 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Apesar do recente progresso no desenvolvimento de novas drogas com
fins terapêuticos, ainda existe uma busca exaustiva por antiinflamatórios e/ou
analgésicos potentes e efetivos. Atualmente, uma das drogas analgésicas mais
importantes e utilizadas na prática clínica continua sendo o alcalóide morfina, que
apesar da eficácia apresenta diversos efeitos colaterais (depressão respiratória;
náusea; vômito; tolerância; dependência, redução da motilidade gastrintestinal). Da
mesma forma, os antiinflamatórios utilizados (inibidores de ciclooxigenase e
corticóides), também possuem inúmeros efeitos colaterais (gastrite, úlcera gástrica,
alterações hemostáticas, predisposição a infarto agudo do miocárdio dentre outros)
O estudo dos mecanismos e dos mediadores envolvidos na inflamação e
dor vem sendo alvo de inúmeras pesquisas ao longo dos últimos anos. Assim, o
estudo de substâncias naturais que possam interferir neste complexo processo
biológico é de extrema relevância, uma vez que a maioria destas substâncias
(incluindo as lectinas) são geralmente de baixo custo e fácil obtenção.
Adicionalmente, diversos produtos naturais obtidos de diferentes espécies vegetais
tem apresentado eficientes atividades antiinflamatórias e antinociceptivas além de
contribuir no conhecimento das complexas vias relacionadas com a inflamação e
dor.
O estudo das lectinas vegetais vem demonstrando crescente interesse
por diversos pesquisadores, uma vez que as sementes deste vegetais possuem
altas concentrações protéicas (propiciando, geralmente, um bom rendimento) e
estas moléculas e apresentam uma certa facilidade de isolamento. Os dados da
literatura, mostram efeitos de diversas lectinas sobre o processo inflamatório com
envolvimento de vários mediadores, somado a isso, já são bastante demonstrados a
associação destes mediadores inflamatórios com os mecanismos que estão
envolvidos na ativação e sensibilização dos nociceptores.
49
Pesquisa de atividades biológicas, com lectinas na nocicepção é algo
novo, e poucos resultados sobre este assunto são encontrados na literatura, estes
trabalhos geralmente envolvem somente lectinas de algas e nada é encontrado a
respeito de atividade antinociceptiva de lectinas vegetais. Assim, este estudo pode
sugerir uma aplicabilidade biotecnológica para lectinas como substâncias úteis na
compreensão do processo inflamatório e algogênico e na construção de
medicamentos alternativos.
50
OBJETIVOS
51
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a atividade antiinflamatória e antinociceptiva, da lectina obtida de
sementes de Lonchocarpus sericeus em modelos experimentais com camundongos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 RELACIONADOS À ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
• Avaliar a atividade da LSL sobre a migração de neutrófilos para cavidade
peritoneal induzida por estímulo inflamatório inespecífico (carragenina) e
antigênico (ovoalbumina em animais imunizados);
• Investigar o efeito da LSL sobre o rolamento e adesão dos leucócitos no
endotélio vascular por microscopia intravital;
• Em extensão ao estudo do mecanismo de ação antiinflamatória da LSL,
estudar seu efeito na liberação de quimiocinas (CCL3; CXCL1 e CXCL2) e
citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) na cavidade peritoneal estimulada
com carragenina;
• Estudar a participação do óxido nítrico (NO) na atividade antiinflamatória da
LSL;
• Verificar efeito da LSL sobre quimotaxia de neutrófilos in vitro
2.2.1 RELACIONADOS À ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
• Avaliar atividade antinociceptiva da LSL em modelos experimentais com
estímulos químicos (ácido acético e formalina) e térmico (placa quente);
52
• Investigar a atividade antihiperalgésica da LSL em modelos experimentais de
hiperalgesia mecânica (von frei) induzida por carragenina e prostaglandina E
2
,
e por ovoalbumina em animais imunizados;
• Avaliar o efeito da LSL na liberação de quimiocinas (CCL3; CXCL1 e CXCL2)
e citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) na pata dos animais estimuladas
com carragenina;
2.2.1 RELACIONADOS À TOXICIDADE E A INVESTIGAÇÃO DE POSSÍVEIS
EFEITOS CENTRAIS
• Investigar a ação da LSL na atividade locomotora de camundongos através
de modelos de rota rod e campo aberto;
• Investigar a ação da LSL em modelos de depressão em camundongos (nado
forçado);
• Avaliar efeitos sistêmicos do tratamento com a LSL através da avaliação dos
parâmetros: leucograma, massa corpórea, aspecto macroscópicos de órgãos
vitais, função renal, função hepática;
53
MATERIAIS E MÉTODOS
54
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 LECTINA
As sementes quiescentes de Lonchocarpus sericeus foram coletadas na
Chapada do Araripe (Crato-Ce). Todo o material foi devidamente identificado por
especialistas do herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da
Universidade Federal do Ceará (UFC). Posteriormente, as sementes foram trituradas
em multiprocessador, a farinha foi peneirada, delipidada com N-hexano, seca ao ar
livre e armazenada em frascos hermeticamente fechados e mantidos a temperatura
ambiente para uso posterior.
A lectina foi isolada e purificada através de uma combinação de
cromatografia de afinidade em coluna de quitina e cromatografia de troca iônica em
coluna de mono-Q (SÉRVULO, 2004). Para avaliar o grau de pureza da amostra foi
realizada eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e 2-
mercaptoetanol e eletroforese bidimensional (SÉRVULO, 2004). Estes
procedimentos foram realizados no do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular (UFC), sob a coordenação do professor Dr. Benildo Sousa Cavada.
3.2 DROGAS E REAGENTES
• Ácido acético (PA - Grupo Química Brasil);
• Ácido etilenodiamino tetra-acético (Merck);
• Ácido sulfúrico (Merck);
• Adjuvante de Freund’s completo – CFA (Sigma);
• Albumina sérica bovina (Sigma);
• Álcool iodado;
• Anticorpo biotinilado anti-IgG de camundongo (Dako);
• Anticorpo biotinilado de interleucina 1 (Dako);
55
• Anticorpo biotinilado KC (Dako);
• Anticorpo biotinilado MIP-1 (Dako);
• Anticorpo biotinilado MIP-2 (Dako);
• Anticorpo biotinilado TNF-α (Dako);
• Avidina – horseradish peroxidase (Dako A/S, Denmark);
• Brometo de hexadeciltrimetilamônio (Sigma);
• 1,2-Fenilenodiamina (Sigma);
• Carragenina (Sigma);
• Diazepam (Roche);
• Dihidroclo de 1,2-fenilenodiamina (ortofenileno diamina, OPD) (Sigma);
• Eosina (Reagen);
• Formol (PA – Merck);
• Fosfato de sódio (Cequímica);
• Glicose (Cequímica);
• Gradiente de Ficoll Hypaque (Sigma);
• Gradiente de Percoll 65% (Sigma);
• Hematoxilina (Reagen);
• Heparina (ampolas de 5.000 UI/ml; HEPARIN®) (Cristália);
• Hidrato de Cloral (Roche);
• N-1-Naftil-etilenodiamino-dihidrocloreto 1 % (Sigma);
• Ovalbumina (Sigma);
• Peróxido de Hidrogênio (Merk);
• Kits laboratoriais para dosagem: Uréia, Creatinina, AST, ALT. (LABTEST
®
);
• Solução de Ringer Locke’s (Merk);
• Solução Salina – Cloreto de sódio estéril a 0,9% (Pharmace);
56
• Solução de Turk (Àcido acético e violeta de genciana-Isofar)
• Soro de cabra (Peprotec);
• Soro de carneiro (Peprotec);
• Sulfanilamida (Sigma);
• Sulfato de morfina (Cristália-Brasil);
• Prostaglandina E
2
/PGE
2
(Sigma);
• Tetrametilbenzidina (Sigma);
• Tribromo etanol (Sigma);
• Tween 80 (Merck);
3.3 EQUIPAMENTOS E MATERIAIS
• Agitador para tubos de ensaio mod. TE089 (MARCON);
• Agitador magnético Thermolyne, mod M37510/26;
• Agulhas 29G e 25 G;
• Aparelho para ELISA “enzime-linked immunosorbent assay” (NEUROPROBE
Inc. CABIN JOHN, MD);
• Alicate para deslocamento cervical;
• Balança para pesagem dos animais, modelo ID-1500 (FILIZOLA);
• Balança analítica, digital modelo 260 (MARTE);
• Banho -maria modelo 100 (FANEN);
• Base emborrachada para permanência do animal;
• Bastão de vidro;
• Beckers de 5, 10 e 50 mL;
• Câmara de Neubauer;
• Campo aberto (insight)-Brasil;
57
• Cânulas de polietileno (PE 50);
• Citocentrífuga mod. 248 (FANEM);
• Espectrofotômetro;
• Geladeira e freezer;
• Instrumental cirúrgico (pinças, bisturis, tesouras, agulhas, etc.);
• Lâminas e lamínulas para microscopia;
• Luvas descartáveis;
• Placa para ELISA 96 poços (NEUROPROBE Inc. CABIN JOHN, MD);
• Placa quente (Power lab);
• Rota Rod (insight)-Brasil;
• Seringas de insulina 0,5 cc com agulha 29G ultrafina (13 x 3,3), de 1 e de 5
mL (BENSON - DIKSON);
• Medidor de pH (pHmetro, MICRONAL);
• Micropipetas automáticas (GILSON);
• Microscópio óptico binocular (Olympus);
• Pletismômetro Hugo Basile (7140);
• Power Lab/8sp, AD Instruments
®
;
• Tubos plásticos de 15 mL (FALCON);
• Von Frey (PanLab).
3.4 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados camundongos Swiss albinos (Mus musculus) machos,
pesando entre 25 a 35 gramas. Todos os animais foram provenientes do Biotério
Central do Campus do Pici – UFC e mantidos no Biotério setorial do Departamento
de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará (UFC). Todos foram acondicionados em gaiolas apropriadas, sob condições
58
adequadas de luz e temperatura, recebendo água e ração ad libitum, permanecendo
nas mesmas condições ambientais durante os experimentos.
Os protocolos utilizados nesse trabalho estão de acordo com os padrões
éticos estabelecidos pelo comitê de ética da Universidade Federal do Ceará.
3.5 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DA LECTINA DE SEMENTES
Lonchocarpus sericeus – LSL: EFEITO SOBRE A MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS
Considerando o potencial antiinflamatório da LSL e a reversibilidade deste
efeito (quando esta lectina era adminstrada com seu açúcar ligante específico N-
acetilglicosamina), demonstrados anteriormente por Alencar et al. (1999) no modelo
de migraçào de neutrófilos induzida por carragenina, um estímulo inespecífico.
Decidiu-se investigar aquí o mecanismo de ação e os mediadores envolvidos no
efeito da LSL neste modelo. Em acréscimo, avaliou-se também o efeito da LSL
sobre a migração de neutrófilos induzida por ovalbumina (OVA) em animais pré-
imunizados. Neste modelo o processo inflamatório é desencadeado por um estímulo
antigênico (OVA), que é especificamente reconhecido pelo sistema imunológico, ou
seja, uma resposta imunológica adaptativa.
3.5.1 Avaliação do efeito da Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
sobre a migração de neutrófilos para cavidade peritoneal induzida por
carragenina (Cg)
Os camundongos receberam por via i.p. carragenina (Cg;500
µg/cavidade) dissolvida em 0,5 mL de salina estéril. A migração de neutrófilos foi
avaliada 4 horas após. Para tanto, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical. Em seguida, as células presentes na cavidade peritoneal foram coletadas
através da lavagem desta injetando-se 3,0 mL de salina contendo 5 UI/mL de
heparina. Os abdomens dos animais foram levemente massageados, e através de
uma incisão foram coletados os fluidos peritoneais, com pipeta Pasteur de plástico.
As contagens total e diferencial dos leucócitos foram realizadas conforme
metodologia descrita anteriormente por Souza e Ferreira (1985). Neste
procedimento, 20 µL do fluido coletado de cada animal foram diluídos em 380 µL do
59
reagente de Turk e posteriormente usados para a contagem total de leucócitos em
câmara de Neubauer. A contagem diferencial das células foi realizada através de
esfregaços corados em lâminas, para tanto, 50 µL do exsudato foram centrifugados
em citocentrífuga a 400 x g, durante 10 min, após este processo os esfregaços
foram corados pelo método da hematoxilina-eosina (HE) e as células contadas
através de microscopia óptica sendo os resultados expressos como a média ±
E.P.M. do número de células x 10
3
/mL de fluido peritoneal.
A LSL (3 e 10 mg/Kg) foi administrada por via endovenosa em 0,1 mL de
salina, 15 minutos antes da injeção da Cg Para controle negativo do experimento
foram utilizados camundongos que receberam salina estéril e.v.
3.5.1.1 Efeito da Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre rolamento e
adesão dos leucócitos induzidos por Cg na microcirculação mesentérica (modelo de
microscopia intravital)
A avaliação do rolamento e adesão dos leucócitos ao endotélio vascular
foi realizada por microscopia intravital através de procedimentos previamente
descritos (BAEZ, 1969; RHODIN, 1986; FORTES et al., 1991). Camundongos
machos receberam LSL na dose de 10 mg/Kg e.v. ou salina, 15 minutos antes do
estímulo inflamatório Cg (500 µg; i.p.). Posteriormente, os animais foram
anestesiados com injeção i.p. de solução salina contendo 250 mg/kg de tribromo
etanol. Através de uma incisão lateral cutânea na cavidade abdominal, o mesentério
foi exteriorizado para a observação da microcirculação in situ. Os animais foram
mantidos sobre uma placa aquecida (37
o
C), dotada de área transparente, sobre a
qual o tecido foi fixado. A preparação foi mantida úmida e aquecida por irrigação
com solução de Ringer-Locke ou salina estéril a 37
o
C. A placa aquecida foi mantida
sobre o charriot de um microscópio óptico tri-ocular, ao qual estão acoplados um
fototubo, com sistema de lentes ampliadoras superpostas, um monitor de
computador e um vídeo que permite a projeção e gravação de imagem com
aumento final de 3400 vezes (BAEZ, 1969)
Os vasos selecionados para o estudo foram vênulas pós-capilares com
diâmetro variando 10 a 18 µm. Duas horas após o estímulo inflamatório (Cg), foi
60
avaliado o rolamento dos leucócitos e o número destes aderidos ao endotélio
durante 5 minutos em uma extensão de 10 µm de vênula. Esta extensão é definida
na tela do monitor: 10 µm no tecido correspondem a 3,4 cm na tela (FORTES et al.,
1991), portanto os resultados foram expressos em rolamento celular/10 µm/min e
células aderidas/10 µm
2
. Foram considerados os leucócitos que permaneceram
aderidos ao endotélio vascular por mais de 30 segundos (GRANGER et al., 1989).
Duas determinações numéricas foram feitas por animal, estimando-se o resultado
como média de ambos.
3.5.1.2 Efeito da Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a liberação de
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas na cavidade peritoneal estimulada com Cg
As concentrações das citocinas (TNF-α e IL-1β) e das quimiocinas (MIP-1
/CCL3), (KC/CXCL1) e (MIP-2/CXCL2) foram determinadas por enzime-linked
immunosorbent assay (ELISA) no liquido peritoneal dos animais pré-tratados com
salina e LSL (3 e 10mg/Kg) e.v. 15 min antes da administração da Cg i.p. (500
µg/cav). Grupo controle negativo recebeu somente salina i.p. Duas horas após a
injeção da Cg o fluído peritoneal foi coletado como descrito no item 3.5.1. em 1,0 mL
de salina e estocado a -70 ° C para posterior dosagem das citocinas e quimiocinas.
O ensaio para determinação da concentração de TNF-α, IL-1β, MIP-1 e
KC foi realizado baseado em protocolo descrito anteriormente por Taktak et al.
(1991). Placas de microtitulação (96 poços) foram recobertas com 50 µL de tampão
PBS contendo 2,0 µg/mL do anticorpo monoclonal (mAb) anti-TNF-α, anti IL-1β, anti
MIP-1 e anti KC. A placa foi incubada durante uma noite a 4
o
C. Após esse período,
a placa foi lavada de 3 a 5 vezes com PBS contendo 0,1% Tween 20 (PBS-T; 200
µL/poço), e em seguida foram incubadas com 50 µL de solução de bloqueio (1% de
albumina bovina) durante 2 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada conforme
descrito acima e, em seguida adicionou-se as amostras testes (triplicata), colhidas
do fluido peritoneal e do homogeneizado da pata. Concentrações decrescentes das
citocinas e quimiocinas foram diluídas em PBS-Tween, e utilizadas para a confecção
de uma curva padrão. A placa foi novamente coberta e mantida durante 12 horas a
4
o
C. No terceiro dia, a placa foi lavada por três vezes e adicionados os anticorpos
61
biotinilados anti-TNF-α, anti-IL-1β anti MIP-1, anti MIP-2 e anti KC (1:1000 em
solução de lavagem contendo 1% de soro de cabra).
Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, a placa foi lavada e em
seguida adicionou-se 50 µL de uma solução 1:5000 do conjugado avidina-
horseradish peroxidase (DAKO A/S, Denmark) diluída em PBS-T. Após incubação
por 30 minutos, a placa foi lavada e incubada com 50 µL do substrato dihidrocloro
1,2-fenilenodiamina (ortofenileno diamina, OPD, Sigma) diluído em tampão e
adicionado com 0,4 µL de H
2
O
2
30% por mL.
Após o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida pela adição de
75 µL de solução de H
2
SO
4
(1M). A medida da absorbância foi determinada a 490
nm. Os resultados foram expressos em pg/mL de TNF-α, IL-1β,MIP-1 ou KC com
base na curva padrão obtida.
3.5.1.3 Envolvimento do óxido nítrico no efeito antiinflamatório da lectina de
sementes de Lonchocarpus sericeus
Com o objetivo de se investigar se o óxido nítrico estaria envolvido no efeito
inibitório da LSL sobre a migração de neutrófilos foram realizadas as seguintes
abordagens experimetais:
3.5.1.3.1 Dosagem do óxido nítrico (NO) no soro dos animais pré-tratados e.v. com
Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
Os animais foram tratados e.v. com salina (controle) ou LSL (10 mg/Kg) e
15 minutos após foi administrado Cg i.p. (500 µg). Quatro horas após a
administração da Cg, os animais foram levemente anestesiados com éter, e em
seguida amostras de sangue foram coletadas do plexo reto orbital através de
capilares de vidro heparinizados. Após separação por centrifugação do sangue (10
min a 600 xg), o soro foi utilizado para a determinação indireta de NO, mensurado
pelos níveis de nitrato, os quais foram determinados através da conversão de nitrato
(NO
3
-
) a nitrito (NO
2
-
), pela ação da enzima nitrato-redutase e o nitrito quantificado
62
pela reação de Griess (CHEN et al., 2000). Para o ensaio, 40 µL de soro foram
incubados por 12h com 40 µL de tampão contendo a enzima nitrato redutase em
placas de 96 poços. Uma curva padrão de nitrato de sódio (0,78-200 µM) também foi
processada da mesma forma que foi realizada para as amostras. A dosagem de
NO
2
-
foi realizada pelo método colorimétrico baseado na reação de Griess. Para tal,
foram adicionados 80 µL do reagente de Griess (1% Sulfanilamida em 1% H
3
PO
4
/
0,1% de N-1-naftil-etilenodiamina dihidrocloreto/ 1% H
3
PO
4
/ água destilada, 1:1:1:1)
em cada poço da placa. Foi determinada a absorbância em leitor de ELISA em 560
nm. A concentração de nitrito foi determinada usando uma curva padrão realizada
com NaNO
2
e expressos em µM de NO
2
-
.
3.5.1.3.2 Efeito de Inibidores da Síntese de NO sobre a Inibição da migração de
neutrófilos pela Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
Nessa abordagem, 15 min antes da administração e.v. de LSL (10,0 mg/Kg)
os animais receberam dois inibidores da NOS: L-Nitro-Arginina metil éster (L-NAME;
inibidor inespecífico da NOS) ou Aminoguanidina (Amino; inibidor seletivo da NOS
induzida) ambos nas doses de 50 mg/Kg s.c. Após 15 min da administração de LSL
a peritonite foi induzida pela injeção i.p. de Cg (500 µg). Para controles
experimentais foram formados os seguintes grupos com animais tratados com:
salina e.v. e i.p. (controle negativo), com salina e.v. e Cg i.p. (controle positivo), com
LSL e.v. e Cg i.p. (controle do efeito da LSL) e com L-NAME ou Amino s.c. e Cg i.p.
(controle inibidores). A migração de neutrófilos foi avaliada conforme o item 3.5.1.
3.5.2 Avaliação do efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
sobre a migração de neutrófilos para cavidade peritoneal induzida por
ovalbumina (OVA) em animais pré-imunizados
Para imunizar os camundongos ovalbumina (OVA; 100 µg) foi dissolvida
em PBS e adicionada a um volume idêntico de Adjuvante de Freund’s completo
(CFA). CFA foi usado para aumentar a eficiência do procedimento de imunização
(FREUND, 1956) por prolongar o tempo de vida do antígeno administrado e por
63
estimular uma efetiva ativação direcionada do sistema imune; isto resulta em
alterada proliferação e diferenciação leucocitária (BILLIAU; MATTHYS, 2001).
Posteriormente, os camundongos foram administrados s.c. (no dorso em dois sítios
diferentes) com a emulsão (ovalbumina dissolvida em PBS e adicionada com CFA)
no 7º (sétimo) e 14º (décimo quarto) dia. Os animais falsos imunizados foram
administrados de forma semelhante com a emulsão sem ovalbumina. Após 21 (vinte
e um) dias, os camundongos foram desafiados com ovalbumina por via i.p. (10
µg/cavidade dissolvido em PBS).
No 21
o
(vigésimo primeiro) dia do processo de imunização, os
camundongos foram pré-tratados com salina (controle positivo) ou LSL (3 e 10
mg/kg em 0,1 ml) e.v. 15 minutos antes de receberem ovalbumina (10 µg/cavidade
em 0,2 ml). Posteriormente, a migração de neutrófilos foi avaliada 4 horas após a
administração de ovalbumina de acordo com o item 3.5.1.. Os animais falsos
imunizados receberam ovalbumina (10 µg/cavidade em 0,2 ml) i.p. e os
camundongos imunizados também foram desafiados com 0,2 ml de PBS (controles
negativos)
3.5.2.1 Elisa para IgG (imunoglobulina G) anti-OVA
Esta abordagem foi realizada para confirmar a eficácia da metodologia
realizada para imunização dos animais descrita no item anterior. A efeiciência foi
comprovada pela presenca de IgG anti-Ova nos animais imunizados e a ausência de
anticorpos específicos anti-Ova nos animais falso imunizados
Para tanto, uma placa para ELISA com 96 poços (Costar 3590, USA) foi
preenchida com 10 µg/ml de ovalbumina diluída e incubada com PBS durante uma
noite a 4ºC. Posteriormente ligações não específicas foram bloqueadas com BSA
(albumina sérica bovina) 1% diluída em PBS por 2 horas a temperatura ambiente, o
soro diluído obtido do sangue dos animais imunizados foi adicionado e incubado
durante uma noite a 4ºC. Após a lavagem com 0.05% Tween 20 diluído em PBS, um
anticorpo anti-IgG biotinilado para camundongo foi adicionado e incubado por 1 hora
a temperatura ambiente. Os poços foram lavados e avidina-HRP (DAKO A/S,
64
Denmark; 1:5000) foi adicionada aos poços, após 30 (trinta) minutos os poços foram
novamente lavados e receberam o reagente responsável pela coloração o-
fenillenodiamina (200 µg/poço). Após 15 minutos a reação foi interrompida por 1M
de H
2
SO
4
. O desenvolvimento da coloração foi mensurado por uma absorbância de
490 nm.
3.5.3 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a
quimiotaxia in vitro de neutrófilos
O modelo de quimiotaxia em câmara de Boyden (BOYDEN, 1962) foi
utilizado para avaliar se a LSL interage diretamente com neutrófilos in vitro. Para
tanto, sangue dos camundongos foi coletado por punção cardíaca e colocado em
tubos estéreis de 5mL contendo EDTA a 2% e mantidos no gelo. Os
polimorfonucleares foram purificados através da utilização de gradiente de Percoll.
Em seguida, essas células foram lavadas com solução de Hanks’ por 2 vezes.
Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e as células resuspendidas em meio
RPMI. A contagem total das células foi realizada em câmara de Neubauer, a pureza
dos neutrófilos em lâminas pela coloração com Panótico e a viabilidade observada
por exclusão em azul de tripan.
Após a separação, 1 x 10
6
neutrófilos/mL foram ressuspensos em meio
RPMI/BSA (0,01%) e pré-incubados por 1 hora (37°C/CO
2
2%) na presença ou não
da LSL (20 e 60µg/mL). Em seguida, os neutrófilos foram lavados 2 vezes com
solução de Hanks’ e ressuspensos em 1mL com RPMI/BSA (0,01%). O ensaio de
quimiotaxia in vitro foi realizado em Câmara de Boyden utilizando como estímulo
MIP-2 (10
-7
M), que foi colocada em volume de 28,6 µL/poço no compartimento
inferior da câmara. A suspensão de células (10
6
células/mL) previamente tratados
com a lectina, foi colocada (50 µL/poço) no compartimento superior. Os dois
compartimentos foram separados por uma membrana de policarbonato (5 µm
Milipore Corp., Bedford, MA). A câmera foi incubada (37°C/CO
2
2%) por 1 hora. No
final do período de incubação, o filtro foi removido fixado e corado com HEMA. Os
neutrófilos que migraram foram quantificados por microscopia óptica usando-se
objetiva de imersão (aumento de 100 X).
65
A contagem foi feita em cinco campos aleatórios, para cada poço, de um
total de 6 poços, por grupo experimental,. Em cada experimento RPMI foi utilizado
como controle negativo (migração randômica) e MIP-2 como controle positivo. A
migração foi expressa como o número de neutrófilos por campo.
3.6 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA LECTINA DE SEMENTES
DE Lonchocarpus sericeus – LSL
Para investigar possíveis efeitos antinociceptivos da LSL, inicialmente
utilizamos três modelos experimentais, nos quais a nocicepção induzida por
estímulos químicos e térmicos ocorre através de mecanismos centrais e/ou
periféricos.
3.6.1 Modelo de nocicepção induzida por ácido acético: contorções
abdominais
Camundongos receberam LSL e.v. nas doses de 1, 10 e 100 mg/Kg
diluídas em salina. Grupos controles receberam salina e.v. (controle positivo) ou
acido acetilsalisílico (ASS; 250mg/kg) s.c. (controle negativo). Após 15 min dos
tratamentos citados, os animais receberam por via i.p. solução de ácido acético
0,6% (10 mL/kg) e após 10 minutos o número total de contorções abdominais foi
determinado por um período de 20 minutos (KOSTER et al., 1959). Os resultados
foram expressos como as médias do número de contorções ± erro padrão da média
(E.P.M.)
3.6.2 Modelo de nocicepção induzida por formalina
Formalina 1,2% foi administrada na pata traseira direita de camundongos
(20µL/pata), previamente mantidos em jejum de 12 h. Imediatamente após a
administração da formalina o tempo de lambedura (“licking time”) foi registrado por
cerca de 5 min (fase 1, neurogênica) e de 20 à 25 min (fase 2, inflamatória).
66
Animais receberam 15 minutos antes da administração da formalina:
salina e.v. (controle positivo), sulfato de morfina (5 mg/Kg; controle negativo) e LSL
na dose de 10 mg/Kg e.v. diluídas em salina. Os resultados foram expressos como o
tempo de lambedura em segundos ± E.P.M (HUNSKAAR; HOLE, 1987).
3.6.3 Modelo de nocicepção induzida por elevação da temperatura: Teste da
Placa quente
O método da placa quente consiste em colocar camundongos sobre uma
placa aquecida (51±1ºC) e observar quanto tempo que os animais levam para
manifestar uma resposta, que corresponde ao ato de saltar e/ou lamber a pata
traseira. Sendo este um teste específico de nocicepção de resposta central.
Os animais que apresentaram reações ao estímulo térmico, em um
intervalo de tempo de até 20 segundos foram selecionados para o teste. Nesse
modelo, camundongos receberam salina e.v. (controle positivo), sulfato de morfina
(5 mg/Kg) s.c. (controle negativo), sulfato de morfina (5 mg/Kg) em adição com
naloxona (2mg/kg) s.c. e LSL nas doses de 10 mg/Kg e.v. no tempo zero (T0),
respectivamente. Após 15 min, o tempo de resposta foi avaliado nos tempos de
30(T30), 60(T60), 90(T90), min, com um tempo de corte (“cut-off”) de 45 segundos
para evitar lesão na pata do animal. Os resultados foram expressos como o tempo
de reação em segundos ± E.P.M (EDDY; LEIMBACH, 1953).
3.6.4 Modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina e
prostaglandina E
2
(PGE
2
)
Quando comparado com os testes de nocicepção induzida por agentes
químicos, os testes mecânicos apresentam uma importante vantagem, pois
permitem uma dissociação entre a sensibilização dos nociceptores (pela injeção de
um flogógeno ou de um mediador inflamatório específico, como uma citocina) e um
comportamento nociceptivo espontâneo (nocicepção manifesta), induzida por um
estímulo químico (LE BARS et al., 2001).
67
As respostas comportamentais para o estímulo mecânico foram
realizadas utilizando filamentos de Von Frey (diâmetro 0,8 mm). Os camundongos
foram colocados em uma caixa plástica elevada com uma trama de arame no
soalho. Os filamentos de Von Frey foram aplicados embaixo da superfície plantar da
pata traseira direita em ordem ascendente de estímulo de força até um valor máximo
de 50g (para evitar lesão na pata). No limiar, o camundongo retirava a pata fora do
filamento. A pata traseira direita foi testada 3 (três) vezes, o intervalo entre dois
testes consecutivos na mesma pata foi de até 1 (um) minuto. Os resultados foram
apresentados como a média das respostas contra um dado estímulo de força.
A hipernocicepção foi mensurada como sendo a diferença obtida entre o
tempo 0 (zero) e 3 (três) horas após a administração intraplantar de carragenina
(100µg/pata; 0,25 ml) ou PGE
2
(100 ng/pata; 0,25ml) em camundongos pré-tratados
e.v. com LSL (3 e 10 mg/kg) ou salina (controle positivo) 15 minutos antes da
administração destes agentes flogísticos. As doses injetadas de carragenina e PGE
2
foram as menores doses que induziram hipernocicepção mecânica aguda máxima
(FERREIRA et al., 1978a, 1978b; 1988; CUNHA et al., 1992).
3.6.4.1 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a migração
de neutrófilos na hipernocicepção induzida por carragenina
Com o objetivo de investigar se o efeito antinociceptivo da LSL na
hipernocicepção induzida por Cg ocorria por inibição da migração de neutrófilos,
esta foi medida indiretamente pela quantificação da atividade da mieloperoxidase
(MPO) nas patas dos animais por um ensaio cinético-colorimétrico descrito por
Souza et al. (1994) com algumas alterações. Os camundongos receberam 15 min
antes da carragenina intraplantar (100 ng/pata, s.c.): salina e.v. (controle positivo) e
LSL (3 e 10mg/kg; e.v.). O controle negativo recebeu salina s.c.
Após 3 horas da administração intraplantar da Cg amostras do tecido das
patas dos animais foram coletadas, pesadas e trituradas em Politron Ultra-Max em
solução (NaCl, NaPO
4
, NaEDTA), sob condições adequadas de refrigeração. A
seguir, foram centrifugadas a 13.000 g durante 15 minutos a 4°C. O pellet obtido foi
ressuspendido na mesma solução tampão e novamente centrifugado. O novo pellet
68
obtido foi ressuspendido em uma segunda solução tampão (NaPO
4
e H-TBA), re-
homogenizado, congelado e descongelado e centrifugado a 4°C, durante 15
minutos, com freqüência de 10.000 a 20.000 rpm. O sobrenadante foi colhido e
devidamente armazenado para posterior ensaio da mielopredoxidase, utilizando
placa de 96 poços e leitura da densidade óptica a 450 nm espectrofotômetro.
A atividade de MPO foi comparada a uma curva padrão de neutrófilos de
camundongos processado da mesma maneira. Os resultados foram apresentados
como a atividade de MPO (número de neutrófilos/mg de tecido).
3.6.4.2 Efeito da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus sobre a liberação de
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas na hipernocicepção induzida por carragenina
As concentrações das citocinas (TNF-α e IL-1β) e das quimiocinas (MIP-1
/CCL3), (MIP-2/CXCL2) e (KC/CXCL1) foram determinadas por enzime-linked
immunosorbent assay (ELISA) em amostras de tecidos das patas dos animais pré-
tratados com salina e LSL (3 e 10mg/Kg) e.v. 15 min antes da administração da Cg
i.pl. (100ng/pata). Grupo controle negativo recebeu somente salina i.p. Duas horas
após a injeção da Cg as patas foram removidas e disecadas, posteriormente, o
tecido foi homogeneizado em 500 µl de tampão contendo inibidores de proteases,
centrifugado e o sobrenadante aramzenado a -70 ° C para posterior dosagem das
citocinas e quimiocinas como descrito no item 3.5.1.2.
3.6.5 Modelo de hipernocicepção mecânica induzida por OVA em animais pré-
imunizados
No 21
o
(vigésimo primeiro), útimo dia do processo de imunização
conforme descrito no item 3.5.2. a hipernocicepção foi mensurada após 3 horas da
administração de ovalbumina de acordo com o item 3.6.4. Nos tempos 0 (zero) e 3
(três) horas após administração s.c. intraplantar de ovalbumina (3 µg/pata em 0,25
ml) em camundongos pré-tratados com salina (controle positivo) ou LSL (3 e 10
69
mg/kg). O veículo (PBS) também foi injetado intraplantar (s.c.) e os camundongos
falsos imunizados foram desafiados com OVA (controles negativos).
3.7 AVALIAÇÃO DE POSSÍVEIS EFEITOS DA LECTINA DE SEMENTES DE
Lonchocarpus sericeus SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL: MODELOS DE
COMPORTAMENTO ANIMAL
3.7.1 Avaliação da atividade motora
3.7.1.1 Teste do rota rod
Esta abordagem foi feita com o objetivo de verificar uma possível
interferência da LSL na coordenação motora do animal. Para tanto, os animais foram
pré-selecionados 24 horas antes da realização do experimento, ao serem
individualmente posicionados no aparelho de rota rod (4 rotações por minuto). O
animal que permaneceu 2 minutos na barra foi selecionado para estudo.
Os animais receberam LSL e.v. na dose de 10 mg/Kg ou salina (grupo
controle). Diazepam (2 mg/Kg; s.c.) foi utilizado como controle negativo no
experimento. Após 30 min das injeções, os animais foram colocados na barra,
individualmente, e registrado o tempo de permanência no aparelho durante 2 min.
Os resultados foram expressos como o tempo (em segundos) de permanência do
animal no aparelho ± E.P.M. (DUNHAM; MYIA, 1957).
3.7.1.2 Teste do campo aberto
A atividade motora (locomoção espontânea) dos animais foi verificada por
meio de um campo aberto quadrangular, com 30 cm de lado, tendo demarcado em
sua base 9 quadrados iguais com 10 cm de lado cada um. Os camundongos foram
divididos em dois grupos: O grupo controle (tratado com salina e.v.) e o grupo
tratado com LSL (10 mg/kg). Após 30 minutos do tratamento, os animais foram
levados individualmente para o campo aberto, ambientados por 1 minuto e, em
70
seguida, observados por 4 minutos quanto ao número de campos explorados
(CAPAZ et al., 1981).
3.7.2 Avaliação da atividade depressora: Teste do nado forçado
No sentido de avalaiar se a LSL exerce atividade depressora central, o
nado forçado foi imposto em camundongos tratados com salina ou LSL (10 mg/kg).
Este nado foi individualmente imposto por 6 minutos, sendo 1 minuto de
ambientação. Estes animais foram colocados individualmente em um recipiente de
acrílico transparente com 21 cm de diâmetro na base e 30 cm na parte superior,
contendo água a 26º C, em quantidade suficiente para se ter 12 cm de profundidade.
Definiu-se como imobilidade do nado forçado o período em que o animal cessava
seus movimentos, permanecendo em postura semiverticalizada, com apoio na ponta
de uma das patas posteriores no fundo, ou em flutuação, mantendo apoio de uma ou
ambas as patas superiores na parede do recipiente e a cabeça verticalizada acima
da superfície da água. Os movimentos rápidos de correção postural após a perda
lenta e progressiva do equilíbrio, observados após instalado um episódio de
imobilidade, não foram considerados como finalizações. Estas correções posturais
foram estipuladas como sendo a procura de novas posturas. A água foi renovada e a
temperatura corrigida com adição de água fria ou quente antes do teste de cada
animal. A soma cumulativa das durações dos episódios de imobilidade durante o
período de 5 minutos de natação forçada foi obtida em cronômetro manual (DETKE
et al.,1997; LUCKI, 1997).
3.8 TOXICIDADE AGUDA
Para avaliação de possíveis efeitos tóxicos da LSL, foram utilizados dois
grupos experimentais. Um grupo recebeu uma solução de lectina (10mg/kg) diluída
em solução salina durante sete dias por via e.v., obedecendo uma posologia de
tomada diária única. O outro grupo recebeu a mesma quantidade de solução salina
pela mesma via e posologia.
71
Após os sete dias, os animais foram pesados e sua massa comparada
com o massa anterior (antes do tratamento) e o resultado sendo expresso como
variação de massa corpórea antes e após os tratamentos. Em seguida, foi coletado
sangue dos animais de ambos os grupos pelo plexo orbital para avaliação do
leucograma e dosagens bioquímicas, sendo estes então sacrificados, e seus órgãos
(fígado, coração, rim) removidos ainda úmidos e pesados. O peso de cada órgão foi
expresso por cada 100g de massa corporal e comparado ao grupo controle. O
estômago dos animais foi também removido para avaliação macroscópica da
possível presença de úlceras (SANTUCCI et al., 1994).
Na avaliação do leucograma, uma gota de sangue foi colocada sobre
lâminas para a confecção de esfregaços, corados pelo método HE, e destinados à
contagem diferencial das células em microscópio óptico, utilizando a objetiva de
imersão (aumento de 100 vezes). A contagem total foi feita de acordo com o método
de Souza e Ferreira (1985). Após este procedimento, obteve-se então o número de
células x 10
3
/ mL de sangue.
O restante da amostra de sangue foi centrifugado, e o plasma removido
para realização das dosagens bioquímicas de uréia como indicador de função renal
e avaliação da atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT), como indicadores da função hepática. Todas as dosagens
foram realizadas utilizando “Kits” específicos em aparelhos automatizados pelo
laboratório de Bioquímica do Hospital Universitário Walter Cantídio da UFC.
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± E.P.M. (Erro Padrão da
Média). Para a verificação das diferenças estatísticas entre os grupos foi realizada
Análise de Variância (ANOVA) e teste de Bonferroni para comparações múltiplas.
Além do teste-t Student para o restante das comparações. Para todas as análises foi
considerado significativo p < 0,05.
72
RESULTADOS
73
4 RESULTADOS
4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
4.1.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos induzida
por carragenina em camundongos
Quatro horas após a administração i.p. de Carragenina (500µg/cavidade)
ocorreu intensa e significativa (p< 0,05) migração de neutrófilos para cavidade
peritoneal dos animais (10,37 ± 1,26 x 10
-6
neutrófilos/cavidade), quando
comparados aos animais controle (salina; i.p.) (0,31 ± 0,02 neutrófilos/cavidade). O
tratamento e.v. com LSL (3 e 10mg/kg), 15 min antes do estímulo inflamatório
(carragenina), reduziu de forma significativa (p<0,05) a migração de neutrófilos para
valores de 3,02 ± 0,18 x 10
-6
neutrófilos/cavidade e 1,06 ± 0,38 x 10
-6
neutrófilos/cavidade, respectivamente (inibição de 70,1 e 89,9%, respectivamente)
(Figura 2)
4.1.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus inibe o rolamento e a adesão dos
leucócitos no endotélio vascular de animais estimulados com carragenina.
A administração de carragenina (500 µg/cavidade) i.p. induziu um aumento
significativo do rolamento (59,6 ± 25,5 leucócitos/min) e adesão (1,21 ± 0,4 leucócitos
aderidos/100mm
2
) de leucócitos no endotélio (vênulas mesentéricas pós-capilares; in vivo)
quando comparado ao grupo controle que recebeu apenas salina i.p. (rolamento: 18,5 ± 2,5
leucócitos/min; adesão: 0,23 ±0,05 leucócitos aderidos/100mm
2
). O tratamento e.v. com LSL
(10mg/kg), 15 min antes dos animais receberem o estímulo inflamatório (carragenina),
produziu redução significativa do rolamento (9,44 ± 1,05 leucócitos/min; inibição de 84,2%) e
adesão (0,59 ± 0,03 leucócitos aderidos/100mm
2
; inibição de 50,8%) de leucócitos ao
endotélio. Salina ou LSL (10 mg/kg) foram administradas i.p. sozinhas e utilizadas como
controle. (Figura 3 painel A e B).
74
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Salina
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina (500 µg/cavidade)
*
*
Salina
#
Neutrófilosx10
6
/cavidade
Figura 2 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) inibe a migração neutrofílica
(MN) induzida por carragenina (Cg) para a cavidade peritoneal de camundongos. Os animais
foram tratados e.v. com salina (0,1 mL), ou LSL (3 ou 10 mg/kg) 15 min. antes de receberem Cg i.p.
(500 µg/cavidade). A MN foi avaliada 4h depois. Os animais controle negativo representam a MN
induzida por salina i.p. Os valores são representados pela média ± E.P.M. do n. de neutrófilos (n=6). *
indica significância estatística (p<0.05) comparado ao grupo Carragenina e
#
comparado ao grupo
salina (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
75
0
20
40
60
80
Salina
Salina
*
Carragenina (500 µg/cavidade)
LSL
10 mg
LSL
10 mg
#
A
Número de leucócitos/min
0.0
0.5
1.0
1.5
Salina
Salina
Carragenina (500 µg/cavidade)
LSL
10 mg
LSL
10 mg
*
#
B
Leucócitos aderidos/100mm
2
Figura 3 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) diminui a adesão e o rolamento
de leucócitos nas células endoteliais. Os animais foram tratados e.v. com salina (0.1 mL) ou LSL
(10 mg/kg), 15 min. antes de Cg i.p. O rolamento (Painel A) e a adesão (Painel B) de leucocitos
foram avalidados por microscopia intravital mesentérica após 2 h da administração da Cg. Os animais
controles foram administrados somente com salina ou LSL (10 mg/kg) i.p. Os resultados expressos
como média ± E.P.M. do n. de leucócitos/ min (painel A) e do n. de leucócitos
aderidos/100mm
2
.(painel B) (n=6).* indica significância estatística (p<0.05) comparado ao grupo
Carragenina e
#
comparado ao grupo salina (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
76
4.1.3 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de citocinas (TNF-α e IL-
1β) no exsudato peritoneal de camundongos estimulados com carragenina.
A administração intraperitoneal de carragenina (500 µg/cavidade) induziu
um significante (p<0,05) aumento nos níveis de TNF-α (161,7 ± 34,0 pg/mL; painel
A) e IL-1β (440,2 ± 73,4 pg/mL; painel B) no exsudato peritoneal dos animais após 2
horas do tratamento (Figura – 4). O pré-tratamento e.v. com LSL (3 ou 10 mg/kg), 15
min antes dos animais receberem carragenina i.p. reduziu de forma significante
(p<0,05) os níveis de TNF-α para valores de 114,1 ± 6,96 pg/mL e 94,90 ± 3,86
pg/mL, respectivamente (inibição de 29,1 e 41,3%, respectivamente) (figura 4 -
painel A). O mesmo pré-tratamento com LSL (3 ou 10 mg/kg) também reduziu de
forma significante (p<0,05) os níveis de IL-1β para valores de 210 ± 10,7 pg/mL e
183 ± 8,99 pg/mL, respectivamente (inibição de 52,3 e 58,4%, respectivamente)
(Figura 4 - painel B).
4.1.4 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de quimiocinas (MIP-1,
KC) no exsudato peritoneal de camundongos estimulados com carragenina.
A administração intraperitoneal de carragenina (500 µg/cavidade) induziu um
significante (p<0,05) aumento nos níveis de quimiocinas CCL3/MIP-1 (450,2 ± 154,5
pg/mL; painel A), CXCL1/KC (600,9 ± 146,3 pg/mL; painel B) e CXCL2/MIP-2 (669,6
± 96,5 pg/mL; painel C) no exsudato peritoneal dos animais após 2 horas de
tratamento (Fig 5). O pré-tratamento e.v. com LSL (10 mg/kg) 15 min antes dos
animais receberem carragenina i.p. reduziu de forma significante (p<0,05) os níveis
de MIP-1 para um valor de 134 ± 13,11 pg/mL (inibição de 70,2%) (Figura 5 - painel
A), e os níveis de KC para um valor de 344,4 ± 12,75 pg/mL (inibição de 42,7%)
(Figura 5 - painel B). Os níveis de MIP-2 não foram reduzidos de forma significante
após tratamento com LSL em nehuma das doses usadas (Figura 5 - painel C).
77
TNF-α
0
50
100
150
200
*
*
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
#
pg/ml
IL-1β
0
100
200
300
400
500
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
*
#
pg/ml
Figura 4 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os níveis de citocinas
(TNF-α e IL-1β) no exsudato peritoneal em camundongos estimulados com carragenina.
PAINEL A – níveis de TNF-α. PAINEL B – níveis de IL-1β. Os animais receberam e.v. salina
(controle) ou LSL (3 ou 10 mg/kg) 15 minutos antes da Cg i.p. (500µg/cavidade). Os animais controle
receberam apenas salina i.p. A concentração de citocinas foi determinada por ELISA. Os resultados
são expressos como media ± E.P.M. de pg de citocina/mL de fluido peritoneal (n=5). * indica
significância estatística (p<0.05) comparado ao grupo Cg e
#
comparado ao grupo salina (ANOVA
seguido pelo teste de Bonferroni).
A
B
78
MIP-1
0
100
200
300
400
500
600
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
A
pg/ml
KC
0
100
200
300
400
500
600
700
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
B
pg/ml
MIP-2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
C
pg/ml
Figura 5 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os níveis de quimiocinas
(MIP-1 e KC) no exsudato peritoneal em camundongos estimulados com carragenina
. PAINEL
A – níveis de MIP-1. PAINEL B – níveis de KC. PAINEL C – níveis de MIP-2. Os animais receberam
salina (controle) ou LSL (3 ou 10 mg/kg) e.v. 15 minutos antes de Cg i.p. (500
µg/cavidade). Os
animais controle receberam apenas salina i.p. A concentração das quimiocinas foi determinada por
ELISA. Os resultados são expressos como media
± E.P.M. de pg de quimiocina/mL de fluido
peritoneal (n=5). * indica significância estatística (p<0.05) comparado ao grupo Carragenina. (ANOVA
seguido pelo teste de Bonferroni).
79
4.1.5 O tratamento e.v. com a lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
induz aumento nos níveis sanguíneos de óxido nítrico (NO).
A lectina de Lonchocarpus sericeus induziu um aumento significativo (cerca
de quatro vezes mais) nos níveis de nitrito em soro de animais com peritonite
induzida por Cg (86,4 ±,16,8 mM de NO
3
). O grupo que recebeu somente salina
apresentou baixos níveis de nitrito no soro (21,53 ± 3,2 mM de NO
3
). A
administração de carragenina não modificou os níveis de nitrito (13,17 ± 2,1 mM de
NO
3
) em relação ao grupo tratado com salina (Figura 6).
4.1.6 Inibidor específico da iNOS inibe a atividade antiinflamatória da lectina de
sementes de Lonchocarpus sericeus na peritonite induzida por carragenina
Aminoguanidina, um inibidor específico da iNOS, foi capaz de reduzir de
forma significativa (5,98 ± 0,54 neutrófilos/cavidade), o efeito inibitório da LSL sobre
a migração de neutrófilos para cavidade peritoneal induzida pela Cg, quando
comparada ao grupo que recebeu a lectina sem um inibidores da síntese de NO
(0,78 ± 0,09 neutrófilos/cavidade). Tanto aminoguanidina quanto L-nitro-arginina
metil éster quando administradas sozinhas, não modificaram a migração de
neutrófilos induzida pela carragenina (Figura 7).
80
Sal - LSL
0
25
50
75
100
125
Cg (500 µg/cav)
*
mM deNO
3
no soro
Figura 6 – Lectina de Lonchocarpus sericeus (LSL) induz aumento de NO no sangue de
camundongos.
Os animais foram tratados e.v. com LSL (10 mg/Kg) ou salina (controle positivo) 15
min antes da Cg i.p. (500 µg/cav.). O controle negativo (Sal) recebeu somente salina i.p. Após 4
horas da Cg, o soro dos animais foi coletado para dosagem de nitrito através da reação de Griess. As
barras representam a média ± E.P.M. da concentração de nitrito em µM.
* p<0,05 comparado com o
grupo Salina e Cg (n=6) (ANOVA, teste de Bonferroni).
C Sal - LNAME AG LNAME AG
0
5
10
15
20
Cg (500 µg/cav)
*
**
#
LSL
Neutrófilos x 10
6
/cav
Figura 7 – Aminoguanidina diminui o efeito antiinflamatório da lectina de Lonchocarpus sericeus
(LSL) no modelo de peritonite induzida por Cg.
Os animais foram tratados s.c. com salina ( - ), L-
Nitro-Arginina (50 mg/Kg; L-Nitro) ou Aminoguanidina (50 mg/Kg; Amino) 15 min antes de LSL (10
mg/Kg e.v.). Após 15 min da injeção de LSL, Cg (500 µg/cav.) foi administrada i.p. O controle
negativo (C) recebeu salina i.p. O grupo controle positivo recebeu salina e.v. e Cg i.p. A migração de
neutrófilos foi avaliada 4 h após a Cg. Grupos controles adicionais foram realizados com a
administração de L-Nitro-Arginina ou Aminoguanidina 15 min antes da administração i.p. de Cg. As
barras representam a média ± E.P.M. do n. de neutrófilos. * p<0,05 indica diferença significativa
comparado ao grupo C, ** comparado ao grupo Cg(Sal) e # ao grupo tratado somente com LSL (n=6).
(ANOVA, teste de Bonferroni)
81
4.1.7 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal induzida por OVA em camundongos imunizados.
Através de ELISA foi mensurado a produção de IgG específica anti-OVA
(figura 8 painel A) e confirmando a eficácia da metodologia de imunização dos
camundongos (presenca de IgG anti-Ova) nos animais imunizados e a ausência de
anticorpos específicos anti-Ova nos animais falso imunizados. No painel B da figura
8, após a administração de OVA (10µg/cavidade; i.p.) nos camundongos
imunizados, foi observado um aumento significante (p<0,05) na migração de
neutrófilos para a cavidade peritoneal destes animais (9,4 ± 1,7 x 10
-6
neutrófilos/cavidade), quando comparado com os animais falso imunizados (1,46 ±
1,01 neutrófilos/cavidade). O tratamento e.v. com LSL (3 e 10mg/kg), 15 min antes
de receberem o estímulo inflamatório (OVA) reduziu de forma significante (p<0,05) a
migração de neutrófilos de maneira dose-dependente para valores de 1,01 ± 0,45 x
10
-6
neutrófilos/cavidade e 0,63 ± 0,09 x 10
-6
neutrófilos/cavidade, respectivamente
(redução de 89,2 e 93,3%, respectivamente).
4.1.8 Lectina de Lonchocarpus sericeus não interefere na quimiotaxia induzida
por MIP-2 in vitro
A migração in vitro em câmara de Boyden utilizando MIP-2 como agente
quimioatrator direto, demostrou que LSL (20 e 60 µg/ml) não inibiu a quimiotaxia
direta de neutrófilos (20,33 ± 0,62 neutrófilos/campo e 19,17 ± 0,68
neutrófilos/campo, respectivamente) quando comparado ao grupo controle positivo
de neutrófilos atraídos por MIP-2 sem a presença da lectina (19,0 ± 0,63
neutrófilos/campo). Adicionalmente o controle negativo (RPMI) não provocou
significante migração de neutrófilos (6,03 ± 0,42 neutrófilos/campo) (figura 9)
82
0.0
0.5
1.0
1.5
Falso Imunizado
Imunizado
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
IgG
A
D.O. 490 nm
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Salina
FI
OVA (10 µg/cavidade)
LSL
3 mg/kg
-
LSL
10 mg/kg
*
*
#
Imunizado
B
Neutrófilos x 10
6
/ cavidade
Figura 8 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz migração de neutrófilos
(MN) induzida por ovoalbumina (OVA) em camundongos imunizados.
PAINEL A – A titulação da
cinética da IgG específica anti-OVA foi acompanhado em camundongos imunizados (∆) e falso-
imunizados (▲) por ELISA.
PAINEL B – Os camundongos imunizados foram tratados e.v. com salina
ou LSL (3 ou 10 mg/kg) 15 min antes de receberem OVA (10
µg/cavidade i.p.). Nos controles, os
animais falso-imunizados (FI) também foram desafiados com OVA (10
µg/cavidade i.p.) e os animais
imunizados também receberam salina. A MN foi determinada 4 h após a OVA. Os resultados são
expressos com média ± E.P.M. do n. de neutrófilos/cav (n=6). * indica significância estatística
(p<0.05) comparado ao grupo imunizado e administrado com OVA;
#
comparado ao grupo salina
(ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
83
0
5
10
15
20
25
RPMI
MIP-2
RPMI
LSL (µg/ml)
20
60
No de neutrófilos /campo
Figura 9 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) não inibe quimiotaxia de
neutrófilos induzida por MIP-2 in vitro.
MIP-2 (10
-7
M), foi utilizado como agente quimiotático
direto em microcâmaras. Os grupos tratados receberam LSL (20 e 60
µg/ml) nas microcâmaras. O
grupo controle foi estimulado com RPMI. Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. do
número de neutrófilos por campos de um total de cinco campos por poço (6 poços por grupo). *p<
0,05 comparado ao grupo RPMI. ANOVA – Bonferroni
84
4.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINOCICEPTIVA
4.2.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a freqüência de contorções
abdominais induzidas por ácido acético em camundongos.
O ácido acético (0,6%) administrado por via intraperitonial produziu um
certo número de contorções abdominais nos camundongos (18,9 ± 1,2
contorções/20 min). A lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) foi
administrada por via i.v. nas doses de 1; 10 e100 mg/kg; as doses de 10 e 100
mg/kg reduziram de forma significante (p<0,05) o número de contorções abdominais
induzidas por ácido acético para valores de 6,4 ± 2,0 e 2,2 ± 0,97 contorções/20 min
(inibição de 66,1 e 87,8% respectivamente). O controle foi realizado com o ácido
acetilsalicílico (AAS) no qual reduziu o número de controções abdominais em 9,7 ±
2,1 contorções/20min (inibição de 49%) (figura 10).
4.2.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus apresenta atividade antinociceptiva
somente na fase inflamatória do teste da formalina
Formalina (1,2%) administrada por via intraplantar produziu um aumento no
tempo de lambedura da pata tanto na primeira (0-5 min; neurogênica) quanto na
segunda fase (20-25 min; inflamatória), esses valores foram de 73,6 ± 8,0 segundos
e 45,6 ± 8,1 segundos, respectivamente. A lectina de sementes de Lonchocarpus
sericeus (LSL) administrada por via i.v. na dose de 10 mg/kg reduziu de forma
significante (p<0,05) o tempo de lambedura da pata somente na segunda fase
(inflamatória) para um valor de 3,57 ± 2,6 segundos (inibição de 92%). Morfina
(morf.) foi utilizada como droga controle e reduziu de forma significante (p<0,05) o
tempo de lambedura na primeira (19,43 ± 3,35, inibição de 74%) e segunda fase
(0,85 ± 0,46, inibição de 98%) do teste (figura 11).
85
0
5
10
15
20
25
1 10
100
Ác. acético 0,6%
250Salina
AAS (mg/Kg)
*
*
*
LSL(mg/Kg)
Número de contorções
Figura 10 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz o número de contorções
abdominais induzidas por ácido acético em camundongos.
A nocicepção foi mensurada
imediatamente após injeção de ácido acético (AC;0,6%) na cavidade peritoneal dos camundongos.
Ácido acetilsalicílico (ASS 250 mg/Kg; s.c.) ou LSL (1, 10 e 100 mg/kg; i.v.) foram administrados 15
min. antes do AC. O grupo controle (salina) recebeu apenas AC. Os resultados são expressos com
media ± E.P.M. do n. de contorções abdominais (n=8). * indica significância estatística (p<0.05)
comparado ao grupo controle (salina); (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
0
20
40
60
80
*
*
*
1
a
fase
2
a
fase
Formalina
Formalina
Salina
Morf
LSL
10 mg/kg
Salina
Morf
LSL
10 mg/kg
tempo de lambedura (s)
Figura 11 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) inibe a segunda fase do teste
de formalina em camundongos.
A nocicepção foi mensurada imediatamente após injeção
intraplantar de formalina (1,2%) nos tempos de 0-5 min (fase neurogênica) e 25-30 min (fase
inflamatória). Morfina (Morf 5 mg/Kg; s.c.) ou LSL (10 mg/kg; i.v.) foram administrados 15 min. antes
da formalina. O grupo controle (salina) recebeu apenas formalina. Os resultados são expressos com
media ± E.P.M. do tempo de lambedura (s) (n=8). * indica significância estatística (p<0.05)
comparado ao grupo controle (salina); (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
86
4.2.3 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus não interfere no tempo de
reação dos camundongos no modelo da placa quente
A placa aquecida a 51 ± 0,5 ºC produziu durante a avaliação (30; 60 e 90
minutos) um tempo de reação nos camundongos de 17,8 ± 3,7; 18,8 ± 6,9 e 20,1 ±
9,4 segundos, respectivamente. A lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus
(LSL) administrada por via e.v. na dose de 10 mg/kg não aumentou de forma
significante (p<0,05) o tempo de latência dos camundongos na placa em nenhum
dos tempos avaliados. Morfina (agonista dos receptores opióides) foi utilizada como
droga controle e aumentou a latência dos animais na placa durante os tempos de 30
e 60 minutos (38,5 ± 10,1 e 34,3 ± 11,3, respectivamente). A Naloxona (antagonista
dos receptores opióides) quando combinada com a morfina inibiu significantemente
(p<0,05) o aumento de tempo de latência na placa induzido pela morfina nos tempos
de 30 e 60 minutos (23,6 ± 6,8 e 23,1 ± 7,8 segundos, respectivamente) (figura 12).
87
0
10
20
30
40
50
*
*
#
#
T0
T30
T60
Morfina (5 mg/kg)
Morfina (5 mg/kg) + Naloxona (2 mg/kg)
LSL (10 mg/Kg)
Controle
T90
Tempo de reação (s)
Figura 12 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) não apresenta efeito no teste
da placa quente em camundongos.
A nocicepção (tempo de reação) foi mensurada imediatamente
após o aquecimento da placa em 51ºC. Morfina (Morf 5 mg/Kg; s.c.) sozinha ou com naloxona (Nalox.
2 mg/Kg; s.c.) e LSL (10 mg/kg; i.v.) foram administrados 15 min. antes dos animais serem colocados
sobre a placa aquecida. O grupo controle foi colocado sobre a placa aquecida sem receber nenhum
tratamento. Os resultados são expressos com media ± E.P.M. do tempo de reação (s) (n=8). A
mensuração ocorreu durante os tempos de 0, 30, 60 e 90 min. * indica significância estatística
(p<0.05) comparado ao grupo controle; # comparado ao grupo morfina (ANOVA seguido pelo teste de
Bonferroni).
88
4.2.4 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a hipernocicepção mecânica
induzida por carragenina em camundongos, mas não por Prostaglandina E
2
(PGE
2
)
A administração s.c de carragenina (100 µg/pata; s.c.) e PGE2 (100 ng/pata)
na pata traseira direita dos camundongos promoveu um significante efeito
nociceptivo (p < 0.05) quando comparado aos animais que receberam apenas salina
por via intraplantar. Este efeito foi observado pelo aumento da diferença do limiar de
retirada (6,19±0,55 g) e (3,38 ± 1,43 g) nos animais tratados com Cg e PGE2,
respectivamente, em relação ao grupo tratado somente com salina (controle). O pré-
tratamento e.v. com a lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) nas
doses de 3 e 10 mg/kg, 15 min antes da administração de carragenina, inibiu de
forma dose dependente a hipernocicepção mecânica induzida pela Cg para valores
de 3,75 ± 0,66 g e 1,75 ± 0,58 g respectivamente (inibição de 39,4% e 71,7%,
respectivamente) (Figura 13 A). Por outro lado, a LSL não alterou a hipernocicepçào
induzida pela PGE2 em nenhuma das doses (Figura 13 B).
4.2.5. Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a migração de neutrófilos
induzida por carragenina na pata de camundongos
A migração de neutrófilos foi mensurada através da dosagem de
mieloperoxidase (MPO) no tecido da pata dos animais. A administração de
carragenina (100 µg/pata; s.c.) induziu intenso acúmulo de neutrófilos para o interior
da pata dos animais (6,24 ± 0,70 x 10
-6
neutrófilos/mg de tecido). O pré-tratamento
e.v. com LSL nas doses de 3 e 10 mg/kg (e.v.) 15 min antes da administração
intraplantar de carragenina reduziu de forma significante (p <0.05) o acúmulo de
neutrófilos na pata dos animais. Esta redução foi de forma dose-dependente e
alcançou níveis de 1,63 ± 0,08 x 10
-6
neutrófilos/mg de tecido e 0,63 ± 0,06 x 10
-6
neutrófilos/mg de tecido, respectivamente (inibição de 74 e 90%, respectivamente)
(Figura 14).
89
0
1
2
3
4
5
6
Salina
Salina
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina (100 µg/pata)
*
#
*
A
∆
Limiar de retirada (g)
0
1
2
3
4
5
Salina
Salina
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
PGE
2
(100 ng/pata)
#
B
∆
Limiar de retirada (g)
Figura 13 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz hipernocicepção
mecânica induzida por carragenina, mas não por PGE.
PAINEL A - hipernocicepção induzida por
Cg.
PAINEL B - hipernocicepção induzida por PGE
2
. A hipernocicepção foi mensurada antes e 3 h
após injeção nas patas traseiras de camundongo de veículo (salina) ou carragenina (100
µg) ou PGE
2
(100 ng/pata). Salina ou LSL (3 ou 10 mg/kg) foi injetada e.v. 15 minutos antes da administração dos
estímulos. Os resultados são expressos com media ± E.P.M. da intensidade de hipernocicepção (∆
limiar de reação, g) (n=8). * indica significância estatística (p<0.05) comparado ao grupo Cg ou PGE
2
;
#
comparado ao grupo salina (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
90
0
1
2
3
4
5
6
7
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina (100 µg/pata)
*
*
#
Neutrófilos 10
6
/mg
Figura 14 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz o influxo de neutrófilos
na pata de camundongos estimulados com carragenina.
Veículo (salina) ou LSL (3 ou 10 mg/kg)
foram injetados e.v., e 15 minutos depois, carragenina (100
µg/pata; 0.25ml) foi administrado na pata
traseira dos animais. O grupo controle negativo recebeu apenas salina. A atividade da
mieloperoxidase na pata traseira foi usada como um indicador do influxo de neutrófilos. Os resultados
são expressos como média ± E.P.M. do número de neutrófilos (n=6). * indica significância estatística
(p<0.05) comparado ao grupo Carragenina (-);
#
comparado ao grupo salina (ANOVA seguido pelo
teste de Bonferroni).
91
4.2.6 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis de TNF-α e IL-1β nas
patas de camundongos estimulados com carragenina.
A administração intraplantar de carragenina (100 µg/pata; s.c.) induziu um
significante (p<0,05) aumento nos níveis de TNF-α (241,9 ± 17,8 pg/mL; painel A) e
IL-1β (801,3 ± 67,6 pg/mL painel B) na pata dos animais após 2 horas do tratamento
(Figura – 15). O pré-tratamento com LSL (3 ou 10 mg/kg), 15 min antes dos animais
receberem carragenina s.c., reduziu de forma significante (p<0,05) os níveis de TNF-
α para valores de 130,4 ± 8,78 pg/mL e 88,67 ± 6,15 pg/mL respectivamente
(inibição de 39,3 e 58,7%, respectivamente) (Figura 15 - painel A). LSL (3 ou 10
mg/kg) também reduziu de forma significante (p<0,05) os níveis de IL-1β para
valores de 547,7 ± 34,05 pg/mL e 256,9 ± 27,07 pg/mL respectivamente (inibição de
31,3 e 68%, respectivamente) (Figura 15 – painel B).
4.2.7 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz os níveis MIP-1 e KC nas patas de
camundongos estimulados com carragenina.
A administração intraplantar de carragenina (100 µg/pata) induziu um
significante (p<0,05) aumento nos níveis da quimiocinas CCL3/MIP-1 (497 ± 44,2
pg/mL, painel A), CXCL1/KC (2936 ± 197,6 pg/mL, painel B) e CXCL2/MIP-2 (768,3
± 72,1 pg/mL, painel C) na pata dos animais após 2 horas de tratamento (Figura 16).
O pré-tratamento com LSL (3 ou 10 mg/kg) 15 min antes dos animais receberem
carragenina i.p. reduziu de forma significante (p<0,05) os níveis de MIP-1 para
valores de 252,9 ± 44,9 pg/mL e 191,2 ± 61,31 pg/mL respectivamente (inibição de
49,1 e 61,5%, respectivamente) (Figura 16 - painel A). LSL somente na dose de 10
mg/kg conseguiu reduzir de forma significante (p<0,05) os níveis de KC para valor
de 21166 ± 136,7 pg/mL (inibição de 29%) (Figura 16 - painel B). Os níveis de MIP-2
não foram reduzidos de forma significante por nehuma das doses usadas de LSL
(Figura 16 - painel C)
92
TNF-α
0
50
100
150
200
250
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
*
A
pg/ml
IL-1β
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
*
B
pg/ml
Figura 15 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os níveis de citocinas
(TNF-α e IL-1β) na pata de camundongos estimulados com carragenina.
PAINEL A – níveis de
TNF-
α. PAINEL B – níveis de IL-1β. Os animais receberam salina (controle) ou LSL (3 ou 10 mg/kg)
e.v. 15 minutos antes da administração carragenina (100
µg/pata; s.c.). Os animais controle
receberam salina s.c. A concentração das citocinas foi determinada por ELISA. Os resultados são
expressos como media
± E.P.M. de pg de citocina/mL (n=5). * indica significância estatística (p<0.05)
comparado ao grupo Carragenina (-). (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
93
CCL3/MIP-1
0
100
200
300
400
500
600
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
*
A
pg/ml
CXCL1/KC
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
*
B
pg/ml
CXCL2/MIP-2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Salina
-
LSL
3 mg/kg
LSL
10 mg/kg
Carragenina
C
pg/ml
Figura 16 - Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz os níveis de MIP-1 e KC
na pata de camundongos estimulados com carragenina.
PAINEL A – níveis de CCL3. PAINEL B
– níveis de CXCL1. PAINEL C – níveis de CXCL2. Os animais receberam salina (-) ou LSL (3 ou 10
mg/kg) e.v. 15 minutos antes da administração de carragenina (100
µg/pata; s.c.). Os animais controle
receberam apenas salina s.c. A concentração das quimiocinas foi determinada por ELISA. Os
resultados são expressos como media
± E.P.M. de pg de quimiocina/mL (n=5). * indica significância
estatística (p<0.05) comparado ao grupo Carragenina (-). (ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni).
94
4.2.8 Lectina de Lonchocarpus sericeus reduz a hiperalgesia mecânica induzida
por OVA em camundongos imunizados.
Após a administração intraplantar de OVA (3µg/pata; s.c.) nos camundongos
imunizados ocorreu um significante efeito nociceptivo (p < 0.05) quando comparado
aos animais falso imunizados. Este efeito foi observado pelo aumento na diferença
do limiar de retirada (3,80
± 0,83 g). O tratamento e.v. com LSL (3 e 10mg/kg), 15
min antes dos animais receberem o estímulo nociceptivo (OVA) reduziu de forma
significante (p<0,05) e limiar de retirada para valores de 0,71
± 0,20 g e 0,47 ± 0,20
g, respectivamente (redução de 81,3 e 87,6%, respectivamente) (Figura 17).
95
0.0
2.5
5.0
Salina
FI
OVA (3 µg/pata)
LSL
3 mg/kg
-
LSL
10 mg/kg
#
*
*
Imunizado
∆
Limiar deretirada (g)
Figura 17 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) reduz a hipernocicepção
induzida por ovoalbumina (OVA) em camundongos.
A hipernocicepção mecânica foi avaliada
depois de 3h da administração de 3
µg/pata de ovoalbumina (OVA) (intraplantar) em camundongos
imunizados (-) ou falso-imunizados (FI). Os camundongos imunizados (controle) receberam a
administração de salina (25
µl/pata). No grupo tratado LSL (3 e 10 mg/kg) foi administrada 15 min.
antes da adminsitração de OVA. Os resultados são expressos com media ± E.P.M. da intensidade de
hipernocicepção (∆ limiar de reação, g) (n=6) * indica significância estatística (p<0.05) quando
comparado ao grupo injetado com OVA (-)
#
comparado ao grupo salina (ANOVA seguido pelo teste
de Bonferroni).
96
4.3 ESTUDO DA ATIVIDADE DA Lonchocarpus sericeus SOBRE O SISTEMA
NERVOSO CENTRAL
4.3.1 Lectina de Lonchocarpus sericeus não modificou a coordenação motora de
camundongos no teste de rota rod.
Entre os grupos salina e LSL (10 mg/Kg) administrados e.v. em
camundongos, 30 min antes de serem colocados na barra, não houve diferença
estatística significante (p>0,05). Os animais do grupo controle apresentaram um
tempo de permanência na barra de 119,6
± 0,3 segundos, enquanto que nos
animais do grupo tratado com LSL (10 mg/kg) o tempo de permanência na barra foi
de 119,5 ± 0,4 segundos. Somente o grupo administrado com diazepam, usado
como controle (2 mg/Kg; i.p.) mostrou uma perda da coordenação motora
significativa (18,5
± 5,2 segundos), quando comparados aos do grupo de animais
não tratados (p<0,05) (Figura 18).
4.3.2 Lectina de Lonchocarpus sericeus não modificou a locomoção espontânea
de camundongos no teste de campo aberto.
Entre os grupos salina e LSL (10 mg/Kg) administrados e.v., em
camundongos, 30 min antes de serem colocados no campo aberto, não houve
diferença estatística significante (p>0,05). Os animais do grupo controle
apresentaram um deslocamento de 58
± 3,8 campos explorados/4 min, enquanto
que os animais do grupo tratado com LSL (10 mg/kg) apresentaram um
deslocamento de 51
± 7,8 campos explorados/4 min (Figura 19).
97
4.3.3 Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus não alterou o tempo de
imobilização dos camundongos no teste de nado forçado.
Entre os grupos salina e LSL (10 mg/Kg) administrados e.v., em
camundongos, 30 min antes de serem colocados na água para verificar o tempo de
imobilização, não houve diferença estatística significante (p>0,05). Os animais do
grupo controle apresentaram um tempo de imobilização de 136,3
± 15 segundos,
enquanto que os animais do grupo tratado com LSL (10 mg/kg) apresentaram um
tempo de imobilização de 113,6
± 11,3 segundos (Figura 20).
98
Sal Diazepam 10
0
50
100
LSL (mg/Kg)
Tempo de permanência
na barra (s)
Figura 18 – A coordenação motora de camundongos não é afetada pela administração da
lectina de sementes de Lonchocapus sericeus (LSL).
Os animais receberam 30 min antes de
serem colocados sobre a barra: salina (controle; e.v.) ou diazepam (2 mg/Kg; i.p.) ou LSL (10
mg/Kg; e.v.), respectivamente. Os valores representam a média ± E.P.M do tempo de
permanência na barra em segundos (s) durante 2 minutos (n=8). * p<0,05 indica diferença
estatística significante quando comparado ao grupo controle. (ANOVA seguido pelo teste de
Bonferroni).
Salina 10
0
10
20
30
40
50
60
70
LSL (mg/kg)
Total de campos
explorados 4/mim
Figura 19 – A locomoção espontânea de camundongos não é afetada com a administração
da lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL)..
Os animais receberam 30 min antes
de serem colocados no campo aberto: salina (controle; e.v.) ou LSL (10 mg/Kg; e.v.),
respectivamente. Os valores representam a média ± E.P.M do total de campos explorados
durante 4 minutos. * p<0,05 indica diferença estatística significante quando comparado ao grupo
controle. (Test Student).
99
0
100
200
Salina
10
LSL (mg/kg)
Tempo de imobilização (s)
Figura 20 – Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) não provoca efeito
depressor em camundongos.
Os animais receberam 30 min antes de serem colocados na
água: salina (controle; e.v.) ou LSL (10 mg/Kg; e.v.), respectivamente. Os valores representam a
média ± E.P.M do do tempo de imobilização (segundos). * p<0,05 indica diferença estatística
significante quando comparado ao grupo controle. (Test Student).
100
4.4 EFEITO DO TRATAMENTO AGUDO COM LECTINA DE SEMENTES DE
Lonchocarpus sericeus EM CAMUNDONGOS
.
LSL (10 mg/Kg; e.v.) quando administrada em um esquema posológico de
dose diária única durante sete dias consecutivos não afetou significativamente
(p<0,05) a massa corporal dos camundongos ou o peso úmido dos órgão avaliados
(fígado, rim e coração), comparados com os animais que receberam somente salina
estéril no mesmo esquema posológico. Todos os órgãos avaliados demonstraram
aparência normal e ausência de edema ao final do tratamento agudo com a lectina.
Adicionalmente, a avaliação macroscópica do estômago demonstrou uma mucosa
intacta e sem lesões visíveis em ambos os grupos avaliados (LSL ou salina). Os
valores de uréia obtidos, usados como parâmetro para a avaliação da função renal
não foi significativamente (p<0,05) diferentes dos animais controle. Quando
comparado com o controle (salina) a função hepática avaliada pela cinética das
enzimas hepáticas (alanina amino transferase-ALT e aspartato amino transferase-
AST) e o número de leucócitos circulantes no sangue não foram alterados
significativamente (p<0,05) pelo tratamento com a lectina. A dose utilizada no
tratamento agudo foi à mesma que demonstrou atividade antiinflamatória e
antinociceptiva (Tabela 1).
101
Tabela 1 – Tratamento agudo dos camundongos com Lonchocarpus sericeus
(LSL) não induz toxicidade sistêmica
Tratamento ( 0.1 mL; i.v.)
Parâmetros
Salina LSL (10 mg/Kg)
Massa corporal (g) depois 33.3 ± 0.4 30.7 ± 0.1
Massa corporal (g) antes 34.8 ± 0.6 29.6 ± 0.8
Fígado (g/10 g peso corporal) 0.45 ± 0.0 0.50 ± 0.0
Rim (g/10 g peso corporal) 0.06 ± 0.0 0.07 ± 0.0
Coração (g/10 g peso corporal) 0.05 ± 0.0 0.05 ± 0.0
Leucócitos totais x 10
3
/mL 6119 ± 503.9 9144 ± 1117.0
Neutrófilos x 10
3
/mL 1265 ± 153.3 1138 ± 153.4
Uréia (mg/dL) 48.0 ± 1.3 46.0 ± 2.2
ALT (UI/L) 33.2 ± 2.3 32.8 ± 3.4
AST (UI/L) 52.7 ± 3.4 62.1 ± 4.8
Os camundongos foram administrados com doses diárias únicas durante sete dias consecutivos.
Após sete dias de tratamento, os animais foram pesados, amostras de sangue foram coletadas para
avaliar o leucograma e dosagens bioquímicas, posteriormente os animais foram sacrificados e os
órgãos ainda úmidos foram pesados. Os valores são apresentados como média ± E.P.M. (Test
Student)
102
DISCUSSÃO
103
5 DISCUSSÃO
Os principais leucócitos a participarem na defesa contra patógenos são os
neutrófilos, entretanto, em alguns casos a infiltração excessiva destas células com
liberação de grandes quantidades de mediadores inflamatórios, enzimas lisossomais
e radicais livres leva ao dano tecidual. Isto é comum em diversas doenças de cunho
imune inflamatório (MALECH; GALLIN, 1987; JONES
et al., 1991).
Este estudo foi baseado nos primeiros dados descritos por Alencar et al.,
1999, que demonstram que a lectina de semetes de
Lonchocarpus sericeus reduz a
peritonite e o edema de pata induzidos por carragenina em ratos e que este efeito
pode estar relacionado com o efeito lectínico. O atual estudo realizado em
camundongos demonstrou que a mesma lectina de sementes de
Lonchocarpus
sericeus (LSL) apresenta uma eficiente capacidade de inibir a infiltração de
neutrófilos induzida por agentes inflamatórios inespecíficos (carragenina) e
antigênicos (ovalbumina).
A carragenina é uma substância caracterizada por elicitar a liberação de
vários mediadores inflamatórios, tais como aminas biogênicas na primeira fase, que
são responsáveis pelo desenvolvimento dos eventos vasculares, que numa segunda
fase é mantida por outros mediadores, tais como citocinas (IL-1 e TNF-
α),
prostaglandinas e óxido nítrico. Associado a isso, esse edema também é
caracterizado por apresentar um infiltrado celular intenso, onde destaca-se a
presença de neutrófilos com produção de radicais livres derivados do oxigênio
(MORRIS
et al., 2003).
O tráfego de neutrófilos para o tecido lesionado por trauma, agentes
flogísticos ou imunógenos é um processo seqüencial e coordenado que requer uma
série de moléculas que reagem sincronicamente (citocinas/quimiocinas, selectinas,
integrinas, moléculas de adesão). Leucócitos podem responder a TNF-
α e IL-1β
ativando e expressando integrinas, produzindo fator ativador de plaquetas, e outros
mediadores. Embora ambas as citocinas (TNF-
α e IL-1β) não sejam agentes
quimiotáticos diretos, estas moléculas mobilizam selectinas de células endoteliais e
produzem supra regulação “up regulation” das moléculas de adesão celular. Por
outro lado, citocinas sinérgicas podem induzir a produção de quimiocinas, as quais
104
podem contribuir para um aumento no rolamento, adesão e quimiotaxia de
leucócitos (WAGNER; ROTH, 2000).
Neste estudo foi demonstrado que LSL é capaz de reduzir a migração de
neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos administrados com
carragenina. Esta inibição da migração ocorre pela redução da intensidade de
interação entre os leucócitos e o endotélio (rolamento e adesão) em resposta a
administração de carragenina. LSL também se mostrou hábil em reduzir a liberação
de citocinas/quimiocinas, este mecanismo também pode estar relacionado com a
redução do influxo de neutrófilos para o sítio da injúria, uma vez que estes
mediadores atuam expressando moléculas de adesão, aumentando a avidez de
ligação entre estas moléculas de adesão, ativando neutrófilos e promovendo
quimiotaxia.
A adesão ao endotélio é um pré-requisito para a infiltração dos neutrófilos
no local da inflamação. Este processo é mediado pelas selectinas, que através de
domínios lectínicos reconhecem e interagem de forma específica com carboidratos
de superfície. Entre as moléculas envolvidas na adesão firme de neutrófilos estão
CD11b/CD18 (nos neutrófilos) ou ICAM-1 e VCAM-1 nas células endoteliais
(ROBBINS
et al., 2005).
Estudos da base molecular de adesão de selectinas têm sido focalizados
principalmente no reconhecimento de carboidrato pelo domínio lectínico (FEIZI,
1993; ROSEN; BERTOZZI, 1994). A identificação de ligantes fisiológicos para
selectinas tem sido alvo de muitos estudos, pois como muitas lectinas, as selectinas
podem se ligar a uma variedade de estruturas de carboidratos
in vitro (TEDDER et
al.,
1995). Lectinas vegetais já foram sugeridas como sendo moléculas capazes de
bloquear essa ligação e assim inibir a migração celular
in vivo (ASSREUY et al.,
1997; 1999; ALENCAR
et al., 1999). Assim, não se pode descartar a possibilidade
de que LSL possa eventualmente estar bloqueando o sítio para ligação para as
selectinas endógenas e desta forma impedir a migração de neutrófilos por reduzir o
rolamento e adesão.
Outros mediadores influenciam na expressão de moléculas de adesão,
tais como o óxido nítrico (NO). Está bem demonstrado na literatura a participação do
105
óxido nítrico (NO) no processo inflamatório e nociceptivo. Estes estudos
demonstraram que o NO também interfere com o recrutamento de neutrófilos
podendo inibir ou induzir a migração dessas células (IALENTI
et al., 2000; PAUL-
CLARK
et al., 2001; MCCARTNEY-FRANCIS et al., 2001).
Kubes
et al. (1991) demonstraram em seus resultados, que o NO pode
ser um importante inibidor endógeno de adesão leucocitária em vênulas pós-
capilares, pois a inativação do NO pela produção identificada de O
2
-
pelas células
endoteliais e/ou neutrófilos, ou a inativação da produção do NO pelos inibidores de
NOS (L-NAME) pôde contribuir com a aderência leucocitária.
Secco
et al. (2006) demonstraram que o efeito inibitório do NO sobre a
expressão de ICAM-1 é mediado via ativação da guanilato ciclase solúvel, pois
inibidores da NOS e o inibidor solúvel da guanilato ciclase (ODQ) foram capazes de
aumentar a migração de neutrófilos em modelo de peritonite induzida por Cg e LPS,
mas os animais tratados com um doador de NO (S-nitroso-N-acetilpenicilamina)
foram capazes de apresentar uma redução na migração dessas células.
De acordo com Liaudet
et al. (2000) a ativação da guanilato ciclase
solúvel pelo NO constitui a principal via de sinalização deste gás, que envolve a
regulação de uma disposição vasta de funções biológicas, incluindo não só o
relaxamento do músculo liso seja ele vascular ou não vascular, mas também como
transdutor no sistema nervoso central, inibição da agregação plaquetária e inibição
da adesão leucocitária no endotélio.
A produção de NO induzida por lectinas de leguminosas isoladas de
Canavalia brasiliensis, Dioclea grandiflora, Pisum arvense e Concanavalina A foi
demonstrado por Andrade
et al (1999), ao qual evidenciaram a capacidade dessas
lectinas em induzirem a produção de NO in vitro e in vivo por macrófagos peritoneais
através da administração local dessas lectinas. Estes autores sugerem que este
efeito pode estar envolvido nas atividades antitumoral e antiparasitária dessas
lectinas.
Mais recentemente, em outro estudo realizado
in vitro demonstrou-se que
macrófagos murinos quando isolados do peritônio, e tratados com a lectina de
Concanavalina A, foram capazes de induzir um aumento na produção de NO e na
expressão de NOSi por diferentes ligantes aos receptores Toll-like (SODHI
et al.,
106
2007). Kesherwani e Sodhi (2007) também demonstraram, in vitro, a capacidade de
lectina de Concanavalina A e a fitohemaglutinina em induzir a produção de NO e a
expressão de NOSi em macrófagos murinos.
Lima
et al (2004) evidenciaram que a lectina de Bryothamnion triquetrum
foi capaz de promover relaxamento de anéis de aorta isolados de rato dependente
de óxido nítrico e que a associação da lectina com mucina inibiu o relaxamento
induzido por esta. Sugerindo a importância do domínio lectínico com seu ligante
específico.
Mais tarde, Gadelha et al (2005) demonstrou que a lectina de Canavalia
marítima foi capaz de induzir relaxamento da aorta isolada de ratos dependente de
NO.
Diante das informações expostas, fomos investigar se a atividade
antiinflamatória demonstrada pela LSL poderia estar relacionada à produção de NO.
Verificamos então se o tratamento e.v. com a LSL acarretaria em modificações nos
níveis sanguíneos de NO. Como resultado, demonstrou-se que a LSL foi capaz de
aumentar a produção de NO (via aumento dos níveis de nitrito) no soro dos animais
submetidos à peritonite induzida por Cg. Este resultado foi reforçado pelo efeito
reversor do inibidor da síntese de NO (aminoguanidina) sobre a atividade da LSL na
migração de neutrófilos induzida por carragenina. Sugerindo então que,
provavelmente esta liberação de NO induzida pela LSL também pode estar
relacionado com a redução da expressão de moléculas de adesão com conseqüente
redução da migração de leucócitos para o sítio da injúria.
Adicionalmente, LSL foi incapaz de inibir a migração de neutrófilos
in vitro
induzida diretamente por MIP-2 (quimioatrator direto para neutrófilos), sugerindo
assim, que esta lectina não atua diretamente na célula inflamatória (neutrófilo) para
inibir a migração. Isso reforça a teoria de que LSL apresenta um mecanismo indireto
de inibição.
Após a discussão dos prováveis mecanismos de inibição da migração de
neutrófilos, elaboramos as seguintes hipóteses: 1) a lectina atua inibindo a produção
de citocinas/quimiocinas e desta forma reduzindo a migração e quimiotaxia de
neutrófilos.; e/ou 2) a lectina quando injetada sistemicamente é capaz de induzir a
produção de NO e/ou 3) a lectina age diretamente sobre as moléculas de interação
leucócito/endotélio bloqueando o sítio de ligação para as selectinas endógenas e
reduzindo o rolamento .
107
Figura 21 – Representação esquemática da hipótese do efeito antiinflamatório da
lectina de Lonchocarpus sericeus.
LSL quando injetada sistemicamente (e.v.) pode
possivelmente bloquear o sítio de ligação para as selectinas endógenas e/ou reduzir a
produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias e/ou aumentar os níveis sistêmicos de
óxido nítrico. Estes mecanismos podem estar explicar com a atividade inibitória da LSL
sobre a migração de neutrófilos.
O interesse para o uso clínico de novas substâncias com atividade
analgésicas, vem aumentando significativamente e vários modelos de nocicepção
em animais de laboratório foram desenvolvidos para verificar a atividade analgésica
de extratos e compostos. O teste de contorções abdominais induzida por ácido
acético é descrito como um típico modelo para avaliar a dor de origem inflamatória e
utilizada na indústria para pesquisa de drogas com atividade analgésica (PORECCA
et al., 1987) Porém este modelo é pouco específico uma vez que drogas não
analgésica como: Atropina, antihistamínicos, antidepressivos tricíclicos e
antihipertensivos são capazes de inibir as contorções neste modelo (CHERNOV
et
al.
, 1967; TAKAHASHI; PAZ, 1987; YEH, 1986). O comportamento de contorções
em camundongos é utilizado para avaliar um possível potencial analgésico central
e/ou periférico de drogas, uma vez que o ácido acético induz algesia através da
liberação de substâncias inflamatórias por macrófagos e mastócitos peritoneais,
além da sensibilização das fibras sensoriais aferentes periféricas (RIBEIRO
et al.,
2000). Apesar da baixa especificidade, esse teste pode ser considerado um teste
pré-clínico de importância para avaliação do efeito antinociceptivo, porque permite
108
uma correlação adequada entre o valor da dose eficaz, obtido em animais, e as
doses analgésicas em humanos (COLLIER
et al., 1968).
Neste modelo, a administração de um agente irritante na membrana
serosa, como o ácido acético, provoca comportamentos estereotipados que são
caracterizados por contorções abdominais, redução e incoordenação da atividade
motora. Estes comportamentos são considerados reflexos e evidenciam a dor
visceral (LE BARS
et al., 2001). A irritação local, provocada pela administração
deste agente na cavidade intraperitoneal desencadeia a liberação de vários
mediadores como a bradicinina, substância P e prostaglandinas, bem como algumas
citocinas como IL-1β, TNFα e IL-8. Adicionalmente o influxo de leucócitos parece
amplificar este processo (RIBEIRO
et al., 2000; IKEDA et al., 2001). Estes
mediadores ativam nociceptores quimiossensíveis que contribuem com o
desenvolvimento da dor de origem inflamatória. No nosso estudo observamos que a
administração sistêmica, e.v. de LSL reduziu, de maneira significativa, o número de
contorções abdominais produzidas pela injeção i.p. de ácido acético em
camundongos, sugerindo que este efeito antinociceptivo pode estar relacionado com
qualquer uma das vias citadas anteriormente. Além disso, um inibidor clássico da
síntese de prostaglandinas (ácido acetilsalicílico) também foi capaz de reduzir o
número de contorções abdominais.
Outro modelo empregado para investigação de substâncias com potencial
antinociceptivo é o de nocicepção induzida por formalina. A resposta provocada pela
formalina constitui-se duas fases de nocicepção: uma fase inicial e uma tardia, que
parecem envolver mediadores químicos diferentes (TJOLSEN; HOLE, 1997;
VANEGAS; SCHAIBLE, 2001).
A fase inicial é caracterizada pela dor de origem neurogênica causada
pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras sensoriais aferentes,
principalmente fibras do tipo C. A fase tardia é representada pela dor de origem
inflamatória que é desencadeada por uma combinação de estímulos que incluem
inflamação nos tecidos periféricos e mecanismos de sensibilização espinhal e
central. Diversos mediadores inflamatórios (bradicinina, histamina, serotonina,
prostaglandinas, citocinas, aminas simpatomimíticas dentre outros) estão
relacionados com desenvolvimento desta atividade nociceptiva (TJØSEN
et al.,
109
1992; TJOLSEN; HOLE, 1997; HONG; ABBOTT, 1996, JOURDAN et al., 1997,
HAMA; MENZAGHI, 2001, LE BARS
et al., 2001; PARADA et al., 2001).
Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível mostrar que a LSL
inibiu o tempo de lambedura das patas dos animais, somente na segunda fase do
teste. Conforme já descrito na literatura, drogas com efeitos centrais como a morfina
e outros narcóticos, inibem ambas as fases do teste (HUNSKAAR
et al., 1985;
SHIBATA
et al., 1989), mas a ação de drogas antiinflamatórias (DAINES e
dexametasona) que inibem a formação ou a ação dos mediadores inflamatórios e
nociceptivos inibem somente a segunda fase na nocicepção induzida por formalina
(SHIBATA
et al., 1989; CHEN et al.,1995). Esses resultados sugerem uma possível
ação da LSL na nocicepção de cunho inflamatório, e esta ação pode estar
relacionada com a síntese e/ou ação destes mediadores nociceptivos e
inflamatórios. Além disso, em nossos resultados, morfina foi capaz de reduzir
ambas as fases do teste, confirmando os dados da literatura.
O teste da placa quente indica a resposta ao estímulo térmico que é
associado à neurotransmissão central (HUNSKAAR
et al., 1996). O comportamento
do animal de “sapatear” ou lamber as patas é a indicação da resposta ao estímulo
nociceptivo térmico, enquanto que a latência para o aparecimento desta resposta é
cronometrada em segundos.
LSL não foi capaz de apresentar efeito antinociceptivo no teste da placa
quente, desta forma não aumentou o tempo de reação dos animais, somente à
morfina aumentou significativamente o tempo de reação. Estes resultados reforçam
os achados no teste da formalina, onde a LSL não apresentou atividade
antinociceptiva de cunho neurogênico.
Para investigar mais detalhadamente a atividade da LSL na dor de origem
inflamatória, delineamos um estudo com atividade hiperalgésica, em modelos de
hiperalgesia mecânica (Von Frey). Posteriormente, tentamos explicar estes efeitos
antinociceptivos através de uma possível interação da atividade antihiperalgésica
com a atividade antiinflamatória (inibição da migração e neutrófilos) já citada
anteriormente e em outros trabalhos (ALENCAR
et al., 2005a).
Neste presente estudo, nós demonstramos que o pré-tratamento de
camundongos com LSL inibiu a hipernocicepção inflamatória induzida por
110
carragenina. Esta atividade antihiperalgésica parece compartilhar do mesmo
mecanismo da atividade antiinflamatória, uma vez que neste modelo de hiperalgesia,
LSL foi capaz de reduzir a migração de neutrófilos para a pata de camundongos
administrados com carragenina. Em adição, esta lectina também se mostrou hábil
em reduzir a liberação de citocinas/quimiocinas o qual pode está relacionado com a
redução do influxo de neutrófilos para o sítio da injúria (pata dos camundongos
tratados com carragenina).
Durante estudos para elucidação dos mecanismos celulares que
envolvem a hipernocicepção inflamatória, tem sido demonstrado que estímulos
inflamatórios nem sempre atuam diretamente induzindo a liberação de
prostaglandinas e aminas simpáticas. Entretanto, uma já bem definida e
sequenciada cascata de citocinas/quimiocinas precedem a liberação destes
mediadores hipernociceptivos finais (FERREIRA
et al., 1988, CUNHA et al., 1991;
LORENZETTI
et al., 2002; CUNHA et al., 1992; CUNHA et al., 2005;). A
hipernocicepção mecânica induzida por carragenina consiste de um componente
periférico que envolve sensibilização dos nociceptores por liberação de
prostaglandinas e aminas simpatomiméticas. Este processo é iniciado pela liberação
de TNF-
α, o qual estimula a formação de interleucinas (IL-1β e IL-6) e formação de
quimiocinas (CINC-1 em ratos e KC em camundongos). Subsequentemente, IL-1
β e
IL-6 podem estimular a produção de prostaglandinas (FERREIRA
et al., 1988,
CUNHA,
et al., 2005). Além disso, quimiocinas são capazes de induzir a liberação de
aminas simpatomiméticas por fibras nervosas sipáticas (CUNHA et al., 1991; 2005).
Nós demonstramos que a administração de LSL reduz significativamente
as concentrações de citocinas (TNF-
α e IL-1β) e quimiocinas (CCL3, CXCL1) na
cavidade peritoneal e tecido intraplantar estimulados com a administração de
carragenina. Estes dados indicam que o efeito antihiperalgésico pode ocorrer devido
ao bloqueio da produção de citocinas e quimiocinas, sendo este efeito um evento
inicial o qual reduz a expressão de selectinas e moléculas de adesão celular nas
células endoteliais, o que resulta numa redução do número de leucócitos que rolam
e aderem ao endotélio vascular (confirmado no ensaio de microscopia intravital).
Além disso, a redução de citocinas como TNF-
α e IL-1β podem culminar na redução
da liberação de mediadores hiperalgésicos finais como as prostaglandinas e aminas
111
simpáticas, desta forma inibindo indiretamente o comportamento hiperalgésico dos
animais.
Esta hipótese é reforçada pelo fato da administração de LSL não inibir a
hipernocicepção mecânica induzida por prostaglandina E
2
, o qual se trata de um
mediador hiperalgésico final no processo de liberação de mediadores
hipernociceptivos, os quais podem ser induzidos por citocinas/quimiocinas (citado
anteriormente).
Outras hipóteses adicionais podem ser utilizadas para explicar a atividade
antihiperalgésica. Como relatado anteriormente LSL foi capaz de induzir a produção
de óxido nítrico (NO), o qual é um modulador negativo da resposta nociceptiva. A
administração de NO causa analgesia acompanhada de aumento na produção de
GMP
c
nos neurônios sensoriais periféricos primários (DUARTE et al., 1992;
FERREIRA
et al., 1991). Ferreira et al. (1999) demonstraram que a administração de
doadores de óxido nítrico bloqueia a hiperalgesia induzida por PGE
2
e esse efeito é
revertido por L-NAME (L-nitro arginina metil éster) e azul de metileno (inibidor de
guanilato ciclase). Ferreira
et al. (1991) propuseram ainda que opióides e
analgésicos periféricos como dipirona e diclofenaco causam analgesia por estimular
a via L-arginina/óxido nítrico/ GMP
c
Nosso resultados demonstraram um aumento na produção de NO, e este
aumento pode além de estar relacionado com a redução da migração celular,
também ser diretamente responsável pela atividade antihiperalgésica em animais
pré-tratados com LSL.
112
ESTÍMULOS (LPS e Cg)
Células residentes
- macrófagos -
BK
Mediadores
Mediadores
simp
simp
á
á
ticos
ticos
PGs
PGs
TNF-α
IL
IL
-
-
6
6
IL
IL
-
-
1
1
IL
IL
-
-
8
8
Hiperalgesia inflamatória
Sensibilização do
nociceptor
Quimiocinas
Neutrófilos
monócitos
+
+
NO
NO
-
ESTÍMULOS (LPS e Cg)
Células residentes
- macrófagos -
BK
Mediadores
Mediadores
simp
simp
á
á
ticos
ticos
PGs
PGs
TNF-α
IL
IL
-
-
6
6
IL
IL
-
-
1
1
IL
IL
-
-
8
8
Hiperalgesia inflamatória
Sensibilização do
nociceptor
Quimiocinas
Neutrófilos
monócitos
ESTÍMULOS (LPS e Cg)
Células residentes
- macrófagos -
BK
Mediadores
Mediadores
simp
simp
á
á
ticos
ticos
PGs
PGs
TNF-α
IL
IL
-
-
6
6
IL
IL
-
-
1
1
IL
IL
-
-
8
8
Hiperalgesia inflamatória
Sensibilização do
nociceptor
Quimiocinas
Neutrófilos
monócitos
+
+
NO
NO
-
NO
NO
NO
NO
-
Figura 22 – Representação esquemática da hipótese do efeito antinociceptivo da
lectina de Lonchocarpus sericeus.
LSL quando injetada sistemicamente (e.v.)
possivelmente reduz a produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias e
hiperalgésicas. Estas citocinas são responsáveis pelo aumento da síntese de mediadores
hiperalgésicos e pela migração de neutrófilos que amplifica o processo de hiperalgesia. LSL
pode também estar elevando os níveis de óxido nítrico, o qual é um mediador químico com
atividade antinociceptiva.
Apesar das respostas imunes serem geralmente protetoras, em alguns
casos estas respostas podem ser inapropriadas, produzindo inflamação, injúria
tecidual e dor o qual contribuem para o surgimento e amplificação de importantes
patologias como a asma e a artrite reumatóide. Atualmente, poucos estudos são
realizados no intuito de investigar as influências nociceptivas em reações
imunologicamente mediadas. Cunha
et al. (2003a), demonstraram que ratos
imunizados e desafiados com ovoalbumina produzem mediadores responsáveis pela
hipernocicepção mecânica, este estudo sugeriu que TNF-
α, IL-1β e CINC-1 induzem
liberação de prostaglandinas, aminas simpáticas e leucotrieno B4 em animais
sensibilizados e desafiados com o antígeno. Outros estudos tem demonstrado a
contribuição de endotelinas endógenas na resposta nociceptiva na pata traseira de
camundongos sensibilizados e desafiados com ovoalbumina, estes estudos sugerem
que a administração de ovoalbumina produz nocicepção associada a uma reação
imunologicamente mediada com participação de degranulação mastocitária e
envolvimento da liberação de endotelinas que parecem atuar em receptores ETA e
ETB (PIOVEZAN
et al., 2004).
113
Nosso estudo demonstrou que a administração de LSL reduz
significativamente a hipernocicepção induzida por ovoalbumina, este efeito
provavelmente se deve a redução notável na migração de neutrófilos o que pode
estar associada com a redução na liberação de citocinas (IL-1 e TNF-
α) e
quimiocinas (CCL3 eCXCL1), ou ainda ao aumento nos níveis de NO.
Os resultados obtidos no presente também demonstraram que a LSL não
causou incoordernação motora e nem apresentou qualquer interferência sobre a
atividade locomotora, uma vez que esta lectina não alterou os padrões de
locomoção nos testes de Rota rod. A ação depressora de diversas drogas
analgésicas sobre o sistema nervoso central e sobre o sistema muscular pode gerar
redução de coordenação motora em animais, assim como na expressão do
comportamento nociceptivo (SOJA
et al., 2002)
Um impedimento locomotor relacionado à administração de substâncias
algogênicas reflete o estado de imobilidade prolongada “freezing” dos animais entre
os episódios comportamentais de dor. A dor produz diferentes reações autonômicas
e comportamentais, dependendo da sua localização, e o teste de campo aberto
permite uma fácil observação destas condições (CAVUN
et al., 2004). A
Administração de LSL não interferiu na locomoção dos camundongos quando
comparados ao grupo controle (salina), reforçando os dados obtidos no teste de rota
rod e sugerindo então que LSL não apresenta efeitos centrais.
O padrão de imobilidade do nado forçado tem sido considerado similar a
algumas manifestações da depressão psiquiátrica e utilizada experimentalmente
como parâmetro em estudos de fins práticos para a triagem de drogas
antidepressivas (DETKE
et al., 1997; LUCKI, 1997). O nado é uma defesa para
acidentes naturais, tais como inundações ou queda involuntária na água. A
inescapabilidade nestas situações pode gerar imobilidade, este efeito após um
período de enfrentamento ativo, pode ter a função de conservação de energia para
gasto em condições mais favoráveis, como já sugerido por outros autores
(SANDRIN, 2002; VALENTIM; HOSHINO, 2006), ou ser manifestação de um estado
depressivo que evoluiu filogeneticamente para tornar indiferente o sofrimento da
morte em condições adversas extremas (HOSHINO, 2006). LSL não causou
nenhum efeito depressor, uma vez que esta lectina não aumentou o tempo de
114
imobilização no teste de nado forçado, estes resultados asseguram que o efeito
antinociceptivo observado não está relacionado a efeitos centrais.
Adicionalmente, LSL parece ser bem tolerada por esses animais, pois a
avaliação da toxicidade sub-crônica em camundongos, com a dose utilizada para se
obter o efeito antihiperalgésico durante sete dias não provocou nenhuma alteração
morfológica nos órgãos avaliados (rim, fígado, coração e estômago). Os parâmetros
usados na avaliação da função renal e hepática também não foram alterados
quando comparado ao grupo controle (salina). O número de leucócitos circulantes
no sangue e a massa corporal dos animais mantiveram-se normais depois do
tratamento agudo com a lectina.
O potencial terapêutico de drogas direcionadas contra a adesão entre
leucócitos e endotélio para o tratamento de doenças inflamatórias agudas e crônicas
pode ser promissor. Nossos resultados demonstraram que a lectina de sementes de
Lonchocarpus sericeus não apresenta toxicidade e nem efeitos centrais. Além disso
ela é capaz de inibir a hipernocicepção inflamatória em camundongos. Este efeito
parece ser causado por uma ampla variedade de ações (inibição da migração de
leucócitos, redução dos níveis de citocinas e quimiocinas e aumento na produção de
óxido nítrico) após a administração do estímulo nociceptivo e/ou inflamatório. Estes
resultados requerem fortemente mais investigações para o surgimento da
possibilidade de uso da lectina de sementes de
Lonchocarpus sericeus para o
tratamento de condições inflamatórias e da hipernocicepção inflamatória, ou ainda
como ferramenta farmacológica para o melhor entendimento dos processos de
inflamação e hiperalgesia auxiliando o desenvolvimento de novas drogas.
115
CONCLUSÃO
116
6 CONCLUSÃO
A Lectina de semenetes de
Lonchocarpus sericeus (LSL) apresenta uma
atividade antiinflamatória associada à inibição da migração de neutrófilos. Esta
inibição ocorre pela redução do rolamento e adesão de neutrófilos que pode estar
associada com a redução da síntese e/ou liberação de citocinas (IL-1 e TNF-
α) e
quimiocinas (CCL3 e CXCL1) e com aumento sistêmico nos níveis de óxido nítrico
(NO). LSL também apresenta efeito antiinflamatório inibindo a migração induzida por
agentes antigênicos como a ovalbumina. Entretanto, LSL parece não atuar
diretamente nos neutrófilos para inibir a migração, uma vez que esta lectina foi
incapaz de inibir a migração
in vitro induzida por MIP-2.
No estudo da atividade antinociceptiva, LSL apresentou atividade no
modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. No modelo de
formalina esta atividade ocorre somente na segunda fase, sugerindo uma ação da
LSL na fase inflamatória da dor, e este achado é reforçado pela ausência do efeito
antinociceptivo central da LSL no modelo da placa quente. Na investigação da
atividade desta lectina sobre a fase inflamatória da dor, LSL apresentou atividade
antihiperalgésica em modelo de hiperalgesia mecânica estimulada por carragenina e
ovalbumina, mas não por prostaglandina E
2
. Este efeito também está relacionado
com inibição da migração de neutrófilos e com a inibição da síntese e/ou liberação
de citocinas (IL-1 e TNF-
α) e quimiocinas (CCL3 e CXCL1). Além disso, a atividade
antinociceptiva da LSL pode também envolver a participação de NO.
Adicionalmente, LSL administrada de forma intravascular não provoca
depressão e não altera atividade locomotora dos animais (comprovando sua
atividade periférica). LSL quando administrada de forma aguda durante sete dias
não promove alterações hepáticas e renais, nem no perfil leucocitário sangüíneo e
no peso corporal.
117
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
118
7 REFEÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALDERTON, W.K.; COOPER, C.E.; KNOWLES, R.G. Nitric oxide synthases:
Structure, function and inhibition.
Biochem. J., v. 357, p. 593-615, 2001.
ALENCAR, N.M.N.; TEIXEIRA, E.H.; ASSREUY, A.M.S.; CAVADA, B.S.; FLORES,
C.A.; RIBEIRO, R.A. Leguminous lectins as tools for studying the role of sugar
residues in leukocyte recruitment.
Mediators Inflamm., v. 8, p. 107-113, 1999.
ALENCAR, N.M.N.; ASSREUY, A.M.S.; ALENCAR, V.B.M.; MELO, S.C.; RAMOS,
M.V.; CAVADA, B.S.; CUNHA, F.Q.; RIBEIRO, R.A. The galactose-binding lectin
from
vatairea macrocarpa seeds induces in vivo neutrophil migration by indirect
mechanism.
Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 35, p. 1674-1681, 2003
ALENCAR, N.M.N.; ASSREUY, A.M.;CRIDDLE, D.N.; SOUZA, E.P.; SOARES, P.M.;
HAVT, A.; ARAGAO, K.S.; BEZERRA, D.P.; RIBEIRO, R.A.; CAVADA, B.S.
Vatairea
macrocarpa lectin induces paw edema with leukocyte infiltration. Protein Pept Lett.,
v. 11, p. 195-200, 2004.
ALENCAR, N.M.N.; CAVALCANTE, C.F.; VASCONCELOS, M.P.; LEITE, K.B;
ARAGÃO, K.S.; ASSREUY, A.M.S.; NOGUEIRA, N.A.P.; CAVADA, B.S.; VALE,
M.R. Anti-inflammatory and anti-microbial effect of lectin from
Lonchocarpus sericeus
seeds in an experimental model of infectious peritonitis.
J. Pharm. Pharmacol., v.
57, p. 919-922, 2005a.
ALENCAR, V.B.M.; ALENCAR, N.M.N.; ASSREUY, A.M.S.; MOTA, M.L.; BRITO,
G.A.C.; ARAGÃO, K.S.; BITENCOURT, F.S.; PINTO, V.P.T.; DEBRAY, H.;
RIBEIRO, R.A.; CAVADA, B.S. Pro-inflammatory effect of
Arum maculatum lectin
and role of resident cells.
Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 37, p. 1805-1814, 2005b.
ALENCAR, V.B.M.; ASSREUY, A.M.S.; ALENCAR, N.M.N.; MEIRELES, A.V.P.;
MOTA, M.R.L.; ARAGÃO, K.S.; CAJAZEIRAS, J.B.; NAGANO, C S.; BRITO, G A C;
SILVA, L I M M; PINTO, V P T; SAMPAIO, A H; DEBRAY, H; CAVADA, B.S.;
RIBEIRO, R.A. Lectin of
Pisum arvense seeds induces in vivo and in vitro neutrophil
migration.
J. Pharm. Pharmacol., v. 57, p. 375-381, 2005c.
ALENCAR, V.B.M.; BRITO, G.A.C.; ALENCAR, N.M.N.; ASSREUY, A.M.S.; PINTO,
V.P.T.; TEIXEIRA, E.H.; SOUZA, E.P.; DEBRAY, H.; RIBEIRO, R.A.; CAVADA, B.S.
Helianthus tuberosus agglutinin directly induces neutrophil migration, which can be
modulated/inhibited by resident mast cells.
Biochem. Cell. Biol., v. 83, p. 659-666,
2005d.
119
ALENCAR, N.M.N.; ASSREUY, A.M.; HAVT, A.; BENEVIDES, R.G.; DE MOURA,
T.R.; DE SOUSA, R.B.; RIBEIRO, R.A.; CUNHA, F.Q.; CAVADA, B.S.
Vatairea
macrocarpa (Leguminosae) lectin activates cultured macrophages to release
chemotactic mediators.
Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol, v. 374, p. 275-
282, 2007.
ALMEIDA, T. F.; ROIZENBLATT, S.; TUFIK, S. Afferent pain pathways: a
neuroanatomical review.
Brain Res., v.1000, p.40-56, 2004.
ALTIER, C.; ZAMPONI, G. W. Targeting Ca
2+
channels to treat pain: T-type versus
N-type.
Trends Pharmacol Sci, v.25, n.9, p. 465-70. 2004.
ANDRADE, J.L.; ARRUDA, S.; BARBOSA, T.; PAIM, L.; RAMOS, M.V.; CAVADA, B.
S.; BARRAL-NETTO, M. Lectin-induced nitric oxide production.
Cell. Immunol. v.
194, p. 98-102, 1999.
ANDRADE, C.A.; CORREIA, M.T.; COELHO, L.C.; NASCIMENTO, S.C.; SANTOS-
MAGALHÃES, N.S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into
liposomes.
Int J Pharm., v. 8, p. 435-445, 2004.
ASSREUY, A.M.S.; SHIBUYA, M.D.; MARTINS, G.J.; SOUZA, M.L.P.; CAVADA,
B.S.; MOREIRA, R.A.; OLIVEIRA, J.T.A.; RIBEIRO, R.A.; FLORES, C.A. Anti-
inflammatory effect of glucose-mannose binding lectins isolated from Brazilian beans.
Mediators Inflamm., v. 6, p. 201-210, 1997.
ASSREUY, A.M.S.; MARTINS, G.J.; MOREIRA, E.E.F.; BRITO, G.A.C.;
CAVADA,
B.S.; RIBEIRO, R.A.; FLORES, C.A. Prevention of Cyclophosphamide-induced
hemorrhagic cystitis by glucose-mannose binding plant lectins.
J. Urol. v.161, p.
1988-1993, 1999.
AZEVEDO-TOZZI, A. M. G. Estudos taxonômicos dos gêneros Lonchocarpus Kunth
e
Deguelia Aubl. no Brasil. Tese de Doutorado, Instituto de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas, Campinas, SP, 1989.
BAEZ S. Simultaneous measurements of radii and wall thickness of microvessels in
the anesthetized rat.
Circ. Res., v. 25, p. 315–329, 1969.
BARRAL-NETTO, M.; SANTOS, S.B.; BARRAL, A.; MOREIRA, L.I.M.; SANTOS,
C.F.; MOREIRA, R.A.; OLIVEIRA, J.T.A.; CAVADA, B.S. Human lymphocyte
stimulation by legume lectins from the
Diocleae tribe. Immun. Invest., v. 21, p. 297-
303, 1992.
BASBAUM, A. I.; JESSELL, T. M. A percepção da dor. In: Kandel, E. R.; Schwartz, J.
120
H.; Jessen, T, M. Princípios da neurociência. Barueri, SP: Manole, p.472-491, 2003.
BAUHMANN, H., GAUDIE, J. The acute phase response.
Immunol. Today, v. 15, p.
74-80, 1994.
BEHBEHANI, M. M.; FIELDS, H. L. Evidence that an excitatory connection between
the periaqueductal gray and nucleus raphe magnus mediates stimulation produced
analgesia.
Brain Res, v.170, n.1, p.85-93. 1979.
BESSON, M. J.; DICKENSON, A. The pharmacology of pain. Berlin: Springer-
Verlag., v.130, p. 21-41, 1997.
BEUTH, J.; KO, H.L.; PULVERER, G.; UHLENBRUCK, G. Importance of lectins for
the prevention of bacterial infection and cancer metastases.
Glycoconjugate J., v.
12, p. 1-6, 1995.
BEVILACQUA, M.P.; NELSON, R.M.; MANNORI, G. Endothelial-leukocyte adhesion
molecules in human disease.
An. Rev. of Medicine, v. 45, p. 361-378, 1994.
BILLIAU, A. MATTHYS, P. Modes of action of Freund's adjuvants in experimental
models of autoimmune diseases.
J. Leuk. Biol., v. 70, p. 849−860, 2001.
BITENCOURT, F.S.; FIGUEIREDO, J.G.; MOTA, M,R.; BEZERRA, C.C.;
SILVESTRE, P.P.; VALE, M.R.; NASCIMENTO, K.S.; SAMPAIO, A.H.; NAGANO,
C.S.; SAKER-SAMPAIO, S.; FARIAS, W.R.; CAVADA, B.S.; ASSREUY, A.M.;
ALENCAR, N.M. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of a mucin-binding
agglutinin isolated from the red marine alga Hypnea cervicornis.
Naunyn
Schmiedebergs Arch Pharmacol
. v. 377, n. 2, p. 139-148, 2008.
BOYD, W.C.; SHAPLEIGH, E. Specific precipitating activity of plant agglutinins
(lectins). Science, v. 119, p. 419, 1954.
BOYDEN, S.; The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on
polymorphonuclaer leucocytes. J. Exp. Med., v. 115, p. 543-466,1962.
BREWER, C.F.; MICELI, M.C.; BAUM, L.G. Clusters, bundles, arrays and lattices:
novel mechanisms for lectin-saccharide-mediated cellular interactions.
Curr Opin
Struct Biol.
, v. 12, n. 5, p. 616-23, 2002.
121
CAILLIET, R. Dor: Mecanismos e tratamentos. Porto Alegre: Editora Artes Médicas
Sul LTDA, p. 274-284, 1993.
CAPAZ, F.R.; VASCONCELLOS, L.E.; DE MORAES, S.; NETO, J.P. The open field:
a simple method to show ethanol withdrawal symptoms.
Arc. Int. Farmacodyn.
Ther., v. 251, p. 228-236, 1981.
CARVALHO, J.T.C.; TEIXEIRA, J.R.M.; SOUZA, P.J.C.; BASTOS, J.K.; FILHO, D.S.;
SARTI, S.J. Preliminary studies of analgesic and anti-inflammatory properties of
Caesalpinea ferrea crude extract.
J. Ethnopharm., v. 53, p. 175-178, 1996.
CAVAILLON, J.M. Pro- versus anti-inflammatory cytokines: Myth or reality.
Cell. Mol.
Biol.
, v. 47, p. 695-702, 2001
CAVUN, S.; GOKTALAY, G.; MILLINGTON, W.R. The hypotension evoked by
visceral nociception is mediated by delta opiod receptors in the periaqueductal gray.
Brain Reseach, v. 1019, p. 237-245, 2004.
CERVERO, F. Mechanisms of visceral pain. Pain – An Updated Review.
IASP
Press, Seattle, 2002.
CHAN, G.H; FISCUS, R.R. Exaggerated production of nitric oxide (NO) and
increases in inducible NO-synthase mRNA levels induced by the pro-inflammatory
cytokine interleukin-1beta in vascular smooth muscle cells of elderly rats.
Exp.
Gerontol., v. 39, p. 378-394, 2004.
CHEN, J.C.; CHEN, H.M.; SHRY, M.H.; FAN, L.L.; CHI, T.Y.; CHI, C.P.; CHEN, M.F.
Selective inhibition of inducible nitric oxide in ischemia-reperfusion of rat small
intestine.
J. Formos Med. Assoc., v. 99, p. 213–218, 2000.
CHEN, Y.F.; TSAI, H.Y.; WU, T.S. Anti-inflammatory and analgesic activities from
root of
Angelica pubescens. Planta Med., v. 61, p. 2–8, 1995.
CHERNOV, H.I; WILSON, D.E.; FOWLER, F.; PLUMMER A.J. Non-specifity of de
mouse writhing test. Arch. Int. Pharmacodyn., v. 167, p. 171-178, 1967.
CIRINO, G.; FIORUCCI, S.; SESSA, W.C.; Endothelial nitric oxide synthase: the
Cinderella of inflammation? T
rends in Pharmacological Sciences, v. 24, n. 2, p.
91-94, 2003.
122
COLLIER, H.O.J.; DINNEEN, L.C.; JOHNSON, C.A.; SCHNEIDER, C. The
abdominal constriction response and its suppression by analgesic drugs in the
mouse.
Br. J. Pharmacol. Chemother., v.32, p. 295-310, 1968.
CRAIG, A.D.; DOSTROVSKY, J.O. Medulla to thalamus. In:
Textbook of pain.
Churchill Livingstone, London: P. D. M. Wall, R, p.183-214, 1999.
CRONSTEIN, B.N.; WEISSMAN,G. The adhesion molecules of inflamation.
Arthritis
Rheum., v. 136, p. 147-157, 1993.
CUNHA, F.Q.; LORENZETTI, B.B.; POOLE, S.; FERREIRA, S.H. Interleukin-8 as a
mediator of sympathetic pain.
Br. J. Pharmacol., v. 104, p. 765–767, 1991.
CUNHA, F.Q.; POOLE, S.; LORENZETTI, B.B.; FERREIRA, S.H. The pivotal role of
tumor necrosis factor alpha in the development of inflammatory hyperalgesia.
Br. J.
Pharmacol., v. 107, p. 660–664, 1992a.
CUNHA, F.Q.; POOLE, S.; LORENZETTI, B.B.; VEIGA, F.R.; FERREIRA, S.H.
Cytokine mediated inflammatory hyperalgesia limited by interleukin-4.
Br J
Pharmacol., v. 126, p. 45-50, 1999.
CUNHA, J.M.; SACHS, D.; CANETTI, C.A.; POOLE, S.; FERREIRA, S.H.; CUNHA,
F.Q. The critical role of leukotriene B4 in antigen-induced mechanical hyperalgesia in
immunised rats.
Br. J. Pharmacol., v. 139, p. 1135-1145, 2003a.
CUNHA, G.M.A.; FONTENELE, J.B.; NOBRE-JUNIOR, H.V.; MARTINS-DESOUSA,
F.C.; SILVEIRA, E.R.; NOGUEIRA, N.A.P.; MORAES, M.O.; VIANA, G.S.B.; COSTA-
LOTUFO, L.V. Cytotoxic activity of chalcones isolated from Lonchocarpus sericeus
(Poir.) Kunth.
Phytother. Res. v. 17, p. 155-159, 2003b.
CUNHA, T.M.; VERRI, W.A. JR.; SILVA, J.S.; POOLE, S.; CUNHA, F.Q.;
FERREIRA, S.H. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory
hypernociception in mice.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 102, p. 1755-1760,
2005.
DAVIS, K.D.; MEYER, R.A.; COHEN, R.H.; CAMPBELL, J.N. Mechanically-
insensitive nociceptors in the primate.
Soc. Neurosc. Abst., v. 15, p. 440, 1989.
DETKE, M.J.; JOHNSON, J.; LUCKI, I. Acute and chronic antidepressant drug
treatment in the rat forced swimming test model of depression.
Exp.Clin.
Psychophar., v. 5, p. 107-112, 1997.
123
DJOUHRI, L.; LAWSON, S.N. Ab-fiber nociceptive primary afferent neurons: a review
of incidence and propertiers in relation to the other afferent A-fiber neurons in
mammals.
Brain Research Reviews, v. 46, p.131-145, 2004.
DOUBELL, T. P.; MANNION, R. J.; WOOLF, C. J. The dorsal horn: state-dependent
sensory processing, plasticity and the generation of pain. In: Churchill Livingstone.
Textbook of pain. London: P.D. Wall; R. Melzack, p. 165-81, 1999.
DUARTE, I.D.; NAKAMURA, M.; FERREIRA, S.H. Participion of sympatheticin
system in acetic acid-induced writhing in mice. Bras.
J. Med. Biol. Res. 21: 341,
1988.
DUARTE, I.D.; DOS SANTOS, I.R.; LORENZETTI B.B. Analgesia by direct
antagonismo f nociceptor sensitization involves the arginina-nitric oxide cGMP
pathway.
Eur. J. pharmacol., v. 217, n. 2-3, p. 225-234, 1992.
DUCKE, A. Plantes nouvelles ou peu connues de la région amazonienne III.
Archos.
Jard. Bot. RJ. v. 4, p. 1-90, 1925.
DUCKE, A. Notas sobre a Flora Neotrópica – II. As leguminosas da Amazônia
brasileira.
Bolm. Téc. Inst. Agron. N. v. 18, p. 171-200, 1949.
DUCKE, A. As leguminosas de Pernambuco e Paraíba.
Mems. Inst. Oswaldo Cruz.
v. 51, p. 417-446, 1953.
DUNHAM, N.W.; MIYA, T.S. A note on a simple apparatus for detecting neurologic
deficit in rats and mice.
J. Neurosci., v.19, p. 3423-3429, 1957.
DWORKIN, R H.; BACKONJA, M.; ROWBOTHAM, M. C.; ALLEN, R R; ARGOFF, C.
R; BENNETT, G. J.; BUSHNELL, M. C.; FARRAR, J. T.; GALER, B. S.;
HAYTHORNTHWAITE, J. A.; HEWITT, D. J.; LOESER, J. D.; MAX, M. B.;
SALTARELLI, M.; SCHMADER, K. E.; STEIN, C.; THOMPSON, D.; TURK, D. C.;
WALLACE, M. S.; WATKINS, L R.; WEINSTEIN, S. M. Advances in neuropathic
pain: diagnosis, mechanisms, and treatment recommendations.
Arch Neurol, v. 60,
n.11, p.1524-34. 2003.
EDDY, N.B.; LEIMBACH, D. Synthetic analgesics. Ll dithienylbutenyl and
dithienylbutylamines,
J. Pharmacol. Exper. Ther., v. 107, p. 385-393, 1953.
EISERICH, J.P.; PATEL, R.P.; ÕDONNELL, V.B.O. Pathophysiology of nitric oxide
and related species: free radical reactions and modification of biomolecule.
Molec.
Aspects Med., v. 19, p. 221-357, 1998.
124
ELBEIN, A. D.; MITCHELL, M.; SANFORD, B. A.; FELLOWS, L. E.; EVANS, S. V.
The pyrrolidine alkaloid, 2,5-dihydroxymethyl-3,4-dihydroxypyrrolidine, inhibits
glicoprotein processing.
J. Biol. Chem., v. 259, p. 12409-12413, 1984.
ELSNER, J.; HOCHSTETTER, R. Human eotaxin represents a potent activator of the
respiratory burst of human eosinophils.
Eur. J. Immunol., v. 26, n. 8, p. 1919-1925.
1996.
ELSNER, J.; H. PETERING.; KULTHE, C.; KIMMING, D.; SMOLARSKI, R.;
PONATH, P.; KAPP. A. Eotaxin-2 activates chemotaxis-related events and release of
reactive oxygen species via pertussis toxin-sensitive G proteins in human
eosinophils.
Eur. J. Immunol., v. 28, n. 7, p. 2152-2158. 1998.
EVANS, W. C. A taxonomic approach to the study of medicinal plants and
animalderived drugs. In: ______.
Trease and Evans’ Pharmacognosy. London,
15a ed., Ed. W. B. Saunders, 2002, cap. 5, p. 15-40.
FACCIOLI, L. H., SOUZA, G. E., CUNHA, F.Q., POOLE, S. AND FERREIRA, S.H.
Recombinant interleukin-1 and tumor necrosis factor induce neutrophil migration “in
vivo” by indirect mechanisms.
Agents Actions, v. 30, p. 344, 1990
FEIZI, T. Oligosaccharides that mediate mammalian cell-cell adhesion.
Curr. Opin.
Struct. Biol., v. 3, p. 701-710, 1993.
FERREIRA, S.H. Prostaglandins, aspirin-like drugs and analgesia.
Nat. New. Biol.,
v. 240, n. 102, p. 200, 1972.
FERREIRA, S.H.; NAKAMURA, M.; DE ABREU CASTRO, M.S. The hyperalgesic
effects of prostacyclin and prostaglandin E2. Prostaglandins, v. 16, p. 31-37, 1978a.
FERREIRA, S.H.; ZANIN, T.; LORENZETTI, B.B.; DE SOUZA, M.Z.; MEDEIROS
M.C.; LEME, J.G. Increased vascular permeability, oedema and hyperalgesia caused
by carrageenan in the rat's paw.
Agents Actions,, v. 8, p. 159, 1978b.
FERREIRA, S.H. Are macrophages the body´s alarmme cells.
Agents and actions.,
v. 10, p. 229, 1980.
FERREIRA, S.H.; LORENZETTI, B.B.; BRISTOW, A.F.; POOLE, S. Interleukin-1
beta as a potent hyperalgesic agent antagonized by a tripeptide analogue.
Nature.,
n. 334, p. 698–700, 1988.
125
FERREIRA, S.H.; LORENZETTI, B.B.; DE CAMPOS, D.I. Induction, blockade and
restoration of a persistent hypersensitive state.
Pain, v. 42, n. 3, p. 365, 1990.
FERREIRA, S.H.; DUARTE, I.D.; LORENZETTI, B.B. The molecular mechanism of
action of peripheral morphine analgesia: stimulation of the cGMP system via nitric
oxide release.
Eur. J. Pharmacol., v. 201, p. 121-129, 1991.
FERREIRA, S. H. The role of interleukins and nitric oxide in the mediation of
inflammatory pain and its control by peripheral analgesics
Drugs, v. 46, Suppl 1, p.
1, 1993a.
FERREIRA, S. H.; LORENZETTI, B. B.; POOLE, S. Bradykinin initiates cytokine-
madiated inflammatory hyperalgesia.
Br. J. Pharmacol., v.110, p.1227-31. 1993b.
FIGARELLA-BRANGER, D.; CIVATTE, M.; BARTOLI, C.; PELLISSIER, J.F.
Cytokines, chemokines, and cell adhesion molecules in inflammatory myopathies.
Muscle Nerve., v. 28, n. 6, p. 659-682, 2003.
FOLLENFANT, R.L., NAKAMURA, M.; GARLAND, L.G. Sustained Hiperalgesia in
rats evoked by the protein kinase inhibitor H-7.
Br. J. Phamacol., v. 99, p. 289,
1990.
FORTES, Z.B.; FARSKY, S.P.; OLIVEIRA, M.A.; GARCIA-LEME, J. Direct vital
microscopic study of defective leukocyte–endothelial interactions in diabetes mellitus.
Diabetes, v. 40, p. 1267-1273, 1991.
FORTES, Z.B.; HYSLOP, S.; DENUCCI, G. Endothelial-derived vascular relaxing
factors: role of nitric oxide. In: BRAIN, S.D. & PAGE, C. (Eds.),
Immunopharmacology of the Microcirculation, Academic Press, New York, 16-42,
1994.
FREUND, J. The mode of action of immuno-pharmacological adjuvants.
Adv.
Tuberc. Res., v. 1, p. 130−148, 1956.
GADELHA, C.A.; MORENO, F.B.; SANTI-GADELHA, T.; CAJAZEIRAS, J.B.;
ROCHA, B.A.; ASSREUY, A.M.; LIMA MOTA, M.R.; PINTO, N.V.; PASSOS
MEIRELES, A.V.; BORGES, J.C.; FREITAS, B.T.; CANDURI, F; SOUZA, E.P.;
DELATORRE, P.; CRIDDLE, D.N.; DE AZEVEDO W.F. JR.; CAVADA, B.S. Native
crystal structure of a nitric oxide-releasing lectin from the seeds of
Canavalia
maritima. J Struct Biol., v. 152, p. 185-194, 2005.
GAO, X.; ZHANG, Y.a.; WU, G.C. Effects of dopaminergic agents on carrageenan
hyperalgesia after intrathecal administration to rats.
Eur. J. Pharmacol, v.418, p.
126
73-77, 2001.
GOLDSTEIN, I.J.; HUGHES, R.C.; MONSIGNY, M.; OZAWA, T.; SHARON, N. What
should be called a lectin?
Nature, v. 285, p.60, 1980.
GOMES, J.C.; FERREIRA, R.R.; CAVADA, B.S.; MOREIRA, R.A.; OLIVEIRA, J.T.A.
Histamine release induced by glucose (mannose)-specific lectins isolated from
Brazilian beans: comparison with concanavalin A.
Ag. Actions., v. 41, p. 132-135,
1994.
GRAEFF, M. Neurofisiologia da dor. Drogas psicotrópicas e seu modo de ação, São
Paulo: EPU-EDUSP, CNPq, 1984.
GRANGER D.N.; BENOIT J.N.; SUZUKI M.; GRISHAM M.B. Leukocyte adherence to
venular endothelium during ischemia–reperfusion,
Am. J. Physiol., v. 257, p. 683-
688, 1989.
GRANGER, D.N.; KUBES, P. The microcirculation and inflammation: modulation of
leukocyte-endothelial cell adhesion.
J. Leuk. Biol., v. 55, p. 662-675, 1994.
GRANJEIRO, T.B. Clonagem, sequenciamento e expressão do gen da lectina
(Con
Br)
de sementes de Canavalia brasiliensis. Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular (tese de doutorado). UFC, 1996.
GREENBERG, S.S.; OUYANG, J.; ZHAO, X.; GILES, T.D. Human and rat
neutrophils constitutively express neural nitric oxide synthase mRNA.
Nitric Oxide, v.
2, p. 203-212, 1998.
GUYTON A.C.; HALL, J.E.
Tratado de Fisiologia Médica. 9 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1997.
HAMA, A.; MENZAGHI, F. Antagonist of nicotinic acetylcholine receptors (nAChR)
enhances formalin-induced nociception in rats: tonic role of nAChRs in the control of
pain following injury.
Brain Res., v. 888, p. 102–106. 2001.
HANDWERKER, H.O.; KILO, S.; REEH, P.W. Afferent C-fibres from rat hairy skin not
driven by natural stimulation.
Soc. Neurosc. Abst. 15: 1265, 1989.
HONG, Y.; ABBOTT, F.V. Contribution of peripheral alpha 1A-adrenoceptors to pain
induced by formalin or by alpha-methyl-5-hydroxytryptamine plus noradrenaline.
Eur.
J. Pharmacol., v. 301, p. 41–48, 1996.
127
HOSHINO, K. A perspectiva biológica do luto. Comportamento e Cognição, v. 17,
p. 313-326, 2006.
HOSTANSKA, K.; VUONG, V.; ROCHA, S.; SOENGAS, M.S.; GLANZMANN, C.;
SALLER, R.; BODIS, S.; PRUSCHY, M. Recombinant mistletoe lectin induces p53-
independent apoptosis in tumour cells and cooperates with ionising radiation.
Br. J.
Cancer, v. 88, p.1785-1792, 2003.
HUNSKAAR, A.T.; HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between
inflammatory and non-inflammatory pain.
Pain, v. 30, p. 103–4, 1987.
HUNSKAAR, S.; BERGE, O.G.; HOLE, K. A modified hot-plate test sensitive to mild
analgesics.
Behav. Brain Res., v.21, p.101-108, 1996.
HUNSKAAR. S.; FASMER, O.B.; HOLE, K. Formalin test in mice, a useful technique
foe evaluating mild analgesia.
J. Neurosci. Methods., v. 14, p. 69–76, 1985.
IALENTI, A.; IANARO, A.; MAFFIA, P.; SAUTEBIN, L.; DI ROSA, M. Nitric oxide
inhibits leukocyte migration in carrageenan-induced rat pleurisy.
Inflamm. Res., v.
49, p. 411–417, 2000.
IKEDA, Y.; UENO A.; NARABA, H.; OH-ISHI; Involvement of vaniloid receptor VR1
and prostanoids in the acid-induced writhing responses of mice.
Life Sci., v.69, p.
2911-2919, 2001.
IGNARO, L.J.; BUGA, G.M.; WOOD, K.S.; BYRNS, R.E.; CHAUDHURI, G.
Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is
nitric oxide.
Proc. Natl. Acad. Sci., v. 84, p. 9265-9269, 1987.
INTERNATIONAL LEGUME DATABASE & INFORMATION SERVICE –Reported
generated by Legume web from the ILDIS World Database of legumes, version 6.05
<http://www.ildis.org/LegumeWeb> acesso em 19 junho 2008.
JONES, A.K.; AL-JANABI, M.A.; SOLANKI, K.; SOBNACK, R.; GREENWOOD, A.;
DOYLE, D.V.;
BRITTON, K.E.; HUSKISSON, E.C. In vivo leukocyte migration in
arthritis.
Arthritis Rheum.,. v. 34, p. 270–275, 1991.
JOURDAN, D.; ARDID, D.; BARDIN, L.; BARDIN, M.; NEUZERET, D.;
LANPHOUTHACOUL, L.; ESCHALIER, A.A. New automated method of pain scoring
in the formalin test in rats.
Pain., v. 71, p. 265–270, 1997.
128
JULIUS, D.; BASBAUM, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413,
n. 6852, p.203-10. 2001.
KAKINUMA, T.; HWANG, S.T.; Chemokines, chemokine receptor, and cancer
metastasis.
J. Leukoc. Biol., v. 79, n. 4, p. 639-651, 2006.
KANSAS, G.S. Selectins and their ligands: Current concepts and controversies.
Blood. v. 88, p. 3259-3287, 1996.
KAPLAN, A.P. Chemokines, chemokine receptors and allergy.
Int Arch Allergy
Immunol., v. 124, n. 4, p. 423-31, 2001.
KAPP, A.; ZECK-KAPP G.; CZECH, W.; SCHOPF, E.The chemokine RANTES is
more than a chemoattractant: characterization of its effect on human eosinophil
oxidative metabolism and morphology in comparison with IL-5 and GM-CSF.
J.
Invest. Dermatol,, v. 102, n. 6, p. 906-914. 1994.
KARABUCAK, B.; WALSCH, H.; JOU, Y.T.; SIMCHON, S.; KIM, S.. The role of
endothelial nitric oxide in the substance P induced vasodilation in bovine dental pulp.
J. Endod., v. 31, p. 733-736, 2005.
KESHERWANI, V.; SODHI, A. Differential activation of macrophages in vitro by lectin
Concanavalin A, Phytohemagglutinin and Wheat germ agglutinin: production and
regulation of nitric oxide.
Nitric Oxide, v. 16, p. 295-305, 2007.
KIDD, B. L.; URBAN, L. A. Mechanisms of inflammatory pain.
Br J Anaesth,
v.87, n.1, p.3-11. 2001.
KLEHA, J. F.; DEVESLY, P.; JOHNS, A. The effects of lectins on the release of
EDRF from rabbit aorta.
Br. J. Pharmacol., v. 104, p. 287-288, 1991
KOSTER, R.; ANDERSON, M.; DEBEER, E.J. Acetic-acid for analgesic screening.
Fed. Proc., v. 18, p. 412-417, 1959.
KUBES, P.; SUZUKI, M.; GRANGER, D.N. Nitric Oxide : An endogenous modulator
of leukocyte adhesion.
Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 88,
p. 4651-4655, 1991.
KULBE, H.; LEVINSON, N.R.; BALKWILL, F.; WILSON. J.L. The chemokine network
in cancer-much more than directing cell movement.
Int. J. Dev. Biol. v. 48, n.6, p.
489-496, 2004.
129
LAINE, R.A. A calculation of all possible oligosaccharide isomer, both branched and
linear yields 1.05 x 10
12
structures or a reducing hexasaccharide: the isomer barrier
to develop of single method saccharide sequencing or synthesis systems.
Glycobiology, v. 4, n. 19, 1994.
LAING, K.J.; SECOMBES, C.J. Chemokines.
Dev. Comp. Immunol., v. 28, n. 5, p.
443-60, 2004.
LANSEN, G.L.; HENSON, P.M. Mediators of inflammation.
Rev. Immunol., v. 1, p.
335-359, 1993.
LE BARS, D.; GOZARIU, M.; CADDEN, S.W. Animals models of nociception.
Pharmacol. Rev., v.53, p.597-652, 2001.
LEE, Y.; LEE, C. H.; OH, U. Painful channels in sensory neurons.
Mol Cells,
v.20, n.3, p.315-24. 2005.
LIAUDET, L.; SORIANO, F.G.; SZABÓ, C. Biology of nitric oxide signaling.
Critic.
Care Med., v. 26, p. 37-52, 2000.
LIMA, R.F.; CRIDDLE, D.N.; SOUZA, E.P.; SAMPAIO, A.H.; NASCIMENTO, K.S.;
CAVADA, B.S.; ASSREUY, A.M. Red marine alga Bryothamnion triquetrum lectin
induces endothelium-dependent relaxation of the rat aorta via release of nitric oxide.
J. Pharm Pharmacol., v. 56, p. 1415-1421, 2004.
LIOTTA, L.A. An atractive force in metastasis.
Nature, v. 241, p. 24-25, 2001.
LORENZETTI, B.B.; VEIGA, F.H.; CANETTI, C.A.; POOLE, S.; CUNHA, F.Q.;
FERREIRA, S.H. Cytokine-induced neutrophil chemoattractant1 (CINC-1) mediates
the sympathetic component of inflammatory mechanical hypersensitivity in rats.
Eur
Cytokine Netw., v. 134, p. 456-461, 2002.
LUCKI, I. The forced swimming test as a model for core and component behavioral
effects of antidepressant drugs.
Behavioral Pharm., v. 8, p. 523-532, 1997.
LUSTER, A.D. Chemokines-chemotactic cytokines that mediated inflammation.
N.
Engl. J. Med., v. 338, n. 7, p. 436-445, 1998.
MA, H.C.; DOHI, S.; WANG, Y.F.; ISHIZAWA, Y.; YANAGIDATE, F. The
antinociceptive and sedative effects of carbachol and oxycodone administered into
brainstem pontine reticular formation and spinal subarachnoid space in rats.
Anesth. Analg, v. 92, p. 1307-1315, 2001.
130
MACHADO, A.B.M. Neuroanatomia funcional. Rio de Janeiro: Atheneu, 1988.
MACIEL, E.V.; ARAUJO-FILHO, V.S.; NAKAZAWA, M.; GOMES, Y.M.; COELHO,
L.C.; CORREIA, M.T. Mitogenic activity of Cratylia mollis lectin on human
lymphocytes.
Biologicals, v. 32, p. 57-60, 2004.
MALCANGIO, M.; BOWERY, N. G. GABA and its receptors in the spinal cord.
Trends Pharmacol. Sci., v.17, n.12, p.457-62. 1996.
MALECH, H.L.; GALLIN, J.I. Current concepts: immunology. Neutrophils in human
diseases. N. Engl. J. Med., v. 317, p. 687–694, 1987.
MARTINS DE SOUSA, F. C. Aspectos químicos do estudo químicofarmacológicode
plantas do nordeste:
Myracroduon urundeuva (Fr. All.),Lonchocarpus sericeus (Poir.)
Kunth e
Stachytarpheta sp. Dissertação de mestrado, Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ce, 2003.
MAYHAN, W.G. Role of nitric oxide in modulating permeability of hamster cheeks
pouch in response to adenosine 5-diphosphate and bradykinin.
Inflammation, v 16,
p 295-305, 1992.
McCARTNEY-FRANCIS, N.L.; ALLEN, J.B.; MIZEL, D.E.; ALBINA, J.E.; XIE, Q.W.;
NATHAN, C.F.; WAHL, S.M. Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide
synthase.
J. Exp. Med., v. 178 p. 749-754, 1993.
McCARTNEY-FRANCIS, N.L.; SONG, X.-Y.; MIZEL, D.E.; WAHL, S.M. Selective
inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates erosive joint disease.
J.
Immunol.
, v. 166, p. 2734–2740, 2001.
McEVER, R.P. Leukocyte interactions mediated by selectins.
Thromb. Haemost. v.
66, p. 80-87, 1991.
MCMAHON, S. B.; KOLTZENBURG, M. Novel classes of nociceptors: beyond
Sherrington.
Trends Neurosci., v. 13, p. 199, 1990.
MELZACK, R; WALL, P. D. Pain mechanisms: a new theory.
Science, v. 150, n.
699, p. 971-9. 1965.
MELZACK, R.; LOESER, J.D. Pain: an overview.
Pain, v. 353, p.1607-1609, 1999.
131
MENEZES, R. A. Neuroanatomofisiologia da Dor. IN: MENEZES, R. A. (org.).
Síndromes Dolorosas – Diagnóstico-Terapêutico – Saúde Física e Mental. Rio de
Janeiro: Editora Revinter, p.9-19, 1999.
MILLAN, M.J. The induction of pain: an integrative review.
Prog. Neurobiol., v. 57, p.
1-64, 1999.
MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A. Nitric oxide: physiology,
pathophysiology, and pharmacology.
Pharmacol. Rev., v. 43, p. 109-142, 1991.
MOORE, P.K.; OLUYOMI, A.O.; BABEDGGE, R.C. L-NG-nitro arginina methyl ester
exhibts antinociceptive activity in mouse.
Br. J. Pharmacol., v. 102, n. 1, p. 198,
1991.
MOREIRA, R.A.; AINOUZ, I.L.; OLIVEIRA, J.T.A.; CAVADA, B.S. Plant lectins,
chemical and biological aspects.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 86, p. 211-218, 1991.
MORRIS, M.R.; DEWITT, S.; LAFFAFIAN, I.; HALLETT, M.B. Phagocytosis by
inflammatory phagocytes: experimental strategies for stimulation and quantification.
Methods Mol Biol., v. 225, p. 35-46, 2003.
MOTA, M.R.L.; CRIDDLE, D.N.; ALENCAR, N.M.N.; GOMES, R.C.; MEIRELES,
A.V.P.; GADELHA, T.S.; GADELHA, C.A.; OLIVEIRA, C.C.; BENEVIDES, R.G.;
CAVADA, B.S.; ASSREUY, A.M.S.; Modulation of acute inflammation by a chitin-
binding lectin from Araucaria angustifolia seeds via mast cells.
Naunyn-
Schmiedeberg's Archives of Pharmacol.
, v. 374, p. 1-10, 2006.
MURDOCK, L.L., HUESING, J.E., NIELSEN, S.S., PRATT, R.C., and SHADE, R.E.
Biological effects of plant lectins on the cowpea weevil.
Phytochemistry, v. 29, p.
85-89, 1990.
MURPHY, P.M. Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis,
N. Engl.
J. Med., v. 345, n. 11. p. 833-835, 2001.
NAKAMURA, M.; FERREIRA, S.H. A peripheral sympathetic component in
inflammatory hiperalgesia.
Eur. J. Pharmacol., v. 135, n. 2, p. 145, 1987.
NATHAN, C. Points of control in inflammation. Nature, v. 420, p. 846-852, 2002.
NESS, T. J.; GEBHART, G.F Visceral pain: a review of experimental studies.
Pain,
v. 41, p. 167-234, 1990.
132
NEVES, S.A.; FREITAS, A.L.P.; SOUZA, B.W.S.; ROCHA, M.L.A.; CORREIA,
M.V.O.; SAMPAIO, D.A.; VIANA, G.S.B. Antinociceptive properties in mice of a lectin
isolated from the marine alga Amansia multifida Lamouroux.
Braz. J. Med. Biol.
Res., v. 40, p. 127-134, 2007.
NIV, D.; KREITLER, S. Pain and Quality of life.
Pain Practice, v.1, p.150-161, 2001.
OTTENSOOSER, F.; NAKAMIZO, Y.; SATO, M.; MIYAMOTO Y.; TAKIZAWA, K.
Lectins detecting groups C streptococci.
Infection and Immunology, v. 9, p. 971-
973, 1974.
PALMER, R.M.; ASHTON, D.S.; MONCADA, S. Vascular endothelial cells synthetize
nitric oxide from L-arginine.
Nature, v. 16, p. 664-666, 1988.
PANÉS, J.; PERRY, M.; GRANGER, D.N. Leukocyte-endothelial cell adhesion:
avenues for therapeutic intervention.
Br. J. Pharmacol., v. 126, p. 537-550, 1999.
PARADA, C.A.; TAMBELI, C.H.; CUNHA F.Q.; FERREIRA, S.H. The major role of
peripheral release of histamine and 5-hydroxytryptamine in formalin-induced
nociception.
Neurosc., v. 102, p. 937–944. 2001.
PAUL-CLARK, M.J.; GILROY, D.W.; WILLIS, D.; WILLOUGHBY, D.A.; TOMLINSON,
A. Nitric oxide synthase inhibitors have opposite effects on acute inflammation
depending on their route of administration.
J. Immunol., v. 2, p. 1169–1177, 2001.
PERRETTI, M.E.R.; FLOWER, J. Modulation of IL-1-induced neutrophil migration by
dexamethasone and lipocortin 1.
J. Immunol., v. 150, p. 992-999. 1993.
PETERING, H.; HOCHSTETTER, R.; KIMMING, D.; SMOLARSKI, R.; KAPP. A.;
ELSNER, J. Detection of MCP-4 in dermal fibroblasts and its activation of the
respiratory burst in human eosinophils.
J. Immunol., v.160, n.2, Jan 15, p.555-8.
1998.
PEUMANS, W.J.; VAN DAMME, E.J.M. Lectins as plant defense proteins. Plant
Physiol. v. 109, p. 347-352, 1995.
PEUMANS, W.J.; VAN DAMME, E.J.M. Plant lectins: versatile proteins with important
perspectives in biotechnology. In:
Biotechnology and Genetic Enginnering
Reviews,
v. 15, p. 199-228, 1998.
PHILIP, M.; ROWLEY, D.A.; SCHEREIBER, H. Inflammation as a tumor promoter in
cancer induction. In: Seminars in Cancer Biology, v.14, p. 433-439, 2004.
133
PIO CORRÊA, M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas
cultivadas. Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, Ministério da
agricultura, Rio de Janeiro – GB, 1974, vol. V, p. 384.
PIOVEZAN, A.P.; D'ORLEANS-JUSTE, P.; FRIGHETTO, M.; SOUZA, G.E.;
HENRIQUES, M.G.; RAE, G.A. Endothelins contribute towards nociception induced
by antigen in ovalbumin-sensitised mice.
Br. J. Pharmacol., v. 141, p. 755-763,
2004.
PORRECA, F.; MOSBERG, H.I.; OMNAS, J.R.; BURKS, T.F.;COWAN, A.
Supraspinal and spinal potency of selective opioid agonists in the mouse writhing
test.
J. Pharmacol. Exp. Ther., v.240, p. 890-894, 1987.
PORTO, C.C.
Exames Clínicos: Base para a Prática Médica. 5 ed, Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, p. 37-40, 2004,.
RAINVILLE, P. Brain mechanisms of pain affect and pain modulation.
Curr. Opin.
Neurobiol., v.12, p.195-204, 2002.
RAJA, S. N.; MEYER, R.A.; RINGKAMP, M.; CAMPBELL, J. N Peripheral neural
mechanisms of nociception. In: Textbook of pain . Churchill Livingstone, London: P.
D. M. WALL, R. p 11-57, 1999.
RANG, H.P.; BEVAN, S.; DRAY, A. Chemical activation of nociception peripheral
neurons.
Br. Med. Bull., v. 47, n. 3, p. 534, 1991
RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M.; MOORE, P.K.
Pharmacology. 5 ed., São
Paulo: Elsevier, 2003.
RHODIN J.A.G. Architecture of the vessel wall, in: D.F. Bohr, A.P. Somlyo, H.V.
Sparks (Eds.), Handbook of Physiology: The Cardiovascular System, Bethesda, v. II,
p. Md 1–31, 1986.
RIBEIRO, R.A.; FLORES, C.A.; CUNHA, F.Q.; FERREIRA, S.H. IL-8 cause in vivo
neutrophil migration by a cell dependent mechanism.
Immunology, v. 73, p. 472-
477, 1991.
RIBEIRO, R.A.; SOUZA-FILHO, M.V.P.; SOUZA, M.H.L.P.; OLIVEIRA, S.H.P.;
COSTA, C.H.S.; CUNHA, F.Q.; FERREIRA, S.H.P. Role of resident mast cells and
macrophages in the neutrophil migration induced by LTB4, fMLP and C5a des arg.
Int. Arch. Allergy. Immunol., v. 112, p. 27-35, 1996.
134
RIBEIRO, R.A.; VALE, M.L.; THOMAZZI, S.M.; PASCHOALATO, A. B.; POOLE, S.;
FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q. Involvemente of resident macrophages and mast
cells in the writhing nociceptive response induced by zimozan and acetic acid in
mice.
Eur. J. Pharmacol., v. 387, p.111-118, 2000.
RIEDEL, W.; NEECK, G. Nociception, pain, and antinociception: current concepts.
Rheumatol., v. 60, n. 6, p. 404-15. 2001.
ROBBINS, S.L.; COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; ABBAS, A.; FAUSTO, N. As Bases
Patológicas das Doenças. Cap 3: Inflamação e reparo. 7. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, p. 48-79, 2005.
ROCHA, J.C.S.; PEIXOTO, M.E.B.; JANCAR, S.; CUNHA, F.Q.; RIBEIRO, R.A.;
ROCHA, F.A.C. Dual effect of nitric oxide in articular inflammatory pain in zymosan-
induced arthritis in rats.
Br. J. Pharmacol., v. 136, p. 588-596, 2002.
ROLLINS, B. J. Chemokines.
Blood, v. 90, n. 3, p. 909-928, 1997.
ROSEN, S.D.; BERTOZZI, C.R. The selectins and their ligands.
Curr. Opin. Cell
Biol., v. 6, p. 663-673, 1994.
ROSSITER, H.; ALON, R.; KUPPER, T.S. Selectins, T-cell rolling and inflammation.
Molecular Med Today, p. 214-222, 1997.
SANDRIN, M. F. N. Densidade populacional e padrões comportamentais do hamster
sírio Mesocricetus auratus (Waterhouse, 1839) (Rodentia: muridae) no nado forçado.
Tese de doutorado, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista,
Botucatu, SP. 2002.
SANTI-GADELHA, T.; GADELHA, C.A.; ARAGÃO, K.S.; OLIVEIRA, C.C.; MOTA,
M.R.L.; GOMES, R.C.; DE FREITAS, P.A.; TOYAMA, M.H.; DE OLIVEIRA, T.D.;
ALENCAR, N.M.N.; CRIDDLE, D.N.; ASSREUY, A.M.S.; CAVADA, B.S.; Purification
and biological effects of
Araucaria angustifolia (Araucariaceae) seeds lectin.
Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 350, p. 1050-1055, 2006.
SANTUCCI, L.; FIORUCCI, S.; GIANSANTI, M.; BRUNORI, P.M.;, DI MATTEO,
F.M.; MORELLI. A.; Pentoxifylline prevents indomethacin inducedacute gastric
mucosal damage in rats: role of tumour necrosisfactor alpha.
Gut., v.35, p. 909–915,
1994.
SANZ-APARÍCIO, J.; HERMOSO, J.; GRANJEIRO, T.B.; CALVETE, J.J.; CAVADA,
B.S. The crystal structure of
Canavalia brasiliensis lectin suggests a correlation
135
between its quaternary conformation and its distinct lectin biological properties from
Concanavalin A.
FEBS Letters, v 405, p. 114-118, 1997.
SCHMIDT, R.R. Stereochemistry of Organic and Bioorganic Transformations.
Bartman, W. and Sharpless, K. B., Eds., VCH, Republic of Germany, p. 169-189,
1987.
SECCO, D.D.; MOREIRA, A.P.; FREITAS, A.; SILVA, J.S.; ROSSI, M.A.;
FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q. Nitric oxide inhibits neutrophil migration by a
mechanism dependent on ICAM-1: role of soluble guanylate cyclase.
Nitric Oxide, v.
15, p. 77-81, 2006.
SÉRVULO, K.B.L.M. Isolamento, purificação, caracterização parcial e atividade
biológica de uma lectina de sementes de
Lonchocarpus sericeus (Leguminosae-
papilionoidae-tribo tephrosieae). Tese de doutorado, Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará. 2004.
SHARON, N.; LIS, H. Lectins: cells aglutinating and sugar-specific proteins.
Science,
v. 177, p. 949-958, 1972.
SHIBATA, M.; OHKUBO, T.; TAKAHASHI, H.; INOKI, R. Modified formalin
test:characteristic biphasic pain response.
Pain., v. 38, p. 347–352, 1989.
SHLYAKHOVENKO, V.A.; KOZAK, V.V.; VINARCHUK, M.P. Expression of lectin
receptors in sites Ehrlich tumor cells under modified polyamine levels.
Exp. Oncol.,
v. 17, p. 119-123, 1995.
SICKER, T.; WUCHOLD, F.; KAISER, B.; GLUSA, E.. Systemic vascular effects of
thrombin and thrombin receptor activating peptide in rats.
Thrombosis Res., v. 101,
p. 467-475, 2001.
SIQUEIRA, J.R.; DANTAS, C.J.S. Mecanismos Celulares e Moleculares da
Inflamação. Rio de Janeiro:
Medsi, p. 238, 2000.
SODHI, A.; TARANG, S.; KESHERWANI, V. Concanavalin A induced expression of
Toll-like receptors in murine peritoneal macrophages in vitro.
Int
Immunopharmacol.
, v. 7, p. 454-463, 2007.
SOJA, P.J.; TAEPAVARAPRUK, N.; PANG, W.; CAIRNS, B.E.; MCERLANE, S.A.;
FRAGOSO, M.C. Transmission throught the dorsal spinocerebellar and spinoreticular
tracts: wakefulness versus thiopental anesthesia.
Anesthesiology, v. 97, p. 1178-
1188, 2002.
136
SOUZA, D.G.; CASSALI, G.D.; POOLE, S.; Effects of inhibition of PDE4 and TNF-
alpha on local and remote injuries following ischaemia and reperfusion injury.
Br J
Pharmacol, v.134, p. 985–994, 1994.
SOUZA, G.E.P.; FERREIRA, S.H. Blockade Antimacrophage serium of the migration
of PMN neutrophils into the inflammed peritoneal cavity.
Ag. Actions, v. 17, p. 97-
103, 1985.
STOWE, D.F.; HEISNER, J.S.; CHUNG, W.W.; FUJITA, S.. Volatile anaesthetics
restore bradykinin and serotonin-induced coronary vasodilation after blocking nitric
oxide synthase: lack of anaesthetic effects on KATP channels and prostaglandin
pathways.
Eur. J. Anaesthes., v. 18, p. 219-230, 2001.
SYRBE, U.; SIVEKE, J. Th1/Th2 subsets: distinct differences in homing and
chemokine receptor expression?
Springer Semin Immunopathol, v. 21, n. 3, p.
263-85, 1999.
TAKAHASHI, R.N.; PAZ, M.M. Influence of naloxone of analgesic effects of
antidepressants in mice.
Brazilian J. Med. Biol. Res., v. 20, p. 607-610, 1987.
TAKTAK, Y.S.; SELKIRK, S.; BRISTOW, A.F.; CARPENTER, A.; BALL, C.;
RAFFERTY, B.; POOLE, S. Assay of pyrogens by interleukin-6 release from
monocytic cell lines.
J. Pharmacol., v. 43, p. 578–582, 1991.
TEDDER, T.F.; STEEBER, D. A.; CHEN, A.; ENGEL, P. The selectins: vascular
adhesion molecules.
Faseb J., v. 9, p. 866-873, 1995.
TEDGUI, M.; MALLAT, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall.
Circul.
Res., v. 88, p. 877-887, 2001.
TEXEIRA, M.J.; PIMENTA, C.A. M. Introdução: a evolução do conhecimento. In
Limay. Dor: conceitos gerais. São Paulo: M. J. Teixeira, p. 3-7, 1994.
THOMAZZI, S. M. Participação de macrófagos e citosinas (TNF-a, IL-1 e IL-8) na
modulação da nocicepção induzida no modelo de contorções abdominais.
Dissertação de mestrado apresentada ao Depto. de Fisiologia e Farmacologia- UFC,
1996.
TITHERADGE, M.A. Nitric oxide in septic shock.
Biochem. Biophys. Acta, v. 1411,
p. 437-455, 1999.
137
TJØLSEN, A.; BERGE, O.G.; HUNSKAAR, S.; ROSLAND, J.H.; HOLE, K. The
formalin test: an evaluation of the method.
Pain, v. 51, p. 5-17, 1992.
TJØLSEN, A.; HOLE, K. Animal models of analgesia. In: BESSON, M. J.;
DICKENSON, A.
The pharmacology of pain. Berlin: Springer-Verlag, p. 21-41,
1997.
TONUSSI, C.R.; FERREIRA, S.H. Bradykinin-induce knee join incapacitation
involves bradykinin B2 receptor mediated hyperalgesia and bradykinin B1 receptor-
mediated nociception.
Eur. J. Pharmacol., v. 61, p. 326, 1997.
TREEDE, R D.; MEYER, R A.; RAJA, S. N.; CAMPBELL, J. N. Peripheral and
central mechanisms of cutaneous hyperalgesia.
Prog Neurobiol, v. 38, n. A, p.
397- 421. 1992.
URBAN, M.O.; SMITH, D.J. Nuclei within the rostral ventromedial medulla mediating
morphine antinociception from the periaqueductal gray.
Brain Res, v. 652, n.1, p.9-
16,1994.
VALENTIM, M. G.; HOSHINO, K. Imobilidade no teste do nado forçado: depressão
ou estratégia de sobrevivência?
Comportamento e Cognição, v. 18, p. 286-291,
2006.
VANEGAS, H.; SCHAIBLE, H. G. Descending control of persistent pain: inhibitory
or facilitatory?
Brain Res Brain Res Rev, v. 46, n. 3, p. 295-309. 2004.
VANEGAS, H.; SCHAIBLE, H.G. Prostaglandins and cicloxygenases in spinal.
Cord.
Prog. Neurob.
, v. 64, p. 327-363, 2001.
VILCEK, J.; FELDMAN, M.; Historical review: cytokines as therapeutic and targets of
therapeutics.
trends Pharmacologic sciences. v.25, n. 4, p. 201-209, 2004.
WAGNER, J.G.; ROTH, R.A. Neutrophil migration mechanisms, with an emphasis on
the pulmonary vasculature. Pharmacol., Rev. v. 52, p. 349-374, 2000.
WEDMORE, C.V.; WILLIAMS, T.J. Control of vascular permeability by
polymorphonuclear leukocytes in inflamation.
Nature. v. 289, p. 646-650, 1981.
WHITE, M. Mediator of inflammation and the inflammatory process.
J. Allergy Clin.
Immunol.
, v. 103, p. 378-381, 1999.
138
WIESENFELD-HALLIN, Z.; HALLIN, R.G. The influence of the sympathetic system
on mechanoreception and nociceptio. A review.
Hum. Neurobiol., v. 3, n. 1, p. 41,
1984.
WOTHERSPOON, F.; BROWNE, D.L.; MEEKING, D.R.; ALLARD, S.E.; MUNDAY,
L.J.; SHAM, K.M.; CUMMINGS, M.H.. The contribution of nitric oxide and vasodilator
prostanoids to bradykinin-mediated vasodilation in type 1 diabetes.
Diabetic
Medicine, v. 22, p. 697-702, 2005.
YEH, S.Y. Potentiation of pentazocine antinociception by tripenlenamine in the rat.
J.
Pharmacol. Exp. Ther.
, v. 35, p. 683-701, 1986.
YOKOYAMA, C.; TANABE, T.; Cloning of human gene encoding prostaglandin
endoperoxidase synthaseand primary structure of enzyme.
Biochem. Biophys. Res.
Commun.. v. 1665, p. 3746-3752, 1989.
YOSHIKAI, Y. Roles of prostaglandins and leukotrienes in acute inflammation
caused by bacterial infection.
Current opinion infectious Diseases, v. 14, p. 257-
263, 2001.
YOUSIF, M.H.M. Histamine-induced vasodilation in the perfused kidney of STZ
diabetic rats: Role of EDNO and EDHF.
Pharmacol. Res., v. 51 p. 515-521, 2005.
ZOLTNIK, A. Chemokines in neoplastic progression.
Semin. Cancer Biol., v. 14, n.
3, p. 181-185, 2004.
139
ANEXO
Lonchocarpus sericeus lectin decreases leukocyte migration
and mechanical hypernociception by inhibiting
cytokine and chemokines production
Marcelo H. Napimoga
a,b,
⁎
, Benildo S. Cavada
c
, Nylane M.N. Alencar
d
,
Mário L. Mota
d
, Flávio S. Bittencourt
d
, José C. Alves-Filho
b
, Renata Grespan
b
,
Reginaldo B. Gonçalves
e
, Juliana T. Clemente-Napimoga
a
, Andressa de Freitas
b
,
Carlos A. Parada
b
, Sérgio H. Ferreira
b
, Fernando Q. Cunha
b
a
Laboratory of Molecular Biology, University of Uberaba, Brazil
b
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Brazil
c
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceará, Brazil
d
Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará, Brazil
e
Department of Oral Diagnostics, Dentistry School of Piracicaba, University of Campinas, Brazil
Received 10 October 2006; received in revised form 28 January 2007; accepted 8 February 2007
Abstract
In this study, we tested the potential use of a lectin from Lonchocarpus sericeus seeds (LSL), to control neutrophil migration
and inflammatory hypernociception (decrease of nociceptive threshold). Pretreatment of the animals intravenously (15 min before)
with LSL inhibited neutrophil migration to the peritoneal cavity in a dose-dependent fashion confirmed by an inhibition of rolling
and adhesion of leukocytes by intravital microscopy. We also tested the ability of the pretreatment with LSL to inhibit neutrophil
migration on immunised mice, and it was observed that a strong inhibition of neutrophil migration induced by ovoalbumin in
immunized mice. Another set of experiments showed that pretreatment of the animals with LSL, inhibited the mechanical
hypernociception in mice induced by the i.pl. injection of OVA in immunized mice and of carrageenan in naïve mice, but not that
induced by prostaglandin E
2
(PGE
2
) or formalin. This anti-nociceptive effect correlated with an effective blockade of neutrophil
influx, as assessed by the hind paw tissue myeloperoxidase levels. In addition, we measured cytokines (TNF-α and IL-1β) and
chemokines (MIP-1α [CCL3] and KC [CXCL1]) from the peritoneal exudates and i.pl. tissue. Animals treated with LSL showed
inhibition of cytokines and chemokines release in a dose-dependent manner. In conclusion, we demonstrated that the inhibitory
effects of LSL on neutrophil migration and mechanical inflammatory hypernocicepetion are associated with the inhibition of the
production of cytokines and chemokines.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Lectin; Nociception; Inflammation; Neutrophil; Cytokines
1. Introduction
Neutrophils are t he main leukocyte sub type
participating in organism defense, and its migration
International Immunopharmacology 7 (2007) 824 – 835
www.elsevier.com/locate/intimp
⁎
Corresponding author. Laboratory of Molecular Biology, University
of Uberaba, Av. Nenê Sabino, 1801, Uberaba, Minas Gerais 38055-500,
Brazil. Tel.: +55 34 3319 8913; fax: +55 34 3314 8910.
1567-5769/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.intimp.2007.02.001
from blood vessels into the tissue is a crucial process in
the host-response against microorganism infections [1].
Although they have a protective role in inflammation,
tissue damage is a deleterious consequence of the
intense neutrophil migration as observed in immune
inflammatory diseases [2].
The neutrophils are chemoattracted to sites of inflam-
mation by several stimuli and the process is mainly
mediated by chemotactic factors released by resident cells
[3]. Cytokines, chemokines, eicosanoids, LTB
4
and C5a
are among the major chemoatractant mediators to these
cells [4–7]. They induce rolling and adhesion of
neutrophils on endothelial cells, followed by their trans-
migration to the extravascular space [7]. The rolling,
adhesion and transendothelial migration involves the
participation of different families of adhesion molecules,
including the selectins, integrins and immunoglobulin
superfamily, respectively [8].
Certainly pain is an important symptom of inflam-
matory disease and is the principal reason by which
patient with inflammatory disease look for specialized
treatment. Following tissue injury and inflammation,
nociceptors are sensitized in such a way that previously
slight or ineffective stimulation becomes painful. The
sensitization of primary afferent nociceptors is a
common denominator of all kinds of inflammatory
pain that leads to a state of hyperalgesia and/or allodynia
in human, better described as hypernocicep tion in
animal models [9,10]. In fact, the term allodynia
involves a change in the quality of a sensation, whether
tactile, thermal, or of any other sort, where original
modality is normally non-painful, but the response is
painful [11]. Thus, there is a loss of specificity of a
sensory modality. By contrast, hyperalgesia represents
an augmented nociceptive response, where the quality is
not altered. In allodynia, the stimulus and response
modes differ, unlike the situation with hyperalgesia. In
this sense, the majority of experimental tests do not
differentiate allodynia from hyperalgesia since they do
not allow detection of loss of specificity of a sensor y
modality, characteristic of allodynia. On the other hand,
they permit to quantify an increase in the intensity of the
nociceptive response, which we believe to be better
described as hypernociception in animals models.
Hypernociception is induced by the direct action of
inflammatory mediators such as prostaglandins and sym-
pathetic amines, on the peripheral nociceptors [12–14].
These direct acting hyperalgesic mediators are ultimately
released in the inflamed tissue following a cascade of
cytokines by the resident and migratory cells: TNF-α is
early released and stimulates the release of IL-6 and IL-
1β which triggers the eicosanoid release. TNF-α also
induces CINC-1 (rat IL-8 related chemokine) release that
stimulated the sympathomimetic amines production
[6,15,16]. Besides the nociceptive direct-acting media-
tors described above, there is evidence that endothelins
[17,18],substanceP[19] and LTB
4
[20] also sensitize
the peripheral nociception.
Lectins constitute a group of widely distributed and
structurally heterogeneous carbohydrate binding pro-
teins that comprises distinct but evolutionary related
families. Leguminosae lectins constitute a protein
family with related amino acid sequences that may
differ from each other strongly with respect to their
carbohydrate-binding specificity [21]. Several lectins
are recognized among the adhesion molecules that
actively participate in those responses, such as the
selectins (L-, P-, and E-selectin), the integrin CD11b/
CD18 (Mac-1), CD31 (PECAM-1), and CD44 [22].
It has recent ly been shown that glucose–mannose and
N-acetyl-glucosamine-binding plant lectins inhibit the
neutrophil infiltration in different models of inflamma-
tion [23–25]. In this context, a Lonchocarpus sericeus
seeds lectin (LSL) inhibited the inflammatory response
in an infectious peritonitis model, by a competitive
blockage with a common selectin carbohydrate ligand
[26]. In the present study, we focused on a potential use
of LSL lectin obtained from seeds of Lonchocarpus
sericeus, as putative modulator of leukocyte migration
and hypernociception. The mechanisms by which this
lectin inhibits neutrophil migration and inflammatory
hypernociception were also addressed.
2. Materials and methods
2.1. Lectin isolation
Lectin was obtained from seeds of L. sericeus as described
by Alencar et al. [23]. Briefly, seeds of L. sericeus were
purified by a combination of affinity (chitin-column) and ion-
exchange chromatography (Mono-Q column), yielding a pure
lectin checked by SDS-PAGE, MALDI-MALDITOF and
partial N-terminal sequence. By SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis LSL yielded an electrophoretic pattern with
an apparent molecular mass of 26 kDa for the lectin similar to
the major band of Vatairea macrocarpa lectin (VML) [27] and
by gel filtration chromatography an apparent molecular mass
of 100 kDa indicating that probably the lectin is a tetramer
(data not published). LSL binds specifically to N-acetyl-
glucosamine residues and is endotoxin free.
2.2. Animals
Male Balb/c mice (20–25 g) were housed in temperature-
controlled rooms (22 –25 °C) with access to water and food ad
825M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
libitum. All experiments were conducted in accordance with
National Institutes of Health guidelines for the welfare of
experimental animals and with the approval of the Ethics
Committee of the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto
(University of São Paulo, São Paulo, Brazil). The animals were
used only in a single experimental group.
2.3. Experimental procedure to evaluate neutrophil migration
For the determination of neutrophil migration to peritoneal
cavity, LSL was administered i.v. 15 min before (3 or 10 mg/kg)
the administration of inflammatory stimuli by intraperitoneal
injection of carrageenan at 500 μg/cavity in naïve mice, or OVA
826 M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
at 100 μg/cavity dissolved in PBS in immunized mice (see
below for immunization procedures).
Mice were killed 4 h after the challenge (carrageenan or
OVA) administration and the peritoneal cavity cells were
harvested by washing the cavity with 3 mL of phosphate-
buffered saline (PBS) containing EDTA 1 mM. The volumes
recovered were similar in all experimental groups and equated
to approximately 95% of the injected volume. Total counts
were performed in a cell counter (COULTER A CT; Coulter,
Miami, FL, USA) and differential cell counts (100 cells total)
were carried out on cytocentrifuge (Cytospin 3; Shandon
Lipshaw, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) slides stained with
Rosenfeld. The results are presen ted as the number of
neutrophils per cavity.
The neutrophil migration to the i.pl. hind paw by
determination of myeloperoxidase activity (see below) after
carrageenan injection was also evaluated. Mice were pretreated
15 min before with lectin solution i.v. at 3 and 10 mg/kg in a
final volume of 100 μl. The animals received an i.pl. injection
of carrageenan (10 μg/paw; 25 μl) and neutrophil migration
was measured after 3 h.
2.4. Determination of myeloperoxidase activity
The extent of neutrophil accumulation in the hind paw was
measured by assaying myeloperoxidase activity as described
elsewhere [28]. Briefly, the hind paw tissue was removed and
homogenized in pH 4.7 buffer (0.1 M NaCl, 0.02 M NaPO
4
,
1.015 M NaEDTA) followed by centrifugation at 3000 rpm for
15 min. The pellet was subjected to hypotonic lyses (1.5 mL of
0.2% NaCl solution followed 30 s later by addition of an equal
volume of a solution containing NaCl 1.6% and glucose 5%).
After further centrifugation, the pellet was resuspended in
0.05 M NaPO
4
buffer (pH 5.4) containing 0.5% hexadecyl-
trimethylammonium bromide (HTAB). After that, the tissue
was snap-frozen in liquid nitrogen three times and was
centrifuged at 10,000 rpm for 15 min and was re-homoge-
nized. Myeloperoxidase activity in the resuspended pellet was
assayed by measuring the change in optical density at 450 nm
using tetramethylbenzidine (1.6 mM) and H
2
O
2
(0.5 mM).
Results were calculated by comparing the optical density of
hind paw tissue superna tant with a standar d curve of
neutrophil (N 95% purity) numbers.
2.5. Determination of neutrophil rolling and adhesion to the
mesenteric microcirculation by intravital microscopy
The leukocyte rolling and adhesion were examined as
previously described [29,30]. Briefly, animals were anesthe-
tized with hydrate chloride. The mesenteric tissue was exposed
for microscopic examination in situ. This was performed
through a longitudinal incision of the skin and abdominal
muscle on the right side of the body followed by the exposure
of the mesentery. Respiratory movements of the animals did
not affect the preparation, and the microcirculatory character-
istics remained essentially stable throughout the course of the
experiment. The animals were maintained on a special board
thermostatically controlled at 37 °C, with a transparent
platform on which the tissue to be transilluminated was
placed. The preparation was kept moist and warm by irrigating
the tissue with warmed (37 °C) Ringer Locke's solution, pH
7.2–7.4, containing 1% gelatin. A 500-line television camera
was mounted onto a triocular Zeiss microscope to facilitate
observation of the enlarged image (3400×) on a video screen.
Images were recorded on a video recorder with a 40× long
distance objective and a 0.65 numerical aperture. An image-
splitting micrometer was adjusted to the phototube of the
microscope as described by Baez [29]. The image splitter
sheared the optical image into two separate images and
displaced one with respect to the other. By rotating the image
splitter in the phototube, the shearing was maintained in a
direction at right angles to the axis of the vessel. The
displacement of one image from the others allowed measure-
ment of the vessel diameter. Vessels selected for study were
third-order venules, defined according to their branch-order
location within the microvascular network. These vessels
corresponded to postcapillary venules, with a diameter of
10 μm. The interaction of leukocytes with the luminal surface
of the venular endothelium was studied in a segment of the
vessel. Rolling leukocytes were defined as those white blood
cells that moved at a velocity less than that of erythrocytes in
the same stream. The number of rolling leukocytes was
Fig. 1. (A) The mice were treated with saline (0.1 mL, i.v.), or LSL (3 or 10 mg/kg, i.v., 15 min before) and then injected i.p. with carrageenan at a dose
of 500 μg/cavity. The neutrophil migration was evaluated 4 h later. The white bars represent the neutrophil migration induced by saline injected i.p. The
values are means ± SD.
⁎
P b 0.05 compared to Carrageenan group;
#
P b 0.05 compared to saline group (ANOVA followed by Bonferroni's t-test).
(B) Effects of the pretreatment with LSL lectin on the influx of neutrophils into the hind paw of mice after carrageenan administration. Vehicle (saline)
or LSL (3 or 10 mg/kg) was injected i.v. and, 15 min later, carrageenan (100 μg/paw; 0.25 mL) was injected into the hind paws. Myeloperoxidase
activity in the hind paw was used as an index of neutrophil influx. Results are shown as the mean±SD.
⁎
P b 0.05 compared to Carrageenan group;
#
P b 0.05 compared to saline group (ANOVA followed by Bonferroni's t test). The LSL treatment decreases leukocyte rolling and adhesion on venular
endothelial cells. The mice were treated with saline (0.1 mL, i.v.) or LSL (10 mg/kg, i.v., 15 min before) and then injected with Cg (500 μg/cavity). The
leukocyte rolling (C) and adhesion (D) were evaluated by intravital microscopy in the mesentery 4 h after Cg injection. The first bar in panels C and D
represents the rolling and adhesion, respectively, in PBS i.p. injected animals. The values are means ±SD.
⁎
P b 0.05 compared to carrageenan-injected
group;
#
P b 0.05 compared to saline group (ANOVA followed by Bonferroni's t-test). (E) Inhibition of OVA-induced neutrophil migration to peritoneal
cavity by LSL in immunized mice. Immunized (IM) animals were treated with saline (i.v; 15 min before) or LSL (3 or 10 mg/kg; i.v; 15 min before) and
false immunized animals were challenged i.p. with OVA (10 μg /cavity) and neutrophil migration was determined 4 h later. Data are mean ± SD.
⁎
P b 0.05 compared to OVA-injected group;
#
P b 0.05 compared to PBS i.p. group (ANOVA followed by Bonferroni's t-test). (F) Chemotaxis assay of
mice neutrophils incubated in the presence of LSL. Cells were allowed to migrate in the Boyden chamber toward the medium alone or MIP-2. Cells
were pre-incubated with different concentrations of LSL. Data show means± SD from three independent experiments performed in triplicate.
827M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
determined in 10-min intervals. These leukocytes moved
sufficiently slow as to be individually visible and were counted
as they rolled past a 10-μm length of venule [30]. A leukocyte
was considered to be adherent to the venular endothelium if it
remained stationary for N 30 s [31]. Adherent cells were
expressed as the number per 10-ìm length of venule. Cells
were counted in the recorded image using five different fields
for each animal to avoid variability due to sampling. Data were
then averaged for each animal.
2.6. Procedures for active immunization
OVA was dissolved in PBS to an appropriate concentration
(100 μg) and mixed with an equal volume of complete
Freund's adjuvant (CFA). CFA was used to augment the
efficiency of the immunization procedure [32] by prolonging
the lifetime of injected autoantigen and by stimulating its
effective delivery to the immune system; this results in altered
leukocyte proliferation and differentiation [33]. Mice were
subsequently injected subcutaneously at two different sites on
their back with an emulsion containing an equal volume of
PBS plus IFA to reforce the immunization at day 7 and 14.
False immunized mice were injected with this emulsion
without OVA. After 21 days, mice were challenged by the
intraperitoneal (i.p) administration of OVA (at 10 μg/cavity
dissolved in PBS) or by i.pl. administration of OVA (3 μg/paw)
to evaluate the hypernociception.
2.7. Isolation and in vitro stimulation of neutrophils
Peripheral blood neutrophils were isolated from mice. After
the lysis of red blood cells with ammonium chloride, neutrophils
were isolated by density-gradient centrifugation using Percoll
(Sigma). Neutrophils were washed with PBS and resuspended in
RPMI 1640 medium supplemented 0.01% of BSA. Neutrophils
were incubated with LSL (20 and 60 μg/mL) or with medium
alone (negative control) for 1 h at 37 °C. After that, neutrophils
were centrifuged and washed twice with fresh medium for
chemotaxis assay.
2.8. Chemotaxis assays
Cell migration was assessed by a 48-well microchemotaxis
chamber technique as described previously [34]. A 28.6 μl
aliquot of chemotaxis stimuli (MIP-2, 10
− 7
M) was placed in
the lower compartment and 50 μL of cell suspension
(1.0 × 10
6
/ml neutrophils) previously treated (as described
above) was placed in the upper compartment of the chamber.
The two compartments were separated by a polycarbonate
filter (5-μm PVP-free polycarbonate filter). The chamber was
incubated at 37 °C for 1 h. At the end of the incubation period,
the filter was removed fixed and stained. The number of
migrated cells in five distinct fields was counted by light
microscopy after coding the samples. All experiments were
repeated at least two times with different cells. The migration
was expressed as number of neutrophil per field.
2.9. Evaluation of systemic effects of LSL
Several parameters such as corporal mass loss, organ weight
alteration, stomach ulceration, leukogram and blood chemistry
parameters: concentration of urea, creatinine, alanine amino
transferase (AST) and aspartate amino transferase (ALT) were
evaluated after sub-chronic treatment with LSL. Animals were
weighed and injected i.v. daily, with a single dose of LSL
(10 mg/kg) or saline for 7 consecutive days. At the end of
treatment, blood of the animals was collected from retro-orbital
plexus under light anesthesia. Biochemical analyses were
performed in serum samples obtained after centrifugation of
total blood without anticoagulants, at 2500 rpm for 15 min.
Standardized diagnostic kits by LABTEST® spectrophotom-
eter were used in spectrophotometrical determination of the
AST, ALT, creatinine and urea parameters. For leukogram
determination, an aliquot of blood per animal was placed in
EDTA and total and differential counts of leukocytes were
carried out by standard manual procedures using light
microscopy [35]. After sacrifice, liver, kidney and heart were
removed and weighed. The wet weight of each organ was
expressed relative to 10 g of body weight and compared to the
saline-injected group (control). Possible ulcerative lesions or
hemorrhage were quantified and macroscopically measured.
The stomach was opened via longitudinal incision following
the great curvature and exposed for evaluation of the number
and grade of gastric mucosal lesions [36].
2.10. Effect of the pretreatment of animals with LSL lectin
upon mechanical hypernociception induced by OVA in
immunized mice and by carrageenan, prostaglandin E2
(PGE
2
) or formalin in naïve mice
Separate sets of 25 g mice (in Balb/c background) were
tested for behavioral responses to mechanical stimuli using
calibrated von Frey nylon filaments (tip diameter, 0.8 mm).
The mice were placed in an elevated plastic cage on a wire
mesh floor. Von Frey hairs were applied from below to the
plantar surface of the right hind paw in ascending order of
stimulus force (maxim 50 g). At threshold, the mouse
withdraws its paw away from the hair. Right hindpaw were
tested 3 times, and the interval between two consecutive trials
on the same paw was at least 1 min. The results are presented
as the average of responses against a given stimulus force.
All mice groups tested were pretreated 15 min before with
lectin solution i.v. at 3 or 10 mg/kg in a final volume of 100 μl.
To test mechanical hypernociception in immunized mice, after
lectin solution administration, the animals received an i.pl.
injection of OVA (3 μg/paw; 0.25 mL) at day 21 (see immu-
nization procedures) and hypernociception was measured 3 h
after OVA administration. Vehicle was injected i.pl. and also a
false immunized animals group were challenged with OVA
and used as a negative control. In a separate set of animals,
hypernociception was measured at 0 and 3 h after injection of
carrageenan (100 μg paw; 0.25 mL) into the hind paws (i.pl.)
or PGE
2
injection (100 ng paw; 0.25 mL) in mice pretreated
828 M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
15 min before with intravenous (i.v.) administration of vehicle
(saline) or LSL (3 or 10 mg/kg). Vehicle was injected i.pl. and
used as a negative control. The carrageenan and PGE
2
doses
injected were the smallest doses that evoked maximum acute
mechanical hypernociception [15,37–40].
Formalin-induced hypernociception behavior was assessed
as described previously [41]. Mice were allowed to acclimate
for 15 min in a plastic box and injected subcutaneously with
25 μl of 1% formaldehyde in 0.9% saline into the plantar right
hindpaw of mice pretreated 15 min before with LSL or vehicle.
The mice were observed for 60 min after the formalin injection,
and the paw flinches counted during the observation period
time. The acute phase (phase 1) was defined as 0–10 min after
injection, and the persistent (tonic) phase (phase 2) was defined
as 10–40 (phase 2a) min and 40–60 (phase 2b) after injection.
Fig. 3. Effects of the pretreatment with LSL lectin on mechanical
hypernociception induced by carrageenan (A), PGE
2
(B) or formalin
(C). Hypernociception was measured before and 3 h after injection of
vehicle (saline), carrageenan (100 μg) or PGE
2
into the hind paws of
mice. Vehicle or LSL (3 or 10 mg/kg) was injected i.v. 15 min before
carrageenan or PGE
2
injection. Results are expressed as means ± SD.
of the intensity of hypernociception (▵ reaction force, g).
⁎
P b 0.05
compared to Carrageenan group;
#
P b 0.05 compared to saline group
(ANOVA followed by Bonferroni's t-test). To perform formalin test,
LSL was injected i.v. 15 min before formalin administration. The mice
were observed for 60 min after the formalin injection, and the paw
flinches were counted during the observation time period. Results are
expressed as means ± SD. at 10, 40 and 60 min after injection.
Fig. 2. (A) Anti-hypernociceptive effect of LSL in immunised mice.
The mechanical hypernociceptive was evaluated after 3 h of i.pl.
injection of OVA in immunised mice at 3 μg/paw, in 25 μl and in false-
immunised mice (FI). Control immunised mice were injected with
saline (25 μl/paw). Results are expressed as mean ± SD.
⁎
P b 0.05
when compared to OVA-injected group;
#
P b 0.05 compared to FI
group (ANOVA followed by Bonferroni's t-test). (B) Anti OVA-
specific IgG endpoint titer kinetics in sera following immunization of
mice (▵) or false immunized mice (▴).
829M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
2.11. Cytokine and chemokine assay
Mice received lectin solution i.v. at 3 and 10 mg/kg in a final
volume of 100 μl, and after 2 h of carrageenan stimuli, peritoneal
exudates were recovered to cytokine measurements. In a separate
set of animals, lectin solution was administered as described and
inflammatory stimuli injection was done in the i.pl. right paw .
After 1 h, animals were killed, the skin tissues were removed
from the injected and control paws (saline). The samples were
homogenized in 500 μl of the appropriate buffer containing
protease inhibitors. Levels of TNF-α,IL-1β, M IP-1 (CCL3) and
KC (CXCL1) were determined by ELISA using protocols
supplied by the manufacturers (R and D Systems, Minneapolis)
from both experiments. The results are expressed as picograms.
2.12. ELISA for IgG anti-OVA
A 96-well plate for ELISA (Costar 3590, USA) was coated
with 10 μg/mL of OVA in PBS overnight at 4 °C. After
nonspecific binding was blocked with 1% BSA (Sigma-
Aldrich) in PBS for 2 h at room temperature, the diluted serum
was added and incubated overnight at 4 °C. After washing
with 0.05% Tween 20 in PBS, byotinilated anti-mouse IgG
antibody (Sigma) was added and incubated for 1 h at room
temperature. The wells were washed and avidin-HRP (DAKO
A/S, Denmark; 1:5000) was added and after 30 min, the plates
were washed, and the color reagent o-phenylen ediamine
(200 μg/well, Sigma-Aldrich) was added. After 15 min, the
reaction was interrupted with 1 M H
2
SO
4
. The color developed
was determined by the absorbance at 490 nm.
2.13. Statistical analysis
Data were expressed as mean ± SD (standard deviation).
Statistical comparisons between groups were made using
analyses of variance followed by Bonferroni's test. Signifi-
cance was accepted when the P value was ≤ 0.05.
Fig. 4. Effect of LSL pretreatment on cytokines (TNF-α and IL-1β) and chemokines (CCL3 and CXCL1) production on peritoneal exudates. Animals
were injected with saline (control) or LSL (3 or 10 mg/kg) and 15 min later it was performed injection with carrageenan. The concentration of all
tested cytokines and chemokines were determined by ELISA. Results are reported as means ±SD. of five animals each group and are representative of
two different experiments.
⁎
P b 0.05 compared to Carrageenan group.
830 M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
3. Results
3.1. Effect of LSL lectin on the neutrophil migration and
leukocyte-endothelium interaction (rolling and adhesion)
induced by carrageenan
The pretreatment with LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.) decreased
in a dose-dependent manner (P b 0.005) the neutrophil
migration in naïve mice, induced by intraperitoneal injection
of carrageenan (500 μg/0.2 mL) determined 4 h later (Fig. 1A).
Moreover, LSL (3 or 10 mg/kg) 15 min before the i.pl.
injection of carrageenan (100 μg/paw) reduced significantly
the neutrophil accumulation assessed by measuring the paw
tissue myeloperoxidase content after 3 h of stimuli (P b 0.05,
Fig. 1B).
To confirm the mechanisms by which the lectin decreases
the neutrophil migrati on to the inflamma tory site , we
administered LSL lectin and evaluate the leukocyte-endothe-
lium interaction in vivo. Leukocyte-endothelium interaction
(rolling and adhesion) was examined in mesenteric postcapil-
lary venules using intravital microscopy system. The intraper-
itoneal injection of carrageenan (500 μg/0.2 mL) caused a
significant increase in rolling (Fig. 1C) and adhesion (Fig. 1D)
of leukocytes on endothelium compared with the i.p. injection
of saline (P b 0.05). The pre-treatment of the carrageenan-
injected mice with LSL, at a dose of 10 mg/kg, significantly
decreased leukocyte rolling and adhesion as shown Fig. 1
panel C and D respectively (P b 0.05).
Moreover, it was also evaluated the neutrophil migration to
the peritoneal cavity in immunized animals. After the i.p.
injection of OVA in immunized mice, it was observed a
significant increase on neutrophil migration, compared with
false-immunized or P BS-injected immunized mice. The
pretreated of the animals with LSL decreased the neutrophil
migration in a dose-dependent manner (Fig. 1E).
We next investigated the ability of neutrophils to migrate in
vitro in the presence of LSL. Fig. 1F shows that MIP-2
(10
− 7
M), a classic neutrophils chemoattractant chemokine,
induces a significant neutrophil migration, compared with the
control (RPMI 1640). When neutrophils were pre-incubated
Fig. 5. Effect of LSL pretreatment on cytokines (TNF-α and IL-1β) and chemokines (CCL3 and CXCL1) production on paw tissue. Animals were
injected with saline (control) or LSL (3 or 10 mg/kg) and 15 min later it was performed i.pl. injection with carrageenan. The concentration of all teste d
cytokines and chemokines were determined by ELISA. Results are reported as means ± SD. of five animals each group and are representative of two
different experiments.
⁎
P b 0.05 compared to Carrageenan group.
831M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
with LSL, we observed similar migration to that induced by
10
− 7
M MIP-2. Even in the presence of the highest in vitro
concentration of LSL tested (60 μg/mL), it was not verified
any cell toxicity (98% of viable cells by trypan blue exclusion,
data not shown).
3.2. Effect of LSL pretreatment on mechanical hypernociception
Immunized mice displayed significantly higher levels of
hypernociception in response to i.pl. injection of OVA, at dose
of 3 μg/paw, compared to PBS-injected immunized mice or
false immunized control mice (
#
P b 0.05). Prior treatment with
LSL lectin (3 or 10 mg/kg, i.v., 15 min before) reduced OVA-
induced hypernociception in immunized mice by 82 and 89%
respectively (
⁎
P b 0.05) (Fig. 2A). It was performed an ELISA
to measure the anti-OVA IgG titer, confirming the efficacy of
the immunization and the absence of it on false immunized
mice (Fig. 2B).
Compared with vehicle, the injection of carrageenan (100 μg/
paw), PGE
2
(100 ng/paw) or formalin 1% (0.25 mL/paw) into
the hind paw of naïve mice evoked a significant hypernocicep-
tive effect (Pb 0.05), measured 3 h after injections. The pre-
treatment 15 min before with LSL (i.v.) inhibited in a dose-
dependent manner (3 or 10 mg/kg), the carrageenan-evoked
hypernociception (Fig. 3A), but was not able to inhibit the
hypernociception caused by PGE
2
(Fig. 3B) or formalin
(Fig. 3C).
3.3. Cytokine levels in the peritoneal exudates and paw tissue
of the animals pre treated with LSL after inflammatory stimuli
The intraperitoneal injection of carrageenan (500 μg/
cavity) induced a significant increase in the exudates levels
of TNF-α (Fig. 4A), IL-1β (Fig. 4B) and of the chemokines
CCL3 (Fig. 4C) and CXCL1 (Fig. 4D) determined 2 h after.
The pretreatment of the mice with LSL (3 or 10 mg/kg) 15 min
early the challenge with carrageenan significantly inhibit the
release of TNF-α, IL-1β, CCL3 and CXCL1 (P b 0.05).
It was also investigated the effect of LSL (3 or 10 mg/kg)
on cytokine and chemokines production in the inflamed paw
skin tissue after i.pl. administration of Cg (100 μg/paw). These
cytokines and chemokines mediate the mechanical hyperno-
ciception induced by i.pl. administration of Cg. The LSL-
treated mice decrease the paw skin tissue production of TNF-α
(Fig. 5A), IL-1β (Fig. 5B), CCL3 (Fig. 5C) and CXCL1
(Fig. 5D; P b 0.05).
3.4. In vivo toxicity
LSL (10 mg/kg; i.v.) injected in a single dose scheme over
seven consecutive days did not affect the animal corporal mass
or the wet weight of animal organs such as liver, kidney and
heart, compared to animals injected with sterile saline. All the
organs evaluated showed normal appearance and absence of
oedema over the whole course of lectin treatment. Addition-
ally, the stomach macroscopic evaluation showed an intact
mucosa with no visible lesions in the two groups analyzed
(LSL or saline treated). Values obtained for urea and
creatinine, used as parameters of renal function, did not differ
from controls. Moreover, hepatic function, evaluated via
hepatic enzymes (alanine amine transferase and aspartate
amine transferase), and the number of blood circulating
leukocytes were not altered by the lectin treatment in
comparison to controls (Table 1).
4. Discussion
Growing insights in the role of glycoconjugates in
bio-recognition, as liga nds for lectins, increase the
interest to study the effects of plant lectins. Lectins are a
structurally diverse class of proteins, their only common
features being the ability to bind carbohydrates
specifically and reversibly and to agglutinate cells
[42]. Attention is given regarding their application as
tools in biotechnology or in immunotherapies [43].
In the present stud y, we demonstrated th at the
pretreatment of mice with Lonchocarpus sericeus lectin
(LSL) attenuated the leukocyte-endothelium inte raction
(rolling and adhesion), neutrophil transmigration and
also the inflammatory hypernociception in response to
injection of inflammatory stimuli. However, LSL was
unable to inhibit MIP-2-induced neutrophil chemotaxis
in vitro. The inhibition of cytokines/chemokines pro-
duction by treatment of the animals with LSL correlates
with the decrease of neutrophil influx to inflammatory
site and of mechanical hyperno ciception.
Trafficking of leukocytes to injured tissues is a
sequential and coordinated process that requires cyto-
kines/chemokines, selectins, integrins and interce ll
Table 1
Sub-chronic treatment of animals with Lonchocarpus sericeus (LSL)
Parameters Treatment (0.1 mL; i.v.)
Saline LSL (10 mg/kg)
Corporal mass (g) after 33.3 ± 0.4 30.7 ± 0.1
Corporal mass (g) before 34.8± 0.6 29.6 ± 0.8
Liver (g/10 g body weight) 0.45 ± 0.0 0.50 ±0.0
Kidney (g/10 g body weight) 0.06± 0.0 0.07 ± 0.0
Heart (g/10 g body weight) 0.05± 0.0 0.05 ± 0.0
Total leukocytes× 10
3
/mL 6119± 503.9 9144± 1117.0
Neutrophils× 10
3
/mL 1265±153.3 1138± 153.4
Urea (mg/dL) 48.0± 1.3 46.0 ± 2.2
ALT (UI/L) 33.2± 2.3 32.8 ± 3.4
AST (UI/L) 52.7± 3.4 62.1 ± 4.8
Animals were injected daily in single doses during seven consecutive
days. After seven days of treatment, animals were weighed, blood
sample collected for leukogram count and biochemical dosage,
sacrificed and the organs wet weight taken. Values are reported as
mean ± SD.
832 M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
adhesion molecules (ICAMs). It has been described that
TNF-α and IL-1β are released in an early phase of the
inflammatory process triggered by non-immune or by
immune stimuli [4]. Although these cytokines are not
chemotactic for leukocytes by themselves [44],when
injected in different animals models they induce neu-
trophil migration [45,46]. Moreover, the neutralization of
these cytokines or their receptors reduces the leukocyte
migration induced by different inflammatory stimuli
[47,48]. It could be explained by the fact that TNF-α
and IL-1β are able to act on leukocytes and resident cells
inducing the expression of integrins and stimulating the
production of platelet-activating factor (PAF), LTB
4
and
chemokines, which are able to induce the neutrophil
recruitment [49]. Moreover, TNF-α and IL-1β also act on
endothelial cells stimulating the expression of selectin and
the up-regulation of ICAMs [3].
Besides cytokines, chemokines, mainly the CXC
branch, display a central role in mediating the signaling
cascade that recruits neutrophils to sites of inflamma-
tion. The chemokines bind to receptors on the surface of
these cells induces their chemotaxis and also induce the
release of other chemotactic mediators, such as LTB
4
[50–52]. In fact, it has been demonstrated that the
blockade of this G protein-coupled receptor or of its
ligands, chemokines are associated with inhibition of
neutrophil migration in models of infection and acute or
chronic inflammatory diseases in mice [51,53,54].We
observed that the pretreatment of the animals with LSL
inhibits the cytokines (IL-1β and TNF-α) and chemo-
kines (CXCL1 and CCL3) release stimulated by
carrageenan. These findings explain the decreased
neutrophil migration and the leukocyte rolling and
adhesion induced by carrageenan. The fact that LSL
does not have significant effect on neutrophil chemo-
taxis in vitro, reinforcing this conclusion. However, we
could not discard that the reduction in the rolling and
adhesion are also consequence of the interference of
LSL on the interaction of leukocytes to endothelium. In
fact, several lectin reduce these interaction of leukocytes
in vitro and in vivo experiments [55,56]. So, the
development of therapies using LSL as prototypes to
inhibit neutrophil migration could be an important aim
to manag ement inflammatory diseases.
Besides its inhibitory effect upon neutrophil migration,
LSL also present an additional analgesic action observed
after inflammatory stimuli induced by carrageenan and in
OVA-induced immune inflammation in mice. The
importance of this effect resides in the fact that pain is a
classical sign of inflammation, and certainly, one of the
main reasons that leads the patients look for treatments. It
was observed that LSL inhibits carrageenan and OVA-
mediated inflammatory hypernociception but not affect
hypernociceptive effect of prostaglandins and sympathet-
ic amines, which are mediators that act directing in the
nociceptive neurons inducing hypernociception
[6,39,57]. It is well-defined that a sequential cascade of
cytokines/chemokines precedes the release of the media-
tors that act directing in the nociceptive receptors inducing
their sensitization [6,15,16,39,57,58]. The noxious stim-
uli induce the release of TNF-α, which in turn stimulates
interleukin 6 (IL-6), interleukin 1β (IL-1β) and chemo-
kines formation (CINC-1 in rats or KC in mice).
Subsequently, IL-1β stimulates prostaglandin production
[6,39], whereas chemokines induces the release of
sympathomimetic amines from sympathetic nerve fibers
[6,57]. The fact that the pretreatment with LSL fails to
inhibit PGE
2
-induced hypernociception corroborates with
the idea of a preventive effect of this drug upon cytokine/
chemokine production. Reinforcing, this conclusion, LSL
pre-treated did not reduce the nociceptive response
induced by i.pl. injected formalin in mice. Different
from that of carrageenan, diluted formaldehyde causes a
biphasic characteristic response, initiated by direct
stimulation of nociceptors, leading to activation of C
fibers [59]. This phase is followed by an inflammatory
phase, in which the mainly mediators are histamine,
bradykinin and sympathomimetic amines [60–64].
However, we cannot discard that the inhibition of
neutrophil migration by LSL also account for its analgesic
action of this lectin. In fact, there are evidences that the
inhibition of neutrophil migration into joint of patients
precedes clinical signs of inflammation, including pain
[2]. Moreover, experimental studies demonstrated that
inhibition of the neutrophil migration reduces the
hypernociception induced by different inflammatory
stimuli [6,17,65,66]. There is evidence that LSL also
reduces the inflammatory oedema formation [23].Wedid
not investigated if the inhibitory effects of LSL upon
neutrophil migration and hypernociception are conse-
quence of the inhibition of the oedema. However, there
are evidences that these events could happen indepen-
dently. In fact, the cytokines TNF-α, IL-1β or IL-8 at
doses which induced hypernociception and neutrophil
migration did not induce oedema formation. Moreover,
thalidomide and pentoxifylline, drugs that inhibit cyto-
kine production, at doses that reduce neutrophil migration
and hypernociception do not affect the oedema formation
[58,67,68].
In conclusion, we demonstrated that the antinocicep-
tive and anti-neutrophil migration effects of L. sericeus
lectin are associated with the inhibition of the production
of cytokines and chemokines and consequently neutrophil
migration. In this context, it is important to strengthen the
833M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
therapeutic potential of drugs that target leukocyte
migration to inflammatory focus as well as the inflam-
matory pain to control either acute or chronic inflamma-
tory diseases. Thus, the results point out requirements for
investigations on the possible use of L. sericeus lectin as a
prototype for development of new drugs to treatment of
inflammatory diseases.
Acknowledgments
The authors would like to thank Mrs. Ieda R. Schivo
and Giuliana Bertozi for their technic al assistance.
References
[1] Malech HL, Gallin JI. Current concepts: immunology. Neutro-
phils in human diseases. N Engl J Med 1987;317:687–94.
[2] Jones AK, Al-Janabi MA, Solanki K, Sobnack R, Greenwood A,
Doyle DV, et al. In vivo leukocyte migration in arthritis. Arthritis
Rheum 1991;34:270–5.
[3] Wagner JG, Roth RA. Neutrophil migration mechanisms, with an
emphasis on the pulmonary vasculature. Pharmacol Rev 2000;52:
349–74.
[4] Dinarello CA. Proinflammatory cytokines. Chest 2000;118:503–8.
[5] Tager AM, Luster AD. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4)
receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2003;69:
123–34.
[6] Cunha TM, Verri Jr WA, Silva JS, Poole S, Cunha FQ, Ferreira
SH. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory
hypernociception in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:
1755–60.
[7] Guo RF, Ward PA. Role of C5a in inflammatory responses. Annu
Rev Immunol 2005;23:821–52.
[8] Panes J, Perry M, Granger DN. Leukocyte-endothelial cell
adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br J Pharmacol
1999;126:537–50.
[9] Millan MJ. The induction of pain: an integrative review. Prog
Neurobiol 1999;57:1–164.
[10] Parada CA, Vivancos GG, Tambeli CH, de Queiroz Cunha F,
Ferreira SH. Activation of presynaptic NMDA receptors coupled
to NaV1.8-resistant sodium channel C-fibers causes retrograde
mechanical nociceptor sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A
2003;100:2923–8.
[11] Bonica JJ. Clinical importance of hyperalgesia. In: Willis Jr WD,
editor. Hyperalgesia and allodynia, vol. 1. New York: Raven
Press; 1992. p. 17–43.
[12] Ferreira SH, Nakamura M. Prostaglandin hyperalgesia, a
cAMP/Ca
2+
dependent process. Prostaglandins 1979;18:179–90.
[13] Nakamura M, Ferreira SH. A peripheral sympathetic component in
inflammatory hyperalgesia. Eur J Pharmacol 1987;135:145–53.
[14] Khasar SG, McCarter G, Levine JD. Epinephrine produces a beta-
adrenergic receptor-mediated mechanical hyperalgesia and in vitro
sensitization of rat nociceptors. J Neurophysiol 1999;81:1104–12.
[15] Cunha FQ, Poole S, Lorenzetti BB, Ferreira SH. The pivo1tal
role of tumor necrosis factor alpha in the development of
inflammatory hyperalgesia. Br J Pharmacol 1992;107:660–4.
[16] Lorenzetti BB, Veiga FH, Canetti CA, Poole S, Cunha FQ, Ferreira
SH. Cytokine-induced neutrophil chemoattractant1 (CINC-1)
mediates the sympathetic component of inflammatory mechanical
hypersensitivity in rats. Eur Cytokine Netw 2002;134:456–61.
[17] Levine JD, Lau W, Kwiat G, Goetzl EJ. Leukotriene B
4
produces
hyperalgesia that is dependent on polymorphonuclear leuko-
cytes. Science 1984;225:743–5.
[18] da Cunha JM, Rae GA, Ferreira SH, de Cunha F de Q.
Endothelins induce ETB receptor-mediated mechanical hyper-
nociception in rat hind paw: roles of cAMP and protein kinase
C. Eur J Pharmacol 2004;501:87–94 .
[19] Nakamura-Craig M, Gill BK. Effect of neurokinin A, substance
P and calcitonin gene related peptide in peripheral hyperalgesia
in the rat paw. Neurosci Lett 1991;124:49–51.
[20] Ferreira SH, Romitelli M, de Nucci G. Endothelin-1 participation
in overt and inflammatory pain. J Cardiovasc Pharmacol 1989;13:
S220–2.
[21] Van Damme EJM, Peumans WJ, Barre A, Rouge P. Plant lectins:
a composite of several distinct families of structurally and
evolutionarily related proteins with diverse biological roles. Crit
Rev Plant Sci 1988;17:575–692.
[22] Hébert E. Endogenous lectins as cell surface transducers. Biosci
Rep 2000;20:213–37.
[23] Alencar NM, Teixeira EH, Assreuy AMS, Cavada BS, Flores CA,
Ribeiro RA. Leguminous lectins as tools for studying the role of
sugar residues in leukocyte recruitment. Mediators Inflamm 1999;8:
107–13.
[24] Assreuy AMS, Shibuya RA, Martins GJ, Souza MLP, Cavada
BS, Moreira RA, et al. Anti-inflammatory effect of glucose–
mannose binding lectins isolated from Brazilian beans. Mediators
Inflamm 1997;6:201–10.
[25] Assreuy AMS, Martins GJ, Moreira MEF, Brito GAC, Cavada
BS, Ribeiro RA, et al. Prevention of cyclophosphamide-induced
hemorrhagic cystitis by glucose–mannose binding plant lectins.
J Urol 1999;161:1988–93.
[26] Alencar NM, Cavalcante CF, Vasconcelos MP, Leite KB, Aragao
KS, Assreuy AM, et al. Anti-inflammatory and antimicrobial effect
of lectin from Lonchocarpus sericeus seeds in an experimental rat
model of infectious peritonitis. J Pharm Pharmacol 2005;57:
919–22.
[27] Cavada BS, Santos CF, Grangeiro TB, Nunes EP, Sales PV,
Ramos RL, et al. Purification and characterization of a lectin from
seeds of Vatairea macrocarpa Duke. Phytochemistry 1998;49:
675–80.
[28] Guerrero AT, Verri Jr WA, Cunha TM, Silva TA, Rocha FA,
Ferreira SH, et al. Hypernociception elicited by tibio-tarsal joint
flexion in mice: a novel experimental arthritis mo del for
pharmacological screening. Pharmacol Biochem Behav 2006;84:
244–51.
[29] Baez S. Simultaneous measurements of radii and wall thickness of
microvessels in the anesthetized rat. Circ Res 1969;25:315–29.
[30] Fortes ZB, Farsky SP, Oliveira MA, Garcia-Leme J. Direct vital
microscopic study of defective leukocyte-endothelial interactions
in diabetes mellitus. Diabetes 1991;40:1267–73.
[31] Granger DN, Benoit JN, Suzuki M, Grisham MB. Leukocyte
adherence to venular endothelium during ischemia-reperfusion.
Am J Physiol 1989;257:G683–8.
[32] Freund J. The mode of action of immuno-pharmacological
adjuvants. Adv Tuberc Res 1956;1:130–48.
[33] Billiau A, Matthys P. Modes of action of Freund's adjuvants in
experimental models of autoimmune diseases. J Leukoc Biol
2001;70:849–60.
[34] Arraes SM, Freitas MS, da Silva SV, de Paula Neto HA, Alves-
Filho JC, Martins MA, et al. Impaired neutrophil chemotaxis in
834 M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
sepsis associates with GRK expression and inhibition of actin
assembly and tyrosine phosphorylation. Blood 2006;108:
2906–13.
[35] Souza GEP, Ferreira SH. Blockade by antimacrophage serum of
the migration of PMN neutrophils into the inflamed peritoneal
cavity. Agents Actions 1985;17:97–103.
[36] Santucci L, Fiorucci S, Giansanti M, Brunori PM, Di Matteo FM,
Morelli A. Pentoxifylline prevents indomethacin induced acute
gastric mucosal damage in rats: role of tumour necrosis factor
alpha. Gut 1994;35:909–15.
[37] Ferreira SH, Nakamura M, de Abreu Castro MS. The hyperalgesic
effects of prostacyclin and prostaglandin E2. Prostaglandins
1978;16:31–7.
[38] Ferreira SH, Zanin T, Lorenzetti BB, de Souza MZ, Medeiros
MC, Leme JG. Increased vascular permeability, oedema and
hyperalgesia caused by carrageenan in the rat's paw. Agents
Actions 1978;8:159.
[39] Ferreira SH, Lorenzetti BB, Bristow AF, Poole S. Interleukin-1
beta as a potent hyperalgesic agent antagonized by a tripeptide
analogue. Nature 1988;334:698–700.
[40] Ferreira SH, Lorenzetti BB, Poole S. Bradykinin initiates
cytokine-mediated inflammatory hyperalgesia. Br J Pharmacol
1993;110:1227–31.
[41] Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole K. The
formalin test: an evaluation of the method. Pain 1992;51:5–17.
[42] Sharon N. Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals:
an atomic view. Trends Biochem Sci 1993;18:221–6.
[43] Rudiger H, Gabius HJ. Plant lectins: occurrence, biochemistry,
functions and applications. Glycoconj J 2001;18:589–613.
[44] Burke-Gaffney A, Hellewell PG. Tumour necrosis factor-alpha-
induced ICAM-1 expression in human vascular endothelial and
lung epithelial cells: modulation by tyrosine kinase inhibitors. Br
J Pharmacol 1996;119:1149–58.
[45] Casale TB, Carolan EJ. Cytokine-induced sequential migration
of neutrophils through endothelium and epithelium. Inflamm Res
1999;48:22–7.
[46] Bombini G, Canetti C, Rocha FA, Cunha FQ. Tumour necrosis
factor-alpha mediates neutrophil migration to the knee synovial
cavity during immune inflammation. Eur J Pharmacol
2004;496:197–204.
[47] Smeets RL, Joosten LA, Arntz OJ, Bennink MB, Takahashi N,
Carlsen H, et al. Soluble interleukin-1 receptor accessory protein
ameliorates collagen-induced arthritis by a different mode of
action from that of interleukin-1 receptor antagonist. Arthritis
Rheum 2005;52:2202–11.
[48] Feldmann M, Pusey CD. Is there a role for TNF-alpha in anti-
neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis? Lessons
from other chronic inflammatory diseases. J Am Soc Nephrol
2006;17:1243–52.
[49] Gaudreault E, Stankova J, Rola-Pleszczynski M. Involvement of
leukotriene B4 receptor 1 signaling in platelet-activating factor-
mediated neutrophil degranulation and chemotaxis. Prostaglan-
dins Other Lipid Mediat 2005;75:25–34.
[50] Khandaker MH, Mitchell G, Xu L, Andrews JD, Singh R, Leung
H, et al. Metalloproteinases are involved in lipopolysaccharide-
and tumor necrosis factor-alpha-mediated regulation of CXCR1
and CXCR2 chemokine receptor expression. Blood 1999;93:
2173–85.
[51] Ramos CD, Canetti C, Souto JT, Silva JS, Hogaboam CM,
Ferreira SH, et al. MIP-1alpha[CCL3] acting on the CCR1 receptor
mediates neutrophil migration in immune inflammation via
sequential release of TNF-alpha and LTB4. J Leukoc Biol
2005;78:167–77.
[52] Ramos CD, Fernandes KS, Canetti C, Teixeira MM, Silva JS,
Cunha FQ. Neutrophil recruitment in immunized mice depends
on MIP-2 inducing the sequential release of MIP-1alpha, TNF-
alpha and LTB(4). Eur J Immunol 2006;36:2025–34.
[53] Belperio JA, Keane MP, Burdick MD, Londhe V, Xue YY, Li K,
et al. Critical role for CXCR2 and CXCR2 ligands during the
pathogenesis of ventilator-induced lung injury. J Clin Invest
2002;110:1703–16.
[54] Moreno SE, Alves-Filho JC, Rios-Santos F, Silva JS, Ferreira
SH, Cunha FQ, et al. Signaling via platelet-activating factor
receptors accounts for the impairment of neutrophil migration in
polymicrobial sepsis. J Immunol 2006;177:1264–71.
[55] Coelho MB, Desouza IA, Freire MG, Marangoni S, Antunes E,
Macedo ML. Neutrophil migration in mice induc ed by a
mannose-binding lectin isolated from Annona coriacea seeds.
Toxicon 2006;48:529–35.
[56] Pereira-da-Silva G, Moreno AN, Marques F, Oliver C, Célia-
Jamur M, Panunto-Castelo A, et al. Neutrophil activation induced
by the lectin KM+ involves binding to CXCR2. Biochim
Biophys Acta 2006;1760:86–94.
[57] Cunha FQ, Lorenzetti BB, Poole S, Ferreira SH. Interleukin-8 as
a mediator of sympathetic pain. Br J Pharmacol 1991;104:765–7.
[58] Poole S, Lorenzetti BB, Cunha JM, Cunha FQ, Ferreira SH.
Bradykinin B1 and B2 receptors, tumour necrosis factor alpha
and inflammatory hyperalgesia. Br J Pharmacol 1999;126:
649–56.
[59] Shibata M, Ohkubo T, Takahashi H, Inoki R. Modified formalin
test: characteristic biphasic pain response. Pain 1989;38:347–52.
[60] Hong Y, Abbott FV. Contribution of peripheral alpha 1A-
adrenoceptors to pain induced by formalin or by alpha-methyl-5-
hydroxytryptamine plus noradrenaline. Eur J Pharmacol 1996;301:
41–8.
[61] Jourdan D, Ardid D, Bardin L, Bardin M, Neuzeret D,
Lanphouthacoul L, et al. New automated method of pain scoring
in the formalin test in rats. Pain 1997;71:265–70.
[62] Hama A, Menzaghi F. Antagonist of nicotinic acetylcholine
receptors (nAChR) enhances formalin-induced nociception in
rats: tonic role of nAChRs in the control of pain following injury.
Brain Res 2001;888:102–6.
[63] Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception.
Pharmacol Rev 2001;53:597–652.
[64] Parada CA, Tambeli CH, Cunha FQ, Ferreira SH. The major role
of peripheral release of histamine and 5-hydroxytryptamine in
formalin-induced nociception. Neuroscience 2001;102:937–44.
[65] Verri Jr WA, Schivo IR, Cunha TM, Liew FY, Ferreira SH,
Cunha FQ. Interleukin-18 induces mechanical hypernociception
in rats via endothelin acting on ETB receptors in a morphine-
sensitive manner. J Pharmacol Exp Ther 2004;310:710–7.
[66] Santodomingo-Garzon T, Cunha TM, Verri Jr WA, Valério DA,
Parada CA, Poole S, et al. Atorvastatin inhibits inflammatory
hypernociception. Br J Pharmacol 2006;149:14–22.
[67] Vale ML, Cunha FQ, Brito GA, Benevides VM, Ferreira SH,
Poole S, et al. Anti-nociceptive effect of thalidomide on zymosan-
induced experimental articular incapacitation. Eur J Pharmacol
2006;536:309–17.
[68] Vale ML, Benevides VM, Sachs D, Brito GA, da Rocha FA,
Poole S, et al. Antihyperalgesic effect of pentoxifylline on
experimental inflammatory pain. Br J Pharmacol 2004;143:
833–44.
835M.H. Napimoga et al. / International Immunopharmacology 7 (2007) 824–835
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
