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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA DO COMPORTAMENTO
Estudo da associação entre duas regiões do genoma do rato, localizadas
nos cromossomos 4 e 7, e a emocionalidade em duas linhagens de ratos
selecionadas no teste do campo aberto
Thaïs Müller Hameister
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre ao
Curso de Pós-graduação em Neurociências
da Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador: Prof. Dr. André de Ávila Ramos
Florianópolis, fevereiro de 2008.
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AGRADECIMENTOS
Gostaria aqui de registrar meus mais sinceros agradecimentos a algumas pessoas, que
possibilitaram a realização desta etapa tão importante em minha vida. Peço desculpas
aos possíveis esquecimentos.
Ao professor Dr. André Ramos, pela amizade e compreensão diante de algumas
dificuldades passadas no decurso do trabalho. Mas principalmente pela oportunidade de
trabalhar neste laboratório, o que propiciou meu desenvolvimento científico na área por
mim tão almejada que é a genética do comportamento. Agradeço também pelo crédito e
dedicação, tão importantes para meu desenvolvimento intelectual e científico.
A professora Ilíada Rainha de Souza que me recebeu no Laboratório de Polimorfismos
Genéticos na UFSC, pelo acolhimento em seu laboratório e pelo carinho, o que
possibilitou a aprendizagem e otimização de técnicas de biologia molecular essenciais
para este trabalho. Também por orientar-me, e permitir à minha prática de ensino, na
disciplina de Genética para Farmácia na UFSC.
Ao professor Paulo Hofmann, do Laboratório de Drosofilídeos na UFSC, pelas dúvidas
esclarecidas e pelos comentários tão importantes a respeito deste trabalho.
Ao professor Victor Hugo Valiati, da Universidade do Vale do Rio dos Sinos, pela
paciência, carinho, compreensão, pelas dúvidas esclarecidas, pelos comentários e
orientações de quais caminhos tomar frente a resultados referentes à seleção artificial e
evolução, imprescindíveis para a análise dos dados obtidos no presente trabalho.
Em especial ao meu colega de trabalho Geison de Souza Izídio, pelas horas e horas de
colaboração, ajuda essencial, sem distinção de horários mesmo à noite ou nos finais de
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semana. Pela troca de conhecimento e pelos debates sempre oportunos envolvendo
temas tão apaixonantes como os transtornos de humor e suas comorbidades. Pelo
carinho, paciência, amizade e também pelas boas risadas no fim do dia depois de horas
de experimentos moleculares.
Aos demais colegas de laboratório Elayne, Gustavo, Leandro, Douglas, Francine, Ana
Paula, Natália, Lígia, Fedra e Luís pela amizade e os bons momentos juntos além da
ajuda nas tarefas diárias no decurso do mestrado.
Aos colegas do Laboratório de Polimorfismos Genéticos da UFSC, em especial ao
Tiago, Sandra e Aninha, que usando o tempo destinados a suas pesquisas se dedicaram a
me ensinar técnicas de biologia molecular, sem as quais este trabalho não teria sido
realizado.
A minha mãe pelo amor, apoio, estímulo constante, conforto nas horas difíceis e por
estar presente diariamente durante todo o curso. Por ter me dado “asas” para “voar”
sozinha.
A minha grande e amada família pelo apoio durante este momento tão importante da
minha vida. Principalmente aos meus tios Gilberto e Jurema, ao meu primo Bernardo, a
Josiane minha cunhada e “irmã” postiça, que tanto me apoiaram durante toda minha
vida e à minha avó amada Frida (in memoriam) que faleceu durante o mestrado, período
em que menos me fiz presente na vida dela.
A minha sobrinha Vitória, pelo amor e pelos conselhos proferidos por uma menina tão
novinha de forma tão sábia e madura. Por compreender de forma tão adulta que este
passo findado é extremamente importante para minha vida.
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Ao meu pai (in memoriam) que não está mais presente e que infelizmente conviveu
durante toda sua vida com transtornos de humor, hoje meu objeto de estudo. Pelo amor
e pelos vínculos estabelecidos em tão pouco tempo de convívio.
Em especial ao Dr. Flavio Vicente, cujo apoio foi fundamental para a finalização deste
trabalho.
A todos os meus amigos em especial a Karina, Tatiana, Carolina, Joana, Celomar,
Denise e Daniela, pela amizade e apoio em todos os momentos.
Ao Cassio pelo carinho e apoio na fase final do mestrado e por acreditar que este
trabalho seria concluído.
Ao funcionário Nivaldo, da Pós-Graduação em Neurociências da UFSC, que trabalha
em favor de uma universidade pública, gratuita e de qualidade, que tantos “galhos me
quebrou” durante o curso.
Ao funcionário Marcos, do CCB da UFSC, que prontamente muitas vidrarias,
microtubos e outros equipamentos autoclavou.
Aos “ratinhos” das linhagens Floripa H e Floripa L, o modelo animal que me permitiu
conhecimento e conclusões fundamentais para o início do entendimento da influência da
genética quantitativa nos transtornos de ansiedade. Também por permitir que
despertasse em mim um sentimento pouco comum a humanos, o carinho pelos roedores.
Ao apoio financeiro da Capes, da Fapesc e do PRONEX, sem o qual esta etapa não teria
sido concluída.
5
"A satisfação está no esforço feito para alcançar o objetivo, e não em tê-lo
alcançado".
Mohandas Karamchand Gandhi (1869 – 1948)
6
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................20
1.1. Emoção e emocionalidade ...............................................................................20
1.2. Ansiedade..........................................................................................................20
1.3. Modelos animais de ansiedade ........................................................................21
1.4. Locus para traços quantitativos (QTL) e comportamento ..........................24
1.5. Ofil1 e Ofil2, dois loci associados à emocionalidade .....................................26
1.6. Linhagens de roedores selecionadas para comportamento..........................28
1.7. Floripa H e Floripa L, duas linhagens de ratos selecionadas para a
emocionalidade ............................................................................................................30
2 - OBJETIVOS ............................................................................................................33
2.1.Gerais .................................................................................................................33
2.2. Específicos.................................... ....................................................................33
3 - MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................34
3.1. Floripa H e Floripa L, duas linhagens de ratos selecionadas para a
emocionalidade ..............................................................................................................34
7
3.2. Extração de DNA............... ..............................................................................34
3.3. Reação em cadeia da polimerase.....................................................................35
3.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% .................................................37
3.5 Eletroforese em gel de agarose a 3%...............................................................39
3.6. Análises estatísticas ..........................................................................................39
3.6.1. Variação nas freqüências alélicas da S0 a S4........................................39
3.6.2. Teste para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg..........................................40
3.6.3. Teste do X
2
de contingência para todas as gerações de seleção ..........41
3.6.4. Análises de correlação e regressão.........................................................41
4 – RESULTADOS .......................................................................................................43
4.1. Tamanho dos alelos .........................................................................................43
4.2. Linhagem Floripa H ........................................................................................44
4.2.1. Dados de genotipagem para D4RAT59 .................................................44
4.2.2. Dados de genotipagem para D4MGH27 ...............................................46
4.2.3. Dados de genotipagem para D7MGH11 ...............................................48
4.2.4. Dados de genotipagem para D7RAT35 .................................................50
8
4.2.5. Correlação entre freqüência alélica e locomoção central ...................51
4.3. Linhagem Floripa L..........................................................................................53
4.3.1. Dados de genotipagem para D4RAT59 .................................................53
4.3.2. Dados de genotipagem para D4MGH27 ...............................................55
4.3.3. Dados de genotipagem para D7MGH11................................................57
4.3.4. Dados de genotipagem para D7RAT35 .................................................59
4.3.5. Correlação entre freqüência alélica e locomoção central ...................60
4.4. Correlação entre a variação das freqüências alélicas e a variação da
locomoção central entre as linhagens Floripa H e Floripa L.....................................61
5- DISCUSSÃO .............................................................................................................65
6 – CONCLUSÃO .........................................................................................................74
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................75
9
ABREVIATURAS
CA (ou OF) = Campo aberto ( ou Open Field)
CBP = Caixa branca e preta
DNA = Ácido desoxiribonucleico
GL = Graus de liberdade
HA = Linhagem de ratos High Avoidance
HAB = Linhagem de ratos High Anxiety-related Behaviour
HEP = Linhagem de ratos High-Ethanol Preferring
HOFT = Linhagem de camundongos High Open-field Thigmotaxis
LA = Linhagem de ratos Low Avoidance
LAB = Linhagem de ratos Low Anxiety-related Behaviour
LCE = Labirinto em cruz elevado
LEW = Linhagem de ratos Lewis
Locus = Região genômica, plural loci
LOD score = Maximum logarithm of the likelihood for the QTL
LOFT = Linhagem de camundongos Low Open-field Thigmotaxis
MNR = Linhagem de ratos Maudsley Nonreactive
10
MR = Linhagem de ratos Maudsley Reactive
NP = Linhagem de ratos Alcohol-Nonpreferring
Ofil1 = QTL para Open field inner locomotion 1 no cromossomo 4 de ratos
Ofil2 = QTL para Open field inner locomotion 2 no cromossomo 7 de ratos
P = Linhagem de ratos Alcohol-Preferring
PCR = Reação em cadeia da enzima polimerase
QTL = locus para traços quantitativos
QTG = Gene para traços quantitativos
RHA = Linhagem de ratos Roman High Avoidance
RLA = Linhagem de ratos Roman Low Avoidance
SHR = Linhagem de ratos Spontaneously Hypertensive Rats
sNP = Linhagem de ratos Sardinian Alcohol-Nonpreferring
sP = Linhagem de ratos Sardinian Alcohol-Preferring
UFSC = Universidade Federal de Santa Catarina
uTaq = Unidade de medida para Taq polimerase
WKY = Linhagem de ratos Wystar-Kyoto
χ
2
= Qui quadrado
11
RESUMO
As linhagens de ratos Floripa H e Floripa L, selecionadas bidirecionalmente para
extremos de locomoção no centro do teste do campo aberto (CA), um comportamento
relacionado à emocionalidade, foram propostas como um modelo animal para estudar a
genética da ansiedade. As duas linhagens foram desenvolvidas no intuito de investigar a
influência de dois locus para traços quantitativos (QTLs). Ambos QTLs foram
previamente identificados em uma geração F2 resultante do acasalamento de ratos LEW
e SHR afetando a ativividade locomotora no centro do CA, o mesmo fenótipo foi
utilizado como parâmetro de seleção nas linhagens Foripa. Os dois QTLs, um no
cromossomo 4 e outro no 7, respectivamente, foram denominados de open field inner
locomotion QTL 1 (Ofil1) e open field inner locomotion QTL 2 (Ofil2). O presente
estudo teve como objetivo verificar se os QTLs (Quantitative Trait Locus) Ofil1 e Ofil2,
sabidamente associados a comportamentos emocionais em ratos derivados das linhagens
isogênicas LEW e SHR, estariam da mesma forma contribuindo para este fenótipo
comportamental nas linhagens Floripa, selecionadas a partir de uma geração de animais
resultante de um intercruzamento entre linhagens parentais ainda não investigadas do
ponto de vista genotípico.
Com este objetivo, foram utilizados quatro marcadores moleculares do tipo
microssatelite, dois flanqueando o pico de Ofil1 (D4RAT59 e D4MGH27) e dois
flanquando o pico de Ofil2 (D7MGH11 e D7RAT35), que se mostraram polimórficos
para o modelo animal em estudo. Para verificar se o genótipo destas duas regiões estaria
influenciando o fenótipo selecionado, ratos de cinco gerações foram genotipados para os
quatro marcadores utilizados. Mudanças nas freqüências alélicas e genotípicas ao longo
do processo de seleção foram avaliadas para verificar se a seleção imposta ao fenótipo
foi acompanhada por divergências genotípicas entre as linhagens.
12
Foram observadas alterações nas freqüências genotípicas em todos marcadores
moleculares para ambos os QTLs, porém somente os genótipos para os marcadores no
locus Ofil1, pareceram estar significativamente correlacionados com a variação no
fenótipo selecionado. Este resultado sugere que nesta região do genoma deve existir um
ou mais genes contribuindo para a variação interindividual na locomoção na área
aversiva do teste do CA. As alterações nas freqüências genotípicas observadas para os
marcadores do QTL Ofil2, por aparentemente não apresentarem correlação com o
fenótipo, parecem ser resultado de deriva genética aleatória, talvez com pequena
contribuição. Portanto, através deste trabalho, corrobora-se a influência do locus Ofil1,
em diferentes linhagens de ratos, para um comportamento relacionado à
emocionalidade, porém o efeito de Ofil2 não pode ainda ser descartado.
13
ABSTRACT
The strains of rats named Floripa H and L, bidirectionaly selected to extremes of
locomotion in the centre of the test of open field (OF), an emotionality-related behavior,
were proposed as an animal model to study the genetics of anxiety. The two strains were
developed in order to investigate the influence of two quantitative trait locus (QTLs)
Both QTLs were previously identified in a generation F2, resulting from the mating of
rats and LEW SHR, affecting the locomotor activity in OF test, the same phenotype was
used as a parameter for selection in Floripa strains. The two QTLs, one on chromosome
4 and another at 7, respectively, were called open field inner locomotion QTL 1 (Ofil1)
and open field inner locomotion QTL 2 (Ofil2). This study aimed to ascertain whether
the QTLs (Quantitative Trait Locus) Ofil1 and Ofil2, known associated with emotional
behavior in rats isogenic lines derived from LEW and SHR, would be the same way
contributing to this behavioral phenotype among strains Floripa, selected from of a
generation of animals resulting from an intercruzamento between parental strains have
not yet investigated the point of view genotipic. Two loci for central locomotion in the
open field test (OF) were identified in the F2 generation resulting from the intercross of
LEW and SHR rats. A locus on chromosome 4 and another on chromossome 7,
respectively, were named Ofil1 and Ofil2. The present study aimed to verify whether the
QTLs (Quantitative Trait Locus) Ofil1 and Ofil2, known to be associated with emotional
behaviors in rats derived from the strains LEW and SHR, would contribute to the same
behavioral phenotype in Floripa H and L rats, selected from another population of
animals.
With this objective, we used four molecular microssatelite markers, two flanking
the peak of Ofil1 (D4RAT59 and D4MGH27) and two flanking the peak of Ofil2
14
(D7MGH11 and D7RAT35), which were polymorphic for the animal population under
study. To verify whether the genotype of these two regions would influence the selected
phenotype, five generations of rats were genotyped for the four markers used. Changes
in genotypic and allelic frequencies throughout the process of selection were evaluated
to determine if the selection on the phenotype was accompanied by genotypic
differences between the strains.
There were changes in genotypic frequencies in all molecular markers for both
QTLs, but only the markers on locus Ofil1, seemed to be significantly correlated with
the changes in the phenotype. This result suggests that this region of the genome may
contain one or more genes contributing to the interindividual variation in locomotion in
the aversive area test of the OF. The changes in genotypic frequencies observed for the
QTL Ofil2 markers, had apparently no correlation with the phenotype, as it appeared to
be the result of random genetic drift, perhaps with little effect of selection. Therefore,
through this work, we confirm the influence of the locus Ofil1, in different strains of
rats, on an emotionality-related behavior, but the effect of Ofil2 is not totally discarded.
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Alelos encontrados para cada um dos marcadores utilizados em ratos da
geração S0, que deu origem às linhagens Floripa H e L, e ratos isogênicos das linhagens
controle LEW e SHR.
Tabela 2 - Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências alélicas e
teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração para o
marcador D4RAT59 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem de ratos
Floripa H.
Tabela 3 - Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências alélicas e
teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração para o
marcador D4MGH27 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem de ratos
Floripa H.
Tabela 4 - Total de indivíduos por classes genotípica/fenotípica, freqüências
genótipicas e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada
geração para os marcadores D7MGH11 e D7RAT35 do cromossomo 7 ao longo de 5
gerações da linhagem de ratos Floripa H.
16
Tabela 5 - Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências genótipicas
e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração
para o marcador D4RAT59 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem
Floripa L .
Tabela 6 - Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências genótipicas
e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração
para o marcador D4MGH27 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem L.
Tabela 7. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências genótipicas
e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração
para os marcadores D7MGH11 e D7RAT35 do cromossomo 7 ao longo de 5 gerações
da linhagem L.
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Locomoção central no teste do campo aberto para machos e fêmeas nas
cinco primeiras gerações de seleção (S0 até S4) das linhagens de ratos Floripa H e
Floripa L. Extraído de Ramos et al. (2003).
Figura 2 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D4RAT59, no cromossomo 4.
Figura 3 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D4MGH27, no cromossomo 4.
Figura 4 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D7MGH11, no cromossomo 7.
Figura 5 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D7RAT35, no cromossomo 7.
18
Figura 6 - Freqüência do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o
marcador D4MGH27, ambos no cromossomo 4, em comparação com a média de
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa H.
Figura 7 - Freqüência do alelo 1 para o marcador D7MGH11 e do alelo 2 para o
marcador D7RAT35, em comparação com a média da locomoção central nas gerações
de seleção da linhagem de ratos Floripa H.
Figura 8 - Freqüências alélicas por gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D4RAT59, no cromossomo 4.
Figura 9 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D4MGH27, no cromossomo 4.
Figura 10 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D7MGH11, no cromossomo 7.
Figura 11 - Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D7RAT35, no cromossomo 7.
19
Figura 12 - Freqüência do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o
marcador D4MGH27, ambos no cromossomo 4 em comparação com a média de
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L.
Figura 13 - Freqüência do alelo 1 para o marcador D7MGH11 e do alelo 2 para o
marcador D7RAT35, ambos no cromossomo 7, em comparação com a média da
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L.
Figura 14 - Freqüências do alelo 1 para o marcador D4RAT59 no cromossomo 4 nas
gerações de seleção para as linhagens Floripa H e Floripa L.
Figura 15 - Freqüências do alelo 3 para o marcador D4MGH27 no cromossomo 4 nas
gerações de seleção para as linhagens Floripa H e Floripa L.
Figura 16. Delta interlinhagens para a locomoção central no teste do CA e para as
freqüências do alelo 1 de D4RAT59 ao longo das cinco gerações de seleção daS
linhagens Floripa H e Floripa L.
20
1. Introdução
1.1. Emoção e emocionalidade
Segundo Silveira Bueno (1965, p. 1498), no Grande Dicionário Etimológico
Prosódico da Língua Portuguêsa, o termo “emoção” (substantivo feminino) refere-se à
impressão produzida no ânimo, enquanto “emocionalidade” (derivação do adjetivo
emocional) é a qualidade do que pode ser emocionado. No campo científico, no entanto,
Calvin Hall (1934), no seu estudo inicial com experimentações comportamentais em
ratos, já havia definido que o termo emocionalidade não abrange todo o termo emoção.
Segundo ele, emocionalidade seria definida como um estado de natureza emocional,
acompanhada de alterações fisiológicas e bioquímicas que alteram a homeostase,
associadas ou resultantes da estimulação emocional, podendo ser observada tanto em
humanos quanto em outros animais. O termo emocionalidade, que pode ser considerado
como uma reação emocional ao estresse (Eley; Plomim, 1997), vem sendo utilizado na
psicologia experimental desde Calvin Hall, e normalmente se refere a estados
psicológicos e fisiológicos relacionados ao medo e à ansiedade.
1.2. Ansiedade
A ansiedade é um fenômeno emocional comum em humanos (Clément et al.,
2002). Em sua forma patológica, pode afetar quase um terço da população, em algum
período durante a vida (Anagnostaras et al., 1999; Finn et al., 2003; Gross; Hen, 2004).
É um estado comportamental que envolve aumento da vigília e da reatividade
comportamental e esquiva de situações aversivas. Além disso, envolve alterações
fisiológicas que resultam no desequilíbrio homeostático do organismo (p.ex.: aumento
da atividade do sistema nervoso autônomo simpático, taquicardia e sudorese) frente a
condições ambientais aversivas (Lazarus, 1993; Ramos; Mormède, 1998; Belzung;
21
Griebel, 2001; Blanchard et al., 2001; Gross; Hen, 2004). É, desta forma, considerada
como a antecipação emocional a uma situação aversiva, difícil de prever ou controlar,
cuja intensidade e natureza da resposta dependem das características de cada indivíduo.
Trabalhos realizados na última década mostram que alguns indivíduos apresentam
uma predisposição genética a certos tipos de reações emocionais, que combinada com
eventos estressantes, pode promover o desenvolvimento de psicopatologias específicas
(Plomim et al., 1994; Eley; Plomim, 1997). Ou seja, a reação emocional ao estresse tem
sido proposta como um componente importante e um fator desencadeante de alguns
transtornos psiquiátricos, como a ansiedade e depressão (Lazarus, 1993; Plomin et al.,
1994).
1.3. Modelos Animais de Ansiedade
Embora os transtornos de ansiedade sejam descritos em humanos, respostas
fisiológicas e comportamentais semelhantes à ansiedade humana não patológica têm
sido encontradas em diversas espécies animais e parecem ser parte de um mecanismo
universal utilizado pelos organismos na adaptação ao ambiente (Gross; Hen, 2004).
Estima-se que aproximadamente de 20 a 30% da variabilidade para traços relacionados
à ansiedade possa ser explicada por fatores genéticos, sendo o restante resultado da
influência ambiental (Kendler, 1995). Para o estudo destas respostas comportamentais,
são desenvolvidos experimentos em laboratório com ambiente controlado, onde se
procura minimizar a influência de fatores ambientais que possam interferir no fenótipo
(Crabbe, 1999; Izídio et al., 2005).
Modelos animais são preparações experimentais envolvendo diferentes espécies
não humanas, com o objetivo de estudar fenômenos humanos. Para que seja validado
como um modelo animal, é necessário que haja correspondência de estrutura do órgão
22
ou sistema envolvido (isomorfismo) com o fenômeno em humanos, assim como deve
haver validade preditiva (correspondência de sensibilidade farmacológica), e a
similaridade dos mecanismos neurobiológicos envolvidos (Treit, 1985; Rodgers et al.,
1997). Outro fator importante, no caso de modelos genéticos, é que a espécie candidata
a modelo animal deve apresentar um ciclo de vida rápido, que permita a produção de
várias gerações em um período curto de tempo, assim como deve ter uma alta
fecundidade e alta taxa de sobrevivência (Lassale, 2007).
Com a finalidade de se investigar a ansiedade ou a emocionalidade, são
desenvolvidos modelos comportamentais em várias espécies animais, entre elas os
drosofilídeos (Belay; Sokolowski, 2007), nematódeos (Jansen; Ségalat, 2007) e roedores
(Hall, 1934; Broadhurst, 1975; Porsolt, 1978; Crawley et al., 1981; Treit; Fundytus,
1989; Trullas; Skolnick, 1993; Castanon et al., 1995; Courvoisier et al., 1996; Rex et
al., 1996; Ramos et al., 1997/1998; Rodgers et al., 1997; Crabbe, 1999; Lassale, 2007).
Apresentando uma grande correspondência genética de estruturas e de respostas
comportamentais (Broadhurst, 1975; Plomin, 1991; Fujita et al., 1994; Ramos;
Mormède, 1998/2007, Ramos et al, 2003; Ramos; Mormède, 2007), ratos e
camundongos são uma importante ferramenta para o estudo de transtornos psiquiátricos
e para a investigação das bases moleculares envolvidas nestes transtornos (Castanon et
al., 1995; Flint, 2003; Hinojosa et al., 2006; Willis-Owen; Flint, 2006). Variáveis
comportamentais não condicionadas, como a resposta de um organismo à exposição
forçada a estímulos aversivos ou à ambientes novos ainda não explorados, são
amplamente usados em testes/paradigmas comportamentais desencadeadores de estresse
em roedores (Hall, 1934; Montgomery, 1955; Treit; Fundytus, 1989; Rodgers et al.,
1997). Estes estudos experimentais constituem uma importante ferramenta para a
identificação de traços de emocionalidade em animais não humanos (Pellow et al.,
23
1985; Blanchard; Blanchard, 1990; Cruz et al., 1994; Angrini et al., 1998). Exemplos
dos testes comportamentais utilizados para se investigar traços de ansiedade e também
utilizados para validação de drogas ansiolíticas (p.ex.: benzodiazepínicos) e
ansiogênicas (p.ex.: naltrexona e pentilenotetrazol) (Pelow et al., 1985; Treit, 1985;
Cruz et al., 1994; Nazar et al., 1997; Ramos et al., 1997), são o campo aberto (CA)
(Hall, 1934; Angrini et al., 1998; Nazar et al., 1997), o labirinto em cruz elevado (LCE)
(Montgomery, 1955; Pellow et al., 1985), e a caixa branca e preta (CBP) (Crawley et
al., 1981).
O CA é um dos testes mais utilizados na pesquisa comportamental desde que
Calvin Hall (1934; 1936), publicou seus trabalhos sobre emocionalidade em ratos. Um
grande número de estudos utilizando o teste do CA tem investigado a influência de
manipulações ambientais e fatores genéticos na emocionalidade em roedores (Ramos et
al., 1997/1998/1999; Ramos; Mormède, 1998). O LCE, desenvolvido por Montgomery
(1955), é também um paradigma muito utilizado para testes de ansiedade em roedores,
assim como a CBP, descrita por Crawley (1981) (Ramos et al., 1997; Henniger et al.,
2000). O CA é uma arena grande e nova para o animal, tendo uma área central
desprotegida e uma área periférica próxima às paredes. Já o teste do LCE apresenta dois
braços abertos também desprotegidos de paredes laterais. Estas regiões são consideradas
aversivas a roedores, que preferem espaços protegidos, familiares, pouco iluminados
(Trullas; Skolnick, 1993; Flint, 2003) e próximos a paredes laterais, onde o animal pode
encostar as vibrissas, o que chamamos de comportamento tigmotáxico (Treit; Fundytus,
1989). Assim, roedores tendem a se esquivar destas regiões nos testes comportamentais,
preferindo localizar-se na periferia, ou nos braços fechados (no caso do LCE), perto dos
muros laterais. Por estes motivos, a atividade locomotora nas áreas aversivas ao animal
pode ser considerada uma medida de ansiedade experimental (Angrini et al., 1998;
24
Ramos et al., 1999) ou uma medida de medo/emocionalidade (Treit; Fundytus, 1989,
Ramos; Mormède, 1998). Variáveis como o tempo e o número de entradas nas regiões
aversivas dos paradigmas experimentais, são utilizadas como medidas de
ansiedade/emocionalidade em modelos animais (Hall, 1934; Hall, 1936; Montgomery,
1955).
Com o intuito de se investigar as bases neurobiológicas e genéticas de traços
psicológicos, podemos utilizar diferentes estratégias, sendo uma delas a análise de
linhagens isogênicas de roedores que respondam aos mesmos estímulos de maneira
contrastante (Ramos; Mormède, 1998; Crabbe, 1999). Apartir de um estudo com seis
linhagens isogênicas de ratos, Ramos et al. (1997) propuseram um novo modelo
genético animal de ansiedade, composto de duas linhagens de ratos, LEW (Lewis) e
SHR (Spontaneously Hypertensive Rat), que foram escolhidas por diferirem em
comportamentos relacionados ao medo/emocionalidade e não na atividade locomotora
total. Como resultado, observou-se que a linhagem LEW apresenta menor locomoção
nas áreas aversivas nos testes CA, LCE e CBP, quando comparada à linhagem SHR
(Ramos et al., 1997/1999/2002). A descoberta deste modelo genético possibilitou a
busca por regiões genômicas envolvidas nos comportamentos relacionados ao
medo/emocionalidade (Ramos et al., 1999).
1.4. Locus para traços quantitativos (QTL) e comportamento
A maioria das variações individuais em características comportamentais é de
natureza quantitativa, ou seja, é a herança poligênica sob influência do ambiente que
resulta em um determinado comportamento que varia em intensidade na expressão do
fenótipo. As regiões cromossômicas que contém variantes alélicas (genes polimórficos),
que contribuem com pequeno efeito para um fenótipo quantitativo são denominadas de
25
loci para traços quantitativos (QTL). O principal desafio da genética quantitativa é saber
quais loci e quais alelos contribuem para a variação quantitativa comportamental (Turri
et al., 2001; Flint, 2003).
O mapeamento de QTLs permite a identificação e localização de regiões
genômicas discretas que afetam comportamentos relacionados à emocionalidade
(Brodkin; Nestler, 1998; Ramos et al., 1999). Este tipo de estratégia envolve o estudo
genômico e pode fornecer informações sobre associações genéticas entre diversas
características fenotípicas complexas, assim como possibilitam a avaliação dos
mecanismos moleculares moduladores das características em estudo (Ramos; Mormède,
1998). Uma maneira de se identificar QTLs envolve o cruzamento entre indivíduos de
duas linhagens parentais isogênicas contrastantes para uma característica fenotípica,
originando animais F1 totalmente híbridos. Estes animais são novamente intercruzados
produzindo animais F2 segregantes, que serão usados em uma análise de varredura do
genoma, correlacionando o fenótipo estudado com variações genotípicas, através da
utilização de marcadores moleculares de DNA espalhados por todos os cromossomos
(Ramos et al., 1999; Flint, 2003).
Outra ferramenta utilizada para o estudo e a confirmação de QTLs previamente
relacionados a traços comportamentais é a seleção artificial divergente de linhagens de
roedores a partir de uma geração heterogênea e polimórfica. Para isto, utilizam-se
populações parentais que apresentam polimorfismos para marcadores genéticos que
serão posteriormente estudados, buscando-se estabelecer correlações entre os
marcadores e as variações fenotípicas das linhagens selecionadas (Flint et al., 1995;
Buck et al., 1997; Ramos et al., 1999). Trabalhos posteriores ao mapeamento de QTLs
podem ser utilizados para testar a influência destes loci em diferentes populações da
mesma espécie. A partir da localização de QTLs pode-se fazer o mapeamento de genes
26
para traços quantitativos (QTGs) que podem ser localizados por homologia em
cromossomos humanos (Disponível em RGD – Rat Genome Database).
As primeiras regiões cromossômicas (loci) influenciando respostas emocionais
foram identificadas em camundongos por Flint et al (1995) e em ratos por Ramos et al.
(1999). Na literatura, já existem diversas regiões descritas para várias medidas
comportamentais de emocionalidade, de atividade locomotora, de abuso, preferência ou
sensibilidade a drogas, ou ainda para algumas características fisiológicas em diferentes
linhagens de roedores (Flint, 2003; Willis-Owen; Flint, 2006).
1.5. Ofil1 e Ofil2, dois loci associados à emocionalidade
Quando as linhagens de ratos LEW e SHR são comparadas em testes
comportamentais, a primeira apresenta menor aproximação e maior esquiva das áreas
aversivas dos diferentes paradigmas utilizados. Por este motivo, a linhagem SHR é
considerada “menos ansiosa” que a linhagem LEW. Considera-se este par de linhagens
um bom modelo animal experimental para o estudo da genética da ansiedade (Ramos et
al., 1998). Ramos et al. (1999), cruzando entre si uma geração híbrida F1, proveniente
de um intercruzamento inicial das linhagens isogênicas de ratos LEW e SHR,
identificaram e mapearam, numa geração F2, pela primeira vez em ratos, dois QTLs
localizados no cromossomo 4 e 7, com alto nível de significância. Ao QTL no
cromossomo 4 foi dado o nome de Ofil1 (para Open field inner locomotion 1). O
segundo QTL, localizado no cromossomo 7, foi chamado de Ofil2 (para Open field
inner locomotion 2). Ele foi identificado como tendo efeito semelhante, porém menos
marcante, que Ofil1 (Ramos et al., 1999). Os dois QTLs tinham forte influência na
locomoção central no teste do CA, aparato previamente descrito por Calvin Hall (1934;
27
1936) para quantificar emocionalidade em roedores, através de medidas de locomoção e
defecação.
A existência de Ofil1 no cromossomo 4 foi corroborada por outro estudo
posterior envolvendo as mesmas linhagens (Mormède et al., 2002). Um outro trabalho
recente, realizado por Vendruscolo et al. (2006), demonstrou que nesta região genômica
devem existir genes contribuindo para traços não só relacionados à ansiedade, mas
também relacionados ao consumo de etanol. Próximo ao locus do cromossomo 4, outros
dois QTL já foram mapeados. O primeiro deles influenciava o consumo de etanol em
ratos e foi encontrado em um estudo com as linhagens Alcohol-Prefering (P) e Alcohol-
Nonprefering (NP) (Bice et al., 1998; Carr et al., 1998). O segundo influenciava o
consumo de etanol e de sacarina e foi encontrado em um estudo com as linhagens de
ratos High-Ethanol Preffering Line (HEP) e Wistar-Kyoto (WKY) (Terenina-Rigaldie
et al., 2003a).
Além destes, outros estudos sugeriram que o locus identificado por Terenina-
Rigaldie et al. (2003a) tinha um efeito pleiotrópico (quando a variação devida a um
gene se traduz em diferentes efeitos fenotípicos), atuando não somente na preferência ao
etanol, mas também em medidas de emocionalidade, como a locomoção central no CA
(Terenina-Rigaldie et al., 2003b). É possível, portanto, que nesta região do genoma do
rato no cromossomo 4, exista um ou mais genes com efeito simultâneo sobre a
reatividade emocional e a preferência pelo etanol, o que a tornaria extremamente
interessante no estudo da genética da comorbidade clínica freqüentemente observada
entre ansiedade e alcoolismo.
28
1.6. Linhagens de roedores selecionadas para comportamentos
Experimentos realizados em laboratório podem manipular a reprodução entre
indivíduos que apresentam o extremo de um fenótipo, acima ou abaixo da média
(Bignami, 1965; DeFries et al., 1978; Futuyma, 1997 p. 96; Ramos et al., 2003;
Koundaurova et al., 2006; Leppännen et al., 2006). Quando indivíduos específicos de
uma população heterogênea, que apresentam um determinado fenótipo comportamental
em comum são acasalados entre si, sua prole tende a apresentar fenótipo mais parecido
com o dos reprodutores selecionados do que com a população em geral se a variação
selecionada for hereditária (Crabbe, 1999; Lassale, 2007). Linhagens de roedores são
usualmente selecionadas em direções opostas (Plomim et al., 1994; Crabbe, 1999),
dando origem a linhagens que expressam um determinado fenótipo de forma divergente
(Bignami, 1965; DeFries et al., 1978; Ramos et al., 2003; Koundaurova et al., 2006;
Leppännen et al., 2006). Manipulações deste gênero são denominadas experimentos de
seleção artificial bidirecional (Falconer, 1987; Futuyma, 1997, p. 200 – 205) e são
desenvolvidos utilizando diferentes critérios e medidas comportamentais em paradigmas
experimentais (DeFries et al., 1978; Ramos et al., 2003). Experimentos envolvendo
seleção de fenótipos constituem uma importante ferramenta para análises
comportamentais e o estudo comparativo de linhagens selecionadas artificialmente para
traços de emocionalidade pode representar uma ferramenta útil para o estudo de
mecanismos genéticos envolvidos nos transtornos relacionados à ansiedade (Trullas;
Skolnick, 1993; Ramos et al., 1997). O resultado esperado do acasalamento seletivo é o
aumento da freqüência dos alelos que contribuem positivamente para o traço fenotípico
selecionado (Falconer, 1987; Futuyma, 1997, p. 220 - 223; Koundaurova et al., 2006).
Exemplos de pares de linhagens de roedores selecionadas bidirecionalmente são:
29
* Ratos Maudsley Reactive (MR) e Maudsley Nonreactive (MNR) (Broadhurst, 1975),
selecionados para extremos de defecação no teste do CA, medida descrita por Calvin
Hall (1934).
* Camundongos HOFT e LOFT (Leppännen et al., 2006), selecionados para medidas
tigmotáxicas no teste do campo aberto.
* Ratos High Anxiety-related Behaviour (HAB) e Low Anxiety-related Behaviour
(LAB) (Landgraf; Wigger, 2002), selecionados para comportamentos relacionados à
ansiedade no teste do LCE (Henninger et al., 2000; Landgraf; Wigger, 2002).
* Ratos Roman High Avoidance (RHA) e Roman Low Avoidance (RLA) (Castanon et
al., 1995), selecionados para extremos de esquiva no teste “Shuttle-Box”.
* Ratos Sardinian Alcohol-Preferring (sP) e Sardinian Alcohol-Nonpreferring (sNP)
(Colombo et al., 1995), selecionados para extremos de consumo de etanol.
Análises genéticas destes modelos animais são importantes para o estudo de
doenças complexas humanas (Jacob; Kwitek, 2002) e ajudam a dissecar traços
psicológicos complexos em componentes mais simples (Ramos; Mormède, 1998).
Estudos quantitativos de seleção artificial permitem uma avaliação de quanto dos traços
estudados é herdado e quanto é influenciado por fatores ambientais (DeFries et al.,
1978; Buck et al., 1997; Plomin et al., 1997; Caspi; Moffitt, 2006), permitindo a
identificação de bases moleculares responsáveis pela variabilidade nas respostas
emocionais (Ramos; Mormède, 1998/2006; Crabbe, 1999; Belzung; Griebel, 2001;
Lassale, 2007).
30
1.7. Floripa H e Floripa L, duas linhagens de ratos selecionadas para a
emocionalidade
A seleção das linhagens de ratos (Rattus norvegicus) Floripa H e Floripa L
iniciou-se em 1999 no Laboratório de Genética do Comportamento na Universidade
Federal de Santa Catarina, com o intuito de verificar, entre outras coisas, a influência
dos QTLs Ofil1 e Ofil2 em comportamentos relacionados à ansiedade em linhagens
oriundas de uma população heterogênea de ratos diferente daquela na qual estes QTLs
foram identificados. Iniciou-se com o intercruzamento entre ratos das linhagens Wistar
e Hooded, ambas linhagens não isogênicas. Cinco fêmeas resultantes deste cruzamento
(F1) foram acasaladas com cinco machos LEW (linhagem isogênica), originando uma
população da qual somente os animais albinos foram intercruzados. Sessenta ratos
albinos resultantes deste último cruzamento formaram uma população geneticamente
heterogênea denominada Floripa S0.
Apartir desta população inicial, foram selecionados bidirecionalmente, para
extremos de locomoção no centro do CA (o mesmo fenótipo afetado pelos QTLs
descritos em 1999), cinco ratos machos e cinco fêmeas com maiores índices para o
comportamento em questão e mais cinco machos e cinco fêmeas com os mais baixos
índices para o mesmo fenótipo. Os casais com maiores índices para locomoção central
no teste do CA geraram a linhagem de ratos Floripa H. Os casais com menores índices
para locomoção central no teste do CA geram a linhagem Floripa L. A cada geração, os
ratos das duas linhagens eram testados no aparato do CA. Os cinco machos e cinco
fêmeas da linhagem H com mais altos níveis de locomoção na área central e aversiva do
CA eram selecionados e intercruzados, produzindo a geração seguinte de ratos Floripa
H. A mesma prática era adotada para a linhagem Floripa L (Ramos et al., 2003).
31
Como resultado desta seleção, diferenças significativas foram observadas não só
na medida selecionada (Figura 1), mas também em outros testes comportamentais de
ansiedade, o LCE e a CBP, além de um modelo de depressão, o teste do nado forçado
(TNF). Nos três primeiros modelos os animais da linhagem H visitaram mais as áreas
aversivas do que os animais da linhagem L, o que sugere que a seleção foi efetiva para o
fenótipo. No TNF, os ratos da linhagem L permaneceram mais tempo imóveis do que os
da linhagem H, sendo a imobilidade neste teste uma medida relacionada à depressão.
Este modelo animal sofreu algumas limitações ao longo do processo seletivo,
como a baixa fertilidade, principalmente na linhagem Floripa H em gerações avançadas,
provavelmente fruto de alelos recessivos e deletérios, fixados na população por
endocruzamento. O cruzamento entre irmãos foi evitado nas gerações de seleção
utilizadas no presente projeto.
Figura 1. Média da locomoção central no teste do CA para machos e fêmeas das
linhagens Floripa H e Floripa L durante as cinco primeiras gerações (S0 a S4). Os
pontos em ambos os gráficos significam a média da locomoção central dos animais
selecionados em cada geração. ** Representa diferenças significativas (p < 0,01) entre
as linhagens.
Figura extraída de Ramos et al. (2003).
32
Em vista do exposto, fica clara a necessidade de se investigar mais
profundamente as promissoras regiões do genoma do rato nos cromossomos 4 e 7,
através de diferentes estratégias experimentais. A estratégia na qual baseia-se o presente
trabalho é a utilização das linhagens Floripa H e Floripa L, selecionadas para extremos
de atividade locomotora na área central do CA, como ferramenta em busca da
confirmação da importância dos QTLs para emocionalidade (Ofil1 e Ofil2) em
diferentes populações. Para isto, utilizaremos dados genotípicos das cinco primeiras
gerações oriundas da seleção genética bidirecional realizada com os ratos Floripa H e L
(Ramos et al., 2003).
Minha hipótese é de que as regiões cromossômicas denominadas Ofil1 e Ofil2
contém genes ainda não identificados capazes de influenciar as variações fenotípicas no
teste do CA na população heterogênea de ratos (S0) que deu origem às linhagens
Floripa H e Floripa L. Portanto, eu espero que o processo seletivo, realizado em
laboratório, baseado em um comportamento relacionado à ansiedade, tenha ocasionado
divergência nas freqüências alélicas de marcadores polimórficos situados próximos a
Ofil1 e Ofil2 entre estas duas linhagens. A futura identificação e clonagem dos genes
envolvidos virá contribuir para a compreensão das bases moleculares das reações
emocionais.
33
2. Objetivos
2.1. Gerais: O presente trabalho pretende confirmar experimentalmente a
importância dos QTLs Ofil1 e Ofil2, para o estudo da emocionalidade. Neste sentido,
pretendemos avaliar a possível correlação entre estes loci e um comportamento
relacionado à ansiedade/emocionalidade em um modelo animal desenvolvido em nosso
laboratório, as linhagens de ratos Floripa H e L.
2.2. Específicos:
I. Identificar os diferentes alelos de dois marcadores moleculares (D4RAT59 e
D4MGH27) mapeados no cromossomo 4, próximos ao locus Ofil1 e dois outros
marcadores (D7RAT35 e D7MGH11) mapeados no cromossomo 7, próximo ao locus
Ofil2, na geração de ratos S0 que serviu de origem para as atuais linhagens Floripa H e
L. Os marcadores no cromossomo 4 não apresentam segregação independente e estão a
13,4 centiMorgans (cM) de distância um do outro. Os marcadores no cromossomo 7
também estão ligados entre si, porém a uma distância de 6,2 cM (Ramos et al., 1999;
RGD – Rat Genome Database).
II. Identificar os alelos do mesmo grupo de marcadores nas quatro gerações
subseqüentes (S1 – S4) das linhagens Floripa H e Floripa L, através da análise
genotípica de todos os animais, procurando relacionar a divergência fenotípica com a
variação das freqüências alélicas a partir da geração inicial S0 durante o processo de
seleção, o que corroborará ou não, a influência dos QTLs sobre o fenótipo destas
linhagens.
34
3. Materiais e Métodos
3.1. Floripa H e Floripa L
O processo seletivo das linhagens de ratos Floripa H e Floripa L iniciou-se com
o intercruzamento entre ratos das linhagens Wistar e Hooded, que produziu a geração
F1. Cinco fêmeas da F1 foram acasaladas com cinco machos LEW (linhagem isogênica)
e originaram a geração inicial de seleção (S0) com um total de sessenta animais. Apartir
desta geração inicial foram selecionados de forma bidirecional, para extremos de
locomoção no centro do CA, cinco machos e cinco fêmeas com maiores índices para o
comportamento em questão e mais cinco machos e cinco fêmeas com os mais baixos
índices para o mesmo fenótipo. Os casais com maiores índices para locomoção central
no teste do CA produziram a geração S1 de ratos Floripa H. Os casais com menores
índices deram origem à geração S1 dos Floripa L. A cada geração, o mesmo
procedimento seletivo, para o cruzamento de animais com extremos do fenótipo
analisado, foi aplicado a cada geração produzida até a geração S4 resultando nas
linhagens Floripa H e L (Ramos et al., 2003).
3.2. Extração de DNA
Foi utilizado para extração de DNA material coletado entre os anos de 2000 e
2001, do fígado e baço de 223 ratos, congelado a -20ºC no Laboratório de Genética do
Comportamento da UFSC. Os tecidos estavam acondicionados separadamente em tubos
eppendorf de 1,5 mL e eram provenientes dos animais das primeiras cinco gerações de
seleção de ratos das linhagens Floripa H e Floripa L (S0 a S4). O DNA foi extraído
utilizando-se o kit e o protocolo DNAzol da empresa Invitrogen Life Technologies. O
kit era composto pela solução reagente DNAzol e a solução tampão HEPES a 1M.
Inicialmente o tecido era picado e então o reagente DNAzol era adicionado a cada
35
amostra a ser macerada e centrifugada. Após a centrifugação o material genômico era
separado e lavado com álcool a -4ºC por até quatro vezes, passando por sucessivas
centrifugações até que se obtivesse uma concentração mínima de 50 ng/uL de DNA,
tamponada com a solução HEPES a 0,1 M na intenção de equilibrar o pH da amostra
em 8.
3.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para amplificação das regiões genômicas específicas a serem estudas, foi utilizado
o aparelho Px2 Thermal Cycler da Thermo Electron Corporation, com programas
específicos otimizados para cada marcador do tipo microssatélite. Para cada reação de
PCR era utilizada uma microplaca de acrílico contendo 96 poços com capacidade para
0,2 mL de amostra distribuídos em 8 linhas e 12 colunas. Após a aplicação das amostras
a microplaca era vedada com adesivo resistente a altas temperaturas, evitando a
evaporação do produto de PCR. O processo de PCR envolve três etapas: primeiro a
desnaturação do DNA original (separação das fitas em dupla hélice); em seguida o
anelamento dos primers para, em fim, com o auxílio da enzima Taq polimerase,
promover a formação das novas cadeias de DNA dos marcadores moleculares
específicos que servirão de base para a produção das novas cadeias no ciclo seguinte.
Para todas as reações de PCR foi utilizado por amostra um volume final de 20
µL que continha 5 µL do DNA genômico previamente extraído e mantido à 50 ng/uL, 5
µL da solução de oligonucleotídeos (primers previamente preparados a partir das
soluções forward e reverse para cada marcador específico) e 10 µL de uma solução
PCR 2x (Biossystems) contendo 0,97 mL de água Milli-Q autoclavada, 250 µL de
solução tampão PCR 2x (Biossystems), 75 µL de Cloreto de Magnésio a 50 mM
(Biossystems) e 6,55 µL de solução contendo os desoxirribonucleosídeos trifosfatados a
36
25 mM (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) (Amresco Inc.). À solução tampão PCR 2x
previamente preparada, foi adicionado por último uma alíquota de 0,076 µL de Taq
polimerase (Biossystems) correspondente a 0,38 uTaq por amostra.
Para todas as reações de PCR foi utilizado um programa básico onde se variou a
temperatura de anelamento para cada marcador. O programa básico com temperaturas e
o número de ciclos foi o seguinte: (i) um ciclo a 96ºC por 5 minutos; (ii) 35 ciclos a
92ºC por 30 segundos, 55,8ºC-61,5ºC (dependendo do microssatélite) por um minuto e
72ºC por 30 segundos; (iii) um ciclo a 72ºC por dois minutos. As temperaturas de
anelamento, estabelecidas através de otimização do programa básico, variaram de
acordo com o microssatélite utilizado e foram as seguintes: para o marcador D4RAT59
usou-se a temperatura de 61,5 ºC e para o marcador D4MGH27 usou-se a temperatura
de 55,8 ºC. Para os demais marcadores utilizou-se a temperatura padrão de anelamento
de 58 ºC.
Para a síntese das soluções contendo os primers para cada marcador, foi
utilizado: 12 µL de yellow tartrazine a 10 mg/mL e, 1268 µL de água Milli-Q
autoclavada, 20 µL da solução forward e 20 µL da solução reverse específicas por
marcador, cada primer a 66 µM. Os marcadores utilizados no cromossomo 4
(D4RAT59 e D4MGH27) flanqueiam o pico de Ofil1, enquanto os marcadores
utilizados no cromossomo 7 (D7RAT35 e D7MGH11) flanqueiam o pico de Ofil2.
Todos os marcadores utilizados no presente trabalho foram adquiridos da empresa
WMED – World Medical Ltda. A seqüência de nucleotídeos presentes nas soluções
forward e reverse, para cada marcador, encontram-se abaixo.
D4RAT59
Solução forward: GCGGAATGATAGTTACTACGGC
Solução reverse: GCAGTGTGTTTGGGGTAGCT
37
D4MGH27
Solução forward: TCCTTCACATACATGTGCATACC
Solução reverse: TGAGAAGGGCTGTCAGTGG
D7MGH11
Solução forward: GGAGCATCCAGATAACCCAA
Solução reverse: CTGGACAACACAGTAAGATTTTGC
D7RAT35
Solução forward: TCTTCCCACCAATCCTTTTG
Solução reverse: CCCTATGTTCATTCAAGTAGCCC
D7MGH11
Solução forward: GGAGCATCCAGATAACCCAA
Solução reverse: CTGGACAACACAGTAAGATTTTGC
3.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%
Dois tamanhos de placas de vidro foram usadas para a corrida eletroforética
vertical. Uma pequena de 30 cm por 20 cm e uma grande de 50 cm por 40 cm. O pente
usado com as placas pequena continha 18 poços distribuídos eqüidistantes. O pente
usado com as placas grandes continha 78 poços também distribuídos de forma
eqüidistante. Também para esta técnica eletroforética utilizou-se um controle negativo
(produto de PCR sem material genômico) e um controle positivo (produto de PCR
conhecido das linhagens isogênicas LEW e SHR). Em gel de poliacrilamida foram
genotipados inicialmente todos os animais da geração S0 para todos os marcadores
utilizados, visto que esta metodologia permite uma melhor precisão na observação de
polimorfismos muito pequenos, de até 2 pares de base (pb). Como as linhagens que
deram origem aos animais da S0 ainda não haviam sido comparados a níveis
38
genotípicos, não se sabia qual seria a diferença em tamanho molecular entre os alelos
para cada marcador investigado. Utilizou-se como metodologia para as gerações
posteriores de ambas as linhagens, a genotipagem através da eletroforese em gel de
poliacrilamida a 8% para os marcadores que apresentaram polimorfismos menores ou
iguais a 4 pb e para os demais marcadores a genotipagem da S1 a S4 foram realizadas
através de eletroforese em gel de poliacrilamida 8%.
Para o preparo do gel de poliacrilamida foi produzida inicialmente uma solução
“mãe” 19:1. Esta solução continha 38 g de acrilamida, 2 g de bisacrilamida mais o
suficiente de água para obter uma solução final de 100 mL. A solução mãe era então
filtrada utilizando-se papel filtro e acondicionada em recipiente de vidro com tampa a
uma temperatura de aproximados -4 ºC. Apartir da solução mãe preparava-se uma
solução de poliacrilamida contendo uréia, água destilada e tampão TBE 10x. A solução
final de gel de poliacrilamida tinha concentração igual a 8%. Após o preparo da solução
para o gel de poliacrilamida a 8% (sempre na hora do uso a partir da solução “mãe”
19:1, já pronta) acrescentava-se uma alíquota dos catalisadores perssulfato de amônio e
TEMED. Então a solução era depositada com o uso de seringa (20 mL) sem agulha no
sanduíche de placas (espessura de 0,5 cm para as placas pequenas e 0,2 cm para as
placas grandes). A corrida era feita por quatro a seis horas, variando de acordo com o
tamanho das placas de vidro, a 2000 V, 50 mA e 300 W. Após a corrida eletroforética o
DNA passava por um processo de fixação em solução de água destilada contendo ácido
acético por 15 min, e a seguir pelo processo de revelação das bandas através da
coloração com solução de nitrato de prata e formaldeído por 10 min.
39
3.5. Eletroforese em gel de agarose a 3%
A cuba para eletroforese em gel de agarose horizontal media 20 x 25 cm e
continha dois pentes, com 21 poços cada, distribuídos eqüidistantemente. Para
visualização do alelos através da eletroforese em gel de agarose a 3% foram adicionados
12,5 µL de brometo de etídeo a 250 mL de solução de agarose ainda líquida. Após o
resfriamento a 55ºC o gel era inserido na cuba, para que depois da solidificação
permitisse a aplicação do produto de PCR nos poços individuais. A corrida
eletroforética durava de 60 a 90 minutos, variando de acordo com o marcador utilizado,
a 250 V, 140 mA e 150 W. Após a corrida as bandas eram visualizadas no
transiluminador através de raios ultravioleta. Utilizou-se um controle negativo (produto
de PCR sem material genômico) e um controle positivo (produto de PCR conhecido das
linhagens isogênicas LEW e SHR). Com esta técnica foram genotipados os animais das
linhagens Floripa H e L das gerações S1 a S4 para todos os marcadores exceto
D4RAT59, que apresentou polimorfismo alélico menor que 4 pb.
3.6. Análises estatísticas
3.6.1. Variação nas freqüências alélicas da S0 a S4
A variação total da freqüência de cada alelo candidato (alelos 1 para o marcador
D4RAT59, 3 para o marcador D4MGH27, 1 para o marcador D7MGH11 e 2 para o
marcador D7RAT35) por linhagem e marcador da S0 a S4 foi calculada da seguinte
forma: (freqüência do alelo na geração S4 – freqüência do alelo na geração S0) x 100 /
freqüência do alelo na geração S0. Estas análises serviram para verificar se houve ganho
ou perda na freqüência de cada alelo candidato ao longo do processo seletivo em cada
linhagem.
40
3.6.2. Teste para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg
Para todas as gerações de seleção (S0 a S4) foram calculadas, a partir do número
de indivíduos obtidos em cada classe genotípica, as freqüências alélicas e o número
esperado de indivíduos por classe genotípica, de acordo com a hipótese do equilíbrio de
Hardy-Weinberg. A partir dos valores esperados, calculou-se então o qui-quadrado (χ
2
)
para estimar se cada geração estava ou não em equilíbrio. Visto que o número de
animais investigados era bastante pequeno, com 4 graus de liberdade (GL) para
D4RAT59 e 1 GL para os demais marcadores, para evitar possíveis erros estatísticos,
comuns em amostras pequenas, o χ
2
foi calculado utilizando a correção de Yates (∑
[(animais obtidos por classe genotípica – animais esperados por classe genotípica) –
0,5]
2
/ animais esperados por classe genotípica) (disponível em Answers.com –
Correção de Yates; Biometria – Qui Quadrado). Valores significativos de χ
2
indicavam
que a geração em questão não obedecia ao princípio do equilíbrio.
A freqüência de cada alelo (denominada “p”, “q” ou “r”, no caso de haver até três
alelos) era dada pela fórmula: [(número de indivíduos homozigotos x 2) + (número de
indivíduos heterozigotos)] / (número total de indivíduos x 2). A partir disso, os valores
esperados em cada classe genotípica eram calculados da seguinte maneira. No caso dos
marcadores com apenas dois alelos (D4MGH27, D7RAT35 e D7MGH11), o número
esperado de indivíduos homozigotos era calculado através de p
2
e q
2
multiplicados pelo
total de indivíduos daquela geração; enquanto que o número esperado de indivíduos
heterozigotos era dado por 2pq x total de indivíduos. No caso de D4Rat59, que continha
três alelos diferentes (com freqüências “p”, “q” e “r”), o número esperado de indivíduos
para cada classe genótipica era calculado através da fórmula p
2
+ 2pq + 2pr + q
2
+ 2qr +
r
2
, multiplicando-se sempre pelo número total de indivíduos em cada geração.
41
3.6.3. Teste do χ
2
de contingência para todas as gerações de seleção
O cálculo do χ
2
de contingência comparou os números de animais com cada
genótipo nas gerações S0 até S4 para cada um dos marcadores utilizados, D4RAT59,
D4MGH27, D7RAT35 e D7MGH11. Isto nos permitiu avaliar se houve alterações nas
proporções genotípicas ao longo do processo seletivo. Caso tenha ocorrido alteração
significativa (p < 0,05) durante o processo de seleção, pode-se sugerir que houve
influência de deriva genética aleatória ou da seleção artificial (Falconer, 1987). Estas
análises foram feitas separadamente para cada uma das linhagens.
Para encontrar o χ
2
para o marcador D4RAT59, utilizou-se uma Tabela de 5
linhas x 6 colunas com GL = 20. Para os demais marcadores, utilizou-se Tabelas de 5
linhas x 3 colunas com GL = 8. Para todos os marcadores utilizados, o cálculo dos
valores esperados de cada geração usou a seguinte fórmula: (total da linha x total da
coluna) / total geral. Cada linha corresponsponde a uma geração e cada coluna a um
genótipo.
3.6.4.Análises de correlação e regressão
Foram feitas análises de regressão para a freqüência de cada alelo candidato em
cada uma das linhagens durante as cinco gerações de seleção, para confirmar se houve
variação significativa e consistente na freqüência alélica ao longo do tempo. Também
foram realizadas análises de correlação entre a freqüência de cada um dos alelos
candidatos e a média de locomoção central no CA nas linhagens de ratos Floripa H e L
ao longo das cinco gerações de seleção. Primeiramente, encontrou-se a freqüência de
cada alelo durante o processo seletivo (gerações S0 a S4) por linhagem. Depois foi
calculada, para cada linhagem, a correlação de Pearson (r) entre a freqüência do alelo
42
estudado e a locomoção central no teste do CA por geração de seleção. Os dados
fenotípicos foram obtidos de experimentos realizados no laboratório entre 2000 e 2001.
Considerando que fenótipos comportamentais são fortemente influenciados pelo
ambiente e sabidamente flutuam de experimento para experimento, mesmo mantendo-se
o genótipo constante, nós realizamos uma outra análise de correlação baseada nas
diferenças genotípicas e fenotípicas entre as linhagens Floripa H e L a cada geração.
Com isso, o efeito de flutuações sazonais no comportamento de nossas linhagens seria
minimizado. Para se encontrar o delta (∆) da freqüência alélica entre as duas linhagens a
cada geração, o valor encontrado para as freqüências alélicas na linhagem H era
subtraído do valor encontrado para as freqüências alélicas na linhagem L. Desta forma,
foi encontrado o valor referente à variação nas freqüências dos alelos entre as duas
linhagens selecionadas. Para o cálculo do ∆ da média fenotípica entre as linhagens,
subtraiu-se, por geração de seleção, a média da locomoção central no teste do CA na
linhagem Floripa H da média deste comportamento na mesma geração para a linhagem
Floripa L. Por fim fez-se a correlação entre o ∆ da freqüência alélica e o ∆ fenotípico
entre as linhagens ao longo das gerações. Em todas as análises de correlação utilizou-se
o programa Statistica 7.0.
43
4. Resultados
4.1. Tamanho dos alelos
Para cada marcador, os tamanhos dos diversos alelos foram estimados de forma
indireta, através das bandas obtidas em gel de poliacrilamida 8% em comparação com
os tamanhos descritos para os alelos das linhagens que utilizamos como controle, LEW
e SHR, obtidos na base de dados RGD (Rat Genome Database, disponível em
http://rgd.mcw.edu/). Tal estimativa foi feita inicialmente na geração S0, que deu
origem às linhagens Floripa, tendo como controle no mesmo gel os produtos PCR
amplificados a partir de ratos LEW e SHR. Os alelos encontrados em cada marcador
foram denominados de 1 a n, sendo 1 o menor alelo e n o maior, incluindo as linhagens
controle. Exceto pelo marcador D4RAT59, onde encontramos três alelos na geração S0,
todos os outros revelaram apenas dois alelos nesta mesma geração. Desta forma, os
dados referentes aos alelos de cada marcador, na geração S0 bem como nas linhagens
controle, estão descritos na Tabela 1.
44
Tabela 1. Alelos encontrados para cada um dos marcadores utilizados em ratos da
geração S0, que deu origem às linhagens Floripa H e L, e em ratos isogênicos das
linhagens controle LEW e SHR.
Marcador alelo 1 alelo 2 alelo 3 alelo 4
D4Rat59
168 pb
(LEW e S0)
174 pb
(SHR)
+ 174 pb
(S0)
+ 174 pb
(S0)
D4Mgh27 252 pb
(SHR)
+ 252 pb
(S0)
258 pb
(LEW e S0)
D7Rat35
121 pb
(LEW e S0)
+ 121 pb
(S0)
150 pb
(SHR)
D7Mgh11
140 pb
(LEW e S0)
162 pb
(SHR)
+ 162 pb
(S0)
Os alelos de 1 a 4 seguem uma ordem crescente de tamanho. Os tamanhos dos
alelos das linhagens controle LEW e SHR estão especificados em pares de base (pb).
Entre parênteses estão especificadas as populações nas quais cada alelo foi encontrado
no presente estudo. Os alelos encontrados na geração S0 estão marcados em negrito. O
sinal + indica que aquele alelo tem tamanho superior a um determinado número de pares
de base encontrado nas linhagens controle. Todos os marcadores na geração S0 foram
genotipados em gel de poliacrilamida 8%.
Como pode ser visto na Tabela 1, os alelos LEW, como esperado, apareceram na
geração S0 para todos os marcadores, enquanto que os alelos SHR, analisados aqui
apenas como controle de tamanho, não apareceram em nenhum marcador.
4.2.Linhagem Floripa H
4.2.1. Dados de genotipagem para D4RAT59
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os χ
2
para testar
o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador D4RAT59,
para a linhagem Floripa H estão sumarizados na Tabela 2 e na Figura 2. Como pode ser
observado na Figura 2, a freqüência do alelo 1, a partir da geração S0, sofreu um
acréscimo de 50,57% até a S4. Quando feita a análise de regressão da freqüência do
45
alelo 1 ao longo do processo seletivo, obteve-se um resultado significativo (p < 0,05; r
2
= 0,87), indicando aumento da freqüência ao longo do tempo. As gerações S0, S1 e S4
não apresentaram o número de animais esperado de acordo com Hardy-Weinberg,
portanto não se encontravam em equilíbrio (Tabela 2). Quando calculado o χ
2
de
contingência, para verificar se houve variação nas proporções genotípicas ao longo das
gerações de seleção,de S0 a S4, como esperado, o χ
2
foi significativo (GL = 20; χ
2
=
37,88; p < 0,01), indicando que as proporções não são as mesmas entre as gerações.
Tabela 2. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências alélicas e
teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração para o
marcador D4RAT59 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem de ratos
Floripa H.
Geração: gerações de seleção da S0 a S4 da linhagem Floripa H. N: número total de animais na
geração analisada para o marcador D4RAT59. Observado: número de animais encontrados por
classe genotípica por geração de seleção. Esperado: número de animais esperados por Hardy-
Weinberg por classe genotípica e geração de seleção. Genótipos (N): animais por geração que
apresentaram cada um dos seis genótipos possíveis. Freq. alélica: freqüência de cada alelo
encontrado por geração de seleção. χ
2
: qui-quadrado obtido por geração de seleção de acordo
com o esperado por Hardy-Weinberg. GL: graus de liberdade.
* χ
2
significativo (p < 0,05).
Genótipos (N) Freq. alélica
Geração 1/1 1/3 1/4 3/3 3/4 4/4 1 3 4 χ
2
(GL=4)
S0 Obs 16 25 7 2 0 2 0,615 0,279 0,106 10,600*
N = 52 Esp 19,692 17,822 6,749 4,032 3,054 0,578
S1 Obs 6 8 9 2 0 0 0,580 0,240 0,180 8,720
N = 25 Esp 8,410 6,960 5,220 1,440 2,160 0,810
S2 Obs 9 4 3 0 0 0 0,781 0,125 0,094 7,430
N = 16 Esp 9,766 3,125 2,344 0,250 0,375 0,140
S3 Obs 6 3 1 0 0 0 0,800 0,150 0,050 16,420*
N = 10 Esp 6,400 2,400 0,800 0,225 0,150 0,025
S4 Obs 23 3 1 0 0 0 0,926 0,055 0,019 38,050*
N = 27 Esp 23,149 2,778 0,925 0,083 0,056 0,009
46
Linhagem H (D4RAT59)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 1
Alelo 3
Alelo 4
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 2. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D4RAT59, no cromossomo 4.
4.2.2. Dados de genotipagem para D4MGH27
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os χ
2
para testar
o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador D4MGH27
para a linhagem de ratos Floripa H estão sumarizados na Tabela 3 e na Figura 3. Como
pode ser observado na Figura 3, a freqüência do alelo 3, a partir da geração S0, sofreu
um acréscimo de 61,09% até a S4. Quando feita a análise de regressão da freqüência do
alelo 3 ao longo do processo seletivo o resultado obtido foi significativo, assim como
para D4RAT59, (p = 0,05; r
2
= 0,80), indicando um aumento da freqüência ao longo da
seleção. As gerações S2 e S4 não se encontravam em equilíbrio (Tabela 3). O χ
2
de
contingência foi altamente significativo (GL = 8, χ
2
= 34,91 e p < 0,001), assim como
ocorreu para D4RAT59, ambos localizados no cromossomo 4.
47
Tabela 3. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências alélicas e
teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada geração para o
marcador D4MGH27 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da linhagem de ratos
Floripa H.
Genótipos (N) Freq. alélica
Geração 2/2 2/3 3/3 2 3 χ
2
(GL=1)
S0 Observado
8 27 17 0,414 0,586 0,376
N = 52 Esperado
8,891 25,221 17,888
S1 Observado
3 7 15 0,260 0,740 1,450
N = 25 Esperado
1,690 9,620 13,690
S2 Observado
0 2 14 0,063 0,938 5,160*
N = 16 Esperado
0,063 1,875 14,062
S3 Observado
0 2 8 0,100 0,900 3,694
N = 10 Esperado
0,100 1,800 8,100
S4 Observado
0 3 24 0,056 0,944 4,148*
N = 27 Esperado
0,083 2,833 24,084
Geração: gerações de seleção da S0 a S4 da linhagem Floripa H. N: número total de animais na
geração analisada para o marcador D4MGH27. Observado: número de animais encontrados por
classe genotípica por geração de seleção. Esperado: número de animais esperados por Hardy-
Weinberg por classe genotípica e geração de seleção. Genótipos (N): animais por geração que
apresentaram cada um dos seis genótipos possíveis. Freq. alélica: freqüência de cada alelo
encontrado por geração de seleção. χ
2
: qui-quadrado obtido por geração de seleção de acordo
com o esperado por Hardy-Weinberg. GL: graus de liberdade.
* χ
2
significativo (p < 0,05).
48
Linhagem H (D4MGH27)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 2
Alelo 3
Gerações de seleção
Fr eqüência alélica
Figura 3. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D4MGH27, no cromossomo 4.
4.2.3. Dados de genotipagem para D7MGH11
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os qui-quadrado
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador
D7MGH11 para a linhagem de ratos Floripa H estão sumarizados na Tabela 4 e na
Figura 4. Como pode ser observado na Figura 4, a freqüência do alelo 1 diminuiu 3,66%
durante o processo seletivo. Quando feita a análise de regressão da freqüência do alelo 1
ao longo do processo seletivo o resultado não foi significativo (p > 0,05; r
2
= 0,14). As
gerações S1 e S3 apresentaram variação significativa em relação às freqüências de
equilíbrio (Tabela 4), portanto, estas duas gerações de seleção não se mantiveram em
equilíbrio de Hardy-Weinberg. Quando calculado o χ
2
de contingência, este foi
altamente significativo (GL = 8; χ
2
= 48,84; p < 0,001).
49
49
5
Tabela 4. Total de indivíduos por classes genotípica/fenotípica, freqüências genótipicas e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de
Hardy-Weinberg para cada geração para os marcadores D7MGH11 e D7RAT35 do cromossomo 7 ao longo de 5 gerações da linhagem de
ratos Floripa H.
D7MGH11 D7RAT35
Genótipos (N) Freq. alélica Genótipos (N %) Freq. alélica
Geração 1/1 1/3 3/3 1 3 χ
2
(GL=1)
1/1 1/2 2/2 1 2 χ
2
(GL=1)
S0 Observado 23 22 7 0,654 0,346 0,195 21 24 7 0,635 0,365 0,053
N = 52 Esperado 22,228 23,540 6,232 20,941 24,116 6,943
S1 Observado 12 6 7 0,600 0,400 5,778* 14 9 2 0,740 0,260 0,150
N = 25 Esperado 9,000 12,000 4,000 13,690 9,620 1,690
S2 Observado 1 9 6 0,344 0,656 1,531 4 8 4 0,500 0,500 0,156
N = 16 Esperado 1,891 7,219 6,890 4,000 8,000 4,000
S3 Observado 1 0 9 0,100 0,900 4,559* 0 9 1 0,450 0,550 7,802*
N = 10 Esperado 0,100 1,800 8,100 2,025 4,950 3,025
S4 Observado 13 8 6 0,630 0,370 3,232 7 13 7 0,500 0,500 0,093
N = 27 Esperado 10,703 12,593 3,704 6,750 13,500 6,750
* χ
2
significativo (p < 0,05).
50
50
5
55
Linhagem H (D7MGH11)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 1
Alelo 3
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 4. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D7MGH11, no cromossomo 7.
4.2.4. Dados de genotipagem para D7RAT35
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os qui-
quadrados para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o
marcador D7RAT35 para a linhagem de ratos Floripa H estão sumarizados na Tabela 4
e na Figura 5. Como pode ser observado na Figura 5, a freqüência do alelo 2 teve um
acréscimo de 36,99% durante o processo seletivo. Quando feita a análise de regressão
da freqüência do alelo 1 ao longo do processo seletivo o resultado não foi significativo
(p > 0,05; r
2
= 0,56). Quando calculado o χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg,
observa-se que na geração S3 este foi significativo (Tabela 4). Portanto, nesta geração,
não se manteve o equilíbrio de Hardy-Weinberg. O χ
2
de contingência encontrado não
foi significativo (GL = 8; χ
2
= 14,06; 0,10 > p > 0,05).
51
51
5
55
Linhagem H (D7RAT35)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 1
Alelo 2
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 5. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa H
para o marcador D7RAT35, no cromossomo 7.
4.2.5. Correlação entre freqüência alélica e locomoção central
Foi calculada a correlação entre a locomoção central da linhagem H ao longo das
gerações e as freqüências do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o
marcador D4MGH27, ambos dentro do intervalo de confiança do QTL Ofil1 (Figura 6),
e as freqüências do alelo 1 para o marcador D7MGH11 e do alelo 2 para o marcador
D7RAT35 (Figura 7), dentro do intervalo de confiança do QTL Ofil2.. Estes alelos
foram escolhidos com base nas evidências que apontam para a mais provável relação na
variação das freqüências destes alelos com a variação do traço fenotípico entre as
gerações de seleção. Para os marcadores no cromossomo 4 (Figura 6), não foi
encontrada nenhuma correlação significativa (r = 0,60 e p = 0,28 para D4RAT59; r =
0,17 e p = 0,78 para D4MGH27). Também para os marcadores localizados no
cromossomo 7 (Figura 7) não foi encontrada nenhuma correlação entre o fenótipo e as
freqüências alélicas (r = 0,46 e p = 0,44 para D7MGH11; r = 0,23 e p = 0,71 para
D7RAT35).
52
52
5
55
Linhagem H
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0
5
10
15
20
25
Alelo 1 D4RAT59
Alelo 3 D4MGH27
Média de locomoção central
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Média locomoção central no CA
Figura 6. Freqüência do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o marcador
D4MGH27, ambos no cromossomo 4, em comparação com a média de locomoção
central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa H.
Linhagem H
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0
5
10
15
20
25
Alelo 1 D7MGH11
Alelo 2 D7RAT35
Média de locomoção central
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Média locomoção central no CA
Figura 7. Freqüência do alelo 1 para o marcador D7MGH11 e do alelo 2 para o
marcador D7RAT35, ambos no cromossomo 7, em comparação com a média da
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa H.
53
53
5
55
4.3. Linhagem Floripa L
4.3.1. Dados de genotipagem para D4RAT59
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os qui-quadrado
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador
D4RAT59 para a linhagem de ratos Floripa L estão sumarizados na Tabela 5 e na
Figura 8. Como pode ser observado na Figura 8, a freqüência do alelo 1, a partir da
geração S0, diminui 39,84% até a S4. Quando feita a análise de regressão da freqüência
do alelo 1 ao longo do processo seletivo o resultado obtido não foi significativo (p =
0,14; r
2
= 0,57), diferente do que ocorreu para este marcador na linhagem H. Quando
calculado o χ
2
para o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração, observamos que nas
gerações S0, S3 e S4, o χ
2
foi significativo (Tabela 5). Portanto estas três gerações não
estavam em equilíbrio. Quando calculado o χ
2
de contingência, o mesmo foi altamente
significativo (GL = 20; χ
2
= 83,00; p < 0,001).
54
54
5
55
Tabela 5. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências
genótipicas e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada
geração para o marcador D4RAT59 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da
linhagem Floripa L .
Geração: gerações de seleção da S0 a S4 da linhagem Floripa L. N: número total de animais na
geração analisada para o marcador D4RAT59. Observado: número de animais encontrados por
classe genotípica por geração de seleção. Esperado: número de animais esperados por Hardy-
Weinberg por classe genotípica e geração de seleção. Genótipos (N): animais por geração que
apresentaram cada um dos seis genótipos possíveis. Freq. alélica: freqüência de cada alelo
encontrado por geração de seleção. χ
2
: qui-quadrado obtido por geração de seleção de acordo
com o esperado por Hardy-Weinberg. GL: graus de liberdade.
* χ
2
significativo (p < 0,05)
Genótipos (N %) Freq. alélica
Geração 1/1 1/3 1/4 3/3 3/4 4/4 1 3 4 χ
2
(GL=4)
S0 Observado
16 25 7 2 0 2 0,615 0,279 0,106 10,583 *
N = 52 Esperado
19,690
17,845 6,792 4,043 3,067 0,581
S1 Observado
10 12 5 2 5 0 0,542 0,309 0,148 3,834
N = 34 Esperado
9,989 11,390
5,456 3,247 3,110 0,745
S2 Observado
11 8 2 4 0 1 0,615 0,308 0,0769 4,629
N = 26 Esperado
9,846 9,846 2,462 2,462 1,231 0,154
S3 Observado
1 5 4 0 0 0 0,550 0,250 0,200 10,289*
N = 10 Esperado
3,025 2,750 2,200 0,625 1,000 0,400
S4 Observado
5 5 2 6 0 5 0,370 0,370 0,260 16,451*
N = 23 Esperado
3,1412 6,284 4,435 3,141 4,435 1,565
55
55
5
55
Linhagem L (D4RAT59)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Alelo 1
Alelo 3
Alelo 4
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 8. Freqüências alélicas por gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D4RAT59, no cromossomo 4.
4.3.2. Dados de genotipagem para D4MGH27
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como o χ
2
para testar o
equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador D4MGH27 para
a linhagem de ratos Floripa L estão sumarizados na Tabela 6 e na Figura 9. Como pode
ser observado na Figura 9, a freqüência do alelo 3, a partir da geração S0, diminuiu
33,39% até a S4. Quando feita a análise de regressão da freqüência do alelo 3 ao longo
do processo seletivo o resultado obtido foi, assim como para a linhagem H, altamente
significativo (p = 0,02; r
2
= 0,86), sugerindo uma variação gradual e consistente nas
freqüências alélicas ao longo das gerações. O χ
2
calculado para testar o equilíbrio de
Hardy-Weinberg foi significativo na geração S4 (Tabela 6). O χ
2
de contingência foi
significativo (GL = 8; χ
2
= 19,96; p < 0,02). Os resultados sugerem uma possível relação
entre as variações nas freqüências dos alelos candidatos para os marcadores no
cromossomo 4 nas linhagens H e L e o processo seletivo.
56
56
5
55
Tabela 6. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências
genótipicas e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada
geração para o marcador D4MGH27 no cromossomo 4 ao longo de 5 gerações da
linhagem L.
Geração: gerações de seleção da S0 a S4 da linhagem Floripa L. N: número total de animais na
geração analisada para o marcador D4MGH27. Observado: número de animais encontrados por
classe genotípica por geração de seleção. Esperado: número de animais esperados por Hardy-
Weinberg por classe genotípica e geração de seleção. Genótipos (N): animais por geração que
apresentaram cada um dos seis genótipos possíveis. Freq. alélica: freqüência de cada alelo
encontrado por geração de seleção. χ
2
: qui-quadrado obtido por geração de seleção de acordo
com o esperado por Hardy-Weinberg. GL: graus de liberdade.
* χ
2
significativo (p < 0,05)
Linhagem L (D4MGH27)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 2
Alelo 3
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 9. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D4MGH27, no cromossomo 4.
Genótipos (N %) Freq. alélica
Geração 2/2 2/3 3/3 2 3
χ2 (GL=1)
S0 Observado
8 27 17 0,413 0,587 0,399
N = 52 Esperado
8,889 25,221 17,890
S1 Observado
6 19 9 0,456 0,544 0,749
N = 34 Esperado
7,066 16,868 10,066
S2 Observado
10 9 7 0,558 0,442 2,099
N = 26 Esperado
8,086 12,827 5,087
S3 Observado
5 3 2 0,650 0,350 1,003
N = 10 Esperado
4,225 4,550 1,225
S4 Observado
6 16 1 0,609 0,391 5,548*
N = 23 Esperado
8,522 10,956 3,522
57
57
5
55
4.3.3. Dados de genotipagem para D7MGH11
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como o χ
2
para testar o
equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador D7MGH11 para
a linhagem de ratos Floripa L estão sumarizados na Tabela 7 e na Figura 10. Como pode
ser observado na Figura 10, a freqüência do alelo 1 diminuiu 23,55 % durante a seleção.
Porém quando feita a análise de regressão da freqüência do alelo 1 ao longo do processo
seletivo o resultado não foi significativo (p = 0,93; r
2
= 0,01). O χ
2
calculado para testar
o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi significativo nas gerações S1 e S4 (Tabela 7). O χ
2
de contingência foi altamente significativo (GL = 8; χ
2
= 28,57; p < 0,001). Os
resultados sugerem uma variação aleatória na freqüência do alelo 1 para D7MGH11 em
ambas linhagens estudadas, provavelmente resultado de uma maior influência de deriva
genética.
58
58
555
5
Tabela 7. Total de indivíduos por classe genotípica/fenotípica, freqüências genótipicas e alélicas e teste do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-
Weinberg para cada geração para os marcadores D7MGH11 e D7RAT35 do cromossomo 7 ao longo de 5 gerações da linhagem L.
Geração: gerações de seleção da S0 a S4 da linhagem Floripa L. N: número total de animais na geração analisada para os marcadores D7MGH11 e D7RAT35.
Observado: número de animais encontrados por classe genotípica por geração de seleção. Esperado: número de animais esperados por Hardy-Weinberg por
classe genotípica e geração de seleção. Genótipos (N): animais por geração que apresentaram cada um dos seis genótipos possíveis. Freq. alélica: freqüência
de cada alelo encontrado por geração de seleção. χ
2
: qui-quadrado obtido por geração de seleção de acordo com o esperado por Hardy-Weinberg. GL: graus de
liberdade.
D7MGH11 D7RAT35
Genótipos (N %) Freq. alélica Genótipos (N %) Freq. alélica
Geração 1/1 1/3 3/3 1 3 χ
2
(GL=1)
1/1 1/2 2/2 1 2 χ
2
(GL=1)
S0 Observado
23 22 7 0,654 0,346 0,191 21 24 7 0,635 0,365 0,053
N= 52 Esperado
22,231 23,538 6,231 20,942 24,116 6,942
S1 Observado
4 24 6 0,471 0,529 6,399* 10 22 2 0,618 0,382 5,196*
N= 34 Esperado
7,529 16,941 9,530 12,971 16,059 4,970
S2 Observado
14 9 3 0,712 0,288 0,501 16 7 3 0,750 0,250 1,607
N= 26 Esperado
13,181 10,663 2,157 14,625 9,750 1,625
S3 Observado
7 3 0 0,850 0,150 2,410 4 6 0 0,700 0,300 2,980
N= 10 Esperado
7,225 2,550 0,225 4,900 4,200 0,900
S4 Observado
9 5 9 0,500 0,500 4,609* 8 15 0 0,674 0,326 5,900*
N= 23 Esperado
5,750 11,500 5,750 10,446 10,109 2,445
* χ
2
significativo p < 0,05
59
55
5
Linhagem L (D7MGH11)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Alelo 1
Alelo 3
Figura 10. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D7MGH11, no cromossomo 7.
4.3.4. Dados de genotipagem para D7RAT35
Os resultados genotípicos e as freqüências alélicas, assim como os qui-quadrado
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg por geração de seleção para o marcador
D7RAT35 para a linhagem de ratos Floripa L estão sumarizados na Tabela 7 e na
Figura 11. Como pode ser observado na Figura 11, a freqüência do alelo 2 teve um
decréscimo de 10,69% durante o processo seletivo. Quando feita a análise de regressão
da freqüência do alelo 1 ao longo do processo seletivo o resultado não foi significativo
(p = 0,46; r
2
= 0,19). O χ
2
calculado para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg só foi
significativo para as gerações S1 e S4 (Tabela 7). O χ
2
de contingência não foi
significativo (GL = 20; χ
2
= 16,12; p > 0,70). Os resultados sugerem variação suave e
aleatória nas freqüências dos alelos candidatos no cromossomo 7, talvez resultado de
deriva genética, porém sem descartar um pequeno efeito de seleção.
60
66
6
Linhagem L (D7RAT35)
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Alelo 1
Alelo 2
Figura 11. Freqüências alélicas por geração de seleção da linhagem de ratos Floripa L
para o marcador D7RAT35, no cromossomo 7.
4.3.5. Correlação entre freqüência alélica e locomoção central
Foi calculada a correlação entre a locomoção central da linhagem L ao longo das
gerações e a freqüência do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o
marcador D4MGH27 para o QTL Ofil1 e a freqüência dos alelos 1 para o marcador
D7MGH11 e 2 para o marcador D7RAT35 para o QTL Ofil2. Procedeu-se desta
maneira porquê estes alelos apresentaram variação mais semelhante às variações do
traço fenotípico selecionado (Figuras 12 e 13). Para nenhum dos alelos analisados foi
encontrada correlação significativa com o fenótipo comportamental (r = 0,56 e p = 0,33
para D4RAT59; r = 0,60 e p = 0,28 para D4MGH27; r = 0,23 e p = 0,70 para
D7MGH11; r = 0,57 e p = 0,31 para D7RAT35).
61
66
6
Linhagem L
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0
5
10
15
20
Alelo 1 D4RAT59
Alelo 3 D4MGH27
Média de locomoção central
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Média locomoção central no CA
Figura 12. Freqüência do alelo 1 para o marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o
marcador D4MGH27, ambos no cromossomo 4 em comparação com a média de
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L.
Linhagem L
S0
S1
S2
S3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0
5
10
15
20
Alelo 1 D7MGH11
Alelo 2 D7RAT35
Média de locomoção central
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Média locomoção central no CA
Figura 13. Freqüência do alelo 1 para o marcador D7MGH11 e do alelo 2 para o
marcador D7RAT35, ambos no cromossomo 7, em comparação com a média da
locomoção central nas gerações de seleção da linhagem de ratos Floripa L.
62
66
6
4.4. Correlação entre a variação das freqüências alélicas e a variação da
locomoção central entre as linhagens Floripa H e Floripa L
Quando analisamos as diferenças interlinhagens nas freqüências do alelo 1 para o
marcador D4RAT59 e do alelo 3 para o marcador D4MGH27, vemos que houve uma
divergência gradual e consistente entre as linhagens, durante o processo seletivo
(Figuras 14 e 15). Por esta alteração nas freqüências alélicas ser compatível com a
hipótese de associação entre o locus Ofil1 e o comportamento usado como critério de
seleção, apesar de nenhuma das análises de correlação anteriores, realizadas
separadamente para cada linhagem, ter se mostrado significativa, analisou-se a
correlação entre o ∆ das freqüências para cada um dos alelos entre as linhagens e o ∆ da
locomoção central no teste do CA por geração, também entre as linhagens. O único
marcador cuja variação apresentou correlação significativa com a variação fenotípica foi
D4RAT59 (o alelo 1 deste marcador) (r = 0,91 e p = 0,03) (Figura 16). Os demais
marcadores não apresentaram correlação significativa com o fenótipo.
63
66
6
D4RAT59, alelo 1
S
0
S
1
S
2
S
3
S
4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Linhagem H
Linhagem L
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 14. Freqüências do alelo 1 para o marcador D4RAT59 no cromossomo 4 nas
gerações de seleção para as linhagens Floripa H e Floripa L.
D4MGH27, alelo 3
S0
S
1
S
2
S
3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Linhagem H
Linhagem L
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Figura 15. Freqüências do alelo 3 para o marcador D4MGH27 no cromossomo 4 nas
gerações de seleção para as linhagens Floripa H e Floripa L
64
66
6
D4RAT59
S0
S1
S2
S
3
S4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0
5
10
15
20
25
Alelo 1 D4RAT59
Locomoção central no CA
r = 0.91
p < 0.05
Gerações de seleção
Freqüência alélica
Delta locomoção central
Figura 16. Delta interlinhagens (L - H) para a locomoção central no teste do CA e para
as freqüências do alelo 1 de D4RAT59 ao longo das cinco gerações de seleção daS
linhagens Floripa H e Floripa L.
65
66
6
5. Discussão
O principal objetivo deste trabalho foi investigar experimentalmente a influência
dos QTLs Ofil1 e Ofil2 para emocionalidade em ratos, previamente identificados em
linhagens isogênicas não-selecionadas (Ramos et al., 1999), em um outro modelo
animal desenvolvido através de seleção bidirecional para locomoção central no teste do
CA, um comportamento relacionado à ansiedade/emocionalidade (Ramos et al., 2003).
O modelo animal em estudo, os ratos das linhagens Floripa H e Floripa L, foram
selecionados a partir de uma geração formada por descendentes de três linhagens
diferentes, entre elas uma isogênica (LEW) e duas heterogêneas (Hooded e Wistar),
usadas para produzir a geração inicial S0 (Ramos et al., 2003). Portanto, os QTLs
identificados a partir das linhagens LEW e SHR (Ramos et al., 1999) não teriam
necessariamente relevância em ratos das linhagens Floripa.
Como as linhagens que deram origem aos ratos das linhagens Floripa H e L não
foram previamente comparadas em termos genotípicos, não se sabia se elas
apresentariam ou não polimorfismos genéticos em relação aos marcadores investigados
ou ao(s) gene(s) potencialmente envolvidos. Outros marcadores para os dois QTLs, não
citados neste trabalho, foram inicialmente utilizados, mas não se mostraram
polimórficos. Os marcadores moleculares que apresentaram polimorfismo no
cromossomo 4 foram D4RAT59 e D4MGH27 e, no cromossomo 7, foram D7MGH11 e
D7RAT35. Os dois primeiros flanqueiam o pico do QTL Ofil1, enquanto os dois
últimos flanqueiam o pico do QTL Ofil2 (ver Ramos et al., 1999). Os principais
trabalhos de seleção para comportamento, utilizados como referência para nossas
análises (Koundaurova et al., 2006; Buck et al., 1997), iniciaram os seus processos
seletivos com o uso de linhagens parentais isogênicas, polimórficas entre si e
66
66
6
divergentes para os QTLs estudados. Tal estratégia é mais simples e mais facilmente
interpretável do que a utilizada no presente trabalho, que, por limitações práticas na
época, lançou mão de linhagens que nunca haviam sido comparadas genotípica ou
fenotipicamente.
Com o interesse de estabelecer possíveis relações entre estas duas regiões
genômicas (Ofil1 e Ofil2) com comportamentos relacionados à ansiedade nas linhagens
Floripa, foi aplicado o teste do χ
2
para testar se cada geração de seleção,
individualmente por marcador, encontrava-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Desta
forma, poderia se avaliar se as freqüências alélicas e genotípicas sofreram alterações
significativas durante o processo seletivo, como seria esperado caso a seleção imposta
exercesse uma ação sobre os genes localizados nas duas regiões cromossômicas
monitoradas. O cálculo do χ
2
para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg também foi
uma ferramenta estatística utilizada por Kondaurova et al. (2006) após o processo
seletivo para extremos de catalepsia em camundongos. Também com o intuito de
verificar se houve alterações genotípicas significativas ao longo do processo seletivo,
foi calculado para o conjunto das gerações de seleção, para cada marcador, o χ
2
de
contingência. Quando este χ
2
é significativo, pode-se sugerir que houve influência do
processo seletivo, ou ao menos de deriva genética aleatória, sobre os genótipos das
regiões estudadas.
Procurando-se avaliar a correlação dos genótipos com o fenótipo selecionado,
utilizou-se a análise de correlação entre a média do fenótipo, por geração e por
linhagem, e as respectivas freqüências alélicas. Visto que o alelo 1 para o marcador
D4RAT59 e o alelo 3 para o marcador D4MGH27 apresentaram uma divergência
durante o processo de seleção, mas que esta divergência não foi confirmada claramente
por nenhuma das análises preliminares realizadas, foi calculada ainda a correlação entre
67
66
6
o ∆ das freqüências alélicas entre as linhagens selecionadas e a variação da atividade
locomotora central no teste do CA entre as mesmas linhagens. Este procedimento foi
adotado na tentativa de se minimizar o efeito do ambiente, que variou em termos de
estação do ano, experimentador (que não foi o mesmo em todos os testes) e outros
fatores ambientais que não foram possíveis de controlar. Tais efeitos podem ter
influenciado os resultados comportamentais de forma independente do genótipo,
fazendo-os flutuar ao longo das gerações, tanto na linhagem H quanto na L (Izídio et
al., 2005; Jones; Jones, 2007).
Partindo do princípio de que os fatores que alteram as freqüências alélicas em
uma população são mutação, migração, seleção e deriva genética aleatória, para saber
quais eventos podem estar atuando nas gerações de cada linhagem estudada,
desconsidera-se o efeito de mutações, visto que foram analisadas poucas gerações de
seleção. Desconsidera-se também o efeito de migração por tratar-se de populações
fechadas e isoladas. No entanto, aceita-se a influência de deriva genética, que são
mudanças aleatórias nas freqüências alélicas em populações pequenas, onde os alelos
que aparecem na prole não são uma amostra perfeitamente representativa dos genes
parentais (Falconer, 1987). Por outro lado, a seleção artificial também deve causar
alteração nas freqüências alélicas e genotípicas de genes e de regiões genômicas
relevantes para o traço selecionado, devido ao cruzamento preferencial entre fenótipos
semelhantes. O acasalamento não aleatório deve mudar as freqüências dos genes
especificamente envolvidos (Futuyma, 1997, p. 216) e, conseqüentemente, dos
marcadores polimórficos localizados na vizinhança destes genes. Ou seja, animais
usados na reprodução seletiva como progenitores, tendem a deixar para a progênie
aqueles alelos que provavelmente estão relacionados à característica selecionada.
Portanto, no presente trabalho, considerou-se como possíveis fatores atuantes nos
68
66
6
genótipos das populações estudadas, em ambas linhagens, a seleção e a deriva genética
(Falconer, 1987).
Quanto ao QTL Ofil1 no cromossomo 4, quando avaliada a variação nas
freqüências dos alelos candidatos para os marcadores D4RAT59 e D4MGH27, a partir
da geração S0 à S4, foi obtida uma variação significativa, gradual e divergente entre as
linhagens. O alelo 1 para o primeiro marcador e o alelo 3 para o segundo aumentaram
suas freqüências na linhagem H enquanto diminuíram na linhagem L. Sendo que, com
exceção do alelo 1 para D4RAT59 em Floripa L, todos os demais candidatos
apresentaram um coeficiente de regressão significativo ao longo do processo seletivo,
sugerindo a influência destes alelos no traço selecionado nas linhagens Floripa H e L.
Também foi observado, para o marcador D4RAT59, que as gerações S1, S3 e S4
em ambas as linhagens, não se encontravam em equilíbrio de Hardy-Weinberg, ou seja,
nestas gerações de seleção, houve uma alteração significativa nas freqüências
genotípicas obtidas em relação às esperadas. Resultado semelhante para um marcador
no cromossomo 13 de camundongos foi encontrado por Koundaurova et al. (2006),
onde os autores observaram alterações nos genótipos das duas primeiras gerações de
seleção, para catalepsia em camundongos, através do teste do equilíbrio de Hardy-
Weinberg, sugerindo influência simultânea do processo seletivo sobre o fenótipo e o
genótipo da região estudada.
Quando calculado o χ
2
de contingência para os marcadores utilizados próximos à
Ofil1, comparando-se da primeira à última geração, observou-se que as duas linhagens
sofreram alterações significativas nas suas freqüências genotípicas, sugerindo que ao
longo do processo seletivo, baseado em um comportamento relacionado à ansiedade,
ocorreram alterações significativas nas freqüências genotípicas. Quando calculamos a
correlação entre o ∆ das freqüências alélicas para Ofil1 e o ∆ do fenótipo selecionado,
69
66
6
entre as duas linhagens estudadas, o alelo 1 para o marcador D4RAT59 apresentou
correlação significativa com o comportamento selecionado de forma divergente nas
linhagens H e L.
De acordo com as evidências obtidas através dos resultados para os marcadores no
cromossomo 4 no presente trabalho, pode-se sugerir o a influência da seleção artificial
nas alterações genotípicas observadas em Floripa H e L na região do QTL Ofil1. Ou
seja, Ofil1 deve estar correlacionado à locomoção central no CA, um comportamento
relacionado à ansiedade.
Em relação ao QTL Ofil2 no cromossomo 7, a linhagem Floripa H apresentou
variação entre o número de indivíduos obtidos e esperados por genótipo, de acordo com
a hipótese de equilíbrio para o marcador D7MGH11, nas gerações S1 e S3, assim como
na linhagem L as gerações S1 e S4 não se encontravam em equilíbrio. Para D7RAT35,
na linhagem H a geração S3 e na linhagem L as gerações S1 e S4 também não estavam
em equilíbrio, sugerindo a influência de algum fator evolutivo na região genômica onde
se encontram estes marcadores. Quando calculado o χ
2
de contingência, observou-se
uma grande significância das variações genotípicas ao longo do processo de seleção em
ambas as linhagens. Porém de acordo com os números absolutos e a análise numérica
bruta das variações alélicas não mostraram variações gradativas tampouco divergentes,
mas sim de forma aleatória durante a seleção. Também não foi encontrada nenhuma
correlação entre o genótipo e o fenótipo em nenhuma das linhagens estudadas (ou entre
as linhagens) para os dois marcadores no cromossomo 7. As evidências sugerem
variações aleatórias nas freqüências alélicas para os marcadores no cromossomo 7 não
relacionadas de forma significativa ao fenótipo, ao longo do processo de seleção das
linhagens Floripa H e L. Sugerimos, portanto, que as alterações observadas nos
70
77
7
marcadores do QTL Ofil2 podem ser efeito de deriva genética, sem descartar alguma
influência do processo seletivo.
Um fator a ser considerado nas análises é o de que na geração S3, em ambas as
linhagens, somente os animais selecionados tiveram seus tecidos extraídos e
armazenados e posteriormente genotipados, devido a motivos práticos na época,
portanto todas as análises genotípicas para esta geração tiveram apenas 10 animais por
linhagem, enquanto as análises fenotípicas basearam-se no número de indivíduos total
de 60 animais. As análises envolvendo a geração S3, portanto, podem ter sofrido
influência do pequeno número de animais genotipados.
Os resultados do presente estudo sugerem que para as populações de ratos
denominadas Floripa H e L, um locus localizado no cromossomo 4 exerce influência, a
exemplo do que já foi demonstrado em ratos oriundos das linhagens LEW e SHR
(Ramos et al., 1999), sobre um comportamento relacionado ao medo ou à
emocionalidade. O mesmo não pode ser concluído a respeito de Ofil2, um outro locus
mapeado no cromossomo 7 e também associado à emocionalidade nas linhagens
isogênicas LEW e SHR (Ramos et al., 1999).
No trabalho de Ramos et al. (1999), quando comparamos os efeitos destes dois
QTLs, vemos que o efeito de Ofil2 (LOD = 3,66) sobre a locomoção central no CA não
é tão significativo quanto o de Ofil1 (LOD = 7,22). Este último explicava 50,4% da
variação fenotípica de ratos F2, um efeito excepcionalmente elevado para este tipo de
estudo. Portanto, podemos deduzir que, enquanto Ofil1 tem uma importância maior e
mais generalizável para outras populações de ratos (como as linhagens Floripa), Ofil2
tem efeito mais modesto e/ou mais específico para certas linhagens. Um estudo com
linhagens recombinantes derivadas das linhagens LEW e SHR, no entanto, confirmou o
efeito de Ofil1, mas não de Ofil2, sobre a locomoção central no CA (Vendruscolo et al.,
71
77
7
2006). Portanto, é possível que o QTL Ofil2 seja pouco importante para a atividade
locomotora no centro do CA nas linhagens Floripa.
No entanto, é importante se reconhecer uma limitação da estratégia utilizada no
presente trabalho, que é a de não se conhecer a ancestralidade do alelos para os
marcadores estudados, visto que não se tratava de uma genealogia ou família provinda
de ancestrais comuns. Assim, talvez animais com um mesmo alelo tenham herdado tal
alelo de ancestrais diferentes, o que mascararia sua eventual ligação com o fenótipo.
Neste caso, resultados falso-negativos poderiam ser obtidos, se um determinado alelo
marcador ora estivesse associado a um efeito fenotípico positivo e ora estivesse
associado a um efeito fenotípico negativo. Em suma, os presentes resultados não nos
permitem descartar o potencial envolvimento de Ofil2 no comportamento das linhagens
Floripa H e L.
O pico do QTL Ofil1, mapeado em 1999, se situava a cerca de 8 cM do
marcador D4RAT59 e a cerca de 5,4 cM de D4MGH27, ou seja, mais próximo deste
último (Ramos et al., 1999). Além disso, o gráfico que representa os valores de LOD
score (que indicam a probabilidade de ligação entre cada ponto do genoma e o fenótipo
estudado), calculados para os diversos pontos do cromossomo 4, indicava um maior
valor de LOD para D4MGH27. Estes dados não são confirmados pelo presente estudo,
que aponta D4RAT59 como estando mais próximo do(s) gene(s) responsável(is) pelo
efeito fenotípico de Ofil1. Cabe salientar, no entanto, que os mapas de ligação utilizados
em análises de QTL, que se baseiam em distâncias em cM, têm baixa precisão e podem
variar de estudo para estudo, pois dependem do número observado de recombinações
em uma dada população entre grupos de marcadores ligados.
Quando consideramos as distâncias físicas em pares de base, atualmente
disponíveis graças ao seqüenciamento do genoma do rato, vemos que a distância entre
72
77
7
os dois marcadores do cromossomo 4 utilizados no presente estudo é bastante grande,
ou seja, de 20,8 milhões de pares de base (ou 20,8 Mb). Como vimos, no entanto,
podemos supor que o nosso gene de interesse esteja mais próximo de D4RAT59 do que
de D4MGH27, provavelmente a menos de 10 Mb do primeiro (disponível em Rat
Genome V3.4 at RGD – Rat Genome Browser). Estudos em andamento em nosso
laboratório deverão refinar a posição de mapa de nosso locus Ofil1.
De acordo com o banco de dados RGD, vários QTLs já foram mapeados perto
de Ofil1. Alguns QTLs relacionados a comportamentos localizados em regiões
próximas aos dois marcadores utilizados no cromossomo 4, como consumo de álcool
(Alc14, Alc16, Alc18) e ingestão de alimentos (Fit1). Dentro deste intervalo genômico
encontram-se vários genes candidatos que têm funções importantes sobre o sistema
nervoso central. Os genes Tac1r (tachykinin receptor 1) e NPY (neuropeptide Y) foram
considerados candidatos no trabalho de 1999, mas estão relativamente distantes do pico
do QTL. No intervalo entre os dois marcadores utilizados, encontram-se outros genes de
interesse, entre eles o Grid2 (glutamate receptor, ionotropic, delta 2); Il12rb2
(interleukin 12 receptor, beta 2); Grip2 (glutamate receptor interacting protein 2); Trh
(thyrotropin releasing hormone); Il5ra (interleukin 5 receptor, alpha); GRm7
(glutamate receptor, metabotropic 7); e o Hrh1 (histamine receptor H 1). Em regiões
mais próximas a Ofil1 encontram-se ainda os genes Syn2 (synapsin II) e Grin2b
(glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2B). Na região do marcador
D4RAT59 encontra-se o gene Gabarapl1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA(A))
receptor-associated protein-like 1), que encontra-se no homem em região homóloga no
cromossomo 3 e está associado a transtornos psiquiátricos. Na região do marcador
D4MGH27 encontra-se o gene Slc6a1 (Solute carrier family 6 (neurotransmitter
73
77
7
transporter, GABA), member 1), também homóloga em humanos no cromossomo 3
(disponível em Rat Genome V3.4 at RGD – Rat Genome Browser).
Até a presente data, não sabemos qual gene é de fato responsável pelos efeitos
comportamentais de Ofil1, mas é possível que um dos genes acima relacionados esteja
envolvido nos resultados fenotípicos. Podemos sugerir para uma investigação futura dos
possíveis QTGs em Ofil1 o estudo dos genes Gabarapl1 e Slc6a1. Estes dois, por
atuarem na neurotransmissão gabaérgica, são fortes candidatos à associação com
transtornos de ansiedade, localizados em ratos na região próxima ao pico do QTL Ofil1.
Estudos em andamento e estudos futuros deverão investigar estas possibilidades, através
de análises moleculares, fisiológicas e comportamentais de alguns destes genes
candidatos.
Com base nos resultados obtidos, concluímos que a região genômica
correspondente ao QTL Ofil1 deve conter um ou mais genes relacionados a traços de
ansiedade, corroborando estudos anteriores com o mesmo QTL nas linhagens LEW e
SHR (Ramos et al., 1999; Mormède et al., 2002; Vendruscolo et al., 2006). Outros
autores que realizaram seleção fenotípica também confirmaram regiões genômicas em
camundongos contribuindo para comportamentos relacionados à ansiedade (Buck et al.,
1997; Koundaurova et al., 2006). O estudo destas regiões genômicas, é uma promissora
ferramenta para identificação e localização de genes que contribuam para
comportamentos ligados à emocionalidade em roedores. O próximo passo seria então a
identificação dos genes relacionados ao fenótipo e a localização destes genes em
humanos, através da homologia da arquitetura genética (genes sintênicos) em
comparação com a de roedores, o que pode futuramente proporcionar o
desenvolvimento de drogas mais específicas para transtornos psiquiátricos relacionados
à ansiedade.
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77
7
6. Conclusão
Através da análise dos resultados obtidos, concluímos que a seleção para a
locomoção na área central e aversiva do teste do CA, um comportamento relacionado à
ansiedade, parece ter atuado alterando as freqüências alélicas nas linhagens de ratos
Floripa H e L na região onde se encontram os marcadores D4RAT59 e D4MGH27,
dentro do intervalo de confiança do QTL Ofil1. Este QTL mostrou correlação
significativa com o fenótipo selecionado, o que nos leva a sugerir que a seleção
fenotípica influenciou as variações genotípicas na região de Ofil1. Isto indica que nesta
região genômica em ratos deve existir um ou mais genes contribuindo para um
comportamento relacionado à ansiedade nas linhagens estudadas. Os marcadores
utilizados neste trabalho para investigar a influência de Ofil2 também apresentaram
alterações nos genótipos, porém esta variação aparentemente é resultado do efeito de
deriva genética, sem descartar totalmente uma possível contribuição do processo
seletivo.
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7. Referências Bibliográficas
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