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LUÍS OTÁVIO DE BRITO BENETOLI
ESTUDO DA ADSORÇÃO DE
BIOMOLÉCULAS SOBRE ARGILAS:
IMPLICAÇÕES PARA A ORIGEM DA VIDA
Londrina
Fevereiro de 2007
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LUÍS OTÁVIO DE BRITO BENETOLI
ESTUDO DA ADSORÇÃO DE
BIOMOLÉCULAS SOBRE ARGILAS:
IMPLICAÇÕES PARA A ORIGEM DA VIDA
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação, em Química dos
Recursos Naturais, da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Dimas A. M. Zaia.
Co-Orientador: Prof. Dr. Henrique de
Santana.
Londrina
Fevereiro de 2007
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COMISSÃO EXAMINADORA
Dr. Dimas Augusto Morozin Zaia
(orientador)
Dr. Andréa Paesano Jr. - UEM
Dr. Nilson Evelázio de Souza - UEM
Londrina, 23 de fevereiro de 2007.
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, pelo ânimo e
força necessários em cada etapa
deste trabalho. Sem vocês este
trabalho não seria possível.
“A evolução é bem mais esperta
do que nós!”.
5
AGRADECIMENTOS
Sou profundamente grato ao Prof. Dr. Dimas Augusto Morozin Zaia,
amigo, “conselheiro” e exemplo de caráter e dedicação à pesquisa,
que não só tolerou-me durante a iniciação científica como também
no mestrado, sempre “levando luz onde há trevas!” Valeu mesmo
Prof.!!!
Ao amigo e Prof. Dr. Henrique de Santana, que em momento algum
mediu esforços na realização deste trabalho. Pela importante
contribuição na minha formação como pesquisador.
Ao Departamento de Ciências Fisiológicas, na pessoa da Profª. Drª.
Cássia Thaís B. V. Zaia pelo apoio, sugestões e espaço cedido
durante a realização de alguns experimentos.
À família Zaia (Dimas, Thaís, Laura, Sofia e Lolly) pelos incontáveis
almoços e clima familiar proporcionado.
A todos os professores do Dep. de Química-UEL, pelos seus
ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Antonio C. S. da Costa, do Dep. de Agronomia da
UEM, pelas análises de difratometria de raios-X.
Ao Prof. Dr. Andrea Paesano Jr, do Dep. de Física da UEM, pelas
análises de espectroscopia Mössbauer.
A CAPES, pela concessão de uma bolsa de mestrado.
A todo pessoal do “laboratório 339”, em especial a Ivanira, Sabrina,
Isadora, Diogo, Eduardo, Lizia e Cláudio, por todo apoio na
realização dos experimentos.
Aos grandes amigos Alfredo, “Brrruno”, José Rafael “Mig’s”,
Marquinhos “Pai”, Ramon, “Rato”, Tiago, Takano, Ulisses e àqueles
que esqueci, por toda alegria, descontração e “discussões
filosóficas” nos churrascos e barzinhos da vida.
À “república Gerby’s”, local de profunda inspiração científica.
Sou muito grato a todos que direta ou indiretamente contribuíram
para a realização deste sonho. Esta dissertação é de todos nós!
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Valores de pK
1
(α-COOH), pK
2
(α-NH
3
), pK
R
(outro grupo
presente na molécula) e pI para alguns aminoácidos................... 5
Tabela 2. Valores de pK
a
para cada estágio de ionização das bases
nitrogenadas estudadas................................................................ 8
Tabela 3. Valores de p
cz
e ASE dos argilo-minerais considerados neste
estudo............................................................................................ 10
Tabela 4.
Quantidade em µg de aminoácidos adsorvidos em 500 mg de
caulim em três faixas de pH.......................................................... 28
Tabela 5.
Quantidade em µg de aminoácidos adsorvidos em 500 mg de
bentonita em três faixas de pH...................................................... 29
Tabela 6. Parâmetros hiperfinos e áreas subespectrais Mössbauer para
as amostras de bentonita com e sem cisteína adsorvida.............. 53
Tabela 7. Parâmetros de Langmuir das bases do DNA/RNA adsorvidas
sobre argilas.................................................................................. 55
Tabela 8. Parâmetros de Freundlich das bases do DNA/RNA adsorvidas
sobre argilas.................................................................................. 56
Tabela 9. Quantidade de bases de DNA/RNA adsorvidas sobre argilas...... 60
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos aminoácidos estudados............................. 4
Figura 2. Estrutura das bases nitrogenadas estudadas............................... 6
Figura 3. Esquema de síntese abiótica de purinas e pirimidinas................. 7
Figura 4. (A) - Estrutura da caulinita. (B) – Estrutura das esmectitas. ........ 9
Figura 5. Concentração relativa de todos os aminoácidos. ......................... 33
Figura 6. Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), alanina sólida (b) e alanina
adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), alanina sólida (b) e
alanina adsorvida em caulim (c).................................................... 37
Figura 7. Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), ácido aspártico sólido (b) e
ácido aspártico adsorvido em bentonita (c); (B) caulim (a), ácido
aspártico sólido (b) e ácido aspártico adsorvido em caulim (c)..... 38
Figura 8. Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), lisina sólida (b) e lisina
adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), lisina sólida (b) e
lisina adsorvida em caulim (c)....................................................... 39
Figura 9. Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), histidina sólida (b) e
histidina adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), histidina
sólida (b) e histidina adsorvida em caulim (c)............................... 41
Figura 10.
Figura 11.
Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), metionina sólida (b) e
metionina adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), metionina
sólida (b) e metionina adsorvida em caulim (c).............................
Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), glutamina sólida (b) e
glutamina adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), glutamina
sólida (b) e glutamina adsorvida em caulim (c).............................
43
44
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Figura 17.
Figura 18.
Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), cisteína sólida (b) e
cisteína adsorvida em bentonita (c); (B) caulim (a), cisteína
sólida (b) e cisteína adsorvida em caulim (c)................................
Difratogramas de raios-X das amostras orientadas de bentonita
em equilíbrio com soluções contendo NaOH 0,1M em três
valores de pH sem e com cisteína................................................
Difratogramas de raios-X das amostras de bentonitas na
presença ou ausência de cisteína em três valores de pH.............
Espectro Mössbauer RT para a bentonita.....................................
Espectro Mössbauer RT para a Cys adsorvida em bentonita. A
figura interna mostra o espectro de Cys/Fe
3+
................................
Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), adenina sólida (b), citosina
sólida (c), timina sólida (d), uracila sólida (e); (B) adenina (a),
citosina (b) timina (d) e uracila (e) adsorvidas em bentonita.........
Espectro FT-IR de: (A) montmorilonita (a), adenina sólida (b),
citosina sólida (c), timina sólida (d), uracila sólida (e); (B)
adenina (a), citosina (b) timina (d) e uracila (e) adsorvidas em
montmorilonita...............................................................................
46
49
50
52
52
63
64
8
SUMÁRIO
RESUMO....................................................................................................... ix
ABSTRACT.................................................................................................... x
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
1.1. Considerações gerais............................................................................. 1
1.2. Aminoácidos........................................................................................... 3
1.3. Bases nitrogenadas ............................................................................... 5
1.4. Argilo-minerais: candidatos a evolução química.................................... 8
1.5. Isotérmas de Adsorção... ...................................................................... 10
1.6. Adsorção de biomoléculas sobre superfícies minerais.......................... 12
1.6.1. Adsorção de aminoácidos sobre argilas.............................................. 12
1.6.2. Adsorção de bases nitrogenadas sobre argilas................................... 14
2. OBJETIVOS............................................................................................... 17
2.1. Objetivos gerais...................................................................................... 17
2.2. Objetivos específicos.............................................................................. 17
3. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 18
3.1. Materiais................................................................................................. 18
3.1.1. Argilas.................................................................................................. 18
3.1.2. Reagentes........................................................................................... 18
3.1.3. Aminoácidos........................................................................................ 18
3.1.4. Bases nitrogenadas............................................................................. 19
3.1.5. Preparo de amostras........................................................................... 19
3.1.5.1. Aminoácidos..................................................................................... 19
3.1.5.2. Bases nitrogenadas.......................................................................... 20
3.1.6. Soluções.............................................................................................. 21
3.1.7. Equipamentos...................................................................................... 24
3.2. Métodos.................................................................................................. 24
3.2.1. Espectroscopia UV-Vis........................................................................ 24
3.2.2. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)............................................ 25
3.2.3. Difratometria de raios-X....................................................................... 25
3.2.4. Espectroscopia Mössbauer..................................................................
3.2.5. Análise estatística................................................................................
26
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................... 27
4.1. Adsorção de Aminoácidos Sobre Argilas................................................ 27
4.1.1. Adsorção.............................................................................................. 27
4.1.2. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)............................................ 35
4.1.3. Difratometria de raios-x........................................................................ 48
4.1.4. Espectroscopia Mössbauer (MS)......................................................... 51
4.2. Adsorção de bases nitrogenadas sobre argilas...................................... 54
4.2.1. Adsorção.............................................................................................. 54
4.2.2. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)............................................ 62
5. CONCLUSÕES.......................................................................................... 67
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 70
9
RESUMO
Na primeira etapa do presente trabalho, a adsorção de aminoácidos (alanina,
Ala; metionina, Met; glutamina, Gln; cisteína, Cys; ácido aspártico, Asp; lisina,
Lys; histidina, His) sobre argilas (bentonita e caulim) foi estudada em diferentes
faixas de pH (3,00, 6,00 e 8,00). Os aminoácidos foram dissolvidos em água do
mar, contendo em sua composição os elementos de maior concentração
presentes naturalmente. O principal resultado deste trabalho foi que a Cys
pode ter tido um importante papel na química prebiótica além de ser apenas
um aminoácido em peptídeos/proteínas. Os aminoácidos com grupo R
carregado (Asp, Lys e His) e Cys (grupo polar R não-carregado) foram mais
adsorvidos sobre argilas do que Ala, Met e Gln (grupo R não-carregado).
Entretanto, 74 % dos aminoácidos nas proteínas dos organismos modernos
contém grupo R não-carregado. Estes resultados geram algumas dúvidas
quanto ao papel dos minerais em fornecer um mecanismo de concentração de
aminoácidos. Diversos mecanismos que poderiam produzir peptídeos com uma
maior proporção de aminoácidos com grupo R não-carregado são também
discutidos. Os espectros de infravermelho FT-IR mostraram que a adsorção de
aminoácidos em argilas ocorreu através do grupo amino, provavelmente como
NH
3
+
. Entretanto, a interação Cys/argilas ocorreu através dos grupos sulfidrila e
também do grupo amino. A difratometria de raios-X mostrou que o pH afeta as
camadas internas da bentonita e a expansão em pH 3,00 da Cys/bentonita foi
maior que a expansão das amostras de etileno glicol/bentonita saturadas com
Mg. O espectro Mösbauer para as amostras com Cys adsorvida mostrou um
grande aumento (~20%) de íons ferrosos. Isto significa que a Cys foi capaz de
reduzir parcialmente o ferro presente na bentonita. Este resultado é similar
àquele que ocorre com a aconitase onde os íons ferrosos são reduzidos a Fe
2,5. Na segunda parte deste trabalho foi realizado um estudo de adsorção de
diversas bases nitrogenadas (adenina, A; citosina, C; timina, T; uracila, U)
dissolvidas em água do mar sobre argilas (caulim, bentonita e montmorilonita)
em dois pHs (2,00 e 7,20). O caulim adsorveu muito pouco da A em pH 2,00 e
nenhuma das outras bases aqui estudadas foram adsorvidas por este mineral.
Os resultados mostram que as bases A e C adsorvem mais sobre as argilas
bentonita e montmorilonita do que as bases U e T. Estes resultados sugerem
duas questões: a) o pH onde ocorreu a maior adsorção é muito baixo, apesar
de ocorrer em alguns hidrotermais, porém, seriam estes ambientes muito
comuns? e b) o outro problema é ainda pior, a ocorrência das bases nos seres
vivos não tem a mesma relação encontrada neste experimento. Uma análise
das bases encontradas no DNA de diversos seres vivos mostra uma relação
A/T por volta de 1,00. Entretanto os resultados obtidos mostram que em
qualquer situação a A é muito mais adsorvida que a T ou seja a relação A/T é
muito maior do que um. Estes resultados levantam algumas questões sobre o
papel dos minerais em fornecer um mecanismo para concentração de bases:
Poderíamos esperar que a composição das bases nitrogenadas adsorvidas
sobre minerais refletisse as das DNA atuais? A adsorção de bases
nitrogenadas sobre minerais foi importante para a origem da vida? Os dados de
infravermelho mostram que todas as bases interagem com as argilas através
do grupo amina.
10
ABSTRACT
In the first part of this paper, the adsorption of amino acids (alanine, Ala;
metionine, Met; glutamine, Gln; cysteine, Cys; aspartic acid, Asp; lysine, Lys;
histidine, His) on clays (bentonite, kaolinite) was studied at different pH (3.00,
6.00, 8.00). The amino acids were dissolved in seawater, which contains the
major elements. The main achievment of this paper was that Cys could play an
important role in prebiotic chemistry besides just being one of the amino acids
in the peptides/proteins.The amino acids with a charged R group (Asp, Lys, His)
and Cys (uncharged R group) were adsorbed on clays more than Ala, Met and
Gln (uncharged R groups). However, 74% of the amino acids in the proteins of
modern organisms have uncharged R groups. These results raise some
questions about the role of minerals in providing a concentration mechanism for
amino acids. Several mechanisms are also discussed that could produce
peptides with a greater proportion of amino acids with uncharged R groups. The
infrared spectra (FT-IR) showed that the adsorption of amino acids on the clays
occurs through the amine group, probably as NH
3
+
. However, the Cys/clay
interaction occurs through the sulfhydryl and amine groups. X-ray diffractometry
showed that pH affects the bentonite interlayer, and at pH 3.00 the expansion of
Cys/bentonite was greater than that of the samples of ethylene glycol/bentonite
saturated with Mg. The Mössbauer spectrum for the sample with absorbed Cys
showed a large increase (~ 20%) in ferrous ions. This means that Cys was able
to partially reduce iron present in bentonite. This result is similar to that which
occurs with aconitase where the ferric ions are reduced to Fe 2.5. In the second
part of this paper the adsorption of several DNA/RNA bases (adenine, A;
cytosine, C; thimine, T; uracil, U) dissolved in seawater on clays (bentonite,
kaolinite, montmorillonite) was studied at two pHs (2.00, 7.20). Kaolinite
adsorbed a small amount of A at pH 2.00 and the other bases were not
adsorbed on this mineral. The results showed that the bases A and C were
much more adsorbed on bentonite and montmorillonite than the bases U and T.
These results raise two questions a) the pH where the adsorption was bigger is
very lower, beside it occurs in hydrothermal, but were these environments
commons? b) the other problem is worst, the amount of base in the living
beings do not have the same rate that were found in these experiments. The
analyses of DNA bases of several organisms showed that rate of A/T are about
1.00. However the results showed that A is always more adsorbed than T, so
the rate A/T is much bigger than one. These results raised some questions
about the role of minerals in providing a concentration mechanism for DNA/RNA
bases: should we expect the composition of adsorbed DNA/RNA bases on
minerals to reflect that of present day DNA/RNA? Was the adsorption of nucleic
acid bases on minerals important in the origin of life? The results of infrared
spectroscopy showed that the bases interact to clays through amine group.
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
Por todo o século 20 cunhou-se a idéia de que a vida surgiu de uma
sopa primordial à qual, continha moléculas orgânicas que dadas às condições
especiais, passariam por um processo de evolução química, culminando com a
origem da vida em nosso planeta. Esta idéia foi proposta independentemente
por Oparin e Haldane, tendo como base uma atmosfera altamente redutora.
Dentre os compostos desta sopa primordial, diversas moléculas de interesse
para o surgimento da vida foram sintetizadas abioticamente (incluindo
aminoácidos – monômeros de proteínas; peptídeos; formaldeído e cianetos –
que podem ter sido intermediários na formação de aminoácidos e de
componentes de ácidos nucléicos; vitaminas; estruturas coacervadas, lipídios,
etc), simulando diferentes condições presentes na Terra primitiva (Miller, 1953;
Ferris et al., 1978; Ferris e Hagan, 1984; Oró, 1960).
Outra hipótese para o surgimento da vida em nosso planeta foi proposta
por Wächtershäuser (1988), que lança a idéia de que a vida emergiu baseada
em um metabolismo autotrófico na superfície ferro/enxofre da pirita.
Experimentalmente, estudos conduzidos na área de origem da vida
devem, a priori, reproduzir os ambientes existentes na Terra primitiva, ou seja,
de aproximadamente 3.5 - 3.9 bilhões de anos atrás, data a qual a maioria das
evidências aponta para o aparecimento das primeiras formas de vida (Mojzsis
et al., 1996).
12
Para ocorrer à evolução química em um ambiente na Terra primitiva o
mesmo deveria ter as seguintes condições: (1) fonte de energia – a energia
necessária para a formação de moléculas orgânicas complexas a partir de
moléculas simples na Terra primitiva estava presente em diversas formas tais
como: descargas elétricas, raios cósmicos, raios UV, impactos de meteoros e
cometas, radioatividade, vulcanismo etc; (2) proteção – após as moléculas
terem se formado, elas tinham que ser protegidas ou seriam destruídas pelo
contínuo fluxo de energia, principalmente na forma de radiação ultravioleta do
Sol. Essa proteção poderia ser em águas mais profundas ou em fendas nas
rochas, em sedimentos, ou mesmo adsorvidas sobre minerais; (3) pré-
concentração de compostos – a diluição das biomoléculas no mar da Terra
primitiva tornaria a evolução molecular impossível, de modo que devem ter
existido mecanismos que favoreceram a pré-concentração de compostos,
sendo estes: evaporação ou congelamento de pequenas lagoas, adsorção
sobre minerais, entrada dentro de estruturas coacervadas, etc; e (4) catálise –
muitas reações químicas são favorecidas por catalisadores, substâncias que
auxiliam nas reações, mas não tomam parte nela sendo que as seguintes
substâncias podem ser alguns exemplos de catalisadores primitivos: argilas,
metais de transição, pequenas moléculas orgânicas, etc. No início, alguns
catalisadores podem ter favorecido a origem de moléculas mais complexas e,
posteriormente, determinadas reações podem ter sido favorecidas por
catalisadores presos no interior de membranas (Menck e Oliveira, 2001).
Bernal (1951) foi o primeiro a sugerir que superfícies minerais poderiam
ter sido de extrema relevância para o surgimento da vida na Terra. Desde
então, diversos estudos têm sido publicados sobre a interação entre
13
biomoléculas e superfícies minerais. Entre estes estudos, inclui-se, por
exemplo, a adsorção de aminoácidos sobre argilas (Lahav e Chang, 1976;
Henrichs e Sugai, 1993; Ben-Taleb et al., 1994; Zaia et al., 2002), e a adsorção
de bases de ácidos nucléicos sobre argilas (Prabahar e Ferris, 1997; Sowerby
et al., 2001a; Sowerby et al., 2001b). Todos estes estudos têm sugerido o
possível envolvimento de superfícies minerais na evolução química da vida
sobre a Terra primitiva.
1.2 Aminoácidos
Aminoácidos são os blocos construtivos (monômeros) das proteínas.
Nesse sentido pode-se entender sua importância para os seres vivos
modernos, uma vez que as proteínas constituem peças-chave na construção e
manutenção da vida como a conhecemos. O apropriado funcionamento de
qualquer célula viva depende do correto funcionamento de milhões de reações
que são catalisadas por biocatalisadores – a grande maioria destes
catalisadores são proteínas chamadas de enzimas. Tendo em mente o
princípio da continuidade biológica, assume-se que os aminoácidos tenham
servido como blocos de construção de alguns dos biocatalisadores primitivos,
similares em sua estrutura e funcionamento as proteínas contemporâneas
(Lahav, 1994).
Aminoácidos foram sintetizados em condição de reação que existiram na
Terra primitiva (Miller, 1953; Miller, 1987; Hennet et al. 1992) e têm sido
detectados em materiais extraterrestres que são trazidos a Terra (Cronin,
1998). De acordo com as estimativas de Dose (1975), a concentração de
14
aminoácidos no oceano primordial, levando-se em conta processos de
produção e destruição no qual estavam sujeitos, foi de aproximadamente 10
-7
mol L
-1
.
Todos os aminoácidos, com exceção da prolina têm como denominador
comum um grupamento carboxílico livre e um amino grupo livre não-substituído
no átomo de carbono α. Eles diferem uns dos outros na estrutura de suas
cadeias laterais distintas, denominadas grupamentos R. Uma das maneiras de
classificar os aminoácidos está baseada na polaridade do grupamento R
presente na estrutura. Existem quatro classes principais de aminoácidos:
aqueles (1) com grupos R não-polares ou hidrofóbicos, (2) com grupos R
neutros (sem carga) polares, (3) com grupos R carregados positivamente, e (4)
com grupos R carregados negativamente (em pH 6,0 a 7,0) (Lehninger, 1976).
A figura 1 apresenta alguns aminoácidos encontrados em proteínas e suas
estruturas.
Ácido Aspártico Alanina Glutamina Cisteína Metionina Lisina Hisidina
Figura 1: Estrutura química dos aminoácidos considerados no estudo.
Propriedade bastante importante dos aminoácidos é o seu
comportamento ácido-básico em solução aquosa, ocorrendo como íons
dipolares, ou zwitterions, apresentando cargas tanto positivas quanto negativas
na mesma molécula. Quando um aminoácido cristalino na forma de íons
15
dipolares é dissolvido em água, ele pode agir como um ácido ou uma base
(Lehninger, 1976). Os valores de pK
a
(logaritmo negativo da constante de
dissociação para os grupamentos –COOH, -NH
2
e -R) para cada etapa de
ionização e os valores de pI (ponto isoelétrico - pH no qual não há carga
elétrica efetiva na molécula do aminoácido) são dados na tabela 1 (Lide, 1998).
Em pHs acima do valor de pI, os aminoácidos tornam-se aniônicos, enquanto
que, abaixo do pI tornam-se catiônicos.
Tabela 1: Valores de pK
1
(α-COOH), pK
2
(α-NH
3
), pK
R
(outro grupo presente
na molécula) e pI para alguns aminoácidos.
Aminoácido pK
1
pK
2
pK
R
pI
Alanina 2.34 9.69 6.00
Ácido aspartico 1.88 9.60 3.65 2.77
Cisteína 1.96 10.28 8.18 5.07
Glutamina 2.17 9.13 5.65
Histidina 1.82 9.17 6.00 7.59
Lisina 2.18 8.95 10.53 9.74
Metionina 2.28 9.21 5.74
1.3 Bases Nitrogenadas
O material genético encontrado em todos os seres vivos reside em duas
macromoléculas: DNA e RNA. Estes ácidos nucléicos são os carregadores de
informação nas células. Sua informação é estrutural, isto é, na forma de uma
16
seqüência de diferentes monômeros ao longo do biopolímero linear (Lahav,
1994). Estes se constituem em fontes de informação química que pode ser
transmitida e reproduzida, se perpetuando no tempo e levando consigo a
informação do que é e como funciona a vida e o que esta selecionou durante
toda a sua evolução. Mesmo que DNA e RNA não tenham, muito
provavelmente, se formado quimicamente logo nas etapas iniciais da vida
sendo o produto de reações catalisadas (Cairn-Smith, 1982; Shapiro, 2000), o
primeiro sistema genético deve ter tido alguma semelhança ao RNA (Cairn-
Smith, 1982), isto é, a complexidade do sistema genético moderno deve ter
sido precedido por um sistema bastante simplificado (com moléculas simples e
um número limitado de reações) que passou por um longo processo de
evolução até o estágio atual (Lahav, 1994). Portanto, é lógico olhar para
aquelas que conferem individualidade química às unidades monoméricas tanto
do DNA quanto do RNA, isto é, as bases nitrogenadas.
As bases do RNA incluem duas purinas (adenina e guanina) e duas
pirimidinas (citosina e uracila), as quais são as mesmas do DNA exceto pela
troca da uracila pela timina. A figura 2 traz a estrutura das bases purínicas e
pirimidínicas predominantes em pH 7,0.
Figura 2: Estrutura das bases nitrogenadas estudadas
17
A síntese abiótica de purinas e, em menor quantidade, de pirimidinas é
possível a partir da condensação de HCN (Menck e Oliveira, 2001), as mesmas
reações que produzem aminoácidos (Levy et al., 2000). A figura 3 (Menck e
Oliveira, 2001) ilustra a síntese de purinas e pirimidinas.
N
N
O
O
N
N
N
N
N
NH
N
N
O
O
COOH
CO
2
Oligômeros de HCN
+ H
2
O
- H
2
O
Ácido Orótico
Uracila
Adenina
Luz
+
Figura 3: Esquema de síntese abiótica de purinas e pirimidinas.
As bases nitrogenadas são compostos fracamente básicos que,
dependendo do pH, podem ocorrer em duas ou mais formas tautoméricas
(Lehninger, 1976). Os valores de pH do meio afetam o estado de ionização das
bases, sendo cada estágio de ionização dado por seu valor de pK
a
(logaritmo
negativo da sua constante de dissociação). A tabela 2 (Lide, 1998) mostra os
valores de pK
a
para as bases consideradas.
18
Tabela 2: Valores de pK
a
para cada estágio de ionização das bases
nitrogenadas estudadas.
Base Valores de pK
a
Adenina <1 4,1 9,8
Citosina 4,5 12,2
Timina 9,9 >13
Uracila 0,5 9,5 >13
1.4 Argilo-Minerais: Candidatos a Evolução Química
Argilo-minerais foram formados abundantemente em eras geológicas
primitivas (Reynolds, 1988). Os tipos de minerais presentes sobre a Terra
primitiva não são conhecidos exatamente. Vários ambientes prebióticos têm
sido propostos, cada um com seus minerais associados. Entre os minerais que
estariam associados à origem da vida, encontram-se entre os mais populares
os argilo-silicatos, principalmente a montmorilonita, bentonita (esmectitas) e a
caulinita (Lahav, 1994).
A adsorção de ânions e cátions sobre a superfície carregada
(positivamente ou negativamente) dos argilo-minerais é considerada por muitos
como o primeiro estágio de uma variedade de reações prebióticas (Lahav,
1994).
A carga elétrica tanto dos íons orgânicos quanto das superfícies
minerais é dependente do pH do meio. Existe um determinado valor de pH em
que a quantidade de cargas elétricas positivas e negativas são iguais, esse
valor de pH, que é característico de cada argila, é denominado de ponto de
19
carga zero (p
cz
). Os principais grupos funcionais de superfície nos argilo-
minerais (bordas) que geram cargas dependentes de pH são os grupamentos
silanol (Si-OH) e Aluminol (Al-OH) (Meurer, 2000).
A caulinita é um mineral secundário (resultante da intemperização de um
mineral primário), constituída por lâminas tetraedrais de Si
4+
ligadas a lâminas
octaedrais de Al
3+
, através do compartilhamento de oxigênios apicais dos
tetraedros (figura 4A) sendo, portanto, um mineral do tipo 1:1. Devido a forte
interação entre as camadas, a caulinita não é expansível. Sua fórmula química
típica é Al
4
Si
4
O
10
(OH)
8
(Meurer, 2000).
Figura 4: (A) - Estrutura da caulinita (1:1). (B) – Estrutura das esmectitas (2:1).
A montmorilonita e a bentonita (esmectitas) são também minerais
secundários, mas, do tipo 2:1 (figura 4B). As substituições isomórficas do Al
3+
por Fe
2+
e Mg
2+
na lâmina octaedral dão origem às cargas negativas, que vão
se manifestar na superfície do mineral, sendo, por isso, mais fracas. Assim as
esmectitas são expansíveis. A grande expansividade das camadas permite a
entrada de cátions e moléculas. A montmorilonita é o mineral mais expressivo
20
do grupo, e sua fórmula típica é M
x
Al
3,2
Fe
0,2
Mg
0,2
O
20
(OH)
4
, onde x, é a carga
líquida da camada, varia de 0,5 – 1,2 (Meurer, 2000).
Outra característica dos argilo-minerais que afeta a magnitude da
capacidade de troca de íons está relacionada à sua área superficial específica
(ASE). No caso dos argilo-minerais expansíveis, tal como as esmectitas, a ASE
é maior devido às superfícies internas entre as camadas. Na caulinita, a ASE é
menor, pois esse argilo-mineral não é expansível e somente expõe a superfície
externa (Meurer, 2000).
A tabela 3 traz valores de p
cz
(Santana et al., 2005) e ASE (Acros
Organics, 2007) das argilas aqui estudadas.
Tabela 3: Valores de p
cz
e ASE dos argilo-minerais considerados neste
estudado.
Argila p
cz
ASE (m
2
/g)
Caulinita 4,52 20
Montmorilonita 1,47 10
Bentonita 1,88 240
1.5 Isotermas de Adsorção
A adsorção dos íons em argilas pode ser representada, graficamente,
por isotermas de adsorção, que relacionam a quantidade do íon adsorvido à
fase sólida (
θ) com sua concentração na solução (C
sol
), numa determinada
temperatura (
T). Existem vários modelos de isotermas de adsorção, tais como,
o de Langmuir e o modelo de Freundlich. O modelo de Langmuir sugere uma
21
adsorção monocamada, sem nenhuma interação lateral entre as moléculas
sorvidas. O modelo de Freundlich assume uma adsorção heterogênea devido à
diversidade dos sítios de sorção ou a natureza diversa dos íons adsorvidos,
espécies livres ou hidrolisadas (Sodré
et al., 2001; Namasivayam e Sangeetha,
2005).
O modelo de Langmuir é expresso pela seguinte equação linearizada:
C
sol
/θ = 1/Kb + C
sol
/b
Onde K pode ser relacionado a energia de ligação e b a capacidade
máxima de adsorção do íon na argila. Considerando
C
sol
/θ como variável
dependente e
C
sol
como variável independente, obtêm–se os valores de K e b,
onde
1/Kb é o coeficiente linear e 1/b é o coeficiente angular da reta (Sodré et
al., 2001; Namasivayam e Sangeetha, 2005).
A isoterma de Freundlich linearizada é expressa como:
Log θ = log K
f
+ 1/n log C
sol
Onde n indica, qualitativamente, a reatividade dos sítios energéticos na
argila e
K
f
pode sugerir a adsorção do íon no solo. No gráfico de log θ versus
log C
sol
, obtêm-se os valores de K
f
e n, onde log K
f
é o coeficiente linear e 1/n
é o coeficiente angular da reta (Sodré
et al., 2001; Namasivayam Sangeetha,
2005).
22
1.6 Adsorção de Biomoléculas Sobre Superfícies Minerais
Presume-se que o processo de adsorção é o primeiro estágio de uma
grande variedade de reações prebióticas (Lahav, 1994) uma vez que, devido a
sua superfície eletricamente carregada, argilo-minerais podem adsorver
moléculas orgânicas provenientes da água ao redor, concentra-las muitas
vezes e fornecer um ambiente catalítico de ocorrência natural para a formação
de grandes moléculas, incluindo os blocos de construção da vida, os
peptídeos/proteínas e moléculas informacionais auto-replicantes, os
nucleotídeos/RNA por exemplo (Bernal,1951; Rao
et al., 1980; Cairns-Smith,
1982; Ferris, 1993).
1.6.1 Adsorção de aminoácidos sobre argilas
Desde que Bernal (1951) primeiramente sugeriu que argilo-minerais
poderiam ter tido um papel importante na origem da vida, uma vez que, estes
poderiam participar de processos tais como a seleção e a pré-concentração de
monôneros a partir de uma solução diluída e, sua subseqüente condensação
para a formação de biopolímeros, diversos estudos vêm sendo realizados.
Pode ser apontado que o estudo da formação de aminoácidos e sua
condensação para formar peptídeos/proteínas são importantes para a química
prebiótica devido ao fato de que a maior parte das reações dos seres vivos
atuais envolve aminoácidos/peptídeos/proteínas (Darnell
et al., 1990).
Numerosos artigos sobre a adsorção de aminoácidos em
minerais/argilas/sedimentos têm sido publicados. Alguns exemplos são:
23
Ala/Gly/Ser/Phe/His sobre β-FeOOH.Cl
n
(Holm et al., 1983); diversos
aminoácidos sobre argilas (Paecht-Horowitz, 1978; Aufdenkampe
et al., 2001;
Ding e Henrichs, 2002); Lys/Leu/Asp sobre dióxido de titânio (Rogacheva e
Bobyrenko, 1985); aminoácidos sobre hidróxiapatita/calcita/albita (Tanaka
et
al., 1989; Churchill et al., 2004); Gly/Lys/Glu sobre hematita (Ben-Taleb et al.,
1994); vinte aminoácidos protéicos sobre sílica gel/poli A (Mellersh e Wilkinson,
2000); vários aminoácidos sobre diversos sedimentos de rio e do mar (Henrichs
e Sugai, 1993; Aufdenkampe
et al., 2001; Montluçon e Lee, 2001; Ding e
Henrichs, 2002) e diversos aminoácidos sobre sílica/quartzo/areia (Basiuk e
Gromovoy, 1996; Basiuk, 2002; Zaia
et al., 2002; Churchill et al., 2004). Em
geral, todos estes artigos mostram que aminoácidos com grupo R carregado
positivamente ou negativamente adsorvem mais que outros tipos de
aminoácidos.
Um estudo publicado por Klappler (1977) tratando da ocorrência média
de aminoácidos em aproximadamente 200 proteínas mostrou que as proteínas
atuais são compostas por 74% de aminoácidos com grupo R não-carregado.
Entretanto, baseado nos estudos anteriormente mencionados deveríamos
esperar uma maior obtenção de peptídeos com grupo R carregado do que não-
carregado, uma vez que, minerais adsorvem muito mais aminoácidos com
grupo R carregado positivamente ou negativamente. Como discutido por Zaia
et al., 2002; Zaia, 2004; Zaia e Zaia, 2006 estes resultados levantam algumas
dúvidas quanto ao papel dos minerais em fornecer um mecanismo de
concentração de aminoácidos: quais foram os mecanismos envolvidos na
produção de peptídeos/proteínas com muito mais aminoácidos com grupo R
não-carregado do que carregado? Poderíamos esperar que a composição dos
24
aminoácidos adsorvidos sobre minerais refletisse a das proteínas atuais? A
adsorção de aminoácidos sobre minerais foi importante para a origem da vida?
Entretanto, como apontado por Zaia (2004) e Zaia e Zaia (2006) muitos dos
estudos de adsorção de aminoácidos foram conduzidos em condições longe
das reais.
A presente dissertação descreve a adsorção de aminoácidos (Ala,
alanina; Met, metionina; Gln, glutamina; Cys, cisteína; Asp, ácido aspártico;
Lys, lisina e His, histidina) sobre argilas (bentonita e caulim) em três faixas de
pH (3,00, 6,00 e 8,00). Estes foram escolhidos de forma a representar as
quatro classes principais de aminoácidos. Os aminoácidos foram dissolvidos
em água do mar artificial contendo todos os elementos mais abundantes. Até
onde sabemos, não existem artigos descrevendo a adsorção de aminoácidos
em condições tão próximas da real como aqui utilizado, assim como a
utilização de uma grande variedade de aminoácidos e uma larga faixa de pH. A
presente dissertação também mostra um estudo da interação de
aminoácidos/argilas usando espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourrier (FT-IR), espectroscopia Mössbauer e difratometria de
raios-X.
1.6.2 Adsorção de bases nitrogenadas sobre argilas
Moléculas capazes de armazenar informação genética (RNA e DNA, por
exemplo) são imprescindíveis para a evolução química que culminou com o
surgimento da vida na Terra. A formação destas moléculas requereu condições
muito específicas, incluindo a síntese e a concentração de precursores, a
25
polimerização destes, sua proteção contra a degradação (forte radiação) e o
seu potencial de multiplicar e evoluir (Franchi
et al., 2003).
Uma das tarefas da química prebiótica é tentar entender como essas
bases nitrogenadas, uma vez formadas abióticamente na Terra primitiva, foram
protegidas da degradação hidrolítica, ocasionando um aumento da taxa de
produção/destruição, o que possibilitou a formação de nucleotídeos de ácidos
nucléicos e, em última análise, a presença destes monômeros no material
genético dos seres vivos.
Argilas são consideradas por muitos autores como tendo um papel
importante na preservação e evolução de biomoléculas para o surgimento da
vida. As bases nitrogenadas formadas abioticamente seriam suscetíveis de
degradação hidrolítica (Shapiro, 1995). A adsorção de bases nitrogenadas
(presentes no material genético dos seres vivos) sobre a superfície de argilas
poderia então protege-las da hidrólise (Sowerby
et al., 2002a) e dos fótons UV
altamente energéticos, capazes de quebrar ligações covalentes (Lahav, 1994).
Na literatura encontram-se diversos estudos sobre a adsorção das
diversas bases nitrogenadas sobre diferentes sólidos inorgânicos. Entre estes
trabalhos encontram-se, por exemplo, a adsorção de bases (purínicas e
pirimidínicas) sobre: grafita (Heckl
et al., 1991; Sowerby et al., 1996; Sowerby
et al., 1997; Sowerby et al., 1999; Sowerby et al., 2001a; Sowerby et al., 2002a;
Srinivasan
et al., 1991); dissulfeto de molibdênio (Sowerby et al., 1996;
Sowerby
et al., 1997; Sowerby et al., 1999; Sowerby et al., 2000; Heckl et al.,
1991); ouro cristalino (Tao
et al., 1993); argilas (Lahav e Chang, 1976;
Perezgasga
et al., 2005; Winter e Zubay, 1995); platina (Saffarian et al., 2001);
zeólitas (Komiyama
et al., 1998); pirita, quartzo, pirrotita, magnetita e fosterita
26
(Cohn et al., 2001); Em geral, todos estes estudos mostram que as bases
nitrogenadas adsorvem espontaneamente a partir do meio aquoso sobre
superfícies minerais, podendo ocorrer a formação de um arranjo ordenado das
mesmas, estabilizado por ligações de hidrogênio entre as bases adjacentes e
que podem possuir a complexidade aperiódica para codificar informação
(Sowerby e Petersen, 2002b). Alem disso, efeitos de temperatura e do tipo de
sólido inorgânico devem ser levados em conta na disponibilidade prebiótica das
bases nitrogenadas (Sowerby
et al., 2001b).
Nesta dissertação, a adsorção de bases nitrogenadas (
A, adenina; C,
citosina; T, timina e U, uracila) sobre argilas (caulim, bentonita e
montmorilonita) foi estudada em duas faixas de pH (2,00 e 7,20). Estas bases
foram escolhidas devido a sua presença no material genético dos seres vivos
conhecidos. As bases nitrogenadas foram dissolvidas em água do mar artificial
contendo todos os elementos mais abundantes. Dois modelos de isotermas de
adsorção foram empregados neste estudo: Langmuir e Freundlich. Análises por
espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourrier (FT-IR) foram
conduzidas na tentativa de melhor compreender a interação das bases com a
superfície mineral.
27
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
• Estudar a adsorção de aminoácidos e bases nitrogenadas
sobre argilas em água do mar, em diversas faixas de pH.
• Estudar a interação de aminoácidos e bases nitrogenadas
com argilas, utilizando diversas técnicas espectroscópicas.
2.2 Objetivos Específicos
• Quantificar a magnitude da adsorção de aminoácidos e
bases nitrogenadas sobre argilas.
• Obter isotermas de adsorção das bases nitrogenadas
sobre argilas, estimando os parâmetros de Langmuir e
Freundlich.
• Correlacionar a magnitude da adsorção de aminoácidos e
bases nitrogenadas sobre argilas com as variações de pH.
• Correlacionar os dados obtidos na adsorção de
aminoácidos e bases nitrogenadas sobre argilas com a
distribuição dos mesmos em proteínas e DNA/RNA dos
seres vivos.
• Caracterizar a interação de grupamentos presentes nos
aminoácidos e bases nitrogenadas com os sítios de
adsorção da superfície do argilo-mineral por
espectroscopia de infravermelho, espectroscopia
Mössbauer e difratometria de raios-X.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Argilas
Todas as argilas foram utilizadas sem preparo prévio. O caulim
foi doado
pelo Dr. Carlos H. Sampaio do LAPROM/CT-UFRGS-RS. A montmorilonita e a
bentonita foram adquiridas da Acros Organics-NJ, EUA. Caulim; Composição
química: SiO
2
=45,7%, Al
2
O
3
=38,9%, Fe
2
O
3
=0,3%, CaO=0,1%, MgO=0,1%,
Na
2
O=0,1%, K
2
O=0,6%, TiO
2
=0,2%; área superficial = 20 m
2
/g. Bentonita;
Composição química: SiO
2
=73,0%, Al
2
O
3
=14,0%, Fe
2
O
3
=2,7%, CaO=0,2%,
MgO=1,1%, Na
2
O=0,6%, K
2
O=1,9%; área superficial = 240m
2
/g (Acros
Organics). Montmorilonita; composição química: SiO
2
=54,0%, Al
2
O
3
=17,0%,
Fe
2
O
3
=5,2%, CaO=1,5%, MgO=2,5%, Na
2
O=0,4%, K
2
O=1,5%; área superficial
= 10 m
2
/g (Acros Organics).
3.1.2 Reagentes
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico (P.A).
3.1.3 Aminoácidos
Todos os L-aminoácidos foram adquiridos da Synth (Brasil) ou Nuclear
(Brasil) e foram usados sem tratamento prévio. As abreviações para os
29
aminoácidos são dadas de acordo com as recomendações da comisão IUPAC-
IUB para nomenclatura bioquímica: Ala, alanina; Met, metionina; Gln,
glutamina; Cys, cisteína; Asp, ácido aspártico; Lys, lisina; His, histidina.
3.1.4 Bases Nitrogenadas
Todas as bases foram utilizadas sem tratamento prévio. Adenina
(99,5%), citosina (99%) e timina (99%) foram adquiridas da Acros Organics
(E.U.A.) e a uracila (mínimo 99%) da Sigma (Canada). As abreviações para as
bases nitrogenadas são dadas de acordo com as recomendações da comisão
IUPAC-IUB para nomenclatura bioquímica:
A, Adenina; C, Citosina; T, Timina;
U, Uracila.
3.1.5 Preparo de Amostras
3.1.5.1 Aminoácidos
Os aminoácidos (Ala, Met, Gln, Cys, Asp, Lys ou His) foram dissolvidos
em água do mar na concentração de 240
µg mL
-1
e solução saturada. Cada
tubo com argila (caulim ou bentonita) foi preparado como segue: em três séries
diferentes de tubos de centrifuga de 15 mL (quadriplicatas) contendo 500 mg
de argila (caulim ou bentonita) foram adicionados: a) 5,00 mL de água do mar;
b) 5,00 mL de solução 240
µg mL
-1
de aminoácido (Ala, Met, Gln, Cys, Asp, Lys
ou His) em água do mar; c) 5,00 mL de água do mar saturada de aminoácido
(Ala, Met, Gln, Cys, Asp, Lys ou His). O pH foi ajustado a 3,00, 6,00 ou 8,00
30
pela adição de HCl ou NaOH. Os tubos foram agitados mecanicamente por 24
h; em seguida, foram centrifugados por 15 min a 2000 rpm; a fase aquosa foi
então usada para análise de concentração de aminoácido enquanto que a fase
sólida foi seca numa estufa a 40
°C por 24 h e usada para análises de FT-IR. As
amostras sólidas de bentonita/Cys foram também utilizadas na obtenção dos
difratogramas de raios-x e dos espectros Mössbauer.
3.1.5.2 Bases Nitrogenadas
As bases nitrogenadas (
A, C, T ou U) foram dissolvidas em água do mar
na concentração de 240
µg mL
-1
ou 720 µg mL
-1
e solução saturada. As
isotermas foram obtidas através da utilização de dois métodos.
Método 1: Variação da massa mantendo-se a concentração da base
nitrogenada fixa. Cada série com argila (caulim, montmorilonita ou bentonita)
foi preparada como segue: em cinco tubos de centrifuga de 15 mL (todos em
duplicatas) foram adicionados diferentes massas de argila na faixa de 10 a
1500 mg e então foram adicionados: a) 5,00 mL de solução 240
µg mL
-1
de
base (
A, C, T ou U), no caso das argilas bentonita e montmorilonita, ou b) 5,00
mL de solução 720
µg mL
-1
de base (A, C, T ou U) no caso da argila caulim.
Método 2: Variação da concentração da base nitrogenada mantendo-se
a massa de argila fixa. Cada série com argila (montmorilonita ou bentonita) foi
preparada como segue: em cinco tubos de centrifuga de 15 mL (todos em
duplicata) contendo 100 mg de argila (montmorilonita ou bentonita) foram
adicionados 5,00 mL de solução de base (
T ou U) em água do mar de
concentração variando na faixa de 240 a 720
µg mL
-1
.
31
O pH das amostras assim preparadas foi então ajustado a 2,00 ou 7,20
pela adição de HCl ou NaOH; os tubos foram agitados mecanicamente por 3 h
para montmorilonita e bentonita e 16 h para o caulim mantendo a temperatura
constante (T = 40
°C); em seguida, foram centrifugados por 15 min a 2000 rpm;
a fase aquosa foi então usada para análise de concentração de base
nitrogenada e a fase sólida foi seca numa estufa a 40
o
C por 24 h e usada para
análises de FT-IR.
3.1.5 Soluções
Todas as soluções foram preparadas com água deionizada e reagentes
de grau analítico (P.A) de acordo com cada metodologia citada.
Solução de água do mar: As seguintes substâncias foram pesadas e
dissolvidas em um balão volumétrico de 1,0 L com água deionizada: 21,57 g de
cloreto de sódio; 3,88 g de cloreto de magnésio; 1,787 g de sulfato de
magnésio; 1,308 g de sulfato de cálcio; 0,832 g de sulfato de potássio; 0,124 g
de carbonato de cálcio; 0,103 g de brometo de potássio e 0,0282 g de ácido
bórico.
Solução de aminoácido (240 µg mL
-1
): foram pesados 24,0 mg de
aminoácido (Ala, Met, Gln, Cys, Asp, Lys ou His) e transferidos para um balão
volumétrico de 100 mL. Em seguida, o volume foi completado com água do
mar.
32
Solução de base nitrogenada (240 µg mL
-1
): foram pesados 24,0 mg de base
nitrogenada (
A, C, T ou U) e transferidos para um balão volumétrico de 100
mL. Em seguida, o volume foi completado com água do mar.
Solução de base nitrogenada (720 µg mL
-1
): foram pesados 72,0 mg de base
nitrogenada (
A, C, T ou U) e transferidos para um balão volumétrico de 100
mL. Em seguida, o volume foi completado com água do mar.
Solução de ninhidrina: foram pesados 0,60 g de ninhidrina e transferidos para
um béquer. Em seguida, foram adicionados através de uma pipeta volumétrica
10,0 mL de etanol.
Solução de p-benzoquinona (0,10 mol L
-1
): foram pesados 11,0 mg de p-
benzoquinona para cada 1,0 mL de dimetilsulfóxido.
Solução tampão de fosfato (0,10 mol L
-1
): foram pesados 6,90 g de fosfato
de sódio monobásico e transferidos para um balão volumétrico de 500 mL. Em
seguida, o volume foi completado com água deionizada e o pH ajustado para
6,00 mediante acréscimo de ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio.
Solução de ácido acético (0,10 mol L
-1
): em um balão volumétrico foram
diluídos 2,86 mL de ácido acético concentrado em água deionizada e o volume
completado para 500 mL.
Solução de HCl (0,10 mol.L
-1
): em um balão volumétrico foram diluídos 8,26
33
mL de HCl em água deionizada e o volume foi completado para 1,0 L.
Solução de HCl (1,0 mol.L
-1
): em um balão volumétrico foram diluídos 82,6 mL
de HCl em água deionizada e o volume foi completado para 1,0 L.
Solução de HCl (2,0 mol.L
-1
): em um balão volumétrico foram diluídos 165,2
mL de HCl em água deionizada e o volume foi completado para 1,0 L.
Solução de HCl (3,0 mol.L
-1
): em um balão volumétrico foram diluídos 247,8
mL de HCl em água deionizada e o volume foi completado para 1,0 L.
Solução de NaOH (0,01 mol.L
-1
): foram pesados 0,40 g de NaOH e
transferidos para um balão volumétrico de 1,0 L. Em seguida, o volume foi
completado com água deionizada.
Solução de NaOH (0,10 mol.L
-1
): foram pesados 4,00 g de NaOH e
transferidos para um balão volumétrico de 1,0 L. Em seguida, o volume foi
completado com água deionizada.
Solução de NaOH (1,0 mol.L
-1
): foram pesados 40,00 g de NaOH e
transferidos para um balão volumétrico de 1,0 L. Em seguida, o volume foi
completado com água deionizada.
Solução de NaOH (2,0 mol.L
-1
): foram pesados 80,00 g de NaOH e
transferidos para um balão volumétrico de 1,0 L. Em seguida, o volume foi
34
completado com água deionizada.
Solução de NaOH (3,0 mol.L
-1
): foram pesados 120,00 g de NaOH e
transferidos para um balão volumétrico de 1,0 L. Em seguida, o volume foi
completado com água deionizada.
3.1.7 Equipamentos
Foram utilizados para a aquisição de dados: espectrofotômetros UV-Vis
1203 e FT-IR 8300 ambos da Shimadzu; espectrômetro Mössbauer
convencional; difratômetro de raios-X Shimadzu D6000; potenciômetro CQA -
pH 2000; balança analítica AND - HR 200; centrifuga QUIMIS - Q-222T1;
agitador mecânico para tubos (movimento em vertical - 360
o
) e estufa Neuoni -
NV 1,5.
3.2 Métodos
3.2.1 Espectroscopia UV-Vis
Os aminoácidos (Ala, Met, Gln, Asp, Lys e His) foram quantificados
utilizando o método da ninhidrina como descrito por Fisher
et al. (1963) e Cys
foi determinada usando o método da p-benzoquinona como descrito por Zaia
et
al. (1999). As bases nitrogenadas foram quantificadas por leitura direta na
região UV (faixa de 260 – 270 nm). A quantidade de espécie adsorvida na
argila foi calculada pela seguinte equação:
35
C
adsorvida
= C
inicial
– C
solução
C
solução
= [(C
branco
)(Abs
amostra
)/(Abs
branco
)]
onde: C = concentração e Abs = absorbância.
3.2.2 Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)
Os espectros foram obtidos utilizando discos de KBr prensados e
resolução espectral de 4 cm
-1
sendo que cada espectro foi obtido após 120
aquisições. As análises foram conduzidas em amostras com e sem
aminoácidos/bases adsorvidos como descrito anteriormente no preparo das
amostras. Aproximadamente 10 mg de amostra e 200 mg de KBr foram
pesados e então, triturados num almofariz com um pistilo até a completa
homogeneização. Pastilhas foram preparadas e os espectros obtidos de 400 a
4000 cm
-1
. Os espectros FT-IR foram analisados no programa Origin (5.0,
2001).
3.2.3 Difratometria de raios-X
Prepararam-se lâminas para análise de difração de raios-x pelo método
do esfregaço. O material na forma de pó, de cada amostra, foi colocado na
superfície de lâminas de vidro e, após adição de algumas gotas de água
deionizada para umedecimento, foi orientado pressionando e deslizando
suavemente outra lâmina de vidro sobre sua superfície, e em seguida foi
colocado para secar a 25
o
C.
36
Difratogramas de raios-X foram obtidos no modo passo de 2 a 30
o
2θ,
0,6 s a cada 0,02
o
2θ. O equipamento possui uma fonte de Cu e filtro de Ni.
Após a análise das amostras originais, todas foram colocadas em um
dessecador com etileno glicol líquido para expansão na presença da molécula
orgânica polar (Whitting e Allardice, 1986) por 24 h. Após, obteve-se nova
leitura no difratômetro.
Os arquivos de cada difratograma foram utilizados para o cálculo do
espaçamento basal (d
001
) das bentonitas utilizando o software Grams/386 v 4.0
(Galactic Ind. Corp) assumindo um formato log-normal para os picos de
reflexão.
3.2.4 Espectroscopia Mössbauer
A espectroscopia Mössbauer foi realizada na geometria de transmissão,
em um espectrômetro Mössbauer convencional, operando em modo de
aceleração constante. Os raios-
γ foram obtidos de uma fonte
57
Co(Rh). Os
espectros Mössbauer foram analisados por uma rotina de mínimos quadrados
linear com forma de linha Lorentziana. Todos os dados de desvio isomérico (IS)
são dados em relação ao α-Fe nesta dissertação.
3.2.5 Análise Estatística
Comparações entre as médias foram alcançadas utilizando: ANOVA e o
teste Student-Newman-Keuls (teste S.N.K) ao nível de significância de p<0,05.
37
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Adsorção de Aminoácidos Sobre Argilas
4.1.1 Adsorção
As tabelas 4 e 5 mostram a adsorção de aminoácidos (Ala, Met, Gln,
Cys, Asp, Lys, His) dissolvidos em água do mar a diversas faixas de pH (3,00;
6,00 e 8,00) sobre caulim e bentonita respectivamente. Deve-se ressaltar que
na literatura existem diversos trabalhos sobre a adsorção de aminoácidos
sobre minerais, entretanto, dos trabalhos conhecidos, nenhum utiliza condições
tão próximas da real quanto às utilizadas aqui. Os experimentos foram
conduzidos sem a utilização de tampões e num grande intervalo de pH. A
água do mar sintética usada neste trabalho contém todos os elementos de
maior concentração presentes naturalmente.
A concentração de Ala (grupo R alifático não-polar), Cys (grupo R polar
não-carregado) e Asp (grupo R carregado negativamente) adsorvidos sobre
caulim assim como Cys e Asp adsorvidos sobre bentonita não sofreram
alteração nos pHs estudados (tabelas 4 e 5) (S.N.K.>0,05). No caso do Asp isto
pode ser devido ao fato de que o ponto isoelétrico pI=2,77, o pK
a
(-COOH)=1,88
e o pK
a
(-NH
3
+
)=9,60 estão fora da faixa de pH estudados (Lehninger et al.,
1993). Como determinado por Santana
et al. (2006) o ponto de carga zero (p
cz
)
para bentonita e caulim é de 1,88 e 4,52, respectivamente. Apesar do p
cz
do
caulim estar dentro da faixa de pH estudado aqui, deve-se notar que a
determinação do p
cz
depende da metodologia utilizada, o que, para o caulim
38
Tabela 4: Quantidade em µg de aminoácidos adsorvidos em 500 mg de caulim
em três faixas de pH.
Grupo-R Aminoácido
#
pH em
tempo t=0*
Faixa de
pH**
Quantidade
adsorvida (µg)
3,00
2,56-3,45
192,3
±21,8 (6)
A
6,00
5,45-7,02
163,3
±10,6 (4)
Alifático não-
polar
Alanina
8,00
7,70-8,41
243,2
±31,7 (7)
β,γ,π,θ
3,00
2,77-3,08
149,3
±22,7 (6)
a,B,C
6,00
5,70-6,71
31,7
±13,3 (7)
a
Metionina
8,00
8,00-8,52
235,7
±17,1 (5)
a,β,γ,π,χ
3,00
3,17-3,32
494,3
±62,2 (4)
b,G
6,00
5,99-6,39
220,8
±16,6 (4)
a,∇
Glutamina
8,00
7,86-8,54
397,1
±48,7 (4)
b,α
3,00
2,67-3,11
1109,8
±69,9 (4)
6,00
6,53-6,72
1154,6
±19,9 (5)
Polar não-
carregado
Cisteína
8,00
8,06-8,34
1193,4
±3,6 (5)
3,00
2,45-3,35
429,3
±31,9 (3)
H
6,00
6,53-6,72
268,5
±13,4 (5)
Carregado
negativamente
Ácido
Aspártico
8,00
7,80-8,25
321,5
±56,5 (8)
β,φ
3,00
2,82-3,07
219,1
±46,1 (5)
b,B,D,E
6,00
5,32-5,63
453,9
±19,7 (4)
a
Lisina
8,00
7,86-8,26
318,0
±13,4 (4)
b, β,γ,µ
3,00
2,89-3,38
207,0
±41,6 (7)
a,B,D,F
6,00
6,35-7,05
531,2
±45,2 (5)
a
Carregado
positivamente
Histidina
8,00
8,05-8,42
893,7
±78,0 (7)
a
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. O
número de séries é dado entre parênteses com quatro amostras cada série.
#
Aminoácidos (1200 µg/ 5,0 mL) foram dissolvidos em água do mar como
descrito na metodologia. *pH ajustado em tempo t=0. **As faixas de pH após as
amostras serem agitadas por 24 h. Teste SNK (p<0,05) Teste ANOVA para Ala
(F=2,19, P=0,149); Teste ANOVA para Met (F=32,79, P=0,000), teste SNK a/a;
Teste ANOVA para Gln (F=8,85, P=0,007), teste SNK a/b; Teste ANOVA para
Cys (F=1,28, P=0,317); Teste ANOVA para Asp (F=1,68, P=0,225); Teste
ANOVA para Lys (F=12,43, P=0,002), teste SNK a/b; Teste ANOVA para His
(F=35,80, P=0,000), teste SNK a/a. Para todos os aminácidos na faixa de pH
3,00 teste ANOVA (F=55,16, P=0,000) e teste SNK (p>0,05) A/B, C/D, E/F e
G/H; Teste ANOVA para todos os aminoácidos na faixa de pH 6,00 (F=282,02,
P=0,000) e teste SNK (p>0,05)
∇/; Teste ANOVA para todos os aminoácidos
na faixa de pH 8,00 (F=50,61, P=0,000) e teste SNK (p>0.05)
α/β, φ/γ, µ/π e
θ/χ.
39
Tabela 5: Quantidade em µg de aminoácidos adsorvidos em 500 mg de
bentonita em três faixas de pH.
Grupo-R Aminoácido
#
PH em
tempo t=0*
Faixa de
pH**
Quantidade adsorvida
(µg)
3,00
2,48-3,21
245,1
±35,0 (5)
b,E
6,00
6,04-6,53
147,4
±13,9 (5)
a
Alifático não-
polar
Alanina
8,00
7,50-8,50
260,6
±22,4 (6)
b,α
3,00
2,73-3,12
521,3
±59,4 (7)
a,B,C
6,00
5,90-6,69
293,1
±32,7 (6)
a,∇
Metionina
8,00
8,15-8,48
672,9
±43,4 (5)
a
3,00
2,79-3,82
266,1
±11,3 (6)
b,F
6,00
6,33-6,83
321,1
±42,6 (7)
b,
Glutamina
8,00
7,84-8,33
508,6
±22,5 (4)
a,φ
3,00
2,81-2,93
1185,8
±14,2 (3)
6,00
6,00-6,22
1155,7
±10,6(5)
Polar não-
carregado
Cisteína
8,00
8,24-8,42
1173,5
±16,0 (5)
3,00
2,65-2,96
607,2
±38,6 (4)
A
6,00
6,55-6,95
468,2
±42,6 (4)
Carregado
negativamente
Ácido
Aspártico
8,00
7,95-8,25
477,2
±44,8 (6)
γ
3,00
2,83-2,89
785,4
±39,4 (6)
b
6,00
6,44-6,95
806,0
±35,5 (5)
b
Lisina
8,00
8,00-8,32
1007,4
±12,2 (4)
a
3,00
2,46-3,37
551,6
±41,0 (5)
a,B,D
6,00
6,74-7,94
928,6
±42,9 (6)
a
Carregado
positivamente
Histidina
8,00
8,02-8,32
273,1
±21,5 (5)
a,β
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. O
número de séries é dado entre parênteses com quatro amostras cada série.
#
Aminoácidos (1200 µg/ 5,0 mL) foram dissolvidos em água do mar como
descrito na metodologia. *pH ajustado em tempo t=0. **As faixas de pH após as
amostras serem agitadas por 24 h. Teste SNK (p<0,05) Teste ANOVA para Ala
(F=5,90, P=0,015), teste SNK a/b.; Teste ANOVA para Met (F=13,99, P=0,000),
teste SNK a/a; Teste ANOVA para Gln (F=12,06, P=0,000), teste SNK a/b;
Teste ANOVA para Cys (F=1,07, P=0,380); Teste ANOVA para Asp (F=2,82,
P=0,103); Teste ANOVA para Lys (F=10,91, P=0,002), teste SNK a/b; Teste
ANOVA para His (F=79,09, P=0,000), teste SNK a/a. Teste ANOVA para todos
os aminoácidos na faixa de pH 3,00 (F=44,02, P=0,000) e teste SNK (p>0,05)
A/B, C/D e E/F; Teste ANOVA para todos os aminoácidos na faixa de pH 6,00
(F=109,49, P=0,000) e teste SNK (p>0,05)
∇/; Teste ANOVA para todos os
aminoácidos na faixa de pH 8,00 (F=127,0, P=0,000) e teste SNK (p>0.05)
α/β
e
φ/γ.
40
estes valores podem variar de 2,7 a 4,5 (Parks, 1967; Appel et al., 2003;
Santana
et al., 2006). Assim, o p
cz
para ambas as argilas pode estar fora da
faixa de pH usada neste trabalho, o que indicaria (no caso de p
cz
<3,00)
uma
carga superficial negativa em todas as faixas estudadas. Também devemos
destacar que o pK
R
para o Asp é de 3,65 e na faixa de pH 3,00 para ambas as
argilas a adsorção de Asp foi pouco maior que a das outras faixas de pH
(tabela 4 e 5). Assim, a adsorção constante de Asp sobre argilas (caulim e
bentonita) observada na faixa de pH (3,00 – 8,00) foi provavelmente devido a
constante carga superficial das argilas (carga negativa) e das moléculas de Asp
–
-
OOC(CH
2
)(H)C
∝
(NH3
+
)COO
-
. Rogacheva e Bobyrenko (1985) estudaram a
adsorção de alguns aminoácidos, incluindo o Asp, sobre dióxido de titânio e
observaram que a adsorção diminui com o aumento do pH. Entretanto, Ben-
Taleb
et al. (1994) mostraram que a adsorção de Glu (grupo R carregado
negativamente) sobre hematita foi máxima em pH próximo ao pI do
aminoácido.
A quantidade de Cys (grupo R polar não-carregado) adsorvida sobre o
caulim e bentonita (tabelas 4 e 5) não se alterou com a variação de pH,
provavelmente devido à elevada capacidade de adsorção deste aminoácido
sobre minerais, tal como apontado por Basiuk (2002), o grupo tiol da Cys
diminui o
∆G°
ads
, e conseqüentemente, aumenta a adsorção deste aminoácido.
Não há uma explicação simples para a não variação da adsorção de Ala
sobre o caulim com o pH (tabela 4). Tanaka
et al. (1989) também mostraram
que a adsorção de Ala sobre hidróxiapatita foi praticamente independente do
pH da solução. Grzegorczyk e Carta (1996) estudaram a adsorção de alguns
aminoácidos (Leu, grupo R não-polar; Phe, Grupo R aromático; Try, grupo R
41
aromático) sobre uma série de adsorventes poliméricos porosos e mostraram
que as isotermas são essencialmente independentes do pH.
A adsorção de Met e Gln, ambos os aminoácidos com grupos R não-
carregados, sobre o caulim e também Ala e Met sobre bentonita na faixa de pH
6,00 foi menor que nas outras faixas estudadas (pH 3,00 e 8,00) (S.N.K.<0,05)
(tabelas 4 e 5). Há de se observar que um mínimo na magnitude da atração ou
repulsão eletrostática pode ocorrer próximo do p
cz
das argilas e do pI dos
aminoácidos em sistemas onde a adsorção é governada por interações
eletrostáticas (Churchill
et al., 2004). Assim, com os valores de pI para Met e
Gln, 5,74 e 5,65 (tabela 1) respectivamente, e considerando-se o valor de p
cz
para o caulim de 4,52 (tabela 3) podemos entender que em pH 6,00 ocorre um
mínimo da atração entre Met, Gln e caulim. A adsorção de Gln (grupo R polar
não-carregado) sobre bentonita na faixa de pH 8,00 foi maior do que em outras
faixas de pH (3,00 e 6,00) (S.N.K.<0,05) (tabela 5). Diversos outros estudos
também mostram a influência do pH sobre a adsorção de aminoácidos em
superfícies de sólidos inorgânicos. Rogacheva e Bobyrenko (1985) mostraram
que a adsorção de Leu (grupo R alifático não-polar) sobre dióxido de titânio
diminuiu com o aumento do pH. Por outro lado, Ben-Taleb
et al. (1994), Kalra
et al. (2000) e Basiuk (2002) obtiveram uma adsorção máxima de Ala, assim
como outros aminoácidos sobre hematita (Ala, Gly, Lys, Thr e Glu),
montmorilonita (Ala e Gly) e sílica pura, próximo do pI do aminoácido. Meng
et
al. (2004) também observaram que a adsorção de Gly (pI = 5,97; grupo R
alifático não-polar) sobre sílica foi máxima em pH 6,00 (Lehninger
et al., 1993).
A adsorção de Lys (grupo R carregado positivamente) sobre o caulim na
faixa de pH 6,00 foi maior que nas outras faixas (3,00 e 8,00) (S.N.K.<0,05)
42
(tabela 4). Por outro lado, a adsorção de Lys sobre bentonita na faixa de pH
8,00 foi maior que nas outras faixas de pH (3,00 e 6,00) (S.N.K.<0,05) (tabela
5). Churchill
et al. (2004) também observaram que a adsorção de Lys (pI=9,74)
sobre quartzo (p
cz
=2,8) aumenta quando os valores de p
cz
e pI diferem
significativamente. Este resultado concorda com o resultado obtido aqui para o
caso Lys/bentonita (p
cz
=1,88) onde há um aumento da adsorção com o
distanciamento dos valores de pI e p
cz
. Rogacheva e Bobyrenko (1985)
mostraram que a adsorção de Lys sobre dióxido de titânio diminuiu com o
aumento de pH. Por outro lado, Ben-Taleb
et al. (1994) obtiveram uma
adsorção máxima de Lys sobre hematita em pH próximo ao pI do aminoácido.
A adsorção de His (grupo R carregado positivamente) sobre o caulim
aumentou com o aumento do pH (S.N.K.<0,05) (tabela 4). Entretanto, a
adsorção de His sobre bentonita aumentou da faixa de pH 3,00 a 6,00 e
diminuiu novamente na faixa de pH 8,00 a um valor menor que o obtido em pH
3,00 (S.N.K.<0,05) (tabela 5).
Os aminoácidos que mostraram as maiores adsorções (k>1, onde
k=C
ads
/C
sol
) sobre caulim ou bentonita foram: Cys (ambas as argilas e em todas
as faixas de pH), Met (bentonita pH 8,00), Asp (bentonita pH 3,00), His (caulim
pH 8,00; bentonita pH 6,00) e Lys (bentonita todas as faixas) (tabelas 4 e 5).
Em geral, pode-se dizer que aminoácidos com grupo R carregado (Asp,
Lys e His) e Cys (grupo R polar não-carregado) foram mais adsorvidos sobre
caulim ou bentonita que os outros aminoácidos (Ala, Met e Gln) (tabelas 4 e 5;
figura 5). Importante notar que a adsorção de Cys foi estudada somente sobre
sílica pura e C18 (Basiuk e Gromovoy, 1996; Basiuk, 2002) e sílica gel/poliA
(Mellersh e Wilkinson, 2000).
43
Figura 5: Concentração relativa de todos os aminoácidos. A quantidade de Ala
adsorvida em caulinita ou bentonita ou a ocorrência em proteínas (Klapper,
1977) foi tomada como 1,00.
44
Um artigo de revisão publicado por Lahav e Chang (1976) e vários
outros artigos citados na introdução mostram o resultado da adsorção de
alguns aminoácidos sobre argilas, minerais e sedimentos. Em quase todos os
casos, aminoácidos com grupos carregados negativamente ou positivamente
são mais adsorvidos que outros tipos de aminoácidos.
Um estudo publicado por Klapper (1977) sobre a ocorrência média de
aminoácidos em 200 proteínas mostrou que 74% dos aminoácidos das
proteínas atuais contêm grupos R não-carregados (Cys 2,8%). Entretanto,
baseado em nossos resultados, tão bem quanto em outros resultados
publicados, deveria se esperar uma maior ocorrência de peptídeos consistindo
de aminoácidos com grupos R carregados e Cys do que de aminoácidos
contendo grupo R não- carregado, uma vez que, minerais adsorvem muito mais
aminoácidos com grupo R carregado negativamente ou positivamente e Cys.
Como discutido em outros artigos, estes resultados levantam algumas
questões sobre o papel dos minerais em fornecer um mecanismo para
concentração de aminoácidos: quais foram os mecanismos envolvidos na
produção de peptídeos/proteínas com mais aminoácidos contendo grupo R
não-carregado do que grupo R carregado e Cys? Poderíamos esperar que a
composição dos aminoácidos adsorvidos sobre minerais refletisse a das
proteínas atuais? A adsorção de aminoácidos sobre minerais foi importante
para a origem da vida? (Zaia
et al., 2002; Zaia, 2004; Zaia e Zaia, 2006). Zaia
(2004) e Zaia e Zaia (2006) propuseram alguns mecanismos que poderiam
estar envolvidos na produção de peptídeos/proteínas compostos por maior
quantidade de aminoácidos com grupo R não-carregado do que com grupo R
carregado. Entre estes mecanismos: membranas lipossomicas (Böhler
et al.,
45
1996; Blocher et al., 1999; Blocher et al., 2000; Luisi et al., 2000); adsorção de
aminoácidos por bases purínicas pré-adsorvidas sobre grafita pura (Sowerby
et
al., 2002a) e ciclos de hidratação/desidratação (Yanagawa et al., 1990;
Suwannachot e Rode, 1999; Plankensteiner
et al., 2002). Andersson e Holm
(2000) estudaram a estabilidade de Asp, Ser, Leu e Ala em condições
encontradas em hidrotermais (tamponadas e não-tamponadas com minerais,
200
o
C, 50 bar). Entre os quatro aminoácidos, Ala foi o mais estável, onde o
tempo de meia vida no experimento não-tamponado foi de 27 h e no
experimento tamponado de 380 h. Também observaram que nos estágios
iniciais do experimento, a concentração de Ala aumentou provavelmente
devido à desidratação da serina, o que também foi responsável pela formação
de Gln, o qual não estava presente inicialmente. Outros aminoácidos deveriam
também ser testados, entretanto, este experimento pode explicar porque Ala é
o mais abundante aminoácido em proteínas (figura 5) (Klapper, 1977).
4.1.2 Espectroscopia de infravermelho (FT-IR) das amostras aminoácidos/
argilas
Foi realizado um estudo por espectroscopia de infravermelho (FT-IR)
para melhor entender a interação entre argilas e aminoácidos. Para todos os
aminoácidos (Ala, Met, Gln, Cys, Asp, Lys e His) adsorvidos sobre argilas
(bentonita e caulim), não houve alteração dos espectros FT-IR com a mudança
de pH (faixa 3,00 – 8,00) (dados não mostrados).
A figura 6 mostra os espectros do caulim, bentonita, Ala sólida e Ala
adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da Ala sólida (figura 6-A-b e
46
6-B-b) mostram bandas em 1520/1593 e 3082 cm
-1
que podem ser atribuídas a
deformação assimétrica do –NH
3
+
e ao estiramento –NH
3
+
, respectivamente
(Stewart e Fredericks, 1999; Wolpert e Hellwig, 2006). O espectro da Ala
adsorvida em bentonita (figura 6-A-c) mostra um pequeno deslocamento nas
freqüências e as seguintes alterações: bandas em 1520/1593 cm
-1
desapareceram, banda em 3082 cm
-1
diminui de intensidade, e uma nova
banda foi observada em 3305 cm
-1
devido ao grupo –NH
3
+
adsorvido na
bentonita. Isto poderia explicar a banda em 1461 cm
-1
que pode estar
relacionada à deformação –NH
3
+
. Estes resultados foram também obtidos por
Nabiev
et al. (1983) e Suh e Moskovits (1986) que identificaram os grupos
carbonil (-COO
-
) e amina (–NH
3
+
). O espectro da Ala adsorvida em caulim
(figura 6-B-c) mostra uma diminuição na intensidade da banda em 1593 cm
-1
e
o estiramento do NH
3
+
foi observado em 3082 cm
-1
. Isto significa que a
interação Ala/caulim foi bastante fraca comparada a Ala/bentonita.
A figura 7 mostra os espectros FT-IR do caulim, bentonita, Asp sólido e
Asp adsorvido em caulim e bentonita. Não foi possível obter bons espectros do
Asp adsorvido nas argilas devido à baixa relação sinal/ruído.
A figura 8 mostra o espectro FT-IR do caulim, bentonita, Lys sólida e Lys
adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da Lys sólida (figura 8-A-b
e 8-B-b) mostra bandas em 1505, 1593/1614, 1566 e 3160 cm
-1
que podem ser
atribuídas à deformação simétrica do -NH
3
+
, deformação assimétrica do -NH
3
+
estiramento simétrico do COO
-
e estiramento do -NH
3
+
, respectivamente
(Stewart e Fredericks, 1999; Wolpert e Hellwig, 2006). O espectro da Lys
adsorvida em bentonita (figura 8-A-c) mostra um pequeno deslocamento de
freqüência. Algumas outras alterações foram observadas tais como: diminuição
47
(A) (B)
Figura 6: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), alanina sólida (b) e alanina
adsorvida em bentonita (c);
(B) caulim (a), alanina sólida (b) e alanina
adsorvida em caulim (c). As amostras com argila foram agitadas por 24 h com
água do mar e solução saturada de alanina em água do mar. Todas as
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o sólido seco
em estufa a 40
o
C por 24 h.
48
Figura 7: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), ácido aspártico sólido (b) e
ácido aspártico adsorvido em bentonita (c);
(B) caulim (a), ácido aspártico
sólido (b) e ácido aspártico adsorvido em caulim (c). As amostras com argila
foram agitadas por 24 h com água do mar e solução saturada de ácido
aspártico em água do mar. Todas as amostras foram centrifugadas por 15
minutos a 2.000 r.p.m., e o sólido seco em estufa a 40
o
C por 24 h.
49
Figura 8: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), lisina sólida (b) e lisina
adsorvida em bentonita (c);
(B) caulim (a), lisina sólida (b) e lisina adsorvida em
caulim (c). As amostras com argila foram agitadas por 24 h com água do mar e
solução saturada de lisina em água do mar. Todas as amostras foram
centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o sólido seco em estufa a 40
o
C
por 24 h.
50
da intensidade das bandas em 1566 e 3160 cm
-1
, alargamento da banda em
1505 cm
-1
e uma nova banda em 3289 cm
-1
(figura 8-A-c). Esta nova banda
pode ser atribuída ao grupo -NH
3
+
adsorvido em bentonita. Isto explicaria o
alargamento da banda em 1505 cm
-1
devido à presença da deformação –NH
3
+
.
O espectro da Lys adsorvida em caulim (figura 8-B-c) mostra um deslocamento
de freqüência de 1505 a 1512 cm
-1
e o desaparecimento da banda em 1566
cm
-1
. Esta última pode ser atribuída a deformação da Lys sobre a superfície do
caulim. Este resultado mostra, também, que a interação Lys/caulim ocorre
através do grupo -NH
3
+
.
A figura 9 mostra os espectros FT-IR do caulim, bentonita, His sólida e
His adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da His sólida (figura 9-
A-b e 9-B-b) mostra bandas em 1271/1315/1571/1589, 1461, 1499, 1632 e
3157 cm
-1
que podem ser atribuídas ao estiramento aromático C-C e N-C
deformação do CH
2
e estiramento C-C do anel, deformação simétrica -NH
3
+
,
deformação assimétrica -NH
3
+
e estiramento -NH
3
+
, respectivamente (Stewart e
Fredericks, 1999; Wolpert e Hellwig, 2006). O espectro da His adsorvida em
bentonita (figura 9-A-c) mostra o desaparecimento das bandas em 1461, 1571
e 1589 cm
-1
e o aparecimento de uma nova banda em 3263 cm
-1
. Este
desaparecimento pode ser atribuído a deformação do anel da His em bentonita
e a falta de carga positiva sobre o nitrogênio imidazólico. A nova banda pode
ser atribuída ao grupo -NH
3
+
adsorvido em bentonita. Pode-se observar que a
banda em 1499 cm
-1
mostra um alargamento. Nas faixas de pH estudado, os
espectros FT-IR não se alteraram, no entanto, Martusevičius
et al. (1996)
observaram duas espécies na faixa de pH 3,00 a 8,00. O espectro da His
adsorvida em caulim (figura 9-B-c) mostra o desaparecimento das bandas em
51
Figura 9: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), histidina sólida (b) e histidina
adsorvida em bentonita (c);
(B) caulim (a), histidina sólida (b) e histidina
adsorvida em caulim (c). As amostras com argila foram agitadas por 24 h com
água do mar e solução saturada de histidina em água do mar. Todas as
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o sólido seco
em estufa a 40
o
C por 24 h.
52
1461, 1499, 1571 e 1589 cm
-1
e diminuição da banda em 3157 cm
-1
. Estes
resultados mostram que a interação His/caulim também ocorre através do
grupo -NH
3
+
.
A figura 10 mostra o espectro FT-IR do caulim, bentonita, Met sólida e
Met adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da Met sólida (figura
10-A-b e 10-B-b) apresenta bandas em 1317, 1352/1446, 1409, 1510,
1563/1584-1612 e 3165 cm
-1
que podem ser atribuídas ao grupo CH
2
,
deformação simétrica/assimétrica do CH
3
, estiramento simétrico do COO
-
,
deformação assimétrica do -NH
3
+
, deformação do NH
2
e estiramento do -NH
3
+
,
respectivamente (Stewart e Fredericks, 1999; Wolpert e Hellwig, 2006). O
estiramento C-S não foi observado no espectro da Met sólida, devido à baixa
relação sinal/ruído. No espectro da Met adsorvida em bentonita as seguintes
alterações foram observadas: desaparecimento das bandas em 1317, 1409,
1446, 1563, 1584, 1612 e 3165 cm
-1
, surgimento de uma nova banda em 3277
cm
-1
e deslocamento da banda em 1510 para 1501 cm
-1
. Para as amostras de
Met adsorvidas em caulim, o espectro mostra um pequeno deslocamento das
freqüências e diminuição de intensidade (figura 10-b-c). A interação da Met
adsorvida em ambas as argilas ocorre através do grupo amino e o átomo de
enxofre não está envolvido em nenhuma interação por estar bloqueado pelo
grupo –CH
3
(figura 10-A-c e 10-B-c).
A figura 11 mostra o espectro de FT-IR do caulim, bentonita, Gln sólida e
Gln adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da glutamina sólida
(figura 11-A-b e 11-B-b) apresenta bandas em 1412, 1449, 1488, 1587, 1687,
3174, 3213-3275 e 3321/3407 cm
-1
que podem ser atribuídas à deformação do
grupo CH, deformação do grupo CH
2
, estiramento simétrico do –NH
3
+
,
53
Figura 10: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), metionina sólida (b) e
metionina adsorvida em bentonita (c);
(B) caulinita (a), metionina sólida (b) e
metionina adsorvida em caulinita (c). As amostras com argila foram agitadas
por 24 h com água do mar e solução saturada de metionina em água do mar.
Todas as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o
sólido seco em estufa a 40
o
C por 24 h.
54
Figura 11: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), glutamina sólida (b) e
glutamina adsorvida em bentonita (c);
(B) caulinita (a), glutamina sólida (b) e
glutamina adsorvida em caulinita (c). As amostras com argila foram agitadas
por 24 h com água do mar e solução saturada de glutamina em água do mar.
Todas as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o
sólido seco em estufa a 40
o
C por 24 h.
55
deformação do grupo NH
2
e estiramento assimétrico do COO
-
, estiramento do
grupo C=O, estiramento de –NH
3
+
, estiramento simétrico do grupo NH
2
e
estiramento assimétrico do grupo NH
2
, respectivamente (Stewart e Fredericks,
1999; Wolpert e Hellwig, 2006). No espectro da Gln adsorvida em bentonita, a
banda em 1587 cm
-1
desaparece provavelmente devido à mudança de NH
2
para NH
3
+
pela interação de um par de elétrons do grupo NH
2
com a superfície
da argila. Neste espectro, também observamos um pequeno deslocamento de
freqüências e uma diminuição na intensidade de algumas bandas, tal como em
1488 cm
-1
(figura 11-A-c). Para as amostras adsorvidas em caulim, o espectro
mostra um pequeno deslocamento nas freqüências e diminuição das
intensidades (figura 11-B-c). A interação da Gln adsorvidas em ambas as
argilas ocorreu através do grupo amino.
A figura 12 mostra os espectros FT-IR do caulim, bentonita, Cys sólida
e Cys adsorvida em caulim e bentonita. O espectro FT-IR da Cys sólida (figura
12-A-b 12-B-b) apresenta bandas em 646/838, 679, 776/1429, 869, 1347,
1398, 1521, 1572, 1623, 1644 e 1741 cm
-1
que podem ser atribuídas a
deformação do grupo COO
-
, estiramento do grupo C-S, deformação do grupo
CH
2
, estiramento C-C, deformação simétrica do grupo NH
3
, estiramento
simétrico do COO
-
, deformação do grupo N-H, deformação assimétrica de –
NH
3
+
, deformação assimétrica de –NH
3
+
, estiramento assimétrico COO
-
e
estiramento C=O, respectivamente (Stewart e Fredericks, 1999; Wolpert e
Hellwig, 2006). A banda fraca próxima a 2561 cm
-1
pode ser atribuída ao grupo
S-H na molécula de Cys (Pawlukojé
et al., 2005; Aryal et al., 2006; Wolpert e
Hellwig, 2006). Na região 3000-3600 cm
-1
os espectros não estão bem
definidos devido à baixa relação sinal/ruído. O espectro da Cys adsorvida em
56
Figura 12: Espectro FT-IR de: (A) bentonita (a), cisteína sólida (b) e cisteína
adsorvida em bentonita (c);
(B) caulinita (a), cisteína sólida (b) e cisteína
adsorvida em caulinita (c). As amostras com argila foram agitadas por 24 h com
água do mar e solução saturada de cisteína em água do mar. Todas as
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 r.p.m., e o sólido seco
em estufa a 40
o
C por 24 h.
57
bentonita mostra que as bandas em 1429 e 1572 cm
-1
desapareceram, bandas
em 1347 e 1741 cm
-1
diminuíram de intensidade, àquelas em 838, 1398, 1623
e 1644 cm
-1
deslocaram para 846, 1412, 1631 e 1650 cm
-1
e a banda em 1521
cm
-1
diminuiu de intensidade e se deslocou para 1505 cm
-1
. As bandas devido
ao estiramento de S-H e C-S não foram observadas no espectro da Cys
adsorvida em bentonita devido a forte interação bentonita/enxofre (figura 12-A-
c). Para as amostras adsorvidas em caulim, o espectro mostra que a banda
em 2561 cm
-1
diminuiu de intensidade, e que a banda em 679 cm
-1
não foi
observada devido a uma forte banda do caulim em 691 cm
-1
(figura 12-B-c). É
muito provável que a interação caulim/enxofre seja tão forte como
bentonita/enxofre. Também foi observado que as bandas em 776, 838, 869,
1431 e 1571 cm
-1
desapareceram; as bandas em 1346, 1398 e 1741 cm
-1
diminuíram de intensidade; a banda em 1521 cm
-1
diminuiu de intensidade e
dividiu-se em duas bandas em 1491 e 1517 cm
-1
(figura 12-B-c). Assim, a
interação Cys/argilas ocorre através dos grupos sulfidrila e amino, o que
demonstra sua complexidade.
O mecanismo de formação de ligações peptídicas sobre argilas
utilizando ciclos de hidratação/desidratação propõe que os aminoácidos
interagem com a argila através do grupo carbonila (White
et al., 1984; Bujdák e
Rode, 2001). No entanto, os resultados por nós obtidos mostram que todos os
aminoácidos aqui estudados interagem com argilas pelo grupo amina e no caso
da cisteína esta interação ocorre também pelo grupo sufidrila.
58
4.1.3 Difratometria de raios-X das amostras aminoácidos/argilas
O espectro da Cys adsorvida em bentonita mostrou as maiores
variações entre os aminoácidos aqui estudados. Assim, um estudo utilizando a
técnica de difratometria de raios-X foi realizado na tentativa de melhor entender
este processo de adsorção.
Os dados de difratometria de raio-X (figuras 13 e 14) mostram que o pH
afeta as camadas internas da bentonita. A expansão intercamada ocorreu em
pH 3,00, 6,00 e 8,00 (figura 13) e foi de 14,1; 14,9 e 13,9 Å, respectivamente.
Para as amostras de Cys adsorvida em bentonita, a expansão das camadas
internas foi maior devido a inclusão de Cys. A expansão foi maior em pH 3,00
(18,3 Å) e 8,00 (17,3 Å), e uma menor expansão (15,2 Å) foi observada em pH
6,00. A expansão em pH 3,00 da Cys/bentonita foi maior do que a de amostras
de etileno glicol/bentonita saturada com Mg (17,7 Å) (figura 14). Os resultados
de difratometria de raios-X mostram que o aminoácido foi incluído na
intercamada o que demonstra a elevada afinidade da Cys pelas camadas
internas da bentonita (Borchardt, 1989; Moore e Reynolds, 1989).
59
Figura 13. Difratogramas de raios-X das amostras de bentonita em equilíbrio
com soluções contendo NaOH 0,1M em três valores de pH sem (acima) e com
cisteína (abaixo).
2345678
37-Branco pH=3,0
41-Branco pH 6,0
45-Branco pH=8,0
2
θ
CuK
α
2345678
15-Cisteina pH=3,0
19-Cisteina pH=6,0
23-Cisteina pH=8,0
2
θ
CuK
α
60
Figura 14. Difratogramas de raios-X das amostras de bentonita na presença ou
ausência de cisteína em três valores de pH.
2345678
2
θ
- CuK
α
15 Cisteina pH 3,0 - glicol
19-Cisteina pH 6,0 - glicol
23- Cisteina pH 8,0 -glicol
37-Branco pH 3,0 - glicol
41-Branco pH 6,0 - glicol
45-Branco pH 8,0 - glicol
61
4.1.4 Espectroscopia Mössbauer das amostras aminoácidos/argilas
Análises químicas revelaram que a bentonita é composta por 2,7% de
Fe
2
O
3
e como apontado por alguns autores (Hartman, 1975; Wächtershäuser,
1988; Kaschke
et al., 1994), a interação de compostos enxofre/ferro tem um
importante papel na química prebiótica. Este fato motivou um estudo utilizando
a espectroscopia Mössbauer na tentativa de melhor compreender a possível
interação ferro/Cys. A figura 15 mostra o espectro RT Mössbauer para a
bentonita. O espectro foi ajustado com dois dubletos, o maior componente
correspondendo ao íon férrico e o menor ao íon ferroso. Este resultado é
consistente com resultados divulgados anteriormente, onde, ambas as
valências do ferro (Fe
3+
e Fe
2+
) foram detectadas (Oliveira et al., 2003). O
espectro Mössbauer para as amostras de Cys é mostrado na figura 16.
Novamente, dois dubletos podem ser observados compreendendo o espectro
inteiro, embora com um grande aumento (~20%) devido à contribuição do íon
ferroso. Isto quer dizer que a Cys foi capaz de reduzir parcialmente o ferro
presente na bentonita. Cowan 1993, através de espectrometria Mössbauer,
mostra a reação de oxiredução que ocorre com a aconitase, onde, os íons ferro
são reduzidos a Fe 2,5. O espectro inserido no canto da figura 16 mostra o
espectro RT Cys/Fe
3+
. Os parâmetros hiperfinos e áreas subespectrais obtidas
destes ajustes são apresentados na tabela 6.
62
Figura 15: Espectro Mössbauer RT para a bentonita.
Figura 16: Espectro Mössbauer RT para a Cys adsorvida em bentonita. A
figura interna mostra o espectro de Cys/Fe
3+
.
63
Tabela 6: - Parâmetros hiperfinos e áreas subespectrais Mössbauer para as
amostras de bentonita com e sem cisteína adsorvida.
Amostra
Temperatura Subspectro
IS
a
(mm/s)
(±0.02)
QS
(mm/s)
(±0.02)
Γ
(mm/s)
(±0.2)
Área
(%)
(±0.3)
Dubleto (Fe
3+
)
0.23 0.58
93.3
Sem
Cys
300 K
Dubleto (Fe
2+
)
1.22 2.45
6.7
Dubleto (Fe
3+
)
0.27 0.75 0.64 73.0
Com
Cys
300 K
Dubleto (Fe
2+
)
1.36 2.35 0.45 27.0
a
Relativo ao α-Fe metálico a temperatura ambiente.
64
4.2 Adsorção de bases nitrogenadas sobre argilas
4.2.1 Adsorção
As tabelas 7 e 8 mostram os parâmetros de Langmuir e Freundlich
calculados a partir das curvas de adsorção para diversas bases nitrogenadas
(
A, adenina; C, citosina; T, timina e U, uracila) sobre argilas (bentonita,
montmorilonita e caulim) em duas faixas de pH (2,00 e 7,20). A faixa de pH
7,20 foi escolhida visto que é este o valor médio do pH dos oceanos. O pH 2,00
foi escolhido, pois o mesmo ocorre em alguns hidrotermais e também, neste pH
estaríamos fora das faixas de pK
a
das bases nitrogenadas encontrados em pH
7,20 (tabela 2).
As capacidades máximas de adsorção (
b) obtidas utilizando a equação
de Langmuir mostram os maiores valores para as bases:
A adsorvida sobre
bentonita e montmorilonita na faixa de pH 2,00, e
C adsorvida sobre
montmorilonita na faixa de pH 2,00 sendo que estes valores não são
estatisticamente diferentes um do outro (S.N.K.>0,05), porém são
estatisticamente diferentes (S.N.K.<0,05) de todos os outros resultados
mostrados na tabela 7. Perezgasga
et al., (2005) estudaram a adsorção de
bases nitrogenadas sobre montmorilonita e também observaram uma maior
adsorção da
A do que de U. Para o caso do caulim foi possível somente
calcular
b para A em pH 2,00, visto que, em pH 7,20 não ocorreu adsorção
(tabela 7). Para todas as outras bases, nos dois pHs estudados, não ocorreu
adsorção sobre esta argila (dado não mostrado). Não foi possível obter um
ajuste da curva de Langmuir para calcular o parâmetro
b para as seguintes
55
Tabela 7: Parâmetros de Langmuir das bases do DNA/RNA adsorvidos sobre argilas
Base Argila *Faixa de pH
**b (
µg/mg) ***K (mL/µg)
#
r
2,21-2,41
29,5
±1,9 (5) [5]
C
0,0238±0,0043 (5) [5]
B
0,9924±0,0020 (5) [5]
bentonita
6,80-7,80
11,0
±3,3 (8) [10]
B,D,F,I
0,0110±0,0033 (5) [10]
B
0,8790±0,0384 (8) [10]
2,17-2,58
33,9
±0,4 (4) [5]
A
0,0490±0,0027 (4) [5]
A
0,9869±0,0011 (4) [5]
montmorilonita
6,13-7,90 (0) [13] (0) [13] (0) [13]
1,93-2,90
0,175
±0,086 (4) [13]
B,D,F,H,J
(0) [13]
0,5965
±0,1286 (4) [13]
adenina
caulim
7,17-8,00 NA NA NA
2,20-2,60
16,1
±0,9 (4) [6]
B,D,F,G
0,0267±0,0071 (3) [6]
B
0,9955±0,0010 (4) [6]
bentonita
6,60-7,55
8,45
±4,30 (4) [10]
B,D,F
0,0118±0,0061 (4) [10]
B
0,4698±0,0851 (4) [10]
2,14-2,36
27,8
±1,8 (5) [5]
E
0,0184±0,0036 (5) [5]
B
0,9903±0,0044 (5) [5]
citosina
montmorilonita
6,75-7,90
8,89
±3,46 (6) [10]
B,D,F
0,0084±0,0026 (5) [10]
B
0,5516±0,0622(6) [10]
1,99-2,28
0,047
±0,015 (5) [5]
BD,F,H,J
(0) [5]
0,9280±0,0240 (5) [5]
bentonita
6,90-7,30
0,176
±0,059 (4) [6]
B,D,F,H’,J
0,0181 (1) [6]
0,8843
±0,0374 (4) [6]
1,92-2,06 (0) [5] (0) [5] (0) [5]
uracila
montmorilonita
6,98-7,54 (0) [5] (0) [5] (0) [5]
1,85-2,35 (0) [6] (0) [6] (0) [6]
bentonita
6,55-7,37 (0) [5] (0) [5] (0) [5]
1,94-2,31 (0) [5] (0) [5] (0) [5]
timina
montmorilonita
6,84-7,54 (0) [5] (0) [5] (0) [5]
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. O número de experimentos em duplicatas que ajustaram
na curva de Langmuir é dado entre parênteses. O número de experimentos é dado entre colchetes com duas séries cada
experimento. NA=não adsorveu. *Faixas de pH após as amostras serem agitadas por 3 h para a bentonita e a montmorilonita e
16 h para o caulim. Os pHs foram ajustados em tempo t=0 em 2,00 ou 7,20. **b=capacidade máxima de adsorção. ***K=energia
de ligação base/argila.
#
Coeficiente de correlação da reta. Para b, teste ANOVA (F=21,35, P=0,000), valores do teste SNK
estatisticamente diferentes (p<0,05) um do outro: A/B, C/D, E/F, G/H e I/J; Para K, teste ANOVA (F=10,84, P=0,000), valores do
teste SNK estatisticamente diferentes (p<0,05) um do outro: A/B.
56
Tabela 8: Parâmetros de Freundlich das bases do DNA/RNA adsorvidos sobre argilas
Base Argila *Faixa de pH **n ***K
f
#
r
2,21-2,41
3,76
±0,38 (5) [5] 5,67±0,59 (5) [5]
B,E
0,9830±0,0039 (5) [5]
bentonita
6,80-7,80
1,71
±0,56 (8) [10] 0,586±0,291 (8) [10]
B,D,F,H
0,8747±0,0437 (8) [10]
2,17-2,58
5,68
±0,63 (5) [5] 11,4±0,2 (5) [5]
A
0,9194±0,0230 (5) [5]
montmorilonita
6,13-7,90
0,499
± 0,045 (9) [13] 0,0018± 0,0012(9) [13]
B,D,F,H
0,8504± 0,0524(9) [13]
1,93-2,90
0,089
±0,012 (7) [13]
< 10
-10
(7) [13]
0,8407
±0,0780 (7) [13]
adenina
caulim
7,17-8,00 NA NA NA
2,20-2,60
12,4
±5,8 (6) [6] 5,91±1,59 (6) [6]
B,C
0,9104±0,0508 (6) [6]
bentonita
6,60-7,55
0,737
±0,155 (7) [10] 0,0140±0,0092 (7) [10]
B,D,F,H
0,7908±0,0544 (7) [10]
2,14-2,36
2,96
±0,32 (5) [5] 3,52±0,54 (5) [5]
B,D,F,G
0,9864±0,0073 (5) [5]
citosina
montmorilonita
6,75-7,90
1,15
±0,20 (10) [10] 0,108±0,049 (10) [10]
B,D,F,H
0,7515±0,0540 (10) [10]
1,99-2,28
0,423
±0,173 (3) [5] 0,0013± 0,0012(3) [5]
B,D,F,H
0,8542±0,0958 (3) [5]
bentonita
6,90-7,30
1,99
±1,63 (3) [6] 0,0319±0,0319 (3) [6]
B,D,F,H
0,7524±0,2074 (3) [6]
1,92-2,06
0,257
± 0,024 (5) [5]
<10
-8
(5) [5]
0,9791
± 0,0024 (5) [5]
uracila
montmorilonita
6,98-7,54
0,445
± 0,053 (5) [5]
<10
-4
(5) [5]
0,9793
± 0,0076 (5) [5]
1,85-2,35
0,339
± 0,043 (5) [6]
<10
-6
(5) [6]
0,9495
±0,0161 (5) [6]
bentonita
6,55-7,37
0,299
± 0,047 (5) [5]
<10
-6
(5) [5]
0,9778
± 0,0069 (5) [5]
1,94-2,31
0,524
± 0,007 (5) [5]
<10
-5
(5) [5]
0,9859
± 0,0078 (5) [5]
timina
montmorilonita
6,84-7,54
0,456
± 0,062 (5) [5]
<10
-4
(5) [5]
0,9469
± 0,0297 (5) [5]
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. O número de experimentos em duplicatas que ajustaram
na curva de Freundlich é dado entre parênteses. O número de experimentos é dado entre colchetes com duas séries cada
experimento. NA=não adsorveu. *Faixas de pH após as amostras serem agitadas por 3 h para a bentonita e a montmorilonita e
16 h para o caulim. Os pHs foram ajustados em tempo t=0 em 2,00 ou 7,20. **n=reatividade dos sítios de adsorção.
***K
f
=capacidade de adsorção.
#
Coeficiente de correlação da reta., Para K
f
, teste ANOVA (F=44,61, P=0,000), valores do teste
SNK estatisticamente diferentes (p<0,05) um do outro: A/B, C/D, E/F e G/H.
57
bases: A adsorvida sobre montmorilonita na faixa de pH 7,00, U adsorvida
sobre montmorilonita nas faixas de pH 2,00 e 7,00 e
T adsorvida sobre todas
argilas e em todos os pHs, visto que estes valores são negativos o que poderia
significar que os sais da água do mar estão ocupando os sítios de adsorção e
impedindo a entrada das bases.
Um aumento do pH provocou uma diminuição dos valores de
b para as
seguintes bases:
A adsorvida sobre bentonita, caulim e montmorilonita e C
adsorvida sobre montmorilonita (S.N.K.<0,05) (tabela 7). Para os outros casos
não ocorreu variação do parâmetro
b com o pH (S.N.K.>0,05) (tabela 7).
Perezgasga
et al. (2005) estudaram a adsorção de A sobre montmorilonita em
diversas faixas de pH (2,00; 6,00 e 10,00) e também observaram uma maior
adsorção em pH 2,00. Esta maior adsorção de algumas bases sobre as argilas
em função do pH pode ser explicada considerando as cargas das argilas e das
bases em cada pH. No pH 2,00 tanto
A quanto a C (ver valores de pK
a
; tabela
2) estão positivamente carregadas e as argilas bentonita e montmorilonita
estão negativamente carregadas (ver p
cz
;
tabela 3). Esta diferença de carga
ocasiona um aumento da adsorção. Na faixa de pH 7,00 ocorre um aumento de
cargas negativas tanto nas argilas como nas bases, ocasionado uma
diminuição na adsorção (tabelas 7 e 8). Para o caso da
U não observamos
variação da adsorção (S.N.K.>0,05) com o pH visto que na faixa estudada a
U
está sempre neutra e as argilas estão sempre carregadas negativamente
(tabelas 7 e 8).
A tabela 7 também mostra a energia de ligação (
K) obtida a partir do
ajuste da isoterma de Langmuir, neste caso observamos que a maior interação
ocorreu entre
A/montmorilonita em pH 2,00 sendo que este valor foi
58
estatisticamente diferente de todos os outros (S.N.K.<0,05) (tabela 7). Os
resultados da tabela 7 também mostram que nos casos onde ocorreu uma
grande adsorção (
b), o valor de K foi maior, sendo estes: A e C adsorvidas
sobre bentonita e montmorilonita na faixa de pH 2,00.
Para todos os casos mostrados na tabela 7 o fator de correlação da reta
(
r) obtida na faixa de pH 2,00 foi sempre melhor do que aquele obtido na faixa
de pH 7,20. A explicação para o melhor ajuste na faixa de pH 2,00 pode ser
que nesta faixa ocorreu uma maior adsorção, portanto um menor erro foi
cometido nas medidas, mas também pode ser que o mecanismo de adsorção
na faixa de pH 7,20 seja diferente daquele da faixa de pH 2,00.
A afinidade dos sítios de adsorção (
n) obtidos utilizando a equação de
Freundlich mostra que em geral quando este valor é maior do que um, temos
um valor de capacidade de adsorção (
K
f
) alto (tabela 8). O maior valor de K
f
foi
obtido para
A adsorvida sobre montmorilonita na faixa de pH 2,00
(S.N.K.<0,05) (tabela 8), sendo que esta mesma base, adsorvida sobre
montmorilonita na faixa de pH 2,00 apresentou também o maior valor de
b
(tabela 7). Outras bases também apresentaram valores altos de
K
f
sendo
estas:
A adsorvida sobre bentonita na faixa de pH 2,00 e C adsorvida sobre
bentonita e montmorilonita na faixa de pH 2,00 (tabela 8). Devemos salientar
que estas mesmas bases adsorvidas sobre as mesmas argilas na faixa de pH
2,00 também apresentaram os maiores valores de
b (tabela 7). Os valores de
K
f
para as bases A (caulim, pH 2,00), U (montmorilonita pHs 2,00 e 7,20) e T
(todas as argilas e pHs) foram muito pequenos indicando sua baixa adsorção
(tabela 8).
59
Em geral os valores de n diminuíram com o aumento do pH indicando
uma alteração na reatividade dos sítios de adsorção com o pH (tabela 8).
No caso das bases A e C adsorvidas sobre bentonita e montmorilonita
um aumento do pH resultou numa diminuição dos valores de
K
f
(S.N.K.<0,05)
(tabela 8). No caso da
U adsorvida sobre bentonita não foi observado alteração
de
K
f
com o pH (S.N.K.>0,05) (tabela 8). Para as outras bases os valores de K
f
obtidos são muito pequenos (< 10
-4
), não sendo relevante uma análise
estatística (tabela 8).
Para todos os casos, exceto
T adsorvida sobre bentonita, o fator de
correlação da reta (
r) obtida na faixa de pH 2,00 foi sempre melhor do que
aquele obtido na faixa de pH 7,20 (tabela 8). No entanto, devemos salientar
que os valores de
r obtidos para isotermas de Freundlich (tabela 8) são
melhores que os obtidos para as isotermas de Langmuir (tabela 7) nos pHs
estudados. Portanto, podemos dizer que o melhor ajuste das isotermas ao
modelo de Freundlich pode estar associado ao fato que os sítios de adsorção
são heterogêneos.
A tabela 9 mostra os resultados obtidos para a soma da quantidade de
base adsorvida dividida pela quantidade de argila (
K
ad
). A maior adsorção foi
da
A sobre a montmorilonita na faixa de pH 2,00 (S.N.K.<0,05). A quantidade
K
ad
das bases nitrogenadas adsorvidas sobre as argilas nas duas faixas de pH
estudadas mostrou a seguinte ordem preferencial de adsorção:
A>C>T>U
(tabela 9). Um fato que devemos destacar é que os valores de
K
ad
, b e K
f
mostram uma concordância entre eles, ou seja, quando
b tem um valor alto
para uma determinada base o mesmo ocorre com
K
ad
e K
f
(tabelas 7, 8, 9).
Sowerby
et. al. (2001a) estudaram a adsorção de diversas bases nitrogenadas
60
Tabela 9: Quantidade de bases de DNA/RNA adsorvidos sobre argilas
Base Argilas *Faixa de pH
**K
ad
(µg/mg)
2,21-2,41
19,5
±0,3 [5]
B,C
bentonita
6,80-7,80
6,06
±0,26 [10]
B,D,F,H,J,K
2,17-2,58
21,7
±0,8 [5]
A
montmorilonita
6,13-7,90
7,44
± 0,25 [13]
B,D,F,H,I
1,93-2,90
0,407
±0,039 [13]
B,D,F,H,J,L,N,P,S,U
adenina
caulim
7,17-8,00 NA
2,20-2,60
13,1
±0,3 [6]
B,D,F,G
bentonita
6,60-7,55
2,15
±0,16 [10]
B,D,F,H,J,L,N,P,R
2,14-2,36
17,7
±0,1 [5]
B,D,E
citosina
montmorilonita
6,75-7,90
3,44
±0,20 [10]
B,D,F,H,J,L,N,O
1,99-2,28
0,212
±0,022 [5]
B,D,F,H,J,L,N,P,S,U
bentonita
6,90-7,30
0,287
±0,018 [6]
B,D,F,H,J,L,N,P,S,U
1,92-2,06
1,24
± 0,14 [5]
B,D,F,H,J,L,N,P,S
uracila
montmorilonita
6,98-7,54
1,35
± 0,06 [5]
B,D,F,H,J,L,N,P
1,85-2,35
0,776
± 0,049 [6]
B,D,F,H,J,L,N,P,S
bentonita
6,55-7,37
0,700
± 0,018 [5]
B,D,F,H,J,L,N,P,S
1,94-2,31
4,23
± 0,08 [5]
B,D,F,H,J,L,M
timina
montmorilonita
6,84-7,54
1,59
± 0,04 [5]
B,D,F,H,J,L,N,P,T
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. O
número de experimentos é dado entre os colchetes com duas séries cada
experimento. NA=não adsorveu. *Faixas de pH após as amostras serem
agitadas por 3 h para a bentonita e a montmorilonita e 16 h para o caulim,
os pHs foram ajustados em t=0 em 2,00 ou 7,20. **Para cada curva, foi
obtido K
ad
: K
ad
=[quantidade total de base adsorvida em argila/quantidade
total de argila], Para K
ad
, teste ANOVA (F=751,63, P=0,000), valores teste
SNK estatisticamente diferentes (p<0,05) do outro: A/B, C/D, E/F, G/H, I/J,
K/L, M/N, O/P, R/S e T/U.
61
dissolvidas em água sobre grafite e obtiveram a seguinte ordem de
deslocamento:
G>A>H>T>C>U. No entanto devemos destacar dois pontos: a)
o grafite é um material muito diferente das argilas aqui estudadas e b)
utilizamos água do mar ao invés de somente água destilada.
Um aumento do pH resultou numa diminuição de
K
ad
para as seguintes
bases:
A e C adsorvidas sobre todas as argilas e T adsorvida sobre
montmorilonita (S.N.K.<0,05) (tabela 9). Não foi observado nenhuma variação
de
K
ad
com o pH para U adsorvida sobre todas as argilas e T adsorvida sobre
bentonita (tabela 9). O caulim adsorveu somente a
A na faixa de pH 2,00, para
todas as outras bases nos dois pHs estudados não ocorreu adsorção sobre
esta argila (dado não mostrado).
Os resultados das tabelas 7, 8 e 9 mostram que as bases
A e C
adsorvem consideravelmente sobre as argilas bentonita e montmorilonita na
faixa de pH 2,00, porém, as bases
U e T apresentaram baixa adsorção nas
argilas e faixas de pHs estudadas. Estes resultados sugerem duas questões,
ou melhor, apontam para dois problemas: a) o pH onde ocorreu a maior
adsorção é muito baixo apesar de ocorrer em alguns hidrotermais, porém
seriam eles muito comuns? e b) o outro problema é ainda pior, a ocorrência
das bases nos seres vivos não tem a mesma relação encontrada neste
experimento.
Uma análise das bases encontradas no DNA de diversos seres vivos
mostra a seguinte relação
A/T dependendo da espécie: 1,05 para homo
sapiens; 1,03 para carneiro; 1,02 para galinha; 1,05 para tartaruga; 1,02
salmão; 1,02 ouriço do mar; 1,00 gafanhoto; 1,01 germe de trigo; 0,95
levedura; 1,04 E. Coli (Lehninger, 1984). Portanto seres vivos muito diferentes
62
possuem quase as mesmas quantidades de A e T. Entretanto se verificarmos
os resultados mostrados nas tabelas 7, 8, e 9 observamos que em qualquer
situação a
A é muito mais adsorvida que a T, ou seja, a relação A/T é muito
maior do que um. Estes resultados levantam algumas questões sobre o papel
dos minerais em fornecer um mecanismo para concentração de bases:
deveríamos esperar que a composição das bases nitrogenadas adsorvidas
sobre minerais refletisse as dos DNA atuais? A adsorção de bases
nitrogenadas sobre minerais foi importante para a origem da vida?
4.2.2 Espectroscopia de infravermelho (FT-IR) das amostras bases
nitrogenadas / argilas
Análises por espectroscopia FT-IR foram realizadas para melhor
entender a interação entre argilas (bentonita e montmorilonita) e as bases
nitrogenadas (
A, C, T, U). Para todas as bases adsorvidas em argilas, os
espectros FT-IR foram melhores em pH 2,00 (dados não mostrados). As figuras
17 e 18 mostram os espectros FT-IR resultantes para a bentonita e
montmorilonita, bases sólidas puras e bases adsorvidas em bentonita e
montmorilonita, respectivamente.
Os espectros FT-IR da
A sólida (figura 17-A-b e 18-A-b) mostram
bandas em 1603 e 1672 cm
-1
as quais podem ser atribuídas ao estiramento
C=N e deformação NH
2
, respectivamente (Colthup et al., 1964). Os espectros
da
A adsorvida sobre bentonita (figura 17-B-b) e montmorilonita (figura 18-B-b)
mostram deslocamentos nas freqüências de 1603 para 1626, de 1672 para
1699 cm
-1
, de 1603 para 1631 e de 1626 para 1700 cm
-1
, respectivamente.
63
Figura 17: Espectros FT-IR da (A): bentonita (a), adenina sólida (b), citosina
sólida (c), timina sólida (d) e uracila sólida (e);
(B): adenina (b), citosina (c),
timina (d) e uracila (e) adsorvidas sobre bentonita. As amostras com argilas
foram agitadas por 3 h com solução saturada de base (adenina, citosina, timina
ou uracila) dissolvidas em água do mar. A solução foi filtrada e, então, os
sólidos foram secados em estufa a 40
°C por 24 h.
64
Figura 18: Espectros FT-IR da (A): montmorilonita (a), adenina sólida (b),
citosina sólida (c), timina sólida (d) e uracila sólida (e);
(B): adenina (b), citosina
(c), timina (d) e uracila (e) adsorvidas sobre montmorilonita. As amostras com
argilas foram agitadas por 3 h com solução saturada de base (adenina,
citosina, timina ou uracila) dissolvidas em água do mar. A solução foi filtrada e,
então, os sólidos foram secados em estufa a 40
°C por 24 h.
65
Considerando que neste pH as argilas estão negativamente carregadas pode-
se afirmar que a interação da
A com as argilas foi através do grupo NH
2
+
protonado, propiciando o enfraquecimento da ligação C=N sobre as argilas.
Os espectros da
C sólida (figura 17-A-c e 18-A-c) mostram a banda em
1661 cm
-1
, que pode ser atribuída ao estiramento C=O (Yamada et al., 2004).
Os espectros da
C adsorvida em bentonita (figura 17-B-c) e montmorilonita
(figura 18-B-c) mostram uma divisão da freqüência em 1661 para 1683 e 1732
cm
-1
e para 1686 e 1735 cm
-1
, respectivamente. É possível que a interação da
C com as argilas foi também através do grupo NH
2
+
protonado, mostrando uma
nova banda a 1732-1735 cm
-1
e um deslocamento na freqüência ν(C=O) para
1683-1686 cm
-1
.
Os espectros FT-IR da
T sólida (figura 17-A-d e 18-A-d) mostram bandas
em 1677 e 1739 cm
-1
que podem ser atribuídas ao estiramento C=C e C=O
(Aroca e Bujalski, 1999). Os espectros da
T adsorvida sobre bentonita (figura
17-B-d) e montmorilonita (figura 18-B-d) mostram um deslocamento de
freqüências de 1677 e 1739 cm
-1
para 1669 e 1714 cm
-1
e para 1672 e 1715
cm
-1
, respectivamente. Possivelmente a interação da T com as argilas foi
através do grupo NH presente no anel base (posição 3), propiciando o
enfraquecimento das ligações C=C e C=O nas argilas.
Os espectros da
U sólida (figura 17-A-e e 18-A-e) mostram bandas em
1720 e 1740 cm
-1
que podem ser atribuídas ao estiramento C=C e C=O
(Lewandowski
et al., 2005). Os espectros da U adsorvida sobre bentonita
(figura 17-B-e) e montmorilonita (figura 18-B-e) mostram um deslocamento na
freqüência 1720 cm
-1
para 1716 e 1715 cm
-1
, respectivamente, e um
desaparecimento da banda em 1740 cm
-1
. Possivelmente, a interação da U
66
com as argilas foi através do grupo NH presente no anel da base (posição 3),
propiciando o enfraquecimento da ligação C=C e C=O sobre as argilas.
67
5. CONCLUSÕES
Adsorção de aminoácidos sobre argilas
A concentração de Ala, Cys e Asp adsorvidos sobre caulim, tão bem
quanto Cys e Asp adsorvidos sobre bentonita não se alterou nas faixas de pH
aqui estudadas. Em geral, os aminoácidos com grupo R carregado (Asp, Lys e
His) e Cys (grupo R não-carregado polar) foram mais adsorvidos sobre caulim
e bentonita do que os outros aminoácidos (Ala, Met e Gln). Estes resultados
sugerem algumas questões sobre o papel dos minerais em fornecer um
mecanismo de pré-concentração de aminoácidos: qual foi o mecanismo
envolvido na produção de peptídeos/proteínas com mais aminoácidos contendo
grupo R não-carregado do que grupo R carregado e Cys? Poderíamos esperar
que a composição dos aminoácidos adsorvidos sobre minerais refletisse a das
proteínas atuais? A adsorção de aminoácidos sobre minerais foi importante
para a origem da vida?
Os espectros de FT-IR mostraram que a adsorção de Ala, Met, Gln, Asp,
Lys e His em argilas (bentonita e caulinita) ocorreu através do grupo amino,
provavelmente como NH
3
+
. Entretanto, a interação Cys/argilas ocorreu através
do grupo sulfidrila, demonstrando a complexidade da interação envolvida.
Os dados de difratometria de raios-X mostraram que o pH afeta a
camada interna da bentonita e que a expansão da Cys/bentonita em pH 3,00
foi maior do que a expansão do etileno glicol/bentonita saturado com Mg. Estes
resultados demonstram a elevada afinidade da Cys pela camada interna da
bentonita.
68
O espectro Mossbauer para as amostras com Cys adsorvida apresentou
um grande aumento (~20%) de íons ferrosos. Isto significa que a Cys foi capaz
de reduzir parcialmente o ferro presente na bentonita. Este resultado é similar
ao que ocorre com a aconitase onde íons ferro são reduzidos a Fe 2,5. Isto
mostra que a Cys pode ter tido um papel importante na química prebiótica,
além de ser apenas um dos aminoácidos em peptídeos/proteínas.
Adsorção de bases nitrogenadas sobre argilas
O caulim adsorveu muito pouco da A em pH 2,00 e nenhuma das outras
bases aqui estudadas foram adsorvidas por este mineral. Os resultados
mostram que as bases
A e C adsorvem mais sobre as argilas bentonita e
montmorilonita do que as bases
U e T. Estes resultados sugerem duas
questões, ou melhor, apontam para dois problemas: a) o pH onde ocorreu a
maior adsorção é muito baixo apesar de ocorrer em alguns hidrotermais, porém
seriam eles muito comuns? e b) o outro problema é ainda pior, a ocorrência
das bases nos seres vivos não tem a mesma relação encontrada neste
experimento.
Uma análise das bases encontradas no DNA de diversos seres vivos
mostra que a relação
A/T é por volta de 1,00. Entretanto os resultados obtidos
mostram que em qualquer situação a
A é muito mais adsorvida que a T ou seja
a relação
A/T é muito maior do que um. Estes resultados levantam algumas
questões sobre o papel dos minerais em fornecer um mecanismo para
concentração de bases: Poderíamos esperar que a composição das bases
nitrogenadas adsorvidas sobre minerais refletisse as dos DNA atuais? A
69
adsorção de bases nitrogenadas sobre minerais foi importante para a origem
da vida?
Os dados de infravermelho mostram que todas as bases interagem com
as argilas através do grupo amina.
70
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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