( PDF ) Estudo comportamental sobre os efeitos do tratamento crônico com imipramina em ratos manipulados no período neonatal

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

Estudo Comportamental Sobre os Efeitos do Tratamento

Crônico com Imipramina em Ratos Manipulados no

Período Neonatal

André Krumel Portella

Orientadora: Prof. Carla Dalmaz

Porto Alegre, Junho de 2005

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Dedicatória

À minha amada esposa...

...sem palavras, somente amor, carinho e paixão...

. II .

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Agradecimentos

Ao pessoal do Lab 32, a turma da Prof. Carla e do Prof Alex...

À minha orientadora;

À minha familia;

À falta de dinheiro, que me trouxe criatividade;

Ao café, que me manteve acordado e

a fome de saber, que ainda não saciei.

. III .

- 4 -

Estudo Comportamental Sobre os Efeitos do Tratamento

Crônico com Imipramina em Ratos Manipulados no

Período Neonatal

. IV .

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Sumário

I. Resumo 02

II. Abstract 03

III. Introdução 08

IV. Objetivos 12

V. Material e Métodos 13

VI. Resultados 20

VII. Artigo a ser submetido para publicação 21

VIII. Resultados Adicionais 52

1. Dose de Imipramina – Fêmeas 53

2. Efeito do tratamento crônico com Imipramina em ratas

fêmeas submetidas ou não à manipulação neonatal,

sobre o peso corporal, consumo de ração padrão e de água 56

3. Efeito do tratamento crônico com imipramina em ratas

fêmeas submetidas ou não à manipulação neonatal, sobre

o consumo de alimento palatável doce, basal e em resposta

a diferentes estímulos 60

4. Efeito do tratamento crônico com imipramina em

ratas fêmeas, submetidas ou não à manipulação neonatal,

sobre o desempenho na tarefas de labirinto em cruz elevado

e campo aberto 60

5. Efeito do tratamento crônico com imipramina em ratos

fêmeas e machos, submetidos ou não à manipulação

neonatal, sobre o desempenho na tarefa de preferência

condicionada de lugar (PCL) 64

IX. Discussão 68

X. Conclusões e Perspectivas 77

XI. Referências 80

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I. Resumo

Eventos precoces, particularmente diferentes tipos de estresse, como hipóxia-

isquemia, infecções, desnutrição/hipernutrição e negligência materna, podem trazer

conseqüências para toda a vida. Tais conseqüências variam conforme a qualidade, a

intensidade e a janela de tempo em que o agente agressor atuou, além da susceptibilidade

do organismo que o recebeu. Os mecanismos pelos quais estes eventos levam a tais

alterações ainda não estão totalmente esclarecidos, mas sabe-se que esta fase da vida

constitui-se ao mesmo tempo de um período de hiporresponsividade ao estresse, assim

como uma fase crítica para desenvolvimento de diversos órgãos e sistemas. Sabe-se que

desafiando a homeostasia do organismo nesse momento, ocorre uma programação de

diversos sistemas envolvidos na resposta ao estresse a um novo equilíbrio funcional, o que

pode alterar a relação saúde-doença na vida adulta.

Dentre os modelos para o estudo de intervenções precoces, temos a Manipulação

Neonatal, que consiste numa separação breve da mãe, durante o período hiporresponsivo ao

estresse. Nesse trabalho usou-se a separação por 10 min, nos primeiros 10 dias de vida. A

partir desta intervenção animais tornam-se menos reativos ao estresse, apresentam

comportamento menos ansioso frente a estressores e têm comportamento alimentar

caracterizado por um aumento no consumo de alimento palatáveis, sem alteração no

consumo de ração padrão.

O controle da alimentação envolve basicamente dois componentes, um homeostático e outro

hedônico. A preferência alimentar alterada dos animais manipulados no período neonatal

indica possivelmente uma alteração da percepção hedônica do alimento. As vias

dopaminérgicas mesolímbicas estão associadas a recompensas naturais ou biológicas como

alimentação, sexo, drogadição. Sabe-se que animais manipulados no período neonatal

apresentam redução de receptores D3 no núcleo acumbens.

A Imipramina é um antidepressivo tricíclico que age principalmente por inibição da

recaptação de serotonina e noradrenalina, e com ações indiretas sobre o sistema

dopaminérgico e eixo Hipotálamo – Pituitária - Adrenal. Seu uso crônico reforça a capacidade

do organismo de enfrentar o estresse e de sentir recompensas naturais como a da

alimentação.

O objetivo desse trabalho foi investigar se o tratamento crônico com Imipramina

reverteria o comportamento alimentar alterado de animais manipulados no periodo neonatal.

Adicionalmente investigou-se o efeito deste tratamento sobre outras alterações

comportamentais como a menor inibição exploratória no Labirinto em Cruz Elevado e menor

habituação no teste do Campo Aberto.

No consumo basal de alimento doce, houve aumento de consumo de alimento doce

apenas em machos manipulados, sendo que o tratamento com Imipramina diminui este

efeito. Os animais machos manipulados não tiveram aumento de consumo em resposta ao

estresse de contenção nem à exposição a um ambiente enriquecido, porém responderam à

novidade. Novamente aqui o tratamento com Imipramina reverteu o comportamento, pois os

animais tratados apresentaram maior reatividade aos estímulos, igualando seu modo de

reagir ao dos animais não manipulados. As fêmeas não apresentaram diferenças no

consumo de alimento doce no basal, porém o tratamento com Imipramina reduziu a

intensidade da resposta aos diferentes estímulos, levando-as a um menor consumo.

Nos testes comportamentais, de um modo geral, animais manipulados, tanto machos

(no Labirinto em Cruz Elevado), quanto fêmeas (no Campo Aberto), mostraram sinais de

menor ansiedade, sem efeito da Imipramina. Porém entre os não manipulados, a Imipramina

teve efeito ansiolítico apenas em fêmeas. Tanto o tratamento medicamentoso, quanto a

manipulação neonatal levaram a uma menor habituação ao Campo Aberto. Na Preferência

Condicionamada de Lugar houve igual desempenho de todos os animais.

O principal achado deste trabalho foi o fato dos animais manipulados não tratados com

Imipramina terem apresentado uma reduzida variabilidade nas respostas decorrentes de

mudanças ambientais, evidenciado tanto no comportamento alimentar persistentemente

mantido no mesmo patamar (independentemente das intervenções), quanto na resistência a

habituação ao Campo Aberto. A Imipramina foi eficaz em reverter apenas a alteração do

comportamento alimentar de ratos machos manipulados no período neonatal, permitindo-lhes

uma maior variabilidade de resposta, o que aproximou o seu comportamento ao dos animais

não manipulados.

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II. Abstract

Early life events, particularly different kinds of stress, like hypoxia-ischemia, infection,

over/under nutrition and maternal negligence, can leads to long lasting consequences.

These consequences vary as a matter of the quality, intensity and the window of time where

the aggressive agent acted, besides the susceptibility of the target organism. The mechanism

by which stress leads to such alterations are not well understood yet, but we know that the

neonatal period is, at the same time, a stress hyporresponsive period and a critical time for

the development of several organs and systems. By challenging the organism homeostasis in

this immature period, we program the several internal mechanism involved in the stress

response to a novel functional balance, which could alter the health/disease relationship in

the adulthood.

Among the models used for the study of early life experiences, we have the Neonatal

Handling procedure, that consists in repeated brief maternal separation during the stress

hyporresponsive period. Upon this intervention the animals become less reactive to stress,

present less anxiety behavior and have a feeding behavior characterized by an increased

consumption of palatable food, without alterations in the ingestion of standard lab chow. In

this work we used 10 minutes of maternal separation during the first 10 days of life.

Feeding control basically evolves two compounds, one homeostatic and another

hedonic. The changed feeding behavior of the handled animals possibly denotes an altered

perception of the hedonic compound of the food. The dopaminergic pathways in the

Mesolimbic system are related to natural or biological reward, such as feeding, drug addiction

and sex. We know that neonatal handled animals have an downregulation of the

Dopaminergic D3 receptors in the nucleus accumbems.

Imipramine is a triciclic antidepressive that acts mainly by inhibiting the reuptake of

Serotonin and Noradrenaline, and have indirect actions over the Dopaminergic system and

the Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis. Its chronic use strengths the capability of the

organism to faces the stress and to feel natural rewards like those from food.

The objective of this work was to investigate if a chronic Imipramine treatment could

reverse the altered feeding behavior of neonatal handled rats. Additionally we investigated the

effect of such treatment over another of their altered behavior, like the less exploratory

inhibition in the Plus Maze and their lesser habituation in the Open Field procedure.

Male neonataly handled rats had an increased sweet food consumption in the basal

test, that was reversed by Imipramine treatment. The manipulated male animals had not had

increase of consumption in reply to contention stress nor to the exposition to an enriched

environment, however they had answered to the novelty. Again the treatment with Imipramine

reverted the behavior, therefore the treated animals had presented greater reactivity to the

stimulus, equaling its way to react to the one of the não manipulad animals. The females had

not presented differences in the sweet food consumption in the basal test, however the

treatment with Imipramina seems to reduce the intensity of the reply to the different stimulus,

taking them to a lesser consumption.

In the behavorial tests, in a general way, manipulated animals, both male (in the Plus

Maze) and female (in the Open Field), had shown signals of lesser anxiety, without effect of

the Imipramine. However, between the não manipulads, the Imipramine had anxiolytic effect

only in females. Both the drug treatment and the neonatal manipulation had led to a lesser

habituation to the Open Field. In the Conditioned Place Preference we had equal

performance of all the animals.

What caught more attention in these experiments was the lack of modulation of reply of

the manipulated rats, evidente both in the feeding behavior as wel as in the Open Field.

Imipramine effectively reverted the alteration of the alimentary behavior of male rats

manipulated in the neonatal period, allowing them to have a bigger variability of reply, wich

approached its behavior to the one of the Non handled animals.

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III. Introdução

O termo “estresse” tem sido largamente usado em várias acepções.

Inicialmente foi usado na física, significando o somatório das forças internas

em um material, resultante da aplicação de uma carga externa. A partir de

1936, Hans Selye transpôs este termo para a Medicina e a Biologia, dando-

lhe o significado de esforço de adaptação do organismo para enfrentar

situações consideradas ameaçadoras à sua vida e a seu equilíbrio interno, ou

homeostase. “Estressor” seria então definido como um desafio ao indivíduo,

que perturba sua homeostase e requer uma resposta fisiológica. Pode

também ser apenas uma interpretação errônea da situação, percebida como

ameaça, que resulta numa resposta comportamental e/ou hormonal

(McEwen, 2002; Tsigos C, Chrousos GP, 2002).

Há três sistemas de resposta ao estresse classicamente descritos

(McEwen, 2002; Francis DD, Meaney MJ, 1999):

1) o Sistema Neurovegetativo, incluindo a liberação de noradrenalina

pelos terminais simpáticos e de adrenalina pela medula adrenal;

2) o Sistema Imunológico;

3) o Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA).

A ativação aguda desses sistemas promove principalmente aumento da

disponibilidade de energia e melhora do fluxo sangüíneo para órgãos-alvo,

sendo altamente adaptativa (Tsigos C, Chrousos GP, 2002).

Estímulos externos têm grande impacto sobre o sistema límbico, que se

relaciona com o hipotálamo. O controle central do sistema de resposta ao

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estresse inclui os neurônios parvocelulares do núcleo paraventricular do

hipotálamo. Estas células secretam hormônio liberador de corticotrofina

(CRH) e vasopressina (AVP) de uma maneira pulsátil, com dois ou três picos

por hora (Engler et al., 1989). Durante o estresse agudo, a amplitude e a

freqüência desses pulsos aumenta, resultando na liberação de

adrenocorticotrofina (ACTH) pela hipófise e de cortisol pelo córtex da adrenal

(Tsigos C, Chrousos GP, 1994). Citocinas e outros mediadores da inflamação

são liberados e potencializam a ação dos vários componentes do eixo HPA.

O ACTH aumenta a síntese de glicocorticóides (em humanos,

principalmente o cortisol; em roedores, principalmente a corticosterona) pela

adrenal. Em situações críticas, os glicocorticóides têm ações de proteção e

manutenção da homeostase: mobilização de estoques energéticos através da

lipólise e do catabolismo protéico, este último fornecendo substratos para a

gliconeogênese, melhora da função cognitiva, inibição da função gonadal,

alteração da homeostase do cálcio (Buckingham JC, 2000). O cortisol tem

importância na sua própria regulação neuroendócrina, uma vez que atua em

receptores do sistema límbico (especialmente amígdala e hipocampo), do

hipotálamo e da hipófise por retroalimentação negativa, encerrando a

ativação do eixo (de Kloet et al., 1998). Esse hormônio também regula a

atividade do eixo HPA, inibindo as citocinas (Tsigos C, Chrousos GP., 1994).

A inibição causada pelos glicocorticóides limita sua própria ação, prevenindo

o organismo de seus efeitos catabólicos, antirreprodutivos e

imunossupressores (Tsigos C, Chrousos GP. 2002) (Figura 1).

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FIGURA 1: Esquema simplificado do eixo HPA, incluindo a alça de

retroalimentação negativa.

Entretanto, a exposição crônica ao estresse pode ser danosa ao

organismo (Kopp MS, Rethelyi J., 2004), levando a uma série de alterações

bioquímicas e comportamentais, que envolvem, entre outras, a sensibilização

da resposta locomotora e a alteração do comportamento alimentar

(Wunderlich et al., 2004; Nikulina et al., 2004; Holmes et al., 1997). Essas

alterações também estão relacionadas ao estresse neonatal (Iwasaki et al.,

2000, Silveira et al., 2004; Sanchez et al., 2005).

O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal apresenta uma regulação peculiar no

período pré e pós-natal imediato, apresentando uma reduzida reatividade ao

estresse, caracterizada por níveis relativamente baixos e constantes de

glicocorticóides. Essa hiporresponsividade é considerada uma resposta

benéfica para o desenvolvimento do organismo, pois níveis inadequados de

HIPOTÁLAMO

CRH

ACTH

ADRENAIS

HIPÓFISE

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glicocorticóides (Neal et al., 2004; Leret et al., 2004), tanto baixos quanto

altos, têm efeitos prejudiciais sobre o desenvolvimento neural e podem levar

a conseqüências fisiológicas e comportamentais a curto e longo prazo. Essa

hiporresponsividade ocorre por meio de uma maior eficiência da retro-

alimentação negativa no hipotálamo (Sapolsky RM, Meaney MJ., 1986;

Meaney et al., 1989) e redução da resposta da glândula adrenal ao ACTH

(Yoshimura et al., 2003). Além disso, nesse período, os sistemas de resposta

ao estresse possuem alta plasticidade, pois ainda estão em desenvolvimento,

e distúrbios no padrão normal de secreção de glicocorticóides podem alterar

de forma definitiva as respostas do organismo ao estresse (Levine et al.,

1967). Desse modo, exigir uma resposta a um estressor num organismo

ainda imaturo pode levar a profundas e persistentes alterações fisiológicas e

bioquímicas, as quais levam a mudanças comportamentais, nociceptivas e

endócrinas na vida adulta (Hermel et al., 2001 ; Gomes et al., 1999 ; Smythe

et al., 1994(a) ; Stephan et al ., 2002 ; Schmidt et al., 2004).

Vários são os modelos de estresse precoce, que podem envolver, por

exemplo, separação materna, injeção de antígenos imunogênicos, exposição

a estressores físicos, como frio, calor, etc. Diferentes tipos de estressores

acionam diferentes componentes do sistema de resposta ao estresse,

portanto levam a resultados diversos. Dentro da intervenção baseada na

separação materna, encontramos na literatura vários modelos e também

grande variação de nomenclatura. A separação pode variar desde um breve

período de 1 a 15 minutos (chamado de manipulação breve) até períodos

mais extensos, como de 24 horas (privação materna / separação materna).

Atualmente, acredita-se que períodos mais breves de separação atuariam

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mais como um fator de perturbação da relação entre a mãe e a prole, tendo

pouca ação direta sobre o filhote (Caldji et al., 1998). Nessa dissertação de

mestrado o modelo adotado foi o de separação materna breve por 10

minutos nos primeiros 10 dias de vida (Silveira et al., 2004; 2005).

Vários trabalhos mostram que ratos submetidos a algum tipo de

estressor no período neonatal apresentam respostas de ACTH e

glicocorticóides alteradas frente a estressores na vida adulta (Gordon et al.,

2002; Ader R. e Grot LJ, 1969). Ratos adultos manipulados precocemente

têm uma maior densidade de receptores glicocorticóides no hipocampo

(Meaney MJ, Aitken DH, 1989) e apresentam reatividade ao estresse agudo

diferenciada, com pico de glicocorticóide semelhante a animais não

manipulados, mas um retorno mais rápido do hormônio aos níveis basais. No

entanto, a privação materna aumenta os níveis basais de ACTH, diminui os

sítios de ligação de CRH na adeno-hipófise e os aumenta no núcleo da rafe

(Plotsky PM, Meaney MJ, 1993). O mecanismo pelo qual o estresse neonatal

leva a essas alterações não está elucidado ainda. Sabe-se, porém, que a

manipulação aumenta a taxa de renovação da serotonina durante o período

neonatal somente em regiões cerebrais onde há expressão de receptores

glicocorticóides, e não em áreas onde não há este tipo de receptor (Smythe

et al., 1994 b).

Estudos revelam que intervenções feitas no período neonatal alteram a

relação mãe-filhote e que o comportamento da mãe afeta o desenvolvimento

do sistema nervoso dos filhotes (Levine S., 1994; Giovenardi et al., 1999).

Entre os efeitos comportamentais da manipulação neonatal, observados na

vida adulta, poderíamos citar uma diminuição em parâmetros relacionados à

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ansiedade (Levine et al., 1967; Silveira et al., 2005) e aumento no consumo

de alimento palatável doce e salgado (Silveira et al., 2004). Sabemos

também que esse aumento de consumo não é um comportamento

relacionado à ansiedade, uma vez que não é revertido pelo uso de

benzodiazepínicos (Silveira et al., 2005). Intervenções realizadas

precocemente na vida também têm sido modelo para adição a drogas

(Kosten et al., 2000).

Antidepressivos constituem uma classe heterogênea de medicações,

que são utilizadas para tratamento de transtornos alimentares, transtornos de

ansiedade, do humor e também em síndromes hiperalgésicas (Bacaltchuk J,

Hay P., 2003; Krueger et al., 2004). Esses transtornos estão relacionados a

alterações do eixo HPA (Heit et al., 1997; Putignano et al., 2001) e do

sistema monoaminérgico (Morilak DA, FrazerA., 2004). Há evidências de que

sua ação sobre o sistema nervoso central (SNC) reforce a capacidade do

organismo de enfrentar o estresse e aumente a efetividade da

retroalimentação negativa exercida pelos glicocorticóides, por meio do

aumento de receptores mineralocorticóides no hipotálamo (Barden N., 2004;

Reul et al., 1993) e da redução de ácido ribonucléico mensageiro (ARNm)

para o CRH no núcleo paraventricular do hipotálamo (Brady et al., 1991).

Pré-tratamento com imipramina também atenua o efeito do estresse agudo

por isolamento sobre o comportamento locomotor e exploratório (Plaznik et

al., 1993). A fluoxetina diminui a ingestão calórica em geral (proteínas,

gorduras e, com menos intensidade, carboidratos) (Heisler et al., 1997). Um

estudo também observou inibição do aumento de consumo de alimento doce

palatável (rico em carboidratos), induzido por privação alimentar (“binge

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eating”) (Hagan et al., 1997). Acredita-se que, em parte, o sucesso de

tratamentos de distúrbios alimentares com o uso de antidepressivos ocorra

devido a sua propriedade de aumentar a capacidade do indivíduo em sentir

prazer com a alimentação, reforçando a sensação de saciedade (Papp M.,

1989; Heal et al., 1998).

Poucos estudos têm usado antidepressivos na tentativa de reverter

efeitos do estresse neonatal. Um deles é o estudo de Huot et al (Huot et al,

2001), sobre dependência a drogas e ansiedade, que usou a paroxetina para

reverter dependência a drogas causada pela separação materna (Huot et al.,

2001). A imipramina foi eficaz em reverter a hiperalgesia encontrada em

ratos submetidos a privação materna no período neonatal (Stephan et al.,

2002). O estresse neonatal altera a nocicepção, mas essas alterações

variam muito conforme o modelo de estresse utilizado, levando a dados

diversos na literatura (Smythe et al., 1994 (b); Stephan et al., 2002).

A imipramina é um antidepressivo tricíclico, cujo mecanismo primário de

ação se dá por inibição da recaptação de serotonina e de noradrenalina

(Briley M., Moret C, 1993) e, em menor escala, tendo ação anti-

histaminérgica (Ookuma et al., 1990) e anticolinérgica (Gumilar et al., 2003).

Uma vantagem do uso da imipramina para estudos em modelos animais

envolvendo estresse é a possibilidade de sua administração ser efetuada por

via oral, o que evita injeções repetidas durante o tratamento. A injeção

repetida causa estresse crônico leve nos animais, levando a diversas

alterações comportamentais, como, por exemplo, redução do consumo de

alimentos palatáveis, e é usada como modelo de anedonia (Grippo et al.,

2004). A prevenção de tal efeito é conseguida exatamente pelo tratamento

- 15 -

crônico com antidepressivo (Monleon et al., 1995). Em nosso desenho

experimental, as injeções poderiam levar a um falseamento importante dos

resultados (os injetados com salina poderiam ter seu comportamento

alimentar alterado pela indução de anedonia).

Nossa hipótese é que o tratamento crônico com imipramina, por

interferir com os mecanismos de resposta ao estresse e com o sistema

monoaminérgico, aumentando a capacidade de percepção da recompensa

pela alimentação, reverteria o aumento de consumo de alimentos palatáveis

em animais manipulados no período neonatal.

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IV. Objetivos

Esta dissertação tem por objetivo estudar o efeito do tratamento crônico

com um antidepressivo, administrado na idade adulta, sobre as alterações

comportamentais causadas pela manipulação no período neonatal. Embora

nossa hipótese se relacione aos efeitos sobre o comportamento alimentar e a

percepção de alimento como recompensa, também estudaremos efeitos

sobre ansiedade e atividade motora. Assim, mais especificamente,

pretendemos avaliar o efeito da imipramina em animais (ratos machos e

fêmeas) submetidos a manipulação breve no período neonatal nos seguintes

testes:

 Comportamento alimentar: consumo de alimentos palatáveis salgados e

doces no estado alimentado (basal) e, no caso de alimento doce, em

resposta a diferentes estímulos (estresse agudo por contenção,

exposição à novidade e ambiente);

 Comportamento no labirinto em cruz elevado;

 Comportamento no campo aberto;

 Comportamento desempenho em um teste de preferência condicionada

de lugar.

- 17 -

V. Material e Métodos

1. Animais Experimentais

Ratas Wistar adultas prenhes, selecionadas ao acaso, durante a última

semana de gestação, foram obtidas do Biotério do Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sendo mantidas

individualmente em caixa-moradia. Aguardou-se o nascimento dos filhotes,

sendo então padronizados num número de 8 filhotes por ninhada. O dia do

nascimento foi considerado dia zero (D0). Os filhotes foram mantidos com a

mãe até o 21

dia de vida, quando foram então desmamados e separados

entre machos e fêmeas, sendo randomizados, com o objetivo de não se

manter mais do que dois irmãos por caixa, e mantidos em grupos de não

mais do que 5 animais. As caixas-moradia eram confeccionadas em

"plexiglas", medindo 41 x 34 x 16 cm, com assoalho recoberto de serragem,

trocada pelo menos uma vez por semana. Os animais foram submetidos a

um ciclo diário claro/escuro de 12 por 12 horas, com ração padronizada e

água "ad libitum", luzes ligadas às 7:00 horas. Desde o nascimento e até o

desmame, as únicas intervenções permitidas foram a colocação de ração e a

troca da água; qualquer intervenção que envolvesse manipulação das

ninhadas, como a troca da serragem, não foi realizada.

- 18 -

2. Manipulação Neonatal

As ninhadas foram divididas em dois grupos:

A. Ninhada não manipulada: os filhotes permanecem com suas mães nas

caixas-moradia, não sofrendo qualquer espécie de manipulação (tanto os

filhotes quanto as mães) até o 21

dia de vida.

B. Ninhada manipulada: os filhotes foram retirados da caixa e colocados em

conjunto em uma incubadora a 36 graus centígrados, onde

permaneceram por 10 minutos, sendo então devolvidos a sua caixa. Este

procedimento foi realizado do 1

ao 10

dia de vida.

Após a sexagem aos 21 dias de vida, os animais foram distribuídos

randomicamente em oito grupos, a saber:

– Grupo machos não manipulados, recebendo água (MñMA);

– Grupo machos manipulados, recebendo água (MMA);

– Grupo machos não manipulados, recebendo imipramina (MñMI);

– Grupo machos manipulados, recebendo imipramina (MMI);

– Grupo fêmeas não manipuladas, recebendo água (FñMA);

– Grupo fêmeas manipuladas, recebendo água (FMA);

– Grupo rêmeas não manipuladas, recebendo imipramina (FñMI);

– Grupo fêmeas manipuladas, recebendo imipramina (FMI).

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3. Tarefas Comportamentais

3.1 Tarefa de comportamento alimentar

O animal foi colocado em caixa retangular (corredor) com tampa de

vidro, por 3 min. No seu interior, havia um recipiente com 10 unidades de

alimento palatável doce. Como alimento doce foi usado o Froot Loops® da

Kellogs. Antes do dia do teste, o animal foi habituado a esse tipo de alimento

durante 5 dias, em restrição alimentar de 80% do consumo habitual. A

quantidade de alimento ingerido em restrição e no estado alimentado foi

medida (Ely et al., 1997).

3.2 Comportamento alimentar em resposta ao estresse agudo de

contenção

Os ratos foram submetidos a restrição de movimentos, em dispositivos

plásticos confeccionados com garrafas "PET" de COCA-COLA 600mL,

cortadas em seu bocal e fundo, e feito um corte transversal para permitir o

ajuste ao tamanho do animal. O rato foi colocado no interior das garrafas

cortadas, firmemente contido e mantido assim por um período de 1h. Após

esse período, os animais aguardaram em uma caixa semelhante à caixa-

moradia por 10 minutos, sendo a seguir testados para consumo de alimento

doce conforme item 3.1.

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3.3 Estresse por exposição à novidade e exposição a ambiente

enriquecido

Os ratos foram colocados em um ambiente novo e desconhecido para

eles, constituído de um aquário de vidro sem água, enriquecido com 4

brinquedos de plástico com cores e formas diversas, por um período de 5

minutos. Após este período, o rato foi colocado em um ambiente neutro,

composto por uma caixa de "plexiglas" individual, durante 2 minutos, sendo a

seguir testado o consumo de alimento palatável doce em corredor conforme

item 3.1.

O procedimento foi repetido como descrito acima por mais dois dias,

eliminando-se o efeito de novidade, para permitir a avaliação do componente

de estimulação ambiental.

3.5 Exposição ao labirinto em cruz elevado

O labirinto consiste em quatro braços dispostos perpendicularmente que

se cruzam centralmente. Dois braços são fechados lateralmente com

paredes de 40cm de altura. Os outros dois braços formam uma passarela

aberta. Existe, entre os braços, uma região intermediária de 10 x 10 cm.

Esse ponto de intersecção entre os braços delimita uma área central,

denominada quadrado central (10 X 10 cm). O labirinto permanece suspenso

do chão a uma altura de 50 cm.

Os animais foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE) por um

período de cinco minutos. O comportamento dos animais foi observado e

foram registradas variáveis espaciais e temporais (porcentagem de entradas

- 21 -

e tempo de permanência nos braços abertos e fechados).

3.6 Exposição ao campo aberto

O teste de campo aberto consiste de um caixa confeccionada em

madeira com a frente em acrílico (40 x 50 x 60 cm). É empregado para

avaliar as atividades exploratórias dos animais, sendo avaliados a

movimentação espontânea dos animais (número de cruzamentos, com as

quatro patas, entre as divisões do campo), o número de comportamentos de

levantar (“rearings”), assim como o tempo de latência para iniciar a

exploração, como índices de emocionalidade e atividade motora, registrados

durante um período de 5 minutos. A tendência natural do animal em um

ambiente novo é de explorá-lo, apesar do conflito com o medo provocado

pelo ambiente desconhecido. Neste trabalho de dissertação, realizamos duas

seções, aqui denominadas treino e teste, em dias consecutivos, sendo a

diferença entre um dia e outro (habituação) interpretada como índice de

memória, pois o animal tende a explorar menos um ambiente já conhecido.

3.7 Preferência Condicionada ao Lugar

Neste procedimento experimental, utilizamos uma caixa confeccionada

em madeira com 10 x 70 x 27,5 cm, dividida em dois ambientes distintos de

igual tamanho, um claro com chão liso, outro escuro com chão coberto por

uma tela de arame trançado. O aparato apresentava uma porta removível

dividindo os dois ambientes.

- 22 -

O experimento teve duração de 8 dias. No primeiro dia, realizou-se um

teste basal, medindo-se o número de entradas e tempo gasto no

compartimento claro e no compartimento escuro num período de 15 min, com

a finalidade de avaliarmos a preferência basal do animal. Esta primeira

exposição também fornece dados sobre a ansiedade gerada pela exposição à

novidade.

Do 2º ao 7º dia, os ratos foram expostos, em regime de restrição

alimentar, ao lado claro, considerado aversivo para o rato, onde foi colocado

alimento doce palatável, ou ao lado escuro, onde não havia alimento. Tais

seções tiveram duração de 30 minutos a cada dia e os animais foram

expostos alternadamente aos lados claro e escuro (Obs: os ratos foram

habituados previamente ao alimento doce palatável - Froot Loops).

No 8º dia foi realizado novo teste, nos mesmos moldes do primeiro dia.

Os resultados do 1º e do 8º dia foram então confrontados para avaliarmos se

houve alteração de preferência.

4. Tratamento Farmacológico

A imipramina (cloridrato de imipramina) foi diluída na água de beber

dos animais, numa concentração de 40 mg/dL, conforme descrição de

Stephan et al (Stephan et al, 2002). A droga foi administrada a partir do 60º

dia de vida (idade adulta) e foi mantida durante a execução de todos os

experimentos. Os ratos foram tratados por um período de 30 dias antes do

início das avaliações comportamentais. Durante todo o tempo de

- 23 -

administração do fármaco, foi monitorada a ingestão hídrica dos animais para

controle da dose.

5. Análise Estatística

Os dados (quantidade de alimento consumida, número de respostas de

orientação e cruzamentos no campo aberto, tempo e número de entradas

nos braços do labirinto em cruz elevado, tempo e cruzamentos no teste de

preferência condicionada de lugar) foram analisados por testes paramétricos

e foram expressos como média + erro padrão da média (E.P.M.). As

comparações entre os grupos experimentais foram realizadas por análise de

variância de uma via ou duas vias, com análise repetida quando era o caso,

seguidas essas análises de variância pelo teste de comparações múltiplas de

Student-Newman-Keuls, quando indicado, ou, quando entre dois grupos, pelo

teste t de Student para amostras dependentes ou independentes (Bliss,

1967; Zar, 1996).

- 24 -

VI. Resultados

Os resultados do presente trabalho de dissertação serão apresentados

na forma de um artigo, a ser encaminhado para publicação, e de resultados

adicionais, que foram obtidos mas não aparecerem no artigo.

- 25 -

VII. Artigo a ser submetido para publicação

Chronic Imipramine Treatment Reverses the Increased

Sweet Food Consumption of Neonatal Handled Rats

André K. Portella, Patrícia P. Silveira, Carla Dalmaz

PPG Neurociências e Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências

Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS, Brasil.

Research supported by CNPq.

Correspondence :

AK Portella, Departamento de Bioquímica, ICBS, UFRGS

Ramiro Barcelos, 2600 (Anexo) Lab. 32.

90035-003, Porto Alegre, RS, Brasil

Fax: 51- 3316-5535.

E-mail: [email protected]

Running title: Neonatal handling, imipramine and sweet food consumption

- 26 -

ABSTRACT

PORTELLA AK; SILVEIRA PP; DALMAZ C. Chronic Imipramine Treatment

Reverses the Increased Sweet Food Consumption of Neonatal Handled Rats

Introduction: Neonatal handling (Neo-H) permanently affects several aspects

of an individual's life. We had previously reported that Neo-H increases

ingestion of palatable food (PF) in adult rats. Antidepressives are used to treat

feeding behavior and mood disorders, probably through actions in the HPA

axis and monoaminergic system, which are also altered in the neonatal

handled rat. The aim of this study is to verify the effect of a chronic treatment

with imipramine on feeding behavior of animals subjected to neonatal

handling. Material and Methods: Litters of randonly selected pregnant Wistar

rats were divided into non handled (NH) and handled (H) groups. Handling

procedure was performed on days 1-10 after birth, 10 min/day. At 60 days of

life, the two groups were subdivided, receiving water(-Water) or imipramine (-

Imip), diluted in the tap water (mean dose of 4.3 mg/Kg/day). At 90 days of

life, we tested the consumption of sweet food at basal and after exposure to

acute restraint stress (ARS), novelty (Nov), and exposure to an enriched

environment (EE). We also evaluated the behavior of the animals in the plus

maze and open field tests. Results: H rats weighted less than NH rats, and

imipramine treated rats showed a reduction in weight gain after 30 days of

treatment. No differences were observed in standard lab chow and water

intake, but H-Water consumed more PF (basal measurement). Novelty

increased PF intake in all rats; ARS did not increase PF consumption in H-

Water and H-Imipramine rats, whereas EE increased PF consumption, except

in H-Water group. In the plus maze, handled rats showed less anxiety

- 27 -

behavior, which was not influenced by the drug. Both imipramine treated and

neonatal handled rats presented impaired habituation to the open field.

Conclusions: We concluded that Imipramine treatment: (1) reverses the

increased basal sweet food consumption of handled rats, (2) restores the

feeding behavior reactivity to the environment, (3) reduces weight gain,

probably by changing energy balance, (4) had no effect on the plus maze test,

and (5) leads to the same impairment of habituation in the open field found in

neonatally handled animals. We discuss these results in terms of stress,

mesolimbic monoaminergic reactivity and hedonic food consumption.

Key words: feeding behavior, neonatal handling, palatable food ingestion,

imipramine, antidepressive, open field, plus maze, anxiety, body weight

- 28 -

INTRODUCTION

Perinatal events have been implicated in several neuroendocrine and

behavioral alterations in adulthood. Several studies have documented the

impact of early life events, like maternal separation and neonatal handling, on

hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) axis function and on behavior (1,

2, 3, 4). The Central Nervous System (CNS) is very vulnerable in the neonatal

period, when a hyporesponsive, immature and yet very plastic neural system

can be permanently altered by different environmental challenges. During this

period, an efficient maternal care is critical for the neonate to develop

optimally (5, 6).

The HPA axis is the chief component activated in response to actual or

presumed challenges. It is intimately linked to the monoaminergic system, as

several of its dysfunctions also leads to alterations in the monoaminergic

system. Examples of these alterations are the sensitization of the

dopaminergic system (7, 8, 9, 10), and the dysregulation of the serotonergic

system (12) induced by chronic stress. Both systems are involved in the

etiopathogenesis of major psychoses and altered feeding behaviors (18, 19,

20, 21). Alterations of the HPA axis have also been reported to accompany

certain psychiatric diseases, such as major depression (24) and feeding

disorders (25).

Perinatal events are also related to similar alterations later in life (13, 14,

15). Neonatal handling is known to lead to permanent alterations in brain

dopaminergic and serotonergic systems (16, 17). It has been related to

decreased anxiety, reduced fear in a new environment (6, 22), and less

- 29 -

reactivity to stress, with lower HPA reactivity (1, 23). An increased number of

type 2 glucocorticoid receptors in hippocampus and reduced Corticotrofin

Releasing Hormone (CRH) in hypothalamus, locus ceruleus and median

eminence are some of the neurochemical alterations found in these animals

(3, 4).

Antidepressives are a heterogeneous group of drugs used for the

treatment of depression, anxiety and feeding disorders. Their mechanisms of

action have in common the modulation of neurochemical systems, including a

hyperactive HPA axis (24), and a disturbed monoaminergic system (27)

Imipramine is a reference tricyclic antidepressive, with primary actions in

blocking the reuptake of Serotonin (5HT) and Noradrenalin (NA) (28), and, in

a less extent, antihistaminergic (29) and anticholinergic effects (30). Chronic

antidepressive treatment has regulatory effects on HPA axis, increasing the

effectiveness of the negative feedback of cortisol (31). Chronic imipramine

treatment reverses the reduction in palatable food consumption observed in

rats exposed, during adulthood, to chronic mild stress, in a model of

anhedonia (32), probably by increasing the functions of the dopaminergic

system (33). Some of the succes in the treatmento of feeding disorders by

antidepressives are credited to their ability in increasing the rewarding aspect

of food, thus improving satiety (39, 40).

Previous studies from our group showed that neonatal handling alters

feeding behavior. Neonatal handled rats present an increased preference for

palatable foods (14), and this behavior is not related to anxiety, as it is not

reversed by diazepam, nor is accompanied by anxiety like behavior (26).

Feeding behavior is regulated by several homeostatic and hedonic factors.

- 30 -

The altered food preference of the neonatal handled rats is most probably due

to hedonic factors, since there is no change in standard lab chow consumption

(14). Changes in dopaminergic neurotransmission have been demonstrated in

these animals (34), and the dopaminergic system is known to be involved in

sensitivity to food reward (35). Since chronic use of imipramine can regulate

the monoaminergic system and HPA axis, we hypothesized that imipramine

could act restoring some of the alterations found in neonatal handled rats,

such as their altered feeding behavior. Our secondary aim was to observe the

effects of such treatment on behavioral tasks related to locomotion, anxiety,

reactivity to stress, novelty and an enriched environment.

MATERIAL AND METHODS

Subjects:

Pregnant Wistar rats from our breeding stock were randomly selected

and housed alone in home cages made of Plexiglas (65 x 25 x 15 cm), with

the floor covered with sawdust, and maintained in a controlled environment

(lights on between 07:00h and 19:00h, temperature of 22 +

2°C). Within 24 h

after birth, all litters were standardized to eight pups and they were maintained

undisturbed, with minimal care until weaning – there was no sawdust

exchange or any manipulations except for the handling procedure. Weaning

occurred on postnatal day 22. No more than two male pups were used per

litter per group. Rats were housed in groups of four to five per cage. A total of

78 (seventy eight) adult male rats were used. They had free access to food

(standard lab rat chow) and water. Tasks were performed between 13:00h

- 31 -

and 16:00h h in proper rooms with the same controlled environmental

conditions. Rats were first habituated to the room where the behavioral tasks

were performed for at least 20 minutes. After being exposed to the behavioral

tasks, animals were returned to their cages. When a group was exposed to

more than one subsequent task, we respected a minimum of three days of

resting. Drug treatment was not interrupted during the experiments. All animal

treatments were in accordance with the recommendations of the International

Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) and received ethical approval

from the the Federal University of Rio Grande do Sul Ethical Committee.

Neonatal Handling procedure:

Non-handled group – Pups were left undisturbed with the dam until

weaning.

Handling – Pups were removed from their home cage and placed in a

clean cage lined with clean paper towels. This cage was placed in an

incubator at 34.0 ± 2.0 °C. After 10 minutes, pups were returned to their dams.

This procedure was performed during the first ten days of life, and the pups

were then left undisturbed until weaning.

Chronic imipramine treatment:

The two groups mentioned above [non-handled (NH) and handled (H)

groups] were subdivided into water and imipramine treated groups.

Imipramine chloridrate was dissolved in drinking water in a concentration of 40

mg/L, using light protected bottles (36), allowing a final mean ingestion of 4.24

± 0.25 mg/Kg in the NH group and 4.38 ± 0.11 mg/Kg in the H group

- 32 -

(Student’s t test, P=0.643). The chronic treatment was initiated at 60 days of

age, and behavioral tasks were applied at least 30 days later. Imipramine

treatment was maintained during all the period the experiments took place.

Standard lab chow ingestion, water consumption and weight measurement

The standard lab chow and water consumption were measured during

a period of six days, by leaving a determined amount of food in the cage and

water in the bottle and checking the remainder each day. The average

ingestion per day per cage was calculated. We used this approach to exclude

the effect of acute social isolation stress. Body weight was measured in three

different occasions, at 90 days of life (before the beginning of the behavioral

tasks; n=13-19/group), at 120 days of life (n=13-19/group), and, in a sample of

the animals in each group, at 150 days of life (n=5-8/group).

Behavioral tasks:

Sweet food ingestion

Rats were tested as adults (ninety days old). The animals were placed

in a lightened rectangular box (40 x 15 x 20 cm) with floor and side walls

made of wood and a semi-transparent glass ceiling. Ten Froot loops

(Kellogg's

- pellets of wheat and corn starch and sucrose) were placed in

one extremity of the box. Each animal was submitted to five habituation trials

of three minutes each, on subsequent days, under food restriction of 80% of

habitual ingestion. After being habituated, animals were left with ad libidun

food access for 24h, and were then put in the same apparatus for a 3 min test

session, when the number of ingested pellets was counted (14, 26, 36). A

- 33 -

protocol was established so that when the animals ate part of the Froot loops

(e.g.: 1/3 or 1/4), this fraction was considered. The counting was done always

by the same person to exclude interobserver bias.

Stress-Induced Feeding Test

Rats were put in an adjustable plastic cylinder (25.0 x 7.0 cm), and

restrained by adjusting the cylinder with plaster tape on the outside for a

period of 1 h. After this period, they were left in individual home-cages for 10

minutes and then tested for palatable food consumption in the same way as

described above.

Novelty- and enriched environment-induced feeding test

In the first day the animals were first presented to an empty glass

aquarium measuring 25 x 55 x 26 cm, that contained three small toys of

different shapes and colors. After a period of 5 minutes, the animals were

removed to a neutral environment (an individual cage) for 10 minutes, when

consumption of palatable food was evaluated. The consumption in this first

day was used to evaluate the effect of novelty on ingestion. During three

consecutives days, the same procedure was performed. The ingestion of

sweet food after exposure to this enriched environment (when no novelty was

present) was also evaluated.

Open field exposure

Open field consisted in an open wooden arena (53,5 x 35 cm) divided into

twelve equal squares, measuring 12.5 x 12.5 cm. Forty-five cm high walls

- 34 -

bordered the field. The animals were gently placed facing the left corner and

observed directly and continuously for 5 minutes. The following behavioral

components were measured: horizontal locomotion (the number of line

crossings), rearing (standing upright on the hind legs), and latency to leave

the first square (in seconds). These measurements were made in two

sequential days (training and test sessions). The difference in the values of

crossings, rearings and latency between the test (Day2) and the training

(Day1) trials was used as a measure of memory retention (habituation).

Elevated plus-maze test

The elevated plus maze apparatus was made of wood and consisted of two

opposed open arms (50 X 10 cm), two opposed enclosed arms with no roof

(50 X 10 X 40 cm), and an open square (10 X 10 cm) in the center. The maze

was elevated 80 cm above the floor. The behavioral test was conducted in the

observational room using red light illumination. The animal was placed into the

center of the plus-maze, facing one of the open arms, and remained in the

apparatus for five minutes. We analyzed the number of entries and the time

spent on open and enclosed arms. A rat was considered to have entered one

arm of the maze when all four feet were within the arm. During the 5-min test

period, conventional parameters of anxiety-like behavior were monitored, i.e.,

the number of entries into the closed arms, entries into the open arms, and the

total time spent in each arm. The ratio "time spent in the open arms/time spent

in all (i.e., open and closed) arms" was calculated and multiplied by 100, to

yield the percentage of time spent in open arms. This parameter is considered

- 35 -

to reflect fear-induced inhibition from entering the open arms and can be

related to the "anxiety" level experienced by the animal.

Statistical analysis:

Data were expressed as mean + standard error of the mean, and

analyzed by a one or two-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range

test, or by repeated measures ANOVA (36). SPSS 8.0 statistical package

software was used. Results were considered statistically significant if p< 0.05.

RESULTS

Body weight

Two-way ANOVA showed an effect of handling at 90 days of life (Two-

way ANOVA; n=11-16 per group; F

(1, 54)

= 5.444; P = 0.023 for handling; F

(1, 54)

= 0.098; P = 0.755 for imipramine treatment; F

(1, 54)

= 0.105; P = 0.747 for the

interaction): H rats weighted less than NH. At 120 days of age, the effect of

handling was still evident, and we also observed an effect of the chronic

imipramine treatment, impairing the rate of weight gain in both H and NH

groups (Two-way ANOVA; 11-16 per group; F

(1, 54)

= 6.078; P = 0.017 for

handling; F

(3, 54)

= 4.099; P = 0.048 for imipramine; F

(1, 54)

= 0.006; P = 0.938

for the interaction). The same effects were still evident at 150 days (Two-way

ANOVA; n = 5-8 per group; F

(1, 19)

= 4.690; P = 0.043 for handling; F

(1, 19)

9.122; P = 0.007 for imipramine treatment; F

(1, 19)

= 0.192; P = 0.666 for the

interaction) (Figure 1).

- 36 -

Figure 1: Body weight at 90, 120 and 150 days of life in animals submitted to neonatal

handling and controls, and subjected or not to imipramine treatment when adults (data in

grams, Mean ± S.E.M.). (a) Statistical significant effect of handling in all ages measured. (b)

Statistical significant effect of Imipramine treatment at 120 and 150 days of age (60 and 90

days of treatment). S.E.M. = Standard Error of the Mean. NH = Non Handled; H = Handled. (Y

axis starts at 300g to better visualize the effects).

Standard lab chow ingestion and water consumption

As displayed in Table 1, there were no statistical differences between

the groups in mean standard lab chow consumption (Two-way ANOVA; n = 4-

7; F

(1, 16)

= 0.290; P = 0.598 for handling; F

(1, 16)

= 0.006; P = 0.937 for

imipramine; F

(1, 16)

= 0.847; P = 0.371 for the interaction). Adjusting for

consumption according to weight did not change the significance of the results

(data not show). There were no statistical differences between groups on

water consumption (Two-way ANOVA; n = 4-7; F

(1, 16)

= 0.019; P = 0.892 for

handling; F

(1, 16)

= 0.007; P = 0.935 for imipramine; F

(1, 16)

= 1.959; P = 0.181

for the interaction).

- 37 -

Table 1:

Groups

Mean daily consumption of

standard lab chow

(g±S.E.M.)

Mean daily intake of water

(mL±S.E.M.)

NH-Water 35.25 ±1.02 g 21.56 ±0.97 ml

H-Water 36.73 ±0.97 g 21.90 ±0.86 ml

NH-Imipramine 36.99 ±1.69 g 22.44 ±0.50 ml

H-Imipramine 35.18 ±0.87 g 21.16 ±0.61 ml

Table 1: Mean daily consumption of standard lab chow and mean daily intake of drinking

water in the cage per rat, values in g per animal and mL per animal, respectively. There are

no statistically significant differences (see text). S.E.M. = Standard Error of Mean. NH = Not

Handled; H = Handled.

Behavioral tasks:

Sweet food ingestion

Animals handled during the neonatal period presented increased consumption

of sweet food at three months of age (One-way ANOVA; n = 16-21; F

(3, 73)

2,768; P = 0.048), post hoc analysis (Duncan) showed that, while handled

animals ate more sweet food, the handled animals treated with imipramine

presented no such effect (Figure 2).

- 38 -

Figure 2: Basal sweet food ingestion (data in number of pellets, Mean ± S.E.M.). (*)

Statistical significant effect of handling only in rats not treated with Imipramine. NH =

Non Handled; H = Handled.

Sweet food ingestion after acute restraint stress

Almost every group increased their intake from basal, but this effect was

less evident in Handled rats, specially in the H-Water group (Repeated

Measures ANOVA, n= 8, F

(1,28)

= 8.475 , P = 0.07, overall, without

significative interactions). (Figure 3a).

Sweet food ingestion after exposure to novelty and to an enriched

environment

All groups presented increased sweet food intake after exposure to

novelty, when compared to the basal consumption (Repeated Measures

Sweet Food Ingestion

0,5

1,5

2,5

Groups

Number of Pellets

NH-Water

H-Water

NH-Imipramine

H-Imipramine

Fig. 2

- 39 -

ANOVA, Basal x Day1, n= 8-11 per group, F

(1,31)

= 28.129 , P < 0.001,

overall, with significative interaction for handling x drug treatment F

(1,31)

4,797 , P = 0.036).

During the second and third days of exposure to this enriched

environment, however, H-Water rats no more presented such increase in

sweet consumption from basal levels (Repeated Measures ANOVA, Basal x

Day2, n= 8-11 per group, F

(1,31)

= 21.096, P < 0.001, overall, with significative

interaction for drug treatment, F

(1,31)

= 4.115 , P = 0.051 and handling x drug

treatment F

(1,31)

= 11.152, P = 0.002; Basal x Day3: n= 8-11 per group, F

(1,31)

= 22.825, P < 0.001, overall, with almost significative interaction for handling x

drug treatment F

(1,31)

= 3.954, P = 0.056). Spreading the analysis to all days,

we saw the same result (Repeated Measures ANOVA, Basal x Day1 x Day2 X

Day3, n= 8-11 per group, F

(1,31)

= 18.740 , P < 0.001, overall, with significative

interaction for handling, F

(1,31)

= 4,415 , P = 0.044 and handling x drug

treatment F

(1,31)

= 5,385 , P = 0.027). (Figure 3b).

- 40 -

Figure 3: (a) Sweet food consumption after acute restraint stress. Only NH rats significantly

increased their sweet food consumption, but H-imipramine rats showed a higer increase tham

H-Water rats. (b) Sweet food consumption after novelty and enriched environment

expositions. H-Water rats increased their ingestion only after novelty. Data expressed as

number of pellets consumed, Mean ± S.E.M. NH = Non Handled; H = Handled.

Fig. 3a

Fig. 3b

- 41 -

Open Field Test

There were no differences in the number of crossings during the first or

the second days, but we observed an overall effect of habituation (Repeated

Measures ANOVA, n= 11-16 per group, F

(1,51)

= 14,400, P < 0.001, with an

almost significative interaction with handling x Imipramine, F

(1,51)

= 2,992, P =

0.090 that seens tobe due to the increased magnitude of the decrease in the

number of crossings in the NH-water group).

Concerning rearings, in the first day (training session), we observed a

decreased number of rearings in the handled groups, indicating an effect of

the handling procedure (Two-way ANOVA, n = 11-16; F

(1,51)

= 4.810; P =

0.033 for handling; F

(1, 51)

= 1.843; P = 0.181 for imipramine; F

(1, 51)

= 1.034; P

= 0.314 for the interaction). In the test session, there was an interaction

between handling and imipramine treatment, were NH-Imipramine rats still

presented an increased number of rearings (Two-way ANOVA, n = 11-16; F

(1,

51)

= 3.054; P = 0.087 for handling; F (1, 51) = 1.995; P = 0.164 for imipramine;

(1, 51)

= 3.893; P = 0.05 for the interaction, followed by post hoc (Duncan) ).

Repeated Measures ANOVA showed no effect of habituation (F

(1,51)

= 2.543,

P = 0.117).

Latency to leave the first square was not different between the groups,

in both first and second days. We observed an overal effect of habituation

(Repeated Measures ANOVA, n= 11-16 per group, F

(1,51)

= 4.632 , P = 0.036)

(Table 2).

- 42 -

Table 2:

Crossings Rearings Latency Open Field

Day1 Day2

Day1 Day2 Day1 Day2

NH – Water

57.82

±5.88

31.18

±5.71

7.18

±1.92

4.27

±1.77

3.26

±0.44

1.50

±0.19

H – Water

57.58

±5.78

51.08

±7.80

5.17

±1.23

4.67

±1.59

4.21

±0.83

2.21

±0.33

NH– Imipramine

50.06

±5.47

42.94

±6.21

11.25

±1.92

10.19

±2.16

3.06

±0.94

2.72

±0.44

H – Imipramine

56.38

±8.07

46.56

±7.00

5.75

±1.46

3.69

±1.08

4.44

±0.86

3.18

±1.41

Table 2: Open field results, values expressed as mean ±SEM.

significant difference from D1, p<0.05 (Repeated Measures ANOVA);

significant difference within the groups in the same day, with p<0.05 (One

Way ANOVA with post hoc when needed; Duncan);

Plus maze test

A two-way ANOVA showed an increased proportional time spent in the

open arms in the H-Water and H-Imipramine groups (n=11-16 per group; F

(1,

51)

= 4.022; P = 0.050 for handling; F

(1, 51)

= 0.104; P = 0.749 for imipramine;

(1, 51)

= 0.203; P = 0.654 for the interaction). There were no statistical

differences in the total number of entries and the number of entries in the

open or closed arms between groups (Table 3).

- 43 -

Table 3:

Plus

Maze

Time spent in

open arms

Time spent in

closed arms

% Time in

open arms

Number of

entries in

open

arms

Number of

entries in

closed

arms

Total

number of

entries

NH –

Water

122.91±7.34 170.45±7.63 41.92±2.52 6.64±0.70 5.73±0.60 12.36±1.16

H – Water 159.08±14.75* 130.50±14.95* 54.97±5.22* 8.08±0.68 6.67±0.89 14.75±1.13

NH –

Imipramine

119.25±17.31 163.88±18.82 42.60±6.17 6.38±0.85 5.73±0.60 13.44±1.02

H –

Imipramine

141.94±13.49* 138.44±14.52* 50.87±4.92* 6.69±0.79 6.19±0.52 12.88±0.81

Table 3: Performance in the elevated plus maze. Data expressed as Mean +

S.E.M. of the time and the percentage of time spent in the open arms, as well

as the number of entries during 5 minutes exposure to the elevated plus

maze. H-Water and H-Imipramine rats spent more time in the open arms. (*)

p<0.05 -Two Way ANOVA.

- 44 -

Discussion

In this study, we demonstrated that imipramine reversed the effects of

neonatal handled on feeding behavior in adulthood, reducing the increased

basal consumption of sweet food and increasing their reaction to

environmental challenges. We also observed an effect of the drug preventing

the weight gain without altering the normal feeding (standard lab chow

ingestion) in both groups.

Neonatal handling increased sweet food ingestion without alteration of

lab chow ingestion, as reported earlier (14, 26). Therefore, it is believed that

hedonic mechanisms are involved. We hypothesized that neonatally handled

rats experience less pleasure when eating a palatable food, seeking to eat

more to feel better. It is known, however, that imipramine can increase the

reward value of reinforcers. When using this antidepressive, these animals

presented the same feeding behavior as controls concerning ingestion of

sweet food. It is possible that they acquire an increased perception of the

rewarding value of the sweet food, and will eat and behave similarly to control

rats.

Nevertheless, we cannot totally discard the possibility of a “ceiling effect”,

impairing the sweet food test ability to present an increased consumption in

those animals with a high basal intake, although previous studies from our

laboratory showed that rats can frequently eat more than that (11).

Stress alters feeding behavior in several ways. Such modulation of the

appetite involves the release of stress hormones, like CRH and

glucocorticoids, concomitantly with the activation of the dopaminergic and

- 45 -

opioid mesocorticolimbic systems (43). Considering behavioral alterations

observed in rats submitted to handling in the neonatal period, Lucion and

coworkers (55) have suggested that this procedure could affect the

interpretation the animal makes of different environment stimuli. Since

handled animals respond in a lesser extend to an environmental challenge,

presenting a decreased stress response (1, 23), this could explain the

decreased response to stressors on sweet food ingestion in this group.

Imipramine-treated neonatally handled rats increased their ingestion in

relation to handled-water group in response to stressors, maybe due to a

different response to stress in these animals, which could be closer to the

response presented by control rats. Possibly, neonatally handled imipramine-

treated rats respond more efficiently to the external stimulus and this is

reflected in the sweet food consumption. Alternatively, we could explain this

effect as an increased sensitivity of the dopaminergic mesolimbic system, as

imipramine effectively upregulate this system (40).

Depending on stress nature, intensity and duration, it can either

increase, as it has been reported after chronic restraint and after acute tail

pinch stress (11, 43), or decrease feeding, like in psychological and restraint

stress (41, 42). Our results are in contrast with this last study, as our rats

increased their consumption after restraint stress. This probably is due to

methodological issues, especially regarding the time chose to evaluate

consumption, as we measured the intake of sweet food in a period of 3

minutes beginning just 10 min from the end of restraint.

Another interesting result was the weight difference at 90 days of life,

were H rats presented a higher body weight than NH ones. This observation

- 46 -

does not agree with some previous results, when differences between the

groups were not significant (14, 39, 44). Another interesting result was the

reduced weight gain in the imipramine treated rats after 30 days of treatment.

This effect coincides with the onset of the antidepressive effect of the drug,

and could be due to an alteration in the metabolic efficiency of the organism,

since there were no differences in the standard lab chow consumption. There

are evidences that antidepressive treatment increases thermogenesis in the

resting state and in reaction to glucose ingestion (45, 46). Another possible

explanation would be a diminished reaction to stress, leading to chronically

lower levels of glucocorticoids, and, consequently, less deposition of

abdominal fat (47); nevertheless, it should be noted that handled rats, which

also present decreased glucocorticoids levels, have more deposition of

intraperitonial fat (38).

Not all effects of neonatal handling were reversed by imipramine

treatment. Although sweet food consumption and the feeding behavior in

response to stress in handled animals treated with imipramine are similar to

control animals, the performance in the plus maze was not affected by this

drug, suggesting that the reduced anxiety levels observed in the adulthood in

neonatal handled rats is not affected by imipramine. This dissociation of

results further suggests that the effects of handling during the neonatal period

on sweet food ingestion are not related to a different anxiety level, which

agrees with a previous study (48).

Additionally, results from the exposure to the open field suggest that both

treatments, handling and chronic imipramine, impaired habituation in this task.

Reports concerning memory in animals handled during the neonatal period

- 47 -

shows that handling is protective to the deleterious effets of aging (49), mild

stressors (50) and neonatal hypoxia-ischemia (51) on spatial memory.

However, it is important to consider that handled animals could present

different levels of emotional reactivity interfering with memory. It has been

shown that the stress level induced by exposure to the behavioral task used to

evaluate memory may lead to different results in memory retention (54).

Memory is known to require some level of activation of stress hormones in

order to present adequate storage (52, 53). Here again, since handling

reduces the stress response (49), this could be involved in the impaired effect

observed in this group on habituation.

In conclusion, we believe that handled rats present a resistance to

change their behavior in response to environmental stimuli, as we have

observed in the exposure to the open field and in the consumption of sweet

food in response to external stimuli (restraint, changes in the environment).

Imipramime was able to reverse this pattern of behavior only regarding

feeding. These findings contribute to the study of neonatal interventions and

the posterior behavior alterations, and emphazise the necessity for additional

studies on the effects of neonatal interventions, particularly in relation to

eating disorders and drug addiction, and the possible reversion of such

findings with pharmacological treatment.

- 48 -

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- 56 -

VIII Resultados Adicionais

1. Dose de Imipramina - Fêmeas

A dose média de imipramina em fêmeas ficou cerca de 20% maior do

que em machos (ANOVA de Duas Vias; n = 4-6 caixas por grupo ; F

(1, 9)

0,15; P = 0,5 para manipulação; F

(1, 9)

= 14,132; P = 0,009 para gênero; F

(1, 9)

= 1,627; P = 0,249 para interação), devido ao fato de as fêmeas consumirem

mais água por kg de peso corporal, e a concentração da solução de

imipramina ser a mesma para ambos os sexos. Em função desse resultado,

os demais resultados serão analisados separadamente, para machos e

fêmeas (veja a Figura 2 para a dose de imipramina nas fêmeas).

Figura 2:

Figura 2: Dose de imipramina (mg/kg) para ratas fêmeas

manipuladas ou não manipuladas) no período neonatal. Não houve

diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Teste t de

Student, t = 1,065; P = 0,399).

Dose de Imipramina - Fêmeas

Grupos

Dose em mg/kg por rato/dia

Não Manipuladas

Manipuladas

- 57 -

2. Efeito do tratamento crônico com Imipramina em ratas

fêmeas submetidas ou não à manipulação neonatal, sobre

o peso corporal, consumo de ração padrão e de água.

2.1 Peso aos 90 e 120 dias

Não houve diferença entre os pesos das fêmeas, quando comparados

os diferentes grupos (Figura 3; ANOVA de Duas Vias para 90 dias; n = 12-17

por grupo; F

(3, 56)

= 1,926; P = 0,171 para manipulação; F

(3, 56)

= 0,183; P =

0,671 para imipramina; F

(3, 56)

= 0,326; P = 0.570 para interação). O

tratamento com imipramina não influenciou o ganho de peso (ANOVA de

Medidas Repetidas; n = 12-17 por grupo; F

(1, 53)

= 0,64, P=0,427 para tempo;

(1, 53)

= 0,19; P = 0,662 para manipulação; F

(1, 53)

= 0,33; P = 0,568 para

imipramina; F

(1, 53)

= 1,04, P = 0,313 para interação).

Figura 3:

Figura 3

: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o peso

de ratas fêmeas aos 90 e 120 dias de vida, tratadas ou não com

imipramina na idade adulta. Não houve diferença estatisticamente

significativa entre os grupos. (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas -

Água; FMA: Fêmeas Manipuladas -Água; FÑMI: Fêmeas Não

manipuladas - Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas -

Imipramina).

Peso aos 90 e 120 dias - Fêmeas

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

90 120

Dias de vida

Peso em gramas

FñMA

FMA

FñMI

FMI

- 58 -

2.2 Consumo de Ração Padrão

Observamos um efeito do tratamento crônico com imipramina sobre o

consumo de ração padrão em fêmeas, sem efeito da manipulação neonatal

(ANOVA de Duas Vias; n = 5 caixas por grupo; F

(1, 12)

= 0,282 ; P = 0,605 para

manipulação; F

(1, 12)

= 5,343 ; P = 0,039 para imipramina; F

(1, 12)

= 0,007 ; P =

0,934 para interação) (Figura 4).

Figura 4:

Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

consumo de ração padrão em ratas fêmeas tratadas ou não com

imipramina na idade adulta. Houve uma redução na ingestão,

causada pelo tratamento com imipramina (ANOVA de duas vias, P

< 0,05 para imipramina). (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas -

Água; FMA: Fêmeas Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não

manipuladas - Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas -

Imipramina).

Consumo de Ração Padrão - Fêmeas

Grupos

Consumo em gramas por rato

FñMA

FMA

FñMI

FMI

- 59 -

2.3 Consumo de água

O consumo de água não foi diferente entre os grupos (ANOVA de Duas

Vias; n=3-4 caixas por grupo; F

(1, 13)

= 3,921; P = 0,076 para manipulação; F

,13)

= 1,383; P = 0,267 para imipramina; F

(1, 13)

= 2,864; P = 0,121 para

interação), conforme mostrado na Figura 5.

Figura 5:

Figura 5

: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

consumo de água em ratas fêmeas tratadas ou não com

imipramina na idade adulta. Não houve diferença entre os grupos.

(FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água; FMA: Fêmeas

Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não manipuladas -

Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas - Imipramina).

Consumo de Água - Fêmeas

Grupos

Conumo em mL por rato

FñMA

FMA

FñMI

FMI

- 60 -

3. Efeito do tratamento crônico com imipramina em ratas

fêmeas submetidas ou não à manipulação neonatal, sobre

o consumo de alimento palatável doce, basal e em resposta

a diferentes estímulos.

3.1 Consumo de alimento doce no estado basal

Não houve diferença no consumo de alimento palatável doce

(ANOVA de Duas Vias; n = 17-21 por grupo; F

(1,74)

= 0,281; P = 0,598 para

manipulação; F

(1,74)

= 0,709; P = 0,402 para imipramina; F

(1,74)

= 0,752; P =

0,389 para interação) (Figura 6).

Figura 6

: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

consumo de alimento palatável doce em ratas fêmeas tratadas ou

não com imipramina na idade adulta. Não houve diferença entre os

grupos. (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água; FMA: Fêmeas

Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não manipuladas -

Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas - Imipramina).

Consumo de Alimento Palatável Doce - Fêmeas

0.5

1.5

Grupos

Número de Rosquinhas

FñMA

FMA

FñMI

FMI

- 61 -

3.2 Consumo de alimento doce após estresse de

contenção

Todos os grupos responderam ao estresse de contenção com aumento

do consumo (ANOVA de medidas repetidas F

(1,34)

= 24,167; P<0,001), sem

interação com imipramina (F

(1,34)

=0,375 ; P=0,544), manipulação (F

(1,34)

3,128 ; P = 0,086) ou imipramina e manipulação (F

(1,34)

= 0,290 ; P = 0,594).

Figura 7: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

consumo de alimento palatável doce em resposta ao estresse de

contenção em ratas fêmeas tratadas ou não com imipramina na

idade adulta. Anova de medidas repetidas mostrou efeito do

estresse de contenção em aumentar o consumo em todos os

grupos (p<0,001). (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água;

FMA: Fêmeas Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não

manipuladas - Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas -

Imipramina).

Consumo de Alimento Doce Pós Estresse de Contenção -

Fêmeas

0.5

1.5

2.5

FñMA FMA FñMI FMI

Número de Rosquinhas de Froot Loops

Basal

Contenção

- 62 -

3.3 Consumo de alimento doce após exposição à

novidade e ao ambiente enriquecido.

3.3.1 Efeito da Novidade

Todos os grupos responderam à exposição ao ambiente novo com

aumento do consumo em relação ao basal, porém o efeito é atenuado pelo

uso da imipramina (ANOVA de medidas repetidas, basal x novidade,

interação com Imipramina, F

(1,34)

=6,59 ; P = 0,015, sem interação com

manipulação, F

(1,34)

=1,95 ; P = 0,172) ou entre imipramina e manipulação,

(1,34)

= 0,61; P = 0,440).

3.3.2 Efeito exposição continuada ao ambiente enriquecido

O resultado é o mesmo na ausência de novidade, quando os animais

são expostos a este ambiente enriquecido, ou seja, todos aumentaram o

consumo em relação ao basal, mas as ratas tratadas com imipramina tiveram

atenuação do efeito (ANOVA de medidas repetidas, basal x novidade x dia 2

x F

(1,34)

=52,317 ; P < 0,001, F

(3,96)

=32,10 ; P < 0,001; interação com

imipramina, F

(3,96)

= 4,52 ; P = 0,005, sem interação com manipulação,

(3,96)

=1,22 ; P = 0,306) sem interação entre imipramina e manipulação, F

(3,96)

= 0,36; P = 0,781). Veja a Figura 8.

- 63 -

Figura 8:

Figura 8

: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o consumo

de alimento palatável doce em resposta à novidade e ao ambiente

enriquecido em ratas fêmeas tratadas ou não com imipramina na idade

adulta. ANOVA de medidas repetidas mostrou aumento do consumo em

todos os grupos, tanto para novidade quando para ambiente enriquecido, p <

0,001, com atenuação do efeito nas ratas tratadas com imipramina (interação

p < 0,05). (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água; FMA: Fêmeas

Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não manipuladas - Imipramina; FMI:

Fêmeas Manipuladas - Imipramina; AE: Ambiente Enriquecido).

Consumo de Alimento Doce Pós Novidade e Ambiente

Enriquecido - Fêmeas

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

FñMA FMA FñMI FMI

Número de Rosquinhas

Basal

Novidade -Dia1

AE - Dia2

AE - DIa3

- 64 -

4. Efeito do tratamento crônico com imipramina em ratas

fêmeas, submetidas ou não à manipulação neonatal, sobre

o desempenho na tarefas de labirinto em cruz elevado e

campo aberto.

4.1 Labirinto em cruz elevado

Na variável de tempo nos braços abertos houve interação manipulação

x imipramina (ANOVA de Duas Vias; n = 12-16 por grupo ; F

(1, 55)

= 0,416; P =

0,522 para manipulação; F

(1, 55)

= 2,012; P = 0,162 para imipramina; F

(1, 55)

6,042; P = 0,017 para interação), análise post-hoc (Duncan) mostrou efeito da

imipramina em aumentar o tempo no braço aberto apenas nas fêmeas não

manipuladas. Considerando-se a porcentagem de tempo despendida nos

braços abertos, o resultado é semelhante (ANOVA de Duas Vias; n = 12-16

por grupo; F

(3, 55)

= 0,195; P = 0,660 para manipulação; F

(3, 55)

= 2,130; P =

0,150 para imipramina; F

(3, 55)

= 5,993; P = 0,018 para interação).

No número de entradas nos braços abertos também houve interação

manipulação x tratamento (ANOVA de Duas Vias; n = 12-16 por grupo; F

(1, 55)

= 1,874 ; P = 0,177 para manipulação; F

(1, 55)

= 0,026 ; P = 0,873 para

imipramina; F

(1, 55)

= 9,218 ; P = 0,004 para interação); análise post-hoc

(Duncan) mostrou efeito da droga em aumentar o número de entradas no

aberto apenas nas fêmeas não manipuladas.

Não houve diferenças no número de entradas nos braços fechados

(ANOVA de Duas Vias; n = 12-16 por grupo; F

(1, 55)

= 0,536 ; P = 0,467 para

manipulação; F

(1, 55)

= 0,763 ; P = 0,386 para imipramina; F

(1, 55)

= 0,001 ; P =

0,975 para interação). Veja a tabela 2.

- 65 -

Tabela 2:

Labirinto

em Cruz

Elevado

Tempo nos

Braços Abertos

Tempo nos

Braços

Fechados

% Tempo

nos Braços

Abertos

Número de

Entradas

nos Braços

Abertos

Número de

Entradas

nos Braços

Fechados

FÑMA

118,25±14,57 172,00±14,47 40,72±4,95 8,00±1,04 8,42±0,92

FMA

141,40±11,62 143,73±11,62 49,58±4,04 9,47±0,84 8,93±0,78

FÑMI

167,75±11,12* 123,81±12,96* 57,99±4,13* 10,81±1,05* 7,75±0,61

FMI

128,13±13,61 153,81±14,28 45,21±4,50 6.94±0,51 8,31±0,66

Tabela2: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

comportamento na tarefa do Labirinto em Cruz Elevado em ratas

fêmeas tratadas ou não com imipramina na idade adulta. Anova de

duas vias mostrou menor inibição da exploração dos braços

abertos nas fêmeas não manipuladas tratadas com imipramina, p <

0,05. (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água; FMA: Fêmeas

Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não manipuladas -

Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas - Imipramina).

* p<0,05 - ANOVA de 1 ou 2 vias, seguida de post hoc – Duncan.

- 66 -

4.2 Campo aberto

4.2.1 Número de cruzamentos horizontais

Houve habituação para esta tarefa, representada por uma diferença no

comportamento entre as seções [ANOVA de medidas repetidas F

(1,54)

= 4,121;

P = 0,047), sem interação com imipramina (F

(1,54)

= 2,593; P=0,113), ou entre

imipramina e manipulação (F

(1,54)

= 0,001; P = 0,982), porém houve quase

efeito da manipulação (F

(1,54)

= 3,843; P = 0,055)].

A ANOVA de duas vias no Dia 2 mostra maior número de cruzamentos

nos grupos manipulados, sem efeito da imipramina (ANOVA de Duas Vias; n

= 12-16 por grupo; F

(1,52)

= 8,475; P = 0,005 para manipulação; F

(1,52)

0,025; P = 0,875 para imipramina; F

(1,52)

= 1,132; P = 0,292 para interação).

4.2.2 Número de respostas de orientação vertical ("Rearings")

Houve habituação, representada pela diferença de comportamento

entre as duas sessões, sem interação entre sessão e imipramina ou

manipulação [ANOVA de medidas repetidas F

(1,55)

=6,131; P=0,016), sem

interação com imipramina (F

(1,55)

= 0,50; P = 0,824), manipulação (F

(1,55)

0,139; P=0,711), ou imipramina e manipulação (F

(1,55)

= 0,208 ; P = 0,650)].

4.2.3 Latência para deixar o primeiro retângulo

Houve habituação, representada pela diferença de comportamento

entre as duas sessões, sem interação com imipramina ou manipulação

[ANOVA de medidas repetidas, F = 6,13; P = 0,016), sem interação com

- 67 -

imipramina (F = 0,05; P = 0,824), manipulação (F = 0,14; P = 0,711), ou

imipramina e manipulação (F = 0,21; P = 0,650)]. No entanto apenas as ratas

manipuladas ficam no segundo dia com uma latência menor (ANOVA de

Duas Vias; n = 12-16 por grupo; F

(3, 52)

= 5,122; P = 0,028 para manipulação;

(3, 52)

= 0,252; P = 0,618 para imipramina; F

(3, 52)

= 0,180; P = 0,673 para

interação). Veja a tabela 3).

Tabela 3:

Cruzamentos “Rearings” Latência Campo

Aberto

Dia1 Dia2

FÑMA 77,55

±6,73

52,00

±7,53

14,92

±3,15

9,67

±3,00

3,81

±0,85

2,38

±0.36

FMA 92,80

±6,35

86,33

±7,44*

18,33

±2,90

13,40

±2,90

2,81±0,

1,33

±0,21

FÑMI 72,69

±5,32

63,56

±7,28

17,94

±3,10

15,25

±3,94

2,61±0,

2,84

±0,78

FMI 73,56

±6,77

79,50

±7,98*

16,25

±4,51

10,44

±2,34

3,59±0,

1,61

±0,17*

Tabela 3: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

comportamento na tarefa de campo aberto em ratas fêmeas

tratadas ou não com imipramina na idade adulta. Anova de

Medidas Repetidas mostra um efeito geral de habituação em todas

as variáveis, p < 0,05, porém ela é mais evidente no grupo não

manipulado água. (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas - Água;

FMA: Fêmeas Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não

manipuladas - Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas -

Imipramina).

$ - Dia1 difere do Dia2 – ANOVA de medidas repetidas, p < 0,05.

• - Diferença entre os grupos no mesmo dia - ANOVA de Duas Vias, p <

0,05.

- 68 -

5. Efeito do tratamento crônico com imipramina em ratos

fêmeas e machos, submetidos ou não à manipulação

neonatal, sobre o desempenho na tarefa de preferência

condicionada de lugar (PCL).

5.1. Fêmeas

5.1.1 Tempo no compartimento claro

Houve habituação entre as seções [ANOVA de medidas repetidas F

(1,54)

= 35,374 P < 0,001, sem interação entre sessão e imipramina

(1,54)

=0,342; P = 0,561), manipulação (F

(1,54)

=2,555; P = 0,116) ou entre

imipramina e manipulação (F

(1,54)

= 1,852; P = 0,179)].

A ANOVA de duas vias no dia 1 e no dia 8 mostra que as ratas tratadas

com imipramina passam menos tempo no lado claro (Dia 1; n = 12-16 por

grupo ; F

(3, 54)

= 0,479; P = 0,492 para manipulação; F

(3, 54)

= 4,192 ; P = 0,045

para imipramina; F

(3, 54)

= 0,251; P = 0,618 para interação / Dia8 : n = 12-16

por grupo; F

(3, 54)

= 0,908 ; P = 0,345 para manipulação; F

(3, 54)

= 5,495 ; P =

0,023 para imipramina; F

(3, 54)

= 0,788; P = 0,379 para interação).

5.1.2 Cruzamentos

Houve diferença entre as seções [ANOVA de medidas repetidas F

(1,54)

30,886; P < 0,001, sem interação com imipramina (F

(1,54)

=0,481; P = 0,491),

manipulação (F

(1,54)

=0,028; P = 0,869) ou imipramina e manipulação (F

(1,54)

0,004; P = 0,947)]. Veja a Tabela 4.

- 69 -

Tabela 4

Tempo no Claro Cruzamentos PCL

Dia1 Dia8

FÑMA

279,50±38,48 333,00±29,80 19,50±1,92 24,42±2,41

FMA

249,60±25,79 389,73±44,75 20,73±1,98 25,20±1,64

FÑMI

211,38±21,64* 288,13±19,05* 17,38±1,79 23,50±1,47

FMI

206,27±22,40* 290,13±22,87* 19,60±1,17 25,53±1,59

Tabela 4: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

comportamento na tarefa da Preferência Condicionada de Lugar

em ratas fêmeas tratadas ou não com imipramina na idade adulta.

Anova de Medidas Repetidas mostra um efeito geral de alteração

de preferência em todos os grupos, p<0,05. Ratas tratadas com

imipramina ficam menos tempo no lado claro, tanto no dia 1 quanto

no dia 2 (Anova de duas vias). (FÑMA: Fêmeas Não manipuladas -

Água; FMA: Fêmeas Manipuladas - Água; FÑMI: Fêmeas Não

manipuladas - Imipramina; FMI: Fêmeas Manipuladas -

Imipramina).

$ - Dia 1 difere de Dia 8 – ANOVA de medidas repetidas, p < 0,05.

* - Diferente dos grupos não tratados com imipramina no mesmo dia) -

ANOVA de Duas Vias, p < 0,05.

- 70 -

5.2 Machos

5.2.1

Tempo no Claro

Houve habituação entre as seções [ANOVA de medidas repetidas, F

(1,51)

= 76,107; P < 0,001, sem interação entre sessão e imipramina

(1,51)

=2,566; P=0,115), manipulação (F

(1,51)

=0,150; P = 0,700) ou imipramina

e manipulação (F

(1,51)

= 0,319; P = 0,575)].

A ANOVA de duas vias no Dia 1 e no Dia 8 mostra que não há diferença

entre os grupos (Dia 1: n = 12-16 por grupo; F

(1, 51)

= 0,032; P = 0,859 para

manipulação; F

(1, 54)

= 2,056; P = 0,158 para imipramina; F

(1, 51)

= 0,367; P =

0,547 para interação / Dia 8: n = 12-16 por grupo; F

(1, 51)

= 0,093; P = 0,762

para manipulação; F

(1, 51)

= 0,727; P = 0,398 para imipramina; F

(1, 51)

= 0,907;

P = 0,345 para interação).

5.2.2 Cruzamentos

Houve diferença entre as seções [ANOVA de medidas repetidas, F

(1,51)

= 87,958; P < 0,001, sem interação entre sessão e imipramina (F

(1,51)

=0,637;

P=0,428), manipulação (F

(1,51)

=0,775; P = 0,383) ou imipramina e

manipulação (F

(1,51)

= 1,571; P = 0,216)].

A ANOVA de duas vias no Dia 1 e no Dia 8 mostra que também não há

diferença entre os grupos (Dia 1; n = 12-16 por grupo; F

(1, 51)

= 0,783; P =

0,380 para manipulação; F

(1, 54)

= 3,474; P = 0,068 para imipramina; F

(1, 51)

2,420; P = 0,126 para interação / Dia 8: n = 12-16 por grupo; F

(1, 51)

= 3,145; P

= 0,082 para manipulação; F

(1, 51)

= 1,967; P = 0,167 para imipramina; F

(1, 51)

0,428; P = 0,516 para interação). Veja a Tabela 5.

- 71 -

Tabela 5

Tempo no Claro Cruzamentos PCL

Dia1 Dia8

MÑMA

153,00±22,90 299,36±43,30 12,73±1,32 19,55±1,43

MMA

171,33±26,83 325,17±35,22 17,50±2,83 23,75±2,46

MÑMI

133,63±18,52 371,31±43,46 12,13±1,70 18,25±1,63

MMI

123,63±23,99 321,19±32,89 10,81±1,67 20,19±1,26

Tabela 5

: Efeito da manipulação no período neonatal sobre o

comportamento na tarefa da Preferência Condicionada de Lugar

em ratos machos tratadas ou não com imipramina na idade adulta.

Anova de Medidas Repetidas mostra um efeito geral de alteração

de preferência em todos os grupos, p < 0,05. (MÑMA: Machos Não

manipulados - Água; MMA: Machos Manipulados - Água; MÑMI:

Machos Não manipulados - Imipramina; MMI: Machos Manipulados

- Imipramina).

$ - Dia 1 difere do Dia 8 – ANOVA de medidas repetidas, p < 0,05.

- 72 -

IX Discussão

1. Consumo de alimento palatável: medidas basais e

em resposta a diferentes intervenções

A manipulação neonatal aumentou o consumo de alimento doce apenas

em machos, mas não em fêmeas. Essa diferença entre sexos pode ter

ocorrido devido a fatores hormonais relacionados ao ciclo estral, que não foi

controlado neste estudo. De fato há evidências de que os efeitos do estresse

neonatal apresentam dimorfismo sexual (Panagiotaropoulos et al., 2004; Park

et al., 2003). É importante, porém, ressaltarmos que, em nossa experiência,

em alguns trabalhos as fêmeas manipuladas apresentam efeitos semelhantes

aos observados para os machos no que se refere ao comportamento

alimentar (Silveira et al., 2004 e 2005).

O estrógeno tem efeitos conhecidos sobre o consumo alimentar,

aumentando o consumo de alimento doce (Gamaro et al., 2003; Boswell et

al., 2005), além de sensibilizar o funcionamento do sistema dopaminérgico

mesocorticolimbico, intimamente ligado ao consumo de alimentos palatáveis,

propensão a droga-adição e relacionado com a resposta ao estresse (Smith

et al., 2004; Hu et al., 2004).

O tratamento com imipramina teve efeito de atenuar o maior consumo

de alimento doce em ratos machos manipulados no período neonatal, no

estado alimentado e sem a influência de fatores ambientais (estressantes e /

ou agradáveis).

- 73 -

Em resposta ao estresse de contenção, observamos aqui que os

machos manipulados, especialmente aqueles não tratados com imipramina,

não aumentaram o consumo da mesma forma que os animais não

manipulados, após terem sido expostos a esse tipo de estressor. Novamente,

o tratamento com imipramina parece alterar o comportamento alimentar de

machos manipulados, ainda que não significativamente. No entanto, uma

ressalva a ser feita é sobre a possibilidade de um possível efeito teto ter

impossibilitado o aumento de consumo nos machos manipulados recebendo

água. A despeito de considerarmos essa possibilidade, temos observado, nas

mesmas condições experimentais, em nosso laboratório, que é comum ratos

apresentarem consumo maior que o observado aqui, seja no estado de jejum

ou alimentado (Ely et al., 1997). Além disso, os machos manipulados tratados

com imipramina, após serem expostos à novidade, mostraram ser possível

um consumo maior. As fêmeas reagiram uniformemente ao estresse de

contenção com aumento do consumo.

No teste de exposição à novidade, todos os animais apresentaram

aumento do consumo de alimento palatável, porém nota-se um efeito da

imipramina em diminuir a resposta de aumento do consumo alimentar nas

fêmeas, principalmente as não manipuladas. Na exposição continuada ao

ambiente enriquecido, apenas os machos manipulados, que receberam água,

voltaram a ter um consumo igual ao basal. A imipramina, neste caso, quando

administrada a machos manipulados, novamente torna o comportamento

desses animais mais parecido com o de ratos não manipulados.

A exposição à novidade pode ser considerada como estresse leve,

portanto gerando um resultado semelhante ao estresse de contenção agudo,

- 74 -

porém aqui fica mais evidente uma recuperação da reatividade ao ambiente,

pelos machos manipulados tratados com imipramina. Esses resultados

sugerem que a alteração do comportamento alimentar, relacionada a

alimentos palatáveis doces, encontrada em ratos machos foi, em grande

parte, revertida pela utilização crônica do antidepressivo imipramina.

O consumo alimentar em resposta ao estresse envolve a participação do

hormônio liberador de corticotrofina (CRH) no hipotálamo, que em níveis

baixos a moderados, correspondentes a estresse leve a moderado, leva ao

aumento do consumo alimentar, e também da concomitante liberação de

dopamina e opióides endógenos no sistema mesocorticolimbico

(Samarghandian et al., 2003). Esses resultados permitem supor que a

resposta alimentar a um estressor moderado e leve, impingido ao animal de

forma aguda, está preservada em todos os grupos, sendo menos evidente

nos machos manipulados e nas fêmeas, sejam não manipuladas ou

manipuladas, tratadas com imipramina. Esse caso é favorável ao fato já

conhecido de que a reatividade ao estresse agudo está preservada nos ratos

machos manipulados, com igual ou maior elevação inicial dos níveis de CRH,

ACTH e cortisol, porém com mais rápido retorno aos níveis basais, gerando

uma menor exposição total aos hormônios de reação ao estresse (Levine,

2000; Liu et al., 1997 e 2000; Panagiotaropoulos et al., 2004), semelhante ao

que ocorre com o uso crônico de imipramina em humanos sadios (Michelson

et al., 1997). Ao que se sabe, tanto o tratamento crônico com antidepressivo,

quanto a manipulação neonatal levam a níveis basais de CRH menores, não

alteram a resposta ao estresse agudo, mas tornam os animais mais

resistentes ao estresse crônico (Butterweck et al., 2001).

- 75 -

Os resultados em fêmeas notoriamente demonstram um dimorfismo

sexual importante no que tange ao comportamento em estudo. Observamos

uma falta de efeito da manipulação em fêmeas, que se comportam como não

manipuladas, sugerindo que possuem uma maior reatividade à novidade, fato

que concorda com o resultado do estudo de Park e colaboradores, onde a

manipulação neonatal levou a uma maior reatividade ao estresse em fêmeas

(Park et al., 2003). A reversão pelo uso do antidepressivo, evidente no teste

da novidade, corrobora esta hipótese.

Resta esclarecer o porquê dessa reversão do comportamento alimentar

em machos manipulados, uma vez que já possuem o eixo Hipotálamo

Pituitária Adrenal menos reativo (Plotsky PM, Meaney MJ 1992, Francis et al

1999). Neste caso, a imipramina poderia atuar alterando apenas os sistemas

monoaminérgicos, em especial as vias dopaminérgicas, tornando-as mais

reativas, ou sensibizadas. O estresse crônico é capaz de gerar anedonia em

ratos, e essa anedonia, caracterizada por um menor consumo de alimentos

doces, está associada a um menor número de receptores D2 no sistema

mesolímbico. A imipramina, em tratamento crônico, restaura o consumo de

alimento doce nesses ratos, e essa restauração também está associada a

uma recuperação no número de receptores D2. No entanto, em animais não

estressados, a imipramina reduz o receptores D1, tanto no sistema

mesolímbico quanto estriatal (Papp et al., 1994).

Van der Elst, estudando linhagens de ratos Wistar selecionadas

conforme a reatividade a apomorfina (agonista D1/D2), mostrou que ratos

hiper-responsivos à apomorfina, que também são mais responsivos ao

estresse, apresentam maior e mais duradoura liberação de dopamina no

- 76 -

Nucleo Acumbens em resposta à novidade (van der Elst et al., 2005). Sabe-

se também que esse mesmo tipo de animal, em condições basais, ingere

menos álcool, comparado a animais hipo-responsivos à apomorfina (Sluyter

et al., 2000), porém em resposta a um desafio estressor consomem mais

álcool que os hiper-responsivos (Van der Kam et al., 2005). Resultados

semelhantes aos encontrados aqui, onde em geral os ratos com maior

reatividade ao estresse apresentam menor consumo de alimento doce em

condições basais, porém possuem maior aumento de consumo quando

desafiados. Possivelmente, o sistema mesocorticolimbico, que é o

responsável pela intermediação de comportamentos relacionado a prazer e

recompensa, esteja alterado nestes animais. Evidências disso são os

achados recentes de que há redução nos receptores D3 de Dopamina no

núcleo acumbens em ratos machos manipulados (Brake, 2004).

- 77 -

2. Labirinto em cruz elevado, campo aberto e preferência

condicionada de lugar

Ratos machos manipulados passam mais tempo nos braços abertos do

labirinto em cruz elevado, não tendo diferenças significativas no número de

entradas, nos braços abertos e fechados. Este resultado mostra que a

manipulação neonatal resultou em uma menor inibição do comportamento

exploratório nestes ratos frente à exposição a um ambiente ansiogênico. Este

resultado concorda com estudos prévios de nosso e de outros laboratórios

(Silveira et al., 2005; Padoin et al., 2001, Kalinichev et al. 2002). Não houve

efeito da imipramina nestas variáveis estudadas em machos. No caso dos

ratos não manipulados, a ausência de efeito ansiolítico pode ser pela baixa

dose utilizada, em torno de 4,3 mg/kg/dia. Ainda, de acordo com a literatura,

já nâo se encontrou efeito ansiolítico da imipramina no labirinto em cruz

elevado, mesmo em doses maiores, de até 10 mg/kg (Griebel et al., 1997).

Nas fêmeas, na variável de tempo proporcional nos braços abertos, houve

interação entre manipulação e tratamento, onde se nota que o tratamento

com imipramina teve efeito de aumentar o tempo nos braços abertos apenas

em ratas não manipuladas. O número de entradas nos braços abertos

também foi maior nesse grupo. Juntos, estes dados nos permitem sugerir que

a imipramina teve efeito de reduzir a ansiedade apenas em fêmeas não

manipuladas, sugerindo uma maior sensibilidade ao tratamento com este

fármaco para a resposta ansiolítica em fêmeas não manipuladas. A ausência

de efeito da droga em fêmeas manipuladas talvez se deva a alterações

- 78 -

bioquímicas / fisiológicas destes animais, que estejam levando a uma maior

resistência à ação da droga.

No campo aberto, nota-se uma maior resposta locomotora das fêmeas

manipuladas, e também uma menor latência no segundo dia, sugerindo

também menor ansiedade e/ou uma maior atividade locomotora. No entanto,

o principal resultado, pela magnitude e consistência do achado entre os

grupos, é a menor habituação, tanto dos animais manipulados, fato já

constatado na literatura (Silveira et al 2005), mas também em animais

tratados com imipramina.

Uma possível explicação para essa menor habituação seria a de que

haveria um menor estímulo para a formação de memória pela menor

reatividade ao estresse desses animais, pois nesses encontra-se uma menor

reatividade à novidade com menor liberação de glicocorticoides e dopamina,

que são necessários para a consolidação de memória (Mele et al., 2004,

Ferretti et al., 2005). Também se sabe que a imipramina dificulta a formação

de memória não associativa através do “downregulation” de receptores

5TH2A e ações anticolinérgicas (Mogensen et al., 2003).

No teste de preferência condicionada de lugar houve igual alteração de

preferência dos animais, sem interação com sexo, intervenção neonatal ou

tratamento com imipramina, mostrando que os mecanismos de formação de

associação e recompensa estão preservados nestes animais. Sabe-se que a

integridade do sistema dopaminérgico é essencial para a realização desta

tarefa, porém o teste é pouco sensível para detecção de alterações mais

leves (Papp, 1989).

- 79 -

3. Ganho de peso e consumo alimentar de ração padrão

Um resultado chamativo foi a diferença de peso aos 90 dias de vida dos

ratos machos, porém uma limitação do estudo foi o fato de não se ter uma

medida de peso anterior, o que nos dificulta afirmar que este achado se deva

ao procedimento de manipulação neonatal. Além do mais, estudos prévios de

nosso laboratório não encontraram tal diferença, e na revisão da literatura há

estudos que mostram que os ratos manipulados pesam mais que os controles

não manipulados (Panagiotaropoulos et al., 2004; Young, 2000), porém em

porcos a manipulação neonatal também levou a uma diminuição de peso

(Weaver et al., 2000).

Também se encontrou uma redução da velocidade de ganho de peso

dos ratos machos tratados cronicamente com imipramina a partir dos 90 dias

de vida. Tomando este dado junto com o fato de que não houve diferença no

consumo de ração padrão, pode-se supor que o tratamento com imipramina,

de alguma forma, possa ter alterado o metabolismo energético e ganho de

peso nesses animais. De fato, na literatura encontram-se evidências de que

antidepressivos aumentam a termogênese em repouso e em resposta à

ingestão de glicose (Kudoh et al., 2003; Bondi et al., 2000). Outra possível

explicação para isso seria uma menor reatividade ao estresse induzida pelo

tratamento com imipramina, com menores concentrações de glicocorticóides

cronicamente, levando a uma menor deposição de gordura (Rosmond e

Bjorntorp, 2000).

Ao contrário dos machos, as fêmeas não apresentaram diferenças no

peso. No entanto, as ratas tratadas com imipramina apresentaram um menor

consumo alimentar de ração padrão. Esse dado favorece a hipótese de

- 80 -

alteração do metabolismo energético proposta para os machos, sendo que

nas fêmeas, possivelmente por não haver uma propensão para o crescimento

nas idades avaliadas, o efeito se manifeste por uma redução do consumo

alimentar, por um mecanismo de auto-regulação da ingestão de alimentos.

- 81 -

X. Conclusões

Assim sendo, considerando os resultados obtidos e discutidos acima,

chegamos às seguintes conclusões:

1) Confirmando estudos prévios, animais machos manipulados no

período neonatal ingerem mais alimento doce em condições sem estresse,

apresentam comportamento menos ansioso no Labirinto em Cruz Elevado e

menor habituação no Campo Aberto.

2) Machos e fêmeas responderam de maneira diversa à manipulação

neonatal, no que se refere ao comportamento alimentar.

3) Animais machos manipulados no período neonatal apresentam menor

modulação do consumo de alimento doce em resposta a estressores

ambientais.

4) Tratamento crônico com imipramina reverte os efeitos induzidos pela

manipulação neonatal sobre o comportamento alimentar de ratos machos.

5) Tratamento crônico com imipramina reduz o efeito da novidade e da

estimulação ambiental em fêmeas.

6) Tratamento crônico com imipramina altera o ganho de peso, sem

reduzir o consumo de ração padrão em animais machos, e reduz o consumo

de ração padrão sem alterar o ganho de peso em fêmeas.

- 82 -

Perguntas que ficam (Perspectivas)

1. Porque fêmeas manipuladas são diferentes dos machos

manipulados?

Possíveis hipóteses seriam a interação com hormônios femininos,

fatores genéticos, sensibilização das vias dopaminérgicas pelo estrógeno e

um efeito diferente da manipulação neonatal (Panagiotaropoulos et al., 2004;

Park et a.,l 2003; Gamaro et al., 2003; Boswell et al., 2005).

2. Porque machos manipulados comem mais doce em condições

sem estresse?

Seria pelo fato de serem hipo-reatores ao estresse e à dopamina?

3. Quais as conseqüências metabólicas a longo prazo do maior

consumo de alimentos palatáveis em condições de pouco

estresse?

Provavelmente dependeria do meio. Se o ambiente for pouco

estressante e a oferta abundante na maior parte do tempo, a tendência seria

a de se ingerir mais alimentos ricos em açúcares, com conseqüências

metabólicas de indução de arterioesclerose, Hipertenção Arterial Sistêmica e

Síndrome Metabólica (Liu et al., 2001, Jeppesen et al., 1997, Coutinho et al,

1999). No entanto, em ambiente mais adverso, provavelmente os animais não

manipulados teriam mais problemas metabólicos, pois reagiriam mais, pelo

menos igualando a preferência por alimentos palatáveis, e ao mesmo tempo

estariam expostos a maior quantidade de glicocorticóides, uma combinação

- 83 -

metabolicamente mais danosa para o organismo. São possibilidades que

podem ser testadas futuramente.

- 84 -

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