ads:
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Parasitologia
Estudo comparativo da ação da saliva de triatomíneos
(Heteroptera: Reduviidae) e do predador Belostoma anurum
(Heteroptera: Belostomatidae) sobre as preparações de nervo
isolado de Rattus novergicus e de vaso dorsal de Rhodnius prolixus
Ceres Luciana Alves
Belo Horizonte
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Ceres Luciana Alves
Estudo comparativo da ação da saliva de triatomíneos
(Heteroptera: Reduviidae) e do predador Belostoma anurum
(Heteroptera: Belostomatidae) sobre as preparações de nervo
isolado de Rattus novergicus e de vaso dorsal de Rhodnius prolixus
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Parasitologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Parasitologia.
Área de Concentração : Entomologia
Orientador: Prof. Marcos Horácio Pereira
Co-Orientador: Prof. Nelder de F. Gontijo
Universidade Federal de Minas Gerais
Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos
Departamento de Parasitologia – ICB -UFMG
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
2007
ads:
043 Alves, Ceres Luciana
A
474e Estudo comparativo da ação da saliva de triatomíneos (Heteroptera:
Reduviidae) e do predador Belostoma anurum (Heteroptera:
Belostomatidae) sobre as preparações de nervo isolado de Rattus
novergicus e de vaso dorsal de Rhodnius prolixus. [manuscrito] / Ceres
Luciana Alves. – 2007.
94 f. : il. ; 29 cm.
Orientador: Marcos Horácio Pereira. Co-orientador: Nelder de
Figueiredo Gontijo.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Parasitologia.
1. Triatoma - Teses. 2. Panstrongylus - Teses 3. Belostoma -
Teses. 4. Saliva - Teses. 5. Inibição do impulso nervoso. 6.
Parasitologia – Teses. I. Pereira, Marcos Horácio. II. Gontijo, Nelder
de Figueiredo. III. Universidade Federal de Minas Gerais.
Departamento de Parasitologia. IV. Título.
CDU: 576.88/.89
Aos meus pais e irmãos
pelo amor, incentivo,
apoio e compreensão
AGRADECIMENTOS
Nesta seção de agradecimentos, quero agradecer a todas as pessoas especiais que participaram
de mais esta etapa da minha vida, sempre me apoiando.
Ao Professor Dr. Marcos Horácio Pereira muito obrigada pela oportunidade de fazer parte da
equipe do laboratório, pela orientação desde a iniciação científica e ajuda cotidiana, pelo
aprendizado constante ao longo desses anos, enfim, obrigada mesmo por tudo...
Ao Professor Dr. Nelder de Figueiredo Gontijo também pela constante orientação e
acompanhamento durante todos esses anos, pelas valiosas discussões e disposição para ajudar
sempre que necessário.
Ao Professor Dr. Alan Lane de Melo, muito obrigada pelo apoio, colaboração, pelas
discussões valiosas, críticas e importantes sugestões feitas no desenvolver desse trabalho.
Gostaria de agradecer também a todo o pessoal do Laboratório de Fisiologia de Insetos
Hematófagos (LFIH), que propiciaram um ambiente de trabalho agradabilíssimo, César,
muito obrigada pela ajuda durante os experimentos. Dani, minha amiga e ex-companheira de
projeto, foi ótimo trabalhar com você, valeu por tudo. Vaninha e Lú adm, vocês que além de
amigas são minhas veteranas de curso e de lab., obrigada pelas dicas e pelo companheirismo,
adoro vocês. As “Diabas da Taz” Adriana, Chefa, Isabella, que tornaram cada dia especial e
divertido no decorrer do trabalho. Ao pessoal da antiga, Raquel, Fernanda Puc e Veruska As
recém chegadas Andreza, Rafaela, Jéssica, Érika e Natasha que tornaram o clima no lab.
ainda mais animado. A “ala masculina do lab.” Ricardo, Vlad, Felipe e Artur, por um
cotidiano muito legal. As “forças superiores” Áurea e Mônica, pela amizade exta-LFIH
construída.
À Dr. Érika Carime Borges, do LFIH, pelas importantes sugestões feitas ao trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia, em especial ao Coordenador do Curso:
Professor Pedro Marcos Linardi, pelo empenho e dedicação ao curso; e à secretária do curso
de Pós-graduação em Parasitologia, “nossa querida” Sumara Aparecida G. Ferreira, pela
assistência e apoio técnico e emocional.
À CAPES pela bolsa de financiamento de Mestrado.
Aos colegas de Departamento, Lara, Heloísa, Cíntia, Karina, aos Bicudos:Sílvia, Elisa, Carol
e Andrey, ao pessoal do Laboratório de Culicídeos, em especial para a Ione, Jivago, Márcia,
Rose, Matheus e Gigante.
À Dr. Liléia Diotaiuti e à Dr. Silvia Ermelinda Barbosa, ambas do Laboratório de
Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas do IRR/FIOCRUZ, pelas importantes
críticas e excelentes sugestões feitas ao trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas do
IRR/FIOCRUZ, em especial a Raquel, Rita, Alessandra e João Paulo.
Aos meus amigos de curso, em especial a AMIGA Cíntia por estar presente em muitos
momentos especiais da minha vida. A AMIGA Maíra, pela ajuda constante, por ser tão
especial e gente muiiiito boa.
Obrigada a todos os meus Amigos “extra-UFMG” em especial ao Clelton, Patrícia,
Elisângela, Andréia, Lé, Laís, Geralda, valeu pelo apoio. Ao Léo, meu amigo dos tempos de
DiamondMall, obrigada pelo incentivo durante a etapa do vestibular, se não fosse por seus
conselhos eu não chegaria aqui. A Paula, minha amiga, valeu pela energia, apoio e alegria...
Ao Antônio, obrigada mesmo por todo apoio, incentivo, ajuda e principalmente por sua
compreensão durante esse tempão...
Agradeço à “Família Mexicana” (Turma de Mestrado 2005 – Departamento de Parasitologia
do ICB/UFMG) e os “Agregados”, juntos, compartilhamos momentos difíceis e alegres, acho
que sem vocês tudo seria ainda mais difícil... Então vou começar pelas “Barangas do 227” –
Ana Flávia – “A mais racional da turma” é companheira de estudos, McDonald’s e afins e de
Mineirão, Carla Maria – “ A mais brava” é companheira de choros, danças, estudos e
seminários; Kelly Key – “A mais querida” é companheira de estudos, passeios turísticos e do
serão noturno das fases pré e pós-tese, “Barangas” obrigada pelo companheirismo inestimável
e por todos os momentos incríveis vividos pelo nosso “quarteto fantástico” que foi formado;
“O Casal” – Sydnei Leonardo “O mais picareta” e Renata Cristina “A pegadora”, vocês são os
meus companheiros de estudos, conspirações, seminários e nos últimos tempos do livro da
ABNT, obrigada pela amizade e cumplicidade, adoro vocês; Priscila Helena – “A mais
organizada, disciplinada, é a mãe do Jorge”, e companheira de estudos e Pizzas; Fernanda
Regina – “A garota Udi” companheira de estudos e do Laboratório; Camila Gabriela – “A
mais gente boa” – companheira de estudos e eventos da turma; Izabela Graziela – “A gata de
Botas” – companheira de estudos e da famosa carrocinha, Meninas, obrigada pela amizade , e
constante apoio nos momentos difíceis.
Quero agradecer em especial à minha família, que me apoiou, durante todas as etapas da
minha vida, Zoraide (Mãe), Benedito (Pai), Hertz e Geisa (Irmãos) e Daniele (Cunhada).
Muito obrigada por todo amor, carinho e compreensão. Obrigada também por sonhar junto
comigo, e por isso, tornar possível a realização e conquista desse sonho. Sem vocês tantos
outros sonhos não seriam possíveis, valeu !!! Cherloque, Diana, Karl e Tathy, não me esqueci
de vocês...
Agradeço também a Deus que tornou esse momento possível, e que está sempre presente em
todos os momentos da minha vida...
“Qualquer tolo inteligente consegue
fazer coisas maiores e mais complexas.
É necessário um toque de gênio e muita
coragem para ir na direção oposta
.”
Albert Einstein
RESUMO
Realizou-se um estudo comparativo da ação da saliva de triatomíneos (Triatoma
infestans e Panstrongylus megistus) e do predador Belostoma anurum sobre o potencial de
ação composto (PAC) de nervo ciático isolado Rattus novergicus e sobre a pulsação do vaso
dorsal de Rhodnius prolixus. A saliva de P. megistus inibiu a amplitude do PAC do nervo
isolado de rato de forma gradual e reversível. A saliva de T. infestans também inibiu de forma
gradual a amplitude do PAC, porém de forma irreversível. Já a saliva de B. anurum, além de
reduzir a amplitude do PAC, também interferiu nas fases de repolarização e duração. Quando
a saliva das espécies T. infestans, P. megistus e B. anurum foi semipurificada houve uma ação
inibitória de forma gradual e reversível sobre a amplitude do PAC, sem alterar as fases de
repolarização e duração. Este fato sugere que as moléculas com atividade sobre o PAC,
presentes na saliva destes heterópteros, são termo-resistentes e apresentam baixo peso
molecular (< 5kDa). Caracterização complementar (extração de lipídeos) sugere que as
moléculas bioativas de T. infestans e de B. anurum não são de natureza lipídica. A incubação
da saliva semipurificada de B. anurum com protease inespecífica (proteinase K) não inibiu a
atividade sobre o PAC, sugerindo uma natureza não protéica da molécula bioativa. Quando
testadas sobre a preparação de vaso dorsal isolado de Rhodnius prolixus, a saliva bruta de
P. megistus e a semipurificada de B. anurum produziram parada imediata dos batimentos, de
forma reversível. Considerando estes parâmetros, é possível que a atividade paralisante
presente na saliva dos heterópteros predadores e a atividade “anestésica-like” encontrada na
saliva dos triatomíneos compartilhem as mesmas biomoléculas, que aparentemente vêm sendo
mantidas na saliva desses insetos ao longo do processo de evolução. Entretanto, somente a
caracterização molecular do componente responsável por estas atividades poderá confirmar
definitivamente esta hipótese.
ABSTRACT
A comparative study about the action of triatomines saliva (Triatoma infestans and
Panstrongylus megistus) and the predator Belostoma anurum was done on the compound
action potential (CAP) of nerves ciatic isolated from Rattus novergicus and on the pulsation
of the dorsal vessel of Rhodnius prolixus. The saliva of P. megistus inhibited the CAP
amplitude from the nerve isolated from rat in a gradual and reversible way. The saliva of
T. infestans also inhibited the CAP amplitude in a gradual but irreversible way. In addition to
a decrease of the CAP amplitude, the saliva of B. anurum also modified the repolarization and
duration of the phases. When the saliva of the species (T. infestans, P. megistus and
B. anurum) was semi-purified, a decrease of the CAP amplitude was observed in a gradual
and reversible way, without modifying the repolarization and duration of the phases of the
CAP from the isolated nerve of rat. This fact suggests that the molecules with activity over the
CAP, that are present in the saliva of these heteropterans, are heat-resistant and possess low
molecular weight (<5 kDa). Complementary characterization (extraction of lipids) suggests
that the bioactive molecules from T. infestans and B. anurum are not of lipidic nature. The
incubation of semi-purified saliva from B. anurum with inespecific proteinase (proteinase K)
did not inhibit the activity of the CAP, suggesting a non-proteic nature of the bioactive
molecules. When tested on preparation of isolated dorsal vessel of R. prolixus, the crude
saliva of P. megistus and semi-purified saliva of B. anurum produced immediate stops in the
vessel beating, in a reversible way. Considering these parameters, it is possible that the
paralysing activity of the heteropterans predators and the anaesthesic-like activity found in
triatomines share common biomolecules that have been kept in the saliva of these insects
throughout the evolutionary process. However, only by doing the molecular characterization
of the compound responsible for these activities this hypothesis could be confirmed.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 –
Esquema da rota hipotética de evolução para a hematofagia na
subordem Heteroptera.
18
Figura 2 –
Câmara de registros eletrofisiológicos 40
Figura 3 –
Sistema de estimulação e de registro do método de ‘single sucrose-
gap’.
41
Figura 4 –
Detalhe do vaso dorsal de R. prolixus observado sob microscópio
estereoscópio
50
Figura 5 –
Registro típico do potencial de ação composto controle (PACc) de
nervo ciático isolado de rato.
53
Figura 6 –
Potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático de rato antes e
após adição da saliva dos heterópteros.
56
Figura 7 –
Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da
saliva dos heterópteros.
57
Figura 8 –
Potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático de rato antes e
após a adição da saliva semipurificada de Panstrongylus megistus e
Belostoma anurum.
59
Figura 9 –
Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da
saliva semipurificada de Panstrongylus megistus e Belostoma
anurum e experimento controle.
60
Figura 10 –
Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da
saliva extraída de Triatoma infestans e experimento controle.
62
Figura 11 –
Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da
saliva extraída de Belostoma anurum
63
Figura 12 –
Porcentagem de redução média do PAC observada a adição das
salivas semipurificadas de Belostoma anurum tratadas ou não com
proteinase K.
65
Figura 13 –
Atividade da enzima proteinase K sobre o substrato de azocazeína 66
Figura 14 –
Cromatografia de camada fina (TLC) da saliva semipurificada de
Triatoma infestans e da saliva semipurificada de Belostoma
anurum
67
Figura 15 –
Efeito da adição da fração (origem) da saliva semipurificada de
Triatoma infestans após TLC, sobre o PAC de nervo isolado de
rato.
69
Figura 16 –
Atividade da fração (origem) da saliva semipurificada de Triatoma
infestans após TLC , sobre o PAC de nervo isolado de rato.
69
Figura 17–
Atividade das frações (mancha alta e origem) da saliva
semipurificada de Belostoma anurum após TLC, sobre o PAC de
nervo isolado de rato.
71
Figura 18 –
Atividade da saliva semipurificada de Belostoma anurum (ensaio
controle) sobre o PAC de nervo isolado de rato.
71
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 –
Secreções salivares presentes em diferentes espécies de
heterópteros
22
Tabela 2 –
Atividade do homogenato de glândula salivar de diferentes
Hemiptera sobre a atividade cardíaca de Periplaneta americana
24
LISTA DE QUADRO
Página
Quadro 1 –
Efeito da saliva dos heterópteros sobre a preparação de vaso dorsal
de Rhodnius prolixus
73
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cm Centímetro
Da Dalton
DDT Diclorodifeniltricloretano
DMSO Dimetil sulfóxido
FIG. Figura
g Aceleração gravitacional
Hz Hertz
kDa QuiloDalton
LFIH Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos
min Minuto
ml Mililitro
mM Milimolar
ms Milisegundo
mV Milivolts
nm Nanômetro
PAS Potencial de ação simples
PAC Potencial de ação composto
PACc Potencial de ação composto controle
S Sul
sp espécie
spp espécies
TAB. Tabela
TLC Cromatografia de camada fina
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
VD Vaso dorsal
W Oeste
o
C Grau centígrado
µg
Micrograma
µl
Microlitro
SUMÁRIO
Página
1
INTRODUÇÃO
17
1.1
Ordem Hemiptera 17
1.1.1
Família Reduviidae 18
1.1.2
Família Belostomatidae 20
1.2
A saliva dos heterópteros 21
1.2.1
A saliva dos reduviídeos 23
1.2.2
A saliva dos belostomatídeos 26
1.3
A dor, o sucesso alimentar e percepção do hospedeiro 28
1.4
Atividade da saliva de Triatoma infestans sobre as terminações nervosas 30
2 JUSTIFICATIVA
33
3 OBJETIVOS
35
3.1
Objetivo Geral 35
3.2
Objetivos Específicos 35
4 MATERIAL E MÉTODOS
37
4.1
Obtenção e criação dos insetos 37
4.1.1
Criação dos triatomíneos 37
4.1.2
Captura e manutenção dos espécimes de Belostoma anurum 37
4.2
Coleta de saliva 38
4.2.1
Saliva de triatomíneos 38
4.2.2
Saliva de Belostoma anurum 38
4.3
Preparação de nervo isolado de rato (‘Single Sucrose-Gap’) 39
4.3.1
Dissecação dos ratos e montagem de câmara da ‘single sucrose-gap’ 39
4.3.2
Montagem do sistema ‘single sucrose gap’ 40
4.4
Purificação parcial da saliva de heterópteros com atividade sobre o PAC
de nervo isolado de rato (saliva semipurificada)
42
4.4.1
Processo de semipurificação da saliva dos heterópteros 42
4.4.2
Obtenção da saliva semipurificada 43
a) Panstrongylus megistus 43
b) Belostoma anurum 43
4.5
Caracterização da natureza química das biomoléculas da saliva de 43
heterópteros com atividade sobre o PAC de nervo isolado de rato
4.5.1
Ensaio de natureza lipídica 43
4.5.2
Ensaio de natureza protéica 45
a) Obtenção da saliva semipurificada de Belostoma anurum 45
b) Proteinase K à concentração de 0,009 µg/µl 45
c) Proteinase K à concentração de 0,018 µg/µl 46
d) Teste-controle para atividade da Proteinase K 46
4.6
Cromatografia de Camada Fina (TLC) da saliva semipurificada de
T. infestans e B. anurum
47
4.6.1
Obtenção da saliva semipurificada 47
a) Triatoma infestans 47
b) Belostoma anurum 47
4.6.2
Cromatografia de Camada Fina (TLC) 48
4.7
Teste das frações (manchas) obtidas no TLC da saliva semipurificada de
T. infestans e B. anurum sobre o nervo ciático isolado de rato
48
4.8
Preparação do vaso dorsal isolado de Rhodnius Prolixus 50
4.8.1
Obtenção do Vaso Dorsal (VD) de Rhodnius prolixus 51
4.8.2
Ensaio da saliva dos heterópteros sobre a preparação do VD de
Rhodnius prolixus
51
5 RESULTADOS
53
5.1
Atividade da saliva dos heterópteros sobre o PAC de nervo isolado de
rato
53
5.1.1
Saliva de Triatoma infestans 54
5.1.2
Saliva de Panstrongylus megistus 54
5.1.3
Saliva de Belostoma anurum 54
5.1.4
Experimentos controle 55
5.2
Atividade da saliva semipurificada dos heterópteros sobre o PAC de
nervo isolado de rato
58
5.2.1
Saliva semipurificada de Panstrongylus megistus 58
5.2.2
Saliva semipurificada de Belostoma anurum 58
5.3
Ensaio para determinar se o princípio ativo responsável pela ação sobre
o PAC de nervo isolado de rato era de natureza lipídica
61
5.3.1
Saliva de Triatoma infestans 61
5.3.2
Experimentos controle 61
5.3.3
Saliva de Belostoma anurum 62
5.4
Ensaio para determinar se o princípio ativo responsável pela ação sobre
o PAC de nervo isolado de rato era de natureza protéica
63
5.5
Cromatografia de camada fina (TLC) da saliva de semipurificada dos
heterópteros
67
5.6
Atividade sobre o PAC, da saliva semipurificada e separada por TLC
sobre o PAC
67
5.6.1
Experimento controle com β-mercaptoetanol
67
5.6.2
Saliva semipurificada de Triatoma infestans 68
5.6.3
Saliva semipurificada de Belostoma anurum 69
5.7
Estabilidade da preparação de vaso dorsal isolado de Rhodnius prolixus 72
5.7.1
Saliva de Triatoma infestans 72
5.7.2
Saliva de Panstrongylus megistus 72
5.7.3
Saliva de Belostoma anurum 73
6 DISCUSSÃO
75
7 CONCLUSÕES
83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
86
Introdução
Introdução
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 ORDEM HEMIPTERA
A ordem Hemiptera, com cerca de 82.000 espécies descritas, é considerada a mais
abundante em número e com maior diversidade entre os insetos com metamorfose incompleta.
Usualmente, esta ordem era dividida em duas subordens, Heteroptera e Homoptera, de acordo
com a estrutura das asas e posição do aparelho bucal. A subordem Heteroptera continua
mantida, entretanto, há uma tendência em dividir o antigo agrupamento Homoptera em três
principais subordens: Coleorrhyncha, Auchenorrhyncha e Sternorrhyncha (SCHOFIELD,
1995).
A grande maioria dos hemípteros é fitofágicos, que, juntamente com as espécies
predadoras e o reduzido número de espécies hematófagas constituem a subordem Heteroptera.
As famílias Cimicidae, Polyctenidae, Reduviidae (apenas a subfamília Triatominae), e
Lygaeidae (apenas a espécie de Clerada apicicornis) constituem os representantes
hematófagos da subordem Heteroptera (SCHOFIELD, 1995).
Dentro da subordem Heteroptera, a hematofagia parece ter surgido
independentemente, em diferentes momentos, a partir de ancestrais predadores. Schofield
(1995) propõe que a evolução para a hematofagia surgiu a partir de espécies predadoras
generalistas, que se alimentavam de pequenos invertebrados presentes em ninhos de aves ou
de mamíferos. Ocasionalmente, algumas dessas espécies de predadores passaram a se
alimentar do sangue de aves e mamíferos, desenvolvendo com isso a hematofagia oportunista.
Das espécies que se mantiveram intimamente associadas aos ninhos de aves e mamíferos,
algumas delas passaram a se alimentar mais freqüentemente do sangue desses vertebrados,
adaptando-se progressivamente para a hematofagia facultativa, e que posteriormente evoluiu
para a hematofagia obrigatória. Durante essa mudança de dieta alimentar, ocorreram várias
Introdução
18
adaptações morfológicas, incluindo modificação das peças bucais dos insetos; mudanças na
sua fisiologia, como perdas e/ou ganho de enzimas (salivares ou intestinais), necessárias para
o aproveitamento e a digestão dos nutrientes presentes nessa nova dieta alimentar (o sangue).
A FIG. 1 apresenta um esquema dessa rota hipotética de evolução para a hematofagia.
FIGURA 1 – Esquema da rota hipotética de evolução para a hematofagia na subordem Heteroptera.
Fonte: SCHOFIELD, 1995, p. 50.
1.1.1 Família Reduviidae
Nos heterópteros terrestres encontramos o hábito predador nas duas infraordens:
Pentatomorpha e Cimicomorpha, sendo que na última estão incluídas também a família
Reduviidae e as famílias de hábito hematofágico Cimicidae e Polyctenidae. Há
aproximadamente 6230 espécies de reduviídeos, distribuídos em 912 gêneros, sendo que
Hematófagos facultativos ou obrigatórios
(por exemplo, Clerada apicicornis).
Hematófagos facultativos
(por exemplo, Lyctocoris).
Ancestral que se alimentava de seiva
A
ncestral que se alimentava de semente
s
Perda da tripsina por causa da baixíssima
concentração de proteínas na seiva
Perda da tripsina devido a presença de
potentes inibidores de tripsina nas semente
s
Retorno para dieta de proteína como
predador de invertebrados
Uso de catepsinas intracelulares como proteases digestivas extracelulares
Predadores de invertebrados
encontrados em ninhos de aves
(principalmente) e de mamíferos.
Hematófagos facultativos
Desenvolvimento de hemolisina
Hematófagos obrigatórios (por exemplo,
Cimicidae, Polyctenidae, Triatominae).
Hematófagos facultativos ou obrigatórios
(por exemplo, Clerada apicicornis).
Hematófagos facultativos
(por exemplo, Lyctocoris).
Hematófagos facultativos ou obrigatórios
(por exemplo, Clerada apicicornis).
Hematófagos facultativos
(por exemplo, Lyctocoris).
Ancestral que se alimentava de seiva
A
ncestral que se alimentava de semente
s
Perda da tripsina por causa da baixíssima
concentração de proteínas na seiva
Perda da tripsina devido a presença de
potentes inibidores de tripsina nas semente
s
Retorno para dieta de proteína como
predador de invertebrados
Uso de catepsinas intracelulares como proteases digestivas extracelulares
Predadores de invertebrados
encontrados em ninhos de aves
(principalmente) e de mamíferos.
Hematófagos facultativos
Desenvolvimento de hemolisina
Hematófagos obrigatórios (por exemplo,
Cimicidae, Polyctenidae, Triatominae).
Ancestral que se alimentava de seiva
A
ncestral que se alimentava de semente
s
Perda da tripsina por causa da baixíssima
concentração de proteínas na seiva
Perda da tripsina devido a presença de
potentes inibidores de tripsina nas semente
s
Retorno para dieta de proteína como
predador de invertebrados
Uso de catepsinas intracelulares como proteases digestivas extracelulares
Predadores de invertebrados
encontrados em ninhos de aves
(principalmente) e de mamíferos.
Hematófagos facultativos
Desenvolvimento de hemolisina
Hematófagos obrigatórios (por exemplo,
Cimicidae, Polyctenidae, Triatominae).
Introdução
19
apenas cerca de 138 espécies da subfamília Triatominae apresentam o hábito hematofágico
(COSTA & FELIX, 2007; GALVÃO et al., 2003).
A provável linha de evolução dos triatomíneos vem há muito tempo sendo pesquisada,
existindo ainda importantes questões sistemáticas e filogenéticas que permanecem sem
respostas. Uma das teorias filogenéticas propõe uma origem monofilética para o grupo,
pressupondo que os triatomíneos provêm de um único ancestral predador (HYPSA et al.,
2002; LENT & WYGODZINSKY, 1979; PEREZ et al., 1992); enquanto que outra teoria,
polifilética, acredita que os triatomíneos teriam se originado de diferentes linhagens de
reduviídeos predadores que convergiram para hábito hematofágico, em diferentes períodos
evolutivos (DE PAULA, et al., 2005; SCHAEFER, 2003; SCHOFIELD, 1988).
A subfamília Triatominae é constituída por seis tribos, que incluem 18 gêneros. Duas
tribos contêm as espécies de maior importância médica: Rhodniini, com dois gêneros:
Rhodnius Stål, 1859 (16 spp.), Psammolestes Bergroth, 1911 (3 spp.); e Triatomini, com nove
gêneros: Triatoma Laporte, 1832 (68 spp.), Paratriatoma Barber, 1938 (1sp.), Panstrongylus
Berg, 1879 (13 spp.), Eratyrus Stål, 1859 (2 spp.), Mepraia Mazza et al., 1940 (2 spp.),
Meccus Stål, 1859 (6 spp.); Nesotriatoma Usinger, 1944 (3 spp.); Hermanlentia Jurberg &
Galvão, 1997 (1 sp.) e Dipetalogaster Usinger, 1939 (1 sp.). As outras quatro tribos
(Alberprosenini, Cavernicolini, Linshcosteiini e Bolboderini) não apresentam espécies de
importância médica, na transmissão do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de
Chagas, para indivíduos humanos (FERERO et al., 2004; GALVÃO et al., 2003).
Segundo Schofield (1994) aproximadamente metade das espécies de triatomíneos já
foram encontradas naturalmente infectadas pelo T. cruzi. As demais espécies, embora não
tenham sido observadas no meio natural portando o T. cruzi, infectam-se facilmente sob
condições experimentais.
Introdução
20
1.1.2 Família Belostomatidae
A família Belostomatidae compreende insetos aquáticos, da infraordem Nepomorpha,
subordem Heteroptera, que geralmente são encontrados associados a plantas aquáticas, em
diferentes ambientes de água doce (lóticos e léticos), tendo ou não peixes. Os insetos são
conhecidos em várias regiões do Brasil como “barata d’água”, e todos são predadores. As
presas são capturadas de diferentes modos por esses insetos, e através da injeção de sua saliva
na presa, ocorre a pré-digestão externa da mesma no meio aquático. O conteúdo semidigerido
e liquefeito do corpo desta presa constitui o alimento para estes insetos (NIESER & ALKINS-
KOO, 1991; TORRE-BUENO, 1906).
A família Belostomatidae apresenta três subfamílias com oito gêneros: Lethocerinae
com o gênero Lethocerus Mayr, 1853; Horvathiniinae com o gênero Horvathinia Montandon,
1911; e Belostomatinae com seis gêneros: Weberiella De Carlo, 1966, Limnogeton Mayr,
1853, Hydrocyrius Spinola, 1850, Diplonychus Laporte, 1833, Belostoma Latreille, 1807 e
Abedus Stål, 1862. No Brasil, são encontrados os gêneros: Lethocerus, Horvathinia,
Weberiella e Belostoma (PEREIRA, 1992; RIBEIRO, 2005).
Os insetos do gênero Belostoma são predadores aquáticos de pequenos invertebrados e
vertebrados. Além disso, os insetos deste gênero destacam-se por possuírem um ciclo
biológico rápido, com alta fecundidade. Algumas espécies são resistentes a ambientes
poluídos com matéria orgânica. Estudos envolvendo a capacidade predatória de diferentes
espécies de Belostoma sobre moluscos e outros invertebrados (CULLEN, 1969; GARCIA-
AVILA et al., 1996; PEREIRA, 1992; PEREIRA et al., 1993; PONTIER & DELPLANQUE,
1976; SEVERIN & SEVERIN, 1911; TORRE-BUENO, 1906) demonstram que esses insetos
podem atuar como importantes biorreguladores de vetores de agentes etiológicos de doenças
Introdução
21
como a esquistossomose, a filariose, a dengue e a febre amarela (que possuem caramujos ou
mosquitos como vetores).
Belostoma anurum, uma espécie de médio porte (em média apresentando 3,4 cm de
comprimento), é de fácil manutenção e criação em condições de laboratório (PEREIRA,
1992). É comum a ocorrência desses belostomatídeos em vários ambientes aquáticos de
Minas Gerais, inclusive na represa da Pampulha, um reservatório artificial localizado em Belo
Horizonte (NIESER & MELO, 1997).
1.2 A SALIVA DOS HETERÓPTEROS
Além da sua função primitiva de lubrificar as peças bucais, a saliva dos heterópteros
auxilia no processo de alimentação e digestão, variando sua composição dependendo do
hábito alimentar do inseto (MILES, 1972).
Dentro do grupo dos heterópteros fitófagos há uma grande variação no processo
digestivo. Em geral, as glândulas salivares dos heterópteros que se alimentam de floema
(“sugadores de seiva”) secretam as enzimas amilase e distintas carboidrases; enquanto que as
enzimas proteinases e esterases são secretadas pelas glândulas salivares de heterópteros
fitófagos que se alimentam de sementes (MILES, 1972).
Cohen (1990, 1996) demonstrou a presença de proteinases e fosfolipases no extrato de
glândulas salivares em todas as espécies de heterópteros predadores estudadas (TAB. 1). A
presença dessas enzimas na saliva de predadores está relacionada à atividade de pré-digestão
do tecido da presa.
Alguns trabalhos têm demonstrado que a onivoria (hábito predador e fitófago) é
bastante difundida entre os heterópteros (COHEN, 1996; COLL & GUERSHON, 2002;
MILES, 1972), fato esse que explicaria a presença, na glândula salivar, de pectinases,
Introdução
22
amilases ou glicosidases (enzimas típicas de insetos fitófagos) junto com “tripsinas-like” e/ou
quimiotripsinas (enzimas típicas de insetos predadores) em alguns grupos (BOYD, 2003;
BOYD et al., 2002).
TABELA 1
Secreções salivares presentes em diferentes espécies de heterópteros
Legenda: + (presença de atividade); 0 (ausência de atividade); / (atividade não estudada).
Fonte: COHEN, 1996, p. 9.
É interessante ressaltar que algumas espécies de triatomíneos (heterópteros
hematófagos) podem alimentar-se da hemolinfa de outros artrópodes, e completar, com esse
tipo de alimentação (hemolinfagia), o seu desenvolvimento até o estágio adulto (LOROSA
et al., 2000). Um dos primeiros relatos de hemolinfagia em triatomíneos foi feito por Brumpt
(1914), ao descrever que algumas ninfas das colônias de triatomíneos, das espécies Triatoma
infestans, T. chagasi, T. sordida, Mestor megista e Rhodnius prolixus, que estavam em jejum
(ninfas não alimentadas), frequentemente alimentavam-se de outras ninfas engurgitadas
(ninfas alimentadas), fenômeno este, que foi chamado de “canibalismo” pelo referido autor.
Veneno
Proteinase
Enzima
Tripsina-like
Fosfolipase
Triaciglicerol
Lipase
Amilase
Pectinase
Lygus hesperus
Deraeocoris sp.
Nabis alternatus
Sinea confusa
Zelus renardii
Podisus maculiventris
Geocoris punctipes
0
0
0
0
Veneno
Proteinase
Enzima
Tripsina-like
Fosfolipase
Triaciglicerol
Lipase
Amilase
Pectinase
Lygus hesperus
Deraeocoris sp.
Nabis alternatus
Sinea confusa
Zelus renardii
Podisus maculiventris
Geocoris punctipes
0
0
0
0
0
0
0
0
Introdução
23
Posteriormente, Ryckman (1951) descreveu o mesmo comportamento para ninfas das
espécies T. pallidipennis, T. guasayana e T. longipes; assim como Sandoval e colaboradores
(2000) para ninfas da espécie Belminus herreri. Abalos & Wygodzinsky (1951) descreveram
que T. rubrovaria poderia usar a hemolinfa de diferentes artrópodes (como por exemplo,
hemolinfa de larvas de borboletas e/ou de aranhas) como fonte alimentar. Miles e
colaboradores (1981) observaram que ninfas de 1º, 2º e 3º estádios do triatomíneo Eratyrus
mucronatus, alimentam-se preferencialmente da hemolinfa de outros artrópodes, como por
exemplo, de aranhas, enquanto que os demais estádios ninfais e os espécimes adultos
alimentam-se de sangue de vertebrados. Estudos de laboratório com as espécies
T. circummaculata, T. rubrovaria, e T. carcavalloi, sugerem que o comportamento de
hemolinfagia também seja comum nestas espécies (LOROSA et al., 2000, RUAS-NETO
et al., 2001). Pouco se conhece sobre a importância da hemolinfagia nos triatomíneos em
condições naturais. Um estudo recente destaca que Belminus herreri, um triatomíneo que
habita regiões de floresta entre a Colômbia e o Panamá, e normalmente está associado a
lagartos, poderia colonizar construções humanas e no intradomicílio, as ninfas dessa espécie,
teriam preferência por se alimentar de hemolinfa de baratas a sangue de hospedeiros
vertebrados (SANDOVAL et al., 2004).
Esse comportamento de hemolinfagia também reforça a hipótese de origem polifilética
dos triatomíneos, sugerindo que a hematofagia é uma característica recente nos triatomíneos e
que as adaptações para este hábito alimentar ainda estão ocorrendo (SCHOFIELD, 1988,
1995).
1.2.1 A saliva dos Reduviídeos
Poucos estudos foram realizados sobre a saliva de reduviídeos predadores. Edwards
Introdução
24
(1961), à procura de uma substância com atividade inseticida, descreveu ‘in situ’ a ação da
saliva de Platymeris rhadamanthus (Hemiptera: Reduviidae) sobre o gânglio abdominal e o
vaso dorsal de Periplaneta americana (Dictyoptera: Blattidae). A saliva de P. rhadamanthus
causou um aumento da atividade elétrica das fibras do axônio de P. americana, 10 a 15
segundos após a sua aplicação na preparação de gânglio abdominal. Na preparação de vaso
dorsal de P. americana, a saliva de P. rhadamanthus provocou, após 30 segundos a três
minutos, contração imediata da musculatura, com parada cardíaca em sístole, acompanhada
de contratura geral da musculatura dorsal. O autor sugere que a toxicidade da saliva se deve à
lise geral conseqüente da atividade fosfolipásica durante a digestão externa da presa. A
TAB. 2 resume os resultados obtidos pelo referido autor, sobre a preparação de coração de
P. americana, comparando a ação do homogenato de glândulas salivares de outras espécies de
hemípteros de distintos hábitos alimentares, realizadas nesse estudo.
TABELA 2
Atividade do homogenato de glândula salivar de diferentes Hemiptera sobre a atividade cardíaca de
Periplaneta americana
Hemíptero Quantidade aplicada Ação
I – Predadores
Naucoris cimicoides
Platymeris rhadamanthus
Rhincoris carmelita
Reduvius personatus
II – Fitófagos
Pentatoma rufipes
Oncopeltus fasciatus
III – Hematófagos
Rhodnius prolixus
Triatoma protracta
0,01 parte de uma
glândula em
0,1 ml de salina
1 par de glândulas em
0,05 ml da salina
1 par de glândulas em
0,05 ml de salina
1 par de glândulas em
0,1 ml de salina
Parada imediata em
sístole e contratura
da musculatura dorsal.
Aumento discreto da freqüência
cardíaca, parada após alguns
minutos.
Redução lenta da amplitude das
contrações cardíacas.
Ausência de efeitos cardíacos.
Fonte: EDWARDS, 1961, p. 64.
Introdução
25
A saliva de triatomíneos, assim como a de outros insetos hematófagos, auxilia na
tarefa da alimentação, pois os danos mecânicos decorrentes da movimentação das peças
bucais dos triatomíneos sobre a pele do hospedeiro, durante a obtenção do repasto sangüíneo,
desencadeiam uma série de respostas fisiológicas de reparo: (1) hemostasia (liberação de
componentes hemostáticos que evitam a perda de sangue do hospedeiro, através dos
mecanismos de agregação plaquetária, coagulação sangüínea e/ou vaso constrição); (2) a
inflamação (liberação de componentes algésicos, tais como, as prostaglandinas, a histamina
e/ou a serotonina, que alertam o hospedeiro sobre a presença de um estímulo doloroso,
facilitando com isso a eliminação desse estímulo mecanicamente); e (3) a resposta imune
(liberação de componentes que recrutam ao sítio da picada células do sistema inumológico do
hospedeiro, aptas para montarem uma resposta imune adequada ao estímulo invasor, como
por exemplo, as interleucinas, a histamina, os mastócitos, os macrófagos e a resposta
humoral) (RIBEIRO & FRANCISCHETTI, 2003). Para contrapor a essas reações adversas do
hospedeiro, o que permitiria uma rápida e eficiente alimentação, os triatomíneos liberam
saliva durante todo o seu processo alimentar. (SOARES et al., 2006).
Uma grande variedade de atividades biológicas tem sido detectada na saliva dos
triatomíneos, incluindo anticoagulantes (HELLMAN & HAWKINS, 1964; 1965; PEREIRA
et al., 1996; RIBEIRO et al., 1995), vasodilatadores (RIBEIRO & NUSSENZVEIG, 1993;
RIBEIRO et al., 1990, 1993), molécula responsável por atividade anestésica (DAN et al.,
1999), molécula formadora de poro (AMINO et al., 2002), agente inibidor do complemento
(CAVALCANTE et al., 2003), inibidores de agregação plaquetária induzida por colágeno
(NOESKE-JUNGBLUT et al., 1994; RIBEIRO & GARCIA, 1981), ADP (RIBEIRO &
GARCIA, 1980; SARKIS et al., 1986; SMITH et al., 1979), ácido araquidônico (RIBEIRO &
SARKIS, 1982) trombina (FRANCISCHETTI et al., 2000; NOESKE-JUNGBLUT et al.,
1995), serotonina, epinefrina e norepinefrina (ANDERSEN et al., 2003).
Introdução
26
Vale a pena ressaltar que algumas destas atividades podem indiretamente diminuir a
irritação do hospedeiro induzida pela picada do inseto, tais como: (1) atividade anti-
histamínica (RIBEIRO & WALKER, 1994), que dificulta a ligação da histamina com as
terminações nervosas livres, evitando o aparecimento do prurido; (2) atividade da enzima
sialidase (AMINO et al., 1998) que atenua a reação inflamatória por diminuir o recrutamento
de leucócitos para o sítio da picada; (3) atividade imunossupressora (KALVACHOVÁ et al.,
1999), que dificulta a exacerbação da resposta inflamatória induzida pela resposta imune; (4)
atividade anti-complemento (CAVALCANTE et al., 2003), que diminui a produção de
anafilotoxina; (5) atividade “anestésica-like”, que atua diretamente sobre as fibras nervosas
interferindo na geração do impulso nervoso pela inibição da corrente de sódio (Dan et al.,
1999).
1.2.2 A saliva dos Belostomatídeos
Um dos primeiros autores que relataram o efeito da saliva de belostomatídeos foi
Torre Bueno (1906). Neste estudo, o referido autor observou que a saliva de Belostoma
flumineum possuía uma ação paralisante sobre as suas presas.
Picado (1936) estudou a ação da saliva de Lethocerus delpontei, que apresentou
atividade proteolítica, mas não digeriu gelatina timolada (que é digerida por venenos de
serpentes). Essa secreção salivar produziu hemorragia seguida de necrose nos tecidos animais
em que foi inoculada. Quando diluída em água de aquário (homogenato de 1 par de
glândulas/400 ml) produziu paralisia reversível em certos peixes. A injeção intraperitoneal em
rã do homogenato de ¼ de glândula salivar intratorácica, juntamente com o rostro de
L. delpontei, produziu apnéia de curta duração e dificuldade para saltar. A necropsia revelou
ausência de hemorragia e leve congestão hepática e renal. O soro anticrotálico, efetivo contra
Introdução
27
o veneno de Crotalus durissus terrificus, foi o único que exerceu atividade neutralizante sobre
o veneno desse belostomatídeo. O veneno de L. delpontei foi destruído por enzimas de tecidos
animais, especialmente as localizadas na pele, que o inativou rapidamente. Esta propriedade
neutralizante do veneno também esteve presente nas enzimas de certos tecidos vegetais, como
células de batata, que destruíram a sua atividade tóxica.
Rees & Offord (1969) observaram uma rápida liquefação dos tecidos da presa, pela
ação da saliva de Lethocerus cordofanus, sugerindo a presença de uma potente mistura de
enzimas hidrolíticas. Os autores detectaram a atividade de cinco diferentes enzimas
proteolíticas (hialuronidase, nuclease, fosfatase e esterase) no macerado de glândula salivar
desse belostomatídeo.
De Carlo e colaboradores (1973), utilizando métodos histoquímicos, observaram a
presença de lipídios no lóbulo posteroventral da glândula salivar de Lethocerus mazzai,
também chamado de lóbulo lipócrino por Fauré-Fremiet (1910).
Swart e colaboradores (2006) encontraram diferenças na composição de enzimas
salivares dos belostomatídeos Lethocerus uhleri (subfamília Lethocerinae) e de Belostoma
lutarium (subfamília Belostomatinae). Na saliva de L. uhleri foram encontradas três enzimas
proteolíticas e nenhuma atividade de amilase, enquanto que a saliva de B. lutarium apresentou
duas enzimas proteolíticas e atividade de amilase. Essa diferença na composição enzimática
das salivas foi atribuída às diferentes dietas alimentares realizadas por essas subfamílias.
A saliva das espécies do gênero Belostoma é esbranquiçada, viscosa e pouco solúvel
em água, sugerindo a presença de lipídeos e lipoproteínas. A presença de proteases
conjugadas com lipídeos poderia dificultar a diluição dessas enzimas na água, o que poderia
auxiliar a pré-digestão externa da presa no ambiente aquático (PEREIRA, 1992).
Em estudos realizados por Pereira e colaboradores (1988, 1989) com a saliva de
B. anurum, demonstrou-se que a inoculação intravenosa da saliva de três espécimes desse
Introdução
28
belostomatídeo é capaz de matar um camundongo (Mus musculus) de cerca de 20 g, 15 a 20
segundos após sua inoculação, e que a saliva de Belostoma harrisi (posteriormente
identificada como B. anurum) induz arritmias cardíacas, hipotensão arterial e morte em 57%
dos hamsters anestesiados. Dan e colaboradores (1993) mostraram que saliva de B. harrisi
produz parada cardíaca em coração isolado de cobaia, podendo ser seguida de contratura
(sístole).
1.3 A DOR, O SUCESSO ALIMENTAR E PERCEPÇÃO DO HOSPEDEIRO
A dor, um dos cinco sinais cardinais da inflamação (PEREIRA & BOGLIOLO,
2000), é a resposta fisiológica a estímulos nocivos, responsável por ativar receptores
sensoriais, que por sua vez ativam as fibras nervosas sensoriais (fibras nervosas aferentes), e
essas são responsáveis por conduzir o estímulo doloroso ao sistema nervoso central. A dor
rápida é conduzida por fibras nervosas aferentes do tipo Aδ. Ela tem início e fim rápidos e é
precisamente localizada. A dor lenta é conduzida por fibras nervosas aferentes do tipo C. É
acompanhada por sentimento de mal-estar e por sensação de queimação ou pulsante, e é mal
localizada (COSTANZO, 1999).
Os nociceptores pertencem a uma classe de receptores sensoriais, localizados na pele,
e respondem a estímulos nocivos dos tipos mecânicos, térmicos e químicos. Eles podem ser
inervados por fibras nervosas aferentes do tipo Aδ (que são pouco mielinizadas e de
condução rápida do estímulo nocivo); ou por fibras nervosas aferentes do tipo C (que são
fibras não-mielinizadas e de condução lenta do estímulo nocivo) (MEBLINGER, 1997).
Além da ativação das fibras nervosas aferentes, os nociceptores liberam
neuropeptídeos que aumentam a permeabilidade vascular, como por exemplo, a substância P.
Quando a substância P é liberada na pele, ela pode produzir vasodilatação, aumento da
Introdução
29
permeabilidade capilar, seguidas por vermelhidão, calor e tumefação – três sinais
característicos da inflamação (COSTANZO, 1999).
A dor gerada pela picada dos insetos hematófagos é resultante do dano mecânico
causado pela movimentação das peças bucais do inseto sobre a pele do hospedeiro e pela
ação de componentes salivares desse inseto (RIBEIRO, 1995).
Assim, a percepção do hospedeiro, durante a picada de insetos hematófagos, é um
fator determinante para o sucesso da aquisição de sangue pelo inseto, pois, ao sentir dor, o
hospedeiro vertebrado pode tentar eliminar o estímulo nocivo mecanicamente. De fato, tem
sido demonstrado, em triatomíneos, que a percepção do hospedeiro vertebrado à picada
depende da quantidade de insetos aos quais ele é exposto. Assim, um aumento na densidade
populacional de triatomíneos induz uma maior percepção das picadas sofridas pelo
hospedeiro, o que provavelmente diminui a quantidade média de sangue ingerido pelo inseto,
por ocasionar interrupções mais freqüentes em seu repasto sangüíneo (PEREIRA et al., 1995,
2006; SCHOFIELD et al., 1986).
Com isso, a obtenção de sangue pelos triatomíneos é limitada pela irritação causada
durante o processo de alimentação, que depende do componente perceptivo de sua picada e
da densidade populacional de triatomíneos por hospedeiro. Estes dados coincidem com as
observações em voluntários humanos que relatam uma picada quase imperceptível de
T. infestans, o principal vetor da Doença de Chagas na América do Sul (LAVOIPIERRE
et al., 1959; SCHOFIELD, 1988).
Uma redução da quantidade média de sangue ingerido pelos triatomíneos pode
acarretar em prolongamento do estádio ninfal, redução da fecundidade das fêmeas e aumento
da probabilidade de dispersão pelo vôo dos adultos. Esses fatores atuariam conjuntamente na
regulação da densidade populacional dos triatomíneos, uma vez que o status nutricional da
população de triatomíneos depende do número de insetos por hospedeiro (SCHOFIELD,
Introdução
30
1980, 1986). Experimentos utilizando as mesmas densidades de insetos por hospedeiro
mostram que T. infestans é mais eficiente do que P. megistus e R. prolixus na aquisição de
sangue em animais não anestesiados, sugerindo que o primeiro seja menos percebido pelo
hospedeiro (PEREIRA et al., 1995, 1998).
1.4 ATIVIDADE DA SALIVA DE Triatoma infestans SOBRE AS
TERMINAÇÕES NERVOSAS
A saliva de T. infestans atua sobre a geração do impulso nervoso. Experimentos
utilizando como modelo experimental o nervo ciático de rato por meio do método de ‘single
sucrose gap‘ mostraram que a saliva induziu uma redução progressiva da amplitude do
potencial de ação composto (PAC), sem apresentar alterações na duração ou na fase de
repolarização. Esta redução mostrou-se irreversível mesmo após 30 minutos de lavagem com
solução controle (solução de Locke) (DAN et al., 1999).
Experimentos posteriores de ‘patch clamp’ (whole cell) em células GH
3
, mostraram
que a adição da saliva de dois espécimes de T. infestans reduziu progressivamente a amplitude
da corrente de sódio (I
Na
) atingindo um bloqueio de 83 ± 13 %. Uma proteína purificada da
saliva de T. infestans, com massa molecular aproximada de 14 kDa, reproduziu os efeitos da
saliva sobre o nervo isolado e sobre os canais de sódio, demonstrando-se pela primeira vez a
ação direta da saliva de insetos hematófagos sobre fibras nervosas. (DAN, 2000).
Provavelmente, o fato dos canais de sódio desempenharem uma importante função na
condução nervosa, faz deles alvos de diversas toxinas, (por exemplo, tetrodotoxina,
saxitoxina, batrachotoxina), como também de fármacos, (por exemplo, os anestésicos locais)
e de inseticidas (DDT e piretróides). Alguns destes compostos ligam-se aos canais de sódio
especificamente e com alta afinidade, sendo capazes de modificar a fisiologia do canal
Introdução
31
através da ocupação de diferentes locais receptores. Até o momento seis diferentes locais de
ligação para toxinas foram demonstrados (CATERRALL, 1980, 1988).
Existem 10 versões (isoformas) de canal de sódio que, embora possuam uma estrutura
tri-dimensional comum, apresentam variações na seqüência de aminoácidos (WAXMAN,
2006). Recentemente Cox e colaboradores (2006) publicaram um interessante estudo sobre a
incapacidade de sentir dor em humanos que apresentavam apenas uma única mutação em
uma isoforma de canal de sódio (Nav 1.7), demonstrando com isso a importância desses
canais iônicos.
Justificativa
Justificativa
33
2 JUSTIFICATIVA
Durante muito tempo especulou-se sobre a existência de um princípio anestésico na
saliva de insetos hematófagos (LENT & WYGODZINSKY, 1979; MELLINK &
BOVENKAMP, 1981). Entretanto, somente recentemente, foi demonstrado que a saliva de
T. infestans apresenta uma atividade inibitória sobre a geração do impulso nervoso devido a
uma redução da corrente de sódio (DAN et al., 1999). Esta atividade inibitória sobre o PAC
de nervo isolado de rato é reproduzida de forma reversível por uma proteína da saliva de
T. infestans (14 kDa), que já foi purificada e sequenciada (DAN, 2000).
A importância de tal atividade é clara, pois reduz a percepção do inseto pelo
hospedeiro durante a hematofagia. A irritação induzida durante o processo de alimentação
pode diminuir o sucesso dos insetos hematófagos na obtenção do seu repasto sanguíneo, pois
o incômodo estimula o comportamento de defesa do hospedeiro (“grooming”).
Embora a filogenia dos triatomíneos seja controversa, todos concordam com a
existência de um predador reduviídeo como ancestral hematófago da subfamília Triatominae
(HYPSA et al., 2002; SCHOFIELD, 1988). Tal hipótese é reforçada pela observação do
comportamento de hemolinfagia em algumas espécies de triatomíneos (ABALOS &
WYGODZINSKY, 1951; BRUMPT, 1914; LOROSA et al., 2000, MILES et al., 1981;
RUAS-NETO et al., 2001; SANDOVAL et al., 2000, 2004).
Neste contexto, a caracterização comparativa de algumas atividades biológicas e das
biomoléculas presentes na saliva de heterópteros poderá proporcionar uma melhor
compreensão sobre as adaptações para a hematofagia a partir de ancestrais predadores. A
nossa hipótese de trabalho é de que a atividade paralisante encontrada na saliva de predadores
especializados poderia ser um precursor da atividade anestésica presente na saliva de
triatomíneos.
Objetivos
Objetivos
35
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Comparar a atividade da saliva de duas espécies de triatomíneos, Triatoma infestans e
Panstrongylus megistus, e do predador Belostoma anurum sobre o potencial de ação
composto de nervo ciático isolado de Rattus novergicus e sobre a preparação de vaso dorsal
isolado de Rhodnius prolixus, bem como, caracterizar parcialmente o princípio ativo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
! Comparar a ação da saliva dos triatomíneos T. infestans e P. megistus e do predador
B. anurum sobre o potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático isolado de
rato;
! Comparar a ação da saliva dos triatomíneos T. infestans e P. megistus e do predador
B. anurum sobre a preparação de vaso dorsal (VD) isolado de R. prolixus;
! Comparar a ação da saliva semipurificada de P. megistus e do predador B. anurum
sobre o PAC de nervo ciático isolado de rato;
! Verificar a ação da saliva semipurificada de B. anurum sobre a preparação de VD
isolado de R. prolixus;
! Caracterizar a natureza química (lipídica e/ou protéica) do princípio ativo presente na
saliva semipurificada de T. infestans e B. anurum sobre o PAC de nervo ciático
isolado de rato;
! Caracterizar por Cromatografia de Camada Fina (TLC) a saliva semipurificada de
T. infestans e B. anurum;
! Testar a atividade das frações (manchas) obtidas na TLC da saliva semipurificada de
T. infestans e B. anurum sobre o PAC de nervo ciático isolado de rato.
Material e Métodos
Material e Métodos
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO E CRIAÇÃO DOS INSETOS
4.1.1 Criação dos triatomíneos
Utilizou-se exemplares de duas espécies de triatomíneos (T. infestans e P. megistus)
que foram gentilmente cedidos pelo Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença
de Chagas do Instituto de Pesquisas René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz
(IRR/FIOCRUZ).
Os triatomíneos foram criados e mantidos no insetário climatizado (com temperatura
de 28 + 1 °C, umidade relativa do ar de 65 + 10% e fotoperíodo de 12 horas) do Laboratório
de Fisiologia de Insetos Hematófagos (LFIH) do Departamento de Parasitologia do
ICB/UFMG, em frascos de acrílico com diâmetro de base de 15 cm e altura de 19 cm,
tampados com tecido de algodão. Os frascos foram forrados com papel de filtro e no seu
interior foi colocada uma tira de cartolina dobrada em sanfona. Esta cartolina, além de servir
de ponte entre o triatomíneo e a fonte alimentar, aumenta o espaço interno disponível para o
inseto.
Os insetos eram alimentados semanalmente em galinhas (Gallus gallus) ou ratos
(R. novergicus).
4.1.2 Captura e manutenção dos espécimes de Belostoma anurum
Para coleta de exemplares da espécie B. anurum, foram utilizadas conchas metálicas
de fundo chato, perfurado, com cerca de 30 cm de diâmetro (panelas de aço). As conchas
foram adaptadas a cabos de madeira, e são rotineiramente utilizadas para captura de
planorbídeos, hospedeiros de Schistosoma mansoni. As coletas foram realizadas na represa da
Material e Métodos
38
Pampulha (19°50’-19°52’ S e 43°58’-44°0’ W), um reservatório artificial, localizado na
região Norte do Município de Belo Horizonte, próximo ao campus da UFMG.
Os espécimes adultos de B. anurum provenientes da represa da Pampulha, foram
transferidos, individualmente, para pequenos recipientes plásticos, de volume aproximado de
200 ml e 15 cm de altura (copos plásticos), contendo água de torneira desclorada e, um
pedaço de isopor para o repouso do inseto. Biomphalaria glabrata fornecidos pelo
Laboratório de Esquistossomose do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG, e ninfas
de quinto estádio de R. prolixus criados e mantidos no LFIH, serviram de alimento para os
belostomatídeos.
4.2 COLETA DE SALIVA
4.2.1 Saliva de triatomíneos
Os triatomíneos (T. infestans e P. megistus) foram imobilizados individualmente, entre
os dedos médio, anular e polegar de uma das mãos do coletor, e com o auxílio dos dedos da
outra mão, realizou-se estimulação mecânica em todo o corpo do inseto. A saliva liberada
pela probóscida de cada triatomíneo foi coletada em um tubo capilar de vidro, transferida para
um tubo de microcentrífuga (mantido em banho de gelo durante a coleta), e, posteriormente,
armazenada no freezer a - 20
o
C até seu uso.
4.2.2 Saliva de Belostoma anurum
A coleta da saliva de B. anurum foi feita através da estimulação elétrica (3 Hz, 100 V
e 2 ms de duração) na inserção do primeiro par de patas do inseto (PEREIRA, 1992). A saliva
liberada pela probóscida de cada belostomatídeo foi coletada em um tubo de capilar de vidro,
e transferida para um tubo de microcentrífuga (mantido em banho de gelo durante a coleta)
Material e Métodos
39
contendo 10 µl de água ultrapura (Mille Q) ou 10 µl solução de Locke (composição: NaCl
154,0 mM, KCl 5,5 mM, CaCl
2
2,2 mM, HEPES 5,0 mM e Glicose 5,0 mM e pH 7,45
ajustado com NaOH), e posteriormente, foi armazenada em freezer a –20
o
C até o seu uso.
4.3 PREPARAÇÃO DE NERVO ISOLADO DE RATO (‘SINGLE SUCROSE-GAP’)
4.3.1 Dissecação dos ratos e montagem da câmara de registros eletrofisiológicos
Nos experimentos de nervo ciático isolado de rato, foram utilizados espécimes de R.
novergicus, pesando entre 250 e 350 g. Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical
seguido de exsanguinação. Após fixação em decúbito ventral, os nervos ciáticos direito e
esquerdo, foram cuidadosamente dissecados e removidos. Os nervos foram mantidos em
solução de Locke até a remoção da bainha conjuntiva, permanecendo viáveis por até 24 horas.
A dissecação da bainha conjuntiva do nervo foi realizada em um microscópio
estereoscópico (SZ – 40, Olympus, Japão), e, após sua remoção, o tronco nervoso foi
cuidadosamente colocado sobre os cinco compartimentos da câmara experimental (câmara de
registros eletrofisiológicos) (FIG. 2). Foi aplicada uma fina camada de vaselina sobre as
divisões entre os compartimentos da câmara para assegurar o posicionamento do nervo. Além
disso, a vaselina desempenha um importante papel de auxiliar no isolamento elétrico dos
compartimentos.
Os eletrodos dos compartimentos 1 e 2 (FIG. 2) servem para aplicar a estimulação
elétrica no nervo, a uma freqüência inferior a 0,1 Hz. Os eletrodos dos compartimentos 3 e 5
(FIG. 2) captam a resposta do nervo ao estímulo aplicado. Pelo compartimento 4 (FIG. 2) flui
continuamente uma solução de sacarose isotônica (283 mM). A saliva dos heterópteros (bruta,
semipurificada ou fracionada por TLC) diluída em solução de Locke foi adicionada ao
compartimento central (compartimento teste), que possui um volume reduzido (40 µl), e é
isolado eletricamente do quinto compartimento (de registro) através do fluxo constante da
Material e Métodos
40
solução de sacarose (~ 3 a 4 ml/min). Os demais compartimentos foram preenchidos com
solução de Locke e possuem um volume de 200 µl cada.
FIGURA 2 – Câmara de registros eletrofisiológicos. A câmara foi projetada pelo Dr. Jader dos Santos
Cruz, do Departamento de Bioquímica e Imunologia ICB/UFMG.
As câmaras utilizadas nos experimentos foram confeccionadas com resina Epoxi a
partir de um molde de silicone, permanecendo por pelo menos 1 ano na estufa, a
aproximadamente 40
o
C, para secar completamente.
4.3.2 Montagem do sistema ‘single sucrose gap’
Os experimentos utilizando o método ‘single sucrose gap’ foram realizados de acordo
com o método descrito por Cruz e colaboradores (1994). A câmara de registros
eletrofisiológicos foi ligada ao sistema de estimulação e de registro (FIG. 3) para a obtenção
dos registros do potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático isolado de rato. O PAC
ou um potencial de ação simples (PAS) correspondem à resposta elétrica da(s) fibra(s) aos
Material e Métodos
41
estímulos elétricos (pulsos) que são aplicados e que se propagam ao longo dessas fibras
(KUTCHAI, 2000).
FIGURA 3 – Sistema de estimulação e de registro do método de ‘single sucrose-gap’
Os dois primeiros compartimentos da câmara foram utilizados para estimulação do
nervo, com pulsos de voltagem isolados (geralmente entre 2 a 3 voltz) com duração de 60 µs,
gerados por um estimulador de pulsos. Os pulsos estimulam o nervo através de eletrodos de
níquel-cromo nos compartimentos 1 e 2. A resposta elétrica do nervo (o PAC) é captada pelos
dois eletrodos de registro adaptados nos compartimentos 3 e 5. Esses eletrodos foram
acoplados a um amplificador diferencial de ganho fixo, alimentado por uma fonte de ± 12 V.
Assim, o PAC captado foi amplificado e registrado em um osciloscópio digital de 36 bits
(ADC-100, PICO Tecnologies) acoplado a um computador. Os registros adquiridos foram
gravados em CD para posterior análise (FIG. 3). O principal parâmetro eletrofisiológico
:
Fluxo de sacarose
Fio terra
Estimulador
F
ADC
AMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
Fluxo de sacarose
Fio terra
Estimulador
F
ADC
AMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
Fluxo de sacarose
Fio terra
Fluxo de sacarose
Fio terra
Estimulador
F
ADC
AMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
Estimulador
F
ADC
AMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
Estimulador
F
ADC
AMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
F
ADC
AMP
FF
ADC
AMP
ADCADC
AMPAMP
Legenda
ADC – conversor analógico digital
AMP – amplificador
F - fonte
Material e Métodos
42
utilizado para análise foi a amplitude dada em mV e definida como a diferença de potencial
entre a linha de base e a altura máxima da curva do PAC.
Para que os PACs pudessem ser registrados adequadamente foi necessário o
isolamento elétrico, proporcionado pela passagem constante de um fluxo de sacarose pelo
compartimento de isolamento, que fica entre os poços de captação do sinal.
Foi requerido um período de aproximadamente 50 minutos para que a preparação
entrasse em equilíbrio e se mantivesse estável. Após esse período de estabilização, foram
registrados os potenciais de ação controle (PACc), que se mantinham estáveis por mais de 4
horas.
4.4 PURIFICAÇÃO PARCIAL DA SALIVA DE HETERÓPTEROS COM
ATIVIDADE SOBRE O PAC DE NERVO ISOLADO DE RATO (SALIVA
SEMIPURIFICADA)
4.4.1 Processo de semipurificação da saliva dos heterópteros
A saliva dos heterópteros, após ser diluída em solução de Locke ou em água Mille Q, foi
submetida ao seguinte procedimento:
a) Fervura por 2 minutos;
b) Centrifugação, a 20.900 g, durante 20 minutos, a temperatura ambiente;
c) O sobrenadante da solução foi transferido para um filtro de membrana (Ultrafree®-
MC Microcentrifuge/Milipore, USA), com limite de exclusão da membrana era de
5 kDa , e após a ultrafiltração por meio de centrifugação à 4.900 g, durante 20
minutos, a temperatura ambiente, obteve-se a saliva semipurificada, que corresponde
ao material que ficou abaixo do filtro.
Material e Métodos
43
4.4.2 Obtenção da saliva semipurificada
a) Panstrongylus megistus
A saliva de P. megistus foi coletada conforme descrita no item 4.2.1, imediatamente
diluída em solução de Locke, na proporção de 1 µl de saliva para 7 µl de solução de Locke, e
semipurificada (conforme item 4.4.1). Para a preparação de nervo isolado de rato, foram
aplicados 40 µl desta saliva semipurificada.
b) Belostoma anurum
A saliva de B. anurum, que havia sido retirada em solução de Locke (conforme item
4.2.2), foi diluída na proporção de 1 belostomatídeo para 50 µl de solução de Locke e
semipurificada (conforme item 4.4.1), sendo que 40 µl desta saliva semipurificada foram
utilizados na preparação de nervo isolado de rato.
Durante as etapas: a (fervura por 2 minutos da solução contendo saliva + solução de
Locke) e b (centrifugação dessa solução a 20.900 g, durante 20 minutos) do processo de
semipurificação da saliva de B. anurum foi obtido, além do sobrenadante, um anel lipídico,
que era descartado.
4.5 CARACTERIZAÇÃO DA NATUREZA QUÍMICA DAS BIOMOLÉCULAS DA
SALIVA DE HETERÓPTEROS COM ATIVIDADE SOBRE O PAC DE NERVO
ISOLADO DE RATO
4.5.1 Ensaio de natureza lipídica
Alíquotas de 20 µl de saliva de T. infestans ou de B. anurum ou de água Mille Q foram
Material e Métodos
44
submetidas a extração de lipídeos, de acordo com o seguinte procedimento:
! Adicionar a saliva ou a água a uma solução de extração composta por 200 µl de água
destilada, 250 µl de clorofórmio e 500 µl de metanol;
! A solução contendo saliva + solução de extração (ou água + solução de extração) foi
homogeneizada, a cada cinco minutos, durante 60 minutos, utilizando o vórtex (MS 1
Minishacker, Ika);
! Posteriormente realizou-se uma centrifugação por 30 minutos a 1000 g, da mistura, a
temperatura ambiente;
! Em seguida, a fase líquida foi separada do precipitado formado e adicionada a uma
mistura contendo 800 µl de clorofórmio e 800 µl de água destilada;
! Esta nova solução foi homogeneizada por 30 segundos em vórtex e após centrifugação
de 30 minutos a 1000 g, a temperatura ambiente, separou-se as duas fases formadas, a
fase aquosa (superior, não lipídica) da fase orgânica (inferior, lipídica);
! As amostras de cada fase (aquosa e orgânica) foram secas em uma centrífuga de
evaporação.
Para os ensaios de nervo ciático de rato, o material retido na fase aquosa foi
ressuspenso em 42 µl de solução de Locke; enquanto que o material retido na fase orgânica
foi ressuspenso em 42 µl de solução de Locke, acrescida do solvente apolar dimetil sulfóxido
(DMSO) (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 5 %.
A utilização de DMSO a 5% em solução de Locke foi realizada para aumentar a
possibilidade de solubilizar todos os compostos orgânicos que pudessem estar à parede do
tubo de microcentrífuga, e que não se solubilizariam em solução de Locke (solução polar).
Nos ensaios de nervo isolado de rato foram realizados três experimentos controle,
utilizando-se somente DMSO a 5 % em solução de Locke.
Material e Métodos
45
4.5.2 Ensaio de natureza protéica
a) Obtenção da saliva semipurificada de Belostoma anurum
A saliva de B. anurum foi retirada (conforme item 4.2.2) em água Mille Q e diluída na
proporção de 1 belostomatídeo para 10 µl de água e semipurificada (conforme o item 4.4.1).
Após o processo de semipurificação, obteve-se 400 µl de saliva semipurificada (em água)
totalizando o equivalente à saliva de aproximadamente 40 belostomatídeos). Esta saliva
semipurificada foi dividida em duas alíquotas de 200 µl, que foram secas em centrífuga de
evaporação e armazenadas no freezer a -20 ºC, para posterior utilização nos ensaios de
natureza protéica. Para estes ensaios foram utilizadas duas diferentes concentrações de
proteinase K: 0,009 µg/µl e 0,018 µg/µl, que serão detalhados a seguir.
b) Proteinase K à concentração de 0,009 µg/µl
Uma das alíquotas contendo saliva semipurificada de B. anurum (que havia sido
secada na centrífuga de evaporação, conforme descrito no item 4.6.a, foi ressuspensa em 200
µl de solução de Locke, e foram retiradas duas amostras de 70 µl cada (correspondendo à
saliva de aproximadamente 7 insetos cada), que foram submetidas ao seguinte tratamento:
! Uma amostra da saliva semipurificada (70 µl) foi tratada com proteinase K (Sigma-
Aldrich) na concentração de 0,009 µg/µl totalizando um volume final de 72 µl;
! A outra amostra de 70 µl foi utilizada como controle positivo da saliva (saliva
semipurificada não tratada com proteinase K);
! Como controle positivo da proteinase K, utilizou-se 70 µl de solução de Locke +
proteinase K na concentração de 0,009 µg/µl, totalizando um volume final de 72 µl;
! Estas amostras (saliva semipurificada tratada com proteinase K, controle saliva
Material e Métodos
46
semipurificada e controle proteinase K) foram mantidas a 37 ºC durante 3 horas;
! As duas amostras que continham proteinase K foram transferidas para filtros de
membrana, (com limite de exclusão de 5 kDa), e, após a ultrafiltração por
centrifugação à 4.900 g, durante 20 minutos, a temperatura ambiente, para separar a
proteinase K das amostras, retirou-se 40 µl do material que ficou abaixo do filtro
(material filtrado) de cada uma das amostras, que foram utilizados nos ensaios de
atividade sobre PAC de nervo isolado de rato.
c) Proteinase K à concentração de 0,018 µg/µl
A segunda alíquota contendo saliva semipurificada de B.anurum (descrita no item
4.5.2.a) foi ressuspensa em 200 µl de solução de Locke. Os procedimentos adotados foram os
mesmos descritos no item 4.5.2, porém utilizando o dobro de proteinase K (concentração de
0,018 µg/µl) durante os ensaios de atividade sobre PAC de nervo isolado de rato.
d) Teste-controle para atividade da Proteinase K
A proteinase K utilizada nos ensaios descritos anteriormente (ítens b e c) foi
submetida a um teste de verificação da sua atividade. Utilizou-se o seguinte protocolo:
! Três tubos de microcentrífugas foram separados e rotulados, sendo que em cada um
deles foram adicionados 100 µl de tampão Tris/HCl (0,1 M, pH 7,5).
! No tubo 1 foram adicionadas Proteinase K (concentração final 0,009 µg/µl) e
Azocazeína (Merck) (concentração final 1%) em 200 µl de solução salina 0,9%.
! No tubo 2 foram adicionadas Proteinase K (concentração final 0,018 µg/µl) e
Azocazeína (concentração final 1 %) em 200 µl de solução salina 0,9%.
Material e Métodos
47
! No tubo 3, correspondente ao branco, foi adicionada apenas a Azocazeína
(concentração final 1%) em 200 µl de solução salina 0,9%.
! Os tubos foram mantidos a 37 ºC, por 3 horas;
! Acrescentou-se em cada tubo 600 µl de ácido tricloroacético (Merck) a 10%, e, após
15 minutos, foram centrifugados à 10.600 g, por 5 minutos, a temperatura ambiente;
! Foram transferidos 600 µl do sobrenadante de cada tubo para um novo tubo contendo
700 µl de NaOH 1 M.
A leitura de cada amostra foi realizada em espectrofotômetro (UF-1650 PC/
Shimadzu) a 440 nm.
4.6 CROMATOGRAFIA DE CAMADA FINA (TLC) DA SALIVA SEMIPURIFICADA
DE T. infestans E DE B. anurum
4.6.1 Obtenção da saliva semipurificada
a) Triatoma infestans
A saliva semipurificada de T. infestans, foi obtida após a diluição da saliva bruta em
água Mille Q, na proporção de 1 µl de saliva para 1 µl de água, e semipurificação (conforme
item 4.4.1), e utilizada para a realização da TLC.
b) Belostoma anurum
A saliva bruta de B. anurum foi retirada em água Mille Q, e, após diluição na
proporção de 1 belostomatídeo para 5 µl de água, semipurificada (conforme item 4.5.1) e
utilizada para a realização da TLC.
Material e Métodos
48
4.6.2 Cromatografia de Camada Fina (TLC)
Para realizar a cromatografia de camada fina da saliva semipurificada de T. infestans e
B. anurum (conforme itens 4.6.1 a e b) foram utilizadas placas de vidro de sílica, de 4 cm de
largura e 10 cm de comprimento, do tipo gel(Sigma), específicas para TLC.
Após a aplicação gota a gota de 5 µl da saliva semipurificada (de T. infestans ou de B.
anurum), em um ponto fixo (localizado aproximadamente a 2 cm da base inferior) da placa de
TLC, esta placa foi colocada na estufa a 40 ºC, por 15 minutos, para secagem completa do
material aplicado. Posteriormente, a placa foi colocada cuidadosamente em uma cuba
cromatográfica de vidro, com tampa, contendo em seu interior a fase móvel (composta por
partes iguais de acetona, metanol, etanol, butanol e hexano). Para obtenção desta fase móvel,
que apresentou bons resultados para ambas as salivas testadas, foram realizados experimentos
de padronização que visaram à combinação de diferentes reagentes e sua proporções. Durante
a corrida da fase móvel o sistema de TLC (cuba cromatográfica) ficou fechado para que a
atmosfera em seu interior permanecesse saturada pelo vapor dos solventes.
Depois da TLC, a placa foi novamente colocada na estufa, a 40 ºC, para completa
evaporação dos solventes da fase móvel, e posteriormente foi revelada em vapor de iodo,
utilizando uma cuba cromatográfica de vidro, com tampa, contendo em seu interior algumas
esferas de iodo (Merk).
4.7 TESTE DAS FRAÇÕES (MANCHAS) OBTIDAS NA CROMATOGRAFIA DE
CAMADA FINA (TLC) DA SALIVA SEMIPURIFICADA DE T. infestans E B.
anurum
SOBRE O NERVO CIÁTICO ISOLADO DE RATO
Para cada ensaio foram utilizadas duas placas de TLC, com dimensões iguais. Em
Material e Métodos
49
uma placa foram aplicados 5 µl de saliva semipurificada de T. infestans ou de B. anurum
(conforme itens 4.5.1 a ou b), enquanto que na outra placa, foram aplicados 40 µl ou 80 µl
das amostras de saliva semipurificada desses heterópteros. Em ambas as placas a aplicação
das amostras foi realizada gota a gota em um ponto fixo, localizado aproximadamente na
mesma posição na placa, a uma altura de 2 cm da base inferior da placa.
As placas contendo foram colocadas simultaneamente dentro da cuba cromatográfica
(item 4.6.2), sendo que, após a cromatografia, somente a placa que havia recebido 5 µl de
saliva semipurificada foi revelada com vapor de iodo para localização das frações (manchas
obtidas).
Os locais correspondentes às manchas obtidas na placa revelada em vapor de iodo,
foram raspados da placa principal (placa contendo 40 ou 80 µl de saliva semipurificada e que
não foi revelada com vapor de iodo) sendo cada fração (mancha presente no pó de sílica)
colocada separadamente em um tubo de microcentrífuga devidamente identificado. Essas
frações foram armazenadas no freezer, a -20 ºC para posterior utilização nos ensaios
utilizando nervo ciático isolado de rato.
Nos ensaios utilizando nervo ciático isolado de rato, o pó de sílica correspondente a
cada fração da saliva semipurificada obtida por TLC, foi ressuspenso em 70 µl de solução de
Locke acrescida de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) na concentração final de 10 mM, sendo
40 µl desse material aplicados no ensaio de nervo ciático isolado de rato.
O β-mercaptoetanol é um agente anti-oxidante que foi utilizado para preservar as
moléculas suscetíveis de sofrerem oxidação durante os procedimentos químicos. A
concentração ideal para os ensaios utilizando solução de Locke contendo β-mercaptoetanol,
foi padronizada utilizando-se diferentes concentrações de β-mercaptoetanol, chegando-se as
seguintes concentrações finais, que foram aplicadas nos ensaios: 0,1 mM; 0,5 mM; 1 mM;
10 mM e 20 mM.
Material e Métodos
50
4.8 PREPARAÇÃO DO VASO DORSAL ISOLADO DE Rhodnius prolixus
Rhodnius prolixus, assim como todos os insetos, possui o sistema circulatório aberto.
O único vaso sanguíneo, denominado de vaso dorsal (VD), destes insetos é um tubo,
localizado na linha mediana, dorsalmente ao trato alimentar e que se estende do tórax ao
abdome (FIG. 4) (CHIANG et al., 1990).
FIGURA 4 – Detalhe do vaso dorsal de R. prolixus (seta) observado sob microscópio estereoscópio
A. Aumento de 8 X após a remoção da região dorsal (tergo) do abdômen e B. Aumento
de 30 X.
A porção posterior do vaso dorsal, o coração, é dividida por válvulas em uma série de
câmaras, cada uma das quais contendo um par de aberturas laterais (óstios). A parte anterior
do vaso dorsal, a qual não possui óstio, é a aorta dorsal. A hemolinfa circula principalmente
pela atividade de contração longitudinal do vaso dorsal, que se inicia da parte posterior para a
anterior, a qual se abre na cavidade geral do corpo, a hemocele (CHIANG et al., 1990).
A B
Material e Métodos
51
4.8.1 Obtenção do Vaso Dorsal (VD) de Rhodnius prolixus
Para obtenção do vaso dorsal (VD) os insetos foram colocados no freezer, a -20
o
C,
por dois minutos, para imobilizá-los. Posteriormente os insetos foram dissecados e o VD
retirado e colocado em uma lâmina escavada contendo 20 µl de solução salina 0,9 % ou 20 µl
de solução de Ringer para insetos (NaCl 129,0 mM, KCl 8,6 mM, CaCl
2
20,0 mM, MgCl
2
8,5
mM, NaHCO
3
10,2 mM, NaP
2
PO
4
4,3 mM e Glicose 5,0 mM), com o objetivo de testar a
estabilidade da preparação (período de tempo em que era possível observar os batimentos do
VD na lâmina escavada). Os batimentos do VD (pulsação) alcançaram maiores estabilidades
na presença de solução salina 0,9%, por isso ela foi a solução de escolha para os ensaios
utilizando o VD.
4.8.2 Ensaio da saliva dos heterópteros sobre a preparação do VD de Rhodnius prolixus
As amostras contendo 0,5 µl, 1 µl ou 2 µl de saliva (bruta ou semipurificada) dos
heterópteros foram adicionadas no poço da lâmina escavada contendo o VD de R. prolixus em
solução salina 0,9% (volume final de 20 µl.).
A freqüência de contrações (pulsação do VD) foi observada antes e após a adição da
saliva dos heterópteros, sob microscópio estereoscópico e os tempos (período em que o VD
pulsava) foram registrados com auxílio de um cronômetro.
A lavagem do VD foi realizada com solução salina 0,9% após o ensaio de adição da
saliva dos heterópteros.
Resultados
Resultados
53
5 RESULTADOS
5.1 ATIVIDADE DA SALIVA DOS HETERÓPTEROS SOBRE O PAC DE NERVO
ISOLADO DE RATO
Através do método de ‘single sucrose gap’ foi possível registrar o potencial de ação
composto (PAC) gerado pela estimulação elétrica do nervo isolado. Um registro típico de
PAC de nervo de rato está ilustrado na figura 5. Pode-se observar que o traçado apresenta
duas fases distintas: uma fase ascendente rápida, que corresponde à despolarização do nervo,
decorrente da abertura dos canais de sódio; seguida por uma fase descendente, mais lenta, que
corresponde à inativação dos canais de sódio e abertura dos canais de potássio, característicos
dos processos de repolarização da fibra (nervosa ou muscular).
Os PACs apresentaram amplitudes que variaram entre 30 mV a 60 mV, dependendo,
principalmente, do grau de sucesso do isolamento elétrico entre os compartimentos 3 e 5 da
câmara experimental (FIG. 2).
FIGURA 5 – Registro típico do PAC controle (PACc) do nervo ciático isolado de rato. O traçado foi
obtido através da aplicação de um estímulo de 2 V com 60 µs de duração, após 50 minutos
da preparação.
PAC
c
10 mV
1 ms
Resultados
54
5.1.1 Saliva de Triatoma infestans
A adição de 0,5 µl de saliva de T. infestans (diluída em 39,5 µl de solução de Locke)
na preparação de nervo isolado de rato, causou uma redução progressiva da amplitude, sem
apresentar alterações na fase de repolarização ou duração do PAC, quando comparada ao
registro do PAC controle (PACc). A figura 6A ilustra uma das três réplicas deste
experimento. Essa inibição progressiva não apresentou recuperação mesmo 30 minutos após a
substituição da solução contendo saliva por solução controle (solução de Locke). A redução
média observada foi de 65,0% ± 11,1, (n=3) (FIG.7).
5.1.2 Saliva de Panstrongylus megistus
A adição de 5 µl de saliva de P. megistus (diluída em 35 µl de solução de Locke) na
preparação de nervo isolado de rato, causou uma redução progressiva da amplitude, sem
apresentar alterações na fase de repolarização ou duração do PAC, quando comparada ao
PACc. A figura 6B ilustra uma das seis réplicas desse experimento. A redução média
observada foi de 57,0% ± 4,6 (n=6) (FIG. 7). Essa inibição progressiva apresentou
recuperação parcial e gradual da amplitude do PAC, e, 30 minutos após a substituição da
solução contendo saliva por solução de Locke (momento da lavagem), a média de
recuperação parcial foi de 41,0% ± 3,4 (FIG.7).
5.1.3 Saliva de Belostoma anurum
Quando a saliva obtida de um belostomatídeo (∼1 µl de saliva) foi misturada em 40 µl
de solução de Locke e adicionada à preparação de nervo ciático de rato, ocorreu uma redução
Resultados
55
de forma gradual da amplitude do PAC, com alteração na fase de repolarização e aumento da
duração, quando comparada ao PACc. A figura 6C ilustra uma das três réplicas desse
experimento. Essa inibição progressiva não apresentou recuperação mesmo 30 minutos após
lavagem. A redução média observada foi de 49,0% ± 12,0 (n=3) em relação ao valor do PACc
(FIG.7).
5.1.4 Experimentos controle
Para demonstrar que a redução da amplitude do PAC era devida à ação da saliva dos
heterópteros estudados, e não por uma provável diluição da concentração de sódio, foi
realizado um controle onde água ultrapura (Mille Q) foi adicionada no lugar da saliva. Ao
aplicar 5 µl de água Mille Q (diluída em 35 µl de solução de Locke) na preparação de nervo
isolado de rato, foi observada uma redução média da amplitude do PAC de 6,4% ± 2,5 (n=4)
ao longo dos 50 minutos de experimento. A recuperação média foi de 4,0% ± 1,0 em relação
ao valor do PACc, após 30 minutos após lavagem (FIG. 7).
Resultados
56
FIGURA 6 – Potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático de rato antes e após a adição da saliva dos heterópteros. Cada curva corresponde a um PAC,
registrado em intervalos de 10 minutos, após a adição de saliva ao ensaio, durante 50 minutos. A seta indica o momento da substituição da
solução contendo saliva por solução controle (Locke) (instante de lavagem). As três últimas curvas mostram os 30 minutos posteriores à
lavagem. A. Efeito da adição de 0,5 µl de saliva de T. infestans sobre ao ensaio. B. Efeito adição de 5 µl de saliva de P. megistus ao ensaio.
Note recuperação parcial da amplitude do PAC após 30 minutos de lavagem. C. Efeito da adição da saliva de 1 belostomatídeo (∼1µl de saliva
de B. anurum ) ao ensaio. Note alteração na fase de repolarização, e aumento da duração do PAC, ao longo dos 50 minutos de teste. Legenda:
PACc – Potencial de ação composto controle. Min – minutos. mV – milivolts. ms – milisegundos.
C
BA
PACc
10 min
20 min
30 min
40 min
50 min
60 min
70 min
80 min
Legenda
1 ms
10 mV
10 mV
1 m
s
10 mV
1 m
s
Resultados
57
FIGURA 7 – Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da saliva dos heterópteros: B. anurum (saliva de 1 belostomatídeo
~ 1 µl de
saliva; n = 3), T. infestans (0,5 µl de saliva, n = 3) e P. megistus (5 µl de saliva, n = 6), e de Água Mille Q (5 µl, n = 4 ) sobre o PAC de nervo
isolado de rato. Valores referentes à média e ao erro padrão. A seta indica o momento da substituição da solução contendo saliva por solução
controle (Locke). Legenda: PAC – Potencial de ação composto. PACc - Potencial de ação composto controle.
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Saliva de Triatoma infestans
Saliva de Pantrongylus megistus
Saliva de Belostoma anurum
Controle Água Mille Q
Porcentagem de Redução do PAC em relação ao PACc
Resultados
58
5.2 ATIVIDADE DA SALIVA SEMIPURIFICADA DOS HETERÓPTEROS SOBRE
O PAC DE NERVO ISOLADO DE RATO
5.2.1 Saliva semipurificada de Panstrongylus megistus
A adição de 40 µl de saliva semipurificada de P. megistus (conforme item 4.5.2 a) na
preparação de nervo isolado de rato provocou uma redução, de maneira gradual e reversível,
da amplitude do PAC, sem alterar a fase de repolarização. A figura 8A demonstra uma das
três réplicas do experimento. A redução da amplitude do PAC, observada foi de 29,0 % ± 8,8
(n=3) após 50 minutos de incubação. Essa inibição apresentou recuperação parcial de 23,0 %
± 6,3 da amplitude do PAC, após 30 minutos de lavagem (FIG.9).
5.2.2 Saliva semipurificada de Belostoma anurum
A adição de 40 µl de saliva semipurificada de B. anurum (conforme item 4.5.2 a) na
preparação de nervo isolado de rato provocou uma redução de maneira gradual e reversível da
amplitude do PAC, sem alterar a fase de repolarização. A figura 8B ilustra um desses
experimentos. A redução média da amplitude do PAC, observada em cinco experimentos, foi
de 32,0 % ± 7,7, após 50 minutos de incubação. Essa inibição progressiva apresentou
recuperação parcial e gradual da amplitude do PAC, de 20,0 % ± 1,6 30 minutos após
lavagem (FIG.9). Esta recuperação não acontecia quando o nervo era tratado com saliva bruta
de B. anurum.
Resultados
59
FIGURA 8 – PAC de nervo ciático de rato antes e após a adição da saliva semipurificada de P. megistus e B. anurum. Cada curva corresponde a um PAC,
registrado em intervalos de 10 minutos, após adição da saliva semipurificada ao ensaio, durante 50 minutos. A seta indica o momento da
substituição da solução contendo saliva por solução de Locke (lavagem). As três últimas curvas mostram os 30 minutos posteriores à lavagem.
A. Efeito da adição de saliva semipurificada de P. megistus sobre o ensaio. B. Efeito da adição de saliva semipurificada de B. anurum sobre o
ensaio. Note ausência de alteração na fase de repolarização, e de duração do PAC, ao longo dos 50 minutos de teste, e recuperação da amplitude
do PAC após troca da solução contendo saliva por solução de Locke (lavagem). Legenda: PAC - Potencial de ação composto. PACc – Potencial
de ação composto controle. Min – minutos. mV – milivolts. ms – milisegundos
A
B
PACc
10 min
20 min
30 min
40 min
50 min
60 min
70 min
80 min
Legenda
10 mV
1 m
s
10 mV
1ms
Resultados
60
FIGURA 9 – Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da saliva semipurificada dos heterópteros: P. megistus (40 µl de saliva
semipurificada, na proporção de 1 µl de saliva para 8 µl de solução de Locke, n = 3) e B. anurum (40 µl de saliva semipurificada, na
proporção de 1 belostomatídeo para 50 µl de solução de Locke; n= 5) e do controle utilizando Água Mille Q (5 µl, n = 4 ) sobre o PAC de
nervo isolado de rato. Valores referentes à média e ao erro padrão. A seta indica o momento da substituição da solução contendo saliva por
solução de Locke. Legenda: PAC – Potencial de ação composto. PACc – Potencial de ação composto controle.
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
Porcentagem de Redução do PAC em Relação ao PACc
0
10
20
30
40
Saliva semipurificada de Panstrongylus megistus
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
Controle Água Mille Q
Resultados
61
5.3 ENSAIO PARA DETERMINAR SE O PRINCÍPIO ATIVO RESPONSÁVEL PELA
AÇÃO NO NERVO ISOLADO DE RATO ERA DE NATUREZA LIPÍDICA
5.3.1 Saliva de Triatoma infestans
Após a realização do protocolo de extração de lipídeos (conforme item 4.6.1)
testaram-se separadamente as duas frações obtidas (fase aquosa e fase orgânica) da saliva de
T. infestans. A adiçãode 40 µl do material retido na fase aquosa , na preparação de nervo
isolado de rato, reduziu de forma gradual e reversível a amplitude do PAC sem alterar a fase
de repolarização. A redução média observada na amplitude do PAC, em dois experimentos
realizados, foi de 15,0 % após 50 minutos de incubação. Quinze minutos após a lavagem
observou-se uma recuperação total na amplitude do PAC (100,0% de recuperação) (FIG. 10).
A adição de 40 µl do material retido na fase orgânica, durante o ensaio produziu uma
redução na amplitude do PAC de 5% e após 30 minutos de lavagem a recuperação parcial foi
de 2,0 % (FIG. 10).
5.3.2 Experimentos controle
Para determinar se os reagentes utilizados no protocolo de extração de lipídeos eram
responsáveis pela a redução da amplitude do PAC observada no material retido na fase
aquosa, foram realizados dois experimentos controle. A adição, no ensaio, de 40 µl dos
materiais obtidos na fase aquosa e orgânica produziu, após 50 minutos de ensaio, uma
redução média da amplitude do PAC de 4,8% e 5,0%, com recuperação parcial de 2,0 e 1,0%,
após 30 minutos de lavagem (FIG 10).
Os experimentos controle utilizando DMSO a 5 % em solução de Locke, quando
adicionados na preparação de nervo, não produziram redução na amplitude do PAC, mesmo
Resultados
62
após 15 minutos da sua adição (n=3), demonstrando com isso que a adição de DMSO a 5%,
não interfere na geração do impulso nervoso.
FIGURA 10 – Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da fase aquosa e
orgânica, da saliva extraída de T. infestans (n=2) e do experimento controle (n=2). A
seta indica o momento em que a solução contendo saliva foi substituída por solução
de Locke Legenda: PAC – Potencial de ação composto. PACc – Potencial de ação
composto controle.
5.3.3 Saliva de Belostoma anurum
Após a realização do protocolo de extração de lipídeos (conforme item 4.6.1)
testaram-se separadamente as duas frações obtidas (fase aquosa e fase orgânica) da saliva de
B. anurum na preparação de nervo isolado de rato. A adição de 40 µl do material retido na
fase aquosa reduziu de forma gradual e reversível a amplitude do PAC sem alterar a fase de
repolarização. A redução média da amplitude do PAC, observada em três experimentos
realizados, foi de 41,0% ± 11, 9., após 50 minutos de incubação. Trinta minutos após a
substituição da solução contendo saliva, por solução de Locke, observou-se uma recuperação
parcial da amplitude do PAC, de 27,0% ± 4,6 (FIG.11).
A adição no ensaio de 40 µl do material retido na fase orgânica causou uma redução
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
Porcentagem de redução do PAC em relação do PACc
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Saliva extraída de T. infestans - fase aquosa
Saliva extraída de T. infestans - fase orgânica
Controle fase aquosa
Controle fase orgânica
Resultados
63
na amplitude de PAC de 7,0% ± 1,0, e após 30 minutos da substituição da solução contendo
saliva por solução de Locke, observou-se uma recuperação parcial na amplitude do PAC, de
4 % ± 2,8 (FIG. 11).
FIGURA 11 – Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição da fase aquosa e
orgânica, da saliva extraída de B. anurum (n=3). Valores referentes à média e ao erro
padrão. A seta indica o momento em que a solução contendo saliva foi substituída por
solução de Locke. Legenda: PAC – Potencial de ação composto. PACc – Potencial de
ação composto controle.
5.4 ENSAIO PARA DETERMINAR SE O PRINCÍPIO ATIVO RESPONSÁVEL PELA
AÇÃO NO NERVO ISOLADO DE RATO ERA DE NATUREZA PROTÉICA
A adição das alíquotas de saliva semipurificada de B. anurum, que foram mantidas
com duas concentrações diferentes de proteinase K, (conforme item 4.5.2), produziu uma
redução gradual e reversível a amplitude do PAC, na preparação de nervo isolado de rato, sem
alterar a fase de repolarização. A redução da amplitude do PAC, após 15 minutos de ensaio,
foi de 83,0% para a saliva semipurificada de B. anurum tratada com proteinase K na
concentração de 0,009 µg/µl (FIG. 12A) e de 72,0% para a saliva semipurificada que foi
tratada com proteinase K na concentração de 0,018 µg/µl (FIG.12B). Essa inibição
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
Porcentagem de Redução do PAC em relação ao PACc
0
10
20
30
40
50
Saliva extraída de Belostoma anurum - fase aquosa
Saliva extraída de Belostoma anurum - fase orgânica
Resultados
64
progressiva apresentou recuperação parcial e gradual da amplitude do PAC de 66,0% e
40,0%, respectivamente, 30 minutos após lavagem (FIG.12A e B).
No ensaio controle com saliva semipurificada B. anurum, sem proteinase K (não
tratada), a redução da amplitude do PAC após 10 minutos, foi de 100% para a alíquota
referente ao ensaio de 0,009 µg/µl de proteinase K, e 30 minutos após a lavagem, a
recuperação parcial da amplitude do PAC foi de 70% (FIG. 12A), e para a alíquota de saliva
semipurificada não tratada com proteinase K, referente ao ensaio de 0,018 µg/µl (de
proteinase K), a redução da amplitude do PAC após 15 minutos, foi de 71%, e, 30 minutos
após a lavagem, a recuperação da amplitude do PAC foi de 57% (FIG. 12B).
Foi realizado um terceiro ensaio, com duração total de 80 minutos, com salivas
semipurificadas de B. anurum tratadas com proteinase K (na concentração de 0,018 µg/µl) e
não tratada (controle saliva semipurificada), a adição dessas salivas semipurificadas causou
uma redução na amplitude do PAC de 78,0% e de 65%, respectivamente, após 50 minutos de
ensaio (FIG. 12C). Trinta minutos após lavagem, observou-se uma recuperação parcial e
gradual da amplitude do PAC de 64,0% e 53 %, respectivamente (FIG 12C).
Quando adicionada proteinase K (conforme item 4.6.2), na preparação de nervo, não
houve redução na amplitude do PAC, mesmo após 15 minutos da sua adição (n=3),
demonstrando, que a proteinase K não interfere na geração do impulso nervoso (FIG.12).
Para o teste de atividade da proteinase K utilizou-se como substrato a azocazeína, a
1%,(conforme item 4.5.2 d), os valores de absorbância obtidos, após 3 horas de incubação a
37
o
C, para as amostras contendo as concentrações de 0,009 µg/µl e 0,018 µg/µl de
proteinase K e o branco foram de 1,173 nm, 1,459 nm e 0,021 nm, respectivamente
(FIG. 13). Demonstrando que a proteinase K, utilizada nos ensaios de caracterização de
biomoléculas de natureza protéica, encontrava-se ativa.
Resultados
65
FIGURA 12 – Porcentagem de redução média do PAC observada após a adição das salivas semipurificadas de B. anurum
tratadas ou não com proteinase K.
A – Ensaios referentes à concentração de 0,009 µg/µl de proteinase K , durante 45 minutos. B – Ensaios referentes à concentração de
0,018 µg/µl de proteinase K, durante 45 minutos. C – Ensaios referentes à concentração de 0,018 µg/µl de proteinase K, durante 80 minutos.
A seta indica o momento da substituição da solução contendo saliva por solução de Locke. Legenda: PAC – Potencial de ação composto.
PACc – Potencial de ação composto controle
C
Porcentagem de redução do PAC em relação ao PACc
Tempo decorrido em minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
tratada com 0,009 ug/ul de Proteinase K
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
não tratada com Proteinase K (Controle)
Solução de Locke tratada com 0,009 ug/ul de
Proteinase K (Controle)
Tempo decorrido em minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
tratada com 0,009 ug/ul de Proteinase K
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
não tratada com Proteinase K (Controle)
Solução de Locke tratada com 0,009 ug/ul de
Proteinase K (Controle)
A
B
Tempo decorrido em minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S
a
tr
a
S
a
na
S
o
Pr
o
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
tratada com 0,018 ug/ul de Proteinase K
Saliva semipurificada de Belostoma anurum
naõ tratada com Proteinase K (Controle)
Solução de Locke tratada com 0,018 ug/ul de
Proteinase K (Controle)
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
Porcentagem de redução do PAC em relação ao PACc
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porcentagem de redução do PAC em relação ao PACc
Resultados
66
FIGURA 13 – Atividade da enzima proteinase K sobre o substrato de azocazeína. Valores de absorbância das amostras de proteinase K, em duas diferentes
concentrações (0,009 µg/µl e 0,018 µg/µl) e do branco, após 3 horas de incubação a 37
o
C.
Ctrl (branco) Pk (0,009 ug/ul) Pk (0,018 ug/ul)
Absorbânica (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Controle (branco)
Proteinase K (0,009 ug/ul)
Proteinase K (0,018 ug/ul)
0,021 nm
1, 173 nm
1,459 nm
Resultados
67
5.5 CROMATOGRAFIA DE CAMADA FINA (TLC) DA SALIVA DE
SEMIPURIFICADA DOS HETERÓPTEROS
A aplicação de 5 µl de saliva semipurificada de T. infestans e de B. anurum (conforme
ítens 4.7.1 a) em um sistema de cromatografia de camada fina (TLC), permitiu a visualização
de duas manchas (uma na origem e outra em um ponto alto) em cada placa (FIG. 14 A).
FIGURA 14 – TLC de saliva semipurificada de Triatoma infestans (A) e Belostoma anurum (B).
Foram aplicados 5 µl de cada saliva semipurificada.
5.6 ATIVIDADE DA SALIVA SEMIPURIFICADA E SEPARADA POR TLC SOBRE
O PAC
5.6.1 Experimento controle com β-mercaptoetanol
Nenhuma das cinco concentrações finais de β-mercaptoetanol (0,1 mM, 0,5 mM,
Mancha alta
origem
A B
Resultados
68
1 mM, 10 mM e 20 mM) em solução de Locke produziu redução da amplitude do PAC,
mesmo após 15 minutos da sua adição. Foi realizado um novo ensaio de nervo ciático isolado
de rato, porém com duração de 50 minutos, utilizando a concentração final de 10 mM de
β-mercaptoetanol (em solução de Locke), e novamente, nenhuma redução da amplitude do
PAC foi observada, demonstrando que o β-mercaptoetanol, nas diferentes concentrações
testadas, não interfere na geração do impulso nervoso.
5.6.2 Saliva semipurificada de Triatoma infestans
As frações da saliva semipurificada de T. infestans raspadas da placa de sílica gel,
foram ressuspensas em 70 µl de solução de Locke acrescida de β-mercaptoetanol (na
concentração final de 10 mM) e aplicadas na preparação de nervo isolado de rato.
A aplicação da fração referente à mancha alta (após a realização do TLC de 40 µl de
saliva semipurificada de T. infestans), não produziu efeito de redução do PAC ao longo dos
50 minutos de ensaio. No entanto, a aplicação da fração referente à origem causou uma
redução progressiva da amplitude do PAC, sem alterar a fase de repolarização ou duração do
PAC, quando comparada com o PACc (FIG. 15). A redução da amplitude do PAC após 50
minutos de ensaio foi de 75%, sendo observada uma recuperação da amplitude do PAC de
69% após 30 minutos de substituição da solução contendo saliva por solução Locke (FIG. 16).
A aplicação da fração referente à mancha alta (após a realização do TLC de 80 µl de
saliva semipurificada de T. infestans), não produziu efeito de redução do PAC ao longo dos
50 minutos de ensaio. Entretanto, a aplicação da fração referente à origem ao ensaio, causou
após 30 minutos de ensaio, a redução da amplitude do PAC de 100%, sendo observada uma
recuperação de 94,0% da amplitude do PAC após 30 minutos da substituição da solução
contendo saliva por solução de Locke.
Resultados
69
FIGURA 15 – Efeito da adição da fração (origem) da saliva semipurificada de T. infestans após TLC,
sobre o PAC de nervo isolado de rato. A seta indica o momento da substituição da
solução contendo saliva por solução Locke. Note: Recuperação da amplitude do PAC
após troca da solução contendo saliva por solução de Locke – lavagem. Legenda:
PACc – Potencial de Ação Composto Controle. Min – minutos. mV – milivolts. ms –
milisegundos
FIGURA 16 – Atividade da fração da saliva semipurificada de T. infestans após TLC, sobre o PAC de
nervo isolado de rato. Adição das frações (origens) obtidas após TLC das salivas
semipurificada (40 µl e de 80 µl). A seta indica o momento em que a solução
contendo saliva foi substituída por solução de Locke.
5.6.3 Saliva semipurificada de Belostoma anurum
As frações da saliva semipurificada de B. anurum raspadas da placa de sílica gel,
foram ressuspensas em 70 µl de solução de Locke acrescida de β-mercaptoetanol (na
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Triatoma infestans após TLC (40 ul)
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Triatoma infestans após TLC (80 ul)
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Triatoma infestans após TLC (40 ul)
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Triatoma infestans após TLC (80 ul)
PA Cc
10 min
20 min
30 min
40 min
50 min
60 min
70 min
80 min
10 mV
1 ms
Legenda
Resultados
70
concentração final de 10 mM) e aplicadas na preparação de nervo isolado de rato.
A aplicação das frações referentes origem e mancha alta (após a realização do TLC de
40 µl de saliva semipurificada de B. anurum) produziram uma redução na amplitude do PAC
de 12% e 10% respectivamente, após 50 minutos de ensaio (FIG. 17). Esta redução não
alterou a fase de repolarização ou duração do PAC, quando comparada com o PACc. A
recuperação da amplitude do PAC observada, nos ensaios, foi de 2% após 30 minutos de
substituição da solução contendo saliva por solução Locke (FIG. 17).
A aplicação da fração referente à mancha alta (após a realização do TLC de 80 µl de
saliva semipurificada de B. anurum) não produziu efeito de redução do PAC ao longo dos 50
minutos de ensaio. A aplicação da fração referente à origem causou uma redução de 12% na
amplitude do PAC, após 50 minutos de ensaio (FIG. 17). Esta redução não provocou
alterações na fase de repolarização e duração do PAC, quando comparada com o PACc. Após
30 minutos de lavagem foi observada uma recuperação de 6% da amplitude do PAC (FIG.
17).
Para verificar se a atividade (porcentagem de redução da amplitude do PAC) da
biomólécula presente na saliva semipurificada de B. anurum encontrava-se ativa, quando essa
saliva semipurificada foi aplicada na placa de TLC, foi retirada uma alíquota de 35 µl de
saliva semipurificada, de cada amostra da saliva semipurificada utilizada nos ensaios de TLC.
Estas alíquotas foram secas na centrífuga de evaporação, ressuspensas em 40 µl de solução de
Locke acrescida de β-mercaptoetanol (na concentração final de 10 mM) e utilizadas no ensaio
de nervo ciático isolado de rato, como controle da saliva semipurificada de B. anurum. A
adição dessas alíquotas causou uma redução na amplitude do PAC de 92% e 93%,
respectivamente, após 50 minutos de ensaio (FIG. 18), sendo observada uma recuperação de
77% e 73% da amplitude do PAC, após 30 minutos de lavagem, demonstrando com isso que a
Resultados
71
atividade da biomolécula presente na saliva de B. anurum encontrava-se ativa no momento da
aplicação da saliva semipurificada de B. anurum na placa de TLC.
FIGURA 17 – Atividade das frações (mancha alta e origem) da saliva semipurificada de B. anurum
sobre o PAC após TLC. Adição das frações obtidas após TLC das salivas
semipurificada (40 µl e de 80 µl). A seta indica o momento em que a solução
contendo saliva foi substituída por solução de Locke. Legenda: PAC – Potencial de
ação composto. PACc – Potencial de ação composto controle. TLC – Cromatografia
de camada fina.
FIGURA 18 – Atividade da saliva semipurificada de Belostoma anurum (ensaio controle) sobre o
PAC de nervo isolado de rato
. As alíquotas foram retiradas das salivas semipurificada
utilizadas nos ensaios de atividades das frações obtidas por TLC (40 µl e 80 µl). A
seta indica o momento em que a solução contendo saliva foi substituída por solução
de Locke. Legenda: PAC – Potencial de ação composto. PACc – Potencial de ação
composto controle. PACc – Potencial de ação composto controle. TLC –
Cromatografia de camada fina.
Tempo decorrido em minutos
0 1020304050607080
Porcentagem de redução do PAC em relaçaõ ao PACc
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle saliva semipurificada
de Belostoma anurum (ensaio de 40 ul)
Controle saliva semipurificada
de Belostoma anurum (ensaio de 80 ul)
Porcentagem de redução do PAC em relação ao PACc
0 1020304050607080
0
2
4
6
8
10
12
14
Fração (mancha alta) da saliva semipurificada
de Belostoma anurum após TLC (40 ul)
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Belostoma anurum após TLC (40 ul)
Fração (mancha alta) da saliva semipurificada
de Belostoma anurum após TLC (80 ul)
Fração (origem) da saliva semipurificada
de Belostoma anurum após TLC (80 ul)
Tempo decorrido em minutos
Resultados
72
5.7 ESTABILIDADE DA PREPARAÇÃO DE VASO DORSAL ISOLADO DE
Rhodnius prolixus
Quando o VD foi colocado em 20 µl de solução salina 0,9%, observou-se que os
batimentos cardíacos se mantinham estáveis, mesmo após 24 minutos de ensaio. Aos 32
minutos, os batimentos diminuíam, e, quando a solução de salina 0,9% foi trocada, ocorreu
um aumento imediato dos batimentos. Quando o VD foi transferido para a lâmina escavada
contendo 20 µl de solução de Ringer, a estabilidade do ensaio foi de apenas 5 minutos. Desta
forma, os ensaios foram realizados utilizando a solução salina 0,9% (item 4.8).
5.7.1 Saliva de Triatoma infestans
Ao adicionar diferentes volumes de saliva bruta de T. infestans (0,5 µ, 1,0 µl e 2 µl),
na preparação de VD isolado de R. prolixus observou-se parada total e imediata do VD.
Mesmo após lavagem da preparação com solução salina 0,9%, o VD não voltou a bater (efeito
irreversível). O QUADRO 1 resume os resultados encontrados.
5.7.2 Saliva de Panstrongylus megistus
Ao adicionar 2 µl de saliva de bruta de P. megistus na preparação de vaso dorsal
isolado de R. prolixus observou-se parada total e imediata do VD, e após lavagem da
preparação, com solução salina 0,9%, o VD volta a bater demonstrando um efeito reversível.
O QUADRO 1 resume os resultados encontrados.
Resultados
73
5.7.3 Saliva de Belostoma anurum
Ao adicionar 0,5 µl de saliva bruta de B. anurum na preparação de vaso dorsal isolado
de R. prolixus, observou-se parada total e irreversível, mesmo após lavagem da preparação
com solução salina 0,9%.
A adição de 2 µl de saliva semipurificada de B. anurum produziu uma parada total e
imediata do VD, apresentando um efeito reversível após lavagem com solução salina 0,9%. O
QUADRO 1 resume os resultados encontrados.
QUADRO 1
Efeito da saliva dos heterópteros sobre a preparação de vaso dorsal de Rhodnius prolixus
Espécie
Quantidade de saliva aplicada
(completando o volume final para 20
µl com salina 0,9 %)
efeito
T. infestans
0,5 µl, 1,0 µl e2 µl de saliva bruta.
Parada total e imediata do VD. Mesmo
após 3 minutos de lavagem com solução
salina ele não voltou a bater (efeito
irreversível).
P. megistus
2 µl de saliva bruta
Parada total e imediata do VD. Após
lavagem com solução salina ele voltou a
bater (efeito reversível).
∼ 0,5 µl de saliva bruta
Parada total e imediata do VD. Mesmo
após 3 minutos de lavagem com solução
salina ele não voltou a bater (efeito
irreversível).
B. anurum
∼ 2 µl de saliva semipurificada
Parada total do VD, e após substituição
da saliva por solução salina 0,9%, voltou
a bater (efeito reversível).
Discussão
Discussão
75
6 DISCUSSÃO
Dan e colaboradores (1999) observaram que a saliva de T. infestans possui atividade
inibitória irreversível sobre a geração do impulso nervoso, por atuar sobre o canal de sódio.
No presente trabalho, foi demonstrado que a saliva de outra espécie de triatomíneo,
P. megistus, também possui atividade inibitória sobre a geração do impulso nervoso. Uma
diferença interessante observada entre essas duas espécies de triatomíneos estudadas é, que,
ao contrário do observado na saliva T. infestans, a saliva de P. megistus causa inibição
progressiva da amplitude do PAC, de maneira reversível, atuando de forma semelhante a um
anestésico local (por exemplo, a lidocaína).
Cavalcante e colaboradores (2003), em ensaio hemolítico visando demonstrar uma
atividade inibidora do sistema de complemento presente na saliva de insetos hematófagos,
observaram que, mesmo em altas concentrações, a saliva de P. megistus incubada com
suspensões de hemácias de carneiro lavadas não causava hemólise, diferente do observado
para a saliva de T. brasiliensis. Isso sugere que a saliva de P. megistus não possui molécula(s)
com atividade hemolítica, como, por exemplo, a trialisina, uma proteína formadora de poro
presente na saliva de T. infestans (AMINO et al., 2002), que é capaz de permeabilizar vários
tipos de células levando-as à morte. Essa proteína estaria presente na saliva das espécies do
gênero Triatoma, o que poderia ajudar a explicar o efeito irreversível observado neste
trabalho quando a saliva de T. infestans foi adicionada ao ensaio de nervo ciático isolado de
rato. Esses dados são reforçados por estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa com a
saliva de T. vitticeps (SOUZA et al.,2003), onde foi observado que, semelhante ao descrito
para a saliva de T. infestans, a saliva de T. vitticeps possui uma atividade inibitória
irreversível sobre a amplitude do PAC de nervo ciático de rato, mesmo após 30 minutos de
lavagem.
Discussão
76
A saliva de B. anurum também inibiu a geração do impulso nervoso em nervo ciático
isolado de rato, de forma gradual, como nos triatomíneos testados, mas, além de inibir de
maneira irreversível a amplitude do PAC, induz alterações na fase de repolarização e um
aumento da duração do PAC, sugerindo fortemente a ocorrência de danos na membrana das
fibras nervosas. Na saliva dos belostomatídeos, como ocorre em outros heterópteros
predadores , encontra-se um mistura de enzimas digestivas (diversas proteases, lipases, por
exemplo) que realizam a pré-digestão externa da presa (COHEN, 1990, 1996; EDWARDS,
1961; MILLES, 1972; PICADO, 1936; REES & OFFORD , 1969; SWART et al., 2006).
Nestes insetos predadores, é comum a presença de fosfolipase salivar, presente também em
B. anurum (Geórgia Atella, comunicação pessoal), cuja função biológica é de lisar as
membranas celulares, ajudando na liquefação dos tecidos da presa. A presença de proteases e
de fosfolipases na saliva de B. anurum poderiam explicar as alterações observadas na fase de
repolarização e no aumento da duração do PAC do nervo ciático isolado de rato.
Um dos controles realizados durante os experimentos com a saliva bruta de
heterópteros foi a incubação do nervo com solução de Locke diluída (7:1) em água ultrapura
(Mille Q). Este controle foi importante para descartar a possibilidade de que os efeitos
observados nos ensaios com saliva fossem, em parte, explicados simplesmente por uma
diluição de sódio do meio onde se encontravam as fibras nervosas.
Nos experimentos com a saliva semipurificada de P. megiustus e de B. anurum,
observou-se uma reversibilidade da atividade inibitória sobre a amplitude do PAC de nervo
isolado de rato. O fato da saliva semipurificada de B. anurum não alterar a fase de
repolarização nem a duração do PAC da mesma forma que a saliva bruta, sugere a existência,
nesta espécie, de uma biomolécula semelhante à encontrada nos triatomíneos, responsável
pela ação reversível sobre o PAC. Isso indica que o aquecimento e/ou a ultrafiltação da saliva
de B. anurum retiram ou inativam a molécula responsável pela lesão irreversível do PAC de
Discussão
77
nervo ciático isolado de rato. A ultrafiltração, a extração de lipídeos com solventes orgânicos
e o tratamento com proteinase K mostraram que o componente ativo da saliva de B. anurum
que atua sobre o PAC não é de natureza lipídica e tem peso molecular < 5 kDa.
As diferenças no perfil de atividade (porcentagem de redução da amplitude do PAC)
da saliva semipurificada de B. anurum, observada nos ensaios de natureza protéica, quando a
saliva semipurificada foi tratada e/ou não tratada com duas diferentes concentrações de
proteinase K, podem ser atribuídas à perda da atividade da molécula bioativa, quando a saliva
é estocada, fenômeno que foi freqüentemente observado durante os experimentos.
O fato da molécula bioativa de B. anurum ser provavelmente de natureza não lipídica,
semelhante ao resultado obtido com a saliva de T. infestans, é bastante interessante, uma vez
que a saliva deste inseto é esbranquiçada, viscosa e pouco solúvel em água, com a presença
abundante de lipídeos. A existência de enzimas proteolíticas de natureza lipoprotéicas ou
conjugadas com lipídeos seria uma adaptação importante para estes predadores aquáticos,
pois dificultaria a diluição das enzimas na água, auxiliando a pré-digestão externa da presa no
ambiente aquático (PEREIRA, 1992). Entretanto, se pensarmos que a saliva também auxilia
na imobilização da presa, seria interessante que a molécula responsável por esta atividade se
difundisse rapidamente pelo corpo da presa até o seu alvo, as fibras nervosas e/ou na
musculatura.
Torre Bueno (1906) descreveu a ação paralisante da saliva de B. flumineum sobre as
suas presas. Posteriormente, trabalhos realizados com B. anurum demonstraram que a
inoculação intravenosa da sua saliva é capaz de matar rapidamente camundongos e hamsters
(PEREIRA et al., 1988, 1989). Como a saliva de B. anurum produz parada cardíaca em
diástole, podendo ser seguida por forte contratura da musculatura cardíaca, em ensaios de
coração isolado de cobaia, Dan e colaboradores (1993), sugeriram que este efeito tóxico sobre
o coração seria o responsável pelas mortes observadas em camundongos e hamsters.
Discussão
78
A fração da saliva semipurificada de T. infestans, recuperada da placa de TLC
referente à mancha da origem, produziu um efeito de inibição da amplitude do PAC
semelhante ao da saliva bruta, porém de forma reversível, o que reforça a idéia de que, além
da molécula responsável pela inibição reversível do canal de sódio, existem uma ou mais
moléculas diferentes que fazem com que o efeito se torne irreversível.
Os resultados do presente trabalho são semelhantes ao obtido por Dan (2002), que
utilizou o mesmo bioensaio de nervo isolado de rato, com uma proteína purificada de 14 kDa
da saliva de T. infestans. Na continuação destes estudos, Amino (2002), sugeriu que esta
proteína de 14 kDa funcionaria como um carreador de uma pequena molécula
(aproximadamente 437 Da), que seria responsável pela atividade biológica sobre PAC do
nervo de rato. A grande dificuldade em provar esta hipótese do carreador é excluir a
possibilidade de que a molécula menor, também encontrada na saliva de T. infestans, seria
uma molécula co-purificada com a proteína de 14 kDa. Embora os resultados aqui
apresentados não resolvam definitivamente a questão sobre o papel da “proteína de 14 kDa”,
eles confirmam a presença de molécula(s) de baixo peso molecular (< 5 kda) na saliva de
T. infestans, com a mesma atividade característica sobre o PAC descrita anteriormente por
Dan (2000) e Amino (2002). Além do baixo peso molecular, os ensaios realizados com a
saliva semipurificada sugerem que a molécula bioativa sobre o PAC é termoresistente e de
natureza não lipídica.
Ao contrário do observado para T. infestans, as frações da saliva semipurificada de
B. anurum recuperadas da placa de sílica gel depois da TLC produziram uma atividade de
redução da amplitude do PAC, pouco expressiva. Fato este que contraria também, os
resultados obtidos nos ensaios controle, no qual, as duas alíquotas de saliva semipurificada de
B. anurum, apresentaram expressivas atividades de redução da amplitude do PAC,
demonstrando que a atividade da biomolécula presente na saliva de B. anurum encontrava-se
Discussão
79
ativa quando a saliva semipurificada foi aplicada sobre a placa de TLC. Provavelmente, ou
houve perda da atividade da biomolécula durante o seu contato com a fase móvel utilizada na
TLC ou perda de material devido a sua forte interação com a placa de sílica gel ou ainda por
oxidação ou mesmo a molécula responsável pela atividade de redução da PAC não se cora
pelo vapor de iodo, poderiam explicar a pequena atividade sobre o PAC, observada quando as
frações da saliva semipurificada de B. anurum recuperadas da placa de TLC foram utilizadas
nos ensaios de nervo ciático isolado de rato.
Os resultados aqui obtidos com a utilização de saliva semipurificada demonstram, de
forma clara, que os heterópteros P. megistus, T. infestans e B. anurum realmente possuem na
sua saliva molécula(s) bioativa(s) sobre o PAC do nervo ciático de rato. É interessante
ressaltar que, em todos eles, o(s) componente(s) da saliva semipurificada são termoresistentes,
menores que 5 kDa e apresentam uma atividade reversível sobre a amplitude do PAC, sem
alterar sua repolarização e duração. Quando a saliva bruta de P. megiustus e a saliva
semipurificada de B. anurum foram testadas sobre a preparação de vaso dorsal de R. prolixus,
produziram uma parada total e reversível das contrações musculares.
A ação da saliva semipurificada de B. anurum e da saliva bruta de P. megistus na
preparação do vaso dorsal de R. prolixus, cessando os batimentos de forma imediata e
reversível, sugere que esta(s) biomolécula(s) poderia(m) estar envolvida(s) também na
atividade paralisante da saliva e que estas atividades poderiam ter um mesmo mecanismo de
ação. Esta suposição é reforçada pelo trabalho de Dan e colaboradores (1999), que
demonstraram que a atividade saliva de T. infestans, reduzindo a amplitude do PAC de nervo
isolado de rato, era devida à um bloqueio da corrente de sódio. Uma ação bloqueadora sobre
os canais de sódio da musculatura de R. prolixus também poderia explicar a parada dos
batimentos observada na preparação do vaso dorsal. Entretanto, experimentos
Discussão
80
complementares são necessários para comprovar se as atividades observadas são devido à
atuação das biomoléculas diretamente sobre os canais de sódio.
Outra evidência de um mecanismo de ação único para a atividade sobre a condução do
impulso nervoso em rato e sobre a musculatura de inseto, seria o relato do processo de
hemolinfagia por triatomíneos Ryckman (1951) observou que as ninfas que eram sugadas
permaneciam paradas durante todo o processo de alimentação e aparentemente não sofriam
danos em conseqüência desse tipo de alimentação e não morriam. Em condições de
laboratório, durante o processo de hemolinfagia dos triatomíneos, não se observa a pré-
digestão dos tecidos e nem a morte dos artrópodos sugados, apenas uma imobilização
temporária dos mesmos (Noireau, F. em comunicação pessoal). Desta forma, sugere-se a
saliva dos triatomíneos atuaria tanto como anestésico, se depositada na pele do hospedeiro
vertebrado, como paralisante, se injetada em invertebrados.
É interessante ressaltar que a hemolinfagia também foi verificada em fêmeas de
mosquitos, quando Harris e colaboradores (1969) demonstraram que, em condições de
laboratório, Aedes aegypti e Culex tarsalis podiam se alimentar de fluidos de larvas de insetos
(lepidópteros) e produzirem ovos viáveis.
Nesse contexto, podemos pensar na hematofagia como uma especialização da
predação, onde, ao invés de utilizar a saliva para predar (paralisar e digerir tecidos) um
pequeno invertebrado, a saliva é utilizada para anestesiar e obter o sangue repetidas vezes de
um vertebrado que, comparativamente, é uma fonte estável e quase inesgotável de alimento
(AMINO, 2002).
Portanto, considerando estes parâmetros, a nossa hipótese de que a atividade
paralisante dos heterópteros predadores e a atividade anestésica encontrada nos hematófagos
compartilhariam das mesmas biomoléculas e que foram mantidas durante a evolução destes
Discussão
81
grupos, pode estar correta. Entretanto, somente a caracterização molecular do princípio
responsável por estas atividades poderá confirmar definitivamente a nossa hipótese.
Uma dificuldade para atingir este objetivo é a natureza das moléculas bioativas
estudadas, que provavelmente não são de natureza protéica, o que impossibilita a sua
produção por meio de recombinação gênica ou por síntese de peptídeos. Além disso o
pequeno volume obtido dessas moléculas por inseto torna o trabalho laborioso e dificulta a
sua análise por técnicas como espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear.
Estudos sobre atividades presentes na saliva de insetos, como os do presente trabalho,
poderão, após a completa caracterização das moléculas bioativas, produzir informações
relevantes sobre a estrutura molecular e função biológica das mesmas, bem como fornecer
novos alvos para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou inseticidas.
Conclusões
Conclusões
83
7 CONCLUSÕES
• A saliva de T. infestans e de B. anurum inibe de forma gradual e irreversível a
amplitude do PAC, porém a saliva de B. anurum interfere na repolarização e duração
do PAC de nervo ciático isolado de rato.
• Tanto a saliva bruta como a saliva semipurificada de P. megistus inibem de forma
gradual e reversível a amplitude do PAC, sem alterar a repolarização e duração do
PAC de nervo ciático isolado de rato.
• A saliva semipurificada de T. infestans e B. anurum inibe de forma gradual e
reversível a amplitude do PAC, sem alterar a repolarização e a duração do PAC de
nervo ciático isolado de rato.
• A saliva de T. infestans e B. anurum provocam parada irreversível dos batimentos do
vaso dorsal de R. prolixus.
• A saliva de P. megistus provoca parada reversível dos batimentos do vaso dorsal de
R. prolixus.
• A saliva semipurificada de B. anurum provoca parada reversível dos batimentos do
vaso dorsal de R. prolixus.
Conclusões
84
• A molécula bioativa com ação sobre o PAC de nervo ciático de rato presente na saliva
de T. infestans, P. megistus e B. anurum é termoresistente, menor do que 5 kDa.
• A molécula bioativa com ação sobre o PAC de nervo ciático de rato presente na saliva
de T. infestans e B. anurum provavelmente não é de natureza lipídica.
• A molécula bioativa com ação sobre o PAC de nervo ciático de rato presente na saliva
de B. anurum provavelmente não é de natureza protéica.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABALOS, J. W.; WYGODZINSKY, P. Las Triatominae Argentinas (Reduviidae,
Hemiptera). 1951, 178p. Monografia – Instituto de Medicina Regional, Universidade
Nacional de Tucumán, San Miguel de Tucumán, 1951.
ANDERSEN, J. F.; FRANCISCHETTI, I. M.; VALENZUELA, J. G.; SCHUCK, P.;
RIBEIRO, J. M. Inhibition of hemostasis by a high affinity biogenic amine-binding protein
from the saliva of a blood-feeding insect. J. Biol. Chem.., v. 278, n. 7, p. 4611-17, Fev. 2003.
AMINO, R. Interações parasito hospedeiro na tripanossomíase americana: o papel da
saliva de Triatoma infestans. 2002. 161f. Tese (Doutorado) – Escola Paulista de Medicina,
Universidade Federal de São Paulo, São Paulo.
AMINO, R.; PORTO R. M.; CHAMMAS, R.; EGAMI, M. I.; SCHENKMAN, S.
Identification and characterization of a sialidase released by the salivary gland of the
hematophagous insect Triatoma infestans. J. Biol. Chem., v. 273, n. 38, p. 24575-82, Set.
1998.
AMINO, R..; MARTINS, R. M.; PROCÓPIO, J.; HIRATA, I. .Y.; JULIANO, M. A.;
SCHENKMAN, S. Trialysin, a novel pore-forming protein from saliva of hematophagous
insects activated by limited proteolysis. J. Biol. Chem., v. 277, n. 8, p. 6207-13, Fev. 2002.
BOYD, D. W. Digestive enzymes and style morphology of Deraeocoris nigritulus (Uhler)
reflecti adaptations for predatory habits. Ann. Entomol. Soc. Am., n.96, v. 5, p. 667-71, Set.
2003.
BOYD, D. W.; COHEN, A. C.; ALVERSON, D. H. Digestive enzymes and style morphology
of Deraeocoris nebulosus (Hemiptera: Miridae), a predacious plant bug. Ann. Entomol. Soc.
Am., n. 95, v. 3, p. 395-401, Maio. 2002.
BRUMPT, E. Importance du cannibalisme et de la coprofhagie chez les Réduvidés
hématophages (Rhodnius, Triatoma) pour la conservation des trypanosomes pathogénes en
dehors de l'hôte vertébré. Bull. Soc. Pathol. Exot., v. 7, p. 702-05, Dez.1914.
CATTERALL, W. A. Neurotoxin that act on voltage-sensitive sodium channels in excitable
membranes. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. v. 20, p. 15-43, Abr. 1980.
Referências Bibliográficas
87
CATTERALL, W. A. Struture and function of voltage-sensitive ion channels. Science. v. 242,
n.7, p. 50-61, Out. 1988.
CAVALCANTE, R.R., PEREIRA, M.H., GONTIJO, N.F. Anti-complement activity in the
saliva of phlebotomine sand flies and other haematophagous insects. Parasitology, v. 127,
n.1, p. 87-93, Jan. 2003.
CHIANG, RG.; CHIANG, J.A.; DAVEY, K.G. Morphology of the dorsal vessel in the
abdomen of the blood feeding insect Rhodnius prolixus. J. Morphol.. v. 204, n. 1, p. 9-23.
1990.
COHEN, A. C. Feeding adaptations of some predaceous Hemiptera. Ann. Entomol. Soc.
Am., v. 83, n. 6, p. 1215-1223, Jun. 1990.
COHEN, A. C. Plant Feeding by predatory Heteroptera: evolutionary and adaptational aspects
of trophic switching. In: WIEDENMANN, R.N.; ALOMAR, O. Zoophytophagous
Heteroptera: Implications for life history and integrated pest management. 1. ed.
Lanham: Entomological Society of America, 1996. p. 1-17.
COLL, M.; GUESRSOHN, M. Omnivory in terrestrial arthropodes: Mixing plant and prey
diets. Annu. Rev. Entomol., v. 47, p. 267-97,Jan. 2002
COSTA, J.; FELIX, M. Triatoma juazeirensis sp. nov. from the state of Bahia, Northeastern
Brazil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v.102, n.1, p. 87-
90, Fev. 2007.
COSTANZO, L. S. Neurofisiologia In: COSTANZO, L. S. Fisiologia. 1.
ed., Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1999. Cap. 3, p. 52-91.
COX , J. J.; REIMANN, F.; NICHOLAS, A. K.; THORNTON, G.; ROBERTS, E.,
SPRINGELL,k K.; KARBANI, G.; JAFRI, H.; MANNAN, J.; RAASHID, Y.; AL-GAZALI,
L.; HAMAMY, H.; VALENTE, E. M.; GORMAN, S.; WILLIAMS, R.; MCHALE, D. P.;
WOOD, J. N.; GRIBBLE, F. M.; WOODS, C.G. An SCN9A channelopathy causes
congenital inability to experience pain. Nature, v. 444, n. 7121, p. 894-8, Dez. 2006.
CRUZ, J. S.; COTTA, G.; DINIZ, C. R.; BEIRÃO, P. S. L. Partial purification and
pharmacological characterization of a neurotoxic fraction isolated from the venom of the
spider Lycosa erythrognatha. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 27, n. 11, p. 2653-59, Nov. 1994.
Referências Bibliográficas
88
CULLEN, M. J. The biology of giant water bugs (Hemiptera: Belostomatidae) in Trinidad.
Proc. R. Ent. Soc. Lon., v. 44, p.123-36. 1969.
DAN, A. Identificação, purificação e caracterização de uma proteína da saliva de
Triatoma infestans com a atividade bloqueadora sobre a geração do impulso nervoso.
2000. 112f. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais, Belo Horizonte.
DAN, A.; PEREIRA, M. H.; MELO, A. L.; AZEVEDO, A. D.; FREIRE-MAIA, L. Effects
induced by saliva of the aquatic hemipteran Belostoma anurum on the isolated guinea-pig
heart. Comp. Biochem. Physiol. C., v. 106, n. 1, p. 221-8, Set. 1993.
DAN, A., PEREIRA M. H, PESQUERO J. L, DIOTAIUTI L, BEIRAO P. S. L. Action of the
saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. J. Med.
Entomol., v. 36, n. 6, p. 875-9, Nov. 1999.
DE CARLO, J. M., PELLERANO, G. N. & MAGGESE, M. C. Anatomia microscópica del
tracto digestivo y glandulas salivares de Lethocerus mazzai (Hemíptera/Belostomatidae)
Physis, v. 32, p. 295-314, 1973.
DE PAULA, A. S.; DIOTAIUTI, L.; SCHOFIELD, C. J. Testing the sister-group relationship
of the Rhodniini and Triatomini (Insecta: Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Mol
Phylogenet. Evol., v. 35, n. 3, p. 712-8, Mar. 2005.
EDWARDS, J. S. The action and composition of the saliva of an assassin bug Platymeris
rhadamanthus Gaerst (Hemiptera/Reduviidae) J. Exp. Biol., v. 38, n. 1, p. 61-77, Mar. 1961.
FAURE-FREMIET, E. Contribuition à l´etude des glandes labieles des hydrocorises. Ann.
Sci. Nat. (9.o. Ser. 2, Zool.), v. 12, p. 215-239, 1910.
FRANCISCHETTI, I. M.; RIBEIRO, J. M., CHAMPAGNE, D., ANDERSEN, J.
Purification, cloning, expression, and mechanism of action of a novel platelet aggregation
inhibitor from the salivary gland of the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. J. Biol.
Chem., v. 275, n. 17, p. 12639-50, Abr. 2000.
FORERO, D.; WEIRAUCH, C.; BAENA, M. Synonymy of the reduviid (Hemiptera:
Heteroptera) genus Torrealbaia (Triatominae) with Amphibolus (Harpactorinae), with notes
on Amphibolus venator (Klug, 1830). Zootaxa, v. 670, p. 1-12, Out. 2004.
Referências Bibliográficas
89
GALVÃO, C.; CARCAVALLO, R.; ROCHA, D. S.; JUBERG, J. A checklist of the current
valid species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1909 (Hemiptera, Reduviidae) and their
geographical distribution, with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa, v. 202, p. 1-36,
Maio. 2003.
GARCIA-AVILA, I..; VIVAR-GUZMAN, R.; QUEZADA-MARQUEZ, J.; HUAMAN-
MAYTA, P. Aquatic insects that are bioregulators of mosquito larvae present in Pantanos de
Villa, Lima, Peru. Rev. Cubana Med. Trop., v. 48, n. 3, p. 227-8. 1996.
HARRIS, P; RIORDAN, D. F.; COOKE, D. Mosquitoes feeding on insect larvae. Science. v.
164, n. 3876, p. 184-85, Abr. 1969.
HELLMANN, K.; HAWKINS, R.I. Anticoagulants and fibrinolytic activities from Rhodnius
prolixus Stål. Nature, v. 201, n. 4923, p. 1008-9, Mar. 1964.
HELLMANN, K.; HAWKINS, R. I. Prolixin-S and Prolixin-G: to anticoagulants from
Rhodnius prolixus Stål. Nature, v. 207, n. 4994, p. 265-67, Jul. 1965.
HYPSA, V.; TIETZ, D. F.; ZRZAVÝ, J.; REGO, R. O. M.; GALVÃO, C.; JURBERG, J.
Phylogeny and biogeography of Triatomnae (Hemiptera: Reduviidae): molecular evidence of
a New World origin of the Asiatic clade. Mol. Phylogenet. Evol., v. 23, n. 3, p. 447-57, Jun.
2002.
KALVACHOVÁ, P.; HRIBALOVÁ, V.; KODYM, P.; VOLF, P. Modulation of murine
lymphocyte responsiveness by the saliva of Rhodnius prolixus (Hemiptera:Reduviidae). J.
Med. Entomol., v. 36, n. 3, p. 341-44, Maio. 1999.
KUTCHAI, H. C. Geração e Condução dos Potenciais de Ação. In: BERNE, R. M.; LEVY,
M. N.; KOEPPEN, B. M.; STANTON, B. A. Fisiologia. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2000. Cap. 3, p. 29-41.
LAVOIPIERRE, M. M.; DICKERSON, G.; GORDON, R. M. Studies on the methods of
feeding of blood-sucking arthropods. Ann. Trop. Med. Parasitol., v. 53, p. 235-50, Jun.
1959.
LENT, H.; WYGODZINSKY, P. Revision of the Triatominae (Reduviidae, Hemiptera) and
their significance as vector of Chagas’disease. Bull. Am. Mus. Nat. Hist., v. 163, n. 3, p.
125-520. 1979.
Referências Bibliográficas
90
LOROSA, E. S.; JURBERG, J.; SOUZA, A. L.; VINHAES, M. C.; NUNES, I. M. Hemolinfa
de Dictyoptera na manutenção do ciclo biológico silvestre de Triatoma rubrovaria
(Blanchard, 1843) e Triatoma circummaculata (Stal, 1859) (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae). Entomol.Vect., v. 7, n. 4, p. 287-296, Out-Dez. 2000.
MEBLINGER, K. What is a nociceptor ? Der. Anaesthesist. v. 46, n. 2, p. 142-53, Fev. 1997.
MELLINK, J. J.; BONVENKAMP, W. V. Funcional aspects of mosquito salivation in blood
feeding in Aedes aegypti. Mosq. News, v. 41, p. 110-15, 1981.
MILES, P.W. The saliva of Hemiptera. Adv. Insect Physiol., v. 9, p. 183-256, 1972.
MILES, A.; ARIAS, J. R.; DE SOUZA, A.; PÓVOA, M. Chagas disease in the Amazon basin
III. Ecotopes of ten triatomine bug species (Hemiptera: Reduviidae) from the vicinity of
Belém, Para state, Brazil. J. Med. Entomol., v. 18, n. 4, p. 266-78, Jul. 1981.
NIESER, N.; ALKINS-KOO, M. The water bugs of Trinidad and Tobago. St. Augustine:
University of the West Indies, 1991. 127p.
NIESER, N.; MELO, A.L. Os heterópteros aquáticos de Minas Gerais: guia introdutório
com chave de identificação para as espécies de Nepomorpha e Gerromorpha. Belo Horizonte:
UFMG, 1997. 180p.
NOESKE-JUNGBLUT, C.; HAENDLER, B.; DONNER, P.; ALAGON, A.; POSSANI, L.;
SCHLEUNING, W. D. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of thrombin. J. Biol.
Chem., v. 270, n. 48, p. 28629-34, Dec. 1995.
NOESKE-JUNGBLUT, C.; KRATZCHMAR, J.; HAENDLER, B.; ALAGON, A.;
POSSANI, L.; VERHALLEN, P.; DONNER, P.; SCHLEUNING, W. D. An inhibitor of
collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. J. Biol.
Chem., v. 269, n. 7, p. 5050-53, Fev. 1994.
PEREIRA, F. E. L.; BOGLIOLO, L. Inflamações In: BOGLIOLO, L. Patologia. 6. ed., Rio
de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000, Cap. 7, p. 112-48.
PEREIRA, M. H. Avaliação da capacidade predatória e aspectos da biologia de
Belostoma anurum e Belostoma plebejum (Hemíptera, Belostomatidae), em laboratório.
1992. 117f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia) – Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
Referências Bibliográficas
91
PEREIRA , M. H.; PENIDO, C. M.; MARTINS, M. S.; DIOTAIUTI, L. Comparative kinetics
of bloodmeal intake by Triatoma infestans and Rhodnius prolixus, the two principal vectors of
Chagas disease. Med.Vet. Entomol., v. 12, n. 1, p. 84-8, Jan. 1998.
PEREIRA, M. H.; PENIDO, C. M.; MARTINS, M. S.; DIOTAIUTI, L. Triatoma infestans is
more efficient than Panstrongylus megistus in obtaining blood meals on non anaesthetized
mice. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 90, n. 6, p. 765-7, Nov-Dez.1995.
PEREIRA, M. H.; DAN, A.; HERMÉTO, M. V.; BICALHO, R. S.; MELO, A.; PEREIRA L.
H. Estudos preliminares da ação da saliva de Belostoma sp. In: REUNIÃO ANUAL DA
SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O PROGRESSO DA CIÊNCIA, 40, 1988, São Paulo.
Anais de resumos dos trabalhos apresentados na reunião anual da Sociedade Brasileira
para o Progresso da Ciência, São Paulo: Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência,
1988. v.1.
PEREIRA, M. H.; DAN, A.; HERMÉTO, M. V.; MELO, A., PEREIRA L. H.; COSTA, J. L.;
FREIRE-MAIA, L. Injeção de saliva de Belostoma harrisi induz arritmias cardíacas,
hipotensão arterial e morte em hamsters anestesiados. In: REUNIÃO ANUAL DA
FEDERAÇÃO DAS SOCIEDADES DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL, 4, Caxambu. Anais
de resumos de Caxambu, Caxambu: Federação das Sociedades de Biologia Experimental,
1989, p. 120.
PEREIRA, M. H.; SILVA, R. E.; AZEVEDO, A. M.; MELO, A. L.; PEREIRA, L. H.
Predation of Biomphalaria glabrata during the development of Belostoma anurum
(Hemiptera, Belostomatidae). Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo, v. 35, n. 5, p. 405-9, Set-
Out. 1993.
PEREIRA, M. H.; SOUZA, M.E.L.; VARGAS, A. P.; PENIDO, C.M.; MARTINS, M. S.;
DIOTAIUTI, L. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus
saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Trop., v. 61, n. 3, p. 255-61, Maio. 1996.
PEREIRA, M. H.; GONTIJO, N. F.; GUARNERI, A. A.; SANT'ANNA, M.R.; DIOTAIUTI,
L. Competitive displacement in Triatominae: the Triatoma infestans success. Trends
Parasitol., v. 22, n. 11, p. 516-20, Set. 2006.
PEREZ, R.; PANZERA Y.; SCAFIEZZO, S.; MAZZELLA, M. C.; PANZERA P.;
DUJARDIN, J. P. & SCVORTZOFF, E. Cytogenetics as a tool for triatominae species
distinction (Hemiptera: Reduviidae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 87, n. 3, p. 353-61, Jul-
Set. 1992.
Referências Bibliográficas
92
PICADO, C. T. Estudo experimental sobre o veneno de Lethocerus Del-Pontei (DeCarlo)
(Hemiptero/Belostomatidae). Memórias do Instituto Butantan, Tomo X, p. 303-10.
1935/36.
PONTIER, J. P.; DELPLANQUE, A. Les predateurs de Biomphalaria glabrata (Say, 1818)
molusque vecteur de la Shistosomose em Guadeloupe. Bull. Soc. Vet. Med. Comp. Lyon., v.
78, p. 319-331, 1976.
REES, A. R.; OFFORD, R. E. Studies on the protease and other enzymes from the venom of
the Lethocerus cordofanus. Nature, v. 221, n. 5181, p. 675-77, Fev. 1969.
RIBEIRO, J. M. C. Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists?
Infect. Agents. Dis., v. 4, n. 3, p. 143–52. Set. 1995.
RIBEIRO, J. M. C.; FRANCISCHETTI, I. .M., Role of arthropod saliva in blood feeding:
sialome and post-sialome perspectives. Annu. Rev. Entomol., v. 48, p. 73-88, Jan. 2003.
RIBEIRO, J. M. C.; GARCIA, E. S. The role of salivary glands in feeding in Rhodnius
prolixus. J. Exp. Biol., v. 94, p. 219-30, 1981.
RIBEIRO, J. M. C.; GARCIA, E. S. The salivary and crop apyrase activity of Rhodnius
prolixus. J. Insect Physiol., v. 26, n. 5, p. 303-07. 1980.
RIBEIRO, J. M. C.; NUSSENZVEIG, R. H. Nitric oxide synthase activity from a
hematophagous insect salivary gland. FEBS Lett., v. 330, n. 2, p. 165-68, Set. 1993.
RIBEIRO, J. M. C.; SARKIS, J. J. F. Anti-thromboxane activity in Rhodnius prolixus salivary
secretion. J. Insect Physiol., v. 28, n. 8, p. 655-60. 1982.
RIBEIRO, J. M. C.; WALKER, F. A. High affinity histamine-binding and antihistaminic
activity of the salivary nitric oxide-carrying heme protein (nitrophorin) of Rhodnius prolixus.
J. Exp. Med., v. 180, n. 6, p. 2251-57, Dez.1994.
RIBEIRO, J. M. C., MARINOTTI, O.; GONZÁLES, R. A salivary vasodilator in the blood-
sucking bug, Rhodnius prolixus. Br. J. Pharmacol., v. 101, n. 4, p. 932-36, Dez. 1990.
RIBEIRO, J. M. C.; SCHNEIDER, M.; GUIMARÃES, J. A. Purification and characterization
of prolixin S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking Rhodnius
prolixus. Biochem J., v. 308, n. 1, p. 243-49, Maio. 1995.
Referências Bibliográficas
93
RIBEIRO, J. M. C.; HAZZARD, J. M. H.; NUSSENZVEIG, R. H.; CHAMPAGNE, D. E.;
WALKER, F. A. Reversible binding of nitric oxide by a salivary heme protein from a
bloodsucking insect. Science, v. 260, n. 5107, p. 539-41, Abr. 1993.
RIBEIRO, J. R. I. Família Belostomatidae Leach, 1815 (Insecta: Hemiptera: Heteroptera):
Chave e catálogo de identificação para as espécies ocorrentes no estado do Rio de Janeiro,
Brasil. Arq. Mus. Nac., Rio de Janeiro, v. 63, n.2, p.247-262, Abr-Jun. 2005.
RUAS-NETO, A. L.; CORSEUIL, E.; CAVALLERI, A. Development of rupestrian
triatomines (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) following hemolymphagy on blaberids
(Blattodea: Blaberidae) in Rio Grande do Sul State, Brazil. Entomol. Vect., v. 8, n. 2, p. 205-
16, Abr-Jun, 2001.
RYCKMAN, R. E. Recent observations of cannibalism in Triatoma (Hemiptera:Reduviidae).
J. Parasitol., v. 37, n.5:1, p. 433-34, Out. 1951.
SANDOVAL, C. M.; JOYA, M. I.; GUTIEREZ, R.; ÂNGULO, V. M. Cleptohaematophagy
of the Triatomine bug Belminus herreri. Med. Vet. Entomol., v.14, n. 1, p. 100-1, Mar. 2000.
SANDOVAL, C. M.; DUARTE, R.; GUTIERREZ, R.; ROCHA, DA S.; ÂNGULO, V. M.,
ESTEBAN, L.; REYES, M.; JURBERG, J.; GALVAO, C. Feeding sources and natural
infection of Belminus herreri (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) from dwellings in Cesar,
Colombia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 99, n. 2, p. 137-40, Mar. 2004.
SARKIS, J. J. F.; GUIMARÃES, J. A.; RIBEIRO, J. M. C. Salivary apyrase of Rhodnius
prolixus. Kinetics and purification, Biochem. J., v. 233, n. 3, p. 885-91, Fev. 1986.
SCHAEFER, C. W. Triatominae (Hemiptera: Reduviidae): Systematic questions and some
others. Neotrop. Entomol., v. 32, n. 1, p. 1-10, Jan-Mar. 2003.
SCHOFIELD C. J. Density regulation of domestic populations of Triatoma infestans in
Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., v. 74, n. 6, p. 761-9, 1980.
SCHOFIELD C. J. Biosystematics of the Triatominae. In: M. W. Service; Systematics
Association. Biosystematics of Haematophagous Insects, v. 37, Oxford: Claredon Press,
1988. Cap. 18, p. 285-312.
SCHOFIELD C. J. Triatominae, biología y control. 1. ed. West Sussex: Eurocommunica
Publications, 1994. 76p.
Referências Bibliográficas
94
SCHOFIELD C. J. Proceedings of the International Workshop on Population Genetics and
Control of Triatominae, Santo Domingo de los Colorados, Ecuador. UNDRE, México City, p.
45-50, Set. 1995.
SCHOFIELD, C. J.; WILLIAMS N. G.; MARSHALL. T. F. .Density-dependent perception
of triatomine bug bites. Ann. Trop. Med. Parasitol.. v. 80, n. 3, 351-58, Jun. 1986.
SEVERIN, H. H. P.; SEVERIN, H. C. Habitis of Belostoma (=Zaitha) flumineum, Say and
Nepa apiculata Uhler, whit observations on other closely related aquatic hemiptera. J. N. Y.
Ent. Soc., v. 19, p. 99-108, 1911.
SMITH, J. J. Effect of diet viscosity on the operation of the pharyngeal pump in the blood-
feeding bug Rhodnius prolixus. J. Exp. Biol., v. 82, p. 93-104, Out. 1979.
SOARES, A. C.; CARVALHO-TAVARES, J.; GONTIJO, N. F.; DOS SANTOS, V. C.;
TEIXEIRA, M. M.; PEREIRA, M. H. Salivation pattern of Rhodnius prolixus (Reduviidae;
Triatominae) in mouse skin. J. Insect Physiol., v. 52, n. 5, p. 468-72, Maio. 2006.
SOUZA, R. C. M; ALVES, C. L.; DIOTAIUTI, L.; PEREIRA, M. H. Ação da saliva de
Triatoma vitticeps (Reduviidae; Triatominae) sobre o nervo ciático de rato. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA, 18, 2003, Rio de Janeiro. Livro de resumos dos
trabalhos do Congresso Brasileiro de Parasitologia. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira
de Parasitologia, 2003. p. 106.
SWART, C. C.; DEATON, L. E.; FELGENHAUER, B. E. The salivary gland and salivary
enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comp. Biochem. Physiol. A.
Mol. Integr Physiol., v. 145, n. 1, p. 114-22, Set. 2006
TORRE BUENO, J. R. De la Life-histories of North-American water-bugs. Canad. Ent., v.
38, p. 189-97, 1906.
WAXMAN, S. G. A channel sets the gain on pain. Nature, v. 444, n. 7121, p. 831-2, Dez.
2006.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
