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Agueda Aparecida Lima da Silva
ESTUDO CLÍNICO-LABORATORIAL DAS
ARTICULAÇÕES DE CÃES NATURALMENTE
INFECTADOS COM LEISHMANIOSE VISCERAL E
EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM Leishmania
chagasi POR VIA INTRA-ARTICULAR
Araçatuba
2007
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Agueda aparecida lima da silva
Estudo clínico-laboratorial das articulações de cães
naturalmente infectados com leishmaniose visceral e
experimentalmente inoculados com leishmania chagasi por via
intra-articular
Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista
“Julio de Mesquita Filho” – Faculdade de Odontologia –
Curso de Medicina Veterinária para obtenção do título de
Mestre em Ciência Animal (Fisiopatologia Clínica e
Cirúrgica)
Orientador: Prof. Ass. Dra. Flávia de Resende Eugênio
Araçatuba
2007
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1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose é uma antropozoonose causada por um protozoário do gênero
Leishmania, que se divide em dois grupos capazes de produzir manifestações cutâneas,
mucocutâneas e viscerais (FEITOSA et al., 2000). Atualmente, são consideradas como
doenças re-emergentes, ressurgindo com grande impacto e, muitas vezes, com perfis de
morbi-motalidade diferentes daqueles já conhecidos (BEVILACQUA et al., 2001), o que as
incluem entre as seis mais importantes endemias do mundo ( FEITOSA et al., 2000).
No Brasil, somente no século XX a enfermidade foi identificada (CAMARGO et al.,
2003). No Estado de São Paulo, a doença foi relatada em 1998, na cidade de Araçatuba
(BEVILACQUA, 2004), quando foram registrados os primeiros casos autóctones de
leishmaniose visceral canina, evidenciando o surgimento de novos focos, com casos
clínicos provenientes de municípios da região.
É uma doença de caráter infeccioso, de evolução aguda ou crônica, sendo a
Leishmania chagasi responsável pela enfermidade no Brasil (CORREIA; CORREIA,
1992).
Os vetores implicados na transmissão são denominados flebotomíneos do gênero
Lutzomyia, dentre os quais a Lutzomyia longipalpis, inseto hematófago que tem por seu
habitat o domícilio e peri-domicílio humanos (CORREIA; CORREIA, 1992).
Os reservatórios mais importantes na área urbana são o cão (Canis familiaris –
Lineus, 1758), a raposa e o homem, em casos de epidemias (CORREIA; CORREIA ,
1992; FONSECA; SANTUCCI, 2001).
Na patogênese da doença, o protozoário, uma vez inoculado na pele, parasita os
fagócitos mononucleares do baço, fígado, nódulos linfáticos, medula óssea e,
eventualmente, de outros órgãos (CAMARGO; BARCINSKI, 2003).
No cão, a leishmaniose pode ser classificada como assintomática, oligossintomática
e sintomática segundo Genaro (1993); Feitosa et al., (2000), cujas manifestações mais
freqüentes são onicogrifose, alterações urinárias, hepáticas, dermatológica, gastrintestinais,
neurológicas, pulmonares, coagulopatias, perda de peso, anorexia e distúrbios locomotores
(CORREIA; CORREIA, 1992; FEITOSA et al., 2000; NOLI, 1999).
Em muitos animais, verifica-se atrofia muscular, diminuição da atividade física,
associada a distúrbios de locomoção (FEITOSA et al., 2000; LONGSTAFFE et al., 1983).
Em 1997, Buracco et al., observaram Leishmania donovani no líquido sinovial de
um cão acometido por leishmaniose visceral. Mais recentemente, foi descrita a presença de
Leishmania sp. no líquido sinovial de cães com distúrbios locomotores, no município de
Araçatuba, São Paulo (BEVILACQUA et al., 2002).
A incidência de problemas locomotores pode chegar a 30%, sendo a claudicação e
dor na parte distal dos membros as principais queixas (BURACCO et al., 1997; FEITOSA
et al., 2000; NOLLI, 1999; WOLSCHRIJN et al., 1996). Estes problemas podem advir de
poliartrites, sinovites, polimiosite, osteoartrite, periostite proliferativa, lesões osteolíticas,
úlceras interdigitais, lesões de coxim plantar e neuralgia (BEVILACQUA et al., 2002;
FEITOSA et al., 2000; MCCONKEY, et al., 2002; NOLLI, 1999). Nas avaliações
radiográficas das alterações locomotoras, foram observadas imagens compatíveis com
osteoartrite erosiva, às vezes, acompanhada por destruição completa das articulações
(BLAVIER, et al., 2001; BURACCO et al., 1997; WOLSCHRIJN et al., 1996).
As artrites podem estar associadas a depósito de imunocomplexos ou à presença do
parasita no interior das articulações, confirmando a identificação de formas amastigotas de
Leishmania sp. no líquido sinovial de cães (AGUT et al., 2003; FEITOSA et al., 2000;
NOLLI, 1999). Embora estes mesmos autores tenham se baseado em relatos de casos, não
há estudos sobre a evolução das artrites no curso da leishmaniose visceral canina, mesmo
havendo vasta literatura sobre o quadro clínico da enfermidade, poucos autores, até o
momento, descreveram, de forma mais detalhada, como ocorrem as alterações articulares
relacionadas à presença do parasita intra-articular, bem como as lesões morfológicas locais
conseqüentes a esta enfermidade.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico da enfermidade
Em 1900, Leishman e Donovan (1903) citado por Correia; Correia, (1992) relataram
que a doença conhecida como Kala-azar que ocorria na Índia era causada por um
protozoário, e Ross, (1903), em homenagem aos dois pesquisadores, denominou como
Leishmania donovani.
Na bacia do Mediterrâneo verificou-se uma enfermidade similar ao kalasar e, em
1980, foi relatado por Nicolle e Compte, que a doença afetava cães na Tunísia, seguida de
vários relatos na Espanha, Itália, Sicília, Grécia, Malta, França, Argélia e em outros países
da região, além de Índia e China (CORREIA; CORREIA, 1992; NOLI, 1999).
Paralelamente, descrevia-se outra enfermidade que causava doença cutânea, com
aspecto nódulo-ulceroso que foi denominada “botão do oriente”, “ferida de Delli” e
leishmaniose cutânea.
Sob as formas visceral ou cutânea, as leishmanioses apresentavam diferentes padrões,
porém, em alguns locais como Nigéria, Quênia e Índia, os cães não eram afetados, tendo
como reservatórios roedores silvestres. Já no mediterrâneo e na China, os cães eram
reservatórios e eram sintomáticos. Frente a essas diferenças, propôs-se a existência de duas
espécies do agente: L. donovani e L. tropica.
Em 1911, o pesquisador Gaspar Vianna citado por Correia; Correia (1992), descobriu
a espécie L. braziliensis, responsável pela leishmaniose muco-cutânea que afetava o
homem e, eventualmente, era vista em cães e gatos, fato confirmado em 1912 e 1913 por
Pedroso que descreveu dois casos caninos com lesões nas narinas, nos municípios de
Itapura e Velha, SP.
A leishmaniose visceral humana no Brasil data-se de 1913 quando Migone,
(Paraguai), descreveu o primeiro caso em necropsia, oriundo do estado do Mato Grosso
(FEITOSA; SANTUCCI, 2000; FONSECA et al., 2001).
Em 1936, Evandro Chagas citado por Feitosa et al. (2000), aponta o vetor P.
longipalpis, hoje denominado Lutzomyia longipalpis, responsável pela disseminação da
leishmaniose visceral e, em 1937, Castro e Ferreira identificaram o cão como reservatório
da mesma (FEITOSA et al., 2000).
O primeiro caso de leishmaniose em cães no município de Araçatuba, estado de São
Paulo foi relatado em 1998, (FEITOSA, 2000; FONSECA; SANTUCCI, 2001).
2.2 Aspectos Epidemiológicos e ciclo biológico
O complexo Leishmania donovani compreende a Leishmania (Leishmania) donovani,
Leishmania (Leishmania) infantun e a Leishmania (Leishmania) chagasi (FEITOSA et al.,
2000; SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997). São protozoários pertencentes à ordem
Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae, que requerem hospedeiros diferentes para
completar seu ciclo de vida, sendo um vertebrado que abriga a forma amastigota, e um
invertebrado com a forma promastigota (NOLI, 1999; SLAPPENDEL; FERRER, 1990).
Dos vertebrados, o cão assume maior importância como reservatório doméstico,
sendo que felinos, roedores e o homem também participam deste ciclo (FEITOSA et al.,
2000; NOLI, 1999; SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997).
O vetor invertebrado é um inseto hematófago, flebotomíneo, denominado Lutzomia
longipalpis, conhecido popularmente como “mosquito palha”, “birigüi” ou “tatuquiras”.
Possui pequeno tamanho, cor palha, grandes asas pilosas dirigidas para trás e para cima,
com 2 a 3 mm de tamanho, de hábito alimentar noturno (ALENCAR et al., 1991;
FEITOSA et al., 2000; FONSECA; SANTUCCI, 2001).
O ciclo biológico da Leishmania tem início quando o flebotomíneo infectante com a
forma promastigota realiza seu repasto sangüíneo liberando-as na epiderme. Estas formas
infectantes são fagocitadas por células do sistema mononuclear fagocitário. Uma vez dentro
de macrófagos, elas se diferenciam em amastigotas, geralmente ovais ou redondas variando
de 2 a 5 µm com um cinetoplasto, multiplicando-se de forma binária com ruptura do
macrófago. Os macrófagos, por sua vez, rompem-se, liberando novas formas amastigotas
para reiniciarem o mesmo ciclo ou serem ingeridas por vetores em seu repasto sangüíneo.
Uma vez dentro do vetor, sofrem divisão binária e se diferenciam em promastigotas
flageladas que também sofrem divisão binária, multiplicação e se transformam em
paramastigotas, colonizando o esôfago e faringe do vetor, sofrendo nova diferenciação para
forma promastigota metacíclica infectante (CASTRO, 1996; CORREIA; CORREIA, 1992;
FEITOSA et al., 2000; NOLI, 1999).
2.3 Patogenia
O cão é considerado o principal reservatório fora do ambiente silvestre, pelo
fato de apresentar maior número de parasitas na pele, e os casos caninos da leishmaniose
visceral antecedem os casos humanos (FEITOSA, et al., 2000; FONSECA; SANTUCCI.,
2001; SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997).
Uma vez infectadas, as células do sistema mononuclear fagocitário do cão atuam
como células apresentadoras de antígenos, estimulando os linfócitos (CD4+) T auxiliares
do tipo T1 (Ta1) ou T auxiliares do tipo2 (Ta2). Se forem ativadas as células Ta1, estas
produzem citocinas (Interferon gama – fator de necrose tumoral) e a (Interleucina 2 –
ativam macrófagos). Estes, por sua vez, estimulam a imunidade celular e, desta forma,
podem eliminar a infecção. Quando a infecção induz os linfócitos T auxiliares do tipo 2
(Ta2), ocorre a proliferação de células B e a produção de anticorpos, com resultado
deletério e não protetor, desenvolvendo-se a infecção (FEITOSA et al., 2000; LOPEZ et al.,
1996; NOLI, 1999; SLAPPENDEL; FERRER, 1990).
Com a regulação dos linfócitos T prejudicada e a grande atividade de linfócitos B, há
a geração de inúmeros imunocomplexos circulantes que se depositam nas paredes de vasos
sangüíneos, podendo causar vasculite, uveíte, poliartrite e glomerulonefrite (LOPEZ et al.,
1996; NOLI, 1999; SLAPPENDEL; FERRER, 1990).
Vários órgãos podem ser afetados e o parasita pode ser encontrado em quase todos os
tecidos e líquidos corpóreos. Por esta razão, a leishmaniose pode adquirir características
clínicas diferentes.
O período de incubação compreende de um mês a sete anos e neste intervalo de tempo
o parasita se dissemina amplamente, com predileção pela medula óssea, gânglios linfáticos,
pele, baço e fígado.
Os sinais clínicos mais comuns são: diminuição da atividade física, onicogrifose,
enfermidades da pele e perda de peso (NOLLI, 1999).
As principais alterações dermatológicas são queda de pêlos, lesões ulcerativas,
geralmente presentes em saliências ósseas, plano nasal e espaços interdigitais, além de
prurido, dermatite seborréica, infecções secundárias bacterianas, fúngicas, e outras
enfermidades associadas, como: linfossarcoma de Sticker, demodiciose, malassezíase e
escabioses (NOLI, 1999; FEITOSA e cols., 2000).
Alterações urinárias são comuns e se caracterizam por poliúria, polidipsia,
proteinúria, hematúria, geralmente provenientes de glomerulonefrite proliferativa, nefrite
intersticial, por deposição de imunocomplexos circulantes; podendo culminar em
insuficiência renal (FEITOSA et al., 2000; NOLLI, 1999).
As leishmanias também se multiplicam nos macrófagos do fígado, causando hepatite
crônica ativa, vômitos, ascite e icterícia. As alterações do sistema gastrintestinal geralmente
estão correlacionadas aos problemas hepáticos e renais, apresentando colites ulcerativas
crônicas, com diarréia e melena. Podem também ocorrer enterites agudas fatais, como
resultado de danos parasitários diretos.
Os cães podem apresentar distúrbios de coagulação como tempo de sangramento
prolongado, diátese hemorrágica, presença de petéquias, hematúria, epistaxe,
hiperglobulinemia, interferindo na polimerização da fibrina, uremia, inibindo a função
plaquetária, seqüestro esplênico de plaquetas, trombocitopenia por aplasia ou hipoplasia
medular. O quadro pode se agravar com infecções associadas à erlichiose, babesiose e
dirofilariose, em regiões endêmicas.
O sistema respiratório pode ser afetado, com ocorrências de epistaxe, geralmente
unilateral; que se acredita ocorrer como resultado de lesões ulcerativas da mucosa nasal ou
por alterações de coagulação. Alguns animais desenvolvem pneumonia intersticial
(FEITOSA et al., 2000; NOLI, 1999).
Em alguns cães ocorre blefarite, ceratoconjuntivite, uveíte bilateral, edema de córnea
e sinéquia, por deposição de imunocomplexos ou pela presença da própria leishmania.
Das alterações neurológicas observadas com maior freqüência, destacam-se paresia de
membros, ataxia, andar em círculos, tremores e convulsões. (FEITOSA et al., 2000).
Atrofia muscular é verificada, inicialmente, nas fossas temporais seguida de perda
generalizada da massa muscular. Como conseqüência, ocorre diminuição da atividade
física, associada a distúrbios locomotores. Esta debilidade muscular e a diminuição da
atividade física podem decorrer da anemia, atrofia muscular, da poliartropatia e
insuficiência renal crônica (FEITOSA et al., 2000; NOLLI, 1999).
Problemas locomotores são decorrentes de poliartrites, sinovites, polimiosite,
osteoartrite, periostite proliferativa, lesões osteolíticas, úlceras interdigitais, lesões de
coxim plantar e neuralgia (BEVILACQUA et al., 2002; FEITOSA et al., 2000; NOLLI,
1999).
2.4 Enfermidade articular inflamatória e infecciosa
A doença articular inflamatória caracteriza-se pelo aumento da quantidade de
neutrófilo no líqüido sinovial (LS). A contagem absoluta de neutrófilo segmentado
evidencia, tipicamente, aumento moderado a intenso, e a causa pode envolver agentes
infecciosos e não-infecciosos (FISHER, 2003).
Algumas doenças articulares são causadas por bactérias, fungos, micoplasma,
espiroquetas (Borrelia burgdorferi), protozoários (Leishmania donovani), vírus (calicivírus,
coronavirus) e bactérias (Ehrlichia canis, anapalsma fagocitun, Ehrlichia equi, Ehrlichia
ewingii) e riquéticias (Rickettsia rickettsii). Os microrganismos podem alcançar as
articulações por via hematógena ou pela inoculação direta (DANLER, 2001; FISHER,
2003; NELSON; COUTO, 1994).
Em 2002, Mcconkey relatou um caso em que um cão apresentava claudicação e dor
nas articulações com evolução de dois anos, diagnosticado como poliartrite erosiva,
subluxação e colapso dos espaços articulares dos carpos, afetando também a articulação do
cotovelo, apresentando moderado aumento de celularidade no LS que consistiam de 23%
de neutrófilos, 16% células mononucleares, e 61% pequenos linfócitos. Muitos macrófagos
e neutrófilos continham numerosos microrganismos, com cinetoplasto, compatíveis com
Leishmania sp.
Nas artrites sépticas, o pH pode se apresentar abaixo do valor normal (SAWYER,
1963), o número de leucócitos aumenta acentuadamente, o coágulo da mucina é ruim e há
aumento na concentração de proteína total (BIASE et al., 2001; FERNANDEZ et al., 1983;
VAN PELT, 1974).
O LS é um dialisado do plasma sangüíneo e contém proteínas, às quais o ácido
hialurônico (AH) se adere, secretado pelas células sinoviais quando o plasma se difunde
pelas paredes dos capilares (VAN PELT, 1962 e 1967). Além da secreção de AH, o LS é
acrescido de glicoproteínas e outras macromoléculas (MAHAFFEY, 1992 e 2002). É um
fluido viscoso, amarelo claro, límpido, livre de partículas e que não coagula (BARNABÉ,
2001 e 2004; BIASE et al., 2001; FERNANDES et al., 1983; VAN PELT, 1967 e 1974)
desprovido de fibrinogênio e outros fatores de coagulação, com pH entre 7 e 7,8
(SAWYER, 1963), e concentração de proteína de 2 a 2,5g/dl (PERMAN, 1980).
A primeira barreira seletiva que o plasma deve ultrapassar é formada pelos capilares
próximos à superfície da camada sinovial interna, em contato direto com a substância basal
entre os sinoviócitos e poros endoteliais. O tecido conjuntivo da substância basal,
juntamente com a camada de AH-proteína secretada pelos sinoviócitos formam a
“membrana” pela qual o plasma é dialisado (BARNABÉ et al., 2004).
Pequenas moléculas, glicose e eletrólitos encontram-se em concentrações similares no
LS, entretanto, em condições normais, as proteínas plasmáticas devem cruzar a “barreira
sangue-sinóvia”, fazendo-o de forma limitada (MAHAFFEY, 1992 e 2002). Essa
permeabilidade seletiva é mantida pelos estreitos espaços entre os sinoviócitos e pela
composição da matriz extracelular, bem como pelo AH (TODHUNTER, 1996).
O AH origina-se da membrana sinovial, sendo considerado o composto de maior
importância do LS, conferindo-lhe várias propriedades exclusivas, como a alta viscosidade
e capacidade de lubrificação e influência a composição do mesmo.
O LS pode ser considerado um fluido tecidual especializado que reflete alterações no
tecido sinovial, isto é, líquido e membrana sinoviais (BARNABÉ et al., 2004;
McILWRAITH, 1980 e 1987; VAN PELT, 1962;) e no metabolismo intra-articular (VAN
PELT, 1962, 1974).
Segundo Barnabé, (2004), para que tais mudanças ocorram são necessárias duas
alterações fundamentais, uma anormalidade na troca de várias substâncias através da
barreira sangue-líquido sinovial e um distúrbio no metabolismo intra-articular. O grau de
permeabilidade desta barreira varia com a severidade e tipo de inflamação (VAN PELT,
1967).
A quantidade de células nucleadas encontrada no LS normal de cães, pode variar de
250 a 3000, com 94% a 100% de células mononucleares e 0 a 6% de neutrófilos (BIASE et
al., 2001; BRINKER et al., 1986).
3 OBJETIVOS
Considerando o crescente número de casos de leishmaniose visceral com
comprometimento articular, despertou-se a necessidade de estudar a artrite experimental
em cães positivos.
Desta forma este trabalho teve por objetivos: descrever as alterações articulares da
leishmaniose experimental através de
a) Avaliações clínica e radiográfica;
b) Análises citológica, parasitológica e físico-química do líquido sinovial, das
articulações inoculadas e controles.
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais
Foram utilizados 20 cães adultos, de raças variadas, sendo dez machos e dez
fêmeas, de um a quatro anos de idade, pesando entre 10 e 35 kg, respectivamente. Todos os
animais, oriundos do Centro de Controle de Zoonoses da cidade de Andradina-SP, eram
sorologicamente positivos para leishmaniose visceral pelos testes de Imunofluorecência
Indireta e ELISA.
O critério de escolha dos animais para inclusão no procedimento experimental
constou de exame físico completo e radiográfico, que definiu ausência de lesões articulares.
Antes do período experimental os animais foram vermifugados com Endal plus®
1
(5 mg/kg/dose única) e receberam tratamento com Doxiciclina®
2
(5 mg/kg/12h por 21
dias), para eliminar a possibilidade de ocorrência de erlichiose.
Durante o experimento, os animais utilizaram coleira inseticida Scalibur ®
3
e foram
alojados em canis telados, recebendo água e ração comercial ”ad libidum”.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal
(CEEA) da Faculdade de Medicina \veterinária Veterinária de Araçatuba (SP) da UNESP –
Campos Araçatuba.
4.2 Inoculação intra-articular de Leishmania chagasi e momentos das avaliações
O período experimental constou de três momentos, a saber:
-Momento 0 (zero): os animais foram submetidos a exames radiográficos das articulações
fêmoro-tibial (FT) e escapuloumeral (EU) direita e esquerda em duas projeções, médio-
lateral e antero-posterior para exclusão de outras doenças articulares degenerativas e
posterior comparação.
-----------------------------------------------
1
Praziquantel, 50mg, palmoato de pirantel 144 mg, febantel 150mg, laboratório Schering-Plough S.A.
2
Doxiciclina 100 mg, laboratório Pfizer
3
deltrametrina -,laboratório Intervet
-Momento 1: Colheita de uma amostra do líquido sinovial 500 µl, com agulha 40x10 ou
40x12, em todos os animais, para realização dos exames laboratoriais. Após anestesia geral,
por meio de tricotomia e anti-sepsia com iodo povidine sobre a pele, foi realizada a
artrocentese das articulações fêmoro-tibial e escapuloumeral, de forma bilateral, em
seguida, inoculações intra-articulares com 1x10
6
(CERQUEIRA et al., 2003. LIMA et al.
2003) de formas amastigotas de Leishmania chagasi
1
diluídas em 500 µl de solução salina
nas articulações escápuloumeral esquerda e fêmoro-tibial direita. Como controle nas
articulações EU direita e FT esquerda, foi inoculado 500 µl de solução isotônica salina.
A escolha dos membros inoculados em diagonal foi proposital para diminuir uma
possível exacerbação da claudicação ipsilateral, o que dificultaria a avaliação clinica desse
sintoma.
- Momento 2: trinta dias após M1, foram realizados exames radiográficos das quatro
articulações em todos os animais, e colheita do líquido sinovial para realização de exame
citopatológico e posterior eutanásia por anestesia geral intravenosa com barbitúrico e
administração de cloreto de potássio.
Propositalmente, não foi utilizado um grupo controle compreendendo animais
sadios inoculados por Leishmania chagasi, uma vez que este procedimento não é permitido
pelos órgãos de Saúde pública, OMS e pela comissão de ética local.
4.3 Avaliação clínica das articulações
Um protocolo de avaliação do sistema locomotor foi elaborado contendo
informações da avaliação diária de cada animal durante o período experimental.
-------------------------------------------
1
cepa MHOM/BR00/MERO 02 - FIOCRUZ-Bahia
Os parâmetros avaliados diariamente foram: temperatura corporal (
o
C), temperatura local
articular (diminuída, normal e aumentada), através de mensuração com a região dorsal da
mão do examinador sobre a área; dor, aumento de volume articular, crepitação articular,
restrição ou exacerbação de movimentos, assimetria, atrofia muscular, claudicação,
impotência funcional.
4.4 Avaliação Radiográfica
Os exames radiográficos
1
(Filmes 24 x 30 cm e 30 x 40 cm) foram realizados no
momento 0 (zero) e no momento 2 (após 30 dias), totalizando oito projeções por animal
(ântero-posterior e médio-lateral), com objetivo de verificar, por método comparativo,
imagens radiográficas compatíveis com: efusão articular, irregularidade nas superfícies
articulares, esclerose óssea e osteófitos .
4.5 Análise do líquido sinovial (LS)
A avaliação do LS foi realizada nos momentos M1 e M2, e constataram de:
4.5.1 Exames físico e químico
À inspeção de tubos de ensaio foram avaliados cor e aspecto. Utilizando-se fitas
reagentes
2
, foram avaliados: pH, proteínas, leucócitos (negativo, traços, baixo, moderado e
alto), sangue (negativo, hemolisado e não hemolisado). E a densidade, por refratometria.
----------------------------------------
1
Fotobras Fotossensíveis do Brasil Ind. Com. Ltda.
2
Combur 10 teste UX Roche Diagnostic Gmbh e Uridiag Baydiag Ltda
4.5.2 Viscosidade
A determinação da viscosidade foi realizada no momento da transferência do LS da
seringa de colheita para lâmina de vidro, estimando-se o comprimento, em centímetros, do
filamento formado pela gota antes do seu desprendimento da extremidade da seringa.
Considerou-se ausente: sem formação de filamento; diminuída: comprimento do filamento
inferior a 5 cm, normal: ultrapassar a 5 cm (BARNABÉ et al., 2005).
4.5.3 Teste de Qualidade de precipitação da mucina (TQPM)
Foi realizado o teste de coágulo de mucina segundo Fisher (2003) no M2, devido à
colheita do LS ser superior a 1ml. O procedimento constou da adição de uma ou duas gotas
de líquido sinovial em 8 gotas de ácido acético 2%
1
. Este teste baseia-se na precipitação do
sal protéico do ácido hialurônico após a acidificação do líquido sinovial, formando um
coágulo que reflete o grau de polimerização do ácido hialurônico (ALTMAN e GRAY,
1984). Segundo Parry (1996) e Barnabé et al., (2005), pode ser graduado em: bom
(formação de coágulo compacto e grande em solução límpida), regular (formação de
coágulo amolecido em solução discretamente turva), ruim (coágulo friável em solução
turva) ou péssimo (não formação de coágulo, mas alguns flocos em solução turva).
4.5.4 Análise citológica
O exame da citologia realizado no M2 compreendeu a contagem diferencial e
morfológica das células do líquido sinovial, bem como a pesquisa direta das formas
amastigotas do parasito.
Para a contagem das células nucleadas foram utilizados um ou mais esfregaços do
LS em cada momento, para todas as articulações, corado com corante panótico rápido
2
.
-----------------------------------------
1
Labsynth Produtos para Laboratórios Ltda
2
Instant-Prov - Newprov produtos para laboratório
O exame citológico constou da contagem de 100 células nucleadas em cada
esfregaço, utilizando microscópio de luz com objetiva de imersão (100X). Utilizou-se um
trajeto em forma de “zigue-zague” na lâmina, de uma extremidade lateral à outra,
registrando-se as células nucleadas em seu trajeto.
As células nucleadas foram classificadas como neutrófilos, linfócitos, e
mononucleares fagocitários e os resultados foram expressos em percentuais.
4.5.5 Análise parasitológica
A pesquisa foi realizada nos momentos M1 e M2, observando, no LS, a presença
de parasitas fora e dentro de células mono e polimorfonucleares, avaliando-se a contagem de
100 células.
4.6 Análise Estatística
A análise estatística constituiu-se de:
1) Teste de McNemar: para comparar a proporção de alterações clínicas nas diferentes
articulações.
2) Teste de Wilcoxon: para comparar a temperatura local das articulações
escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), as variáveis físico-quimicas do grupo
inoculado nos M! e M2 para cada uma das articulações e a precipitação da mucina
(TQPM) dos gruposcontrole e inoculado para cada uma das articulações.
3) Coeficiente de correlação de Spearman: para comparar as variáveis viscosidade e
TQPM para cada articulação e grupo.
As estatísticas foram consideradas significantes quando p < 0,05. A análise
estatística foi efetuada empregando-se o programa SAS (Statistical Analysis System) (ZAR,
1998).
5 RESULTADO
Dentre os 20 animais selecionados, quatro morreram devido ao rápido avanço da
doença que ocorreu principalmente após a inoculação intra-articular, com piora dos
sintomas digestórios e urinários. Um animal apresentou contaminação bacteriana no líquido
sinovial e em outro, foi identificado mórula de Ehrlichia sp. no interior de macrófago,
sendo excluídos do experimento.
5.1 Avaliação clínica das articulações inoculadas
Nos 14 animais avaliados foi identificado dor articular, claudicação, restrições de
movimentos e atrofia muscular, nas articulações avaliadas não foram observadas alterações
de volume articular, crepitação articular, exacerbação de movimentos, assimetria ou
impotência funcional parcial ou total do membro durante o período de 30 dias.
Os resultados obtidos no exame clínico das articulações EU e FT inoculadas entre o
M1 e M2. estão contidos na TABELA 1.
Com referência à variável restrição de movimento, pode-se observar que esta ocorreu
na articulação EU em 50% dos animais e em 71,4% na articulação FT, não apresentando
diferença significante entre as articulações inoculadas.
Atrofia muscular do membro, cuja articulação recebeu inoculo, persistiu durante todo
o período experimental sendo que 71,4% dos animais a apresentaram no membro torácico
esquerdo e 78,6% no membro pélvico direito, não ocorrendo diferença significante entre as
articulações inoculadas. Na maioria dos casos a atrofia muscular ocorreu de forma
generalizada, co discreta diferença entre as articulações contreles e inoculadas.
Todos os animais apresentaram claudicação e relutância em andar, observando-se
uma diferença significante (p=0,0040) entre as articulações EU e FT inoculadas, ainda
37,5% manifestaram na articulação EU e 100,0% na articulação FT, durante todo período
experimental. Os 14 animais apresentaram dor local, observada após a inoculação, bem
como no decorrer do período experimental, não diferindo significantemente (p=0,2500)
quanto às articulações EU e FT inoculadas onde esse sintoma clínico foi evidente, 75,0%
apresentaram na articulação EU e 100,0% na articulação FP .
Todos os sinais clínicos avaliados foi mais evidente na articulação FT.
Tabela 1 - Restrição de movimento, atrofia muscular, claudicação e dor, observados nas
articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT) nos 14 cães naturalmente
infectados por Leishmania sp. e experimentalmente inoculados intra-articular
por Leishmania chagasi (Araçatuba – SP, 2006).
Sinais clínicos
Articulação EU Articulação FT
P
(1)
n % n %
Restrição de movimentos 7 50,0 10 71,4 0,2500
Atrofia muscular 10 71,4 11 78,6 1,0000
Claudicação 5 35,7 14 100,0 0,0040
Dor 11 78,6 14 100,0 0,2500
(1)
teste de McNemar
Em relação à temperatura local, as articulações controle não apresentaram alterações.
Nas articulações inoculadas, houve um aumento inicial que foi atribuído à inflamação pós-
inoculação que manteve-se dentro dos padrões de normalidade após o 7º dia. Este
parâmetro não apresentou diferença estatística significante entre as articulações estudadas
em todos os momentos avaliados.
A temperatura corporal avaliada ao longo de trinta dias, oscilou entre 37ºC a 40,7 ºC,
com uma média de 38,8 ºC.
5.2 Avaliação Radiográfica
Não foram encontradas quaisquer alterações ósseas e articulares nos 14 animais em
nenhum dos momentos avaliados conforme pode-se na FIGURA 1.
Figura 1 – Imagens radiográficas
das articulações EU esquerda e FT direita
de cães naturalmente
infectados por leishmaniose visceral e experimentalmente inoculados com formas amastigotas de
Leishmania chagasi. A: articulação EU esquerda no M0; B: articulação EU esquerda no M2; C:
articulação FT direita no M0 e D: articulação FT direita no M2. Superfícies articulares normais,
sem áreas de proliferação ou lise.
A
B
C
D
5.3 Análise do líquido sinovial (LS)
5.3.1 Exames Físico e Químico
Obteve-se LS em 100% das punções realizadas e o volume obtido na articulação FT,
em M1, não ultrapassou 0,4 ml. No M2, variou de 1,2 ml a 1,5 ml na articulação FT e na
articulação EU de 1,0 ml a 2,0 ml. Das 56 punções realizadas, o LS apresentou-se com
aspecto amarelo palha, límpido e com ausência de partículas. Na punção, onze amostras
foram contaminadas com sangue, devido à ruptura de capilares subsinoviais.
As TABELAS 4 e 5 contemplam os resultados dos parâmetros avaliados (leucócitos,
proteína, pH e viscosidade) do liquido sinovial das articululações EU e FT nos momentos
M1 e M2.
No liquido sinovial das articulações EU e FT controles, não foi identificado à
presença de leucócitos no M1 em todos os animais. No M2, após a inoculação de solução
fisiológica, foi detectado através do método utilizado , a presença de leucócitos em
intencidade moderada em 57,1% e 71,4% para EU e FT, respectivamente.
Para articulações EU e FT a serem inoculadas , também não foram detectados leucócitos
em M1. No M2, 30 dias após o inoculo de (1x10
6
) promastigotas foi verificado aumento
moderado de leucócitos em 78,6% na EU e, em 85,7% na FT, respectivamente.
A concentração de proteína no LS na articulação EU controle no M1 foi variável, não
tendo sido detectada em 35,7,% dos animais. Apresentou nível de normalidade em 7,1% e
foi considerada moderada em 57,2%. No M2, observo-se valores normais em 35,7% e
64,3% moderada.
Na articulação EU a ser inoculada, M1, a concentração de proteína não foi detectada
em 28,6%, esteve normal em 14,3% e intensidade moderada em 57,1%. No M2, a proteína
apresentou-se com intensidade moderada em 92,9% e elevada em 7,1%.
Na articulação FT controle, no M1 a concentração de proteínas não foi detectada em
42,9% e de forma moderada em 57,1%. Em M2, esteve moderada em 85,7% e elevada em
14,3%.
Na articulação FT inoculada, no M1 não foi detectado presença de proteínas em
35,7%, ocorrendo de forma moderada em 64,3%. Em M2, 28,6% dos animais apresentaram
nível moderado da mesma e esteve elevada em 71,4%. Houve diferença estatistica
significante nas articulações EU e FT inoculadas no M2 (p<0,0010).
O pH do LS no grupo controle manteve-se alcalino na articulação EU e FT em todos
os momentos. Em três animais, observou-se pH ácido na articulação FT controle. O grupo
inoculado apresentou valores inferiores ao limite nas articulações EU e FT, de forma mais
acentuada em M2 indicando pH ácido. Esta alteração foi detectada nas articulações FT de
sete animais no M2.
Houve diferença estatisticamente significante (p=0,0266) entre as articulações EU e
FT inoculadas, em M2.
Tabela 2 - Valores bioquímicos de pH do líqüido sinovial (média e desvio-padrão) obtidos
das articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), dos grupos
inoculado e controle, em diferentes momentos (M1 e M2) nos 14 cães
naturalmente infectados por Leishmania sp. e experimentalmente inoculados
intra-articular por Leishmania chagasi (Araçatuba – SP, 2006)
Variável Grupo
Articulação EU Articulação FT
M1 M2 M1 M2
pH
Controle
8,21 ± 0,26 7,82 ± 0,32 8,14 ± 0,23 7,57 ± 0,78
Inoculado
8,21 ± 0,26 7,25 ± 0,80 8,18 ± 0,25 6,68 ± 1,19
Viscosidade
A viscosidade do LS da articulação EU controle apresentou-se dentro dos valores
normais em 100% dos casos no M1, enquanto no M2, diminuída em 57,1%. Na articulação
EU inoculada, este parâmetro esteve em 100% dos casos normais no M1, e diminuída em
100% dos casos no M2.
A articulação FT controle manteve um padrão idêntico à EU controle no M1 e
diminuída em 42,9% dos casos no M2. Na articulação FT inoculada, em 71,4% dos animais
a viscosidade esteve normal e diminuída em 28,6%, no M1. No M2, ausente em 35,7% e
diminuída em 64,3%.
Esta variável esteve diretamente correlacionada ao coágulo de mucina, apresentando
coeficientes de correlação de Spearman, a saber: articulações EU controle (r
S
= 0,603;
p=0,0224), FT controle (r
S
=0,835; p<0,0002), FT tratado (r
S
=0,913; p<0,0001).
Na articulação EU inoculada, não foi possível calcular o coeficiente de correlação, pois
todos os cães apresentaram viscosidade diminuída.
5.3.2 Precipitação da Mucina
Os resultados obtidos no Teste qualidade precipitação da mucina (TQPM) do líqüido
sinovial obtido das articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), inoculadas e
controle, no 30º dia de avaliação encontram-se na Tabela 3.
A formação de coágulo de mucina não foi avaliada no M1 devido a quantidade de LS
ser insuficiente para o teste. Ao se compararem os grupos controle e inoculado, observou-se
que, na articulação EU controle, três animais apresentaram coágulo categorizado como
bom, e onze animais, como regular, na articulação EU inoculada, em seis animais, a
qualidade do coágulo foi considerado regular e em oito deles, o coágulo apresentou-se
ruim. Houve diferença estatisticamente significante entre estes dois grupos (p=0,0039).
Na articulação FT controle, quatro animais apresentaram coágulo categorizado como
bom, cinco, regular e em outros cinco, coágulo ruim. Na articulação FT inoculada, dois
animais com coágulo regular, sete com coágulo ruim e cinco, coágulo péssimo.
Observando-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,0010) entre as
articulações FT controle e inoculada.
Foi observado também que a articulação FT inoculada mostrou-se mas susceptível à
infecção, apresentando diferença significativa (p=0,0469) quando comparada à articulação
EU inoculada.
Tabela 3 - Teste qualidade precipitação da mucina (TQPM) do líqüido sinovial obtido das
articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), inoculadas e controle,
no 30º dia de avaliação, nos 14 cães naturalmente infectados por Leishmania sp.
e experimentalmente inoculados intra-articular por Leishmania chagasi
(Araçatuba – SP, 2006).
TQPM
EU FT
Controle Inoculado Controle Inoculado
n % n % n % n %
Péssimo 0 0,0 0 0,0 0 0,0 5 35,7
Ruim 0 0,0 8 57,1 5 35,7 7 50,0
Regular 11 78,6 6 42,9 5 35,7 2 14,3
Bom 3 21,4 0 0,0 4 28,6 0 0,0
P
(1)
0,0039 0,0010
(1)
teste de Wilcoxon
TQPM - EU Inoculado x FT Inoculado : p = 0,0469
Tabela 4 - Valores de leucócitos, proteína, viscosidade e pH, obtidos do líqüido sinovial das
articulações escapuloumeral (EU) inoculada e controle, em diferentes momentos
(M1 e M2) nos 14 cães naturalmente infectados por Leishmania sp. e
experimentalmente inoculados intra-articular por Leishmania chagasi
(Araçatuba – SP, 2006).
Variável Categoria
Articulação EU
Controle
Articulação EU
Inoculada
M1 M2 M1 M2
P
(1)
N % N % n % n %
Leucócitos
Ausente 14 100,0
6 42,9 14
100,0
3 21,4
____
Moderado 0 0,0 8 57,1 0 0,0 11
78,6
Proteína
Ausente 5 35,7 0 0,0 4 28,6 0 0,0
0,0156
Normal 1 7,1 5 35,7 2 14,3 0 0,0
Moderada 8 57,2 9 64,3 8 57,1 13
92,9
Elevada 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 7,1
Viscosidade
Diminuída 0 0,0 8 57,1 0 0,0 14
100,0
____
Normal 14 100,0
6 42,9 14
100,0
0 0,0
pH
Ácido 0 0,0 0 0,0 0 0,0 2 14,3
0,0005
Normal 0 0,0 4 28,6 0 0,0 8 57,1
Alcalino 14 100,0
10 71,4 14
100,0
4 28,6
(1)
teste de Wilcoxon para o grupo inoculado
Tabela 5 - Valores de leucócitos, proteína, viscosidade e pH, obtidos do líqüido sinovial das
articulações fêmoro-tibial (FT) inoculada e controle, em diferentes momentos (M1
e M2) nos 14 cães naturalmente infectados por Leishmania sp. e
experimentalmente inoculados intra-articular por Leishmania chagasi (Araçatuba
– SP, 2006).
Variável Categoria
Articulação FT
Controle
Articulação FT
Inoculada
M1 M2 M1 M2
P
(1)
n % n % N % n %
Leucócitos
Ausente 14
100,0
4 28,6 14
100,0
2 14,3
____
Moderado 0 0,0 10
71,4 0 0,0 12
85,7
Proteína
Ausente 6 42,9 0 0,0 5 35,7 0 0,0
0,0010
Normal 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Moderada 8 57,1 12
85,7 9 64,3 4 28,6
Elevada 0 0,0 2 14,3 0 0,0 10
71,4
Viscosidade
Ausente
0 0,0 0 0,0 0 0,0 5 35,7
0,0020
Diminuída
0 0,0 6 42,9 4 28,6 9 64,3
Normal
14
100,0
8 57,1 10
71,4 0 0,0
pH
Ácido
0 0,0 3 21,4 0 0,0 7 50,0
0,0007
Normal
0 0,0 1 7,1 0 0,0 3 21,4
Alcalino
14
100,0
10
71,5 14
100,0
4 28,6
(1)
teste de Wilcoxon para o grupo inoculado
5.3.4 Densidade
A densidade do líqüido sinovial obtida das articulações EU e FT variaram de 1010
a 1030 dos Grupos controle e inoculado, e os valores estão expressos na Tabela 6.
Tabela 6 - Valores de densidade do líqüido sinovial (média e desvio-padrão) obtidos das
articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), inoculada e controle, em
diferentes momentos (M1 e M2) nos 14 cães naturalmente infectados por
Leishmania sp. e experimentalmente inoculados intra-articular por Leishmania
chagasi (Araçatuba – SP, 2006)
Variável Grupo
EU FT
M1 M2 M1 M2
Densidade
Controle
1012,5 ± 7,3 1016,1 ± 6,8 1015,4 ± 6,0 1019,3 ± 7,3
Inoculado
1014,3 ± 5,5 1018,2 ± 8,0 1015,0 ± 5,5 1024,6 ± 7,5
5.3.5 Citologia
A observação de eritrócitos nos esfregaços do LS em M1 e M2 foi rara, excetuando-se
quando houve contaminação com sangue durante a colheita.
No M1, observaram-se células sinoviais em 100% das amostras (FIGURA 2A); em
90% das articulações, houve predomínio de células mononucleares, principalmente de
linfócitos e monócitos. Apenas em um dos animais houve predomínio de neutrófilos no
M1, em três articulações, excetuando a articulação EU controle em que se pode observar a
mucina (FIGURA 2B). Nesse mesmo animal, observou-se Leishmania sp. no interior de
macrófagos e neutrófilos, nos momentos M1 e M2. A observação de neutrófilos nos
esfregaços ocorreu em 8% das articulações avaliadas em M1.
No M2, em relação aos tipos celulares identificados, a alteração mais marcante foi a
elevação do percentual de neutrófilos, que ocorreu em 59% dos cães avaliados. A
freqüência de neutrófilos foi acima de 70% na maioria dos casos, havendo dois casos em
que atingiram mais de 90% das células nucleadas totais contadas.
Houve inversão da celularidade em M1 e M2, caracterizado pela substituição de
mononucleares por polimorfonucleares, especificamente neutrófilos (FIGURA 2C).
Nas articulações EU inoculadas não ocorreram alterações significantes nos momentos
M1 e M2, havendo predomínio de células mononucleares (FIGURA 2D). Apenas em um
animal houve inversão de celularidade na articulação EU inculada, com valores de
neutrófilos acima de 70% e presença de Leishmania sp. no interior de macrófagos e de
neutrófilos. Por outro lado, foram constatadas mudanças na celularidade das articulações
FT, comparando-se M1 com M2, já que em 56% dos animais, a articulação FT inoculada
apresentou predomínio de neutrófilos, com valores que variaram de 55 a 86% da
celularidade em M2 (FIGURA 2E).
No M2, em 64% dos animais foi observado formas amastigotas de Leishmania sp. no
LS. Em todos esses cães, o protozoário foi identificado no citoplasma de macrófagos
(Figura 2F), e em dois cães as formas amastigotas do parasita localizavam-se no interior do
citoplasma de neutrófilos.
Em relação às articulações onde o parasita foi identificado, ocorreu em dois cães na
articulação EU, enquanto na articulação FT, foi detectado em sete cães. Destes sete, as
formas amastigotas foram verificadas no M1 em três animais, correspondendo três
articulações a serem inoculadas e uma controle.
Figura 2 - Fotomicrografia do líqüido sinovial das articulações EU esquerda e FT direita, de cães
naturalmente infectados por Leishmania sp. e experimentalmente inoculadas com formas
amastigotas de Leishmania chagasi. A: Células sinoviais em M1; B: mucina (seta), neutrófilos e
linfócitos em M2; C: neutrófilo em M2; D: Células sinoviais e mononucleares em M2; E:
Predomínio de neutrófilos em M2; F: Macrófago com Leishmania sp (seta) em M2 (Araçatuba –
SP, 2006).
A B
C D
E F
6 DISCUSSÃO
Restrições de movimento ocorrem em grande parte dos animais com infecção
natural por Leishmania sp. (FEITOSA et al., 2000; LONGSTAFFE et al., 1983; NOLLI,
1999). Neste trabalho, a relutância à marcha, claudicação e atrofia muscular foram
observadas com maior intensidade nos primeiros dias após a inoculação do agente nas
articulações EU e FT.
A incidência de claudicação em cães com infecção natural compreende de 30% a
37,5% dos casos (BEVILACQUA et al., 2002; BURACCO et al., 1997; FEITOSA et al.,
2000; MCCONKEY et al., 2002; NOLLI, 1999; WOLSCHRIJN et al., 1996), porém como
conseqüência da inoculação experimental de promastigotas esta alteração esteve presente
na totalidade dos animais, sendo mais evidente na articulação FT quando comparada a EU.
A dor é um sinal clínico local está sempre presente nas artrites sépticas segundo Nelson e
Couto (1994). Alguns animais deste trabalho apresentaram dor, após inoculação e outros,
no decorrer do período experimental.
A articulação FT mostrou-se mais sensível e de grande importância no diagnóstico
de enfermidades articulares apresentando sintomas de forma precoce e com maiores
alterações. Estes achados provavelmente se devam ao menor espaço articular, maior
vascularização local pelo fato de ser uma articulação submetida a menor estresse
mecânico, quando comparada à articulação escapuloumeral.
Na análise radiográfica das articulações do M0 e M2, não foram identificadas
quaisquer alterações articular e óssea, o que está de acordo com os relatos de Agut at al.,
(2003), Feitosa (2006) que identificaram Leishmania sp no LS de cães, na ausência de
alterações radiográficas evidentes. Padrões de poliartrite erosiva e não erosiva são
descritos em animais acometidos pela leishmaniose visceral segundo Agut et al. (2003),
Blavier et al. (2001), Buracco et al. (1997); Mcconckey et al. (2002), e Wolschrijn et al.
(1996). Cães portadores da doença apresentaram quadro de claudicação com evolução lenta
de um a dois anos antes dos sinais radiográficos de osteoartrite estarem evidente.
(Mcconkey et al., 2002; Wolschrijn et al., 1996).
Alterações radiográficas das articulações envolvidas nas artrites sépticas,
inicialmente, são inespecíficas e se limitam a espessamento da membrana sinovial e cápsula
articular e, em infecções crônicas, é possível observar, radiograficamente, degeneração de
cartilagem, formação osteófitos periarticulares, reação periosteal e lise óssea subcondral
(NELSON; COUTO, 1994). Desta forma, para se detectarem alterações radiográficas
ósseas em cães com leishmaniose, talvez seja necessário um período de observação
superior ao proposto neste trabalho, que foi de trinta dias.
Segundo Lozier e Menard (1998) e Borges et al. (1999), o volume médio de LS na
articulação fêmoro-patelar normal do cão é de 0,24 ml. Embora a média encontrada neste
experimento, em M1, tenha sido de 0,4 ml e, portanto, maior do que a de cães sadios, este
volume é ainda escasso para realização de toda análise proposta neste estudo. Porém, após
30 dias (M2), maior volume de LS foi obtido nas articulações inoculadas, sendo que na
articulação FT e EU os volumes não excederam a 1,5 ml, e 2 ml respectivamente. Esta
observação reforça a idéia de que, nas artrites sépticas, ocorre aumento significativo do LS
intra-articular (NELSON; COUTO, 1994).
Das 56 amostras colhidas, onze foram contaminadas com sangue que, segundo Van
Pelt (1974) e Boon (1997), este fato é freqüente, devido à ruptura de capilares subsinoviais.
Van Pelt (1974) relatou também um aumento acentuado no número de leucócitos
nas artrites infecciosas; o mesmo achado foi observado no decorrer do experimento nas
articulações EU e FT inoculadas, em grau moderado no M2.
A concentração de proteína no LS normal varia de 2 a 2,5 g/dl (BIASE at al., 2001;
LIPOWITZ, 1985; PERMAN, 1980). Valores aumentados foram detectados nas
articulações EU e FT inoculadas no M2, sendo que na articulação FT o aumento foi
significante. Segundo Van Pelt (1974), ocorre um aumento acentuado nos casos de artrites
infecciosas.
O pH do LS no grupo controle manteve-se alcalino, nas articulações EU e FT, no
M1. Segundo os relatos de Biase et al. (2001) e Sawyer (1963), o pH do LS normal de cão
varia de 7,0 a 7,8. Na articulação EU inoculada, houve pequena mudança para o pH ácido
no M2, na articulação FT inoculada, houve alteração mais acentuada de alcalino para
ácido, observada em sete animais no M2. Segundo Sawyer (1963) o pH pode-se apresentar
abaixo dos valores normais nas artrites sépticas.
Foi verificada uma correlação entre a viscosidade do LS e o teste do coágulo de
mucina também observada por Barnabé et al., (2005), que apresentaram qualidade inferior
no M2 em ambas as articulações, como referido por Biase et al. (2001) e Fernandes at al.
(1983). Nos processos inflamatórios articulares, o LS freqüentemente apresenta um
péssimo coágulo de mucina; fato atribuído à influência exercida pela quantidade e
qualidade do ácido hialurônico presentes na amostra (BARNABÉ at al., 2005; VAN PELT,
1967). Este mecanismo indica alterações na composição do líquido sinovial que, segundo
Nelson e Couto (1994), resultará em coágulo de baixa qualidade, possivelmente decorrente
da presença de microrganismos ou de enzimas liberadas pelas células inflamatórias
presentes nas articulações.
Houve diferença entre os membros torácicos e pélvicos quanto às características
observadas no LS nas articulações inoculadas, que foi não foi observado por Barnabè at al.
2005, no estudo do mesmo fluido da bainha tendínea de eqüinos sadios.
Em relação à análise citológica do LS no M1, houve predomínio de células
mononucleares, principalmente as fagocitárias, e em menor número, os linfócitos. Segundo
Luvizotto (2006), o LS apresenta uma reação inflamatória mononuclear em cães infectados
naturalmente por Leishmania sp. Os valores para as células mononucleares superaram 90%
em quase todos os casos, referidos Biase et al. (2001) como valores de normalidade a
ocorrência de 94 a 100% de mononucleares. Segundo Hans (1984), células mononucleares
constituem-se de linfócitos, monócitos, macrófagos e células da membrana sinovial e
podem variar de 90 a 100%, tanto no líquido sinovial normal como nas artropatias. Neste
estudo, percentual de neutrófilos do M1 (0 a 8%), situa-se nos limites para o LS normal
onde os valores para polimorfonucleares são inferiores ou iguais a 10%. (BIASE et al.,
2001; COLES, 1984; FISHER, 2003).
Em relação aos tipos celulares observados no M2, a alteração evidente foi a elevação
do percentual de neutrófilos, que ocorreu em 59% dos cães cujos valores de
polimorfonucleares superaram os 70% da celularidade observada, atingindo em alguns
animais, mais de 90% das células nucleadas totais. Ocorreu uma inversão da celularidade,
já que o predomínio de mononucleares foi substituído pelo de polimorfonucleares,
especificamente neutrófilos. De fato, na maioria das artrites sépticas, há prevalência de
neutrófilos segmentados (FISHER, 2003; NELSON; COUTO, 1994).
No que se refere à articulação EU, não ocorreram alterações significantes nos
constituintes celulares do LS quando comparados os M1 e M2. Ou seja, permaneceu em
quase todos os momentos, o predomínio de mononucleares. Por outro lado, foram
constatadas mudanças na celularidade das articulações FT, comparando-se M1 com M2,
onde em 56% dos animais, a articulação FT inoculada apresentou inversão de celularidade
no M2 , com predomínio de neutrófilos sobre mononucleares, com valores que variaram de
55 a 86% o pode ser confirmado no trabalho de Mcconkey et al. (2002), que encontraram
esta inversão no LS de um cão acometido pela Leishmaniose. Esses mesmos autores
observaram Leishmania sp. no interior de células mononucleares e em neutrófilos,
coincidindo com o que fora observado nesse estudo, onde as formas amastigotas de
Leishmania sp. foram identificadas no LS de 64% dos animais no M2. Elas foram
observadas no interior de células mononucleares pequenas ou grandes, e em poucos
neutrófilos.
Em relação à análise citológica do LS para a pesquisa do parasito, a articulação FT
superou a EU quanto ao numero de células parasitadas. Segundo Parry (1999), Leishmania
sp. tem sido demonstrada no interior de macrófagos no liquido sinovial de um número
pequeno de cães com leishmaniose visceral canina.
Embora tenha sido realizado o tratamento prévio de todos os cães deste experimento
com doxiciclina, um animal apresentou mórula de Ehrlichia sp. no interior de macrófago,
no M1 e, desta forma, foi excluído do experimento.
A diferença entre o encontro ou não do parasita nas articulações FT e EU, observada
aos trinta dias pós-inoculação, talvez possa ser explicada pela migração do protozoário para
tecidos circunvizinhos.
Em futuros trabalhos, é necessária uma avaliação histopatológica da cápsula articular,
para que os dados obtidos neste estudo possam ser confrontados com os achados
citológicos, a fim de se elucidarem as diferenças observadas entre as articulações FT e EU
no tocante à celeridade e gravidade da artrite encontrada em cães com leishmaniose
experimental.
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos nesse estudo, pôde-se concluir que:
- A inoculação de suspensão de promastigota (1x10
6
) intrarticular não determinou
alterações radiográficas articulares após 30 dias.
- A análise do líquido sinovial foi determinante na identificação de alteração inflamatória ,
pós-inoculação.
- A análise parasitológica revelou formas amastigotas de Leishmania sp em 64 % dos cães
no 30º dia.
- A articulação fêmoro-tibial foi a mais adequada para a observação de alterações
inflamatórias pela análise físico-química e, principalmente, pela citologia do liquido
sinovial;
- Os achados clínicos de claudicação e dor foram mais intensos e ocorreram precocemente,
demonstrando que o processo inflamatório ocorre com maior intensidade nos primeiros dias
após a inoculação do parasita.
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ZAR, J.H. Biostatistical analysis. 4. th. New Jersey: Prentice-Hall, 1998. 930 p.
Instruções aos autores
Devem ser estruturados de acordo com os seguintes itens:
• Artigos científicos
1. Página de rosto, com:
• Título do trabalho em português, em inglês e em espanhol, fonte Times New
Roman, tamanho 12, com espaçamento simples, em negrito e centralizado, no
qual somente a primeira letra de cada palavra deve ser maiúscula. Quando
necessário, indicar a entidade financiadora da pesquisa, como primeira
chamada de rodapé;
• Nomes completos dos autores, em que somente a primeira letra de cada nome
deve ser maiúscula, centralizado e em negrito. Digitá-los, separados por
vírgulas, com chamadas de rodapé numeradas e em sobrescrito, que indicarão
o cargo e o endereço profissional dos autores (inclusive endereço eletrônico),
seguidos da instituição onde o trabalho foi desenvolvido ou às quais estão
vinculados;
• Nome, endereço, telefone, fax e correio eletrônico, para correspondência;
• Em caso de envolvimento de seres humanos ou animais de experimentação,
encaminhar o parecer da Comissão de Ética ou equivalente, assinalando, no
trabalho, antes das referências, a data de aprovação.
2. Página com resumo, abstract e resumen
• Tanto o resumo, como o abstract e o resumen devem ser seguidos do título do
trabalho, no respectivo idioma, e conter no máximo 400 palavras cada um, com
informações referentes à introdução, metodologia, resultados e conclusões. O
texto deve ser justificado e digitado em parágrafo único e espaço 1,5,
começando por RESUMO. O abstract, e o resumen, devem ser tradução fiel do
resumo. Se for apresentado em inglês, deve conter também, resumos em
português e espanhol; se for em espanhol, resumos em português e inglês.
• Devem conter, no máximo, cinco palavras-chave, key words, e palabras-clave
que identifiquem o conteúdo do texto.
3. A estrutura do artigo deverá conter:
Introdução: Deve ser clara, objetiva e relacionada ao problema investigado e à literatura
pertinente, bem como aos objetivos da pesquisa. A introdução estabelece os objetivos do
trabalho.
Material e Métodos: Deve oferecer informações de reprodutibilidade da pesquisa, de
forma clara e concisa, como variáveis, população, amostra, equipamentos e métodos
utilizados, inclusive os estatísticos.
Resultados: Apresentação dos resultados obtidos, que devem ser descritos sem
interpretações e comparações. Poderá ser sob a forma de tabelas, em folha à parte, no
máximo de cinco, ordenadas em algarismos arábicos e encabeçadas pelo título, de acordo
com as normas de apresentação tabular da ABNT/WBR 6023/2000 da Associação
Brasileira de Normas Técnicas, identificadas no texto como Tabela; sob a forma de
figuras, nos casos de gráficos, fotografias, desenhos, mapas, etc., ordenadas em algarismos
arábicos, até no máximo de seis, e citadas no texto como Figura. Devem ser identificadas
em folha à parte, onde deve constar o título do artigo. Fotografias podem ser em preto e
branco ou coloridas, identificadas com o(s) nome(s) do(s) autor(es) no verso. No caso de
desenhos originais, a impressão deve ser em papel adequado, de qualidade. Se o trabalho
for apresentado na língua portuguesa ou espanhola, os enunciados das tabelas e figuras bem
como das variáveis apresentadas deverão estar também escritos em inglês.
Discussão: Deve ser entendida como a interpretação dos resultados, confrontando com a
literatura pertinente, apresentada na introdução. Se julgar conveniente, os resultados e a
discussão poderão ser apresentados conjuntamente.
Conclusões: É a síntese final, fundamentada nos resultados e na discussão.
Referências: Devem ser apresentadas de acordo com as normas da ABNT, e o arranjo deve
ser em ordem alfabética por sobrenome do autor (modelos anexos).
Deverão ser editorados em Microsoft Word for Windows, para edição de
textos, Excel (qualquer versão) para gráficos, formato JPEG ou GIF (imagem) para
fotografias, desenhos e mapas, em três vias (uma original e duas cópias) impressas,
formato A4 (21,0 x 29,7 cm), em espaço duplo, mantendo margens de 2,5 cm, nas laterais,
no topo e pé de cada página, fonte Times New Roman, tamanho 12 e numeração
consecutiva das páginas em algarismos arábicos, a partir da folha de identificação.
Ilustrações e legendas devem ser apresentadas em folhas separadas. Encaminhar cópia em
disquete 3 ½” de alta densidade ou CD, identificado com título do artigo e nome dos
autores. Nas duas cópias deve(m) ser omitido(s) o(s) nome(s) do(s) autor(es), o local
onde se realizou o trabalho, bem como o rodapé.
Não serão fornecidas separatas. Os artigos estarão disponíveis no formato
PDF no endereço eletrônico da revista. Para as demais seções da revista são válidas as
normas anteriores. Não devem exceder a 15 páginas. Abreviaturas não usuais devem ser
Citações no texto Geral: é normalizada segundo a Associação Brasileira de Normas
Técnicas.
–ABNT/NBR 10520: http://biblioteca.inpa.gov.br/NBR10520.htm ou
http://www.creupi.br/biblioteca/normas.htm
Estudo clínico-laboratorial das articulações de cães naturalmente infectados com
leishmaniose visceral e experimentalmente inoculados com leishmania chagasi por via
intra-articular
Clinical-laboratorial study of dog articulations naturally infected by visceral
leishmaniasis and experimentally inoculated with Leishmania chagasi via intra-
articular injection
Estudio Clínico-Laboratorial de las Articulaciones de canes naturalmente infectados
con Leishmaniose visceral y experimentalmente inoculados con Leishmania chagasi
por vía intra-articular
Agueda Aparecida Lima da Silva
1
, Flávia de Rezende Eugênio
2
, Maria Cecília Rui
Luvizotto
3
, Silvia Helena Venturolli Perri
4
, Valéria Marçal Félix de Lima
5
, Fabio Luis
Bonello
6
.
1- Médica Veterinária Mestranda na Disciplina de Clínica Cirúrgica pela Unesp Araçatuba/SP. Rua
Amazonas nº571, <aguedavet@bol.com.br
2- Professora Assistente Doutora, Curso de Medicina Veterinária, Unesp Araçatuba/SP. Rua Clovis
Pestana nº793,<eugeni[email protected]p.br
3- Professora Assistente Doutora, Curso de Medicina Veterinária, Unesp Araçatuba/SP. Rua Clovis
Pestana nº793, ruimcl@fmva.unesp.br
4- Professora Assistente Doutora, Curso de Medicina Veterinária, Unesp Araçatuba/SP. Rua Clovis
Pestana nº793, shvper[email protected]sp.br
5- Professora Assistente Doutora, Curso de Medicina Veterinária, Unesp Araçatuba/SP. Rua Clovis
Pestana nº793, vmfli[email protected]sp.br
6- Fabio Luis Bonello, Médico Veterinário Docente da Faculdade de Medicina Veterinária de
Andradina/SP. Rua Amazonas nº571, <bonellofl@yahoo.com.br
RESUMO
Estudo clínico-laboratorial das articulações de cães naturalmente infectados com
leishmaniose visceral e experimentalmente inoculados com leishmania chagasi por via
intra-articular.
Este estudo teve por objetivo descrever a evolução das alterações locomotoras, citológicas e
radiográficas, na tentativa de se elucidar o mecanismo pelo qual se desenvolve a artrite na
leishmaniose experimental em cães. Formas pro-mastigotas de L. chagasi foram inoculadas
nas articulações escápuloumeral e fêmoro-tibial de 14 cães. Os animais foram submetidos
a avaliações clínicas diárias por 30 dias, bem como análises radiográfica, citológica e
físico-química do líqüido sinovial. As alterações clínicas mais encontradas foram:
claudicação, dor, restrição de movimentos e aumento de temperatura local. No liquido
sinovial, houve aumento gradativo de leucócitos, predominando mononucleares e,
posteriormente, polimorfonucleares. Aumento de proteínas, diminuição do pH (de alcalino
tendendo a acido), bem como da viscosidade, e qualidade do coagulo ruim foram
observados ao longo do estudo. Estatisticamente, a articulação femoro-tibial apresentou
maiores alterações quando comparada à escápuloumeral. Em 64% dos animais, observou-
se a presença do parasita na articulação e não foram encontradas alterações radiográficas
ósseas, no período estudado. O confronto dos valores físicos, químicos e achados
citológicos do liquido sinovial, permitiu subsidio importante para afirmar que há ocorrência
de artrite infecciosa, porém sem caráter proliferativo ou sequer degenerativo, no período
estudado.
palavras chave: Cão, liquido sinovial, artrite, leishmaniose visceral.
ABSTRACT
Clinical-laboratorial study of dog articulations naturally infected by visceral leishmaniasis
and experimentally inoculated with Leishmania chagasi via intra-articular injection.
The aim of this study was to describe the evolution of the locomotor and cytological
articular alterations, trying to unveil the mechanism through which the arthritis develops in
the experimental leishmaniasis in dogs. Pro-amastigotes forms of L. chagasi were
inoculated in the humeral-scapular and the femoral-tibial articulations of 14 dogs. The
animals were submitted to daily clinical evaluations for a thirty-day period, as well as
cytological and physiochemical analysis of the synovial fluid The most frequent clinical
alterations were: limping articular volume increase, pain and local temperature increase. In
the synovial fluid, there was a gradual increase of leukocytes, predominating mononuclear
cells and, later, polymorphonuclear ones. Protein increase, decrease of the pH (from
alkaline towards neutral), as well as viscosity, and coagulation test of bad quality were
observed along the study. Statistically, the femoro-tibial articulation presented greater
alterations when compared to the humeral-scapular one. In 64% of the animals, the parasite
presence was observed in the articulation and no osseous radiographic alterations were
found in the period of the study. The comparison of the physical and chemical values and
the cytological findings in the synovial fluid supplied important information to state that
there are occurrences of septic arthritis, in the initial phase, however without prolipherative
or degenerative characteristics, in the period of the study
Key words: Dog, synovial liquid, arthritis, visceral leishmaniasis
RESUMEN
Estudio Clínico-Laboratorial de las Articulaciones de canes naturalmente infectados con
Leishmaniose visceral y experimentalmente inoculados con Leishmania chagasi por vía
intra-articular.
Este estudio tuvo por objetivo describir la evolución de las alteraciones locomotoras y
citológicas articulares, en el intento de elucidarse el mecanismo por el cual se desenvuelve
la artritis en la leishmaniose experimental en canes. Formas pro-amastigotas de L. chagasi
fueron inoculadas en las articulaciones escapulohumeral (EU) y fémur-tibial (FT) de
catorce (14) canes. Los animales fueron sometidos a evaluaciones clínicas diarias por 30
días, bien como a análisis citológico y fisicoquímico del líquido sinovial. Las alteraciones
clínicas encontradas fueron: claudicación, aumento del volumen articular, dolor y aumento
de la temperatura local. En el líquido sinovial, hubo aumento gradual de leucocitos,
predominantemente mononucleares y, posteriormente, polimorfonucleares. Aumento de
proteínas, disminución del pH (de alcalino tendiendo a neutro), así como de la viscosidad, y
test de coágulo de mala calidad fueron observados a lo largo del estudio. Estadísticamente,
la articulación FT presentó mayores alteraciones cuando comparada a la EU. En 64% de los
animales, se observó la presencia del parásito en la articulación y no fueron encontradas
alteraciones radiográficas óseas en el período estudiado. La confrontación de los valores
físicos, químicos y hallazgos citológicos del líquido sinovial, permitió subsidio importante
para afirmar que hay ocurrencia de artritis séptica, en su fase inicial, aunque sin carácter
prolífico, ni siquiera degenerativo, en el período estudiado. Palabras llave: Can, líquido
sinovial, artritis, leishmaniose visceral.
INTRODUÇÃO
A Leishmaniose visceral é uma doença de caráter infeccioso, de evolução aguda ou
crônica, sendo a Leishmania chagasi responsável pela enfermidade no Brasil. Em muitos
animais verifica-se atrofia muscular, diminuição da atividade física associada a distúrbios
de locomoção (FEITOSA et al., 2000; LONGSTAFFE et al., 1983).
A incidência de problemas locomotores pode chegar a 30%, sendo as queixas
principais de claudicação e dor na parte distal dos membros (BURACCO et al., 1997;
WOLSCHRIJN et al., 1996). Estes problemas podem advir de poliartrites, sinovites,
polimiosite, osteoartrite, periostite proliferativa, lesões osteolíticas, úlceras interdigitais,
lesões de coxim plantar e neuralgia (BEVILACQUA et al., 2002; FEITOSA et al., 2000;
MCCONKEY et al., 2002).
Alguns autores relataram manifestações clínicas locomotoras em que os cães
acometidos apresentavam variados graus de claudicação e aumento do volume articular
sendo que, após exames radiográficos, as imagens eram compatíveis com osteoartrite
erosiva e, às vezes, com destruição completa das articulações (AGUT et al., 2003;
BEVILACQUA et al., 2002; BURACCO et al., 1997; WOLSCHRIJN et al., 1996).
Em 1997, Buracco et al., (1997), relataram o encontro de Leishmania donovani no
líquido sinovial de um cão acometido por leishmaniose visceral. Mais recentemente, foi
descrita a presença de Leishmania chagasi no líquido sinovial de cães com distúrbios
locomotores no município de Araçatuba, São Paulo (BEVILACQUA et al., 2002).
As artrites podem estar associadas com o depósito de imunocomplexos ou a
presença do parasita no interior das articulações. Neste caso, é possível a identificação de
formas amastigotas de Leishmania sp. no líquido sinovial (AGUT et al., 2003;
BEVILACQUA et al., 2002; BURACCO et al., 1997; FEITOSA et al., 2000).
Muito embora estes autores tenham se baseado em relatos de casos, não há estudos
sobre a evolução das artrites no curso da leishmaniose visceral canina.
Diante do exposto, este estudo teve por objetivo descrever a evolução clínica,
radiográfica das articulações e análise do líquido sinovial em cães naturalmente infectados
por Leishmania sp após a inoculação de Leishmania chagasi intra-articular.
MATERIAL E METODO
Foram utilizados 20 cães adultos, de raças variadas, machos e fêmeas, de um a
quatro anos de idade, pesando entre 10 e 35 kg. Todos os animais, sorologicamente
positivos para leishmaniose visceral pelos testes de Reação de Imunofluorecência Indireta,
e ELISA, alojados em canil telado e usando coleira
1
Scalibur.
O critério de escolha constou de exame físico completo e radiográfico que
definiram ausência de lesões articulares. O projeto foi aprovado pelo Comitê de ética em
Experimentação Animal de Medicina Veterinária da Universidade Estadual Paulista – Julio
de Mesquita Araçatuba-SP, (protocolo nº 140/05).
Seis animais foram descartados no decorrer do experimento.
O período experimental constou de três momentos, a saber:
-Momento 0 (zero): os animais foram submetidos a exames radiográficos das articulações
fêmoro-tibial (FT) e escapuloumeral (EU) direita e esquerda em duas projeções, médio-
lateral e antero-posterior, totalizando oito projeções por animal, com objetivo de verificar,
por método comparativo, imagens radiográficas compatíveis com: efusão articular,
irregularidade nas superfícies articulares, esclerose óssea e osteófitos .
-Momento 1: Colheita de uma amostra do líquido sinovial 500 µl, com agulha 40x10 ou
40x12, em todos os animais, para realização dos exames laboratoriais. Após anti-sepsia
sobre a pele foi realizada a artrocentese das articulações fêmoro-tibial e escapuloumeral,
bilateralmente, em seguida, foram realizadas inoculações intra-articulares com 1x10
6
(CERQUEIRA et al.; 2003) de formas amastigotas de Leishmania chagasi
2
diluidas em 500
µl de solução salina nas articulações escápuloumeral esquerda e fêmoro-tibial direita. O
parasita foi cultivado conforme descrito por Lima et al., 2003. Como controle nas
articulações EU direita e FT esquerda, foi inoculado 500 µl de solução isotônica salina.
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1
deltrametrina -,laboratório Intervet
2
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A escolha dos membros tratados em diagonal foi proposital para diminuir uma possível
exacerbação da claudicação.
Momento 2: trinta dias após M1, foram realizados exames radiográficos das quatro
articulações em todos os animais, e colheita do líquido sinovial para realização de exame
citopatológico e posterior eutanásia.
Um protocolo de avaliação foi elaborado contendo informações dos parâmetros
avaliados diariamente, constando de: temperatura corporal (
o
C), temperatura local articular
(diminuída, normal e aumentada), mensuração com a região dorsal da mão do examinador
sobre a área; dor, aumento de volume articular, crepitação articular, restrição ou
exacerbação de movimentos, assimetria, atrofia muscular, claudicação, impotência
funcional.
A avaliação do LS foi realizada nos momentos M1 e M2, e constataram de:
Na inspeção em tubo de ensaio foram avaliados cor e aspecto. Utilizando-se fitas
reagentes
1
, foram avaliados: pH, proteínas, leucócitos (negativo, traços, baixo, moderado e
alto), sangue (negativo, hemolisado e não hemolisado). E a densidade, por refratometria.
A determinação da viscosidade foi realizada no momento da transferência do LS da
seringa de colheita para lâmina de vidro, estimando-se o comprimento, em centímetros, do
filamento formado pela gota antes do seu desprendimento da extremidade da seringa.
Considerou-se: ausente, quando não houve formação de filamento; diminuída: quando o
comprimento do filamento foi inferior a 5 cm e normal: quando ultrapassou a 5 cm
(BARNABÉ et al., 2005).
Foi realizado o teste de coágulo de mucina segundo Fisher, (2003) no M2, devido à
colheita do LS ser superior a 1ml. O procedimento constou da adição de uma ou duas gotas
de líquido sinovial em 8 gotas de ácido acético 2%
2
,pode ser graduado segundo Parry
(1996) em: bom, regular, ruim ou péssimo.
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1
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2
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O exame da citologia realizado no M1 e M2 compreendeu a contagem diferencial e
morfológica das células do líquido sinovial e a pesquisa direta das formas amastigotas do
parasito.
Para a contagem das células nucleadas foram utilizadas um ou mais esfregaços do
LS em cada momento, para todas as articulações, corado com corante panótico rápido
1
, que
constou da contagem de 100 células nucleadas em cada esfregaço, utilizando microscópio
de luz com objetiva de imersão (100X). Utilizou-se um trajeto em forma de “zigue-zague”
na lâmina, de uma extremidade lateral à outra, registrando-se as células nucleadas em seu
trajeto.
As células nucleadas foram classificadas como neutrófilos, linfócitos, e
mononucleares fagocitários e os resultados foram expressos em percentuais.
A análise estatística foi utilizada para as variáveis classificatórias de distribuição normal
e foram consideradas significantes nos testes de Wilcoxon e McNemar quando p < 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos 14 animais avaliados foi identificado dor articular, claudicação, restrições de
movimentos e atrofia muscular. Com referência à variável restrição de movimento, pode-se
observar que esta ocorreu na articulação EU em 50% dos animais e em 71,4% na
articulação FT.
Atrofia muscular do membro cuja articulação recebeu inoculo, persistiu durante todo
o período experimental sendo que 71,4% dos animais apresentaram no membro torácico
esquerdo e 78,6% no membro pélvico direito.
Todos os animais apresentaram claudicação e relutância em andar, observando-se
uma diferença significativa (p=0,0040) entre as articulações EU e FT inoculadas, onde
37,5% apresentaram na articulação EU e 100,0% na articulação FT.
Restrições de movimento ocorrem em grande parte dos animais com infecção natural
por Leishmania sp. (FEITOSA et al.; 2000; LONGSTAFFE et al.; 1983), e, neste trabalho,
a relutância à marcha, claudicação e atrofia muscular foram observadas com maior
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1
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intensidade nos primeiros dias após a inoculação do agente nas articulações EU e FT.
A incidência de claudicação em cães com infecção natural compreende de 30% a
37,5% dos casos (BEVILACQUA et al.; 2002 FEITOSA et al.; 2000).
Os 14 animais apresentaram dor local, observada após a inoculação, bem como no
decorrer do período experimental, sendo que 75,0%, apresentaram na articulação EU e
100,0% na articulação FP inoculadas. A dor é um sinal clínico local sempre presente nas
artrites sépticas, segundo Nelson e Couto (1994). A articulação FT mostrou-se mais
sensível e de grande importância no diagnóstico de enfermidades articulares apresentando
sintomas precocemente.
Em relação à temperatura local, houve um aumento inicial que foi atribuído à
inflamação pós-inoculação e mantendo-se dentro dos padrões de normalidade. As
articulações controle não apresentaram alterações.
A temperatura corporal avaliada ao longo de trinta dias, oscilou entre 37ºC a 40,7 ºC.
Na análise radiográfica das articulações do M0 e M2, não foram identificadas
quaisquer alterações articular e óssea, o que está de acordo com os relatos de Agut at al.,
(2003), Feitosa (2006) que identificaram Leishmania sp no LS de cães, na ausência de
alterações radiográficas evidentes. Poliartrite erosiva e não erosiva são descritas em
animais acometidos pela leishmaniose visceral segundo Agut at al., (2003); Buracco at al.,
(1997); Mcconckey at al., (2002);Wolschrijn at al., (1996). Cães portadores da doença
apresentaram quadro de claudicação com evolução lenta de um a dois anos antes dos sinais
radiográficos de osteoartrite estarem evidentes. (MCCONKEY et al., 2002; WOLSCHRIJN
et al., 1996).
Alterações radiográficas das articulações envolvidas nas artrites sépticas,
inicialmente, são inespecíficas e se limitam a espessamento da membrana sinovial e cápsula
articular e, em infecções crônicas, é possível observar, radiologicamente, degeneração de
cartilagem, formação de osteófitos, reação periosteal e lise óssea subcondral
(NELSON; COUTO, 1994). Desta forma, para se detectarem alterações radiográficas
ósseas em cães com leishmaniose, talvez seja necessário um período de observação
superior ao proposto neste trabalho, que foi de trinta dias. Acreditamos ser necessários um
período mínimo de seis meses para que ocorram alterações articulares na infecção natural.
No exame físico, o LS apresentou-se com aspecto amarelo palha, límpido e com
ausência de partículas. Das 56 amostras colhidas, onze foram contaminadas com sangue,
fato que, segundo Boom (1997) e Van Pelt (1974) e, é freqüente, devido à ruptura de
capilares subsinoviais.
Segundo Lozier e Menard (1998) e Borges et al., (1999), o volume médio de LS na
articulação fêmoro-patelar normal do cão é de 0,24 ml. Embora a média encontrada neste
experimento, em M1, tenha sido de 0,4 ml e, portanto, maior do que a de cães sadios, este
volume é ainda escasso para realização de toda análise proposta neste estudo. Porém, após
30 dias (M2), maior volume de LS foi detectado nas articulações inoculadas, sendo que na
articulação FT o volume não excedeu a 1,5 ml, e na EU, 2 ml. Esta observação reforça a
idéia de que, nas artrites sépticas, ocorre aumento significativo do LS intra-articular
(NELSON; COUTO, 1994).
No liquido sinovial das articulações EU e FT controles, não foi identificada a
presença de leucócitos no M1 em todos os animais. No M2, após a inoculação de solução
fisiológica, foi detectada, através do método utilizado, a ocorrência de leucócitos em
intensidade moderada em 57,1% e 71,4% respectivamente para EU e FT.
Para articulações EU e FT inoculadas, também não foram detectados leucócitos em
M1. No M2, 30 dias após o inoculo de (1x10
6
) formas promastigotas, foi verificado
aumento moderado de leucócitos em 78,6% na EU e, em 85,7% na FT, respectivamente,
apresentaram intensidade moderada, segundo Van Pelt (1974) há aumento acentuado no
número de leucócitos nas artrites infecciosas.
A concentração de proteína no LS na articulação EU controle no M1 foi variável, não
tendo sido detectada em 35,7,% dos animais. Apresentou nível de normalidade em 7,1% e
foi moderada em 57,2%. No M2, esteve normal em 35,7% e moderada em 64,3%.
Na articulação EU inoculada, em M1, a concentração de proteína não foi detectada
em 28,6%, esteve normal em 14,3% e foi de intensidade moderada em 57,1%. No M2, a
proteína apresentou-se com intensidade moderada em 92,9% e elevada em 7,1%.
Na articulação FT controle, no M1 a concentração de proteínas não foi detectada em
42,9% e moderada em 57,1%. Em M2, esteve moderada em 85,7% e elevada em 14,3%.
Na articulação FT inoculada, no M1 não foram detectadas proteínas em 35,7%,
ocorrendo em concentração moderada em 64,3%. Em M2, 28,6% dos animais apresentaram
nível moderado e elevado, em 71,4%. Houve diferença estatisticamente significativa nas
articulações EU e FT inoculadas no M2, (p<0,0010).
A concentração de proteína no LS normal varia de 2 a 2,5 g/dl (BIASE at al., 2001;
LIPOWITZ, 1985; PERMAN, 1980). Valores aumentados foram detectados nas
articulações EU e FT inoculadas no M2, sendo que na FT o aumento foi significativo.
Segundo Van Pelt (1974), ocorre um aumento acentuado nos casos de artrite infecciosa.
O pH do LS no grupo controle manteve-se alcalino, nas articulações EU e FT, no
M1. Segundo os relatos de Biase et al., (2001) e Sawyer (1963), o pH do LS normal de cão
varia de 7,0 a 7,8. Na articulação EU inoculada, houve pequena mudança para o pH ácido
no M2, na articulação FT inoculada, houve alteração mais acentuada de alcalino para
ácido, observada em sete animais no M2. Segundo Sawyer (1963), o pH pode-se apresentar
abaixo dos valores normais nas artrites sépticas.
Houve diferença estatisticamente significante (p=0,0266) entre as articulações EU e
FT inoculadas, em M2.
A viscosidade do LS da articulação EU controle apresentou-se 100% normal no M1,
enquanto no M2, diminuída em 57,1% dos casos. Na articulação EU inoculada, esteve
100% normal no M1, e 100% diminuída no M2.
A articulação FT controle manteve um padrão idêntico à EU controle no M1 e
diminuída em 42,9% dos casos no M2. Na articulação FT inoculada, em 71,4% dos animais
a viscosidade esteve normal e diminuída em 28,6%, no M1. No M2, ausente em 35,7% e
diminuída em 64,3%.
A formação de coágulo de mucina não foi avaliada no M1 devido à quantidade de LS
ser insuficiente para o teste. No M2, ao se compararem os grupos controle e inoculado,
observou-se diferença estatisticamente significativa entre estes dois grupos (p=0,0039).
Houve também diferença (p=<0,0010) entre as articulações FT controle e inoculada,
onde a articulação FT inoculada apresentou coágulo ruim e de péssima qualidade
respondendo rapidamente à infecção, apresentando diferença significante (p=0,0469)
quando comparada à articulação EU inoculada.
Houve diferença entre os membros torácicos e pélvicos quanto às características
observadas no LS, fato que não foi observado por Barnabé et al (2005), no LS normal da
bainha tendínea de eqüinos
Foi verificada correlação entre a viscosidade do LS e o teste do coágulo de mucina, o
que coincide com os relatos de Barnabé et al., (2005), apresentando coeficientes de
correlação de Spearman, a saber: articulações EU controle (r
S
= 0,603; p=0,0224), FT
controle (r
S
=0,835; p<0,0002), FT tratado (r
S
=0,913; p<0,0001), que apresentaram
qualidade inferior no M2 em ambas as articulações. Nos processos inflamatórios
articulares, o LS freqüentemente apresenta péssimo coágulo de mucina; fato atribuído à
influência exercida pela quantidade e qualidade do ácido hialurônico presentes na amostra
(BARNABÉ at al., 2005; VAN PELT, 1967). Este mecanismo indica alterações na
composição do líquido sinovial que, segundo Nelson e Couto, (1994), resultará em coágulo
de baixa qualidade, possivelmente decorrente da presença de microrganismos ou de
enzimas liberadas pelas células inflamatórias presentes nas articulações.
A densidade do líqüido sinovial obtida das articulações EU e FT variou de 1,010 a
1,030 nos grupos controle e inoculado nos M1 e M2.
Em relação à análise citológica do LS no M1, houve predomínio de células
mononucleares, principalmente as fagocitárias, e em menor número, os linfócitos. Segundo
Luvizotto (2006), o LS apresenta uma reação inflamatória mononuclear em cães infectados
naturalmente por Leishmania. Os valores para as células mononucleares superaram 90% em
quase todos os casos, referidos Biase et al., (2001) como valores de normalidade a
ocorrência de 94 a 100% de mononucleares. Segundo Hans (1984), células mononucleares
constituem-se de linfócitos, monócitos, macrófagos e células da membrana sinovial e
podem variar de 90 a 100%, tanto no líquido sinovial normal como nas artropatias. O
percentual de neutrófilos do M1 de 0 a 8%, situa-se nos limites para o LS normal onde os
valores para polimorfonucleares são inferiores ou iguais a 10%. (BIASE at al., 2001;
COLES, 1984; FISHER, 2003).
Em relação aos tipos celulares observados no M2, a alteração evidente foi a elevação
do percentual de neutrófilos, que ocorreu em 59% dos cães cujos valores de
polimorfonucleares superaram os 70% de celularidade, atingindo em alguns animais, mais
de 90% das células nucleadas totais. Ocorreu uma inversão da celularidade, já que o
predomínio de mononucleares foi substituído pelo de polimorfonucleares, especificamente
neutrófilos. De fato, na maioria das artrites sépticas, há prevalência de neutrófilos
segmentados (FISHER, 2003; NELSON; COUTO, 1994).
No que se refere à articulação EU, não ocorreram alterações significativas nos
constituintes celulares do LS quando comparados os M1 e M2. Ou seja, o predomínio de
mononucleares permaneceu em quase todos os momentos. Por outro lado, foram
constatadas mudanças na celularidade das articulações FT, comparando-se M1 com M2,
onde em 56% dos animais, a articulação FT inoculada apresentou inversão de celularidade
no M2 , com predomínio de neutrófilos sobre mononucleares, com valores que variaram de
55 a 86% o que pode ser confirmado no trabalho de Mcconkey et al., (2002), que
encontraram esta inversão no LS de um cão acometido pela Leishmaniose. Estes mesmos
autores observaram Leishmania sp. no interior de células mononucleares e em neutrófilos,
coincidindo com este trabalho, onde as formas amastigotas deste parasita.foram
identificadas no LS de 64% dos animais no M2, sendo observadas no interior de células
mononucleares pequenas ou grandes, e em poucos neutrófilos.
Em relação à análise citológica do LS para a pesquisa do parasita, a articulação FT
superou a EU quanto ao número de células parasitadas. Segundo Parry (1999), Leishmania
sp. tem sido demonstrada no interior de macrófagos no liquido sinovial de um pequeno
número de cães com leishmaniose visceral.
A diferença observada entre o encontro ou não do parasita nas articulações FT e EU,
observada aos trinta dias pós-inoculação, talvez possa ser explicada pela migração do
protozoário para tecidos circunvizinhos.
Em futuros trabalhos, é necessária uma avaliação histopatológica da cápsula articular,
para que os dados obtidos neste estudo possam ser confrontados com os achados
citológicos, a fim de se elucidarem as diferenças observadas entre as articulações FT e EU
no tocante à celeridade e gravidade da artrite encontrada.
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Anexos A – Modelo do Protocolo individual dos 14 cães usadas para avaliação clínica,
no estudo.
Nº
Nome
• Foto do animal
• Temperatura corporal (quadrados correspondem a 30 dias)
• Temperatura local
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Diminuída
2 – Normal
3 – Aumentada
• Aumento de volume articular
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Alterações inflamatórias na pele local
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
Obs:
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
• Crepitações
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Restrições de movimentos
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Exacerbação de movimentos
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Assimetria
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Atrofia muscular
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Claudicação
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Impotência funcional
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
• Dor
Escapuloumeral
Fêmoro-patelar
1 – Sim
2 – Não
Observações gerais
1________________________________________________________________________
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3________________________________________________________________________
4________________________________________________________________________
5________________________________________________________________________
6________________________________________________________________________
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30_______________________________________________________________________
DATA INÍCIO:
Exame fita EU Controle Fita FP Controle
LEU LEU
NIT NIT
URO URO
PRO PRO
PH PH
SAN SAN
DEN DEN
CET CET
BIL BIL
GLI GLI
T. M. T. M.
DATA FINAL:
Exame fita EU Controle Fita FP Controle
LEU LEU
NIT NIT
URO URO
PRO PRO
PH PH
SAN SAN
DEN DEN
CET CET
BIL BIL
GLI GLI
T. M. T. M.
Anexo B – Meio de cultura de manutenção de leishmania chagasi.
RPMI – 1640 (Sigma, USA)
10,39 g/l RPMI
2 g/l Bicarbonato de sódio
2,38 g/l Hepes
0,02 g/l Acido fólico
0,01 g/l Hemina
870 ml H2O Milliq
20 ml Urina
10ml Antibióticos (100 mg/ml Streptomicina, 100 UI/ml Penicilina).
10% Soro bovino fetal
pH 7,2
Filtrar em membrana de 0,2
Estocar a 4º C.
Anexo C
Tabela . Temperatura local observada na pele local da região de inoculação nas articulações
escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT) nos 14 cães naturalmente infectados
por Leishmania sp. e experimentalmente inoculados intra-articular por
Leishmania chagasi (Araçatuba – SP, 2006)
Dia Temperatura local
Articulação EU Articulação FT P
(1)
n % n %
7
Normal 11 78,6 10 71,4
0,8125
Aumentada 3 21,4 4 28,6
15
Normal 14 100,0 13 92,9
____
Aumentada 0 0,0 1 7,1
21
Diminuída 1 7,1 0 0,0
0,5000 Normal 13 92,9 13 92,9
Aumentada 0 0,0 1 7,1
30
Diminuída 2 14,3 2 14,3
____
Normal 12 85,7 12 85,7
(1)
teste de Wilcoxon
Anexo D
Tabela Valores de densidade do líqüido sinovial (média e desvio-padrão) obtidos das
articulações escapuloumeral (EU) e fêmoro-tibial (FT), inoculada e controle, em
diferentes momentos (M1 e M2) nos 14 cães naturalmente infectados por
Leishmania sp. e experimentalmente inoculados intra-articular por Leishmania
chagasi (Araçatuba – SP, 2006).
Articulação Grupo M1 M2
EU
Controle 1012,5 ± 7,3 aB 1016,1 ± 6,8 aA
Inoculado 1014,3 ± 5,5 aB 1018,2 ± 8,0 aA
FP
Controle 1015,4 ± 6,0 aB 1019,3 ± 7,3 bA
Inoculado 1015,0 ± 5,5 aB 1024,6 ± 7,5 aA
Para cada membro, médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P > 0,05).
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