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Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
1
CHRISTIAN EMERSON ROSAS JORQUERA
A INFLUÊNCIA DO DESAFIO COM O PARASITA SOBRE A
PATOLOGIA CARDÍACA DURANTE A FASE
CRÔNICA DA INFECÇÃO PELO T. cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo, para
a obtenção do título de Mestre em Ciências
(Imunologia).
SÃO PAULO
2009
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Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
2
CHRISTIAN EMERSON ROSAS JORQUERA
A INFLUÊNCIA DO DESAFIO COM O PARASITA SOBRE A
PATOLOGIA CARDÍACA DURANTE A FASE
CRÔNICA DA INFECÇÃO PELO T. cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo, para
a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. José Maria Álvarez Mosig
SÃO PAULO
2009
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Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
3
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunologia das
Parasitoses do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo com o auxílio financeiro do
FAPESP (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico),
projeto Número 06/50054-6.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
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7
Dedico esta dissertação
Aos meus Pais, Velimir e Mary, por
todo amor e apoio.
À “Mis Abuelos” queridos, Naldo e
Ruth, que desde sempre, sonharam os
meus sonhos.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. José Maria Álvarez Mosig (Pepe) pela oportunidade, confiança e principalmente
paciência. Sem dúvida foi muito gratificante tê-lo não só como orientador, mas como
educador e amigo.
À Profa. Maria Regina D’Império Lima pelas contribuições na realização deste trabalho e
pelas agradáveis aulas de imunologia durante o PAE.
Aos professores Karina Bastos, Maurício Rodrigues e Nancy Starobinas pelas relevantes
sugestões apresentadas no exame de qualificação, que em muito melhoraram este
trabalho.
Aos professores do Departamento de Imunologia ICB/USP que contribuíram para minha
formação.
Ao meu amigo Rogério Nascimento (técnico) pela presteza como técnico e pelas
agradáveis conversas durante os cafés que tornaram o convívio sempre muito agradável.
Ao amigo e colaborador Luiz Sardinha, obrigado por estar sempre disposto a ajudar e a
ensinar.
À enérgica amiga Meire (técnica), obrigado por toda ajuda com experimentos e
manutenção da ordem no laboratório, “arrumação”.
Às gentis amigas “Sandrinha” Muxel e “Claudinha” Zago, que sempre se dispuseram não
só a ouvir, como até a concordar com minhas “fantasiosas e loucas” teorias.
Rosas-Jorquera, C.E.
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Aos “chagásicos” André, Dani, Fernando, Luis Natividad, Ricardo e Alexandra que além
da do companheirismo contribuíram de maneira direta ou indireta com este projeto.
Aos “malariólogos” Henrique, Sheyla, Ana, Sergio, Dani e Raquel pelo convívio e auxílio
diário.
À sensível Profa. Adriana Pires e ao Prof. Cláudio Marinho por toda força inicial e
incentivo.
Aos doidos Edson, Celina, Alisson, Renato, Michelle e Murilo pela amizade verdadeira e
por sempre torcerem e acompanharem minha caminhada. O prazer é um dever.
À todos os amigos do Departamento de Imunologia, pelas animadas festas e ambiente
sempre muito agradável, em especial Vanessa e Rebecca.
Aos funcionários dos Biotérios de Camundongos Isogênicos do Departamento de
Imunologia pela manutenção e fornecimento dos camundongos.
À todo o pessoal da secretaria do Departamento Valéria, Amarildo, Eny, pela atenção e
paciência.
Ao pessoal da portaria do ICB IV (Milton e Otacílio) e a galera do audiovisual (Moisés,
Andres, Marcio) pelo tratamento respeitoso e auxílio durante todos esses anos de
convivência.
E a todos que de alguma maneira contribuíram para realização deste projeto.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Efeito do desafio do animal crônico com uma única dose de T. cruzi
Sylvio X10/4 na freqüência de subpopulações no
baço...........................................................................................................................47
Figura 2: Efeito do desafio do animal crônico com uma única dose de T. cruzi
Sylvio X10/4 no número total de células das subpopulações do
baço...........................................................................................................................48
Figura 3: Freqüência dos linfócitos IFNγ+ no baço..............................................49
Figura 4: Total dos linfócitos IFNγ+ no baço................................................ .......51
Figura 5: Efeito do desafio de camundongos crônicos com dose única de T.
cruzi Sylvio X10/4 na freqüência dos leucócitos CD4
+
, CD8
+
e B no
sangue.......................................................................................................................52
Figura 6: Efeito do desafio de camundongos crônicos com dose única de T.
cruzi Sylvio X10/4 na freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFNγ
+
no sangue.................................................................................................................54
Figura 7: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos 10 e 60 dias após
um único desafio com parasitas Sylvio X10/4.......................................................55
Figura 8: Análise do parasitismo subpatente no sangue de animais crônicos e
crônicos após desafio único com parasita homólogo.........................................56
Figura 9: Análise de parasitismo subpatente no coração de animais crônicos e
crônicos após desafio único com parasita homólogo.........................................57
Figura 10: Avaliação da patologia cardíaca de camundondos crônicos controle
e crônicos desafiados após desafio único com parasita
homólogo..................................................................................................................58
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A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
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Figura 11: Avaliação da patologia cardíaca, muscular e hepática de
camundondos crônicos controles e crônicos desafiados após desafio único
com parasita homólogo...........................................................................................58
Figura 12: Efeito do desafio sustentado na freqüência e no número total de
linfócitos no baço de animais crônicos.................................................................60
Figura 13: Efeito do desafio sustentado na freqüência e no número total de
linfócitos no baço de camundongos crônicos......................................................62
Figura14: Efeito do desafio sustentado na freqüência dos esplenócitos CD4
+
e
CD8
+
esplênicos produtores de IFNγ de camundongos crônicos......................63
Figura 15: Total de linfócitos IFNγ
+
no baço do animal crônico após desafio
sustentado...............................................................................................................64
Figura 16: Média da freqüência de linfócitos no sangue de animais crônicos
(machos) após desafio sustentado com parasita homólogo..............................65
Figura 17: Aumento da freqüência de linfócitos CD8
+
produtores de IFNγ no
sangue dos animais crônicos (machos) após desafio sustentado.....................65
Figura 18: Média da freqüência de linfócitos no sangue de animais crônicos
(fêmeas) após desafio sustentado com parasita homólogo................................66
Figura 19: Aumento da freqüência de linfócitos CD8
+
IFNγ
+
no sangue de
animais crônicos (fêmeas) após desafio sustentado com parasita
homólogo..................................................................................................................66
Figura 20: Aumento da freqüência de linfócitos em proliferação nos animais
crônicos após desafio sustentado com parasita homólogo...............................68
Figura 21: Aumento da freqüência de linfócitos em proliferação nos animais
crônicos após desafio sustentado com parasita homólogo...............................69
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
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Figura 22: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos machos e
fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4.............................70
Figura 23: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos
crônicos após desafio sustentado.........................................................................71
Figura 24: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos
crônicos após desafio sustentado.........................................................................72
Figura 25: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda), muscular e hepática
(direita) após desafio sustentado dos camundongos crônicos.........................73
Figura 26: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda), muscular e hepática
(direita) após desafio sustentado dos camundongos crônicos..........................74
Figura 27: Avaliação da patologia cardíaca no conjunto de machos e fêmeas
crônicos após desafio sustentado.........................................................................74
Figura 28: Freqüência de linfócitos em proliferação no animal crônico após
desafio sustentado..................................................................................................77
Figura 29: Freqüência de linfócitos em proliferação no animal crônico após
desafio sustentado..................................................................................................78
Figura 30: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos machos e
fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4.............................79
Figura 31: Análise através do ensaio CBA da produção de citocinas Th1 e Th2
de animais crônicos machos após desafio sustentado com parasitas Sylvio
X10/4..........................................................................................................................81
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
13
Figura 32: Análise através do ensaio CBA da produção de citocinas Th1 e
Th2 de animais crônicos fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio
X10/4.........................................................................................................................82
Figura 33: Análise através do ensaio de Elisa de captura da produção de IL-
10 por esplenócitos de animais crônicos machos e fêmeas após desafio
sustentado com parasitas Sylvio X10/4..................................................................83
Figura 34: Análise da produção do óxido nítrico pelos esplenócitos de
animais crônicos machos e fêmeas após desafio sustentado com parasitas
Sylvio X10/4...............................................................................................................84
Figura 35: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos
crônicos após desafio sustentado.........................................................................85
Figura 36: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos
crônicos após desafio sustentado.........................................................................86
Figura 37: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda) e do número de
ninhos no coração (direita) após desafio sustentado dos camundongos
crônicos....................................................................................................................87
Figura 38: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda) e do número de
ninhos no coração (direita) após desafio sustentado dos camundongos
crônicos....................................................................................................................87
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................22
A Doença de Chagas – Aspectos Gerais...............................................................23
1.1 A Patologia na doença de Chagas ....................................................................24
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
14
1.2 O sistema imune na infecção.............................................................................26
1.3 O sistema imune na geração de memória........................................................28
1.4 Terapia para a doença de Chagas crônica.......................................................29
2 OBJETIVO ..............................................................................................................33
2.1 Objetivo Principal...............................................................................................34
2.2 Objetivos Complementares...............................................................................34
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................35
3.1 Delineamento experimental...............................................................................36
3.2 Animais................................................................................................................37
3.3 Parasitas..............................................................................................................37
3.4 Meios de cultura e tampões...............................................................................37
3.5 Anticorpos e conjugados fluorescentes...........................................................37
3.6 Infecção e desafio único....................................................................................38
3.7 Infecção e desafio sustentado...........................................................................38
3.8 Isolamento de populações celulares do baço..................................................38
3.9 Isolamento de leucócitos do sangue................................................................39
3.10 Citometria de fluxo (FACS)..............................................................................39
3.11 Marcação Intracelular.......................................................................................40
3.12 Marcação de células esplênicas com carboxifluoresceína diacetato
succinimidil éster (CFSE)........................................................................................40
3.13 ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) Indireto..............................41
3.14 Determinação de citocinas através do kit CBA TH1/TH2)............................42
3.15 Determinação do nível de Óxido Nítrico (NO)................................................42
3.16 Avaliação da parasitemia na fase crônica.....................................................42
3.17 Exame Histopatológico....................................................................................43
3.18 Análise Estatística............................................................................................43
4 RESULTADOS........................................................................................................44
4.1 Experiência I: Efeito de um único desafio com parasita homólogo.............45
4.1.1 Aumento da resposta imune anti-T. cruzi do camundongo crônico após
um único desafio com o parasita homólogo.........................................................46
4.1.2 Produção de IFNγ por células do baço do camundongo crônico após um
único desafio com parasita homólogo...................................................................49
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
15
4.1.3 Aumento dos linfócitos CD4
+
e CD8
+
e das células produtoras de IFNγ no
sangue de camundongo crônico após um único desafio com T. cruzi
homólogo..................................................................................................................52
4.1.4 Avaliação da produção de anticorpos T. cruzi-específicos de animais
crônicos após desafio único...................................................................................54
4.1.5 A carga parasitária dos camundongos crônicos não diminui após um
único desafio com parasita homólogo...................................................................55
4.1.6 A patologia cardíaca de camundongos crônicos não é reduzida após
desafio único com parasita homólogo..................................................................57
4.2 Experiência II: Efeito do desafio sustentado com parasita homólogo I......59
4.2.1 Um aumento da resposta anti-T. cruzi é também obtida após desafio
sustentado com parasita homólogo......................................................................60
4.2.2 Aumento da produção de IFNγ por esplenócitos do animal crônico após
desafio sustentado com parasita homólogo........................................................62
4.2.3 Aumento da produção de IFNγ por células CD8
+
do sangue de animais
crônicos após desafio sustentado.........................................................................65
4.2.4 Aumento da capacidade proliferativa dos linfócitos T esplênicos
específicos de camundongos machos crônicos após desafio sustentado com
parasita homólogo...................................................................................................67
4.2.5 Aumento da produção de anticorpos T. cruzi-especificos nos animais
crônicos após desafio sustentado.........................................................................70
4.5.6 Redução da carga parasitária no sangue do camundongo crônico após
desafio sustentado...................................................................................................71
4.2.7 A patologia cardíaca dos camundongos crônicos é reduzida após desafio
sustentado................................................................................................................72
4.3 Experiência III: Efeito do desafio sustentado com parasita homólogo II.....76
4.3.1 Aumento da capacidade proliferativa específica das células CD4
+
de
animais crônicos após desafio sustentado com parasita homólogo.................77
4.3.2 Produção de anticorpos T. cruzi- específicos nos animais crônicos após
desafio sustentado...................................................................................................79
4.3.3 Produção de citocinas in vitro de camundongos crônicos após desafio
sustentado................................................................................................................80
4.3.4 Análise da produção de óxido nítrico in vitro de animais crônicos após
desafio sustentado...................................................................................................84
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
16
4.3.5 Aumento da carga parasitária sangüínea nos animais crônicos
desafiados de modo sustentado.............................................................................85
4.3.6 A patologia cardíaca não é reduzida em animais crônicos após desafio
sustentado................................................................................................................86
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................89
6. CONCLUSÕES......................................................................................................97
6.1 Desafio Único......................................................................................................98
6.2 Desafio Sustentado I e II....................................................................................98
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................100
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
17
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA – Albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin)
CD- Grupos de diferenciação (Cluster of differentiation)
CFSE- (Carboxifluorescein Diacetate Succinimidil Ester)
CTLA-4- Antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos (cytotoxic T lymphocyte-
associated antigen 4)
Cy- (Cy-chrome)
ELISA- Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunoabsorbent assay)
FACS- Ensaio de citometria de fluxo (Fluorescence-activated cell sorter)
FITC- Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
Foxp3 – Fator de transcrição da família “forhead” (forkhead box p3)
FSC- Parâmetro de tamanho (Forward scatter)
IL – Interleucina (interleukin)
i.p – Intraperitoneal
i.v - Intravenoso
IFN-γ- Interferon gama
Ig- Imunoglobulina
Mab – Anticorpo monoclonal (monoclonal antibody)
MACS- (Magnetic cell sorting)
ME- Mercaptoetanol
PBS- Salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered saline)
PE- Ficoeritrina (Phycoerythrin)
RPMI- Meio McCoy de cultura modificado
SBF- Soro fetal bovino (Fetal calf serum)
SCID – Imunodeficiência combinada severa (Severe Combined Immunodeficiency)
TCR – Receptor de linfócitos T (T cell receptor)
TGF– Fator indutor de crescimento (Transforming growth factor)
Th- Linfócito T auxiliador (Lymphocyte T helper)
TNF- Fator de necrose tumoral (tumour necrosis factor)
T
reg
– Células Treguladoras (regulatory T cell)
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
18
RESUMO
Rosas-Jorquera CE. A influência do desafio com o parasita sobre a patologia
cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi [dissertação (Mestrado em
Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo; 2009.
A doença de Chagas, moléstia causada pelo protozoário Trypanosoma
cruzi, resulta freqüentemente em um quadro de miocardite crônica que pode levar à
morte do paciente. As causas que determinam a afetação cardíaca não estão
totalmente esclarecidas, mas resultados recentes sugerem seja devido à reação
imune aos parasitas que persistem no coração. Camundongos C3H/HePAS
infectados pelo T. cruzi da cepa Sylvio-X10/4 apresentam, na fase crônica, lesões no
tecido cardíaco com infiltrados inflamatórios e raros ninhos de amastigotas.
Utilizando este modelo experimental, o presente trabalho tem analisado o impacto
sobre a miocardite do desafio do animal crônico com parasita homólogo vivo. A
nossa hipótese de trabalho é que o desafio poderia aumentar a ação efetora do
sistema imune frente ao T. cruzi, resultando em redução da carga parasitária
sistêmica e local, e, em longo prazo, na diminuição da patologia. Inicialmente
verificamos que no décimo dia após o desafio do camundongo crônico com uma
dose única do parasita observa-se um aumento no número de linfócitos CD4
+
e
CD8
+
no baço e sangue, e um aumento na produção espontânea ou induzida por
anti-CD3/CD28 de IFN (P<0.05). No entanto, aos sessenta dias do desafio, estes
parâmetros tornam-se semelhantes aos dos animais crônicos não desafiados.
Quando avaliadas a capacidade de um único desafio em reduzir a carga parasitária
no sangue e diminuir a patologia, os resultados esperados em função ao aumento
da resposta imune não se concretizaram. Assim, no grupo desafiado, o parasitismo
no sangue não se reduziu e a patologia permaneceu com grau elevado de infiltrados
inflamatórios. Em uma segunda etapa, persistindo no nosso objetivo de reduzir a
patologia, procuramos manter otimizada a resposta anti-T. cruzi por um período
prolongado. Para isso, grupos de camundongos C3H/HePAS crônicos, machos e
fêmeas, foram desafiados com quatro doses de tripomastigotas com intervalos de
três semanas. Duas experiências foram realizadas. Nossos resultados mostram que
após o último desafio, ocorrem aumentos no número de linfócitos CD4
+
produtores
de IFNγ e na resposta proliferativa destas células a antígeno de T. cruzi, além de um
aumento da secreção de IgG1 parasita-específica. O desafio sustentado também
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
19
resulta em aumento das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 e da produção de óxido nítrico.
Com relação à carga parasitaria dos grupos desafiados, houve uma pequena
redução desta na primeira experiência e um discreto aumento na segunda. Em
correspondência direta com os resultados de parasitismo, a análise histopatológica
mostrou que o desafio foi capaz de reduzir a patologia cardíaca na primeira
experiência, enquanto que na segunda determinou um discreto aumento. Nossos
dados mostram que o nosso protocolo de desafio sustentado não permite reduzir em
forma consistente a patologia cardíaca dos animais crônicos. Os motivos que podem
ter determinado tal fato são discutidos.
Palavras Chaves: Doença de Chagas. Trypanosoma cruzi. Patologia cardíaca.
Linfócito T CD8
+
. Linfócito T CD4
+
.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
20
ABSTRACT
Rosas-Jorquera CE The influence of the challenge with the parasite in the heart
pathology during the chronic stage of T. cruzi infection [dissertação (Mestrado em
Imunologia)] São Paulo : Instituto de Ciências Biomédicas da Univesidade de São
Paulo; 2009.
Chagas' disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and
often results in chronic myocarditis, which can lead the patient to the death. The
causes that determine damages on heart tissue are not fully clarified, but recent
reports suggest it is due to the host immune reaction to the parasites that persist in
the heart. C3H/HePAS mice infected with T. cruzi strain of the Sylvio-X10/4 clone
present, in the chronic phase, lesions in the cardiac tissue with inflammatory
infiltrates and rare nests of amastigote forms. Using this experimental model, the
present work examined the impact of the challenge with homologous alive parasites
on myocarditis presented by chronic mice. Our working hypothesis was that the
challenge could increase the action of the effector immune system against T. cruzi,
resulting in a reduction of systemic and local parasitism, and at a long term, in the
reduction of the pathology. Initially, we noted that at the tenth day after the chronic
challenge with a single dose of the protozoan, there was an increase in the number
of CD4
+
and CD8
+
lymphocytes in the spleen and the blood, and an increase in the
spontaneous or CD3/CD28-induced production of IFN- (p<0.05). However, at the
sixtieth day after the challenge, these parameters became similar to those seen on
unchallenged chronic mice. When we evaluated the capacity of a single challenge to
reduce the parasite load in the blood and to diminish the cardiac pathology, the
expected results due to the increased immune response did not occur. Thus, in the
challenged group the parasitism in the blood was not reduced and the pathology
remained presenting high degree of inflammatory infiltrates. In the second stage, we
continued focusing on our objective of reducing the illness, trying to maintain
optimized the anti-T. cruzi immune response for a prolonged period. For this, groups
of both male and female chronic C3H/HePAS mice were challenged with four doses
of trypomastigotes with intervals of three weeks each. Two experiments were
performed. Our results showed that after the last challenge, there were increases in
a) the number of CD4
+
IFN-γ-producing lymphocytes, b) in the proliferative response
of these T. cruzi specific T cells and c) in the parasite-specific IgG1 release. The
sustained challenge also resulted in the increase of the production of the cytokines
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
21
IL-4, IL-5 and IL-10 and of nitric oxide. With regard to the parasite load in challenged
groups, there was a small reduction in the first experiment and a slight increase in the
second. In direct correlation with the outcome of the parasitism, the histopathological
analysis reveled that the challenge was able to reduce the heart disease in the first
experiment, while in the second one it caused a slight increase. Our data show that
the sustained challenge protocol does not allow, in a consistent way, the reduction of
the heart disease in the chronic animals. The reasons that may have determined this
fact are discussed.
Key-words: Chagas disease. Trypanosoma cruzi. Heart pathology. CD8 T
lymphocyte. CD4 T lymphocyte.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
22
1 INTRODUÇÃO
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
23
1.1 A Doença de Chagas – Aspectos Gerais
A Doença de Chagas, originalmente descrita em 1909 pelo cientista
brasileiro Carlos Chagas, é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi,
que é endêmico do continente americano. Segundo a Organização Mundial de
Saúde (W.H.O.) [1], 9-12 milhões de pessoas estão infectadas com o protozoário. O
principal problema de saúde pública que resulta da Doença de Chagas é a
cardiopatia chagásica, que sendo originalmente uma forma comum de cardiopatia na
população rural, propagou-se para as cidades com o aumento da migração urbana
[2, 3].
A principal forma de transmissão da doença ocorre através da
penetração das formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos), presentes nas
fezes do inseto vetor. Outras formas de transmissão, no entanto, podem ocorrer, e
entre elas, transfusão sanguínea, transmissão congênita, ingestão de alimentos
contaminados e acidentes de laboratório [4].
O ciclo de transmissão doméstico do T. cruzi inicia-se no momento que o
triatomídeo infectado suga o sangue do hospedeiro e deposita suas fezes na pele
lesada ou na mucosa. Os tripomastigotas metacíclicos presentes invadem diferentes
tipos celulares e se transformam na forma amastigota. As formas intracelulares se
multiplicam por divisão binária simples, diferenciam-se em tripomastigotas e, após
rompimento da célula hospedeira, infectam células adjacentes ou ganham a corrente
sanguínea invadindo tecidos distantes.
A infecção humana pelo T. cruzi freqüentemente apresenta uma fase
aguda que se estende por volta de 50 dias e se caracteriza por um elevado número
de parasitas no sangue e nos tecidos. Na maioria dos casos e coincidindo com o fim
da fase aguda, a parasitemia é reduzida, mas não erradicada pela resposta imune.
O paciente evolui para a fase indeterminada ou assintomática da doença que pode
persistir por muitos anos e até por toda a vida. Cerca de 30% dos indivíduos
infectados, entretanto, desenvolvem a fase crônica caracterizada pela manifestação
de quadros patológicos como esofagopatia, colonopatia ou a cardiomiopatia, que
pode conduzir à morte.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
24
1.2 A Patologia na doença de Chagas
Finalizada a fase aguda, os parasitas só podem ser detectados por
xenodiagnóstico, hemocultura e amplificação enzimática do DNA do parasito [5, 6].
Na fase indeterminada da doença de Chagas, o indivíduo não apresenta
nenhum tipo de manifestação clínica, mas naqueles que desenvolvem os sintomas
crônicos da doença após 10-20 anos [2], uma redução da expectativa de vida de
nove anos em média é observada [3].
A destruição do miocárdio é característica fundamental da forma clínica
cardíaca da doença de Chagas crônica, e parece ser o resultado de uma reação
inflamatória local [7] que irá se somar à destruição direta causada pelo parasita das
fibras musculares cardíacas.
Existem discrepâncias sobre a natureza da reação inflamatória cardíaca,
sendo que a resposta auto-imune e a reação aos parasitas que persistem no
coração constituem as hipóteses mais cogitadas para explicá-la [2]. O desequilíbrio
da inervação autônoma do coração pode estar também envolvido no déficit funcional
cardíaco. Uma disfunção da inervação autonômica do coração pode resultar de
diferentes processos patológicos, tais como parasitismo direto de neurônios,
degeneração causada pela inflamação periganglionar e reação auto-imune
antineural [8, 9]. Além disso, uma miocardite intensa com fibrose pode conduzir a
interrupção da inervação autônoma, levando diretamente a arritmia, disfunção
cardíaca e eventualmente à morte [10].
Na visão autoimune [7, 11-13], a patologia cardíaca crônica é o resultado da
ação de anticorpos ou linfócitos T auto-reativos que sofreriam uma quebra do seu
estado de tolerância como resultado de uma reação cruzada entre os antígenos
próprios e os do parasita. Anticorpos de reação cruzada entre T. cruzi e a proteína P
ribossomal, ou o receptor adrenérgico tem sido detectados em pacientes com
Chagas na fase indeterminada da doença [14]. A reatividade cruzada é também
observada em pacientes com cardiomiopatia onde clones de linfócitos T CD4
+
derivados de biopsias do endocárdio reconhecem tanto a proteína B13 do T cruzi
como a miosina cardíaca [15, 16]. Em estudos que avaliam se a magnitude da auto-
imunidade é diretamente proporcional ao dano tecidual causado pelo parasita,
observou-se uma ligação direta entre os níveis de T. cruzi e a presença do quadro
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
25
auto-reativo, sugerindo que, a eliminação do parasita pode conduzir à redução ou
eliminação da auto-imunidade na fase crônica da infecção [17].
Por outro lado, com a hipótese da reatividade aos parasitas que persistem
no tecido, Zhang e Tarleton [18] propuseram que clones linfocitários parasita-
específicos, ao agirem sobre os parasitas remanescentes no coração, causariam as
lesões características da patologia chagásica [18]. A base experimental para esta
hipótese foi propiciada pelo aumento da sensibilidade das técnicas para a detecção
do T. cruzi como imunohistoquímica e PCR. Este avanço tecnológico permitiu
constatar que a incidência de patologia cardíaca [19, 20], ou digestiva [21], no
hospedeiro crônico, correlaciona-se com a presença de DNA ou antígeno do parasita
no próprio local da lesão. Mais ainda, através de um estudo mostrando a
persistência de amastigotas íntegros em 22 das 26 biópsias endomiocárdicas de
pacientes crônicos, confirmou-se que a patologia correlaciona-se com a presença de
T. cruzi vivo [22]. Marinho et al., utilizando camundongos crônicos infectados por
parasitas da cepa Sylvio X10/4, mostraram que o desenvolvimento de patologia
cardíaca correlaciona com a presença de ninhos ou culturas LIT positivas neste
órgão [23]. Por outro lado, estes mesmos autores observaram que na infecção por
parasitas da cepa Y, a patologia do animal crônico reflete a carga parasitária na fase
aguda, uma vez que camundongos infectados com alto inóculo de T. cruzi
mostravam na fase crônica uma parasitemia residual, e infiltrado no coração mais
intensos do que os animais infectados com inóculo cem vezes menor [24].
Desta forma, o conjunto dos trabalhos mais recentes, sem descartar a
participação de um componente auto-imune, focaliza o desenvolvimento da
patologia chagásica na permanência do parasita. Neste contexto, os elementos do
hospedeiro que influenciam no tamanho da carga parasitária local teriam papel
decisivo. Assim, diferenças individuais na eficiência da resposta imune em destruir o
T. cruzi deixariam níveis de parasitismo residual diferentes. Neste sentido, a
intensidade e a qualidade da resposta imune correlacionariam em forma inversa com
a intensidade da lesão. Entretanto, não devemos esquecer que na óptica de uma
patologia causada pela persistência local do parasita, o sistema imune passa a ter
um papel duplo na indução da patologia, uma vez que os mesmos clones estariam
envolvidos no controle local do T. cruzi e no desenvolvimento das lesões. Por outro
lado, levando em consideração a natureza inflamatória das lesões chagásicas
crônicas, é provável que diferenças individuais na regulação dos mecanismos
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
26
efetores do sistema imune sejam cruciais para estabelecer o ponto de equilíbrio
entre atividade inflamatória e carga parasitária.
Na fase crônica da infecção o hospedeiro mantém altos níveis de
ativação do seu sistema imune, o que garante o controle não estéril do T. cruzi. No
entanto, estudos do nosso laboratório mostraram que, a despeito deste alto nível de
ativação, o sistema imune do hospedeiro crônico não está totalmente otimizado na
sua atividade antiparasita. Isto foi concluído ao observarmos que a re-estimulação
de camundongos crônicos com parasita vivo ou antígeno de T. cruzi resulta em
aumento do título de anticorpos séricos parasita-específicos, aumento da
capacidade de produzir IFN- no baço e, o que é mais importante, redução
significativa nos níveis de parasitemia subpatente dos animais re-estimulados [25].
Já em relação às complicações digestivas da doença, que se
manifestam pela dilatação do cólon ou esôfago, existe um relativo consenso em
relação à sua etiopatogenia, acreditando-se que sejam conseqüência de um
processo de denervação por perda de células ganglionares dos plexos que inervam
estes órgãos do sistema digestivo [26, 27].
1.3 O sistema imune na infecção
O modelo murino da doença de Chagas tem contribuído para a
elucidação dos fenômenos imunológicos envolvidos na infecção pelo T. cruzi, uma
vez que muitos de seus aspectos podem ser diretamente correlacionados com a
doença em humanos. A infecção experimental demonstrou que um eficiente controle
da carga parasitária e a sobrevida do hospedeiro são dependentes de uma resposta
imune inata com ativação de macrófagos e células Natural Killer (NK), e da indução
de uma resposta imune adquirida mediada por células T, CD4
+
e CD8
+
, e produção
de anticorpos.
A ativação de macrófagos por citocinas parece ser fundamental no
controle do parasita. Golden e Tarleton (1991) mostraram que o tratamento in vitro
de macrófagos com IFN- resulta em um aumento da morte de amastigotas
intracelulares [28]. Mais ainda, animais que carecem de imunidade adquirida, tais
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
27
como os camundongos RAG-KO, são capazes de reduzir a proliferação do parasita
através da produção de IL-12 e IFN- [29]. A proteção imune contra parasitos
intracelulares como o T. cruzi parece ser dependente da produção de óxido nítrico
(NO). No inicio da infecção, células NK produzem IFN- [30] e direcionam um
mecanismo microbicida frente ao T. cruzi, ao induzir a síntese de NO nas células da
estirpe macrofágica. Assim como o IFN-, o TNF-α também é capaz de induzir a
ativação de macrófagos [31], enquanto que o TGF-β [32] e a IL-10 inibem esta
ativação [33].
Após ativação da resposta imune específica, linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
ativam vários mecanismos efetores frente ao T. cruzi (revisto por Abrahamsohn,
1998, [34]). Desta forma, as citocinas secretadas pelos linfócitos T CD4
+
com padrão
de diferenciação funcional Th1 atuariam ativando mecanismos protetores, o que foi
elegantemente demonstrado por Kumar e Tarleton (2001) através de experimentos
de transferência de clones Th1 [35]. Além da produção de IFN, a ação dos linfócitos
T CD4
+
inclui o auxilio aos linfócitos B na produção de anticorpos específicos, os
quais têm um papel fundamental na eliminação dos parasitas extracelulares. No
modelo murino, os anticorpos IgG anti-T. cruzi predominantes são das subclasses
IgG2a [36, 37] e IgG2b [38], que conferem proteção no sangue e tecidos ao
propiciarem a remoção dos tripomastigotas por células fagocitárias, como
polimorfonucleares, macrófagos e outras células do sistema fagocítico mononuclear,
que expressam receptores para a porção Fc de IgG [39, 40]. Além dos linfócitos T
CD4
+
, os linfócitos T CD8
+
apresentam importante função no controle da infecção
por T. cruzi. Estes linfócitos reconhecem peptídeos do parasita apresentados em
moléculas de MHC de classe I e são capazes de causar a morte da célula infectada
por citotoxicidade. Além disto, as células T CD8
+
também secretam IFN- que irá
ativar os macrófagos e potencializar sua atividade microbicida, assim como
quimiocinas. Em 1995, Rottenberg mostrou a importância dos linfócitos CD4
+
e CD8
+
em experimentos utilizando animais nocautes [41]. Nos resultados foi concluído que
camundongos deficientes de linfócitos CD4
+
são incapazes de controlar o parasito
no coração. Neste trabalho, o não envolvimento das células CD8
+
foi explicado pela
baixa expressão das moléculas de MHC-I pelos cardiomiócitos [42]. Contudo,
resultados opostos foram publicados por Zhang e Tarleton mostrando que na fase
crônica da doença as células cardíacas têm aumento na expressão das moléculas
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
28
do MHC, de maneira que as células CD8
+
poderiam estar atuando neste local [43].
Neste mesmo trabalho, assim como em outros realizados em humanos ou com
modelo murino, os autores verificaram a presença dos linfócitos T CD8
+
no tecido
cardíaco lesionado.
1.4 O sistema imune na geração de memória
A memória imunológica é a capacidade do sistema imune de responder
mais rápido e efetivamente aos patógenos que foram encontrados previamente, e
em parte reflete a pré-existência de uma população expandida de clones de
linfócitos T e B antígeno-específicos. A memória é mantida por linfócitos de vida
longa induzidos durante a resposta primária e que persistem num estado de repouso
até um segundo encontro com o antígeno. A manutenção das células de memória é
favorecida pela persistência do patógeno em pequenas quantidades, suficientes
para induzir um nível baixo de re-estimulação às células ativadas [44]. Na doença de
Chagas, entretanto, o fato do parasito persistir em níveis baixos nas fases
indeterminada e crônica sugere que a maior parte dos clones T parasito-específicos
deve persistir como células efetoras e células de memória efetora e não como
células de memória central [45, 46]. Contudo, nas infecções, o processo inflamatório
inicial resulta em alta proliferação de linfócitos, enquanto que, numa fase mais tardia
e sob condições que limitam o estimulo antigênico, há redução no número de células
ativadas ou de memória [47-49].
Estudos recentes indicam que os eventos envolvidos durante o estágio
inicial da infecção, incluindo a disponibilidade do antígeno, o estímulo inflamatório,
moléculas co-estimuladoras, linfócitos T CD4
+
e a secreção de citocinas têm efeitos
na quantidade e qualidade das células T de memória [49-51]. Shaula e Krishna,
utilizando um modelo em que combinaram a influência do antígeno e inflamação,
demonstraram por transferência adotiva que exposições simultâneas e sustentadas
de antígeno, somadas ao processo inflamatório, contribuem para uma expansão das
células T CD8
+
, assim como para alta diferenciação de memória [52].
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
29
A memória na doença de Chagas foi evidenciada na fase crônica da
doença pelos altos índices de células CD8
+
esplênicas que apresentam em sua
superfície alta expressão de moléculas CD44 (molécula de adesão – “homing”) e
CD11a (LFA-1 – molécula de adesão ao endotélio; família das integrinas). Nesta
fase da infecção, as células CD8
+
mostram-se capazes de produzir IFN em
resposta ao antígeno de T. cruzi, e mantêm conservadas as propriedades citolíticas
[46], bem como a sua capacidade protetora. Assim, a atividade citotóxica das
células CD8
+
específicas para células infectadas ou pulsadas com peptídeos de T.
cruzi tem sido evidenciada em humanos e murinos infectados [53, 54]. No entanto,
Leawey e Tarleton mostraram que células T CD8
+
de memória isoladas do músculo
de animais crônicos, têm atividade citotóxica e produção de IFN reduzidas [55].
Mais tarde Martin et al. publicariam que o TGF- não contribui para o estado não
respondedor (disfuncional) das células CD8
+
no tecido [56].
Modular aumentando a resposta imune frente ao T. cruzi se torna
interessante quando o objetivo é aumentar o “pool” das células parasita-específicas,
na tentativa em longo prazo de diminuir o processo inflamatório cardíaco como
resultado direto da redução da carga parasitária no órgão e/ou da parasitemia.
Entender os fatores que contribuem para uma geração otimizada de células
efetoras/memória é importante para o desenvolvimento de melhores vacinas e
estratégias terapêuticas anti-T. cruzi.
1.5 Terapia para a doença de Chagas crônica
Atualmente não há tratamento curativo para a doença de Chagas
crônica. Drogas tripanocidas como o benzonidazol (Rochagan) ou o nifutimox
(Lampit) são indicados na fase aguda da infecção e quando a reativação da fase
crônica ocorre durante condições imunossupressoras. Por outro lado, apesar da
maioria dos estudos revelarem uma baixa eficiência destes fármacos durante a
terapia de pacientes crônicos, avaliações mais recentes preconizam o tratamento na
tentativa de conter a evolução progressiva da doença crônica. Contudo, o uso
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
30
destes fármacos ainda é restrito e inadequado uma vez que possuem sérios efeitos
colaterais, baixo efeito na fase crônica da doença e mais ainda, ação limitada sobre
cepas/populações de parasitos resistentes [57, 58].
Considerando os dados acima e o fato de que tratamentos com
fármacos (benzonidazol e nifutimox) são ineficientes em eliminar o parasita do
hospedeiro que está progredindo para a doença cardíaca, vêm sendo desenvolvidas
terapias para o tratamento de pacientes cronicamente infectados.
Proteínas recombinantes associadas a motivos CpG estão sendo
fortemente aplicadas como ótimos adjuvantes na geração de novas vacinas, embora
o seu mecanismo de ação não tenha sido totalmente elucidado. Recentemente,
utilizando camundongos deficientes em IFN, foi mostrado que esta citocina tem um
papel crítico na atividade adjuvante do CpG, e conseqüentemente na indução das
moléculas co-estimuladoras CD40 e CD86 [59]. Em 2007, Holf et al. mostraram que
a administração intranasal da combinação antígeno de TS (trans-sialidase de T.
cruzi) recombinante solúvel com oligodeoxynucleotideo CpG pode induzir imunidade
de mucosa e sistêmica de camundongos, além de que a hiper-imunização por
repetidos desafios com TS também pode gerar uma imunidade protetora por
linfócitos T CD4
+
e CD8
+
específicos nas fases, aguda e crônica da infecção [60].
Semelhantemente, camundongos ICR infectados com T. cruzi foram
tratados 5 e 12 dias após a infecção com vacinas de DNA que codificam antígenos
de T. cruzi, tais como ASP-2, TS, TSA-1, Tc52 e Tc24. O tratamento com DNA de
ASP-2 não reduziu a carga parasitaria, contudo o tratamento com DNA de Tc52
reduziu significativamente a parasitemia e a carga parasitária cardíaca embora não
tenha reduzido a miocardite. Finalmente, os DNAs de Tc24 e TSA-1 se mostraram
melhores candidatas à vacinas por controlarem a parasitemia, a carga parasitária do
coração e a miocardite chagásica [61].
Em um outro protocolo de vacinação, a imunidade protetora ocasionada
principalmente por linfócitos T CD8
+
foi observada em camundongos da linhagem
A/Sn, suscetíveis a infecção pelo Trypanosoma cruzi, quando vacinados com a
proteína de fusão GST representando aminoácidos de ASP-2 (proteína da superfície
de amastigotas) somados a presença dos adjuvantes alúmem e CpG [62].
Também utilizados como bons candidatos a vacinas, os adenovírus
recombinantes que expressam seqüências específicas de antígenos TS e ASP-2 de
T. cruzi foram capazes de induzir, 14 semanas após a última imunização, altos
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
31
níveis de anticorpos específicos, polarização dos linfócitos CD4
+
para uma resposta
TH1, assim como acionar uma resposta imune mediada por linfócitos CD8
+
, sendo
que os camundongos imunizados mostraram uma importante proteção após infecção
pelo T. cruzi [63].
As vacinas na doença de Chagas poderiam ser preventivas, para evitar
que o indivíduo se infecte, ou terapêuticas, para impedir a progressão da doença
nos indivíduos infectados. Considerando a segunda possibilidade, diversas
abordagens podem ser utilizadas para aumentar a atividade efetora frente ao
parasita, tais como vacinas constituídas por proteínas predominantes do T. cruzi e
vacinas de DNA recombinante que codificam algumas destas proteínas, parasita
integro vivo, morto ou inativado. Uma vez que tanto os anticorpos como as células
CD4
+
e CD8
+
parasita-específicas participam no controle do T. cruzi, a escolha da
vacina deve considerar qual ferramenta(s) do sistema imune, a vacina visa
potencializar.
Como citado anteriormente, em nosso laboratório temos realizado
experiências para avaliar se o desafio com o parasito homólogo seria capaz de ativar
a resposta imune do camundongo crônico. Nestas experiências, que utilizaram
animais A/J infectados por T. cruzi da cepa Y, constatou-se, uma semana após o
desafio, um aumento das populações CD4
+
e CD8
+
esplênicas, aumento dos
anticorpos específicos no soro e aumento da produção de citocinas pelos
esplenócitos. Mais importante, constatou-se que os animais desafiados mostravam
uma redução da carga parasitária sistêmica em relação aos animais crônicos
controle [25]. Não foi possível estudarmos nesse modelo o impacto do desafio sobre
a patologia cardíaca, uma vez que na infecção pelo T. cruzi da cepa Y a patologia
cardíaca de fase crônica é praticamente inexistente.
Consideramos que os efeitos do desafio com T. cruzi homólogo
deveriam ser avaliados em um modelo experimental que apresentasse patologia
cardíaca intensa na fase crônica da infecção. Utilizando um modelo com estas
características, poderíamos estimar o impacto de uma re-estimulação da resposta
específica do animal crônico sobre a carga parasitária e a patologia cardíaca.
Para as experiências de desafio partimos da hipótese da patologia
cardíaca crônica decorrer da reatividade aos parasitas que persistem no local. Caso
esta hipótese esteja correta, o aumento da resposta imune após-desafio poderá
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
32
eventualmente resultar na redução da carga parasitária no coração, e esta
diminuição, poderá secundariamente se traduzir em queda da infiltração inflamatória
e redução da patologia tissular.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
33
2 OBJETIVO
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
34
2.1 Objetivo Principal:
Avaliar se a evolução da patologia cardíaca no animal cronicamente
infectado pelo T. cruzi pode ser alterada mediante uma re-estimulação específica da
resposta imune.
2.2 Objetivo Complementar:
Confirmar no modelo de infecção crônica de camundongos C3H/HePAS
por parasitas Sylvio X10/4, se o desafio com parasita homólogo resulta no aumento
da atividade efetora sistêmica frente ao T. cruzi, e se determina uma redução da
carga parasitária sistêmica e local.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
36
3.1 Delineamento experimental
Camundongos C3H/HePAS foram infectados com 10
5
ou 10
6
tripomastigotas do Trypanosoma cruzi cepa Sylvio-X10/4, obtidos em culturas
celulares LLCMK2 e contendo menos de 20% de amastigotas. Neste modelo
experimental a infecção cursa sem parasitemia, mas determina altos índices de
patologia cardíaca em fase tardia da infecção [23].
Aproximadamente 120 dias depois da infecção, e após confirmação de
que os animais apresentavam patologia cardíaca, a metade dos camundongos foi
inoculada com uma ou quatro doses de 5x10
6
de T. cruzi homólogos (vivos) por
animal, caracterizando o grupo desafio. A outra metade dos camundongos não
recebeu tratamento algum e constituiu o grupo controle.
Nos diferentes tempos após o desafio (nos dias 10 e 60 pós-desafio, na
experiência de inoculação com uma única dose de T. cruzi, e nos dias 35 e 45 ou,
55 e 68 dias pós-desafio, nas experiências I e II de inoculação com quatro doses de
T. cruzi), os camundongos dos grupos crônicos controles e grupos crônicos
desafiados foram sacrificados e analisados com relação a:
a) parâmetros imunológicos: celularidade diferencial (CD4
+
, CD8
+
e B220
+
)
do sangue e baço estimada através de citometria de fluxo (FACs); produção
do IFNγ intracelular por células CD4
+
e CD8
+
do baço e sangue; proliferação
antígeno-específico das células CD4
+
e CD8
+
do baço; reconhecimento
específico por anticorpos IgG1 e IgG2a; produção de citocinas TH1 (IL-2;
IFNγ; TNFα) e TH2 (IL-4; IL-5, IL-10); dosagem do óxido nítrico (NO).
b) nível da carga parasitária subpatente: estimado por culturas do sangue e
coração em meio LIT;
c) avaliação da patologia cardíaca: Através de exame histopatológico de
lâminas coradas com hematoxilina-eosina.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
37
3.2 Animais
Camundongos machos e fêmeas da linhagem isogênica C3H/HePAS,
com 6 a 8 semanas de vida, foram obtidas do Biotério de Camundongos Isogênicos
do Departamento de Imunologia do ICB/USP.
3.3 Parasitas
A cepa Sylvio (clone X10/4) de Trypanosoma cruzi foi originalmente
obtida na Escola Paulista de Medicina (UNIFESP) e os parasitas mantidos por
passagens semanais em monocamadas de células LLC-MK2 (American Type
Culture Collection - ATCC - CCL7.1).
3.4 Meios de cultura e tampões
Para o cultivo de células foi utilizado meio de cultura RPMI 1640 (Gibco)
contendo 10 mM de HEPES (Gibco), 0,05 mM de 2-Mercaptoetanol (Gibco), 2 mM
de L-glutamina (Gibco), 2 mM de piruvato (Sigma), 100 µg/mL de
penicilina/estreptomicina (Gibco) e 5% de FCS (Gibco). Para o cultivo de LLC-MK2,
foi utilizado meio RPMI 1640 com 3% de FCS.
Para o processamento de células nos ensaios de citometria de fluxo foi
usado PBS (tampão salino fosfatado, pH 7,2), suplementado com 1% de BSA (soro
albumina bovina; (Sigma) e 0,05% de azida sódica (Sigma).
3.5 Anticorpos e conjugados fluorescentes
Foram utilizados nos experimentos os seguintes anticorpos dos
respectivos clones conjugados a FITC (fluoresceína), PE (ficoeritrina) ou Cy-
Chrome, obtidos da companhia Pharmingem (San Diego, USA): anti-CD4 (H129.19),
anti-CD8α (53-6.7), anti-CD45R/B220 (clones RA3-6B2) e anti-IFN.
3.6 Infecção e desafio único
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
38
Camundongos fêmeas C3H/HePAS foram infectados i.p. com 10
6
parasitas. Posteriormente, a metade dos camundongos foi desafiada uma única vez
i.v. com 5x10
6
/animal durante a fase crônica da doença, no dia 120 pós-infecção. No
décimo dia após o desafio parte dos camundongos controles e parte dos
camundongos desafiados foram sangrados e sacrificados. Sessenta dias após o
desafio o restante dos camundongos foi igualmente sangrado e sacrificado.
3.7 Infecção e desafio sustentado
Camundongos machos e fêmeas C3H/HePAS foram infectados i.p. com
10
5
parasitas. Posteriormente, parte dos camundongos foi desafiado durante a fase
crônica da doença por quatro vezes (2 i.v. e 2 i.p.) com 5x10
6
parasitas/animal, do
dia 120 ao 150 pós-infecção. Para o grupo dos machos, os camundongos controles
e camundongos desafiados foram sangrados e sacrificados 35 (Experimento I) ou 55
(Experimento II) dias após a última dose do desafio. Para o grupo das fêmeas, os
camundongos foram sangrados e sacrificados 45 (Experimento I) ou 68 dias
(Experimento II) após a última dose do desafio.
3.8 Isolamento de populações celulares do baço
Após sacrifico do camundongo o baço foi processado por ruptura
mecânica, o macerado transferido para um tubo Falcon de 15ml e adicionado com
meio RPMI 1% SBF até completar 5ml. Da suspensão, 3ml foram transferidos para
outro tubo, que foi completado com meio RPMI 1% SBF e centrifugado (8 minutos, a
4
o
C, a 1200 rpm). Repetiu-se a lavagem, contado o número de células e na
seqüência utilizadas nos diferentes ensaios.
3.9 Isolamento de leucócitos do sangue
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
39
Os camundongos foram anestesiados com éter e em seguida sangrados
por punção cardíaca com uma seringa contendo 40µl de EDTA 0,2M e em seguida
sacrificados. Um volume de 0,4mL de sangue foi misturado com 1mL de meio de
cultura, homogeneizado lentamente e transferido para um tubo Falcon de 15ml
contendo 3mL de percoll 70%. O tubo foi então centrifugado (20 minutos, em
temperatura ambiente, 1500 x g) e em seguida as células que estavam presentes na
interface formada entre o percoll 70% e o meio foram retiradas com o auxilio de uma
pipeta Pasteur. Adicionou-se às células 5 mL de meio de cultura e logo em seguida,
estas foram centrifugadas (10 minutos, 4
o
C, 800 x g). O sobrenadante foi
descartado, o pellet ressuspendido em 0,5 mL de meio de cultura, e as células
contadas e utilizadas nos diferentes ensaios.
3.10 Citometria de fluxo (FACS)
Células do sangue e baço foram distribuídas em placas de cultura de 96
poços com fundo em U (Corning, New York, USA) na concentração de 10
6
células/100µL/poço. Após a centrifugação (5 minutos, 4°C, 250 g), o sobrenadante
foi desprezado e foram adicionados 0,5µg de anticorpos anti-CD16/CD32 (Fc Block).
As placas de cultura foram mantidas a 4° C por 20 minutos e seguidamente foram
adicionados os anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos FITC, PE e
CyChrome em concentrações ótimas previamente estabelecidas. A seguir, as
amostras foram incubadas a 4° C por 30 minutos em local com pouca luminosidade,
e então lavadas com uma solução de PBS suplementada com 1% de FCS e 0,05%
de azida sódica por 3 vezes e ressuspendidas em 0,5 mL de uma solução de PBS
em tubos de poliestireno com fundo em U (Falcon - Becton Dickinson, Mountain
View, USA). As suspensões de células marcadas foram analisadas em um citômetro
de fluxo (FACScan - Becton Dickinson, Mountain View, USA), de acordo com a
intensidade de fluorescência (FL1, FL2 e FL3) e a dispersão frontal (FSC) e lateral
(SSC) do feixe luminoso.
3.11 Marcação Intracelular
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
40
Os ensaios de detecção intracelular de citocinas foram realizados
conforme protocolo sugerido no kit de permeabilização Cytofix/Cytoperm
(Pharmingen). Em resumo, após o isolamento dos esplenócitos e dos leucócitos do
sangue, estes foram lavados por duas vezes com meio de cultura RPMI
suplementado. Então, 10
6
células foram diluídas em 0,2 ml de meio de cultura RPMI
suplementado contendo Stop Golgi (monensina) para bloquear a secreção das
citocinas presentes no complexo de Golgi. As células foram incubadas em placas de
96 poços de fundo chato (Becton Dickinson), previamente sensibilizados, ou não,
com anti-CD3 (10µg/ml) e anti-CD28 (2µg/ml) por 10 horas a 37° C, em atmosfera
contendo 5% de CO2. Após a incubação, as células foram lavadas por duas vezes
e, em seguida foi feita a marcação extracelular, conforme já descrito. Após esta
etapa, as células foram fixadas com Cytofix (Pharmingen) por 20 minutos, antes da
permeabilização celular, realizada através de duas lavagens com Cytoperm
(Pharmingen). A seguir, as células foram incubadas com concentrações ideais de
anticorpos anti-IFN-γ, lavadas novamente com Cytoperm (por 2 vezes) e
ressuspendidas em uma solução de PBS suplementada com 1% de SBF e 0,05% de
azida sódica. Os anticorpos utilizados para marcação externa foram: Anti-CD4, anti-
CD8α
3.12 Marcação de células esplênicas com carboxifluoresceína diacetato
succinimidil éster (CFSE)
Para os experimentos de proliferação celular in vitro as células
esplênicas dos camundongos machos crônicos e crônicos desafiados de modo
sustentado foram “marcadas” com CFSE (do inglês CarboxyFluoroscein Succinimidyl
Ester, Molecular Probes, OR, EUA). Esta técnica permite a marcação e visualização
de células por citometria de fluxo. As células esplênicas (3x10
7
) foram incubadas em
PBS contendo 0,1% de BSA e 5 µM de CFSE, por 15 minutos a 37° C, ao abrigo da
luz. Após este passo, as células foram lavadas duas vezes (centrifugação por 5
minutos, 4° C, 250 g) em meio RPMI contendo 10% de SBF e o sobrenadante foi
descartado. Em seguida, as células foram ressuspendidas em meio RPMI contendo
10% de SBF na concentração de 1x10
7
células/ml e incubadas na ausência de
estímulos, ou na presença de mAb anti-CD3 (1,25 µg/ml), ou antígeno de T. cruzi.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
41
Após 72 e 96 horas em cultura, a proliferação celular foi estimada por citometria de
fluxo quantificando a freqüência de células com fenótipo CFSE
LOW
.
3.13 ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) Indireto
Volumes de 50µl do antígeno de T. cruzi da cepa Sylvio na concentração
de 1600µl/ml de tampão carbonato/bicarbonato foram distribuídos em microplacas
de 96 poços (Maxsorp, Nunc, Denmark) para a sensibilização. Após 12 horas na
geladeira, o material não aderido ao plástico foi descartado e foram adicionados
0,2ml de PBS 1X BSA 1% por poço para o bloqueio dos espaços não preenchidos
pelo antígeno, por um período de 2 horas em temperatura ambiente. A microplaca foi
lavada por 3 vezes com PBS 1X Tween 20 0,05%, e em seguida foram distribuídos
na microplaca os soros dos animais experimentados diluídos 400, 1600 e 12000
vezes em PBS 1X BSA 1% Tween 20 0,05%, num volume de 50µl (anticorpos
primários). Após incubação de 1 hora, a placa foi novamente lavada por três vezes
com PBS 1X Tween 20 0,05% e acrescentado o conjugado (anticorpo secundário).
Anticorpos de cabra anti-IgG1 e anti-IgG2a de camundongos conjugados com
estreptoavidina peroxidase (Southen Biotechnology Associates, Inc USA) e diluídos
2000 vezes em PBS 1X BSA 1% Tween 20 0,05% foram adicionados à placa no
volume de 50µl, para incubação em temperatura ambiente sob agitação constante
durante 1 hora. Logo após, a placa foi novamente lavada por três vezes e
adicionado 100µl do reagente TMB (Invitrogen) e trinta minutos depois foi realizada a
leitura da densidade Óptica (D.O.) em espectrofotômetro à 650nm e analisada no
software Softmax Pró versão 4.0.
3.14 Determinação de citocinas através do kit CBA TH1/TH2)
IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4 e IL-5 foram quantificados simultaneamente
através do Cytometric Bead Array (CBA; PharMingen) dos sobrenadantes obtidos
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
42
das culturas de esplenócitos totais mantidos por 48 e 72 horas em estufa úmida.
Esta técnica usa a citometria de fluxo para mensurar analítos solúveis através de
imunoensaio baseado em partículas, e foi realizado de acordo com as instruções do
fabricante. O limite mínimo de detecção para todas as citocinas neste ensaio é de 20
pg/mL.
3.15 Determinação do nível de Óxido Nítrico (NO)
O óxido nítrico é indiretamente mensurado estimando a concentração de
nitrito nos sobrenadantes de culturas de esplenócitos totais dos animais
experimentados mantidos por 48 e 72 horas em estufa úmida. O nitrito usado como
indicador da síntese de Óxido Nítrico é detectado pelo Reativo de Griess, composto
por 1% de sulfanilamida e 0,1% naftil-etileno-diamina em 2,5% H
3
PO
4
(Ding et al,
1988). Desta forma, um volume de 50µl do sobrenadante das culturas foi adicionado
em microplacas com igual volume do Reativo de Griess e incubado a temperatura
ambiente por 15 minutos. A leitura da Densidade Óptica nas placas foi realizada em
espectrofotômetro à 540nm. A concentração do óxido nítrico dos sobrenadantes das
amostras foi determinada utilizando uma curva padrão com concentrações
conhecidas de nitrito de sódio e expressa em µM.
3.16 Avaliação da parasitemia na fase crônica
A presença de parasitas no sangue e coração foi avaliada em alíquotas
de sangue ou tecido cardíaco homogeneizado cultivadas em triplicatas, a 28
o
C, por
um mês, em meio LIT. Para evitar que as amostras de tecido cardíaco pudessem ser
contaminadas com parasitas presentes no sangue, todos os animais foram
perfundidos através da veia cava inferior. Esta foi seccionada sobre o diafragma e
conectada através do ventrículo esquerdo a uma bomba de infusão de duas
seringas KDS 200 (KD Scientific, New Hope, PA), que infundia PBS estéril por 5
minutos, a um fluxo de 2mL/minuto.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
43
3.17 Exame Histopatológico
Após sangria e sacrifício dos camundongos, os órgãos foram
imediatamente coletados e fixados por 24 h em solução de formaldeído tamponado
a 10%, sendo posteriormente processados para inclusão em blocos de parafina. O
coração foi cortado sagitalmente em duas partes, cada uma contendo as quatro
cavidades. Seis cortes sagitais de 5 µm, não consecutivos, foram obtidos do
coração, fígado e do músculo esquelético (quadríceps), corados por hematoxilina-
eosina e posteriormente analisados qualitativamente na sua totalidade por
microscopia óptica na forma de cruzes (0= ausência de lesões; 1= leve; 2=
moderada; 3= média; 4= intensa e 5= severa).
3.18 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com o t test (student). Todas as
análises estatísticas foram realizadas no programa Prisma 4 (Graph Pad Software) e
as diferenças entre os três grupos foram consideradas significativas para valores de
p<0,05 (5%).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
44
4 RESULTADOS
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
45
EXPERIÊNCIA I
Efeito de um único desafio com parasita homólogo
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
46
4.1.1 Aumento da resposta imune anti-T. cruzi do camundongo crônico após
um único desafio com parasita homólogo
Na fase crônica da infecção pelo Trypanosoma cruzi, o hospedeiro
mantém altos níveis de ativação do seu sistema imune, o que garante um controle
não estéril do parasita. No entanto, estudos anteriores de nosso laboratório
mostraram que camundongos A/J com infecção crônica por parasitas da cepa Y,
quando desafiados, apresentam aumento da resposta imune e conseqüente redução
dos níveis de parasitemia subpatente [25].
Seguindo por este caminho, nos fomos avaliar os efeitos a um único
desafio em um modelo de infecção crônica indutor de miocardiopatia. Desta forma,
camundongos da linhagem C3H/HePAS com infecção crônica por Trypanosoma
cruzi da cepa Sylvio X10/4 foram desafiados uma única vez via i.v, com 5x10
6
parasitas homólogos. Dez e 60 dias depois, os animais crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados e os baços e sangue processados para mensurar os
níveis de ativação do sistema imune.
Aos dez dias do desafio, os camundongos desafiados apresentam um
aumento na freqüência dos linfócitos CD4
+
(p<0.001) e CD8
+
(p<0.005), e uma
redução aproximada de 40% de linfócitos B (CD45R, B220
+
) (p<0.001). Outras duas
populações celulares, divididas por tamanho pequeno ou grande, que não são CD4
+
,
CD8
+
e tampouco B, estão aumentadas no baço do animal crônico desafiado. A
presença da população de tamanho menor é expressiva (p<0.05) (Figura 1).
Contudo, 60 dias após o desafio as freqüências dos linfócitos CD4
+
,
CD8
+
e B, bem como as outras subpopulações, estão equivalentes nos dois grupos,
e apenas a freqüência da população de linfócitos CD8
+
mostra uma leve queda não
significativa (Figura 1).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
47
Dia 10
Dia 60
Figura 1: Efeito do desafio do animal crônico com uma única dose de T. cruzi Sylvio X10/4 na freqüência
de subpopulações no baço. Animais crônicos e crônicos desafiados com 5x10
6
tripomastigotas
(desafio único) foram sacrificados após 10 e 60 dias para análise da freqüência de linfócitos CD4
+
,
CD8
+
e B no baço. Animal crônico controle (■), animal crônico desafiado (□). O asterisco indica
resultado estatisticamente diferente: * p<0.05; *** p<0.005; **** p<0.001.
Em relação aos números de células no baço aos dez dias do desafio,
observamos que o número de linfócitos CD4
+
aumenta de 24x10
6
para 65x10
6
(p<0.001). De forma similar, o número de linfócitos CD8
+
no baço do camundongo
crônico aos dez dias do desafio sofre um aumento de três vezes comparado com o
camundongo crônico controle (p<0.001). O número de linfócitos B não apresenta
mudança após o desafio, porém as subpopulações não B, não T, sim. Assim, a
população CD4
-
CD8
-
B220
-
de células pequenas mostra uma tendência para o
aumento (p=0.09), e aquela com tamanho maior mostra níveis bem acima à dos
animais crônicos controles (p<0.005) (Figura 2).
Sessenta dias após o desafio, os números de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B,
assim como os das populações não T não B, se assemelham aos do grupo crônico
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
48
controle (Figura 2). O total de linfócitos B nos animais crônicos e crônicos
desafiados, apesar de heterogêneo, mantém-se com as médias próximas nos dias
dez e 60 do desafio (Figura 2). Estes resultados demonstram que o desafio de
camundongos crônicos com o parasita leva a ativação do sistema imune, e que esta
perdura pelo menos até o décimo dia; mas no dia 60 encontra-se em níveis
equivalentes aos dos animais crônicos controles.
Dia 10
Dia 60
Figura 2: Efeito do desafio do animal crônico com uma única dose de T. cruzi Sylvio X10/4 no número
total de células das subpopulações do baço. Animais crônicos e crônicos desafiados com 5x10
6
tripomastigotas (desafio único) foram sacrificados após 10 e 60 dias para análise do número de
linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B no baço. Animal crônico controle (■), animal crônico desafiado (□). O
asterisco indica resultado estatisticamente diferente: *** p<0.005; **** p<0.001.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
49
4.1.2 Produção de IFN por células do baço do camundongo crônico após um
único desafio com parasita homólogo
Para assegurar que uma única re-estimulação seria capaz de ativar o
sistema imune, fomos avaliar os níveis do importante mediador IFN produzido por
linfócitos CD4
+
e CD8
+
no baço dos animais crônicos e crônicos desafiados. Para
isso, a freqüência de células produtoras de IFN
+
entre os linfócitos CD4
+
e CD8
+
foi
mensurada, assim como os números totais de células CD4
+
IFN
+
e CD8
+
IFN
+
no
baço. Dez e 60 dias após o desafio, camundongos crônicos, controles e desafiados,
foram sacrificados e seus baços processados. Na seqüência, as células foram
mantidas por 12 horas em cultura à 37
o
C, sem estímulo (produção de IFN
espontânea), ou na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (produção de IFN
estimulada).
Dia 10
Dia 60
Figura 3: Freqüência dos linfócitos IFN+ no baço. Camundongos crônicos foram sacrificados 10 e 60 dias
após desafio com uma única dose de T. cruzi Sylvio X10/4 e analisada a freqüência de linfócitos
CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN em forma espontânea e/ou após estimulação por 12h com anti-CD3
e anti-CD28. Camundongo crônico controle (■) e crônico desafiado (□). O asterisco indica resultados
estatisticamente diferentes (* p<0.05).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
50
A análise dos camundongos 10 dias após o desafio mostra que a re-
estimulação em dose única mantém freqüências semelhantes de células CD4
+
produtoras de IFN, com ou sem estimulo. Para as células CD8
+
observamos nos
camundongos desafiados uma tendência a sofrerem aumento na freqüência de
células que produzem IFN em forma espontânea (p=0.09). Surpreendentemente,
após estimulação in vitro com anti-CD3, as células CD8
+
no baço dos animais do
grupo desafiado exibem uma redução significativa na freqüência de células
produtoras de IFN (p<0.05) (Figura 3).
No dia 60, a produção espontânea e estimulada de IFN pelos linfócitos
CD4
+
não difere significativamente entre o camundongo crônico e crônico desafiado.
O mesmo ocorre com as células CD8
+
dos camundongos desafiados, que no caso
da produção espontânea apresentam uma média de freqüência de células
produtoras de IFN maior que a dos crônicos, porém com grande variabilidade entre
os animais do grupo (Figura 3).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
51
Dia 10
Dia 60
Figura 4: Total dos linfócitos IFN+ no baço. Camundongos crônicos controles e crônicos desafiados foram
sacrificados 10 e 60 dias após desafio com uma única dose de T. cruzi Sylvio X10/4 e analisados os
números totais de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN em forma espontânea e/ou após
estimulação por 12h com anti-CD3 e anti-CD28. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□). O
asterisco indica resultados estatisticamente diferentes (** p<0,01; *** p<0.005).
A analise do total de linfócitos CD4
+
e CD8
+
positivos para IFN
intracelular mostra que o nível de ativação do sistema imune é afetado após o
desafio. Dez dias após este, há um aumento significativo no número de linfócitos
CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN em forma espontânea (respectivamente, p<0.005 e
p<0.01) nos animais do grupo crônico desafiado (Figura 4). Após estimulação in vitro
ocorre igualmente aumento no número de células produtoras de IFN nos animais
desafiados, sendo que o número de células CD4
+
IFN
+
aumenta 2,6 vezes (p<0.01)
e o de células CD8
+
IFN
+
cerca de duas vezes (p=0.05) (Figura 4)
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
52
Embora tenha havido significância para os resultados do décimo dia, no
dia 60 pós-desafio, os níveis de linfócitos IFN
+
do grupo desafiado recuaram,
indicando que o sistema imune voltou ao nível de ativação basal do animal crônico
(Figura 4).
4.1.3 Aumento dos linfócitos CD4
+
e CD8
+
e das células produtoras de IFN no
sangue de camundongo crônico após um único desafio com T. cruzi homólogo
Após mostrarmos o notável aumento do número de linfócitos CD4
+
e
CD8
+
, bem como do número destas células que produzem IFN no baço do animal
crônico após um único desafio com T. cruzi homólogo, fomos analisar no sangue dos
mesmos animais, a freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
(estimada individualmente)
e a produção de IFN (no “pool” de células de cada um dos grupos).
Dia 10 Dia 60
Figura 5: Efeito do desafio de camundongos crônicos com dose única de T. cruzi Sylvio X10/4 na
freqüência dos leucócitos CD4
+
, CD8
+
e B no sangue. Animais crônicos e crônicos desafiados
com 5x10
6
tripomastigotas (desafio único) foram sacrificados após 10 e 60 dias para análise da
freqüência de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B no sangue. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□). O
asterisco indica resultado estatisticamente diferente: **** p<0.001.
Similarmente ao que acontece no baço, a freqüência das populações de
linfócitos T CD4
+
e CD8
+
circulantes aumenta no décimo dia após o desafio.
Contudo, é importante ressaltar o aumento dos linfócitos CD8
+
(p<0.001),
importantes na destruição do parasita intracelular, que tem um aumento médio de 2
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
53
vezes e atinge freqüência similar à dos linfócitos T CD4
+
. Para a população de
linfócitos B é visto o inverso, ou seja, uma redução maciça da freqüência (p<0.001)
(figura 5). No dia sessenta do desafio, há recuo da ativação da resposta imune nos
animais crônicos desafiados, que é evidenciado nas freqüências das diferentes
subpopulações linfocitárias que se apresentam próximas à dos crônicos controles
(figura 5).
Para avaliar a capacidade efetora dos leucócitos do sangue, estimamos
as freqüências de células T CD4
+
e CD8
+
produtoras de IFN. Em função do
pequeno número de células isoladas de cada animal, a quantificação das células
produtoras de IFN foi realizada em “pools” (total de 10
6
de células por grupo, a
partir de um número igual de células de cada um dos indivíduos do grupo) de células
dos diferentes grupos. Na seqüência, as células foram mantidas por 12 horas em
cultura à 37
o
C, sem estímulo (produção de IFN espontânea), ou na presença de
anti-CD3/CD28 (produção de IFN estimulada).
No décimo dia após desafio não encontramos diferenças na produção
espontânea de IFN pelas células CD4
+
e CD8
+
dos dois grupos. No entanto, o
aumento na freqüência de células CD4
+
e CD8
+
produtoras de IFN que resulta após
estimulação in vitro com anti-CD3 e anti-CD28 mostrou-se mais intenso no pool de
células do sangue dos animais crônicos desafiados do que naquele dos animais
crônicos (Figura 6).
Sessenta dias após o desafio, e em relação ao grupo crônico controle, o
grupo crônico desafiado apresentou um leve aumento na freqüência de linfócitos T
CD4
+
e CD8
+
que produzem espontaneamente IFN. No entanto, quando
estimulados in vitro por anti-CD3/CD28, ambos os grupos atingem freqüências
similares de células CD4
+
IFN
+
e CD8
+
IFN
+
. Este resultado pode indicar que o
desafio não resulta em ativação duradoura.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
54
Dia 10
Dia 60
Figura 6: Efeito do desafio de camundongos crônicos com dose única de T. cruzi Sylvio
X10/4 na freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN
+
no sangue. Camundongos
crônicos controles e crônicos desafiados foram sacrificados 10 e 60 dias após desafio único.
Foram feitos “pools” de células sanguíneas para cada grupo e analisada a média de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN em forma espontânea e/ou após estimulação por 12h com anti-CD3 e
anti-CD28. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□).
4.1.4 Avaliação da produção de anticorpos T. cruzi-específicos de animais
crônicos após desafio único
Uma vez que a resposta humoral é extremamente importante no
estabelecimento de uma imunidade protetora durante a infecção crônica pelo T.
cruzi, decidimos avaliar se haveria mudanças na produção de anticorpos parasita-
específicos aos 10 e 60 dias após desafio único com T. cruzi homólogo. Para
verificarmos isto, utilizamos extratos totais do parasita como antígeno e analisamos
por ensaio imunoenzimático (ELISA) a presença de anticorpos específicos do tipo
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
55
IgG1 e IgG2a no soro dos animais crônicos e crônicos desafiados. Observando a
figura 7, podemos perceber que o desafio melhorou a resposta humoral no dia 10, já
que aumentos consideráveis de imunoglobulinas IgG1 (P<0.05) e IgG2a (P<0.005)
foram encontrados nos soros dos animais desafiados. Embora os níveis séricos
destes anticorpos estiverem elevados logo após o re-estímulo, aos 60 dias do
desafio a comparação dos grupos crônicos e crônicos desafiados não revelou
grandes diferenças, mostrando que o desafio único não exerce uma mudança
prolongada na resposta protetora por anticorpos.
Dia 10 Dia 60
Figura 7: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos 10 e 60 dias após um único desafio com
parasitas Sylvio X10/4. Camundongos crônicos controles e crônicos desafiados foram sangrados
10 e 60 dias após desafio único e os soros coletados para determinação da presença de anticorpos
T. cruzi-específicos IgG1 e IgG2a. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□). O asterisco indica
resultados estatisticamente diferentes (*p<0,05; *** p<0.005).
4.1.5 A carga parasitária dos camundongos crônicos não diminui após um
único desafio com parasita homólogo
Para determinar a carga parasitária subpatente no sangue de
camundongos crônicos controles e crônicos desafiados, realizamos culturas em
meio LIT suplementado de alíquotas (5µl) de sangue dos diferentes animais (três
culturas por animal) por ocasião do sacrifício destes nos dias 10 e 60 do desafio. As
culturas foram analisadas duas vezes por semana quanto ao crescimento de
epimastigotas.
Sangue
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
56
Dia 10 Dia 60
Figura 8: Análise do parasitismo subpatente no sangue de animais crônicos e crônicos após desafio
único com parasita homólogo. Nos dias 10 e 60 pós-desafio, os animais foram sacrificados e 3
alíquotas de sangue de cada animal cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença de parasitas
nas culturas nas semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da freqüência
de animais que deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas positivas por
grupo. Crônico controle (■) e crônico desafiado (■)
No dia 10 após o desafio a carga parasitária mostrou-se superior nos
animais do grupo crônico desafiado. Isto foi observado em relação à freqüência de
animais que deram culturas positivas, e, em menor intensidade, em relação à
freqüência de culturas positivas no conjunto de animais do grupo (Figura 8). No dia
60 pós-desafio, entretanto, a positividade das culturas LIT foi semelhante no grupo
crônico e grupo crônico desafiado (Figura 8), indicando não haver maiores
diferenças nesta data na carga parasitária sanguínea dos dois grupos de animais.
Carga Parasitária no Coração
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
57
Dia 10 Dia 60
Figura 9: Análise de parasitismo subpatente no coração de animais crônicos e crônicos após desafio
único com parasita homólogo. Nos dias 10 e 60 pós-desafio, os animais foram sacrificados e 3
alíquotas de macerado cardíaco de cada animal cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença
de parasitas nas culturas nas semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da
freqüência de animais que deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas
positivas por grupo. Cada grupo crônico controle representado pela figura (■) e crônico desafiado
pela figura (■)
Em relação à carga parasitária cardíaca, níveis discretamente inferiores
de parasitismo foram revelados pelas culturas em meio LIT nos animais do grupo
crônico desafiado, aos 60 dias pós-desafio (Figura 9).
4.1.6 A patologia cardíaca de camundongos crônicos não é reduzida após
desafio único com parasita homólogo
No que se refere ao infiltrado inflamatório no coração, um dos principais
expoentes da patologia cardíaca, numa análise provisória avaliada por cruzes (0;
nenhuma; 1: leve; 2: moderada; 3: média; 4: intensa e 5: severa), não observamos
diferenças entre os grupos crônico controle e crônico desafiado (Figura 10). Isto foi
patente tanto aos dez dias do desafio como aos sessenta.
Patologia cardíaca
Dia 10 Dia 60
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
58
Figura 10: Avaliação da patologia cardíaca de camundondos crônicos controle e crônicos desafiados
após desafio único com parasita homólogo. Camundongos crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados nos dias 10 e 60 após um único desafio e o coração avaliado
qualitativamente em relação à intensidade do infiltrado inflamatório. Crônico controle (■) e crônico
desafiado (□).
Para a patologia muscular (quadríceps), observamos que os animais do
grupo crônico desafiado apresentam infiltrados similares aos dos animais crônicos
controle. Entretanto, no dia 10 pós-desafio, os animais do grupo desafiado
apresentaram níveis de hepatite discretamente superiores aos do grupo crônico
(Figura 11). No dia 60, a média de intensidade da infiltração leucocitária no músculo
e fígado foi equivalente em ambos os grupos (Figura 11).
Patologia
Dia 10 Dia 60
Figura 11: Avaliação da patologia cardíaca, muscular e hepática de camundondos crônicos controles e
crônicos desafiados após desafio único com parasita homólogo. Camundongos crônicos
controles e crônicos desafiados foram sacrificados 10 e 60 dias após o desafio e a intensidade de
patologia no coração, músculo estriado (quadríceps) e fígado avaliada semi-quantitativamente pela
presença de infiltrados celulares. Camundongo crônico controle (■) e crônico desafiado (□).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
59
EXPERIÊNCIA II
Efeito do desafio sustentado com parasita
homólogo I
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
60
4.2.1 Um aumento da resposta anti-T. cruzi é também obtida após desafio
sustentado com parasita homólogo
Os resultados acima mostram que aos 60 dias após do animal crônico
ter recebido um único desafio com T. cruzi homólogo não há redução da inflamação
nos diferentes órgãos, e a diminuição da carga parasitária no sangue e coração é
pequena. Isto poderia ser interpretado como indicativo da inabilidade do desafio
único em manter otimizada a resposta imune por tempo prolongado. Seguindo por
este caminho, decidimos verificar o que aconteceria no animal crônico se
prolongássemos a exposição ao antígeno. Camundongos C3H/HePAS machos e
fêmeas cronicamente infectados com Trypanosoma cruzi da cepa Sylvio X10/4
foram desafiados com doses de 5x10
6
tripomastigotas vivos, por quatro vezes (as 2
primeiras i.v e as 2 últimas i.p), com intervalos de 3 semanas. Os machos foram
sacrificados 35, e as fêmeas 45 dias após o último desafio para mensurar os níveis
de ativação do sistema imune, carga parasitária e patologia.
Machos
Figura 12: Efeito do desafio sustentado na freqüência e no número total de linfócitos no baço de animais
crônicos. Animais C3H/HePAS machos crônicos e crônicos desafiados por quatro vezes com 5x10
6
tripomastigotas Sylvio X10/4 foram sacrificados 35 dias após a última dose para análise da
freqüência (acima) e do número total (abaixo) de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B no baço. Camundongos
crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
61
Trinta e cinco dias após o último desafio, os camundongos machos
crônicos desafiados apresentam freqüências de linfócitos T CD4
+
, CD8
+
e B, assim
como de outras populações não T e B, equiparáveis às dos camundongos crônicos
controles. Na avaliação do número total de células no baço, observamos nos
animais desafiados discretos aumentos que não são significativos nas três
subpopulações linfocitárias, contudo mais evidentes na população T CD4
+
(p=0.06).
Nas populações não T não B os números de células por baço se mostraram
inalterados após o desafio sustentado (Figura 12).
Para as fêmeas, sacrificadas aos 45 dias do último desafio, os
resultados da freqüência e do número total de células por baço diferem em pouco
aos obtidos nos machos. As diferenças entre as fêmeas desafiadas e as controles
foram mais intensas que as dos machos. Assim, a tendência observada nos machos
desafiados em apresentarem um número maior de linfócitos T CD4
+
, passa a ser
uma diferença estatisticamente significativa nas fêmeas desafiadas (p<0.01)
(Figuras 13). Os discretos aumentos observados nos números totais dos animais
crônicos submetidos a quatro desafios indicam que a potenciação na ativação do
sistema ainda persiste após 35-45 dias.
Fêmeas
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
62
Figura 13: Efeito do desafio sustentado na freqüência e no número total de linfócitos no baço de
camundongos crônicos. Camundongos C3H/HePAS fêmeas crônicos e crônicos desafiados por
quatro vezes com 5x10
6
tripomastigotas Sylvio X10/4 foram sacrificados 45 dias após a última dose
para análise da freqüência (acima) e do número total (abaixo) de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B no baço.
Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultado estatisticamente
diferente: * p<0.05, ** p<0.01.
4.2.2 Aumento da produção de IFN por esplenócitos do animal crônico após
desafio sustentado com parasita homólogo
Para determinar se o desafio sustentado com parasita homólogo eleva a
capacidade efetora do sistema imune frente ao T. cruzi, estimamos as freqüências
de linfócitos produtores de IFNnas populações T CD4
+
e CD8
+
nos camundongos
crônicos controles e crônicos desafiados, aos 35 e 45 dias do último desafio,
respectivamente, para machos e fêmeas.
Nos camundongos crônicos machos, as freqüências dos linfócitos CD4
+
e CD8
+
esplênicos produtores de IFN se mantêm inalteradas após os desafios. Isto
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
63
é observado tanto para a produção espontânea como na estimulação com anti-
CD3/CD28.
Machos
Fêmeas
Figura 14: Efeito do desafio sustentado na freqüência dos CD4
+
e CD8
+
esplênicos produtores de IFN de
camundongos crônicos. Camundongos machos e fêmeas crônicos controles e crônicos desafiados
foram sacrificados 35 e 45 dias após o último desafio respectivamente, e analisados quanto à
freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN de forma espontânea e/ou após 12h de
estimulo com anti-CD3 e anti-CD28. Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□).
É importante notar que, em ambos os grupos de animais, crônicos e
crônicos desafiados, a produção espontânea de IFN é semelhante nos linfócitos
CD4
+
e linfócitos CD8
+
. No entanto, após 12 horas de estimulação com anti-
CD3/CD28 observa-se nos dois grupos de animais que aproximadamente 40% dos
linfócitos CD8
+
esplênicos produzem IFN, e somente 15% dentre as células CD4
+
(Figura 14). Isto é observado tanto nos machos como nas fêmeas, o que sugere a
existência de uma maior freqüência de células de memória entre os linfócitos CD8
+
,
do que entre os linfócitos CD4
+
(Figura 14).
O número total de linfócitos CD4
+
e CD8
+
esplênicos produtores de IFN
foi também avaliado nos camundongos crônicos, machos e fêmeas. Em relação à
produção espontânea, os camundongos machos desafiados mostram tendência a
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
64
exibirem números de células CD4
+
IFN
+
superiores aos dos crônicos controles
(p=0.05), mas os números de células CD8
+
IFN
+
não são diferentes entre os
grupos. Após estimulo com anti-CD3/CD28, torna-se mais evidente o aumento das
células CD4
+
IFN
+
no grupo dos animais machos desafiados (p<0.05) e observa-se
um discreto aumento no número de células CD8
+
IFN
+
(p=0.07) (Figura 15).
Machos
Fêmeas
Figura 15: Total de linfócitos IFN
+
no baço do animal crônico após desafio sustentado. Camundongos
machos e fêmeas, crônicos controles e crônicos desafiados foram sacrificados 35 e 45 dias após
último de quatro desafios, e analisados quanto ao número total de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores
de IFN de forma espontânea ou após 12h de estimulo com anti-CD3 e anti-CD28. Crônicos
controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultado estatisticamente diferente: *
p<0.05, **** p<0.001.
Para as fêmeas (Figura 15), não se observam diferenças entre os
animais crônicos controles e crônicos desafiados quanto ao número de linfócitos
CD4
+
e CD8
+
que produzem IFN de maneira espontânea. Entretanto, de modo
similar aos machos, após o estimulo in vitro com anti-CD3/CD28, as fêmeas
desafiadas apresentam elevação significante do número de células CD4
+
IFN
+
(P<0.001) e um discreto aumento sem significância na média do número de células
CD8
+
IFN
+
.
4.2.3 Aumento da produção de IFN por células CD8
+
do sangue de animais
crônicos após desafio sustentado
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
65
Visto o aumento de linfócitos produtores de IFN no baço dos animais
crônicos submetidos à desafios sustentados, decidimos verificar se tal efeito seria
promovido nos leucócitos do sangue. Para isso, camundongos crônicos desafiados,
machos e fêmeas, foram sacrificados respectivamente 35 e 45 dias após o ultimo
desafio, e avaliados em relação à freqüência das subpopulações CD4
+
e CD8
+
no
sangue, assim como em relação à freqüência das células produtoras de IFN, sendo
que esta última análise foi realizada com “pools” de sangue dos animais de cada
grupo.
Machos
Figura 16: Média da freqüência de linfócitos no sangue de animais crônicos (machos) após desafio
sustentado com parasita homólogo. Camundongos machos crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados 35 dias após o último desafio, e a freqüência dos linfócitos CD4
+
,
CD8
+
e B analisada no sangue. Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□).
Figura 17: Aumento da freqüência de linfócitos CD8
+
produtores de IFN no sangue dos animais
crônicos (machos) após desafio sustentado. Camundongos machos crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados 35 dias após o último desafio. Foram feitos “pools” de células para
cada grupo, e analisados quanto à freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
que produzem IFNde
forma espontânea e após estimulo com anti-CD3 e anti-CD28 por 12h . Grupo crônico controle (■) e
crônico desafiado (□).
A freqüência de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B no sangue, avaliada de
maneira individual (dados não mostrados) e pela média, é similar nos camundongos
crônicos machos e crônicos desafiados (Figura 16). Por outro lado, as porcentagens
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
66
dos linfócitos CD4
+
e CD8
+
do sangue que produzem IFN de forma espontânea do
grupo crônico desafiado mostram-se inferiores daquelas no grupo crônico controle.
No entanto, após estimulação com anti-CD3 e anti-CD28 in vitro, o aumento nas
porcentagens de células CD4
+
IFN
+
e CD8
+
IFN
+
do grupo crônico desafiado
ultrapassa os observados no grupo controle (figura 17), fenômeno que é
particularmente expressivo no compartimento das células T CD8
+
.
Fêmeas
Figura 18: Média da freqüência de linfócitos no sangue de animais crônicos (fêmeas) após desafio
sustentado com parasita homólogo. Camundongos fêmeas crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados 45 dias após o último desafio, e a freqüência de linfócitos CD4
+
, CD8
+
e B analisada no sangue. Grupo crônico controle (■) e grupo crônico desafiado (□)
Figura 19: Aumento da freqüência de linfócitos CD8
+
IFN
+
no sangue de animais crônicos (fêmeas) após
desafio sustentado com parasita homólogo. Camundongos fêmeas crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados 45 dias após o último desafio. Foram feitos “pools” de células para
cada grupo, e analisados quanto a freqüência de linfócitos CD4
+
e CD8
+
que produzem IFNde
forma espontânea e após estimulo com anti-CD3 e anti-CD28 por 12h . Crônicos controles (■) e
crônicos desafiados (□).
Para as fêmeas, as freqüências de linfócitos CD4
+
e B no sangue dos
animais em ambos os grupos. Uma pequena redução é, entretanto, observada para
os linfócitos CD8
+
dos animais crônicos desafiados (figura 18). A freqüência de
linfócitos CD4
+
e CD8
+
do sangue que produzem espontaneamente IFN
+
é
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
67
discretamente inferior no grupo crônico desafiado. Mais ainda, após estimulo com
anti-CD3 e anti-CD28, a porcentagem de linfócitos CD4
+
produtores de
IFN é menor
no grupo crônico desafiado do que no grupo crônico controle. Contudo, de forma
análoga ao observado nos camundongos machos, após a estimulação com anti-
CD3/CD28, a freqüência de células CD8
+
produtoras de IFN no grupo crônico
desafiado mostra um forte aumento, que reflete no dobro do alcançado no grupo
crônico controle (Figura 19). Estes resultados sugerem que, analogamente ao
observado no baço, a freqüência de células de memória CD8
+
encontra-se
aumentada no sangue.
4.2.4 Aumento da capacidade proliferativa dos linfócitos T esplênicos
específicos de camundongos machos crônicos após desafio sustentado com
parasita homólogo
Outra abordagem utilizada para avaliar a resposta imune frente ao
Trypanosoma cruzi foi através do ensaio de proliferação. Camundongos crônicos e
crônicos desafiados machos foram sacrificados 35 dias após o ultimo desafio, e
tiveram o baço processado, as células marcadas com CFSE e posteriormente,
mantidas em cultura por 72 e 96 horas com meio RPMI apenas, anticorpos anti-CD3
ou antígeno de T. cruzi. A freqüência de células que sofreram divisão foi
determinada por citometria de fluxo pela baixa expressão do CFSE em esplenócitos
CD4
+
e CD8
+
marcados com anti-CD4
+
e anti-CD8
+
.
72 horas
CD4
+
CD8
+
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
68
Figura 20: Aumento da freqüência de linfócitos em proliferação nos animais crônicos após desafio
sustentado com parasita homólogo. Camundongos machos crônicos e crônicos desafiados foram
sacrificados 35 dias após o último de quatro desafios, tiveram o baço processado, as células
mantidas por 72h em cultura com RPMI apenas, anti-CD3 ou antígeno de T. cruzi e depois
analisadas quanto à porcentagem de linfócitos CD4
+
(esquerda) ou CD8
+
(direita) CFSE
LOW
.
Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultado estatisticamente
diferente: * p<0.05, *** p<0.005.
No ensaio de proliferação por 72h, os resultados mostram que nos
esplenócitos do grupo crônico desafiado a porcentagem de células CD4
+
que
expressam níveis reduzidos de CFSE é relativamente mais alta do que nos animais
crônicos. Isto foi observado tanto na ausência de estimulo (p<0.005), como após
estimulação com anti-CD3 (p<0.05) ou antígeno de T.cruzi (p<0.005). As células
CD8
+
dos animais desafiados também mostraram maior proliferação às 72 horas que
as dos animais crônicos. Isto foi observado na presença de apenas meio (p<0.05) e
quando estimuladas com anti-CD3 (p<0.05) ou com antígeno de T. cruzi, apesar que
neste último caso foi uma tendência ao aumento (p=0.07) (Figura 20)
96 horas
CD4
+
CD8
+
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
69
Figura 21: Aumento da freqüência de linfócitos em proliferação nos animais crônicos após desafio
sustentado com parasita homólogo. Camundongos machos crônicos e crônicos desafiados foram
sacrificados 35 dias após o último de quatro desafios, tiveram o baço processado, as células
mantidas por 96h em cultura com RPMI apenas, anti-CD3 ou antígeno de T. cruzi, e depois
analisadas quanto à porcentagem de linfócitos CD4
+
(esquerda) ou CD8
+
(direita) CFSE
LOW
. Crônico
controle (■) e crônico desafiado (□). O asterisco indica resultado estatisticamente diferente: ***
p<0.005.
Após 96 horas de cultura a análise nos mostra que a porcentagem de
células CD4
+
em proliferação nos animais desafiados é significativamente mais alta
do que nos animais crônicos, com exceção da proliferação espontânea. Na resposta
a anti-CD3, aproximadamente 48% das células CD4
+
dos camundongos desafiados
tem queda da expressão de CFSE contra aproximadamente 28% nas células dos
camundongos crônicos (p=0.08). Na presença do antígeno de T. cruzi, a diferença
entre os grupos é altamente significativa, com aproximadamente 38% das células
CD4
+
dos animais desafiados expressando baixo nível de CFSE (p<0.005). Com
relação às células CD8
+
, a proliferação após 96 horas de cultura mostra um discreto
aumento nos animais crônicos desafiados em relação aos crônicos, tanto em
resposta ao anti-CD3, como ao antígeno de T. cruzi, mas as diferenças não são
significativas (Figura 21).
4.2.5 Aumento da produção de anticorpos T. cruzi-especificos nos animais
crônicos após desafio sustentado
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
70
Na experiência de desafio único dos animais crônicos, mostrada na
primeira parte dos resultados, observamos aumento nos níveis de anticorpos de
subclasses importantes para o “clearence” do T. cruzi. Lembrando que aos 10 dias
após o desafio os anticorpos específicos das subclasses IgG1 e IgG2a estão
aumentados nos animais desafiados, e que aos 60 dias do desafio não há grandes
diferenças entre os grupos, nos faltava saber como iria se comportar a resposta
humoral do animal crônico após desafio sustentado. Novamente utilizamos extratos
do parasita como antígenos para análise dos níveis de anticorpos por ensaio
imunoenzimático (ELISA) de camundongos crônicos sangrados 35 e 45 dias após o
desafio, para machos e fêmeas respectivamente.
Machos Fêmeas
Figura 22: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos machos e fêmeas após desafio
sustentado com parasitas Sylvio X10/4. Camundongos crônicos e crônicos desafiados, machos
e fêmeas foram sangrados 35 e 45 dias respectivamente após desafio sustentado e os soros
coletados para determinação da presença de anticorpos T. cruzi-específicos IgG1 e IgG2a.
Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados estatisticamente
diferentes (*p<0,05).
A figura 22 nos mostra que camundongos crônicos 35 dias após terem
recebido o último desafio apresentam níveis aumentados das imunoglobulinas IgG1
e IgG2a. Apesar do aumento ser maior para IgG1, os níveis de anticorpos anti-T.
cruzi de ambas as subclasses diferem significativamente nos animais crônicos e
crônicos desafiados (p<0.05). Já em relação aos níveis séricos de anticorpos
presentes nas fêmeas crônicas sangradas 45 dias após o último desafio, apenas a
imunoglobulina G1 está aumentada (p<0.05). Estes resultados mostram que o
desafio sustentado poderia resultar em uma proteção duradoura por anticorpos da
subclasse IgG1 em animais crônicos.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
71
4.2.6 Redução da carga parasitária no sangue do camundongo crônico após
desafio sustentado
Para avaliar se o desafio sustentado é capaz de reduzir os níveis de
parasitemia subpatente no sangue, camundongos C3H/HePAS crônicos controles e
crônicos desafiados foram sacrificados 35 e 45 dias após o ultimo desafio, e o
sangue coletado. Triplicatas de culturas em meio LIT com alíquotas de 5µl de
sangue foram estabelecidas. Periodicamente estas foram analisadas quanto à sua
positividade. A porcentagem de camundongos machos desafiados que tiveram
culturas positivas foi expressivamente menor, mostrando uma redução de 60% em
relação à dos camundongos crônicos controles. Quanto estes resultados são
expressos em função da freqüência do total de culturas positivas por grupo, os
animais crônicos controles tiveram 60% de poços positivos, enquanto que nos
animais crônicos desafiados este valor foi de 40% (Figura 23).
Machos
Figura 23: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos crônicos após desafio
sustentado. No dia 35 pós-desafio, os animais machos foram sacrificados e 3 alíquotas de sangue
de cada animal foram cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença de parasitas nas culturas
nas semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da freqüência de animais
que deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas positivas por grupo. Grupo
crônico controle (■) e crônico desafiado (■)
Para as fêmeas, os resultados obtidos são igualmente promissores.
Enquanto que os animais crônicos controles mostram uma positividade de 50%, os
crônicos desafiados positivaram apenas 18%. Na análise das culturas positivas por
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
72
grupo, o grupo crônico controle mostrou 30% de positividade, contra 5,6% no grupo
crônico desafiado (Figura 24).
O resultado deste experimento sugere que diferentemente do ocorrido
no experimento com desafio único, camundongos C3H/HePAS crônicos diminuem a
carga parasitaria subpatente no sangue após desafio sustentado com parasita
homologo.
Fêmeas
Figura 24: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos crônicos após desafio
sustentado. No dia 45 pós-desafio, os animais fêmeas foram sacrificados e 3 alíquotas de sangue
de cada animal foram cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença de parasitas nas culturas
nas semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da freqüência de animais
que deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas positivas por grupo. Grupo
crônico controle (■) e crônico desafiado (■)
4.2.7 A patologia cardíaca dos camundongos crônicos é reduzida após desafio
sustentado
Para avaliar o impacto que o aumento da resposta imune provocada pelo
desafio sustentado exerce na patologia, camundongos crônicos controles e crônicos
desafiados foram sacrificados nos dias 35 (machos) e 45 (fêmeas) após desafio e a
infiltração leucocitária no coração, músculo estriado (quadríceps) e fígado, estimada
de forma qualitativa por análise duplo cego (0; nenhuma; 1: leve; 2: moderada; 3:
média; 4: intensa e 5: severa).
Nos camundongos machos crônicos os repetidos desafios levam a uma
diminuição no número de infiltrados no coração no seu aspecto global. A redução da
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
73
miocardite é leve, porém significante (p<0.05). A pericardite também apresenta
menor intensidade nos animais crônicos desafiados, enquanto que para o
endocárdio não há diferença entre os grupos. No fígado não observamos diferenças
entre os grupos e, em relação à patologia muscular, observamos um discreto
aumento nos animais crônicos desafiados. (Figura 25).
Machos
Figura 25: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda), muscular e hepática (direita) após desafio
sustentado dos camundongos crônicos. Camundongos machos crônicos controles e crônicos
desafiados por quatro vezes foram sacrificados 35 dias após o desafio e avaliados de forma
qualitativa em relação à intensidade de patologia no coração, músculo esquelético e fígado pela
presença de infiltrados celulares. Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica
resultado estatisticamente diferente: * p<0.05.
Com relação às fêmeas, os animais crônicos desafiados apresentam
uma intensidade na patologia cardíaca global inferior a dos crônicos controles
(p<0.05), embora apenas a diferença na pericardite seja significativa na analise
segmentada (p<0.05). Contudo, é importante destacar que a patologia crônica
cardíaca é menos intensa nos camundongos crônicos fêmeas do que nos machos.
No músculo estriado e fígado dos camundongos fêmeas desafiados, uma redução
da patologia também pode ser registrada (p<0.05) (Figura 26).
Fêmeas
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
74
Figura 26: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda), muscular e hepática (direita) após desafio
sustentado dos camundongos crônicos. Camundongos fêmeas crônicos controles e crônicos
desafiados por quatro vezes foram sacrificados 45 dias após o desafio e avaliadas de maneira
qualitativa em relação à intensidade de patologia no coração, músculo esquelético e fígado pela
presença de infiltrados celulares. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□).O asterisco indica
resultado estatisticamente diferente: * p<0.05.
Em uma segunda análise da patologia cardíaca, juntamos os dados de
patologia cardíaca dos camundongos machos e das fêmeas com o objetivo de
aumentar o número, e tornar os dados mais precisos e significantes. Nesta análise
observamos redução significante da pericardite (p<0.01) e da patologia total
cardíaca (avaliação global do órgão) (p<0.05) nos camundongos crônicos
desafiados, embora as médias para a miocardite e endocardite também estejam
inferiores neste grupo (Figura 27). O conjunto dos resultados torna patente a idéia
de que o desafio sustentado como forma de otimizar a resposta imune ao T. cruzi
possa ter impacto sobre a patologia cardíaca dos animais crônicos.
Machos e Fêmeas
Figura 27: Avaliação da patologia cardíaca no conjunto de machos e fêmeas crônicos após desafio
sustentado. Camundongos machos e fêmeas crônicos controles e crônicos desafiados por quatro
vezes foram sacrificados 35 e 45 dias após o desafio e a patologia no coração avaliada de maneira
qualitativa em relação à intensidade dos infiltrados celulares. Crônico controle (■) e crônico
desafiado (□).O asterisco indica resultado estatisticamente diferente: * P<0.05, ** P<0.01.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
75
Quadro: Fotografias representativas das lesões no tecido cardíaco e da presença de ninhos. (A) Tecido
cardíaco de animal não infectado livre de infiltrados celulares. (B) Intenso infiltrado celular grau 4,5 no
miocárdio de camundongo fêmea crônico desafiado. (C) Pericardite de grau 4 de camundongo fêmea
crônico desafiado. (D) Endocardite grave grau 5 de camundongo fêmea crônico desafiado. (E)
Infiltrado inflamatório de grau 5 na região da aurícula do camundongo macho crônico. (F) Ninho de
Trypanosoma cruzi com infiltrado celular no tecido cardíaco do camundongo macho crônico . As
fotografias A, B, C, D e E foram feitas com a objetiva x20, e a fotografia F com a objetiva x100.
A
C
E
B
D
F
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
76
EXPERIÊNCIA III
Efeito do desafio sustentado com parasita
Homólogo II
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
77
4.3.1 Aumento da capacidade proliferativa específica das células CD4
+
de
animais crônicos após desafio sustentado com parasita homólogo
Para confirmar os resultados obtidos na primeira experiência de desafio
sustentado do animal crônico (desafio sustentado II), decidimos avaliar em uma
outra experiência alguns dos parâmetros principais obtidos na experiência anterior: a
proliferação específica das células T CD4
+
e CD8
+
ao antígeno de T. cruzi, os níveis
de anticorpos séricos, a carga parasitária no sangue e a patologia nos diferentes
órgãos dos grupos crônicos e crônicos desafiados. Além destas avaliações,
incluímos neste novo experimento uma avaliação da produção de citocinas in vitro.
Camundongos C3H/HePAS fêmeas com aproximadamente 120 dias de
infecção foram desafiados por quatro vezes (2 i.v e 2 i.p) com inóculo de 5x10
6
do
parasito homólogo vivo, sacrificados 68 dias após o último desafio e avaliados em
relação a animais crônicos não desafiados.
Para o ensaio de proliferação, conforme procedido no experimento
anterior, os camundongos tiveram o baço processado, as células marcadas com o
fluorocromo CFSE e posteriormente mantidas em cultura por 72 e 96 horas com
meio apenas, anti-CD3 ou antígeno de T. cruzi. Após este período a divisão celular
foi estimada pela freqüência de células CD4
+
ou CD8
+
com expressão diminuída de
CFSE.
72 horas
CD4+ CD8+
Figura 28: Freqüência de linfócitos em proliferação no animal crônico após desafio sustentado.
Camundongos fêmeas crônicos e crônicos desafiados foram sacrificados 68 dias após o último de
quatro desafios, tiveram o baço processado, as células mantidas por 72h em cultura com RPMI
apenas, anti-CD3 ou antígeno de T. cruzi e a seguir analisados quanto à porcentagem de linfócitos
CD4
+
(esquerda) ou CD8
+
(direita) CFSE
LOW
. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□). O
asterisco indica resultado estatisticamente diferente: * p<0.05.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
78
No ensaio realizado por 72 horas em cultura, com ou sem estímulo, se
observam porcentagens similares de células CD4
+
CFSE
LOW
entre os animais dos
grupos crônico e desafiado. Em relação à proliferação das células CD8
+
neste
mesmo período, as porcentagens novamente se assemelham nos animais dos
grupos crônico e desafiado estimulados com anti-CD3 e antígeno de T. cruzi.
Contudo, a proliferação espontânea (apenas com meio RPMI) mostrou-se superior
no grupo crônico (Figura 28).
96 horas
CD4+ CD8+
Figura 29: Freqüência de linfócitos em proliferação no animal crônico após desafio sustentado.
Camundongos fêmeas crônicos e crônicos desafiados foram sacrificados 68 dias após o
último de quatro desafios, tiveram o baço processado, as células mantidas por 96h em cultura
com RPMI apenas, anti-CD3 ou antígeno de T. cruzi e a seguir analisados quanto à
porcentagem de linfócitos CD4
+
(esquerda) ou CD8
+
(direita) CFSE
LOW
. Crônico controle (■) e
crônico desafiado (□). O asterisco indica resultado estatisticamente diferente: * p<0.05.
Após 96 horas, as células CD4
+
dos animais desafiados apresentam
uma porcentagem significativamente mais alta (P<0.005) de células CFSE
LOW
em
resposta à estimulação in vitro com antígeno de T. cruzi que aquelas do grupo
crônico controle, embora isso não ocorra na ausência de estímulo ou na estimulação
com anti-CD3. Já as células CD8
+
apresentam médias equivalentes para ambos os
grupos quando mantidas com ou sem estímulo (Figura 29).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
79
4.3.2 Produção de anticorpos T. cruzi- específicos nos animais crônicos após
desafio sustentado
Bem como no desafio sustentado anterior de animais crônicos,
novamente fomos avaliar os níveis de anticorpos T. cruzi-específicos encontrados
em animais crônicos e crônicos desafiados. Camundongos machos e fêmeas foram
sacrificados respectivamente, 55 e 68 dias após o último desafio, e tiveram avaliados
pelo método de ELISA os níveis das imunoglobulinas IgG1 e IgG2a.
Machos Fêmeas
Figura 30: Avaliação da resposta humoral de animais crônicos machos e fêmeas após desafio
sustentado com parasitas Sylvio X10/4. Camundongos crônicos e crônicos desafiados, machos e
fêmeas foram sangrados 55 e 68 dias respectivamente após desafio sustentado e os soros coletados
para determinação da presença de anticorpos T. cruzi-específicos IgG1 e IgG2a. Crônicos controles
(■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados estatisticamente diferentes (*p<0,05).
Como mostrado na figura 30, aos 55 dias do último desafio, os
camundongos machos crônicos não apresentam mudanças significativas nos níveis
de anticorpos antígeno-específicos IgG2a e IgG1. Contudo, as fêmeas crônicas
desafiadas mantém potencializada a resposta humoral por mais tempo, já que
mesmo tendo sido sacrificadas 68 dias após o último desafio, os níveis da
imunoglobulina IgG1 permanecem elevados quando comparados com aqueles das
fêmeas crônicas não desafiadas (p<0.05). Isso corrobora com o fato das fêmeas
serem mais resistentes às infecções do que os machos.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
80
4.3.3 Produção de citocinas in vitro de camundongos crônicos após desafio
sustentado
Levando em consideração o fato de nas duas experiências de desafio
sustentado termos obtido uma maior proliferação ao antígeno de T. cruzi pelos
esplenócitos CD4
+
dos animais do grupo desafiado, mas havendo discordâncias na
classe de anticorpos específicos aumentados no soro após desafio (IgG2a e IgG1 na
primeira experiência e somente IgG1 na segunda), restava-nos saber qual o padrão
de citocinas que poderia estar associado ao perfil de resposta aumentada desta
segunda experiência. Camundongos crônicos machos e fêmeas foram sacrificados
55 e 68 dias após o último desafio, respectivamente, tiveram o baço processado, os
esplenócitos coletados e mantidos em cultura por 48 e 72 horas na presença de
antígeno de T. cruzi. Após esse período, coletamos os sobrenadantes para
mensurar os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IFN e TNF pelo ensaio de CBA
(Cytometric Bead Array). Avaliamos também por Elisa de captura, a produção da
importante citocina reguladora, IL-10.
Machos
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
81
Figura 31: Análise através do ensaio CBA da produção de citocinas Th1 e Th2 de animais crônicos
machos após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4. Camundongos machos crônicos e
crônicos desafiados foram sacrificados 55 dias após o desafio, os esplenócitos estimulados com
antígeno de T. cruzi por 48 e 72 horas, e os sobrenadantes das culturas processados para
determinação da produção das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IFN e TNF Crônicos controles (■) e
crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados estatisticamente diferentes:* p<0.05; **
p<0.01; **** p<0.001. As linhas horizontais indicam os valores médios das citocinas produzidas, após
48-72 h de cultura na presença de antígeno de T. cruzi, pelos esplenócitos de animais não
infectados.
Quando comparados aos animais crônicos, os camundongos machos
crônicos desafiados mostram uma produção semelhante de IL-2 nos sobrenadantes
das culturas de 48 horas. Com relação às citocinas do padrão Th2, IL-4 e IL-5,
diferenças também são observadas. Nos machos desafiados a IL-4 tem um pequeno
aumento não significante, enquanto que para a IL-5, se observa aumento no grupo
desafiado próximo do limite de significância. Quanto à produção do IFN, verificamos
que em ambos os grupos, crônicos e crônicos desafiados, os níveis são bastante
elevados, entretanto, os animais crônicos desafiados mais uma vez apresentam
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
82
níveis discretamente superiores, porém não significativos, aos encontrados nos
animais crônicos. Diferentemente do IFN, o TNF está presente em níveis mais
altos nos sobrenadantes dos esplenócitos dos animais crônicos controles do que
naqueles dos animais crônicos desafiados, fenômeno observado tanto as 48 como
às 72 horas, mas que não atinge significância estatística (Figura 31).
Fêmeas
Figura 32: Análise através do ensaio CBA da produção de citocinas Th1 e Th2 de animais crônicos
fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4. Camundongos fêmeas crônicos e
crônicos desafiados foram sacrificados 68 dias após o desafio, os esplenócitos estimulados com
antígeno de T. cruzi por 48 e 72 horas, e os sobrenadantes das culturas processados para
determinação da produção das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IFN e TNF Crônicos controles (■) e
crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados estatisticamente diferentes:* p<0.05; **
p<0.01; **** p<0.001. As linhas horizontais indicam os valores médios das citocinas produzidas, após
48-72 h de cultura na presença de antígeno de T. cruzi, pelos esplenócitos de animais não
infectados.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
83
Na avaliação das citocinas presentes nos sobrenadantes das fêmeas,
podemos observar um aumento da produção de IL-2 nos animais desafiados apenas
às 48 horas de cultura. Já para nossa surpresa, as citocinas IL-4 e IL-5 se
apresentam em quantidades significativamente maiores nas fêmeas desafiadas
(P<0.05), tanto as 48 como às 72 horas. Do mesmo modo o IFNγ é superior nos
animais desafiados, com médias equivalentes nos dois tempos, 48 e 72 horas.
Contudo, contrário aos resultados dos machos desafiados, as fêmeas desafiados
apresentam níveis superiores do TNFα as 48 horas (Figura 32).
Machos Fêmeas
Figura 33: Análise através do ensaio de Elisa de captura da produção de IL-10 por esplenócitos de
animais crônicos machos e fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4.
Camundongos machos (esquerda) e fêmeas (direita), crônicos e crônicos desafiados, foram
sacrificados 55 ou 68 dias após o desafio sustentado e a produção da citocina IL-10 determinada no
sobrenadante das culturas dos esplenócitos estimulados por 48-72 horas na presença de antígeno
de T. cruzi. Crônicos controles (■) e crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados
estatisticamente diferentes:* p<0.05; ** p<0.01; **** p<0.001. As linhas horizontais indicam os valores
médios da citocinas produzida, após 48-72 h de cultura na presença de antígeno de T. cruzi, pelos
esplenócitos de animais não infectados.
Na avaliação do nível da citocina IL-10 por Elisa, os camundongos
machos desafiados apresentam níveis semelhantes aos dos crônicos às 48 horas,
porém às 72 horas, ocorre um aumento expressivo desta citocina no sobrenadante
dos esplenócitos dos animais desafiados (p<0.05). Já para as fêmeas, um aumento
significativo na produção de IL-10 pôde ser demonstrado no sobrenadante de 48
horas dos animais do grupo desafiado (p<0.005) (Figura 33). Estes resultados
podem indicar que mesmo os animais desafiados produzam quantidades
discretamente mais elevadas do IFN, moléculas anti-inflamatórias são também
induzidas pelo desafio, o que indica o alto nível de regulação da atividade efetora
frente o parasito.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
84
4.3.4 Análise da produção de óxido nítrico in vitro de animais crônicos após
desafio sustentado
Embora o desafio possa induzir um pequeno aumento da capacidade de
produzir IFN em reposta ao antígeno de T. cruzi pelos esplenócitos do animal
crônico, as citocinas com função antagônica IL-5 e IL-10, também se apresentaram
elevadas. Considerando a possibilidade da IL-10 interferir nas atividades pró-
inflamatórias dos macrófagos, decidimos avaliar a presença do óxido nítrico (NO) de
maneira indireta pela estimativa das concentrações de nitrito nos sobrenadantes de
camundongos machos e fêmeas, crônicos e crônicos desafiados. Esplenócitos totais
coletados após 55 e 68 dias do último desafio de machos e fêmeas respectivamente
foram mantidos em cultura com, ou sem a presença de antígeno de T. cruzi e 48 e
72 horas depois os sobrenadantes foram aliquotados e os níveis de NO mesurados.
Machos Fêmeas
Figura 34: Análise da produção do óxido nítrico pelos esplenócitos de animais crônicos machos e
fêmeas após desafio sustentado com parasitas Sylvio X10/4. Camundongos machos e fêmeas,
crônicos e crônicos desafiados foram sacrificados 55 e 68 dias após o desafio sustentado
respectivamente e os baços processados para determinação da produção do NO pelos esplenócitos
após cultura por 48 e 72 horas na presença de antígeno de T. cruzi. Crônicos controles (■) e
crônicos desafiados (□). O asterisco indica resultados estatisticamente diferentes:* p<0.05; **
p<0.01.
Os sobrenadantes dos esplenócitos de camundongos machos
desafiados apresentaram níveis comparáveis de NO aos dos animais crônicos, ou
seja, o desafio não causou o aumento da atividade microbicida dos macrófagos,
avaliada pela produção do NO. Isto pode ser observado tanto nas culturas de 48
como nas de 72 horas, espontaneamente ou estimuladas com antígeno de T. cruzi.
Por outro lado, as fêmeas desafiadas produzem níveis mais altos de NO as 48 e 72
horas de modo espontâneo, e às 48h com estimulo antigênico (Figura 34).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
85
4.3.5 Aumento da carga parasitária sangüínea nos animais crônicos desafiados
de modo sustentado
Camundongos C3H/HePAS, machos e fêmeas, crônicos foram desafiados por
quatro vezes, e sacrificados 55 e 68 dias após o último desafio respectivamente para
terem o nível de parasitismo sangüíneo avaliado através de culturas em meio LIT.
Foram coletados 15µl de sangue por animal e distribuídos em 3 poços (5µl por poço
contendo 1ml de LIT).
Machos
Figura 35: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos crônicos após desafio
sustentado. No dia 55 pós-desafio, os animais machos foram sacrificados e 3 alíquotas de sangue
de cada animal foram cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença de parasitas nas culturas
nas semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da freqüência de animais que
deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas positivas por grupo. Crônico
controle (■) e crônico desafiado (■)
Os camundongos machos crônicos, 55 dias após serem desafiados pela
última vez, apresentam porcentagens superiores de culturas positivas (% de animais
com culturas LIT positivas e % de culturas LIT positivas por grupo) do que os
camundongos crônicos controles (Figura 35). Com resultado semelhante, as fêmeas
do grupo crônico desafiado revelam uma quantidade maior de parasito no sangue do
que as fêmeas do grupo crônico controle (Figura 36).
De forma inesperada, estes resultados não concordam com os realizados na
experiência anterior de desafio sustentado em que os animais eram sacrificados 35
dias (machos) e 45 dias (fêmeas) após o último desafio.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
86
Fêmeas
Figura 36: Análise de parasitismo subpatente no sangue de camundongos crônicos após desafio
sustentado. No dia 68 pós-desafio, os animais fêmeas foram sacrificados e 3 alíquotas de sangue de
cada animal foram cultivadas em meio LIT, verificando-se a presença de parasitos nas culturas nas
semanas subseqüentes. Os resultados foram expressos em função da freqüência de animais que
deram culturas positivas, assim como pela freqüência de culturas positivas por grupo. Grupo crônico
controle (■) e crônico desafiado (■).
4.3.6 A patologia cardíaca não é reduzida em animais crônicos após desafio
sustentado
Com o intuito de confirmar os resultados obtidos no experimento de
desafio sustentado anterior em que animais crônicos desafiados reduziam
moderadamente os níveis de patologia, optamos novamente por realizar a análise
histopatológica de animais machos e fêmeas, crônicos e crônicos desafiados. Os
camundongos machos foram sacrificados 55 dias após o último desafio, enquanto as
fêmeas após 68 dias. A patologia foi avaliada estimando de maneira qualitativa a
presença de infiltrados inflamatórios no coração (0; nenhuma; 1: leve; 2: moderada;
3: média; 4: intensa e 5: severa).
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
87
Machos
Figura 37: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda) e do número de ninhos no coração (direita) após
desafio sustentado dos camundongos crônicos. Camundongos machos crônicos controles e
crônicos desafiados por quatro vezes foram sacrificados 55 dias após o desafio e avaliados de
maneira qualitativa em relação à intensidade da patologia no coração pela presença de infiltrados
celulares e número de ninhos. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□).O asterisco indica
resultado estatisticamente diferente: * p<0.05; ** p<0.01.
Em relação à patologia, os resultados obtidos com os camundongos
machos desafiados não confirmam os resultados do experimento de desafio
sustentado anterior, no qual era observada uma sutil regressão da patologia. Assim,
de forma contrária, nesta segunda experiência o desafio exacerba significativamente
a patologia na aurícula e pericárdio. Contudo, de maneira global as patologias de
ambos os grupos não diferem estatisticamente. Na avaliação da presença de ninhos
no tecido cardíaco, o número de ninhos observados nas lâminas dos camundongos
desafiados, surpreendentemente é superior à dos camundongos crônicos, apesar
das diferenças não serem significativas (Figura 37).
Fêmeas
Figura 38: Avaliação da patologia cardíaca (esquerda) e do número de ninhos no coração (direita) após
desafio sustentado dos camundongos crônicos. Camundongos fêmeas crônicos controles e
crônicos desafiados por quatro vezes foram sacrificados 68 dias após o desafio e avaliados de
maneira qualitativa em relação à intensidade da patologia no coração pela presença de infiltrados
celulares e número de ninhos. Crônico controle (■) e crônico desafiado (□).
Nas fêmeas, o desafio exerceu leves mudanças. Apesar das fêmeas
exibirem uma tendência para o aumento nos níveis de pericardite, miocardite e
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
88
endocardite, assim como na avaliação global, as diferenças não se tornam
significantes (Figura 38). Quanto à presença de ninhos no tecido cardíaco das
fêmeas, não há grande diferença. Desconsiderando algumas exceções, mais
precisamente uma das fêmeas crônicas e duas do grupo desafiado, a maior parte
dos animais de ambos os grupos apresentam poucos ou nenhum ninho (Figura 38).
Estes resultados indicam que apesar do aumento da resposta imune
específica dos animais crônicos, o desafio sustentado não se mostra eficiente para
diminuir a carga parasitária sistêmica e promover uma redução da patologia dos
animais crônicos em um tempo mais tardio.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
89
5 DISCUSSÃO
Seguindo o caminho inicialmente trilhado por Marinho et al., que
estudaram o desafio de camundongos da linhagem A/J crônicos com T. cruzi da
cepa Y [25], temos avaliado o efeito do desafio com parasita homólogo no modelo
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
90
de infecção de camundongos C3H/HePAs cronicamente infectados por T. cruzi da
cepa Sylvio X10/4.
No modelo com camundongos A/J, Marinho et al. observaram elevação
dos níveis séricos de anticorpos, do número de linfócitos esplênicos CD4
+
e CD8
+
,
da produção de IFN e, mais ainda, redução da parasitemia sistêmica, contribuindo
para idéia de que no animal crônico a resposta do sistema imune ao parasito não se
encontra otimizada. Uma vez que o modelo A/J-Y não apresenta patologia cardíaca,
prosseguimos por esta mesma linha de pesquisa, agora utilizando uma diferente
cepa do parasito e linhagem de camundongo. Para os experimentos realizados
neste projeto, optamos pela infecção crônica de camundongos C3H/HePAS com a
cepa Sylvio X10/4 do T. cruzi. Neste modelo, os animais não apresentam
parasitemia sistêmica, embora o parasito possa ser detectado no sangue em baixas
quantidades através de hemocultura, mas sofrem patologia crônica cardíaca que
parece depender da presença local do parasito, se assemelhando em boa parte à
doença crônica observada em pacientes infectados pelo T.cruzi. Adotamos como
hipótese de trabalho aquela que presume que a patologia chagásica resulta da
reatividade aos parasitas remanescentes no coração. Neste contexto, considerando
que um aumento da atividade efetora específica frente ao parasita poderia reduzir ou
até eliminar os parasitas presentes no tecido cardíaco, cogitamos que numa primeira
etapa se observariam infiltrados celulares mais intensos nos animais desafiados em
comparação aos crônicos, porém, em longo prazo, com a redução do numero de T.
cruzi no coração, ocorreria progressivamente uma diminuição da patologia.
Visando aumentar a resposta imune especifica, numa primeira
experiência desafiamos camundongos fêmeas cronicamente infectados pelo T. cruzi
com uma única dose de 5x10
6
parasitas homólogos vivos. O desafio único dos
camundongos crônicos mostrou que a resposta imune pode ser aumentada no
modelo C3H/HePAS / Sylvio X10/4. A modulação positiva da resposta imune foi
evidenciada no grupo desafiado pelo aumento no número de linfócitos CD4
+
e CD8
+
no baço e aumento da freqüência das mesmas subpopulações no baço e sangue.
Nos animais desafiados ambas as populações de linfócitos T mostraram capacidade
aumentada de produzir IFNγ, importante citocina no controle da infecção pelo T.
cruzi [64, 65], como de outros parasitos intracelulares [66, 67]. O aumento da
produção de IFN mostrou-se evidente apenas aos 10 dias pós-desafio, mas não no
dia 60, o que nos levou a crer que talvez fosse necessário um estímulo sustentado
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
91
para prolongar a potenciação da resposta especifica. Resultados anteriores do
nosso laboratório mostraram que os níveis séricos de anticorpos dos animais
crônicos são suficientes para a remoção de altas doses do tripomastigotas quando
inoculados na veia. Os parasitas inoculados no animal crônico são possivelmente
recobertos por anticorpos, o que facilita sua remoção do sangue no pulmão, fígado e
baço. Com este panorama, pode-se afirmar que a apresentação do antígeno esteja
ocorrendo via MHC classe II para as células T CD4
+
. Entretanto, nossos resultados
mostrando o aumento da população de CD8
+
corroboram com a possibilidade das
APCs estarem também apresentando o antígeno do parasito via MHC de classe I, a
chamada apresentação cruzada. Alternativamente, o aumento das células CD8
+
poderia estar acontecendo em resposta às citocinas (como IL-15) liberadas por
outras populações celulares.
No dia 10 do desafio único, a expansão clonal, o aumento de células
efetoras/memória produtoras de IFN e o aumento das IgG1 e IgG2a parasito-
específicas não foram suficientes para aumentar a remoção / eliminação de
parasitos do sangue e tecido cardíaco, e a patologia cardíaca (e muscular) se
manteve semelhante à dos animais crônicos. Contudo, a ausência de uma redução
da parasitemia subpatente foi um resultado surpreendente, pois difere daquele
observado por Marinho et al. no modelo de camundongos A/J infectados por
parasitas da cepa Y. Os resultados obtidos após desafio único no modelo
C3H/HePAS/Sylvio X10/4 sugere que os parasitas que persistem no sangue dos
animais crônicos desafiados são relativamente resistentes ao aumento no nível de
anticorpos. Por outro lado, o pequeno aumento da hepatite observado nos animais
desafiados pode ser facilmente explicado em função do fígado ser um dos locais de
remoção dos parasitos opsonizados por anticorpos [30].
A falha na tentativa de reduzir a patologia cardíaca desafiando
camundongos crônicos com uma única dose do parasita, junto ao fato dos
parâmetros citados acima retornarem aos níveis basais do animal crônico aos 60
dias do desafio único, nos levou a cogitar a necessidade de testarmos um protocolo
de desafio sustentado na tentativa de reduzir ou controlar a patologia. Este consistiu
em aplicar quatro doses do parasito homólogo vivo (as 2 primeiras i.v. e as 2 últimas
i.p.). A hipótese por trás desta nova proposta, é que neste modelo, a eliminação do
parasito no coração poderia ocorrer principalmente quando uma célula infectada
(ninho) se rompe. Levando em conta a possibilidade de isso acontecer em
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
92
momentos incertos (transitórios ou em períodos longos), surgiu o desafio sustentado
como estratégia para manter a resposta imune otimizada por um longo tempo, o que
poderia gradualmente forçar uma diminuição do ciclo do T. cruzi no coração e no
hospedeiro vertebrado como um todo.
O primeiro experimento de desafio sustentado (experimento de desafio
sustentado I), realizada em camundongos machos e fêmeas, 35 e 45 dias após o
último desafio respectivamente, mostrou que no baço dos animais desafiados o
aumento dos linfócitos CD4
+
perdura por mais tempo do que o das CD8
+
. A
capacidade efetora destas duas subpopulações foi mensurada quanto à produção
do IFNγ. As análises de FACS mostraram que as células T CD4
+
são mais eficientes
em produzir esta citocina no baço, enquanto que no sangue são as células T CD8
+
.
Por outro lado, os ensaios de proliferação realizados nos camundongos machos do
desafio sustentado I mostraram que após o desafio sustentado há aumento da
capacidade proliferativa das células CD4
+
esplênicas frente ao estímulo específico.
Resultado idêntico foi obtido na experiência do desafio sustentado II, confirmando
que o desafio sustentado leva a um aumento das células CD4
+
de memória.
Entretanto, o fato de não termos achado aumento da proliferação antígeno-
específica das células CD8
+
após 96 horas de cultura não pode ser tomado como
prova do desafio sustentado ativar mais intensamente o compartimento CD4
+
do que
o compartimento CD8
+
. Isto não pode ser concluído pelo fato do nosso ensaio de
proliferação, que utiliza antígeno de T. cruzi solúvel, privilegiar a apresentação
antigênica para as células CD4
+
.
Além do aumento da capacidade efetora/memória das células CD4
+
, em
ambos experimentos sustentados, I e II, o desafio sustentado promoveu um aumento
do nível sérico de anticorpos anti-T. cruzi. Porém, enquanto que o aumento de IgG1
anti-T. cruzi foi observado nos machos e fêmeas desafiadas de ambas as
experiências, o aumento de IgG2a (que presume uma estimulação tipo TH1) foi
somente observado para os machos do desafio sustentado I.
Considerando a necessidade de uma avaliação funcional detalhada dos
efeitos do tratamento sustentado realizamos no desafio sustentado II uma análise
das citocinas produzidas após estimulação antígeno-específica dos esplenócitos dos
animais crônicos e crônicos desafiados. Na experiência realizada, a análise dos
sobrenadantes dos animais crônicos desafiados revelou aumento da produção de
citocinas, tanto do perfil TH1, como do perfil TH2. Desta forma, os animais
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
93
desafiados mostraram produção aumentada, não somente de IFN, mas de IL-4, IL-
10 e de IL-5. Além disso, um aumento da produção espontânea de óxido nítrico foi
também revelado. Contudo, com exceção do aumento da IL-5 e IL-10, observado
tanto nos machos como nas fêmeas, o aumento dos outros mediadores foi somente
detectado nas fêmeas.
Prosseguindo com nosso estudo dos efeitos do desafio sustentado
avaliamos a sua influência sobre a carga parasitária sistêmica e a patologia dos
animais crônicos, objetivo central do presente projeto. Nos animais crônicos
desafiados observamos mudanças discretas nestes parâmetros. Entretanto, e para
nosso desapontamento, nas duas experiências realizadas o desafio sustentado
induziu efeitos contrários nestes dois parâmetros. Desta forma, no desafio
sustentado I, a inoculação reiterada de altas doses do parasita vivo levou a uma
redução da parasitemia subpatente no sangue dos camundongos crônicos machos e
fêmeas. Mais ainda, uma redução moderada e significativa da infiltração linfocitária
cardíaca foi também observada neste experimento. Desta forma, os resultados os
resultados do experimento de desafio sustentado I apresentam concordância com os
estudos apresentados recentemente por Sanchez-Burgos et al. [61] onde a
vacinação terapêutica com plasmídeos que codificam as proteínas Tc24 and TSA-1
de T. cruzi induz uma redução significante da parasitemia, mortalidade, miocardite e
carga parasitária no coração. Na tentativa de confirmar os nossos resultados,
repetimos o desafio sustentado e verificamos novamente a parasitemia e a patologia
cardíaca. Entretanto, os resultados da experiência do desafio sustentado II não
confirmaram os resultados obtidos na primeira experiência. Assim, nos
camundongos machos e fêmeas, sacrificados 55 e 68 dias após o último de quatro
desafios, mostraram (em relação aos animais crônicos não desafiados) um discreto
aumento do parasita no sangue e um pequeno agravamento da patologia.
A discrepância observada nos resultados de carga parasitaria/patologia
cardíaca das duas experiências pode ser encarada de formas diferentes. Numa
primeira interpretação, a discrepância pode estar indicando que a inoculação
reiterada de tripomastigotas exerce um efeito muito discreto sobre a carga
parasitária e a patologia cardíaca, a diferença entre as experiências expressando
variabilidade experimental de pouca importância. Alternativamente, a discrepância
entre os resultados dos experimentos de desafio prolongado I e II, pode indicar que
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
94
a carga parasitária e a patologia podem ser moduladas pelo desafio sustentado, mas
que a modulação pode acontecer nos dois sentidos, de melhora ou de agravamento.
Nesta visão, os desafios sustentados I e II seriam a expressão de modulações
incipientes (ou discretas) nas duas direções, sendo extremamente importante
esclarecer quais as condições que levam às diferentes modulações.
Na óptica da primeira interpretação devemos nos perguntar porque o
desafio sustentado não consegue reduzir a carga parasitária local e a patologia do
animal crônico. Dentre as possíveis respostas para esta pergunta, pode-se cogitar:
a) que a inoculação com tripomastigotas (via i.v ou i.p) não é estímulo suficiente para
potenciar os mecanismos efetores necessários para a destruição dos parasitas no
tecido cardíaco. Neste contexto, desconhecemos se nas nossas experiências houve
indução de células CD8
+
citotóxicas, supostamente envolvidas na destruição de
cardiomiócitos infectados; b) que o aumento sistêmico da atividade efetora frente ao
T. cruzi não se acompanha forçosamente de um aumento da migração celular ao
tecido cardíaco infectado, processo que depende exclusivamente de sinalização
local; c) Além disso, a indução de mecanismos de regulação poderia estar
contrabalançando o aumento da resposta imune nos animais desafiados
contribuindo à discreta/nula eficiência do desafio sustentado na redução da
patologia. Neste contexto, Fernando D. Pretel do nosso laboratório utilizando
esplenócitos dos animais do experimento desafio sustentado I mostrou que nos
animais crônicos desafiados o número de linfócitos T
reg
CD25
+
FoxP3
+
é maior do
que no baço dos camundongos crônicos.
Já na óptica da segunda interpretação, seria importante determinar o
porque do diferente comportamento dos experimentos dos desafios sustentados I e
II. Neste sentido e apesar do nosso estudo ser incompleto, pode se cogitar que a
resposta imune induzida pelo desafio sustentado foi qualitativamente diferente nas
duas experiências. Desta forma, a resposta imune anti-T. cruzi poderia ter se
aprofundado para TH1 no desafio sustentado I e para um perfil misto TH1/TH2 no
desafio sustentado II, modulando diferentemente o padrão de citocinas e
imunoglobulinas secretadas. Dados em modelos murinos mostram que citocinas
inflamatórias tem um papel central no controle da infecção pelo T. cruzi [68]. Assim,
as citocinas inflamatórias IL-12, IFNγ e TNFα estão associadas com a resistência à
infecção [69]. Já as citocinas do padrão Th2 conduziriam para um aumento de
suscetibilidade na infecção, como mostrado por Abrahamson et al (1996), com
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
95
ensaios de transferências de células Th2 T.cruzi-específicas em que os animais não
conseguem controlar os níveis de parasitemia [70]. A título ilustrativo da existência
de diferenças qualitativas na resposta imune nas duas experiências, a indução de
IFN e de IgG2a (isótipo de imunoglobulina que corresponde ao padrão TH1) foram
mais expressivos no desafio sustentado I, que no desafio sustentado II, sendo que
desta última experiência os machos crônicos desafiados secretaram níveis de IFNγ
equivalentes aos dos machos crônicos. A possibilidade de ter se estabelecido na
experiência do desafio sustentado II um padrão de citocinas mais próximo do perfil
TH2 pode ser também cogitado pelo aumento de IL-5, e IL-4. No entanto, esta
possibilidade carece de validez uma vez que as citocinas TH2 não foram avaliadas
na experiência 2. Já em relação ao aumento da produção de IL-10, observado nos
animais tratados do desafio sustentado II, o cenário é ainda mais complexo, uma vez
que diversos estudos têm demonstrado que células efetoras Tbet
+
(Th1) também são
fontes da produção de IL-10 em infecções por Toxoplasma gondii [71] e Leishmania
major [72]. Isto poderia conferir as células TH1 o autocontrole da regulação [73],
como forma de minimizar o dano tecidual ao passo que restringe a habilidade de
eliminar totalmente o parasita.
Em um contexto geral, podemos dizer que a patologia cardíaca nos
animais com infecção crônica pelo Trypanosoma cruzi não foi reduzida mediante um
aumento da resposta imune frente ao parasito induzido pelo desafio sustentado com
parasito homólogo vivo. Experiências adicionais tornam-se necessárias para
esclarecer se o controle do T. cruzi no coração pode ser promovido por uma
manipulação da resposta imune. Acreditamos que deva ser apoiado o
desenvolvimento de vacinas terapêuticas que considerem a otimização da resposta
imune quanto à geração de linfócitos de memória CD8
+
e CD4
+
e o aumento da
produção de IFN deva ser apoiada. Contudo, para que esses elementos
contribuam nos mecanismos de eliminação do parasito e uma conseqüente redução
patologia, os mecanismos de regulação e tolerância na doença de Chagas precisam
ser mais estudados.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
96
6 CONCLUSÕES
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
97
6.1 Desafio Único
Nossos estudos mostram que o desafio único com parasita homólogo de
camundongos C3H/HePAS crônicos infectados pelo T. cruzi da cepa Sylvio X10/4
causa um aumento passageiro da resposta imune:
No décimo dia do desafio, as populações de linfócitos CD4
+
e CD8
+
produtores de IFN encontram-se aumentadas no baço e sangue dos camundongos
desafiados. No entanto, o aumento da resposta não é mais perceptível no dia 60
após desafio.
Os animais desafiados têm aumento da resposta humoral parasita-
específica após 10 dias do desafio com a produção de anticorpos IgG1 e IgG2a. No
entanto, no dia 60 pós-desafio as diferenças entre os grupos não são mais
significativas.
O aumento da resposta imune induzido pelo desafio único não reduz a
carga parasitária sistêmica nos camundongos crônicos desafiados, embora aos 60
dias a carga parasitária cardíaca esteja diminuída nestes animais.
Os camundongos crônicos desafiados com uma única dose de T. cruzi
não apresentam diferenças na patologia cardíaca quando comparados aos animais
crônicos.
6.2 Desafio Sustentado I e II
O desafio sustentado de camundongos machos e fêmeas crônicos
resulta em um aumento da resposta imune:
No experimento de desafio sustentado I, os camundongos crônicos
machos e fêmeas desafiados apresentam aumento no número de linfócitos
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
98
esplênicos CD4
+
produtores de IFN, enquanto que os linfócitos esplênicos CD8
+
IFN
+
mostram uma tendência para o aumento.
Em ambos os experimentos realizados, o desafio sustentado de
camundongos crônicos machos e fêmeas causa um aumento da proliferação dos
linfócitos CD4
+
em resposta ao antígeno de T.cruzi.
Nos animais desafiados machos e fêmeas a produção de anticorpos
IgG1 também se mostra aumentada nos dois experimentos de desafio sustentado.
No experimento de desafio sustentado II observamos que nos
camundongos machos desafiados há aumento da produção de citocinas de perfil
TH2, como IL-5 e IL-10, enquanto que nos camundongos fêmeas desafiados, o
aumento ocorre tanto para as citocinas de perfil TH2, IL-4, IL-5 e IL10, como para as
de perfil TH1, como IFN, TNF e IL-2.
Neste mesmo experimento, as fêmeas desafiadas aumentam a produção
de óxido nítrico (NO) de maneira espontânea e após estimulação com antígeno de T.
cruzi.
No desafio sustentado I, o tratamento sustentado de camundongos
crônicos machos e fêmeas com parasito homólogo resulta na redução dos níveis da
carga parasitária do sangue, embora no experimento de desafio sustentado II os
animais tratados apresentarem níveis mais altos do parasita.
Finalmente, nos dois experimentos realizados, o desafio sustentado de
camundongos crônicos machos e fêmeas causou mudanças na patologia cardíaca
de signo diferente. Assim, enquanto que nos animais tratados do desafio sustentado
I há uma discreta redução da patologia, no desafio sustentado II, os animais machos
desafiados aumentam a patologia cardíaca enquanto as fêmeas desafiadas não
mostram alterações significativas neste parâmetro.
Rosas-Jorquera, C.E.
A influência do desafio com o parasita sobre a patologia cardíaca durante a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
99
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