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ELISA KORENBLUM
ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS DE
PRODUÇÃO DE PETRÓLEO
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas (Microbiologia).
Orientador: Profa. Dra. Lucy Seldin
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
DEZEMBRO DE 2008
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Elisa Korenblum
2008
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KORENBLUM, ELISA
ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM
SISTEMAS DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO/ Elisa Korenblum – Rio de Janeiro,
2008
xvi,106
Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo
de Góes, 2008.
Orientador: Lucy Seldin
Referências bibliográficas: 206
1. Microbiologia do petróleo 2. Rocha petrolífera 3. Bactéria redutora de
sulfato 4. Acidulação biogênica 5. Corrosão 6. Biocidas 7. Substâncias
antimicrobianas produzidas por Bacillus
Korenblum, Elisa
UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Doutorado em Ciências
(Microbiologia).
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Elisa Korenblum
2008
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"A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
“Toda dissertação tem uma história. Esta história é
construída a partir de mil definições do objeto, das
mudanças de perspectivas, das indecisões, dos cenários
novos, das inseguranças sobre tudo que não foi lido, da
paranóia sobre a “qualidade” do escrito, das vontades de
rasgar tudo e recomeçar, dos ataques de inspiração e da
falta dela. Uma tese exige, além de conhecimentos gerais e
específicos, uma enorme paciência e disponibilidade
psicológica para expor-se, errar, experimentar, recomeçar,
observar e ousar”.
Autor desconhecido
Elisa Korenblum
2008
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Dedico não apenas este trabalho, mas todas as conquistas
da minha vida, à minha família,
em especial aos meus pais, Helio e Angela,
que sempre me apoiaram.
Elisa Korenblum
2008
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Elisa Korenblum
ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS
DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO
Rio de Janeiro, 10 de dezembro de 2008.
(Profa. Dra. Lucy Seldin, IMPPG/UFRJ)
(Prof. Dr. Andrew Macrae, IMPPG/UFRJ)
(Profa. Dra. Valéria Maia de Oliveira, UNICAMP)
(Dr. Bias Marçal de Faria, CENPES/Petrobras)
(Porf. Dr. Alexandre Soares Rosado, IMPPG/UFRJ)
Elisa Korenblum
2008
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Microbiana,
Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob
orientação da Dra. Lucy Seldin.
Elisa Korenblum
2008
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Agradecimentos
Agradeço à minha orientadora, Professora Lucy, por me orientar em mais uma etapa
importante da minha formação acadêmica, pela confiança creditada, ensinamentos e
conversas fundamentais para a realização dessa dissertação. Sobretudo pelo exemplo de
pessoa e de profissional dedicado, sempre oferecendo o melhor para seus alunos.
A Universidade Federal do Rio de Janeiro, em especial à Coordenação do Programa
de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), pela oportunidade e formação de
qualidade. Agradeço à direção do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes pelas
facilidades oferecidas.
Aos meus pais, minha vida. Quem os conhece sabe a dedicação que têm comigo e
com meu irmão, são meu presente de D’s, meus melhores amigos. Agradeço pelo carinho,
pela atenção, pelo colo, pelos ensinamentos, pelo apoio incondicional, por me aceitarem,
por respeitarem e apoiarem minhas decisões e meus sonhos. Nesta reta final, como sempre,
a presença e apoio foram fundamentais.
Ao meu maninho querido Andre, por se portar como irmão mais velho, me
protegendo, me aconselhando, por ser um grande amigo sempre, pelas brincadeiras, pela
confidencia que temos um com outro. Final de ano difícil para nós dois, não é mesmo?!
Muito trabalho que nos trará bons frutos. O Meza Bar fará sucesso e os cariocas vão adorar!
Agradeço à Luiza, minha futura cunhada, pela amizade e carinho.
À minha avó amada e idolatrada, pelo exemplo de garra, de alegria de vida, pelo
carinho, por ser simplesmente a melhor avó do mundo.
À minha família que amo tanto, pelo incentivo, pelo amor, pela amizade, pelos
conselhos, pelos valiosos e alegres momentos juntos. Agradeço em especial ao mais novo
membro da família, a mais linda e perfeita, minha fofinha “sobrinha-prima” Julinha,
obrigada por fazer a nossa família ainda mais feliz.
Aos professores do Departamento de Microbiologia Geral, em especial aos
professores Alexandre Rosado, Andrew Macrae, Celuta Sales Alviano, Eliana Bergter,
Rosalie Reed Coelho, Thaïs Souto-Padrón e Ulysses Lins por estarem sempre com seus
laboratórios de portas abertas e prontos a ajudar, pelos ensinamentos e disponibilidade para
discussões e esclarecimentos.
Ao Prof. Alexandre Rosado, por aceitar fazer a revisão desta tese, mesmo numa
Elisa Korenblum
2008
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época que se encontra tão atarefado: fechando grandes projetos, terminado a correção de
artigos, ministrando aulas, participando de reuniões, de organizações de congressos,
preparando mais uma palestra, dando mais uma entrevista, ainda assim teve tempo de
revisar minha tese. Obrigada!
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Andrew Macrae, Prof. Dra. Valéria
Maia de Oliveira, Dr. Bias Marçal de Faria, por aceitarem fazer parte da banca.
Ao CENPES-Petrobras, pelos projetos GENOPETRO e CORROSÃO. Em especial,
agradeço às pesquisadoras Gina Vazquez Sebastián e Mônica Penna.
À Prof. Maria Antonia Malajovich, pelo exemplo, confiança e apoio desde o curso
de ensino fundamental, no Instituto de Tecnologia ORT.
Aos valiosos amigos do Laboratório de Genética Microbiana, que sempre estiveram
dispostos a ajudar, discutir resultados e melhorar o desempenho da equipe como um todo.
Não posso deixar de agradecer pelas festas e churrascos que deram o tempero todo especial.
Obrigada, Renata, Vanessa, Luciano, Silvia, Diju, Diobs, Sicotta, Joana, Juliana, Si
Siqueira e Natália.
À Janinha, pela dedicação e carinho indispensáveis e muito preciosos.
Aos meus estimados co-orientandos Diju, Diobs, Raquel, Joana e Vinicius.
Ao Prof. Brent M. Peyton, que me recebeu de braços abertos em seu laboratório, por
confiar em meu trabalho e por estar sempre pronto a ajudar. Aos colegas do Peyton’s lab
Abbie, Storm, Mike, John, James, Catherine e especialmente a minha amiga Sutapa. Aos
colegas do CBE-MSU Betsey, Lynne e John Neuman.
Aos amigos internacionais que conheci em Bozeman, Priscila, Andreas, Brent,
Thiru, Markus, Purcie, Dibyendu, Kathy, Magnólia, Silvina. Vocês foram minha família
em Montana.
À minha vizinha de bairro, minha amiga querida e minha irmã científica Marcinha,
pelo carinho, pelas conversas sobre amenidades e seriedades do dia a dia, mas
principalmente pelo apoio que me deu na pesquisa, nos ensinamentos e nas dicas
fundamentais.
À minha amiga de todas as horas, Erikita, sempre pronta pra tudo mesmo! Seja no
trabalho ou a qualquer hora do dia no samba! Agradeço a Petrobras por muitas coisas, mas
nunca vou esquecer esse presente! Uma amizade dessas, pra vida toda!
Elisa Korenblum
2008
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Às minhas muito queridas amigas Iba, Quel, Juliana e Júlia. Por serem minhas
amigas “espelho”. Me espelho em vocês. Porque vocês são lindas... E guerreiras,
trabalhadoras, decididas, focadas. Mas, especialmente, por nossas conversas e chopes
essenciais.
Aos amigos da “Micro” Raquel Peixoto, Felipe Dias, Patrícia Hodos, Claudia
Cunha, Prof. André Santos, Prof. Walter Oelemann, Prof. Marco Miguel.
Às minhas amigas do curso de “Micro” desde a graduação, Dani e Rachel.
Agradeço às minhas grandes amigas Trica, Dani, Aline, Flávia, Tathi, Carina, Fabs,
Robertinha, Karen, Helena, Bianca pela amizade de longa data e pelas conversas e boas
gargalhadas de sempre. Adoro muito vocês! Vamos envelhecer juntas.
À Fernanda, ou melhor Nana e Jonas, pela amizade e por me dar um “sobrinho”
lindo.
À Flavia e Arthur, amizades que vieram definitivamente ficar na minha vida.
Obrigada por tudo!
À Dorinha, pela carinho e pelas guloseimas deliciosas.
À American Society for Microbiology que me concedeu o prêmio ASM Fellowship
for Latin Amerincan Students.
Ao CNPq pelo fomento de bolsa de estudo.
A todos que de alguma forma contribuíram para realização desse trabalho.
À D’s, agradeço a beleza da vida.
Elisa Korenblum
2008
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RESUMO
Elisa Korenblum
ESTRUTURA DA COMUNIDADE BACTERIANA PRESENTE EM SISTEMAS
DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO
Orientador: Lucy Seldin
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título
de Doutor em Ciências (Microbiologia).
O monitoramento dos processos perniciosos da indústria de petróleo e a
investigação de avanços tecnológicos na área de controle de riscos são atividades de rotina
da Petrobras. O procedimento de amostragem neste trabalho foi realizado durante as
operações de testemunhagem realizadas pela Petrobras, através de técnicas pioneiras de
exploração de campos offshore. Quatro amostras do core de rocha foram obtidos de campo
ainda não explorado em uma profundidade de 2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do mar.
Para estudar as comunidades bacterianas presentes nestas amostras, foram construídas
bibliotecas de clones baseadas nos genes rrs e aprA (87 clones). A diversidade bacteriana
encontrada foi homogênea nas quatro amostras, apresentando majoritariamente seqüências
relacionadas ao filo Proteobacteria, e em menor número, aos grupos Firmicutes e
Actinobacteria. Utilizando o gene aprA, também foi possível detectar a presença de
bactérias redutoras de sulfato (BRS) em uma das amostras de rocha, onde predominou o
gênero Desulfovibrio. Pela primeira vez, a comunidade bacteriana de rocha petrolífera foi
analisada em tal profundidade.
No Brasil, a recuperação secundária de petróleo lança mão da injeção de água do
mar, que passa por um sistema de tratamento para redução da biomassa bacteriana. A
diversidade das bactérias presentes no sistema de injeção de água do mar de três
plataformas de produção de óleo foi avaliada neste trabalho utilizando bibliotecas de clones
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] x
baseadas no gene rrs. A classe Gammaproteobacteria foi a principal classe encontrada em
duas plataformas, predominando os gêneros Marinobacter (47,5%) na A e Colwellia
(40,6%) e Achromobacter (21,1%) na plataforma B. Na plataforma C, 100% dos clones
apresentaram no primeiro hit do blastn (≥98% de similaridade) seqüências relacionadas a
não cultiváveis. Destes clones da plataforma C, 21% das seqüências apresentaram algum hit
com organismos cultiváveis, sendo identificadas como pertencentes à classe
Alphaproteobacteria (<98% de similaridade). A análise estatística do componente principal
mostrou que o tempo de operação de cada plataforma foi o fator que mais influenciou a
diversidade da comunidade bacteriana.
Ainda neste trabalho, foi testada a atividade de uma substância antimicrobiana
(SAM), previamente caracterizada, produzida pela estirpe Bacillus firmus H
2
O-1 contra
biofilmes formados por BRS. O biofilme de BRS foi previamente formado em um sistema
dinâmico por 5 dias sobre superfície de vidro e, em seguida, o biocoupon foi tratado com a
SAM. Foi observada a redução de 10% das células aderidas após 24 horas de contato com a
SAM através de NMP. Através da microscopia confocal usando o corante de viabilidade
LIVE/DEAD BacLight kit, foi observada uma redução de 94% da intensidade de
fluorescência total (células marcadas com BacLight) no biofilme tratado, quando
comparado ao biofilme não tratado. Além disso, na parte mais externa do biofilme tratado,
houve a predominância de células vermelhas (mortas), enquanto no controle só foram
observadas células vivas (coradas em verde pelo SYTO 9). Este resultado de atividade
inibitória sobre a formação de biofilmes formados por BRS sugere que esta nova SAM
produzida pela estirpe H
2
O-1 seja uma possível alternativa ao uso de biocidas para o
controle e/ou remoção de biofilmes na indústria de petróleo.
Palavras-chave: Microbiologia do petróleo, rocha petrolífera, bactérias redutoras de
sulfato, acidulação biogênica, corrosão, biocidas, substâncias antimicrobianas produzidas
por Bacillus.
Elisa Korenblum
2008
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ABSTRACT
Elisa Korenblum
STRUCTURE OF BACTERIAL COMMUNITIES IN SYSTEMS OF OILFIELD
PRODUCTION
Supervisor: Lucy Seldin
Abstract of the doctoral thesis submitted to the post-graduation program for Science
(Microbiology), Institute of Microbiology Prof. Paulo de Góes, Federal University of Rio
de Janeiro, this is a requisite to acquire the certificate of PhD in Science (Microbiology).
Monitoring pernicious processes in the oil industry and the search for technological
advances in controlling risks are routine activities in Petrobras. Facilities developed by
Petrobras for accessing deep subsurface oil reservoirs were used to obtain four rock
samples at 2,822-2,828 m below the ocean floor surface from a virgin field located in the
Atlantic Ocean, Rio de Janeiro. To address the bacterial diversity of these rock samples,
clone libraries based on rrs and aprA genes were generated (87 clones). The phylogenetic
analyses of the DNAr 16S clone libraries showed a wide distribution of types in the
Domain B
acteria in the four core samples, and the majority of the clones were identified as
belonging to Proteobacteria. The sulfate-reducing bacteria community could only be
amplified by PCR in one sample, and all clones were identified as belonging to
Desulfovibrio genus. For the first time, the bacterial community was assessed in such a
deep subsurface environment.
In Brazil, secondary oil recovery makes use of seawater which is subjected to
treatments, in order to reduce bacterial contamination, prior to water injection. The
bacterial diversity was assessed in different water injection systems of three offshore oil
platforms to study the community that was retained after different water treatments.
Phylogenetic analyses of the DNAr 16S clone libraries showed that the bacterial
communities in the different platforms were taxonomically different. A predominance of
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] xii
clones affiliated with Gammaproteobacteria, mostly belonging to the genera Marinobacter
(47.5%), was observed in platform A samples. Clones from platform B were mainly related
to the genera Colwellia and Achromobacter, representing 40.6% and 21.1% of the clones
obtained, respectively. All the clones were closely related to uncultured bacteria in platform
C samples considering 98% of similarity or higher. Taking into account blastn similarities
lower than 98%, 21% of these clones could be related to Alphaproteobacteria. Statistical
analyses were applied to compare the results from the three platforms. Principal component
analysis showed that the main factor affecting the bacterial community was the operating
time of each platform.
In a previous study, an oil reservoir Bacillus strain H
2
O-1 was shown to produce
antimicrobial substance (AMS) active against different Bacillus strains and a consortium of
sulfate-reducing bacteria (SRB) on solid medium. Here we report that the application of
AMS produced by H
2
O-1 reduced the viability and attachment of the SRB consortium
biofilm by one order of magnitude, when MPN technique was applied. Using confocal
scanning laser microscopy and LIVE/DEAD BacLight fluorescent kit, it was observed that
the pre-established SRB biofilm was drastically reduced (94%) using the H
2
O-1 AMS.
Moreover, it was observed the predominance of reddish dead cells in the treated biofilm.
Our results suggest that the AMS produced by Bacillus strain H
2
O-1 may have a potential
for pipeline cleaning technologies to inhibit biofilm formation and consequently reduce
biocorrosion.
Keywords: Petroleum microbiology, Sulfate reducing bacteria, biogenic souring,
biocorrosion, biocides, antimicrobial substances produced by Bacillus.
Elisa Korenblum
2008
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Índice:
RESUMO ...................................................................................................................................... ix
ABSTRACT .................................................................................................................................. xi
Índice: .......................................................................................................................................... xiii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ........................................................................................... xiv
LISTA DE ABREVEATURAS ................................................................................................... xv
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1
1.1 O petróleo ............................................................................................................... 1
1.2 Microbiologia do Petróleo: processos perniciosos ................................................. 6
1.3 Biofilmes bacterianos ........................................................................................... 22
1.4 Controle do crescimento de BRS e da produção de Sulfeto ................................ 32
1.5 Produção de substância antimicrobiana (SAM) em biofilme .............................. 34
1.6 Bactérias do gênero Bacillus produtoras de SAM ............................................... 34
2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO ........................................................................................ 38
3 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 40
4 ETAPAS DESENVOLVIDAS .................................................................................................. 41
4.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em
rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas
profundas. ........................................................................................................... 41
4.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em
sistemas de água de injeção. ............................................................................... 41
4.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de
Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por
bactérias redutoras de sulfato. ............................................................................ 42
5 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 43
5.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em
rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas
profundas. ........................................................................................................... 43
5.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em
sistemas de água de injeção. ............................................................................... 51
5.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de
Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por
bactérias redutoras de sulfato. ............................................................................ 55
5.4 Meios de cultura, Tampões e Soluções ................................................................ 58
6 RESULTADOS ......................................................................................................................... 62
6.1 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em rocha de
subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas
profundas. ........................................................................................................... 62
6.2 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água
de injeção. ........................................................................................................... 71
6.3 Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus isolada de
reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras de
sulfato. ................................................................................................................ 82
7 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 85
8 CONCLUSÕES FINAIS ........................................................................................................... 96
9 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 97
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] xiv
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1: Desenho esquemático de uma coroa, broca usada na perfuração de
testemunhagem. ...................................................................................................................... 3
Figura 2: Desenho esquemático da injeção de água em campos petrolíferos.. ..................... 4
Figura 3: Esquema de tratamento de água de injeção ........................................................... 5
Figura 4: Árvore filogenética baseada no gene rrs de espécies de BRS descritas. ............. 9
Figura 5: Via metabólica da redução do sulfato dissimilatória. .......................................... 11
Figura 6: Formação de pites por CIM ................................................................................. 17
Figura 7: Representação esquemática da estrutura do biofilme bacteriano. ....................... 27
Figura 8: Diagrama ilustrativo da coagregação de bactérias e formação do biofilme ........ 29
Figura 9: Representação esquemática da plataforma offshore ............................................ 44
Figura 10: Representação esquemática de um sistema de injeção de água na recuperação
secundária do petróleo. ......................................................................................................... 52
Figura 11: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones e de seqüências de Betaproteobacteria provenientes do GenBank ........................... 68
Figura 12: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones e de seqüências de Alphaproteobacteria provenientes do GenBank. ....................... 68
Figura 13: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones e de seqüências de Gammaproteobacteria provenientes do GenBank. .................... 69
Figura 14: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones e de seqüências de Firmicutes provenientes do GenBank. ....................................... 70
Figura 15: Abundância relativa dos gêneros bacterianos em cada plataforma ................... 74
Figura 16: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones procedentes da plataforma A e de seqüências provenientes do GenBank ................ 77
Figura 17: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones procedentes da plataforma B e de seqüências provenientes do GenBank ................. 78
Figura 18: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones procedentes da plataforma C e de seqüências provenientes do GenBank ................. 79
Figura 19: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de
clones procedentes das três plataformas, não relacionados a organismos previamente
descritos, e de seqüências provenientes do GenBank........................................................... 80
Figura 20: Gráfico de ordenação das comunidades bacterianas das plataformas A e B ..... 81
Figura 21: Análise do biofilme da T6-lab por microscopia confocal a laser ...................... 84
Tabela 1: Número de clones das amostras de rocha. ........................................................... 62
Tabela 2: Identificação das seqüências do gene aprA. ........................................................ 65
Tabela 3: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da
Plataforma A. ........................................................................................................................ 72
Tabela 4: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da
Plataforma B. ........................................................................................................................ 72
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] xv
LISTA DE ABREVIATURAS
DNAr 16S – Fragmento oriundo da amplificação por PCR do gene que codifica a
subunidade menor do ribossomo bacteriano
RNAr 16S – Subunidade menor do RNA ribossomal bacteriano
APS – adenosina fosfosulfato
BRS – Bactéria redutora de sulfato
BSA – do inglês bovie serum albumine (albumina de soro bovino)
CIM – Corrosão influenciada por microrganismos
DAPI – Di-hidrocloreto de 4’,6-diamino-2-fenilindol
DCA – do inglês detrended correspondence analysis (análise de correspondência
distendida)
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – deoxinucleotideo trifosfato
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
EOR – do inglês enhanced oil recovery (Métodos especiais de recuperação terciária
de óleo)
ex. – Por exemplo
FAD – flavina adenina dinucleotídeo
FHWA – do inglês Federal Highway Administration (Administração federal de
rodovias – EUA)
GC – nucleotídeos Guanina e Citosina
IP – Iodeto de propídeo
IPTG – Isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo
LA – Laranja de acridina
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
mRNA – RNA mensageiro
NACE – do inglês National Association of Corrosion Engineers (Associação
nacional de engenheiros de corrosão – EUA)
NCBI – do inglês National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional
de Informação Biotecnológica, banco de dados americano)
NMP – Número mais que provável
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] xvi
OTU – do inglês operational taxonomic unit (unidade taxonômica orperacional)
pb – Pares de bases
PBS – do inglês Phosphate Buffer Saline (Tampão fosfato salino)
PCA – do ingles principal component analysis (análise de componente principal)
PCR – do inglês Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
PROCAP – Programa de Capacitação Tecnológica em Águas Profundas
PVP – Polivinil pirrolidona
QAT – Amônio quaternário
RDA – do inglês redundancy analysis (análise de redundância)
RDP – Ribosomal Database Project
RNA – Ácido ribonucléico
RNAr – RNA ribossômico
SAM – Substância antimicrobiana
SAM H
2
O-1 – Substância antimicrobiana produzida pela estirpe de Bacillus firmus
H
2
O-1
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SPE – Substâncias poliméricas extracelulares
TE – Tampão Tris/EDTA
TEB – Tampão Tris/EDTA/H
3
BO
3
THPS – do inglês Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium Sulfate (sulfato de
tetraquishidroximetilfosfônio)
Tris – Tris (hidroxi-metil-amino-metano)
UV – Ultra-violeta
X-gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O petróleo
Petróleo (do latim petra = rocha e oleum = óleo) é o nome dado às misturas naturais
de hidrocarbonetos que podem ser encontrados no estado sólido, líquido ou gasoso,
dependendo das condições de pressão e temperatura a que estejam submetidas. O petróleo
no estado líquido é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água, com cheiro
característico e cor variando entre o negro e o castanho-claro. Sua presença pode ocorrer
tanto em uma única fase como pode se apresentar em mais de uma fase em equilíbrio.
Assim, o petróleo é um termo para designar tanto o óleo como o gás natural (THOMAS,
2004; ROSA, CARVALHO & XAVIER, 2006).
Os principais compostos químicos da mistura que constitui o petróleo são os
hidrocarbonetos, saturados e aromáticos; as resinas; e os asfaltenos. Os constituintes do
petróleo considerados como impurezas são compostos orgânicos que contêm outros
elementos além do carbono e hidrogênio, os mais comuns são enxofre, nitrogênio e
oxigênio. A infinita variedade de composições das misturas de hidrocarbonetos, aliada às
variações de tipos de impurezas, faz com que praticamente todas as misturas tenham
características diferentes. Cor, viscosidade, massa específica podem diferir bastante de uma
jazida para outra. (THOMAS, 2004).
1.1.1 Geologia do Petróleo
O petróleo é originado a partir da matéria orgânica depositada junto com os
sedimentos em ambientes aquáticos que migra através de aqüíferos e fica aprisionado em
reservatórios. A matéria orgânica é basicamente originada de microrganismos marinhos e
algas. A matéria orgânica proveniente de vegetais também pode dar origem à formação do
petróleo. O tipo de hidrocarboneto gerado é determinado pela constituição da matéria
orgânica original e pela intensidade do processo térmico atuante sobre ela (THOMAS,
2004, ROSA, CARVALHO & XAVIER, 2006).
O petróleo, após ser gerado, na rocha geradora, migra para regiões de menor pressão
através de espaços, poros vazios de arenitos e calcários. Tendo em vista que o óleo é mais
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 2
leve que do que a água de formação
1
, ele tende a fluir para cima, se separando da água. O
petróleo preenche os poros permeáveis da rocha petrolífera, com a qual permanece
intimamente ligado. Eventualmente, este pode ser armazenado em uma matriz rochosa
denominada rocha-reservatório, quando encontra uma armadilha, ou trapa, constituindo
verdadeiras bolsas que variam de tamanho e de conformação, o que possibilita sua
acumulação (CORRÊA, 2003).
1.1.2 Testemunhagem
A amostragem de rocha ou testemunhagem é definida como o processo de obtenção
de uma amostra real de rocha de subsuperfície cilíndrica, saturada com petróleo, com
alterações mínimas nas propriedades naturais da rocha. As amostras provenientes deste
procedimento são denominadas testemunhos. Com a análise deste testemunho se obtêm
informações confiáveis de dados geológicos, de engenharia de reservatórios, de
completação e de perfuração das rochas que se encontram em subsuperfície, tais como
textura, porosidade, permeabilidade, litologia, saturação de óleo e de água da rocha
(THOMAS, 2004).
A testemunhagem pode ser feita pelo método de testemunhagem com barrilete
convencional. Este procedimento consiste na descida de uma broca vazada, conhecida
como coroa, e ainda dois barriletes, um externo e outro interno (aonde irá se alojar o
testemunho). Os testemunhos recuperados pelo barrilete são cortados entre determinadas
profundidades e trazidos à superfície. Coroas diamantadas são empregadas para diminuir o
tempo de exposição do testemunho à ação da lama de perfuração
2
e também causar menor
distúrbio ao testemunho, devido ao mecanismo de corte que é realizado por raspagem, em
vez de cisalhamento. Utiliza-se também um barrilete revestido no seu interior por um tubo
de fibra de vidro ou liner, cuja função principal é diminuir a desagregação do testemunho
durante a operação de testemunhagem (THOMAS, 2004). A Figura 1 ilustra o equipamento
utilizado na perfuração de testemunhagem.
1
Água de formação: água encontrada associada ao petróleo na rocha-reservatório.
2
Lama de Perfuração: fluido especial utlizado para evitar desmoronamentos durante a perfuração da
rocha e trazer o cascalho – material perfurado – do fundo do poço para a superfície.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 3
1.1.3 Métodos de recuperação do petróleo
O petróleo, encontrado tanto na forma líquida como semi-sólida, flui da jazida
através da perfuração de poços petrolíferos, cujas profundidades são variáveis (alguns
metros até mais de 4 mil metros). A extração do petróleo é denominada primária quando a
sua liberação da rocha-reservatório ocorre devido à pressão natural inicial do reservatório
para deslocar o produto. A pressão do reservatório declina, reduzindo também a produção
de petróleo, permitindo a liberação de apenas 8% a 30% do petróleo ali existente. Assim,
técnicas convencionais são aplicadas para estimular e aumentar a produtividade de um poço
produtor de petróleo (THOMAS, 2004; PLANCKAERT, 2005). Essas técnicas são
conhecidas como recuperação secundária, ou métodos convencionais de recuperação.
Normalmente, a recuperação secundária é feita pela injeção de água pressurizada na
rocha-reservatório, para elevar a pressão do reservatório e empurrar o petróleo ainda
remanescente. Esta técnica, que consiste essencialmente na injeção de água do mar ou doce,
gás ou vapor para o interior do reservatório, a fim de permitir o deslocamento do petróleo,
se usada com eficiência e sucesso permite extrair de 15 a 60% do petróleo original. Ao se
Figura 1: Desenho esquemático de uma coroa, broca usada
na perfuração de testemunhagem. Adaptado de FIGUEIREDO &
BREHME, 2000.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 4
injetar um fluido em um reservatório com a finalidade única de deslocar o óleo para fora
dos poros da rocha se busca um comportamento puramente mecânico. Isto é, a água
injetada deve empurrar o óleo para fora dos poros da rocha e ao mesmo tempo ocupar o
espaço deixado à medida que este é expulso (THOMAS, 2004; PLANCKAERT, 2005). A
Figura 2 ilustra o mecanismo de empuxo de injeção de água para recuperação secundária do
petróleo.
A injeção de água é, geralmente, o método de recuperação secundária aplicado em
reservatórios e seus custos operacionais são menores do que os outros métodos
convencionais de recuperação. A água de injeção considerada ideal deve minimizar a
possibilidade de contaminação do sistema de produção de óleo como um todo. Assim, antes
da injeção no reservatório, a água deve ser tratada previamente para remoção de oxigênio e
microrganismos. O sistema de tratamento de água é escolhido de acordo com a origem da
Figura 2: Desenho esquemático da injeção de água em campos
petrolíferos. Adaptado do site do KANSAS GEOLOGICAL SURVEY
(http://www.kgs.ku.edu/index.html
).
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 5
água, são empregados geralmente tratamentos físicos e químicos (MCINERNEY &
SUBLETTE, 2002). No Brasil, a recuperação secundária do petróleo é feita pela injeção de
água do mar, que é tratada para redução da carga bacteriana, antes de chegar aos poços
injetores
3
que irão pressionar a entrada de água no reservatório.
Na indústria de óleo, o sistema de tratamento da água de injeção é constituído por
filtros, cloração, desaeração
4
e adição de biocidas (Figura 3). O tratamento de biocida pode
ser utilizado continuamente, ou por aplicações em batelada de duas a três vezes por semana.
Geralmente, dois biocidas devem ser escolhidos (um contínuo e outro para batelada) para
evitar o declínio da eficiência do tratamento (PLANCKAERT, 2005). A estratégia de
escolha do biocida depende principalmente das leis locais de proteção ambiental e da
população bacteriana presente na água (LARSEN, SANDERS & TALBOT, 2000). Os
biocidas utilizados para controle microbiano na indústria de petróleo serão abordados no
item 1.5 - Controle do crescimento de biofilmes através do uso de biocidas.
Figura 3: Esquema de tratamento de água de injeção
Existe ainda a recuperação terciária do petróleo, ou métodos especiais de
recuperação, que são métodos mais sofisticados de extração, chamados de EOR (do inglês,
enhaced oil recovery). Nessa abordagem são empregadas técnicas utilizando-se processos
térmicos, químicos e microbianos (PLANCKAERT, 2005).
3
Poços injetores: são destinados a injetar fluidos dentro do reservatório, para estimular a produção de
petróleo.
4
Desaeração: em razão de controle de corrosão dos dutos pela presença de oxigênio, assim a água do
mar é tratada com produtos químicos (antiespumante, inibidores de encrustamento e químicos que reagem
com o oxigênio dissolvido, como os íons sulfeto e bisulfeto que combinam com o oxigênio para formar
sulfato).
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 6
1.1.4 Fluidos produzidos
Durante o processo de injeção, a água injetada também é extraída com o óleo e,
então, os dois fluidos são separados na superfície, a quantidade de óleo remanescente é
removida e a água é reinjetada ou tratada para descarte. Um comportamento padrão
esperado para um reservatório de petróleo é a produção tanto de óleo, como de gás natural e
água. O tempo de chegada da água de mar usada na injeção nos poços produtores
5
é
conhecido como o tempo da frente de deslocamento (breakthrough) da água de injeção.
Este tempo de deslocamento da água de injeção no reservatório determina o aumento da
proporção de fluido injetado no fluido produzido (THOMAS, 2004; PLANCKAERT,
2005).
1.2 Microbiologia do Petróleo: processos perniciosos
Reservatórios de petróleo, localizados em subsuperfície profunda, são ainda hoje
pouco estudados. Isto se deve à problemática econômica e tecnológica de amostragem deste
ambiente. Como descrito anteriormente, a testemunhagem é uma técnica especializada de
perfuração e retirada do core da rocha. Além disso, os custos empregados nessa técnica são
altos, limitando o número de amostras que podem ser obtidas. Assim, o estudo da
população microbiana em grandes profundidades se torna tecnicamente difícil (HURST et
al., 1997). A Petrobras, por intermédio de seu Programa de Capacitação Tecnológica em
Águas Profundas – PROCAP – criado em 1986, tem trilhado um caminho de inúmeras
descobertas, que proporcionou à instituição o título de líder internacional em tecnologia de
exploração de petróleo em águas profundas. Ainda, como pioneira em perfurar rochas
profundas em campos offshore
6
em águas profundas, também desenvolveu a técnica de
amostragem de rocha neste tipo de campo (PATENTE US5192167A, DA SILVA et al.,
2003).
A extração de petróleo, desde o início da comercialização pela indústria petrolífera,
enfrenta problemas causados por microrganismos. O grupo de bactérias redutoras de sulfato
(BRS) foi desde então reconhecido como o responsável pela produção de sulfeto (S
2-
), em
5
Poço produtor: conduto para o fluxo dos fluidos das formações para a superfície.
6
Offshore: exploração do petróleo em alto mar.
Elisa Korenblum
2008
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reservatórios e instalações industriais em superfície (BASTIN, 1926; apud MAGOT,
OLLIVER & PATEL, 2000). O primeiro estudo de microbiologia de reservatórios de
petróleo foi realizado em 1926 onde Bastin descreveu a ampla presença de BRS em poços
produtores de óleo (MAGOT, OLLIVER & PATEL, 2000, APUD). Neste mesmo trabalho,
Bastin já questionava se as bactérias encontradas no reservatório eram de origem autóctone
ou alóctone. Atualmente, já se sabe que existe uma ampla diversidade bacteriana presente
em ambientes de subsuperfície profundos (TOFFIN et al., 2004; TESKE, 2005).
Os microrganismos que conseguem sobreviver em ambientes petrolíferos são
selecionados pelas características e composição química deste ecossistema. A temperatura é
o principal fator limitante para o crescimento de bactérias em reservatórios de petróleo. A
cada 100 m de profundidade, a temperatura aumenta 3ºC, podendo alcançar 130-150ºC. No
entanto, muitos trabalhos sugerem que somente em temperaturas até aproximadamente
80ºC é possível detectar bactérias indígenas de campos petrolíferos (FISHER, 1987;
BARTH, 1991; BERNARD, CONNAN & MAGOT, 1992). A salinidade, pH e pressão
também podem limitar o crescimento bacteriano ou influenciar as propriedades fisiológicas
destes organismos. A salinidade geralmente está em concentrações de saturação, enquanto
que o pH in situ varia de 3-7, pois é influenciado pela dissolução de gases sob alta pressão
(≅ 500 atm). A disponibilidade de doadores e aceptores de elétrons determina o tipo de
metabolismo bacteriano nestes ambientes. Como os campos de petróleo são ambientes de
subsuperfície profundos, o potencial redox detectado é muito baixo, favorecendo
principalmente a redução do sulfato. Estes fatores são decisivos para a ocorrência dos
principais processos metabólicos em tais ecossistemas (MAGOT, OLLIVER & PATEL,
2000).
Assim, estudos de ecologia microbiana de reservatórios são de grande interesse para
a indústria, já que os microrganismos têm um papel importante na mediação de processos
biogeoquímicos com graves efeitos econômicos e tecnológicos negativos. Sérios problemas
na linha de produção são causados pela presença de BRS. Diversos grupos bacterianos,
além das BRS, estão envolvidos em processos perniciosos, contribuindo para a falha em
operações de recuperação secundária e terciária de petróleo, causando o plugueamento de
poços, redução da produção de óleo, degradação de polímeros de deslocamento usados em
EOR. O metabólito da respiração da BRS, o sulfeto de hidrogênio, é capaz de reduzir a
Elisa Korenblum
2008
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qualidade do óleo, promover corrosão dos materiais metálicos e ameaçar a saúde dos
trabalhadores (BEECH & GAYLARDE, 1999; MAGOT, OLLIVER & PATEL, 2000).
1.2.1 Bactérias redutoras de sulfato
Devido aos seus efeitos deletérios na indústria petrolífera, as bactérias redutoras de
sulfato (BRS) têm sido o grupo bacteriano mais estudado nesta área. As BRS foram
descritas pela primeira vez em 1895 por Beijerinck (apud POSTGATE, 1984) e constituem
um grupo taxonomicamente diverso de bactérias anaeróbias estritas, que utilizam
preferencialmente o sulfato (SO
4
2-
) (ou outros oxiânions como o sulfito e o tiosulfato) como
aceptor final de elétrons (POSTGATE, 1984; GIBSON, 1990; BARTON & TOMEI, 1995;
HAMILTON, 1998).
As BRS estão amplamente distribuídas em ambientes aquáticos e terrestres que se
tornam anóxicos, onde podem usar o sulfato como aceptor final de elétrons para a
degradação de matéria orgânica, resultando na produção de sulfeto (MADIGAN,
MARTINKO & PARKER, 1997; MUYZER & STAMS, 2008). JØRGENSEN (1992)
estimou que 50 % da mineralização da matéria orgânica em sedimentos marinhos se devem
ao metabolismo da redução de sulfato. Morfologicamente as BRS variam
consideravelmente (vibrios, cocos, bastonetes, bastonetes curvos) (BARTON & TOMEI,
1995). Além disso, as BRS formam um grupo fisiologicamente complexo. Esta diversidade
fisiológica permitiu que fossem classificadas em dois subgrupos, baseado nas
características fisiológicas (oxidação de compostos orgânicos, temperatura ótima de
crescimento, constituição da parede celular) (MADIGAN, MARTINKO, & PARKER,
1997; CASTRO, WILLIAMS & OGRAM, 2000; MADIGAN & MARTINKO, 2006;
MUYZER & STAMS, 2008):
• BRS mesofílicas Gram-negativas que promovem a degradação incompleta
de compostos orgânicos até acetato. Ex. Desulfovibrio spp.
• BRS termofílicas Gram-positivas que promovem a degradação completa de
compostos orgânicos até dióxido de carbono. Ex. Desulfotomaculum spp.
Atualmente, as BRS também podem ser subdivididas em sete subgrupos
filogenéticos, baseados na análise comparativa de seqüências de DNAr 16S. Os 32 gêneros
que abrigam as BRS estão organizados em cinco subgrupos pertencentes ao domínio
Elisa Korenblum
2008
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Bacteria e dois subgrupos ao domínio Archaea (Figura 4). A maioria se encontra no
subgrupo 1, constituído por 23 gêneros da classe Deltaproteobacteria (CASTRO,
WILLIAMS & OGRAM, 2000; MUYZER & STAMS, 2008).
Figura 4: Árvore filogenética baseada no gene rrs de espécies de BRS descritas. Os sete grupos
de BRS estão destacados em diferentes cores, 5 grupos pertencentes ao domínio Bacteria e 2 ao domínio
Archaea. O número indicado nos balões indica o número de espécies naquele grupo específico. A barra
de escala indica 10% de diferença entre as seqüências (MUYZER & STAMS, 2008).
O gênero mais conhecido é o Desulfovibrio, que é comum em ambientes aquáticos e
solos alagados contendo bastante material orgânico e níveis suficientes de sulfato. As
bactérias pertencentes ao gênero Desulfotomaculum são encontradas principalmente no solo
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 10
e são formadas por bastonetes capazes de formar endósporos. Esse gênero possui uma
espécie termofílica. Os outros gêneros de BRS são indígenas de ambientes anóxicos de
água doce ou marinho (MADIGAN, MARTINKO & PARKER, 1997).
A redução de sulfato ocorre intracelularmente, logo após sua ativação pela reação
com ATP, dando origem à adenosina fosfosulfato (APS). Desta forma, o sulfato deve ser
transportado através da membrana citoplasmática, convertido em APS, para então ser
reduzido a sulfito, em uma transferência de dois elétrons (APS + 2 e
-
→ SO
3
2-
+ AMP, E
o
=
-60mV), e este reduzido a sulfeto (SO
3
2-
+ 6 e
-
+ 8 H
+
→ H
2
S + 6 H
2
O, E
o
= -116mV)
(HANSEN, 1994; HAMILTON, 1998). Uma pequena quantidade de enxofre reduzido é
assimilada pela BRS, mas potencialmente tudo é liberado para o meio ambiente como íons
sulfeto, normalmente, sulfeto de hidrogênio (H
2
S) (POSTGATE, 1984). As BRS
necessitam de uma baixa diferença de potencial redox no meio para sua sobrevivência e
como uma conseqüência direta desses valores relativamente baixos, existe uma
disponibilidade limitada de energia produzida quando ocorre a oxidação do substrato
(HAMILTON, 1998). As enzimas envolvidas na redução metabólica dissimilatória de
sulfato são a ATP sulfurilase, adenosina 5’-fosfosulfato (APS) redutase e a sulfito redutase
dissimilatória (HIPP et al., 1997). A Figura 5 representa a via metabólica da redução do
sulfato, destacando as enzimas importantes para cada etapa de redução.
Além da utilização de sulfato como aceptor de elétrons, muitas BRS podem crescer
usando nitrato (NO
3
-
) como aceptor final, reduzindo NO
3
-
a amônia (NH
3
), ou podem usar
certos compostos orgânicos para produção de energia por vias fermentativas na ausência de
sulfato ou outros aceptores finais de elétrons. O composto fermentável mais comum é o
piruvato, que é convertido a acetato, CO
2
e H
2
. Com lactato ou etanol, a energia produzida
não é suficiente para fermentação e, nesse caso, o sulfato é necessário. A importância do
sulfato como aceptor de elétrons foi demonstrada em um estudo comparativo do
crescimento de BRS em piruvato com e sem sulfato. Na presença do sulfato o crescimento
é maior, considerando a maior quantidade de energia disponível quando a utilização do
piruvato está acoplada com a redução do sulfato (MADIGAN,
Elisa Korenblum
2008
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Figura 5: Via metabólica dissimilatória da redução do sulfato.
Elisa Korenblum
2008
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MARTINKO, & PARKER, 1997).
As BRS podem oxidar diferentes compostos e a maioria deles se constitui de
produtos típicos de fermentação e produtos que não foram completamente quebrados, tais
como certos aminoácidos, glicerol e ácidos graxos. Entretanto, essas bactérias podem
utilizar outros compostos como fonte de energia, dentre eles podemos citar: hidrogênio
molecular (reação catalisada por hidrogenases de superfície), álcoois, aldeídos, açúcares,
gás carbônico e até hidrocarbonetos (GIBSON, 1990; HANSEN, 1994). Elas também
necessitam de outros nutrientes complementares como nitrogênio, fósforo e ferro para seu
crescimento.
A anaerobiose obrigatória das BRS e sua nutrição relativamente restrita asseguram
que sejam sempre encontradas como membros de uma comunidade ou consórcio
microbiano. Esses consórcios são, freqüentemente, encontrados na forma de biofilmes (ver
item 1.3 - Biofilmes bacterianos), em interfaces ou sobre substratos sólidos, e permitem a
criação de microambientes anaeróbios dentro de um ambiente aeróbio (HAMILTON, 1985,
1998).
Apesar de serem anaeróbias, as BRS podem circular (provavelmente em um estado
latente) em águas aeradas, incluindo aquelas tratadas com cloro e outros agentes oxidantes,
até encontrarem um local apropriado para sobrevivência. Existem algumas evidências de
que algumas cepas de BRS podem tolerar baixos níveis de oxigênio (TATNALL, 1993;
HAMILTON, 1998). As BRS podem, também, crescer em grandes variações de
temperatura (da psicrofilia à hipertermofilia) e de osmolaridade (da água doce às águas
hipersalinas) (HANSEN, 1994).
1.2.2 Acidulação Biogênica - Souring
A acidulação, também comumente chamada por souring (do inglês), é caracterizada
pelo aumento do gás H
2
S em reservatórios de petróleo. Este aumento de sulfeto se deve à
produção deste gás diretamente pelas BRS que liberam para o ambiente como um
subproduto da respiração anaeróbica. A injeção de água do mar na recuperação secundária
do petróleo também é um fator importante para o avanço do souring (MCINERNEY &
SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005).
Este método convencional de extração de óleo, a recuperação secundária pela
injeção de água do mar, é realizada para manter a pressão interna. Juntamente à injeção de
Elisa Korenblum
2008
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água do mar são introduzidas concentrações altas de sulfato e microrganismos de origem
marinha, mesmo depois do emprego de tratamentos como o uso de biocidas e filtragem. Ao
chegar ao interior do reservatório, a água do mar tratada resfria o ambiente, resultando em
condições ideais para a proliferação de BRS, e conseqüentemente também acarretando a
biogênese do sulfeto. A disponibilidade de carbono e sulfato determina o crescimento de
BRS em condições ambientais extremas, podendo haver a redução ou o aumento da
atividade destas bactérias. A salinidade, a temperatura e a pressão também influenciam o
desenvolvimento da comunidade de BRS presente no interior do reservatório de petróleo
(MCINERNEY & SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005).
Os reservatórios de petróleo geralmente iniciam o processo de souring após longo
período de atividade extrativa. As conseqüências do souring são muitas: (i) corrosão nos
poços de injeção e de produção; (ii) plugueamento dos poços de injeção por produtos de
corrosão; (iii) toxicidade da água e odor característico de H
2
S; (iv) riscos de segurança aos
trabalhadores por ser volátil e tóxico (inibidor respiratório); (v) aumento dos custos para
remoção de H
2
S do gás natural antes de entrar nas tubulações de gás; e (vi) aumento do
conteúdo de enxofre no óleo tornando seu refinamento mais complicado, diminuindo a
qualidade dos combustíveis, e assim reduzindo o valor do produto (MCINERNEY &
SUBLETTE, 2002; HUBERT et al., 2005; KJELLERUP et al., 2005).
A acidulação em instalações petrolíferas implica em custos adicionais para o
controle da exposição dos operadores ao H
2
S tóxico, para o controle de fluidos com alta
quantidade de água, para a gestão de sulfetos ferrosos sólidos que interferem na limpeza da
água produzida para re-injeção e para descarte, para a gestão do acúmulo de sulfetos
ferrosos sólidos que se depositam e promovem corrosão e danos a equipamentos. Os custos
de prevenção da acidulação também são altíssimos, abrangendo os tratamentos químicos
para remoção do H
2
S produzido, o transporte e estocagem do material para tratamento da
acidulação em plataformas offshore e, principalmente, o uso de biocidas em altas doses nos
tratamentos em batelada. Desde a análise do potencial de souring do reservatório até o
controle dos fluidos produzidos, a produção de H
2
S pelas BRS acarreta em problemas
logísticos e econômicos para as indústrias petrolíferas (VANCE & THRASHER, 2005).
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1.2.3 Corrosão influenciada por microrganismos (CIM)
A corrosão é uma das principais causas de falha em tubulações e dos custos de
operação e manutenção em muitas indústrias (JAYARAMAN, HALLOCK & CARSON,
1999; ZHU, LUBECK & KILBANE, 2003). Quando a corrosão é provocada ou acelerada
pela presença de microrganismos é denominada corrosão influenciada por microrganismos
(CIM). A CIM ou biocorrosão é qualquer processo de corrosão localizada causado por
modificação microbiana da química em um ponto de uma superfície, tanto em meios
aerados, como em meios desaerados. A formação de biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes
bacterianos) sobre superfícies metálicas confere um gradiente de concentração de oxigênio
e formação de células de aeração diferencial, o que pode contribuir no processo de CIM
(TILLER, 1983; JAYARAMAN et al., 1997; ANGELL, 1999). Quando a CIM se dá sob
condições de anaerobiose em pH neutro é geralmente atribuída à ação das BRS
(CAVALCANTI, 2001). Segundo revisão sobre o tema, AGUIAR (1991) sugeriu que a
participação das BRS nos mecanismos de corrosão se dá por 3 vias. A primeira via,
considerada direta, ocorre por uma necessidade metabólica das bactérias, visto que suas
hidrogenases de superfície consomem o filme de H
2
que se forma na região catódica como
conseqüência da reação de elétrons (e
-
) derivados do metal com íons H
+
resultantes da
dissociação iônica da água. Esse consumo de H
2
desloca a reação de dissociação iônica da
água atraindo mais e
-
que regeneram a formação de H
2
, liberando mais Fe
2+
na região
anódica (perda de massa). A segunda via, também direta, ocorre pelos produtos
metabólicos das BRS, que colocam em solução o H
2
S. Este, por sua vez, reage com Fe
2+
formando sulfeto de ferro, gerando mais ions H
+
, que aceleram o consumo de elétrons na
região catódica. A terceira via é considerada indireta e acontece devido à formação de
zonas de aeração diferencial sobre o metal, com a deposição de elementos de matriz
extracelular e a formação irregular do biofilme. Desta forma, todos os fenômenos
observados de CIM são reações comuns de corrosão (SASAKI, 1997).
As BRS têm sido o principal foco da maioria das investigações sobre corrosão
microbiológica e van Wolzogen Kuhr e van der Vlugt (1934) (apud LEE et al., 1995)
sugeriram as seguintes reações eletroquímicas para o processo de CIM:
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4Fe Î 4 Fe
+2
+ 8e
-
(reação anódica)
8H
2
O Î 8 H
+
+ 8 OH
-
(dissociação da água)
8H
+
+ 8e
-
Î 8 H (adsorvido) (reação catódica)
SO
4
-2
+ 8H Î S
-2
+ 4 H
2
O (via ação bacteriana)
Fe
+2
+ S
-2
Î FeS (produtos de corrosão)
_________________________________________________
4Fe + SO
4
-2
+ 4H
2
O Î 3 Fe(OH)
2
+ FeS + 2OH (reação global)
Essa reação global foi descrita como despolarização catódica, baseado na teoria que
as BRS removem o hidrogênio que se acumula sobre a superfície do ferro. O resultado do
consumo do hidrogênio é a retirada do elétron resulta em uma despolarização catódica e,
assim, promove maior dissolução do ferro na região catódica da superfície metálica.
A corrosão relacionada às BRS está, invariavelmente, associada com a formação de
biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes bacterianos) em superfícies metálicas, sendo que
condições anaeróbicas locais favoráveis ao crescimento dessas bactérias podem surgir na
forma de consórcios microbianos mistos em sistemas industriais (LEE et al., 1995). O
padrão de corrosão característico da ação das BRS sobre o aço é a corrosão localizada
denominada pitting, com os pites (buracos - Figura 6) sendo formados e preenchidos por
produtos de corrosão de cor negra na forma de sulfetos de ferro (HAMILTON, 1985). A
taxa e a extensão dos processos de CIM são criticamente afetadas pela natureza química e
física dos produtos de corrosão precipitados (sulfetos de ferro), e pelo acesso de oxigênio
ao sistema (HAMILTON, 1998). Essas taxas de corrosão não parecem estar diretamente
relacionadas com a biomassa total e/ou com o número de espécies microbianas (CHEUNG
& BEECH, 1996), mas se devem às espécies envolvidas e às fontes de carbono e de metal
usadas como descrito por Pedersen (1988) (apud CAVALCANTI, 2001). As substâncias
poliméricas extracelulares (SPE) sintetizadas por diferentes cepas de BRS podem contribuir
para o processo de corrosão, não somente por facilitar a adesão celular irreversível e
conseqüente colonização de superfícies metálicas, como também por suas características de
ligação a íons metálicos (BEECH & CHEUNG, 1995).
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A produção de H
2
S pelas BRS pode gerar impactos ambientais e econômicos
(HAMILTON, 1998), pois, como já abordado, este composto é corrosivo para o aço
(MORRIS et al., 1995). Nesse sentido, o estudo da prevenção do desenvolvimento de BRS
é de grande interesse para as indústrias de petróleo, no que diz respeito aos problemas
causados pela biocorrosão de estruturas metálicas de plataformas marinhas, dutos de
transporte, assim como aos problemas causados pela acidificação de reservatórios de
petróleo (GIBSON, 1990).
Apesar das BRS serem o tipo de bactéria comumente associado a processos
corrosivos em campos de petróleo por constituir biofilmes (ver item 1.3 - Biofilmes
bacterianos) e gerar produtos metabólicos corrosivos como o H
2
S, outros grupos
bacterianos também devem ser considerados, por contribuir direta ou indiretamente para a
corrosão dos materiais, como por exemplo, o das bactérias produtoras de ácido
(CAVALCANTI, 2001). A atuação das bactérias sob a forma de consórcio microbiano
tende a exercer um processo sinérgico que potencializa a corrosão. Sabe-se, também, que a
capacidade das BRS gerarem quantidades significantes de H
2
S influencia toda a atividade
metabólica e diversidade total de espécies desses consórcios (HAMILTON, 1998).
Algumas espécies produtoras de ácidos têm a característica de formar ácidos orgânicos a
partir da oxidação de hidrocarbonetos, que são nutrientes para as BRS e corrosivos ao aço.
Outros grupos (bactérias facultativas) criam condições adequadas ao desenvolvimento das
espécies anaeróbias (BRS, por exemplo) à medida que consomem o oxigênio do meio
durante o seu metabolismo.
1.2.4 A CIM na indústria do petróleo
Como já descrito, a recuperação secundária do petróleo pode ser aplicada com a
injeção de água do mar para fornecer a força adicional necessária para a recuperação do
óleo. À água de injeção soma-se a água de formação residual existente no próprio poço. O
ambiente formado por esse processo favorece o crescimento bacteriano, em particular das
BRS, oferecendo condições de anaerobiose com sulfato e nutrientes, assim como o
substrato metálico (a liga da tubulação) para a adesão bacteriana. Esse é o problema mais
importante de biocorrosão na indústria do petróleo, embora não seja o único. Na indústria
do petróleo existem muitos pontos em que a CIM é um problema, provocando neste setor a
deterioração de estruturas de aço, cabos submersos em água, sistemas de água de injeção,
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oleodutos, tanques de estocagem de óleo e sistemas de resfriamento (HAMILTON, 1985).
A biocorrosão de metais tem conseqüências econômicas importantes, sendo as
bactérias redutoras de sulfato (BRS) responsáveis por 50% dos casos dos processos
corrosivos em sistemas de perfuração, recuperação, transporte e armazenamento de petróleo
(HAMILTON, 1985). Com intuito de demonstrar a escala do problema, muitos trabalhos
mostraram a estimativa dos custos da corrosão, por exemplo, o custo pela perda dos
oleodutos e equipamentos danificados pela corrosão. Entretanto, é quase impossível sugerir
algo além de cifras e números aproximados. Para o Reino Unido em 1985, os gastos para a
indústria do petróleo devidos à corrosão microbiana já eram de 300 a 500 milhões de libras
esterlinas por ano (TILLER, 1983; HAMILTON, 1985). Desde 1949, os EUA estudam o
problema da corrosão por uma ótica econômica. Uma pesquisa detalhada realizada nos
EUA, feita pela National Bureau of Standards em 1978, indicou que a biocorrosão
especificamente custava à indústria daquele país entre 16 e 18 bilhões de dólares por ano
Figura 6: Formação de pites por CIM (extraído e adaptado de CHARACKLIS &
MARSHALL, 1990). Colonização não uniforme do biofilme resulta na formação de células
de aeração diferenciada. Diferentes concentrações de oxigênio, em dois locais sobre um
metal, causam uma diferença de potencial e, conseqüentemente, corrente elétrica, levando à
corrosão. Sob condições aeróbicas, as áreas colonizadas por microrganismos aeróbios se
tornam anódicas e a região ao redor, catódica.
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(HAMILTON, 1985). Em 2001, a C.C. Technologies Laboratories, a Nace International,
conhecida como a Sociedade da Corrosão, e o Federal Highway Administration (FHWA),
que administra as rodovias norte-americanas, conduziram um estudo mais completo sobre o
impacto da corrosão na economia dos EUA. A conclusão só reforçou a suspeita de que a
corrosão é um dos maiores problemas enfrentados pela indústria. Só naquele país os gastos
associados à corrosão consumiam, há dez anos, cerca de 3% PIB, algo próximo de US$ 400
bilhões, em valores atuais.
De uma forma geral, os estudos em diferentes países têm chegado a conclusões
parecidas, estimando custos variáveis entre 1% e 5% do PIB. Acredita-se que no Brasil os
gastos com a corrosão correspondem 3,5% do PIB e nas indústrias mais sujeitas às ações
corrosivas, como o setor químico e petroquímico, por exemplo, o percentual pode ser ainda
maior (REVISTA MULTILOGÍSTICA ONLINE, 24 de julho de 2008). Na indústria
petrolífera brasileira, os gastos podem chegar a cerca de US$ 10 bilhões. Somente os
sistemas de injeção de água para recuperação secundária de petróleo das plataformas da
Bacia de Campos, o custo anual médio com biocidas está em torno de 6,5 milhões de
dólares. Nas grandes estruturas navais utilizadas pelas companhias de petróleo, a corrosão
é uma das principais responsáveis pelos desastres ambientais que são os derramamentos de
óleo no mar. Quando não são causados por falha humana, esses desastres fatalmente são
obra de estruturas comprometidas pela corrosão. Por isso, essa é uma das maiores
preocupações atuais das companhias de petróleo (REVISTA MULTILOGÍSTICA
ONLINE, 24 de julho de 2008).
Os impactos ambientais causados indiretamente pela corrosão também pode levar a
grandes prejuízos financeiros. Os dados acima não incluem o custo da poluição ao meio
ambiente. A corrosão provocada por BRS é localizada (pites), sendo de difícil previsão e,
no caso de vazamento de óleo por perfurações na tubulação, além da conseqüente perda de
óleo produzido, pode resultar em danos ambientais devido à contaminação com compostos
xenobióticos. Um dos grandes vazamentos de óleo causados pelo rompimento de
tubulações da Petrobras na Baía de Guanabara-RJ (1,3 milhões de litros de óleo em janeiro
de 1999) retratou bem esse caso. O prejuízo ecológico foi enorme, sendo previstos vários
anos para a recuperação da área afetada (CAVALCANTI, 2001). A British Petroleum, por
exemplo, no primeiro trimestre do ano passado apresentou queda de 17% no seu lucro, na
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comparação com o primeiro trimestre de 2006, por causa da suspensão da exploração no
campo de Prudhoe, no Alasca, após derramamentos ocorridos devido a problemas de
corrosão. Com a intensificação dos estudos sobre o assunto, a cada ano têm surgido novas
técnicas para prever e evitar tais danos. Com esse conhecimento, é possível desenvolver
técnicas para se predizer por quanto tempo e sob quais condições essas ligas metálicas
resistirão (REVISTA MULTILOGÍSTICA ONLINE, 24 de julho de 2008).
1.2.5 Análise molecular da comunidade bacteriana presente em ambiente
petrolífero
As técnicas clássicas de observação, detecção, identificação e classificação de
microrganismos provenientes de amostras ambientais são realizadas geralmente através de
plaqueamento e cultivo em meios de cultura. Porém, os meios de cultura são seletivos para
determinados grupos de microrganismos, dificultando o isolamento de outras populações
microbianas. Estima-se que ao redor de 90% a 99% das bactérias que habitam o ambiente
não foi cultivada em meios de cultura (HUGENHOLTZ & PACE, 1996). Com o advento
das técnicas baseadas na PCR, reação em cadeia da polimerase (ou do inglês, PCR,
polymerase chain reaction), juntamente a outros grandes desenvolvimentos tecnológicos
baseados em seqüenciamento de ácidos nucléicos para a identificação de grupos
filogenéticos presentes em populações mistas, houve uma mudança na perspectiva da
microbiologia ambiental, estabelecendo assim o estado da arte da microbiologia ambiental,
referida como Ecologia Microbiana Molecular (AKKERMANS, VAN ELSAS & DE
BRUIJN, 1995; ROSADO et al., 1997; OREMLAND et al., 2005). Estas técnicas podem
ajudar a compreender melhor a composição da comunidade microbiana presente em
ambientes diversos (ROSADO et al., 1997). Todavia, a obtenção de culturas puras
representativas dos processos importantes na área de geomicrobiologia
7
, especificamente na
microbiologia de ambientes petrolíferos, é ainda uma etapa crítica para elucidar quais são
os microrganismos presentes neste ambiente. As técnicas de cultivo utilizadas para isolar
microrganismos de reservatórios de petróleo geralmente implicam em conferir condições
7
Geomicrobiologia: ciência que estuda as relações entre a evolução geológica e físico-química da
Terra e a evolução e adaptação microbiana.
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extremas para o crescimento microbiano (alta temperatura, pressão, concentrações de
micronutrientes), dificultando ou mesmo impossibilitando o isolamento destes organismos.
Desta forma, as técnicas moleculares então são muitas vezes usadas como abordagem única
na definição de misturas complexas ou guildas
8
de microrganismos não-cultivados ou
muito diversos presentes em comunidades naturais. E ainda, essas técnicas podem ser
adaptadas, gerando conhecimento para otimizar o isolamento de organismos previamente
conhecidos como “não-cultiváveis”.
Extração de DNA da comunidade microbiana predominante
A análise molecular da diversidade microbiana de comunidades complexas do
ambiente requer procedimentos eficientes e sem interferentes de extração de DNA. A
extração de ácidos nucléicos pode ser realizada diretamente das amostras ambientais por
métodos mecânicos ou químicos; ou indiretamente, onde há o fracionamento da amostra,
empregando técnicas para a separação das células do restante do material, e posteriormente
é feita a lise celular para a extração do DNA. Diversas metodologias e protocolos já foram
descritos para a extração de ácidos nucléicos do ambiente. E ainda, atualmente, muitos
estudos lançam mão de “kits” de extração de DNA de amostras ambientais rápidos e
eficientes (OGRAM, SAYLER, & BARKAY, 1987; SMALLA et al., 1993;
AKKERMANS, VAN ELSAS & DE BRUIJN, 1995; VAN ELSAS, WELLINGTON &
TREVORS, 1997; WEBSTER et al., 2003).
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerse Chain Reaction”)
A PCR é uma técnica que consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA, muito utilizada em estudos
moleculares de diversidade e ecologia microbiana. A PCR amplifica seqüências alvo de
DNA por meio de iniciadores (ou em inglês primers) que são oligonucleotídeos que
delimitam uma determinada região ou domínio do DNA que deverá ser amplificada (SAIKI
et al., 1988). A técnica de PCR tem inúmeras aplicações, podendo utilizar iniciadores que
podem ter como alvo a população predominante de Bacterias, Archaeas, como no caso de
iniciadores universais. Além disso, se podem empregar iniciadores específicos para um
8
Guildas: Um grupo de espécies diversas que ocupam um mesmo nicho e caracteriza-se pela
utilização dos mesmos recursos ambientais.
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determinado grupo (ex.: bactérias redutoras de sulfato) ou sintetizar novos iniciadores para
determinados microrganismos que desejarmos estudar, bem como para genes funcionais
dos mesmos.
Iniciadores universais: Gene rrs
Os genes rrs, rrl e rrf codificam os RNAr 16S, 23S e 5S, respectivamente. As
moléculas de RNAr apresentam regiões extremamente conservadas estruturalmente e
funcionalmente entre todos os organismos, pois a taxa de mutações ao longo do processo
evolutivo é extremamente baixa, se comparada a outros genes. Além disso, também
apresenta regiões altamente variáveis, sendo que o grau de variação nestas regiões pode
variar de um táxon para outro. Esta característica variável de regiões dos genes que
codificam RNAr proporciona o desenho de iniciadores reino-específicas, gênero-
específicas e até espécie-específicas (WOESE, 1987; ROSADO et al., 1996).
A primeira tentativa em caracterizar a comunidade microbiana de amostras
ambientais por métodos independente de cultivo utilizou o gene rrf (RNAr 5S). Entretanto,
devido ao seu tamanho (aproximadamente 120 nucleotídeos), a informação gerada foi
pequena, insuficiente para análises filogenéticas, sendo somente aplicável para
comunidades pouco diversas (PACE et al., 1986). O gene rrs (RNAr 16S) têm sido
preferencialmente escolhido porque além de estar presente em todos os organismos
procariotos, este gene apresenta um tamanho (número de pares de bases) adequado para as
análises filogenéticas subseqüentes (HILLIS, MORITZ & MABEL, 1996).
O uso do RNAr 16S em diversos trabalhos como ferramenta de estudo de
diversidade bacteriana trouxe a conveniência de se armazenar informações de seqüências
deste gene em grande número. Isto é, uma vez obtidas, as seqüências podem ser
depositadas em banco de dados especializados (RDP, GenBank e EMBL), ficando
disponíveis para estudos posteriores. Atualmente, o GenBank possui um total de 832.000
seqüências de rrs (data de consulta: 25 de outubro de 2008). O RNAr 16S foi a molécula
pioneira nos estudos de seqüências e por isso hoje possui o maior número de seqüências
disponíveis em bancos de dados, facilitando muito os estudos comparativos. Deste modo, a
análise das seqüências dos ácidos nucléicos vem contribuindo para a expansão do
conhecimento acerca da filogenia e da evolução microbiana (WOESE, 1987; OLSEN,
WOESE, OVERBEEK, 1994).
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Iniciadores específicos: Gene aprA
A APS redutase bacteriana é um heterodímero formado por uma subunidade alfa
(75–80 kDa) com uma FAD (flavina adenina dinucleotídeo) e uma subunidade beta (18–23
kDa) com dois centros [4Fe–4S], que são codificados pelo gene aprBA (MEYER &
KUEVER, 2008). Ambas as subunidades AprA e AprB são altamente conservadas entre as
BRS, devido a suas propriedades fisicoquímicas estáveis. Assim, o gene que codifica esta
enzima (aprBA) tem sido usado para análises filogenéticas de BRS (HIPP et al., 1997;
FRIEDRICH, 2002). A AprA, a maior subunidade da APS redutase, contem o local de
ligação de substrato APS, uma região que é conservada em todas as APS redutases
(SPEICH et al., 1994). FRIEDRICH (2002) comparou o uso do gene rrs com o gene aprA
como ferramenta de estudo de filogenia de BRS, que indicou relativa similaridade na
topologia das árvores filogenéticas obtidas a partir destes genes, pois detectou a formação
dos mesmos clusters da maioria das espécies analisadas. As diferenças encontradas nas
árvores construídas com o gene rrs e com o gene aprA foram atribuídas à transferência
lateral do gene aprA entre certas BRS. Ainda neste mesmo estudo de FRIEDRICH (2002),
foi sugerida a existência de uma única cópia do gene para em casa uma das estirpes.
1.3 Biofilmes bacterianos
As bactérias são geralmente vistas como organismos simples quando comparadas
aos organismos superiores. Entretanto, o estudo do desenvolvimento bacteriano tem
mostrado que estes microrganismos são capazes de diferenciações e comportamentos
complexos. Uma característica extraordinária das bactérias é sua capacidade de crescimento
rápido em condições ambientais apropriadas e quando há disponibilidade de nutrientes.
Ainda mais extraordinária é a capacidade desses microrganismos permanecerem viáveis em
condições adversas. Muitas bactérias desenvolveram mecanismos altamente sofisticados
que lhes permitem manter a viabilidade celular durante períodos de escassez de nutrientes,
voltando a crescer rapidamente quando estes se tornam disponíveis. Um exemplo destes
mecanismos é a formação de esporos por espécies do gênero Bacillus, cuja célula
vegetativa capta sinais externos e internos para desencadear a síntese de uma nova estrutura
morfológica que se adapta para a sobrevivência em ambientes adversos (BROWN &
WILLIAMS, 1985; COSTERTON et al., 1995; O’TOOLE, KAPLAN & KOLTER, 2000).
Outras células bacterianas também podem formar corpos de frutificação e agregados
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2008
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celulares em resposta à falta de nutrientes (SIEGELE & KOLTER, 1992). Pode-se dizer
que as bactérias constituem a forma de vida de maior sucesso na Terra, em termos de
biomassa total e em relação à variedade e extensão de habitats colonizados. Isso se deve
principalmente à plasticidade fenotípica, ou seja, à habilidade dos diferentes grupos
bacterianos em responder distintamente a estímulos ambientais. Uma importante estratégia
fenotípica que vem sendo extensivamente estudada é a organização das bactérias sob a
forma de biofilmes (BROWN &WILLIAMS, 1985; COSTERTON ET AL., 1995).
As bactérias podem ser encontradas livremente em suspensão (existência
planctônica) ou aderidas a um substrato (existência séssil) em ambientes onde se faz
presente uma fase líquida. A superfície para adesão de bactérias e formação de biofilmes
pode ser abiótica (lentes de contato, tubulações industriais, etc.) ou biótica (tecidos animais
e vegetais) (DUNNE, 2002; FLEMMING, 2002). Organizações complexas de várias
espécies e até gêneros diferentes podem ocorrer dentro de comunidades bacterianas
planctônicas e sésseis. As condições ambientais, em grande parte, ditam se os organismos
irão existir em um estado planctônico ou séssil (GEESEY, 1993).
A propensão das bactérias em colonizar superfícies é vantajosa, do ponto de vista
ecológico, porque permite a proteção destas células contra agentes antimicrobianos, e a
existência de relações simbióticas entre diferentes bactérias e destas com células
eucarióticas (DUNNE, 2002). Estas relações são abundantes na natureza como, por
exemplo, a colonização de bactérias fixadoras de nitrogênio nas raízes de leguminosas. A
tendência das bactérias em se aderir é ubíqua em diversos ecossistemas e confere vantagem
seletiva sobre as bactérias planctônicas (encontradas livremente em solução). Uma das
razões possíveis para a adaptação de muitos microrganismos para a formação estratégica de
biofilme é a concentração de nutrientes sobre superfícies sólidas em ambientes aquáticos.
Além disso, as bactérias que se encontram organizadas na forma de biofilmes são capazes
de se envolver em relações sintróficas, podendo até facilitar o aparecimento de novas
características por transferência gênica (DAVEY & O’TOOLE, 2000).
As bactérias aderidas a superfícies sólidas formam uma camada lodosa
escorregadia, constituindo os biofilmes bacterianos. Esses biofilmes estão presentes na
maioria das superfícies molhadas ou úmidas, encontradas na natureza, e também em
ambientes industriais e médicos (CARPENTIER & CERF, 1993; ELDER, STAPLETON &
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DART, 1995). COSTERTON, STEWART & GREENBERG (1999) definem biofilme
como “uma comunidade estruturada de células bacterianas cercadas por uma matriz
polimérica produzida pelas próprias bactérias, aderida a uma superfície inerte ou viva”. Os
biofilmes bacterianos atingem dimensões compatíveis para observação a olho nu e,
possivelmente, essas comunidades microbianas tenham sido as primeiras a serem estudadas
na área da microbiologia (COSTERTON, 1999).
Em 1684, Antonie van Leeuwenhoek raspou a placa bacteriana de seus dentes e
observou, com seu microscópio primitivo, a presença dos agregados de “animalcules”. Suas
observações foram confirmadas por outros pesquisadores, mas a compreensão da natureza e
da importância desses minúsculos organismos demorou a ser esclarecida. A partir do século
XIX, o químico francês Louis Pasteur provou que a vida não era fruto da geração
espontânea e desenvolveu métodos para controlar o crescimento microbiano. Já o físico
alemão Robert Koch criou critérios experimentais que serviram como base para o estudo de
microrganismos patogênicos e desenvolveu o primeiro método para o crescimento de
culturas puras de microrganismos (COSTERTON, 1999). Porém, a teoria da predominância
da existência séssil das bactérias sob a forma de biofilme foi somente promulgada em 1978.
Esta teoria sugere que a maioria das bactérias cresce em comunidades aderidas a superfícies
em ecossistemas aquáticos, sob a forma de biofilmes, sendo este o maior componente da
biomassa bacteriana (GEESEY et al., 1977; DONLAN & COSTERTON, 2002). Estudos
vêm demonstrando que a adesão bacteriana ocorre de uma forma bastante organizada
obedecendo a princípios de especificidade e sinalização celular (COSTERTON,
STEWART & GREENBERG, 1999). A predominância de biofilmes foi estabelecida em
praticamente todos os ecossistemas. Observações microscópicas e técnicas quantitativas
diretas mostram que mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilme em uma variedade
de superfícies (DONLAN & COSTERTON, 2002).
A formação de biofilmes sobre superfícies é uma estratégia bacteriana universal
para sobrevivência e posicionamento favorável em relação aos nutrientes disponíveis
(COSTERTON et al., 1987). Constitui, também, uma proteção que permite a sobrevivência
das bactérias em ambientes hostis (COSTERTON et al., 1995).
1.3.1 Estrutura e fisiologia de biofilmes bacterianos
Os biofilmes bacterianos são estruturas constituídas por comunidades de bactérias
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aderentes entre si e/ou a superfícies, envolvidas por matriz extracelular altamente hidratada
(COSTERTON et al., 1994, 1995). Os biofilmes podem compreender uma única ou várias
espécies bacterianas. Apesar dos biofilmes mistos predominarem na maioria dos ambientes,
biofilmes formados por uma espécie ocorrem em diversas infecções e na superfície de
implantes médicos (O’TOOLE, KAPLAN & KOLTER, 2000). Estudos nesta área têm
mostrado que a coagregação de bactérias sésseis geralmente ocorre entre organismos
distantes taxonomicamente e, ocasionalmente, entre estirpes pertencentes à mesma espécie
(RICKARD et al., 2003a). A superfície do biofilme é bastante adsortiva devido a sua
natureza polieletrolítica, capaz de reter quantidades significantes de compostos orgânicos e
inorgânicos do meio (CHARACKLIS, 1981; NIVENS, PALMER & WHITE, 1995).
Estudos da arquitetura do biofilme têm mostrado que a microcolônia é a unidade básica
desta estrutura (COSTERTON, 1999). As microcolônias são compostas por populações de
uma única espécie e o conjunto de microcolônias forma o biofilme. Vários parâmetros
podem afetar a estrutura do biofilme, como as propriedades da superfície de adesão e da
interface sólido-líquido, disponibilidade de nutrientes, composição da comunidade
microbiana e hidrodinâmica (DAVEY & O’TOOLE, 2000).
A microcolônia pode ser composta por 10-25% de células e 75-90% de matriz
composta por substâncias poliméricas extracelulares (SPE), dependendo das espécies
envolvidas (COSTERTON, 1999). Aproximadamente 80% - 90% da massa total dos
biofilmes é constituída por água. As bactérias representam cerca de 70% do peso seco,
enquanto o restante é atribuído aos elementos de matriz extracelular (MARSH &
BRADSHAW, 1995).
Nos estágios iniciais de formação do biofilme, as bactérias sésseis encontram-se
justapostas, podendo formar biofilmes simples ou mistos (COSTERTON et al., 1995). O
ambiente interno de cada microcolônia é condicionado pelos elementos de matriz
extracelular e pela atividade metabólica de suas células. Os biofilmes possuem um alto grau
de organização, onde as bactérias se beneficiam da justaposição estável e da cooperação
fisiológica para constituir uma comunidade coordenada funcionalmente (COSTERTON et
al., 1987, 1995; FERRIS et al., 1989).
Análises estruturais do biofilme revelaram que a arquitetura dos biofilmes é
formada por estruturas cônicas simples e por outras em forma de cogumelo (Figura 7).
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Essas estruturas formam poros e/ou canais de água que se intercalam entre as microcolônias
formadas pelas bactérias sésseis. Por entre estes poros podem circular nutrientes, oxigênio e
substratos até nas partes mais internas do biofilme, o que facilita a troca de subprodutos
metabólicos com a fase líquida (DE BEER, SRINIVASAN & STEWART, 1994;
COSTERTON, 1995; COSTERTON et al., 1995; COSTERTON, 1999; STOODLEY et al.,
1999; DAVEY & O’TOOLE, 2000; TOLKER-NIELSEN & MOLIN, 2000; DONLAN &
COSTERTON, 2002). Quando um biofilme é composto por diferentes espécies, os
subprodutos metabólicos de um organismo podem servir de suporte para o crescimento de
outro, enquanto que a adesão de uma espécie confere ligantes para anexar outros (Figura 8).
Porém, a competição por nutrientes e o acúmulo de subprodutos tóxicos podem limitar a
diversidade no biofilme (DUNNE, 2002). Desta forma, a arquitetura do biofilme é
influenciada tanto pela microbiologia quanto pelas condições ambientais (DAVEY &
O’TOOLE, 2000).
1.3.2 Adesão bacteriana e componentes da matriz extracelular
As bactérias aderem a um substrato sólido através das SPE, sintetizadas, secretadas
e orientadas pela célula, que se estendem desde a superfície dos microrganismos para
formar uma matriz extracelular emaranhada altamente hidratada (COSTERTON et al.,
1987, 1995). A matriz extracelular pode atuar como uma resina de troca iônica, extraindo
moléculas orgânicas e íons inorgânicos do meio ambiente e produzindo uma concentração
de nutrientes favorável dentro do biofilme (COSTERTON et al., 1987).
As SPE são os principais componentes do glicocálice bacteriano, ou camada limosa,
que se encontra intimamente associado à parede celular. Elas são também encontradas nos
espaços extracelular e intercelular. As SPE são predominantemente constituídas por água.
Quimicamente, são polímeros altamente heterogêneos, constituídos por polissacarídeos,
proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos, dos quais muitos são espécie-específicos.
Polissacarídeos de SPE são geralmente carregados negativamente, mas também podem ser
neutros ou, raramente, apresentar cargas positivas. As células presas na matriz de SPE não
apresentam movimento Browniano. A composição das SPE determina a característica
hidrofílica ou hidrofóbica da matriz extracelular. A hidrofobicidade apresenta um papel
importante para a adesão de certas bactérias em determinados substratos. As SPE
encontram-se densamente concentradas ao redor das microcolônias bacterianas e são
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responsáveis por imobilizá-las na superfície, assim como por facilitar o arranjo espacial e a
comunicação entre esses grupos bacterianos através dos canais de água formados por elas
(SUTHERLAND, 1985; WHITFIELD, 1988; NEU & PORALLA, 1990; BAYER &
BAYER, 1994; MARSHALL, 1997; ALLISON, 1998; BEECH & GAYLARDE, 1999;
DUNNE, 2002).
Figura 7: Representação esquemática da estrutura do biofilme bacteriano.
O modelo contempla aspectos estruturais e fisiológicos de um biofilme bacteriano aderido a
uma superfície sólida. A Figura mostra estruturas cônicas e em forma de cogumelo, perfuradas em
sua extremidade inferior por canais, pelos quais circulam o fluido e os nutrientes. As bactérias
organizam-se em microcolônias imersas em grande quantidade de matriz extracelular. Porções
mais superficiais do biofilme se desprendem, com conseqüente limitação do crescimento do biofilme
e colonização de novas regiões da superfície.
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1.3.3 Formação e organização de biofilmes bacterianos
A partir do momento em que um material inerte é imerso em um ambiente líquido,
sua superfície sofre grandes mudanças, a começar pela adsorção de compostos químicos
inorgânicos. Em ambientes biologicamente ativos, há aderência de moléculas orgânicas
(camada condicionante – Figura 8) e de bactérias, dando início ao processo de formação do
biofilme bacteriano. O biofilme bacteriano pode atingir dimensões macroscópicas através
da aderência de outros microrganismos (algas, fungos e protozoários) e/ou de
macrorganismos (cracas, mexilhões) adquirindo a denominação de biofouling. O termo
fouling (incrustação, acumulação de resíduos, depósitos, sujeira, etc.) está relacionado à
formação indesejável de depósitos orgânicos e/ou inorgânicos em superfícies, podendo
causar problemas como, por exemplo, diminuição do fluxo de calor através de uma
superfície e o aumento de sua taxa de corrosão (CHARACKLIS, 1981).
O processo de formação de biofilme parece ser iniciado quando as células
bacterianas captam certos sinais do ambiente que desencadeiam a transição de crescimento
de vida planctônica para vida séssil aderida a substratos sólidos (DAVEY & O’TOOLE,
2000). O desenvolvimento do biofilme procede como uma sucessão de eventos de adesão e
multiplicação (Figura 8). As bactérias em ambientes naturais e artificiais encontram uma
ampla variedade de superfícies sólidas que podem alterar seu comportamento fisiológico e
ecológico. As bactérias alcançam aleatoriamente uma distância próxima à superfície, ou por
quimiotaxia ou por mobilidade. Estas células podem ser consideradas partículas coloidais
vivas. Uma vez aderidas a superfícies, estão sujeitas a várias forças de atração e repulsão.
Estas forças podem levar a uma adesão rápida, porém passiva, ou podem acarretar uma
adesão lenta, mas ativa. O processo de adesão envolve uma fase intermediária reversível,
seguida de respostas fisiológicas induzidas nas bactérias ao primeiro contato com a
superfície. Neste ponto, as bactérias consolidam o processo de adesão pela produção de
SPE, e se tornam aderidas irreversivelmente (MARSHALL, 1997; DUNNE, 2002;
RICKARD et al., 2003b).
O processo de formação de um biofilme bacteriano pode ser subdividido em vários
estágios, obedecendo à seguinte ordem (GEESEY, 1993; ALLISON et al., 1999): (1)
Formação da camada condicionante por moléculas orgânicas que se transferem do líquido
para a superfície sólida; (2) Colonização ou adesão da superfície por bactérias planctônicas
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Figura 8: Diagrama ilustrativo da coagregação de bactérias e formação do biofilme
(extraído e adaptado de Rickard et al., 2003b).
a) Colonização primária do substrato sobre camada condicionante.
b) Crescimento celular e produção de SPE, que ancoram as células à superfície de
uma forma geralmente irreversível.
c) Co-agregação de células no biofilme. Nesta fase, o biofilme aumenta de
espessura e as condições em sua base são alteradas.
d) Biofilme Maduro.
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e começo da existência séssil pela excreção de produtos de matriz extracelular, que
ancoram as células à superfície de uma forma geralmente irreversível; (3) Multiplicação de
diferentes espécies de bactérias sésseis sobre a superfície do metal; (4) Crescimento das
microcolônias e eventual estabelecimento de relações próximas entre si na superfície. Nesta
fase, o biofilme aumenta em espessura e as condições em sua base são alteradas; (5)
Desprendimento de porções do biofilme; (6) Recolonização de áreas adjacentes e expostas
da superfície por bactérias planctônicas ou por bactérias sésseis.
Durante os primeiros estágios de desenvolvimento, um biofilme é composto das
espécies bacterianas pioneiras que se aderem à camada de condicionamento adsorvida à
superfície e essas bactérias encontram-se distribuídas como células individuais de forma
heterogênea. A natureza e a extensão da adesão dependem das propriedades físico-químicas
do substrato, da origem das moléculas da camada condicionante, inicialmente substratos
orgânicos e posteriormente SPE, e dos organismos envolvidos (RICKARD et al., 2003b).
Em questão de minutos, algumas das espécies aderidas produzem SPE que
envolvem as células e se estendem da superfície celular até o substrato em contato com o
meio. Neste estágio do desenvolvimento, o biofilme costuma ser menor que 10 μm em
espessura e costuma apresentar uma matriz descontínua de exopolímeros intercalada com
células. Como as células sésseis do biofilme continuam multiplicando e excretando mais
SPE, o biofilme forma uma camada confluente de espessura crescente sobre a superfície.
Com o passar do tempo, espécies de bactérias planctônicas e partículas inorgânicas
entranham-se no biofilme e contribuem para o crescimento de uma comunidade de grande
complexidade. Nesse estágio, o biofilme é considerado maduro. Sua morfologia e
consistência variam dependendo dos tipos de bactérias presentes e das condições do meio
que o envolve. O tempo necessário para a formação de um biofilme maduro pode variar de
alguns dias até várias semanas. Com o aumento da espessura do biofilme, fica prejudicada a
difusão de gases dissolvidos e outros nutrientes vindos do meio para o substrato. Nesse
caso, as condições podem se tornar inóspitas para as bactérias localizadas na base do
biofilme e que se encontram distantes dos canais de água e, como conseqüência, essas
bactérias acabam morrendo. As células em diferentes regiões de um biofilme exibem
diferentes padrões de expressão gênica (DAVIES et al., 1998). A competição por nutrientes
também faz com que sejam perdidas muitas das vantagens da vida protegida dentro dos
Elisa Korenblum
2008
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biofilmes. As células tendem a se desprender não só para colonizar novas áreas, mas
também para buscar nutrientes. O deslocamento das bactérias para novas áreas também
serve para dispersar a população e, portanto, para expandir a diversidade genética. Com a
necessidade nutricional e com a base do biofilme abalada devido à morte de bactérias, o
estresse causado pelo fluxo do meio e mecanismos de sinalização celular denominado
quorum sensing (sensibilidade ao quorum) atuam em conjunto para que ocorra o
desprendimento de partes do biofilme, expondo áreas descobertas na superfície (FUQUA,
WINANS & GREENBERG, 1994). O quorum sensing é causado por um acúmulo de
substâncias de baixo peso molecular em uma concentração limiar crítica, permitindo que
células individuais "sintam" que uma unidade populacional bacteriana mínima foi atingida
e assim deve ser iniciada uma resposta coordenada pela população. ALLISON e
colaboradores, em 1998, mostraram que as N-acil homoserina lactonas têm participado do
processo de desprendimento de células por quorum sensing em biofilmes formados por P.
fluorescens. As áreas que se tornam expostas após o desprendimento são,
subseqüentemente, recolonizadas e novas bactérias e suas SPE dão continuidade ao
biofilme existente. Esse fenômeno cíclico (adesão, formação do biofilme e seguinte
desprendimento das células) ocorre mesmo quando as condições físicas no líquido
permanecem constantes.
1.3.4 Métodos microscópicos para estudo de biofilmes
O conhecimento sobre os biofilmes tem sido adquirido através de observações
microscópicas e por análises bioquímicas e taxonômicas destrutivas, ou seja, que alteram
sua estrutura. Um aspecto fundamental do estudo da adesão bacteriana a superfícies é a
necessidade de métodos confiáveis para quantificação de células aderidas. Muitos métodos
de contagem bacteriana incluem metodologias de contagem direta por microscopia óptica e
microscopia eletrônica de varredura (MEV). A microscopia óptica convencional pode
fornecer informações sobre a distribuição e atividade fisiológica dos microrganismos, bem
como extensão da superfície colonizada. Entretanto, seu uso é limitado quando se estuda
biofilmes maduros, onde a natureza tridimensional da comunidade mascara a observação
dos microrganismos constituintes destes biofilmes (AN & FRIEDMAN, 1997;
CAVALCANTI, 2001).
Um grande avanço na instrumentação microscópica com potencial para estudo de
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2008
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biofilmes bacterianos é o microscópio óptico confocal de varredura a laser (COSTERTON
et al., 1995). O confocal é um microscópio de epifluorescência de alta tecnologia que
permite a realização de cortes ópticos (~3μm) horizontais e verticais, onde são excluídos
aqueles que se encontram fora de foco. Através do confocal podemos documentar a
morfologia e a fisiologia de biofilmes intactos sob condições in situ, permitindo a melhor
compreensão sobre a sua organização espacial (PALMER & STERNBERG, 1999). As
informações que podem ser obtidas a partir desta técnica incluem quantificação, medição
do biofilme, identificação de espécies no complexo, assim como de estruturas na superfície
celular, em termos de espessura, área de superfície colonizada, densidade bacteriana e
tempo de colonização do substrato sólido. Além disso, a organização tridimensional do
biofilme pode ser estudada correlacionando-a com o estado fisiológico das bactérias. A
observação direta de populações microbianas e da atividade biológica é necessária para
fornecer uma informação exata sobre a dinâmica de agregação celular, os processos
metabólicos, a resistência a agentes microbianos ou sobre os predadores dentro de uma
estrutura de biofilme funcional. As análises de biofilmes microbianos podem ser realizadas
através da utilização de uma grande variedade de sondas fluorescentes, sendo possível
distinguir células viáveis das não-viáveis usando colorações vitais.
Os fluoróforos comumente usados são o DAPI (dihidrocloreto 4´,6-diamino-2-
fenilindol), iodeto de propídio (IP) e laranja de acridina (LA). O DAPI é um composto que
se liga a DNA e fluoresce em azul quando excitado por luz UV; portanto, é útil para
visualizar bactérias totais em uma amostra. O IP é freqüentemente usado para corar células
desestabilizadas. Este composto se intercala entre as bases de DNA e, quando excitado por
lâmpadas de mercúrio ou xenônio, emite fluorescência em vermelho. A LA emite
fluorescência em verde quando ligado a DNA dupla fita e em laranja quando ligado a
ácidos nucléicos de fita simples, como mRNA.
1.4 Controle do crescimento de BRS e da produção de Sulfeto
A medida mais comum contra o crescimento microbiano indesejado é o uso de
biocidas (FLEMMING, 2002). Os biocidas são capazes de eliminar ou inibir o crescimento
microbiano. Entre outros objetivos, os biocidas são usados para o controle de biofilmes
bacterianos, em especial daqueles ricos em BRS, causadores de CIM em superfícies
Elisa Korenblum
2008
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metálicas na indústria do petróleo. Um critério importante para seleção e aplicação de um
biocida deve incluir o cumprimento de leis de proteção ambiental. Os principais biocidas
usados na indústria do petróleo são sais de amônio quaternário, cloro, glutaraldeído e o
THPS (sulfato de tetraquishidroximetilfosfônio). Em geral, estas bases químicas ativas
apresentam problemas de toxicidade a formas de vida superior e de persistência de resíduos
tóxicos, podendo gerar impactos ambientais (DOWLING & GUEZENNEC, 1997;
JAYARAMAN, HALLOCK & CARSON, 1999; VIDELA, 2002).
A eficiência do biocida depende da natureza do microrganismo a ser eliminado e as
condições de operação do sistema a ser tratado (VIDELA, 2002). É importante reconhecer
que bactérias presentes em um biofilme maduro se comportam de forma diferente de
quando estão em sua forma planctônica. Como anteriormente comentado, bactérias
presentes em biofilmes são mais resistentes a agentes antimicrobianos do que aquelas em
suspensão. As SPE atuam como uma barreira de difusão entre as células e o meio e
funcionam como um fator de proteção das bactérias contra, por exemplo, o efeito letal de
biocidas, de antibióticos e de agentes surfactantes, ataque de bacteriófagos, entre outros
(COSTERTON et al., 1987, 1994, 1995; SUTHERLAND, SKILLMAN & HUGHES,
1999). A penetração e a reatividade dos agentes antimicrobianos variam com o tamanho da
malha e com as características químicas das SPE (COSTERTON et al., 1995;
SUTHERLAND, SKILLMAN & HUGHES, 1999).
Em alguns casos extremos, as concentrações de biocidas necessárias para se atingir
uma atividade bactericida contra organismos sésseis podem ser três a quatro vezes maior do
que as concentrações usadas para bactérias livres na fase líquida (DUNNE, 2002). A
resistência dos microrganismos presentes em biofilmes tem implicações econômicas e
ambientais muito sérias em vários setores industriais. Os mecanismos responsáveis pela
resistência aos biocidas podem ser: (1) difusão limitada do agente antimicrobiano através
da matriz do biofilme; (2) nível reduzido de atividade metabólica dos organismos do
biofilme; (3) estrutura do envelope celular; (4) interação do agente antimicrobiano com a
matriz do biofilme (células e polímeros); (5) resistência mediada por enzima; (6) bomba de
fluxo; (7) adaptação genética (DONLAN & COSTERTON, 2002; CLOETE, 2003).
Elisa Korenblum
2008
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1.5 Produção de substância antimicrobiana (SAM) em biofilme
Métodos convencionais de controle e remoção de biofilmes em um cenário
industrial nem sempre são eficientes. É comum aumentar a concentração usual de um
biocida na tentativa de melhorar sua eficiência, porém esta estratégia pode resultar em
impactos ambientais ainda mais graves. Uma alternativa vantajosa para controle de
biofilmes com menor impacto ambiental inclui a estimulação de organismos capazes de
produzir substâncias antimicrobianas (SAM) in situ (JAYARAMAN, MANSFELD &
WOOD,1999). Bactérias produzem importantes metabólitos, dentre estes compostos estão
as SAM. Alguns trabalhos mostram que bactérias produtoras de SAM encontram-se
majoritariamente no estado séssil (YAN et al., 2003). Os resultados obtidos por YAN,
BOYD & BURGUESS (2002) sugeriram que a formação de biofilme é um fator importante
na produção de compostos antimicrobianos pelas estirpes B. licheniformis EI-34-6 e B.
subtilis II-111-5 (YAN, BOYD & BURGESS, 2002; YAN et al., 2003). JAYARAMAN,
MANSFELD & WOOD (1999) observaram um decréscimo na população de uma espécie
de BRS (Desulfovibrio vulgaris) em um biofilme de B. subtilis expressando bactenecina,
tendo sido também detectada a inibição da corrosão induzida por BRS.
1.6 Bactérias do gênero Bacillus produtoras de SAM
Bactérias do gênero Bacillus habitam comunidades ecológicas complexas, como
solos e ambientes aquáticos, onde produzem uma variedade de compostos que parecem
aumentar sua capacidade de sobrevivência. Muitos destes compostos apresentam atividade
antimicrobiana, podendo ser produzidos em condições de estresse nutricional, sendo
comum observar o acúmulo destes produtos na fase estacionária do crescimento bacteriano
(ZUBER, NAKANO & MARAHIEL, 1993).
1.6.1 O gênero Bacillus
Bactérias do gênero Bacillus pertencem à família Bacillaceae e têm, como uma
característica taxonômica importante, a formação de endósporos, ocorrendo somente um
por célula. Como os esporos são resistentes ao calor, frio, radiação, dessecação e
desinfetantes podem permanecer viáveis por longo período de tempo (GORDON, 1977).
O gênero é composto por células que são encontradas no formato de bastonetes
Elisa Korenblum
2008
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retos ou quase retos. Bactérias pertencentes a este gênero são Gram-positivas, entretanto,
algumas espécies são consideradas Gram-variáveis por serem coradas de rosa, nos estágios
finais do crescimento (BEVERIDGE, 1990). Algumas espécies podem ser móveis,
apresentando geralmente flagelo peritríquio. Certas espécies são aeróbias estritas e outras
aeróbias facultativas; o oxigênio é, na maioria das vezes, o aceptor final de elétrons. A
morfologia e o tamanho das colônias são muito variáveis. Algumas estirpes de Bacillus
apresentam pigmentação em determinados meios de cultura. Devido ao grande número de
espécies pertencentes a este gênero, apresentando características fisiológicas diversas,
bactérias do gênero Bacillus são encontradas em diferentes ambientes, podendo ser desde
psicrófilas a termófilas, acidofílicas a alcalinofílicas, halotolerantes ou halofílicas. A
maioria das espécies produz catalase e pode ser oxidase positiva ou negativa. Algumas
espécies deste gênero são quimiorganotróficas, prototróficas a auxotróficas necessitando de
vários fatores de crescimento (CLAUS & BERKELEY, 1986).
Até a década de 90, as diferentes espécies de Bacillus eram identificadas usando
somente critérios morfológicos e bioquímicos. Em 1991, ASH e colaboradores, através da
análise da seqüência do gene que codifica o RNA ribossômico 16S, demonstraram a
heterogeneidade filogenética das espécies que compunham o gênero Bacillus. Com base
nesta análise detalhada, o gênero Bacillus foi dividido em 5 linhas filogenéticas distintas
altamente divergentes. Assim, novos gêneros do mesmo ramo filogenético de Bacillus
foram destacados, como por exemplo: Amphibacillus (NIMURA et al., 1990),
Paenibacillus (ASH, PRIEST & COLLINS, 1993), Alicyclobacillus (WIZOTZKEY et al.,
1992), Halobacillus (SPRING et al., 1996), Brevibacillus, Aneurinibacillus (SHIDA et al.,
1996), Virgibacillus (HEYNDRICKX et al., 1998), Gracilibacillus e Salibacillus (WAINO
et al., 1999), Thermobacillus (TOUZEL et al., 2000), Filobacillus (SCHLSNER et al.,
2001), Ureibacillus (FORTINA et al., 2001), Geobacillus (NAZINA et al., 2001),
Jeotgalibacillus (YOON et al., 2001), Oceanobacillus (LU, NOGI, & TAKAMI, 2001),
Paraliobacillus (ISHIKAWA et al., 2002), Pontibacillus (LIM et al., 2005),
Ornithinibacillus (MAYR
et al., 2006) e Piscibacillus (TANASUPAWAT et al., 2007).
Espécies do gênero Bacillus são de grande importância prática, pois interagem de
diversas formas com as atividades humanas. A importância biotecnológica de certas
espécies, como B. subtilis, B. licheniformis e B. amyloliquefaciens é devida às várias
Elisa Korenblum
2008
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aplicações relacionadas à produção de enzimas, antibióticos, solventes e outras moléculas.
B. mycoides apresenta, por exemplo, atividade promotora de crescimento de planta
(DAFFONCHIO et al., 1998). A espécie B. thuringiensis também é amplamente usada na
agricultura para o biocontrole de insetos fitopatogênicos. Esta espécie é capaz de produzir
uma endotoxina, com atividade específica contra certas espécies de insetos, nematodos e
protozoários (DAFFONCHIO et al., 1998). Na área da saúde, outras espécies como B.
anthracis e B. cereus são de interesse médico, pois são responsáveis por causarem o antrax
e doenças de origem alimentar, respectivamente. Com maior importância na indústria de
alimentos, a espécie Geobacillus stearothermophilus pode causar problemas na linha de
produção, pois é altamente resistente a tratamentos térmicos, podendo causar problemas,
por exemplo, na conservação de leite e queijo por longos períodos (DAFFONCHIO et al.,
1998).
1.6.2 Produção de SAM por Bacillus
As SAM podem ser de natureza peptídica. Estas moléculas geralmente são pequenas
e estruturalmente diversas. Algumas contêm aminoácidos incomuns, como os D-
aminoácidos ou ácido α-amino isobutírico, lantionina, de-hidroalanina. Em geral, estas
moléculas não são passíveis de serem sintetizadas quimicamente (ZUBER, NAKANO &
MARAHIEL, 1993; VAN T’HOF et al., 2001).
Os metabólitos secundários produzidos por certas espécies e estirpes do gênero
Bacillus têm mostrado atividade antimicrobiana contra microrganismos patogênicos e
fitopatogênicos. É sugerido na literatura que estes compostos com atividade antimicrobiana
possam ser utilizados como um método alternativo ou suplementar ao uso de biocidas
químicos. Assim, espécies de Bacillus são candidatas ideais para o uso como agentes de
biocontrole em programas de tratamento de sementes contra patógenos originados do solo
(FÖLDES et al., 2000). Estes produtos têm atraído também interesse farmacêutico, como
agentes terapêuticos contra bactérias Gram-positivas e com importância na modificação da
microbiota intestinal em humanos (OSCÁRIZ, LASA & PISABARRO, 1999). A produção
de SAM por bactérias intestinais pode ser considerada como um tipo de defesa, pois estes
peptídeos matam microrganismos invasores que competem por nutrientes (NISSEN-
MEYER & NES, 1997). Já foi relatada também a atividade de SAM em rumem de animais
(PATTNAIK et al., 2001).
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 37
Dentre as substâncias com atividade antibacteriana produzidas por Bacillus,
incluem-se as bacteriocinas, que são geralmente peptídeos de baixa massa molecular
sintetizados pelo ribossomo. Na maioria das vezes, a atividade destas substâncias é espécie-
específica, entretanto algumas bacteriocinas apresentam um espectro de ação mais amplo
(HYRONIMUS, LE MARREC & URDACI, 1998).
Em 1995, YAKIMOV e colaboradores isolaram uma estirpe de B. licheniformis
(BAS50) de um reservatório de petróleo com profundidade de 1500 m. Esta estirpe é capaz
de produzir um composto surfactante chamado de liquenisina A, que apresenta atividade
antibacteriana. No entanto, sua atividade frente às bactérias testadas mostrou-se mais fraca
que a atividade inibitória de outro surfactante, a surfactina, produzida pela estirpe B.
subtilis ATCC 39307.
Elisa Korenblum
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2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO
A exploração de petróleo e gás se justifica pela importância desses recursos para a
economia e a segurança nacional, como pelo papel que desempenham na impulsão para
uma série de indústrias. A imagem da mineração como uma atividade agressiva ao meio
ambiente e aos interesses do desenvolvimento sustentado tem suas raízes na intensa
demanda pelos bens minerais que vigorou no passado remoto, associada à falta de soluções
tecnológicas adequadas.
O monitoramento dos processos perniciosos da indústria de petróleo e a
investigação de avanços tecnológicos na área de controle de riscos são atividades de rotina
da Petrobras. Os processos perniciosos causados pela presença de microrganismos na linha
de produção de petróleo são a acidulação biogênica e a biocorrosão de superfícies
metálicas. A ocorrência de bactérias redutoras de sulfato (BRS) e da conseqüente produção
intensiva de H
2
S em reservatórios de petróleo são fatores que agravam os processos citados.
Assim, a acidulação biogênica e a corrosão influenciada por microrganismos tem se
tornado uns dos maiores problemas na indústria de petróleo. Isto se deve principalmente ao
aumento da atividade de injeção de água do mar, para aumentar a pressão interna do
reservatório, como meio de recuperação secundária de petróleo. Considerando os cenários
ambiental, econômico e de segurança associados ao crescimento de BRS presentes em
ambientes petrolíferos, é de grande interesse para as indústrias petrolíferas o conhecimento
abrangente da microbiologia de reservatório e das bactérias presentes em instalações
industriais, especialmente no sistema de injeção de água do mar que é uma das maiores
fontes de contaminação do sistema. A busca por novos agentes biocidas é também uma
constante nas pesquisas de ponta para controle microbiológico, a fim de melhorar o sistema
de tratamento de água de injeção atualmente aplicado. Este tratamento convencional utiliza
biocidas sintéticos que apresentam efeitos colaterais provenientes da alta dose de biocida
aplicada (problemas ambientais, custo elevado para sua aplicação).
O estudo da geomicrobiologia promete melhor entendimento da origem dos
microrganismos que ali habitam e que atuam em diferentes vias metabólicas. A percepção
de que os microrganismos encontrados em ambientes petrolíferos podem ser tanto de
origem autóctone quanto alóctone estimulou o interesse no estudo da microbiologia do
petróleo quanto à diversidade bacteriana em ambientes de subsuperfície profundos,
Elisa Korenblum
2008
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característico dos muitos reservatórios brasileiros. As informações provenientes da
comunidade natural ou contaminante neste ambiente podem facilitar a escolha de
procedimentos e tratamentos mais adequados e específicos para o controle microbiano.
O enfoque deste trabalho foi avaliar a diversidade bacteriana presente em rochas
petrolíferas de poços não injetados com água do mar no Bacia de Campos, Rio de Janeiro,
para o estudo da comunidade autóctone de reservatórios. Outro aspecto estudado foi a
diversidade bacteriana presente em sistemas de água de injeção em plataformas situadas no
campo de Marlim, localizado também na Bacia de Campos, a fim de compreender a
comunidade bacteriana com potencial para contaminar o reservatório.
E por fim, em 2005, na dissertação de mestrado intitulada “Formação de biofilmes
por estirpes de Bacillus produtoras de substâncias antimicrobianas e isoladas de ambiente
petrolífero” (KORENBLUM, 2005) foi mostrado que a substância antimicrobiana (SAM)
H
2
O-1 apresentou atividade inibitória contra BRS in vitro (KORENBLUM et al., 2005).
Sendo as BRS as principais responsáveis pela acidulação biogênica e corrosão
microbiológica, diversos esforços são realizados a fim de aplicar novos mecanismos de
controle destes processos. Devido à toxicidade e persistência dos biocidas comumente
usados para evitar o crescimento de BRS, foi avaliado também no presente estudo, a
atividade da SAM produzida pela estirpe Bacillus firmus H
2
O-1 sobre biofilmes formados
por BRS, buscando uma possível alternativa aos métodos convencionais de controle e
remoção de biofilmes formados em diversos sistemas na indústria petrolífera.
Elisa Korenblum
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3 OBJETIVOS
9 Analisar a diversidade filogenética de bactérias totais e de bactérias redutoras de
sulfato presente em rocha petrolífera de subsuperfície profunda localizada no campo
petrolífero Marlim, Rio de Janeiro, utilizando o gene que codifica o RNAr 16S e o
gene aprA, respectivamente.
9 Analisar a diversidade filogenética de bactérias totais, utilizando o gene que codifica o
RNAr 16S, presentes em diferentes tratamentos do sistema de injeção de água em três
plataformas localizadas na Bacia de Campos, Rio de Janeiro. Comparar a composição
das populações encontradas em cada sistema de injeção de acordo com o tratamento
aplicado no controle microbiano.
9 Determinar a atividade inibitória da substância antimicrobiana (SAM) produzida pela
estirpe Bacillus firmus H
2
O-1 sobre o desenvolvimento de biofilmes de bactérias
redutoras de sulfato (BRS) em um biorreator CDC, caracterizando por microscopia
confocal de varredura a laser a adesão das BRS tratadas ou não tratadas com SAM.
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4 ETAPAS DESENVOLVIDAS
4.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente
em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas
profundas.
Foram identificados os principais grupos de bactérias totais e de bactérias redutoras
de sulfato (BRS) presentes em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero
offshore de águas profundas. Para tal, foi utilizado a abordagem molecular de PCR,
clonagem e seqüenciamento do gene que codifica o RNAr 16S e do gene aprA para
bactérias totais e BRS, respectivamente.
9 Extração de DNA a partir de quatro testemunhos de rocha reservatório do
campo de Marlim, coletados a uma profundidade de 2.822 – 2.828 m abaixo
da coluna de água do mar. Para tal, foi adaptada a metodologia de extração
de DNA para aumentar a eficiência de recuperação do DNA da comunidade
bacteriana presente nestas amostras.
9 Amplificação do DNA presente nas amostras de rocha por PCR, com base
em iniciadores universais para o gene que codifica o RNAr 16S e com base
em iniciadores grupo-específicos para o gene aprA.
9 Clonagem dos produtos de PCR para construção de bibliotecas.
9 Seqüenciamento de clones obtidos contendo os fragmentos esperados.
9 Identificação dos principais grupos taxonômicos presentes nos diferentes
testemunhos da rocha reservatório através de ferramentas de bioinformática.
4.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente
em sistemas de água de injeção.
Foram identificados os principais grupos de bactérias totais presentes em diferentes
pontos do sistema de tratamento de água de injeção, que utiliza água do mar para aumentar
a pressão do reservatório, na recuperação secundária. Estes sistemas de injeção de água são
situados na Bacia de Campos, Rio de Janeiro. Para este fim, também foi utilizado a
abordagem molecular de PCR, clonagem e seqüenciamento do gene que codifica o RNAr
16S.
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9 Extração de DNA a partir de água do mar coletada em diferentes pontos de
sistemas de tratamento de água de injeção de três plataformas.
9 Amplificação do DNA presente nas amostras de água por PCR, com base em
iniciadores universais para o gene que codifica o RNAr 16S.
9 Clonagem dos produtos de PCR para construção de bibliotecas.
9 Seqüenciamento de clones obtidos contendo os fragmentos esperados.
9 Identificação dos principais grupos taxonômicos presentes nas diferentes
amostras de água do sistema de tratamento de água de injeção através de
ferramentas de bioinformática.
9 Comparação dos tratamentos por métodos estatísticos de análise
multivariada utilizando análise de componente principal (PCA – do inglês:
principal component analysis).
4.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe
de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por
bactérias redutoras de sulfato.
Foram observadas alterações no padrão de colonização da superfície das estirpes de
BRS na presença da SAM H
2
O-1 sobre biofilmes simples previamente estabelecidos pelas
BRS sobre substrato de vidro. As alterações foram observadas utilizando microscopia
confocal de varredura a laser.
9 Preparação do sobrenadante da SAM H
2
O-1.
9 Formação de biofilmes por BRS em biorreator anaeróbico CDC.
9 Tratamento dos biofilmes com a SAM H
2
O-1.
9 Análise da redução de log do total de células, no biofilme controle não
tratado e no biofilme teste tratado com a SAM, pela técnica do número mais
que provável (NMP).
9 Processamento das amostras para microscopia de confocal de varredura a
laser com o corante fluorescente LIVE/DEAD BacLight (L-7007; Molecular
Probes).
9 Observação e captura de imagens das amostras por microscopia confocal de
varredura a laser.
9 Análise das imagens das células aderidas.
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5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Primeira etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente
em rocha de subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas
profundas.
5.1.1 Amostragem de campo
Os testemunhos da rocha usados neste estudo foram coletados de um campo de
petróleo virgem (antes de entrar na fase de produção de óleo), em uma base offshore no
campo de Marlim, na bacia de Campos, Rio de Janeiro (latitude sul -22
o
38’; longitude
oeste -39
o
59’). A amostragem foi totalmente realizada utilizando equipamentos e
tecnologia desenvolvida pelo Centro de Pesquisa da Petrobras (CENPES), possibilitando o
acesso ao reservatório de subsuperfície profunda. A amostragem em profundidade requer
tecnologia especializada para perfuração de cores intactos, chamada de testemunhagem
(como descrita na introdução, no item 1.1.2 Testemunhagem). Logo que o core, ou
testemunho, foi trazido à superfície, o liner (tubo de fibra de vidro) contendo a amostra de
rocha foi removido do barrilete. Foi feita a assepsia do liner com etanol 70%, e então foi
demarcada uma área de aproximadamente 20 cm para corte do liner. Após o corte do liner,
cada secção do testemunho foi cortada apenas com um impacto superficial, realizado com o
auxílio de uma talhadeira pré-desinfetada com álcool iodado (1g de iodo dissolvido em
etanol a 70%). Cada secção tinha 20 cm de comprimento e 15 cm de diâmetro. A secção de
testemunho protegida pelo liner foi revestida com parafilme e suas extremidades
imediatamente amparadas e recobertas por tampas plásticas estéreis. As amostras foram
transportadas para o laboratório preservadas em gelo seco. Os quatro cores foram coletados
numa faixa de profundidade de 2,822 a 2,828 m abaixo do fundo do mar (Figura 9). As
amostras foram denominadas T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9.
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Figura 9: (A) Representação esquemática da plataforma offshore. As secções foram obtidas em
profundidades entre 2.822 – 2.828 m a partir do fundo do mar; (B) liner contendo o core da rocha; (C)
amostrador estéril usado na sub-amostragem da rocha.
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A temperatura do reservatório era de 60°C, a pressão variou de 23.830 a 26.477 KPa
e a salinidade era equivalente a 55 g/ l de NaCl. A coluna de água acima do fundo do mar
era de 1.717 m. A geologia local consiste em rocha sedimentar, composta principalmente
por arenito de coloração escura (grafite), com grãos finos a médios, consolidada.
No laboratório, a porção externa da rocha foi raspada usando uma espátula metálica
estéril (Figura 9B). A porção interna do core da rocha foi então sub-amostrada usando um
amostrador metálico esterilizado formado por dois cilindros. Um cilindro é vazado (10 cm
comprimento, 14 mm diâmetro externo, 12 mm diâmetro interno), e o outro, maciço (10 cm
comprimento, 11 mm diâmetro). Isto é, o cilindro vazado é introduzido na rocha, onde as
porções interiores do core são retidas, e em seguida, o cilindro maciço é utilizado para
empurrar a amostra do interior do cilindro vazado para um tubo falcon estéril (Figura 9C).
Neste trabalho, quatro secções foram amostradas, obtidas no intervalo de 2.822 e 2.828 m a
partir do fundo do mar em um reservatório de óleo offshore, no Brasil. Todas as amostras
foram mantidas em frascos esterilizados e preservadas a -70°C antes da etapa de extração
de DNA.
5.1.2 Extração de DNA das amostras de rocha
Todo o procedimento de extração de DNA foi realizado dentro de um fluxo laminar.
Foram utilizadas ponteiras com barreira (proteção a aerossol) para reduzir a chance de
contaminação. A extração foi conduzida usando 30 g de material de cada uma das quatro
sub-amostragens realizadas como descrito acima. As amostras foram misturadas com 150
ml de tampão Winogradsky, 15 g de polivinil pirrolidona (PVP) e 10 g de pérolas de vidro
de 2 mm. As misturas foram incubadas por 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente, a
fim de dissolver o material agregado das amostras. As amostras foram então centrifugadas a
4°C por 10 minutos a 750 x g. Os sobrenadantes foram mantidos a 4°C. Os pellets de
sedimento rochoso formados foram novamente homogeneizados manualmente com tampão
Winogradsky adicional (100 ml), e novamente centrifugados a 4°C por 10 minutos a 750 x
g. Este procedimento foi repetido mais 3 vezes. Os sobrenadantes provenientes de todas as
repetições do procedimento recém descrito foram então concentrados a 4°C por 20 minutos
a 10.000 x g, para que a fração bacteriana fosse recuperada. Os pellets contendo a fração
bacteriana foram lavados cuidadosamente com 200 ml tampão TE, centrifugando também a
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2008
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4°C por 20 minutos a 10.000 x g, e suspensos em 10 ml do mesmo tampão. A seguir, a
suspensão de células foi dividida em dois tubos de poliestireno. A lise celular mecânica foi
feita pela adição de 3 g de pérolas de vidro (106 micras, lavagem ácida, Sigma) a cada tubo.
Estes tubos foram fechados hermeticamente e submetidos a ciclos (3 ciclos de 60 segundos
sob homogeneização, com intervalos de 10 segundos) no homogeneizador de células MSK
(Braun-Melsungen) a 4.000 rpm. As amostras de células rompidas foram imediatamente
colocadas em banho de gelo e 180 μl de SDS 20% foram adicionados a cada tubo. Em
seguida foi adicionado fenol (4 ml) em cada tubo, para a desnaturação de proteínas, e então
os tubos foram homogeneizados manualmente. O material protéico foi então precipitado
por centrifugação a 6.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa foi transferida para outro tubo
de centrífuga de 50 ml, tratada com 4 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e
centrifugada a 6.000 x g por 20 minutos. Os ácidos nucléicos foram então precipitados com
0,5 ml de NaCl 5M e 2 volumes de etanol gelado e mantidos por 18 horas a -20
º
C. Após
este tempo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 12.800 x g. O pellet de DNA foi
lavado com 5 ml de etanol 70% e centrifugado novamente por 10 minutos a 12.800 x g.
Dentro de um fluxo laminar, o pellet de DNA foi seco ao ar e então suspenso em 200 μl de
tampão TE, e solubilizado em banho-maria a 55
º
C por 5 minutos. Em seguida, 0,1 g de
CsCl foi adicionado ao extrato bruto de DNA e o tubo foi mantido a temperatura ambiente
por 1 hora. A mistura contendo o DNA extraído foi transferido para um tubo eppendorf
novo, e foram adicionados 400 μl de água destilada e 300 μl de álcool isopropílico. A
mistura foi mantida a temperatura ambiente por 30 minutos, e então o DNA foi coletado
por centrifugação a 12.800 x g por 15 minutos. Dentro de um fluxo laminar, o DNA
purificado foi seco ao ar e então suspenso em 100 μl de tampão TE.
Para verificar a qualidade do DNA obtido na extração, uma alíquota de cada
amostra foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,8% (p/v) a 80 V, em
tampão TEB por aproximadamente 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram
aplicadas no gel misturadas com 1/3 do volume da solução corante de corrida para
eletroforese de DNA em gel de agarose.
Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com brometo de etídio (2 μg/ml) e o
DNA foi observado e fotografado sob luz UV em sistema de análise de imagem IMAGO
(B&L, Holanda).
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5.1.3 Amplificação por PCR
Foi realizada a amplificação por PCR utilizando-se iniciadores universais para o
gene que codifica o RNAr 16S (gene rrs) e iniciadores específicos para a detecção de
bactérias pertencentes ao grupo das BRS (gene aprA).
Em cada reação de amplificação por PCR para o gene rrs foram utilizadas albumina
de soro bovino (BSA) e formamida para melhorar a eficiência da amplificação do DNA
alvo (KREADER, 1996; CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001). Todas as reações de PCR
incluiram controles positivos (DNA extraído das estirpes Bacillus licheniformis T6-5 ou
Desulfovibrio alaskensis NCIMB 13491) e negativos apropriados (sem DNA).
Para verificar a eficiência das reações de amplificação por PCR, os produtos de PCR
foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,4% (p/v) a 70 V em
tampão TEB por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. Cada produto de PCR
foi aplicado no gel misturado com 1/3 do volume de solução corante de corrida para
eletroforese de DNA em gel de agarose. O “1 Kb Plus DNA Ladder” (Invitrogen Life
Technologies) foi utilizado como padrão de tamanho de DNA linear.
Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com brometo de etídio (2 μg/ml) e os
fragmentos de DNA foram observados e fotografados sob luz UV em sistema de análise de
imagem IMAGO (B&L, Holanda). O aparecimento de apenas uma banda do tamanho
esperado no gel de agarose foi considerado uma reação bem sucedida.
Amplificação por PCR do gene que codifica o RNAr 16S
Os iniciadores selecionados para esta análise foram o U968f (5’ AAC GCG AAG
AAC CTT AC 3’) e o L1401r (5' GCG TGT GTA CAA GAC CC 3’) (HEUER &
SMALLA, 1997). O iniciador U968f é homólogo à região 968-984 do gene que codifica o
RNAr 16S de Escherichia coli, enquanto que o iniciador L1401r é homólogo à região
1385-1401 deste mesmo gene. As reações foram realizadas como descrito por HEUER &
SMALLA (1997). Cada reação foi realizada em um volume de 50 μl com uma mistura de:
50 mM de KCl, 2.5 mM de MgCl
2
, 2 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 0,2
μM de cada iniciador, 5 μg de BSA e 1% de formamida (v/v), 2,5 U Taq polimerase e 2 μl
de DNA. O programa de PCR utilizado foi de um ciclo de desnaturação das fitas de DNA
por 2 minutos a 94ºC, seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1,5 minutos a 48ºC e 1,5
minutos a 72ºC, e da extensão a 72°C por 10 min.
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Amplificação por PCR para o gene da APS redutase
A fim de detectar apenas a comunidade de bactérias redutoras de sulfato (BRS)
presentes nos testemunhos de rocha foram utilizados os iniciadores para uma região
conservada do gene da subnidade α da enzima APS redutase. Os iniciadores utilizados
foram F2 (5’ CCA GGG CCT GTC CGC CAT CAA TAC 3’) e R2 (5’ CCG GGC CGT
AAC CGT CCT TGA A 3’) descritos por ZINKEVICH & BEECH (2000), que
correspondem às regiões 969-992 e 1603-1624, respectivamente, da subunidade alfa da
enzima adenosina-5´-fosfosulfato redutase (aprA) da espécie Desulfovibrio vulgaris,
levando à amplificação de um fragmento de 658 pb. As reações de PCR foram realizadas
também de acordo com ZINKEVICH & BEECH (2000), em tubos contendo 50 μl da
mistura composta de 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl
2
, 2 mM de
cada dNTP, 0,4 μM de cada iniciador, 2,5 U da enzima Taq polimerase e 2 μl de DNA. O
ciclo aplicado foi: um ciclo de desnaturação das fitas de DNA por 2 minutos a 95°C,
seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 62ºC e 1 minuto a 72ºC, e da extensão
a 72°C por 10 min.
5.1.4 Biblioteca de clones
Os fragmentos obtidos pela amplificação por PCR foram purificados com a
utilização do kit de purificação comercial “WizardTM Rapid PCR Purification System”
(Promega). Em seguida, os produtos de PCR (3 μl) do gene rrs parcial (433 nt) e do gene
aprA (658 nt) das diferentes amostras foram clonados no vetor pGEM T-easy, a 4ºC
durante uma noite, de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Em seguida, as
células competentes de Escherichia coli JM109 foram transformadas através de
eletroporação (choque de 1,8 kV, 200 Ω, 25 μF), utilizando 70 μl de células competentes e
3 μl da ligação em uma cubeta com espaçamento de 0,1 cm. Após a transformação as
células foram mantidas em meio LB por 1,5 horas a 37 ºC sob agitação. Uma quantidade de
100 μl de cada cultura foi semeada em placas contendo meio LB com ampicilina 100
μg/ml, nas quais foram previamente espalhados sobre a superfície 100 μl da solução de
IPTG 0,1M e 20 μl da solução de X-gal 50 mg/ml. Em seguida, as placas foram incubadas a
37ºC por 24 horas. Após este período, as colônias brancas (contendo os insertos de rrs ou
aprA) de cada amostra foram repicadas em meio LB com ampicilina 100 μg/ml.
Para a confirmação da presença do inserto nos clones, foi feita uma reação de PCR
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diretamente da colônia, utilizando os iniciadores M13f (5′ GTA AAA CGA CGG CCA G
3′) e M13r (5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’). Após a confirmação, os DNAs
plasmidiais dos transformantes foram extraídos com auxílio do kit comercial “Wizard Plus
SV miniprep DNA purification system” (Promega). Os DNAs plasmidiais purificados
foram então submetidos à reação de PCR para seqüenciamento, utilizando os iniciadores
M13f e M13r, em seqüenciador automático ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, USA).
5.1.5 Análise filogenética
Primeiramente foi feita uma análise de todas as seqüências obtidas (forward e
reverse) utilizando o programa BioEdit 7.0 (HALL, 1999), e as seqüências que continham
bases ambíguas não foram consideradas para as análises seguintes. Em seguida, as bases
correspondentes à seqüência do vetor de clonagem foram detectadas utilizando a
ferramenta VecScreen, encontrada no site NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html
) e retiradas manualmente
usando-se o programa BioEdit. As seqüências selecionadas para este estudo foram então
comparadas com as presentes no banco de dados GenBank utilizando-se a ferramenta blastn
(Basic Local Alignment Search Tool) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
(ALTSHUL
et al., 1990) para identificação das seqüências de rrs e aprA mais próximas. As seqüências
relacionadas foram obtidas no banco de dados GenBank e alinhadas com as seqüências do
presente trabalho usando o programa Clustal-X (THOMPSON et al., 1997). Árvores
filogenéticas foram construídas baseadas nas seqüências parciais de DNAr 16S, usando o
método Neighbor-Joining, e foi usado o programa MEGA 3.1 (KUMAR, TAMURA &
NEI, 2004) para calcular os valores de distância p entre duas seqüências. A análise de
bootstrap foi realizada com 1000 repetições e somente os valores maiores que 50% foram
indicados nas árvores. As seqüências foram testadas quanto a possibilidade de
representarem estruturas quiméricas usando o aplicativo CHECK_CHIMERA do sítio
(http://rdp8.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU
) presente no website do projeto RDP
(Ribosomal Database Project). As possíveis seqüências quimeras foram excluídas deste
estudo. Após a identificação das seqüências foram calculados os índices: (1) de cobertura
(C) das bibliotecas como descrito por CHELIUS & TRIPLETT (2001), C = 1 – n1/N x 100,
onde n1/N é a freqüência de clones que aparecem somente uma vez (n1) e N é o número
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total de clones; (2) de dominância de Berger-Parker (d), d = N/N
max
(TATON et al., 2003),
onde N é o número total de clones e N
max
é o número de clones relacionados ao gênero
dominante na biblioteca.
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5.2 Segunda etapa: Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em
sistemas de água de injeção.
5.2.1 Amostragem de campo
Nesta etapa, três sistemas de tratamento de água de injeção foram estudados. Estes
sistemas de tratamento são localizados em plataformas na Bacia de Campos, Rio de
Janeiro. As coordenadas da localização geográfica de cada plataforma analisada são:
plataforma A - 22º25'36 de latitude sul e 40º01'47'' de longitude oeste, plataforma B -
22º26'12 de latitude sul e 40º25'33 de longitude oeste e plataforma C - 22º26'07 de latitude
sul e 40º04'10 de longitude oeste. Essas três plataformas começaram a produzir óleo com
injeção de água nos anos 1983, 1994 e 1999, respectivamente para as plataformas A, B e C.
A Figura 10 mostra uma representação esquemática de um sistema de tratamento de injeção
de água. A água do mar usada no sistema de injeção é submetida, continuamente, ao
biocida amônio quaternário (QAT) 50% a uma dosagem de 10 ppmv. O tratamento com
THPS foi utilizado em batelada duas vezes por semana, numa dosagem de 300 ppmv de
uma solução de THPS 75% (Figura 10A). Os três sistemas foram tratados de modo similar,
com a exceção de um poço da plataforma A que foi tratado separadamente com 100 ppmv
de nitrato (nitrato de sódio 40%).
A plataforma A foi amostrada a jusante de 4 pontos do sistema, enquanto que as
plataformas B e C foram amostradas também a jusante de três pontos cada. A Figura 10B
resume os pontos de amostragem. As amostras foram mantidas congeladas até análises
subseqüentes. As amostras foram nomeadas de acordo com o nome da plataforma e o
número do ponto de amostragem: A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2 e C3 (Figura 10B).
5.2.2 Extração de DNA das amostras de água de injeção
As células bacterianas foram concentradas por filtração (membrana de acetato de
celulose de 0,22 μm de porosidade) de um litro de água de cada ponto de amostragem
(Figura 10B). O filtro (membrana de acetato de celulose) foi cortado assepticamente usando
uma lâmina esterilizada. O DNA total das células retidas nos filtros foi extraído através do
método de lise direta seguindo-se o protocolo do fabricante do kit comercial FastDNA
®
SPIN Kit for Soil, Bio Systems, Q Bio gene, USA.
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2008
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Figura 10: Representação esquemática de um sistema de injeção de água na recuperação secundária do petróleo. As amostras
foram nomeadas de acordo com o nome da plataforma e o número do ponto de amostragem: A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2 e C3.
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Para verificar a qualidade do DNA obtido na extração, uma alíquota de cada
amostra foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,8% (p/v) a 80 V em
tampão TEB por aproximadamente 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram
aplicadas no gel misturadas com 1/3 do volume da solução corante de corrida para
eletroforese de DNA em gel de agarose. Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com
brometo de etídio (2 μg/ml) e o DNA foi observado e fotografado sob luz UV em sistema
de análise de imagem IMAGO (B&L, Holanda).
5.2.3 Amplificação por PCR
As metodologias usadas para amplificação por PCR do gene que codifica o RNAr
16S foram idênticas às utilizadas no item 5.1.3.
5.2.4 Biblioteca de clones
A metodologia usada foi idêntica à utilizada no item 5.1.4.
5.2.5 Análise filogenética
A metodologia usada foi idêntica à utilizada no item 5.1.5.
5.2.6 Análise estatística
A análise de componente principal (PCA) foi realizada para agrupar os gêneros
bacterianos de cada plataforma de acordo com o tratamento aplicado em cada sistema de
injeção de água. Os dados físicos e químicos dos tratamentos da água (variáveis
ambientais) e as abundâncias relativas dos gêneros bacterianos em cada local (variáveis
biológicas) foram usados na PCA, utilizando o programa Canoco for Windows 4,5
(Microcomputer Power, Ithaca, NY).
As relações entre a diversidade bacteriana dos diferentes pontos de amostragem e os
tratamentos aplicados foram avaliadas usando técnicas de ordenação. A análise de
correspondência distendida (DCA) indicou que os dados apresentam uma resposta linear.
Sendo assim, foi utilizado método de ordenação linear. Os dados físicos e químicos dos
tratamentos da água e o tempo de operação de cada plataforma (variáveis ambientais) e as
abundâncias relativas dos gêneros bacterianos em cada local (variáveis biológicas) foram
usados na análise de redundância (RDA), utilizando o programa Canoco for Windows 4,5
(Microcomputer Power, Ithaca, NY). O tempo de operação dos sistemas de injeção de água
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2008
[Digite o endereço da empresa] 54
de cada plataforma foi usado de forma semi-quantitativa (ranques). Esta técnica identifica a
variabilidade das amostras de acordo com os tratamentos. O teste de permutação de Monte
Carlo baseado em randomização de 199 permutações foi usado para testar a hipótese nula
de que os perfis das comunidades bacterianas não são relacionados com os tratamentos
aplicados no sistema de injeção.
Baseado no alinhamento das seqüências dos clones obtidos de cada amostra usando
o programa Clustal-X (THOMPSON et al., 1997), as matrizes de distância foram
construídas usando o programa DNAdist do PHYLIP v.3,6 (FELSENSTEIN, 2005). Estas
matrizes foram usadas como dados de entrada para o programa DOTUR (SCHLOSS,
LARGET, & HANDELSMAN, 2004) para agrupar as seqüências em OTUs definidas em
similaridade de 0,05. A partir destes grupos de OTUs foram calculados os índices de
diversidade bacteriana em cada amostra (Shannon - H´).
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5.3 Terceira etapa: Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe
de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por
bactérias redutoras de sulfato.
5.3.1 Estirpes Bacterianas
Foi utilizada uma estirpe pertencente ao gênero Bacillus, previamente isolada e
identificada por Sebastián (1999) a partir de amostras obtidas durante prospecção de
reservatório marítimo de petróleo em águas ultraprofundas brasileiras (2.500 m de
profundidade de subsuperfície). A estirpe Bacillus firmus H
2
O-1 foi obtida da água de
formação. A estirpe foi mantida em meio LB-ágar inclinado acrescido de 1% de carbonato
de cálcio, pH 7,2, 30°C.
O consórcio contendo BRS chamado de T6-lab (Sébastian, 1999) foi usado como
cultura indicadora da produção de SAM, produzida pela estirpe H
2
O-1. A T6-lab foi
crescida a 30ºC em anaerobiose por 3 dias em frascos de penicilina (10 ml) contendo meio
VMNI, preparado sob purga de N
2
para conferir anaerobiose.
5.3.2 Preparação do sobrenadante 10 vezes concentrado
O inóculo (5 ml) da estirpe produtora crescida por 24 horas em caldo LB foi
adicionado em um erlenmeyer de 1 litro (contendo 500 ml de caldo LB) e incubado a 30º
C,
sob agitação por 4 dias. Então, a cultura bacteriana foi centrifugada (10.000 x g, 20
minutos) e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e filtrado usando uma membrana
de filtro Millipore (0,45 µm). Em seguida, o filtrado foi colocado em frascos de penicilina,
mantido a -20
o
C por 24 horas e, então, liofilizado e suspenso em um total de 50 ml de caldo
LB, concentrando-se o sobrenadante 10 vezes.
5.3.3 Sistema dinâmico de formação de biofilmes de bactérias redutoras de
sulfato (Biorreator anaeróbico)
O biofilme de BRS foi crescido sobre coupons (amostradores) de vidro borosilicato
(12,7 mm diâmetro e 1,5 mm espessura - BioSurface Technologies Corporation, Bozeman,
MT). Vinte e quatro coupons foram lavados em etanol 70% por 30 minutos, e lavados com
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água destilada. Antes de autoclavar, os coupons foram encaixados no biorreator de fluxo
contínuo (BioSurface Technologies Corporation, Bozeman, MT). Este biorretator foi usado
para crescer o consórcio T6-lab, formando um biofilme anaeróbico. O meio VMNI
esterilizado (400 ml) foi introduzido no reator e purgado por 3 horas com nitrogênio
(filtrado em 0,2 μm) para alcançar um meio anaeróbico. Em seguida, uma cultura (até a
fase log, aproximadamente 10
7
células/ml) da T6-lab foi usada para inocular o biorreator. O
sistema foi incubado em batelada por 20 horas a 30ºC. Após este período, o sistema foi
incubado em fluxo contínuo por 4 dias. Durante esses 4 dias, o meio VMNI esterilizado foi
adicionado em uma velocidade de 1 ml/min. O sistema foi purgado com nitrogênio
esterilizado por filtragem, aplicando um fluxo de 200 ml/h ao longo de todo o período de
incubação do biorreator, ou seja, durante a fase em batelada e a fase contínua de incubação.
Ao terminar o período de incubação, o biorreator foi colocado dentro de uma câmara de
anaerobiose, e então, os coupons foram transferidos e mantidos, assepticamente, em uma
placa de 24 poços.
5.3.4 Demonstração da atividade da SAM H
2
O-1 sobre o biofilme de BRS
Dentro da câmara de anaerobiose, metade dos coupons foi tratada com a SAM H
2
O-
1 e a outra metade foi usada como controle. Todo os coupons foram incubados por 24 horas
a temperatura ambiente dentro da câmera de anaerobiose. Após este tempo de contato com
a SAM, esta foi removida dos poços utilizando uma pipeta estéril, e todos os coupons
foram lavados três vezes com PBS estéril e purgado com nitrogênio, para remover as
células não aderidas. Seis coupons tratados e seis coupons controle foram corados com o
corante BacLight LIVE/DEAD e foram observados utilizando microscopia confocal de
varredura a laser e analisados como descrito a seguir. Os biofilmes estabelecidos nos
coupons restantes (tratados e controles) foram raspados assepticamente com uma espátula
estéril. O material raspado foi suspenso em 10 ml de PBS esterilizado e purgado com
nitrogênio. O número de células foi determinado pela técnica do NMP (HAMILTON,
1985).
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5.3.5 Processamento das amostras para microscopia confocal de varredura a
laser
Os 12 coupons separados para análise microscópica foram corados com kit
fluorescente LIVE/DEAD BacLight (L-7007) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) por
30 minutos, no escuro, dentro da câmera de anaerobiose. Em seguida, os coupons foram
lavados três vezes com água destilada previamente purgada com nitrogênio e esterilizada
por autoclavação. Os biofilmes corados foram observados no microscópio confocal de
varredura a laser (Leica DMRXE, Leica Microsystems. Wetzlar GmbH, Germany)
equipado com uma lente objetiva 63x de imersão em água. Dois canais de laser foram
usados para coletar as imagens, Argônio (488 nm) e Criptônio (561 nm).
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5.4 Meios de cultura, Tampões e Soluções usados em experimentos das três
etapas
5.4.1 Meios de cultura
Sempre que necessário, os meios de cultura foram solidificados pela adição de ágar
na concentração de 1,2%.
Após o preparo, os meios foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados a
temperatura ambiente. Está indicado quando outros procedimentos foram realizados.
LB (LURIA-BERTANI BROTH, SCHLEIF & WENSINK, 1981)
Triptona
10 g
Extrato de levedura
5 g
NaCl
5 g
Água destilada
1000 ml q.s.p.
pH 7,2
VMN I (ZINKEVICH & BEECH, 2000)
KH
2
PO
4
0,5 g
NH
4
Cl
1 g
Na
2
SO
4
4,5 g
NaCl
25 g
CaCl
2
.2H
2
O
0,04 g
MgSO
4
.7H
2
O
0,06 g
Lactato de Sódio
6 g
Citrato de Sódio
0,3 g
Casamoniácido
2 g
Triptona
2 g
Ácido tioglicólico
0,1 g
FeSO
4
.7H
2
O
0,5 g
Solução de ácido ascórbico 10%
1 ml
Elixir mineral Wolfe modificado
1 ml
Água destilada
1000 ml q.s.p.
pH 7,5
Durante o preparo do meio, a mistura deve ser purgada com nitrogênio por 30 minutos
(200 ml/h). Após autoclavação, adicionou-se 1 ml da solução de vitaminas.
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5.4.2 Tampoões
Após o preparo, os tampões foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados
a temperatura ambiente.
Tampão Winogradsky
K
2
HPO
4
0,25 g
MgSO
4
.7H
2
O
0,25 g
NaCl
0,125 g
Fe
2
(SO
4
) .3H
2
O
2,5 mg
MnSO
4
.4H
2
O
2,5 mg
Água destilada
1000 ml q.s.p.
PBS (Phosphate buffer saline)
NaCl
150 mM
Tampão Fosfato
20 mM
,
pH 8
Tampão TEB
Tris (tris-hidroximetil metil-amino-metano)
89 mM
EDTA (etilenodiaminotetraacetato de cálcio e dissódico)
2,5 mM
H
3
BO
3
89 mM
pH 7,8
Tampão TE
Tris
10 mM
EDTA
1 mM
pH 8
Elisa Korenblum
2008
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5.4.3 Soluções
Após o preparo, os tampões foram autoclavados a 121ºC por 20 minutos e estocados
a temperatura ambiente.
Elixir Mineral Wolfe Modificado
C
6
H
9
NO
6
1,5 g
MgSO
4
.7H
2
O 3 g
MnSO
4
.H
2
O 5 g
NaCl 1 g
FeSO
4
.7H
2
O 0,1 g
CoSO
4
.7H
2
O 0,1 g
NiCl
2
.6H
2
O 0,1 g
CaCl
2
.2H
2
O 0,1 g
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1 g
CuSO
4
.5H
2
O 0,01 g
AlKSO
4
0,01 g
H
3
BO
3
0,01 g
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,01 g
Na
2
SeO
3
0,001 g
Água destilada 1000 ml q.s.p.
Solução de Vitaminas
Ácido nicotínico 0,5 g
Vitamina B
1
0,6 g
Vitamina B12 0,05 g
Vitamina B2 0,2 g
Vitamina B5 0,6 g
Vitamina B6 0,6 g
Vitamina H 0,01 g
Após o preparo da solução de vitaminas, esta foi esterilizada por filtração (0,22 μM) e estocada
a 4
o
C.
Elisa Korenblum
2008
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Solução de IPTG 0,1M
IPTG 1,2 g
Água destilada
50 ml q.s.p.
Após o preparo da solução, esta foi esterilizada por filtração (0,45 μm).
Solução de X-gal 50mg/ml
5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactosídio 100 mg
N,N´- dimetil formamida
2 ml
Após o preparo da solução, esta foi esterilizada por filtração (0,45 μm). O tubo foi coberto com
papel alumínio e estocado a -20ºC.
Solução estoque de Ampicilina 10 mg/ml
Ampicilina 500 mg
Água bidestilada estéril
50 ml q.s.p.
Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose
Glicerol 50%
EDTA, pH 7,5 20mM
Azul de bromofenol 0,05%
Xileno cianol 0,05%
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 62
6 RESULTADOS
6.1 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em rocha de
subsuperfície localizada em reservatório petrolífero offshore de águas profundas.
Quatro amostras de testemunho foram obtidas de um reservatório de petróleo, em
uma profundidade compreendida entre 2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do mar, e usadas
para extração de DNA. As amostras foram denominadas T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9
(Tabela 1). A metodologia de extração de DNA utilizada neste trabalho foi adaptada devido
à presença de óleo nas amostras e de uma densidade baixa de células. Assim, a quantidade
de rocha usada foi aumentada para 30 g e as quatro repetições das lavagens com o tampão
Winogradsky foi também determinada para conferir maior concentração de biomassa
celular. Entretanto, como conseqüência deste aumento, não só a biomassa foi concentrada
mas também o óleo presente. Para a remoção deste contaminante, foi também necessária
uma etapa adicional no procedimento para purificação do extrato bruto de DNA usando
CsCl. Após a extração e purificação do DNA das amostras, o DNA não foi visualizado em
gel de agarose 0,8%, sugerindo que a concentração de DNA estava menor que 0,5 ng/μl.
Contudo, a quantidade e a qualidade de DNA obtido foram suficientes para a amplificação
por PCR. Foram observados produtos de PCR nas quatro amostras utilizando-se iniciadores
para o gene que codifica o RNAr 16S. Entretanto, quando foram usados os iniciadores para
o gene aprA somente uma amostra (T2-8/9) apresentou produto de PCR após a
amplificação por PCR.
Tabela 1: Número de clones das amostras de rocha. Os clones foram identificados em nível
de classe ou filo, baseados no gene rrs. (n) número total de clones.
Amostras de rocha T2-1/9 T2-2/9 T2-7/9 T2-8/9 Total (n)
Alphaproteobacteria
8 6 1 2
17
Betaproteobacteria
7 11 10 8
36
Gammaproteobacteria
1 1 2 1
5
Firmicutes
1 1 5 2
9
Actinobacteria
- - - 1
1
Total 17 19 18 14 68
Índice de Cobertura (C) 88 89 94 86
Índice de Berger-Parker 2,1 1,7 1,8 1,75
Elisa Korenblum
2008
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A diversidade bacteriana das amostras de rocha de subsuperfície em águas
profundas foi estudada através da análise filogenética das seqüências obtidas por PCR
baseadas no gene que codifica o RNAr 16S. Para tal quatro bibliotecas de clones foram
construídas com os produtos de PCR obtidos da amplificação do DNA extraídos das
amostras T2-1/9, T2-2/9, T2-7/9 e T2-8/9. As bibliotecas baseadas no gene rrs foram
formadas por 14 a 19 clones, totalizando 68 seqüências (Tabela 1). Para verificar se o
número de clones de cada biblioteca estava realmente refletindo a diversidade das amostras,
foi calculado o índice de cobertura de acordo com CHELIUS & TRIPLETT (2001). As
quatro bibliotecas obtidas neste estudo cobriram de 86 a 94% da diversidade total (Tabela
1), considerando a identificação feita pelo blastn. O índice de dominância de Berger-Parker
(TATON et al., 2003) indicou que a diversidade das quatro amostras apresentam um grupo
dominante, sugerindo baixa diversidade das amostras (Tabela 1).
A distribuição filogenética destes clones foi bastante homogênea predominando o
filo Proteobacteria nas quatro amostras. A maioria dos clones identificados neste estudo foi
relacionada à classe Betaproteobacteria (36 clones, Tabela 1). Dezessete clones foram
identificados como pertencentes à Alphaproteobacteria. O filo Firmicutes também foi
encontrado em todas as amostras, porém foi mais abundante nas amostras T2-7/9 e T2-8/9.
O número total de clones associados à classe Alphaproteobacteria foi mais baixo nas
amostras T2-7/9 e T2-8/9 do que nas amostras T2-1/9 e T2-2/9. O filo Actinobacteria foi
detectado em baixo número em uma única amostra (T2-8/9; Tabela 1).
As árvores filogenéticas baseadas na distância entre as seqüências obtidas no
presente estudo, baseadas no gene rrs, foram construídas usando o método de Neighbor-
Joining. As seqüências deste gene mais próximas encontradas no banco de dados GenBank
foram analisadas juntamente às seqüências dos clones para comparação e avaliação da
proximidade entre as seqüências. As seqüências foram reunidas e comparadas de acordo
com sua classificação, assim quatro árvores foram construídas com os clones relacionados
aos diferentes grupos filogenéticos, Betaproteobacteria (Figura 11), Alphaproteobacteria
(Figura 12), Gammaproteobacteria (Figura 13) e Firmicutes (Figura 14). A árvore obtida
após análise filogenética dos clones (n = 36, Tabela 1) das quatro amostras de rocha
relacionados à classe Betaproteobacteria mostra que a maioria (23 clones) apresentou
maior similaridade com a família Comamonadaceae, sendo 15 clones relacionados a
Elisa Korenblum
2008
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organismos não cultivados e 8 clones a bactérias dos gêneros Pelomonas, Variovorax e
Delftia. A família Burkholderiaceae também pode ser observada nesta árvore, pois um
clone apresentou similaridade com gêneros pertencentes a esta família (ex. Leptothrix). Um
dos clones agrupou com seqüências do GenBank pertencentes à família Rhodocyclaceae.
Os clones restantes (n = 11) formaram um cluster separados dos demais clones. Este cluster
continha clones das diferentes amostras de rocha e não apresentou relação a organismos
previamente conhecidos.
A árvore da Figura 12 representa a comparação de todos os clones das quatro
amostras de rochas relacionados à classe Alphaproteobacteria (n = 17, Tabela 1). Os clones
(7 clones) relacionados a esta classe apresentaram similaridade à família
Bradyrhizobiaceae, sendo 5 clones mais próximos do gênero Bradyrhizobium e 2 clones
próximos aos gêneros Rhodopseudomonas e Afipia. A segunda família que predominou
nesta análise foi a Phylobacteriaceae, com quatro clones associados a seqüências
pertencentes a esta família. Em menor número, os clones relacionados à
Methylobacteriaceae (2 clones), Brucellaceae (1 clone) e Rhodobacteraceae (1 clone)
também estão dispostos na árvore da Figura 12. Dois clones relacionados à classe
Alphaproteobacteria, T2-2/9(23) e T2-8/9(4), não apresentaram similaridade a nenhum
organismo conhecido.
A árvore obtida através da análise das seqüências relacionadas à classe
Gammaproteobacteria está representada na Figura 13. Os clones relacionados a esta classe
representaram somente 7,3% (n = 5) de todas as seqüências estudadas. Pelo menos, um
clone desta classe foi encontrado nas bibliotecas de clones construídas de cada amostra de
rocha (Tabela 1). Três clones apresentaram similaridade a seqüências de organismos
previamente estudados, duas seqüências se alinharam com membros da família
Enterobacteriaceae e um clone foi relacionado à família Xanthomonadaceae. Os dois
clones restantes apresentaram similaridade a seqüências de organismos não cultivados da
classe Gammaproteobacteria de estudos anteriores provenientes do GenBank (Figura 13).
Os clones relacionados ao filo Firmicutes (n = 9, Tabela 1) foram comparados com
seqüências mais próximas deste filo provenientes do GenBank, a árvore filogenética da
Figura 14 mostra esta análise. A maioria dos clones (6 clones) foram relacionados a
seqüências pertencentes à família Bacillaceae. Os demais clones foram associados às
Elisa Korenblum
2008
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famílias Paenibacillaceae [1 clone, T2-8/9 (51)], Streptococcaceae [1 clone, T2-8/9(30)] e
Leuconostocaceae [1 clone, T2-7/9(58)]. O grupo Actinobacteria foi encontrado somente
em uma amostra (T2-8/9) e esta única seqüência foi relacionada ao gênero Arthrobacter,
que é constituído por bactérias Gram-positivas com alto conteúdo de GC.
Neste estudo também foi analisada a comunidade de bactérias redutoras de sulfato
presente nas amostras de rocha e com este intuito a análise foi feita utilizando iniciadores
para o gene aprA. Entretanto, a amplificação com estes iniciadores apresentou resultado
positivo somente na amostra T2-8/9, resultando em um produto de PCR do tamanho
esperado. A distribuição de clones baseado no gene aprA mostrou-se baixa, todos os clones
(n = 19, Tabela 2) foram relacionados à classe Gammaproteobacteria, especificamente ao
gênero Desulfovibrio: D. profundus (1 clone), D. indonesiensis (2 clones) e D.
desulfuricans (16 clones). Devido ao baixo número de clones obtidos no estudo, todos os
clones foram considerados nesta análise, independente da porcentagem de similaridade com
as seqüências do GenBank.
Tabela 2: Identificação das seqüências do gene aprA obtidas do testemunho T2-8/9, utilizando a
ferramenta blastn (seqüência mais próxima de uma bactéria cultivada).
Clones Identificação da seqüência % identidade
aps8
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps87
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps25
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps32
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps36
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps37
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps40
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 96%
aps53
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 83%
aps69
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps72
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps73
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps74
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps76
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 97%
aps80
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps82
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 94%
aps84
Desulfovibrio desulfuricans CP000112.1 (G20) 98%
aps10
Desulfovibrio indonensis AJ271651.1 (NCIMB 13468) 93%
aps18
Desulfovibrio indonensis AJ271651.1 (NCIMB 13468) 93%
aps59
Desulfovibrio profundus EF442886.1 (DSM 11384) 85%
Elisa Korenblum
2008
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Figura 11.
Rubrivivax gelatinosus (AB250625)
Burkholderia cepacia (AF244133)
Ideonella sp. (DQ436455)
Leptothrix discophora (L33975)
T2-8/9 (12) z
Mitsuaria chitosanitabida (AB024307)
Roseateles sp. (AB013424)
Roseateles depolymerans (AB003626)
T2-2/9 (69)
T2-7/9 (6) ¡
T2-7/9 (64) ¡
T2-1/9 (52) *
T2-2/9 (74)
T2-2/9 (49)
T2-7/9 (15) ¡
T2-7/9 (36) ¡
T2-2/9 (53)
Uncultured Comamonadaceae (DQ028393)
T2-8/9 (25) z
T2-2/9 (26)
T2-1/9 (64) *
T2-2/9 (7)
Uncultured betaproteobacteria (AF445700)
T2-8/9 (50) z
T2-7/9 (5) ¡
T2-7/9 (10) ¡
Pelomonas sp. (DQ291149)
T2-8/9 (22) z
Pelomonas saccharophila (AF368755)
Variovorax paradoxus (AY169418)
T2-2/9 (27)
Betaproteobacteria (AY612302)
Rubrivivax-like (X89910)
T2-8/9 (33) z
T2-8/9 (5) z
Variovorax sp. (DQ205307)
T2-1/9 (48) *
T2-2/9 (4)
Variovorax paradoxus (AF532868)
Uncultured betaproteobacteria (AY133088)
T2-7/9 (8) ¡
Delftia tsuruhatensis (AY738262)
Delftia acidovorans (AB231159)
Comamonas sp. (AJ002803)
Zoogloea oryzae (AB201043)
Azoarcus sp. (AF011351)
T2-8/9 (48) z
Dechlorosoma sp. (AY126453)
Uncultured betaproteobacteria (AY133096)
Thiobacillus sp. (AJ289884)
T2-2/9 (66)
Uncultured betaproteobacteria (AF324205)
T2-2/9 (64)
Azohydromonas lata (AB201626)
T2-8/9 (2) z
Uncultured betaproteobacteria (AB128892)
T2-7/9 (1) ¡
T2-1/9 (38) *
T2-7/9 (63) ¡
T2-1/9 (42) *
T2-1/9 (36) *
T2-2/9 (29)
T2-7/9 (35) ¡
T2-1/9 (43) *
Uncultured Aquabacterium (AF523004)
58
75
63
100
53
100
100
95
100
96
67
74
58
93
81
82
65
0.05
Comamonadaceae
Rhodocyclaceae
Burkholderiaceae
Hydrogenophilaceae
Alcaligenaceae
Rubrivivax gelatinosus (AB250625)
Burkholderia cepacia (AF244133)
Ideonella sp. (DQ436455)
Leptothrix discophora (L33975)
T2-8/9 (12) z
Mitsuaria chitosanitabida (AB024307)
Roseateles sp. (AB013424)
Roseateles depolymerans (AB003626)
T2-2/9 (69)
T2-7/9 (6) ¡
T2-7/9 (64) ¡
T2-1/9 (52) *
T2-2/9 (74)
T2-2/9 (49)
T2-7/9 (15) ¡
T2-7/9 (36) ¡
T2-2/9 (53)
Uncultured Comamonadaceae (DQ028393)
T2-8/9 (25) z
T2-2/9 (26)
T2-1/9 (64) *
T2-2/9 (7)
Uncultured betaproteobacteria (AF445700)
T2-8/9 (50) z
T2-7/9 (5) ¡
T2-7/9 (10) ¡
Pelomonas sp. (DQ291149)
T2-8/9 (22) z
Pelomonas saccharophila (AF368755)
Variovorax paradoxus (AY169418)
T2-2/9 (27)
Betaproteobacteria (AY612302)
Rubrivivax-like (X89910)
T2-8/9 (33) z
T2-8/9 (5) z
Variovorax sp. (DQ205307)
T2-1/9 (48) *
T2-2/9 (4)
Variovorax paradoxus (AF532868)
Uncultured betaproteobacteria (AY133088)
T2-7/9 (8) ¡
Delftia tsuruhatensis (AY738262)
Delftia acidovorans (AB231159)
Comamonas sp. (AJ002803)
Zoogloea oryzae (AB201043)
Azoarcus sp. (AF011351)
T2-8/9 (48) z
Dechlorosoma sp. (AY126453)
Uncultured betaproteobacteria (AY133096)
Thiobacillus sp. (AJ289884)
T2-2/9 (66)
Uncultured betaproteobacteria (AF324205)
T2-2/9 (64)
Azohydromonas lata (AB201626)
T2-8/9 (2) z
Uncultured betaproteobacteria (AB128892)
T2-7/9 (1) ¡
T2-1/9 (38) *
T2-7/9 (63) ¡
T2-1/9 (42) *
T2-1/9 (36) *
T2-2/9 (29)
T2-7/9 (35) ¡
T2-1/9 (43) *
Uncultured Aquabacterium (AF523004)
58
75
63
100
53
100
100
95
100
96
67
74
58
93
81
82
65
0.05
Rubrivivax gelatinosus (AB250625)
Burkholderia cepacia (AF244133)
Ideonella sp. (DQ436455)
Leptothrix discophora (L33975)
T2-8/9 (12) z
Mitsuaria chitosanitabida (AB024307)
Roseateles sp. (AB013424)
Roseateles depolymerans (AB003626)
T2-2/9 (69)
T2-7/9 (6) ¡
T2-7/9 (64) ¡
T2-1/9 (52) *
T2-2/9 (74)
T2-2/9 (49)
T2-7/9 (15) ¡
T2-7/9 (36) ¡
T2-2/9 (53)
Uncultured Comamonadaceae (DQ028393)
T2-8/9 (25) z
T2-2/9 (26)
T2-1/9 (64) *
T2-2/9 (7)
Uncultured betaproteobacteria (AF445700)
T2-8/9 (50) z
T2-7/9 (5) ¡
T2-7/9 (10) ¡
Pelomonas sp. (DQ291149)
T2-8/9 (22) z
Pelomonas saccharophila (AF368755)
Variovorax paradoxus (AY169418)
T2-2/9 (27)
Betaproteobacteria (AY612302)
Rubrivivax-like (X89910)
T2-8/9 (33) z
T2-8/9 (5) z
Variovorax sp. (DQ205307)
T2-1/9 (48) *
T2-2/9 (4)
Variovorax paradoxus (AF532868)
Uncultured betaproteobacteria (AY133088)
T2-7/9 (8) ¡
Delftia tsuruhatensis (AY738262)
Delftia acidovorans (AB231159)
Comamonas sp. (AJ002803)
Zoogloea oryzae (AB201043)
Azoarcus sp. (AF011351)
T2-8/9 (48) z
Dechlorosoma sp. (AY126453)
Uncultured betaproteobacteria (AY133096)
Thiobacillus sp. (AJ289884)
T2-2/9 (66)
Uncultured betaproteobacteria (AF324205)
T2-2/9 (64)
Azohydromonas lata (AB201626)
T2-8/9 (2) z
Uncultured betaproteobacteria (AB128892)
T2-7/9 (1) ¡
T2-1/9 (38) *
T2-7/9 (63) ¡
T2-1/9 (42) *
T2-1/9 (36) *
T2-2/9 (29)
T2-7/9 (35) ¡
T2-1/9 (43) *
Uncultured Aquabacterium (AF523004)
58
75
63
100
53
100
100
95
100
96
67
74
58
93
81
82
65
0.05
Comamonadaceae
Rhodocyclaceae
Burkholderiaceae
Hydrogenophilaceae
Alcaligenaceae
Elisa Korenblum
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Figura 12.
Bradyrhizobium sp. (AF509902)
T2-2/9 (6)
uncultured
α
-proteobacterium (AB231998)
T2-2/9 (65)
T2-1/9 (41) *
T2-2/9 (1)
T2-1/9 (34) *
Rhodopseudomonas sp. (AB250617)
Rhodopseudomonas faecalis (AF123085)
Afipia sp. (U87769)
Afipia broomeae (AY513505)
Rhodopseudomonas sp. (AB079679)
T2-1/9 (47) *
T2-1/9 (50) *
T2-2/9 (23)
α
-proteobacterium from soil (AB245344)
Bacterium ellin (AY234449)
T2-8/9 (4) z
T2-2/9 (50)
T2-2/9 (8)
Methylobacterium sp. (Z23156)
Uncultured
α
-proteobacterium (AB192061)
T2-8/9 (10) z
Ochrobactrum sp. (AJ550273)
α
-proteobacterium from sea (AY770702)
Phyllobacterium myrsinacearum (AY512821)
Phyllobacterium trifolii (AY786080)
T2-1/9 (10) *
Uncultured Rhizobium (AY599700)
Defluvibacter lusatiae (AJ132378)
Aquamicrobium defluvium (Y15403)
Gram negative
α
-proteobacterium (AF323261)
T2-1/9 (59) *
T2-1/9 (57) *
T2-1/9 (58) *
Paracoccus sp.(DQ347522)
Rhodobacter sphaeroides (DQ001153)
T2-7/9 (8) ¡
100
99
100
69
100
100
88
68
58
89
99
68
70
80
99
99
52
98
75
100
95
68
87
69
71
99
99
0.02
Bradyrhizobiaceae
Methylobacteriaceae
Brucellaceae
Phyllobacteriaceae
Rhodobacteraceae
Bradyrhizobium sp. (AF509902)
T2-2/9 (6)
uncultured
α
-proteobacterium (AB231998)
T2-2/9 (65)
T2-1/9 (41) *
T2-2/9 (1)
T2-1/9 (34) *
Rhodopseudomonas sp. (AB250617)
Rhodopseudomonas faecalis (AF123085)
Afipia sp. (U87769)
Afipia broomeae (AY513505)
Rhodopseudomonas sp. (AB079679)
T2-1/9 (47) *
T2-1/9 (50) *
T2-2/9 (23)
α
-proteobacterium from soil (AB245344)
Bacterium ellin (AY234449)
T2-8/9 (4) z
T2-2/9 (50)
T2-2/9 (8)
Methylobacterium sp. (Z23156)
Uncultured
α
-proteobacterium (AB192061)
T2-8/9 (10) z
Ochrobactrum sp. (AJ550273)
α
-proteobacterium from sea (AY770702)
Phyllobacterium myrsinacearum (AY512821)
Phyllobacterium trifolii (AY786080)
T2-1/9 (10) *
Uncultured Rhizobium (AY599700)
Defluvibacter lusatiae (AJ132378)
Aquamicrobium defluvium (Y15403)
Gram negative
α
-proteobacterium (AF323261)
T2-1/9 (59) *
T2-1/9 (57) *
T2-1/9 (58) *
Paracoccus sp.(DQ347522)
Rhodobacter sphaeroides (DQ001153)
T2-7/9 (8) ¡
100
99
100
69
100
100
88
68
58
89
99
68
70
80
99
99
52
98
75
100
95
68
87
69
71
99
99
0.02
Bradyrhizobiaceae
Methylobacteriaceae
Brucellaceae
Phyllobacteriaceae
Rhodobacteraceae
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 68
Figura 11: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e
de seqüências de Betaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no
método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são
mostrados os valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com
diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 (); T2-7/9 (¡); T2-8/9
(z). Os códigos entre parênteses após o nome da amostra representam o número referência do clone.
Os números de acesso do GenBank de cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala
representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos.
Figura 12: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e
de seqüências de Alphaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no
método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são
mostrados os valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com
diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 (); T2-7/9 (¡); T2-8/9
(z). Os códigos entre parênteses após o nome da amostra representam o número referência do clone.
Os números de acesso do GenBank de cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala
representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 69
Xanthomonas retroflexus (AY841369)
T2-1/9 (74) *
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY587207)
Stenotrophomonas maltophilia (AY841799)
Dokdonella fugitiva (AJ969432)
Dokdonella ginsengisoli (AB245362)
Uncultured Rhodanobacter sp. (DQ366107)
Uncultured proteobacterium (DQ004805)
T2-2/9 (36)
Pseudomonas sp. (DQ337559)
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY509440)
Uncultured soil bacterium (DQ297982)
T2-8/9 (41) z
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY921812)
T2-7/9 (66) ¡
Escherichia albertii (AY696669)
Shigella boydii (AY696668)
Shigella flexneri (AE005674)
T2-7/9 (68) ¡
72
100
59
97
100
98
56
46
96
64
100
53
0.02
Xanthomonadaceae
Pseudomonadaceae
Enterobacteriaceae
Xanthomonas retroflexus (AY841369)
T2-1/9 (74) *
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY587207)
Stenotrophomonas maltophilia (AY841799)
Dokdonella fugitiva (AJ969432)
Dokdonella ginsengisoli (AB245362)
Uncultured Rhodanobacter sp. (DQ366107)
Uncultured proteobacterium (DQ004805)
T2-2/9 (36)
Pseudomonas sp. (DQ337559)
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY509440)
Uncultured soil bacterium (DQ297982)
T2-8/9 (41) z
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY921812)
T2-7/9 (66) ¡
Escherichia albertii (AY696669)
Shigella boydii (AY696668)
Shigella flexneri (AE005674)
T2-7/9 (68) ¡
72
100
59
97
100
98
56
46
96
64
100
53
0.02
Xanthomonas retroflexus (AY841369)
T2-1/9 (74) *
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY587207)
Stenotrophomonas maltophilia (AY841799)
Dokdonella fugitiva (AJ969432)
Dokdonella ginsengisoli (AB245362)
Uncultured Rhodanobacter sp. (DQ366107)
Uncultured proteobacterium (DQ004805)
T2-2/9 (36)
Pseudomonas sp. (DQ337559)
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY509440)
Uncultured soil bacterium (DQ297982)
T2-8/9 (41) z
Uncultured
γ
--proteobacterium (AY921812)
T2-7/9 (66) ¡
Escherichia albertii (AY696669)
Shigella boydii (AY696668)
Shigella flexneri (AE005674)
T2-7/9 (68) ¡
72
100
59
97
100
98
56
46
96
64
100
53
0.02
Xanthomonadaceae
Pseudomonadaceae
Enterobacteriaceae
Figura 13: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones e de
seqüências de Gammaproteobacteria provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no método
neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000 repetições e somente são mostrados os
valores maiores que 50%. As seqüências dos clones de DNAr 16S foram marcadas com diferentes símbolos de
acordo com as amostras de rocha: T2-1/9 (*); T2-2/9 (); T2-7/9 (¡); T2-8/9 (z). Os códigos entre parênteses
após o nome da amostra representam o número referência do clone. Os números de acesso do GenBank de
cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala representa a porcentagem de divergência de
nucleotídeos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 70
Bacillus anthracis (AY643481)
Bacillus cereus (AB244530)
Bacillus subtilis (AB218804)
T2-7/9 (3) ¡
Bacillus circulans (AY724690)
T2-2/9 (68)
Uncultured Gram-positive (DQ084324)
Uncultured Bacillus sp. (AY289526)
Halobacillus trueperi (AJ310149)
T2-7/9 (69) ¡
Halobacillus sp. (AY553078)
Halobacillus blutaparonensis (DQ058358)
T2-7/9 (38) ¡
T2-7/9 (44) ¡
Oceanobacillusprofundus (DQ386635)
Oceanobacillus iheyensis (BA000028)
T2-1/9 (51) *
Brevibacillus formosus (AF378234)
Brevibacillus brevis (AY591911)
T2-8/9 (51) z
Brevibacillus agri (AY319301)
T2-8/9 (30) z
Streptococcus mitis (AY281077)
Streptococcus pneumoniae (AY485600)
Uncultured bacterium (AY307989)
Streptococcus oralis (AY281080)
T2-7/9 (58) ¡
Leuconostoc mesenteroides (AY675249)
Leuconostoc cremoris (M23034)
Leuconostoc pseudomesenteroides (AB023237)
88
100
100
64
69
100
72
88
99
61
87
98
97
99
78
98
53
100
67
0.01
Bacillaceae
Paenibacillaceae
Streptococcaceae
Leuconostocaceae
Bacillus anthracis (AY643481)
Bacillus cereus (AB244530)
Bacillus subtilis (AB218804)
T2-7/9 (3) ¡
Bacillus circulans (AY724690)
T2-2/9 (68)
Uncultured Gram-positive (DQ084324)
Uncultured Bacillus sp. (AY289526)
Halobacillus trueperi (AJ310149)
T2-7/9 (69) ¡
Halobacillus sp. (AY553078)
Halobacillus blutaparonensis (DQ058358)
T2-7/9 (38) ¡
T2-7/9 (44) ¡
Oceanobacillusprofundus (DQ386635)
Oceanobacillus iheyensis (BA000028)
T2-1/9 (51) *
Brevibacillus formosus (AF378234)
Brevibacillus brevis (AY591911)
T2-8/9 (51) z
Brevibacillus agri (AY319301)
T2-8/9 (30) z
Streptococcus mitis (AY281077)
Streptococcus pneumoniae (AY485600)
Uncultured bacterium (AY307989)
Streptococcus oralis (AY281080)
T2-7/9 (58) ¡
Leuconostoc mesenteroides (AY675249)
Leuconostoc cremoris (M23034)
Leuconostoc pseudomesenteroides (AB023237)
88
100
100
64
69
100
72
88
99
61
87
98
97
99
78
98
53
100
67
0.01
Bacillus anthracis (AY643481)
Bacillus cereus (AB244530)
Bacillus subtilis (AB218804)
T2-7/9 (3) ¡
Bacillus circulans (AY724690)
T2-2/9 (68)
Uncultured Gram-positive (DQ084324)
Uncultured Bacillus sp. (AY289526)
Halobacillus trueperi (AJ310149)
T2-7/9 (69) ¡
Halobacillus sp. (AY553078)
Halobacillus blutaparonensis (DQ058358)
T2-7/9 (38) ¡
T2-7/9 (44) ¡
Oceanobacillusprofundus (DQ386635)
Oceanobacillus iheyensis (BA000028)
T2-1/9 (51) *
Brevibacillus formosus (AF378234)
Brevibacillus brevis (AY591911)
T2-8/9 (51) z
Brevibacillus agri (AY319301)
T2-8/9 (30) z
Streptococcus mitis (AY281077)
Streptococcus pneumoniae (AY485600)
Uncultured bacterium (AY307989)
Streptococcus oralis (AY281080)
T2-7/9 (58) ¡
Leuconostoc mesenteroides (AY675249)
Leuconostoc cremoris (M23034)
Leuconostoc pseudomesenteroides (AB023237)
88
100
100
64
69
100
72
88
99
61
87
98
97
99
78
98
53
100
67
0.01
Bacillaceae
Paenibacillaceae
Streptococcaceae
Leuconostocaceae
Figura 14: Árvore Filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S
de clones e de seqüências de Firmicutes provenientes do GenBank. A árvore foi construída
baseada no método neighbor-joining. As análises de bootstrap foram realizadas com 1000
repetições e somente os valores maiores que 50% são mostrdos. As seqüências dos clones de
DNAr 16S foram marcadas com diferentes símbolos de acordo com as amostras de rocha: T2-
1/9 (*); T2-2/9 (); T2-7/9 (¡); T2-8/9 (z). Os códigos entre parentesis após o nome da
amostra representam o número referência do clone. Os números de acesso do GenBank de
cada espécie está também entre parênteses. A barra de escala representa a porcentagem de
divergência de nucleotídeos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 71
6.2 Diversidade molecular da comunidade bacteriana presente em sistemas de água de
injeção.
Neste trabalho foi estudado um total de 10 amostras de água de injeção de diferentes
pontos do sistema de tratamento de água localizados em três plataformas da Petrobras, as
amostras das plataformas (A, B e C) da Bacia de Campos foram designadas como A1, A2,
A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2 e C3. As características de cada uma destas amostras estão
resumidas na Figura 10B. As amostras foram submetidas à extração de DNA e o DNA das
comunidades bacterianas presentes foi extraído com sucesso. A amplificação de um
fragmento de 433 pb do gene que codifica o RNAr 16S a partir dos extratos brutos de DNA
de cada amostra também foi realizada com eficiência. A diversidade bacteriana das
amostras de água de injeção foi estudada através da análise filogenética das seqüências
obtidas por PCR baseadas no gene que codifica o RNAr 16S. Três bibliotecas de clones
foram construídas com os produtos de PCR obtidos da amplificação do DNA extraídos das
amostras provenientes das plataformas A, B e C. O número de clones obtidos das
bibliotecas das plataformas A e B foram 213 e 260, respectivamente. Entretanto os números
de clones utilizados neste estudo estão listados nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. Para
verificar se o número de clones de cada biblioteca estava realmente refletindo a diversidade
das amostras, foi calculado o índice de cobertura de acordo com CHELIUS & TRIPLETT
(2001). As bibliotecas obtidas nesta etapa cobriram de 90 a 99% da diversidade total
(Tabelas 3 e 4), considerando a identificação feita pelo blastn. O índice de dominância de
Berger-Parker (TATON et al., 2003) variou entre as amostras, sendo os maiores valores
encontrados nas amostras da Plataforma B (Tabela 3 e 4).
O número de organismos identificados em nível de gênero em cada amostra,
utilizando a ferramenta BLAST, foi computado como abundância relativa, de acordo com a
seqüência mais próxima encontrada no GenBank (Figura 15). Para esta análise, foram
consideradas somente as seqüências com similaridade maior ou igual a 98%. A distribuição
filogenética dos clones baseada no fragmento de rDNA 16S foi bastante homogênea dentro
de cada plataforma. O filo Proteobacteria predominou em todas as amostras. A classe
Gammaproteobacteria foi o grupo dominante encontrado nas plataformas A e B. De todos
os clones obtidos das diferentes amostras da plataforma A, 47,5 % eram relacionados ao
gênero Marinobacter (87 clones). Dos clones obtidos dos pontos de amostragem da
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 72
Tabela 3: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma
A. Os clones foram identificados em nível de gênero, baseados no gene rrs. (n) número total de clones.
Amostras de água Plataforma A
A1 A2 A3 A4 Total/gênero
Marinobacter
14 39 4 30 87
Vibrio
- 3 - - 3
Micavibrio
- 3 - - 3
Alteromonas
3 6 - - 9
Sphingopyxis
- 3 - - 3
Kopriimonas
- 6 - - 6
Tistrella
3 - - - 3
Desulforegula
- - 3 - 3
Não cultivado
6 39 6 15 66
Total (n)
26 99 13 45 183
Índice de Shannon (H)
1,039 2,187 0,636 1,357
Índice de Berger-Parker (d)
1,85 2,53 - 1,5
ÍndÍce de Cobertura (C)
93 99 90 93
Tabela 4: Número de clones das amostras do sistema de tratamento de água de injeção da Plataforma
B. Os clones foram identificados em nível de gênero, baseados no gene rrs. (n) número total de clones.
Amostras de água Plataforma B
B1 B2 B3 Total/gênero
Neptumonas
9 15 0 24
Achromobacter
15 12 27 54
Colwellia
24 78 2 104
Burkholderia
3 3 12 18
Synechococcus
6 - - 6
Thiomicrospira
- 3 - 3
Oceanospirillum
- 2 - 2
Não cultivado
6 39 - 45
Total (n)
63 152 41
256
Índice de Shannon (H)
2,397 3,098 1,675
Índice de Berger-Parker (d)
2,63 1,95 1,52
Índice de Cobertura (C)
98 98 97
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 73
plataforma B, dois principais gêneros predominaram Colwellia (40,6%, 104 clones) e
Achromobacter (21,1%, 54 clones). Um grande grupo de seqüências bacterianas foi
associado a organismos não cultivados em ambas as plataformas A (35%) e B (14%)
(Figura 15). Na plataforma C (60 clones totais), 100% dos clones analisados foram
relacionados a organismos não cultivados quando considerado somente o primeiro hit do
blastn. Na tentativa de comparar os clones obtidos na plataforma C com organismos já
cultivados, foi observado e analisado também o primeiro hit do blastn de uma seqüência de
organismo cultivado. Esta segunda análise dos clones oriundos da plataforma C mostrou
que 21% estariam relacionados à classe Alphaproteobacteria, enquanto 79% dos clones
continuaram não identificados (Figura 15).
Todas as seqüências de clones associadas a bactérias não cultivadas encontradas nas
três plataformas foram submetidas à análise filogenética. As árvores filogenéticas baseadas
na distância entre as seqüências relacionadas a organismos não cultivados, baseadas no
gene rrs, foram construídas usando o método de Neighbor-Joining. As árvores filogenéticas
foram construídas individualmente por plataforma (Figuras 16, 17 e 18). Em cada uma das
três árvores foram formados dois grupos principais. Em um dos grupos, os clones foram
relacionados a seqüências do GenBank de clones também não identificados de outros
estudos provenientes de ambientes marinhos. O segundo grupo divergiu de todos os grupos
previamente descritos (Figuras 16, 17 e 18, em destaque nos quadrados de cor azul). Foram
reunidos os clones do segundo grupo de cada plataforma e comparados entre eles. A árvore
filogenética (Figura 19) obtida da comparação deste clones do segundo grupo mostrou que
os clones formaram um grande cluster. Todas as seqüências dos clones reunidos do
segundo grupo, independente da plataforma de origem, foram relacionadas entre elas, como
mostra a Figura 19. Desta forma, este grupo parece ser amplamente distribuído, já que foi
encontrado nas três plataformas estudadas.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 74
Figura 15: Abundância relativa dos gêneros bacterianos em cada plataforma. Somente as seqüências mais próximos provenientes do
GenBank (≥98% de similaridade) foram considerados e incluídos nos gráficos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 75
Para verificar como as amostras de água de injeção de cada plataforma se
relacionaram, ou seja, o quanto estas eram semelhantes segundo as variáveis ambientais
utilizadas neste trabalho, e assim mostrar se a diversidade bacteriana de cada ponto de
amostragem nas plataformas variou de acordo com o tratamento aplicado, foi feita a análise
de RDA utilizando o programa Canoco. As variáveis ambientais escolhidas neste trabalho
foram os tratamentos físicos e químicos e o tempo de operação das plataformas. Somente as
seqüências de clones que apresentaram similaridade a organismos cultivados foram
consideradas nesta análise como variável biológica. Para complementar esta análise
estatística, foi realizado outro teste estatístico com base na distribuição das seqüências
obtidas para inferir o índice de diversidade Shannon. O gráfico de ordenação (Figura 20 a)
mostra que o vetor que mais influenciou a distribuição da diversidade das bactérias das
amostras de água foi o vetor de explicação do tempo de operação do sistema de injeção (P
= 0,02). Desta forma, dentre as variáveis ambientais analisadas neste estudo, o principal
fator para determinar a diversidade da comunidade bacteriana das amostras A2, A4, B1, B2
e B3 foi o tempo de operação de cada plataforma. As amostras influenciadas pelo tempo de
operação mostraram-se diversas, apresentando índices de diversidade Shannon variados:
A2 (H´= 2.187), A4 (H´= 1.367), B1 (H´= 2.387), B2 (H´= 3.098) e B3 (H´= 1.675)
(Tabelas 3 e 4). Estes valores do índice de diversidade Shannon estão indicados na Figura
20 a. O ponto A3 foi influenciado pelo THPS, levando a uma comunidade bacteriana
menos diversa devido ao efeito biocida sobre a sobrevivência bacteriana (H’= 0.636). O
ponto A1 não foi influenciado por nenhum fator estudado. Os vetores que explicam os
tratamentos cloração, desaeração e adição de QAT determinaram pouca influência sobre a
diversidade bacteriana total das amostras de água (Figura 20 a). Na disposição dos dados
das amostras de água é possível observar que a primeira componente principal (PC1)
explica 53,2% da variância total dos dados, onde observa-se a separação entre as amostras
da plataforma A e as amostras da plataforma B. Os pontos da plataforma C não foram
incluídos nesta análise, pois todas as seqüências desta biblioteca eram relacionadas a não
cultivados (considerando 98% de similaridade). No entanto, os índices de diversidade
Shannon foram calculados para cada ponto: C2 (H’= 1.971), C1 (H’=1.298) e C3 (H’=
0.978).
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 76
A dominância dos principais grupos obtidos em cada amostra foi também
representada de forma gráfica. Para tal, a análise de PCA foi realizada para ordenar os
gêneros bacterianos dominantes (presença e ausência; abundância relativa) de acordo com
os tratamentos aplicados em cada amostra (Figura 20, b e c). Os grupos predominantes na
plataforma A (Marinobacter) e na plataforma B (Colwellia) foram observados em todos os
pontos estudados nas respectivas plataformas, ou seja, o gênero Marinobacter foi
encontrado nos pontos A1, A2, A3 e A4. Do mesmo modo, o gênero Colwellia foi
observado nos pontos B1, B2 e B3. Os gráficos de ordenação na Figura 20 (b e c) mostram
que os vetores que representam estes dois gêneros tendem a inclinar perto do eixo da
componente principal (PC1). Desta forma, não foi possível correlacionar estes gêneros a
nenhum dos tratamentos utilizados. Na disposição dos gêneros bacterianos na PCA da
Figura 20 b é possível observar que a primeira componente principal (PC1) explica 57,4%
da variância total dos dados, observa-se que existe a separação de dois grupos (Figura 20
b). Em um dos grupos, os clones associados aos gêneros Sphingopyxis, Kopriimonas,
Micavibrio, Vibrio e Alteromonas foram agrupados pelos tratamentos com QATS, cloro e
pela desaeração, separando o gênero Marinobacter que foi mais influenciado pelo
tratamento com nitrato. Enquanto o gênero Desulforegula foi encontrado somente na
amostra tratada com THPS (Figura 20 b), que é um gênero que pertence ao grupo de BRS
da classe Gammaproteobacteria. Os clones relacionados ao gênero Tistrella também não
puderam ser relacionados aos tratamentos, já que foram detectados na amostra de água não
tratada. Na plataforma B (Figura 20 c), os clones relacionados com Achromobacter e
Burkholderia foram agrupados devido à influência da desaeraçcão. Nenhuma outra relação
positiva foi observada neste gráfico de ordenação, pois os vetores que explicam os dados
biológicos estão inclinados em posição oposta aos vetores de dados físico-químicos
(tratamentos). Também nesta análise, os pontos da plataforma C não foram incluídos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 77
Figura 16: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones
procedentes da plataforma A e de seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída
baseada no método neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo
nome designado da amostra juntamente ao número de referência do clone. A barra de escala
representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de
clones que divergiu de grupos previamente descritos.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 78
Figura 17: Árvore filogenética baseada na
comparação de seqüências do RNAr 16S de clones
procedentes da plataforma B e de seqüências provenientes
do GenBank. A árvore foi construída baseada no método
neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S
estão identificadas pelo nome designado da amostra
juntamente ao número de referência do clone. A barra de
escala representa a porcentagem de divergência de
nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de
clones que divergiu de grupos previamente descritos.
Elisa Korenblum
2008
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Figura 18: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones
procedentes da plataforma C e de seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída
baseada no método neighbor-joining. As seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo
nome designado da amostra juntamente ao número de referência do clone. A barra de escala
representa a porcentagem de divergência de nucleotídeos. O quadrado em cor azul destaca o grupo de
clones que divergiu de grupos previamente descritos.
Elisa Korenblum
2008
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Figura 19: Árvore filogenética baseada na comparação de seqüências do RNAr 16S de clones
procedentes das três plataformas, não relacionados a organismos previamente descritos, e de
seqüências provenientes do GenBank. A árvore foi construída baseada no método neighbor-joining. As
seqüências dos clones de DNAr 16S estão identificadas pelo nome designado da amostra juntamente ao
número de referência do clone. A barra de escala representa a porcentagem de divergência de
nucleotídeos.
B2G02
B2G11
B1B01
A2B07
A2D03
B2G12
B2G06
B2E10
B2D09
B2E08
B2G05
B1B02
B2E03
B1A05
B2F08
B1A02
B2C12
C2D02
B2F09
B2H02
C2D04
A2E09
B1A11
B2H26
C2D07
C2D08
A2C07
A2D01
B2G08
A1E05
B2H30
B2H25
C3E04
B1A04
B2A02
C3E05
A2D05
B2D07
C2D09
A1E03
C2D11
A2C11
C2D01
B2B08
C1C06
A1E04
C1C02
C2D03
C2D05
C2D06
Uncult marine Gammaproteobacteria
Colwellia psychroerythraea
100
99
82
83
98
76
53
56
97
70
73
75
98
58
90
97
57
92
52
90
0.2
Elisa Korenblum
2008
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Figura 20: Gráfico de ordenação das comunidades bacterianas das plataformas A e B. (a)
Gráfico RDA mostrando a relação entre a diversidade bacteriana em cada ponto de amostragem e os
tratamentos da água de injeção (P = 0,02). Os índices de diversidade (em nível de gênero) foram
estimados para cada ponto (indicados entre parênteses abaixo das abreviações das amostras. (b e c),
Gráfico PCA mostrando a relação entre os principais gêneros bacterianos das plataformas A (b) e B (c)
e os tratamentos de água utilizados nos sistemas de injeção. O número de clones de cada gênero está
indicado entre parênteses.
Elisa Korenblum
2008
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6.3 Ação antimicrobiana da substância produzida pela estirpe de Bacillus
isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes formados por bactérias redutoras
de sulfato.
Em estudo previamente realizado, foi observado que o consórcio T6-lab, cultura
mista de BRS proveniente de reservatório de petróleo, foi sensível ao contato com a SAM
produzida pela estirpe de Bacillus firmus H
2
O-1 (KORENBLUM et al., 2005). Foi
observado sob condições de anaerobiose que SAM H
2
O-1 inibiu o crescimento da T6-lab
em placa. Portanto, foi avaliado se este mesmo consórcio de BRS crescendo em biofilme
seria também sensível à SAM H
2
O. A capacidade de adesão das células do consórcio T6-
lab sobre coupons de vidro borosilicato foi testada em sistema contínuo, em um biorreator
CDC (BioSurface). Após 5 dias de incubação total em condições de anaerobiose (sob purga
de nitrogênio), foi observada a formação de biofilmes aderidos sobre os coupons de vidro.
A análise dos biofilmes formados foi feita através de microscopia confocal a laser, e as
imagens de microscopia confocal dos biofilmes formados e corados com LIVE/DEAD
BacLight (Figura 21 a) mostraram que a máxima espessura do biofilme de BRS alcançou
240 μm a partir do substrato de adesão (vidro de borosilicato). Avaliando o biofilme da T6-
lab ao longo de sua profundidade, foi detectada uma maior intensidade de fluorescência na
profundidade do biofilme de 100 μm. Esta observação indica que nesta profundidade havia
maior densidade de células que no restante do biofilme, ou seja, as células se concentraram
no interior do biofilme. Já na base do biofilme, próximo ao substrato de adesão (o vidro) as
células formaram uma camada com células dispersas. O biofilme em estudo foi corado,
como já descrito, com LIVE/DEAD BacLight. Este kit de fluoróforos é constituído por dois
corantes o SYTO 9 (verde) que indica a viabilidade celular e o iodeto de propídeo
(vermelho) que indica inviabilidade celular, corando somente as células mortas. O biofilme
da T6-lab cobriu a superfície do vidro homogeneamente, contendo principalmente células
vivas (células coradas somente em verde, SYTO 9). No entanto, poucas células vermelhas
também foram observadas formando grupos espalhados. A máxima intensidade de
fluorescência dos grupos de células vermelhas (400 pixels) chegou à terça parte da
intensidade da fluorescência verde (1200 pixels). A técnica do NMP mostrou que a
concentração de células removidas por raspagem dos coupons chegou a 2,4x10
7
células/mm
2
.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 83
A partir do mesmo biorreator usado no estudo da formação de biofilme pelo
consórcio de BRS T6-lab, os coupons utilizados como substrato de adesão foram tratados
com a SAM H
2
O-1. Os biofilmes tratados foram incubados por 24 horas na presença da
substância antimicrobiana. Através da análise de microscopia confocal a laser, foi
observado que o biofilme pré-estabelecido de BRS foi drasticamente reduzido quando
tratado com a SAM H
2
O-1. A Figura 21 b mostra que a intensidade total de células vivas e
mortas, verdes e vermelhas, apresentou uma redução de 94% da fluorescência comparada
ao biofilme não tratado (Figura 20 a), indicando que o número total de células e a
viabilidade celular reduziram significativamente. No biofilme tratado com a SAM, tanto as
células coradas em verde quanto aquelas coradas em vermelho formavam grumos de
células (micrografia em destaque na Figura 21 b). Apesar da redução da intensidade de
fluorescência ter sido extremamente alta, a espessura do biofilme não foi reduzida (200
μm), indicando a persistência da matriz polissacarídica sobre o coupon de vidro. A
contagem total de células usando NMP indicou uma redução de 1 log somente (NMP do
biofilme tratado ≅ 2x10
6
células/mm
2
).
Elisa Korenblum
2008
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Figura 21: Análise do biofilme de T6-lab por microscopia confocal a laser. Os gráficos
mostram a intensidade de fluorescência das células contidas no biofilme de BRS coradas com o kit
LIVE/DEAD BacLight de acordo com a profundidade da matriz. (a) Biofilme formado pelo consórcio
T6-lab não tratado (controle); (b) Biofilme formado pelo consórcio T6-lab tratado com a SAM H
2
O-1.
As fotos destacadas no canto direito dos gráficos são imagens de projeção máxima do biofilme não
tratado (a) e tratado (b). Barra de escala = 30 μm.
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 85
7 DISCUSSÃO
No início do século passado, os estudos de geomicrobiologia não haviam detectado
ainda comunidades microbianas significativas, e por muitas décadas se acreditou que o
papel dos microrganismos presentes nestes ambientes de subsuperfície profunda era
insignificante (PHELPS, RAIONE & WHITE, 1989). Entretanto, concomitantemente aos
interesses da indústria de petróleo no controle microbiano em sistemas de produção de óleo
devido a problemas causados por microrganismos, como a corrosão e acidulação biogênica,
o estudo da comunidade microbiana em reservatório de petróleo representa atualmente uma
importante área na microbiologia ambiental e industrial. O advento da extração de petróleo
facilitou a coleta de amostras para estudos de geomicrobiologia (a partir de 100 m abaixo
da superfície). Mesmo assim, a amostragem é ainda hoje um impedimento e um desafio ao
estudo da microbiologia de subsuperfície, principalmente devido à necessidade do uso de
tecnologias especializadas, caras e complicadas de perfuração (testemunhagem). A
testemunhagem para estudos de biologia requer ainda técnicas de amostragem em
condições assépticas. Seccionar a amostra e remover a parte mais externa do testemunho
são os principais cuidados para evitar contaminação de microrganismos alóctones. Neste
trabalho, uma das etapas estudadas foi a avaliação da diversidade bacteriana presente em
testemunhos obtidos em subsuperfície ultraprofunda (2.822 a 2.828 m abaixo do fundo do
mar, apresentando ainda uma coluna de água de 1.700 m) no campo de Marlim, na Bacia de
Campos, através de métodos independentes de cultivo. Foi a primeira vez que se
evidenciou a possível presença de bactérias nesta profundidade.
A quantidade de células em amostras de rocha é muito baixa, tornando a eficiência
da extração de DNA também baixa. Assim, a quantidade de ácido nucléico disponível para
análises de microrganismos se encontra em ordens de magnitude menores que o limiar de
detecção de muitas das técnicas de biologia molecular (OGRAM et al., 1995). Neste
trabalho, o primeiro obstáculo foi exatamente a quantidade de DNA extraída, assim como
observado em outros estudos que trabalharam com sedimentos coletados abaixo do fundo
do mar. O outro obstáculo foi a presença de óleo, que pode inibir ou atrapalhar a técnica de
amplificação por PCR (TSAI & OLSON, 1992; WILSON, 1997; NEWBERRY et al.,
2004; PARKES et al., 2005; INAGAKI et al., 2006). No presente trabalho, utilizamos 30
gramas de rocha para estudo da comunidade bacteriana de cada testemunho. O protocolo de
Elisa Korenblum
2008
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extração de DNA usado foi baseado no fracionamento da amostra, separando as células do
sedimento rochoso, e na lise mecânica por bead-beating. Este procedimento resultou em
uma baixa concentração de DNA, mas foi suficiente para a amplificação por PCR da
comunidade bacteriana presente nas diferentes amostras de rocha. Os cuidados referentes à
contaminação com produtos pré-amplificados de experimentos anteriores foram uma
preocupação constante nesta pesquisa, principalmente pela natureza da amostra de rocha
que poderia contaminar-se, durante o processamento de extração, com DNA estranho. Para
se obter então, a garantia de que o produto amplificado era realmente proveniente da
comunidade autóctone da rocha, foram utilizadas soluções esterilizadas, material
descartável, ponteiras com barreira filtrante durante todo o experimento para evitar este
problema. E ainda, como já comentado acima, também foi retirada a camada mais externa
da rocha e então o cerne do testemunho foi amostrado como descrito nos materiais e
métodos. Além disso, foram feitos controles negativos durante a extração de DNA e a
amplificação por PCR, ou seja, tubos brancos nos quais não foi adicionado nenhum
material proveniente das amostras de rocha.
A estratégia de estudo foi baseada, como em outros trabalhos (PARKES et al.,
2005; INAGAKI et al., 2006), em seqüências de DNAr 16S para a análise da comunidade
bacteriana presente em rochas de sedimentos coletados abaixo do fundo do mar. Diferentes
filos bacterianos já foram detectados em subsuperfície, como Proteobacteria, Firmicutes,
Actinobacteria e Bacteroidetes (D’HONDT et al., 2004; TESKE, 2005). O resultado da
presente análise filogenética indicou que a diversidade bacteriana nas amostras de rocha
ultraprofunda apresenta uma ampla distribuição de grupos do domínio Bacteria (filos
Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria) com a predominância da classe
Betaproteobacteria. Dentre estas seqüências de Betaproteobacteria, a maioria foi
relacionada a seqüências de organismos não cultivados (Figura 11). Somente um clone se
afiliou ao gênero Pelomonas, e cinco clones aos gêneros Variovorax (Figura 11). A espécie
de V. paradoxus já foi descrita como degradadora de hidrocarboneto (SMITH, ALVEY &
CROWLEY, 2005). Além destas espécies, clones relacionados aos gêneros
Comamonas/Delftia e Azoarcus foram encontrados dentre as Betaproteobacteria. Algumas
das espécies relacionadas a estes gêneros já foram identificadas em processos de
biorremediação (LIN et al., 2005; VACCA, BLEAM & HICKEY, 2005)
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 87
Os 17 clones relacionados à classe Alphaproteobacteria obtidos neste trabalho
foram encontrados nas quatro amostras de rocha, entretanto foram representativos em maior
número nas bibliotecas das amostras T2-1/9 e T2-2/9. Sete clones foram relacionados à
família Bradyrhizobiaceae (Figura 12), sendo dois clones associados a membros de cada
um dos gêneros Rhodopseudomonas e Methylobacterium. Estirpes pertencentes a estes
gêneros já foram detectados em fluido produzido (óleo) (SETTE et al., 2007; LIEW &
JONG, 2008). Os clones T2-8/9(10) e T2-7/9(8) são próximos a uma bactéria degradadora
de diesel, Ochrobactrum sp. (PRINCE, 2005) e Rhodobacter sphaeroides (VRDOLJAK et
al., 2005), respectivamente. Três clones foram relacionados aos gêneros Defluvibacter e
Aquamicrobium. A espécie Defluvibacter lusatiae é uma bactéria Gram-negativa que é
capaz de degradar fenol (FRITSCHE et al., 1999).
A distribuição dos grupos Gammaproteobacteria e Firmicutes foi ampla, pois foram
obtidos clones das quatro amostras relacionados a estes grupos, entretanto foram menos
abundantes que a classe Betaproteobacteria. Os clones obtidos neste estudo que foram
relacionados à classe Gammaproteobacteria, foram associados especificamente aos gêneros
Xanthomonas, Stenotrophomonas e Pseudomonas, que já foram descritos como
degradadores de hidrocarbonetos (DUARTE et al., 2001; BOSZCZYK-MALESZAK et al.,
2006). Quanto aos clones relacionados ao filo Firmicutes, dois clones foram relacionados
ao gênero Bacillus. Em um estudo anterior de amostras de rocha provenientes também do
campo de Marlim, na Bacia de Campos, foram isoladas estirpes de Bacillus capazes de
degradar petróleo e de crescer em hidrocarbonetos como única fonte de carbono (CUNHA
et al., 2006). Foi detectado um clone relacionado à espécie Oceanobacillus iheyensis. Esta
espécie foi isolada de sedimentos de mar ultraprofundo (1.050 m de profundidade) no Japão
e foi reconhecida por ser halotolerante e alcalifílica (LU, NOGI & TAKAMI, 2001). Outro
clone foi relacionado a Brevibacillus sp., considerado como potencial degrador de asfalteno
(PINEDA-FLORES et al., 2004).
Finalmente, somente um clone da amostra T2-8/9 foi relacionado ao filo
Actinobacteria (Tabela 1). Esta seqüência apresentou maior similaridade ao gênero
Arthrobacter, que foi isolado de sedimentos ultraprofundos e mostrou ter capacidade em
degradar uma ampla variedade de compostos (PRINCE, 2005).
A comunidade de BRS somente pôde ser detectada em uma das amostras de rocha
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 88
ao usar os iniciadores para o gene aprA. Três espécies do gênero Desulfovibrio foram
identificadas (D. desulfuricans, D. profundus e D. indonesiensis). Este resultado indica a
que a presença de BRS está em baixo número e diversidade neste ambiente. O mesmo foi
observado anteriormente por PARKES e colaboradores (2005). Estes autores observaram
procariotos relacionados diretamente à redução de sulfato representados por uma pequena
porção da população total encontrada no ponto de amostragem no Peru, Oceano Pacífico.
Nesta etapa foi possível obter DNA total dos testemunhos de rocha de subsuperfície
profunda e a partir deste material amplificar fragmentos de DNAr 16S possibilitando assim
a avaliação da diversidade bacteriana total destes testemunhos. A comunidade de bactéria
redutora de sulfato foi detectada somente em um dos testemunhos de rocha de subsuperfície
profunda utilizando os iniciadores para o gene aprA. Os processos de corrosão e acidulação
biogênica causados pela presença autóctone de BRS, não devem ser esperados inicialmente
neste reservatório, pois este apresentou baixo número de clones relacionados a este grupo
utilizando métodos moleculares. Entretanto, estes processos podem ser intensificados à
medida que este campo de petróleo seja explorado, assim alterando as condições ambientais
internas do reservatório, e estimulando a população de BRS. Outro grande problema que
indústria de petróleo enfrenta é a biodegradação do óleo. A degradação de óleo é um
problema cuja relevância é geralmente observada em ambientes contaminados por petróleo
ou seus derivados, ou seja, onde estes compostos não são encontrados naturalmente.
Contudo, este processo também é encontrado em reservatório de petróleo, resultando no
acúmulo de óleos biodegradados, com característica de óleos considerados pesados. Este
processo é também um grande problema para a indústria de petróleo, pois o óleo pesado é
comercialmente menos favorável. Muitos dos clones obtidos nesta etapa deste estudo foram
relacionados a bactérias descritas previamente como degradadoras de hidrocarbonetos do
petróleo. Esta evidência pode indicar a qualidade do óleo do reservatório como sendo de
densidade pesada. Esta evidência é corroborada com o histórico das reservas de óleos
pesados no Brasil, que são significativamente grandes. No Brasil, o local com maior
incidência de óleos pesados está exatamente em reservatórios de águas profundas da Bacia
de Campos, no estado do Rio de Janeiro.
A avaliação de microrganismos autóctones de subsuperfície foi a primeira etapa do
trabalho. Considerando a possibilidade de contaminação antropogênica dos reservatórios de
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 89
petróleo pelos procedimentos de perfuração e pelos diferentes métodos de extração de
petróelo, a segunda etapa deste estudo foi a avaliação do sistema de tratamento de injeção
de água do mar utilizada na recuperação secundária do petróleo.
Durante a drenagem do petróleo em um poço produtor é necessário a manutenção da
pressão dentro do reservatório para manter a produção do óleo. Em plataformas offshore, a
manutenção da pressão é geralmente alcançada pela injeção de água do mar. Esta água do
mar deve ser desaerada para evitar problemas de corrosão, pelo oxigênio, das tubulações
metálicas. Este processo de injeção de água do mar está associado a outros problemas
envolvendo microrganismos, como a acidulação biogênica e a corrosão influenciada por
microrganismos. Isto se deve ao fato que a injeção de água do mar, rica em sulfato, pode
estimular o crescimento de BRS e conseqüentemente a produção de H
2
S. Outros grupos
bacterianos, como Bacillus e Pseudomonas, também conseguem se desenvolver após a
injeção de água, devido à redução da temperatura do reservatório ao chegar a água do mar
em seu interior (DAVIS, 1967; BEEDER et al., 1996).
Este é o primeiro estudo a comparar a diversidade de bactérias planctônicas em
sistemas de tratamento de água do mar para injeção na recuperação secundária de petróleo
em plataformas offshore no Brasil. Os sistemas de tratamento de três plataformas offshore
foram analisados em diferentes pontos da linha de tratamento da água (Figura 10). A
predominância de Marinobacter sp. (87 clones) na plataforma A e de Colwellia sp. (104
clones) na plataforma B foi observada em todos os pontos amostrados em cada plataforma,
com exceção dos pontos tratados com THPS. Somente dois trabalhos recentes foram
realizados até hoje em sistemas de tratamento de água de injeção, e resultados semelhantes
foram observados em plataformas offshore (Mar do Norte, Noruega) onde a água foi tratada
com nitrato (BØDTKER et al., 2008; SCHWERMER et al., 2008). BØDTKER e
colaboradores (2008) e SCHWERMWER e colaboradores (2008) detectaram também a
prevalência dos gêneros Marinobacter e Colwellia, respectivamente. Entretanto, mesmo
reconhecendo que ambos os gêneros conseguem obter energia da redução de nitrato, a
presença destes grupos no presente estudo não foi restringida por este tratamento, pois
foram detectados tanto em amostras não tratadas e tratadas com nitrato (somente um poço
da plataforma A foi tratado com nitrato). Tanto os gêneros Marinobacter como Colwellia já
foram descritos em processos de corrosão de materiais metálicos e degradação de
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 90
hidrocarbonetos, processos que podem causar grandes perdas econômicas para a indústria
de petróleo (GORSHKOVA et al., 2003; POWEL, BOWMAN & SNAPE, 2004; LOPEZ et
al., 2006; SCHWERMER et al., 2008). DUNSMORE e colaboradores (2006) detectaram a
espécie Marinobacter aquaeolei em uma cultura mista de bactérias redutoras de nitrato,
proveniente de um poço de produção do Mar do Norte, tratado com nitrato. Estes autores
sugerem que Marinobacter pode ser um indicador da eficiência do tratamento com nitrato
(DUNSMORE et al., 2006). Marinobacter sp. provavelmente é capaz de sobreviver às
condições de reservatório. No presente estudo este gênero foi observado em todas as
amostras provenientes da plataforma A. como observado no gráfico de ordenação onde é
observada a presença deste grupo na amostra antes do tratamento com nitrato (somente
tratada com cloro e QATS) como também na amostra tratada com nitrato (Figura 20 b).
Assim, de acordo com DUNSMORE e colaboradores (2006), este grupo tem grande
potencial para servir como indicador no monitoramento do sistema de produção de petróleo
como um todo, desde a injeção de água até o poço produtor. Não foi encontrado nenhum
trabalho relatando a sobrevivência do grupo Colwellia em reservatório de petróleo.
Provavelmente as bactérias do gênero Colwellia não são capazes de sobreviver a este
ambiente mesmo após o resfriamento com a água de injeção. Os membros pertencentes ao
gênero em questão são estritamente psicrofílicos (crescem abaixo de 20ºC) (METHÉ et al.,
2005).
Em menor número, outros clones relacionados ao filo Proteobacteria também foram
obtidos nas plataformas A e B, assim como nos trabalhos anteriores também evidenciaram
outros clones relacionados a este mesmo filo nos sistemas de água de injeção (BØDTKER
et al., 2008; SCHWERMER et al., 2008). Em comum também foram detectados os gêneros
Alteromonas e Vibrio (SCHWERMER et al., 2008). Todos os gêneros observados neste
estudo (Figura 15) já foram detectados ou têm algum membro comumente encontrado em
ambiente aquático. Os gêneros Pseudomonas, Vibrio, Alteromonas (plataforma A) e
Achromobacter (plataforma B) estão dentre os grupos bacterianos mais freqüentemente
encontrados em ambientes marinhos e capazes de degradar hidrocarbonetos (RISER-
ROBERTS, 1992; FLOODGATE, 1995; MUNN, 2004). Neptunomonas sp. é degradador
de hidrocarboneto aromático (naftaleno) (HEDLUND et al., 1999). Os gêneros
freqüentemente encontrados em ambiente marinhos são, na plataforma A, Sphingopyxis
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 91
(Mar Amarelo, Corea - YOON et al., 2005), Kopriimonas (KWON et al., 2005); na
plataforma B, Burkholderia (Mar Sul da China – WANG et al., 2008), Synechococcus (Mar
Negro – UYSAL, 2001), Thiomicrospira (Oceano Pacífico – SCOTT et al., 2006),
Oceanospirillum (POT et al., 1989). No entanto, todos são microrganismos aeróbios, ou no
caso de Synechococcus e Thiomicrospira que são fotoautotróficos e litoautotróficos,
respectivamente. Mesmo que tenham persistido ao sistema de tratamento de água,
dificilmente irão sobreviver no interior do reservatório, na ausência de oxigênio. Já os
gêneros Micavibrio (LAMBINA et al., 1989), Tistrella (SHI et al. 2003) e Desulforegula
(REES & PATEL, 2001) foram originalmente isolados de ambientes de água doce (lagos).
Micavibrio é um gênero parasito obrigatório de bactérias em ambientes aquáticos, não
sobrevive sem seu hospedeiro. Tistrella foi recentemente descrita como degradadora de
fenantreno em solo (ZHAO et al., 2008), porém provavelmente não suportaria a salinidade
do reservatório, que geralmente é superior à salinidade do mar, chegando a ponto de
saturação (5,5 % a 20% de sais totais) (DAVIS, 1967).
O estudo da comunidade de bactérias redutoras de sulfato é de grande interesse para
a indústria petrolífera, pois são as responsáveis por danos causados pelos processos de
acidulação biogênica e corrosão microbiológica. Somente três clones do gênero
Desulforegula foram observados na plataforma A, o único gênero de BRS encontrado neste
trabalho utilizando o gene rrs como ferramenta. Foi avaliada a presença de BRS pelo uso
de iniciadores para o gene aprA, em todas as amostras das plataformas A, B e C, porém o
produto quando obtido era muito fraco. Infelizmente nenhum clone baseado no gene aprA
foi obtido nesta etapa do trabalho. Quando avaliada pelos técnicos do grupo de Corrosão do
CENPES/Petrobras, a concentração de biomassa de BRS total chegou a um máximo de 28
NMP/ml em todas as amostras. Estes resultados demonstram que há BRS nos sistemas de
injeção de água, porém em baixo número. A dificuldade de detectar um grupo minoritário
com grande influência biogeoquímica como as BRS já foi observado anteriormente por
métodos moleculares, quando comparado a grupos bacterianos predominantes (D’HONDT
et al., 2004; PARKES et al., 2005; WEBSTER et al., 2006). A análise de classificação dos
clones das três bibliotecas construídas usando a ferramenta blastn do NCBI foi feita com
base na escolha de 98%, ou mais, de similaridade entre as seqüências dos clones e das
provenientes do BLAST. Esta escolha foi feita para garantir a confiabilidade na
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 92
identificação dos clones em nível de gênero.
As Figuras 21 a, b e c agrupam por meio gráfico os dados apresentados das
plataformas A e B como um todo. O gráfico de ordenação (Figura 21 a) permite a
observação das diferenças entre as plataformas A e B através da diversidade bacteriana, dos
tratamentos das amostras e do tempo de operação. Comparando as variáveis ambientais
escolhidas para este estudo, o resultado do gráfico da Figura 21 a indica que as plataformas
diferem quanto à diversidade bacteriana principalmente pelo tempo de atividade de cada
uma delas, e não pelo tratamento aplicado na água de injeção. Outra possibilidade, que
pode ser ressaltada, apesar de não ter sido avaliada, é a variação das amostras de acordo
com a plataforma de origem, mesmo que sejam todas localizadas na Bacia de Campos, as
correntes marinhas locais podem influenciar a comunidade bacteriana da água do mar bruta
usada na injeção. O litoral do sudeste brasileiro é banhado por duas correntes marinhas, a
corrente do Brasil, com águas quentes (vinda do equador), e a corrente das Malvinas com
águas gélidas (vinda do pólo Sul). Possivelmente, a temperatura das águas pode ter
determinado desde o início a população bacteriana dos sistemas de tratamento de água de
injeção. De fato, a análise de PCA, mostrou que as diversidades das comunidades
bacterianas nas plataformas de injeção de água avaliadas neste estudo diferiram de maneira
“plataforma-dependente”. Além disso, as Figuras 21 b e c indicam que os gêneros
predominantes nas amostras das plataformas A e B não são influenciados pelos tratamentos
aplicados, pois são detectados em todos os pontos. Não foi observada assim nenhuma
correlação dos gêneros Marinobacter e Colwellia com nenhum tratamento específico.
O objetivo do tratamento da água de injeção é principalmente a redução de BRS
pelo fato de promoverem os processos conhecidos como souring e corrosão. Nestes
sistemas de tratamento de injeção de água foi detectado um único gênero pertencente ao
grupo Desulforegula (3 clones) somente na plataforma A, utilizando os iniciadores para o
gene rrs. Assim, o tratamento utilizado é, sem dúvida, necessário. A aplicação em batelada
com THPS é a etapa mais drástica do tratamento, possibilitando uma melhor eficiência no
controle microbiano, mas não há a eliminação total de microrganismos do sistema.
Entretanto, a biomassa que sobrevive ao sistema de tratamento pode ou não resistir às
condições do interior do reservatório, sobretudo devido à salinidade e temperatura, como
discutido acima. Desta forma, a estimulação da atividade de redução de sulfato pela injeção
Elisa Korenblum
2008
[Digite o endereço da empresa] 93
de água do mar influencia provavelmente as BRS autóctones, que são encontradas na rocha,
como observado neste trabalho (no testemunho T2-8/9), e estão adaptadas às condições
locais. No momento da introdução da água do mar, há o aumento da concentração de
sulfato e outros nutrientes, levando à redução de sulfato por essas bactérias, e
conseqüentemente à produção de H
2
S.
O grande grupo encontrado no estudo da diversidade bacteriana em sistemas de
tratamento de injeção de água das plataformas A, B e C foi formando por clones
relacionados a organismos não cultivados das três plataformas. Este grupo divergiu, se
distanciando de organismos já conhecidos cultivados e não-cultivados, mostrando assim
pouca similaridade às seqüências previamente estudadas incluídas no GenBank. A
possibilidade de estas seqüências serem de origem quimérica foi descartada pela análise
destas seqüências utilizando a ferramenta CHECK_CHIMERA (do site RDP). Este cluster
foi formado por clones provenientes das três plataformas (Figura 20). Portanto, os clones
são provenientes de produtos formados de reações de PCR também distintas. O grupo em
questão foi separado como um grupo monofilético, ratificando a idéia de estas seqüências
são de fato autênticas. Além disso, há também o indicativo de que este cluster é
amplamente distribuído, já que foi detectado nas três plataformas, independente do local ou
de tempo de operação. Este cluster pode ser uma nova subdivisão bacteriana. Entretanto,
não pode ser categorizado como tal devido ao estudo ser baseado em uma região pequena
(433 nucleotídeos) do DNAr 16S. Este cluster não classificado e predominante é o único
grupo em comum nos três sistemas de injeção de água das plataformas estudadas. Contudo,
ainda não é possível determinar qual a importância ecológica e industrial da presença deste
grupo nos sistemas de água de injeção da indústria de petróleo, pois como foi sugerido
neste presente trabalho: alguns grupos bacterianos, mesmo após resistirem às etapas de
tratamento do sistema de injeção de água do mar, podem não suportar as condições
extremas do reservatório. O mesmo pode acontecer com este grupo não identificado.
Porém, por terem sido amplamente encontrados nas amostras, pode se tratar de um grupo
que resistente a diferentes condições ambientais.
Os resultados obtidos no estudo da comunidade bacteriana presente em pontos do
tratamento de água de injeção forneceram uma ampla análise da comunidade destes
sistemas sugerindo que a presença de alguns grupos bacterianos pôde sobreviver aos
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tratamentos. Sobretudo, o sistema de tratamento é de extrema necessidade para indústria de
petróleo. Assim, também é de interesse desta indústria o desenvolvimento de novos agentes
antimicrobianos mais eficientes e ambientalmente corretos. A busca por novos agentes
biocidas se deve ao fato de que com o tempo muitos dos biocidas aplicados podem perder a
eficiência no controle microbiano e pela incapacidade de controlar a formação de biofilmes.
Vários métodos têm sido propostos para controlar biofilmes em diversas instalações da
indústria de petróleo.
A última etapa deste trabalho foi a avaliação da ação antimicrobiana da substância
produzida pela estirpe de Bacillus isolada de reservatório de petróleo contra biofilmes
formados por bactérias redutoras de sulfato. Na procura por novas substâncias inibitórias,
muitos autores trabalharam com estirpes bacterianas selvagens e geneticamente
modificadas, objetivando a produção de compostos ativos contra a formação de biofilme e
conseqüentemente a redução da biocorrosão (JAYARAMAN, MANSFELD & WOOD,
1999; ÖRNEK et al., 2002, ZUO & WOOD, 2004). Procedimentos industriais de limpeza
devem levar em conta o material remanescente aderido às superfícies após aplicação do
tratamento, pois este material restante pode facilitar a adesão subseqüente de
microrganismos indesejáveis (PARKAR, FLINT & BROOKS, 2004). GARDNER &
STEWART (2002) mostraram que o composto biocida glutaraldeído, comercialmente
usado pelas indústrias de petróleo, suprimiu a atividade de BRS na concentração de 100
mg/l. Entretanto, eles também observaram que não houve redução significativa da
espessura do biofilme, indicando uma remoção incompleta do biofilme. Além disso, é
sabido que há maiores chances de corrosão por aeração diferencial da superfície, quando a
camada de células deixa de ser homogênea, formando grumos espalhados pela superfície de
adesão. A disposição de células remanescentes e de resíduos aderidos após tratamento com
o biocida pode causar corrosão por aeração diferencial (GARDNER & STEWART, 2002).
FANG, XU & CHAN (2002) também demonstraram o aumento da corrosão quando o
biofilme formado por BRS foi exposto a substâncias químicas e metais tóxicos, pois o
tratamento aplicado não removeu totalmente o biofilme formado sobre a superfície testada.
No presente trabalho, o biofilme de BRS foi crescido em um reator CDC por 5 dias
em condições anaeróbicas sobre coupons de vidro. Esta superfície foi escolhida para evitar
a formação de produtos de corrosão que podem interferir na visualização microscópica. LI
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e LOGAN (2004) observaram a formação de biofilme sobre superfícies inertes e
compararam diferentes superfícies (de vidro e metálicas). Estes autores observaram que não
há um efeito significativo (P = 0,26) da adesão bacteriana quanto à topologia da superfície.
O biofilme formado pelo consórcio de T6-lab, que é uma cultura mista de BRS
proveniente de reservatório de petróleo, foi colocado em contato com o extrato bruto da
SAM H
2
O-1 por 24 horas. O contato da SAM H
2
O-1 com o biofilme causou uma redução
de 94% da fluorescência total, indicando uma remoção de células do biofilme previamente
formado. As células restantes no biofilme tratado apresentaram principalmente a coloração
vermelha, determinada pela marcação com iodeto de propídeo que indica inviabilidade
celular. Porém, foi observada a manutenção da espessura do biofilme tratado, quando
comparado ao biofilme de BRS controle (não tratado). Isto é, provavelmente a matriz
polimérica extracelular que confere o arcabouço do biofilme se manteve constante, mesmo
após a morte e remoção das células do biofilme tratado. Este resultado pode trazer
problemas adicionais devido ao material remanescente sobre a superfície, que pode
funcionar como camada condicionante para adesão de novas células da fase líquida. Assim,
para evitar este inconveniente, um tratamento mais longo ou mesmo contínuo, como é feito
com os biocidas atualmente aplicados em diferentes sistemas da indústria petrolífera, pode
ser necessário para alcançar melhor eficiência de remoção do biofilme existente.
Finalmente, o presente estudo abrangeu a diversidade bacteriana autóctone e
alóctone presente em sistemas de produção da indústria de petróleo, destacando os grupos
dominantes de cada amostra (rocha e água de injeção), sugerindo seus possíveis impactos
na produção de petróleo. A presença de BRS foi detectada em baixo número nestas
amostras. Contudo, o controle deste grupo bacteriano é de extrema importância pelos
motivos aqui apresentados. Assim, a SAM produzida pela estirpe Bacillus firmus H
2
O-1
poderá ter aplicações industriais, pois esta SAM tem potencial na redução do crescimento
de BRS e, conseqüentemente, no controle da biocorrosão e acidulação biogênica.
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8 CONCLUSÕES FINAIS
9 A extração de DNA da comunidade bacteriana presente nos quatro testemunhos de
reservatório de subsuperfície profunda analisados foi eficiente e foi possível amplificar
por PCR fragmentos do gene rrs e aprA.
9 O filo Proteobacteria predominou nas quatro amostras de rocha petrolífera.
9 As BRS foram encontradas em uma amostra de rocha e todos os clones obtidos foram
relacionados ao gênero Desulfovibrio.
9 O sistema de tratamento de água de injeção não elimina todas as bactérias presentes no
sistema. Os clones obtidos das três plataformas puderam ser divididos em dois grupos:
o primeiro foi relacionado ao filo Proteobacteria e o segundo não apresentou
similaridade a organismos previamente descritos.
9 O tempo de atividade das plataformas de injeção de água foi o fator que mais
influenciou a diversidade bacteriana nestas amostras.
9 A SAM H
2
O-1 apresentou atividade inibitória sobre biofilme de BRS pré-formado. A
análise deste biofilme por microscopia confocal a laser indicou uma redução de 94% da
intensidade de fluorescência total.
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Elisa Korenblum
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