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VÂNIA APARECIDA TERRA MALACHIAS
ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO PELA IRRADIAÇÃO
AGUDA POR UVB NA PELE DE CAMUNDONGOS SWISS
LONDRINA
2008
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VÂNIA APARECIDA TERRA MALACHIAS
ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO PELA IRRADIAÇÃO
AGUDA POR UVB NA PELE DE CAMUNDONGOS SWISS
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Patologia
Experimental, Departamento de Ciências
Patológicas da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Cecchini
Co-orientadora: Profª Drª Alessandra
Lourenço Cecchini Armani
Londrina
2008
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VÂNIA APARECIDA TERRA MALACHIAS
ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO PELA IRRADIAÇÃO AGUDA POR
UVB NA PELE DE CAMUNDONGOS SWISS
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Patologia
Experimental, Departamento de Ciências
Patológicas da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
________________________________
Prof. Dr. Décio Sabatini Barbosa
Universidade Estadual de Londrina
__________________________________
Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte
Universidade Estadual de Maringá
________________________________
Prof. Dr. Rubens Cecchini
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 06 de junho de 2008.
DEDICATÓRIA
À Deus, minha fortaleza, pela concretização
deste trabalho e por todas as realizações,
principalmente o nascimento da minha filha
Nicole, durante este período abençoado; à
minha querida filha Nathália, meu marido e
companheiro, Ronaldo, que foram meus
parceiros neste projeto e que são meus
amores e a razão da minha vida.
Aos meus pais, Deonízia e Miguel, pelos bons
exemplos e ensinamentos e ao meu querido
irmão Paulo Henrique pela contribuição.
Ao meu sogro Airton e sogra Diva, que
possibilitaram a realização deste trabalho,
acolhendo os netos com muito amor, paciência
e muita colaboração.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Rubens Cecchini e à Profª Drª Alessandra Lourenço Cecchini
Armani, pela imprescindível orientação durante a realização deste trabalho.
Á Profª Drª Rúbia Casagrande, pelas informações que contribuíram para a
execução deste trabalho.
Aos colegas e amigos de laboratório, de mestrado e amigos do transcorrer
do curso, por terem participado, marcadamente, desta inesquecível etapa da minha
vida: Aida Mehanna, Cristiane Akemi Iamamoto, Débora F. Vituri Rodrigues da Silva,
Fábio Leandro Santos Fenner, Luiz Antônio Custódio, Jair Tonon, Josiane Mendes,
Leila Regina Arias Rotunno, Marcelo Abba Macioszek, Patrícia da Silva Peres,
Patrícia Sayuri Suzuki, Juliana Rubira, Rosália Hernandes Fernandes Vivan. Em
especial Alissana Ester Iakmiu Camargo, Flávia Alessandra Guarnier, Francielle
Caroline Rodrigues, Priscila Cassolla e Alexandre Yukio Saito por todo auxílio e
colaboração.
Aos técnicos de laboratório de patologia, Jesus Antônio Vargas e Pedro
Sebastião Dionízio Filho, pela assistência técnica prestada e colaboração.
Ao corpo docente do Mestrado em Patologia Experimental, por ter
contribuído para a minha formação científica: Profª Drª Alessandra Lourenço
Cecchini Armani, Profª Drª Eiko Itano Nakagawa, Prof. Dr. Emerson José Venâncio,
Profª Drª Halha Ostrensky Saridakis, Profª Drª Helenir Medri de Souza, Profª Drª
Ionice Felipe, Profª Drª Ivete Conchon Costa, Profª Drª Maria Angélica Ehara
Watanabe, Prof. Dr. Mario Augusto Ono, Prof.ª Dr.ª Marli Martins Pinge, Prof. Dr.
Phileno Pinge Filho, Prof. Dr. Rubens Cecchini, Profª Drª Tânia Longo Mazzuco.
MALACHIAS, VANIA APARECIDA TERRA. Estresse oxidativo induzido pela
irradiação aguda por UVB na pele de camundongos Swiss. 2008. 68 f. Dissertação
(Mestrado em Patologia Experimental) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
RESUMO
As radiações ultra-violetas (UV) são as principais responsáveis pela maioria das lesões
cutâneas devido à excessiva exposição solar. O UVB é o agente físico mais descrito por
induzir manifestações agudas e crônicas, como respostas inflamatórias, envelhecimento e
doenças cutâneas malignas, através da formação de radicais livres. Existem mecanismos
celulares que inibem o excesso de espécies reativas do oxigênio (EROs), como o sistema
enzimático da catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px)
e não enzimático como as vitaminas E, C, β-caroteno, ácido urocânico, acido lipóico, entre
outros. A procura por substâncias que evitem os efeitos oxidativos na pele tem sido intensa.
O objetivo desse estudo foi caracterizar o padrão oxidativo no modelo experimental de
irradiação aguda por UVB, que possa contribuir com futuras pesquisas que utilizam este
modelo na verificação das propriedades de fármacos. Para tanto, camundongos Swiss
tricotomizados foram submetidos à dose aguda por UVB (2,98J/cm
2
). As peles foram
removidas após 6 e 24 horas da irradiação. De acordo com análise macroscópica das peles
dos camundongos, o UVB provocou eritema e na histologia o aparecimento de sunburn cells
(SBCs), indicando uma alta atividade sinalizadora de morte celular (apoptose) de
queratinócitos. Foram medidos os níveis de hidroperóxidos lipídicos, de proteínas oxidadas
e a capacidade antioxidante total (TRAP), a atividade enzimática da superóxido dismutase
(SOD) e da catalase (CAT). Os resultados do grupo 6 horas mostraram diminuição
significativa dos níveis de hidroperóxidos lipídicos avaliados por quimiluminescência (QL)
estimulada por terc-butil hidroperóxido comparados ao grupo controle (p< 0.05) e das
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (4,4 ± 1,3 nM MDA/mg proteína;
controle 11,4 ±1,04 nM MDA/mg proteína; p<0,01) assim como foi menor os níveis de
proteínas carbonílicas (PCs) (8.15 ± 0.53 nM/mg proteína; controle: 9,07 ± 0,52 nM/mg
proteína; p<0,05). Houve aumento significativo do TRAP (1,5 ± 0,11 µM Trolox; controle:
1,18 ± 0,06 µM Trolox; p< 0,05) e da atividade da SOD (1,34 ± 0,09 USOD/mg proteína;
controle: 0,95 ± 0,06 USOD/mg proteína; p< 0,01), indicando aumento das defesas
antioxidantes de baixa massa molecular e enzimáticas. Isto mostra que as defesas
antioxidantes foram estimuladas pela irradiação e eficientes contra a lipoperoxidação. O
mesmo não ocorreu no grupo 24 horas, quando os resultados mostraram aumento nos
níveis de hidroperóxidos lipídicos, comparados ao grupo controle (p< 0.05), quantificados
por QL. TBARS apresentou queda significativa (6,4 ± 1,10 nM MDA/mg proteína; controle:
11,4 ±1,04 nM MDA/mg proteína; p<0,05), assim como as proteínas carbonílicas (7,74 ±
0,31 nM/mg proteína; controle: 9,07 ± 0,52 nM/mg proteína; p<0,01). Níveis diminuídos
também foram evidenciados para a TRAP (0,86 ± 0,04 µM de Trolox; controle: 1,24 ± 0,06
µM Trolox; p<0,05), para a atividade da CAT (0,27 ± 0,01 abs/mg proteína; controle: 0,39 ±
0,01 abs/mg proteína; p<0,001) e da SOD (0,92 ± 0,05 USOD/mg proteína), quando
comparada ao grupo 6 horas, (1,34 ± 0,09 USOD/mg proteína; p<0,05). Portanto, o estresse
oxidativo foi observado após 24 horas da irradiação quando houve aumento da
lipoperoxidação provavelmente pela formação de EROs, devido ao acúmulo de peróxido de
hidrogênio conseqüência da dismutação do ânion superóxido pela SOD e o consumo das
defesas antioxidantes. Sugere-se que o modelo experimental que utiliza dose aguda por
UVB, seja adequado para testes com fármacos com propriedades antioxidantes, desde que
seja levado em consideração o tempo de instalação do estresse oxidativo após 24 horas de
irradiação, já que após 6 horas, os mecanismos antioxidantes cutâneo são eficientes.
Palavras-chaves: Pele. Estresse oxidativo. Eros. Antioxidantes. UVB. Irradiação aguda.
MALACHIAS, VANIA APARECIDA TERRA. Oxidative stress induced by UVB acute
irradiation of the skin of Swiss mice. 2008. 68 f. Dissertation (Master’s Degree
Dissertation) – State University of Londrina, Londrina.
f
ABSTRACT
The ultra-violet radiation (UV) is the main responsible for most of the skin lesions due to
excessive sun exposure. UVB is described to induce acute and chronic manifestation, as
inflammatory responses, ageing and malignant skin diseases, through the formation of free
radicals. There are cellular mechanisms that inhibit reactive oxygen species (ROS), the
antioxidants defenses, such as the enzyme system of catalase (CAT), superoxide dismutase
(SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and non-enzymatic such as vitamins E, C and β -
carotene, urocanic acid, lipoic acid and others. The search for substances that prevent the
oxidative effects in the skin, has been extended. The aim of this study was to characterize
the oxidative pattern in the experimental model of acute UVB irradiation, to contribute to
future research that use this model to analyses drugs properties. Swiss shaved mice were
submitted of acute dose of UVB (2.98 J/cm
2
). The skin was removed after 6 and 24 hours of
irradiation. According to macroscopic analysis of skin, UVB caused erythema and the
appearance of sunburn cells (SBCs), indicating a high activity of cell death (apoptosis) of
keratinocytes. We measured the levels of lipid hydroperoxides, oxidized proteins and total
antioxidant capacity (TRAP), the SOD and CAT activity. The results of 6 hours group
showed significant decrease in the levels of lipid hydroperoxides levels as evaluated by
chemiluminescense (CL) stimulated by tert-butyl when compared to the control group,
(p<0.05), as well as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) (4.4 ± MDA 1.3 nM / mg
protein; control MDA 11.4 ± 1.04 nM / mg protein, p<0.01) and proteins carbonylation (PCs)
(8.15 ± 0.53 nM / mg protein; control: 9.07 ± 0.52 nM / mg protein, p<0.05) lower levels.
TRAP increased significantly (1.5 ± 0.16 µ M Trolox; control: 1, 24 ± 0.06 µ M Trolox, p
<0.05), as well as SOD activity (1.34 ± 0.09 USOD / mg protein; control: 0.95 ± 0.06 USOD /
mg protein, p<0.01), indicating elevation in antioxidant defenses stimulated by irradiation and
an efficient protection against lipoperoxidation. In the 24 hours group, the results showed
remarkable increasing in lipid hydroperoxides levels when compared to control group
(p<0.05).TBARS showed significant drop (6.4 ± 1.10 MDA nM / mg protein; control: 11.4 ±
1.04 nM MDA / mg protein, p<0.05) as well as PCs (7.74 ± 0.31 nM / mg protein; control: 9,
07 ± 0.52 nM / mg protein, p<0.01). Significant low levels of TRAP was observed (0.95 ±
0.07 µ M Trolox; control: 1.24 ± 0.06 µ M Trolox, p<0,05), to CAT activity (0.27 ± 0.01 abs /
mg protein; control: 0.39 ± 0.01 abs / mg protein, p<0,001) and to SOD activity (0.92 ± 0.05
USOD/mg protein) when compared to 6 hours group, (1.34 ± 0.09 USOD / mg protein,
p<0.05). In conclusion, the oxidative stress was observed after 24 hours of irradiation. In this
period we demonstrated increasing on lipid peroxidation probably due to ROS, for the
accumulation of hydrogen peroxide as consequence of superoxide anion dismutation by
SOD and consumption of antioxidants defenses. We suggested that experiments with acute
dose of UVB are viable for tests with antioxidants drugs, considering the installation time of
oxidative stress after 24 hours of irradiation. After 6 hours, the antioxidants mechanisms
showed efficient.
Key Words: Skin. Oxidative stress. ROS. Antioxidants. UVB. Acute irradiation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Desenho esquemático das camadas da pele e seus componentes ........ 14
Figura 2- Penetração dos raios UVA e UVB nas camadas da pele......................... 19
Figura 3- Fontes de espécies reativas na pele e mecanismos de defesa............... 20
Figura 4- Formação das principais espécies reativas na pele provocada pela
radiação UV e sua inativação pelos sistemas antioxidantes da pele ....... 26
Figura 5- Caixa de irradiação................................................................................... 34
Figura 6- Remoção da pele do dorso do camundongo após sacrifício.................... 36
Figura 7- Gráfico representativo do TRAP, mostrando a emissão de fótons pelo
n
o
de leituras ............................................................................................ 39
Figura 8- Aspecto da pele do dorso do camundongo.............................................. 42
Figura 9- Fotomicrografia mostrando alterações histológicas após a irradiação
da pele por UVB....................................................................................... 43
Figura 10-Avaliação dos níveis de hidroperóxidos lipídicos por quimiluminescência
dos homogenatos de pele dos camundongos irradiados ....................... 44
Figura 11-Quantificação dos níveis de TBARS na pele de camundongos
irradiados................................................................................................ 45
Figura 12-Quantificação de PCs dos homogenatos de pele de camundongos
irradiados................................................................................................ 46
Figura 13-Quantificação dos níveis de TRAP dos homogenatos de pele de
camundongos irradiados......................................................................... 47
Figura 14-Atividade da SOD nos sobrenadantes de pele de camundongos
irradiados................................................................................................ 48
Figura 15-Atividade da CAT nos sobrenadantes de pele de camundongos
irradiados................................................................................................ 49
Figura 16-Mecanismo de formação de lipoperóxidos de membrana e de
aldeídos de baixa massa molecular como o MDA.................................. 52
Figura 17-Principais alterações observadas na pele de camundongos após 6
horas da irradiação aguda por UVB........................................................ 55
Figura 18- Principais alterações observadas na pele de camundongos após 24
horas da irradiação aguda por UVB........................................................ 57
LISTA DE SIGLAS
ABAP: 2,2-azo-bis(2-amidinopropano diidroclorido)
AP-1: proteína ativadora 1
Bax: proteína pro-apoptótica
Bcl-2: proteína oncogênica que inibe apoptose
BHT: butilato de hidroxitolueno
CAT: catalase
COX-II: ciclooxigenase II
DNPH: dinitrofenil hidrazina
DTNB: ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico
eNOS: óxido nítrico sintase endotelial
EROs: espécies reativas de oxigênio
ERNs: espécies reativas de nitrogenio
GSH: glutationa reduzida
GSH-Px: glutationa peroxidase
GSH-Rd: glutationa redutase
GSSG: glutationa oxidada
GT: glutationa total
HCl: ácido clorídrico
HCLO: ácido hipocloroso
H
2
SO4: ácido sulfúrico
H
2
O: água
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
I CAM-1: molécula de adesão intercelular
IE: índice de estresse
IFN-γ: interferon gama
IL: interleucina
IκB: subunidade do NF- κB
iNOS: óxido nítrico sintase indutível
J: joule
KCl: cloreto de potássio
KH
2
PO
4
L
●
: radical de ácido graxo
LOO
●
: radical peroxil
LO
●
: radical alcoxil
LOOH : peróxido orgânico
MDA: dialdeído malônico
Mn-SOD: manganês superóxido dismutase
MPO: mieloperoxidase
mtDNA: ácido desoxi-ribonucléico mitocondrial
NaCl: cloreto de sódio
NAOH: hidróxido de sódio
NACO
3
: carbonato de sódio
NA
2
HPO:
monoidrogenofosfato de sódio
NK: Natural Killer
NF- κB: fator nuclear Κapa B
NMF: fator natural de hidratação
NO
•
: óxido nítrico
NOS: óxido nítrico sintase
NTB: ácido 2-nitro-5-tiobenzóico
1
O
2
: oxigênio singlet
·
O
2
-
: ânion radical superóxido
•
OH: radical hidroxil
ONOO
-
: peroxinitrito
PCs: proteinas carbonílicas
PCA: ácido pirrolidino carboxílico
p21: proteína reguladora do ciclo celular
p53: gene supressor de tumor
QL: quimiluminescência
SOD: superóxido dismutase
SBCs: células queimadas do sol
TCA: ácido tri-cloro acético
TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TNF-α: fator de necrose tumoral α
TRAP: capacidade antioxidante total
Ub: ubiquitina
URL: unidade relativa de luz
USOD: unidades de SOD
UV: ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12
1.1 A PELE ................................................................................................................ 12
1.1.1 Estrutura básica da pele ................................................................................. 13
1.1.2 Epiderme......................................................................................................... 14
1.1.3 Derme.............................................................................................................. 16
1.2 FATORES RESPONSÁVEIS PELO ESTRESSE OXIDATIVO NA PELE .............................. 17
1.3 BALANÇO REDOX NA PELE..................................................................................... 21
1.4 FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS NA PELE PROVOCADA PELA RADIAÇÃO UV ....... 23
1.5 EFEITOS OXIDATIVOS DA RADIAÇÃO UV NA PELE ................................................... 26
1.6 MANIFESTAÇÕES AGUDAS E CRÔNICAS NA PELE APÓS RADIAÇÃO UV ..................... 28
2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 31
2.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................................. 31
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................................... 31
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 32
3.1 REAGENTES.......................................................................................................... 32
3.2 ANIMAIS ............................................................................................................... 33
3.3 FONTE DE IRRADIAÇÃO UVB.................................................................................. 33
3.4 RETIRADA DA PELE DOS ANIMAIS E PREPARO DO HOMOGENATO ............................... 35
3.5 QUIMILUMINESCÊNCIA INDUZIDA POR TERT-BUTIL HIDROPERÓXIDO .......................... 36
3.6 QUANTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO ............... 37
3.7 DOSAGEM DE PROTEÍNAS CARBONÍLICAS ............................................................... 37
3.8 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL POR QUIMILUMINESCÊNCIA... 38
3.9 ATIVIDADE DA CATALASE ...................................................................................... 39
3.10 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE............................................................... 40
3.11 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS ............................................................... 40
3.12. ANÁLISE HISTOLÓGICA ....................................................................................... 40
3.13. ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................... 41
4 RESULTADOS...................................................................................................... 42
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA ..................................................................................... 42
4.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA .......................................................................................... 42
4.3 ESTRESSE OXIDATIVO NA PELE.............................................................................. 44
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 50
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 58
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 60
REFERÊNCIAS........................................................................................................ 61
12
1 INTRODUÇÃO
Os raios ultravioleta do tipo A e B (UVA e UVB), são os principais
responsáveis pela maioria das lesões cutâneas devido à excessiva exposição à
radiação solar. As manifestações da exposição aguda incluem eritema e queimadura
solar. A exposição crônica leva ao envelhecimento e é considerada um dos agentes
mais importantes para o desenvolvimento de doenças cutâneas malignas (PODDA
et al., 1998; SAIJA et al., 2000).
A exposição dos seres humanos à radiação ultravioleta (UV) causa grande
preocupação devido aos vários relatos sobre os efeitos nocivos causados pela
exposição solar. Estudos epidemiológicos revelam que pessoas que trabalham sob
exposição solar apresentam maior incidência de problemas de pele, desde a
formação de rugas até o desenvolvimento de câncer (HARRIS, 2005).
Considerando que poucos tecidos no corpo estão sujeitos ao estresse
oxidativo como a pele (KOHEN; GATI, 2000), muitos autores sugerem o efeito
benéfico dos antioxidantes tópicos, que seriam uma opção para diminuir os danos
neste órgão mediados pela radiação UVB (CASAGRANDE et al., 2006).
O modelo experimental de irradiação aguda por UVB é muito utilizado para
evidenciar as propriedades antioxidantes de fármacos (WIDYARINI et al., 2001).
Neste trabalho utilizamos este mesmo modelo, procurando avaliar os aspectos do
balanço entre a formação de espécies reativas e as variações no sistema
antioxidante endógeno enzimático e não enzimático. Foram caracterizados os
padrões oxidativos relevantes do modelo, que poderão contribuir com futuras
pesquisas que utilizam esse protocolo experimental.
1.1 A PELE
A pele é uma estrutura complexa, composto por vários tipos celulares e
estruturas interdependentes, que funcionam como uma barreira, com o objetivo de
proteger os órgãos internos dos agressores ambientais (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005; GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007).
13
A principal diferença entre a pele e demais sistemas epiteliais é o fato dela
estar exposta a um ambiente externo extremamente agressivo, ao passo que a
epiderme que reveste os órgãos internos está protegida, por exemplo, da radiação
solar, poluição, agentes químicos, etc (HARRIS, 2005; GUARATINI; MEDEIROS;
COLEPICOLO, 2007).
Devido à sua estrutura complexa, a pele pode exercer diferentes funções
como, manutenção de sua própria integridade e da integridade do organismo,
proteção contra agressões e agentes externos, absorção e secreção de líquidos,
controle de temperatura, barreira à prova d’água, metabolismo de vitamina D,
funções estéticas e sensoriais e proteção contra a radiação UV (HARRIS, 2005;
KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005;).
1.1.1 Estrutura básica da pele
A pele ou tegumento cutâneo reveste externamente o corpo, variando em
espessura e cor nas diferentes regiões, assim como na presença de pêlos,
glândulas e unhas, possuindo um padrão de estrutura básica. Além disso, a pele
recebe um grande suprimento de rede de vasos provenientes dos músculos e tecido
adiposo (HARRIS, 2005).
Resumidamente, a superfície externa da pele é formada por um epitélio
pavimentoso estratificado, denominada epiderme. A epiderme é sustentada e nutrida
por uma camada espessa de tecido conjuntivo denso, fibro-elástico, denominado
derme, que é ricamente vascularizada e possui numerosos receptores sensoriais. A
derme está ligada aos tecidos subjacentes por uma camada de tecido conjuntivo
frouxo, hipoderme ou camada subcutânea e que contém quantidade variável de
tecido adiposo. Os folículos pilosos, glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas e
unhas são anexos cutâneos em virtude de sua origem embrionária a partir de
brotamentos que originando-se na epiderme, penetram na derme e hipoderme
(Figura 1) (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
14
Figura 1. Desenho esquemático das camadas da pele e de seus componentes.
Fonte: Kumar, Abbas e Fausto (2005).
1.1.2 Epiderme
A epiderme é a camada mais externa, compactada, impermeável e não
possui um sistema de irrigação sanguínea direta, sendo que os nutrientes são
transportados por capilaridade (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A epiderme é constituída por quatro camadas distintas (estrato córneo,
estrato granuloso, estrato espinhoso e estrato basal). A camada basal é constituída
por células matrizes (steam cells) e células proliferativas, que são células
germinativas, que darão origem aos queratinócitos e melanócitos (Figura 1)
(KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Os queratinócitos sofrem alterações conforme passam de uma camada a
outra durante o processo de maturação até serem eliminados e na medida em que
as camadas mais superficiais são eliminadas, as mais profundas (camada basal) são
restauradas. O processo de renovação demanda um período de aproximadamente
duas a três semanas (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2007).
15
O principal componente da epiderme é o queratinócito, célula especializada
que, além de produzir queratina, sofre um processo de estratificação ou
queratinização, gerando os corneócitos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
A parte superior da epiderme (estrato córneo) é o resultado final de um
processo que consiste em uma matriz de queratina (células mortas), que formam
uma barreira protetora efetiva. Estas células são constantemente perdidas e
renovadas (Figura 1) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
O estrato córneo é a barreira mais importante para a penetração de espécies
químicas através da pele. Os corneócitos são envoltos por um envelope protéico,
embebidos numa matriz lipídica. A camada lipídica é formada por ligações ésteres
entre os resíduos glutamato e hidroxiceramidas. O principal componente do
envelope protéico é uma proteína denominada involucrina (HARRIS, 2005).
Os corneócitos revestidos pela involucrina, na pele saudável, possuem altas
concentrações (até 10% de seu peso seco) de fator natural de hidratação (NMF),
composto por moléculas de baixo peso molecular, higroscópicas e que se ligam à
água, prevenindo sua evaporação. São principalmente aminoácidos, como os ácidos
pirrolidono-carboxílico (PCA), um potente umectante ou ácido urocânico, absorvente
de raios UV. Também constituem o NMF o ácido lático e a uréia (HARRIS, 2005).
O fator natural de hidratação é produzido pela degradação da profilagrina,
proteína insolúvel produzida pelos queratinócitos do estrato espinhoso e do estrato
granuloso. Durante a degradação da profilagrina ocorre a liberação dos aminoácidos
histidina e glutamina formando o ácido pirrolidono-carboxílico (HARRIS, 2005).
Na epiderme, a enzima histidina desaminase é responsável pela síntese do
ácido urocânico a partir do aminoácido histidina. A atividade desta enzima e os
níveis de ácido urocânico se elevam após estímulo cutâneo com UV. É provável que
o suor também tenha ação fotoprotetora, porque tem grande quantidade de ácido
urocânico (BICKERS; ATHAR, 2006).
A epiderme possui ainda outros tipos celulares como os melanócitos, as
células de Langerhans e as células de Merkel. É transpassada pelas estruturas dos
anexos invaginados na derme, os folículos pilossebáceos e as glândulas
sudoríparas (HARRIS, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Os melanócitos (Figura 1) são células dendríticas que se originam a partir da
crista dos neurônios, com a função de produzir melanina, um pigmento que pode
16
variar do amarelo ao marrom ou preto, responsável pelas diferentes tonalidades da
pele (SCOTT et al., 2001; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A melanina é um dos filtros solares mais perfeitos que existem, pois absorve
radiações de 250 a 1200 nm, protegendo as células basais dos efeitos nocivos da
radiação UV. Por isso, indivíduos com menor capacidade de produção de melanina
são mais propensos à manifestação de câncer de pele. Em função da exposição à
radiação UV, o organismo aumenta a atividade dos melanócitos, observando-se uma
quantidade aumentada de melanina na pele e conseqüentemente, seu
escurecimento (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; GUARATINI; MEDEIROS;
COLEPICOLO, 2007).
1.1.3 Derme
A derme, parte estrutural do tegumento do corpo, é formada por tecido
conjuntivo, responsável, parcialmente, pela termorregulação, pelo suporte da rede
vascular e pela defesa imunológica em associação com as células de Langerhans
da epiderme (Figura 1) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Dentro da derme, além dos apêndices da epiderme (pêlos, glândulas
sudoríparas e sebáceas), há também vasos sanguíneos, nervos e componentes
celulares contendo células matrizes, fibroblastos, miofibroblastos; mastócitos e
macrófagos, sustentados por uma rede fibrosa de tecido conectivo, contendo
elastina, colágeno e proteoglicanas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Uma das proteínas extracelulares mais importantes do corpo humano é o
colágeno, constituído por uma família de proteínas e são os componentes fibrilares
principais dos tecidos conectivos. Na pele humana, as fibras de colágeno formam
uma grande massa de matriz extracelular e representam 70% a 80% do peso da
derme (HARRIS, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A síntese do colágeno depende da produção do protocolágeno, um
precursor insolúvel secretado pelos fibroblastos no meio intracelular. Várias etapas
bioquímicas ocorrem para garantir a formação das fibras de colágeno, uma delas é a
hidroxilação dos resíduos de lisina e prolina, a qual apresenta-se dependente da
presença de oxigênio, ferro e vitamina C (HARRIS, 2005).
17
As fibras elásticas são responsáveis pelas propriedades retráteis da pele.
Apesar de fortemente associadas ao colágeno, em peles normais, são constituintes
minoritários da derme (2% a 4%). São sintetizadas nos fibroblastos e compõem-se
de microfibrilas (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Formando o meio para os constituintes celulares e fibrosos da derme, a
substância de cimentação (matriz extracelular) é um gel aquoso, constituído
basicamente de fibronectina e glicosaminoglicanas, que são ácido hialurônico,
sulfato de condroitina e sulfato de dermatana, os quais são sintetizados pelos
fibroblastos e possivelmente, pelas células musculares e mastócitos (HARRIS, 2005;
KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Além de fornecer meio para a acomodação de células e fibras, a matriz
extracelular serve ainda para o transporte de água e eletrólitos e está intimamente
relacionada à permeabilidade e osmolaridade intersticial dos fluidos (HARRIS,
2005).
1.2 FATORES RESPONSÁVEIS PELO ESTRESSE OXIDATIVO NA PELE
O estresse oxidativo é um fenômeno que ocorre quando há um desequilíbrio
entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) e
as defesas antioxidantes, podendo resultar tanto na diminuição destas defesas
quanto no aumento da formação de EROs e ERNs (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2007).
A pele está continuamente exposta a uma combinação de fatores, tais como
agentes químicos, físicos e microbiológicos, muitos dos quais induzem a formação
de EROs e ERNs (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007; CASAGRANDE
et al., 2006), ficando a pele sujeita ao estresse oxidativo por fontes endógenas e
exógenas.
As principais fontes endógenas são as enzimas que podem, indiretamente,
produzir EROs. A enzima xantina oxidase, a qual converte xantina a ácido úrico,
também converte oxigênio a radical superóxido (
●
O
2
-
) durante este processo e a
enzima óxido nítrico sintase que pode produzir radicais do óxido nítrico (NO
●
)
18
diretamente na pele (KOHEN; FANBERSTEIN; TIROSHI, 1997; KOHEN, 1999;
KOHEN; GATI, 2000).
Outros processos de fonte endógena de EROs são a ativação das células do
sangue durante o processo inflamatório, como os neutrófilos e durante a isquemia-
reperfusão, cuja formação de alta produção de EROs resulta em danos oxidativos
(KOHEN; FANBERSTEIN; TIROSHI, 1997; KOHEN, 1999; KOHEN; GATI, 2000).
São consideradas fontes exógenas o ar poluente, gases naturais deletérios,
ozônio, alta concentração de oxigênio, radiação ionizante e não-ionizante, invasão
de bactéria patogênica, vírus e toxina exógena. A pele também pode sofrer danos
oxidativos por lesões físicas (KOHEN; FANBERSTEIN; TIROSHI, 1997; KOHEN;
GATI, 2000).
Ademais, as agressões externas incluem agentes químicos (ex. cremes,
loções, desodorantes e cosméticos de modo geral), águas contaminadas (ex. cloro,
metais dissolvidos), e agentes excretados no suor, como os metais de transição
(ferro, cobre), capazes de catalisar reações com radicais livres e de estimular o
crescimento bacteriano (GUTTERIDGE et al., 1985; ATHAR, 2002).
A radiação UV é o agente físico mais descrito responsável pela maioria das
lesões cutâneas devido a excessiva exposição a radiação solar e conseqüente
formação de radicais livres. As manifestações da exposição aguda incluem eritema e
queimadura solar. A exposição crônica é considerada um dos agentes mais
importantes para o desenvolvimento de doenças cutâneas malignas e o
envelhecimento (ARMSTRONG; KRICKER, 2001; MORÊTE; RODRIGUES; PINTO
2002; BICKERS; ATHAR 2006).
A radiação UV provoca reações fotoquímicas. Ao alcançarem a pele, essas
ondas penetram diferentemente, interagindo com as células da epiderme e da
derme, conduzindo a processos degenerativos. Tais reações podem estimular a
produção de melanina, cuja manifestação é visível sob a forma de bronzeamento da
pele, ou pode levar desde a produção de simples inflamações até graves
queimaduras (KVAM; DAHLE, 2003; HARRIS, 2005).
Os raios solares contêm a radiação ultravioleta A, B e C. Os raios UVC
incidem num comprimento de onda entre 180 e 290 nm, os UVB entre 290 e 320 nm
e os UVA entre 320 e 400 nm. As UVA e UVB estimulam a formação de radicais
livres e podem provocar o estresse oxidativo. Esta estimulação é dependente da
penetração nas camadas da pele (Figura 2) (SCOTT et al., 2007).
19
Ao observarmos os efeitos do UV solar, temos que considerar não apenas a
resposta cutânea dentro de cada comprimento de onda, mas também a quantidade
de energia solar que existe nos respectivos comprimentos de onda. Por exemplo,
embora a pele responda violentamente com formação de eritema em 290nm,
apenas 0,8% da energia solar total, que chega à Terra, está dentro desse
comprimento de onda (KIRCHHOFF et al., 2000).
A radiação UVB (280-320 nm) é o agente físico mais descrito como formador
de radicais livres na pele (ARMSTRONG; KRICKER, 2001; BICKERS; ATHAR,
2006), e embora exista muito mais UVA do que UVB no espectro solar, a UVB é
1000 vezes mais eficaz em produzir eritema do que a UVA. A UVB requer de 2,0 a
5,0J/cm
2
para produzir uma dose mínima eritematosa, e o eritema atinge máxima
intensidade de seis a 20 horas após a exposição (YING; PARRISH; PATHAK, 1974).
Figura 2: Penetração dos raios UVA e UVB nas camadas da pele.
Fonte: Adaptado Fuchs (1998).
Dentre as EROs formadas na pele , podemos destacar o radical hidroxil
(
●
OH), ânion superóxido (
●
O
2
-
), os radicais peroxil e alcoxil (LOO
●
e LO
●
), o oxigênio
singlet (
1
O
2
), e os peróxidos de hidrogênio (H
2
O
2
) e orgânicos (LOOH). Além das
EROs, também estão envolvidos em processos redox outras espécies
intermediárias, as ERNs, tais como NO
●
,
peroxinitrito (ONOO
-
) e espécies reativas
20
de enxôfre, com importância biológica significativa (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2007).
Essas espécies são fundamentais em diversos processos fisiopatológicos e
bioquímicos, mantendo a sobrevivência e a homeostase celular, com um equilíbrio
refinado entre sua formação e remoção. Porém, quando há alterações acentuadas
neste equilíbrio, um estado pró-oxidante é gerado, levando, assim, ao chamado
estresse oxidativo (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007).
No que diz respeito à remoção das espécies reativas, vários mecanismos de
defesas antioxidantes foram desenvolvidos durante o processo de evolução dos
seres humanos (KOHEN; GATI, 2000). Na pele, as células possuem mecanismos
enzimáticos de resposta rápida, bem como moléculas antioxidantes de baixo peso
molecular para contrabalançar o efeito deletério causado pelo estresse oxidativo,
como apresentado na figura 3 (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007).
Portanto, o equilíbrio entre a formação e a remoção das espécies reativas na
pele pode sofrer ação dos agentes exógenos ou endógenos, induzindo um estado
de estresse oxidativo, o qual pode ser combatido pelos sistemas antioxidantes
presentes no tecido cutâneo (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007).
Figura 3. Fontes de espécies reativas na pele e mecanismos de defesa.
Fonte: Guaratini, Medeiros e Colepicolo (2007).
21
1.3 BALANÇO REDOX NA PELE
O sistema antioxidante cutâneo é formado por substâncias enzimáticas e
não-enzimáticas. Dentre os antioxidantes enzimáticos, destacam-se a glutationa
peroxidase (GSH-Px), a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD) (KOHEN;
FANBERSTEIN; TIROSH, 1997). As enzimas antioxidantes constituem o principal
mecanismo de defesa intracelular, por prevenirem as reações em cadeia dos
radicais livres pela diminuição na concentração disponível destes para iniciar o
processo oxidativo (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
A SOD contribui para um dos mecanismos antioxidantes mais eficientes,
catalisando a dismutação do radical
●
O
2
-
em H
2
O
2
na presença de próton H
+
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007) e evita os danos que poderiam ser causados
por este radical. Diversos tipos de SOD são descritos na literatura, alguns estão
localizados no citosol, em organelas celulares específicas e extracelularmente, em
sítios ativos que podem conter diferentes íons, como cobre, zinco, manganês ou
ferro (FRIDOVISH, 1998).
A CAT e a GSH-Px são as principais responsáveis pela remoção imediata de
H
2
O
2
. A CAT encontrada em todos os órgãos do corpo, especialmente nos
hepatócitos e eritrócitos, está presente em grandes concentrações nos
peroxissomos e em baixas concentrações nas mitocôndrias, catalisando a
decomposição específica de H
2
O
2
, gerando moléculas de água e oxigênio (O
2
)
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007; FRIDOVISH, 1998).
2 H
2
O
2
CAT
2H
2
O + O
2
A GSH-Px, por sua vez, é fundamental no metabolismo de H
2
O
2
e de outros
peróxidos, pois catalisa reações de doação de elétrons, no qual se utiliza da
glutationa reduzida (GSH) como agente redutor, formando a glutationa oxidada
(GSSG) (ROVER et al, 2001).
H
2
O
2
+ 2 GSH
GPx
2H
2
O + GSSG
LOOH + 2 GSH
GPx
2H
2
O + GSSG + LOH
22
A GSH é um tripeptídeo formado pelos aminoácidos glicina, cisteína e ácido
glutâmico. Sua capacidade redutora é determinada pelo grupamento tiol–SH
presente na cisteína (MATSUBARA; MACHADO, 1991). Quando a GSH é oxidada
pela reação da GSH-Px, há a interligação de duas moléculas do tripeptídeo por uma
ponte dissulfeto, com formação de GSSG. A queda nos níveis de GSH pode
prejudicar as defesas celulares contra a ação tóxica dos radicais livres. As células
íntegras mantêm uma razão GSH/GSSG alta. Para isso, a GSSG formada é
reduzida novamente a GSH à custa de NADPH, pela ação da enzima glutationa
redutase (GR) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
GSSG + NADPH + H
+
GR GSH + NADP
+
Os antioxidantes não enzimáticos ou de baixo peso molecular, também
contribuem com a manutenção do balanço redox celular. Nesta classe, incluem-se
um vasto número de compostos, sintetizados in vivo ou obtidos exogenamente, que
previnem danos oxidativos por interações diretas ou indiretas com as EROs/ERNs
(BIALY et al., 2002). Dentre os antioxidantes de baixo peso molecular que protegem
a pele contra as EROs, incluem o ascorbato, glutationa, tocoferol e ubiquinol
(PODDA, et al., 1998).
Dentre as substâncias endógenas, podemos destacar alguns hormônios,
como estradiol e estrógeno, que apresentam atividade antioxidante semelhante à
vitamina E, devido, provavelmente, à sua porção fenólica, comum a ambas as
moléculas (KVAM; DAHLE, 2003). A melatonina, reguladora do relógio biológico nos
mamíferos também apresenta atividade antioxidante, provavelmente, devido à
desidrogenação do grupamento–NH da sua estrutura, além de induzir a síntese de
antioxidantes enzimáticos in vivo como a glutationa peroxidase (SLOMINSKI et al.,
2002). Destacam-se, também, o ácido lipóico, um cofator essencial em vários
complexos enzimáticos que apresenta atividade antioxidante e que pode atuar como
regenerador de forma oxidadas de glutationa; ascorbato e a-tocoferol; bem como a
melanina, um pigmento formado pela oxidação e polimerização da tirosina, com
papel antioxidante, protegendo a pele principalmente contra
●
O
2
-
e LOO
●
(KVAM;
DAHLE, 2003).
Além de todo o sistema antioxidante endógeno exemplificado, a pele conta
ainda com um eficiente mecanismo de reparo, caso os danos já tenham ocorrido,
23
envolvendo enzimas e substâncias de baixo peso molecular (KROKAN, STANDAL,
SLUPPHAUG, 1997; ICHIHASHI et al., 2003).
Em especial, a pele submetida à radiação UV conta com a proteção natural
de cada indíviduo, que pode ser atribuída:
- ao processo de queratinização que condiciona a espessura e a coesão da
camada córnea;
- ao acúmulo cutâneo e subcutâneo de carotenos, pelo ácido urocânico;
- à pigmentação melânica constitucional promovida, exclusivamente, pela
eumelanina, a qual dispersa, absorve e transforma a energia fotônica em calor ou
vibração e é também um captador de radicais livres (MORÊTE; RODRIGUES;
PINTO, 2002).
1.4 FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS NA PELE PROVOCADA PELA RADIAÇÃO UV
Sugere-se que as radiações UVA e UVB são responsáveis pela diminuição
de sistemas antioxidantes cutâneos, bem como pelo aumento de sistemas
oxidantes, alterando assim o balanço redox celular e conseqüentemente a
homeostasia cutânea (YASUI; SAKURAI, 2000).
Contudo, os danos causados a pele pela indução do estresse oxidativo são
altamente controlados devida a rápida eliminação das EROs, pelos mecanismos
antioxidantes eficientes da pele (KOHEN; FANBERSTEIN; TIROSHI, 1997; KOHEN;
GATI, 2000).
Embora o sistema antioxidante da pele seja muito eficiente, a radiação UV
pode provocar lesão celular pela formação de radicais livres, por meio dos
mecanismos descritos a seguir:
1 - As interações entre as ondas provenientes da radiação solar e a pele
podem ocorrer por meio de ação direta da radiação sobre as estruturas
celulares, como faz a UVB ou UVA (HARRIS, 2005). O
1
O
2
, uma espécie
eletronicamente excitada, pode ser produzida por diversas reações
químicas e fotoquímicas e devido a sua eletrofilicidade, pode reagir com
compostos insaturados, sulfetos e aminas, sendo os ácidos graxos
24
insaturados, DNA e proteínas importantes alvos biológicos (Figura 4)
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
2 - Os danos na pele, provocados pela radiação aguda por UVB, podem
acontecer também de forma indireta, provavelmente resultado do
aumento de radicais livres produzidos durante a resposta inflamatória
imediata com eritema e infiltrado de leucócitos (CASAGRANDE et al.,
2006).
Os neutrófilos ativados por citocinas pró-inflamatória, geram
●
O
2
-
por
uma reação catalisada pela enzima NADPH oxidase. No neutrófilo, a
SOD catalisa a dismutação do
●
O
2
-
em
H
2
O
2
, a partir do qual podem ser
gerados
●
OH e ácido hipocloroso (HClO). O
●
OH é produzido por meio
de uma reação que requer Fe
2+
, também conhecida como reação de
Haber-Weiss. O HClO é gerado a partir de uma reação catalisada pela
mieloperoxidase (MPO), a partir do qual, podem ser formados derivados
altamente tóxicos, as cloroaminas (Figura 4) (SHINDO; WITT; PACKER,
1993; VINTEN-JOHANSEN, 2004).
Ainda durante as repostas inflamatórias o NO
●
desempenha importante
papel como componente vasodilatador e na modulação das respostas
imunes na pele. O NO
●
na presença de
●
O
2
forma o ONOO
-
que pode
provocar danos oxidativos na pele (Figura 4) (FUCHS et al., 2001).
3 - As espécies reativas podem ser formadas, ainda, indiretamente, por
reações da luz com fotossensibilizadores endógenos cutâneos, como por
exemplo, o ácido urocânico (BICKERS; ATHAR, 2006). Como resultado
da sensibilização endógena pode ocorrer a produção do
●
O
2
-
ou
1
O
2
(Figura 4) (MARTIN; BURCH, 1990).
Substâncias exógenas aplicadas sobre a pele, na forma de cosméticos
ou drogas fotossensibilizadoras ingeridas que atingem a pele, incluindo
alguns fenotiazínicos (usado em tranqüilizantes), como também as
fluoroquinolonas e os antibióticos (tetraciclinas), podem promover a
geração de
1
O
2
,
●
OH e outras espécies reativas de oxigênio, com efeitos
nos queratinócitos da epiderme e células de Langerhans (Figura 4)
(MAGLIO et al., 2005).
25
4 - Moléculas oxidantes também podem ser geradas devido aos danos
na mitocôndria pela radiação UVB, produzindo
●
O
2
-
, H
2
O
2
e
●
OH
(WELLER et al, 2003).
5 - Uma outra situação é que, apesar da luz UV não depositar energia
suficiente nas moléculas de água para ionizá-las, se H
2
O
2
estiver
disponível, a UVB causa fissão homolítica, gerando o radical hidroxil
(
·
OH), altamente reativo (Figura 4) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
H
2
O
2
·
OH +
·
OH
6 - Outro mecanismo de formação de espécies reativas foi sugerido por
Heck et al. (2003), quando identificaram uma catalase presente em
queratinócitos capaz de formar EROs em resposta a radiação UV, em
especial UVB. Usando cromatografia de troca iônica, afinidade metálica
e exclusão de tamanho, uma proteína de 240 kDa e capacidade de gerar
EROs foi isolada de cultura de queratinócitos previamente submetidos à
irradiação UVB. A proteína exibiu grande absorção na extensão de 320 a
360nm com pico adicional entre 400 e 410 nm, sugerindo a presença do
grupamento heme. Seqüenciamento usando cromatografia líquida iônica
acoplada à espectrometria de massa identificou a proteína como
catalase. Observações que os efeitos da luz UVB na catalase são
altamente sensíveis ao pH e dependentes de oxigênio, mas que não
requerem substratos adicionais, sugerem que as EROs podem ser
formadas pela transferência de fótons derivados da água que
subseqüentemente interagem com o oxigênio molecular (Figura 4).
26
Membrana plasmática
Mecanismos
1 – 2 – 3 – 4 – 5 – 6
ESTRESSE OXIDATIVO
Arginina
Citrulina
SOL
Membrana plasmática
Mecanismos
1 – 2 – 3 – 4 – 5 – 6
ESTRESSE OXIDATIVO
Arginina
Citrulina
SOL
Figura 4. Formação das principais espécies reativas na pele, provocada pela radiação UV e sua
inativação pelos sistemas antioxidantes da pele.
Fonte: Adaptado Bickers e Athar (2006).
1.5 EFEITOS OXIDATIVOS DA RADIAÇÃO UV NA PELE
Lesões oxidativas são produzidas quando os radicais livres atacam os
próprios constituintes celulares, numa reação típica de oxirredução. Os radicais
livres atacam os principais constituintes celulares, como os lipídeos das membranas
celulares, as proteínas estruturais e enzimas e o próprio DNA. Os constituintes
celulares são oxidados e degradados através de reações em cadeia, quando são
formados novos radicais livres intermediários que atacam outros compostos
sucessivamente, causando lesões nas estruturas celulares (HARRIS, 2005).
Durante as reações em cadeia, a indução da peroxidação de ácidos graxos
pode induzir à formação de hidroperóxidos lipídicos, que na presença de Fe
2+
,
podem ainda ser oxidados a LO
●
, vindo a sofrer quebra na ligação C--C seguinte e
originar compostos intermediários, aldeídos de baixo peso molecular, dialdeído
malônico (MDA), α-hidroxinonenal e hidrocarbonetos, como etano e n-pentano
(OHKAWA; NOBUKO; YAGI, 1979), que podem atacar grupamento amino de
27
proteína e fosfolipídio, modificando moléculas biológicas (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2007). Os aldeídos formados pela lipoperoxidação podem, ainda,
interagir com o DNA formando adutos que têm sido associados ao câncer.
A peroxidação lipídica traz conseqüências homeostáticas severas para as
membranas atacadas, refletidas, principalmente, na perda de sua integridade,
devido à alteração na sua permeabilidade a íons e pequenas moléculas e perda nas
suas características de fluidez (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Esta agressão
acaba por interferir em mecanismos celulares importantes, incluindo sistemas
enzimáticos, expressão gênica, entre outros (CREMONESE; PEREIRA-FILHO;
MAGALHAES , 2001).
Todos os componentes celulares são susceptíveis à ação das espécies
reativas do oxigênio, porém as membranas biológicas (retículo endoplasmático,
membranas mitocondriais ou plasmáticas) são as mais atingidas em decorrência da
peroxidação lipídica e pode resultar em alterações na organização estrutural,
funcional, enzimática e na permeabilidade das membranas celulares (MELLO
FILHO; HOFFMAN; MENEGHINI, 1984; CECHINI; ARUOMA; HALLIWELL, 1990).
No caso das proteínas, quando há ação das EROs, suas estruturas
secundárias e terciárias são rompidas, com subseqüente aumento de
hidrofobicidade e perda de função.
●
OH é particularmente proteotóxico, pois pode
reagir com o carbono de qualquer aminoácido (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Parte dos danos no DNA é mediada pela formação do
●
OH. Este radical
promove modificação de bases púricas e pirimídicas, muitas das quais são
mutagênicas ou impedem a ação dos processos de regulação e de transcrição
gênica (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Existem muitos relatos sobre os efeitos oxidativos devido à radiação UV.
Tem sido sugerido que a reação das espécies reativas formadas pelas UVA e UVB
com componentes celulares podem resultar em lipoperoxidação, oxidação de
proteínas e de DNA (LINTON; DAVIES; DEAN, 2001; BICKERS; ATHAR, 2006).
Segundo Inal e Kahraman (2000), a exposição prolongada da pele à luz UV
resulta em grande diminuição dos antioxidantes, na formação de EROs e no
aumento dos produtos da lipoperoxidação, responsáveis pelo dano oxidativo da
pele. Essa diminuição do sistema de defesa antioxidante é muito mais grave na
epiderme do que na derme, resultando na supressão do sistema imune, inibição do
reparo no DNA, podendo causar papilomas e carcinomas de células basais.
28
Contrário a todos os relatos sobre a lipoperoxidação pela exposição ao UVB,
Maglio et al. (2005), descreveram uma diminuição da peroxidação lipídica na pele
por doses agudas, mesmo tendo constatado produção mitocondrial de
●
O
2
-
e um
aumento na expressão de iNOS. Este aumento induziria uma via de sinalização
protetora contra a peroxidação lipídica na pele de animais irradiados, como descrito
por outros autores (DELICONSTANTINOS; VILLIOTOU; STAVRIDES, 1996; LEE et
al., 2000; WELLER et al., 2003). Maglio et al. (2005) justificaram que muitos dos
estudos sobre os efeitos da irradiação UVB na pele, nos quais evidenciaram o
estresse oxidativo e a lipoperoxidação, foram realizados em ensaios com cultura de
células, sem levar em consideração os efeitos de fatores sistêmicos. No modelo
utilizado, com camundongo hairless, a resposta inflamatória foi mediada por fatores
como a histamina, prostaglandina e citocinas.
1.6 MANIFESTAÇÕES AGUDAS E CRÔNICAS NA PELE APÓS RADIAÇÃO UV
Provavelmente muitas das doenças na pele provocada pela exposição a
radiação UV é conseqüência da geração de radicais livres e mobilização do metal de
transição ferro, durante as manifestações da exposição aguda ou crônica à radiação
solar. As EROs formadas nestas condições, desempenham um papel importante nas
doenças cutâneas, incluindo a inflamação, carcinogênese na pele, envelhecimento e
danos nas células epiteliais (WHEELER et al.,1986).
Com relação às manifestações da exposição aguda a radiação UV, sabe-se
que tanto os raios UVA quanto os UVB podem induzir ativação de vários fatores de
transcrição nas células da pele, incluindo AP-1 e NF-kB (TYRRELL, 1996). O NF-kB
é um fator sensível ao estresse oxidativo que ativa múltiplos genes envolvidos na
expressão de muitos mediadores pro-inflamatórios, óxido nítrico sintase induzivel
(iNOS) e a ciclooxigenase 2 (COX-2), e de genes envolvidos na regulação do ciclo
celular, proliferação e apoptose (Bax, Bcl2, p53, p.21, etc) (FUCHS, 1998; CARINI,
et al., 2000; BIKERS; ATHAR, 2006), Tem sido sugerido que a modulação do NF-kB,
sensível à redução pelas EROs, é o principal evento na indução de reações
inflamatórias (FUCHS et al., 2001). A ativação de AP-1 e NF-kB, pode ser promovida
por
1
O
2
ou outras espécies reativas de oxigênio (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
29
Kabashima, et al. (2007), relataram que uma única exposição à radiação
UVB (dose de 5 J/cm
2
) em camundongos tricotomizados causa uma importante
inflamação na pele com conseqüente edema após 24 horas da irradiação. O eritema
solar é provocado por uma vasodilatação e aumento do volume sanguíneo na derme
após exposição à radiação solar, sendo reconhecido visualmente como um
vermelhidão da pele. A queimadura solar surge quando a reação de eritema é muito
intensa, acompanhada de calor, dor e edema. A vasodilatação após a exposição por
UV leva ao acúmulo de células inflamatórias como neutrófilos, macrófagos e células
T (KABASHIMA et al., 2007).
De fato, tem sido sugerido que inflamação induzida pela radiação UV é
conseqüência da estimulação de citocinas pro-inflamatórias pelos queratinócitos
(WIDYARINI et al., 2001). Após a exposição pela radiação UV, as citocinas da
superfície celular e os receptores para fatores de crescimento (EGF), fator de
necrose tumoral-a (TNF-a) são ativados (FISHER et al, 2002).
Fuchs et al. (2001) sugeriram que em resposta às citocinas inflamatórias ou
endotoxinas durante a resposta inflamatória, há uma superregulação da iNOS
associada com o aumento da atividade da NOS. Kuhn et al. (1998) demonstraram a
expressão aumentada de iNOS na pele quando exposta a radiação UVB, resultando
em formação excessiva de NO
●
,
que além de provocar lesões oxidativas na pele,
pode estar relacionado com a produção do eritema após a exposição à irradiação
UVB (DELICONSTANTINOS; VILLIOTOU; STAVRIDES, 1995).
Tron et al. (1998), relataram que os efeitos da imunossupressão também são
observados após a irradiação UV. Demonstrou-se em camundongos e humanos que
a pele irradiada por UV é caracterizada por uma perda de epiderme e diminuição
das células de Langerhans e uma infiltração de leucócitos inflamatórios na derme.
Foi observado infiltração de macrófagos na epiderme após 6 horas da irradiação por
UV, acompanhada de produção e secreção de IL-10 após 72 horas e efeitos da
imunossupressão em 24 horas (TRON et al., 1998).
Sobre os efeitos crônicos tem sido relatado que, como resultado da geração
das espécies reativas, ocorre uma alteração no sistema imunológico pela diminuição
da capacidade de eliminar células alteradas, devido a mudanças na produção de
citocinas pelos queratinócitos e outras células cutâneas, por alterações na
expressão de moléculas de adesão e perda de funções celulares. A UVB inibe
também a função das células natural killer (NK) em processos de apoptose e lise
30
celular. Esta última alteração correlaciona-se diretamente com a carcinogênese em
condições de desequilíbrio na expressão do gene p53 (CLYDESDALE; DANDIE;
MULLER, 2001). Desse modo, o UVB pode ser responsável pelo câncer na pele
humana, como os carcinomas de células basais e escamosas, até melanomas
malignos (ARMSTRONG; KRICKER, 2001).
Quanto ao envelhecimento cutâneo sabe-se que grande parte das
transformações cutâneas que eram somente atribuídas ao processo de
envelhecimento cronológico, devem-se entre outros fatores a exposição solar
crônica (HELENIUS et al., 1996). Na pele, a UVB induz a síntese de
metaloproteinases, as quais podem degradar o colágeno e outros componentes do
tecido conectivo. A indução destas enzimas pode ser mediada por AP-1 e NF-kB
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
31
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar os padrões oxidativos na pele, provocados por dose aguda de
irradiação UVB.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a oxidação de lipídeos e proteínas, as alterações dos sistemas
enzimáticos e não enzimáticos, a capacidade antioxidante total e as alterações
morfológicas da pele, provocadas por dose aguda de irradiação UVB, em modelo de
camundongo Swiss tricotomizado.
32
2 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 REAGENTES
Para este estudo foram utilizados os seguintes reagentes:
- Albumina sérica bovina (Sigma);
-2,2-azo-bis-2-amidinopropano diidroclorido (ABAP) (Aldrich);
-BHT (Sigma)
-DNFH (Merck)
-DTNB (Merck)
-EDTA (Reagen)
-Eosina (Merck);
-Etanol (Merck)
-Etil acetato (Merck)
-Éter etílico (Nuclear);
-Guanidina (Sigma)
-KCl (Reagen Quimibrás);
-KH
2
PO
4
(Merck);
-H
2
O
2
(Synth);
-H
2
SO
4
(Quimex);
-Hematoxilina (Merck);
-Luminol (5-Amino-2,3-diidro-1,4-ftalazinadiona, Sigma);
-N
2
(Air Liquide Brasil LTDA);
- n-butanol (Grupo Química)
-NaCl (Reagen Quimibrás);
-Na
2
CO
3
(Merck);
-Na
2
HPO4 (Merck); NaH
2
PO
4
(Merck);
-NaOH (Merck); Pirogalol (Sigma);
-Parafina (Paraplast)
-Reagente fenólico de Folin-Ciocalteus (Merck);
-Terc-butil hidroperóxido (Sigma);
-Tris (Sigma);
33
-Trolox (Aldrich);
-TBA - SIGMA
-TCA (Merck)
-Xilol (Fynth)
3.2 ANIMAIS
O ensaio com animais foi autorizado pelo Comitê de Ética em
experimentação animal da Universidade Estadual de Londrina.
Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando 20-25g,
tricotomizados no dorso por aparelhos Wahl Professional e Panassonic ER389, sem
causar lesão mecânica na pele. Modelos experimentais que utilizam camundongos
tricotomizados, foram anteriormente relatados conforme Lu et al. (2004) e Gorman et
al. (2005), demonstrando ser viável e não limitando o número de ensaios.
Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Ciências
Patológicas, com ciclo claro-escuro de 12 horas, alimentados com ração balanceada
e supridos com água ad libitum.
3.3 FONTE DE IRRADIAÇÃO UVB
A fonte de luz utilizada foi uma lâmpada UVB fluorescente modelo PHILIPS
TL/12 40W, que emite irradiação na faixa de comprimento de onda de 270 a 400 nm
com pico máximo de emissão em torno de 313 nm. A lâmpada foi acoplada a uma
caixa de dimensões 1,30 m X 0,43 m X 0,45 m (Figura 5A). A caixa acomodava 6
gaiolas, com um camundongo em cada uma (Figura 5B). As gaiolas tinham redes
que permitiam a movimentação dos animais, porém garantiam que a irradiação
fosse concentrada no dorso dos mesmos. Irradiância média da lâmpada =
2,3718.10
-4
W/cm
2
, colocada 15 cm acima do animais. Como a irradiância da
lâmpada não era uniforme em toda a sua extensão, as gaiolas foram trocadas de
34
lugar a cada 35 minutos, de modo que todos os camundongos recebessem a
mesma dose de irradiação.
A dose aguda de UVB utilizada (2,98 J/cm
2
) por três horas e trinta minutos,
provocou eritema logo após a irradiação, intensificando-se a partir de seis horas,
estando de acordo com outros autores (DELICONSTANTINOS; VILLIOTOU;
STRAVRIDES, 1996; MAGLIO et al., 2005) Heck et al. (2003), analisaram os efeitos
da luz UVB na geração de oxidantes intracelulares em queratinócitos humanos e
murinos, evidenciando que a luz UVB, numa extensão de 0,1-1,0 J/cm
2
, causou um
aumento acentuado na formação de EROs em ambos os tipos celulares. Esta
resposta foi dependente da dose de luz UVB.
Figura 5. Caixa de irradiação. A - Caixa de irradiação acoplada lâmpada B - Caixa de irradiação
contendo 6 caixas de plástico
35
Os animais foram separados em três grupos:
-Grupo Experimental (grupo 6 horas) – camundongos receberam a dose de
irradiação (2,98 J/cm
2
) durante 3 horas e 30 minutos, e tiveram a pele removida
após 6 horas.
-Grupo Experimental (grupo 24 horas) – camundongos receberam a dose de
irradiação (2,98 J/cm
2
) durante 3 horas e 30 minutos, e tiveram a pele removida
após 24 horas.
-Grupo Controle (Controle) – os camundongos foram submetidos às mesmas
condições dos animais experimentais, portanto colocados na caixa de irradiação, por
3 horas e 30 minutos, sem receber a dose aguda de UVB.
3.4 RETIRADA DA PELE DOS ANIMAIS E PREPARO DO HOMOGENATO
Os grupos controles e experimentais foram sacrificados por deslocamento
cervical. A pele do dorso desses animais (4X3 cm – figura 6A) foi removida (Figura
6B), pesando no total de 600 a 700mg, cortada em pedaços e armazenada em
nitrogênio líquido.
Para as análises, as peles foram homogeneizadas em um aparelho modelo
Van Potter com 2 movimentos de pistilo 5 vezes, por 45 segundos, com intervalos
de 15 segundos, na concentração de 10 mg/mL, para os testes de
quimiluminescência (QL), capacidade antioxidante total (TRAP) e das substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), 30 mg/mL, para o teste de proteínas
carbonílicas (PCs) ou 50 mg/mL, para os testes da atividade da SOD e da CAT, em
tampão de pH apropriado para cada técnica. O homogenato de 50 mg/mL foi
submetido à centrifugação a 10500 x g por 20 minutos a 4°C e o sobrenadante foi
utilizado nas análises. As amostras foram mantidas no gelo durante os
experimentos.
36
Figura 6. Remoção da pele do dorso do camundongo após sacrifício. A -Camundongo tricotomizado
B - Remoção da pele
3.5 QUIMILUMINESCÊNCIA (QL) INDUZIDA POR TERT-BUTIL HIDROPERÓXIDO
Para avaliar o grau de estresse oxidativo prévio da pele, foi utilizado o
método de QL induzida por tert-butil hidroperóxido, descrito por Flecha, Llesuy, e
Boveris (1991), modificado pela adição de hemina (ZAMBURLINI et al.; 1995a;
ZAMBURLINI et al.; 1995b). Os homogenatos foram preparados na concentração de
10 mg de tecido em 1,0 mL de tampão. As amostras (100 µL) foram incubadas com
870 µL de tampão fosfato de potássio monobásico pH 7,4 e 10 µL de hemina 1 mM
a 37ºC por 5 minutos. A reação foi iniciada pela injeção de 20 µL de tert-butil,
preparado no momento do uso e mantido em banho de gelo e ao abrigo da luz. A
emissão de luminescência pela amostra foi determinada em luminômetro Turner
Designs TD-20/20, com resposta entre 300-650nm, durante 2 minutos, em ambiente
de baixa luminosidade. Os resultados foram expressos em Unidades Relativas de
Luz (URL) / mg de tecido.
37
3.6 QUANTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
Os produtos da lipoperoxidação de membrana foram determinados pela
formação de TBARS, segundo BISWAS et al. (1985), modificado por Cecchini,
Aruoma e Halliwell (1990).
Neste trabalho empregou-se uma alteração do método colorimétrico
proposta por Jentzsch et al. (1996), no qual se utiliza butilado de hidroxitolueno
(BHT), para impedir a oxidação do homogenato durante o experimento, garantindo
que a lipoperoxidação observada fosse anterior ao mesmo. As amostras foram
agitadas em vórtex e incubadas no banho-maria 95ºC por 30 minutos. Após
resfriamento em banho gelado, a fase orgânica foi extraída pela adição de n-butanol,
seguido de agitação vigorosa por 40 segundos, centrifugação a 2167 x g por 15
minutos e utilizada para a quantificação espectrofotométrica de TBARS.
A quantificação do cromóforo formado entre o TBA e o MDA foi realizada
pela diferença das absorbâncias a 535 e 572 nm da seguinte maneira:
X = Abs
535nm
– Abs
572nm
X
amostra
– X
branco
= Y
Y x 1000= N nM TBARS/mg proteína
156 x mg proteína/100µL
3.7 DOSAGEM DE PROTEÍNAS CARBONÍLICAS (PCS)
As PCs foram quantificadas de acordo com o método de Reznick e Packer
(1994), que utiliza o método colorimétrico através da reação com a
dinitrofenilhidrazina (DNFH).
Homogenatos de 30mg/mL em tampão fosfato de potássio monobásico
50mM, 1mM EDTA, pH 7,4 foram feitos e submetidos à ação da DNFH. Na
seqüência, foram realizadas precipitações seguidas de proteína com ácido
tricloacético (TCA) 20 e 10%, e tratamento com etanol etil-acetato (1:1 – v/v) para
38
remoção do excesso de DNFH. Os pellets finais foram ressuspendidos em guanidina
6M e um pico de absorvância obtido na leitura da cor amarelada do sobrenadante e
foi lido em espectrofotometria de varredura entre 355-390 nm. Os resultados foram
expressos em nmoles de carbonil/mL/mg de proteínas totais.
3.8 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (TRAP) POR
QUIMILUMINESCÊNCIA
A TRAP foi avaliada conforme descrito por Repetto et al. (1996). Esta
técnica avalia os níveis de antioxidantes totais de um tecido, principalmente
antioxidantes de baixa massa molecular. Neste método, o ABAP, um sistema
gerador de radical alcooxil por decomposição térmica, produz fótons que são
amplificados pelo luminol e medidos em luminômetro (Turner Designs TD 20/20). A
reação é inibida por análogos da vitamina E outros antioxidantes lipossolúveis e
hidrossolúveis
A adição 100µL de homogenato 50mg/mL do miocárdio também diminuiu a
quimiluminescência a níveis basais (tempo de indução, Ti) proporcionalmente a
concentração de antioxidantes até radicais de luminol serem gerados.
O sistema foi calibrado com um análogo hidrossolúvel da vitamina E
(Trolox). Uma comparação do tempo de indução depois da adição de concentrações
conhecidas de Trolox e homogenato permitiu obter valores de TRAP com uma
concentração relativa a concentração do Trolox (Figura 7).
39
Figura 7. Gráfico representativo do TRAP, mostrando a emissão de fótons pelo nº de leituras . A
interseção das retas representa a fase de indução da reação.
Para obtenção do resultado a seguinte equação foi usada:
TRAP (µM Trolox)= D x T
amostra
/T
Trolox
onde:
D - é uma fator de diluição;
T
amostra
- é o tempo de indução da amostra;
T
Trolox
- é o tempo de indução provocado pela adição 1 µM de Trolox.
3.9 ATIVIDADE DA CATALASE (CAT)
A atividade da CAT foi determinada de acordo com o método de Cohen,
Dembiec e Marcus (1970), modificado por Aebi (1984). A absorbância de um padrão
de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), adicionado à água deonizada e a tampão TRIS
HCL 1M pH 8,0 foi lida a 240 nm. Em seguida, 100 µL da amostra do sobrenadante
do homogenato de 50mg/mL foi adicionado ao meio e foi verificada a queda da
absorbância do peróxido de hidrogênio durante 3 minutos. Os resultados foram
expressos em abs/mg proteína/minuto. A decomposição do H
2
O
2
está relacionada
diretamente com a queda da absorbância a 240 nm.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0
200
400
600
800
1000
URL
nº de leituras
ABAP
amostra 1
amostra 2
Trolox
40
3.10 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD)
A atividade da SOD foi determinada de acordo com o método descrito por
Marklund e Marklund (1974), baseado na inibição da autoxidação do pirogalol em
solução aquosa. A SOD inibe a autoxidação do pirogalol por catalisar a dismutação
do
·
O
2
-
em H
2
O
2
. Esta oxidação foi acompanhada pelo aparecimento de cor amarela
no meio de reação, monitorada a 420 nm por 6 minutos. Na reação valores de
sobrenadante (100 µL, 200 µL, 300 µL, 400 µL) do homogenato de 50mg/mL, inibem
a autoxidação do pirogalol. Os resultados representam a relação entre os valores
obtidos das amostras e do controle (pirogalol). A quantidade de SOD capaz de
produzir 50% de inibição da oxidação do pirogalol é definida como uma unidade de
atividade enzimática (U). Os resultados foram expressos em U SOD/mg proteína.
3.11 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
A quantificação de proteínas dos homogenatos foi determinada pelo método
de Lowry et al. (1951) modificado por Miller (1959), utilizando soro albumina bovina
como padrão.
3.12 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Amostras de pele do dorso nos animais foram submetidas a tratamento
histológico. Para tanto, o tecido foi desidratado em concentrações crescentes de
álcool e xilol e embebido em parafina. Os cortes de 5 µm foram feitos utilizando o
micrótomo Reichert-Jung, corados com hematoxilina-eosina e observados em
microscópio óptico.
41
3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados representam a média e erro padrão da média de 6 a 11
animais por grupo. A análise de significância foi realizada pelos testes one-way
ANOVA e Bonferroni como post hoc. Os resultados foram considerados significativos
quando p<0,05. e p<0,01. Para os resultados de QL estimulada por tert-butil a
análise foi avaliada por two-way ANOVA e Bonferroni como post hoc. O programa
Origin 6.0 e GraphPad Prisma 4 foram utilizados para as análises estatísticas.
42
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA
Observou-se eritema 6 horas (Figura 8 B) após a irradiação aguda por UVB,
permanecendo 24 horas após a irradiação (Figura 8 C), comparado ao controle não
irradiado (A).
Figura 8. Aspecto da pele do dorso do camundongo. (A). Antes da irradiação UVB; (B). Após 6 horas
de irradiação UVB; (C). Após 24 horas de irradiação UVB.
4.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Na análise histológica da pele do grupo controle foi observado parênquima
organizado, adipócitos pequenos e ausência de sunburn cells (SBCs), conforme
pode ser observado na figura 9 A. Na análise histológica da pele dos grupos
irradiado 6 e 24 horas, o parênquima estava menos organizado, com presença de
SBCs (Figura 8 B e C).
43
Figura 9. Fotomicrografia mostrando alterações histológicas após a irradiação da pele por
UVB. (A) Pele sem irradiação; (B) após 6 horas da irradiação; (C) após 24 horas da irradiação
(He 100x em A1-B1-C1 e 400x em A2-B2-C2). Em B2 e C2, mostra a ruptura da integridade da
epiderme e a presença de SBCs (setas).
44
4.3 ESTRESSE OXIDATIVO NA PELE
A figura 10 ilustra a quimiluminescência estimulada por terc-butil
hidroperóxido emitida pelos grupos experimentais, refletindo o nível de hidroperóxido
emitida pelo grupo 24 horas. A curva do grupo 6 horas é significativamente menor,
enquanto que a curva do grupo 24 horas mostrou significativamente maior,
comparadas ao grupo controle, com *p< 0.05. Além disso, a comparação entre os
grupos experimentais mostrou significância (
#
p<0,05).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
10
20
30
40
50
60
70
#
*
*
URL(mg tecido)
Tempo (seg)
controle
6 horas
24 horas
Figura 10. Avaliação dos níveis de hidroperóxidos lipídicos por quimiluminescência estimulada por
terc-butil hidroperóxido dos homogenatos de pele de camundongos irradiados. O gráfico representa a
emissão de fótons entre 0 a 80 segundos. As curvas são estatisticamente diferentes. A comparação
foi feita pelo teste two-way ANOVA e Bonferroni como post hoc, são *p<0.05 comparado ao grupo
controle;
#
p<0,05 comparado ao grupo 6 horas (n=6 para os três grupos).
45
Os níveis de TBARS (figura 11), diminuíram significativamente no grupo 6
horas (4,4 ± 1,3 nM MDA/mg proteína) e 24hs (6,4 ± 1,10 nM MDA/mg proteína)
quando comparados ao grupo controle (11,4 ± 1,04 nM MDA/mg proteína) com
*p<0,01 grupo 6 horas e *p<0,05 grupo 24 horas.
controle 6 horas 24 horas
0
2
4
6
8
10
12
*
nM MDA/ mg proteína
GRUPOS
*
Figura 11. Quantificação dos níveis de TBARS dos homogenatos de pele de camundongos
irradiados. Os resultados representam a média ± o erro padrão. Valores de p foram determinados
pelo test one-way ANOVA e Bonferroni como post hoc, são *p<0,01 grupo 6 horas (n=6) e *p<0,05
grupo 24 horas (n=7) quando comparado ao controle (n=12).
46
Os níveis de proteínas carbonílicas (figura 12) diminuíram significativamente
no grupo 6 horas (8.15 ± 0.53 nM/mg proteína) e 24 horas (7,74 ± 0,31 nM/mg
proteína) em relação ao grupo controle (9,07 ± 0,52 nM/mg proteína) com *p <0,05
grupo 6 horas e *p<0,01 grupo 24 horas.
Controle 6 horas 24 horas
0
2
4
6
8
10
*
nM/mg proteína
GRUPOS
*
Figura 12: Quantificação de PCs dos homogenatos da pele de camundongos irradiados. Os
resultados representam a média ± erro padrão. Valores de p foram determinados pelos testes one-
way ANOVA e Bonferroni como post hoc, são *p<0,05 grupo 6 horas (n=6) e *p<0,01 grupo 24 horas
(n=6) quando comparado ao controle (n=7).
47
Os níveis de TRAP (figura 13) foram significantemente elevados no grupo 6
horas (1,50 ± 0,11 µM Trolox) e significativamente diminuídos no grupo 24 horas
(0,86 ± 0,04 µM de Trolox), comparados ao grupo controle (1,18 ± 0,06 µM Trolox)
com *p<0,05. A diferença entre os grupos experimentais mostrou significante com
#
p<0,01.
Controle 6 horas 24 horas
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
#
*
uM Trolox
GRUPOS
*
Figura 13: TRAP dos homogenatos da pele de camundongos irradiados. Os resultados representam
a média ± erro padrão. Valores de p foram determinados pelo test one-way ANOVA e Bonferroni
como post hoc, são: *p< 0,05 comparado ao grupo controle (n=8);
#
p<0,01 comparado ao grupo 6
horas (n=8); (grupo 24 horas n=6).
48
A atividade da SOD (figura 14) apresentou um aumento significativo no
grupo 6 horas (1,34 ± 0,09 USOD/mg proteína) com *p<0,01, enquanto que não
houve nenhuma diferença no grupo 24 horas (0,92 ± 0,05 USOD/mg proteína)
comparados ao grupo controle (0,95 ± 0,06 USOD/mg proteína),. A diferença entre
os grupos experimentais mostrou significante com
#
p<0,05.
Controle 6 horas 24 horas
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
#
*
U SOD/mg proteína
GRUPOS
Figura 14. Atividade da SOD nos sobrenadantes da pele de camundongos irradiados. Os resultados
representam a média ± erro padrão. Valores de p foram determinados pelo test one-way ANOVA e
Bonferroni como post hoc, *p<0,01 comparado ao grupo controle (n=12) e
#
p<0,05 comparado ao
grupo 6 horas (n=6 para os grupos irradiados).
49
A atividade da CAT (figura 15) diminuiu significativamente no grupo 24 horas
(0,27 ± 0,01 abs/mg proteína) com *p<0,01, enquanto que não se observou
diferença no grupo 6 horas (0,38 ± 0,02 abs/mg proteína), comparados ao grupo
controle ( 0,39 ± 0,01 abs/mg proteína). A diferença entre os grupos experimentais
mostrou significante com
#
p<0,01.
Controle 6 horas 24 horas
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
#
abs/mg de proteína
GRUPOS
*
Figura 15: Atividade da Catalase nos sobrenadantes de pele de camundongos irradiados. Os
resultados representam a média ± erro padrão. Valores de p foram determinados pelo test one-way
ANOVA e Bonferroni como post hoc, *p<0,001 comparado ao grupo controle (n=16);
#
p<0,001
comparado ao grupo 6 horas (n = 7) e grupo 24 hs (n = 8).
50
5 DISCUSSÃO
A pele está continuamente exposta a agentes químicos, físicos e
microbiológicos muitos dos quais induzem a formação de EROs e ERNs, portanto
sujeita ao estresse oxidativo (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007;
BICKERS; ATHAR, 2006; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). O estresse oxidativo
é conhecido como um desequilíbrio entre a produção EROs e ERNs e as defesas
antioxidantes, podendo resultar tanto na diminuição destas defesas quanto no
aumento da formação de espécies reativas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
A radiação por UVB é o agente físico mais descrito capaz de induzir uma
série de eventos na pele, induzindo lesão celular, através da formação de radicais
livres, podendo ocorrer lesões cancerígenas e pré-cancerígenas, envelhecimento e
processos inflamatórios (ARMSTRONG; KRICKER, 2001; BICKERS; ATHAR, 2006).
O modelo experimental onde camundongos são submetidos à dose aguda
por UVB, foi utilizado neste estudo, para verificar as alterações morfológicas, no
sistema antioxidante e o estresse oxidativo na pele provocado pela irradiação, que
resultam nos danos extensivamente descritos na pele. O ensaio foi realizado com
camundongos swiss tricotomizados, conforme outros autores (TRON et al., 1998; LU
et al., 2004; GORMAN et al., 2005; SCHIRATO et al.; 2006).
De acordo com análise macroscópica da pele dos camundongos submetidos
à dose aguda de 2,98J/cm
2
de UVB, foi suficiente para provocar eritema que pode
ser observado após 6hs e 24 hs da irradiação (Figura 8). A dose utilizada é
semelhante às doses em outros estudos (SHINDO; WITT; PACKER, 1993; PODDA
et al., 1998; LEE et al., 2000; WELLER et al., 2003; MAGLIO et al., 2005; JIN et al.,
2007).
Apesar do UVB representar somente 4% do total da radiação UV solar, pode
provocar o avermelhamento da pele com conseqüente resposta inflamatória,
(ARMSTRONG; KRICKER, 2001). Uma única exposição à irradiação por UVB em
camundongos causa uma importante inflamação na pele, com conseqüente edema
após 24hs de irradiação (KABASHIMA et al., 2007). As manifestações da exposição
aguda ao UVB na pele incluem eritema, queimaduras, aumento da pigmentação com
vasodilatação e edema local, com a migração de macrófagos e neutrófilos, devido a
51
liberação de citocinas pelos queratinócitos, caracterizando o processo inflamatório
(SAIJA et al., 2000).
Kabashima et al. (2007), relataram que uma única exposição à radiação
UVB (dose de 5 J/cm
2
) em camundongos tricotomizados causa uma importante
inflamação na pele, com conseqüente edema após 24 horas de irradiação. A
vasodilatação, depois da exposição à radiação UV, leva ao acúmulo de células
inflamatórias como neutrófilos, macrófagos e células T.
As células em apoptose na pele são chamadas de SBC ou células
queimadas do sol (BICKERS; ATHAR, 2006). O aparecimento de SBC e a ruptura
da integridade da epiderme foi observado na análise histológica, 6 e 24 horas após a
irradiação, indicando uma alta atividade sinalizadora de morte celular (apoptose) de
queratinócitos.
Apesar dos queratinócitos serem mais resistentes aos danos induzidos pelos
UVB do que outras células, estes promovem uma cascata de eventos na células,
devido a indução de diferentes vias de sinalização celular, levando a um processo
inflamatório ou a apoptose (LU et al., 2004). Tron et al. (1998), descreveram que a
apoptose nos queratinóccitos, devida à irradiação por UVB, é dependente de p53,
num mecanismo restrito para a população de queratinócitos
As EROs na pele, provocadas por UVB podem ser produzidas
principalmente pela fotossensibilização, levando a produção de
●
O
2
-
ou
1
O
2
(MARTIN; BURCH, 1990; BICKERS; ATHAR, 2006) e pela resposta inflamatória,
gerando uma série de espécies reativas, como
●
O
2
-
, H
2
O
2
,
●
OH, HOCl e
possivelmente NO
●
(SHINDO; WITT; PACKER, 1993; BICKERS; ATHAR, 2006).
Todos os componentes celulares são susceptíveis a ação das espécies
reativas do oxigênio, porém as membranas biológicas são as mais atingidas em
decorrência da peroxidação lipídica, podendo acarretar alterações na organização
estrutural, funcional, enzimática e na permeabilidade das membranas celulares e
morte celular (MELLO FILHO; HOFFMAN ; MENEGHINI, 1984; CECCHINI;
ARUOMA; HALLIWELL; 1990).
Neste estudo, a peroxidação lipídica no tecido cutâneo foi determinada por
um teste colorimétrico clássico (TBARS) e pela quimiluminescência (QL), iniciada
por terc-butil hidroperóxido. Ambos os métodos têm sido frequentemente utilizados
para a avaliação da lipoperoxidação em vários tecidos (CECCHINI; ARUOMA;
HALLIWELL,1990; FLECHA; LLESUY; BOVERIS, 1991; OLIVEIRA; CECCHINI;
52
2000; BARBOSA et al., 2003). Embora as duas técnicas verifiquem a lesão
oxidativa, não devem ser comparadas já que os produtos das reações avaliados por
elas, são diferentes. A QL avalia a formação de lipoperóxidos lipídicos, o que
acontece num primeiro momento da reação de oxidação da membrana (figura 16A),
enquanto TBARS quantifica a presença de aldeídos de baixa massa molecular como
o MDA, que ocorre após a formação de hidroperóxidos lipídicos (figura 16B).
16A
Formação de
lipoperóxidos
QL
16B
Formação de
aldeídos de baixa
massa molecular
TBARS
16A
Formação de
lipoperóxidos
QL
16B
Formação de
aldeídos de baixa
massa molecular
TBARS
Figura 16. Mecanismo de formação de lipoperóxidos de membrana e de aldeídos de baixa massa
molecular como o MDA.
Fonte: Halliwell e Gutteridge (2007).
Além disso, quando ocorre lesão da membrana da célula, a formação de
lipoperóxidos de membrana ou aldeídos de baixa massa molecular como o MDA,
53
depende de alguns fatores, especialmente pela presença de agentes redutores
como metais (Fe e Cu), de enzimas antioxidantes e da extensão da lesão
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Kitazawa e Iwasaki (1999), sugeriram que o Fe
cutâneo catalisa a geração de radicais livres e a utilizaram um antioxidante quelador
de Fe formado pelos aminoácidos glicina e L-serina conjugados com salicialdeído
em cultura de fibroblastos expostos a uma dose aguda de irradiação por UVB,
verificando a diminuição na formação de MDA.
A quantificação de lipoperóxidos de membrana analisados pela técnica da
QL mostrou-se diminuído nas peles dos camundongos, removida após 6 horas da
irradiação e aumentada nas peles dos animais, quando removidas após 24 horas e
comparadas ao grupo controle.
A lesão oxidativa acumulativa medida através da técnica de TBARS,
mostrou-se significativamente diminuída nos grupos 6 e 24 horas, quando
comparadas ao grupo controle.
Maglio et al. (2005), num estudo realizado in vivo com dose aguda de 2,0
J/cm
2
de irradiação UVB, relatou uma diminuição de TBARS na pele, a partir de 6
horas até 24 horas, atribuindo ao óxido nítrico um efeito protetor contra a
lipoperoxidação, estando de acordo com o estudo realizado por Lee et al. (2000) e
com os resultados obtidos neste estudo.
Outras investigações utilizaram a técnica do TBARS como representante do
dano lipoperoxidativo, porém a QL, mostrou-se um teste mais sensível
(ZAMBURLINI et al., 1995a; ZAMBURLINI et al., 1995b), justamente por detectar os
níveis de lipoperóxidos na pele, que ocorrem numa etapa que antecede a formação
de aldeídos de baixa massa molecular (figura 16).
Os resultados sugerem portanto uma diminuição na formação de
lipoperóxidos após 6 horas da irradiação por UVB, enquanto que após 24 horas
houve aumento significativo na formação dos lipoperóxidos de membrana.
O TRAP avalia a capacidade antioxidante total e reflete o equilíbrio entre a
ação conjunta de antioxidantes de baixo peso molecular e espécies oxidantes,
portanto pode fornecer uma informação mais relevante do que a determinação da
concentração isolada de um determinado antioxidante (GHISELLI; SERAFINI;
NATELLA, 2000).
A capacidade antioxidante total do grupo 6 horas foi significativamente maior
comparada ao grupo controle, assim como a SOD, indicando um aumento das
54
defesas antioxidantes, embora a atividade da CAT, tenha permanecido inalterada.
Jin et al., (2007), em seu estudo também observou um aumento da SOD uma hora
após a dose de 4,5 J/cm
2
de irradiação UVB em cultura de queratinócitos. O
aumento significativo da SOD pode ser atribuído pela produção de
●
O
2
-
, após 6
horas da irradiação. Mais detalhadamente os neutrófilos ativados por citocinas pró-
inflamatória, geram
●
O
2
-
(VINTEN-JOHANSEN, 2004). A SOD é uma enzima que
pode ser induzida pelo aumento de produção de
●
O
2
-
, responsável por eliminar esta
espécie reativa com conseqüente produção de H
2
O
2
. (KRUIDENIER et al, 2003a;
KRUIDENIER et al, 2003b).
Segundo Kohen e Gati (2000), após a radiação UV ocorre ativação da
enzima xantina oxidase resultando numa intensa produção de ácido úrico, que pode
ser detectada na superfície da pele, podendo contribuir para o aumento do TRAP no
grupo 6 horas, devido a capacidade do ácido úrico de proteger contra a lesão
oxidativa, doando elétrons e atuando como um limpador (scavenger) de radicais
livres (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 2007).
Os danos causados na pele pela formação de espécies reativas por UVB é
altamente controlado pela rápida eliminação das EROs, atribuído ao mecanismo
antioxidante eficiente da pele (KOHEN, 1999).
Portanto observou-se na pele de camundongos após 6 horas da irradiação
aguda por UVB, aumento nos níveis de TRAP e atividade da SOD, diminuição dos
níveis de QL, MDA e PCs, indicando que as defesas antioxidantes da pele foram
estimuladas pela irradiação e eficientes contra a lipoperoxidação (Figura 17).
55
SOD
RESPOSTA INFLAMATÓRIA
= CAT
LPO
DEFESAS ANTIOXIDANTES EFICIENTES
Fotossensibilização
TRAP
Membrana plasmática
Arginina
Citrulina
OCL
•
MPO
CL
-
SOD
RESPOSTA INFLAMATÓRIA
= CAT
LPO
DEFESAS ANTIOXIDANTES EFICIENTES
Fotossensibilização
TRAP
Membrana plasmática
Arginina
Citrulina
OCL
•
MPO
CL
-
Figura 17. Principais alterações observadas na pele de camundongos após 6 horas da irradiação
aguda por UVB
Fonte: Adaptado Bickers e Athar (2006).
O mesmo não ocorreu no grupo 24 horas, mostrando diminuição significativa
de TRAP, da atividade da CAT em relação ao controle e diminuição da atividade da
SOD comparada ao grupo 6 horas e aumento significativo da QL, portanto as
defesas antioxidantes foram consumidas e insuficientes para impedir o estresse
oxidativo (Figura 18), embora os valores de TBARS e PCs tenham diminuído. A
diminuição das PCs pode ser explicada se considerarmos o fato de se tratar de pele
de camundongo jovem, capaz de remover proteínas oxidadas através do sistema
proteolítico ubiquitina-proteassoma (MERKER; SITTE; GRUNE, 1999). Fibroblastos
velhos são muito mais vulneráveis ao acúmulo de proteínas oxidadas depois de
sofrerem estresse oxidativo e não são capazes de removê-las de modo tão eficiente
quanto fibroblastos jovens o são (MERKER; SITTE; GRUNE, 1999).
Um outro fato a ser considerado é que a carbonilação de proteínas
freqüentemente acompanha a formação de MDA, pois este dois compostos formam
adutos que têm sido associados ao câncer (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007),
portanto a diminuição nos níveis de proteínas carbonílica e TBARS é concordante.
Além disso Podda et al. (1998), evidenciou em cultura de pele, aumento de
proteínas carboniladas somente em altas doses de irradiação UVB/UVA (16,8
56
J/cm
2
), sendo que em doses menores (4,2 J/cm
2
.e 8,4 J/cm
2
), permanecem
inalteradas, estando de acordo com os dados obtidos neste estudo cuja dose de
irradiação UVB foi 2,98 J/cm
2
.
A diminuição significativa da atividade da CAT no grupo 24 horas é
compatível com o aumento de SOD no grupo 6 horas, voltando aos valores basais
após 24 horas e com o eritema observado (Figura 8), indicando uma resposta
inflamatória com conseqüente produção de
●
O
2
-
e formação de H
2
O
2
após 6 horas
da irradiação, o que explica a CAT estar sendo consumida. A CAT e a GPx são as
principais responsáveis pela remoção de H
2
O
2
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
O consumo da CAT pode, portanto resultar num excesso de H
2
O
2
. Uma outra
hipótese é que a CAT é destruída pela luz visível (CHENG; PARCKER, 1979),
resultando também no excesso de H
2
O
2
. Ademais, H
2
O
2
reflete uma resposta aguda
da pele pela exposição por UVB e pode ser gerado por queratinócitos ou infiltrado de
neutrófilos (WEI et al., 2002). Desta forma H
2
O
2
, além de provocar diretamente a
lesão tecidual, poderia estimular a quimiotaxia de neutrófilos, ativar o linfócito T,
induzir a expressão de moléculas de adesão ou outros mediadores pró-inflamatórios
(KRUIDENIER et al, 2003a; KRUIDENIER et al, 2003b). Os neutrófilos ativados por
citocinas pró-inflamatória, geram
●
O
2
-
, através de uma reação catalisada pela enzima
NADPH oxidase. A SOD catalisa a dismutação do
●
O
2
-
em H
2
O
2
, a partir do qual
podem ser gerados
●
OH e HCLO. O
●
OH é produzido através de reação Haber-
Weiss que requer Fe
2+
, (VINTEN-JOHANSEN, 2004). Finalmente, as evidências
experimentais mostradas neste estudo sugerem que o excesso de H
2
O
2
é
responsável pelo estresse oxidativo, observado após 24 horas da irradiação aguda
por UVB (Figura 19).
Portanto o estresse oxidativo foi observado após 24 horas da irradiação,
quando houve um consumo das defesas antioxidantes totais e um aumento na
formação de hidroperóxidos lipídicos. Sugere-se que o modelo experimental que
utiliza dose aguda por UVB, seja adequado desde que os testes elaborados com
fármacos, levem em consideração o tempo de instalação do quadro de estresse
oxidativo, após 24 horas de irradiação, já que após 6 horas os mecanismos
antioxidantes cutâneo são eficientes.
57
SOD
Resposta inflamatória
CAT
LPO
ESTRESSE OXIDATIVO
Fotossensibilização
H
2
O
2
H
2
O
2
TRAP
SOL
Membrana plasmática
Arginina
Citrulina
OCL
•
MPO
CL
-
SOD
Resposta inflamatória
CAT
LPO
ESTRESSE OXIDATIVO
Fotossensibilização
H
2
O
2
H
2
O
2
TRAP
SOL
Membrana plasmática
Arginina
Citrulina
OCL
•
MPO
CL
-
Figura 18. Principais alterações observadas na pele de camundongos após 24 horas da irradiação
aguda por UVB.
Fonte: Adaptado Bickers e Athar (2006).
58
6 CONCLUSÕES
Após 6 horas de irradiação aguda por UVB na pele de camundongos:
· Na análise macroscópica observou-se eritema e a análise morfológica
mostrou leve desorganização da epiderme com aumento do número de
SBCs, indicando atividade sinalizadora de morte celular de queratinócitos;
· Formação de hidroperóxidos lipídicos diminuiu, evidenciado pela queda
na quimiluminescência;
· Diminuição nos níveis de TBARS, ou seja, de formação de aldeídos de
baixa massa molecular (MDA);
· Houve queda significativa nos níveis de proteínas carbonílicas;
· O potencial antioxidante total aumentou;
· A atividade da SOD aumentou, enquanto a CAT permaneceu inalterada;
· Portanto, a redução na formação de lipoperóxidos ocorreu devido aos
eficientes mecanismos antioxidantes enzimáticos e lipossolúveis da pele
que foram estimulados pela irradiação UVB;
Após 24 horas de irradiação na pele de camundongos por UVB:
· Na análise macroscópica observou-se eritema e na morfológica maior
ruptura da integridade da epiderme quanto comparada à pele do grupo
6horas, com aumento do número de SBCs, indicando atividade
sinalizadora de morte celular de queratinócitos;
· Formação de hidroperóxidos lipídicos aumentou;
· Diminuição nos níveis de TBARS (MDA);
· Houve queda nos níveis de proteínas carbonílicas;
· A capacidade antioxidante total diminuiu;
· Redução na atividade da SOD, comparada ao grupo 6 horas, voltando a
valores basais;
· Redução na atividade da CAT;
· Portanto, o estresse oxidativo foi observado após 24 horas da irradiação
quando houve aumento da formação de hidroperóxidos lipídicos
provavelmente pela formação de EROs, devido ao acúmulo de H
2
O
2
,
59
conseqüência da dismutação do
●
O
2
-
pela SOD (aumentou após 6 horas
da irradiação) e o consumo das defesas antioxidantes totais.
60
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo mostrou que, quando submetida à lesão aguda por irradiação
UVB, a pele possui capacidade antioxidante importante, capaz de impedir os efeitos
lesivos de EROS. Entretanto, após 24 horas desta lesão aguda, com o consumo das
defesas antioxidantes, já se pode evidenciar lesões cumulativas de lipídeos de
membrana, com possível comprometimento da integridade da pele.
Tendo em vista que estudos ainda apontam o NO como possível causador
ou protetor de danos oxidativos na pele, estudos complementares são necessários
para se verificar a participação do NO neste modelo.
A presente pesquisa abre um novo caminho para intervenção com
cosméticos para a pele.
61
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