( PDF ) Estresse osmótico: síntese de lipídios a partir de aminoácidos em caranguejos Neohelice granulata (DANA, 1851)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA

ESTRESSE OSMÓTICO: SÍNTESE DE LIPÍDIOS A PARTIR DE AMINOÁCIDOS

EM CARANGUEJOS Neohelice granulata (DANA, 1851)

Dissertação de Mestrado

TIAGO LEAL MARTINS

Porto Alegre, 2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

FISIOLOGIA

ESTRESSE OSMÓTICO: SÍNTESE DE LIPÍDIOS A PARTIR DE AMINOÁCIDOS

EM CARANGUEJOS Neohelice granulata (DANA, 1851)

TIAGO LEAL MARTINS

Orientadora: Dra. Roselis Silveira Martins da Silva

Dissertação apresentada ao curso de Pós-graduação

em Ciências Biológicas: Fisiologia, da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre.

Porto Alegre, 2008

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Comissão Examinadora

Denise Maria Zancan

Profª Doutora do Programa de Pós-graduação em

Ciências Biológicas: Fisiologia – UFRGS

Vera Maria Treis Trindade

Profª Doutora do Programa de Pós-graduação em

Ciências Biológicas: Bioquímica – UFRGS

Carolina Arruda de Oliveira Freire

Profª Doutora do Programa de Pós-graduação em

Biologia Celular e Molecular – UFPR

Dedico este trabalho à minha família

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora Professora Roselis Silveira Martins da Silva,

que gentilmente me acolheu em sua equipe e possibilitou a realização deste traba-

lho, depositando muita confiança, paciência e transferindo conhecimentos.

À minha família, que desde sempre acreditou em mim e me apoiou nos mo-

mentos difíceis.

Ao Professor Luiz Carlos Kucharski pela parceria e por estar sempre dispos-

to a ajudar e partilhar seus conhecimentos.

Aos mais que colegas, os grandes amigos que fiz no Laboratório de Metabo-

lismo e Endocrinologia Comparada (LaMEC) por proporcionarem um ambiente a-

gradável para trabalhar e pelos momentos de prazer e descontração regados a

muito “amargo”.

Aos professores do curso de Pós-graduação em Fisiologia por me guiarem

na busca do conhecimento e contribuírem na minha formação docente.

Aos colegas do Departamento de Fisiologia pela convivência e amizade.

Às funcionárias da secretaria do curso de Pós-graduação em Fisiologia pelo

carinho e dedicação no atendimento às necessidades dos alunos.

Aos colegas do curso de Especialização em Toxicologia, que recentemente

ingressaram na minha vida, mas puderam acompanhar os instantes finais deste

trabalho me apoiando muito durante este período.

Aos amigos de longa data, que de uma forma ou de outra também tornaram

possível a concretização deste projeto, seja por palavras de incentivo ou no convite

para umas “happy hours” nos redutos boêmios da minha amada Porto Alegre, a fim

de “desencanar” dos problemas relacionados ao trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pela concessão da bolsa de estudos e auxilio financeiro.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS.........................................................................8

RESUMO.......................................................................................................9

1. INTRODUÇÃO.........................................................................................10

2. OBJETIVOS.............................................................................................24

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais........................................................................................25

3.2 Procedimentos experimentais.....................................................25

3.3 Determinação da conversão de

C-glicina em

C-lipídios........26

3.4 Determinação da atividade da enzima fosfoenolpiruvato carboxi-

quinase (PEPCK (E.C. 4.1.1.32))......................................................28

3.5 Determinação de proteínas.........................................................29

3.6 Análise estatística........................................................................29.

4. RESULTADOS.........................................................................................30

5. DISCUSSÃO............................................................................................38

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................47

LISTA DE ABREVIATURAS

αα

α-KG – Alfa-cetoglutarato

ANOVA – Análise de variância

Asp – Aspartato

ATP – Adenosina trifosfato

DHAF – Diidroxiacetona fosfato

Glut – Glutamato

GSH – Glutationa

GTP – Guanosina trifosfato

HDL – Lipoproteína de alta densidade

HEPES – N-[2-hidroxiethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]

ITP – Inosina trifosfato

MeAIB – Ácido metal-aminoisobutírico

OAA – Oxaloacetato

PC – Piruvato carboxilase

PEP – Fosfoenolpiruvato

PEPCK – Fosfoenolpiruvato carboxiquinase

PMSF – Fluoreto de fenilmetilsulfonil

POPOP – 1,4-bis[2-(5-Phenyloxazolyl)]benzene

PPO – 2,5-Diphenyloxazole

SFC – Solução fisiológica de caranguejo

SNK – Student-Newman-Keuls

TCA – Ácido tricloracético

TMAO – Óxido de trimetilamina

RESUMO

No ambiente estuarino, hábitat do caranguejo Neohelice granulata, a salini-

dade pode variar de 0,22 a 34‰, implicando em mudanças comportamentais e fisi-

ológicas neste animal. Este estudo teve como objetivo verificar os efeitos do es-

tresse hiper e hiposmótico sobre a via lipogênica a partir de glicina em diferentes

tecidos de N. granulata, bem como a atividade da enzima fosfoenolpiruvato carbo-

xiquinase (PEPCK).

No presente trabalho, aumentos na incorporação de

C-glicina em

C-

lipídios totais foram constatados nas brânquias anteriores (estresse hiposmótico) e

posteriores (hiperosmótico). Este aumento provavelmente ocorreria via gliceroneo-

gênese, já que também foi constatado o incremento na atividade da enzima

PEPCK. Nestes órgãos a atividade desta enzima ocorre tanto na fração citosólica

como na mitocondrial, o que permitiria a conversão da glicina em glicerol, manten-

do, assim, o ciclo triacilglicerol/ácido graxo nesses tecidos.

Nas brânquias posteriores (no estresse hiposmótico), no músculo e no hepa-

topâncreas a síntese de lipídios através da formação de ácidos graxos a partir de

C-glicina seria uma via de ajuste de concentração de aminoácidos livres intracelu-

lares em resposta ao estresse osmótico.

O presente estudo demonstra que a lipogênese a partir de

C-glicina seria

uma via metabólica que estaria envolvida no processo de aclimatação ao estresse

osmótico em N. granulata.

PALAVRAS-CHAVE: Estresse osmótico, lipogênese, aminoácido, PEPCK, caran-

guejo.

1. INTRODUÇÃO

O ecossistema estuarino representa uma transição entre o ambiente mari-

nho e límnico e se caracteriza pela presença de sedimento fino de origem marinha,

fluvial ou terrestre que se acumula formando planícies de barro ricas em alimento,

mas escassas em oxigênio (McLusky, 1989). As freqüentes variações do cenário,

em vista da ação constante das marés, alternando períodos de total cobertura do

meio pelas águas e de exposição do substrato, além dos fatores meteorológicos,

exercem um controle seletivo e severo sobre as espécies nativas.

O estresse provocado pelas alterações de fatores como salinidade, tempera-

tura ou teor de O

na água, leva à utilização de estratégias comportamentais e fi-

siológicas pelos organismos, capacitando-os a tolerar tais oscilações característi-

cas do meio estuarino (Odum, 1985; Miranda, 1994).

Considerando-se as variações na concentração osmótica dos fluidos corpo-

rais dos organismos aquáticos em resposta às variações de salinidade do meio,

distinguem-se duas formas de ajustes osmóticos: osmoconformação e osmorregu-

lação. Nas espécies osmoconformadoras, a pressão osmótica intracelular pode

variar de acordo com a variação da osmolaridade do meio, ou seja, esses animais

mantêm a osmolaridade dos seus fluidos corporais semelhante àquela do meio em

que se encontram. As espécies osmorreguladoras são capazes de tolerar varia-

ções na salinidade do meio com mínimas alterações da concentração osmótica da

hemolinfa (Péqueux, 1995; Schmidt-Nielsen, 2002).

A capacidade osmorregulatória parece ser um pré-requisito para a invasão

de espécies marinhas a ambientes osmoticamente diferentes. Tais espécies, uma

vez estabelecidas, perderiam a capacidade de osmorregular depois de um longo

período evolutivo nestes ambientes (Freire et. al., 2008).

O caranguejo Neohelice granulata, também conhecido popularmente como

“catanhão” ou “gatanhão”, é uma espécie endêmica do ambiente estuarino e se

distribui desde o Rio de Janeiro até o golfo de San Matias (Argentina) (Boschi,

1964), onde a salinidade pode variar de 0,22‰ a 34‰ (Turcato, 1990). Cava sua

toca geralmente nas regiões supralitoral e mesolitoral superior, deslocando-se para

o mesolitoral inferior e infralitoral em busca de umidade e de alimento (Bond-

Buckup et al., 1991).

Este caranguejo, assim como outros crustáceos eurialinos, ou seja, toleran-

tes às grandes amplitudes na salinidade do meio, possui capacidade osmorregula-

dora, apresenta hemolinfa hiposmótica em meio concentrado, ao passo que em

meio diluído, sua hemolinfa é hiperosmótica (Mañe-Garzon et al., 1974). Seu ponto

isosmótico situa-se entre 28,5‰ e 30‰, no inverno e no verão, respectivamente

(Bromberg, 1992).

Estudos realizados em várias espécies eurialinas mostraram que as células

desses animais estabelecem uma relação de isosmolaridade, com relativa rapidez,

com o fluido extracelular. Esta regulação é realizada principalmente por altas con-

centrações de efetores osmóticos orgânicos, e não por meio de altas concentra-

ções de osmólitos inorgânicos como sódio, potássio ou cloreto. Os principais osmó-

litos orgânicos em eucariotos, que vivem em ambiente aquático estressante, estão

restritos a uma pequena classe de moléculas com baixo peso molecular: polióis

(p.ex. glicerol, manitol e sacarose); aminoácidos livres e derivados de aminoácidos

(p.ex. taurina e alanina); uréia e metilaminas (p.ex. trimetilamina-N-óxido-TMAO,

betaína e sarcosina) (Yancey et al., 1982). No caso da betaína, é particularmente

interessante observar que esse composto, derivado da colina, após sucessivas

desmetilações dá origem à dimetilglicina, à metilglicina e à glicina (Viana et. al.,

2005). Jahn et al. (2006) demonstraram a importância da colina e de glicina betaína

na regulação osmótica em N. granulata. Os autores constataram um aumento na

captação de colina e na conseqüente formação de glicina betaína no hepatopân-

creas de caranguejos submetidos ao estresse hiperosmótico.

Mudanças na concentração de osmólitos orgânicos no fluido extracelular in-

fluenciam diretamente rotas metabólicas, por meio de alterações no fluxo de meta-

bólitos para as células. Desta forma, altera a concentração de hormônios e outras

moléculas sinalizadoras, levando a alteração na expressão de genes que codificam

proteínas reguladoras ou enzimas chave do metabolismo intermediário. Estas alte-

rações metabólicas estão diretamente envolvidas nas respostas fisiológicas e bio-

químicas estratégicas para a integridade celular face às alterações no meio extra-

celular (Schliess e Häussinger, 2002).

Diversos autores sugerem um controle neuroendócrino sobre o mecanismo

osmorregulatório (Mcnamara et al., 1990; Eckhadt et al., 1995; Freire et al., 1995)

Em Macrobrachium olfersii, fatores neuroendócrinos, presentes no Sistema

Nervoso, atuam sobre a regulação de aminoácidos livres da hemolinfa. O homoge-

nado de gânglio torácico aumentou a quantidade de aminoácidos livres na hemolin-

fa de camarões mantidos em água doce, e diminuiu estes compostos nitrogenados

na hemolinfa de animais submetidos ao estresse hiperosmótico (Freire et al.,

1995).

Os aminoácidos exercem muitas funções nos processos biológicos. Além de

serem precursores da biossíntese de proteínas, de carboidratos e de lipídios, os

aminoácidos também são utilizados como fonte energética, como transportado-

res/doadores de átomos de carbono e de nitrogênio, como neurotransmissores ou

neuromoduladores, como componentes de sistemas de tamponamento, e como

osmólitos (Kilberg e Haüssinger, 1992).

Nos crustáceos eurialinos a concentração de aminoácidos tissulares é cerca

de dez vezes mais elevada que a encontrada em tecidos de mamíferos, enquanto

que os níveis desses osmólitos orgânicos na hemolinfa são equivalentes (Gilles,

1987). A mobilização dos aminoácidos nos tecidos, durante o ajuste homeostático

ao estresse osmótico, estaria envolvida com a utilização dos mesmos em três me-

canismos básicos: a) deslocamento do equilíbrio entre influxo e efluxo dos aminoá-

cidos através da membrana plasmática; b) alterações na capacidade de síntese e

de oxidação destes aminoácidos livres tissulares; c) alterações na capacidade de

síntese e de mobilização de proteínas, de carboidratos e de lipídios (Figura 1) (Gil-

les, 1982; Turcato, 1990).

Em algumas espécies eurialinas, a quantidade de aminoácidos livres repre-

senta apenas 10-20% da concentração osmótica intracelular (Gilles, 1997). Essas

espécies, geralmente, utilizam metilaminas nas respostas regulatórias de volume

celular (Gilles e Delpire, 1997). Schein et al. (2005 b) mostraram que a captação de

C-MeAIB

aumenta no músculo mandibular e no hepatopâncreas de caranguejos

submetidos ao estresse hiperosmótico.

No hepatopâncreas e no músculo da mandíbula de N. granulata, o transpor-

te de alanina via sistema A

é um dos mecanismos envolvidos no ajustamento da

concentração de aminoácidos durante o estresse hiperosmótico (Schein et al.,

2005 b). Em invertebrados, estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que o au-

C-MeAIB: ácido

C-metilaminoisobutirico, usado como modelo para identificar o trans-

porte de aminoácidos via sistema A.

Sistema A: Sistema de transporte de aminoácidos dependente de Na

mento dos aminoácidos intracelulares, durante o estresse hiperosmótico, envolve a

captação de compostos nitrogenados do líquido extracelular (Gilles e Delpire, 1997;

Gilles, 1998).

Figura 1 – Mecanismos que podem estar implicados no controle da concen-

tração de aminoácidos livres tissulares (segundo Gilles, 1982).

Schein et al. (2005 b) constataram que durante o estresse hiperosmótico, a

redução da oxidação de

C-alanina parece ser um dos mecanismos envolvidos no

aumento da concentração de aminoácidos livres intracelulares no hepatopâncreas

de N. granulata. Ao passo que no estresse hiposmótico, a oxidação total de amino-

ácidos não estaria envolvida na diminuição das concentrações de osmólitos orgâ-

nicos no hepatopâncreas e no músculo mandibular. Schein (1999) observou tam-

bém que durante o estresse hiperosmótico, a concentração do aminoácido glicina

na hemolinfa de N. granulata diminui cerca 60%. Bock (2005) verificou que a sínte-

CARBOIDRATOS

PROTEÍNAS

LIPÍDIOS

OXIDAÇÃO PARA CO

se de proteínas, a captação e a oxidação de aminoácidos estariam envolvidas nas

variações de concentração de aminoácidos intracelulares em hepatopâncreas,

músculo mandibular e brânquias anteriores e posteriores de N. granulata, submeti-

dos ao estresse osmótico agudo in vitro.

A participação do metabolismo de carboidratos, durante o processo de acli-

matação ao estresse osmótico, foi demonstrada no músculo, no hepatopâncreas e

nas brânquias de caranguejo N. granulata (Da Silva e Kucharski, 1992; Schein,

1999; Oliveira e Da Silva, 2000; Schein et al., 2004; 2005 a; Chittó et al., 2008 a).

Assim como em outros crustáceos, o tecido branquial deste animal apresen-

ta uma diferenciação funcional e estrutural. Os três pares de brânquias posteriores

constituem o principal sítio osmo e ionorregulador das espécies eurialinas, enquan-

to os três anteriores estão mais associados à função respiratória e excreção de

amônia (Bianchini et al., 2008).

A diminuição na concentração de glicose livre nas brânquias anteriores e

posteriores durante o estresse hipo e hiperosmótico indica a utilização deste subs-

trato como fonte de energia no processo de aclimatação ao estresse osmótico

(Chittó, 2000).

Segundo Oliveira e Da Silva (2000), a via gliconeogênica hepatopancreática

também estaria implicada no ajuste da concentração de aminoácidos durante a

aclimatação ao estresse hiposmótico em N. granulata. As autoras ainda constata-

ram um aumento dos níveis de uréia na hemolinfa, sugerindo um aumento do cata-

bolismo de aminoácidos em resposta ao estresse hiposmótico. Chittó et al. (2008

a) observaram uma redução de cerca de 34% na conversão de

C-glicerol em

C-

glicose nas brânquias posteriores de N. granulata expostos por 3 dias em meio

concentrado, comprovando a participação da via gliconeogênica como uma das

vias envolvidas no ajuste metabólico durante a aclimatação ao estresse hiperosmó-

tico em brânquias.

Os lipídios teciduais também participam do ajuste metabólico ao estresse

osmótico em caranguejos. Em N. granulata, submetido ao estresse osmótico du-

rante os meses de verão, ocorre diminuição na concentração de lipídios totais nas

brânquias posteriores, no hepatopâncreas e no músculo, sugerindo a utilização

desse substrato energético durante o esforço de aclimatação ao estresse (Chittó et

al., 2008 a).

Os principais lipídios em crustáceos são os lipídios neutros, entre estes,

90% são triglicerídios (Allen et al., 2000). Os lipídios de crustáceos são transporta-

dos na hemolinfa por lipoproteínas de alta densidade (HDL) (Garcia et al., 2002). O

músculo, o hepatopâncreas e as gônadas são locais de armazenamento de lipí-

dios, pois não há um tecido adiposo diferenciado em crustáceos (Kucharski e Da

Silva, 1991; Rosa e Nunes, 2002). Diversos estudos têm demonstrado que durante

períodos de grande demanda energética, como a muda e a gametogênese, ocorre

uma marcante mobilização de lipídios, principalmente, aqueles presentes no hepa-

topâncreas.

Em mamíferos, o ciclo triglicerídio/ácido graxo requer não apenas ácidos

graxos, mas também glicerol 3-fosfato para a síntese de triglicerídios. A glicose é o

principal precursor de glicerol 3-fosfato durante o estado alimentado. Entretanto,

durante o jejum, quando a lipólise no tecido adiposo é induzida pelas baixas con-

centrações de insulina circulante, a disponibilidade de glicose é limitada em função

do seu papel crucial no metabolismo de tecidos fundamentais. O glicerol não pode

ser usado pelo tecido adiposo devido aos níveis insignificantes da enzima glicerol

quinase neste tecido (Hanson e Reshef, 2003). Para manter o ciclo triglicerí-

dio/ácido graxos ocorre a formação de glicerol 3-fosfato a partir de outros compos-

tos como piruvato, lactato e alanina por uma via denominada gliceroneogênese.

A gliceroneogênese foi descoberta na década de 60 por Lea Reshef, Ri-

chard Hanson e John Ballard, e simultaneamente por Eleazar Shafrir e seus cola-

boradores, os quais ficaram intrigados pela presença de duas enzimas gliconeogê-

nicas, piruvato carboxilase (PC) e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), no

tecido adiposo, onde a glicose não era sintetizada (Nelson e Cox, 2004). Esta via é

uma versão reduzida da gliconeogênese, de piruvato à diidroxiacetona fosfato

(DHAF), seguido pela conversão de DHAF em glicerol 3-fosfato pela ação da glice-

rol 3-fosfato desidrogenase. O glicerol 3-fosfato é subsequentemente utilizado na

síntese de triglicerídios (Figura 2) (Devlin, 2002).

A conversão de piruvato em fosfoenolpiruvato ocorre em duas etapas sepa-

radas que requerem compostos de fosfato de alta energia (1 ATP e 1 GTP). A pri-

meira é catalisada pela PC, que converte piruvato em oxaloacetato e envolve a

hidrólise de um ATP (adenosina trifosfato). Há duas vias que podem ser adotadas

pelo oxaloacetato para chegar a DHAF. Isto acontece porque a PEPCK está pre-

sente tanto no compartimento citosólico como no mitocondrial. A via mais simples

envolve a PEPCK mitocondrial. O OAA é convertido em PEP que, então, atravessa

a membrana mitocondrial para o meio citosólico. A segunda via envolve a conver-

são de OAA em aspartato que é transportado para o citosol através do antiporte

glutamato-aspartato. No citosol, a transaminação com α-cetoglutarato converte o

aspartato novamente em oxaloacetato, que é descarboxilado pela PEPCK citosóli-

ca. No compartimento citosólico, o PEP sofre sucessivas reações até formar glice-

raldeído 3-fosfato. Este composto pode ser convertido a DHAF, numa reação re-

versível catalisada pela triose fosfato isomerase (Figura 2) (Devlin, 2002).

Figura 2 – Esquema da via lipogênica a partir de glicina, mostrando alguns

dos principais substratos e as enzimas-chave dessa via. PC: piruvato carboxilase,

PEPCK: fosfoenolpiruvato carboxiquinase, OAA: oxaloacetato, PEP: fosfoenolpiru-

vato, Asp: aspartato, Glut: glutamato, α-KG: α-cetoglutarato, DHAF: diidroxiacetona

fosfato. Adaptado de Devlin, 2002.

O primeiro passo da síntese de triglicerídios é a incorporação de dois acetil-

CoA ao glicerol 3-fosfato formado a partir de DHAF ou glicerol, dando origem ao

ácido fosfatídico. O ácido fosfatídico é hidrolisado à 1,2-diacilglicerol, que pode ser

convertido à triglicerídio pela transesterificação com um terceiro acetil-CoA (Figura

3) (Nelson e Cox, 2004).

Glic

Ser

Piruv

OAA

ATP

ADP + P

Asp

PEP

PEPCK

GTP

GDP

ATP

ADP

Glut

Mit

sol

Asp

OAA

PEP

ADP

ATP

GDP

GTP

PEPCK

Gliceralde

do 3

fosfato

1,3

Bifosfoglicerato

DHAF

Glicerol 3

fosfato

Triglice

deo

Fosfoglicerato

ADP + P

ATP

Cit

sol

Glic

Glut

αα

-KG

αα

-KG

Figura 3 – Esquema da síntese de triglicerídios. Adaptado de Nelson e Cox,

2004.

A distribuição da PEPCK entre as frações celulares varia entre as espécies

(Moon, 1988). Conforme a espécie estudada, a PEPCK pode se localizar na mito-

côndria, no citosol ou em ambos os compartimentos, como ocorre em humanos

(Marks et al., 1996). Em aves, a PEPCK hepática é mitocondrial (Moon, 1988). Em

ratos e camundongos, a PEPCK hepática é principalmente citosólica, em outros

mamíferos, como nos coelhos e nos porcos da índia (Wiese et al., 1991; Somberg

e Mehlman, 1969), está presente nos dois compartimentos do hepatócito.

A maior diferença entre as duas isoformas da enzima é o tipo de regulação

da expressão de seus genes. A regulação transcricional da expressão gênica da

PEPCK citosólica (PEPCKc) é modulada por dieta ou sinalização hormonal, o que

resulta em alteração na síntese desta enzima (Croniger et al., 2002). Entretanto,

em vertebrados, a PEPCK mitocondrial hepática é expressa constitutivamente, não

sendo controlada por estes fatores (Croniger et al., 2002).

DHAF

Glicerol 3

fosfato

Glic

rol

cido fosfat

Acetil

CoA

Acetil

CoA

1,2

diacilglicerol

TRIGLICER

DIO

Acetil

CoA

Alguns estudos têm discutido a importância da isoforma citosólica no meta-

bolismo lipídico em mamíferos (Croniger et al., 2002; Hanson e Reshef, 2003; Re-

shef et al., 2003; Beale et al., 2002; Hanson, 2005). Olswang et al. (2002) produzi-

ram camundongos geneticamente modificados em que foi suprimido o sítio de liga-

ção para o PPARγ2

, que regula a expressão a gênica da PEPCKc em tecido adi-

poso. Os autores demonstraram que esta linhagem de camundongos apresentava

níveis normais de PEPCKc no fígado e nos rins, porém nada no tecido adiposo. Os

animais ainda apresentavam quantidades reduzidas de gordura corporal e aproxi-

madamente 25% dos camundongos eram lipodistróficos. Por outro lado, Frankhau-

ser et al. (2002) verificaram que a superexpressão da PEPCKc no tecido adiposo

de camundongos resulta em animais obesos devido ao aumento da taxa de re-

esterificação e da gliceroneogênese.

Brito et al. (1999) demonstraram que em ratos alimentados com uma dieta

rica em proteínas ocorre a indução da gliceroneogênese a partir de alanina, de pi-

ruvato e de lactato no tecido adiposo marrom, e um aumento de cerca de quatro

vezes na atividade da enzima PEPCKc, levando ao aumento da re-esterificação de

ácidos graxos livres.

Zammit e Newsholme (1978) verificaram a atividade da PEPCK no músculo

do caranguejo ferradura Limulus polyphemus e da lagosta Homarus vulgaris e su-

geriram que essa enzima catalisa a conversão de oxaloacetato em fosfoenolpiruva-

to, sendo parte da via de oxidação de alguns aminoácidos nos músculos desses

animais. No hepatopâncreas e no manto do molusco Megalobulimus oblongus a

atividade da enzima PEPCK é predominantemente mitocondrial, entretanto, no co-

PPARγ2: Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma expresso no tecido adiposo.

ração e no diafragma a maior atividade foi constatada na fração citosólica (Dias,

1996; 2000).

Em caranguejos N. granulata a PEPCK foi clonada (AY074922) e sua ex-

pressão determinada no hepatopâncreas, no músculo, no sistema nervoso, nas

brânquias e no coração (Schein et al., 2004).

Oliveira e Da Silva (1997) demonstraram, pela primeira vez, a presença da

via gliconeogênica e a atividade da PEPCK no hepatopâncreas de N. granulata. As

autoras constataram que entre 84 e 89% da atividade desta enzima era mitocon-

drial. Schein et al. (2004) demonstraram que no músculo da mandíbula deste

mesmo caranguejo mais de 90% da atividade da PEPCK é mitocondrial, evidenci-

ando similaridade com os valores encontrados no hepatopâncreas. No mesmo tra-

balho foi constatado um aumento significativo na expressão e na atividade da en-

zima durante o choque hiperosmótico, sugerindo que a gliconeogênese colabora

no ajuste metabólico durante este tipo de estresse. Os resultados desse trabalho

também sugerem que em crustáceos, a isoforma mitocondrial não seria constituti-

va, como ocorre em mamíferos, já que sua expressão pode ser modulada pelo es-

tresse osmótico. Recentemente, Maciel (2007) demonstrou que a atividade e a ex-

pressão da PEPCK muscular também seriam controladas pelo teor de oxigênio no

meio e pela composição da dieta administrada aos caranguejos.

Chittó et al. (2008 b) verificou que, contrariamente ao que ocorre no músculo

e no hepatopâncreas, a atividade da enzima PEPCK está presente tanto na fração

mitocondrial como na citosólica em brânquias anteriores e posteriores de N. granu-

lata.

A sazonalidade também altera o perfil metabólico de crustáceos. Rosa e

Nunes (2002), em seu trabalho com três diferentes espécies de crustáceos decá-

podes, mostraram que o ciclo reprodutivo tem efeitos marcantes sobre a dinâmica

de lipídios em crustáceos. Os lipídios são a principal fonte de energia metabólica

para o desenvolvimento embrionário e sua quantidade correlaciona-se com o ta-

manho dos ovos, com o intervalo de tempo entre a postura, a incubação e a primei-

ra alimentação das larvas. Durante o período de maturação gonadal os ovários tor-

nam-se um centro adicional para o metabolismo lipídico, incluindo a lipogênese

(síntese de triacilglicerol). Sob estas circunstâncias, o requerimento lipídico parece

ser dependente do aporte de lipídios da dieta e/ou das reservas hepatopancreáti-

cas (Ferreira et al, 2005).

Esta variação sazonal já foi verificada em outros crustáceos. Ferreira et al

(2005), estudando o perfil metabólico em Aegla platensis, submetida a diferentes

dietas, observou um aumento da demanda energética no verão, possivelmente pa-

ra a produção de gametas; a incubação e a postura dos ovos no outono e no inver-

no respectivamente, visto que em ambiente natural o outono antecede os meses

de ocorrência do pico reprodutivo da espécie. Em N. granulata o glicogênio é a

principal fonte de energia durante a primavera e o verão, ao passo que os lipídios

do músculo são mais utilizados durante o outono e o inverno (Kucharski e Da Silva,

1991).

Luvizzotto-Santos et al. (2003) verificaram diferenças sazonais na concen-

tração de lipídios totais em tecidos de N. granulata, constatando concentrações

maiores de lipídios em animais de inverno quando comparados aos caranguejos de

verão. As concentrações de lipídios totais nas brânquias e no músculo foram signi-

ficativamente menores em caranguejos expostos por sete dias ao meio hiposmóti-

co do que naqueles submetidos ao mesmo período de estresse hiperosmótico ou

mantidos em condições controle. Assim como relatado para outros crustáceos, o

hepatopâncreas de N. granulata apresentou altas concentrações lipídicas em rela-

ção aos outros tecidos.

Em N. granulata previamente alimentado com uma dieta rica em proteína ou

carboidratos, Vinagre e Da Silva (1992) constataram um consumo acentuado dos

lipídios do hepatopâncreas e do músculo ao final de um período de jejum de 8 se-

manas, evidenciando a utilização deste substrato energético durante o jejum longo.

Os autores ainda observaram que a lipogênese, no hepatopâncreas, no músculo e

nas brânquias, não foi alterada nestes animais quando mantidos em jejum por 3

semanas. Entretanto, a realimentação de 48 horas após o jejum de 3 semanas,

elevou a síntese de lipídios no hepatopâncreas (Vinagre e Da Silva, 2002).

Kucharski e Da Silva (1991) verificaram que em N. granulata alimentados

com uma dieta rica em proteínas há uma maior concentração de lipídios totais no

hepatopâncreas em relação aos animais alimentados com uma dieta rica em car-

boidratos e aos animais coletados do campo.

Na maioria dos crustáceos eurialinos, como o N. granulata, sabe-se que os

aminoácidos intracelulares são utilizados como osmólitos orgânicos para a regula-

ção do volume celular. Nos crustáceos em geral, o principal lipídio armazenado é o

triacilglicerol. Assim a pergunta que o presente trabalho gostaria de esclarecer é:

Haveria um controle da capacidade de síntese de lipídios a partir de aminoácidos

durante a aclimatação ao estresse osmótico em tecidos de Neohelice granulata?

2. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi verificar os efeitos dos estresses hiperos-

mótico e hiposmótico sobre a via lipogênica e sobre a atividade da enzima fosfoe-

nolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) em diferentes tecidos do caranguejo N. granu-

lata.

Para isto, foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos:

1) Avaliar a capacidade lipogênica, através da conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais, nas brânquias anteriores e posteriores, no músculo da mandíbu-

la e no hepatopâncreas de animais do grupo controle ou submetidos a 24, 72 e 144

horas de estresse hiperosmótico ou hiposmótico.

2) Determinar a atividade da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase

(PEPCK) nas brânquias anteriores e posteriores, no músculo da mandíbula e no

hepatopâncreas de animais do grupo controle ou submetidos a 24, 72 e 144 horas

de estresse hiperosmótico ou hiposmótico.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados caranguejos Neohelice granulata (Chasmagnathus granula-

tus Dana 1851) (Crustacea, Brachyura, Varunidae) machos em estágio C do ciclo

intermudas (Drach e Tchernigovtzeff, 1967), a fim de minimizar os efeitos dos perí-

odos de ecdise.

A coleta foi realizada na margem da Lagoa Tramandaí, no município de Im-

bé (RS), durante a primavera e o verão. Os animais foram capturados manualmen-

te e acondicionados em caixas plásticas, com água do próprio local, durante o

transporte até o laboratório, localizado no Instituto de Ciências Básicas da Saúde

na UFRGS, em Porto Alegre (RS).

No laboratório, os caranguejos foram submetidos ao choque hiposmótico

com água destilada por 24 horas, para eliminação de possíveis parasitas e limpeza

do conteúdo estomacal (Kucharski, 1990). Após este procedimento, os animais

foram mantidos por 10 dias em tanque contendo água com salinidade de 20‰,

temperatura de 25°C, fotoperíodo natural, aeração constante. Os caranguejos fo-

ram alimentados, ad libitum, com carne bovina crua, duas vezes por semana.

3.2. Procedimentos experimentais

Após o período de aclimatação os animais foram divididos em dois grupos

experimentais e submetidos durante 24, 72 e 144 horas ao estresse hiposmótico

(salinidade de 0‰) ou hiperosmótico (salinidade de 34‰), os outros parâmetros

foram mantidos nas mesmas condições de aclimatação e os caranguejos foram

alimentados até 16 horas antes de serem utilizados nos experimentos.

Ao final dos períodos experimentais, os caranguejos foram crioanestesiados

e amostras de 50-100mg de brânquias (anteriores e posteriores), de músculo da

mandíbula e de hepatopâncreas foram coletadas e colocadas em placas de Petry

sobre gelo, contendo solução fisiológica de caranguejo (SFC). Foram feitos peque-

nos cortes nas lamelas das brânquias, possibilitando um maior contato do tecido

com o meio de incubação. As brânquias foram divididas em anteriores e posterio-

res, pois apresentam funções distintas, estando as anteriores relacionadas com a

respiração e as posteriores com o processo osmorregulatório (Luquet et al., 2000;

Bianchini et.al., 2008).

Os animais mantidos no tanque, contendo água com salinidade de 20‰,

constituíram o grupo controle e foram sacrificados juntamente com os animais dos

grupos submetidos ao estresse osmótico.

3.3. Determinação da conversão de

C-glicina em -

C-lipídios

As amostras de tecido foram colocadas em tubos de 2ml com 250µl de SFC

contendo:

1) Grupo controle: 374mM de NaCl, 10mM KCl, 25mM CaCl

, 10mM Mg-

O, 8,8mM H

, 10mM HEPES e 0,1mM fluoreto de fenilmetilsulfonil

(PMSF), pH 7,8, 770 mOsm/kg. A osmolalidade da hemolinfa dos animais aclima-

tados à salinidade de 20‰ é de 719 ± 10,41 mOsm/kg.

2) Grupo hiposmótico: 331mM de NaCl, 10mM KCl, 25mM CaCl

, 10mM

MgCl

O, 8,8mM H

, 10mM HEPES e 0,1mM fluoreto de fenilmetilsulfonil

(PMSF), pH 7,8, 690 mOsm/kg. A osmolalidade da hemolinfa dos animais aclima-

tados à salinidade de 0‰ é de 636 ± 21,5 mOsm/kg.

3) Grupo hiperosmótico: 457mM de NaCl, 10mM KCl, 25mM CaCl

, 10mM

MgCl

O, 8,8mM H

, 10mM HEPES e 0,1mM fluoreto de fenilmetilsulfonil

(PMSF), pH 7,8, 900 mOsm/kg. A osmolalidade da hemolinfa de N. granulata acli-

matado à 34‰ é de 853 ± 12.45 mOsm/kg.

Ao meio da incubação dos três grupos experimentais (controle, estresse hi-

posmótico e hiperosmótico) foi adicionado 0,2µCi de

C-glicina (104mCi mmol

-1

Amersham International) e 5mM de glicina não marcada. A seguir foi feita a substi-

tuição da fase gasosa por carbogênio (O

:CO

, na proporção 95:5% v/v). Os tubos

foram fechados e incubados em banho metabólico do tipo Dubnoff por 1 hora sob

agitação constante a 25°C.

Após a incubação, os tubos foram imediatamente colocados no gelo, para

parar as reações bioquímicas. Os tecidos foram lavados com SFC, para retirar o

excesso de material radioativo, e secos em papel filtro. Em seguida as amostras

foram homogeneizadas em uma mistura de clorofórmio:metanol (2:1, v/v), utilizan-

do-se um homogeneizador com pistilo de teflon, e armazenadas para posterior ex-

tração dos lipídios.

A extração dos lipídios foi realizada conforme o método descrito por Folch et

al. (1957). Às amostras filtradas foi adicionada solução salina (0,9%) na proporção

de 5:1 (v/v). Após a centrifugação por 5 minutos a 1500rpm, a fase superior foi

descartada e amostras de 2ml foram repassadas para tubos de vidro, que foram

deixados em repouso dentro de uma capela de exaustão, a temperatura ambiente,

até a evaporação completa da fase clorofórmica sob nitrogênio. Às amostras foram

acrescentados 5ml de líquido de cintilação [Tolueno - PPO (0,4%) e POPOP

(0,01%)] e a radioatividade medida em espectrômetro de cintilação líquida (LKB-

Wallac). Os resultados foram expressos em nmol de

C-glicina convertida em

C-

lipídios totais .g

-1

de tecido.h

-1

de incubação.

3.4. Determinação da atividade da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase

(PEPCK (E.C. 4.1.1.32))

A determinação da atividade da PEPCK foi realizada segundo a técnica

descrita por Oliveira e Da Silva (1997), baseado na reação de troca entre H

o oxalacetato.

As amostras de tecidos (cerca de 500mg) de caranguejos dos diferentes

grupos experimentais foram homogeneizadas em sacarose 0,25M mais fluoreto de

fenilmetilsulfonil (PMSF) na proporção de 0,5:3:0,003 (w/v/v), com a utilização de

um homogeneizador com pistilo de teflon. Em seguida, o homogeneizado foi centri-

fugado a 600xg por 10 minutos a temperatura de 4ºC e o sobrenadante transferido

para outro tubo que foi mantido em gelo.

A mistura da reação (500µl) continha tampão Tris-HCl 0,625M, oxalacetato

(OAA) 0,3M, MnCl

0,04M, MgCl

0,4M, GSH 6,25M, trifosfato de inosina (ITP)

0,02M, NaHCO

1M e 0,4µCi de NaH

(8,4mCi/mmol – Du Pont). A essa mis-

tura foram adicionados 50µl de amostra e realizada a incubação em banho metabó-

lico a 37ºC durante 4 minutos. A reação enzimática foi interrompida com a adição

de 500µl de ácido tricloroacético (TCA) 5%. As amostras foram imediatamente ae-

radas com CO

durante 5 minutos para remoção do excesso de H

. Após, as

amostras foram centrifugadas a 3000rpm durante 10 minutos. Do sobrenadante

foram retirados 300µl e repassados para os tubos de vidro contendo 3ml de líquido

de cintilação [Tolueno-Triton X-100 (2:1) - PPO (0,4%) e POPOP (0,01%)]. A radio-

atividade foi medida em espectrômetro de cintilação líquida (LKB-Wallac).

Para cada grupo experimental foi preparado um branco. Os brancos conti-

nham todos os componentes da mistura (inclusive a amostra), exceto ITP (ativador

enzimático). As contagens obtidas dos brancos eram descontadas das contagens

das amostras e os resultados da atividade foram expressos em µmol de H

incorporado em oxalacetato.mg

-1

de proteína.min

-1

de incubação.

3.5. Determinação de proteínas

A determinação da concentração de proteínas totais nos tecidos foi realiza-

da segundo o método descrito por Bradford (1976) e como padrão foi utilizada al-

bumina bovina.

3.6. Análise estatística

Os resultados foram expressos como a média mais ou menos o desvio pa-

drão da média (média ± DPM). Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) de

uma ou duas vias, com teste de comparação Sudent-Newman-Keuls (SNK). Os

dados foram considerados significativos quando P<0,05. O testes foram realizados

com o programa estatístico SigmaStat 3.1.

4. RESULTADOS

4.1. Estudo in vitro da incorporação do

C da glicina em

C-lipídios totais e

determinação da atividade da PEPCK nas brânquias anteriores em Neohelice

granulata submetidos ao estresse hiper ou hiposmótico

A medida da conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais, nas brânquias

anteriores de animais submetidos a diferentes tempos de estresse osmótico, pode

ser vista na figura 4 A.

Nas brânquias anteriores de caranguejos submetidos ao estresse hiposmó-

tico, constata-se um aumento de 3,5 vezes (p<0,05) na síntese de lipídios-

C às

72 horas de estresse, com uma diminuição de 27% no tempo de 144 horas. Nas

brânquias anteriores de animais previamente submetidos ao estresse hiperosmóti-

co, verifica-se uma diminuição de 52% na capacidade lipogênica entre os tempos

de 72 e 144 horas de estresse.

A atividade da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), medida

através da incorporação de H

em oxalacetato, nas brânquias anteriores de

animais submetidos a diferentes tempos de estresse osmótico pode ser vista na

figura 4 B.

Durante o estresse hiperosmótico, observa-se um aumento linear (r

=0,99)

na atividade da PEPCK. Entretanto, em animais submetidos ao estresse hiposmó-

tico, constata-se uma diminuição de 65% na atividade da PEPCK no tempo de 24

horas e, posteriormente, um aumento de cerca de 6 vezes no tempo de 72 horas,

mantendo-se até o final do período experimental.

Figura 4: Efeito de diferentes tempos de estresse hiperosmótico ou hiposmótico

sobre a conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais (A) (n=6-24) e sobre a ativi-

dade da enzima PEPCK (B) (n=6-12), nas brânquias anteriores de caranguejos N.

granulata. As colunas e as barras representam, respectivamente, as médias ±

DPM.

- valores médios diferentes do grupo controle (p<0,05).

- valores médios diferentes entre tempos do mesmo grupo (p<0,05).

Tempo de estresse (horas)

0h 24h 72h 144h

Atividade da PEPCK

micromol.mg

-1

de prot.min

-1

0h 24h 72h 144h

Lipídio-C

formado a partir de C

-glicina

(nmol.g

-1

de tecido.h

-1

)

Hiperosmótico

Hiposmótico

4.2. Estudo in vitro da incorporação do

C da glicina em

C-lipídios totais e

determinação da atividade da PEPCK nas brânquias posteriores em Neoheli-

ce granulata submetidos ao estresse hiper ou hiposmótico

A medida da incorporação da

C-glicina em lipídios totais em brânquias

posteriores de animais submetidos ao estresse hiper ou hiposmótico pode ser vista

na figura 5 A.

Nas brânquias posteriores de N. granulata, submetidos tanto ao estresse hi-

perosmótico como no hiposmótico, constata-se um aumento significativo (p<0,05)

na formação de lipídio-

C a partir de

C-glicina às 72 horas de estresse, retornan-

do aos valores do grupo controle às 144 horas.

Na figura 5 B pode ser vista a atividade enzimática da PEPCK nas brânquias

posteriores de animais submetidos a diferentes tempos de estresse osmótico.

Nas primeiras 24 horas de estresse hiperosmótico, observa-se um aumento

de 5,5 vezes (p<0,05) na atividade da PEPCK. Essa atividade diminui cerca de 3

vezes (p<0,05), mas mantém-se aumentada (p<0,05) em relação ao grupo controle

até o final do período experimental. Nos caranguejos submetidos ao estresse hi-

posmótico, a atividade da PEPCK diminui cerca de 50% (p<0,05) no tempo de 24

horas, retornando aos níveis próximos do grupo controle às 72 horas. No final do

período experimental novamente constata-se uma diminuição (p<0,05) na atividade

dessa enzima.

Figura 5: Efeito de diferentes tempos de estresse hiperosmótico ou hiposmótico

sobre a conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais (A) (n=7-19) e sobre a ativi-

dade da enzima PEPCK (B) (n=6), nas brânquias posteriores de caranguejos N.

granulata. As colunas e as barras representam, respectivamente, as médias ±

DPM.

- valores médios diferentes do grupo controle (p<0,05).

- valores médios diferentes entre tempos do mesmo grupo (p<0,05).

Tempo de estresse (horas)

0h 24h 72h 144h

Atividade da PEPCK

micromol.mg

-1

de prot.min

-1

0h 24h 72h 144h

Lipídio-C

formado a partir de C

-glicina

(nmol.g

-1

de tecido.h

-1

)

Hiperosmótico

Hiposmótico

a b

4.3. Estudo in vitro da incorporação do

C da glicina em

C-lipídios totais e

determinação da atividade da PEPCK no músculo da mandíbula em Neohelice

granulata submetidos ao estresse hiper ou hiposmótico

Na figura 6 A está representada a medida da incorporação de

C-glicina em

lipídios totais, no músculo da mandíbula de animais submetidos a diferentes tem-

pos de estresse osmótico.

Durante o estresse hiperosmótico, verifica-se um aumento de cerca de 44%

(p<0,05) na incorporação de

C-glicina em lipídios totais ao final do período (144h)

de tratamento. Nos animais submetidos ao estresse hiposmótico, também é possí-

vel observar um aumento na síntese de

C-lipídios totais neste mesmo tempo de

estresse.

A atividade da enzima PEPCK no músculo da mandíbula de animais subme-

tidos ao estresse osmótico está representada na figura 6 B.

Durante o choque hiperosmótico, observa-se uma diminuição de 42% na ati-

vidade da PEPCK nas primeiras 24 horas, retornando aos valores do grupo contro-

le às 72 horas e diminuindo a atividade em 66% (p<0,05) no final do período expe-

rimental. Nos animais submetidos ao estresse hiposmótico, constata-se um aumen-

to na atividade enzimática da PEPCK no tempo de 72 horas e, posteriormente,

uma diminuição de 58% no tempo de 144 horas de estresse.

Figura 6: Efeito de diferentes tempos de estresse hiperosmótico ou hiposmótico

sobre a conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais (A) (n=6-15) e sobre a ativi-

dade da enzima PEPCK (B) (n=6-12), no músculo da mandíbula de caranguejos N.

granulata. As colunas e as barras representam, respectivamente, as médias ±

DPM.

- valores médios diferentes do grupo controle (p<0,05).

- valores médios diferentes entre tempos do mesmo grupo (p<0,05).

Tempo de estresse (horas)

0h 24h 72h 144h

Atividade da PEPCK

micromol.mg

-1

de prot.min

-1

0h 24h 72h 144h

Lipídio-C

formado a partir de C

-glicina

(nmol.g

-1

de tecido.h

-1

)

Hiperosmótico

Hiposmótico

a b

4.4. Estudo in vitro da incorporação do

C da glicina em

C-lipídios totais e

determinação da atividade da PEPCK no hepatopâncreas em Neohelice gra-

nulata submetidos ao estresse hiper ou hiposmótico

O efeito de diferentes tempos de estresse hiper ou hiposmótico, sobre a in-

corporação de

C-glicina em lipídios totais no hepatopâncreas, está representado

na figura 7 A.

Durante o estresse hiperosmótico, o hepatopâncreas apresenta uma diminu-

ição de 43% (p<0,05) na síntese de

C-lipídios totais nas primeiras 24 horas de

estresse, com um aumento (p<0,05) de cerca de 2,5 vezes às 72 horas e retornan-

do aos valores próximos do grupo controle no tempo de 144 horas. Nos animais

submetidos ao estresse hiposmótico, após uma diminuição (p>0,05) no primeiro dia

de estresse, a formação de

C-lipídios totais a partir de

C-glicina retornou aos

valores do grupo controle a partir das 72 horas.

Na figura 7 B pode ser vista a atividade da enzima PEPCK no hepatopân-

creas de animais submetidos a diferentes tempos de estresse osmótico.

Nos animais submetidos ao estresse hiposmótico, observa-se um aumento

linear (r

=0,95) na atividade da PEPCK. Entretanto, em animais submetidos ao es-

tresse hiperosmótico, constata-se um aumento (p<0,05) de 2,6 vezes na atividade

da PEPCK no tempo de 24 horas e, posteriormente, um retorno aos valores do

grupo controle às 72 horas de estresse, aumentando novamente (p<0,05) a ativi-

dade enzimática ao final do período experimental.

Figura 7: Efeito de diferentes tempos de estresse hiperosmótico ou hiposmótico

sobre a conversão de

C-glicina em

C-lipídios totais (A) (n=6-18) e sobre a ativi-

dade da enzima PEPCK (B) (n=6-12), no hepatopâncreas de caranguejos N. gra-

nulata. As colunas e as barras representam, respectivamente, as médias ± DPM.

- valores médios diferentes do grupo controle (p<0,05).

- valores médios diferentes entre tempos do mesmo grupo (p<0,05).

Tempo de estresse (horas)

0h 24h 72h 144h

Atividade da PEPCK

micromol.mg

-1

de prot.min

-1

0h 24h 72h 144h

Lipídio-C

formado a partir de C

-glicina

(nmol.g

-1

de tecido.h

-1

)

Hiperosmótico

Hiposmótico

a b

5. DISCUSSÃO

Schein (1999) verificou que durante o estresse hiperosmótico, a concentra-

ção do aminoácido glicina na hemolinfa de N. granulata diminui cerca 60%. A redu-

ção na concentração da glicina na hemolinfa estaria envolvida no processo de a-

climatação do N. granulata ao estresse osmótico, aumentando a concentração in-

tracelular de aminoácidos em resposta ao choque hiperosmótico. Schein et al.

(2005 b) demonstraram que a captação de aminoácidos aumenta significativamen-

te no músculo e no hepatopâncreas de N. granulata submetido ao estresse hipe-

rosmótico. Os autores também mostraram que a oxidação de aminoácidos no he-

patopâncreas seria uma das estratégias metabólicas para aumentar a concentra-

ção de aminoácidos livres intracelulares durante o processo de aclimatação ao

meio hiperosmótico (Schein et al., 2005 b). Também a participação da via glicone-

ogênica no processo de aclimatação ao estresse osmótico foi demonstrada no he-

patopâncreas, no músculo e nas brânquias de N. granulata (Oliveira e Da Silva,

2000; Schein et al., 2004; 2005; Chittó et al., 2008 a; b).

Em N. granulata, Schein et al. (2004) realizaram a clonagem molecular da

PEPCK do músculo mandibular e verificaram a expressão desta enzima nas brân-

quias anteriores e posteriores, no hepatopâncreas, no sistema nervoso e no cora-

ção. A atividade da PEPCK no hepatopâncreas e no músculo mandibular é cerca

de 80-95% mitocondrial (Oliveira e da Silva, 1997; Schein et al., 2004; 2005 a).

Contudo, nas brânquias anteriores e posteriores a atividade dessa enzima está

dividida entre as frações citosólica (32-36%) e mitocondrial (66-68%) (Chittó et al.,

2008 b).

O tecido branquial de crustáceos decápodes apresenta uma diferenciação

funcional e estrutural. Os três pares de brânquias posteriores constituem o principal

sítio osmorregulador das espécies eurialinas, enquanto os três anteriores estão

mais associados à função respiratória e excreção de amônia (Bianchini et al.,

2008).

No presente trabalho, em brânquias anteriores de caranguejos expostos ao

meio hiperosmótico não foram observadas alterações significativas na síntese de

lipídios em relação aos animais do grupo controle. Os aminoácidos tissulares (argi-

nina, alanina, glicina, prolina, ácido glutâmico e taurina entre outros) são conside-

rados os principais efetores orgânicos osmoticamente ativos em crustáceos, contri-

buindo com cerca de 50% da pressão osmótica intracelular (Gilles e Delpire, 1997).

Durante a aclimatação ao meio hiperosmótico a concentração de aminoácidos in-

tracelulares aumenta com objetivo de limitar a alteração do volume celular. Desta

forma, a ativação da síntese de lipídios a partir de aminoácidos comprometeria a

regulação isosmótica do fluido intracelular, pois diminuiria a concentração de osmó-

litos orgânicos nas células branquiais. Bock (2005) verificou uma diminuição na

capacidade de síntese de proteínas nas brânquias anteriores às 72 horas de es-

tresse hiperosmótico.

Contudo, no presente trabalho, a atividade da PEPCK nas brânquias anterio-

res apresenta um aumento linear (r

=0,99) ao longo do estresse hiperosmótico.

Estudos prévios, realizados em brânquias anteriores deste mesmo caranguejo,

mostraram que a incorporação de

C-alanina em

C-glicose diminui significativa-

mente às 24 horas de estresse hiperosmótico, retornando a valores semelhantes

àqueles verificados no grupo controle entre 72-144horas de estresse osmótico

(Chittó et al., 2008 b). Esta redução na capacidade de síntese de glicose a partir de

aminoácidos às 24 h de estresse osmótico foi acompanhada por uma diminuição

significativa de cerca de 55% na atividade da PEPCK citosólica (Chittó et al., 2008

b). No presente trabalho foi determinada a atividade total da enzima PEPCK, o que

possivelmente mascarou a redução da atividade citosólica às 24h de estresse hipe-

rosmótico. Porém, o aumento da atividade total da PEPCK entre 72-144h de es-

tresse hiperosmótico, constatado no presente estudo, corrobora com o retorno da

capacidade de síntese de glicose, a partir de aminoácidos, constatada por Chittó et

al. (2008 b) nesse mesmo período experimental. A redução, de cerca de 40% (não

significativa), na incorporação de

C-glicina em lipídios totais em brânquias anteri-

ores às 144h de estresse hiperosmótico poderia ser interpretada como um desvio

desse aminoácido para a via gliconeogênica, reforçado pelo aumento nos valores

de glicose hemolinfática neste período experimental (Chittó, 2000).

Durante o choque hiposmótico, a partir das 72h de estresse, constata-se um

aumento significativo na atividade da enzima PEPCK em brânquias anteriores, que

coincide com o aumento da síntese de

C-lipídios totais a partir de

C-glicina. As-

sim, o aumento na síntese de lipídios, que perdura até o término dos seis dias

(144h) de estresse hiposmótico, diminuiria as concentrações intracelulares de ami-

noácidos, contribuindo para o ajuste metabólico em resposta à exposição dos ani-

mais ao meio diluído. Chittó et al. (2008 b) não verificaram, durante o choque hi-

posmótico, alteração na atividade gliconeogênica a partir de

C-alanina em N. gra-

nulata submetido durante o mesmo tempo experimental ao estresse hiposmótico.

Também o aumento significativo na incorporação da

C-glicina em lipídios totais

nas brânquias posteriores de caranguejos submetidos durante 72 horas ao estres-

se hiperosmótico foi precedido (às 24h) pelo aumento, de cerca de cinco vezes, na

atividade da PEPCK. Apesar da diminuição observada a partir das 72 horas de es-

tresse, a atividade dessa enzima manteve-se cerca de 50% mais elevada que à-

quela verificada no grupo controle. Em N. granulata submetido ao estresse hipe-

rosmótico, durante os meses de verão, a concentração de lipídios totais nas brân-

quias posteriores diminui significativamente no período compreendido entre 72 e

144 horas de choque osmótico e coincide com a redução significativa da incorpora-

ção de

C-glicerol em glicose (Chittó et al., 2008 a). Os achados do presente tra-

balho sugerem que tanto em brânquias anteriores de caranguejos submetidos ao

estresse hiposmótico como em brânquias posteriores de animais expostos ao meio

hiperosmótico haveria a participação da via gliceroneogênica. Assim, para manter o

ciclo triacilglicerol/ácido graxo e/ou reduzir a concentração de aminoácidos livres

intracelulares nas brânquias anteriores e posteriores, a formação de glicerol 3-

fosfato seria as expensas de aminoácidos via gliceroneogênese. Corroborando

com esta hipótese, nas brânquias anteriores e posteriores ocorrem as duas isofor-

mas da enzima PEPCK, a citosólica e a mitocondrial, diferentemente dos outros

tecidos de N. granulata, tais como o músculo e o hepatopâncreas, em que a ativi-

dade da PEPCK é cerca de 90% mitocondrial (Oliveira e Da Silva, 1997; Schein et

al., 2004).

A participação da enzima PEPCK citosólica na gliceroneogênese foi de-

monstrada em mamíferos (Croniger et al., 2002; Hanson e Reshef, 2003; Reshef et

al., 2003; Beale et al., 2002; Hanson, 2005). Olswang et al. (2002) verificaram que

camundongos geneticamente modificados, nos quais a PEPCKc não era expressa

no tecido adiposo, apresentavam quantidades reduzidas de gordura corporal. Por

outro lado, a superexpressão desta enzima resultava em animais obesos (Fran-

khauser et al., 2002).

Além disso, no período de aclimatação ao laboratório e ao estresse osmóti-

co, os caranguejos foram alimentados com carne bovina crua, isto é, uma dieta rica

em proteínas. Em ratos alimentados com dieta rica em proteínas a atividade da

gliceroneogênese nos tecidos adiposos branco e marrom é significativamente mai-

or que aquela verificada nos animais alimentados com dieta balanceada (Botion et

al., 1995; Brito et al., 1999). Contudo, para a confirmação da participação da glice-

roneogênese no ajuste metabólico durante o estresse hiposmótico serão necessá-

rias medidas das atividades das enzimas PEPCK citosólica e piruvato quinase e

experimentos de incorporação de piruvato-2-

C em glicerol 3-fosfato.

No presente estudo, em brânquias posteriores de caranguejos submetidos

ao choque hiposmótico constata-se uma diminuição significativa na atividade da

PEPCK às 24 e 144 horas de estresses. Estes resultados estão de acordo com os

dados obtidos por Chittó et al. (2008 b) que constataram às 72 horas de estresse

hiposmótico uma significativa diminuição da incorporação de

C-alanina em glico-

se em brânquias posteriores de N. granulata submetido aos mesmos tempos de

estresse. Contudo, os valores de incorporação de

C-glicina em lipídios totais au-

mentam marcadamente às 72 horas de estresse hiposmótico em brânquias poste-

riores. Durante o choque hiposmótico o tecido deve reduzir a concentração de ami-

noácidos livres intracelulares, assim, os átomos de carbono dos aminoácidos seri-

am convertidos à acetil-CoA, diretamente ou via fosfoenolpiruvato, e a acetil-CoA

produzida proveria de precursores a via de síntese de ácido graxo. Como conse-

qüência da diminuição na concentração de aminoácidos livres intracelulares, ocor-

reria uma redução da atividade gliconeogênica em brânquias posteriores em res-

posta a aclimatação ao meio hiposmótico.

Os efeitos do estresse hiposmótico e hiperosmótico sobre o metabolismo li-

pídico do músculo da mandíbula só foram observados no sexto (144h) dia de tra-

tamento, quando se constata um aumento significativo de cerca de 44% da lipogê-

nese a partir de

C-glicina. A diminuição da concentração intracelular de aminoá-

cidos intracelulares, durante o estresse hiposmótico, seria uma das estratégias pa-

ra a regulação do volume celular utilizada em tecidos de crustáceos (Gilles e Delpi-

re, 1997). Nesse mesmo tempo de estresse hiposmótico, foi observado por Schein

et al. (2005 b) que a oxidação e a captação de aminoácidos não sofreram altera-

ções significativas no músculo de N. granulata. Já a síntese de glicose a partir de

aminoácidos, neste mesmo tecido, aumenta significativamente às 24h de choque

hiposmótico, contudo, no período de 72-144h de tratamento os valores de glicone-

ogênese foram semelhantes àqueles verificados no grupo controle (Schein et al.,

2005 a). Nesse mesmo tempo de estresse hiposmótico, Bock (2005) observou au-

mento na síntese de proteínas, estratégia que também contribuiria para a diminui-

ção da concentração de aminoácidos do meio intracelular. Assim o aumento da

síntese de lipídios a partir de aminoácidos no músculo mandibular seria uma das

estratégias metabólicas para regular o volume celular em período mais tardio de

aclimatação ao meio hiposmótico, quando os valores de gliconeogênese retornam

a valores semelhantes aqueles do grupo controle (Schein et al., 2005 a). Entretan-

to, a atividade da enzima PEPCK não acompanhou o perfil do metabolismo lipídico

e, inclusive, apresentou uma diminuição de cerca de 47% no último dia de trata-

mento em relação aos animais do grupo controle, sugerindo que a redução no fluxo

de aminoácidos no tecido estaria controlando a atividade da enzima.

No presente trabalho, às 144 horas de aclimatação ao meio hiperosmótico,

constata-se uma redução de 57% da atividade da PEPCK acompanhada por um

aumento marcante na síntese de lipídios totais a partir de

C-glicina. Também em

músculo mandibular de N. granulata, submetido ao estresse hiperosmótico, foi veri-

ficado aumento significativo na captação de aminoácidos às 9, 12 e 24 horas, se-

guido de diminuição na capacidade gliconeogênica a partir de aminoácidos e dimi-

nuição na atividade da enzima PEPCK mitocondrial e citosólica (Waché, 2003;

Schein et al., 2005). Desta forma, os resultados do presente trabalho sugerem que

o aumento na síntese de lipídios a partir de aminoácidos, às 144h, seria uma estra-

tégia de ajuste na concentração intracelular de aminoácidos após a aclimatação ao

meio hiperosmótico. Recentemente, foi verificado que a concentração de lipídios

totais no músculo mandibular diminui significativamente durante o estresse hipe-

rosmótico (Chittó et al., 2008 a), assim o aumento na síntese de lipídios a partir de

aminoácidos também serviria para repor as reservas energéticas utilizadas durante

o esforço de regulação osmótica.

No tecido hepatopancreático, a exposição dos caranguejos por 24 horas ao

meio hiperosmótico promove um aumento na atividade da enzima PEPCK, contu-

do, a síntese de lipídios a partir de

C-glicina diminui significativamente no mesmo

período experimental. Nesse mesmo período de choque hiperosmótico foi consta-

tado aumento na captação e diminuição na oxidação de aminoácidos no hepato-

pâncreas (Schein et al., 2005 a; b). Esses parâmetros metabólicos foram determi-

nados às 24 h de estresse hiperosmótico. Estudo realizado por Waché (2003) mos-

trou que a captação de aminoácidos ocorre a partir das 9 horas de exposição ao

meio salino. Assim, o aumento da atividade da PEPCK constatado no presente tra-

balho (às 24 e 144 horas) seria uma conseqüência do incremento na concentração

de aminoácidos livres intracelulares e do ajuste do volume celular ocorrido antes

das 24 horas. Como o hepatopâncreas é um órgão metabólico importante para a

resposta ao estresse, os ajustes metabólicos estratégicos para a aclimatação ao

estresse osmótico ocorreriam temporalmente mais rapidamente que nos outros

tecidos como, por exemplo, no músculo. O aumento na síntese de lipídios a partir

C-glicina às 72 horas de estresse hiperosmótico e o retorno da atividade da

PEPCK a valores semelhantes àqueles verificados no grupo controle, corroboram

com a hipótese de que um ajuste metabólico mais rápido ocorreria no hepatopân-

creas.

Nos caranguejos submetidos ao estresse hiposmótico, a lipogênese não se-

ria uma das rotas envolvidas no ajuste metabólico para regulação do volume celu-

lar no hepatopâncreas, pois os valores mantiveram-se próximos aos do grupo con-

trole durante todo o período de exposição dos animais ao meio diluído.

O aumento linear (r

=0,95) da atividade da PEPCK no hepatopâncreas de

caranguejos submetidos ao estresse hiposmótico pode ser explicado pelo aumento

da atividade gliconeogênica. Neste mesmo tecido, Oliveira e Da Silva (2000) verifi-

caram aumento significativo da incorporação de

C-alanina em glicose e da ativi-

dade da PEPCK nos mesmos tempos de estresse hiposmótico utilizados no pre-

sente estudo. Desta forma, a gliconeogênese a partir de aminoácidos durante a

aclimatação ao choque hiposmótico diminuiria a concentração intracelular de com-

postos nitrogenados. As autoras ainda demonstraram neste mesmo estudo um

aumento nas concentrações de uréia na hemolinfa, sugerindo um aumento no ca-

tabolismo de aminoácidos e, com isso, diminuição nas concentrações intracelulares

destes compostos durante o ajuste ao estresse hiposmótico.

O presente estudo demonstra que a síntese de

C-lipídios a partir de

C-

glicina seria uma via metabólica que participaria do ajuste de aminoácidos intrace-

lulares durante o processo de aclimatação ao estresse osmótico em Neohelice

granulata. Nas brânquias anteriores (estresse hiposmótico) e posteriores (estresse

hiperosmótico) provavelmente o aumento na incorporação da

C-glicina ocorreria

via gliceroneogênese. Nestes órgãos a atividade da PEPCK ocorre tanto na fração

citosólica como na mitocondrial, o que permitiria a conversão da glicina em glicerol,

mantendo, assim, o ciclo triacilglicerol/ácido graxo nesses tecidos. Contudo, estu-

dos mais aprofundados sobre a via gliceroneogênica em N. granulata serão neces-

sários para confirmar estes resultados.

Nas brânquias posteriores (no estresse hiposmótico), no músculo e no hepa-

topâncreas a síntese de lipídios através da formação de ácidos graxos a partir de

C-glicina seria uma via de ajuste de concentração de aminoácidos livres intracelu-

lares durante a aclimatação ao estresse osmótico.

Figura 8: Contribuição do presente trabalho para a compreensão das vias

metabólicas envolvidas na regulação osmótica em N. granulata.

Triglicerídeo

Glicerol

Glicerol 3-fosfato

Acetil-CoA

GLIC

Ácido-graxo

PROTEÍNAS

OXIDAÇÃO PARA

Piruvato

Diidroxiacetona fosfato

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