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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM
RATOS
Karina Maria Cancelliero
SÃO CARLOS
2007
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ii
ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM
RATOS
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iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM
RATOS
Karina Maria Cancelliero
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Fisioterapia da Universidade
Federal de São Carlos, como parte dos
requisitos para obtenção do Título de
Doutora em Fisioterapia.
Orientador: Prof. Dr. Dirceu Costa
SÃO CARLOS
2007
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
C215ed
Cancelliero, Karina Maria.
Estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET)
em ratos / Karina Maria Cancelliero. -- São Carlos : UFSCar,
2008.
121 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2007.
1. EDET. 2. Diafragma. 3. Bleomicina. 4. Fibrose
pulmonar. I. Título.
CDD: 615.845 (20
a
)
iv
KARINA MARIA CANCELLIERO
"ESTIMULAÇÃO DIAFRAGMÁTICA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (EDET) EM
RATOS”
Tese apresentada à Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Doutora em Fisioterapia.
BANCA EXAMINADORA
Presidente: Dirceu Costa (Orientador)
1
o
Examinador: Audrey Borghi e Silva (UFSCar)
2
o
Examinador: Fabio Viadanna Serrão (UFSCar)
3
o
Examinador: Fernanda Klein Marcondes (UNICAMP)
4
o
Examinador: Rinaldo Roberto de Jesus Guirro (UNIMEP)
v
A Deus, pela minha vida e por guiar meu
caminho, mostrando que todos os momentos ocorrem no
tempo certo, que é o traçado por Ele.
À Nossa Senhora, que me ajuda em todos os
momentos, me dando força e me mostrando que a fé e a
esperança podem levar à realização de sonhos.
Aos meus pais, pela educação, pelo incentivo
constante e por me mostrarem que a fé em Deus é
primordial para a vida.
vi
DEDICATÓRIA
Aos meus Pais, João Alberto Cancelliero e Zilda M. Mantelatto Cancelliero
O agradecimento a vocês é diário, pois todos os dias da minha vida eu recebo a ajuda de
vocês.
Muito obrigada pela educação, pelo apoio, pelo incentivo constante e pela oportunidade de
realizar muitos sonhos profissionais.
Sempre agradeço a Deus por eu poder ter pais como vocês, exemplos de amor e de fé.
Muito obrigada por estarem sempre ao meu lado, pois vocês me ajudaram a concluir mais
uma etapa da minha vida profissional.
Meu agradecimento a vocês é eterno!
vii
AGRADECIMENTO ESPECIAL
MEU ORIENTADR
Prof. Dr. Dirceu Costa
Primeiramente, muito obrigada por acreditar em mim e assim eu ter a oportunidade de realizar
um sonho.
Muito obrigada pelos ensinamentos científicos, pelo apoio e pela dedicação.
Mas além desses, te agradeço pelos ensinamentos relacionados à vida profissional, que eram
constantes, além daqueles relacionados à prática clínica da fisioterapia respiratória, que foram
essenciais para a minha atuação profissional.
Muito obrigada também pelo incentivo relacionado à continuidade do caminho da pesquisa.
Prof. Dirceu, sempre serei grata a você por essa conquista, onde o centro da minha formação,
nessa etapa, foi o desenvolvimento desse projeto, mas foi a união com as dificuldades, as
oportunidades e as experiências encontradas nesses três anos que proporcionaram uma etapa
de conhecimentos e uma experiência inesquecível.
viii
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto da Silva
É difícil encontrar palavras para te agradecer, pois foi com a sua ajuda que eu pude realizar
meus sonhos profissionais.
Foram sete anos de pesquisa ao seu lado, onde posso dizer que minha formação profissional
foi moldada por todas as oportunidades que você me proporcionou durante esses anos.
Eu sempre serei grata a você e saiba que você é um profissional ímpar, que eu sempre terei
como exemplo na minha vida profissional.
Que Deus sempre esteja ao seu lado te iluminando, te orientando e te dando oportunidades
para ajudar pessoas a realizarem sonhos!
Carlos, muito obrigada por tudo o que fez por mim!
ix
AGRADECIMENTOS
A todas as pessoas que colaboraram, direta ou indiretamente, para a realização desse
trabalho e pela conquista de mais uma etapa da minha vida profissional
A Deus
Aos Meus Pais
Aos meus irmãos
Ao Rafael
Ao meu orientador, prof. Dr. Dirceu Costa
Ao meu amigo, prof. Dr. Carlos Alberto da Silva
Aos colegas da UFSCar: Daniela, Carol, Camila, Michel, Gabriel, João e Paula
Aos colegas da Unidade de Fisioterapia Respiratória da UFSCar: Bruna, Eloisa, prof.
Mauricio Jamami e Profa. Valéria Amorim Pires Di Lorenzo
Aos colegas da UNIMEP: Theresa, Luciano, Cecília e Rommel.
Ao meu grande colega de pesquisa João Luiz Quagliotti Durigan
Ao meu tio Fernando Luis Medina Mantelatto
Laboratório de Fisiologia da UNIMEP
À Patrícia Carla Paulino Belotto e Melissa Victo
Aos professores: Dr. Rinaldo Roberto de Jesus Guirro, Dra. Maria Luiza Ozores Polacow,
Dra. Fernanda Klein Marcondes, Dr. Gerson Eduardo Rocha Campos, Dra. Tania de Fátima
Salvini, Dr. Miguel Arcanjo Areas, Dra. Vivian Cristine Calegari, Dr. Wilton Marlindo
Santana Nunes e Dr. Ariovaldo Pereira da Cruz Neto.
Aos meus mestres da pós-graduação
À Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - Processo 04/14798-5
x
LETRAS
Penso nas letras como cores
Penso na união das letras como frases a serem ditas
Penso na junção de frases como desejos contidos no íntimo do cérebro onde
O racional cruza com o emocional e busca expressar o que ainda não se concretizou
Penso nos verbos como pontos de união
Penso nos adjetivos como hastes de apoio que suspendem as vontades contidas no subconsciente
Penso nos substantivos como mestres de ensino que passeiam livres pelas frases sem se importar
se são ou não excluídos por vírgulas jogadas ao acaso
Penso nos adjuntos adverbiais que como guias dão sentido a tudo
Penso nas vírgulas como sendo donos das frases, impondo onde o raciocínio tem que acabar
Penso no ponto, não como sendo o final de tudo, mas o início de uma nova frase
Doutorar-se não significa o ponto final, mas o recomeço onde se escolhe a vírgula, se determina
o adjetivo, se constrói a frase e se expõe o mais íntimo que viaja no inconsciente para explicar
algo que até então outros cérebros ainda não conseguiram expressar
Tornar-se doutor é criar asas para alçar vôo por onde a imaginação fluir
É tornar-se ponto de referencia nas frases, sentido nos adjetivos e se eternizar nos conceitos que
por muito tempo estão escondidos no sentido da vida
É perceber DEUS contando em seu ouvido um pouco do real significado que ele dimensionou
para sua existência ou ainda revelar o porquê DEUS te escolheu para ser o mensageiro deste
mistério.
Carlos Alberto da Silva
xi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xiii
LISTA DE TABELAS ........................................................................................... xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................................ xviii
RESUMO ............................................................................................................... xx
ABSTRACT ........................................................................................................... xxii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ....................................
2.2. Sulfato de Bleomicina ................................................................................
01
05
09
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral ............................................................................................
3.2. Objetivos específicos..................................................................................
13
13
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais .................................................................................................... 15
4.2. Estimulação diafragmática elétrica transcutânea ..................................... 15
4.3. Tratamento com bleomicina ..................................................................... 16
4.4. Amostragem.............................................................................................. 17
4.5. Conteúdo de glicogênio muscular ............................................................ 17
4.6. Conteúdo de proteínas totais e DNA......................................................... 17
4.7. TBARS ..................................................................................................... 17
4.8. Determinação dos tipos de fibras musculares ........................................... 18
4.9. Respirometria de fluxo aberto ................................................................... 18
4.10. Eletrocardiograma .................................................................................. 19
4.11. Sensibilidade atrial às catecolaminas ..................................................... 19
4.12. Imunohistoquímica do nervo vago ......................................................... 20
4.13. Efluxo de
86
Rb
+
........................................................................................ 21
4.14. Análise da população de receptores de insulina ..................................... 22
4.15. Insulina plasmática ................................................................................. 23
4.16. Secreção estática de insulina .................................................................. 23
4.17. GTT ........................................................................................................ 24
4.18. ITT .......................................................................................................... 25
xii
4.19. Dosagem de Insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas
pancreáticas......................................................................................................
25
4.20. Perfil hematológico ................................................................................ 27
4.21. Fragilidade osmótica .............................................................................. 28
4.22. Concentração plasmática de glicose, lactato, creatinina, fosfatase
alcalina, uréia, AST e ALT..............................................................................
29
4.23. Análise de úlcera gástrica ....................................................................... 29
4.24. Perfil bioquímico durante uma sessão de EDET .................................... 29
4.25. Análise morfométrica do tecido pulmonar.............................................. 30
4.26. Análise das metaloproteases musculares................................................. 30
4.27. Análise das citocinas plasmáticas .......................................................... 31
4.28. Análise estatística ................................................................................... 31
5. RESULTADOS
5.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ...................................
5.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET ........................
34
47
6. DISCUSSÃO
6.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea ...................................
6.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET .......................
60
74
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................ 93
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 96
9. ANEXOS
9.1. Aprovação do C
omitê de ética em experimentação animal ............
116
9.2. Artigos publicados.................................................................................. 117
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.
Estimulação elétrica realizada no animal através de dois eletrodos de
superfície (1 e 2) acoplados com gel na região lateral do gradil costal, entre
a 4
a
e a 6
a
costela..............................................................................................
16
FIGURA 2.
Administração do sulfato de bleomicina via intratraqueal com uma sonda.....
16
FIGURA 3.
Animal com quatro eletrodos posicionados bilateralmente nas patas
inferiores e superiores para a análise do registro eletrocardiográfico..............
19
FIGURA 4.
Curvas concentração-efeito à noradrenalina, antes (A) e após (B) a inibição
dos sistemas de metabolização das catecolaminas, obtidas em átrios direitos
isolados de ratos controle ou submetidos à estimulação diafragmática
elétrica transcutânea. n=6/grupo.....................................................................
38
FIGURA 5.
Corte transversal do esôfago de rato controle correspondente à região
subdiafragmática. Observa-se a presença de imunoreatividade positiva para
neurofilamentos nos troncos vagais anterior (va), posterior (vp) e os demais
ramos. ABC peroxidase; contra coloração com hematoxilina de Meyer
(aumento 40x)...........................................................................................................
39
FIGURA 6.
Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas
isoladas de ratos do grupo controle. Na linha A pode-se verificar a dinâmica do
efluxo do
86
Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato
(5.6mM) durante 80 minutos. Em B, as linhas verticais interrompidas (42-60
o
min) indicam o momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada
ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150
ilhotas......................................................................................................................
41
FIGURA 7.
Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas
pancreáticas isoladas de ratos do grupo controle. A linha A mostra o efluxo de
ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de
glicose, durante todo o período. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60
o
min) indicam o momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada
ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150
ilhotas.......................................................................................................................
42
FIGURA 8.
Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas
isoladas de ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea
(EDET). Na linha A de efluxo pode-se verificar a dinâmica do efluxo do
86
Rb
xiv
de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato (5.6mM) durante
80 minutos. Em B (42-60
o
min), as linhas verticais interrompidas indicam o
momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a
média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas..........................
42
FIGURA 9.
Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas
pancreáticas isoladas de ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica
transcutânea. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de
Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período de
perfusão. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60
o
min) indicam o
momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto representa
a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.......................
43
FIGURA 10.
Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações
2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado
com EDET durante 7 dias (preto). n=6, p<0,05, * comparado ao controle......
44
FIGURA 11.
Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações
2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de glicose dos grupos controle (branco) e tratado
com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento (preto). n=6,
p<0,05, * comparado ao controle.....................................................................
44
FIGURA 12.
Comportamento da concentração de insulina plasmática (ng/mL; média)
durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos
tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão)............................................
46
FIGURA 13.
Comportamento da concentração de glicemia e lactacidemia (mmol/L;
média) durante a sessão de estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20)
nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão)......................................
46
FIGURA 14.
Alvéolos e sacos alveolares dos pulmões dos grupos controle (A) e tratado
com bleomicina (B). Em B, no tecido intersticial, entre duas camadas de
células epiteliais alveolares, o septo alveolar é maior e a área alveolar é
menor (100x, HE).............................................................................................
47
FIGURA 15.
Teste de fragilidade osmótica nos grupos controle e tratado com bleomicina
(n=6) ................................................................................................................
50
FIGURA 16.
Teste de tolerância à glicose (GTT) aplicado nos grupos controle e tratado
com bleomicina, analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0,
5, 10, 15, 20, 30 e 60, após a sobrecarga da glicose. n=6, p<0,05, sendo que
o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle..............
51
xv
FIGURA 17.
Teste de tolerância à insulina (ITT) aplicado nos grupos controle e tratado
com bleomicina, analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0;
2,5; 5; 10 e 20, após a aplicação da insulina. n=6, p<0,05, sendo que o grupo
tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle............................
52
FIGURA 18.
Concentração de insulina (ng.ilh.h) dos grupos controle (C) e bleomicina
(Ble) submetidos ao teste de secreção estática de insulina nas concentrações
2,8mM, 8,3mM e 22,2mM de glicose. Os valores correspondem à
média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle. Em A, representação
gráfica em linhas e em B, em barras.................................................................
53
QUADRO 1.
Desenho Experimental .....................................................................................
32
QUADRO 2.
Síntese dos resultados ......................................................................................
58
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.
Concentração do glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal,
peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com estimulação
diafragmática elétrica transcutânea (EDET)........................................................
35
TABELA 2.
Concentração de proteínas totais (mg/100mg) dos músculos diafragma,
intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com
estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET)....................................
35
TABELA 3.
Frequência cardíaca (FC, batimentos/minuto), dos intervalos QR, QT, QTc,
PR (mm) e do eixo elétrico cardíaco (graus) obtidos na avaliação
eletrocardiográfica dos grupos controle (C) e tratado com a estimulação
diafragmática elétrica transcutânea (EDET)........................................................
36
TABELA 4. Valores de freqüência inicial (FI, batimentos/minuto) e resposta máxima (RM,
batimentos/minuto) à noradrenalina de átrios direitos isolados de ratos dos
grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea
(EDET) ...............................................................................................................
37
TABELA 5. Valores pD
2
da noradrenalina de átrios direitos isolados dos grupos controle e
tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET)...............
37
TABELA 6.
Conteúdo de TBARS (TBARS/mg tecido) do plasma e dos músculos
diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos grupos controle e tratado com
bleomicina............................................................................................................
48
TABELA 7.
Concentração plasmática de glicose (mg/dL), lactato (mmol/L), uréia (mg/dL),
creatinina (mg/dL), fosfatase alcalina (U/L), aspartato aminotransferase (AST,
U/mL), alanina aminotransferase (ALT, U/mL), ácidos graxos livre (AGL,
mmol/L) dos grupos controle (C) e tratado com bleomicina..............................
48
TABELA 8.
Perfil hematológico do grupo controle e tratado com bleomicina, constando-se
de eritrometria (células/mm
3
), hematócrito (%), hemoglobina (g/dL).................
49
TABELA 9.
Leucometria, linfócitos do timo, linfócitos dos linfonodos mesentéricos e
macrófagos torácicos dos grupos controle (C) e bleomicina (B).........................
49
TABELA 10.
Concentração de insulina (ng.ilh.h) dos grupos controle e bleomicina
submetidos ao teste de secreção estática de insulina nas concentrações 2,8; 8,3
e 22,2mM de glicose.............................................................................................
52
TABELA 11.
Tabela 11. Concentração (Ua) e immunoblotting de insulina, GLUT2
(transportador de glicose 2), PKC (proteína quinase C) e PKA (proteína
xvii
quinase A) em ilhotas isoladas e dos grupos controle (C) e tratado com
bleomicina (B)......................................................................................................
54
TABELA 12.
Conteúdo de glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal,
peitoral e abdominal dos grupos controle (C), tratado com bleomicina (B) e
tratado com bleomicina + EDET (B+EDET).......................................................
55
TABELA 13.
Concentração (%) e immunoblotting de receptores de insulina do músculo
diafragma dos grupos controle (C), tratado com bleomicina (B) e tratado com
bleomicina + EDET (B+EDET). .........................................................................
55
TABELA 14.
Concentração de insulina plasmática (ng/mL) dos grupos controle (C), tratado
com bleomicina (B) e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET)...................
56
TABELA 15.
Peso (g) das glândulas supra-renais, timo e baço dos grupos controle (C),
tratado com bleomicina (B) e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET).......
56
TABELA 16.
Densitometria quantitativa das bandas de zimografia MMP-2 (pró-ativa,
intermediária e ativa) em unidade arbitrária (%) em músculo diafragma dos
grupos controle (C), tratado com bleomicina (B), EDET e tratado com
bleomicina + EDET (B+EDET) ..........................................................................
57
TABELA 17.
Citocinas plasmáticas IL-10, IL-6 e TNF-α dos grupos controle, EDET, pós-
EDET, bleomicina e bleomicina associado à EDET............................................
57
xviii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
β = beta
ADP= difosfato de adenosina
AGL = ácidos graxos livres
ALT = alanina amino transferase
AMP = monofosfato de adenosina
AMPK = proteína quinase ativada por AMP
AST = aspartato amino transferase
ATP = trifosfato de adenosina
bat/min = batimento por minuto
CCE = curva concentração-efeito
cDNA: DNA complementar
CO
2
= gás carbônico
dL = decilitro
DNA = ácido desoxiribonucléico
DPOC = doença pulmonar obstrutiva crônica
ECG = eletrocardiograma
EDET = estimulação diafragmática elétrica transcutânea
FiO
2
= fração inspirada de oxigênio
g = grama
g = gravidade
GLUT2 = transportador de glicose 2
GTT = teste de tolerância à glicose
Hz = Hertz
IL-10 = interleucina 10
IL-1ra = receptor antagonista de IL-1
IL-6 = interleucina 6
IR = receptor de insulina
ITT = teste de tolerância à insulina
kg = quilograma
KOH = hidróxido de potássio
mA = miliamper
xix
mATPase = ATPase miofibrilar
mg = miligrama
min = minuto
mL = mililitro
mM (mmol) = milimolar
MMPs = metaloproteases
ms = milisegundo
µl = microlitros
µM = micromolar
µm
2
= micrômetro quadrado
ng = nanograma
ng.ilh.h = nanograma por ilhota por hora
nm = nanômetro
NOS = óxido nítrico sintetase
o
C = grau Celsius
O
2
= oxigênio
PKA = proteína quinase A
PKC = proteína quinase C
PO
2
= pressão arterial de oxigênio
86
Rb
+
= rubídio
RNA = ácido ribonucléico
ROS = espécies reativas de oxigênio
rpm = rotações por minuto
TBARS = substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TGF-β = Fator de Crescimento de Transformação-β
TIMPs = inibidores de metaloproteases
TNF-α = fator de necrose tumoral alfa
VCO
2
= consumo de gás carbônico
VO
2
= consumo de oxigênio
VO
2
máximo = consumo máximo de oxigênio
xx
RESUMO
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da estimulação diafragmática elétrica transcutânea
(EDET) e da bleomicina tanto nos músculos respiratórios quanto em órgãos que poderiam ser
influenciados pelos tratamentos. Ratos Wistar foram divididos em 6 grupos (n=6-8/grupo):
controle, tratado com EDET, tratado com bleomicina, tratado com bleomicina + EDET, pós-
EDET e tratado com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento. As análises
realizadas foram: conteúdo de glicogênio, TBARS (substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico), proteínas totais e DNA dos músculos diafragma (D), intercostal (I), peitoral
(P) e abdominal (A), tipagem de fibra e população de receptores de insulina do diafragma,
perfil bioquímico após uma sessão (glicemia, lactacidemia, insulina, ácido ascórbico e
colesterol da supra-renal, glicogênio muscular), eletrocardiograma (ECG), sensibilidade atrial
às catecolaminas, respirometria, imunohistoquímica do nervo vago, efluxo de
86
Rb
+
, secreção
estática de insulina, insulina plasmática, GTT, ITT, concentrações de PKA, PKC e GLUT2
das ilhotas pancreáticas, perfil hematológico, fragilidade osmótica, concentração plasmática
de glicose, lactato, creatinina, uréia, fosfatase alcalina, TBARS, AST e ALT, além de ácidos
graxos livres, presença de úlcera gástrica, peso das glândulas supra-renais, timo e baço,
morfometria do tecido pulmonar, análise de metaloproteases musculares e citocinas
plasmáticas. A análise estatística foi realizada pelo teste de normalidade Kolmogorov-
Smirnov seguido do teste t ou da ANOVA e Tukey (α<0,05). Foi observado que a EDET
promoveu alteração significativa no conteúdo de glicogênio dos músculos respiratórios, nos
parâmetros bioquímicos avaliados durante uma sessão de EDET, na tipagem de fibra
diafragmática, nos receptores de insulina, na insulinemia, além do efluxo de
86
Rb
+
e secreção
estática de insulina. Com relação às proteínas totais e DNA musculares, respirometria, análise
gástrica, parâmetros do ECG (freqüência cardíaca, intervalos QR, QT e QTc) e sensibilidade
atrial não apresentaram diferença na presença da EDET. O tratamento com bleomicina
promoveu redução na densidade da área alveolar, além de alteração no conteúdo de TBARS e
glicogênio dos músculos respiratórios, nos parâmetros bioquímicos como AST, ALT, ácidos
graxos livres e lactacidemia, além de parâmetros hematológicos como no hematócrito e
hemoglobina. O grupo tratado também apresentou alterações relacionadas ao pâncreas,
destacando os testes GTT, ITT, teste de secreção estática de insulina além das concentrações
de GLUT2, PKC e PKA. O grupo tratado com bleomicina associado à EDET apresentou
alteração significativa no conteúdo de glicogênio, nos receptores de insulina, insulinemia,
lactacidemia, hematócrito e no peso das supra-renais e timo. Com relação às metaloproteases
e às citocinas plasmáticas, não houve alteração significativa em nenhum dos grupos
xxi
analisados no período agudo de tratamento. Assim, a EDET foi eficaz em melhorar o perfil
metabólico da musculatura respiratória e interferir na tipagem de fibra diafragmática sem
alterar parâmetros cardíacos, porém ressalta-se a interferência na atividade vagal relacionada
ao pâncreas. O tratamento com bleomicina promoveu alterações não somente no tecido
pulmonar, mas também nos músculos respiratórios e outros sistemas, principalmente
relacionado ao pâncreas, destacando que a EDET aplicada nessa condição mostrou-se eficaz à
musculatura respiratória, promovendo aumento no conteúdo de glicogênio e de hemoglobina
bem como na população dos receptores de insulina do diafragma.
Palavras-chave: diafragma - estimulação elétrica - bleomicina - fibrose pulmonar -
fisioterapia
xxii
ABSTRACT
The objective of this study was to assess the effect of transcutaneous electrical diaphragmatic
stimulation (TEDS) and of bleomycin as much in respiratory muscles as in organs that could
be influenced by the treatments. Wistar male rats were divided into 6 groups (n=6-8/group):
control, treated with TEDS, treated with bleomycin, treated with bleomycin + TEDS, after-
TEDS and treated with TEDS for 7 days followed 7 days without treatment. The analyses
realized were: glycogen content, TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances), total
proteins and DNA of diaphragm (D), intercostals (I), pectoral (P) and abdominal (A) muscles,
fibers type and population of diaphragm insulin receptor, biochemical profile after one session
(glycemia, lactacidemia, insulin, ascorbic acid and cholesterol of supra-renal, muscle
glycogen), electrocardiogram (ECG), atrial sensibility to catecholamines, respirometry,
imunohistochemic of vagus nerve,
86
Rb
+
efflux, static secretion of insulin, insulin plasmatic,
GTT, ITT, concentrations of PKA, PKC and GLUT2 in pancreatic islets, hematological
profile, osmotic fragility, plasmatic concentration of glucose, lactate, creatinine, urea, alkaline
phosphatase, TBARS, AST and ALT, free fatty acid, gastric ulcer presence, weight of supra-
renais glands, thymus, spleen, pulmonary tissue morphometry, muscle metalloproteases
analysis and plasmatic cytokines. The statistical analysis was carried by the normality test
Kolmogorov-Smirnov followed by Student t-test or ANOVA and Tukey (α<0.05). It was
observed that TEDS promoted significant alteration in glycogen content of respiratory
muscles, in biochemical parameters evaluated during one TEDS session, in diaphragmatic
fiber type, in insulin receptors, in insulinemia, besides of
86
Rb
+
efflux and static secretion of
insulin. With relation to muscle total proteins and DNA, respirometry, gastric analyses, ECG
parameters (heart rate, QR, QT and QTc intervals) and atrial sensibility didn’t present
difference in TEDS presence. The bleomycin treatment promoted decrease in alveolar area
density besides of alteration in content of TBARS and respiratory muscles glycogen, in
biochemical parameters as AST, ALT, free fatty acid and e lactacidemia besides
hematological parameters as hematocrit and haemoglobin. The group treated also showed
alterations related to pancreas, detaching GTT and ITT tests, static secretion of insulin besides
GLUT2, PKC e PKA concentrations. The group treated with bleomycin associated TEDS
showed significant alteration in glycogen content, insulin receptors, insulinemia, lactacidemia,
hematocrit and weight of supra-renais and thymus. With relation to metalloproteases and
plasmatic cytokines, did not have significant difference in none of the analyzed groups in
acute period of treatment. Thus, the TEDS was efficient in improving the metabolic profile of
respiratory muscles musculature and intervening in diaphragmatic fiber type without
xxiii
modifying cardiac parameters, however it is standed out interference in the vagal activity
related to the pancreas. Already the bleomycin treatment not only promoted alterations in
pulmonary tissue, but also in respiratory muscles and other systems, mainly related to the
pancreas, detaching that the TEDS applied in this condition revealed efficient to the
respiratory muscles, promoting increase in content of glycogen and of hemoglobin and in
population of diaphragm insulin receptors.
Keywords: diaphragm - electrical stimulation – bleomycin – pulmonary fibrosis – physical
therapy
1
1. INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
Esse trabalho surgiu da necessidade de se entender melhor o efeito da
estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET) no músculo diafragma, uma vez que
esse recurso fisioterapêutico é pouco abordado na literatura científica, mesmo sendo utilizado
em pacientes, principalmente aqueles submetidos à ventilação mecânica, acamados ou mesmo
com distrofia muscular. Além disso, os parâmetros da corrente elétrica aplicados na EDET
são questionáveis, pois há aparelhos com protocolos prontos, o que não é interessante, uma
vez que a condição muscular pode se alterar por vários fatores, destacando a mudança do tipo
de fibra muscular, a qual leva à escolha de parâmetros próprios para cada tipo de condição
clínica.
No Brasil, alguns pesquisadores se destacaram na aplicação da EDET na
prática clínica, como por exemplo, Carlos Alberto Azeredo, utilizando esse recurso em
Unidade de Terapia Intensiva e Maria Ignez Zanetti Feltrim que vem utilizando em pacientes
que se submeteram à cirurgia cardíaca. Porém, esse recurso ainda precisa de mais estudos
científicos, pois poucos são os trabalhos documentados tanto no Brasil como mundialmente.
A partir dessa lacuna, surgiu a idéia de se entender melhor esse recurso com
relação aos seus efeitos fisiológicos no músculo esquelético, além de que um estudo já estava
sendo desenvolvido, no mesmo grupo de pesquisa, porém com humanos e uma co-relação
poderia ser feita nessa interface de pesquisa humano-animal. Com isso, surgiu a idéia e
consequentemente a busca de estudos na literatura científica, porém, dentro da metodologia
proposta, não foi encontrado trabalho abordando o efeito da EDET em ratos e em nenhum
outro modelo experimental.
Com base nessa realidade, foi necessário adaptar a EDET para aplicação em
ratos, desenvolvendo um protocolo similar ao utilizado no ser humano, mais especificamente
com relação à frequência da corrente, pois na literatura constam trabalhos de estimulação
elétrica em diafragma somente relacionados a eletrodos subcutâneos, sendo implantados no
ponto motor ou mesmo no nervo frênico. Diante disso, optou-se pela estimulação elétrica por
meio de eletrodo transcutâneo, comumente utilizada pela fisioterapia.
Sendo assim, apesar do estudo abranger uma análise mais sistêmica, houve a
preocupação de se conhecer a EDET de forma mais ampla, invasivamente, para que o
protocolo estabelecido pudesse futuramente ser reproduzido em humanos. Como a corrente
elétrica é aplicada na região do tórax, isso requer segurança relacionada a outros sistemas do
3
organismo, de forma que o protocolo também exigiu garantia para a viabilidade da utilização
do mesmo em estudos com animais.
Além do objetivo de se propor um protocolo da EDET aplicada em ratos,
houve também a inserção de uma condição patológica pulmonar, especificamente a fibrose
pulmonar, gerada por um quimioterápico, para avaliar a condição dos músculos respiratórios,
que são alvos de ação da fisioterapia, a qual, dentro da área respiratória, também trabalha com
treinamento de força e/ou de resistência, e por isso, o conhecimento muscular de forma mais
invasiva é necessário para se entender melhor os mecanismos que levam o indivíduo
pneumopata a ter fraqueza e/ou fadiga muscular. Assim, a EDET poderia ser um recurso
complementar na área da fisioterapia respiratória para minimizar algum efeito deletério
desencadeado pela bleomicina.
Nesse contexto, apesar desse trabalho avaliar fisiologicamente outros sistemas
no decorrer do seu desenvolvimento, o que é essencial à visão ampla do profissional
fisioterapeuta, o objetivo principal foi o desenvolvimento do protocolo da EDET em ratos,
uma vez que não havia trabalhos na literatura científica de maneira invasiva, sendo somente
abordado em humanos com métodos de avaliação relacionados a parâmetros funcionais.
4
2. REVISÃO DA LITERATURA
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
2. 1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea
O tecido muscular tem a característica de plasticidade funcional, ou seja, de se
adaptar de acordo com o estímulo aplicado, como por exemplo, a inatividade, imobilização,
diferentes tipos de exercício, estimulação elétrica, nutrição, inervação. Assim como a
imobilização articular promove hipotrofia de músculos periféricos, o diafragma também pode
passar por um estado de inatividade, como observado nos casos de ventilação mecânica,
desencadeando o mesmo quadro ou, até mesmo, progredir para a atrofia.
Le Bourdelles et al. (1994) avaliaram a ventilação mecânica com pressão
positiva em ratos e observaram que tão pouco quanto 48 horas já foram suficientes para
promover atrofia do diafragma, além da redução das suas propriedades contráteis. Esta
importante observação instiga outros estudos relacionados à utilização de períodos de
estimulação elétrica no intuito de prevenir a atrofia muscular do diafragma em humanos.
A fisioterapia é a área que possui a estimulação elétrica como um dos recursos
utilizados na reabilitação neuromuscular, sendo este recurso considerado uma modalidade útil
de assistência à contração muscular para indivíduos que apresentam dificuldade na realização
do exercício voluntário (HAMADA et al., 2003). Uma especificidade dos recursos
eletroterapêuticos é a estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET), utilizada para
melhorar a função ventilatória, auxiliando pacientes com fraqueza dos músculos respiratórios
ou submetidos à ventilação mecânica. Porém, além dos poucos estudos disponíveis na
literatura abordando os parâmetros e benefícios desse recurso à musculatura respiratória,
especialmente o músculo diafragma, esses são direcionados à abordagem em seres humanos,
impossibilitando a obtenção de importantes informações fisiológicas, só possíveis em estudos
invasivos.
A literatura mostra que pacientes submetidos a treinamento muscular
profilático obtiveram melhora da força e função muscular respiratória, além da melhora da
oxigenação, ventilação e diminuição no tempo de hospitalização (GREEN et al., 2001).
Contudo, não foi possível informar se houve alterações estruturais nesses músculos, por
exemplo.
Historicamente, há um grande interesse em estimular eletricamente o músculo
diafragma, havendo relatos da aplicação de estímulos elétricos em vítima apnéica que
apresentava asfixia tóxica por carvão (SARNOFF, MALONEY e SARNOFF, 1950). Assim,
6
frente à falta de recursos técnicos para determinar parâmetros da corrente elétrica utilizada,
houve uma busca por localizar os pontos ideais para a aplicação da EDET em humanos. Foi
proposto que o estímulo deveria ser aplicado entre os músculos escaleno e
esternocleidomastóideo de cada lado do pescoço por representar o melhor ponto para estímulo
do nervo frênico e conseqüente a estimulação do diafragma. Esta técnica foi estudada em
humanos neonatos e portadores de poliomielite, com o objetivo de promover a contração
muscular diafragmática (SARNOFF, SARNOFF e WHITTENBERGER, 1951;
GOLDENTHAL, 1961), mas nessa época, faltaram maiores informações científicas e
fisiológicas sobre a técnica.
Na década de 80, foi realizado um trabalho pioneiro com pacientes portadores
de disfunções musculares diafragmáticas onde se implantou cirurgicamente um
microestimulador elétrico nas proximidades do nervo frênico gerando um marcapasso frênico,
cuja aplicação teve objetivo de induzir contrações diafragmáticas e melhorar a ventilação de
pacientes que apresentavam diferentes estados patológicos, como por exemplo, disfunções
neuromusculares ou portadores de traumatismo raquimedular alto (GLENN, GEE e
SCHACHTER, 1978; GLENN e PHELPS, 1985). Resultados clinicamente bem sucedidos
têm estimulado a realização de estudos mais aprofundados sobre a técnica EDET.
Concomitante à utilização do marcapasso frênico tornou-se necessário a
investigação de diferentes parâmetros elétricos, os quais não provocassem degeneração
neural. Foi neste contexto que experimentos foram realizados com cães monitorados
eletroneuromiograficamente, sendo propostos três pontos motores para o nervo frênico, assim
definidos: região do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar, região
paraxifóidea e a base do pescoço entre o escaleno e o esternocleidomástoideo de cada lado
(GLENN et al., 1986). Deste experimento ficou o consenso de que impulsos de baixa
intensidade de corrente estimulam o diafragma no ponto da região paraxifóidea e o nervo
torácico longo na região do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar,
por outro lado, impulsos de alta intensidade estimulam os músculos abdominais no ponto
paraxifóideo e o diafragma nos pontos do sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha
média axilar.
Uma vez que se trata de corrente elétrica aplicada na caixa torácica, o
procedimento não deve repercutir em alterações na hemodinâmica ou no ritmo cardíaco. Para
dirimir esta dúvida foram realizados experimentos com cães, sendo determinado que o valor
seguro da duração do pulso da corrente para contrair o diafragma deveria estar entre 0.1ms -
10ms (RISCILI, FOSTER e VOORHEES, 1988; RISCILI, HINDS e VOORHEES, 1989). O
7
passo seguinte foi avaliar sua aplicabilidade em humanos portadores de disfunção
diafragmática variada utilizando-se análise via eletroneuromiografia respiratória e pressão
transdiafragmática com balões intraesofágicos. Para tal, foram escolhidos os pontos situados
na base lateral do pescoço esquerdo e direito e a freqüência utilizada foi de 1 Hertz (Hz) e a
largura de pulso de 0,1 milisegundo (ms). O estudo revelou que o procedimento foi eficaz no
condicionamento muscular diafragmático beneficiando 95% dos pacientes com disfunções
diafragmáticas (MIER, BROPHY e MOSCHAM, 1987; BOLTON, 1992).
Na literatura científica há publicação de um protocolo de estimulação
diafragmática elétrica transcutânea aplicado a humanos, que consistia dos seguintes
parâmetros: corrente modulável para ajuste do tempo de subida igual a 1 segundo, tempo de
sustentação da contração igual a 1 segundo, e tempo de relaxamento igual a 2 segundos; a
freqüência da corrente seria em torno de 25Hz-30Hz; a largura de pulso da corrente deveria
estar entre 0,1ms-10ms; os eletrodos deveriam estar fixados em pontos paraxifóideos ou
intercostais na linha média axilar; a intensidade deveria ser a mínima para obter contração; o
tempo de estimulação de 20 minutos. Segundo alguns autores, a eletroneuromiografia pode
ser um método efetivo para avaliar o procedimento, uma vez que somente seriam candidatos
para estimulação, pacientes que possuíssem nervos frênicos íntegros (GEDDES, VOORHEES
e BABBS, 1985; GEDDES, VOORHEES e BOULAND, 1990; GEDDES e SIMMONS,
1991).
No mesmo período, o protocolo foi utilizado enquanto recurso fisioterapêutico
no tratamento de cinco pacientes, sendo quatro com lesão frênica de pós-cirurgia cardíaca e
um com seqüelas respiratórias de poliomielite (CUELLO, MASCIANTONIO e MENDOZA,
1991; SAADEH, 1993). A estimulação foi realizada com eletrodos posicionados
bilateralmente no sexto, sétimo e oitavo espaços intercostais da linha média axilar durante
vinte minutos, quatro vezes ao dia sendo utilizado na avaliação radioscópica (antes e após o
procedimento) e avaliação espirométrica (volume corrente, capacidade vital, ventilação
máxima voluntária, capacidade pulmonar total e de força muscular (pressão inspiratória
máxima)) e os resultados demonstraram ganho de excursão diafragmática na radioscopia, bem
como incrementos nos valores espirométricos dos pacientes tratados (GEDDES, VOORHEES
e LAGLER, 1988; HON e HULME, 1958).
A EDET também foi utilizada como recurso fisioterapêutico em paciente
portador de paralisia de hemicúpula diafragmática esquerda na pós-cirurgia cardíaca por
injúria frênica e em paciente portador de traumatismo raquimedular cervical, promovendo a
contração diafragmática nessas situações (AQUIM, ABRY e MOTTER, 1992; WETZEL et
8
al., 1994; WHEELER, FELL e HAUCK, 1994; DAMASCENO et al., 1997). Este recurso que
é uma forma de estimulação elétrica neuromuscular utilizada na região diafragmática, de
maneira não-invasiva, tem o objetivo de auxiliar pacientes com fraqueza dos músculos
respiratórios e pacientes submetidos à ventilação mecânica. A literatura mostra que pacientes
submetidos a treinamento muscular profilático obtiveram uma melhora de sua força e função
muscular respiratória, além de outros benefícios como a melhora de sua oxigenação, de sua
ventilação e diminuição no tempo de hospitalização (NOMORI et al., 1994; GREEN et al.,
2001).
Nesse contexto, nos estágios atuais da evolução das ciências da saúde surgiu a
necessidade de uma maior dedicação de cientistas em estudos relacionados à fisioterapia
respiratória experimental, que na sua essência, busca aprimorar o conhecimento e a
aplicabilidade dos métodos fisioterapêuticos, como é o caso desse tão importante método, a
EDET. Nesta linha experimental, foram testados em ratos alguns protocolos obedecendo a
uma ampla variação nos parâmetros funcionais da corrente elétrica como frequência e
intensidade. A maior eficácia quimiometabólica (aumento do conteúdo muscular de
glicogênio) foi conseguida com o seguinte protocolo: frequência de 50Hz (T
ON
/T
OFF
= 2
segundos), largura de fase de 0,4ms, intensidade de 5mA e 20 minutos de aplicação. Este fato
é importante ser destacado, pois houve a realização de um estudo piloto utilizando a
frequência de 30Hz, porém o efeito metabólico foi menor, jutificando assim, a utilização do
protocolo acima.
É bastante conhecido na literatura que a homeostasia energética do tecido
muscular depende de inúmeros fatores como a integridade da junção neuromuscular, o estado
funcional das fibras musculares, a sensibilidade à insulina e o suprimento adequado de
substratos metabolizáveis (ZHENG et al., 2001).
Recentemente, foi demonstrado que o
músculo esquelético desnervado ou sob a condição de imobilização apresenta melhora
significativa nas reservas energéticas quando submetido à estimulação elétrica neuromuscular
de baixa freqüência (GUIRRO et al., 2004; CANCELLIERO, 2004), mostrando a importância
da contração muscular no aporte energético.
Assim, tais estudos mostram a importância da utilização da estimulação
elétrica diafragmática e sua evolução em diversas patologias e em situações nas quais há a
disfunção ou o desuso muscular, permanecendo a lacuna nas informações morfofuncionais e,
portanto, de caráter invasivo. Vale ressaltar, que na literatura os poucos estudos de
estimulação diafragmática elétrica transcutânea existentes são relacionados a seres humanos e
9
suas análises se limitam, principalmente, à espirometria e força muscular respiratória,
atendendo ao Comitê de Ética em humanos.
2.2. Sulfato de Bleomicina
Com relação ao sulfato de bleomicina, este é um antibiótico citotóxico
utilizado por pacientes portadores de carcinoma localizado principalmente na cabeça e
pescoço (boca, língua, amígdalas, nasofaringe, orofaringe, seios paranasais, palato, lábios,
mucosa bucal, gengiva, epiglote e laringe) pele, pênis, colo uterino e vulva, além de
carcinoma de testículo, linfomas (Doença de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin) e derrame
pleural maligno (BRISTOL-MYERS SQUIBB
).
A toxicidade pulmonar, efeito colateral mais grave do sulfato de bleomicina,
ocorre em 10% dos pacientes, sendo que em 1% a pneumonite não-específica induzida evolui
para fibrose pulmonar e óbito. A toxicidade é mais frequente em pacientes com idade superior
a 70 anos e aqueles que recebem doses totais maiores que 400 unidades (BRISTOL-MYERS
SQUIBB
). Segundo Sleijfer (2001) o sulfato de bleomicina é um agente antineoplásico que
causa fibrose pulmonar como um efeito colateral durante o tratamento em humanos. Seu
efeito tóxico tem sido utilizado em modelos experimentais em animais (LAZO et al., 1990),
porém o mecanismo envolvido na indução dessa doença não tem sido completamente
entendido (GOTO et al., 2004).
Devido à falta de especificidade da síndrome clínica, a identificação dos
pacientes portadores de toxicidade pulmonar é extremamente difícil. O primeiro sintoma
associado à toxicidade pulmonar é a dispnéia e os primeiros sinais são os estertores finos.
Radiograficamente, a pneumonite produz opacidades não-específicas, geralmente dos campos
pulmonares inferiores. As alterações mais comuns dos testes da função pulmonar são a
diminuição do volume pulmonar total e diminuição da capacidade vital, sendo que não são
fatores indicativos do desenvolvimento da fibrose pulmonar (BRISTOL-MYERS SQUIBB
).
As alterações microscópicas dos tecidos decorrentes da toxicidade do sulfato
de bleomicina incluem metaplasia escamosa bronquiolar, macrófagos reativos, células atípicas
do epitélio alveolar, edema fibrinoso e fibrose intersticial (BRISTOL-MYERS SQUIBB
).
No estudo de Venkatesan et al. (2000) amostras histológicas mostraram inflamação mais
evidente em 7 e 14 dias após a administração da bleomicina (1,5mg/kg peso,
intratraquealmente), sendo que após 28 dias o processo inflamatório estava amenizado. Zhao
10
et al. (2004) observaram alta apoptose em 1 dia após a exposição à bleomicina (1mg/kg peso,
via intratraqueal), que diminuiu gradualmente no terceiro dia, mas ainda acima de valores
considerados normais.
Diversos estudos se dirigem à análise imunológica mostrando alterações de
acordo com o período após a administração do sulfato de bleomicina. Já em 1984, Thrall e
Barton observaram aumento significativo na porcentagem dos linfócitos B no tecido
pulmonar dentro de 3 dias após a administração, sendo o pico observado no 7
o
dia, além de
encontrarem população de linfócitos em fluido de lavado nos 3
o
, 7
o
e 14
o
dias, sem encontrar
nos 30
o
e 120
o
dias após o tratamento com bleomicina.
Goto et al. (2004) observaram uma significativa diminuição na pressão parcial
arterial de oxigênio, um significativo aumento na diferença de pressão de oxigênio alvéolo-
arterial e um aumento no número de eritrócitos, sugerindo que este aumento eritrocitário pode
ter sido causado pelo distúrbio de difusão e imbalanço na ventilação-perfusão devido à lesão
pulmonar. O risco de desenvolver a toxicidade pulmonar aumenta quando o oxigênio é
administrado na intervenção cirúrgica, portanto, recomenda-se manter o FiO
2
(fração
inspirada de oxigênio) em concentrações próximas ao ar ambiente (25%) durante a cirurgia e
no período pós-operatório (BRISTOL-MYERS SQUIBB
).
Hagiwara, Ishii e Kitamura (2000) relataram que o modelo de fibrose pulmonar
induzida pela bleomicina em ratos é uma ferramenta útil para avaliar os mecanismos gerais da
fibrose, principalmente aqueles mediados por radicais livres de oxigênio. Em 1978, Sausville
et al. observaram que o mecanismo do efeito antineoplásico da bleomicina é que o complexo
ferro da bleomicina reduz o oxigênio molecular para radicais superóxido e hidroxil que
podem atacar o DNA e causar strand cleavage. Haycock et al. (1996) destacaram que a
produção das espécies reativas de oxigênio (ROS) em exercícios fisiológicos específicos ou
em fisiopatologia, como distrofias, desnervação e miopatias é incerta.
O músculo esquelético, em mamíferos adultos, exibe uma capacidade
extraordinária para se adaptar a diferentes demandas fisiológicas como o crescimento,
treinamento e lesão, em grande parte com auxílio de células satélites (HAWKE e GARRY,
2001). Reid (2001) observou que as ROS têm efeito bifásico nas funções contráteis das
miofibras esqueléticas, com baixas concentrações de ROS, essenciais para a produção da
força normal, e o acúmulo excessivo de ROS, envolvido no desenvolvimento da fadiga
muscular aguda.
O aprimoramento do conhecimento fisiológico da musculatura esquelética
respiratória, incluindo parâmetros metabólicos, morfológicos e bioquímicos, é de fundamental
11
importância para o profissional da área da saúde, uma vez que, adquirir condições musculares
adequadas, pode refletir na qualidade de vida de cada paciente. Segundo Pette e Vrbová
(1999), o tecido muscular tem a característica de plasticidade funcional, ou seja, de se adaptar
de acordo com o estímulo aplicado.
Uma vez que a fibrose pulmonar promove alterações na função pulmonar e na
mecânica respiratória, o nosso estudo se preocupou não somente em analisar a condição
clínica isolada, mas também o efeito da EDET associado, buscando um melhor conhecimento
da condição da musculatura esquelética respiratória, além dos efeitos sistêmicos que as duas
condições poderiam estar promovendo e possivelmente, alterando a homeostasia sistêmica do
organismo.
12
3. OBJETIVOS
13
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
A partir do exposto, a proposta geral deste trabalho foi desenvolver um
protocolo de EDET para animais e realizar uma avaliação ampla com a aplicação do recurso
fisioterapêutico, testando a hipótese de que a corrente elétrica poderia afetar a homeostasia
dos músculos respiratórios, componentes plasmáticos e funções de alguns órgãos, além de
avaliar o efeito da bleomicina sobre o tecido pulmonar e muscular respiratório, associado a
uma avaliação sistêmica, focalizando a homeostasia do organismo, uma vez que a indução da
fibrose pulmonar é realizada por um fármaco quimioterápico, o qual pode trazer outros efeitos
colaterais. Outro objetivo foi avaliar o efeito da EDET na condição de fibrose pulmonar sob
alguns aspectos de análises.
3.2. Objetivos Específicos
Os objetivos específicos foram avaliar:
a) conteúdo de glicogênio, proteínas totais e DNA dos músculos diafragma, intercostal,
peitoral e abdominal
b) tipagem de fibras musculares, receptor de insulina e metaloproteases do diafragma
c) respirometria
d) eletrocardiograma e sensibilidade atrial às catecolaminas
e) imunohistoquímica do nervo vago
f) efluxo de
86
Rb
+
e secreção estática de insulina
g) GTT (teste de tolerância à glicose) e ITT (teste de tolerância à insulina)
h) insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas pancreáticas
i) perfil hematológico e fragilidade osmótica
j) concentração plasmática de insulina, glicose, lactato, creatinina, uréia, fosfatase alcalina,
TBARS, AST, ALT e citocinas (IL-6, IL-10 e TNF-α)
k) úlcera gástrica
l) perfil bioquímico (glicemia, lactacidemia, insulinemia) durante uma sessão de EDET, além
do glicogênio dos músculos respiratórios, ácido ascórbico e colesterol da supra-renal pós-
sessão.
m) morfometria do tecido pulmonar
14
4. MATERIAL E MÉTODOS
15
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados ratos albinos Wistar, com idade variando de 3 a 4 meses, os
quais foram alimentados com ração e água ad libitum, sendo submetidos a ciclo fotoperiódico
de 12 horas claro/escuro e divididos em seis grupos experimentais (n=6-8): controle, tratado
com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET), tratado com bleomicina, tratado
com bleomicina associado à EDET, pós-EDET (após 1 sessão) e tratado com EDET durante 7
dias seguido de 7 dias sem tratamento. Houve também a realização do grupo Sham o qual foi
tratado somente com o anestésico.
Os animais foram tratados segundo os princípios recomendados pelo COBEA
(Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), sendo o trabalho aprovado pela comissão de
ética na experimentação animal – CEEA-IB-UNICAMP sob o protocolo n
o
754-2. Ressalta-se
que tanto os tratamentos quanto as coletas foram realizados no período da manhã.
4.2. Estimulação diafragmática elétrica transcutânea
Para a aplicação da estimulação diafragmática elétrica transcutânea, os animais
foram anestesiados (Ketalar
®
e Rompum
®
) e a região anterior do tórax tricotomizada para
garantir uma maior efetividade da estimulação e do posicionamento dos eletrodos. A
estimulação elétrica foi realizada diariamente por 20 minutos durante 7 dias, sendo a
frequência de 50 Hertz (ciclos por segundo), T
ON
de 2 segundos (tempo de contração), T
OFF
de
2 segundos (tempo de relaxamento) e a largura de fase (duração do pulso) de 0,4
milisegundos (ms). A intensidade (amplitude do pulso) foi padronizada em 5.0 miliamperes
(mA), a partir da visualização da contração muscular, sendo que a cada 3 minutos foi aplicado
um acréscimo de 1.0mA à corrente minimizando a acomodação do diafragma.
O equipamento utilizado para a estimulação elétrica foi o Dualpex 961
(QUARK
), além de dois eletrodos de silicone-carbono com área de 1,5x2,0 centímetros cada
e gel de acoplamento. Os dois eletrodos foram posicionados bilateralmente na região lateral
do tórax entre a 4
a
e a 6
a
costela, no ponto médio entre o cotovelo e a última costela do
animal, como mostra a figura 1. Essa região é próxima aos ramos laterais do nervo frênico,
que terminam na região lateral do diafragma.
16
Figura 1. Estimulação elétrica realizada no animal através de dois eletrodos de superfície (1 e 2) acoplados com
gel na região lateral do gradil costal, entre a 4
a
e a 6
a
costela.
4.3. Tratamento com bleomicina
O tratamento foi realizado por uma dose única de sulfato de bleomicina
(Blenoxane
-
BRISTOL-MYERS SQUIBB) na concentração de 2,5mg/Kg de peso corporal
segundo a proposta de Beller et al. (2004) pela via intratraqueal (figura 2) e depois do período
de 7 dias os animais foram sacrificados e as análises experimentais foram realizadas.
Figura 2. Administração do sulfato de bleomicina via intratraqueal com uma sonda.
1
2
17
4.4. Amostragem
Após o período experimental, os animais foram anestesiados com pentobarbital
sódico (40mg/kg peso), o sangue foi coletado com anticoagulante (heparina ou EDTA,
conforme especificação de cada análise) pela veia renal, centrifugado 10 minutos a 2500rpm e
o plasma armazenado em freezer para a realização das devidas análises.
Para as amostras musculares, o diafragma, o intercostal, o peitoral e o
abdominal foram cuidadosamente isolados, retirados e encaminhados para as avaliações, além
dos pulmões, coração, pâncreas, estômago, glândulas supra-renais, timo e baço para outras
análises.
4.5. Conteúdo de glicogênio muscular
As amostras do músculo foram digeridas em KOH (hidróxido de potássio) 30%
a quente e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol a quente. Entre uma fase e
outra da precipitação, a amostra foi centrifugada e o glicogênio precipitado foi submetido à
hidrólise ácida na presença de fenol e posterior leitura em espectofotômetro a 490nm,
segundo a proposta de Siu, Russeau e Taylor (1970). Os valores foram expressos em
mg/100mg de peso úmido.
4.6. Conteúdo de proteínas totais e DNA
O conteúdo de proteínas dos músculos respiratórios foi determinado pelo
método do folin-fenol segundo Lowry et al. (1951) em que as amostras passam pelo
procedimento do hidrolizado e após pela colorimetria na presença de 3 soluções com leitura
em espectofotômetro a 650nm.
O conteúdo de DNA foi analisado pelo método da difenilamina (GILES e
MEYERS, 1965) que consiste do preparo do homogenato das amostras, da solução de
difenilamina e de um reagente com posterior leitura em espectofotômetro a 595 nm.
4.7. TBARS
A análise dos TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) foi
realizada pelo método de Yagi (1987), no qual há o preparo do homogenato das amostras com
solução tampão, que são submetidas a soluções reagentes, finalizando com banho maria
18
fervente, banho de gelo, presença de n-butanol, centrifugação e leitura do sobrenadante em
espectrofotômetro a 520 nm.
4.8. Determinação dos tipos de fibras musculares
O fragmento muscular coletado foi imediatamente posicionado em bloco de
madeira com Tragacanth gum e congelado em isopentano resfriado em nitrogênio líquido a -
159
o
C, sendo posteriormente armazenado em biofreezer a -74
o
C, para posterior microtomia.
A microtomia do fragmento muscular em criostato MICRON HM 505E, a -24
o
C, permitiu a obtenção de cortes de 12 µm de espessura, que foram armazenados em cubetas
especiais e mantidos em biofreezer a -74
o
C. Em seguida, todos os cortes foram submetidos à
reação histoquímica simultaneamente. Os principais tipos de fibras foram delineados
utilizando-se a técnica de mATPase de acordo com Staron (1997), após pré-incubações em
pH de 4.3, 4.55 e 10.5 (GUTH e SAMAHA, 1970). Foram feitas em microscópio trinocular
OLYMPUS através do programa CAMEDIA MASTER, fotomontagens de todo corte nos
diferentes pHs, permitindo a determinação do número e porcentagem de cada um dos tipos de
fibras puras, incluindo I, IIA, IIB e IID.
4.9. Respirometria de fluxo aberto
As variáveis analisadas foram o VO
2
(consumo de oxigênio) e VCO
2
(consumo
de gás carbônico). Para isso, amostras de ar (10mL) foram colocadas com uma seringa
hermética anexada ao respirômetro por uma torneira de três direções. Para assegurar que as
amostras foram representativas da composição do ar interno do respirômetro, foi colocado ar
várias vezes antes de coletar a amostra definitiva. Imediatamente após as amostras terem sido
coletadas, essas foram injetadas num tubo contendo CO
2
(gás carbônico)
e absorventes de
vapor de água, dentro de um analisador de oxigênio (AMETEK S3A) numa taxa de fluxo de
150 mL/min. A taxa fracional de oxigênio das amostras de ar foi lida diretamente na potência
digital do analisador de oxigênio. O respirômetro permaneceu fechado durante o experimento
e, portanto, a taxa da captação de oxigênio foi calculada pela depleção do conteúdo de
oxigênio ocorrido entre a coleta de duas amostras consecutivas de ar (VLECK, 1987).
A análise respirométrica também foi realizada em dois grupos, incluindo o Pós-
EDET e o Sham (Anestésico).
19
4.10. Eletrocardiograma
Para a determinação do ECG (eletrocardiograma), foi utilizado um
eletrocardiógrafo Heart Ware acoplado a um software adaptado para avaliação em roedores.
Os eletrodos foram conectados por meio de agulhas hipodérmicas às patas do animal
anestesiado (pentobarbital sódico, 40mg/kg de peso corporal) (figura 3). Os registros das
ondas do ECG foram utilizados para as medidas da freqüência cardíaca, para mediar a
intensidade e os intervalos entre as ondas (QR, QT, QTc, PR) e o estabelecimento do eixo
cardíaco. O intervalo QT foi corrigido pela fórmula de Bazzet’s (SGOIFO et al., 1996).
Figura 3. Animal com quatro eletrodos posicionados bilateralmente nas patas anteriores e posteriores para a
análise do registro eletrocardiográfico.
4.11. Sensibilidade atrial às catecolaminas
Para a avaliação da sensibilidade adrenérgica do marcapasso cardíaco, os
animais foram anestesiados por inalação de halotano (TANNO et al., 2002), e em seguida o
animal foi morto por parada respiratória (pneumotórax). O coração foi isolado, o átrio direito
foi excisado e preparado para registro isométrico das contrações espontâneas, sob tensão
diastólica de 0.5gf, em câmara para órgãos isolados contendo 20 mL de solução de Krebs-
Henseleit, com a seguinte composição [mM]: NaCl 115,0; KCl 4,7; CaCl
2
.2H
2
O 2,5;
20
KH
2
PO
4
1,2; MgSO
4
.7H
2
O 2,5; NaHCO
3
25,0; glicose 11,0; ácido ascórbico 0,11. Este
último foi adicionado para diminuir a oxidação das catecolaminas, durante a obtenção das
curvas concentração-efeito (CCE) (MARCONDES et al., 1996). O líquido de incubação foi
borbulhado continuamente com 95% de O
2
e 5% de CO
2
e a temperatura mantida a
36,5±0,1ºC, com auxílio de uma bomba de perfusão. Para registro das contrações espontâneas
foi utilizado um transdutor isométrico de tensão acoplado a um polígrafo (MARCONDES et
al., 1996; TANNO et al., 2002).
Após a montagem do átrio, o líquido de incubação foi trocado a cada 15 min
durante 45-60 min para estabilização da freqüência de batimentos. Esta foi determinada por
variações de freqüência menores que 5 batimentos por minuto (bat/min), durante 15 min, com
contagens sucessivas a cada 5 minutos. Átrios que apresentaram irregularidades rítmicas, ou
que não estabilizaram sua freqüência após 60 minutos de incubação foram descartados
(MARCONDES et al., 1996). Após o período de estabilização, foram obtidas as CCE à
noradrenalina pelo método cumulativo, com incrementos sucessivos da concentração molar
do agonista de 0,5 unidade logarítmica (VAN ROSSUM, 1963). A resposta máxima foi
determinada quando três concentrações sucessivas e crescentes do agonista não alteraram a
resposta obtida com a concentração imediatamente anterior (MARCONDES et al., 1996). Ao
final da CCE à noradrenalina, o tecido foi lavado com solução de Krebs-Henseleit até que a
freqüência retornasse ao nível obtido antes da realização da primeira curva (TANNO et al.,
2002).
Em seguida, para avaliação da atividade dos sistemas de metabolização das
catecolaminas, antes da segunda curva realizada à noradrenalina, o tecido foi tratado com
10µM de fenoxibenzamina (PBZ), a qual bloqueia o sistema de recaptação neuronal (TANNO
et al., 2002). Após 30 min, a solução de incubação foi trocada a cada quinze minutos durante
uma hora, para remover o excesso de PBZ. Ao compararmos CCE na presença e na ausência
de inibidores dos mecanismos de metabolização, espera-se que a inibição de tais processos
determine um desvio significativo à esquerda na curva na ausência dos inibidores
(KENAKIN, 1993). Se isto não ocorrer, o sistema analisado provavelmente encontra-se
inibido por outro fator, que não o tratamento in vitro (TANNO et al., 2002).
4.12. Imunohistoquímica do nervo vago
A identificação dos neurofilamentos nos cortes obtidos da região esofágica foi
realizada através de imuno-histoquímica no grupo controle, empregando-se a técnica da
21
Estrepotavidina-biotina-peroxidase (ABC peroxidase) descritos por Hsu, Raine e Fanger
(1981). Durante o procedimento de imuno-histoquímica foram utilizadas as seguintes
soluções: Tampão Citrato (pH 6,0), Solução A (ácido cítrico anidro= 9,21g, ácido cítrico
monohidratado=21,01 g e H
2
O destilada=1000mL); Solução B (fosfato dissódico
duodecahidratado= 71,64 g e H
2
Odestilada =1000mL), Solução de trabalho: Solução A - 36,8
mL + Solução B - 63,2 mL, Solução Tampão Fosfato (pH 7,4) : (Na
2
HPO
4 =
1,4 g,
KH
2
PO4=0,43 g, NaCl=7,0 g e H2O= 1000mL) e Solução corante: (DAB=40 mg, Solução
Tampão Fosfato=100 mg e H
2
O
2
= 40 mL.
Para os anticorpos e reagentes da imunohistoquímica foram utilizados: 3-
aminopropil-trietoxi-silano - (Sigma, St. Louis, Mo.), 3,3 tetra-hidrocloreto diamino-benzidina
(Sigma- St.Louis, Mo), "Multi - Link" Swine immunoglobullins to goat, mouse, rabbit
immunoglobulin (Dakopatts a/s, Denmark), StreptABComplex (Dako) (Carpinteria, CA, USA),
Monoclonal Anti-Neurofilament 200 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA).
4.13. Efluxo de
86
Rb
+
Para a avaliação da secreção de insulina, de forma indireta, foi analisado o
efluxo de
86
Rb
+
(rubídio) nas ilhotas de Langerhans, as quais foram isoladas de acordo com a
técnica de Lacy e Kostianovsky (1967) modificada por Boschero, Delattre e Santos (1980).
No isolamento das ilhotas, foi utilizada a solução elaborada por Hanks e Wallace (1949) e
para a incubação e perfusão foi utilizada a solução de Krebs-Ringer bicarbonato. Na solução
de incubação foram acrescentados glicose (2,8mM) e 10µl de
86
Rb
+
. À solução perfusora da
condição experimental foi adicionada glicose (5,6mM ou 16,7mM) e/ou carbamilcolina
100µM (concentração escolhida por promover estímulo máximo no processo secretório da
insulina, segundo Persaud et al. (1989)).
O
86
Rb
+
foi utilizado neste trabalho para a análise da permeabilidade ao K
+
(potássio) como isótopo substituto desse íon. Tal procedimento justifica-se por motivos técnicos,
uma vez que o
42
K
+
, ideal como traçador do
39
K
+
, apresenta meia vida muito curta (12,5 horas), o
que dificulta sua utilização. O uso do
86
Rb
+
como substituto do K
+
tem sido utilizado em
laboratório experimental sendo a razão de efluxo e a permeabilidade de ambos muito semelhantes
(PRECHTL e POWLEY, 1985).
As ilhotas foram incubadas durante 60 minutos e após este período, elas foram
lavadas com solução de Krebs-Ringer e transferidas para uma câmara de perfusão, que foram
conectadas a um sistema de perfusão que consiste de dois recipientes, sendo um deles preenchido
22
com a solução perfusora da condição inicial (solução de Krebs-Ringer com ou sem glicose 5,6
mM) e o outro contendo a solução perfusora experimental (glicose 16,7 mM ou glicose 5,6 mM +
carbamilcolina 100µM).
A concentração plasmática de glicose foi determinada por método enzimático
utilizando-se kit de aplicação laboratorial da CELM – Reactoclin
.
Para analisar a magnitude da variação do efluxo do
86
Rb
+
foram calculados valores
teóricos a partir dos valores obtidos e realizada uma extrapolação da curva de regressão
exponencial a fim de calcular os valores esperados para o intervalo.
4.14. Análise da população de receptores de insulina
Homogeneização e Determinação do conteúdo de proteínas totais
O material extraído (músculo diafragma) foi submetido à homogeneização em
tampão de extração, a 4ºC, utilizando-se um homogeneizador tipo Polytron PTA 20S (modelo
PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY) operado em velocidade máxima por 30
segundos. Os fragmentos celulares foram então centrifugados (15.500g, 20 minutos, 4ºC) para
remoção do material insolúvel e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio. Parte deste foi
utilizado para determinação do conteúdo das proteínas totais através do método
fotocolorimétrico de Biureto (BRADFORD, 1976), enquanto que a outra parte foi submetida
à imunoprecipitação e immunoblotting com anticorpos específicos.
Imunoprecipitação
Após determinação do conteúdo de proteínas totais, o sobrenadante foi
utilizado para imunoprecipitação overnight, a 4 ºC, com anticorpos específicos. O
imunoprecipitado foi separado após incubação com proteína A sepharose 6 MB por 2 horas a
4 ºC.
Após isso, as amostras foram centrifugadas (15.500g, 20 minutos, 4ºC) e
submetidas à lavagem com tampão de lavagem por 3 vezes de 5 minutos cada (15.500g, 4ºC).
Em seguida, as proteínas precipitadas foram tratadas com tampão de Laemmli (LAEMMLI,
1970) contendo 100 mmol/l de DTT e aquecidas em água fervente por 5-10 minutos. A
seguir, quantidades iguais de proteína (5mg) foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida - SDS-PAGE em aparelho de eletroforese BIO-RAD miniature slab gel
23
apparatus (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). A eletrotransferência das
proteínas do gel para a membrana foi realizada em 120 minutos a 120V em aparelho
miniaturizado de transferência da BIO-RAD, como descrito (TOWBIN, STAEHELIN e
GORDON, 1979). A ligação dos anticorpos a proteínas não-específicas foi reduzida por pré-
incubação da membrana por 120 minutos com tampão de bloqueio à temperatura ambiente. A
membrana de nitrocelulose foi incubada overnight com anticorpos específicos diluídos em
solução para anticorpo, e então, lavada por 15 minutos com solução basal. Após, a membrana
foi incubada com 5 µCi de [
125
I] Proteína A (30 µCi/ µg) em solução de iodo por 120
minutos à temperatura ambiente e lavada novamente por 15 minutos, como descrito
anteriormente. A proteína A [
125
I] ligada aos anticorpos específicos foi detectada e
quantificada por autoradiografia em filmes Kodak XAR
®
(Eastman Kodak, Rochester, NY).
Para isso, o cassete contendo a membrana e o filme foi mantido à temperatura de -80 °C e,
após 12 - 120 horas, o filme foi revelado de maneira convencional. As bandas identificadas na
autoradiografia foram quantificadas nas suas áreas utilizando-se densitometria óptica. Para tal,
foi utilizado um scanner de mesa ColorPage HR6X (Genius
®
) e o programa Scion Image
(Scioncorp
®
).
Immunoblotting
Após a determinação do conteúdo de proteínas totais, ao sobrenadante foi
acrescentado tampão de Laemmli (LAEMMLI, 1970) contendo 100mM de DTT, e então
aquecido por 5-10 minutos. Em seguida, quantidades iguais de proteínas (200 µg) foram
submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE conforme descrito
anteriormente.
4.15. Insulina plasmática
Amostras do plasma, obtidas após a centrifugação do sangue, foram
encaminhadas para a análise da insulinemia (ng/mL), realizada por meio de
radioimunoensaio.
4.16. Secreção estática de insulina
As ilhotas de Langerhans foram isoladas segundo a técnica descrita por
Moskalewski (1965), aplicada a pâncreas murino por Lacy e Kostianovsky (1967), com as
24
modificações de Boschero, Delattre e Santos (1981) e Sutton et al. (1986). Após laparotomia e
localização do ducto biliar comum, esse foi ocluído no extremo distal, junto ao duodeno, e
dissecado próximo ao pedículo hepático, onde se introduziu uma cânula de polietileno no
sentido da desembocadura. Cerca de 8mL da solução de Hanks, contendo 8mg de colagenase,
foram injetados via cânula, provocando, por fluxo retrógrado, a divulsão do tecido acinoso.
Procedeu-se, então, a ablação do pâncreas, que foi transferido para os tubos de ensaio de vidro
(12x12cm) e incubado por 18 minutos a 37°C.
Em seguida, ainda a 37°C, o conteúdo foi agitado vigorosamente por um
minuto e vertido em becker. Após mistura com Hanks, o conteúdo foi lentamente agitado,
ejetado com seringa e decantado durante 3 minutos. O sobrenadante foi então descartado, e o
sedimento ressuspenso em Hanks. Após repetir esse procedimento por quatro vezes, o produto
final foi transferido para placa de Petri, de onde, sob lupa, as ilhotas foram coletadas por
aspiração com auxílio de pipeta de vidro de ponta afilada. As ilhotas isoladas de ratos foram
coletadas em placa de polietileno com 24 poços contendo em cada poço, 05mL da solução-
tampão Krebs-Ringer suplementada com albumina bovina, a qual se adicionou glicose
(5,6mM). Após incubação (pré-incubação), a 37°C, em atmosfera de carbogênio (pH 7,4),
sendo que a solução de Krebs foi substituída por 1,0mL do mesmo tampão, contendo
diferentes concentrações de glicose: 2,8; 5,6; 8,3; 16,7 mmol/L. Procedeu-se a nova
incubação, por 90 minutos, nas condições referidas acima. Após esse período, as placas foram
colocadas em freezer (-20°C) por 10 minutos e, o sobrenadante, de cada poço, transferido
para tubos de polietileno e conservado a -20°C, até o momento da dosagem da insulina
secretada.
A insulina plasmática e a secretada durante o período de incubação por ilhotas
foram avaliadas de acordo com o método descrito por Herbert (1965), modificado por Scott,
Atwater e Rojas (1981).
Essa análise, primeiramente foi realizada no grupo tratado com EDET durante
7 dias e, posteriormente, foi realizada em um grupo que recebeu as 7 sessões de EDET, porém
avaliado somente 7 dias após a última sessão, devido às alterações ocorridas no primeiro
grupo, suspeitando que a ativação vagal gerada pela corrente elétrica pudesse estar
interferindo na atividade pancreática.
25
4.17. Teste de tolerância à glicose (GTT)
Para o GTT, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40
mg/Kg de peso) e após 40 minutos foi feita uma incisão próxima à veia femural por onde foi
coletada amostra de sangue. Após a primeira coleta foi injetado glicose (1g/Kg de peso) e
novas amostras coletadas nos tempos 5, 10, 15, 20, 30 e 60 minutos e a glicemia avaliada por
glicosímetro (Accu Check
).
4.18. Teste de tolerância à insulina (ITT)
Para o ITT, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40
mg/Kg de peso) e após 40 minutos foi feita uma incisão próximo à veia femural por onde foi
coletada amostra de sangue. Após a primeira coleta foi injetado insulina regular Biobrás
1U/Kg de peso (1U/mL) e novas amostras coletadas nos tempos 0, 2,5, 5, 10 e 20 minutos e a
glicemia avaliada por glicosímetro (Accu Check
).
4.19. Dosagem de Insulina, PKA, PKC e GLUT2 das ilhotas pancreáticas
Para detectar o nível de expressão celular do Receptor de Insulina (IR), das
proteínas de extrusão e movimentação de grânulos de insulina PKC e PKA e do GLUT2, foi
empregada a metodologia de Western Blot. Grupos de 500 ilhotas recém-isoladas e incubadas
por 2,5 horas em Krebs contendo 8.3 mM de glicose foram centrifugados rapidamente e o
sobrenadante desprezado. A seguir, foram adicionados 200µL de tampão específico para
imunoprecipitado. As ilhotas foram então politronizadas nesta solução, por aproximadamente
10 segundos, e o homogeneizado centrifugado a 3000g por 10 minutos.
O precipitado foi desprezado e foi feita a dosagem protéica no sobrenadante
obtido, utilizando-se o reagente para ensaio de proteína da “BioRad Protein Assay-Dye
Reagent Concentrate” (Melville, NY). Foi utilizado como referencial uma curva padrão de
albumina. As amostras foram então incubadas a 37
o
C por 1h em 20% do volume de Tampão
de Laemmli 5X (Azul de bromofenol 0,1%, fosfato de sódio 1M, glicerol 50%, SDS 10%).
Para corrida eletroforética foi utilizado gel bifásico: gel de empilhamento
(EDTA 4mM, SDS 2%, Trisma base 750mM, pH 6.7) e gel de resolução (EDTA 4mM, SDS
2%, Trisma base 50mM, pH 6.7). A corrida foi efetuada à 200V por aproximadamente 30min
com tampão de corrida (Trisma base 200mM, glicina 1.52M, EDTA 7.18mM e SDS 0.4%),
diluído 1:4. As amostras foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad). A
26
transferência foi realizada durante 60min a 30V em gelo, banhada com tampão de
transferência (Trisma base 25mM, glicina 192M).
Após transferência, a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em
solução Tris Salina (TBS) (Trisma base 1M, NaCl 5M, Tween 20 0.5%) overnight a 4
o
C. As
proteínas relacionadas ao estudo foram detectadas na membrana de Nitrocelulose por
incubação por 2h, à temperatura ambiente, com anticorpo monoclonal específico anti-IR, anti-
PKA, anti-PKC e anti-GLUT2 (Sta Cruz
®
, diluição 1:500 em TBS com 3% de leite
desnatado). Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo conjugado com
peroxidase HPB (diluição 1:5000 ou 2 µg/mL em tampão TBS). A reação com peroxidase foi
detectado por auto-radiografia, logo após a reação com o kit SuperSignal da Pierce
®
.
Extração de RNA Total
O RNA total foi extraído de cerca de 800-1000 ilhotas através da adição de
1,0mL de reagente Trizol (GIBCO BRL - Life Technologies
®
). As ilhotas foram
homogenizadas em vortex e incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida,
200 µl de clorofórmio foram adicionados e as amostras vigorosamente homogeneizadas
durante 15 segundos. Após incubação de 3 min à temperatura ambiente, as amostras foram
centrifugadas a 12.000 g durante 15 minutos a 4 ºC. O volume correspondente à fase
aquosa foi transferido para outro tubo e o RNA precipitado através da adição de 500µl de
álcool isopropílico, seguido de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente. Nova
centrifugação a 12.000 g durante 15 minutos a 4 ºC foi realizada, o pellet obtido foi lavado
em seguida com 1mL de etanol 75%, centrifugado a 7500g por 10 minutos a 4 ºC e,
posteriormente, lavado com 1 mL de etanol 100%. O etanol foi descartado e o pellet
parcialmente seco em estufa a 37 ºC. As amostras foram ressuspensas em água.
A integridade do RNA obtido foi verificada através de eletroforese em gel e
a quantificação do mesmo foi obtida através de leituras de absorbâncias a 260 e 280 nm
em aparelho Genequant (Pharmacia Biotech
®
).
Obtenção de cDNA a Partir de RNA Total
A reação da transcriptase reversa foi realizada a 42ºC durante 50 minutos, em
20µl de uma mistura contendo 2,0µg de RNA total, 10mM de dNTP mix, 40 U/µl de inibidor
de RNase, 0,1M de DTT, 5X first-strand buffer, 0,5µg/mL de oligo dT e 200U da enzima
Super Script II RNase H
-
Reverse Transcriptase (GIBCO BRL – Life Technologies
®
).
27
RT-PCR
O cDNA resultante foi amplificado com os "primers": sense e antisense
específicos. A PCR foi realizada em 12,5 µl de uma mistura contendo tampão da Taq
polimerase, 50mM de MgCl
2
, 10mM de cada desoxinucleosídeo trifosfato, 2,5U/µl de Taq
DNA polimerase, 10 pmol de "primer" sense, 10pmol de "primer" antisense e cDNA.
Alíquotas de 5µl do produto da PCR foram analisados por eletroforese em gel 1,0%
preparado em tampão TBE. Após coloração com brometo de etídeo (0,5µg/mL) o gel foi
fotografado sob luz UV, quantificado em aparelho Eagle Eye II
®
.
4.20. Perfil hematológico
4.20.1. Hemoglobina
A dosagem de hemoglobina plasmática foi realizada por kit laboratorial da
marca Labtest diagnóstica
, que contém uma solução reagente e uma solução padrão, sendo
as concentrações advindas de um cálculo após a realização da leitura das amostras em
espectofotômetro. O valor foi expresso em g/dL.
4.20.2. Hematócrito
Para determinação da porcentagem de eritrócitos foi utilizado o método do
microhematócrito que consiste na coleta do sangue em capilares de vidro heparinizados, os
quais são centrifugados e a porcentagem de células determinada em tabela de aplicação
laboratorial (LIMA et al., 1977).
4.20.3. Eritrometria
O número de eritrócitos foi determinado pela contagem de células sob
microscópio e consiste no isolamento das hemáceas em pipeta de vidro contendo líquido de
Hayem, agitação manual e contagem em câmara de Newbauer (LIMA et al., 1977).
4.20.4. Leucometria
Após a coleta do sangue, este foi homogeneizado e uma pequena quantidade da
amostra, com auxílio de uma pipeta de 5-50 µl JENCONS SEALPETTE
®
, foi retirado 10 µl
de sangue, o qual foi colocado num tubo de plástico. Em seguida, acrescentou-se a este tubo
28
plástico 190µl de corante Turkey e homogenizou-se com a pipeta. A câmara de Neubauer foi
preenchida com a solução e as células contadas em microscópio de Luz, utilizando-se os
quadrantes laterais da Câmara de Neubauer. Para obtenção do número de células, o cálculo foi
realizado como a seguir: o valor da contagem foi divido por 4 devido à contagem dos quatro
campos e multiplicado pela diluição feita na solução de células o que resulta numa
concentração 10
4
células/mL, aferida pela própria câmara de Neubauer (LIMA et al., 1977).
4.20.5. Linfócitos do timo
O timo foi localizado, retirado e, em seguida, foi separado o tecido ganglionar
linfóide do tecido gorduroso. As células foram obtidas através de um sistema composto de
dois cilindros de aço inox de diferentes diâmetros, de modo que um se encaixa no outro,
contendo cada cilindro um sistema de malhas na sua extremidade. O timo foi colocado entre
os dois cilindros e através de movimentos normais circulares, este foi levemente comprimido,
obtendo-se assim linfócitos íntegros e isolados (VIEIRA et al., 1990). Ao tecido macerado
foram adicionados 10 mL de PBS (4ºC), sendo a solução colocada num tubo de plástico e
centrifugada por 1 minuto a 2000rpm para formação do pellet. O sobrenadante foi descartado
e o pellet foi ressuspenso em 10 mL de PBS (4ºC) sendo a solução diluída em 10x. Desta
solução foi coletada uma amostra de 100µL e colocada em outro tubo plástico do tipo
eppendorff, acrescentando-se 900µL de PBS (4ºC) levando a uma diluição de 10x.
4.21. Fragilidade osmótica
Foi preparada uma solução mãe de NaCl (cloreto de sódio) equivalente a
100g/L. Esta solução foi colocada em balões volumétricos separados, conforme a
concentração que foi analisada, sendo: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 mL da solução mãe
associada à água destilada suficiente para completar 100mL. Após, foi colocado 5mL de cada
solução em cada tubo e adicionado 0,5mL de sangue total coletado pela veia renal. Depois de
homogeneizado, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 1200-1500 rpm. O grau de
hemólise foi medido no sobrenadante em espectrofotômetro em 540 nm, sendo o tubo NaCl
0,65% considerado como branco. O cálculo para a porcentagem de hemólise foi calculada
pela densidade óptica do tubo desconhecido multiplicado por 100 e dividido pela densidade
óptica do tubo com NaCl a 0,35%.
29
4.22. Concentração plasmática de glicose, lactato, creatinina, uréia, fosfatase
alcalina, ALT, AST e ácidos graxos livres.
Após a coleta do sangue e centrifugação, amostras de plasma foram
encaminhadas para diversas análises. Para a análise da glicemia e lactacidemia foram
utilizados glicosímetro e lactímetro (Accu Check
®
), respectivamente. A dosagem de
creatinina, uréia, fosfatase alcalina, ALT, AST foi realizada por kits laboratoriais.
A análise dos ácidos graxos livres foi realizada pelo método de Regouw
(1971), pelo qual se adiciona um líquido extrator às amostras, seguido de centrifugação, uma
mistura reagente (nitrato de cobre, trietanolamina, hidróxido de sódio e água destilada)
seguida de centrifugação e um reativo cromogênico (dietilditiocarbamato de sódio e butanol
secundário), sendo a absorbância lida em espectrofotômetro em filtro de 435nm e o ácido
palmítico considerado como padrão.
4.23. Análise de úlcera gástrica
Os estômagos foram isolados, retirados e encaminhados para a análise em
microscópio, onde foi observada a presença ou não de processo inflamatório desencadeado
pela secreção de ácido clorídrico, conforme a metodologia utilizada no estudo de Hayden,
Thomas e West (1978).
4.24. Perfil bioquímico durante uma sessão de EDET
Para a análise durante a sessão da EDET, amostras de sangue foram coletadas,
em vários tempos, através da veia femural, centrifugadas e alíquotas plasmáticas foram
encaminhadas para as análises: glicemia pelo glicosímetro (Accu Check
®
), lactacidemia pelo
lactímetro (Accu Check) e insulinemia (ng/mL) pela técnica de radioimunoensaio. Os
tempos de amostragem foram: 0 (início da sessão), 5
o
, 10
o
, 15
o
, 20
o
(término da sessão), 25
o
,
30
o
, 35
o
e 40
o
minuto (pós-sessão).
Amostras dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal foram
retiradas e encaminhadas para avaliações do conteúdo de glicogênio (SIU, RUSSEAU e
TAYLOR, 1970) e as glândulas supra-renais encaminhadas para a análise da concentração de
ácido ascórbico (MINDKLIN e BUTLER, 1938) e da concentração de colesterol (método
colorimétrico – kit laboratorial).
30
4.25. Análise morfométrica do tecido pulmonar
Para a análise morfométrica, segmentos pulmonares foram colocados em
solução tamponada de formol a 10% para fixação e após 48 horas, as peças passaram por
desidratação em álcool etílico, diafanização em xilol e incluídas em paraplast. Cortes
transversais não seriados de 7 µm de espessura foram realizados do tecido e corados por
Hematoxilina-Eosina (H:E). O sistema de captação e análise das imagens utilizado consistiu
de um software Image Pró-plus 4.0 (Media Cybernects
®
), câmera digital (JVC
®
) acoplada a
um microscópio (Zeiss) com integração a um microcomputador. Todas as imagens foram
captadas com resolução de 640 por 480 pixels com aumento de 100 vezes (ocular de 10x e
objetiva de 10x). Foram coletadas 5 fragmentos por animal, 5 cortes por fragmento, 5 áreas
por corte, totalizando 125 imagens pulmonares por animal. Um sistema de planimetria foi
utilizado para a contagem de pontos (MATHIEU et al., 1981; DE LACERDA, 1994), sendo a
quantificação realizada por meio de um retículo com quadrados de 2500 µm
2
contendo 50
linhas de intersecção de reta, havendo 1400 pontos por imagem, sendo que os pontos
coincidentes nos alvéolos foram contados. A área relativa do pulmão foi calculada dividindo a
soma número de pontos coincidentes nas intersecções de reta na área alveolar pelo número
total de pontos.
4.26. Análise das metaloproteases musculares
Dosagem de proteínas
Essa técnica foi utilizada para a determinação da concentração de proteínas musculares
totais necessária para aplicação da técnica de zimografia. A concentração de proteínas foi
determinada utilizando-se a metodologia descrita por Bradford (1976), com albumina de soro
bovino (BSA) (Sigma
®
) como padrão. Foi construída uma curva padrão baseada nas
concentrações de 0,2 mg/mL a 1 mg/mL de BSA, com adição de Dye Reagent (BioRad
Protein Assay
®
). As absorbâncias da curva padrão e das amostras de interesse foram lidas a
595 nm e a concentração protéica foi estimada a partir delas.
Zimografia
A zimografia é uma técnica que utiliza gelatina como substrato em gel de SDS-PAGE,
permitindo verificar a atividade gelatinolítica de proteases teciduais. Neste caso, o objetivo foi
observar a atividade de metaloproteases. Para a utilização dessa técnica bioquímica os
músculos diafragmas foram tratados conforme descrito por Cleutjens et al. (1995) para
31
obtenção do extrato tecidual. O tecido congelado foi lavado 3 a 4 vezes com salina gelada e
incubado com o tampão de extração (ácido cacodílico 10 mM pH 5,0, NaCl 0,15 mM, ZnCl2
1 µM, CaCl2 20 mM, NaN3 1,5 mM e Triton X-100 0,01% [v/v]) a 4
o
C, com agitação
contínua, durante 24 horas. Após este tempo, o tampão de extração foi coletado por
centrifugação e o pH levado para 7,4 pela adição de solução concentrada de Tris em pH 8,0.
O extrato tecidual foi então testado quanto à presença de atividade gelatinolítica pela
técnica de zimografia, conforme descrito por Cleutjens et al. (1995). Duplicatas de amostras
foram submetidas a SDS-PAGE com gelatina (2mg/mL). Após a eletroforese, o gel foi lavado
2 vezes durante 30 minutos em solução 2,5 % de Triton X-100 para remoção do SDS. Em
seguida, foram preparadas as duplicatas, cortando-se o gel. Uma metade do gel foi incubada
em tampão de substrato (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, CaCl2 5 mM e NaN3 0,02%). A outra
metade foi incubada no mesmo tampão contendo EDTA (15mM), para verificar se a protease
é uma metaloprotease, uma vez que o EDTA inibe sua atividade. Ambas as metades foram
incubadas a 37º C, durante 24 horas. Após este tempo, o gel foi corado com Coomassie Blue
por 30 minutos, descorado com ácido acético:metanol:água (1:4:5) para visualização das
bandas de atividade. Para documentação, o gel foi escaneado e as bandas de atividade foram
analisadas quanto à sua densitometria no software Gene Tool da Syngene®.
4.27. Análise das citocinas plasmáticas
A análise das citocinas plasmáticas (IL-6, IL-10 e TNF-α) foi realizada pelo
método ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - Ensaio imunoenzimático em fase
sólida), seguindo as especificações correspondentes ao kit (R&D Systems
®
, Minneapolis,
MN). Todas as amostras para determinação das concentrações das citocinas circulantes foram
realizadas em duplicata, para garantir a precisão dos resultados obtidos.
4.28. Análise estatística
A análise estatística foi realizada inicialmente pelo teste de normalidade
Kolmogorov-Smirnov e pelo teste de homocedasticidade (critério de Bartlett). Como as
variáveis apresentaram distribuição normal e homocedasticidade, foi utilizado o teste
paramétrico ANOVA seguido do teste post-Hoc de Tukey para a comparação de mais de 3
grupos experimentais e o teste t de Student para a comparação de 2 grupos. Em todos os
cálculos foi fixado um nível crítico de 5% (α<0,05) e os softwares utilizados foram o Origin
6.0
®
, Statistica
®
6.1. e o Prism
®
3.0.
32
Com relação aos grupos experimentais e suas respectivas análises, dentro da
metodologia apresentada, o quadro 1 mostra detalhadamente pelo desenho experimental.
QUADRO 1. Desenho Experimental.
Grupos experimentais / Análises
Controle
Controle
EDET
EDET
Bleomicina
B+EDET
Pós-EDET
EDET+7 dias
Sham
N
o
total de animais
Tamanho da amostra (n)
6 6 6 8 7 7 6 8 6 60
Glicogênio muscular
x x x x x
Proteínas totais/DNA
x x
Tipo de fibras
x x
TBARS musculares
x
IR
x x x x
MMPs
x x x
ECG e sensibilidade atrial
x x x
Respirometria
x x x x
Imunohistoquímica do vago
x
Efluxo de
86
Rb
+
x x
Secreção estática de insulina
x x x x
GTT e ITT
x x
Insulina, PKA, PKC e GLUT2 das
ilhotas pancreáticas
x x
Insulinemia
x x x x
Perfil hematológico
x x x
Fragilidade osmótica
x x
Concentração plasmática de glicose,
lactato, creatinina, uréia, fosfatase
alcalina, TBARS, AST, ALT
x x x x x
Citocinas plasmáticas (IL-6, IL-10 e
TNF-α)
x x x x x x
Úlcera gástrica
x x
Morfometria do tecido pulmonar
x x
Ácido ascórbico e colesterol da
supra-renal pós-sessão
x x
Peso das supra-renais, timo e baço
x x x
33
5. RESULTADOS
34
5. RESULTADOS
Os resultados serão apresentados em duas partes, sendo a primeira sobre a EDET e a
segunda parte sobre o tratamento com o sulfato de bleomicina e a associação com a EDET.
Com relação à primeira parte, serão abordados parâmetros de avaliação
especificamente no tecido muscular, seja ele representado pelos músculos respiratórios, em
alguns momentos, ou especificamente pelo músculo diafragma, que é o principal alvo do
recurso terapêutico EDET, além da abordagem de parâmetros sistêmicos relacionados a
órgãos, como coração, pâncreas e estômago, os quais poderiam estar sendo estimulados pela
corrente elétrica, uma vez que essa é aplicada na caixa torácica. No final dessa primeira parte,
será abordada a análise do perfil bioquímico durante uma sessão de EDET, uma vez que esta
promove contrações musculares.
O início da segunda parte dos resultados está relacionado à certificação do efeito do
quimioterápico bleomicina no tecido pulmonar e, posteriormente, as análises estão
direcionadas ao tecido muscular, especificamente aos músculos respiratórios, e ao perfil
bioquímico e hematológico, uma vez que são importantes para a homeostasia sistêmica. Após
foi realizada uma análise do tecido pancreático, devido à ação da bleomicina, uma vez que a
insulina é essencial para ativar vias citosólicas responsáveis pela homeostasia do tecido
muscular, incluindo os músculos respiratórios, os quais são os tecidos-alvo de ação do
fisioterapeuta. Esta análise insulínica se perdura no decorrer da apresentação dos resultados,
incluindo também o grupo tratado com bleomicina e EDET, sendo finalizada com duas
análises, sendo uma no músculo diafragma e outra sistêmica.
5.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea
O foco inicial do trabalho esteve direcionado na avaliação do conteúdo de
glicogênio dos músculos respiratórios dos grupos controle (C) e submetidos a 7 sessões
subsequentes de estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET). Nesta fase do
estudo, foi observado que o recurso fisioterapêutico promoveu uma expressiva elevação
(p<0,05) na concentração muscular de glicogênio atingindo 90,5% no diafragma (D), 50% no
intercostal (I), 113,3% no peitoral (P) e 136,4% no abdominal (A) quando comparado ao
grupo controle, conforme mostra a tabela 1.
35
Tabela 1. Concentração do glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal
dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Controle EDET
Diafragma
0,21±0,01 0,40±0,03*
Intercostal
0,32±0,08 0,48±0,03*
Peitoral
0,30±0,05 0,64±0,04*
Abdominal
0,22±0,01 0,52±0,04*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
As 7 sessões diárias de EDET não foram suficientes para alterar o conteúdo de
proteínas totais em nenhum dos músculos analisados, conforme observado na tabela 2. A
quantidade de DNA (mg/100mg) nos músculos respiratórios também não foi alterada
(p>0,05) pela EDET (D: 0,06±0; I: 0,03±0; A: 0,03±0; P: 0,03±0) em relação ao controle (D:
0,08±005; I: 0,05±0,01; A: 0,03±0,05; P: 0,03±0,005).
Tabela 2. Concentração de proteínas totais (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e
abdominal dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Controle EDET
Diafragma
4,53±0,25 4,65±0,30
Intercostal
5,31±0,72 4,56±0,25
Peitoral
4,45±0,58 3,66±0,24
Abdominal
4,26±0,09 4,79±0,47
Valor da média±epm, n=6.
Com relação à tipagem de fibra muscular do diafragma, o grupo controle
apresentou 47,2% de fibras tipo I, 26% tipo IIA, 12,7% tipo IIB e 14,1% tipo IID. Já o grupo
que recebeu 7 sessões de EDET apresentou 39,2% tipo I, 29% tipo IIA, 10% tipo IIB e 21,8%
tipo IID, ressaltando a diminuição das fibras tipo I (16,9%; p<0,05) e aumento das fibras do
tipo IID (54,6%; p<0,05).
Foi avaliada também a população de receptores de insulina do músculo
diafragma, além da concentração de insulina plasmática e foi observado que houve aumento
36
de 37,67% na quantidade de receptores de insulina e de 92,19% na insulinemia no grupo
tratado com EDET durante 7 dias quando comparado ao controle.
Na análise de respirometria aberta, o grupo controle não diferiu
estatisticamente (p>0,05) do grupo tratado com EDET em nenhuma das variáveis, incluindo
VO
2
(C: 2,78±0,88; EDET: 4,04±1,37; mLO
2
/h.g) e VCO
2
(C: 2,12±0,70; EDET: 3,13±0,97;
mLCO
2
/h.g). Com relação ao grupo Pós-EDET e Sham também não houve diferença
significativa (p>0,05) (VO
2
(Pós-EDET: 3,59±1,8; Sham: 2,65±0,7; mLO
2
/h.g); VCO
2
(Pós-
EDET: 2,95±1,41; Sham: 2,20±0,1; mLCO
2
/h.g).
A partir da constatação de alterações metabólicas musculares, insulinêmicas e
da tipagem de fibra muscular diafragmática, condições relevantes da terapêutica, e pautados
no fato da terapia basear-se na aplicação de corrente elétrica na região torácica, o trabalho foi
redirecionado para a análise do padrão eletrocardiográfico, tentando dirimir a dúvida se o
tratamento estaria interferindo na atividade elétrica cardíaca.
Os resultados mostraram que não houve alteração significativa na freqüência
cardíaca média in vivo dos animais submetidos à EDET, em relação ao grupo controle
(p>0,05, Tabela 3). A aplicação de EDET também não alterou as outras variáveis, como a
amplitude (mm) dos intervalos registrados no ECG (QR, QT e QTc), o intervalo PR e o eixo
elétrico quando comparado ao grupo controle, conforme mostra a tabela 3.
Tabela 3. Frequência cardíaca (FC, batimentos/minuto), dos intervalos QR, QT, QTc, PR (mm) e do eixo elétrico
cardíaco (graus) obtidos na avaliação eletrocardiográfica dos grupos controle e tratado com a estimulação
diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Grupos FC
(bat/min)
QR
(mm)
QT
(mm)
QTc
(mm)
PR
(mm)
Eixo
(graus)
Controle
381 ±11 99,2±19,2 199,2±8,03 353,4±9,7 105,3±7,4 49,9±9,3
EDET
370 ± 18 72±21,9 198±15,4 345±18,6 114±8,1 64,5±2,9
Valor da média±epm, n=6.
Dentro da análise da dinâmica cardíaca foi realizada a avaliação da
sensibilidade atrial às catecolaminas, onde não foi observada diferença significativa na
frequência de batimentos do átrio direito isolado (in vitro) entre os grupos controle e EDET
(p>0,05; Tabela 4). Também não houve alteração na resposta máxima (p>0,05; Tabela 4) ou
37
na sensibilidade (p>0,05; Tabela 5, Figura 4) à noradrenalina em átrios direitos isolados de
ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea, quando comparado a
animais do grupo controle. O mesmo foi observado quando a curva concentração-efeito à
noradrenalina foi obtida em presença de inibidores dos sistemas de metabolização das
catecolaminas (p>0,05; Tabela 4 e 5, Figura 4).
Tabela 4. Valores de freqüência inicial (FI, batimentos/minuto) e resposta máxima (RM, batimentos/minuto) à
noradrenalina de átrios direitos isolados de ratos dos grupos controle e tratado com estimulação diafragmática
elétrica transcutânea (EDET).
Grupos N
a
FI
b
-curva1
c
RM
b
-curva1
c
FI
b
-curva2
d
RM
b
-curva2
d
Controle 6 287±09 120±10 262±03 145±09
EDET 6 270±05 167±16 267±07 160±15
a
Nº de experimentos.
b
Média ± erro–padrão.
c
Curva realizada na ausência de inibidores dos processos de
recaptação neuronal e captação extraneuronal das catecolaminas.
d
Curva realizada na presença de inibidores
dos processos de metabolização das catecolaminas.
Tabela 5. Valores pD
2
da noradrenalina de átrios direitos isolados dos grupos controle e tratado com
estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET).
Grupos N
a
pD
2
b
-curva1
c
pD
2
b
-curva2
d
Controle 6 7,50±0,12 7,85±0,52
EDET 6 7,59±0,13 7,78±0,08
a
Nº de experimentos.
b
Média ± erro–padrão.
c
Curva realizada na ausência de inibidores dos processos de
recaptação neuronal e captação extraneuronal das catecolaminas.
d
Curva realizada na presença de inibidores
dos processos de metabolização das catecolaminas.
38
Figura 4. Curvas concentração-efeito à noradrenalina, antes (A) e após (B) a inibição dos sistemas de
metabolização das catecolaminas, obtidas em átrios direitos isolados de ratos controle ou submetidos à
estimulação diafragmática elétrica transcutânea. n=6.
Além da análise cardíaca, houve também a hipótese de que a EDET poderia
estar estimulando o nervo vago, uma vez que ele se localiza nessa região. Assim, dois órgãos,
inervados por ele, foram alvos de avaliação, incluindo o pâncreas e o estômago. Com relação
ao pâncreas foram realizadas duas avaliações, o efluxo de
86
Rb
+
e a secreção estática de
insulina das ilhotas pancreáticas, e com relação ao estômago, a presença ou não de úlcera
devido à secreção de ácido clorídrico pela estimulação vagal.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
50
100
eletroestimulação
controle
A
log [NA] M
% Resposta Máxima
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
50
100
controle
B
eletroestimulação
log [NA] M
% Resposta Máxima
39
É importante ressaltar que nesse ínterim, para a certificação da localização do
nervo vago na região, também foi realizada a análise imunohistoquímica. Neste sentido, a
figura 5 mostra a presença/localização da inervação vagal, ressaltando que este ponto anatômico
encontra-se na zona de fixação e emissão de corrente pelos eletrodos.
Figura 5. Corte transversal do esôfago de rato controle correspondente à região subdiafragmática. Observa-se a
presença de imunoreatividade positiva para neurofilamentos nos troncos vagais anterior (va), posterior (vp) e os
demais ramos. ABC peroxidase; contra coloração com hematoxilina de Meyer (aumento 40x).
A resposta à concentração estimulatória de glicose (16,7mM) foi avaliada em
ilhotas isoladas de ratos controle (aproximadamente 150 ilhotas/câmara, figura 6). Após 20
minutos iniciais de perfusão com solução de Krebs-Ringer (5,6mM) para adaptação das
ilhotas ao sistema, estas foram perfundidas com glicose a 5.6mM durante mais 60 minutos
(6A) sendo determinada a razão de efluxo cuja dinâmica mostra a constante média de
2,34±0,02% min
-1
; 2,08±0,006% min
-1
e 1,83±0,01% min
-1
respectivamente
nas 3 fases da
perfusão (22-40
o
min, 42-60
o
min e 62-80
o
min). Em B, está representado o efluxo do
86
Rb
+
,
inicialmente na concentração de 5,6mM seguido da mudança para a solução perfusora
contendo 16,7 mM de glicose. A razão do efluxo de
86
Rb
+
foi reduzida significativamente,
sendo o efluxo médio na primeira fase do período 2,30±0,01% min
-1
(22-40
o
min)
seguido de
declínio de 20% em relação ao período anterior quando o efluxo atingiu 1,83±0,07% min
-1
. O
40
retorno à solução perfusora com 5,6mM de glicose provocou o retorno da razão do efluxo até
2,17±0,05% min
-1
.
A figura 7A mostra o efluxo fracional do radioisótopo em ilhotas isoladas de
ratos controle perfundidas durante 80 min com glicose a 5,6mM na solução de Krebs-Ringer, a
média da razão do efluxo foi 2,34±0,02% min
-1
, 2,08±0,006% min
-1
e 1,83±0,01% min
-1
respectivamente
nas 3 fases da perfusão (22-40
o
min, 42-60
o
min e 62-80
o
min). Em B, pode-se
verificar que o efluxo na primeira fase da perfusão foi de 2,30±0,01%min
-1
e quando a
carbamilcolina (100µM) foi adicionada ao meio perfusor (40-60
o
min) provocou uma elevação de
27% no efluxo fracional até a acrofase do platô em 2,90±0,03% min
-1
permanecendo até o final
do período. Após o retorno à condição inicial, a razão de efluxo declinou a valores próximos da
condição inicial (média de 2,21±0,06% min
-1
).
Na fase experimental seguinte, foi avaliado o efluxo do
86
Rb realizado em
ilhotas de Langerhans isoladas de ratos submetidos a 7 sessões de estimulação diafragmática
elétrica transcutânea. A figura 8A mostra a dinâmica de efluxo na presença Krebs-Ringer
contendo glicose 5,6mM (A) sendo determinada a constância da razão de efluxo média de
2,29·0,01% min-
1
; 2,17±0,01% min
-1
e 2,02±0,0% min
-1
respectivamente
nas 3 fases da perfusão
(22-40
o
min, 42-60
o
min e 62-80
o
min). A figura 8B representa o efluxo do
86
Rb
+
inicialmente
na concentração de 5,6mM seguido da mudança para 16,7 mM de glicose e nota-se que a
razão do efluxo de
86
Rb
+
foi reduzida em 16% sendo o efluxo médio na primeira fase do
período 2,33±0,03% min
-1
(22-40
o
min)
seguido de uma redução em relação ao período anterior
quando o efluxo atingiu na acrofase do plâto 1,95±0,07% min
-1
(42-60
o
min). O retorno à
solução perfusora com 5,6mM de glicose provocou o retorno da razão do efluxo até
2,17±0,07% min
-1
(62-80
o
min).
A figura 9 se refere ao efluxo de ilhotas de Langerhans isoladas de ratos
submetidos a 7 sessões de estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET) e mostra
em A o efluxo fracional do radioisótopo em ilhotas perfundidas durante 80 minutos com glicose
5,6mM na solução de Krebs-Ringer, sendo que neste a média da razão do efluxo foi 2,29±0,01%
min
-1
; 2,17±0,01% min
-1
e 2,02±0,02% min
-1
respectivamente
nas 3 fases da perfusão (22-40
o
min, 42-60
o
min e 62-80
o
min). Em B, pode-se observar a mudança na condição experimental
onde o efluxo dos 22-40
o
minuto manteve a média de 2,34±0,01% min
-1
, no entanto, quando a
carbamilcolina (100µM) foi adicionada ao meio de perfusão (40-60
o
min) provocou uma elevação
de 19,6% no efluxo fracional mantendo a acrofase do platô em 2,80±0,03% min
-1
até o final do
41
período. Após o retorno à condição inicial a razão de efluxo declinou de forma lenta e constante a
valores similares à condição inicial (média de 2,30±0,1% min
-1
).
Após a verificação das alterações na sensibilidade das células β pancreáticas foi
avaliada a concentração plasmática de glicose dos animais, sendo que os valores observados no
grupo submetido à EDET não diferenciou do controle (Controle: 91,28±5,9mg/dL x EDET:
83,43±2,7mg/dL).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78
Tempo
(
min
)
86
Rb (%/min)
16,7mM
Figura 6. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos do grupo
controle. Na linha A pode-se verificar a dinâmica do efluxo do
86
Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs -
bicarbonato (5,6mM) durante 80 minutos. Em B, as linhas verticais interrompidas (42-60
o
min) indicam o momento
de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo
100 a 150 ilhotas.
A
B
42
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78
Tempo (min)
86
Rb (%/min)
Cch
Figura 7. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas isoladas de
ratos do grupo controle. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas por solução de Krebs - bicarbonato
contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período. Na figura B, as linhas interrompidas (42-60
o
min) indicam o
momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual
contendo 100 a 150 ilhotas.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78
Tempo (min)
86
Rb (%/min)
16,7mM
EDET
Figura 8. Efeito da glicose sobre a dinâmica do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos submetidos
à estimulação diafragmática elétrica transcutânea (EDET). Na linha A de efluxo pode-se verificar a dinâmica do
efluxo do
86
Rb de ilhotas perfundidas com solução de Krebs - bicarbonato (5,6mM) durante 80 minutos. Em B (42-
60
o
min), as linhas verticais interrompidas indicam o momento de introdução e retirada da glicose 16,7mM. Cada
ponto representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.
A
B
A
B
43
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78
Tempo (min)
86
Rb (%/min)
Cch
EDET
Figura 9. Efeito da carbamilcolina (100µM) sobre a razão do efluxo de
86
Rb
+
em ilhotas pancreáticas isoladas de
ratos submetidos à estimulação diafragmática elétrica transcutânea. A linha A mostra o efluxo de ilhotas perfundidas
por solução de Krebs - bicarbonato contendo 5,6mM de glicose, durante todo o período de perfusão. Na figura B, as
linhas interrompidas (42-60
o
min) indicam o momento de introdução e de retirada da carbamilcolina. Cada ponto
representa a média de 3 experimentos, cada qual contendo 100 a 150 ilhotas.
Outra análise direcionada à função pancreática foi a secreção estática de
insulina, onde foram avaliados os grupos controle, tratado com EDET e também um grupo
que foi avaliado após 7 dias da última sessão de EDET, para observar se o comprometimento
na secreção era persistido mesmo após a retirada da correntes em sessões diárias. Os
resultados mostraram que o grupo tratado com EDET 7 dias apresentou um aumento de 323%
na secreção de insulina quando suas ilhotas foram submetidas à baixa concentração de glicose
(2,8mM) com relação ao controle, além de diminuição de 63,2% na maior concentração
(16,7mM) (figura 10). Com relação ao grupo tratado associado com o período de recuperação,
o aumento na secreção hormonal foi observado nas concentrações 5,6mM (162,5%) e 8,3mM
(575%), e a diminuição persistiu na concentração de 16,7mM (72,6%), conforme mostra a
figura 11.
A
B
44
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
*
16,7mM
8,3mM
5,6mM
2,8 mM
*
Figura 10. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de
glicose dos grupos controle (branco) e tratado com EDET durante 7 dias (preto). n=6, p<0,05, * comparado ao
controle.
0
1
2
3
4
5
16,7mM
8,3mM
5,6mM
2,8mM
*
*
*
Figura 11. Média±epm da concentração de insulina (ng/ilhota/hora) nas concentrações 2,8; 5,6; 8,3 e 16,7mM de
glicose dos grupos controle (branco) e tratado com EDET durante 7 dias seguido de 7 dias sem tratamento
(preto). n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
n
g
/ilhota/hora
n
g
/ilhota/hora
45
Mesmo havendo alteração na função pancreática devido à presença da corrente
elétrica no tórax e uma possível ativação vagal, não foi observada presença de úlcera nos
estômagos dos animais que receberam as sessões de EDET.
Uma vez que a estimulação elétrica promove contração muscular, é sugestivo o
fato de a terapia estar alterando o perfil bioquímico durante a aplicação do estímulo. Frente ao
exposto, foi avaliada a concentração plasmática de glicose, lactato e insulina durante a sessão
da estimulação diafragmática elétrica transcutânea, além de avaliar o comportamento da
concentração de ácido ascórbico e colesterol da glândula supra-renal e o conteúdo de
glicogênio dos músculos respiratórios de ratos, em um período logo após a sessão.
Durante a sessão de EDET foi observada uma redução inicial na concentração
de insulina plasmática e uma elevação no tempo 20
o
, sendo que os valores (média±dpm,
ng/mL) foram, respectivamente, nos tempos 0, 5, 10, 15 e 20: 1,72±0,23; 1,18±0,37;
0,86±0,18; 0,92±0,56 e 1,54±0,42. Após a finalização da sessão, a insulina continuou a se
elevar, atingindo o pico no tempo 35
o
, sendo os valores (média±dpm, ng/mL): 2,54±0,32;
2,71±1,02; 3,12±0,17; 2,68±1,57, respectivamente, nos tempos 25, 30, 35, 40 (figura 12).
Com relação à glicemia (mmol/L) houve um aumento progressivo durante a
EDET perdurando no período pós-sessão, porém esse aumento se manteve em concentrações
de normalidade, não promovendo hiperglicemia. A lactacidemia (mmol/L) também
apresentou aumento progressivo durante a estimulação elétrica, porém, no tempo 25
o
atingiu o
pico (8,27±0,47) e retornou aos níveis de normalidade no tempo 40
o
(figura 13).
No grupo controle, o qual não recebeu a estimulação elétrica, não houve
alteração nas concentrações plasmáticas de glicose (5,22±1,17mmol/L) lactacidemia
(4,52±0,31mmol/L) e insulinemia (4,52±0,31ng/mL) durante esse mesmo período, mantendo
concentrações normais, e assim, não estão representadas nas figuras.
Findada a análise durante o período de estimulação elétrica nesse grupo que
recebeu uma sessão, foram coletadas as glândulas adrenais para analisar a concentração de
ácido ascórbico (µg/mg), a qual não se alterou em relação ao grupo controle (Controle:
6,35±0,27; EDET: 7,00±0,58), por outro lado, a concentração de colesterol (mg/dL) foi menor
(42,57% , p<0,05) na presença do recurso (Controle: 108,45±14,95 x EDET: 62,28±14,96).
A concentração de glicogênio (mg/100mg) dos músculos respiratórios após a
sessão, foi maior em 66,67% (p<0,05) no diafragma (média±epm, Controle: 0,21±0,01 x
EDET: 0,35±0,04) e em 136,36% no abdominal (Controle: 0,22±0,01 x EDET: 0,52±0,07) e
46
menor em 43,33% no peitoral (Controle: 0,30±0,05 x EDET: 0,17±0,02, p<0,05), sem haver
alteração significativa no intercostal (Controle: 0,32±0,08 x EDET: 0,20±0,02, p>0,05).
0 10203040
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Insulina plasmática (ng/mL)
Tempo (minuto)
Figura 12. Comportamento da concentração de insulina plasmática (ng/mL; média) durante a sessão de
estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão).
0 10203040
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
mmol/L
Tempo (minutos)
Glicemia
Lactacidemia
Figura 13. Comportamento da concentração de glicemia e lactacidemia (mmol/L; média) durante a sessão de
estimulação elétrica (20 minutos, tempos 0 a 20) nos tempos (minutos) 25, 30, 35 e 40 (após a sessão).
47
5.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET
Conforme exposto anteriormente, a sequência dos resultados está direcionada
ao efeito do tratamento com bleomicina, não somente no tecido-alvo da indução da fibrose
pulmonar, mas também em tecidos musculares, especificamente, nos músculos respiratórios,
além de outros sistemas que poderiam estar sendo influenciados pelo tratamento
quimioterapêutico, destacando a avaliação de enzimas plasmáticas, perfil hematológico e
funcionalidade pancreática.
Com relação à análise morfométrica do tecido pulmonar, o tratamento com
bleomicina promoveu alteração significativa (p<0,05) caracterizada pela redução de 43,2% na
densidade da área alveolar quando comparado ao grupo controle (figura 14).
Figura 14. Alvéolos e sacos alveolares dos pulmões dos grupos controle (A) e tratado com bleomicina (B). Em
B, no tecido intersticial, entre duas camadas de células epiteliais alveolares, o septo alveolar é maior e a área
alveolar é menor (100x, HE).
Após a verificação da alteração no tecido pulmonar pelo tratamento com o
quimioterápico, foi avaliado o conteúdo de TBARS nos músculos respiratórios, sendo que
houve aumento significativo (p>0,05) em dois músculos do grupo tratado com bleomicina,
representado por 73% no peitoral e por 88% no abdominal. Foi avaliado também o conteúdo
de TBARS plasmático, havendo aumento de 56,7%, conforme pode ser observado na tabela 6.
A
B
48
Tabela 6. Conteúdo de TBARS (TBARS/mg tecido) do plasma e dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e
abdominal dos grupos controle e tratado com bleomicina.
Controle Bleomicina
Diafragma
48,52±5,14 55,26±1,31
Intercostal
43,95±3,62 40,52±2,82
Peitoral
23,44±2,54 40,55±2,56*
Abdominal
19,57±1,65 36,78±2,25*
Plasma
46,52±3,29 72,90±3,46*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
Com relação à concentração plasmática de glicose, uréia, creatinina e fosfatase
alcalina não houve diferença significativa quando o grupo tratado com bleomicina foi
comparado ao controle. Porém, houve aumento de 391,4% tanto na lactacidemia quanto nas
enzimas aspartato aminotransferase (45,3%) e alanina aminotransferase (37,3%), conforme
mostra a tabela 7. Com relação aos ácidos graxos livres (AGL), houve também alteração no
grupo tratado com bleomicina, representado por aumento de 180,4% (tabela 7).
Tabela 7. Concentração plasmática de glicose (mg/dL), lactato (mmol/L), uréia (mg/dL), creatinina (mg/dL),
fosfatase alcalina (U/L), aspartato aminotransferase (AST, U/mL), alanina aminotransferase (ALT, U/mL),
ácidos graxos livre (AGL, mmol/L) dos grupos controle e tratado com bleomicina.
Controle Bleomicina
Glicose (mg/dL)
93,7±2,12
87,57±7,51
Lactato (mmol/L)
1,97±0,08 9,68±2,35*
Uréia (mg/dL)
26,3±1,42 29,1±2,19
Creatinina (mg/dL)
0,61±0,04 0,71±0,04
Fosfatase Alcalina (U/L)
91,6±8,12 86,6±10,25
AST (U/mL)
63,5±5,24 92,3±1,83 *
ALT (U/mL)
24,1±1,83 33,1±1,19 *
AGL (mmol/L)
0,46 ± 0,02 1,29±0,28*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
49
Outra avaliação realizada foi a do perfil hematológico, sendo que houve
utilização de parâmetros considerados normais para ratos, conforme está presente na literatura
científica. Sendo assim Baker, Russell e Steven (1979), consideram os seguintes valores
normais: Eritrometria: 6 a 9,7 x10
6
; Hemoglobina: 11,4 a 19,2 g/dL; Hematócrito: 40,5 a
53,9%. Já no Canadian Council on Animal Care, os valores considerados são: Eritrometria: 6
a 10 x10
6
; Hemoglobina: 11 a 17 g/dL; Hematócrito: 40 a 50%.
Sendo assim, conforme mostra a tabela 8, o grupo bleomicina apresentou
valores normais na eritrometria, porém reduzidos nos valores de hematócrito e na
concentração de hemoglobina quando comparado aos valores considerados normais, além da
comparação com o grupo controle.
Tabela 8. Perfil hematológico do grupo controle e tratado com bleomicina, constando-se de eritrometria
(células/mm
3
), hematócrito (%), hemoglobina (g/dL).
Eritrometria Hematócrito Hemoglobina
Controle
6,7±0,5 x10
6
47,7±1,9 14,8±0,42
Bleomicina
6,06±0,19 x10
6
36±1* 10,33±0,58*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
Com relação à série branca das células sanguíneas, foram avaliados alguns
parâmetros, incluindo a leucometria, os linfócitos do timo, os linfócitos dos linfonodos
mesentéricos e os macrófagos torácicos, sendo observado redução significativa (p<0,05) nos
linfonodos mesentéricos e aumento (p<0,05) nos macrófagos torácicos no grupo tratado com
bleomicina quando comparado ao controle (tabela 9).
Tabela 9. Leucometria, linfócitos do timo, linfócitos dos linfonodos mesentéricos e macrófagos torácicos
(células/mm
3
, x10
6
) dos grupos controle e bleomicina.
Controle Bleomicina
Leucometria
6,34±0,36 7,01±0,38
Linfócitos do timo
459,5±42,5 412,5±34,8
Linfócitos dos linfonodos mesentéricos
158,62±4,02 107,75±10,1*
Macrófagos torácicos
5,31±0,72 9,00±0,60*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle.
50
Além do perfil hematológico, foi realizado o teste de fragilidade osmótica, o
qual não apresentou alteração no padrão da resposta, conforme pode ser observado na
representação da curva na figura 15.
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0
0
20
40
60
80
100
Hemólise (%)
Concentração NaCl (g/L)
CONTROLE
BLEOMICINA
Figura 15. Teste de fragilidade osmótica dos grupos controle e tratado com bleomicina (n=6).
Direcionando à avaliação ao pâncreas, foi realizado o teste de tolerância à
glicose (GTT), sendo que a variável analisada foi a área sob a curva, a qual foi formada pela
variação na concentração glicêmica (mg/dL), nos tempos, em minutos, 0 (momento da
aplicação da glicose), 5, 10, 15, 20, 30 e 60 (após a aplicação da glicose). O grupo tratado
com bleomicina mostrou uma área estatisticamente maior (17.306±539, p<0,05) do que o
grupo controle (9.151±517), conforme mostra a figura 16.
51
0 102030405060
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
Glicemia (mg/dL) - GTT
Tempo (minutos)
CONTROLE
BLEOMICINA
Figura 16. Teste de tolerância à glicose (GTT) aplicado nos grupos controle e tratado com bleomicina,
analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0, 5, 10, 15, 20, 30 e 60, após a sobrecarga da glicose.
n=6, p<0,05, sendo que o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle.
Uma vez que a resposta da célula β à sobrecarga de glicose mostrou-se
alterada, optou-se por realizar um teste de tolerância à insulina (ITT) para avaliar a
sensibilidade tecidual.
O ITT está representado pela porcentagem de decaimento da glicemia (Kitt) na
presença da insulina, sendo analisados os tempos, em minutos, 0 (seguido da aplicação da
insulina); 2,5; 5; 10 e 20 (após a aplicação da insulina). A figura 17 mostra que o grupo
tratado teve um maior valor (média±epm, 8,08±0,56%, p<0,05) na porcentagem de
decaimento da glicemia, quando comparado ao controle (3,87±1,14%). Isso mostra que a
bleomicina alterou a sensibilidade à insulina, pois a velocidade de redução da glicemia se
apresentou maior.
52
0 5 10 15 20
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Glicemia (mg/dL) - ITT
Tempo (minutos)
CONTROLE
BLEOMICINA
Figura 17. Teste de tolerância à insulina (ITT) aplicado nos grupos controle e tratado com bleomicina,
analisando a glicemia (mg/dL) nos tempos (em minutos) 0; 2,5; 5; 10 e 20, após a aplicação da insulina. n=6,
p<0,05, sendo que o grupo tratado se apresentou diferente estatisticamente do controle.
Uma vez que houve alteração na funcionalidade pancreática, observada no
GTT, o estudo foi direcionado a uma avaliação especificamente das ilhotas pancreáticas,
realizando assim, o teste de secreção estática de insulina e pôde-se observar que houve
redução significativa (p<0,05) na secreção de insulina nas três concentrações de glicose
induzidas (2,8mM, 8,3mM e 22,2mM), representada por 40%, 35,5% e 55,5%,
respectivamente, quando comparado ao grupo controle (tabela 10 e figura 18).
Tabela 10. Concentração de insulina (ng.ilh.h) de ilhotas pancreáticas coletadas dos grupos controle e bleomicina
submetidos ao teste de secreção estática de insulina nas concentrações 2,8; 8,3 e 22,2mM de glicose.
Concentração de glicose Controle Bleomicina
2,8mM
1,70±0,20 1,02±0,25*
8,3mM
4,98±0,48 3,21±0,37*
22,2mM
21,72±1,68 9,67±1,18*
Valor da média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle
53
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0,0
2,2
4,4
6,6
8,8
11,0
13,2
15,4
17,6
19,8
22,0
24,2
Concentração de insulina (ng.ilh.h)
Concentração de Glicose (mM)
CONTROLE
BLEOMICINA
C2,8 Ble2,8 C8,3 Ble8,3 C22,2 Ble22,2
0
5
10
15
20
25
*
*
*
Concentração de Insulina (ng.ilh.h)
Grupos experimentais - Concentração de glicose (mM)
Figura 18. Concentração de insulina (ng.ilh.h) dos grupos controle (C) e bleomicina (Ble) submetidos ao teste de
secreção estática de insulina nas concentrações 2,8mM, 8,3mM e 22,2mM de glicose. Os valores correspondem
à média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle. Em A, representação gráfica em linhas e em B, em barras.
Ainda com relação às ilhotas pancreáticas do grupo tratado com bleomicina,
foram avaliadas as concentrações de insulina, GLUT2, PKC e PKA, sendo observado
aumento significativo (p<0,05) no GLUT2 (48,4%) e na PKC (70,8%), além da redução
(p<0,05) na PKA (38,5%), conforme mostra a tabela 11.
A
B
54
Tabela 11. Concentração (Ua) e immunoblotting de insulina, GLUT2 (transportador de glicose 2), PKC (proteína
quinase C) e PKA (proteína quinase A) em ilhotas isoladas e dos grupos controle (C) e tratado com bleomicina
(B).
Controle Bleomicina Immunoblotting
C B
Insulina
2,22±0,1 2,26±0,08
GLUT2
2,27±0,1 3,37±0,1*
PKC
1,27±0,1
2,17±0,2*
PKA
4,21±0,1
2,59±0,2*
Valor da média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle
Após as análises do grupo tratado com bleomicina, o estudo direcionou as
avaliações no grupo tratado com bleomicina associado à EDET, buscando não somente
avaliar a condição da musculatura respiratória, mas também outros sistemas, uma vez que o
animal havia sido tratado com um fármaco. Destaca-se que o foco de estudo desse grupo
associado, é o efeito da EDET na musculatura respiratória nessa condição.
Com relação ao tecido muscular, a avaliação foi direcionada ao conteúdo de
glicogênio muscular, reservatório energético principal para a musculatura esquelética. O
tratamento com bleomicina promoveu aumento significativo (p<0,05) nos músculos
diafragma (28,6%), peitoral (80%) e abdominal (145,4%) comparado ao grupo controle,
conforme pode ser observado na tabela 12. Porém, quando a EDET foi aplicada nessa
condição de tratamento, houve um aumento mais expressivo no conteúdo de glicogênio
muscular, representado por 95,2% no diafragma, 93,7% no intercostal, 180% no peitoral e
177% no abdominal quando comparado ao grupo controle (tabela 12).
Comparando o grupo tratado com bleomicina com o grupo tratado associado à
EDET, foi observado aumento significativo (p<0,05) no conteúdo de glicogênio nos músculos
diafragma (51,8%), intercostal (77,1%) e no peitoral (55,5%), também observado na tabela
12.
55
Tabela 12. Conteúdo de glicogênio (mg/100mg) dos músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal dos
grupos controle, tratado com bleomicina e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET).
Controle Bleomicina B+EDET
Diafragma
0,21±0,01 0,27±0,01* 0,41±0,04*#
Intercostal
0,32±0,08 0,35±0,03 0,62±0,06*#
Peitoral
0,25±0,03 0,45±0,05* 0,70±0,03*#
Abdominal
0,22±0,01 0,54±0,06* 0,61±0,05*
Valor da média±epm, n=6, p<0,05, * comparado ao controle, # comparado ao tratado com bleomicina
Ainda no tecido muscular, mais especificamente, no principal músculo da
inspiração, o diafragma, foi avaliada a concentração de receptores de insulina, havendo uma
redução no grupo tratado com bleomicina (34,83%) e um aumento no grupo tratado com
bleomicina associado à EDET (31,56%), quando comparado ao controle (tabela 13).
Tabela 13. Concentração (%) e immunoblotting de receptores de insulina do músculo diafragma dos grupos
controle, tratado com bleomicina e tratado com bleomicina + EDET (B+EDET).
Grupos IR (%) Immunoblotting
Controle
100
Bleomicina
65,1±14,8*
B+EDET
131,5±22,9*
Valor da média±epm. n=6
Após a avaliação dos receptores, determinou-se a concentração plasmática de
insulina nos grupos controle, tratado com bleomicina e tratado com bleomicina associado à
EDET, conforme mostra a tabela 14. Foi observado que houve um aumento significativo
(p<0,05) nos grupos bleomicina e bleomicina associado à EDET quando comparado ao
controle, porém sem diferença entre os grupos tratados (p>0,05).
56
Tabela 14. Concentração de insulina plasmática (ng/mL) dos grupos controle, tratado com bleomicina e tratado
com bleomicina + EDET (B+EDET).
Grupos Insulina
Controle
0,83±0,12
Bleomicina
7,81±0,87*
B+EDET
6,88±0,83*
Valor da média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle, # comparado ao tratado com bleomicina
Outras análises realizadas no grupo tratado com bleomicina e no grupo
associado com a EDET foram o peso de algumas estruturas como as glândulas supra-renais,
timo e baço, conforme mostra a tabela 15, além da verificação de uma possível alteração
gástrica gerada pela EDET, não apresentando alteração em nenhum dos dois grupos tratados.
Tabela 15. Peso (g) das glândulas supra-renais, timo e baço dos grupos controle, tratado com bleomicina e
tratado com bleomicina + EDET (B+EDET).
Controle Bleomicina B+EDET
Supra-renais
0,024±8,85E-4 0,027±0,002 0,034±0,002*#
Timo
0,47±0,01 0,40±0,03 0,34±0,03*
Baço
0,60±0,03 0,94±0,30 0,67±0,05
Valor da média±epm. n=6, p<0,05, * comparado ao controle, # comparado ao tratado com bleomicina
Com relação à lactacidemia do grupo tratado com bleomicina + EDET, o valor
foi de 4,08±0,47 (média±epm), havendo redução de 57,8% (p<0,05) quando comparado ao
grupo bleomicina, e a glicemia se apresentou em valores normais.
O perfil hematológico do grupo tratado com bleomicina + EDET se
caracterizou por valores considerados normais (média±epm) para a eritrometria (6,29±0,28 x
10
6
células/mm
3
) e hemoglobina (12,05±0,69 g/dL), porém o hematócrito apresentou
reduzido, conforme também observado anteriormente no grupo tratado somente com a
bleomicina.
57
Com relação à análise das metaloproteases do diafragma, houve a presença da
metaloprotease 2 (MMP-2), porém não houve diferença significativa entre os grupos
analisados, conforme mostra a tabela 16.
Tabela 16. Densitometria quantitativa (%) das bandas de zimografia MMP-2 (pró-ativa, intermediária e ativa)
em músculo diafragma dos grupos controle, tratado com bleomicina, EDET e tratado com bleomicina + EDET
(B+EDET).
Grupos Pró-ativa Intermediária Ativa
Controle
100 100 100
Bleomicina
115,1±30,6 135,4±10,9 129,3±51,9
EDET
123,5±45,5 129,0±19,0
150,6±63
B+EDET
117,9±62,7 135,5±26,5 146,2±56,8
Valor da média±epm. n=6.
A análise das citocinas plasmáticas foi realizada em 7 grupos experimentais,
porém não houve diferença significativa (p>0,05) em todos os grupos, fato que pode estar
relacionado ao tempo de exposição dos tratamentos, que foi um período agudo. Apesar de
haver diferença em outros parâmetros de análise, inclusive alteração muscular, as citocinas
plasmáticas não apresentaram diferença (tabela 17).
Tabela 17. Citocinas plasmáticas (pg/mL) IL-10, IL-6 e TNF-α dos grupos controle, EDET, pós-EDET,
bleomicina e bleomicina associado à EDET.
Grupos IL-10 IL-6
TNF-α
Controle
0,0035±0,002 0,0055±0,004 0,0217±0,031
EDET
0,0182±0,032 0,0269±0,060 0,0163±0,023
Pós-EDET
0,0032±0,001 0,0369±0,099 0,0153±0,025
Bleomicina
0,0035±0,001 0,0104±0,020 0,0194±0,032
Bleomicina+EDET
0,0028±0,001 0,021±0,047 0,0198±0,033
Valor da média±epm. n=6.
58
Após a exposição dos resultados em duas partes, o quadro 2 mostra uma síntese dos
mesmos.
QUADRO 2. Síntese dos resultados
Ht= hematócrito
Hb= hemoglobina
LM= linfócitos dos linfonodos mesentéricos
MT= macrófagos torácicos
SR= supra-renal
Símbolos: ↑ (aumento); ↓ (redução); = (não houve diferença)
Grupos experimentais /
Resultados
EDET
Bleomicina
B+EDET
Pós-EDET
EDET+7 dias
Sham
Glicogênio muscular
↑
↑: D, P, A
↑
D, A: ↑
P: ↓ e I: =
Proteínas totais/DNA
=
Tipo de fibras
↑ IID
↓ I
TBARS musculares
↑: A, P
IR
↑ ↓ ↑
MMPs
= =
ECG e sensibilidade atrial
= =
Respirometria
= = =
Imunohistoquímica do vago
Efluxo de
86
Rb
+
↓
Secreção estática de insulina
↓ ↓
GTT e ITT
↑
↓
Insulina, PKA, PKC e GLUT2
das ilhotas pancreáticas
↑: GLUT2 e PKC
↓: PKA
Insulinemia
↑ ↑ ↑ ↓
Perfil hematológico
↓ Ht, Hb e LM
↑ MT
↓ Ht
Fragilidade osmótica
=
Concentração plasmática de
glicose, lactato, creatinina, uréia,
fosfatase alcalina, TBARS, AST,
ALT
↑
↑ TBARS,
lactato, AST,
ALT e AGL
↓
lactato
↑ lactato
Citocinas plasmáticas (IL-6, IL-
10 e TNF-α)
= = = =
Úlcera gástrica
=
Morfometria do tecido pulmonar
↓
Ácido ascórbico e colesterol da
supra-renal pós-sessão
↓ colesterol
=
Peso das supra-renais, timo e
baço
=
↑ SR
↓ timo
59
6. DISCUSSÃO
60
6. DISCUSSÃO
6.1. Estimulação Diafragmática Elétrica Transcutânea
A fisioterapia respiratória tem buscado constantemente o aprimoramento de
técnicas e métodos de análise que dêem uma maior aplicabilidade para avaliar parâmetros
respiratórios, melhorando a efetividade da reabilitação de pacientes com patologias
pulmonares, intervenções periódicas em pacientes hospitalizados e na prevenção de alterações
pulmonares, com objetivo de proporcionar a melhor qualidade de vida possível a cada
condição.
Dentre os recursos fisioterapêuticos utilizados rotineiramente na clínica, a
estimulação elétrica neuromuscular é merecedora de destaque frente aos benefícios inerentes à
aplicação de estimulo elétrico, tendo sido observada elevação na captação de substratos
metabolizáveis (CANCELLIERO, 2004), ativação enzimática, redução no processo de fibrose
(KITCHEN e BAZIN, 2003), além de promover o fortalecimento muscular (GUIRRO,
NUNES e DAVINI, 2000). Neste sentido, tem sido sugerido que concomitante à elevação na
atividade contrátil, induzida pela estimulação elétrica, as fibras musculares apresentam
aumento na sensibilidade à insulina bem como ativação dos processos relacionados à elevação
na captação de glicose e síntese de glicogênio (WOJTASZEWSKI et al., 1999).
Com relação ao conteúdo muscular de glicogênio destaca-se que se trata de
uma reserva de glicose importante que reflete o status nutricional da fibra muscular, visto que
a hexose é o substrato energético preferencialmente metabolizado, assim, quando as reservas
glicogênicas apresentam-se reduzidas tem início o desenvolvimento de fadiga e conseqüente
comprometimento na atividade contrátil (SHULMAN e ROTHMAN, 2001). Assim, a
manutenção das reservas glicogênicas dentro da normalidade proporciona o equilíbrio na
homeostasia energética.
A área da fisioterapia respiratória com modelos experimentais em animais é
uma área em expansão que merece atenção especial por parte da comunidade científica,
principalmente no que se refere ao desenvolvimento/teste/validação de protocolos
experimentais que contribuam para o progresso desta área.
Assim, dentro da proposta do nosso estudo, a mobilização de glicogênio foi
avaliada na musculatura respiratória submetida ao recurso fisioterapêutico EDET durante 7
61
dias e foi verificado que houve uma expressiva e generalizada elevação nas reservas, similar
ao observado nos músculos esqueléticos periféricos estimulados eletricamente.
Isto reitera a existência de relações funcionais na rede de informações
delimitadas pela estimulação elétrica, a captação de substratos, o metabolismo e a formação
de reservatórios (RADDA, 1996; DUPONT, RICHMOND e LOEB, 2003). Cabe ressaltar
que, recentemente demonstramos os benefícios metabólicos da estimulação elétrica
neuromuscular em músculos desnervados e imobilizados (CANCELLLIERO, 2004; GUIRRO
et al., 2004)
Destacamos ainda que, além da ausência de estudos experimentais com
animais relacionados à estimulação diafragmática elétrica transcutânea e à abordagem
metabólica muscular respiratória, os estudos em seres humanos são escassos, limitando,
assim, a discussão dos resultados encontrados.
As alterações no suprimento energético muscular promovido pela EDET, não
refletiram em alterações na quantidade de proteínas totais e DNA musculares, fazendo
inferência a sistemas que possam ser desencadeados tardiamente e que venham a interferir na
síntese protéica. É importante salientar que os estudos apresentam caráter multifatorial
diferindo quanto ao tempo de tratamento, protocolo e tipo de fibras analisadas, e isso,
consequentemente, discrimina os resultados. Em nosso estudo, o período do tratamento foi de
7 dias, com 20 minutos diários de aplicação e no grupo, o qual foi aplicada a terapia, não
havia condições musculares catabólicas. Alterações significativas também não foram
observadas na respirometria, tanto no grupo EDET quanto no Pós-EDET.
Pelo nosso estudo estar relacionado a desenvolvimento de um protocolo de
EDET em animais, é importante entender os sistemas de estimulação elétrica neuromuscular,
os quais podem ser realizados através de eletrodos de superfície, percutâneos e implantáveis,
sendo que o fisioterapeuta pode utilizar o recurso somente da primeira forma. Assim, os
eletrodos de superfície, comparados aos eletrodos implantáveis, apresentam algumas
vantagens, tais como: facilidade na colocação, alteração de posição, atingem grandes áreas
musculares e não são invasivos (VOSSIUS, 1986). O potencial elétrico produz linhas de
campo de forma que os íons sódio, localizados externamente à membrana do nervo motor,
sofram um influxo súbito, gerando o potencial de ação, o qual se propaga pelo axônio até a
fenda sináptica e o músculo é, então, contraído (PEIXOTO e CLIQUET, 1996).
O estímulo deve ter certas características para promover uma contração,
destacando amplitude e duração, que devem ser iguais ou maiores que as condições
fisiológicas para cada tecido. A força de contração muscular pode ser modulada a partir da
62
variação da carga elétrica total aplicada por unidade de tempo e o sinal é constituído
basicamente por trens de pulsos (SENE, 2003). A amplitude e a largura dos pulsos estão
relacionados ao recrutamento das fibras musculares que serão excitadas e a freqüência dos
pulsos controla a taxa de disparo das unidades motoras. (NATHAN e TAVI, 1990).
O princípio de Henneman, Somjen e Carpenter (1965), em relação ao
recrutamento da unidade motora do músculo esquelético humano, descreve um recrutamento
progressivo das pequenas unidades motoras, tipicamente lentas seguidas em ordem pelas
fibras de maior diâmetro, tipicamente unidades motoras de contração rápida. A sugestão é de
que a estimulação elétrica neuromuscular inverte esse princípio, recrutando unidades motoras
maiores (rápidas) antes das lentas, se devendo a dois fatos: os axônios das unidades motoras
maiores têm baixa resistência à passagem da corrente e conduzem o potencial de ação mais
rapidamente em relação a unidades motoras menores, e dados demonstram um aumento na
fadiga com estimulação elétrica versus contração voluntária. No nosso estudo, com relação à
tipagem de fibra muscular, a EDET promoveu alteração na porcentagem das fibras,
destacando a diminuição no tipo I e aumento no tipo IID. Tal fato pode ser explicado pela
frequência da corrente utilizada, a qual foi de 50Hz.
Savage (1984) relatou que as faixas de freqüência utilizadas na estimulação de
nervos motores estão entre 10 e 50Hz. Nas estimulações musculares a freqüência da corrente
utilizada é de vital importância, uma vez que freqüências acima de 15Hz promovem
contrações tetanizantes. Como o mecanismo contrátil nessa condição não apresenta período
refratário, consegue-se, com o aumento de freqüência, atingir um instante em que cada nova
contração ocorra antes do término da precedente. Isso decorre do fato de existirem íons cálcio
em quantidades suficientes no sarcoplasma, até mesmo no intervalo entre os potenciais de
ação para manter o estado de tetania, sem permitir o relaxamento entre os potenciais de ação.
Como resultado, a segunda contração é parcialmente somada à anterior, de forma que a força
total de contração aumenta progressivamente com o aumento da freqüência de estimulação até
atingir um limite máximo próximo à freqüência de 50Hz.
Mesmo utilizando-se freqüências superiores a 50Hz, o aumento adicional de
força da contração não é proporcional ao aumento da freqüência (GUIRRO e GUIRRO,
2002). As fibras musculares de contração rápida (tipo II) ou fásicas, que são recrutadas para
acrescentar força muscular e rapidez de movimento, respondem melhor a frequências na faixa
de 50-150 Hz (LOW e REED, 2001). Frente às ações deflagradas pela estimulação elétrica
merecem destaque os cuidados quanto à aplicação desta técnica terapêutica considerando-se a
forma e duração do pulso utilizado, tipo de contração utilizada para estimular o músculo, a
63
força de contração induzida, número de contrações produzidas por período de tratamento, a
duração de cada contração, o tempo de repouso entre as contrações e o número de sessões
diárias ou semanais (HERBISON, JAWEED e DITUNNI, 1978). Sendo assim, o profissional
fisioterapeuta deve conhecer os parâmetros da corrente elétrica para poder aplicar a EDET
com segurança em cada condição clínica.
Vale ressaltar, que a EDET é um recurso pouco utilizado e estudado na prática
clínica fisioterapêutica, pelo fato das análises em humanos serem limitadas, incluindo
capacidades e volumes pulmonares, e força muscular inspiratória e expiratória. Porém, o
recurso pode ser benéfico, em algumas condições, ao paciente pelo fato de alterar a tipagem
de fibra muscular e contribuir para o trabalho muscular respiratório, uma vez que há
condições clínicas que promovem transformação na tipagem de fibra, como por exemplo, a
terapia com glicocorticóides. Segundo Polla et al. (2004), os músculos esqueléticos são
compostos por diferentes tipos de fibras, sendo cada tipo identificado por uma isoforma de
cadeia pesada de miosina, a qual é expressa como lenta 1, rápida 2A, rápida 2X (ou 2D) e
rápida 2B. As fibras lentas são resistentes à fadiga devido seu alto metabolismo oxidativo
enquanto as fibras 2X e a 2B são facilmente fadigáveis e as fibras 2A exibem resistência à
fadiga intermediária. Em diafragma de humanos adultos, as fibras lentas e rápidas estão
presentes em igual proporção, enquanto os intercostais possuem uma proporção maior de
fibras rápidas. Esses autores ainda destacam que as características funcionais e estruturais das
fibras musculares respiratórias não são fixas, ou seja, podem se modificar em resposta a
muitas condições fisiológicas e patológicas como treinamento, adaptação à hipóxia, mudanças
relacionadas à idade, associadas a doenças respiratórias e a fármacos como glicocorticóides e
agonistas β-adrenérgicos.
Tratamento com corticóides são frequentemente utilizados para tratar uma
variedade de doenças pulmonares, porém tem-se verificado a atrofia dos músculos
respiratórios, incluindo o diafragma (KOERTS-DE et al., 2000), além da diminuição da força
muscular (SIECK et al., 1999). O tratamento agudo induz atrofia de todos os tipos de fibra
muscular, porém, o crônico é manifestado predominantemente nas fibras que expressam
isoformas de cadeia pesada de miosina 2X e 2B (SIECK et al., 1999; VAN BALKOM et al.,
1997). Verheul et al. (2004) também observaram que tratamento com corticosteróide causa
atrofia nas fibras do músculo diafragma de ratos, especificamente naquelas contendo cadeia
pesada de miosina, tanto tipo 2X quanto 2B. Segundo Aravamudan et al. (2006), o músculo
diafragma, o maior músculo inspiratório, se difere dos músculos de membros em condições
64
de sobrecarga e por ser de tipagem de fibra mista, suas fibras são colocadas na mesma
condição experimental.
Vários estudos observaram atrofia significativa das fibras tipo IIX e IIB em
duas semanas de desnervação do diafragma (YANG et al., 1998; ZHAN et al., 1997). Nesse
mesmo período analisado, Aravamudan et al. (2006) observaram diminuição do domínio
mionuclear (MND) das fibras IIX e IIB em músculo diafragma desnervado. Ressalta-se, que
cada mionúcleo regula tanto os produtos gênicos quanto a expressão protéica em um volume
limitado de fibras musculares, o que tem sido denominado de MND (HALL e RALSTON,
1989).
Outra condição em que ocorre alteração na tipagem de fibras é na doença
pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), sendo que esses pacientes apresentam uma maior
proporção de fibras tipo I do que pessoas sem a doença e esse processo podem contribuir para
a diminuição da geração de força pelo diafragma de pacientes com DPOC severa (LEVINE et
al., 2002). Segundo Gosker et al. (2000) a baixa tolerância a exercícios físicos tem uma
grande influência na condição de saúde dos indivíduos com DPOC e insuficiência cardíaca
crônica, e o desempenho do músculo esquelético é um forte preditor da capacidade a essa
condição. Há similaridades entre ambas as doenças com relação às alterações musculares que
estão prejudicadas, porém alterações diferentes ocorrem em tipo de fibras diferentes. Dados
histológicos e metabólicos mostram que músculos periféricos sofrem uma mudança de
metabolismo energético oxidativo para glicolítico, enquanto o oposto é observado no
diafragma, havendo limitação principalmente nas capacidades de resistência e força,
respectivamente. Esses autores ainda ressaltaram que em ambas as doenças, o déficit
muscular é multifatorial determinado por hipóxia, estresse oxidativo, desuso, medicamentos,
depleção nutricional e inflamação sistêmica, podendo contribuir para anormalidades
musculares.
Esse aspecto multifatorial é importante ao conhecimento do profissional, pois
direciona ao tratamento específico de reabilitação. A EDET ou o treinamento muscular deve
ser direcionado conforme as necessidades de cada paciente, sendo aplicado um protocolo de
resistência, de força ou ambos. No caso da EDET, o protocolo também deve ser programado
de acordo com a condição clínica e o objetivo da reabilitação muscular. Tal fato é importante
ser destacado, pois há aparelhos de estimulação elétrica com protocolos prontos, incluindo o
parâmetro da frequência da corrente elétrica, a qual é essencial para recrutamento dos tipos de
fibras rápidas ou lentas.
65
Como já descrito anteriormente, o recrutamento das fibras musculares na
contração ativa, se inicia com as fibras tipo I e posteriormente as fibras tipo II, sendo que
essas últimas requerem uma maior sobrecarga para serem recrutadas. Tal fato pode ser
importante a pacientes que estão debilitados a realizar em exercícios mais vigorosos, por
exemplo, com carga, e assim, dificultar o recrutamento das fibras tipo II, que são as fibras de
força. Destaca-se ainda que o músculo tem suas proporções de tipos de fibras, que são
importantes tanto para a resistência quanto para a força muscular, e um desequilíbrio nessa
proporção pode levar a repercussões funcionais deletérias para o indivíduo. Assim, é
importante ressaltar que o trabalho aplicado em ratos durante um período de 7 dias foi
suficiente para alterar o tipo de fibras, destacando sua plasticidade diante do estímulo elétrico,
porém em humanos esse período pode ser maior, uma vez que vários trabalhos mostram
diferenças na desproporção, com treinamento muscular respiratório a partir de duas semanas.
Para poder aplicar esse protocolo de EDET com segurança nos animais, um
aspecto importante abordado no nosso estudo foi o fato de que a corrente elétrica aplicada na
caixa torácica poderia ser dissipada e transmitida desta, através dos líquidos corporais, para
outras estruturas presentes na região, incluindo o coração. Isso poderia gerar alterações nas
condições homeostáticas e inviabilizar a aplicabilidade enquanto protocolo experimental em
animais.
Dentre as análises cardíacas, a eletrocardiografia é um dos importantes
métodos de diagnóstico de diferentes alterações de condutibilidade, incluindo as arritmias
cardíacas, podendo determinar a origem do ritmo e a freqüência de despolarização do coração.
Este método fornece informações do estado clínico do miocárdio, uma vez que as deflexões
P-QRS-T do traçado podem ser alteradas por fatores fisiopatológicos (WOLF, CAMACHO e
SOUZA, 2000).
O eletrocardiograma (ECG) é um dos métodos mais importantes no diagnóstico
de alterações cardíacas e dependendo do comprometimento, a propagação do potencial de
ação no músculo cardíaco altera as ondas do ECG e seus intervalos. O conhecimento desta
propriedade de condução através dos fluidos corporais permite registrar, de modo não-
invasivo, eventos que ocorrem no coração. As ondas do ECG decorrem da somatória temporal
de despolarizações e repolarizações em grupos de fibras cardíacas e permitem distinguir
intervalos que correspondem ao tempo para ativar as regiões do músculo cardíaco
(LENGYEL, 1974).
O fundamento/princípio que foi utilizado no nosso estudo para avaliar o
registro do ECG segue o padrão fisiológico rotineiramente utilizado e assim definido: desde o
66
início da onda P até o início do complexo ventricular que é chamado de intervalo P-R, e
corresponde ao tempo desde o início da ativação sinusal ao início da despolarização
ventricular. A duração do complexo QRS, que corresponde ao tempo total para a
despolarização ventricular, iniciada no feixe de His se dissipa pelo tecido condutor His-
Purkinje e a toda massa ventricular contrátil. O intervalo S-T inicia-se no final do complexo
QRS e vai até o início da onda T. Este intervalo corresponde ao tempo que decorre desde o
fim da despolarização completa até o início da repolarização do ventrículo, ou seja, a fase de
platô do potencial de ação. Para determinar a freqüência cardíaca o intervalo R-R é utilizado,
o que determina o tempo entre duas ondas R sucessivas. O intervalo entre o início do
complexo QRS e o fim da onda T é chamado de intervalo Q-T, que corresponde ao tempo
necessário para a completa excitação elétrica e a recuperação dos ventrículos, sendo, portanto,
a medida da duração da sístole “elétrica”, a qual inclui a despolarização e a repolarização
ventricular (ROCHA e SILVA, 1999).
Como já explicitado no nosso trabalho, a estimulação diafragmática elétrica
transcutânea consiste na aplicação de corrente elétrica na caixa torácica produzindo a
contração diafragmática. Foi baseado neste contexto, que optamos por realizar um estudo das
ondas eletrocardiográficas e seus intervalos em ratos submetidos ao procedimento
fisioterapêutico. Os resultados do nosso estudo mostraram que não houve diferença no eixo
elétrico do coração que se manteve entre 60-90º, angulação classicamente constatada em
ratos, acompanhando a normalidade para a espécie. A frequência cardíaca e a relação
amplitude/duração das ondas eletrocardiográficas e seus segmentos, também não
apresentaram alterações, em comparação ao grupo controle. Assim, não houve alteração na
geração e condução do potencial elétrico cardíaco, bem como no posicionamento do órgão,
garantindo assim, a segurança do protocolo.
Ainda na análise cardíaca do nosso trabalho, também foi avaliada a freqüência
de batimentos espontâneos médios in vitro dos átrios direitos de animais controle ou
submetidos à EDET. Como os átrios foram isolados e mantidos em banho com solução
nutritiva, o tecido não estava sujeito a quaisquer influências da inervação autonômica, já que
não havia no sistema nenhuma forma de estimulação elétrica que pudesse desencadear a
liberação de neurotransmissores. Assim, a freqüência observada neste experimento representa
a frequência intrínseca das células marcapasso. Como esta é decorrente da atividade de canais
iônicos com características especiais que determinam a despolarização espontânea da célula,
nossos resultados mostraram que a aplicação de EDET não alterou a atividade elétrica da
célula marcapasso, confirmando os resultados obtidos na análise eletrocardiográfica.
67
É sabido que o nódulo sinoatrial é um conjunto de células auto-excitáveis
responsáveis pelo marcapasso cardíaco e, mesmo apresentando atividade automática, recebe
controle de sistemas como o endócrino, parácrino e nervoso caracterizado pela inervação
autonômica simpática, cujo neurotransmissor é a noradrenalina. Ele se localiza na câmara
atrial direita e é o marcapasso cardíaco, visto que gera potenciais de ação em freqüência maior
do que nas outras áreas do miocárdio, portanto a normalidade de sua função representa um
importante fator para o controle da frequência cardíaca. A manutenção do equilíbrio da
função nodular conduziu nosso estudo na realização da segunda análise, buscando avaliar se
há segurança do protocolo utilizado quanto à integridade funcional e a eficiência dessa
estrutura.
Essa segunda análise está relacionada à resposta do tecido às catecolaminas,
que depende da interação aos receptores adrenérgicos e dos eventos intracelulares, bem como
da atividade dos sistemas de metabolização das catecolaminas, incluindo a recaptação
neuronal e captação extraneuronal. O principal substrato de recaptação neuronal pelas
terminações nervosas é a noradrenalina, e esse mecanismo é principalmente mediado pela
enzima monoamino-oxidase (SLOTKIN e BAREIS, 1980; TRENDELENBURG, 1991). Já na
captação extraneuronal, as catecolaminas são captadas por células não nervosas do tecido e
são metabolizadas por ação da enzima catecol-orto-metil transferase, sendo a adrenalina o
principal substrato deste sistema (TRENDELENBURG, 1978; MANNISTO e KAAKKOLA,
1999). Alterações no sistema do marcapasso cardíaco podem ocorrer em algumas patologias,
levando a comprometimentos importantes que interferem na qualidade de vida dos pacientes.
Segundo Sanders et al. (2004) o complexo do marcapasso sinusal normal é
uma grande estrutura que está presente no átrio direito, o qual pode estar comprometido,
como na Síndrome do nodo sinusal, a qual, por sua vez, está associada com remodelação
atrial difusa caracterizada por mudança estrutural, anormalidades de condução e aumento na
refração atrial direita. Outra patologia que interfere na condução cardíaca é o Bloqueio
cardíaco congênito, no qual a anormalidade da condução é caracterizada pelo bloqueio
atrioventricular completo, e que a bradicardia sinusal pode ser um importante marcador na
detecção e prevenção dessa patologia (HU et al., 2004).
Verkerk et al. (2003) também observaram bradicardia em modelos animais
com insuficiência cardíaca, sendo que a diminuição na frequência cardíaca foi resultante do
aumento do comprimento do ciclo intrínseco do nodo sinoatrial, alterando a atividade do
marcapasso cardíaco. Marmade et al. (2005), num relato de caso de hemangioma de átrio
68
direito, observaram alteração cardíaca, onde o eletrocardiograma mostrou ritmo sinusal com
distúrbios de repolarização difusa.
Em alguns estudos da literatura, foi observada supersensibilidade à
isoprenalina e adrenalina em átrio direito de ratos submetidos a uma única sessão de natação,
porém após três sessões de natação verificou-se que havia uma subsensibilidade (SPADARI,
BASSANI e MORAES, 1988; SPADARI e DE MORAES, 1988). Tanno et al. (2002)
observaram alteração na sensibilidade atrial de ratas submetidas à natação (50 minutos)
caracterizada por supersensibilidade à noradrenalina somente na fase proestro do ciclo estral,
sem alteração nas outras fases, incluindo, estro, metaestro e diestro. Em outro estudo, ratos
submetidos a treinamento aeróbico durante nove semanas apresentaram redução na frequência
inicial de átrios isolados quando comparado ao grupo sedentário, além da supersensibilidade
atrial à norepinefrina e epinefrina (Tanno et al., 2005).
Com relação ao protocolo utilizado no nosso estudo, esse não interferiu nos
parâmetros analisados da sensibilidade atrial, incluindo frequência cardíaca inicial, resposta
máxima e sensibilidade à noradrenalina, ativação dos sistemas de metabolização das
catecolaminas, além da atividade elétrica cardíaca (ECG). Tal fato reforça a segurança do
protocolo, viabilizando-o para futuras análises de relevância à fisioterapia respiratória e ao
benefício do paciente que necessita do recurso fisioterapêutico.
Após a verificação da segurança parcial do protocolo com relação a essas
específicas análises cardíacas, as análises sequentes foram relacionadas ao pâncreas devido à
hipótese da ativação vagal. Com a análise imunohistoquímica da região esofágica na linha
diafragmática, pôde-se observar que a inervação parassimpática colinérgica, representada pelo
nervo vago, encontra-se na linha de propagação de corrente elétrica. A análise morfológica da
região esofágica focalizando sua inervação tem sido utilizada em vários trabalhos e permite
afirmar com segurança a localização da inervação parassimpática (POWLEY et al., 1983;
PRECHTL e POWLEY, 1987).
Com relação ao tecido pancreático, é sabido que os canais iônicos controlam os
fluxos dos íons através das membranas nas células β, mantendo assim o potencial de
membrana e participando efetivamente do processo secretório da insulina estimulada por
diferentes substâncias. Mudanças no efluxo de K
+
são eventos iniciais da cadeia de reações
que levam à secreção de insulina induzida por glicose (ATWATER et al., 1980). Esse
experimento foi iniciado avaliando o efeito da adição de glicose (16,7mM) sobre o efluxo de
ilhotas isoladas de ratos controle perfundidas com glicose 5,6 mM, e foi observada uma
expressiva redução no efluxo do radioisótopo concomitante à elevação na concentração de
69
glicose no meio perfusor, porém houve reversão após sua remoção, indicando bloqueio na
permeabilidade ao K
+
. Os dados aqui apresentados são similares aos relatados na literatura,
estando fundamentado em estudos que demonstraram que a glicose é o mais potente
secretagogo da insulina, promovendo diminuição na razão do efluxo do
86
Rb (ATWATER,
1980). Esta mudança na permeabilidade da célula β ao K
+
, contribui para o padrão bifásico da
atividade elétrica e da secreção de insulina (HENQUIN e MEISSNER, 1988).
A literatura mostra que, o controle colinérgico do fluxo iônico em células β
pancreáticas é alvo de estudo de diabetologistas (ZAWALICH et al., 1996). Assim, o
experimento foi direcionado à avaliação da sensibilidade colinérgica de ilhotas de Langerhans
coletadas de ratos controle, optando pela utilização da carbamilcolina (100µM) visto que não
é metabolizada pela acetilcolinesterase das ilhotas pancreáticas e nesta concentração provoca
o estímulo máximo no processo secretório, sendo adicionada ao meio perfusor contendo
glicose 5,6mM. Observou-se que o agente colinérgico provocou aumento significativo no
efluxo do radioisótopo, corroborando com observações que apontam para a participação do
neurotransmissor no processo secretório de insulina (DEBUYSER, DREWS e HENQUIN,
1991).
Dentro da proposta do nosso trabalho, passou-se a avaliar o efluxo do
86
Rb de
ilhotas de Langerhans isoladas de ratos submetidos a sete sessões de EDET. Inicialmente foi
avaliado o comportamento do efluxo do radioisótopo frente à adição de glicose 16,7mM ao
meio perfusor contendo glicose 5,6mM, e foi observada modificação na permeabilidade ao
K
+
. A mudança para a solução de glicose contendo 16,7mM causou diminuição reversível no
efluxo do
86
Rb, porém em menor intensidade se comparado à resposta obtida em ilhotas
controle, sugerindo diminuição na sensibilidade das células β à glicose. No mesmo contexto,
foi avaliada a sensibilidade colinérgica das ilhotas coletadas de ratos submetidos à EDET
através da adição de carbamilcolina (100µM) no meio perfusor e observou-se redução na
capacidade do agente colinomimético em estimular elevação no efluxo do
86
Rb, indicando
redução na sensibilidade colinérgica. Este fato mostra que a EDET promove modificação na
efetividade do controle neural parassimpático do processo secretório da insulina, entendendo
que este sistema está dentro da dinâmica multifuncional que coordena a secreção de insulina
(ZAWALICH et al., 1989).
Com relação à concentração plasmática de glicose foi observada diferença
entre os grupos controle e submetidos à EDET, mantendo a normoglicemia. Cabe ressaltar
que as alterações na sensibilidade das ilhotas, induzida pela EDET, podem indicar
70
downregulation nos sistemas que atuam na interface controle autonômico
colinérgico/glicemia, merecendo novos estudos para uma maior exploração sobre o assunto.
Assim, os resultados do nosso estudo mostraram que a EDET pode interferir na
homeostasia do sistema secretório da insulina, uma vez que promoveu redução na dinâmica
de efluxo do
86
Rb, fato que reflete diretamente em alterações no padrão insulinêmico. Nesse
mesmo sentido, a secreção estática de insulina, também foi alterada na presença de EDET,
tanto no grupo que foi analisado após as 7 sessões quanto no grupo que foi analisado após 7
dias da última sessão, mais um fato que sugere a ativação vagal do pâncreas.
O conhecimento do comportamento pancreático na presença da EDET pode
auxiliar na conduta do fisioterapeuta, imprimindo um caráter de ação mais individualizada,
que insere no contexto profissional o acompanhamento do perfil glicêmico do paciente.
Destaca-se ainda, a importância de outros estudos mais aprimorados direcionados à avaliação
das relações EDET/insulinemia que venham contribuir para uma análise mais globalizada da
ação fisioterapêutica, uma vez que a insulina é essencial para a ativação de vias citosólicas
importantes do tecido muscular como a síntese protéica, manutenção energética, transcrição
gênica, entre outras, e como a fisioterapia respiratória trabalha com músculo esquelético, tais
fatos fisiológicos são importantes para o conhecimento do profissional.
Como a EDET promove uma contração muscular, o nosso estudo também foi
direcionado na avaliação de parâmetros bioquímicos relacionados ao exercício físico.
Segundo Nelson e Cox (2002), o exercício físico estimula a secreção de catecolaminas pela
supra-renal que agem nos músculos e fígado ativando a enzima glicogênio fosforilase,
promovendo a glicogenólise, ao mesmo tempo inibindo a enzima glicogênio sintetase. Nos
primeiros minutos do exercício físico, o músculo esquelético utiliza-se da glicose livre
citosólica e do próprio reservatório de glicogênio enquanto as células hepáticas são
estimuladas a liberar a glicose no plasma proveniente da glicogenólise.
O glicogênio é o principal reservatório energético muscular, preferencialmente
mobilizado durante o exercício físico. No estudo de Lees et al. (2001) a contração muscular
resultou na diminuição na concentração de glicogênio muscular, também verificado por
Johnson et al. (2003)
no músculo vasto lateral de humanos após a estimulação elétrica. O
período após o exercício físico é também caracterizado pelo aumento substancial na
sensibilidade à insulina que promove translocação de GLUT4 insulino-dependente e
conseqüente captação de glicose, fenômeno restrito aos músculos exercitados (MUNOZ,
LÓPEZ-LUNA e HERRERA, 1999). O aumento na sensibilidade à insulina pós-exercício
parece ser conseqüência de melhora dos eventos relacionados à fase pós-receptor de insulina,
71
isto é, na fosforilação de proteínas que iniciam as ações do hormônio (KIRWAN et al., 2000).
O conteúdo muscular de glicogênio é um componente importante no fornecimento de energia
durante a realização do exercício físico (BACURAU, 2001), sendo que níveis elevados
podem melhorar a resistência, enquanto que a depleção está freqüentemente associada à
fadiga muscular (SHULMAN e ROTHMAN, 2001).
O músculo peitoral é classificado como acessório da inspiração, diferente do
diafragma e intercostais, considerados músculos principais. Este fato pode explicar o
comportamento diferenciado do peitoral durante a maior demanda respiratória induzida pela
EDET, o qual passou a ser mais solicitado reduzindo o conteúdo de glicogênio. Apesar do
intercostal não apresentar diferença estatística, o diafragma apresentou aumento significativo
nas reservas glicogênicas após a sessão da EDET. Cabe ressaltar que, o diafragma é um
músculo com atividade constante (24 horas por dia) durante a inspiração, ou seja, o estímulo é
constante em cada curso inspiratório, e ao ser estimulado se comportou de maneira diferente
do peitoral. Este fato também ocorreu no abdominal, que é recrutado somente na expiração
forçada, já que esse movimento é passivo. Apesar de não serem classificados como músculos
principais, os músculos abdominais exercem outras funções importantes como, por exemplo,
estabilizar a base do tórax durante a inspiração, além de proporcionar uma importante
proteção das vísceras (BRANDT, RICIERI e GRIESBACH et al., 2004).
O aumento nas reservas glicogênicas, observadas nos músculos abdominal e
diafragma, pode ser explicado por uma taxa aumentada na captação de glicose e ativação das
vias responsáveis pela glicogênese e menor oxidação da hexose. Segundo Goodyear et al.
(1992), o aumento na atividade contrátil induzida pelo exercício físico favorece a captação de
glicose pelas fibras musculares, cujo mecanismo é explicado pela translocação de GLUT4
insensíveis à insulina de reservatórios citosólicos para a membrana. Há evidências de que há
dois espaços intracelulares distintos de transportadores de glicose no músculo esquelético, um
responde pelo exercício e outro pela insulina (FRANCH, ASLESEN e JENSEN, 1999). O
exercício físico induz melhora na sensibilidade do músculo à insulina, sendo que seus efeitos
podem durar por várias horas após o término (GOODYEAR e KAHN, 1998). Um achado
importante do estudo de Hamada et al. (2003) foi que a captação de glicose corporal é
agudamente aumentada em resposta a 20 minutos de estimulação elétrica e este aumento
perdura por pelo menos 90 minutos após a finalização. Neste sentido, este estudo reitera e
corrobora com esta resposta fisiológica.
Forti et al. (2004)
estudaram o perfil bioquímico em ratos que receberam
estimulação elétrica no membro inferior e, avaliaram a glicemia e lactacidemia, constatando
72
que estes parâmetros foram alterados durante a estimulação, além de uma expressiva redução
no conteúdo de glicogênio dos músculos periféricos, logo após a sessão. Assim, nossos
resultados mostram a especificidade do comportamento muscular frente ao estímulo aplicado,
como mostra esse experimento com a EDET, apontando uma hierarquia funcional no processo
respiratório.
Ainda analisando o grupo que recebeu uma sessão de EDET, dentre as
glândulas estimuladas durante o exercício físico, destaca-se a supra-renal, responsável pela
secreção dos hormônios adrenalina e noradrenalina (medula adrenal) e corticosteróides
(córtex adrenal), que são divididos em glicocorticóides, mineralocorticóides e androgênios.
Dentre os efeitos das catecolaminas, estão: aumento na taxa metabólica, aumento na
glicogenólise (fígado e músculo), aumento da força de contração do coração, aumento na
liberação de glicose e ácidos graxos livres para a corrente sanguínea, vasodilatação nos
músculos exercitados e vasoconstrição em vísceras e na pele, aumento da pressão arterial e
aumento da frequência respiratória (BERNE e LEVY, 1996).
Dois hormônios secretados durante o exercício pelo córtex da glândula supra-
renal são: os mineralocorticóides, que atuam no sentido da manutenção da concentração de
líquidos corporais gerando aumento na pressão arterial e os glicocorticóides, responsáveis por
várias adaptações do organismo como: durante o exercício ocorre mudança no metabolismo
energético muscular, disponibilizando mais intensamente a glicose para o tecido neural, além
de promover mobilização das reservas lipídicas gerando ácidos graxos e estimular o
catabolismo protéico fornecendo, assim, outras fontes de energia e/ou substratos
neoglicogênicos. Segundo Canali e Kruel (2001) a dinâmica secretória do cortisol durante o
exercício é de difícil diagnóstico, pois há muita variabilidade no tipo e intensidade do
exercício, nível de treinamento, estado nutricional e ritmo circadiano.
Nesse grupo do nosso trabalho, foi também analisado o comportamento da
glicemia e insulinemia durante a sessão de estimulação diafragmática elétrica transcutânea, já
que durante o exercício os hormônios glucagon e insulina, importantes no controle glicêmico,
são alterados. Segundo Guyton e Hall (1997) o glucagon, juntamente com o cortisol e
catecolaminas são responsáveis pelo aumento na glicemia, mas no estudo de Fernández-
Pastor (1992) foi observado que no início do exercício a secreção de glucagon é mais rápido
até o 15
o
minuto se comparado aos demais hormônios e que a sua secreção é proporcional à
duração do exercício. Vale ressaltar que, variação na flutuação hormonal é dependente tanto
do tipo do exercício, quanto do condicionamento do indivíduo.
73
Corroborando com esses estudos, nossos resultados apresentaram aumento
tênue da glicose plasmática durante a sessão de EDET, perdurando após 20 minutos. Esse
aumento se manteve na faixa de concentrações normoglicêmicas, não sendo observada
hiperglicemia.
Com relação à insulina, hormônio contra-regulador do glucagon, houve uma
queda na concentração plasmática durante a sessão de estimulação elétrica seguido de
aumento após a sessão. Segundo Deuschle et al. (1998) o exercício físico estimula a liberação
de glucagon, e esse hormônio atua, pela via parácrina, inibindo a secreção de insulina,
principalmente para favorecer a maior disponibilidade de glicose para a atividade. Além
disso, as catecolaminas, cuja concentração é aumentada durante o exercício, também inibem a
secreção. Após a sessão, há uma pequena elevação na insulinemia refletindo o
comportamento de retorno à condição de equilíbrio uma vez que havia o domínio de um
sistema de bloqueio do processo secretório da insulina.
A lactacidemia também foi acompanhada durante a sessão de EDET, e foi
observado aumento, com pico em cinco minutos após a finalização da sessão, seguida de
redução e retorno à normalidade, demonstrando que a taxa de produção acha-se em equilíbrio
com a remoção. Estudos mostram que a concentração plasmática de lactato depende da
relação entre a velocidade com que é produzido pelo músculo e a velocidade com que é
removido, começando a se elevar no plasma quando a intensidade do exercício chega a 50-
60%VO
2
máximo (FOSS e KETEYIAN, 2000). Com a glicólise muscular acelerada, devido à
necessidade de energia, e impulsionada pela ação das catecolaminas, a produção de ácido
láctico aumenta nas mesmas proporções, e este é lançado à corrente sangüínea sob a forma de
lactato, representado pela elevação na sua concentração no plasma.
Os mecanismos envolvidos no acúmulo de lactato durante o exercício físico
são diversos, porém um dos principais envolve a maior participação da glicólise anaeróbia na
produção de energia. O retorno aos níveis normais se deve à oxidação pela própria
musculatura esquelética, pela musculatura cardíaca e em menor proporção pela conversão em
glicose pelo fígado enquanto substrato gliconeogênico (BONEN, 2000). Porém, quando a
oferta de energia e oxigênio começa a ser insuficiente e a glicólise passa a ocorrer de forma
mais acelerada para se obter energia mais rapidamente, num metabolismo anaeróbio,
desequilibra-se o sistema de produção e utilização de lactato, já que uma aceleração na
glicólise aumenta proporcionalmente a concentração plasmática de lactato. Apesar disso, as
74
células hepáticas não conseguem realizar a gliconeogênese na mesma velocidade, havendo
um acúmulo de lactato sangüíneo (NELSON e COX, 2002).
Com relação à concentração de ácido ascórbico e colesterol na glândula supra-
renal, observamos somente alteração significativa no colesterol, representada por diminuição
no grupo que recebeu a EDET. Sayers e Sayers
já demonstraram em 1949, que a glândula
adrenal de ratos submetidos a situações como exposição ao frio, lesões ou outras condições
estressoras, apresentavam diminuição das concentrações de colesterol e de ascorbato.
Azevedo (1994) relatou que há inúmeros experimentos com glândula adrenal
demonstrando que a redução no colesterol, precursor dos esteróides corticais, coincide com a
queda do ascorbato. Porém, nesse estudo o conteúdo de ácido ascórbico não se alterou como o
colesterol, sugerindo que a EDET interferiu parcialmente no processo da formação dos
hormônios, indicando que há um estímulo primário eficaz, porém não totalmente efetivo para
promover elevação na síntese hormonal.
6.2. Tratamento com bleomicina e a associação com a EDET
Com relação à segunda etapa do desenvolvimento do nosso estudo, essa foi
relacionada ao efeito do tratamento com o quimioterápico sulfato de bleomicina, o qual induz
a fibrose pulmonar como efeito colateral, além da associação com o tratamento da EDET.
Nas doenças respiratórias, os músculos respiratórios podem “experenciar”
overload (sobrecarga) e overactivity (excesso de atividade) porque cada respiração pode
requerer maior força muscular inspiratória e uma maior frequência respiratória (número de
contrações musculares respiratórias). A carga excessiva pode ser também definida em termos
de aumento no dispêndio de energia ao invés dos termos overload e overactivity, e assim, o
dispêndio energético dos músculos respiratórios é aumentado em determinadas doenças
(REID e MACGOWAN, 1998).
A fibrose pulmonar é uma doença respiratória que pode ser decorrente da
administração do sulfato de bleomicina, agente antineoplásico que pode causar essa doença
como efeito colateral durante o tratamento em humanos (SLEIJFER, 2001). Esse efeito tóxico
tem sido utilizado em modelos experimentais em animais (LAZO et al., 1990), porém, o
mecanismo envolvido na indução dessa doença não tem sido completamente entendido
(GOTO et al., 2004). É importante destacar que o tempo da administração de bleomicina pode
influenciar na doença respiratória induzida, ressaltando que o período curto foi o escolhido
para o nosso estudo. Segundo Borzone et al. (2001), estágios mais curtos de lesão pulmonar
75
induzida pela bleomicina estão associados com mudanças bioquímicas e funcionais que se
assemelham àquelas da fibrose pulmonar em humanos, porém, em estudos abordando estágios
mais crônicos, as mudanças na função pulmonar não são compatíveis com a doença restritiva,
mas são mais semelhantes com aquelas descritas em estudos de humanos com DPOC (doença
pulmonar obstrutiva crônica), na qual a inflamação mural e a fibrose em bronquíolos estão
associadas com mudanças que ocorrem no enfisema pulmonar.
Há tempo tem sido relatado que durante o tratamento com bleomicina, uma
série de processos fisiopatológicos relacionados a lesões pulmonares é ativada, destacando-se
a fibrose pulmonar, aumento de colágeno, redução na capacidade e volume pulmonar e
principalmente processos inflamatórios e infiltração de células inflamatórias (SNIDER et al.,
1978; BOWDEN, 1984). Neste sentido, o nosso estudo mostra que houve redução na
quantidade de linfócitos nos linfonodos mesentéricos, indicando que concomitante à
progressão da lesão pulmonar causada pela bleomicina, um maior número de linfócitos possa
ter sido disponibilizado e por sua vez, deslocado para a microvascularização pulmonar, que é
um importante setor de acúmulo de leucócitos marginados como sugeriu Hogg (1987). Esta
proposta tem apoio em estudos realizados na década de 90 que demonstraram que
polimorfonucleares imaturos liberados da medula óssea têm se mostrado preferencialmente
nos capilares pulmonares (VAN EEDEN et al., 1997; LAWRENCE et al., 1996).
Desta forma, é sugestiva a hipótese de que a lesão pulmonar gerada pelo agente
quimioterapêutico estimula a proliferação de células fagocitárias e polimorfonucleares com
objetivo de elevar a proteção e o potencial de reparo tecidual, que está expresso nos resultados
do nosso estudo, pela elevação na quantidade de macrófagos residentes na caixa torácica. No
entanto, concomitante ao aumento na população de macrófagos residentes há elevação na
produção e liberação de fatores quimiotáticos para os neutrófilos como, por exemplo, a
interleucina 8 ou o leucotrieno B4, os quais secretam proteases e espécies reativas de oxigênio
que potencializam o desenvolvimento da fibrose (SERRANO-MOLLAR et al., 2002; SIME e
O’REILLY, 2001).
De acordo com Hagiwara, Ishii e Kitamura (2000), a fisiopatologia da
pneumonite induzida pela bleomicina consiste em duas fases. Uma é a fase da inflamação
aguda caracterizada pela infiltração celular tal como infiltração de macrófagos, neutrófilos e
linfócitos no espaço intersticial e alveolar. Na segunda fase, as espécies reativas de oxigênio
(ROS) e as proteases geradas por células inflamatórias infiltradas são consideradas as
responsáveis pela lesão do tecido pulmonar e a fibrose excessiva ocorre como um processo de
reparação. Em 2006, Wallach-Dayan et al. mostraram em seu estudo que a bleomicina causou
76
um aumento nas ROS, resultando em estresse oxidativo e apoptose nas células epiteliais
pulmonares, fato recentemente reiterado no estudo de Yildirim et al. (2006), onde foi
demonstrado que o estresse oxidativo tem um importante papel na patogênese da fibrose
pulmonar idiopática.
Em nosso estudo, pode-se observar uma redução na densidade de área alveolar
(43,2%) mostrando que houve um processo fibrótico induzido pelo tratamento com
bleomicina e possivelmente interferindo com a mudança na troca de gases e com a capacidade
pulmonar. Em alguns estudos, os testes de função pulmonar foram alterados com a progressão
da fibrose, destacando uma deficiência ventilatória restritiva, caracterizada pela perda da
complacência e redução da capacidade pulmonar total e capacidade vital (CRYSTAL et al.,
1976; HOSPENTHAL, 2006).
Um fato importante a se destacar é que o grau de oxigenação interfere na
produção de ROS, uma vez que, a produção excessiva pode induzir danos a biomoléculas
entre elas ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos que, em grande extensão, podem levar à morte
celular (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; PINHO et al., 2004). No estudo de Goto et al.
(2004), a bleomicina (4,5 e 6,0mg/kg) promoveu pneumonite intersticial, espessamento das
paredes alveolares e das paredes das artérias pulmonares, hemorragia, além de redução da
pressão parcial de oxigênio e aumento da diferença da tensão de oxigênio alvéolo-arterial e
um aumento significativo do conteúdo de eritrócitos. Assim, a redução na oxigenação
verificada em animais com fibrose pulmonar induzida pela bleomicina, pode ter origem em
alteração no mecanismo de oxidação, não somente no tecido pulmonar, mas também no tecido
periférico como o músculo esquelético.
É importante destacar que, em nosso estudo, os animais tratados com
bleomicina apresentaram redução na concentração de hemoglobina e no hematócrito,
mostrando que a condição estudada no período de 7 dias já promoveu uma alteração no perfil
hematológico. Uma possível explicação para este efeito pode estar relacionado ao fato da
bleomicina apresentar um efeito sobre o íon Fe
2+
que é a molécula principal na constituição da
hemoglobina, possivelmente interferindo no processo de gênese dos eritrócitos, uma vez que,
já foi relatado que bleomicina tem um efeito sobre o íon Fe
2+
que se liga ao DNA, além de
que, essa combinação, bleomicina associada a Fe
2+
reduz o oxigênio do meio e forma radicais
livres, o que possivelmente, estejam mediando à formação de fibrose (DISCROLL et al.,
1995, SERRANO-MOLLAR et al., 2002).
No nosso estudo, pode-se constatar que, além do aumento de TBARS no
plasma, houve um aumento também nos músculos respiratórios, incluindo o músculo peitoral,
77
considerado como acessório da inspiração, e o músculo abdominal, um acessório na
expiração, sem interferir nos principais músculos inspiratórios como o diafragma e intercostal.
Isso pode estar relacionado com a interferência tanto na oxigenação quanto na capacidade
respiratória e a utilização dos músculos acessórios na presença de fibrose pulmonar, a qual
aumentou o trabalho respiratório.
Apesar de detectarmos aumento de TBARS nos músculos acessórios, e não no
diafragma, depois do período de 7 dias da administração da bleomicina, há vários estudos na
literatura mostrando a geração de radicais livres no diafragma durante o estado de hipóxia,
como é o caso do estudo de Mohanraj et al. (1998), no qual foi observado aumento na
formação de ROS ou redução na habilidade das células em se defender contra o estresse
oxidativo. Murrant, Andrade e Reid (1999) e Matsuo e Kaneko (2000) destacaram que os
radicais livres são produzidos continuamente pelas fibras musculares esqueléticas. O
mecanismo de liberação extracelular de ROS e derivados de óxido nítrico têm sido
demonstrados, mas pouco se conhece sobre a regulação oxidante intracelular.
Zuo e Clanton (2005) observaram em músculo diafragma que durante a
transição de baixa concentração intracelular de PO
2,
um burst de ROS intracelulares é
formado e pode ter implicações funcionais relacionados aos sistemas sensíveis ao O
2
do
músculo esquelético e as respostas ao estresse metabólico agudo. De acordo com Ottenheijm
et al. (2006), a hipóxia piora a função muscular esquelética, mas o mecanismo preciso ainda
está incompletamente entendido. No músculo diafragma de ratos com hipóxia, a geração de
peroxinitrito é elevada e associada com ROS, e tem sido mostrado piora na contratilidade das
fibras musculares, refletindo em uma disfunção das proteínas contráteis. Esses autores
hipotetizaram que a hipóxia induz à disfunção das proteínas contráteis e que as ROS estão
envolvidas. Destaca-se que esses estudos não avaliaram os outros músculos respiratórios,
diferentemente do nosso estudo que também abordou o músculo peitoral e o abdominal,
apresentando alterações significativas devido à indução da fibrose pulmonar, condição que
pôde ter oferecido um aumento da carga de trabalho muscular respiratório, recrutando a
musculatura acessória da respiração.
Além do aumento da concentração de TBARS, houve também alteração no
metabolismo energético muscular, representado por aumento significativo no conteúdo de
glicogênio nos músculos respiratórios, incluindo diafragma, peitoral e abdominal, destacando
os músculos acessórios como o peitoral e os músculos expiratórios como o abdominal, onde o
aumento nas reservas foi maior.
78
O fato de, em nossos resultados, os músculos acessórios da respiração terem
apresentado maior alteração tanto no conteúdo de TBARS quanto no de glicogênio, pode estar
relacionado com o tipo de atividade do músculo. Um exemplo de músculo periférico é o sóleo
(fibra tipo I) que possui uma atividade contínua no decorrer de cada dia levando-o a uma
forma de treinamento físico. Enquanto isso, o músculo extensor digital (fibra tipo II) é
geralmente inativo e aumenta a susceptibilidade à lesão (WARREN et al., 1994). Esse mesmo
raciocínio pode ser realizado para melhor entendimento dos resultados nos músculos
respiratórios estudados, uma vez que o diafragma mantém sua contração 24 horas por dia,
diferentemente dos músculos acessórios e abdominais.
Vandenberghe, Ritcher e Hespel (1999) afirmaram que o papel da
concentração de glicogênio na regulação da sua degradação em músculos durante contrações,
é difícil de ser interpretado, além da resposta específica da concentração inicial de glicogênio
dos tipos de fibras musculares, tão bem quanto o possível, papel da estimulação da insulina e
β-adrenérgica, que não tem sido explorada. Esses autores observaram que a concentração
inicial de glicogênio em músculo rápido glicolítico de ratos está associada com aumento do
nível glicogenolítico durante as contrações e em músculos rápidos oxidativos. Portanto, a
relação positiva entre a concentração de glicogênio e a quantidade da degradação durante
contrações é eliminado pela exposição de níveis fisiológicos de insulina, sendo ainda
restaurado sobre a estimulação adrenérgica simultânea. É importante destacar que, em nosso
estudo, o grupo tratado com bleomicina também apresentou aumento na concentração
plasmática de insulina, indicando uma resposta indireta moduladora das reservas glicogênicas
musculares que refletem no padrão observado nos músculos respiratórios.
Recentemente, Supinski e Callahan (2007) ressaltam que os radicais livres
podem também afetar, indiretamente, a geração da força por alterar a capacidade funcional
mitocondrial e, portanto, alterar a homeostase do composto fosfato de alta energia (ATP,
fosfato de creatina) durante períodos de intenso trabalho muscular. Assim, pode-se observar
também que há uma relação entre as reservas energéticas musculares e a concentração de
radicais livres. No estudo de Delpand e Duan (1996) foi observado que os músculos
respiratórios são compostos por grandes porcentagens de fibras do tipo IIB, que possuem
características glicolíticas, incluindo os músculos diafragma, intercostal, peitoral e abdominal.
Em nossos resultados, esses músculos também foram avaliados e apresentaram alteração do
perfil metabólico com aumento da concentração de glicogênio na situação de fibrose
pulmonar, que é caracterizada por aumento do trabalho respiratório.
79
Um ponto adicional referente à perspectiva metabólica pode estar
fundamentado na hipótese da geração de IL-6 pelos músculos em sobrecarga de função
gerado indiretamente pelo efeito da bleomicina, uma vez que encontramos elevação na
concentração plasmática de ácidos graxos livres e que a IL-6 manifesta ação lipolítica. Assim,
esta interleucina pode ser mediadora de ajustes metabólicos elevando a disponibilidade de
substratos metabolizáveis (PEDERSEN, STEENSBERG e SCHEJERLING, 2001). Nesta
linha de pensamento, Gleeson (2000) demonstrou que frente ao aumento na atividade contrátil
inúmeros mecanismos são ativados, em especial elevação na captação de glicose, gerado pelo
aumento na população de GLUT 4 translocado de reservatórios citosólicos para a membrana,
além da produção e liberação da IL-6 que estimula a glicogenólise hepática e a lipólise.
Nossos resultados estão de acordo com esses autores, sugerindo que o processo de integração
metabólica é acionado indiretamente pelo tratamento com a bleomicina. Também pudemos
constatar a lipólise, caracterizada pelo aumento na concentração de AGL.
Destaca-se também que apesar de alguns parâmetros do perfil bioquímico
plasmático como glicose, uréia, creatinina e fosfatase alcalina não se alterarem, constatamos
que a concentração das enzimas hepáticas AST e ALT apresentou aumento, sugerindo uma
possível lesão hepática, além do aumento do lactato. Com relação a este último parâmetro,
alguns estudos mostraram que a geração de lactato durante o exercício foi associado à
oxigenação insuficiente (STRYER, 1998) e outros mostraram que isto pode ocorrer em
oxigenação adequada (CONNETT, GAYESKI e HONIG, 1984). Estudos mais recentes como
o de Brooks et al. (1998) propuseram que a hipótese do lactate shuttle, na qual o lactato
distribui fontes energéticas de carboidratos, após uma refeição ou durante exercício físico
sustentado.
No estudo de Reid (2001) a hipótese foi que os feixes de fibras musculares
produzem intermediários de oxigênio reativo e que as espécies oxidantes reativas contribuem
para a fadiga muscular in vitro. Eles observaram que os feixes de fibras do músculo diafragma
produzem intermediários reativos de oxigênio e a contração muscular aumenta os níveis de
oxidantes intracelulares e de intermediários reativos de oxigênio, que promovem fadiga à
baixa freqüência nessa condição.
De acordo com Shulman e Rothman (2001), apesar do estudo bioquímico
intensivo, o caminho da produção de energia da glicose no músculo está incompletamente
entendida. Em exercícios físicos, o glicogênio é inicialmente utilizado como energia, porém,
depois da depleção parcial, sua utilização cessa, e a concentração permanece constante. Nesse
estudo foi observado que a oxidação do lactato fornece energia para a resíntese de glicogênio
80
que ocorre entre as contrações pela síntese de glicogênio. Esses autores afirmaram que a
produção ineficiente de ATP pela síntese e degradação contínua de glicogênio resulta em
produção de mais lactato do que o necessário para a oxidação e restauração dos níveis de
glicogênio. O “glycogen shunt” auxilia na rápida necessidade de força durante a contração
para a oxidação de glicose por um período longo e o excesso da produção de lactato é uma
consequência. Taylor et al. (1992) propuseram que a degradação de glicogênio contínua é
acompanhada pela resíntese durante o período de glicogênio constante, e a energia para a
resíntese de glicogênio que é degradado para períodos curtos requeridos é fornecida pela
oxidação do lactato gerado. Este fato pode explicar o aumento que constatamos do lactato nos
ratos com fibrose pulmonar, que apresentaram alteração no perfil metabólico, além do
estresse oxidativo nos músculos respiratórios pela presença do padrão pulmonar restritivo.
Após analisar especificamente o efeito da bleomicina na musculatura
esquelética, além do perfil hematológico e bioquímico, foi verificado o efeito do tratamento
sobre o pâncreas, uma vez que foi observado alteração na insulina plasmática, conforme
exposto anteriormente. Indiscutivelmente a insulina é um hormônio importantíssimo para a
regulação da homeostasia glicêmica, assim, qualquer alteração na fisiologia do pâncreas
endócrino, reflete diretamente no equilíbrio da razão síntese/degradação dos principais
reservatórios energéticos (CHEATHAM e KAHN, 1995).
Inúmeros métodos avaliativos foram desenvolvidos no intuito de discriminar a
responsividade das células β pancreáticas, destacando o teste de tolerância à glicose
(COBELLI et al., 1986). Há muito tempo, os mecanismos de ação dos antineoplásicos tem
sido alvo de estudo e eixo norteador dos trabalhos de pesquisa (DAMIENS e MEIJER, 2000).
Neste contexto, o agente antineoplásico bleomicina merece uma atenção especial, pois, em
baixas concentrações, a substância pode induzir estresse oxidativo, alterações no DNA,
particularmente relacionada à base nitrogenada timina, alterando expressivamente os ciclos
celulares, condição que estabiliza e/ou inibe o crescimento da célula neoplásica (VIG e
LEWIS, 1978; CHEN e STUBBE, 2004).
No teste de tolerância à glicose (GTT) pudemos observar que o tratamento com
bleomicina induziu supra-desnivelamento da área indicando comprometimento na
sensibilidade das células β pancreáticas. Na busca de explicar este fato, é importante refletir
sobre as mudanças no comportamento secretório da insulina. Neste contexto, o estudo foi
centrado inicialmente no fato da bleomicina expressar sua ação no DNA, indicando que se
trata de uma substância com alta lipossolubilidade, que tem acesso ao núcleo de diferentes
células e que possivelmente apresenta maior intensidade de ação em células com elevada
81
atividade metabólica, como é o caso das células tumorais. Porém, não se descarta uma
possível ação em células não cancerígenas, que também podem ter sua homeostasia afetada
pela bleomicina. Neste interim, é importante lembrar que, tem sido amplamente descrito que
dentre os mecanismos relacionados à ação da substância antineoplásica bleomicina uma
grande relevância tem sido atribuído à capacidade de promover a formação de radicais livres
(KAISEROVA et al., 2006).
É sabido que as células β pancreáticas possuem alta atividade metabólica, que
é regulada de forma multifatorial em especial frente à elevação na concentração de glicose
extracelular, frente a ativadores da adenilato ciclase e frente a ativadores da fosfolipase C
(acetilcolina e colecistoquinina) (WOLLHEIN e SHARP, 1981, PRENTKI e
MATSCHINSKY, 1987). Com relação à ação da bleomicina sobre o processo secretório da
insulina observou-se que ilhotas isoladas de ratos submetidos a tratamento com a bleomicina
apresentaram elevação na concentração de GLUT2, transportador que se expressa em alta
intensidade nas células β, indicando que frente à sobrecarga de glicose rapidamente atinge-se
o Km do GLUT2, possibilitando a captação de elevadas quantidades de glicose, fato que
predispõe ao aumento no fluxo glicolítico, mudança na relação ATP/ADP, mudança na
concentração citosólica de cálcio e consequente elevação na secreção de insulina, eventos
associados que também podem induzir elevação na geração de espécies reativas do oxigênio
(FRINDLAND e PHILISON, 2004). Desta forma, concomitante à elevação no conteúdo
citosólico de glicose nas células β, também ocorre elevação na formação de radicais livres e
mudanças na responsividade do processo secretório da insulina representado pela maior área
sob a curva, após a sobrecarga de glicose, de acordo com diferentes estudos que sugerem estas
mudanças (EVANS et al., 2002, SAKAI et al., 2003). Desta forma a bleomicina pode reduzir
a eficiência do processo secretório pelas células β e possivelmente desencadear um status pré-
diabético.
O estresse oxidativo gerado pelo tratamento com bleomicina também é um dos
fatores de lesão nas células β das ilhotas pancreáticas, as quais, ao apresentarem elevação na
atividade do sistema AMPK, passam a produzir uma grande quantidade de espécies reativas
de oxigênio que, ao ativarem a enzima calpase e o segmento gênico BCL
2
, predispõe a
apoptose celular comprometendo a responsividade das células secretoras de insulina,
reforçando ainda mais o supra-desnivelamento da curva do GTT, anteriormente relatado
(ROBERTSON et al., 2003; MANDRUP-POULSEN, 2003; ROBERTSON, 2004; CAI et al.,
2007) .
82
Dentre os mecanismos indutores da secreção de insulina devemos ressaltar a
importância das mitocôndrias enquanto agente integrador na geração de energia que
determina a eficácia do processo secretório, uma vez que, mutações e alterações na função
mitocondrial induzem a uma grande produção de espécies reativas do oxigênio e pode
participar da lesão na célula β como já identificado no diabetes (KRAUSS et al., 2003;
MAECHLER, CAROBBIO e RUBI, 2006).
Em detrimento da alteração na responsividade das células β indicado pelo
GTT, justificou-se avaliar a secreção de insulina em ilhotas isoladas de animais controle
comparando-as com ilhotas isoladas de ratos tratados com bleomicina. Constatamos redução
na resposta secretória mesmo na presença de concentrações secretagogas de glicose como
8,3mM e 22,2mM. Assim, os resultados aqui apresentados são extremamente importantes ao
demonstrar que o tratamento com bleomicina compromete o processo secretório de insulina,
induzido pela glicose, e pode ser reflexo de um possível estresse oxidativo resultante da
toxicidade da substância nas células β ou ainda pode estar potencializando a glicotoxicidade
gerada por uma elevada captação da hexose (TANAKA et al., 2002; MAECHLER e
ANDRADE, 2006).
Neste ínterim, foi realizada uma avaliação mais criteriosa sobre o processo
secretório da insulina, direcionando o estudo para a avaliação das concentrações das proteínas
quinases C (PKC) e A (PKA). Os dados mostram um desequilíbrio funcional representado por
elevação significativa na concentração de PKC acompanhado de redução na concentração da
PKA, as quais de forma integrada e sinérgica regulam as etapas relacionadas ao processo
secretório de insulina (DUNLOP e LARKINS, 1986). Vale ressaltar, que foi observada
elevação na população de GLUT2 nas células β pancreáticas isoladas de ratos tratados com a
bleomicina, oferecendo condições ideais para a elevação na taxa de captação da glicose neste
microambiente e concomitante à elevação na concentração de glicose no citosol. Neste
contexto, tem sido descrito que a elevação na concentração de glicose é um forte estímulo
ativador da PKC, sendo que, assim, o nosso estudo acompanha e corrobora com a sugestão de
Ha, Yu e Lee (2001).
Um ponto importante a se destacar é que possivelmente a ação da bleomicina
esteja relacionada a alterações na eficiência das vias metabólicas, visto que a PKA atua na
velocidade de movimentação das vesículas contendo os grânulos de insulina e a PKC age na
co-localização de enzimas envolvidas no processo secretório e dos grânulos de insulina,
auxiliando movimentação das vesículas para periferia celular (WEI et al., 2000). Assim,
83
transportando estas observações para as células-alvo, que são as células tumorais, sugere-se
que a bleomicina gera um descompasso no sinergismo entre as quinases e com isso gera um
desequilíbrio na eficiência de processos geradores de energia que são essenciais para a
manutenção da célula viva. É interessante ressaltar que Lee et al. (2004) demonstraram que
espécies reativas do oxigênio amplificam a expressão e a ação da PKC, considerando este
comportamento na funcionalidade da célula β pancreática. A ação da bleomicina enquanto
agente que eleva a formação dos radicais livres pode indiretamente comprometer o processo
secretório e implantar um status pré-diabético, resultado que foi recentemente confirmado no
estudo de Bai et al. (2007).
Por outro lado, ao analisar a insulinemia plasmática verifica-se que houve
elevação no grupo tratado com bleomicina, fato que nos leva a gerar a hipótese que a
bleomicina pode induzir apoptose nas células β pancreáticas e promover hiperinsulinemia,
uma vez que, ao morrer, a ilhota transfere seu conteúdo insulínico ao plasma, como já
relatado na fase inicial do desenvolvimento do diabetes mellitus. Neste sentido, é de se
esperar que haja a implantação de um status diabetogênico relacionado ao tratamento
Outra avaliação realizada foi o teste de tolerância à insulina (ITT) com objetivo
de avaliar o comportamento dos tecidos periféricos, sendo utilizada a proposta de Cobelli et
al. (1986). A análise do índice de decaimento da glicemia mostrou que houve uma
significativa elevação na taxa de captação de glicose pelos tecidos periféricos indicando
mudança na responsividade tecidual. Este dado sugere que na constância do estímulo pode se
desenvolver resistência à insulina, neste sentido, algumas considerações são importantes.
Inicialmente, duas hipóteses foram centradas, ou seja, frente à redução na secreção de insulina
induzida pela bleomicina, ocorre, inicialmente, elevação na população de receptores de
insulina (up-regulation) nos tecidos periféricos, hipersensibilizando o sistema glicorregulador
de forma compensatória e provocando aumento na velocidade de captação da hexose
justificando os resultados demonstrados no ITT. Por outro lado, não podemos descartar a
hipótese que os radicais livres gerados no tratamento com bleomicina geram lesão nos
sistemas geradores de energia e podem, em uma segunda fase, comprometer a sensibilidade
insulínica em tecidos periféricos, desta forma, recentes estudos demonstraram que no quadro
de resistência à insulina observa-se redução na atividade mitocondrial, deficiência na
fosforilação oxidativa, além de induzir modificação morfológica nas mitocôndrias (STUMP et
al., 2006; RABOL, BOUSHEL e DELA, 2006; PETERSEN e SHULMAN, 2006; BEFROY
et al., 2007).
84
Em suma, durante o tratamento com bleomicina, inúmeras alterações quimio-
metabólicas são desencadeadas, em tecidos que não são alvos primário do quimioterápico
podendo assim, comprometer a homeostasia dos sistemas que participam do ajuste glicêmico,
predispondo assim, ao desenvolvimento de um padrão pré-diabético cujo grau de incidência
ou reversibilidade ainda é desconhecido na comunidade científica.
Dentro das etapas experimentais inerentes ao nosso estudo optou-se por avaliar
alguns parâmetros bioquímicos relacionados ao grupo tratado com bleomicina + EDET. Com
relação ao comportamento das reservas glicogênicas do tecido muscular do grupo submetido à
estimulação elétrica, foi observado que este conteúdo apresentou-se ainda mais elevado se
comparado ao grupo somente tratado com bleomicina, com exceção no abdominal, onde não
foi observado diferença. Vale a pena destacar que enquanto a EDET promoveu elevação em
1,5 vezes nos músculos diafragma e peitoral, no músculo intercostal a elevação foi de 1,7
vezes. Este fato pode estar relacionado com a elevação na contração muscular imposta pela
EDET e, consequentemente, imposição de um padrão respiratório alterado, que ativa de forma
mais intensa os músculos acessórios. Neste sentido, é sabido que em conseqüência da
elevação na contração muscular ocorre elevação na concentração citosólica de cálcio bem
como da relação ATP/AMP, fatores associados que ativam o complexo AMPK contribuindo
para a translocação do GLUT4 (JESSEN e GOODYEAR, 2005).
No período pós-exercício há um processo remanescente relacionado à
sensibilidade à insulina onde as vias citosólicas que amplificam a sinalização insulínica
continuam ativas, refletindo na manutenção da atividade da cascata sinalizadora mantendo
uma elevada taxa de captação de glicose e re-estruturação das reservas glicogênicas,
fenômeno restrito aos músculos exercitados (ROSE e RICHTER, 2005; HUANG e CZECH,
2007).
O fato de a EDET ter promovido elevação nas reservas de glicogênio nos
músculos inspiratórios, pode ser indicativo da maior captação de glicose associado à elevação
na população de GLUT4 externalizada e da ativação dos sistemas enzimáticos citosólicos
ligados à glicogênese (GOODYEAR
et al., 1992; BRYANT, GOVERS e JAMES, 2002).
Nesse sentido, já foram descritas a existência de importantes relações metabólicas deflagradas
quando o tecido muscular é submetido à estimulação elétrica neuromuscular com reflexos na
melhora das condições energéticas (SILVA et al., 1999).
Ao avaliar especificamente o músculo diafragma, foi observado redução na
concentração de receptores de insulina no grupo tratado com bleomicina e aumento no grupo
tratado com bleomicina associado à EDET quando comparado ao controle. Por sua vez, ao
85
avaliarmos a concentração plasmática de insulina foi observado que houve um aumento nos
dois grupos quando comparado ao controle. No primeiro grupo, ou seja, tratado com
bleomicina, tal fato pode estar relacionado com o aumento da insulinemia e conseqüente
ajuste na população dos receptores via down-regulation, uma vez que a concentração
plasmática da insulina estava em valores supra-fisiológicos. Com relação ao segundo grupo,
observou-se que mesmo estando a concentração de insulina plasmática supra-fisiológicas, os
receptores de insulina estiveram em concentrações maiores, o que pode ser justificado pelo
estímulo das contrações musculares promovidas pela EDET, a qual pode ter aumentado a
expressão dos receptores pelo tecido estimulado. Neste sentido, tem sido sugerido que,
concomitante à elevação na atividade contrátil, induzida pela estimulação elétrica, as fibras
musculares apresentam aumento na sensibilidade à insulina bem como ativação dos processos
relacionados à elevação na captação de glicose e síntese de glicogênio (WOJTASZEWSKI et
al., 1999).
Com relação às analises de glicemia, peso das glândulas supra-renais, timo e
baço, além da verificação de alteração gástrica pela EDET, não houve alteração significativa
em nenhum dos dois grupos tratados.
O perfil hematológico do grupo tratado com bleomicina + EDET se
caracterizou por valores considerados normais tanto para a eritrometria quanto para a
concentração plasmática de hemoglobina, porém o hematócrito apresentou-se reduzido,
conforme também observado anteriormente no grupo tratado somente com a bleomicina.
Ressalta-se que a EDET promoveu uma melhora na concentração de hemoglobina, a qual
estava reduzida no grupo tratado com bleomicina.
Frente aos resultados, algumas considerações são importantes. Inicialmente,
observa-se que pelas características do quimioterápico, sua absorção atinge pico plasmático
em 60 minutos com duração de 4 horas com mínima taxa de ligação a proteínas (1%) e o
volume de distribuição de 22 L/m
2
. É metabolizada no fígado, rim, intestino, pele, pulmão e
apresenta eliminação bifásica, tendo a fase inicial meia-vida de eliminação de 1,3 a 2 horas e
a fase terminal, de 9 a 30 horas, indicando longa permanência na circulação. Merece destacar
que o foco principal de ação do fármaco é inibir a incorporação de timidina no DNA, inibindo
a síntese deste e ao ligar-se ao DNA, causa quebras de suas hélices atacando a célula tumoral.
Por outro lado, como efeito colateral tem-se elevação na síntese de colágeno e indução de
fibrose pulmonar, restringindo a troca de gases (KELLEY, NEWMAN e EVANS, 1980).
Desta forma, temos que considerar que a restrição na troca gasosa traz reflexos no coeficiente
de saturação da hemoglobina e na pressão parcial de oxigênio. Assim, pode-se sugerir que
86
frente às alterações nos índices de ventilação, uma das respostas fisiológicas deflagrada é a
elevação na secreção de eritropoetina, a qual intensifica a formação de hemoglobina. Este
processo a médio prazo induz elevação na eritrometria e no hematócrito, no entanto, é
possível inferir que a curto prazo a elevação na formação de hemoglobina pode preceder
outras alterações.
Um segundo fator que pode estar associado à elevação na concentração da
hemoglobina pode estar relacionado com a formação de óxido nítrico, que é sintetizado no
tecido pulmonar e nas vias aéreas, sendo mediador neurogênico da broncodilatação
(CERQUEIRA e YOSCHIDA, 2002). As enzimas óxido nítrico sintetase (NOS) exercem um
importante papel no perfil fisiológico da árvore brônquica. A NOS tipo I está presente nos
nervos das vias aéreas, sendo a principal mediadora neuronal para o relaxamento do músculo
liso das vias aéreas; a NOS tipo III tem um papel importante no relaxamento da musculatura
lisa brônquica e, portanto, na broncodilatação; a NOS tipo II é cálcio-independente, sendo
encontrada em macrófagos, mas pode ser induzida em muitas células do trato respiratório, nas
células epiteliais alveolares tipo II, nos fibroblastos pulmonares, nas células do músculo liso
brônquico ou vasculares, nas células epiteliais das vias aéreas, em mastócitos, nas células
endoteliais tendo sua produção aumentada em resposta a mediadores inflamatórios, gerando
um aumento na produção de NO (ZIMMERMANN e ROTHENBERG, 2006; FISCHER et
al., 2002). Assim, pode-se sugerir que frente à restrição na troca gasosa a via do óxido nítrico,
que é uma resposta rápida, possa ser ativada interferindo nas dinâmicas vasculares buscando
maior eficiência na hematose.
Com relação à concentração plasmática de lactato, observou-se que no grupo
tratado com bleomicina e submetido à EDET, foi observado que houve melhora na
lactacidemia, havendo uma redução (57,8%) quando comparado ao grupo bleomicina. Este
perfil pode ser explicado pelo aumento do trabalho muscular e consequentemente pela
glicogenólise, pois segundo Taylor et al. (1992) a degradação de glicogênio contínua é
acompanhada pela resíntese durante o período de glicogênio constante e a energia para a
resíntese de glicogênio que é degradado para períodos curtos requeridos, é fornecida pela
oxidação do lactato gerado.
Outras considerações podem ainda ser geradas, uma vez que, estudos
realizados em humanos mostram que concentrações elevadas da enzima lactato
desidrogenase, indicadora de perda de estabilidade da membrana e, por isso, de rompimento
de células, sendo que estes dados são também apoiados por estudos em animais (AIR
QUALITY GUIDELINES, 2000). A questão básica que deve ser colocada é: se, por um lado,
87
o grau de lesão pulmonar pode ser determinado por medidas relativamente simples, tais como
a fração inspirada de oxigênio necessária para manter uma oxigenação arterial adequada e a
complacência pulmonar, por outro, a concentração plasmática de lactato pode ser utilizado
como marcador da perfusão (BARBAS, 1995). O lactato com certeza não é a medida mais
sensível para se avaliar o grau de sofrimento tecidual, porém caso esteja acima do normal
pode indicar lesão tecidual grave. Neste sentido, a EDET pode ser considerada como um
método auxiliar e efetivo, contribuindo na implantação de um status energético diferenciado.
Vale ressaltar que mesmo havendo alterações nos músculos respiratórios e em
alguns parâmetros bioquímicos, não houve alteração nas citocinas plasmáticas nos grupos
estudados. Tal fato pode estar relacionado ao tempo curto de exposição aos tratamentos,
apesar de que na literatura alguns estudos mostram alterações em diversos tempos.
Com relação às citocinas, estas são hormônios protéicos mediadores e
reguladores de respostas imunes e inflamatórias, produzidas pelas próprias células de defesa,
durante as fases de ativação da imunidade inata e específica. As citocinas pró-inflamatórias
favorecem a produção de reações inflamatórias, sendo estas: IL-1, IL-6, IL-8, Fator de
Necrose Tumoral-α (TNFα) e aquelas produzidas por células Th1 (IL-2 e interferon-γ). As
citocinas com ação antiinflamatória favorecem a produção de imunoglobulina E, e ativação
e/ou produção de eosinófilos, e neste grupo se encontra o receptor antagonista de IL-1 (IL-
1ra), o Fator de Crescimento de Transformação-β (TGF-β) e as citocinas produzidas por
células Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10). Um desequilíbrio entre as citocinas pró e antiinflamatórias
pode induzir respostas inflamatórias ou de hipersensibilidade (alergias) (KELLY, 2001;
PLAYFAIR e LYDYARD, 1999).
Segundo Moldoveanu, Shephard e Shek (2001), as citocinas são glicoproteínas,
produzidas por diferentes tipos de células do sistema imunitário que tem como função
principal mediar a comunicação entre as células do sistema imunitário e as de outros tecidos.
As citocinas inflamatórias são moduladas por vários estímulos, incluindo o exercício físico,
trauma e infecção. Este tipo de atividade afeta a produção sistêmica de citocinas,
principalmente o TNF-α, além das interleucinas-1 β (IL-1β), IL-6, interferons e outras
citocinas (RIVIER et al., 1994; GARCIA et al., 1999; MOLDOVEANU, SHEPHARD e
SHEK, 2000; OSTROWSKI, SCHJERLING e PEDERSEN, 2000; JANKORD e JEMIOLO,
2004; NEMET et al., 2004).
A citocina IL-6, também avaliada no nosso estudo, é uma citocina pró-
inflamatória chave na fase aguda da resposta inflamatória. Em alguns estudos, foi observado
88
que há uma relação direta entre o aumento da concentração plasmática de IL-6, exercícios
extenuantes e aumento de sepsis e infecções respiratórias (OSTROWSKI, SCHJERLING e
PEDERSEN, 2000; TOTH et al., 2006). Com relação ao músculo esquelético, a elevação de
citocinas proinflamatórias como a IL-6 está inserida no contexto de impactos deletérios,
geralmente associada como conseqüência de lesão no tecido muscular induzida por atividades
de alta intensidade ou ações excêntricas (KELLER et al., 2001). No entanto, a produção da
IL-6 durante o exercício pode estar presente mesmo na ausência de lesão muscular induzida
pelo exercício (STARKIE, ROLLAND e FEBBRAIO, 2001). Tal fato pode sugerir que o
tratamento da EDET proposto nesse presente estudo não foi deletério ao tecido muscular no
sentido de estimular a produção de citocinas, sendo caracterizada por contrações de curta
duração, porém uma análise futura diretamente no tecido muscular, especificamente no
diafragma, seria importante para conhecer o efeito local.
Já o tratamento com bleomicina, na qual a indução da fibrose pulmonar foi
avaliada num período curto de 7 dias, mesmo alterando o perfil energético e aumentando as
concentrações de TBARS, indicador de estresse oxidativo, esse período não foi o suficiente
para mostrar alterações de citocinas plasmáticas.
Outro fator importante a ser destacado é que quando os conteúdos de
glicogênio estão comprometidos, pode ocorrer crise energética no músculo em contração,
afetando tanto o metabolismo dos carboidratos como o lipídico, se o período de recuperação
entre as sessões de exercício for pequeno e a intensidade do trabalho elevada (STICH et al.,
2000). Por exemplo, existem observações de que a IL-6 direta ou indiretamente media efeitos
catabólicos sobre o músculo esquelético (GRIMBLE, 2003). No caso da EDET, além do
período de recuperação entre as sessões ser grande, o seu objetivo no perfil metabólico foi
anabólico, fato este apresentado no grupo que recebeu a EDET apresentando aumento do
conteúdo de glicogênio muscular. Já no caso do tratamento com bleomicina, as concentrações
de IL-6 elevadas era o esperado, pelo aumento do trabalho respiratório, porém o tempo de
exposição ao tratamento pode ter sido curto e não ter influenciado nessa variável plasmática.
Isso pode direcionar outros estudos para uma análise mais focalizada no músculo respiratório
e não somente no plasma.
No estudo de Pedersen et al. (2003) foi sugerido que as elevações na IL-6 em
resposta ao exercício podem exercer um papel antiinflamatório, principalmente pela inibição
na produção de TNF-α, uma citocina tipicamente proinflamatória. Com relação a esta citocina
(TNF-α), esta induz efetivamente respostas inflamatórias locais e auxilia no controle de
infecções. No entanto, a produção sistêmica de TNF-α pode levar a sepsi, choque, e morte
89
(GOEBEL et al., 2000). Sessões de exercício que induzem lesão de células musculares e altas
sobrecargas metabólicas causam uma liberação seqüencial de TNF-α e outras citocinas
tipicamente proinflamatórias (IL-1β e IL-6), o TNF-α por sua vez estimula a produção de IL-
6, que induz a fase de resposta aguda e a produção de IL-1ra (HENSON et al., 2000). As
citocinas inflamatórias auxiliam na rápida regulação da migração de neutrófilos e,
posteriormente monócitos para áreas de células musculares lesadas a outros tecidos
metabolicamente ativos para iniciar reparo (NIEMAN et al., 2001).
Em adultos, foram demonstrados aumentos significativos no TNF-α circulante
em resposta ao exercício extenuante (OSTROWSKI et al., 1999), porém, outro estudo não
registrou nenhuma mudança na mesma citocina (SUZUKI et al., 2000). Tais fatos mostram
que, mesmo com exercícios similares, a literatura ainda apresenta resultados diversos.
A TNF-α está também associada também com a resistência à insulina e a
Diabetes tipo 2 (KERN et al., 2001) e possivelmente, o músculo esquelético pode estar
associado aos aumentos do TNF-α (STEENSBERG et al., 2002). Apesar de altas
concentrações do RNAm de TNF-α terem sido demonstradas no tecido muscular em pacientes
com resistência à insulina, está menos claro se existe uma relação causal entre insulina e
TNF-α (KROGH-MADSEN et al., 2004). Vale destacar que o grupo tratado com bleomicina
apresentou alterações pancreáticas, além da hiperinsulinemia, porém mesmo com essas
alterações, não houve alteração na concentração plasmática da citocina TNF-α.
É importante destacar que o exercício extenuante induz aumentos na
concentração de citocinas no sangue e que as concentrações de TNF-α apresentam aumento
de duas a três vezes depois deste (OSTROWSKI et al., 1999). É relevante destacar que as
citocinas têm meia vida curta e os tempos nos quais as amostras são coletadas influenciam nos
resultados (PEDERSEN, ROHDE e OSTROWSKI, 1998), além de outros fatores que também
podem alterar os dados obtidos como a duração, a intensidade e o tipo de exercício físico
executado. Assim, tais fatos podem estar influenciando nos resultados encontrados na análise
das citocinas plasmáticas.
Nessa linha de pesquisa relacionada à contração muscular e a avaliação das
citocinas na musculatura esquelética, Jonsdottir et al. (2000) observaram o aumento da
concentração de RNAm de IL-6 nos músculos gastrocnêmio e sóleo de ratos após 30 minutos
de estimulação elétrica tanto para contração concêntrica quanto excêntrica (4 x 10 contrações
com 1 minuto de descanso entre as 4 séries, 100Hz). Já no estudo de Ono et al. (2007), foi
90
observado aumento de RNAm de IL-6 em músculo masseter de ratos estimulados
eletricamente (100Hz; tempos de 10, 30 e 60 minutos).
Assim, o presente trabalho mostra que não houve alteração nas citocinas
plasmáticas durante o período curto dos tratamentos, porém pode ter ocorrido alguma
alteração das citocinas na musculatura esquelética que não refletiu alterações plasmáticas,
instigando, assim, estudos futuros focalizando a musculatura esquelética, especialmente a
respiratória.
Outra análise realizada nesse trabalho foi a concentração das metaloproteases
de matriz (MMPs), especificamente no músculo diafragma, uma vez que essas poderiam ser
estimuladas nas condições tanto da fibrose pulmonar quanto do tratamento com EDET, uma
vez que estas podem alterar o padrão contrátil muscular, uma pela doença respiratória e outra
pela indução da contração muscular, e assim alterar a integridade da matriz extracelular caso
promovessem um estímulo excessivo. Porém, não foi observada diferença significativa, o que
pode ser explicado pelo curto período de ambos os tratamentos, além da análise ser no
músculo diafragma que conforme já discutido anteriormente, é um músculo com atividade 24
horas por dia.
A lâmina basal, a qual consiste os componentes da matriz extracelular como o
colágeno tipo IV, a laminina e as proteoglicanas, mantém a integridade fisiológica das fibras
musculares e tem um papel no reparo da fibra muscular após lesão ou exercício excessivo
(CARMELI et al., 2004). As metaloproteases contribuem para uma variedade de processos
fisiológicos como desenvolvimento embrinonário, morfogênese de órgãos, migração celular,
apoptose, angiogênese, remodelamento de cartilagem, crescimento ósseo e cicatrização de
lesão (BIRKEDAL-HANSEN et al., 1993; NAGASE e WOESSNER, 1999; McCAWLEY e
MATRISIAN, 2001). Elas são comumente induzidas por citocinas e secretadas por células
inflamatórias (CHOI e DALAKAS, 2000). A ativação de promotores de MMPs envolvem a
proteína kinase ativada por mitogen (MAPK) mostrando as vias que podem ser ativadas pelo
fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 1 (IL-1) (MENGSHOL, MIX e
BRINCKERHOFF, 2002).
Por outro lado, a perda da regulação das MMPs leva à degradação da matriz
extracelular, resultando em várias doenças como progressão do tumor ou metástase, doenças
cerebrovasculares, doenças cardiovasculares, artrite reumatóide e doenças pulmonares,
porém, os inibidores das MMPs podem ser agentes prospectivos úteis para a prevenção e
tratamento dessas doenças (SPINALE et al., 2000; VIHINEN e KAHARI, 2002; DEGRABA,
91
2004; GUEDERS et al., 2006; BURRAGE, MIX e BRINCKERHOFF, 2006; OVERALL e
KLEIFELD, 2006; ZHAO et al., 2006).
Embora relativamente pouco se conheça sobre o papel das MMPs no músculo
esquelético, elas têm sido envolvidas numa gama de processos de desenvolvimentos
funcionais e patológicos. As MMPs têm papeis regulatórios no crescimento e
desenvolvimento do músculo e também são importantes no processo de reparo após lesão
traumática ou miopatia por desuso (REZNICK et al., 2003). Segundo Edwards et al. (1996), a
família das metaloproteinases degradam todos os componentes da matriz extracelular,
possuindo características semelhantes, incluindo um modo comum de ativação, conservação e
seqüências de aminoácidos na suposta região do local ativo de ligação com metal e inibição
por TIMPs (inibidores de metaloproteases). O nível de atividade final in vivo da atividade de
degradação resulta das interações de muitos fatores que controlam a expressão e ativação de
enzimas ativadoras e inibidoras, assim como a inatividade e degradação das mesmas, sendo
que seu balanço determina a extensão da degradação da matriz.
As metaloproteases são uma grande família de enzimas, sendo que as
metaloproteases de matriz (MMPs) fazem parte de um grupo distinto de metaloproteases por
pelo menos 26 membros, incluindo: colagenases, gelatinases, estromelisinas de membranas,
matrilisinas e metaloelastases (CHANDLER et al., 1996; MANNELLO et al., 2003;
FREDERIKS e MOOK, 2004). Dos muitos tipos de MMPs, esse estudo focalizou a MMP-2
ou gelatinase A e a MMP-9 ou gelatinase B, que estão presentes no músculo esquelético.
A MMP-2, por regular a integridade e a composição da matriz extracelular no
músculo esquelético, tem papel essencial na proliferação da miofibra diferenciada e
cicatrização da fibra após lesão e na manutenção de tecido conjuntivo subjacente. Além das
miofibras, a matriz extracelular do tecido muscular esquelético contém fibroblastos,
fibrócitos, macrófagos, endotélio vascular, nervos, adipócitos e várias células do sistema
imunológico (MATRISIAN, 1992).
No presente estudo houve a presença somente da MMP-2 no músculo
diafragma sem a expressão da MMP-9. É importante ressaltar que a MMP-2 é secretada por
um amplo tipo de células de tecidos conjuntivos (AIMES e QUIGLEY, 1995), já a MMP-9 é
produzida principalmente por células inflamatórias principalmente por leucócitos,
macrófagos, eosinófilos e linfócitos (STAHLE-BACKDAHL et al., 1994; MONTGOMERY,
SABZEVARI e REISFELD, 1993). Nesse sentido, nenhum dos tratamentos promoveu
alteração na integridade da matriz extracelular do músculo analisado no período de 7 dias.
92
Festtoff et al. (1986) também observaram a presença de MMP-2 em músculo esquelético
normal sem expressão da MMP-9, corroborando assim com os resultados do presente estudo.
É importante ressaltar que as MMPs por muito tempo foram consideradas
moléculas pró-inflamatórias, porém atualmente são consideradas imunomoduladoras, atuando
de diferentes maneiras dependendo do contexto fisiológico no qual são inseridas, na tentativa
de retornar à homeostase (KHERIF et al., 1999). Portanto, as MMPs são importantes e
potenciais alvos terapêuticos (FREDERICKS e MOOK, 2004), bem como o uso de inibidores
de MMPs, que já mostraram eficácia em modelos de câncer e doenças inflamatórias agudas e
crônicas (CHANDLER et al., 1997).
93
7. CONCLUSÕES
94
7. CONCLUSÕES
A estimulação diafragmática elétrica transcutânea, no protocolo utilizado, foi
eficaz em melhorar o perfil metabólico da musculatura respiratória e interferir na tipagem de
fibra diafragmática, confirmando a hipótese inicial do estudo, sem alterar parâmetros
cardíacos, porém ressalta-se a interferência na atividade vagal relacionada ao pâncreas,
confirmando outra hipótese, uma vez que a estimulação elétrica, sendo aplicada na caixa
torácica, poderia estimular algum órgão do local. Já o tratamento com bleomicina promoveu
alterações não somente no tecido pulmonar, mas também nos músculos respiratórios e outros
sistemas, principalmente relacionado ao pâncreas, destacando que a EDET aplicada nessa
condição mostrou-se eficaz à musculatura respiratória, promovendo aumento no conteúdo de
glicogênio e de hemoglobina bem como na população dos receptores de insulina do
diafragma.
Considerações finais
Esse trabalho sugere um protocolo, aplicado a ratos, que pode subsidiar no
desenvolvimento de estudos em fisioterapia respiratória, uma vez que além da escassez de
estudos relacionados à estimulação diafragmática elétrica transcutânea na área da fisioterapia,
esses são realizados em seres humanos e, por não poderem ser invasivos, limitam as análises.
Nossos resultados reiteram a eficácia do método fisioterapêutico EDET, enquanto promotor
de melhora nas condições energéticas da musculatura respiratória, além da alteração na
tipagem de fibra muscular diafragmática, informações importantes que podem nortear sua
aplicabilidade.
É importante que o fisioterapeuta conheça o recurso terapêutico não somente por
meio das análises permitidas pelo profissional, ou seja, as não-invasivas, mas também aquelas
com abordagens experimentais, em animais, uma vez que essas permitem conhecer, com mais
profundidade, os resultados benéficos que podem auxiliar no tratamento clínico. Ressalta-se
ainda, que o tratamento fisioterapêutico aborda várias técnicas, e a EDET é uma dessas a qual,
apesar de ter sido empregada há certo tempo, ainda necessita de análises mais aprimoradas,
para poder ser melhor fundamentada. Toda técnica merece ser estudada isoladamente, porém
o tratamento objetiva a melhora na qualidade de vida do paciente e para isso é necessário um
95
conjunto de técnicas destinadas à necessidade específica de cada paciente no status quo em
que ele se encontra.
Com relação ao tratamento com o quimioterápico sulfato de bleomicina, foi
observado um perfil do tecido muscular diferenciado em decorrência do tratamento, e assim,
este merece uma atenção especial, especialmente quando se propõe realizar uma reabilitação
muscular.
Limitações do estudo
É importante destacar algumas limitações do nosso estudo, pois poderíamos
entender melhor os efeitos musculares do tratamento com bleomicina e o benefício da EDET
nessa condição, porém as causas foram relacionadas ao limite tempo, devido aos prazos da
pós-graduação. Caso houvesse mais tempo, e esse estudo fosse estendido por mais um ano,
outros elementos poderiam ser explorados, tais como: 1) citocinas musculares, pois há
escassez de trabalhos relacionados à estimulação elétrica neuromuscular, músculo esquelético
e citocinas, e assim, a melhor compreensão do comportamento destas poderia fornecer dados
importantes para auxiliar na escolha de modalidades utilizadas na fisioterapia,
especificamente, na área respiratória; 2) análise dos músculos periféricos; 3) tipo de fibras
musculares na condição de fibrose pulmonar, apesar de estudos da literatura mostrarem
redução nas fibras responsáveis pela força muscular, e nessa condição a EDET seria viável; 4)
análise das cadeias pesadas de miosina; 5) histologia pulmonar no grupo tratado com
bleomicina e EDET para observar se haveria um efeito protetor, reduzindo a fibrose
pulmonar, uma vez que há trabalhos mostrando que a estimulação no nervo vago tem uma
ação antiinflamatória; 6) o período de tratamento com a bleomicina, que apesar de
caracterizar a fase da indução do padrão pulmonar restritivo, pode-se analisar outros
diferentes períodos precedendo a fase crônica; 7) outros parâmetros de análise relacionados ao
estado de estresse oxidativo muscular; 8) desenvolvimento de outros protocolos de EDET,
principalmente relacionados a diferentes frequências da corrente e períodos de estimulação; 9)
variáveis hemodinâmicas.
Com isso, sugere-se que novos estudos sejam realizados, no sentido de se
aprofundar as explorações sobre os importantes efeitos terapêuticos da EDET como uma
técnica da Fisioterapia Respiratória.
96
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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115
9. ANEXOS
116
9.1. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL
117
9.2. ARTIGOS PUBLICADOS
118
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