ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓCICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
‘‘ESTABELECIMENTO DE UMA CANA-DE-AÇÚCAR TRANSGÊNICA
SUPEREXPRESSANDO O GENE DA CANACISTATINA (CaneCPI-1), UMA
PROTEÍNA INIBIDORA DE CISTEÍNO-PROTEASE’’
CAROLINA WERNER RIBEIRO
SÃO CARLOS
-2007-
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓCICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
‘‘ESTABELECIMENTO DE UMA CANA-DE-AÇÚCAR TRANSGÊNICA
SUPEREXPRESSANDO O GENE DA CANACISTATINA (CaneCPI-1), UMA
PROTEÍNA INIBIDORA DE CISTEÍNO-PROTEASE’’
CAROLINA WERNER RIBEIRO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Genética e
Evolução do Centro de Ciências Biológicas e da
Saúde da Universidade Federal de São Carlos,
como parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Ciências (Ciências
Biológicas), área de concentração: Genética e
Evolução.
SÃO CARLOS
-2007-
ads:
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
R484ec
Ribeiro, Carolina Werner.
Estabelecimento de uma cana-de-açúcar transgênica
superexpressando o gene da canacistatina (CaneCPI-1),
uma proteína inibidora de cisteíno-protease / Carolina
Werner Ribeiro . -- São Carlos : UFSCar, 2007.
98 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2007.
1. Genética molecular. 2. Alimentos transgênicos. 3.
Cana-de-açúcar. 4. Canacistatina. 5. Cistatina. I. Título.
CDD: 574.87328 (20
a
)
Orientador
Prof. Dr. Flávio Henrique Silva
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.....................................................................................................I
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................III
RESUMO.........................................................................................................................V
ABSTRACT...................................................................................................................VI
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
1.1. CANA-DE-AÇÚCAR...............................................................................................1
1.2. PRAGAS E DOENÇAS EM CANA-DE-AÇÚCAR..............................................4
1.3. PROTEASES............................................................................................................7
1.3.1. Cisteíno-proteases..................................................................................................8
1.4. PROTEÍNAS INIBIDORAS DE PROTEASES....................................................9
1.4.1. Cistatinas..............................................................................................................11
1.4.2. Cistatinas da cana-de-açúcar..............................................................................14
1.4.3. Inibidores de proteases no controle de insetos..................................................15
1.4.4. Plantas transgênicas como sistema de expressão..............................................18
1.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA......................................................................19
1.5.1. Técnica de transformação por biobalística.......................................................21
1.5.2. Transformação genética da cana-de-açúcar.....................................................23
1.5.3. Escolha do transgene...........................................................................................24
2. OBJETIVOS..............................................................................................................25
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................26
3.1. MATERIAL............................................................................................................26
3.2. CONSTRUÇÃO DO VETOR PARA EXPRESSÃO NA PLANTA..................27
3.2.1. Amplificação da fase aberta de leitura da CaneCPI-1.....................................29
3.2.2. Subclonagem da CaneCPI-1 no vetor pAHC17................................................30
3.3. OBTENÇÃO DE CALOS DE CANA-DE-AÇÚCAR.........................................31
3.4. PREPARAÇÃO DAS PARTÍCULAS DE TUNGSTÊNIO PARA O
BOMBARDEAMENTO................................................................................................32
3.5. SELEÇÃO DAS PLANTAS TRANSFORMADAS.............................................34
3.6. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA CANECPI-1 EM PLANTAS
TRANSGÊNICAS.........................................................................................................35
3.7. ANÁLISE DE WESTERN BLOTTING DA CaneCPI-1 EM PLANTAS
TRANSGÊNICAS.........................................................................................................37
3.7.1 Produção de anticorpos policlonais contra a proteína Poliubiquitina.............38
3.8. PURIFICAÇÃO DA CANECPI-1 A PARTIR DA CANA-DE-AÇÚCAR
TRANSFORMADA.......................................................................................................43
3.8.1. Extração e purificação da
HIS
CaneCPI-1...........................................................44
3.8.2. Análise de Western blotting da
HIS
CaneCPI-1..................................................45
3.8.3. Ensaio de atividade da proteína
HIS
CaneCPI-1.................................................46
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................47
4.1. CONSTRUÇÃO DOS VETORES DE EXPRESSÃO.........................................47
4.2. OBTENÇÃO DOS CALOS DE CANA-DE-AÇÚCAR.......................................52
4.3. BOMBARDEAMENTO DOS CALOS EMBRIOGÊNICOS DE CANA-DE-
AÇÚCAR........................................................................................................................54
4.4. SELEÇÃO DAS PLANTAS TRANSFORMADAS.............................................59
4.5. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA CaneCPI-1 NAS PLANTAS
TRANSGÊNICAS.........................................................................................................62
4.6. ANÁLISE DE WESTERN BLOTTING DA CaneCPI-1 NAS PLANTAS
TRANSGÊNICAS.........................................................................................................67
4.6.1. Produção de anticorpos policlonais contra a proteína Poliubiquitina............71
4.7. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA CaneCPI-1 DA CANA-DE-AÇÚCAR
TRANSFORMADA.......................................................................................................80
4.7.1. Extração e purificação da
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da
planta..............................................................................................................................80
4.7.2. Análise de Western blotting
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da
planta..............................................................................................................................82
4.7.3. Ensaio de atividade com a proteína
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da
planta..............................................................................................................................84
5. CONCLUSÕES..........................................................................................................87
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................88
I
AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr. Flávio Henrique Silva, pela orientação, apoio e incentivo.
À Dra. Andrea Soares da Costa Fuentes, pela co-orientação e ajuda na realização
deste trabalho, pelo incentivo, apoio, pelas viagens divertidas, pelo carinho, longas
conversas e amizade.
À todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para execução deste trabalho, em
especial:
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução da Universidade
Federal de São Carlos, pela oportunidade de realização deste trabalho.
Às instituições CEPID/CBME/FAPESP.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo
auxílio financeiro.
À Dra. Adriana K. Carmona e Simone S. Cotrin, pela colaboração no trabalho e
gentileza.
Ao Dr. Eugênio C. Ulian, pela oportunidade de colaboração com o Centro de
Tecnologia Canavieiro (CTC- Piracicaba/SP) e auxílio no planejamento do trabalho.
Às pesquisadoras do CTC Maria Cristina Falco e Sabrina M. Chabregas, pela
colaboração e auxílio na execução deste trabalho, sempre dispostas a ajudar.
À todos os funcionário e técnicos do CTC, em especial a Sueli A. Piacentini e
Luis C. de Almeida, pelos experimentos realizados com larvas.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação, em especial à Regiane pelos
auxílios prestados.
II
À todos os amigos do Laboratório de Biologia Molecular, pela ajuda,
solidariedade e amizade e aos amigos de outros laboratórios.
Aos amigos de longe, pelo incentivo, palavras de apoio, força e amizade.
Às amigas do coração: Andreia, Márcia, Mylene e Viviane, pela enorme ajuda,
apoio, conversas, risadas, carinho e pela amizade, em especial à Andréia pela ajuda
desde o meu primeiro dia no laboratório.
Aos meus pais, por tudo que representam de bom em minha vida, por sempre
estarem ao meu lado, pelo apoio, incentivo e dedicação. Muito obrigada!
À Deus, pela minha vida e por me dar forças para alcançar meus objetivos.
III
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fotografia mostrando os estágios de desenvolvimento do inseto S. levis....... 5
Figura 2: Infestação da cana-de-açúcar por Sphenophorus Levis....................................6
Figura 3: Visão esquemática de uma cistatina e uma cisteíno-protease.........................13
Figura 4: Seqüência de nucleotídeos do gene da CaneCPI-1.........................................15
Figura 5: Transformação por biobalística......................................................................22
Figura 6: Mapa do pAHC17...........................................................................................28
Figura 7: Esquema representativo dos vetores de expressão.........................................29
Figura 8: Aparelho de biobalística.................................................................................33
Figura 9: Amplificação do gene da CaneCPI-1 a partir do plasmídeo pET28canecys..48
Figura 10: Clivagem do plasmídeo pAHC17 com a enzima de restrição BamHI..........49
Figura 11: Análise por restrição dos vetores pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C....50
Figura 12: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos do gene CaneCPI-1 e das
construções pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C.........................................................51
Figura 13: Palmito de cana-de-açúcar............................................................................52
Figura 14: Calos embriogênicos de cana-de-açúcar.......................................................53
Figura 15: Calos de cana-de-açúcar bombardeados.......................................................55
Figura 16: Calos de cana-de-açúcar regenerados em placa............................................56
Figura 17: Plantas de cana-de-açúcar regeneradas em tubete........................................57
Figura 18: Plantas enraizadas.........................................................................................58
Figura 19: Análise da presença da CaneCPI-1 nas plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1A.............................................................................................................60
Figura 20: Análise da presença da CaneCPI-1 nas plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1C.............................................................................................................61
Figura 21: Canas-de-açúcar transformadas com o gene CaneCPI-1..............................62
IV
Figura 22: Análise por PCR Semi-quantitativo das plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1A ...........................................................................................................64
Figura 23: Análise por PCR Semi-quantitativo das plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1C.............................................................................................................65
Figura 24: Imunodetecção da CaneCPI-1 em folhas de plantas transformadas com o
vetor pAHCaneCPI-1A....................................................................................................68
Figura 25: Imunodetecção da CaneCPI-1 em folhas de plantas transformadas com o
vetor pAHCaneCPI-1C....................................................................................................69
Figura 26: Imunodetecção da CaneCPI-1 em raízes de plantas transformadas com o
vetor pAHCaneCPI-1C....................................................................................................70
Figura 27: Amplificação do gene da poliubiquitina à partir do plasmídeo
pSPORTST2001..............................................................................................................71
Figura 28: Clivagem do plasmídeo pTZST2001............................................................72
Figura 29: Análise de expressão e solubilidade da proteína Poliubiquitina...................73
Figura 30: Análise de expressão, solubilidade e purificação da proteína Poliubiquitina
em condições desnaturantes.............................................................................................75
Figura 31: Imunodetecção teste da Poliubiquitina expressa em E. coli.........................77
Figura 32: Imunodetecção da Poliubiquitina em folhas de plantas transformadas com o
vetor pAHCaneCPI-1A....................................................................................................79
Figura 33: Imunodetecção da Poliubiquitina em plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1C.............................................................................................................79
Figura 34: Análise da purificação da
HIS
CaneCPI-1.......................................................81
Figura 35: Imunodetecção da
HIS
CaneCPI-1..................................................................83
Figura 36: Gráfico de inibição da
HIS
CaneCPI-1 sobre catepsina L ………..................85
V
RESUMO
A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no
Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de cana-
de-açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos,
causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão
focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso
laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de
cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem
Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato
digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar
e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar
transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da
ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a
posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a
transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi
feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas
que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e
ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI-
1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de
afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da
HIS
CaneCPI-1 em um único passo. O
rendimento foi de 6mg de proteína pura por kilograma de folhas de cana-de-açúcar. A
HIS
CaneCPI-1 purificada demonstrou atividade inibitória contra a enzima catepsina L,
uma cisteíno-protease humana. Estes resultados mostram que a cana-de-açúcar pode ser
usada como um sistema de expressão seguro e viável para a produção de proteínas
recombinantes e é o primeiro passo para o estabelecimento de uma cana-de-açúcar
resistente à pragas.
VI
ABSTRACT
Sugarcane is a plant of great economical importance, mainly in Brazil, which is
currently the largest producer of this crop in the world. However, sugarcane farming has
suffered attacks from pests and pathogens, leading to considerable economical losses.
Therefore, a number of studies have focused on the development of more resistant
sugarcane varieties. Our laboratory has been working on a sugarcane protein (CaneCPI-
1), which is a cystein-protease inhibitor protein. Based on studies that indicate that
insects belonging to the order Coleoptera possess cystein-proteases in their mid-gut and
with the knowledge that some species of Coleoptera are sugarcane pests, a transgenic
sugarcane plant overexpressing the CaneCPI-1 gene was developed under the control of
maize ubiquitin promoter. CaneCPI-1 was fused to a His-tag to facilitate further
purification through affinity chromatography. The calli transformation was performed
through biobalistics. The transformed plants were then selected by polymerase chain
reaction. Positive plants were further selected by Semi-quantitative PCR and Western
blotting. A transformed plant expressing a His-tagged CaneCPI-1 was selected for
purification of the recombinant protein in a nickel column, enabling purification of
HISCaneCPI-1 from plant leaves in a single step. The yield was about 6mg of pure
protein per kilogram of sugarcane leaves. The
HIS
CaneCPI-1 purified from the
transformed sugarcane demonstrated inhibitory activity on the human cysteine protease
cathepsin L. These studies demonstrate that the sugarcane can be a safe and viable
expression system for recombinant protein production, and are the first step in the
establishment of a sugarcane plant that is more resistant to pathogens.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. CANA-DE-AÇÚCAR
A cana-de-açúcar é uma planta alógama que pertence à família Gramineae
(Poaceae). Faz parte do gênero Saccharum, originária do Sudeste Asiático, da grande
região central da Nova Guiné e Indonésia (DANIELS e ROACH, 1987). A maioria das
variedades comerciais é formada por meio do cruzamento das várias espécies existentes.
Possui número poliplóide de cromossomos, variando entre 130 e 170.
É uma planta que se propaga vegetativamente nas culturas agrícolas através de
toletes que sofrem indução para brotação das gemas. A cana-de-açúcar é ereta, perene,
rizomatosa e forma touceiras Pode crescer de 3 a 6 metros. O colmo é cilíndrico,
extremamente glabro e de coloração variável. As folhas são simples, alternadas e
estreito lanceoladas. Possui frutos secos, do tipo cariopse e com semente de endosperma
abundante. É uma cultura que produz, em curto período, um alto rendimento de matéria
verde, energia e fibras, sendo considerada uma das plantas com maior eficiência
fotossintética. Seu plantio em larga escala é tradicional em vários países das regiões
tropical e subtropical (COSTA-LIMA et al., 2001).
No Brasil, devido às condições climáticas favoráveis, a cana-de-açúcar é
cultivada desde o seu descobrimento, sendo que a cultura estabeleceu-se de forma
definitiva nas regiões Centro-Sul e Nordeste do país. A cana-de-açúcar tem grande
importância nas indústrias de açúcar e álcool e constitui a base de produção de matérias
primas como o bagaço, o melaço e outros de utilização crescente (STUPIELLO, 1987).
O Brasil se tornou o maior produtor mundial de açúcar derivado da cana e o
único país a produzir álcool em larga escala, em substituição ao petróleo, e com a
2
vantagem de ser um combustível renovável e menos poluente. Atualmente o cultivo de
cana-de-açúcar fundamenta a economia de determinadas regiões do país.
Com uma área plantada de 6,18 milhões de hectares e uma safra estimada em
475,7 milhões de toneladas em 2006/07, o mercado sucroalcooleiro movimenta mais de
12,7 bilhões de reais por ano com a venda de produtos como açúcar, aguardente, álcool
e alguns subprodutos como melaço e vinhaça. Atualmente existem no Brasil cerca de 50
mil produtores de cana-de-açúcar e 308 unidades de processamento industrial, com uma
produtividade de 76,8kg/ha e produzindo 17,6 milhões de m
3
de etanol por ano
(Disponível em: <www.unica.com.br>. Em jan. de 2007).
A agroindústria canavieira é responsável por milhões de empregos, o que
evidencia a importância social da cultura (SGRILLO, 1979), com a geração de divisas
através da exportação de açúcar e álcool e pelo aproveitamento racional da biomassa
vegetal, gerando energia elétrica e produtos para a indústria alcoolquímica e para a
alimentação de animais entre outros (RAIZER, 1998).
Com tecnologias comerciais, e usando somente o bagaço, é possível gerar
energia elétrica, sendo que a tecnologia existente permite gerar cem kilowatts de
eletricidade por tonelada de bagaço. A utilização de parte da palha poderia elevar este
potencial, aumentando ainda mais a importância econômica da cana-de-açúcar
(SACILOTO, 2003).
Por ser um mercado de expressão econômica, preocupações com a qualidade e a
produtividade são constantes no setor. Existem vários fatores que contribuem para a
qualidade e a produtividade da cana-de-açúcar como o preparo do solo, a adubação, a
escolha de variedades, o plantio e o ataque de pragas e doenças. Dentre estes fatores
estima-se que as perdas na produção causadas por ataques de pragas na cana-de-açúcar
chegam a um total de 470 milhões de dólares por ano. O ataque de patógenos e pragas
3
de plantas vêm contribuindo significativamente para as perdas na produção sofridas por
produtores de cana-de-açúcar em todo o mundo. As perdas na produção agrícola
mundial causadas por insetos chegam a 37% e sabe-se que mais de 200 doenças de
plantas são causadas por fitopatógenos (HAQ et al., 2004). Os principais métodos de
controle aplicados ao combate de fitopatógenos ainda são os que se baseiam na
utilização de fungicidas e pesticidas, causando altos custos econômicos e ambientais.
Estes métodos de combate químico são geralmente eficientes, porém contaminam o
meio ambiente deixando resíduos no solo, o custo é elevado para os produtores e
permitem o surgimento de pragas resistentes a estes pesticidas (GLEDDIE et al.,1989).
Por tais motivos, é desejável o desenvolvimento de alternativas de baixo custo que
diminuam o uso de produtos químicos e conseqüente contaminação do solo, e também
evitando o surgimento de patógenos resistentes.
Um grande sucesso na produção de cana-de-açúcar deve-se à utilização de
variedades advindas do melhoramento genético clássico desenvolvido por centros de
pesquisas e estações experimentais, como o antigo IAA – Instituto do Açúcar e do
Álcool e atualmente o CTC – Centro de Tecnologia Canavieira (SACILOTO, 2003). O
mapeamento genético dos cultivares de cana mais utilizados está sendo realizado
(GRIVET e ARRUDA, 2001), porém, a seleção de variedades mais produtivas,
resistentes a pragas e doenças, e adaptadas a ambientes diversos por intercruzamentos, é
um processo demorado que pode levar anos.
Hoje, o seqüênciamento do genoma de várias plantas tem facilitado e acelerado a
identificação de genes responsáveis por qualidades desejáveis, possibilitando o estudo e
a manipulação subseqüente de genes de interesse através de técnicas de genética
molecular. Assim, é possível o desenvolvimento de plantas com maior resistência ao
ataque de pragas inserindo nestas plantas genes que codificam proteínas com função de
4
defesa, isto é, proteínas que possam interferir em alguma função metabólica vital para o
organismo invasor. Após estes estudos será possível disponibilizar comercialmente
culturas de importância econômica resistentes a pragas e patógenos, proporcionando a
diminuição de problemas fitossanitários que comprometem a alta produção das culturas
ou a sanidade do meio ambiente pela utilização de agrotóxicos.
1.2. PRAGAS E DOENÇAS EM CANA-DE-AÇÚCAR
Como já mencionado, as perdas na produção de culturas de plantas devido ao
ataque de pragas e doenças têm sido estimadas em 37% em todo mundo (HAQ et al.,
2004), causando sérios problemas para a agricultura.
Em culturas de cana-de-açúcar foram descritas mais de 216 patogenias, das
quais 38 já foram encontradas nos canaviais brasileiros, sendo 10 de grande importância
para os produtores.
Até alguns anos atrás, as variedades de canas-de-açúcar existentes apresentavam
uma alta resistência ao ataque de pragas, porém, as variedades atuais não mostram o
mesmo grau de resistência em relação às variedades passadas. Em alguns casos é
provável que os genes de resistência ainda estejam presentes nestas variedades, mas
estes genes não estão sendo corretamente expressos (FALCO et al., 2001) ou então as
plantas e suas pragas têm co-evoluído ao longo dos anos, causando uma adaptação dos
insetos aos mecanismos de defesa das plantas (JONGSMA e BOLTER, 1997).
5
A cana-de-açúcar é susceptível ao ataque de vários insetos. Dentre eles, um que
tem se tornando uma praga destruidora de lavouras de cana-de-açúcar nos últimos anos
é o Sphenophorus levis (Ordem Coleoptera). Este inseto é conhecido como “Gorgulhão
rajado” ou “bicudo da cana” (figura1) e sua infestação nas lavouras vêm causando
grandes prejuízos.
Figura 1. Fotografia mostrando os três estágios de desenvolvimento do inseto Sphenophorus levis. As
setas indicam duas larvas, uma pupa e dois adultos.
O gênero Sphenophorus é comumente encontrado na América do Sul com 14
espécies descritas no Brasil. É um coleóptero da família curculionidae que foi
identificado em 1978 e se tornou uma importante praga da cana-de-açúcar (VANIN,
1990).
O Sphenophorus levis possui um tamanho aproximado de 15 mm, tem hábitos
noturnos, apresenta pouca agilidade e simula-se morto quando atacado. A postura dos
Larvas
Pupa
Adultos
6
ovos é realizada no solo, mais especificamente nos rizomas. As larvas recém-nascidas
são brancas e com cabeça e corpo volumoso. Elas penetram no rizoma em busca de
alimento e abrigo construindo galerias irregulares (figura 2) onde permanecem até o
estágio adulto, bloqueando a parte basal da planta e rizomas, causando como
conseqüência o amarelamento do canavial, morte das plantas e falhas nas soqueiras
(CERDA et al, 1999). Alguns inseticidas vêm sendo utilizados no controle desta praga,
mas sem sucesso. O comportamento do Sphenophorus em estágio larval não permite a
utilização de inseticidas sintéticos porque eles permanecem no interior da cana.
Assim, é necessária a busca de novas estratégias para controle desta praga,
podendo ser aplicadas como uma abordagem útil no manejo integrado do
Sphenophorus. Uma das alternativas para controle deste e de outros insetos seria a
utilização de plantas transgênicas expressando proteínas de defesa, capazes de inibir o
crescimento e desenvolvimento destas pragas nas lavouras.
Figura 2. Infestação da cana por Sphenophorus levis. Foto mostrando larvas de Sphenophorus levis
atacando o rizoma de uma cana-de-açúcar (Disponível em: <www.biologico.sp.gov.br>. Acesso em dez.
2006).
7
1.3. PROTEASES
As enzimas constituem um grupo especializado e diverso de proteínas que têm
muitas funções em diversos processos fisiológicos. Enzimas proteolíticas têm como
ação a regulação de processos complexos envolvidos na fisiologia normal da célula e o
controle da síntese e degradação de proteínas (LEUNG-TOUNG et al., 2002). As
proteases estão envolvidas em processos digestivos, ativação de proenzimas, processos
inflamatórios e outros (OLIVEIRA et al., 2003).
As proteases são divididas em cinco categorias de acordo com o resíduo de
aminoácido essencial ao seu sítio ativo e ao seu mecanismo de ação, similaridades de
seqüências de aminoácidos e estruturas tridimensionais das proteínas, similaridades de
inibidores e a extensão do pH ótimo de atividade (BARRET et al., 2004; RAO et al.,
1998). São elas: serino-proteases, cisteíno-proteases, aspartil-proteases, metalo-
proteases e as treonino-proteases. Exemplos destas proteases têm sido identificados em
plantas, insetos, microorganismos, e são todas semelhantes àquelas encontradas nos
mamíferos.
As serino-proteases compreendem duas famílias distintas. Em geral, a estrutura
tridimensional das duas famílias é diferente, porém a geometria do sítio catalítico e o
mecanismo de catálise são os mesmos. Possuem no sítio catalítico um grupo serino
(BEYNON e BOND, 1989). As cisteíno-proteases incluem as proteases de plantas tais
como papaína, várias catepsinas lisossomais de mamíferos, calpaínas e proteases de
parasitas. A catálise das cisteíno-proteases ocorre através da formação de um
intermediário covalente e envolve uma cisteína e um resíduo de histidina (TURK e
BODE, 1991).
8
A grande parte das aspartil-proteases pertence à família pepsina, incluindo
enzimas digestivas, catepsinas lisossomais e enzimas de processamento. Estas enzimas
são compostas por moléculas bilobadas com o sítio ativo localizado entre dois lobos
homólogos, em que cada lobo contribui com um resíduo de aspartato, o qual é
necessário para a atividade da enzima (BEYNON e BOND, 1989). As metalo-proteases
são enzimas encontradas em bactérias, fungos e em organismos superiores. Elas
apresentam grandes diferenças em suas seqüências e estruturas, porém a maioria destas
enzimas contém um átomo de zinco o qual é cataliticamente ativo. Em alguns casos o
zinco pode ser substituído por outro metal, como o cobalto ou níquel sem perda de
atividade. Estudos de cristalografia indicam que o zinco é ligado por duas histidinas e
um ácido glutâmico (BLUNDELL, 1994).
1.3.1. Cisteíno –proteases
Em vertebrados, as cisteíno-proteases estão envolvidas no sistema de degradação
de proteínas lisossomais, mas também possuem uma função extracelular como em
algumas desordens metabólicas. Em invertebrados, tais como nematóides e ácaros,
cisteíno-proteases estão entre as enzimas digestivas e em artrópodos, tais como lagostas,
elas exercem um papel digestivo, mas também estão relacionadas ao sistema nervoso
(RAWLINGS e BARRET, 1994). Em insetos, elas são utilizadas em processos
digestivos (RAWLINGS e BARRET, 1994), porém são encontradas em muitos outros
tecidos, indicando que podem ter outras funções. As cisteíno-proteases também são
muito utilizadas por vírus, fungos e bactérias para infecção de plantas.
9
Experimentos realizados com larvas de insetos mostraram que eles, e também
outros animais, usam uma mistura de enzimas digestivas para hidrolisar proteínas
ingeridas (APLLEBAUM, 1985).
Geralmente as cisteíno-proteases requerem um processamento de remoção do
fragmento amino-terminal para que seja ativada. A região amino-terminal, também
chamada de pró-região, exerce importantes funções não somente como inibidor de
atividade enzimática, mas também no correto enovelamento da proteína recém
sintetizada para protegê-la contra desnaturação em mudanças repentinas em condições
de pH (OLIVEIRA et al., 2003).
Em plantas estas enzimas são encontradas particularmente nos vacúolos e são
responsáveis pela mobilização de proteínas estocadas no endosperma durante a
germinação das sementes (OLIVEIRA et al., 2003). Também são encontradas no meio
extracelular tais como aquelas de papaia e figo (RAWLINGS e BARRET, 1994).
1.4. PROTEÍNAS INIBIDORAS DE PROTEASES
Ao longo da evolução, as plantas parecem ter desenvolvido mecanismos de
defesa contra proteases de fungos e insetos. Dentre estes mecanismos estão aqueles que
se utilizam de proteínas de defesa. Desta forma, estas proteínas têm potencial para
utilização no desenvolvimento de plantas transgênicas mais resistentes a patógenos. São
descritas em torno de treze classes de proteínas de defesa. Entre elas estão as proteínas
PR (“pathogenesis related”), as Ciclofilinas, as RIPs (“RNA N-glycosidases”), as LTPs
(“Lipids Transfer Proteins”), as “Killer proteins” e finalmente os inibidores de cisteíno-
10
proteases de plantas (fitocistatinas). Esta última classe, fitocistatinas, é capaz de inibir
proteases que ocorrem em muitas espécies de insetos herbívoros e fungos patogênicos,
interferindo no crescimento e desenvolvimento, pois têm a capacidade de ligar-se, e,
portanto, inibir a ação das proteases digestivas destas pragas e patógenos
(SELITRENNIKOFF, 2001). Os inibidores de proteases (IPs) são produzidos em órgãos
de estoque e sua síntese é induzida por ferimentos que constituem o complexo
mecanismo de defesa de plantas. Altos níveis de inibidores de proteases são induzidos
em folhas de batata por ferimentos e quando estes inibidores são ingeridos pela larva do
besouro do Colorado da batata (Leptinotarsa decemlineata), bloqueiam as atividades
proteolíticas específicas no intestino do inseto, alterando o seu crescimento (GRUDEN
et al., 1998).
Os IPs são considerados agentes antimetabólicos, pois causam deficiências
protéicas nos patógenos. O comportamento antibiótico de inibidores de proteases é
atribuído pela sua interferência na digestão de proteínas, as quais reduzem a viabilidade
de aminoácidos impedindo, assim, a síntese de proteínas necessárias para o crescimento,
desenvolvimento e reprodução de patógenos (BRODWAYS e DUFFEY, 1986). A
atividade dos inibidores deve-se a sua capacidade de formar complexos estáveis com as
proteases alvo, bloqueando, alterando ou prevenindo o acesso ao sítio ativo da enzima
(HAQ et al., 2004)
Os IPs são classificados em quatro grupos de acordo com suas especificidades e
aminoácidos ativos nos sítios catalíticos das proteases. São eles: inibidores de serino,
cisteíno, aspártico e metalo-proteases.
11
1.4.1. Cistatinas
As cistatinas são proteínas que especificamente inibem a atividade de cisteíno-
proteases (TURK e BODE, 1991). As cistatinas são inibidores reversíveis e seu
mecanismo de ação é baseado na inibição competitiva através do bloqueio da atividade
proteolítica (ABRAHAMSON, 1993). Têm como principal função garantir a proteção
de células e tecidos contra a atividade proteolítica de peptidases lisossomais que podem
ser liberadas ocasionalmente na morte normal de células ou na morte celular causada
por doenças ou invasão de organismos, como insetos (BARRETT e KIRSCHKE, 1981).
A primeira cistatina a ser isolada foi um inibidor de enzimas “papaína like”,
caracterizado a partir da clara do ovo de galinha. O nome cistatina foi proposto por
Barret em 1986 e mais tarde foi usado para descrever proteínas homólogas da mesma
família. Cistatinas têm sido consideradas evolutivamente relacionadas, formando a
“superfamília cistatina’’. Membros desta superfamília podem ser divididos em três
famílias de proteínas intimamente relacionadas, que compreendem as cistatinas animais
(BARRET et al., 1987) e uma família de cistatinas de plantas. A classificação das
famílias é baseada nas similaridades da seqüência primária, massas moleculares,
número de ligações dissulfeto e localização subcelular. A Família 1, ou família Estefina,
compreende as cistatinas que não contém ligações dissulfeto, com massa molecular de
aproximadamente 11 kDa e são geralmente citosólicas (OLIVEIRA et al, 2003). A
Família 2, ou família Cistatina, são as cistatinas que formam duas ligações dissulfeto
intracelulares próximas ao carboxi-terminal, com massa molecular entre 13 e 24 kDa e
podem ocorrer em altas ou baixas concentrações em muitos fluidos biológicos (TURK e
BODE, 1991). A Família 3, ou família Cininogênio, estão no plasma sangüíneo e
possuem alta massa molecular, com cerca de 60 a 120 kDa. Formam ligações dissulfeto,
12
são glicosiladas e têm uma grande participação no processo de coagulação do sangue
(TURK e BODE, 1991). Finalmente, a Família 4, ou fitocistatinas pois são encontradas
em plantas. A massa molecular está entre 5 e 87 kDa e possuem características das
famílias 1 e 2 (REIS e MARGIS, 2001).
As fitocistatinas são a segunda classe de inibidores de proteases mais estudada e
têm sido caracterizadas a partir de várias espécies de plantas, tanto monocotiledôneas
como dicotiledôneas, incluindo feijão de corda (FERNANDES, et al., 1993), batata
(WALDROM et al., 1993), repolho (LIM et al., 1996), erva daninha (ROGERS et al.,
1993), cenoura (OJIMA et al., 1997), papaia (SONG et al., 1995), maçã (RYAN et al.,
2003), abacate (KIMURA et al., 1995) e castanha (CONNORS et al., 2002). Cistatinas
também têm sido isoladas de sementes de várias plantas incluindo girassol
(KOUZUMA et al., 1996), arroz (ABE et al., 1987), trigo (KURODA et al., 2001),
milho (ABE et al., 1995) e soja (HINES et al., 1991; MISAKA et al., 1996). Essas
proteínas exercem importantes funções biológicas, como a regulação das atividades das
proteases endógenas durante a maturação de sementes, a defesa contra ataque de insetos
e nematóides, que geralmente têm cisteíno-proteases em seus intestinos. A inibição é
causada por uma região hidrofóbica, em forma de cunha da molécula de cistatina, que é
inserida no sítio ativo da protease bloqueando o acesso do substrato neste sítio (BODE
et al., 1988). Esta forma triangular é composta por três elementos estruturais, que são
três regiões que possuem resíduos ou domínios conservados na maioria das cistatinas,
compreendendo uma Glicina na região N-terminal, um motivo Gln-Val-Val-Ala-Gly no
primeiro “loop” e uma sequência Leu-Pro ou Pro-Trp no segundo “loop” de ligação das
famílias 1 e 2 das cistatinas. A atividade das cistatinas tem sido explicada pela presença
destes três pontos de contato com a protease alvo.
13
Estudos com a cistatina C humana indicam que o primeiro ponto de interação
envolve um segmento contendo um resíduo de glicina no N-terminal, que se encaixa
entre os sub-sítios S1 e S2 da enzima. Os outros pontos de interação ocorrem no
“hairpin loop” contendo o domínio QxVxV (uma sequência altamente conservada
presente na superfamília das cistatinas) o qual estabiliza o complexo fornecendo uma
área de contato estendida com o sítio de ligação da protease. O segundo “loop”
corresponde a um segmento contendo um resíduo de triptofano que também pode
interagir com o sítio de ligação da protease (ABRAHAMSON et al., 1987).
Os três pontos de interação da cistatina com a cisteíno-protease são ilustrados na
figura 3.
Figura 3. Visão esquemática da interação de uma cistatina e uma cisteíno-protease. O sítio ativo da
enzima é mostrado na parte superior da figura. A cadeia polipeptídica da cistatina C é ilustrada abaixo,
com os resíduos de aminoácidos indicados por letras. Três segmentos da cistatina estão envolvidos na
ligação da enzima. Os resíduos da região N-terminal (amarelo) interagem com o substrato. Dois ‘’loops’’
são formados, um em vermelho na região central e um segmento localizado próximo à região C-terminal
(azul) juntos formam a área de contato com a protease. A conformação da molécula da cistatina não
permite que ela seja clivada por uma protease na interação (ABRAHAMSON, 1993).
14
1.4.2. Cistatinas da cana-de-açúcar
As cistatinas de cana-de-açúcar foram descritas primeiramente por REIS e
MARGIS (2001), que identificaram no banco de dados de cana-de-açúcar do SUCEST
(Sugarcane Expressed Tags Project) vinte e cinco prováveis fitocistatinas, possíveis
membros da superfamília cistatina.
O clone SCCCRZ2001G09, originário do SUCEST, foi utilizado no projeto de
doutorado da Dra. Andrea Soares Costa desenvolvido no Laboratório de Biologia
Molecular da UFSCar. Este clone codifica uma proteína inibidora de cisteíno protease
da cana-de-açúcar que foi denominada Canacistatina (SOARES-COSTA et al., 2002).
Esta proteína é composta por 126 aminoácidos e possui massa molecular aproximada de
13 kDa.
A canacistatina, também denominada CaneCPI-1, possui similaridade de
seqüência com a Orizacistatina I, uma cistatina de arroz. A proteína recombinante foi
expressa em E. coli e apresenta-se na forma solúvel. A proteína purificada foi
caracterizada como sendo uma cistatina e foi utilizada em ensaios de inibição de
atividade de cisteino-proteases, inclusive com algumas catepsinas humanas (SOARES-
COSTA et al., 2002; OLIVA et al., 2004).
Outras duas cistatinas foram isoladas da cana-de-açúcar sendo denominadas de
CaneCPI-2 e CaneCPI-3. Estas cistatinas foram expressas em E. coli e purificadas. Em
ensaios de inibição, a CaneCPI-2 e CaneCPI-3 mostraram atividade inibitória sobre a
papaína (GIANOTTI et al., 2006).
A figura 4 mostra a seqüência de nucleotídeos e aminoácidos da CaneCPI-1.
15
Figura 4. Seqüência de nucleotídeos do gene da CaneCPI-1. A região codificante da proteína é mostrada a
partir do códon de iniciação (ATG), em rosa; as regiões conservadas presentes na superfamília Cistatina
são mostradas em azul; o motivo conservado característico da família Fitocistatina é mostrado em laranja.
1.4.3. Inibidores de proteases no controle de insetos
As perdas na produção de culturas de plantas causadas por pragas são um grave
problema que afeta os produtores, a agricultura e a economia de um país. Assim, é
necessária a busca por novos métodos de combate a estas pragas. O método mais
utilizado para eliminar os patógenos e as pragas de plantas é o uso de agrotóxicos e
pesticidas, porém este método é caro e prejudicial ao meio ambiente.
M A E A H N G R R V G M V G D
ATGGCCGAGGCACACAACGGGCGGCGCGTGGGGATGGTGGGCGAC
V R D A P A G H E N D L E A I E L A
GTCCGGGACGCGCCGGCCGGCCACGAGAACGACCTCGAGGCCATCGAGCTCGCG
R F A V A E H N S K T N A M L E F E
CGCTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGACCAACGCGATGCTGGAGTTCGAG
R L V K V R H Q V V A G T M H H F T
AGGCTGGTGAAGGTGAGGCACCAGGTGGTGGCCGGGACCATGCACCACTTCACC
V Q V K E A G G G K K L Y E A K V W
GTCCAGGTGAAGGAGGCCGGCGGCGGCAAGAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGG
E K V W E N F K Q L Q S F Q P V G D
GAGAAGGTGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTGCAGAGCTTCCAGCCGGTCGGGGAC
A
GCC
16
Plantas superexpressando genes de resistência a pragas vêm se tornando uma
alternativa interessante para a agricultura, viabilizando a obtenção de plantas menos
dependentes de pesticidas químicos (BOUCHARD et al., 2003). Recentes estudos estão
focados na busca de novos genes de interesse que codificam proteínas de defesa, isto é,
proteínas que ofereçam proteção contra os insetos. Neste sentido, as proteínas inibidoras
de proteases têm se mostrado eficientes no combate aos insetos.
Os inibidores de proteases têm como uma de suas funções a defesa das plantas
contra o ataque de pragas ou patógenos. Muitas pesquisas recentemente vêm explorando
este mecanismo de defesa para a proteção da cultura, através da transformação genética
de plantas com genes que codificam proteínas inibidoras de proteases, aumentando a
resistência destas plantas aos insetos (WALKER et al., 1999). Os inibidores de
proteases atuam extracelularmente no intestino dos insetos através do bloqueio da
proteólise do alimento, interferindo na nutrição e outras funções metabólicas
relacionadas (BOUCHARD et al., 2003).
O provável envolvimento dos inibidores de proteases na proteção das plantas foi
observado inicialmente por LIPKE et al., em 1954, quando larvas do besouro da flor
Tribolium confusum não se desenvolveram na presença de inibidores de tripsina de soja.
Após estes estudos surgiram vários outros exemplos de inibidores de proteases que se
mostraram ativos contra certas espécies de insetos tanto em experimentos realizados
com proteases in vitro (PANNETIER et al., 1997; KOIWA et al., 1998) quanto in vivo
em ensaios feitos com dietas artificiais (URWIN et al., 1997; VAIN et al., 1998).
O uso de proteínas inibidoras de proteases no desenvolvimento de plantas
transgênicas resistentes a pragas e doenças tem sido adotado recentemente (HILDER et
al., 1987).
17
Para uma administração eficiente do controle de pragas através do uso de
inibidores de proteases em plantas transgênicas, é importante conhecer o tipo de enzima
presente no intestino do inseto. Das quatro classes de proteases existentes, as serino e
cisteíno-proteases são as que mais se destacam, sendo encontradas com maior
freqüência no intestino dos insetos fitófagos. As serino-proteases são encontradas com
maior freqüência nos insetos da ordem Lepidoptera, já as cisteíno-proteases são
encontradas com maior incidência nos insetos da ordem Coleoptera. O inseto
Callosobruchus maculates (Coleoptera:Bruchidae) possui no intestino de suas larvas
enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases (CAMPOS et al, 1989). Proteases
similares foram isoladas do intestino de larvas do besouro da flor Tribolium castanaeum
(MURDOCK et al, 1987).
Como já verificado em diversos trabalhos, testes bioquímicos e moleculares
indicam que as cisteíno-proteases “catepsina L-like” são as enzimas mais comumente
encontradas no intestino de insetos pertencentes às ordens Hemiptera, Diptera e
Coleoptera (TERRA e FERREIRA, 1994).
As cisteíno-proteases isoladas de intestino de insetos podem ter sua atividade
inibida por inibidores sintéticos como também por inibidores naturais. Em um estudo
com proteases de intestino de vários membros da ordem Coleoptera 10 de 11 besouros
tiveram inibição de proteases por um reagente à base de sulfidrila (PCMBS) indicando
que as proteases são da classe das cisteíno-proteases (MURDOCK et al., 1987). A
atividade ótima observada nas cisteíno-proteases ocorre em pH 5-7, mesma faixa de pH
do intestino de insetos que utilizam cisteíno-proteases na sua digestão (MURDOCK et
al., 1987).
18
1.4.4. Plantas transgênicas como sistema de expressão
Recentemente, o potencial uso das cistatinas de plantas em inibir cisteíno-
proteases de insetos tem evoluído e a importância dos estudos das proteases digestivas
de patógenos tem sido acentuada (TURK et al., 1991). Várias plantas transgênicas
expressando cistatinas de plantas já foram testadas contra espécies de insetos. Foi
desenvolvida uma batata transgênica expressando um inibidor de cisteíno-protease de
arroz, a orizacistatina (OC-I) (BOUCHARD et al., 2003). Uma orizacistatina mutante,
OC-I∆86, também foi utilizada na transformação genética de banana (ATKINSON et
al., 2004) e Arabidopsis thaliana (WALKER et al., 1999).
A transformação genética de plantas com genes que codificam inibidores de
proteases pode se tornar uma alternativa interessante não somente para o controle de
pragas e patógenos, mas também como um método de produção de inibidores de
proteases. Algumas proteínas vêm sendo produzidas em plantas transgênicas com
sucesso. Tabaco e alfafa foram transformados geneticamente com o gene que codifica
uma proteína inibidora de protease de tomate (NARVAEZ-VASQUEZ, et al., 1992),
assim como o arroz foi transformado expressando o inibidor Kunitz de soja (LEE et
al.,1999) e pera também tem sido produzida expressando um inibidor de protease de
Nicotiana alta (CHARITY, et al., 1999). Assim, as plantas transgênicas além de se
tornarem resistentes a pragas e patógenos podem funcionar como uma “biofábrica” para
a produção de proteínas heterólogas (SARDANA et al., 1998). Além das vantagens
econômicas, existem benefícios qualitativos que favorecem o uso de plantas
transgênicas como fábricas para a produção de proteínas recombinantes.
Embora os sistemas de expressão em bactérias e fungos sejam mais robustos,
eles não são ideais para a síntese de muitas proteínas de mamíferos devido às diferenças
19
nas suas vias metabólicas, uso de códons e formação de corpos de inclusão. Apesar de
existirem diferenças no processamento pós-traducional e no uso de códons entre plantas
e mamíferos, estas diferenças são menos significativas quando comparamos mamíferos
e microorganismos. E, se as diferenças no processamento representarem alguma
dificuldade, é possível modificar as plantas para alterar as vias de maturação das
proteínas. Em adição, os produtos das plantas transgênicas são menos suscetíveis à
contaminação por patógenos, toxinas microbianas ou seqüências oncogênicas
(GIDDINGS, 2001).
1.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Utilizando as técnicas de cultura de tecidos vegetais e da engenharia genética,
ampliaram-se consideravelmente as possibilidades da introdução de genes de interesse
agronômico, inclusive para o controle de fitopatógenos (DOMINGUEZ et al., 2000). A
introdução de genes exógenos em plantas pode ser feita através da Agrobacterium
tumefaciens ou por métodos diretos como a eletroporação e a biobalística.
A bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens é do tipo gram negativa,
causadora da doença ‘‘galha da coroa’’, em que ocorre um processo de transferência
natural de genes entre a agrobactéria e a célula vegetal, quando fragmentos de DNA
bacteriano (T-DNA) são transferidos para dentro da célula vegetal, integrando-se ao
genoma nuclear (REAM e GELVIN, 1996). Em sua forma natural, a bactéria transfere
um fragmento de DNA, parte do plasmídeo bacteriano, e este se integra ao genoma das
células de plantas infectadas. No fragmento de T-DNA (Transferred DNA) que é
20
transferido para a célula vegetal estão os genes que codificam enzimas envolvidas na
síntese de opinas e de fitohormônios, produtos que são responsáveis pela formação do
tumor e sobrevivência da bactéria. Os vetores utilizados para a transformação são
chamados de ‘‘desarmados’’, isto é, não possuem os oncogenes em seu plasmídeo, mas
retém os genes de virulência (região vir), localizados no plasmídeo Ti (REAM e
GELVIN, 1996). Estas construções de plasmídeos possuem promotores de plantas e
genes bacterianos que conferem resistência a antibióticos, fazendo com que estes
marcadores sejam eficientes para a seleção de células ou plantas transformadas. Assim,
a Agobacterium tumefaciens é utilizada como vetor de transformação, onde o fragmento
de T-DNA é deletado e substituído por um gene de interesse (SACILOTO, 2003),
perdendo a capacidade de causar tumores, porém sendo capaz de transferir o DNA
exógeno. Explantes inoculados com as linhagens desarmadas têm capacidade
regenerativa e grande porcentagem de produção de plantas transgênicas (BRASILEIRO,
1998).
O processo de eletroporação consiste na indução temporária de poros nas
membranas celulares de protoplastos, produzidos por um campo elétrico permitindo,
assim, a passagem de íons e moléculas, como a de DNA contendo os transgenes. Este
método não é muito utilizado em monocotiledôneas (BIRCH, 1997).
A biobalística é o procedimento que utiliza o bombardeamento de explantes com
microprojéteis objetivando a inserção de DNA exógeno no genoma das plantas. A
técnica da biobalística (balística biológica), também conhecida por biolística, aceleração
de partículas ou bombardeamento de partículas, foi descrita inicialmente por
SANFORD et al., (1987).
21
1.5.1. Técnica de transformação por Biobalística
O método de biobalística consiste na aceleração de micropartículas que
atravessam a parede celular e a membrana plasmática, de forma não letal, carreando
substâncias adsorvidas, como DNA, para o interior da célula (FERREIRA et al., 2004).
São utilizados microprojéteis de ouro ou tungstênio, com diâmetro em torno de 1µm,
nos quais são precipitadas as moléculas de DNA. Os projéteis carregam moléculas de
DNA precipitadas na superfície, que são liberadas, sendo que algumas atingem o núcleo
da célula vegetal e, em baixa freqüência, conseguem integrar-se de forma aleatória no
genoma (Klein et al, 1987). O tipo de aparelho usado para acelerar as micropartículas
envolvidas pelo DNA pode ter propulsão a ar, pólvora, gás hélio ou eletricidade
(FERREIRA et al., 2004).
A figura 5 mostra em um esquema representativo os passos envolvidos na
técnica de transformação genética por biobalística.
22
Figura 5. Transformação por biobalística. Esquema representativo do método de transformação genética
por biobalística. A: foto do aparelho de biobalística, que é utilizado para o bombardeio dos calos
embriogênicos. B: Placa de Petri com os calos embriogênicos posicionados no centro da placa. C: calos
embriogênicos após o bombardeamento, em meio de seleção. D e E: regeneração dos calos e formação de
plântulas, inicialmente em placa de Petri e depois em tubetes de vidro. F: Plantas regeneradas, cultivadas
em vasos com terra. (Disponível em: www.porquebiotecnologia.com.ar. Acesso: jan 2006).
Neste método de transformação genética, são utilizadas moléculas de DNA do
gene de interesse e marcadores selecionáveis, os quais são clonados em plasmídeos que
possuem uma origem de replicação de E.coli e um gene marcador de resistência a um
antibiótico, para a seleção das bactérias que levam o inserto.
Um fator importante desta técnica é a escolha do tecido alvo. Vários tipos de
tecidos podem servir como alvo, como folhas, calos, raízes, células em suspensão e
outros explantes têm sido empregados em inúmeros trabalhos. Gambley et al., 1993
verificaram que a escolha do alvo é um dos fatores fundamentais neste processo.
23
1.5.2. Transformação genética da cana-de-açúcar
A transformação genética de cana-de-açúcar foi descrita por Chen et al. (1987),
que obtiveram massas celulares transgênicas a partir de protoplastos tratados com
polietilenoglicol (PEG) sem, contudo, alcançar a regeneração de plântulas. Plantas
transgênicas foram obtidas através da utilização de métodos diretos e indiretos de
transformação, incluindo a eletroporação de tecidos meristemáticos e fragmentos de
calo, o bombardeamento de calos embriogênicos e outras técnicas baseadas na
utilização da Agrobacterium tumefaciens (COSTA-LIMA et al., 2001).
Para a cana-de-açúcar, a técnica de transformação genética por biobalística
mostrou-se eficiente e com resultados satisfatórios. Neste método, verificou-se que os
calos embriogênicos foram os melhores alvos para a transformação genética de cana-de-
açúcar. Além do alvo, a escolha do promotor também é importante para garantir o
sucesso da técnica. No caso das monocotiledôneas o promotor mais utilizado é o da
ubiquitina do milho (Ubi-1).
As técnicas de transformação de cana-de-açúcar estão sendo amplamente
estudadas e atualmente existem plantas transgênicas para as mais variadas
características. As perspectivas de transformação genética de cana-de-açúcar foram
incrementadas pelo projeto genoma da cana, financiado pela FAPESP e
COPERSUCAR. Este projeto identificou milhares de seqüências expressas.
24
1.5.3. Escolha do transgene
Vários trabalhos têm sido desenvolvidos em relação à transformação de plantas,
empregando transgenes na tolerância a herbicidas (FALCO et al., 2000). Temos como
exemplos o gene da capa protéica do mosaico da cana-de-açúcar (SMITH et al., 1992),
o gene bt para resistência a pragas (MOORE, 1996) e o gene da lactoferrina, uma
proteína que possui atividade antibacteriana, que foi inserido em tabaco, causando
diminuição dos sintomas causados R. solanaceum. Em tabaco, outra proteína Ttr,
(tabatoxina) foi expressa em plantas transformadas, levando a completa resistência da
planta a P. syringae.
Neste trabalho, o gene escolhido para a transformaçõa genética da cana-de-
açúcar foi o gene da proteína Canacistatina ou CaneCPI-1 (SOARES-COSTA et al,
2002). Esta proteína pertence ao grupo das cistatinas de cana-de-açúcar, que
provavelmente estão envolvidas com mecanismos de defesa da planta ao ataque de
insetos.
25
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma cana-de-açúcar
transgênica superexpressando o gene que codifica a proteína Canacistatina (CaneCPI-1),
com a finalidade de obtenção de uma planta resistente ao ataque de insetos e a posterior
purificação desta proteína recombinante das folhas da cana-de-açúcar transgênica. A
escolha da CaneCPI-1 foi baseada em ensaios enzimáticos anteriores que mostraram
que ela pode inibir proteases intestinais do inseto S. levis. Estes ensaios são parte do
trabalho de pós-doutoramento de Andréa Soares-Costa.
2.1. Objetivos específicos
• Inserção do gene que codifica a CaneCPI-1 no vetor pAHC17 para expressão da
proteína sob controle do promotor Ubi-1.
• Transformação genética da cana-de-açúcar com o gene CaneCPI-1 através do
bombardeamento dos calos embriogênicos.
• Regeneração dos calos de cana-de-açúcar após bombardeamento e cultivo das
células transformadas in vitro.
• Verificação da integração estável do gene exógeno ao genoma da planta.
• Análise da expressão gênica nas plantas transformadas pelo método de PCR
Semi-Quantitativo.
• Detecção da CaneCPI-1 em canas transgênicas por análise de Western blotting.
• Purificação da proteína Canacistatina (
HIS
CaneCPI-1) a partir das folhas das
plantas transformadas.
• Ensaio de atividade com a proteína
HIS
CaneCPI-1 contra a catepsina L.
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de Biologia Molecular do
Departamento de Genética e Evolução da UFSCar (São Carlos), com a colaboração do
laboratório de Biologia Molecular do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC-
Piracicaba) e laboratório de Biofísica do Departamento de Biofísica do Instituto de
Farmacologia (INFAR) da UNIFESP (São Paulo).
3.1. MATERIAL
O gene utilizado neste trabalho foi o gene da canacistatina, CaneCPI-1, que foi
obtido inicialmente a partir do clone SCCCRZ2001G09 (Acession Number: AY119689)
originado do Sugarcane Genome Project – SUCEST (FAPESP). A proteína CaneCPI-1
foi expressa em E. coli, purificada e caracterizada, sendo que o gene CaneCPI-1 foi
subclonado no vetor de expressão pET28a, sendo esta construção denominada
pET28canecys. Este plasmídeo foi utilizado como molde para as amplificações.
O método de transformação genética utilizado foi a Biobalística e este
procedimento foi realizado no Centro de Tecnologia Canavieira – CTC (Piracicaba –
SP). O vetor de expressão utilizado para a transformação genética da cana-de-açúcar foi
o plasmídeo pAHC17 (CHRISTENSEN e QUAIL, 1996). Outro vetor utilizado na
transformação genética dos calos de cana-de-açúcar foi o vetor pHA9 que contém o
gene marcador de seleção para geneticina e o gene que codifica para a enzima
neomicina fosfotransferase II (NPT II). Essas enzimas não são normalmente
encontradas em plantas e atuam fosforilando antibióticos aminoglicosilados, como os
27
antibióticos canamicina, geneticina e neomicina (BRASILEIRO, 1998; SACILOTO,
2003). A variedade de cana-de-açúcar escolhida para o bombardeamento do transgene
foi a SP80-185, a qual se mostra ser estável em diversos ambientes.
Para a expressão da proteína Poliubiquitina em bactérias foi utilizada a cepa
bacteriana Rosetta (DE3). Para a purificação da proteína foi utilizada resina de níquel
Ni-NTA (QIAGEN).
Nos ensaios de atividade com proteases foi utilizada a enzima Catepsina L
(Calbiochem), o substrato Z-Phe-Arg-MCA (7-amino-metil-coumarina) (Calbiochem) e
o ativador enzimático dithioerithreitol – DTE (SIGMA).
3.2. CONSTRUÇÃO DOS VETORES PARA EXPRESSÃO NA PLANTA
O plasmídeo pAHC17 utilizado nesta construção foi cedido pelo Dr. Eugênio
Cesar Ulian do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC). O plasmídeo pAHC17 possui o
promotor da ubiquitina do milho (ubi1) que expressa muito bem em monocotiledôneas.
A frente do promotor há sítios de restrição para facilitar a clonagem do gene de
interesse (CHRISTENSEN e QUAIL, 1996).
O esquema representativo do mapa do pAHC17 é mostrado na figura 6.
28
Figura 6: Mapa do pAHC17. Este plasmídeo possui um polylinker para clonagem, sendo
preferencialmente usado o sítio de restrição para a enzima BamHI.
Foram construídos dois vetores de expressão. O primeiro vetor, denominado de
pAHCaneCPI-1A (figura 7), não possui cauda de histidinas mantendo a forma original
do gene da canacistatina. A outra construção, denominada pAHCaneCPI-1C (figura 7),
possui uma cauda contendo seis histidinas no C-terminal. Esta estratégia foi utilizada
para facilitar a posterior purificação da proteína a partir da planta.
SalI (2005)
BamHI (2017)
PstI (1999)
XbaI (2011)
SalI (2030)
PstI (2036)
HindIII (1)
PstI (13)
XbaI
SalI (608)
BglII (954)
XbaI (1390)
XbaI (1628)
EcoRI (1404)
EcoRI (2279)
pAHC17
(5267 pb)
2880 pb
pUC8
NOS term
(243 pb)
Ubi1 prom
(2000 pb)
29
Figura 7: Esquema representativo dos vetores de expressão pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C. Ubi-1,
promotor da ubiquitina do milho; ORF da Canacistatina; 6X Histidina tag; NOS (nopaline synthase
terminator).
3.2.1. Amplificação da fase aberta de leitura da CaneCPI-1
A fase aberta de leitura que codifica a proteína inibidora de cisteíno protease,
contida no vetor pET28canecys, foi obtida através de amplificação por PCR.
Para a construção pAHCaneCPI-1A foram utilizados os oligonucleotídeos
CaneF_bam: 5’ cac ttg gat ccg tca gcg atg gcc gag g 3’ e CaneR_Bam: 5` cag cag gat
cct tag gcg tcc ccg acc ggc tg 3´ e para a construção pAHCaneCPI-1C foram utilizados
os oligonucleotídeos CaneF_bam: 5’ cac ttg gat ccg tca gcg atg gcc gag g 3’ e
CaneR_His: 5’ tag gat cct tta atg atg atg atg atg atg agg cgt ccc cga ccg gct g 3’. Nota-
se que o oligonucleotídeo CaneR_His possui uma seqüência de seis histidinas (em
negrito).
30
Os oligonucleotídeos acima descritos contém sítios para a enzima de restrição
BamHI (em sublinhado) para a clonagem no vetor pAHC17 clivado com a mesma
enzima. Para a amplificação do gene da CaneCPI-1 por PCR foram utilizados 10ng de
DNA como molde, 200µM de cada dNTP (Invitrogen), tampão de PCR 1 X (20mM
Tris-HCl pH 8.4), 1.5mM MgCl
2
, 20pmol de cada oligonucleotídeo e 1U de Taq DNA
Polymerase (Invitrogen) em uma reação com volume final de 100µl. O programa usado
foi [1x] 94°C 1 min, [35x] 94°C 30 sec, 48°C 30 sec, 72°C 1 min, e [1x]72°C 5 min. Os
resultados das amplificações foram observados em gel de agarose 1%. Os produtos de
amplificação foram clivados com a enzima BamHI e purificados utilizando o kit GFX
PCR DNA and Gel Band Purification (Amersham Bioscience).
3.2.2. Subclonagem da CaneCPI-1 no vetor pAHC17
O vetor pAHC17 foi previamente digerido com a enzima de restrição BamHI e
1µg de DNA do vetor foi defosforilado com 2U de enzima SAP – Shrimp Alcaline
Phosphatase (Amersham Biosciencies) e tampão da enzima 1X, em um volume final de
50µl. Foi necessária a defosforilação do vetor clivado para evitar a ligação do plasmídeo
sem o inserto.
Os produtos de amplificação CaneCPI-1A e CaneCPI-1C, previamente digeridos
com a enzima de restrição BamHI, foram ligados no vetor pAHC17. A ligação foi feita
utilizando 80ng do vetor pAHC17, 480ng de cada fragmento amplificado, tampão da
enzima 1X e 1U da enzima T4 DNA Ligase, durante 12 horas a 4°C. A mistura de
ligação contendo o inserto e o vetor pAHC17 foi utilizada para transformar células de
E.coli DH5-α, cloreto de cálcio competentes (SAMBROOK et al., 1989). As bactérias
transformadas foram plaqueadas em LB Ágar (USB) contendo ampicilina (100µg/ml).
31
As colônias transformantes foram analisadas por PCR, com os primers utilizados na
amplificação dos insertos, e as colônias com amplificação positiva foram selecionadas
para extração do DNA plasmidial. Para isso, foram cultivadas em meio líquido LB
Broth (USB) contendo o antibiótico ampicilina, durante 16 horas a 37°C, e a partir
destas colônias foram feitas extrações do DNA plasmidial.
Para confirmar a inserção dos fragmentos no vetor pAHC17 foi feita uma análise
de restrição, utilizando 3U da enzima BamHI (Fermentas), 200ng de DNA e tampão
BamHI
+
1X (Fermentas), durante 3 horas a 37°C.
Após a confirmação dos recombinantes por análise de restrição, os clones
selecionados foram seqüenciados para verificação da integridade e correta direção dos
insertos. Para o sequenciamento foi utilizado o kit Dyenamic ET Terminator
(Amersham Biosciencies) em sequenciador ABI Prism 377 DNA sequencer (SANGER,
1977), utilizando os primers M13 Foward: 5’ gta aaa cga cgg cca g 3’ ou M13 Reverse:
5’ cag gaa aca gct atg ac 3’.
3.3. OBTENÇÃO DE CALOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Todos os procedimentos de obtenção dos calos de cana-de-açúcar,
bombardeamento, seleção e regeneração dos calos e cultivo das plantas transformadas
foram realizados no Centro de Tecnologia Canavieira (Piracicaba - SP). Estes
procedimentos foram realizados pelos técnicos e pesquisadores do CTC.
32
A variedade da cana de açúcar utilizada na transformação foi a SP80-185. Esta
variedade foi escolhida pela sua característica de estabilidade em diferentes ambientes
com fácil adaptação.
Foram utilizados calos embriogênicos de cana-de açúcar como tecido alvo para o
bombardeamento, que regeneram plantas com grande facilidade, além de serem de fácil
manuseio no processo de seleção em meio de cultura e permitem uma alta produção de
material para o uso em bombardeamento em pouco tempo. Foram feitos cortes da região
meristemática e estas cultivadas em meio indutor de calogênese. Dos calos que se
desenvolveram, foram selecionados os calos com potencial embriogênico para o
bombardeamento das micropartículas com DNA transformante.
3.4. PREPARAÇÃO DAS PARTÍCULAS DE TUNGSTÊNIO PARA O
BOMBARDEAMENTO
Foram utilizadas no bombardeamento partículas de tungstênio envolvidas com o
DNA transformante de acordo com o método descrito por Sanford et al. (1987). O DNA
plasmidial contendo o gene de interesse foi preparado para o bombardeamento, através
de Midiprep (QIAGEN). Os plasmídeos foram precipitados em partículas de tungstênio,
através da mistura de 2.5M de cloreto de cálcio, 10µg de DNA, 0.1M de espermidina e
também com 10µl do plasmídeo pHA9, que contém os genes de resistência para
geneticina, em um volume final de 140µl. O DNA vetor foi preparado usando uma
variação do método de co-bombardeamento de Klein et al. (1988a,b). Essa mistura
ficou sob agitação lenta por 10 minutos para aderência, depois foi centrifugada e o
33
pellet foi lavado duas vezes com etanol 95% e ressuspendido em 25 µl de etanol 95%.
Quatro microlitros desta mistura foram utilizados no bombardeamento de cada placa de
Petri contendo os calos embriogênicos posicionados no centro da mesma para o
bombardeamento. No total, foram bombardeadas seis placas de Petri. O aparelho
utilizado foi desenvolvido pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) e emprega gás
Helio comprimido de 8 a 9kgf/cm
2
e os disparos são realizados em uma câmara de
vácuo de 27mmHg para minimizar a resistência do ar.
A figura 8 mostra uma foto do aparelho de biobalística utilizado neste trabalho.
Figura 8: Aparelho de biobalística. Foto do aparelho de biobalística utilizado para o bombardeamento de
DNA exógeno em plantas, construído pelo CTC (Centro de Tecnologia Canavieira), o qual utiliza gás
hélio comprimido e vácuo parcial.
Após o bombardeamento os calos de cana-de-açúcar passaram por vários
processos de seleção e regeneração baseados no trabalho de Bower e Birch (1992). Os
calos foram transferidos para meio de cultura sem seleção e mantidos em sala de
34
crescimento. Após 10 dias os calos foram transferidos para um novo meio de cultura CI-
3 contendo o antibiótico geneticina para seleção. Estes calos foram mantidos em sala de
crescimento em um fotoperíodo de 12 horas a temperatura de 24ºC ± 2ºC para a
regeneração dos transformantes.
3.5. SELEÇÃO DAS PLANTAS TRANSFORMADAS
Os calos que cresceram em meio de seleção, provavelmente transformados,
foram transferidos para um meio contendo geneticina para seleção, crescimento e
regeneração das plantas. Após aproximadamente quatro meses foram obtidas plantas
com raiz, sendo possível a coleta de pequenos pedaços de folhas para extração de DNA.
Foram utilizadas plantas controles não-transformadas, obtidas do mesmo tipo de calo, e
que se regeneraram passando pelos mesmos passos da cultura de tecido, porém não
sofreram bombardeamento.
As plantas regeneradas em meio de cultura seletivo, com cerca de 4cm de altura,
foram analisadas por PCR para determinar se houve integração do transgene no genoma
da cana-de-açúcar.
O DNA da planta foi isolado através de maceração de folhas de cana-de-açúcar
em nitrogênio líquido e posterior homogeneização do tecido em Reagente Plant
DNAzol (Invitrogen), obtendo-se no final o DNA genômico das plantas. A reação de
amplificação foi realizada utilizando 20ng do DNA isolado das folhas de plantas não-
transformadas e transformadas como molde, 200µM de cada dNTP (Invitrogen), tampão
de PCR 1 X (20mM Tris-HCl pH 8.4), 1.5mM MgCl
2
, 8pmol de cada oligonucleotídeo
35
e 0.25U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen) em uma reação de 25µl. Os seguintes
oligonucleotídeos foram utilizados nas reações para as duas construções: Ubi_forward:
5' ggc ata tgc agc atc tat tca 3' e CaneR_bam: 5' cag cag gat cct tag gcg tcc ccg acc ggc
tg 3', os quais hibridizam no promotor da ubiquitina e na região flanqueadora 3’ do gene
da CaneCPI-1, respectivamente. O programa utilizado no termociclador foi [1x] 94°C 1
min, [40x] 94°C 30 seg, 48°C 30 seg, 72°C 1 min, e [1x] 72°C 5 min. Os produtos de
amplificação foram analisados em gel de agarose 1%.
3.6. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA CaneCPI-1 EM PLANTAS
TRANSGÊNICAS
A análise de expressão foi realizada através de PCR Semi-quantitativo para
confirmar a presença de um transcrito de tamanho esperado. Para esta análise, 100mg de
folhas de canas-de-açúcar não-transformadas e transformadas foram maceradas em
nitrogênio líquido com ajuda de um pistilo e homogeneizadas em 1ml de reagente
Trizol (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante para a obtenção do RNA total.
O RNA total foi quantificado em espectrofotômetro com absorbância de 260nm. Para
síntese de cDNA foi utilizada a técnica de RT-PCR através do Kit Improm II Reverse
Transcription System (Promega). Cerca de 2µg de RNA total e 1µg de Oligo dT
(Promega) foram utilizados por reação.
Foi realizada uma reação de PCR para amplificar os fragmentos de cDNAs das
plantas selecionadas. Assim, como molde para a reação, foram utilizados 4 µl do cDNA
sintetizado a partir do RNA da planta não-transformada e das transformadas, 200µM de
36
cada dNTP (Invitrogen), tampão de PCR 1 X (20mM Tris-HCl pH 8.4), 1.5mM MgCl
2
,
5pmol de cada oligonucleotídeo e 0.25U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen) em uma
reação de 25µl. Os oligonucleotídeos utilizados na reação de amplificação foram:
CaneF_bam:5’ cac ttg gat ccg tca gcg atg gcc gag g 3´ e CaneR_bam:5’ cag cag gat cct
tag gcg tcc ccg acc ggc tg 3´.
Para estimar a expressão do gene da CaneCPI-1 na cana-de-açúcar transformada,
em comparação com uma não-transformada, foi utilizada a técnica de PCR semi-
quantitativo. Seis diluições do cDNA foram utilizadas nas reações de amplificação (1:2,
1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64). Estas reações de PCR foram realizadas com os
oligonucleotídeos específicos para o gene da CaneCPI-1, em um volume final de 25µl.
Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1% e visualizados sob
luz UV.
O gene da poliubiquitina foi escolhido como controle endógeno para este
experimento por ser um gene com expressão homogênea e adequado para a
normalização de experimentos (PAPINI-TERZI, et al., 2005). O clone
SCCCST2001G02.g da cana-de-açúcar (originário do SUCEST- Sugarcane EST
Project) apresenta uma fase aberta de leitura de aproximadamente 250pb e codifica uma
proteína com 83 resíduos de aminoácidos (8kDa). O controle endógeno também foi
utilizado em uma amplificação por PCR, em uma reação seguindo as mesmas condições
descritas para o gene da CaneCPI-1, nas mesmas diluições e com os oligonucleotídeos:
ST2001F: 5´ ccc ata tgc aga tat ttg tg 3´ e ST2001R: 5´ ccg gat cct tac tgc cca cc 3´. O
programa usado para o gene da poliubiquitina foi [1x] 94°C 5 min, [35x] 94°C 45 seg,
50°C 45 seg, 72°C 1 min, e [1x]72°C 10 min.
37
3.7. ANÁLISE DE WESTERN BLOTTING DA CaneCPI-1 EM PLANTAS
TRANSGÊNICAS
Para a análise da expressão da proteína CaneCPI-1 na planta não-transformada e
nas plantas transformadas, foram realizados ensaios de Western blotting utilizando dois
diferentes tecidos das plantas: folhas e raízes.
Aproximadamente, 200mg de tecido de planta não-transformada e de plantas
transformadas selecionadas foram macerados em nitrogênio líquido com a ajuda de
pistilo e homogeneizados em 2ml de reagente Trizol (Invitrogen). As proteínas foram
isoladas de acordo com as instruções do fabricante e a concentração da proteína foi
medida utilizando o Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad).
Para confirmação da integridade das proteínas extraídas das folhas e raízes das
plantas transformadas e não-transformadas, foi realizado um SDS-PAGE 15% contendo
10µg da proteína recombinante expressa em E. coli e purificada e quantidades iguais de
proteínas extraídas do extrato bruto das folhas das canas-de-açúcar (cerca de 30µg de
proteínas do extrato bruto de cada planta).
Para análise de Western blotting, novamente 10µg da proteína recombinante
expressa em E. coli e purificada e 30µg de proteínas extraídas do extrato bruto das
folhas das plantas foram separadas em SDS-PAGE 15% e transferidas para membranas
de PVDF Invitrolon
TM
(Invitrogen), em tampão de transferência contendo 20mM Tris,
50mM Glicina e 165ml de metanol, em volume final de 975ml. As membranas foram
bloqueadas em tampão TBS 1X (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl), com 5% de
leite desnatado. Após 12 horas a 4°C, as membranas foram lavadas 4X em TBS 1X e
incubadas com anticorpo específico anti-CaneCPI-1 com diluição de 1:3000 e lavadas
novamente com TBS. Em seguida a membrana foi incubada com anti-mouse IgG AP-
38
labeled (Sigma) com diluição de 1:10000. As bandas de proteínas que reagiram com os
anticorpos foram reveladas utilizando o Kit AP Conjugate Substrate (Bio-Rad).
Neste experimento também utilizamos a proteína Poliubiquitina como controle
endógeno. Para isto, foi necessária a produção de anticorpos policlonais anti-
poliubiquitina para as análises de Western blotting. Os mesmos procedimentos acima
descritos foram realizados para imunodetecção da Poliubiquitina nos extratos brutos das
plantas transformadas e não-transformadas, porém substituindo a proteína recombinante
CaneCPI-1 pela proteína Poliubiquitina produzida em E. coli.
3.7.1. Produção de anticorpos policlonais contra a proteína Poliubiquitina
O gene ST2001, que codifica a proteína Poliubiquitina, estava inicialmente
inserido no vetor pSPORT1, assim sendo denominado de pSPORTST2001. Este vetor
pSPORTST2001 foi utilizado como molde em uma reação de PCR para a amplificação
do gene ST2001.
Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação foram: ST2001F: 5´ ccc ata
tgc aga tat ttg tg 3´ e ST2001R: 5´ ccg gat cct tac tgc cca cc 3´. Estes oligonucleotídeos
possuem sítios de clivagem para as enzimas de restrição NdeI e BamHI,
respectivamente (sublinhados). Para a reação de amplificação foram utilizados 20ng de
DNA como molde, 200µM de cada dNTP (Invitrogen), tampão de PCR 1 X (20mM
Tris-HCl pH 8.4), 1.5mM MgCl
2
, 20pmol de cada oligonucleotídeo e 1U de Taq DNA
Polymerase (Invitrogen) em uma reação de 100µl. O programa usado para o gene da
poliubiquitina foi [1x] 94°C 5 min, [35x] 94°C 45 seg, 50°C 45 seg, 72°C 1 min, e
[1x]72°C 10 min. O produto da amplificação foi observado em gel de agarose 1%.
39
Após a amplificação, este fragmento foi purificado e foi inserido no vetor de
propagação pTZ57R/T (Fermentas). Foi feita a transformação do produto da ligação em
células competentes (cepa DH-5α CaCl
2
). A seleção das colônias recombinantes foi
feita através das colônias que exibiam coloração branca. Algumas colônias foram
selecionadas para extração do DNA plasmidial e foram seqüenciadas utilizando o kit
Dyenamic ET Terminator (Amersham Biosciencies) em sequenciador ABI Prism 377
DNA sequencer (SANGER, 1977), utilizando os primers M13 Foward ou M13 Reverse.
O novo plasmídeo, denominado de pTZST, foi clivado com as enzimas NdeI e
BamHI. O inserto foi recuperado do gel de agarose, purificado utilizando o kit Wizard
SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) e subclonado no vetor de expressão
pET28a, previamente clivados com as enzimas de restrição NdeI e BamHI.
O inserto foi ligado no vetor pET28a, que contém em sua seqüência uma cauda
de histidinas (6XHIS). A ligação foi feita utilizando 50ng do vetor pET28a, 120ng do
inserto, tampão da enzima 1X e 1U da enzima T4 DNA Ligase, durante 12 horas a 4°C.
A mistura de ligação contendo inserto e pET28a foi utilizada para transformar células
de E.coli DH-5α, cloreto de cálcio competentes (SAMBROOK et al., 1989).
As bactérias transformadas foram plaqueadas em LB Ágar (USB) contendo
canamicina (25µg/ml). As colônias transformantes foram analisadas por PCR, com os
primers da poliubiquitina, e as colônias com amplificação positiva foram selecionadas
para extração do DNA plasmidial. Para isso, foram cultivadas em meio líquido LB
Broth (USB) contendo o antibiótico canamicina, durante 16 horas a 37°C, e delas foram
feitas as extrações do DNA plasmidial.
Após a confirmação do recombinante, o plasmídeo agora denominado
pETST2001, foi utilizado para a realização de ensaios de expressão da Poliubiquitina
em E. coli. O plasmídeo pETST2001 foi utilizado na transformação de células de E.coli
40
cepa Rosetta (DE3) cloreto de cálcio competentes, resultando em várias colônias. Uma
dessas colônias foi cultivada em 500ml de meio líquido LB Broth (USB) com
antibiótico canamicina (25µg/ml) a 37°C sob agitação até atingir uma densidade óptica
(D.O.) de 0.6 no comprimento de onda de 600nm. Após a D.O. ter sido atingida, foi
coletada uma alíquota de 1ml da amostra para servir de controle antes da indução e
adicionou-se IPTG (Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo) em uma concentração final de
0.4mM, para indução. A indução foi de 4 horas e a expressão foi analisada em SDS-
PAGE 15%, segundo LAEMMLI (1990).
Após a indução, as células foram coletadas e analisadas em relação à
solubilidade. Assim, as células foram sonicadas 7 vezes de 60 segundos com intervalos
de 30 segundos. As células bacterianas foram mantidas em gelo durante os intervalos de
sonicação. As células foram novamente centrifugadas e foram coletadas alíquotas do
pellet formado e do sobrenadante, e estas foram analisadas em SDS-PAGE 15% para a
verificação da solubilidade da proteína (LAEMMLI, 1990).
Foi verificado que a proteína poliubiquitina apresentou-se na forma insolúvel,
estando concentrada no pellet e não no sobrenadante (parte solúvel após a sonicação).
Assim, foi necessária a utilização da uréia para solubilizar a proteína. Após a indução,
as células foram centrifugadas, ressuspendidas em tampão de lise (100mM NaCl, 10mM
Tris-HCl, 50mM NaH
2
PO
4
, pH 8), sonicadas 7 vezes de 60 segundos com intervalos de
30 segundos (mantidas em gelo) e novamente centrifugadas. O precipitado foi
ressuspendido em tampão de lise acrescido de 6M de Uréia e permaneceu 2 horas no
gelo sob agitação. Após este período, a mistura foi centrifugada e foram coletadas
alíquotas do pellet e do sobrenadante para análise de solubilidade.
A purificação da poliubiquitina foi realizada em cromatografia de afinidade
utilizando coluna contendo resina de níquel Ni-NTA (QIAGEN). Esta coluna contém
41
um ligante (níquel) fixado por ligações covalentes a resina e este ligante tem a
capacidade de interagir com a proteína recombinante. Ao passar a mistura protéica pelo
complexo resina-ligante, ocorre uma interação entre a proteína alvo e o ligante. Como o
gene da poliubiquitina foi clonado no vetor pET28a fusionado a uma seqüência de 6
histidinas na sua região N-terminal, foi possível a purificação desta proteína em coluna
de afinidade utilizando o ligante níquel devido à alta afinidade entre a histidina e o
níquel.
Para a eluição da proteína recombinante ligada ao níquel utilizou-se o composto
imidazol, pois o anel imidazólico liga-se aos íons níquel imobilizados pelos grupos
NTA da resina.
O sobrenadante proveniente da lise bacteriana solubilizada em uréia foi utilizado
para a purificação da proteína em coluna de afinidade ao níquel. A coluna foi montada
em uma seringa com 5ml de resina de níquel empacotada e mantida à temperatura
ambiente. Inicialmente, a coluna foi lavada com água mili-Q (Millipore) com a
passagem de 3 vezes o volume da resina e depois equilibrada com 3 volumes de tampão
(10mM Tris-HCl, 50mM NaH
2
PO
4
e 100mM NaCl, pH 8, 6M Uréia). Em seguida o
sobrenadante foi fracionado e novamente foram passados 3 volumes de tampão com
uréia. Após esta etapa, iniciou-se a eluição da proteína com a passagem de tampões com
uréia, contendo um gradiente com concentrações crescentes de imidazol. O primeiro
tampão utilizado continha 10mM de imidazol, o segundo 25mM de imidazol, o terceiro
50mM de imidazol, o quarto 75mM de imidazol, o quinto 100mM de imidazol e o sexto
tampão continha 250mM de imidazol. Foram coletadas duas frações de cada gradiente.
Esta etapa de purificação foi analisada em SDS-PAGE 15%.
Após a eluição, a proteína foi submetida a diálise utilizando membranas
SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing 3,500MWCO (PIERCE n.catal. 68035). Nesta
42
membrana foi colocada a proteína purificada e esta foi submergida em tampão contendo
(10mM Tris-HCl, 50mM NaH
2
PO
4
e 100mM NaCl, pH 8) e 3M Uréia. A diálise foi
realizada durante um período de 12 horas a 4°C sob agitação, para a retirada do
imidazol e da uréia. Foram realizadas mais 3 diálises, a segunda em tampão contendo
1M de uréia e a terceira e quarta em tampão sem uréia, nas mesmas condições
anteriores. A concentração da proteína foi determinada pelo método de Bradford (1976).
Anticorpos policlonais anti-poliubiquitina foram produzidos em camundongos
contra a proteína purificada, produzida em E. coli, utilizando o protocolo segundo
Sambrook et al. (1989). Na primeira imunização foram usados 50µg da proteína
recombinante Poliubiquitina purificada misturados com adjuvante completo de Freud
(Sigma). Uma segunda imunização foi feita após 45 dias utilizando novamente 50µg da
proteína recombinante purificada Poliubiquitina misturada com adjuvante incompleto
de Freud (Sigma). Após 15 dias, os animais imunizados foram sacrificados e o soro foi
coletado por centrifugação a 15000g por 5 minutos e mantido a 4ºC.
Após a obtenção do anticorpos policlonais, foi realizada uma análise de Western
blotting para testar se os anticorpos estavam funcionando. Para esta análise de Western
blotting, foram utilizadas amostras do vetor pET28a sem inserto transformado em
células de E.coli, cepa Rosetta (DE3) induzido com IPTG e amostras da proteína
poliubiquitina expressa em E.coli (cultura de bactéria induzida) e da proteína
poliubiquitina purificada.
Assim, 10µl de cada amostra foram separados em SDS-PAGE 15% e
transferidos para membrana de PVDF Invitrolon
TM
(Invitrogen), em tampão de
transferência contendo 20mM Tris, 50mM Glicina e 165ml de metanol, em um volume
final de 975ml. A membrana foi bloqueada em tampão TBS 1X (50mM Tris-HCl, pH
8.0, 150mM NaCl), com 5% de leite desnatado. Após 12 horas a 4°C, a membrana foi
43
lavada 4X em TBS 1X e incubada com anticorpo específico anti-poliubiquitina com
diluição de 1:5000 e lavada novamente com TBS. Em seguida a membrana foi incubada
com anti-mouse IgG AP-labeled (Sigma) com diluição de 1:10000. As bandas de
proteínas que reagiram com os anticorpos foram reveladas utilizando o Kit AP
Conjugate Substrate (Bio-Rad).
Estes anticorpos anti-poliubiquitina foram utilizados para as análises de Western
blotting das proteínas extraídas dos extratos brutos das folhas das canas-de-açúcar,
seguindo os mesmos procedimentos realizados para a imunodetecção da proteína
CaneCPI-1 nas folhas das plantas transformadas e não-transformadas.
3.8. PURIFICAÇÃO DA CaneCPI-1 A PARTIR DA CANA-DE-AÇÚCAR
TRANSFORMADA
A construção pAHCaneCPI-1C contendo uma cauda de histidinas na região C-
terminal do gene da CaneCPI-1 foi feita para possibilitar a posterior purificação da
proteína recombinante superexpressa a partir das folhas da cana-de-açúcar
transformada. Foi selecionada uma cana-de-açúcar transformada com um maior nível de
expressão da proteína CaneCPI-1 (esta denominada
HIS
CaneCPI-1) para ser utilizada na
purificação.
Plantas com aproximadamente nove meses já cultivadas em vasos com terra
foram utilizadas para a extração da proteína recombinante.
44
3.8.1. Extração e Purificação da
HIS
CaneCPI-1
Para a extração da proteína
HIS
CaneCPI-1 a partir das folhas da cana-de-açúcar
transgênica, foram coletados 10g de folhas da planta transformada selecionada e da
planta não transformada e estas foram maceradas em nitrogênio líquido com a ajuda de
pistilo e homogeneizados em 30ml de solução contendo 0.15M NaCl e mantidos
durante 12 horas a 4°C. A mistura foi centrifugada durante 20 minutos, 10.000g a 4°C.
O sobrenadante derivado da planta transformada foi precipitado com acetona 50% v/v e
centrifugado durante 10 minutos, 10.000g a 4°C. O precipitado, contendo todas as
proteínas solúveis da planta transformada, foi ressuspendido em 10ml de tampão
contendo 10mM Tris-HCl, 50mM NaH
2
PO
4
e 50mM NaCl, pH 8 (ROE, 2001).
A proteína recombinante foi purificada como descrito em SOARES-COSTA et
al., 2002. A
HIS
CaneCPI-1 foi purificada da fração solúvel do extrato bruto de folhas por
cromatografia de afinidade utilizando uma coluna contendo resina de níquel Ni-NTA
Superflow (Qiagen). Como a proteína foi expressa em fusão com uma “cauda” de
histidinas (6XHIS) contida no oligonucleotídeo e considerando que resíduos de
histidina têm afinidade pelo níquel, foi possível a purificação em etapa única neste
procedimento. Para a posterior eluição da
HIS
CaneCPI-1 utilizou-se o imidazol, por este
ter maior afinidade aos íons de níquel quando comparado à histidina.
A coluna foi montada em uma seringa com 5ml de resina de níquel empacotada
e mantida à temperatura ambiente. Inicialmente, a coluna foi lavada com água mili-Q
(Millipore) com a passagem de 3 vezes o volume da resina e depois equilibrada com 3
volumes de tampão 10mM Tris-HCl, 50mM NaH
2
PO
4
e 50mM NaCl, pH 8. Em
seguida foi passado o extrato bruto das folhas da planta transformada e novamente
foram passados 3 volumes de tampão. Após esta etapa, iniciou-se a eluição da proteína
45
com a passagem de tampões contendo concentrações crescentes de imidazol. O primeiro
tampão continha 10mM de imidazol, o segundo 25mM de imidazol, o terceiro 50mM de
imidazol, o quarto 75mM de imidazol, o quinto 100mM de imidazol e o sexto tampão
continha 250mM de imidazol. As etapas de purificação foram analisadas em SDS-
PAGE 15%.
Após a eluição, a proteína foi submetida a diálise utilizando membrana
SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing 3,500MWCO (PIERCE n.catal. 68035). Nesta
membrana foi colocada a proteína purificada e esta foi submersa em tampão contendo
10mM Tris-HCl e 50mM NaCl, pH 8, durante 12 horas a 4°C sob agitação, para a
retirada do imidazol. A concentração da proteína foi determinada pelo método de
Bradford (1976).
3.8.2. Análise de Western blotting da
HIS
CaneCPI-1
Para confirmar a purificação da proteína
HIS
CaneCPI-1 foi feita uma análise de
Western blotting. Para esta análise, quantidades iguais de amostras de proteínas (60µg)
provenientes do extrato bruto das folhas da planta não-transformada e da planta
transformada e 0.4µg de proteína
HIS
CaneCPI-1 purificada das folhas foram separadas
em SDS-PAGE 15% e transferidas para membrana de PVDF Invitrolon
TM
(Invitrogen),
em tampão de transferência contendo 20mM Tris, 50mM Glicina e 165ml de metanol,
em um volume final de 975ml. A membrana foi bloqueada em tampão TBS 1X (50 mM
Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl), com 5% de leite desnatado. Após 12 horas a 4°C, a
membrana foi lavada 4X em TBS 1X e incubada com anticorpo específico anti-
CaneCPI-1 com diluição de 1:3000 e lavada novamente com TBS. Em seguida a
membrana foi incubada com anti-mouse IgG AP-labeled (Sigma) com diluição de
46
1:10000. As bandas de proteínas que reagiram com os anticorpos foram reveladas
utilizando o Kit AP Conjugate Substrate (Bio-Rad).
3.8.3.Ensaio de atividade da proteína
HIS
CaneCPI-1
Para verificar a atividade inibitória da
HIS
CaneCPI-1 após a purificação da
proteína das folhas da cana-de-açúcar transgênica, realizou-se um teste de inibição
contra uma cisteíno-protease. O ensaio de atividade foi realizado em colaboração com a
Prof. Dra. Adriana K. Carmona da UNIFESP (São Paulo).
Para este ensaio de atividade foi utilizada a cisteíno-protease humana catepsina
L (Calbiochem) e o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-MCA (Calbiochem). A medida
foi realizada em cubeta de quartzo mantida em compartimento aquecido a 37°C e foi
ensaiada pela adição do substrato a enzima, utilizando o espectrofluorímetro HITACHI-
2000 com comprimentos de onda de excitação e emissão de 380 e 460nm,
respectivamente.
Foram adicionados na cubeta de quartzo, 100mM de tampão acetato de sódio pH
5.5, 1mM de dithioerithreitol (DTE) e 0.3nM de catepsina L e incubados 5 min a 37°C.
Após este período, foi adicionado 0.01mM do substrato Z-Phe-Arg-MCA e após 5 min
de incubação foi adicionado 5nM do inibidor
HIS
CaneCPI-1. Assim, foi determinada a
atividade hidrolítica residual da enzima após a adição do inibidor.
47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Como o objetivo principal deste trabalho é a obtenção de uma cana-de-açúcar
transgênica resistente a insetos utilizando como transgene um inibidor de cisteino-
protease, é de fundamental importância saber qual tipo de enzimas alvo estão presentes
no trato digestivo do inseto Sphenophorus levis. Assim, foram realizados experimentos
relacionados à purificação parcial das enzimas do Sphenophorus levis. Estes
experimentos fazem parte do projeto de pós-doutorado da Dra. Andrea Soares Costa.
Foi realizado com a proteína CaneCPI-1 um ensaio de atividade inibitória contra
as proteases do trato digestivo de Sphenophorus levis e esta demonstrou boa capacidade
inibitória sobre as proteases deste inseto. A CaneCPI-1 inibiu por completo a atividade
das proteases com uma constante de inibição de 3.9 nM. Este dado pode ser mais um
indicativo de que a proteína CaneCPI-1 pode ser utilizada na produção de uma cana-de-
açúcar transgênica resistente a insetos, especificamente ao Sphenophorus levis.
4.1. CONSTRUÇÃO DOS VETORES DE EXPRESSÃO
A fase aberta de leitura do gene que codifica a proteína CaneCPI-1 foi
amplificada através de uma reação de PCR. O molde utilizado foi o vetor
pET28canecys, que continha o gene da CaneCPI-1.
Foram construídos dois vetores de expressão, em que em um deles o gene da
CaneCPI-1 estava na sua forma original (pAHCaneCPI-1A) e no outro vetor o gene da
48
CaneCPI-1 foi fusionado a uma seqüência de seis histidinas (pAHCaneCPI-1C), para
posterior purificação da proteína recombinante.
Os produtos das amplificações da proteína CaneCPI-1, utilizando os
oligonucleotídeos específicos para cada construção, resultaram em dois fragmentos de
aproximadamente 320pb (figura 9). Os resultados das amplificações são mostrados a
seguir:
Figura 9. Amplificação do gene da CaneCPI-1 a partir do plasmídeo pET28canecys. Legendas: L: Ladder
1Kb; A: fragmento amplificado para a construção pAHCaneCPI-1A; C: fragmento amplificado para a
construção pAHCaneCPI-1C, com aproximadamente 320pb.
Nas reações de amplificação, em cada oligonucleotídeo foi inserido um sítio de
restrição para a enzima BamHI, para facilitar a subclonagem destes fragmentos no vetor
de expressão pAHC17. Após as amplificações, os fragmentos foram clivados com a
enzima BamHI e purificados.
O vetor pAHC17 possui um único sítio de clivagem para a enzima BamHI. Este
plasmídeo foi clivado com a enzima BamHI, linearizando (figura 10).
500pb
250pb
320
p
b
LAC
49
Figura 10. Clivagem do plasmídeo pAHC17 com a enzima de restrição BamHI. L: Ladder 1Kb; 1:
pAHC17 não clivado; 2: pAHC17 clivado e linearizado.
Após clivagem dos fragmentos estes foram purificados e subclonados no
plasmídeo pAHC17 clivado com a mesma enzima formando os vetores denominados
pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1B. Esses vetores quando digeridos com a enzima de
restrição BamHI, que flanqueia as construções, liberaram, cada um, um fragmento de
320pb, confirmando o sucesso da subclonagem (figura 11). Nota-se que o fragmento
clivado da construção pAHCaneCPI-1C apresenta-se com um tamanho maior, de alguns
pares de bases, pela presença da cauda de histidinas neste amplificado.
L 1 2
5000pb
5267
p
b
50
Figura 11. Análise por restrição dos plasmídeos pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C. L: Ladder 1Kb;
A1 e A2: pAHCaneCPI-1A
clivado com a enzima BamHI gerando um fragmento de aproximadamente
320pb; C1 e C2: pAHCaneCPI-1C clivado com a enzima BamHI gerando um fragmento de
aproximadamente 320pb.
Os vetores com resultados positivos na análise de restrição foram submetidos ao
sequenciamento para verificar a integridade dos genes e se estes estavam em sua correta
direção.
A figura 12 mostra um alinhamento obtido a partir das seqüências do gene
CaneCPI-1 e das construções pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C, confirmando
integridade do gene da CaneCPI-1 no vetor pAHC17.
250pb
500pb
5000pb
LA1A2C1C2
320
p
b
51
Figura 12. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da ORF CaneCPI-1 e das construções
pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C, confirmando integridade do gene da canacistatina no vetor
pAHC17. Em vermelho a ORF, e em azul a seqüência do plasmídeo pAHC17.
52
4.2. OBTENÇÃO DOS CALOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Neste trabalho foram utilizados calos embriogênicos de cana-de-açúcar da
variedade SP80-185.
Inicialmente, plântulas de cana-de-açúcar com aproximadamente 30cm foram
utilizadas para a obtenção dos calos embriogênicos. Estes toletes foram seccionados em
e os palmitos inoculados (figura 13) em meio de cultura CI-3, acrescido de antibiótico
para evitar contaminações. Estes palmitos foram mantidos em sala de crescimento, por
trinta dias, quando a primeira repicagem foi realizada. Os mesmo foram repicados a
cada três semanas.
Figura 13. Palmito de cana-de-açúcar recém inoculado em meio de cultura contendo antibiótico.
53
A figura 14 mostra explantes com duas semanas em meio de cultura com
antibiótico e a formação inicial dos calos.
Figura 14. Calos da cana-de-açúcar apresentando formação inicial de calos embriogênicos após trinta
dias.
Após quatro repicagens, foram selecionados os calos embriogênicos, com cerca
de 19 semanas. Estes calos foram utilizados no bombardeamento de micropartículas de
tungstênio contendo o DNA de interesse, ou seja, gene da CaneCPI-1.
54
4.3. BOMBARDEAMENTO DOS CALOS EMBRIOGÊNICOS DE CANA-DE-
AÇÚCAR
Para o bombardeamneto dos calos embriogênicos de cana-de-açúcar foram
necessários 10µg de DNA plasmidial.
Os plasmídeos foram precipitados em partículas de tungstênio, acrescidos de
espermidina, cloreto de cálcio e do plasmídeo pHA9, que contém o gene de resistência
ao antibiótico geneticina. Foi utilizada a técnica de co-bombardeamento, modificada, de
Klein et al. (1988a,b).
Após o bombardeamento, os calos foram transferidos para uma placa de Petri
contendo meio CI-3 sem seleção para regeneração dos calos. Após 10 dias para a
regeneração, os calos foram transferidos para um novo meio de cultura CI-3 contendo o
antibiótico geneticina para seleção. Estes calos foram mantidos em sala de crescimento
em um fotoperíodo de 12 horas a temperatura de 24ºC ±2ºC para a regeneração dos
calos transformantes.
A geneticina é um eficiente agente seletivo para ser usado na transformação
genética de cana-de-açúcar. Em relação aos outros antibióticos, a geneticina é o
antibiótico ideal para monocotiledôneas, pois não interfere na regeneração, sendo eficaz
como agente seletivo nos estágios iniciais (NEHRA, et al., 1994).
55
A figura 15 mostra os calos de cana-de-açúcar após o bombardeamento.
Figura 15. Calos de cana-de-açúcar bombardeados em meio de cultura contendo antibiótico e mantidos
em sala de crescimento com fotoperíodo de 12h a 24ºC.
Estes calos sofreram trocas regulares de meio de cultura a cada duas semanas e,
após seis semanas, os calos foram transferidos para meio de cultura de regeneração. Os
calos foram mantidos neste meio de cultura por trinta dias em sala de crescimento em
um foto período de 12 horas a temperatura de 24ºC ±2ºC.
A figura 16 mostra os calos em fase de regeneração em placa de Petri.
56
Figura 16. Calos de cana-de-açúcar regenerados em meio de seleção com hormônio indutor de
crescimento
Os calos embriogênicos de cana-de-açúcar mostraram ser muito eficientes como
tecidos alvos para a transformação genética da cana-de-açúcar, facilitando a seleção dos
calos transformados através do antibiótico geneticina e apresentando uma boa
freqüência de regeneração, estando de acordo com Birch et al., 1995.
Regeneraram calos provenientes das doze placas de Petri bombardeadas
inicialmente, sendo seis placas bombardeadas para cada vetor de expressão. Para se ter
um controle dos eventos de transformação, os calos regenerados foram nomeados de
acordo com a placa de origem para identificação dos eventos de bombardeamento e
mantidos separadamente. Neste trabalho foi utilizada uma nomeclatura simplificada
para descrever as plantas regeneradas, porém, o controle interno dos eventos foi
mantido. Assim, é possível saber exatamente qual o evento em que a planta
transformada pertence.
57
Os calos embriogênicos resistentes ao antibiótico geneticina originaram plantas
possivelmente transformadas. Estas plantas foram selecionadas através do antibiótico
contido no meio de cultura e colocadas em tubetes com o mesmo meio de cultura e com
o mesmo antibiótico. Observa-se que as plantas regeneradas dos calos bombardeados
possivelmente são as plantas transformadas com o gene da CaneCPI-1 e o plasmídeo
pHA9 que contém o gene de resistência à geneticina.
As plantas regeneradas em tubetes de vidros podem ser observadas na figura 17.
Figura 17. Plantas regeneradas de cana-de-açúcar da variedade SP80-185 em tubetes de vidro.
Estas plantas permaneceram no meio de cultura com agente seletivo e após três
meses, foram obtidas as primeiras plantas com raiz. Estas plantas enraizadas
possibilitaram a coleta de pequenos pedaços de folhas para a extração de DNA e análise
58
da integração do gene da CaneCPI-1 no genoma da planta. Na figura 18 pode-se
observar as plantas regeneradas em tubetes contendo meio de cultura seletivo.
Figura 18. Plantas que sofreram seleção com antibiótico, enraizada em meio de cultura contendo indutor
de crescimento.
Plantas não transformadas, que não sofreram bombardeamento, foram utilizadas
como controle. Essas plantas passaram pelos mesmos processos de regeneração que as
plantas transformadas e possuem a mesma idade.
59
4.4. SELEÇÃO DAS PLANTAS TRANSFORMADAS
As plantas que regeneraram e cresceram no meio de seleção contendo o
antibiótico geneticina foram consideradas transformadas. Porém, esta análise visual não
é suficiente para confirmar que estas plantas foram transformadas com o gene da
CaneCPI-1. Após o bombardeamento, o DNA de interesse introduzido via
micropartículas poderá estar integrado ao genoma das plantas ou não. Após inúmeras
divisões celulares, a permanência do agente marcador de seleção caracterizará um
elemento de transformação positiva. Caso contrário, o tecido que foi submetido ao
processo de bombardeamento ao passar pelo processo de seleção química, por exemplo,
resistência a antibióticos, não será viável, vindo a perecer no processo de multiplicação.
Entretanto, a simples passagem pelo processo de seleção não é indicador de
transgenicidade, termo que se refere à célula que teve o DNA exógeno integrado ao
genoma.
Para confirmação da integração do gene da CaneCPI-1 no genoma das plantas
transformadas é necessário utilizar técnicas de biologia molecular, como a reação de
amplificação por PCR e/ou Southern Blotting.
Foram construídos dois vetores de expressão contendo o gene da CaneCPI-1, em
que um deles continha a proteína na sua forma original (pAHCaneCPI-1A) e o outro
com o gene da CaneCPI-1 fusionado a uma seqüência de seis histidinas (pAHCaneCPI-
1C). Para análise da presença destes vetores nas plantas, foram extraídos os DNAs
genômicos das plantas transformadas e não-transformadas para posterior análise por
PCR. Entre as plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A, um total de vinte e
cinco plantas regeneraram em meio de seleção com antibiótico e foram selecionadas
60
para análise de PCR Destas 25, vinte e três amplificaram um fragmento de tamanho
esperado de 520pb (figura 19).
Figura 19. Análise da presença da CaneCPI-1 dirigida pelo promotor Ubi-1 nos possíveis transformantes.
Gel de agarose 1% mostrando produtos amplificados a partir de amostras de DNA de folhas de cana-de-
açúcar transformada com a construção pAHCaneCPI-1A. M: Ladder 1kb; coluna 1 a 25: plantas
selecionadas; W: planta não-transformada; C+: controle positivo (pAHCaneCPI-1A); C-: controle
negativo.
O fragmento amplificado a partir do DNA das plantas teve um tamanho
aproximado de 520pb, sendo 200pb correspondentes ao promotor da ubiquitina do
milho (Ubi1) e 320pb correspondentes ao gene da CaneCPI-1. Plantas não
transformadas foram utilizadas como controle e nas reações não apresentaram banda de
amplificação.
As plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C também foram
regeneradas e selecionadas para análise de PCR. Entre as plantas transformadas com
este vetor, um total de dezesseis plantas regeneraram em meio de seleção com
antibiótico. Destas dezesseis, quinze amplificaram um fragmento de tamanho esperado
de 520pb (figura 20). Plantas não transformadas foram utilizadas como controle e não
apresentaram banda de amplificação.
500pb
61
Figure 20. Análise da presença da CaneCPI-1 dirigida pelo promotor Ubi-1 nos possíveis transformantes.
Gel de agarose 1% mostrando produtos amplificados a partir de amostras de DNA de folhas de cana-de-
açúcar transformadas, construção pAHCaneCPI-1C. M: Ladder 1kb; coluna 1 a 16: plantas selecionadas;
W: planta não-transformada; C+: controle positivo (pAHCaneCPI-1C); C-: controle negativo.
Após seleção das plantas transformadas e confirmação da integração do vetor
contendo o gene da CaneCPI-1 sob controle do promotor da ubiquitina do milho no
genoma das plantas, as canas-de-açúcar que apresentaram um produto de amplificação
de 520pb foram selecionadas e transferidas para vasos em casa de vegetação, durante
um período de três meses para o desenvolvimento e crescimento das plantas. Após este
período, as plantas que melhor se desenvolveram foram selecionadas para análise de
expressão gênica. Para a análise de expressão é necessário que as canas já estejam mais
desenvolvidas para possibilitar a coleta de folhas dessas plantas.
A figura 21 mostra as canas-de-açúcar transgênicas que foram analisadas por
PCR e selecionadas para crescerem em casa de vegetação.
500pb
62
Figura 21. Canas-de-açúcar transformadas com o gene da CaneCPI-1. Plantas que foram regeneradas,
selecionadas, analisadas por PCR e transferidas para casa de vegetação, com aproximadamente 6 meses
de idade.
4.5. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA CANECPI-1 NAS PLANTAS
TRANSGÊNICAS
As plantas selecionadas e crescidas em casa de vegetação foram submetidas à
análise da expressão gênica da CaneCPI-1 e do controle endógeno poliubiquitina.
A análise foi realizada através da obtenção de transcritos para a CaneCPI-1 e
poliubiquitina por RT-PCR e quando amplificados apresentaram um produto de
amplificação de tamanho esperado para estes genes. Através da técnica de PCR Semi-
quantitativo, foi possível a análise da expressão da CaneCPI-1 nas canas-de-açúcar
transgênicas. A análise foi realizada nas plantas transformadas com o vetor
pAHCaneCPI-1A, nas plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C e nas
63
plantas não- transformadas, possibilitando detectar uma expressão diferencial entre estas
plantas.
Para esta análise de PCR Semi-quantitativo foram realizadas amplificações
utilizando o cDNA como molde e os oligonucleotídeos específicos para o gene da
CaneCPI-1 nas duas construções. Para o controle endógeno foi utilizado o mesmo
cDNA sintetisado para amplificação da CaneCPI-1 como molde para a amplificação da
poliubiquitina. Para a amplificação da poliubiquitina foram utilizados os
oligonucleotídeos específicos para este gene. O resultado da amplificação da
poliubiquitina mostrou que a expressão deste gene foi similar entre as plantas
transformadas (T) e não-transformadas (NT), apresentando níveis de transcritos
similares nos tecidos de folhas. O gene da Poliubiquitina mostrou ser um bom controle
endógeno para análises de PCR Semi-quantitativo, estando de acordo com os resultados
obtidos por PAPINI-TERZI, et al. (2005).
Nas plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A
observou-se que o
gene da CaneCPI-1 apresentou uma maior expressão nestas plantas quando comparadas
com a planta não transformada, mostrando que o gene da CaneCPI-1 deve estar sendo
mais expresso nas plantas transformadas.
A figura 22 mostra o resultado do PCR Semi-quantitativo realizado com as
plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1A. As plantas que apresentaram
maior nível de expressão foram as plantas 2, 5, 8, 15 e 21.
64
Figura 22. Análise por PCR Semi-quantitativo das plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A.
Fotografias de géis de agarose 1% mostrando produtos de amplificação por PCR a partir de amostras de
RNA de folhas de canas-de-açúcar de plantas não transformadas e plantas transformadas com a
construção pAHCaneCPI-1A. CaneCPI-1: amplificação utilizando oligonucleotídeos específicos para
CaneCPI-1 gerando um fragmento de 320pb: NT (planta não transformada), T (plantas transformadas - 2,
5, 8, 15 e 21). Poliubiquitina: amplificação utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene da
poliubiquitina gerando um fragmento de 250pb: NT (planta não transformada), T (planta transformada).
M: Ladder 1kb; diluições de RT-PCR (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64).
Nas plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C, que possui uma cauda
de histidinas no C-terminal,
observou-se que o gene da CaneCPI-1 também apresentou
uma maior expressão nestas plantas em relação à planta não transformada, novamente
mostrando que o gene da CaneCPI-1 deve estar superexpresso nas plantas
transformadas com este vetor.
CaneCPI-1
Poliubiquitina
65
A figura 23 mostra o resultado do PCR Semi-quantitativo realizado com as
plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C. As plantas que apresentaram
maior nível de expressão foram as plantas 1, 4, 9 e 12.
Figura 23. Análise por PCR Semi-quantitativo das plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C.
Fotegrafia de géis de agarose 1% mostrando produtos da amplificação por PCR a partir de amostras de
RNA de folhas de canas-de-açúcar de plantas não-transformadas e plantas transformadas com a
construção pAHCaneCPI-1C. CaneCPI-1: amplificação utilizando oligonucleotídeos específicos para
CaneCPI-1 gerando um fragmento de 320pb: NT (planta não transformada), T(plantas transformadas - 1,
4, 9, 12); Poliubiquitina: amplificação utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene da ubiquitina
gerando um fragmento de 250pb: NT (planta não-transformada), T(planta transformada). M: Ladder 1kb;
diluições de RT-PCR (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64).
CaneCPI-1
Poliubiquitina
66
De acordo com as reações de amplificação realizadas com as diluições dos
cDNAs (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64) foi possível detectar maior expressão da
CaneCPI-1 nas plantas transformadas com as construções pAHCaneCPI-1A e
pAHCaneCPI-1C quando comparadas as plantas não transformadas (controle negativo)
que apresentaram menor expressão nas mesmas diluições. Assim, observa-se que a
CaneCPI-1 possui um maior grau de expressão nas plantas transgênicas em relação à
planta selvagem que possui uma baixa expressão da CaneCPI-1 endógena. Além disso,
nota-se que a poliubiquitina teve expressão similar entre as plantas transformadas e não-
transformadas, comprovando que o bombardeamento do gene da CaneCPI-1 não afetou
os genes endógenos da planta. Este fato também pode ser observado visualmente, pois
as plantas transformadas não apresentam nenhuma modificação morfológica, pelo
menos até o presente momento, quando possuem 15 meses.
As plantas transformadas e analisadas pelo PCR Semi-quantitativo apresentando
maior expressão foram selecionadas para a realização dos experimentos de
immumodetecção da proteína CaneCPI-1 em seus tecidos.
Entre as plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1A, os clones
selecionados para realização de experimentos com imunodetecção foram 2, 5, 8, 15 e
21. Entre as plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C, os clones
selecionados para os experimentos de imunodetecção foram 1, 4, 9 e 12. A maioria
destas plantas são provenientes de eventos de bombardeamentos diferentes.
67
4.6. ANÁLISE DE WESTERN BLOTTING DA CaneCPI-1 NAS PLANTAS
TRANSGÊNICAS
As plantas transformadas que foram selecionadas pelo método de PCR Semi-
quantitativo foram utilizadas para análise de imunodeteccão da proteína CaneCPI-1 nos
tecidos destas plantas e das plantas não-transformadas. Foram realizados testes de
imunodetecção utilizando folhas e raízes das canas-de-açúcar.
Folhas e raízes das plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A (plantas
2, 5, 8, 15 e 21) e das transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C (plantas 1, 4, 9 e 12)
e também folhas e raízes de plantas não-transformadas foram coletadas e utilizadas para
a extração de proteínas.
Utilizando o anticorpo policlonal gerado contra a proteína CaneCPI-1, foi
possível a detecção da proteína recombinante e da proteína endógena e recombinante
nos tecidos das folhas e raízes das plantas transformadas e não-transformadas. O
anticorpo mostrou-se eficiente reconhecendo as bandas de proteínas de tamanho
esperado de 13kDa. O anticorpo anti-CaneCPI-1 também foi específico, não
reconhecendo outras bandas na membrana. A CaneCPI-1 foi uniformemente detectada
nos tecidos de folhas e raízes de cana-de-açúcar.
Um SDS-PAGE 15% contendo amostras de proteínas extraídas dos tecidos das
canas-de-açúcar foi realizado em paralelo ao Western blotting para mostrar que
quantidades similares de proteínas foram utilizadas para a imunodetecção da CaneCPI-1
nos tecidos das plantas transformadas e não transformadas.
A figura 24 mostra o ensaio de Western blotting realizado com as folhas das
plantas que foram transformadas com a construção pAHCaneCPI-1A e a figura 25
mostra o ensaio de Western blotting realizado com as folhas das plantas que foram
68
transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C. Os mesmos ensaios foram
realizados com o anticorpo anti-poliubiquitina para detectar a expressão da proteína
Poliubiquitina nos tecidos de folhas das plantas não transformadas e transformadas.
Figura 24 mostrando a análise de Western blotting realizada com as folhas das
plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1A.
Figura 24. Imunodetecção da CaneCPI-1 em folhas de canas-de-açúcar. Western blotting do extrato bruto
de folhas de canas-de-açúcar não transformadas e transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A. (A)
Aproximadamente, 60µg de proteína foram extraídas de folhas e separadas em SDS-PAGE 15%,
mostrando que foram utilizadas quantidades similares de proteínas na imunodetecção, (B) Proteínas
transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-CaneCPI-1. M:
marcador de peso molecular; R: Proteína CaneCPI-1 recombinante, expressa em E.coli e purificada; NT:
extrato bruto de plantas não transformadas; 2: extrato bruto da planta transformada 2; 5: extrato bruto da
planta transformada 5; 8: extrato bruto da planta transformada 8; 15: extrato bruto da planta transformada
15 e 21: extrato bruto da planta transformada 21.
kDa
(A)
(B)
13kDa
13kDa
69
A figura 25 mostra a análise de Western blotting realizada com as folhas das
plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C.
Figura 25. Imunodetecção da CaneCPI-1 em folhas de canas-de-açúcar. Western blotting do extrato bruto
de folhas de canas-de-açúcar não transformadas e transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C. (A)
Aproximadamente, 60µg de proteína foram extraídas de folhas e separadas em SDS-PAGE 15%,
mostrando que foram utilizadas quantidades similares de proteínas na imunodetecção, (B) Proteínas
transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-CaneCPI-1. M:
marcador de peso molecular; R: Proteína CaneCPI-1 recombinante, expressa em E.coli e purificada; NT:
extrato bruto de plantas não-transformadas; 1: extrato bruto da planta transformada 1; 4: extrato bruto da
planta transformada 4; 9: extrato bruto da planta transformada 9 e 12: extrato bruto da planta
transformada 12.
kDa
(A)
(B)
13kDa
13kDa
70
A figura 26 mostra a análise de Western blotting realizada com as raízes das
plantas transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C.
Figura 26. Imunodetecção da CaneCPI-1 em raízes de canas-de-açúcar. Western blotting do extrato bruto
de raízes de canas-de-açúcar não transformadas e transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C. (A)
Aproximadamente, 60µg de proteína foram extraídas de raízes e separadas em SDS-PAGE 15%,
mostrando que foram utilizadas quantidades similares de proteínas na imunodetecção, (B) Proteínas
transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-CaneCPI-1. M:
marcador de peso molecular; R: Proteína CaneCPI-1 recombinante, expressa em E.coli e purificada; NT:
extrato bruto de plantas não-transformadas; 1: extrato bruto da planta transformada 1; 4: extrato bruto da
planta transformada 4; 9: extrato bruto da planta transformada 9 e 12: extrato bruto da planta
transformada 12.
Embora a intensidade das bandas detectadas tenha sido menor quando
comparada com a banda da proteína recombinante, os anticorpos provaram ser
específicos e permitiram a verificação da expressão da CaneCPI-1 na planta
transformada. Vale ressaltar que tentamos utilizar anticorpos contra a cauda de
Histidinas em experimentos de Western blotting. No entanto, estes experimentos não
(A)
kDa
15
20
R NT 1 4 9 12
M R NT 1 4 9 12
13kDa
13kDa
(B)
71
foram bem sucedidos. As análises com estes anticorpos poderiam mostrar a expressão
apenas da proteína recombinante, excluindo o sinal da CaneCPI-1 endógena.
4.6.1. Produção de anticorpos policlonais contra a proteína poliubiquitina
O produto de amplificação do gene da poliubiquitina a partir do clone
pSPORTST2001 resultou em um fragmento de aproximadamente 250pb. O resultado da
amplificação é mostrado na figura 27.
Figura 27. Amplificação do gene da poliubiquitina a partir do plasmídeo pPORTST2001. L: Ladder 1Kb;
1: fragmento amplificado com aproximadamente 250pb.
O produto da amplificação foi purificado e subclonado no plasmídeo de
propagação pTZ57R/T (Fermentas). O plasmídeo recombinante foi denominado de
pTZST2001. Nos oligonucleotídeos específicos para o gene da poliubiquitina foram
inseridos sítios de clivagem para as enzimas NdeI e BamHI, facilitando a subclonagem.
250pb
500pb
L1
250
p
b
72
Após a seleção das colônias recombinates e extração do DNA plasmidial, o vetor
pTZST2001 foi seqüenciado.
Posteriormente, o plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e
BamHI, que flanqueiam a construção, liberando um fragmento de aproximadamente
250pb, confirmando a subclonagem. A figura 28 mostra a clivagem do plasmídeo
pTZST2001 com as enzimas NdeI e BamHI.
Figura 28. Clivagem do plasmídeo pTZST2001 com as enzimas de restrição NdeI e BamHI. L: Ladder
1Kb; 1 e 2: plasmídeos pTZST2001 clivados, liberando um fragmento de aproximadamente 250pb.
O fragmento originado da clivagem do plasmídeo pTZST2001 foi subclonado no
vetor de expressão pET28a, denominado de pETST2001. Ensaios de expressão da
proteína Poliubiquitina em E.coli foram realizados utilizando esta construção.
Os resultados da expressão da proteína Poliubiquitina em E.coli foram bem
sucedidos, pois foi observada uma banda de expressão com massa molecular de
aproximadamente 8KDa, como esperado. A análise de expressão da Poliubuquitina
pode ser observada em SDS-PAGE 15% (figura 29).
500pb
250pb
L12
250
p
b
73
Foram realizados ensaios para analisar a solubilidade da proteína Poliubiquitina.
Se a proteína estivesse solúvel, ela poderia ser purificada na sua forma nativa, porém, se
a proteína estivesse insolúvel seria necessário realizar uma purificação em condições
desnaturantes.
O teste de solubilidade mostrou que a proteína Poliubiquitina apresentou-se
insolúvel. O teste de solubilidade foi analisado em SDS-PAGE 15%, mostrado na figura
29.
Figura 29. Análise da expressão e solubilidade da proteína Poliubiquitina. SDS-PAGE 15%. M: marcador
de peso molecular; 1: pETST2001 não-induzido; 2: pETST2001 induzido; 3: fração solúvel do lisado
bacteriano; 4: fração insolúvel do lisado bacteriano.
M 1 2 3 4
kDa
20
8kDa
74
Após a verificação que a proteína Poliubiquitina encontrava-se insolúvel,
decidiu-se optar pela purificação desta proteína em condições desnaturantes, onde,
apesar da proteína não apresentar atividade biológica evidente, a purificação é simples e
realizada em um único passo. Como agente desnaturante, foi utilizada a uréia para a
purificação da proteína Poliubiquitina. A uréia é um agente desnaturante, capaz de
solubilizar proteínas a partir de corpos de inclusão.
Proteínas expressas em E. coli normalmente formam corpos de inclusão, que são
agregados protéicos insolúveis. Embora esta seja uma das barreiras para estudos
estruturais (YASUKAWA et al., 1995) a purificação de proteínas recombinantes a partir
de corpos de inclusão é relativamente fácil.
Assim, os ensaios de purificação da proteína Poliubiquitina foram realizados em
condições desnaturantes.
A purificação da proteína foi feita através de sucessivos fracionamentos
considerando algumas propriedades da proteína, como solubilidade, carga iônica, massa
molecular, ponto isoelétrico, propriedades de adsorção e especificidade de ligação a
outras moléculas. As técnicas de purificação de proteínas utilizam colunas verticais, nas
quais as amostras são colocadas nas colunas, formando duas fases, uma fixa e uma
móvel. A fase fixa é composta por uma resina ligada a um elemento imóvel e a fase
móvel é o solvente, cujo fluxo arrasta a maioria das moléculas (NELSON e COX,
2000).
O método de purificação escolhido para a proteína Poliubiquitina foi a
cromatografia de afinidade em coluna de níquel, em condições desnaturantes. Este
sistema foi eficiente para a purificação desta proteína, pois o resultado em SDS-PAGE
15% mostrou que a proteína ligou-se à resina e foi possível sua eluição na fração
75
coletada em 250mM de imidazol (figura 30). Observa-se na figura uma banda de
aproximadamente 8kDa correspondente à proteína Poliubiquitina purificada.
Figura 30. Análise da expressão, solubilidade e purificação da proteína Poliubuquitina em condições
desnaturantes. SDS-PAGE 15%. M: marcador de peso molecular; 1: pETST2001 não-induzido; 2:
pETST2001 induzido; 3: fração insolúvel do lisado bacteriano; 4: fração solúvel do lisado bacteriano; 5:
fração insolúvel do lisado bacteriano após tratamento com uréia; 6: fração solúvel do lisado bacteriano
após tratamento com uréia; 7: proteína Poliubiquitina purificada.
Após a purificação, foram realizadas quatro diálises com a proteína
Poliubiquitina para a retirada do imidazol e da uréia, possibilitando a renaturação da
proteína.
O rendimento da purificação da Poliubiquitina foi em torno de 2mg de proteína
por litro de cultura. Os resultados da purificação da Poliubiquitina obtidos foram
satisfatórios, pois foi possível purificar a proteína em quantidade suficiente para a
produção de anticorpos policlonais contra esta proteína.
M 1 2 3 4 5 6 7
20
kDa
8kDa
76
Após a produção do anticorpo anti-poliubiquitina, foi realizado um teste para
verificar se o anticorpo estava ativo e se era específico à proteína Poliubiquitina. Para
este teste foram utilizados o vetor pET28a sem inserto, o plasmídeo pETST2001 e a
proteína recombinate purificada. Os vetores pET28a e pETST2001 foram transformados
em células de E. coli Rosetta (DE3) e foram induzidos com 0.4mM de IPTG durante 4
horas com 200rpm de rotação a 37°C. O vetor pET28a sem inserto foi utilizado para
comprovar que o anticorpo não reconhece nenhuma proteína endógena da bactéria.
Quantidades iguais das culturas induzidas e não induzidas dos plasmídeos
pET28a e pETST2001 e 0.3µg da proteína Poliubiquitina pura foram separadas em
SDS-PAGE 15% e transferidas para membranas de PVDF Invitrolon
TM
(Invitrogen). A
membrana foi incubada com anticorpo específico anti-poliubiquitina e o anticorpo
mostrou ser capaz de detectar a proteína Poliubiquitina de peso molecular aproximado
de 8kDa.
O anticorpo demonstrou ser específico, porém como a proteína Poliubiquitina é
uma proteína formada por várias moléculas de ubiquitina, o anticorpo reconheceu outras
bandas correspondentes a poliubiquitinas no extrato da bactéria. A figura 31 mostra o
resultado da análise de Western blotting realizado com o anticorpo policlonal anti-
poliubiquitina.
77
Figura 31. Imunodetecção teste da Poliubiquitina expressa em E. coli. A figura mostra a imunodetecção
da Poliubiquitina utilizando o anticorpo policlonal anti-poluibiquitina. (A) Quantidades iguais das frações
induzidas e não induzidas dos plasmídeos e 0.3µg da proteína ST2001purificada foram separadas em
SDS-PAGE 15%, (B) Proteínas transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpo policlonal
anti-poliubiquitina. M: marcador de peso molecular; 1: pETST2001 não induzido; 2: pETST2001
induzido; 3: pET28a não induzido; 4: pET28a induzido; R: proteína ST2001 recombinante purificada.
10
kD
a
1 2 3 4
R
20
15
M 1 2 3 4 R
8kDa
(B)
(A)
8kDa
78
Após verificar que o anticorpo era específico para a proteína Poliubiquitina,
foram realizadas análises de Western blotting para detectar a expressão da
Poliubiquitina nos extratos brutos das folhas das canas-de-açúcar transgênicas.
O anticorpo anti-poliubiquitina mostrou ser específico contra esta proteína,
reconhecendo as bandas de peso molecular esperado de aproximadamente 8kDa. Porém,
como a Poliubiquitina é uma proteína formada de várias moléculas de ubiquitina, ela é
capaz de formar polímeros de diferentes tamanhos e moléculas de ubiquitina, com pesos
moleculares diferentes. Assim, o anticorpo além de reconhecer a Poliubiquitina de
tamanho esperado, também reconheceu bandas na membrana referentes a estes
diferentes polímeros de Poliubiquitina. Pode-se concluir que neste experimento de
Western blotting, não foi possível utilizar a proteína Poliubiquitina como controle
endógeno, pois a proteína não foi detectada em uma banda única e definida. Desta
forma, utilizamos apenas a análise por PCR Semi-quantitativo para comparação entre a
expressão gênica da CaneCPI-1 e Poliubiquitina nas diferentes plantas transformadas e
não-transformadas.
A figura 32 mostra o ensaio de Western blotting realizado com plantas que
foram transformadas com a construção pAHCaneCPI-1A, utilizando o anticorpo anti-
poliubiquitina.
79
Figura 32. Imunodetecção da Poliubiquitina em folhas de canas-de-açúcar. Western blotting do extrato
bruto de folhas de canas-de-açúcar não transformadas e transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A.
Proteínas transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-poliubiquitina.
R: Proteína Poliubuquitina recombinante, expressa em E.coli e purificada; NT: extrato bruto de planta não
transformada; 2: extrato bruto da planta transformada 2; 5: extrato bruto da planta transformada 5; 8:
extrato bruto da planta transformada 8; 15: extrato bruto da planta transformada 15 e 21: extrato bruto da
planta transformada 21.
A figura 33 mostra o ensaio de Western blotting realizado com plantas que
foram transformadas com a construção pAHCaneCPI-1C, utilizando o anticorpo anti-
poliubiquitina
Figura 33. Imunodetecção da Poliubiquitina em folhas de canas-de-açúcar. Western blotting do extrato
bruto de folhas de canas-de-açúcar não transformadas e transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1C.
Proteínas transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-poliubiquitina.
R: Proteína Poliubuquitina recombinante, expressa em E.coli e purificada; NT: extrato bruto de planta
não-transformada; 1: extrato bruto da planta transformada 1; 4: extrato bruto da planta transformada 4; 9:
extrato bruto da planta transformada 9 e 12: extrato bruto da planta transformada 12.
R NT 2 5 8 15 21
8kDa
R NT 1 4 9 12
8kDa
80
4.7. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA CaneCPI-1 A PARTIR DA CANA-DE-
AÇÚCAR TRANSFORMADA
Após a análise por Western blotting das plantas transgênicas foi selecionada
uma planta transformada com o vetor pAHCaneCPI-1C para extração e purificação da
proteína CaneCPI-1 fusionada a uma His-Tag (
HIS
CaneCPI-1). A planta utilizada para a
extração da proteína recombinante foi a planta 9, que apresentou maior expressão da
CaneCPI-1. Esta expressão é resultado da expressão endógena adicionada da expressão
do gene controlado pelo promotor da ubiquitina.
4.7.1. Extração e Purificação da
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da planta
Folhas de canas-de-açúcar não-transformada e transformada foram coletadas,
maceradas e ressuspendidas em tampão, como descrito em métodos. O extrato bruto da
planta transformada foi precipitado com acetona e o precipitado contendo todas as
proteínas solúveis da planta transformada foi ressupendido em tampão e purificado. O
método de purificação utilizado foi uma cromatografia de afinidade em coluna de
níquel, já que a construção pAHCaneCPI-1C contém o gene da CaneCPI-1 fusionado a
uma cauda de histidinas (6XHIS) que possui alta afinidade pelo níquel.
Ao passar pela coluna, a proteína recombinante ligada a histidina foi fixada aos
íons de níquel e as outras proteínas presentes no extrato bruto foram eluídas. Este
método de purificação foi eficiente, permitindo a eluição da proteína
HIS
CaneCPI-1 na
fração de 250mM de imidazol. O resultado do SDS-PAGE 15% revelou a presença de
uma banda de tamanho esperado para a proteína
HIS
CaneCPI-1 de 13 kDa (figura 34).
81
Figura 34: Análise da purificação da
HIS
CaneCPI-1 produzida em cana-de-açúcar transgênica. SDS-PAGE
15% corado com prata. M: marcador de peso molecular; 1: extrato bruto de folhas de cana-de-açúcar
transformada; 2: extrato bruto de folhas de cana-de-açúcar não-transformada; 3: fração eluída de 100mM
de imidazol; 4: fração eluída de 250mM de imidazol, apresentando uma banda de tamanho esperado para
a
HIS
CaneCPI-1 de 13kDa.
É possível observar no gel, na coluna 1, a presença de uma região mais escura na
altura prevista para a proteína CaneCPI-1, quando comparamos com a coluna 2, embora
não se possa afirmar com certeza que se trata da proteína em questão.
A produção da proteína
HIS
CaneCPI-1 na planta transgênica apresentou um
rendimento de aproximadamente 6mg de proteína purificada por kilograma de folhas de
cana-de-açúcar. Isto representa um bom rendimento, com cerca de 1% do total de
proteína solúvel presente nos tecidos das folhas. Acreditamos que podemos obter ainda
maiores quantidades otimizando o protocolo de extração de proteínas da folha e,
posteriormente, utilizando o caldo da cana transgênica. Outras plantas também
utilizadas como sistema de expressão produziram proteínas recombinantes com níveis
altos de acumulação de proteínas, como por exemplo, a avidina (HOOD et al., 1997) e a
82
β-glucuronidase (WITCHER et al., 1998) que foram produzidas em concentrações de 3
e 0.7% do total de proteínas solúveis, respectivamente, em sementes de milho. A
proteína lectina tem sido produzida em cana-de-açúcar transgênica com níveis de
aproximadamente 1% do total de proteínas solúveis (SÉTAMOU et al., 2002).
A utilização de plantas como sistema de expressão de proteínas heterólogas é
uma alternativa viável e eficiente. Além de produzir proteínas a níveis
consideravelmente altos, as plantas possuem outras vantagens. A primeira vantagem é o
baixo custo de produção, pois este custo já está embutido no custo do plantio da cultura
a ser utilizada como sistema de expressão. O custo adicional seria o custo de extração e
purificação, porém esta metodologia é viável de ser implantada nas indústrias e já
existem vários estudos buscando reduzir os custos de processamento das proteínas
recombinantes (TWYMAN et al., 2003). A segunda vantagem é que plantas possuem
muitas semelhanças com os mamíferos na produção de proteínas, como o uso de códons
e modificações pós-traducionais, que não são possíveis em sistemas de expressão que
utilizam organismos inferiores, como bactérias e fungos (GIDDINGS, 2001).
4.7.2. Análise de Western blotting da
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da planta
Para análise de Western blotting foi utilizado o anticorpo policlonal anti-
CaneCPI-1, produzido anteriormente em camundongo contra a proteína recombinante
produzida em E. coli. A imunodetecção da proteína CaneCPI-1 purificada a partir da
planta transgênica foi realizada para detectar a expressão e confirmar a purificação da
proteína.
As análises mostraram que o anticorpo anti-CaneCPI-1 foi capaz de detectar a
proteína CaneCPI-1 purificada a partir da planta com tamanho esperado de 13kDa
83
(figura 35). Embora a intensidade da banda detectada tenha sido baixa, o anticorpo
provou ser específico, reconhecendo somente a proteína
HIS
CaneCPI-1 e também
permitiu a verificação da expressão da proteína em plantas transformadas e não-
transformadas, embora nestas últimas a visualização na figura 35 esteja comprometida
pela perda de qualidade após aquisição da imagem por scanner.
Figure 35: Imunodetecção da
HIS
CaneCPI-1 em canas-de-açúcar. Western blotting do extrato bruto de
canas-de-açúcar não-transformadas e transformadas, e
HIS
CaneCPI-1 purificada da cana-de-açúcar
transformada. Aproximadamente, 60µg de proteína extraída das folhas das plantas e 0.4µg de proteína
HIS
CaneCPI-1 pura foram separadas em SDS-PAGE 15%, transferidas para uma membrana de PVDF e
incubada com anticorpos policlonais gerados contra a proteína CaneCPI-1 recombinante purificada. 1:
extrato bruto de folhas de cana-de-açúcar não-transformada; 2: extrato bruto de folhas de cana-de-açúcar
transformada; 3: proteína
HIS
CaneCPI-1 purificada de folhas de cana-de-açúcar transformada.
84
4.7.3. Ensaio de atividade da
HIS
CaneCPI-1 purificada a partir da planta
Como já verificado em trabalhos anteriores, a proteína CaneCPI-1 é capaz de
inibir a atividade da enzima catepsina L com uma constante de inibição (Ki) de 0.6nM
(OLIVA et al., 2004). Este ensaio de atividade é importante para confirmar se a proteína
purificada a partir das folhas da cana-de-açúcar transgênica mantém sua conformação
correta e capacidade inibitória após os processos de purificação. Além disso, confirma o
tipo da proteína purificada como sendo uma cistatina.
Foi verificado que a proteína recombinante
HIS
CaneCPI-1 foi capaz de inibir a
atividade da enzima catepsina L na mesma ordem de grandeza que aquela produzida em
E. coli (Figura 36). Baseando-se na atividade inibitória da
HIS
CaneCPI-1, pode-se
concluir que esta proteína produzida em cana-de-açúcar transgênica está em sua
conformação correta e forma ativa. Estes resultados contribuem para eleger a cana-de-
açúcar como um sistema alternativo para a expressão de proteínas heterólogas visto que
a proteína recombinante não sofreu nenhuma modificação aparente em sua estrutura que
bloqueie sua atividade.
85
Figura 36: Gráfico de inibição da
HIS
CaneCPI-1 sobre a enzima Catepsina L. Catepsina L (0.3nM) foi
ativada por incubação em 100mM de tampão acetato de sódio pH 5.5 e 1mM de DTE e sua atividade foi
determinada espectrofluoréticamente, após a adição do substrato Z-Phe-Arg-MCA. A atividade inibitória
da CanaCPI-1 expressa em E. coli e da
HIS
CaneCPI-1 purificada das folhas de uma cana-de-açúcar
transgênica foi determinada medindo-se a atividade hidrolítica residual da enzima após pré-incubação
com o inibidor.
Vale ressaltar que estudos com enzimas digestivas de alguns coleópteras
demonstraram a presença de cisteíno-proteases catepsina L-like no intestino destes
insetos (MURDOCK et al., 1987; CAMPOS et al., 1989). Sabendo-se que alguns
insetos da ordem Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar, é importante que a proteína
produzida na cana-de-açúcar transgênica não perca sua capacidade inibitória sobre a
catepsina L, pois uma cana-de-açúcar superexpressando a proteína
HIS
CaneCPI-1 poderá
ser mais resistente ao ataque destas pragas.
O Laboratório de Biologia Molecular do DGE/UFSCar, onde este trabalho foi
desenvolvido, iniciou recentemente trabalhos com o coleóptera Sphenophorus levis, o
Time (s )
0 20406080100120140
AUF
1400
1600
1800
2000
2200
2400
Control
Canecystatin
E. coli
Canecystatin
expressed
sugarcane
Controle
CaneCPI-1 –
E. col
i
CaneCPI-1 –
cana-de-açúcar
transgênica
Tempo (s)
86
qual é uma importante praga dos canaviais no estado de São Paulo. As larvas desse
inseto destroem o rizoma da planta, pois estes abrigam-se no interior do rizoma e
danificam os tecidos. Em conseqüência pode ocorrer a morte da planta e falhas nas
brotações das soqueiras, causando prejuízos da ordem de 30 toneladas de cana por
hectare, além de reduzir a longevidade do canavial. Ensaios iniciais utilizando proteases
purificadas do intestino do inseto mostraram que elas são inibidas eficientemente pela
CaneCPI-1. Desta forma, acreditamos que os resultados obtidos nesta dissertação
possam contribuir para esta nova linha de pesquisa do laboratório no sentido de obter
plantas mais resistentes a esta praga.
87
5. CONCLUSÕES
• Foram obtidas 38 plantas transgênicas superexpressando a proteína CaneCPI-1,
entre as plantas transformadas com o vetor pAHCaneCPI-1A e com o vetor
pAHCaneCPI-1C.
• A análise de expressão da proteína CaneCPI-1 nas plantas transformadas com as
construções pAHCaneCPI-1A e pAHCaneCPI-1C revelou que a proteína CaneCPI-
1 apresentou maior expressão nas plantas transformadas em relação às plantas que
não foram transformadas, tanto nas análises de expressão gênica e nas análises de
Western blotting.
• Foi possível a detecção da proteína CaneCPI-1 nos tecidos de folhas e raízes das
canas-de-açúcar transformadas
• Foi possível a purificação eficiente da proteína
HIS
CaneCPI-1 a partir de folhas
de uma planta transformada com a construção pAHCaneCPI-1C (selecionada por
expressar a proteína CaneCPI-1 em maior quantidade).
• A proteína purificada da planta transformada foi capaz de inibir catepsina L
humana, mostrando que CaneCPI-1 manteve sua forma ativa.
88
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ABE, K.; EMORI,Y.; KONDO, H. Molecular cloning of a cysteine proteinase
inhibitor of rice (oryzacystatin). J. Biol Chem, v. 262, p. 16793-16797, 1987.
2. ABE, M. et al. Two distinct species of corn cystatin in corn kernels. Biosci
Biotechnol Biochem,v. 59, p. 756-758, 1995.
3. ABRAHAMSON, M. et al. Identification of the probable inhibitory reactive
sites of the cysteine inhibitors human cystatin C and chicken cystatin. J Biol
Chem, v. 262, p. 9688-9694, 1987.
4. ABRAHAMSON, M. Cystatins-Proteins Inhibitors of papain-like cysteine
proteinases. Journal of the Brazilian Association for the Advancement of
Science, v. 45, p. 299203, 1993.
5. APLEBAUM, S.W. Biochemistry of digestion. In: KERKUT, G.; GILBERT,
L.I. (Ed.). Compehensive insect physiology, biochemistry and
pharmacology. Oxford: Pergamon Press, 1985. p. 279-311.
6. ATKINSON, H.J. et al. Prototype demonstration of transgenic resistance to the
nematode Radopholus similes conferred on banana by a cystatin. Trans Res, v.
13, p. 135-142, 2004.
7. BARRET, A.J.; KIRSCHKE, H. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L.
Methods Enzymol, v. 80, p. 535-561, 1981.
8. BARRET, A.; FRITZ, H.; GRUB, A. Nomeclature and classification of the
homologous with the cysteíne proteinases inhibitor chicken cystatin. Biochem J,
v. 236, p. 3-12, 1987.
9. BARRET, A.J.; RAWLINGS, N.D.; WOESSNER, J.F. Handbook of
proteolytic enzymes. London: Academic Press, 2004.
89
10. BEYNON, R.J.; BOND, J.S. Proteolitic enzymes: a practical approach. Oxford
England, 1989. p.87-89.
11. BIRCH, R.G. et al. Expression of foreign genes in sugarcane. In.
CONGRESSO OF THE INTERNATIONAL SOCIETY OF SUGARCANE
TECHNOLOGISTS, 1995, Cali: Tecnicanã. v.2, p.369-373.
12. BIRCH, R.G. Plant transformation: problems and strategies for practical
application. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, v. 48, p. 297-326, 1997.
13. BLUNDELL, T.L. Metalloproteinase superfamilies and drug desing. Nature
Struct Biol, v. 1, p. 73-75, 1994.
14. BODE, W. et al. The 2.0 A X-ray crystal structure of chicken egg white cystatin
and its possible mode of interaction with cysteine proteinases. EMBO J, v. 7, p.
2593-2599, 1988.
15. BOUCHARD, E.; CLOUTIER, C.; MICHAUD, D. Oryzacystatin I expressed in
transgenic potato induces digestive compensation in an insect natural predator
via its herbivorous prey feeding on the plant. Mol Ecology, v. 12, p. 2439-2446,
2003.
16. BOWER, R.; BIRCH, R. Transgenic sugarcane plants via microprojectile
bombardment. Plant J, v. 2, p. 409-416, 1992.
17. BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem, v. 72, p. 248-254, 1976.
18. BRASILEIRO, A.C.M. Manual de transformação genética de plantas.
Brasília: EMBRAPA, CENARGEN, 1998. 309 p.
90
19. BRODWAY, R.M.; DUFFEY, S.S. Plant proteinase inhibitor: mechanism of
action and effect on the growth and digestive physiology of larval Helionthis zea
and Spodptera exigua. J Insect Physiol, v. 32, p. 827-833, 1986.
20. CAMPOS, F.A. et al. Resolution and partial characterization of proteinases and
alpha-amylases from midguts of larvae of the bruchid beetle Callosobruchus
maculates. Comp Biochem Physiol, v. 92B, p. 51-57, 1989.
21. CERDA, H. et al. Olfactory attraction of the sugarcane weevil
(coleopetra:curculionidae) to host plant odors and its aggregation pherormone.
Fla Entomology, v. 82, p. 103 -112, 1999.
22. CHARITY, J.A. et al. Transgenic tobbaco and peas expressing a proteinase
inhibitor from Nicotiana alata have encreased insect resistance. Mol Breeding,
v. 5, p. 357-365, 1999.
23. CHEN, W.H. et al. Transformation of sugarcane protoplasts by direct uptake of
a selectable chimeric gene. Plant Cell Reports, v. 6, p. 297-301, 1987.
24. CHRISTENSEN, A.H.; QUAIL, P.H. Ubiquitin promoter-based vectors for
high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in
monocotyledonous plants. Trans Res, v. 5, p. 213-218, 1996.
25. CONNORS, B.J. et al. Molecular characterization of a gene encoding a cystatin
expressed in the stems of American chestnut (Castanea dentata). Planta, v. 215,
p. 510-514, 2002.
26. COSTA LIMA, M.A. et al. Morfogênese in vitro e susceptibilidade de calos de
variedades nacionais de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) a agentes
seletivos utilizados em sistemas de transformação genética. Rev Brasileira
Botânica, v. 24 n. 1, 2001.
91
27. DANIELS, J.; ROACH, B.T. Taxonomy and evolution. In: HEINZ, D. J. (Ed.).
Sugarcane improvement though breeding. Amsterdan: Elsevier, 1987. p. 7–
84.
28. DOMINGUES, A. et al. Efficient production of transgenic citrus plants
expressing the coat protein gene of citrus trusties virus. Plants Cell Reports,
v.19, p.427-433, 2000.
29. FALCO, M.C.; TULMANN-NETO, A.; ULIAN, E.C. Transformation and
expression of a gene for herbicide resistance in a Brazilian sugarcane. Plant Cell
Rep, v. 19, p. 1188-1194, 2000.
30. FALCO, M.C. et al. Mechanisms of sugarcane response to herbivory. Gen Mol
Biol, v. 24, p. 113-122, 2001.
31. FERNANDES, K.V.S. et al. The resistance of cowpea seeds to bruchid beetles
is not related to levels of cysteine proteinase inhibitors. Plant Mol Biol, v. 23, p.
215-9, 1993.
32. FERREIRA, M.G.R. et al. Genes introduction in foliar segments of cupuassu
(Theobroma grandiflorum schumm.) using biolistic. Ciência Rural, Santa
Maria, v. 4, p. 279-280, 2004.
33. GAMBLEY, R.L.; FORD, R.; SMITH, G.R. Microprojetile transformation of
sugarcane meristems and regeneration transformation of shoots expressing β-
glucoronidase. Plant Cell Rep, v. 12, p. 343-346, 1993.
34. GIANOTTI, A. et al. Recombinant expression, purification, and functional
analysis of two novel cystatins from sugarcane (Saccharum officinarum).
Protein Expr Purif, v. 47, p. 483-489, 2006.
35. GIDDINGS, G. Transgenic plants as protein factories. Curr Opin Biotechnol,
v. 12, p. 450-454, 2001.
92
36. GLEDDIE, S.; LELLER, W.A. Protoplast fusion technology. J Tissue Cult
Methods, v. 12, p. 157-162, 1989.
37. GRIVET, L.; ARRUDA, P. Sugarcane genomics: depicting the complex genome
of an important tropical crop. Curr Opin Plant Biol, v. 5, p. 122-127, 2001.
38. GRUDEN, K. et al. The cysteine protease activity of Colorado potato beetle
(Leptinotarsa decemlineata Say) guts, which is insensitive to potato protease
inhibitors, is inhibited by thyroglobulin type-1 domain inhibitors. Insect
Biochem Mol Biol, v. 28, p. 549-60, 1998.
39. HAQ, S.K.; ATIF, S.M.; KHAN, R.H. Protein proteinase inhibitor genes in
combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered
phytoprotection. Arch Biochem Biophys, v. 431, p. 145-159, 2004.
40. HILDER, V.A. et al. A novel mechanism of insect resistence engineered into
tobacco. Nature, v. 330, p. 160-163, 1987.
41. HINES, M.E.; OSUALA, C.I.; NIELSEN, S.S. Isolation and partial
characterization of a soyabean cystatin cysteine proteinase inhibitor of
coeopteran digestive proteolitc activity. J Agric Food Chem, v. 39, p. 1515-
1520, 1991.
42. HOOD, E.E. et al. Commercial production of avidin from transgenic maize:
characterization of transformant, production, processing, extraction and
purification. Mol Breeding, v. 3, p. 291-306, 1997.
43. JOGSMA, M.A.; BOLTER, C. The adaptation of insects to plant protease
inhibitors. J Insect Physiol, v. 43, p. 885-895, 1997.
44. KIMURA, M. et al. Primary structure of a cysteine proteinase inhibitor from the
fruit of avocado (Persea americana Mill). Biosci Biotechnol Biochem, v. 59, p.
2328-9, 1995.
93
45. KLEIN, T.M. et al. Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by
hight velocity of microprojectiles. Biotechnology, v. 6, p. 559-563, 1987.
46. KLEIN, T.M. et al. Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the
particle bombardment process. Proc Natl Acad Sci, USA, v. 85, p. 8502-8505,
1988.
47. KLEIN, T.M. et al. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-
velocity microprojectiles. Proc Natl Acad Sci, USA, v. 85, p. 4305-4309, 1988.
48. KOIWA, H. et al. A plant defensive cystatin (soyacystatin) targets cathepsin L-
like digestive cysteine proteinases (DvCALs) in the larval midgut of western
corn rootworm (Diabrotica virgifera). FEBS Lett, v. 471, p. 67-70, 1998.
49. KOUZUMA, Y. et al. Purification, characterization, and sequencing of two
cysteine proteinase inhibitors, Sca and Scb, from sunflower (Helianthus annus)
seeds. J Biochem, v. 119, p. 1106-1113, 1996.
50. KURODA, M. et al. Molecular cloning, characterization, and expression of
wheat cystatins. Biosci Biotechnol Biochem, v. 65, p. 22-28, 2001.
51. LAEMMLI, V.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
52. LEE, S.I. et al. Soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) confers resistence to the
brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal.) in transgenic rice. Mol Breeding,
v. 5, p. 1-9, 1999.
53. LEUNG-TOUNG, R. et al. Thiol-dependent enzymes and their inhibitors: a
review. Curr Med Chem, p. 979-1002, 2002.
94
54. LIM, C.H. et al. Characterization of a cDNA encoding cysteine proteinase
inhibitor from Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis) flower
buds. Plant Mol Biol, v. 30, p. 373-379, 1996.
55. LIPKE, H.; FRAENKEL, G.S; LIENER, J.E. Effects of soybean inhibitors on
growth of Tribolium confusion. J Sci Food Agric, v. 2, p. 410-415, 1954.
56. MISAKA, T. et al. Soyacystatin, a novel cysteine proteinase inhibitor in
soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other
cystatins of animal and plant origin. Eur J Biochem, v. 240, p. 609-14, 1996.
57. MOORE, P.H. Progress in sugarcane molecular biology. In: CONGREES OF
INTERNATIONAL SOCIETY OH SUGARCANE TECHNOLOGISTS.
Proceedings. Cali: ISSCT, 1996. p.353-362.
58. MURDOCK, L.L. et al. Cysteine digestive proteinase in Coleoptera. Comp
Biochem Physiol, v. 87, p. 783-787, 1987.
59. NARVAEZ-VASQUEZ, J.; OROZCO-CARDENAS, M.L.; RYAN, C.A.
Differential expression of a chimeric CaMV-tomatoproteinase inhibitor I gene in
leaves of transformed nightshade, tobacco and alfalfa plants. Mol Biol, v. 20, p.
1149-1157, 1992.
60. NEHRA, N.S. et al. Self-fertile transgenic wheat plants regenerated from
isolated scutellar tissues from micrprojectile bombardment with two distinct
genes constructs. Plant J, v. 5, p. 285-297, 1994.
61. NELSON, D.L.; COX, M.M. Principles of Biochemistry. 3. ed. New York:
Worth Publishers, 2000. p. 848-849.
62. OJIMA, A. et al. An extracellular insoluble inhibitor of cysteine proteinases in
cell cultures and seeds of carrot. Plant Mol Biol, v. 34, p. 99-109, 1997.
95
63. OLIVA, M.L.V. et al. Inhibitory selectivity of canecystatin: a recombinant
cysteine peptidase inhibitor from sugarcane. Biochem Biophys Res Commun,
v. 320, p. 1082-1086, 2004.
64. OLIVEIRA, A.S.; XAVIER-FILHO, J.; SALES, M.P. Cysteine proteases and
Cystatins. A Review. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 46, p.
91-104, 2003.
65. PANNETIER, C. et al. Introduction of new traits into cotton through genetic
engeneering: insect resistance as example. v. 96, p.163-166, 1997.
66. PAPINI-TERZI, F.L. et al. Transcription profiling of signal transduction-related
genes in sugarcane tissues. DNA Res, v. 12, p. 27-38, 2005.
67. RAIZER, A.J. Interações genótipos x ambientes e estabilidade fenótipo em
cana-de-açúcar no estado de São Paulo. 103p. DISSERTAÇÃO (Mestrado) -
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo,
Piracicaba, 1998.
68. RAO, M.B. et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.
Microbiol Mol Biol Rev, v. 62, p. 597-635, 1998.
69. RAWLINGS, N.D.; BARRET, A.J. Families of cysteine peptidases. Methods
Enzymol, v. 244, p. 461-486, 1994.
70. REAM, W.; GELVIN, S.B. Crow gall: advances in understending interkingdon
gene transfer. Saint Paul: APS Press, 1996. 148 p.
71. REIS, E.M.; MARGIS, R. Sugarcane phytocystatins: identification,
classification and expression pattern analysis. Gen Mol Biol, v. 24, p. 291-296,
2001.
72. ROE, S. Protein purification techniques. New York: Oxford University Press,
2001.
96
73. ROGERS, B.L. et al. Sequence of the proteinase-inhibitor cystatin homologue
from the pollen of Ambrosia artemisiifolia (short ragweed).Gene, v. 133, p. 219-
221, 1993.
74. RYAN, S.N.; LIANG, W.A.; MCMANUS, M.T. A cysteine protease inhibitor
purified from apple fruit. Phytochemistry, v. 49, p. 957-963, 2003.
75. SACILOTO, R.F.Z. Inserção do gene PR5K em cana-de-açúcar visando
induzir resistência ao fungo da ferrugem Puccinia melanocephala. 74p.
DISSERTAÇÃO (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2003.
76. SAMBROOK, J.; FRTSCH, E.F; MANIATIS, T. Molecular cloning: a
laboratory manual 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989.
77. SANFORD, J.C. et al. Delivery of substances into cells and tissues using a
particle bombardment process. Journal Particle Science Technology, v. 5, p.
27-37, 1987.
78. SANGER, F.; NICKLENS, S.; COULSON, A.R. DNA sequencing with chain
terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Science, USA, v. 74, p. 5463-5467,
1977.
79. SARDANA, R.K. et al. Sintesis of recombinant human cytokine GMCSF in the
sedes of transgenic tobacco plants. In: CUNNINGHAM, C.; PORTER, AJ.R.
(Ed.). Recombinants proteins from plants. Production and isolation of clinically
useful compounds. Totowa, N.J., Humana Press. p.77-87, 1998.
80. SELITRENNIKOFF, C.P. Antifungal proteins. Aplied and Enviromental
Microbiology, v. 67, p. 2883-2894, 2001.
97
81. SÉTAMOU, M. et al. Evaluation of lectin-expressing transgenic sugarcane
against stalkborers (Lepidoptera:Pyralidae): effects on life history parameters. J
Econ Entomol, v. 95, p. 469-477, 2002.
82. SGRILLO, R.B. Desenvolvimento de modelo matemático para a população
da broca da cana-de-açúcar, Diatrea saccharalis (Fabr., 1794) e simulação
da técnica do indivíduo estéril. 189p. TESE (Doutorado) – Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1979.
83. SMITH, F.D.; HARPENDINDING, P.R.; SANFORD, J.C. Biolistic
transformation of prokaryotes: factors that affect biolistic transformation of very
small cells. J Gen Microbiol, v. 138, p. 239-248, 1992.
84. SOARES-COSTA, A. et al. A sugarcane cystatin: recombinant expression,
purification, and antifungal activity. Biochem Biophys Res Commun, v. 296, p.
1194-1199, 2002.
85. SONG, I. et al. Inhibition of cysteine proteinases by Carica papaya cystatin
produced in Escherichia coli. Gene, v. 162, p. 221-224, 1995.
86. STUPIELLO, J.P. A cana-de-açúcar como materia-prima. In: PARANHOS, S.B.
(Ed.). Cana-de-açúcar: cultivo e utilização. Campinas: Fundação Cargil, 1987.
v. 2, p. 187-259.
87. TERRA, W.R.; FERREIRA, C. Insect digestive enzymes: properties,
compartmentalization and function. Comp Biochem Physiol, v. 109, p. 1–62,
1994.
88. TURK, V.; BODE, W. The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases.
FEBS, v. 285, p. 213-219, 1991.
89. TWYMAN, R.M. et al. Molecular farming in plants: host systems and
expression technology. Trends Biotechnol, v. 21, p. 570-578, 2003.
98
90. URWIN, P.E. et al. Resistance to both cyst and rootnot nematodes conferred by
transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin. Plant J, v. 12, p.
455-461,1997.
91. VAIN, P. et al. Expression of an engineering cysteine proteinase inhibitor
(oryzacystatina-I delta D876) for nematode resistance in transgenic rice plants.
Theor Appl Genet, v. 96, p. 266-271, 1998.
92. VANIN, S.A. A new species of Sphenophorus Schoenherr from Brazil
(Coleoptera, Curculionidae, Rhynchophorinae). Revista Brasileira de
Entomologia, São Paulo, v. 34, p. 697-701, 1990.
93. WALDRON, C. et al. Characterization of a genomic sequence coding for potato
multicystatin, an eight-domain cysteine proteinase inhibitor. Plant Mol Biol, v.
23, p. 801-12, 1993.
94. WALKER, AJ. et al. Transgenic Arabidopsis leaf tissue expressing a modified
oryzacystatin shows resistance to the field slug Deroceras reticulatum (Müller).
Trans Res, v. 8, p. 95-103, 1999.
95. WITCHER, D.R. et al. Commercial production of β-glucuronidase (gus): a
model system for the production of proteins in plants. Mol Breeding, v. 4, p.
301-312, 1998.
96. YASUKAWA, T. et al. Increase of solubility of foreign proteins in E. coli by
co-production of bacterial thioredoxin. J Biol Chem, v. 270, p. 25328-25331,
1995.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
