( PDF ) Estabelecimento de um modelo de extração ácida de pectina de bagaço de maçã

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-Graduação

Programa de Pós-Graduação Stricto sensu

Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos

Heloisa Cristina Ramos Fertonani

ESTABELECIMENTO DE UM MODELO DE EXTRAÇÃO ÁCIDA

DE PECTINA DE BAGAÇO DE MAÇÃ.

Dissertação apresentada como um dos requisitos

para a obtenção do título de mestre em Ciência e

Tecnologia de Alimentos.

Orientador: Dr. Gilvan Wosiacki

Co-orientadora: Dra. Eliana Beleski Borba

Carneiro

PONTA GROSSA

2006

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Livros Grátis

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AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Gilvan Wosiacki, pelo incentivo, dedicação,

confiança, apoio e aprendizado que não só contribuiu com a ciência, como também com

o exemplo de respeito, ética e seriedade que conduz seus trabalhos.

À minha co-orientadora, Prof

. Dr

. Eliana Beleski Borba Carneiro, pela

atenção, colaboração e pelas correções finais da dissertação.

Ao Prof. Dr. Ivo, pela amizade, confiança e concessão de seu laboratório e

equipamentos.

Ao Prof. Dr. Paulo Borba Carneiro pela disponibilidade do seu equipamento e

suporte técnico com as análises de espectroscopia.

Ao Prof. Dr. Alessandro Nogueira, pela colaboração com o processamento das

maçãs, orientação com a fabricação do suco e do vinho, e pela gentileza no empréstimo

do material bibliográfico.

À Prof. Maria Helene Canteri Schemin, pela paciência, orientação, dedicação,

pela grande amizade e aprendizado.

À minha tia e professora de metodologia de pesquisa, Maria Etelvina Madalozzo

Ramos, pela orientação recebida na utilização das normas para apresentação de trabalho

científico, pelo imenso apoio, entusiasmo, carinho, dedicação, amizade e paciência.

A Danianne, Denise e Rita pela paciência e ajuda com as análises físico-

químicas e pelos momentos de descontração e harmonia.

À minhas amigas, Belinda, Krischina, Luciana e Maria Carolina, pela amizade,

companheirismo, apoio e convivência sempre tão alegre e indispensável.

À Ardalla, pela colaboração com as análises de espectroscopia e titulometria e

amizade.

À minha família, sem a qual não teria chegado até aqui e conquistado tantos

objetivos, sempre me apoiaram e incentivaram em todas as minhas decisões com

carinho, muito amor e paciência.

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RESUMO

O processamento de suco concentrado de maçã pode acarretar a disponibilidade de 20 a

40% da matéria-prima sob a forma de resíduo agroindustrial, o bagaço, que pode ser

usado como matéria-prima para a obtenção de compostos de alto valor. O objetivo deste

trabalho foi estabelecer um procedimento de extração ácida de pectina a partir do

bagaço de maçã. O bagaço foi obtido em nível de laboratório e desidratado em estufa.

Foram feitos ensaios com 7 ácidos em diferentes concentrações de 1 a 750 mM,

temperatura 97º C por 10 min, para verificar o efeito sobre a reação de extração. Com o

ácido mais adequado, foi utilizado um planejamento fatorial 2

axial com repetições no

ponto central para estabelecer o efeito da sua concentração e do tempo, a 97º C, sobre o

rendimento e a esterificação da pectina. Os modelos foram analisados estatisticamente

com relação à regressão e a falta de ajuste. A fração de pectina obtida no ensaio central

do experimento foi comparada com amostras comerciais de pectina de alto e baixo grau

de esterificação em termos titulométricos, espectroscópicos (FT-IR), cromatografia de

exclusão em gel e em relação ao seu conteúdo de açúcares neutros por cromatografia

gasosa. As reações de extração evidenciaram a diferença entre os ácidos nítrico,

clorídrico, succínico e lático, com rendimento crescente até 100 mM, e os ácidos

tricloroacético, málico e cítrico, com rendimento crescente até 750 mM chegando a

valores superiores aos teores existentes de pectina. O ácido nítrico foi o que apresentou

resultados mais coerentes e a reação de extração com 10 g de bagaço de maçã

apresentou maior praticidade em comparação com 5g ou 25g embora os rendimentos

tenham sido todos iguais (R

= 0,9978). O modelo de extração ácida de pectina foi

estatisticamente significativo (R

= 0,9834) e demonstra que a 126 mM durante 14 min

deve haver um rendimento máximo de 20,07 g. O mesmo experimento definiu o modelo

estatisticamente significativo (R

= 0.9796) que demonstrou o grau de esterificação

mínimo de 43,73% de pectinas extraídas a 200 mM durante 10 min. A amostra de

pectina experimental (10 min, 100mM, 97ºC) foi similar à comercial de baixo grau de

esterificação tanto por titulometria quanto por espectroscopia FTIR, apresentou

semelhante perfil de exclusão estérica e grau de inserção de ramnose na cadeia

principal. Os resultados sugerem o uso do modelo em condições ainda mais brandas que

as do ensaio central para a obtenção de pectinas de baixo grau de esterificação com

menores possibilidades de danos estruturais.

Palavras-chave: pectinas, bagaço de maçã, rendimento, grau de esterificação

ABSTRACT

Apple juice processing may produce around 20-40% of the raw material as a by-product

known as pomace, which could be useful as natural source of many high value

compounds. The objective of this work was to establish a procedure of acid extraction

of pectin from such industrial by-product. Apple pomace, obtained in laboratory scale,

was dried to decrease its chemical and microbiological instability. With essays at 97º

C/10min seven acids were tested (1-750 mM) in what concerns their effects on pectin

yield and best acid was identified. Pectin was extracted according to a experimental

design factorial 22 axial with repetitions at the central essay considering the effects of

HNO3 concentration and time. The resulting model was analyzed in what concerns

regression and lack of fit. The pectin fraction obtained at the central essay was

compared to commercial samples of low and high methoxyl pectin with titrimetry and

spectroscopic FTIR techniques as well as by size exclusion chromatography and neutral

sugar composition.The extraction reactions showed the difference of the nitric,

hydrochloric, succinic and lactic acids, which an increasing yield up to 100 mM from

the trichloroacetic, malic and citric acids, with an increasing yield up to 750 mM,

reaching higher levels than possible. Nitric acid was the selected and the reaction

containing 10 g of apple pomace gave better results than that with 5 or 25 although he

yields were all the same (R2=). The model was statistically significant concerning

gravimetric yield (R

=0.9834) and predicts that at 126 mM and during 14 min it will be

reached a maximum yield of 20.07 g/100g. The same experiment established the model

statistically significant (R

=0.9888) which predicts the minimum degree of

esterification of 43,73% in extracted pectin at 200 mM during 10 min. The experimental

sample of pectin (10 min, 100mM, 97ºC) was similar to the commercial low methoxyl

pectin both by titrimetric techniques as well as spectroscopic FTIR, and showed a

similar HPSEC profile and ramnose insertion frequency in main acid chain. The results

suggest the utilization of the model in conditions even milder than that of the central

essay for obtaining low methoxyl pectin with less possibility of structural damage.

Palavras-chave: pectin, apple pomace, yield, degree of esterification.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AUA Ácido anidrogalacturônico

Ara Arabinose

Cálcio

cv Cultivar

CSDN Carboidratos solúveis em detergente neutro

CIT Ácido cítrico

DE Grau de esterificação

DA Grau de acetilação

FDA Fibra por detergente ácido

FDN Fibra por detergente neutro

FSDN Fibra solúvel em detergente neutro

FID Detector de ionização de chama

FT-IR Espectroscopia de infravermelho com transformador de Fourier

Fuc Fucose

GalA Ácido galacturônico

Gal Galactose

Glc Glucose

GLC Cromatografia Líquido-gasosa

GTM Grupo de trabalho sobre maçã

HCl Ácido clorídrico

HG Homogalacturonana

HMP Pectina de alto grau de esterificação

HNO

Ácido nítrico

HPSEC-MALLS Cromatografia de exclusão estérica de alta pressão

IR Índice de refração

LAC Ácido láctico

LMP Pectina de baixo grau de esterificação

LS Espalhamento de luz

MAL Ácido málico

MALLS Espalhamento de luz em multiângulos

mM Milimolar

mEq Miliequivalente

MeO Teor de Metoxilação

Coeficiente de regressão

RG-I Ramnoglacturonana do tipo I

RG-II Ramnogalacturonana do tipo II

SUC Ácido succínico

Rha Ramnose

TCA Ácido tricloroacético

TFA Ácido trifluoracético

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Maçãs cv Joaquina, ilustrando a diferença entre a fruta industrial, a

menor, das comerciais.

Figura 2 Farinha de bagaço de maçã após secagem em estufa.. 18

Figura 3 Ilustração sobre a composição das células vegetais. 19

Figura 4 Ilustração de uma célula vegetal. 20

Figura 5 Estrutura química da cadeia de pectina em forma de cadeira. 25

Figura 6 Estrutura dos dois dímeros formados por ácido galacturônico e ramnose,

mostrando as ligações α-(1à2), α-(1à4) e α-(1à2) respectivamente.

Figura 7 Estrutura convencional de pectina (A), nova proposta dos autores (B). 28

Figura 8 Fluxograma do beneficiamento do bagaço de maçã. 37

Figura 9 Fluxograma de extração de pectinas de bagaço de maçã desidratado. 38

Figura 10 Bagaço de maçã desidratado em pó. 44

Figura 11 Rendimento gravimétrico de obtenção das substâncias pécticas com os

ácidos nítrico, clorídrico, succínico e lático no gráfico A e com os ácidos

tricloroacético, cítrico e málico no gráfico B, de 1 a 750 mM.

Figura 12 Rendimento gravimétrico de obtenção das substâncias pécticas com os

ácidos diluídos nítrico, clorídrico, succínico e lático no gráfico A e com os

ácidos tricloroacético, cítrico e málico no gráfico B, de 1 a 100 mM.

Figura 13 Linhas de tendência do rendimento gravimétrico de obtenção das

substâncias pécticas com os ácidos diluídos nítrico, clorídrico, succínico e

lático no gráfico A e com os ácidos tricloroacético, cítrico e málico no

gráfico B, de 1 a 100 mM.

Figura 14 Quantidade de substâncias pécticas extraídas com diferentes ácidos a

100 mM.

Figura 15

Relacionamento entre a matéria prima e as substâncias pécticas extraídas com

HNO3 100 mM /10min, 97ºC.

Figura 16 A influência da concentração de ácido e do tempo sobre o rendimento

gravimétrico do processo de extração de substâncias pécticas ilustradas

(A) por superfície de resposta e (B) por curvas de nível.

Figura 17 A influência da concentração de ácido e do tempo sobre a qualidade do

produto ilustrada (A) por superfície de resposta e (B) por curvas de nível.

Figura 18 Características de qualidade físico-química de pectinas. 61

Figura 19 Caracterização espectroscópicas FT-IR das substâncias pécticas ext

raídas com

Ácido nítrico (100 mM; 10 min; 97ºC) a partir de 5 g/200 g (A); 10 g/400g

(B) e 25 g/1000g (C).

Figura 20 Espectroscopia de infravermelho das amostras experimental (A) e

comerciais (B) e (C).

Figura 21 Cromatogramas em HPSEC-MALLS das amostras de pectina comercial

(A) HMP e (B) LMP e (C) amostra experimental = HNO

, 100 mM,

10 min, 97ºC.

Figura 22 Proporção dos ácidos urônicos e da somatória dos açúcares galactose e

arabinose por unidade de ramnose.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Teor de pectinas em frutas 23

TABELA 2 Domínio do planejamento experimental 43

TABELA 3 Ensaios do planejamento experimental 43

TABELA 4 Qualidade físico-química de amostra de bagaço de maçã cv

Joaquina

TABELA 5 Influência de ácidos no rendimento gravimétrico. 46

TABELA 6 Listagem das equações das curvas de tendências e seu

coeficiente de correlação

TABELA 7 Influência da quantidade de matéria-prima no rendimento

gravimétrico

TABELA 8 Resultados do modelo do rendimento gravimétrico 53

TABELA 9 Os coeficientes do modelo de extração ácida de pectina 53

TABELA 10 Análise da variância 54

TABELA 11 Resultados do modelo em grau de esterificação 55

TABELA 12 Os coeficientes do modelo em grau de esterificação 56

TABELA 13 Análise da variância do modelo em grau de esterificação 56

TABELA 14 Valores preditos em coordenadas específicas 58

TABELA 15 Característica titulométrica das pectinas experimental e

comerciais

TABELA 16 Tempo de retenção de pectinas em minutos 65

TABELA 17 Identificação dos açúcares neutros pela mobilidade

cromatográfica(GLC).

TABELA 18 Identificação dos açúcares neutros pela composição dos

fragmentos obtidos em espectrógrafo de massa

TABELA 19 Proporção relativa de açúcares neutros identificados nas

amostras

TABELA 20 Proporção relativa dos açúcares neutros e ácidos 70

TABELA 21 Relações entre os açúcares das cadeia principal e das

cadeias laterais

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12

2 REVISÃO DA LITERATURA 14

2.1 A PRODUÇÃO DE MAÇÃS 14

2.2 PAREDE CELULAR EM TECIDOS VEGETAIS 19

2.3 SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS 21

2.3.1 Estrutura da pectina 24

2.3.2 Extração 29

2.3.3 Aplicação 30

3 OBJETIVO 35

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35

4 MATERIAL E MÉTODOS 36

4.1 MATERIAL 36

4.2 MÉTODOS 36

4.2.1 Os processos 36

4.2.1.1 Obtenção do bagaço 36

4.2.1.2 Extração ácida 37

4.2.1.3 Isolamento da pectina 38

4.2.2 Análises 39

4.2.2.1 Análises Físico-químicas 39

4.2.2.2 Análises estatísticas 39

4.2.2.3 Análises Espectroscópicas 40

4.2.2.4 Análises Cromatográficas 40

4.2.2.5 Análises Titulométricas 41

4.2.3 Experimentos 42

4.2.3.1 Efeitos dos diferentes ácidos 42

4.2.3.2 Planejamento experimental 43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 44

5.1 CARACTERÍSTICAS DO BAGAÇO DESIDRATADO DE MAÇÃ 44

5.2 EFEITO DE DIFERENTES ÁCIDOS NA EXTRAÇÃO DE PECTINA 46

5.2.1 Estabelecimento da quantidade de matéria prima no sistema

experimental

5.3 MODELO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO E DA QUALIDADE

DO PRODUTO

5.3.1 Rendimento gravimétrico do processo de extração 53

5.3.2 Grau de esterificação 55

5.4 CARACTERÍSTICAS DA QUALIDADE DA PECTINA EXPERIMENTAL

E COMERCIAIS

5.4.1 Característica de qualidade titulométrica 59

5.4.2 Característica da qualidade de espectroscópica de infravermelho (FT-IR) 61

5.4.3 Característica de qualidade cromatográfica 65

5.4.3.1 Cromatografia de exclusão estérica (HPSEC MALLS) 65

5.4.3.2 Composição em monossacarídeos (GLC) 67

6 CONCLUSÕES 73

REFERÊNCIAS 74

APÊNDICE 79

ESTABELECIMENTO DE UM MODELO DE EXTRAÇÃO ÁCIDA

DE PECTINA DE BAGAÇO DE MAÇÃ.

1 INTRODUÇÃO

O cultivo de maçãs na Região Sul do País foi implantado no início da década de

1970, após tentativas de plantio em outras regiões, como no Sudeste e Centro-Oeste

brasileiro. Foi notável o desenvolvimento da cultura nos Estados do Paraná, Santa

Catarina e Rio Grande do Sul, em algumas regiões com climas mais adequados, com

características mais próximas das de zonas temperadas. Em cerca de 30 anos o Brasil

tornou-se auto-suficiente na produção e abastecimento de maçã, dando início aos

processos de exportação de fruta in natura. A evolução da cultura posicionou o país

como 13º maior produtor mundial, com nível de 1000 toneladas métricas anuais.

Como a maçã produzida no Brasil foi programada para atender consumidores de

frutas in natura isto acarretou o desenvolvimento de um processo de beneficiamento

altamente rigoroso, com demanda de equipamentos automatizados, aumento de área de

armazenagem com atmosfera controlada e profissionais especializados, criando

empregos e impulsionando o desenvolvimento sócio-econômico.

As maçãs desqualificadas para o comércio passaram a ser industrializadas, com

a produção de sucos concentrados e de fermentados, matéria-prima para o

beneficiamento da sidra, bem como a obtenção de vinagres e aguardentes, em menor

escala. Com a industrialização, apesar das vantagens relativas aos novos produtos,

inclusive com atividades de exportação, surgiram os resíduos e sub-produtos, dentre os

quais o economicamente mais importante é o bagaço de maçã, que pode representar de

30 a 40% da matéria-prima, dependendo do nível de tecnologia empregado.

De acordo com as informações divulgadas pelo Grupo de Trabalho sobre Maçã -

GTM (www.pitangui.uepg.br/gtm) da Universidade Estadual de Ponta Grossa, o bagaço

contém todas as partes da fruta, como por exemplo, cascas, sementes, centro do fruto,

polpa, incluindo células com parede celular intacta. Dentre os constituintes da maçã, são

encontrados no bagaço açúcares solúveis, ácidos orgânicos, compostos fenólicos,

constituintes do aroma e fibras incluindo celuloses, hemiceluloses e pectinas.

A condição atual da produção de maçãs no Brasil faz com que seja necessário

um avanço no processo de industrialização e é conhecido o fato de que as variedades

Fuji e Gala não são especialmente adequadas para esta finalidade. Algumas das

variedades que estão sendo desenvolvidas apresentam características que favorecem o

seu processamento, como o cultivar (cv) Joaquina, da qual pode ser extraído o suco e

feito o vinho, de boa qualidade, gerando o bagaço a ser valorizado.

O bagaço de maçã pode ser visto não como um resíduo ou um subproduto, mas

sim como uma matéria-prima para a extração de pectina. As substâncias pécticas,

presentes na maioria das frutas e vegetais, mas em maior proporção no albedo das frutas

cítricas e no bagaço de maçã, podem ser extraídas por diferentes métodos com ácidos,

álcalis ou enzimas, constituindo-se em um conhecimento de domínio industrial de

difícil acesso. Portanto, a fim de colher subsídios para aproveitamento do bagaço de

maçã no Brasil há necessidade de que sejam estabelecidas às condições de extração com

tipos e concentrações de ácidos, de tempo e de temperatura levando em consideração a

quantidade do rendimento e a qualidade da pectina comparativamente com amostras

comerciais.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 A PRODUÇÃO DE MAÇÃS

Com o desenvolvimento da cultura no Sul do Estado do Paraná, na região central

de Santa Catarina e na serra gaúcha (WOSIACKI; NOGUEIRA; SILVA, 2000), a

produção passou de 543 mil toneladas métricas em 1990 para 978 toneladas métricas

em 2004 (WORLD..., 2005). Em 1990, a área ocupada por pomares comerciais era de

22 938 mil hectares enquanto que em 2004, 32 931 mil hectares, representando um

aumento de 43%. Estes resultados colocam o Brasil como um dos 15 maiores

produtores de maçãs (WOSIACKI; NOGUEIRA; SILVA, 2000; WORLD..., 2005).

Os pomares comerciais brasileiros, mesmo os mais recentemente instalados,

continuam com aspectos peculiares de produzir maçãs para consumo in natura, sendo

que as principais cultivares são a Fuji (43%), Gala (46%) e a Golden delicious (6%);

todas as demais variedades representam não mais do que 3% da produção total

(WOSIACKI; NOGUEIRA; SILVA, 2000). Estes números refletem a exigência do

consumidor altamente criterioso na aceitação de maçã de mesa evidenciando que a

Golden delicious não apresenta qualidade que o satisfaça, principalmente em termos de

aparência. A Gala e a Fuji, que no Brasil representam 89% da produção de maçãs, são

classificadas em 3º e 4º lugar em termos quantitativos mundiais, perdendo apenas para

Golden delicious e a Delicious (WORLD..., 2005).

Estas frutas produzidas para consumo in natura não necessariamente apresentam

as qualidades requeridas para processamento industrial, em especial os altos teores de

ácido málico. Outras variedades cultivadas podem, entretanto, em função de seus

elevados teores de ácido málico e compostos fenólicos, ser usadas para corrigir os

produtos do processamento da Gala e da Fuji. (WOSIACKI; NOGUEIRA; SILVA,

2000).

A cultura de maçã no Brasil, praticamente bivarietal e fundamentada nos cv Fuji

e Gala, atualmente supridas por muitos outros países produtores, não apresenta mais

vantagens do ponto de vista econômico e novas variedades devem ser desenvolvidas no

sentido de suprir o mercado com ofertas competitivas (WORLD..., 2006).

Os pomares mais recentes já contêm novas variedades de maçãs escolhidas entre

aquelas resistentes às doenças de verão causadas por sarna (Venturia inaequalis), oídio

(Podosphaera leucotricha) e bitter pit (Glomerella cingulata) que, se não forem

tratadas adequadamente, podem acarretar a perda total da produção (WOSIACKI et al.;

2002). Assim surgiram as variedades comerciais Baronesa, Catarina, Condessa, Daiane,

Duquesa, Fred hough, Fuji suprema, Imperatriz, Lisgala, Primicia e Princesa, mais

resistentes requerendo menos cuidados técnicos e gastos com defensivos agrícolas.

O cultivar Joaquina (Figura 1), lançado durante a Festa Nacional da Maçã em

São Joaquim, em 2002, é uma nova espécie desenvolvida para atuar nos pomares como

polinizadora de outra variedade, a Catarina. Essa variedade passou a estar disponível

aos produtores a partir de 2003 integrando os pomares da região, sendo resistente

geneticamente à sarna permitindo reduzir em 70% o uso dos fungicidas e diminuindo o

custo de produção (PEREIRA, et al., 2002).

Sua avaliação tecnológica identificou que tem todas as características de uma

fruta comercial doce-amarga como a Fuji e a Gala, sem diferenças em suas composições

físico-químicas, podendo ser usada com parcimônia no processamento do suco e com

segurança na produção de vinho (FERTONANI, et al., 2006).

Figura 1 - Maçãs cv Joaquina, ilustrando a diferença entre a fruta industrial, a menor, das

comerciais.

A previsão da produção para o ano de 2006 era de 1.050 mil toneladas de maçãs,

735 mil ton (70%) destinadas ao abastecimento do mercado doméstico, 105 mil ton

(10%), o processo de exportação com frutas de alta qualidade e 210 mil ton (20%), para

frutas destinadas ao processamento industrial (WOSIACKI et al.; 2002).

Por outro lado, considera-se, que as frutas destinadas ao processamento

industrial correspondem a 30% da produção, sendo que 10% constituem as frutas com

problemas fitossanitários e 20% as frutas industriais propriamente ditas. As frutas com

problemas fitossanitários estão sendo destinadas indevidamente para a fabricação de

sidra, ou vinagre e destilados (PAGANINI et al., 2004), embora a toxina formada por

bolores seja eliminada pelas leveduras do gênero Saccharomyces durante o processo

fermentativo.

As frutas denominadas industriais (20%) apresentam formato inadequado,

tamanho pequeno, cicatrizes provenientes do ataque de insetos e de pássaros, ou de

granizos, ferimentos resultantes de tratos culturais e transporte inadequado, com má

distribuição de coloração, características que as tornam sem valor comercial. Mas,

apresentam a mesma composição físico-química das frutas comerciais e, portanto,

podem ser destinadas à produção de suco, agregando valor e possibilitando a oferta de

um produto nobre ao longo do ano (PAGANINI et al., 2004; WOSIACKI, et al., 1992).

O processamento destas frutas leva também à produção do bagaço, que pode

representar de 20 a 40% da quantidade total de maçã processada. É constituído de

cascas e polpas (94,5%), sementes (4,4%) e centro do fruto (1%), contendo 80% de

umidade, 5% de fibras (31% de celulose, 15% de lignina, 12% de hemicelulose e 9%

de pectina insolúvel em água) e 14% de sólidos solúveis correspondendo a glucose,

frutose e sacarose. Pode ser aproveitado para a extração de enzimas, de constituintes de

aromas, de pectinas, além de ser útil na formação de meios de cultura para produção de

cogumelos comestíveis, e de ácido cítrico em fermentação semi-sólida (ENDREβ, 2000;

HANG, 1987; KENNEDY, 1999; NOGUEIRA et al., 2005).

O bagaço de maçã, incluindo sementes, consiste em uma rica fonte de polifenóis,

sendo que alguns destes constituintes, as prócianidinas e glicosídios da quercitina,

apresentam forte atividade antioxidante, e de pectinas (ENDREß, 2000), entretanto no

Brasil é praticamente jogado fora, sendo usado como ração animal ou adubo orgânico.

A sua composição justifica o fato de ser altamente instável tanto química quanto

microbiologicamente e por causa disto é importante que seja processado imediatamente,

mas se isso não for possível, deve ser desidratado e armazenado em embalagens

herméticas minimizando as atividades enzimáticas e aumentando sua estabilidade

(ENDREß, 2000; KENNEDY, 1999; NOGUEIRA et al., 2005). O conteúdo de ácido

galacturônico e grau de esterificação são influenciados pelas condições de

processamento e, segundo Constenla; Ponce e Lozano (2002), a secagem do bagaço visa

diminuir as atividades enzimáticas presentes e são raros os trabalhos que demonstram a

perda da qualidade das pectinas de bagaço de maçã influenciadas pelas condições

empregadas.

Na Figura 2 está sendo ilustrado o bagaço de maçã logo após seu processamento,

desidratando em estufa, e armazenado em recipientes de vidro.

Foto:Alessandro Nogueira

Figura 2 – Farinha de bagaço de maçã após secagem em estufa.

2.2 PAREDE CELULAR EM TECIDOS VEGETAIS

Os carboidratos das plantas distribuem-se no interior das células e na formação

da estrutura da parede celular (CARVALHO; FERNANDES; PIRES, 2006). No interior

das células os autores incluem ácidos orgânicos, embora não seja um carboidrato, mono

e oligossacarídeos, amidos e frutanas, enquanto na parede celular podem ser

encontradas celulose, hemiceluloses e substâncias pécticas como galactanos e ß-

glucanos, conforme esquematizados na Figura 3.

Figura 3 - Composição das células vegetais ( FDA: fibra em detergente ácido; FDN: fibra em detergente

neutro; FSDN: fibra solúvel em detergente neutro; CSDN: carboidrato solúvel em detergente neutro).

FONTE – CARVALHO; FERNANDES; PIRES, 2006 (adaptado)

Os compostos, apresentados de forma esquemática na Figura 3, representam, do

ponto de visto prático, as frações FDA, FDN, FSDN. A primeira, Fibra em Detergente

Ácido corresponde à celulose enquanto a segunda, Fibra em Detergente Neutro, à

celulose e hemicelulose, e a última, Fibra Solúvel em Detergente Neutro, inclui as

Carboidratos das plantas

Conteúdo celular

Parede celular

Ácidos

orgânicos

Mono-oligos

sacarídeos

Amidos

Frutanas

Substâncias

pécticas

Hemicelulose Celulose

Galactanos

ß-glucanos

CSDN

FDA

FSDN

FDN

Substâncias

não amiláceas

substâncias pécticas e as frutanas. As três frações das fibras correspondem aos

polissacarídeos e substâncias não amiláceas (CARVALHO; FERNANDES; PIRES,

2006).

Com exceção das frutanas, os constituintes das fibras, a celulose, a hemicelulose

e as substâncias pécticas, com seus componentes ácidos e neutros, compõem a parte

estrutural da parede celular dos vegetais.

A Figura 4 ilustra de uma forma simples uma célula vegetal e sua interligação

com outras para formar um tecido vegetal.

Figura 4 - Célula vegetal.

FONTE: BIRUS, 2003 (traduzido).

2.3 SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS

As substâncias pécticas encontram-se associadas com celulose e hemicelulose. A

associação, entre pectina e hemicelulose, tem sido relatada como sendo covalente,

embora nem todas as frações pécticas sejam mantidas desta maneira, pois certas

quantidades podem ser removidas da parede celular com água fria, indicando que não

estão ligadas covalentemente (THAKUR; SINGH; HANDA, 1997).

As pectinas solúveis desempenham um importante papel na manutenção do

equilíbrio hídrico e no movimento dos fluídos vegetais (THAKUR; SINGH; HANDA,

1997). Em tecidos jovens, especialmente em frutas, as pectinas estão presentes em

grandes quantidades, nos espaços intercelulares, com excelente capacidade de absorção

de água, sendo importante para os estágios iniciais de desenvolvimento dos tecidos

vegetais.

De acordo com Thakur; Singh e Handa (1997), as pectinas contribuem para

firmeza e estrutura do tecido vegetal, tanto fazendo parte da estrutura da parede celular

primária quanto sendo o principal componente da lamela média envolvido na coesão

intercelular. A resistência da parede celular vegetal depende da orientação, das

propriedades mecânicas e dos tipos de ligações existentes entre as substâncias pécticas e

as fibras de celulose. Algumas moléculas de pectinas estão ligadas glicosidicamente às

cadeias de xiloglucanas que podem se ligar covalentemente com a celulose.

Quando firmemente ligadas à estrutura destes polissacarídeos, são insolúveis em

água e denominadas protopectinas que, por mecanismos enzimáticos ou hidrólise ácida

tornam-se solúveis passando a ser chamadas de pectinas (BERK, 1976). A hidrólise

enzimática, segundo Wang; Págan e Shi (2002), responsável pelo aumento da

solubilidade das pectinas, inclui as atividades das endo e exo-poligalacturonases e

glicosidases e, na maioria das frutas, a enzima endo - poligalacturonase catalisa a

conversão da protopectina em pectina.

As maiores concentrações de pectinas na parede celular são encontradas na

lamela média com um decréscimo gradativo na parede celular primária até a membrana

plasmática (THAKUR; SINGH; HANDA, 1997).

Do ponto de vista industrial, (LEVIGNE; RALET; THIBAULT, 2002) as

matérias-primas mais importantes são o albedo das frutas cítricas e o bagaço de maçã.

Além destas duas fontes, que são as principais (YAPO et al., 2006), outras têm

sido estudadas como, por exemplo, a polpa de beterraba sacarina que anualmente gera

mais do que 2 milhões de toneladas de bagaço para indústria de açúcar. Levigne; Ralet;

Thibault, 2002 eYapo et al., 2006, relatam que esta matéria-prima pode conter teores

elevados de pectina chegando a 25 e 30% respectivamente, baixo custo e um excelente

potencial de extração de pectina. Entretanto, não é interessante do ponto de vista

industrial por suas pobres propriedades geleificantes, atribuídas à sua pequena massa

molar, altos conteúdos de grupos acetil e grandes quantidades de cadeias laterais. Estas

características conferem à pectina boas propriedades emulsificantes (YAPO et al.,

2006).

De acordo com Schieber et al. (2003), em muitas aplicações as pectinas de maçã

são caracterizadas por propriedades geleificantes superiores se comparadas às das

pectinas cítricas. Todavia sua cor marrom leva a limitação com respeito ao seu uso em

produtos alimentícios de coloração clara. A cor do bagaço de maçã e das pectinas

extraídas é causada pela oxidação dos compostos fenólicos, que são extraídos

simultaneamente do bagaço e apenas removida parcialmente na etapa de precipitação.

Renard et al. (1996 apud SCHIEBER et al., 2003), demonstraram que tentativa de

diminuir a coloração de bagaço de maçã com peróxidos alcalinos resulta na perda de

compostos fenólicos e na degradação da maior parte das pectinas, e que um eficiente

branqueamento apenas poderia ser obtido à custa de baixo rendimento.

A Tabela 1 apresenta o teor das substâncias pécticas em diversas frutas

(THAKUR; SINGH; HANDA, 1997), e estas pectinas de várias matérias-primas podem

ser diferentes na estrutura molecular como, por exemplo, massa molecular, grau de

esterificação, conteúdo de acetil, teor de açúcares neutros, distribuição dos grupos

carboxi-metoxilados e, portanto apresentarem diferentes propriedades funcionais

(SCHEMIN, 2003; ENDREß, et al., 1999; THIBAULT, 1980).

Tabela 1 - Teor de pectina em frutas.

Frutas

Substancias pécticas %

(base úmida)*

Base seca**

Maçã 0,5 – 1,6 4 – 7

Bagaço de maçã 1,5 – 2,5 15 - 20

Polpa de beterraba 1,0 15 – 20

Polpa de cítricos 2,5 – 4,0 30 - 35

Cascas de laranjas 3,5 – 5,5 ---

Tamarindo 1,71 ---

Cenouras 0,2 – 0,5 10

Mamão papaia 0,66 – 1,0 ---

Tomate --- 3

Girassol --- 25

FONTE: THAKUR; SINGH e HANDA, 1997 *; THIBAULT, 1980**(adaptado).

A aplicação das pectinas apresenta importância na indústria alimentícia sendo

empregada como um aditivo de acordo com suas propriedades geleificante,

estabilizante, espessante e, recentemente, vem sendo utilizada como substituintes de

açúcar e gordura em alimentos dietéticos (IGLESIAS; LOZANO, 2004;

MOORHOUSE, 2004; THAKUR; SINGH; HANDA, 1997).

As pectinas formam géis e estas propriedades podem ser utilizadas para

produção de gomas, geléias e marmeladas, produtos lácteos e confeitados

(INGLESIAS; LOZANO, 2004; MOORHOUSE, 2004).

2.3.1 Estrutura da pectina

Como a maioria de outros polissacarídeos, as pectinas são polimoleculares e

polidispersas, o que significa que são heterogêneas com relação à estrutura química e à

massa molecular. Sua composição varia com a fonte, condições de extração e fatores

ambientais (IGLESIAS; LOZANO, 2004; THAKUR; SINGH; HANDA, 1997; WANG;

PAGÁN; SHI, 2002).

As pectinas são polissacarídeos complexos de vegetais, consistindo

principalmente de ácido D-galacturônico e açúcares neutros, tais como L-ramnose, L-

arabinose, e D-galactose (YAPO et al.; 2006). São organizadas sob forma de cadeia

constituída principalmente por resíduos de ácido D-galacturônico unidos por ligação

glicosídica α-(1à4) formando uma estrutura linear. Esta estrutura principal pode ser

esporadicamente interrompida em locais com resíduos simples de α-L-ramnose, que

pode carregar cadeias laterais de resíduos de açúcares neutros, primariamente

arabinanas e ou arabinogalactanas (THAKUR; SINGH; HANDA, 1997). Os resíduos de

ácido galacturônico podem ser parcialmente esterificados na posição C-6 com metanol,

assim como os grupos hidroxilas nas posições C-2 ou C-3 podem estar parcialmente

esterificados com ácido acético (RENARD; THIBAULT, 1993; YAPO, et al., 2006).

A Figura 5 apresenta a estrutura esquematizada da molécula de pectina com a

conformação cadeira.

Figura 5 - Estrutura química da cadeia de pectina em conformação cadeira.

FONTE: (BRANDÃO; ANDRADE, 1999).

A estrutura deste polissacarídeo contém 65% de ácido galacturônico e é bem

diversificada, pois consiste de três tipos de frações conhecidas como a linear

homogalacturonana (HG) e as ramificadas, ramnogalacturonanas (WILLATS; KNOX;

MIKKELSEN, 2006).

As homogalacturonanas formam géis rígidos e insolúveis na presença de

cálcio, uma propriedade que irá determinar suas diversas funções na parede celular

(MARCON, 2004; WILLATS; KNOX; MIKKELSEN, 2006; NOVOSEL´SKAYA, et

al., 2000). São constituídas de longas cadeias de resíduos de ácido galacturônico, que

podem estar parcialmente esterificados (até 70%), consistindo de resíduos de ácido

galacturônico com ligações α-(1à4), que são mais resistentes a hidrólise (RIDLEY;

O´NEILL; MOHNEM, 2001; WILLATS; KNOX; MIKKELSEN, 2006). A resistência

das ligações glicosídicas a hidrólise ácida não são iguais, sendo que GalA α-(1à4)

GalA > GalA α-(1à2) Rha > Rha α-(1à4)GalA > açúcar neutro α-(1à4) açúcar

neutro. Isto permite que a região homogalacturônica seja purificada por hidrólise sob

condições controladas e seu comprimento mínimo seja estimado (NOVOSEL´SKAYA

et al., 2000).

Como resíduos de ramnose estão presentes na região linear da homogalacturonana,

vários autores relataram proporções que variam de 25 a 200 resíduos de ácido

galacturônico por resíduo de ramnose. No caso de pectina de citrus foi demonstrado que

a razão era de 40 resíduos de ácido galacturônico por ramnose, mas apenas 15% de

ramnose encontravam-se na cadeia principal enquanto 85% localizavam-se nas regiões

ramificadas (ZHAN; HANSSEN; MORT, 1998 apud NOVOSEL´SKAYA et al.; 2000).

A hidrólise ácida das regiões ramificadas produz duas frações, uma rapidamente

hidrolisável contendo açúcares neutros e outra, mais resistente, rica em ácido

galacturônico e ramnose, cuja estrutura foi identificada como uma série de homólogos

lineares [à 4) GalA α-(1à2) Rha α-(1à], podendo chegar a 10 dímeros (RENARD;

CREPEAU; THIBAULT, 1995).

A Figura 6 apresenta a estrutura de dois dímeros GalA α-(1à2) Rha α-(1à4)

GalA α-(1à2) Rha inseridos na cadeia linear do ácido poligalacturônico, característicos

da região ramificada.

Figura 6 - Estrutura de dois dímeros formados por ácido galacturônico e ramnose, mostrando as ligações

α-(1à2), α-(1à4) e α-(1à2) respectivamente.

FONTE: http://www.lsbu.ac.uk/water/hypec.html, jul. de 2006.

A região ramificada apresenta-se sob duas formas, uma contendo a série de

homólogos lineares (10 dímeros) inseridos na cadeia do ácido poligalacturônico (RG-I)

e outra contendo uma seqüência mínima de sete resíduos de ácido galacturônico aos

quais se ligam quatro oligossacarídeos em cadeias laterais (RG-II)

(NOVOSEL´SKAYA et al., 2000).

A ramnogalacturonana – I representa a maior parte das substâncias pécticas e

constitui da repetição de unidades de dissacarídeos de ácido galacturônico e ramnose

com cadeias laterais formadas por diferentes açúcares, principalmente arabinanas e

galactanas, ligados diretamente aos resíduos de ramnose, em C-4. Segundo Renard,

Crepeau e Thibault (1995), 78% de ramnose existente na pectina de maçã está ligada

diretamente na cadeia principal sob a forma de oligômeros (NOVOSEL´SKAYA et al.

2000; PRADE et al., 1999; THAKUR; SING; HANDA, 1997).

As RG-II são regiões de ácidos galacturônicos aos quais se ligam diretamente,

em C-2 ou C-3, alguns açúcares raros como fucose, xilose, apiose e ácido acérico, além

dos açúcares comuns como arabinose, glucose, ácido galacturônico e glucurônico. Neste

caso a ramnose, quando aparece, está nas cadeias laterais (MARCON, 2004;

NOVOSEL´SKAYA et al. 2000; WILLATS; KNOX; MIKKELSEN, 2006),

correspondendo em pectina de maçã a 22% (RENARD; CREPEAU; THIBAULT,

1995).

Sob o ponto de vista dos autores Willats, Knox e Mikkelsen (2006) é possível

observar que a estrutura principal da pectina foi considerada como homogalacturonanas,

com ligações simples chamadas de regiões lisas (smooth region) e as

ramnogalacturonanas com ramificações contendo vários açúcares, chamadas de regiões

em cabeleira (hairy region), como demonstrada pela Figura 7 identificada pela letra A.

A letra B refere-se à recentes pesquisas onde os autores propõem um novo ponto de

vista, demonstrando que a homogalacturonana pode ser considerada uma cadeia lateral

das ramnogalacturonanas, o que causou grande impacto nos estudos da estrutura fina

das pectinas (PRADE et al., 1999; WILLATS; KNOX; MIKKELSEN, 2006;

VINCKEN et al., 2003).

Figura 7 - Estrutura convencional (A), Nova proposta dos autores (B).

FONTE: WILLATS; KNOX ; MIKKELSEN, 2006.

2.3.2 Extração

A presença de um ácido ou uma base em elevadas temperaturas ajudam no

rompimento da parede celular, hidrolisando a protopectina e solubilizando as

substâncias pécticas (WANG; PAGÁN; SHI, 2002). Os autores Joye e Luzio (2000)

relataram em seus estudos que o processo de extração alcalino rende uma pectina de

baixo grau de esterificação (DE) como resultado da saponificação dos grupos ésteres,

enquanto que o processo de extração ácida, em geral, rende uma pectina com alto grau

de esterificação, aproximadamente igual ao grau de esterificação de ocorrência natural.

A extração de pectina é, portanto, um processo físico-químico complexo no

qual a solubilização, extração e despolimerização das macromoléculas ocorrem ao

mesmo tempo, sendo extraídas com mais facilidade as pectinas de alto grau de

esterificação (KERTESZ, 1951). Segundo os autores Wang; Pagán e Shi (2002), o

processo industrial de extração emprega ácido sulfúrico, clorídrico ou nítrico, pH 2,

com temperaturas de 60 a 100ºC, durante 5 a 10 horas. O tratamento ácido aplicado no

bagaço de maçã como relatado por Cho e Hwang (2000), usando HCl e pH 1,2 durante

15 a 240 min em temperaturas de 70 a 100ºC, extrai polissacarídeos solúveis em água,

mas causa degradação parcial em polímeros. O rendimento e a qualidade dos

polissacarídeos são fortemente afetados pelas condições de extração, portanto para se

obter um produto melhor, as condições de extração não podem ser muito drásticas.

Assim, Schemin et al. (2005), pesquisando a reação de extração ácida de pectina

a partir de bagaço de maçã, confirmam que o ácido nítrico é um bom agente extrator,

porém o ácido cítrico apresentou melhores resultados. Com um modelo matemático

definiu que com 6,2 g/100 mL a 100º C durante 152 min obtinha um rendimento de

17,82 g/100g de uma pectina de 68,8% de grau de esterificação. Marcon (2004) obteve

resultado semelhante, com um rendimento de 16,8 g/100g quando extraiu pectina com 5

g/100 mL de ácido cítrico a 100ºC durante 80 minutos, demonstrando que o tempo de

reação poderia ser menor.

Scabio et al. (2006), estabeleceu um modelo de extração com ácido nítrico

estatisticamente significativo (R

= 0,9271) e no ponto central com temperatura de

80ºC, obteve um rendimento de 9,05 g/100g de uma pectina com grau de esterificação

de 74,39% quando usou ácido a 50 mM, durante 20 minutos. A análise do efeito dos

fatores sobre o processo de extração evidenciou que a temperatura é mais importante

que a concentração de ácido e o tempo.

Uma das principais variações funcionais entre as pectinas de alto e baixo DE

está na sensibilidade em presença de íons polivalentes, como o cálcio. A pectina

sensível ao cálcio pode ser geleificada na sua presença e são, portanto, utilizadas para

formulações de ingredientes alimentícios para produtos com baixo teor de gordura ou

sem açúcar, para os quais existe uma grande aplicação no mercado (JOYE; LUZIO,

2000).

2.3.3 Aplicação

A solubilidade das pectinas é diretamente proporcional ao número de

grupamentos carboxílicos esterificados e inversamente, ao tamanho da massa molecular,

embora o pH da solução, a temperatura, a concentração e a natureza dos solutos

presentes tenham efeitos marcantes. Por ser muito solúvel, sob a forma de pó em que se

comercializa, ao se ligar com a água forma uma camada que funciona como uma

barreira que impede o resto da pectina interagir com a água (THAKUR; SINGH;

HANDA, 1997; WANG; PAGÁN; SHI, 2002).

A prática em laboratório consiste em dissolver a pectina com um solvente pelo

qual tenha menos afinidade, como álcool, a fim de dispersar as moléculas e após isto

pode ser adicionada água na proporção desejada. A prática na indústria de fabricação de

geléias consiste em diluir a pectina sólida com 10% do açúcar a ser usado e após

adequada mistura, adicionar aos poucos ao suco de frutas, deixando dissolver e somente

após isto são adicionados os 90% restante do açúcar programado.

A principal propriedade das pectinas é a de formar gel na presença de açúcar e

de íons cálcio em meio ácido, e isto depende da massa molecular e do grau de

metoxilação, o que justifica que pectinas de diferentes fontes não apresentam a mesma

capacidade de geleificação. As características físicas do gel são conseqüências da

formação de contínuas redes tri-dimensionais com ligações cruzadas entre as moléculas

(MOORHOUSE, 2004; THAKUR; SING; HANDA, 1997).

A formação do gel também é influenciada por vários fatores como temperatura,

tipo de pectina, grau de esterificação, grau de acetilação, pH, açúcar e outros solutos e

cálcio. (SCHEMIN, 2003; MARCON, 2004; MOORHOUSE, 2004; WILLATS;

KNOX; MIKKELSEN, 2006).

O grau de esterificação é um dos aspectos mais importantes da estrutura da

pectina devido à excelente correlação com a propriedade de formar gel, que define a

adequação de seu uso industrial. De acordo com Novosel´skaya et al. (2000) e Monsoor,

Kalapathy, e Proctor (2001), o método mais comum para determinar o grau de

esterificação de pectinas é a titulação clássica (FOOD..., 1981). Nesta metodologia, são

tituladas as carboxilas livres e as desesterificadas, com NaOH 0,1N e o cálculo do grau

de esterificação corresponde à razão entre as carboxilas esterificadas e as carboxilas

totais, em percentual. Os mesmos autores citam o método de determinação do teor de

metanol por cromatografia gasosa após hidrólise química ou enzimática das carboxilas

esterificadas. O grau de esterificação por espectroscopia de infravermelho, tanto por

reflectância difusa (DRIFTS) quanto por transmissão (FT-IR) é recomendado por

Monsoor, Kalapathy e Proctor (2001) pois apresenta correlação bastante alta com a

metodologia da cromatografia gasosa utilizada para quantificar metanol. Na técnica

FTIR, usando amostras no estado sólido como pastilhas de KBr, as áreas do picos

referentes às faixas de 1760-1745 e 1640-1620 cm

-1

correspondem às carboxilas

esterificadas e livres, respectivamente. Por definição o grau de esterificação é a razão da

área do pico da carboxila esterificada pela área da carboxila total (MONSOOR;

KALAPATHY; PROCTOR, 2001).

As pectinas podem ser classificadas como de alta (HM) ou baixa (LM)

metoxilação, quando apresentarem de 50 a 80% ou de 25 a 50%, respectivamente

podendo assim formar dois tipos de géis. O mecanismo de formação do gel é diferente,

sendo que as pectinas de alta esterificação formarão gel em pH próximo de 3,6 e na

presença de co-solutos, açúcares com concentração maior do que 65%. A função do

açúcar na formação dos géis das pectinas HM é estabilizar as zonas de junção

promovendo interações hidrofóbicas entre os grupos metil ésteres. Nas pectinas de baixa

metoxilação (LM) os géis são formados na presença do cálcio, o qual age como uma

ponte entre pares de grupos carboxílicos de moléculas de pectinas. Estas são

quimicamente mais estáveis com relação à umidade e aquecimento do que as pectinas

HM, que apresentam tendência à desesterificação em umidade atmosférica

(GILSENAM; RICHARDSON; MORRIS, 2000; THAKUR; SINGH; HANDA 1997).

As pectinas de alta metoxilação apresentam considerável poder de geleificação e

são amplamente usadas na estruturação de sucos de frutas com a intenção de aumentar a

consistência dando a aparência de polpa de fruta. A presença de cadeias laterais,

principalmente com unidades de arabinose e galactose, afeta significativamente as

propriedades funcionais das pectinas, tais como solubilidade, geleificação, formação de

filme e propriedades reológicas, além de favorecer a agregação em soluções

concentradas (BRANDÃO; ANDRADE, 1999).

O tamanho molecular, a ramificação natural de açúcares, os graus de acetilação e

de amidação, e o teor de cinzas influenciam as propriedades geleificantes das pectinas

sendo que as de baixo grau de esterificação são usadas para produtos com baixos teores

de açúcar, mas na presença de cálcio. São, portanto, ingredientes para formulação de

alimentos de baixos valores calóricos ( SAHARI; AKBARIAN; HAMEDI, 2003).

As soluções de pectinas apresentam baixas viscosidades, mas sua importância

comercial está mais relacionada com a sua capacidade de geleificação. De uma forma

geral, são utilizadas no processamento de geléias, de produtos de confeitaria incluindo

cremes, de molhos para churrasco e produtos de tomate, bebidas carbonatadas e

sobremesas de frutas. Sua grande aplicação, em iogurtes com frutas, demonstra

vantagem em relação às outras gomas ou hidrocóloides, pois estabiliza a textura da base

de iogurtes permanecendo constante durante armazenagem, eliminando a flotação e a

separação da fruta mesmo no manuseio da carga (MOORHOUSE, 2004).

A seleção de uma pectina apropriada é dependente da temperatura de

geleificação, da textura e do processamento. Por exemplo, para um gel tradicional com

partículas de frutas suspensas torna-se necessária uma rápida geleificação e assim usa-se

pectina de alto grau de metoxilação (HM). Para gomas ou geléias com calorias

reduzidas ou sem açúcar, entretanto, são indicadas as pectinas de baixo grau de

metoxilação (LM), pelo baixo nível de sólidos solúveis requeridos para a geleificação

(menor que 25%). Estas pectinas, HMP e LMP, são utilizadas em conjunto com outros

hidrocóloides sendo capazes de promover o gel desejado para cada tipo de produto

(MOORHOUSE, 2004).

As pectinas comerciais são regulamentadas em alguns países como aditivo

alimentício, e não apresentam problemas do ponto de vista toxicológicos. No Brasil, o

Ministério da Saúde aprova a inclusão da pectina como aditivo com funções de

estabilizante, espessante, geleificante e também para gelados comestíveis, em

quantidade suficiente para obter o efeito desejado. Portanto, a pectina ocorrendo

naturalmente em frutas, especialmente em frutas cítricas e maçãs, tem seu uso permitido

pela legislação nacional com a função de coadjuvante de tecnologia para diversos tipos

de produtos (AGÊNCIA..., 2006).

3 OBJETIVO

Estabelecer um procedimento de extração ácida de pectina a partir do bagaço

desidratado de maçã.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Estabelecer as características de qualidade físico-química de bagaço de maçã

obtido em nível de laboratório, após desidratação, moagem e tamisação;

Identificar a influência de ácidos nítrico, clorídrico, succínico, láctico,

tricloroacético, málico e cítrico, em diferentes concentrações e com o binômio tempo:

temperatura sobre o rendimento gravimétrico;

Determinar as tendências do processo de extração de pectinas do bagaço

desidratado de maçã com ácidos diluídos, de 1 a 100 mM,;

Estabelecer e validar o modelo de extração de pectina com ácido nítrico,

mediante um planejamento composto 2

, axial e com repetições no ponto central.

Caracterizar a pectina experimental por metodologia titulométrica (DE),

espectroscópico (FT-IR) e cromatográfico (GLC – HPSEC-MALLS) comparando-a

com amostras de pectinas comercial de maçã de alto (HMP) e baixo (LMP) grau de

esterificação (DE).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

Amostras de maçãs comerciais da variedade da Joaquina cedida pela Estação

Experimental de São Joaquim (EPAGRI). Amostras de pectinas comerciais de maçã do

tipo HMP e LMP cedidas pelo fabricante (Herbstreith & Fox). Produtos químicos e

solventes orgânicos de qualidade pró análise.

4.2 MÉTODOS

Os procedimentos metodológicos compreendem os processos, as análises e os

experimentos, que estão apresentados a seguir.

4.2.1 Os Processos

A seguir são apresentadas as formas de obtenção do bagaço, de extração ácida e

de isolamento de pectina.

4.2.1.1 Obtenção do bagaço

O bagaço, obtido do processamento do suco de maçã, foi lavado com água

corrente por três vezes para retirada dos açúcares e ácidos orgânicos, centrifugado e

desidratado em estufa de circulação à 60ºC de 5 a 8 horas. Foi então triturado em

moinho de facas, tamisado a 60 MESH e armazenado à temperatura ambiente em

frascos fechados (Figura 8).

Figura 8: Fluxograma do beneficiamento do bagaço de maçã.

4.2.1.2 Extração ácida.

O sistema de reação foi composto por 5g de bagaço desidratado e em pó,

acrescido a 400 mL de ácido com uma concentração e um tempo escolhidos de acordo

com o modelo experimental. O procedimento para extração foi o seguinte: em um

béquer de 500 mL foram pesados 5g de bagaço de maçã em pó e adicionado 5 mL de

álcool e deixado em repouso por aproximadamente 5 minutos. A seguir, com agitação,

foram adicionados 200 mL de água deionizada, misturando bem e levando para

aquecimento até a fervura. Simultaneamente foram preparados 200 mL de uma solução

de ácido, levado para aquecimento até a fervura. Atingido o ponto de ebulição, a

solução ácida foi adicionada à suspensão, levando a um volume total de 400mL. A

Maçãs

Lavagem e Corte

Trituração e Prensagem

Suco de Maçã

Lavagem do Bagaço

Secagem

Bagaço Desidratado

concentração final do ácido e o tempo foram estabelecidos pelo planejamento. A reação

foi minimizada com o abaixamento da temperatura em banho-maria gelado. Após o

resfriamento, o extrato da reação foi filtrado em morim, e lavado com 200 mL de água

deionizada sendo o resíduo desprezado e o filtrado reservado para isolamento das

substâncias pécticas (Figura 9).

4.2.1.3 Isolamento de pectina

As substâncias pécticas que ficaram solúveis no filtrado da extração ácida foram

precipitadas, sob agitação constante, com etanol 2:1 (v:v) e, após repouso mínimo de

duas horas, foram desidratadas por tratamento com etanol a 70%, acetona e finalmente

éter etílico, ao ar e à temperatura ambiente. O material seco foi pulverizado

manualmente em gral de vidro e armazenado em frascos de plástico em dessecador.

Para serem analisadas, as frações obtidas foram previamente mantidas em dessecador de

vidro contendo pentóxido de fósforo durante, no mínimo, 24 horas (Figura 9).

Figura 9: Fluxograma de extração de pectinas de bagaço de maçã desidratado

Bagaço Desidratado em pó

Farinha + Água

Ácido + Água

Aquecimento a 97ºC

(Ebulição / 10 min)

Resfriamento com banho de gelo

Filtração e lavagem com água

Precipitação com etanol Secagem da Pectina

(Estufa 50ºC / 8h)

Bagaço Desidratado em póBagaço Desidratado em pó

Farinha + ÁguaFarinha + Água

Ácido + ÁguaÁcido + Água

Aquecimento a 97ºC

(Ebulição / 10 min)

Resfriamento com banho de gelo Resfriamento com banho de gelo

Filtração e lavagem com água Filtração e lavagem com água

Precipitação com etanolPrecipitação com etanol Secagem da PectinaSecagem da Pectina

(Estufa 50ºC / 8h)

4.2.2 Análises

A seguir as análises são apresentadas como Análises Físico-químicas,

Estatísticas, Espectrofotométricas, Cromatográficas, e Titulométricas.

4.2.2.1 Análises Físico-químicas.

O teor de umidade foi determinado em estufa a 105ºC e o de cinzas em mufla a

505ºC até peso constante.

Os açúcares redutores foram quantificados pelo método colorimétrico de

Somogyi-Nelson assim como os açúcares redutores totais após a hidrólise da sacarose

com HCl 2,25 N (67ºC/5 min.). As absorbâncias foram medidas em 520 nm

(SOMOGYI, 1945; NELSON, 1944). A glucose foi quantificada pelo método

enzimático da glucose oxidase, sendo que a sacarose e a frutose foram calculadas por

diferença e todos os carboidratos foram expressos como monossacarídeos em g/100 mL.

A acidez titulável total foi determinada por neutralização com NaOH 0,1 N

fatorado até pH 8,33 indicado por fenolftaleína e calculada como ácido málico, sendo

expresso em g/100 mL. O extrato etéreo foi efetuado em Soxleht durante 5 horas com

éter etílico e os lipídeos determinados por diferença gravimétrica. Os teores de proteínas

foram determinados pelo método de Kjeldahl, utilizando fator de conversão de 6,25. As

fibras foram analisadas pelo método de fibra alimentar e os resultados foram calculados

por diferença. (IAL, 1975; RSK, 1987; TANNER;BRUNNER, 1985).

4.2.2.2 Análises estatísticas.

Os resultados do delineamento experimental foram analisados pela regressão

múltipla da metodologia de superfície de resposta pelo software STATISTICA®.

4.2.2.3 Análises espectroscópicas.

Para análises de espectroscopia de infravermelho foram feitas pastilhas contendo

100 mg de KBr com 1 a 2 mg de amostras desidratadas de pectinas que foram prensadas

(50N/sqin) e analisadas em espectrofotômetro Shimadzu 8400 FTIR com 4 cm

-1

resolução e os espectrogramas foram registrados na faixa de 4000 a 500 cm

-1

. O cálculo

dos graus de esterificação foram feitos considerando a razão entre a área relativa à

banda 1740 cm

-1

(grupos carboxílicos esterificados) e as áreas relativas às bandas 1740

-1

e 1620 cm

-1

(esterificados e livres, respectivamente).

4.2.2.4 Análises cromatográficas

A) Cromatografia Líquido-Gasosa (GLC)

A identificação e determinação dos teores relativos de açúcares neutros das

amostras de pectina foram feitas após derivatização a alditóis, por cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massa.

As pectinas foram hidrolisadas com ácido trifluoroacético 1M (100ºC/ 5 h)

(ADAMS, 1965; ASPINALL, 1982) e o hidrolisado foi evaporado em capela. Os

açúcares livres foram reduzidos com NaBH

(WOLFRON ; THOMPSON, 1963), após

o que os cátions Na+ foram retirados com resina Lewatit na forma ácida. A seguir o

filtrado reduzido foi seco em rota-evaporador e lavado com metanol, para eliminação do

boro na forma de borato de trimetila. O material foi acetilado com anidrido acético e

piridina 1:1 (v:v) levando à obtenção de acetatos de alditóis que foram extraídos com

clorofórmio e lavados com solução de sulfato de cobre (5%) para remoção da piridina.

A amostra contendo os acetatos de alditóis resultantes foi analisada por cromatografia

gás-líquido (GLC) em equipamento modelo HP 5890 SII, com detector de ionização de

chama (FID) e nitrogênio como gás de arraste, com fluxo 2 mL/min, a 220ºC,

temperatura do detector e do injetor de 250ºC. Foi utilizada uma coluna capilar (0,25 m

d.i. x 30 m), modelo DB-210, com espessura de filme de 0,25 mm.

B) Cromatografia de exclusão estérica (HPSEC-MALLS)

O perfil de massas moleculares das frações foi determinado por cromatografia de

exclusão estérica. As amostras na concentração de 2 mg. mL

-1

foram solubilizadas em

água e filtradas sob pressão através de membranas de acetato de celulose (Milipore),

com tamanho do poro de 0,2 μm. A seguir foram injetadas em cromatógrafo de exclusão

estérica modelo 150 C ALC/GPC Waters, com detector de índice de refração diferencial

modelo Waters 2410, e detector de espalhamento laser em multiângulos.

4.2.2.5 Análise titulométrica.

As amostras de pectinas foram quantificadas por titulometria (BOCHEK;

ZABIVALOVA; PETROPAVLOVSKII, 2001; WOSIACKI, 1977). Quantidade de

amostra conhecida, de aproximadamente 250 mg, foi umedecida com 2 mL de álcool e

solubilizada em 25 mL de água deionizada sob agitação constante por 30 minutos com

agitador magnético, sendo então determinado o pH da solução. As carboxilas livres dos

ácidos anidrogalacturônicos foram neutralizadas com NaOH 0,1N e as carboxilas

esterificadas igualmente, após saponificação (10 mL NaOH 0,25 N, 30 min a

temperatura ambiente e neutralização com 10 mL HCl 0,25 N), obtendo-se assim os

valores de mEq de NaOH referentes aos dois tipos, livres e esterificados,

respectivamente representados por mEq’ e mEq”. Com estes dados foram feitos os

cálculos segundo as fórmulas:

4.2.3 Experimentos

Foram feitos experimentos com a finalidade de estabelecer os efeitos de

diferentes ácidos sobre o processo de extração, e com o ácido mais adequado foi feito

um delineamento experimental para escolha das melhores condições de sua aplicação,

sendo determinado o rendimento do processo e a qualidade do produto, comparando

com padrões comerciais.

4.2.3.1 Efeitos do diferentes ácidos

Para este processo 5g de bagaço em pó de maçã dispersos em 200 mL de água

deionizada, foram tratados com ácidos nítrico, clorídrico, succínico, lático,

tricloroacético, cítrico ou málico, em concentrações que variaram de 1 a 750 mM

durante o tempo de 10 min à temperatura 97ºC.

Z = massa /

mEq totais

AUA = 17600/Z 2

MeO = (mEq”x 31 x 100)/massa 3

DE = (176/31) x (MeO/AUA) = mEq” /(mEq`+ mEq”) 4

Pectina = AUA% + MeO% 5

Fração neutra = 100 – pectina 6

4.2.3.2 Planejamento experimental

Com a finalidade de estabelecer a influência do tempo e da concentração do

HNO

variáveis de entrada, sobre a quantidade (rendimento) e qualidade da pectina

solubilizada (grau de esterificação), variáveis de saída, foi seguido um delineamento

composto central (BARROS NETO et al., 2002). Foram respeitados os domínios de

abrangência do experimento definidos na Tabela 2 e a seqüência dos ensaios descritos

na Tabela 3.

Tabela 2 - Domínio do planejamento experimental

Variável -√2 -1 0 +1 + √2

Ácido, mM 8 35 100 165 192

Tempo, min 2,93 5 10 15 17,07

Tabela - 3 Ensaios do planejamento experimental

Fatores codificados Fatores decodificados Ensaios

Ácido, mM Tempo, min

1 -1 -1 35 5

2 -1 +1 35 15

3 +1 -1 165 5

4 +1 +1 165 15

5 0 0 100 10

6 0 0 100 10

7 0 0 100 10

8 - √2 0 8 10

9 + √2 0 192 10

10 0 -√2 100 2,93

11 0 +√2 100 17,07

A regressão polynomial de segunda ordem é representada a seguir

= b

+ b

Onde Y

representa a variável de resposta, b

, o intercepto, b

, o coeficiente de

regressão e X

, a variável independente. Tal modelo pode ser ajustado cancelando o

componente o qual o erro padrão é alto e a probabilidade (p) é maior do que 5%.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CARACTERÍSTICAS DO BAGAÇO DESIDRATADO DE MAÇÃ

O bagaço obtido no processamento de maçã, por ser altamente instável tanto

química quanto microbiologicamente, foi desidratado (Endreß, 2000), levando em

consideração as características do produto final influenciadas pelo processo de

obtenção, mas também pelo cultivar e pela rapidez do processo de desidratação, entre

outros fatores. O seu beneficiamento, reduzido às fases principais, desidratação e

moagem, levou a obtenção do bagaço em pó (Figura 10).

Figura 10 - Bagaço de maçã desidratado em pó.

Na Tabela 4 estão apresentados os resultados das análises físico-químicas deste

bagaço em pó, que se constituiu na matéria-prima para obtenção de pectinas.

Tabela 4 - Qualidade físico-química de amostra de bagaço desidratado de maçã cv.

Joaquina.

g / 100 g

Amostra Umidade Cinzas Proteína Lipídeos Açúcares Acidez Fibras

Joaquina 11,94 1,51 3,88 2,82 29,43 1,00 36,00

Base seca 0 1,72 4,41 3,20 33,44 0,235 40,91

Para facilitar tanto o processo de secagem do bagaço quanto o processo de

extração de pectina há necessidade de que sejam diminuídos os teores de sólidos

solúveis totais (SCHIEBER et al., 2003; SCHEMIN, 2003). Isto pode ser feito com

água corrente respeitando-se a proporção de massa de bagaço: água de extração igual a

1:1 (v/v), uma vez que, com três extrações, os teores de sólidos solúveis totais

diminuem de 6º Brix para 2º Brix (PAGANINI et al., 2004). Como o objetivo é de

aproveitamento das estruturas presentes no bagaço, e não nos sólidos solúveis, esta

proporção pode ser aumentada sendo feita apenas uma extração, e sendo desprezados os

açúcares e outros componentes.

Segundo Krokida et al. (2000), o bagaço deve ser desidratado por ventilação

com ar a temperatura ambiente e em seguida à temperatura de 60º, 70º até atingir

umidade de 10 – 12%. Porém a prática em laboratório demonstrou que após uma

desidratação parcial à temperatura ambiente o bagaço pode ser colocado diretamente

para secar em estufa com ar forçado à 70ºC, e após 10 horas estará com peso constante.

O processo industrial, bem mais efetivo, parte de uma matéria-prima com 30% de

umidade, sendo desidratado em forno de três estágios durante 5 - 8 minutos com ar

superaquecido (300 - 700º C), embora a temperatura no bagaço não seja superior a 50-

60º C (SCHIEBER et al., 2003).

Com a umidade de 12 g/100g é possível considerar que este produto tem boa

estabilidade físico-química, desde que seja estocado adequadamente em embalagens

herméticas. Este teor de umidade pode ser comparado aos obtidos por Cho e Hwang

(2000), 11,4 g/100g, por Marcon et al. (2005) com 10,02 g/100g para o cultivar gala, e

por Joshi e Kaushal (1995) com 8,2 g/100g. O teor de cinzas de 1,51 g/100g está

compatível aos valores encontrados por Cho e Hwang, (2000), de 1,8g/100g, por

Marcon et al. (2005), de 1,62 g/100g e por Kennedy, (1999), de 2,6 g/100g. O teor de

proteínas de 3,88g/100g apresenta-se compatível com os resultados encontrados por

Cho e Hwang (2000), de 3,7 g/100g, por Marcon et al., em 2005, de 3,03 g/100g, mas

não aos valores encontrados por Kennedy, (1999), de 4,5 g/100g.

O teor de açúcares totais é elevado, mas compatíveis com o relato de Marcon et

al. (2005) com o valor de 35,9 g/100g, de Schemin (2003), com o de 31,78 g/100g, e de

Cho e Hwang (2000), de 27,4 g/100g.

5.2 EFEITO DE DIFERENTES ÁCIDOS NA EXTRAÇÃO DE PECTINA

Na Tabela 5 são apresentadas as quantidades de substâncias pécticas que foram

precipitadas com etanol a 70% a partir do bagaço tratado com diferentes ácidos à 97ºC,

de 1 a 750 mM, durante 10 minutos.

Tabela 5 – Influência dos ácidos no rendimento gravimétrico.

Rendimento, g/100 g

Concentrações

dos ácidos 1mM 5mM 25mM 50mM 100mM 250mM 500mM 750mM

HNO

1,00 2,10 16,09 18,63 19,26 16,39 15,95 14,26

HCl 1,53 1,65 11,45 13,74 16,00 20,23 17,19 13,67

Succínico 0,80 1,60 2,29 3,56 6,44 7,00 3,47 2,70

Láctico 0,69 0,90 0,99 1,49 4,03 4,15 4,33 4,32

TCA 1,33 1,73 9,66 10,44 15,36 17,31 28,64 30,16

Málico 1,25 2,27 3,30 4,91 5,62 10,47 16,52 19,41

Cítrico 1,00 4,00 9,55 12,78 16,73 20,86 28,33 36,67

As análises destes resultados levam à constatação de que existem pelo menos

dois comportamentos distintos, manifestados pela atuação de dois grupos de ácidos.

O primeiro conjunto, que compreende os ácidos nítrico, clorídrico, succínico e

lático, apresentou como resultados um rendimento crescente até a concentração de 100

mM, mantendo o padrão ou diminuindo a quantidade extraída a partir desta

concentração até a de 750 mM. Este comportamento é compatível com uma reação de

hidrólise da protopectina liberando pectinas em baixas concentrações de ácidos e a sua

degradação quando em concentrações mais elevadas. Esta característica é observada

apenas com os ácidos minerais diluídos (HNO

e HCl). Os ácidos orgânicos (succínico

e lático) apesar de apresentarem um perfil semelhante de diminuição do rendimento

acima da concentração de 100 mM, são bem menos eficientes.

O segundo conjunto, representado pelos ácidos tricloroacético, cítrico e málico,

apresentou um rendimento crescente mas com valores que ultrapassaram, em muito, o

teor da pectina existente no bagaço de maçã, estimado ser da ordem de 10 a 15 g/100g

(ENDREß, 2000). Este comportamento, que ocorre com estes ácidos orgânicos, pode

corresponder a uma extração de pectina semelhante a aquela que ocorre com

concentrações de ácidos minerais, mas com a incorporação de grupamentos ácidos

esterificando as hidroxilas C-2 ou C-3 do ácido poligalacturônico ou nas hidroxilas

livres dos açúcares neutros acompanhantes.

A Figura 11 ilustra estes dois tipos de comportamento, sendo que na Figura11-A

o gráfico indica uma extração seguida de uma degradação e na Figura 11- B, indica uma

extração seguida de uma incorporação de grupamentos ácidos na estrutura péctica.

0 200 400 600 800

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

HNO3

HCL

SUC

LAC

0 200 400 600 800

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

TCA

CIT

MAL

(A) (B)

Figura 11 - Rendimento gravimétrico de obtenção das substâncias pécticas com os ácidos nítrico, clorídrico,

succínico

e lático no gráfico A e com os ácidos tricloroacético, cítrico e málico no gráfico B, de 1 a 750 mM.

(HNO

: ácido nítrico; HCl: ácido clorídrico; SUC; ácido succínico; LAC: ácido lático; TCA: ácido

Tricloroacético; CIT: ácido cítrico; MAL: ácido málico)

Marcon (2004), utilizando um planejamento experimental com os fatores tempo

(20 – 80 min.) e temperatura (50-100ºC), extraiu pectina de farinha de maçã do cv Gala

com ácido cítrico à 5g/100g, obtendo rendimentos de 5,7 a 16,8%. Estes resultados

foram compatíveis com os de SCHEMIN (2003), que extraiu 20% de pectina de uma

mistura de variedades de maçã com ácido cítrico (5g/100g) a 100º C durante 110

minutos. Com os resultados encontrados neste trabalho, de 36% de rendimento, é

possível observar que a pectina que se extrai com altas concentrações de ácido cítrico à

temperatura de ebulição do sistema, contenha também outros compostos ou mesmo que

o ácido cítrico tenha sido incorporado, de alguma forma, à estrutura péctica.

Conforme os resultados dos processos de extração com os mesmos sete ácidos,

mas com a concentração máxima de 100 mM, foi possível observar que no primeiro

conjunto, a tendência da reação é logarítmica para os ácidos minerais e linear para os

ácidos orgânicos, enquanto que no segundo conjunto, a tendência é logarítmica para os

três ácidos orgânicos testados (Figura 12).

0 20 40 60 80 100 120

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

HNO3

HCL

SUC

LAC

0 20 40 60 80 100 120

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

TCA

CIT

MAL

(A) (B)

Figura 12 - Rendimento gravimétrico de obtenção das substâncias pécticas com os ácidos diluídos nítrico,

clorídrico, succínico e lático no gráfico A e com os ácidos tricloroacético, cítrico e málico no

gráfico B, de 1 a 100 mM.

As linhas de tendência estão sendo ilustradas na Figura 13 para demonstrar com

mais clareza os dois tipos de comportamento, sem os pontos experimentais.

0 20 40 60 80 100 120

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

Log. (HNO3)

Log. (HCL)

Linear (SUC)

Linear (LAC)

0 20 40 60 80 100 120

Concentração do ácido, mM

Rendimento, g/100g

Log. (CIT)

Log. (TCA)

Log. (MAL)

(A) (B)

Figura 13 - Linhas de tendência dos rendimento gravimétrico de obtenção das substâncias pécticas com os

ácidos diluídos nítrico, clorídrico, succínico e lático no gráfico A e com os ácidos tricloroacético,

cítrico e málico no gráfico B, de 1 a 100 mM.

Estas tendências estão expressas em equações logarítmicas e lineares e seus

coeficientes encontram-se apresentados na Tabela 6 com os respectivos coeficientes de

correlação. De uma forma simples estas equações expressam os mesmos resultados já

apresentados anteriormente, demonstrando um destaque ao ácido nítrico, com

semelhança aparente entre os ácidos clorídrico, cítrico, tricloroacético, e uma baixa

eficiência do ácido málico, desconsiderando-se os coeficientes lineares das equações

dos ácidos succínico e lático porque são muito baixos.

Tabela 6 - Listagem das equações das curvas de tendências e seu coeficiente de

correlação.

Ácido Equação preditiva R

HNO3 Y = 4,652 Ln (x)-1,008 90,59

HCl Y = 3,5108 Ln (x) – 0,5026 90,92

Succínico Y = 0,054x + 0,9835 98,99

Lático Y = 0,0324x + 0,4485 91,35

Cítrico Y = 3,3677 Ln (x) – 0,1768 96,22

TCA Y = 3,0805 Ln (x) – 0,5182 89,82

Málico Y = 0,9436 Ln (x) + 0,9535 94,15

Os rendimentos obtidos a 100 mM com um tempo de reação de 10 min à

temperatura de ebulição(97ºC) do sistema encontram-se ilustrados na Figura 14, com

perfeita semelhanças em relação aos coeficientes de X apresentados anteriormente.

HNO3 HCL SUC LAC TCA CIT MAL

Tipo de ácido, 100 mM

Figura 14 - Quantidade de substâncias pécticas extraídas com diferentes ácidos a 100 mM

O rendimento e a qualidade destes polissacarídeos solúveis em água são afetados

por condições de extração como pH, temperatura, e o tempo de extração. Portanto

condições severas de extração aumentaram o rendimento, mas também a degradação

dos polímeros. Um modelo de estudo pode ser um método muito efetivo para pesquisar

as condições ótimas de extração (CHO; HWANG, 2000).

Ao se levar em conta o comportamento de reação do ácido nítrico em condições

diluídas e observando-se que a concentração de 100 mM representa um equilíbrio em

termos do binômio extração : degradação, e também considerando-se o poder de

corrosão do ácido clorídrico e a duvidosa extração das pectinas com os ácidos

tricloroacético e cítrico, foi selecionado o sistema de ácido nítrico, 100 mM por 10 min

mantendo-se a temperatura de ebulição do solvente como constante para direcionar os

experimentos seguintes.

5.2.1 Estabelecimento da quantidade de matéria-prima no sistema experimental.

Foram testadas 5 gramas de farinha de bagaço com 200 mL de solução ácida,

10g com 400 mL e 25g com 100 mL, a fim de verificar as influências sobre o

rendimento gravimétrico das substâncias pécticas, com concentração de 100 mM, 10

min, 97ºC, e na Tabela 7 são apresentados os resultados destes ensaios.

Tabela 7 – Influência da quantidade de matéria-prima no rendimento gravimétrico.

Matéria-prima (g) Substâncias pécticas (g)

Rendimento (%)

5,206 0,838 16,09

10,006 1,418 14,17

25,017 3,559 14,22

Embora o sistema com 5g/200 mL tenha levado a um rendimento de 16,09

g/100g de substâncias pécticas, rendeu apenas 0,838g quantidade considerada pequena

para a continuidade dos experimentos. Por outro lado com 25g levou ao rendimento

pouco menor 14,22 g/100g, mas por causa do volume houve a necessidade de dividir

em duas porções o que correspondia na prática a uma fração de 12,5g de matéria-prima,

valor não muito diferente do ensaio com 10 g. No ensaio de 10g que se mostrou mais

satisfatório, o rendimento foi de 14,17 g/100g e a quantidade de substâncias pécticas

obtidas de 1,418g foram suficientes para continuidade dos experimentos.

A relação entre as substâncias pécticas extraídas e a matéria-prima confirma que

aumentando a quantidade de matéria-prima será obtida uma quantidade maior de

pectina, embora possa não ser interessante quanto ao rendimento gravimétrico e aos

procedimentos práticos em laboratório.

Na Figura 15 está demonstrado a influência da quantidade de substâncias

pécticas extraídas com o aumento da quantidade de matéria-prima, mostrando que na

realidade os valores são muito próximos.

y = 0,1429x

= 0,9978

0,5

1,5

2,5

3,5

0 5 10 15 20 25 30

Matéria-prima, g

Substâncias pécticas, g

Figura 15 - Relacionamento entre a matéria prima e as substâncias pécticas extraídas

com

HNO

100 mM /10min, 97ºC

Com estes resultados chegou-se a conclusão que 10g de matéria-prima era a

quantidade necessária suficiente para o sistema experimental.

5.3 MODELO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO E DA QUALIDADE DO PRODUTO

Quando uma solução de ácido nítrico é adicionada a uma mistura aquosa

contendo bagaço de maçã em pó, muitas reações hidrolíticas ocorrem, rompendo a

parece celular vegetal com liberação de pectinas solúveis com cadeias laterais contendo

açúcares neutros.

A concentração do ácido, a temperatura e o tempo são fatores que podem

promover também a destruição dos próprios polissacarídeos (CHO; HWANG, 2000).

Segundo estes autores, é preciso lembrar que as condições dos ensaios devem direcionar

o equilíbrio das reações positivas, que liberam os polímeros solúveis em ácido, com as

reações negativas, que hidrolisam as ligações glicosídicas e ésteres.

Um modelo matemático para a extração ácida de pectina a partir de bagaço de

maçã e a determinação de seus graus de esterificação, numa abordagem quantitativa e

qualitativa, respectivamente, são apresentados e discutidos no que diz respeito à sua

validade estatística e relevância prática.

5.3.1 Rendimento gravimétrico do processo de extração

Na Tabela 8 são mostrados os resultados dos experimentos do delineamento

assim como os previstos pelo modelo e os resíduos, que representam as diferenças entre

os dois conjuntos.

Tabela 8 - Resultados do modelo do rendimento gravimétrico.

Rendimento, g/100g Número

do ensaio Visto Previsto Resíduo

1 11,8700 11,4935 0,37653

2 14,8800 15,2885 -0,40850

3 17,1800 16,9655 0,21453

4 18,5400 19,1105 -0,57050

5 19,2600 19,0100 0,24996

6 18,6000 19,0100 -0,41004

7 19,1700 19,0100 0,15996

8 10,7500 10,7676 -0,01755

9 17,5500 17,3384 0,21159

10 14,8200 15,2782 -0,45817

11 20,1300 19,4778 0,65220

Os ensaios em triplicata foram realizados para determinar o desvio padrão, de

0,357911 e o gráfico de dispersão entre os valores vistos e os previstos fornecem uma

linha reta com um coeficiente de correlação R

= 0,9898.

Na Tabela 9 é apresentado o modelo de extração ácida de pectina.

Tabela 9 - Os coeficientes do modelo de extração ácida de pectina

Fatores Coefeciente

de regressão

Erro

padrão

t(5) P Limite de

confiança

95%

Limite de

confiança

Média 19,01 0,33 57,90 0,00 18,17 19,85

(L) 2,32 0,20 11,56 0,00 1,81 2,84

(Q) -2,48 0,24 -10,36 0,00 -3,09 -1,86

(L) 1,48 0,20 7,39 0,00 0,97 2,00

(Q) -0,82 0,24 -3,41 0,02 -1,43 -0,20

1L by 2L -0,41 0,28 -1,45 0,21 -1,14 0,31

= 0,98348; Ajuste = 0,96696; MS Resíduo = 0,3233428

Os resultados mostrados na tabela incluem os efeitos significativos da

concentração do HNO

e do tempo, e não significativo da interação entre os dois. Os

coeficientes negativos para os termos quadráticos indicam que a superfície apresenta um

ponto estacionário máximo.

Na Tabela 10 são apresentados os resultados da análise de variância do modelo

de rendimento gravimétrico.

Tabela 10 - Análise da variância

Fatores Soma

Quadrática

Grau de

liberdade

Média

Quadrática

cal

tab

Regressão 96,25 5 19,25 59,55 11,79 Significativo

Resíduos 1,61 5 0,32

Falta de ajuste 1,26 3 0,45 3,53 0,18 Não Sign.

Erro puro 0,26 2 0,12

Total 97,86 10

% variância explicada = 0,983485 % máxima de variância explicável = 0,997382

Estes resultados confirmaram a significância estatística da regressão tendo em

vista que o F crítico é F(5/5) = 5, 05 e a falta de ajuste não é significativa F(3/2) =

19,16. O modelo é eficaz com um coeficiente de determinação de 98,35% e um ajuste

de 96,70%, tendo uma variância explicável de 98,35% e um máximo explicável de

99,74%.

A Figura 16 (A) ilustra a superfície de resposta do modelo em três dimensões

(3D) e a Figura 16 (B), a sua projeção em curvas de níveis em duas dimensões (2D).

10,912

11,824

12,736

13,649

14,561

15,473

16,385

17,297

18,209

19,122

above

10,912

11,824

12,736

13,649

14,561

15,473

16,385

17,297

18,209

19,122

HNO3, mM

TEMPO, min

-20 20 60 100 140 180 220

(A) (B)

Figura 16 - A influência da concentração de ácido e do tempo sobre o rendimento gravimétrico do processo de

extração de substâncias pécticas ilustradas (A) por superfície de resposta e (B) por curvas de nível.

O elevado efeito da concentração do ácido e o menor efeito do tempo pode ser

observado nesta figura, embora ambos fatores tenham influencia positivas e negativas

(CHO; HWANG, 2000). Pode ser enfatizado que aumentando a concentração e o tempo

ocorre mais extração do que destruição da pectina e que no ponto máximo ambas as

reações estão em equilíbrio. Com a continuidade do aumento da concentração e do

tempo ocorre um predomínio das reações de degradação, com decréscimo do

rendimento. A Figura 16 (B) é útil para identificar as coordenadas do ponto

estacionário, que na realidade encontra-se na região que apresentam altos valores de

rendimento gravimétrico.

As coordenadas do ponto estacionário foram calculadas derivando-se a equação

preditiva em relação a X1 e a X2, e resolvendo as duas equações com as duas

incógnitas, levando aos valores das coordenadas (0,400; 0,814) que decodificadas

representa as condições 126 mM e 14,07 min com um valor máximo de 20,07 g.

Y = 19,01004 + 2,32350*X1 - 2,47928*X1^2 + 1,48502* X2 - 0,81627*X2^2 -

0,41250X1X2

5.3.2 Grau de esterificação

Na Tabela 11 estão apresentados os resultados do planejamento experimental

assim como os previstos pelo modelo e os resíduos, que são as diferença dos dois

conjuntos.

Tabela 11 - Resultados da modelo em grau de esterificação

Grau de esterificação, % Ensaio

Visto Previsto Resíduo

1 67,5700 67,0904 0,47956

2 64,3600 63,7978 0,56222

3 49,5500 48,3342 1,21581

4 47,7300 46,4315 1,29847

5 48,6100 50,7863 -2,17630

6 52,4800 50,7863 1,69370

7 51.2700 50,7863 0,48370

8 69,0100 69,3786 -0,36859

9 42,4300 43,8400 -1,40998

10 57,2200 58,0508 -0,83083

11 53,4300 54,3777 -0,94774

O ensaio feito em triplicata foi usado para determinar o desvio padrão de

1,979508. O gráfico de dispersão entre os valores visto e o previsto mostrou uma

tendência linear com o R

de 97,96%

Na Tabela 12 está apresentado o modelo para o grau de esterificação das

pectinas extraídas.

Tabela 12 – Os coeficientes do modelo em grau de esterificação

Fatores Coeficiente

de regressão

Erro

Padrão

t(5) P Limite de

confiança

95%

Limite de

confiança

95%

Média. 50,78 1,00 50,33 0,00 48,19 53,37

X1(L) -9,03 0,61 -14,61 0,00 -10,61 -7,44

X1(Q) 2,91 0,73 3,96 0,01 1,02 4,80

X2 (L) -1,30 0,61 -2,10 0,09 -2,88 0,30

X2(Q) 2,71 0,73 3,70 0,01 0,82 4,60

1L by 2L 0,34 0,87 0,40 0,71 -1,90 2,60

= 0,97966; Ajuste = 0,95932; MS Resíduo = 3,054288

Na Tabela 12 são apresentados os coeficientes do modelo para o grau de

esterificação das pectinas extraídas e os principais efeitos são negativos e quanto à

concentração de ácido em primeiro lugar e o tempo em seguida, com menor influência,

mas sem explicação estatística. Os coeficientes positivos para ambos os termos

quadráticos indicam que a superfície de resposta apresenta um ponto estacionário

mínimo.

Na Tabela 13 são apresentados os resultados da análise de variância do modelo

de grau de esterificação.

Tabela 13 – Análise da variância do modelo em grau de esterficação

Fatores Soma

Quadrática

Grau de

liberdade

Média

Quadrática

cal

tab

Regressão 735,51 5 147,10 48,16 9,53 Significativo

Resíduos 15,27 5 3,05

Falta de ajuste 7,43 3 2,47 0,63 0,03 Não Sign.

Erro puro 7,83 2 3,92

Total 750,78 10

% variância explicada = 0,979658 % variância máxima explicável = 0,989559

Estes resultados confirmam a significância estatística da regressão tendo em

vista que o F(5/5) crítico é 5,05 e a falta de ajuste não é significativa F(3/2) = 19,16. O

modelo é eficaz com um coeficiente de determinação de 97,96% e um ajuste de 95,93%,

tendo uma variância explicável de 97,96% e uma máxima variância explicável de

98,95%.

A Figura 17 (A) ilustra a superfície de resposta do modelo em 3D e a Figura 17

(B), a sua projeção em curvas de níveis em 2D.

48,181

52,574

56,967

61,360

65,753

70,146

74,539

78,933

83,326

87,719

above

46,353

48,917

51,482

54,047

56,612

59,176

61,741

64,306

66,871

69,435

HNO3, mM

Tempo, min

-20 20 60 100 140 180 220

(A) (B)

Figura 17 - A influência da concentração de ácido e do tempo sobre a qualidade do produto ilustrada (A) por

superfície de resposta e (B) por curvas de nível.

Os elevados efeitos negativos da concentração de ácido e do tempo sobre o grau

de esterificação são visíveis, como esperado, pois as condições favoreceram a reação de

desmetoxilação, que transformou HMP em LMP (CONSTENLA; LOZANO, 2003). A

Figura 17 (B) é útil para ter uma idéia das coordenadas para os valores mais baixos do

grau de esterificação da pectina extraída, que aparentemente está nos limites do domínio

do delineamento experimental. A qualidade das pectinas está diretamente relacionada à

concentração e ao tipo do ácido, à temperatura e ao tempo de reação (SCHEMIN, 2003)

e o modelo aqui apresentado dá suporte à predição da quantidade e da qualidade dos

produtos.

As coordenadas do ponto estacionário foram calculadas derivando-se a equação

preditiva em relação a X1 e a X2, e resolvendo as duas equações com as duas

incógnitas, levando aos valores das coordenadas (1,546; 0,140) que decodificadas

representam as condições 200 mM e 10,07 min com um valor máximo de 43,73 g.

Y = 50,78548 - 9,03123*X1 + 2,91368*X1^2 - 1,29713*X2 + 2,71461*X2^2 +

0,34565X1X2

Na Tabela 14 são mostrados os valores das coordenadas do ponto estacionário

de cada modelo.

Tabela14 – Valores preditos em coordenadas específicas

Variável codificada Variável decodificada

X1 X2 HNO3 mM Tempo, min

Rendimento

g/100g

DE %

0 0 100 10 19,01 50,78

0,400 0,814 126 14,07 20,07 48,49

1,546 0,140 200 10,07 16,77 43,73

O modelo relacionado ao rendimento gravimétrico da extração de pectina foi

utilizado para encontrar as coordenadas do ponto estacionário que representa um valor

máximo uma vez que os dois coeficientes dos termos quadráticos são negativos. A

aplicação da fórmula mostra o valor máximo de pectina, de 20,07 g/100 g quando a

concentração de HNO

é 126 mM com um tempo de reação de 14, 07 min. Nestas

condições, o grau de esterificação, calculado pelo modelo adequado, deve ser 48,49%.

Estas coordenadas não estão muito distantes das coordenadas do ponto central do

planejamento experimental.

O modelo apresentado com relação ao grau de esterificação foi utilizado para

encontrar as coordenadas do ponto estacionário que representa o valor mínimo uma vez

que ambos os coeficientes quadráticos são positivos. O mais baixo grau de esterificação

foi 44,3 % quando a concentração de HNO

foi 200 mM e o tempo de reação é de

10,07 min. Nestas coordenadas o modelo para o rendimento gravimétrico prevê o valor

de 16,77 g/100g.

Nas coordenadas do ponto central do planejamento de experimentos (100 mM;

10 min) o valor esperado é de 19,01 g/100 g se aproxima do previsto máximo de 20,07

g/100 g uma vez que representa um diferencial menor que 5% sendo ainda que ambos

os valores estão categorizadas em dois níveis contíguos na projeção 2D da superfície de

resposta. Deve ser lembrado que a sensibilidade dos procedimentos práticos de obtenção

de pectina está muito aquém dos cálculos teóricos o que pode ser observado pelo desvio

padrão dos ensaios do ponto central feito em triplicata.

Existe uma grande diferença entre ambos os conjuntos de coordenadas que

representam os pontos estacionários dos dois modelos. Os melhores resultados são

encontrados nas coordenadas escolhidas como o ponto central do desenho experimental

por que há um elevado rendimento gravimétrico 19,01 g/100 g de uma LMP (50,78%).

Deve ser mencionado ainda que tais condições devem proporcionar uma pectina menos

despolimerizada com um grau de esterificação mais próximo de 50%.

5.4 CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DAS PECTINAS EXPERIMENTAL E

COMERCIAIS.

A amostra de pectina experimental, extraída com HNO

100 mM a 97º C por 10

minutos, foi comparada com as amostras de pectinas comerciais de alto e baixo grau de

esterificação de acordo com suas características titulométricas, espectroscópicas FT-IR,

cromatográficas incluindo exclusão estérica e composição em açúcares neutros.

5.4.1 Características de qualidade titulométricas

Pelo método titulométrico foram determinadas as características de qualidade

que compreendem os teores de ácidos anidrogalacturônico (AUA) e de metoxilas

(MeO), cuja soma representa o percentual de ácido poligalacturônico (fração ácida),

sendo o restante o percentual acompanhante de açúcares neutros (fração neutra) da

pectina (100%). O grau de esterificação (DE) independe da quantidade de massa uma

vez que pela fórmula utilizada trata-se de uma razão entre a fração ácido

anidrogalacturônico metoxilado e a fração ácido anidrogalacturônico total.

Os resultados da comparação estão apresentados na Tabela 15.

Tabela 15 – Característica titulométrica das pectinas experimental e comerciais.

Amostra AUA MEO DE Fração ácida Fração neutra

HNO

53,75± 2,90 4,81±0,81 50,78±6,74 58,57±3,62 41,43±3,62

HMP 61,41± 0,42 8,45±0,075 75,7±0,17 69,83±0,49 30,17±0,49

LMP 55,99 ± 0,24 5,02±0,035 49,34±0,42 60,98±0,25 39,02±0,25

(* amostra experimental = ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

HMP: pectina de alta esterificação;

LMP: pectina de baixa esterificação

Existe uma semelhança entre a amostra experimental e a amostra LMP

comercial em termos de conteúdo de ácido poligalacturônico, com valor médio de

55,99%, o que difere dos 61,41% da amostra HMP comercial. Este fato se repete quanto

ao teor de metoxila, com valor médio de 4,81% e que difere em muito do valor 8,45%

da amostras HMP comercial. Portanto a amostra experimental se assemelha mais à

amostra comercial LMP do que à HMP, em termos de teores de ácido poligalacturônico

e metoxilas. Os valores encontrados para ácido poligalacturônico totais são inferiores

aos 65% preconizados pela FAO (WILLATS; KNOX; MIKKELSEN, 2006), portanto a

fração neutra será superior aos 35% uma vez que a soma das frações representa o total

das substâncias pécticas.

A determinação do grau de esterificação leva à mesma conclusão, pois a amostra

experimental (50,78%) tem um valor mais próximo da LMP (49,34%) do que da HMP

(75,7%).

A Figura 18 foi elaborada com os resultados das análises titulométricas para

ilustrar

as semelhanças e diferenças entre as três amostras de pectina.

(%)

HNO3 LMP HMP

Tipos de pectinas

AUA

MEO

FRAÇÃO ÁCIDA

FRAÇÃO NEUTRA

Figura 18 - Características de qualidade físico-química de pectinas (AUA: ácido

Anidrogalacturônico, MEO: teor de metoxilas, DE: grau de esterificação).

5.4.2 Características de qualidade espectroscópica de infravermelho (FT-IR)

As pectinas extraídas sob aumento da quantidade de matéria-prima foram

analisadas quanto ao grau de esterificação, utilizando espectroscopia de infravermelho

(FT-IR), que permite identificar grupos funcionais em diferentes regiões do espectro.

Os autores Monsoor, Kalapathy e Proctor (2001) demonstraram que a faixa entre

1000 e 2000 cm

-1

é a região importante para identificação de grupos funcionais do ácido

galacturônico, uma vez que as carboxilas livres absorvem em aproximadamente 1620

-1

e as esterificadas em 1750 cm

-1

. A ampla e forte faixa de absorção entre 2400 e

3600 cm

-1

corresponde aos estiramentos dos grupos hidroxilas relativos à umidade das

amostras de pectina. Os picos na faixa entre 3000 e 2800 estão relacionados ás ligações

C-H e CH

dos grupamentos metil éster. A região mais importante para a determinação

do grau de esterificação das pectinas é aquela relacionada diretamente aos grupos

carboxílicos apesar da influência das demais.

Na Figura 19(A, B e C) estão apresentados os espectros de infravermelho, em

transmitância, das pectinas isoladas sob idênticas condições, porém com maior

quantidade de matéria-prima. A média dos valores do grau de esterificação encontrado,

de 42,7% ± 0,814%, está coerente com valor convencional de pectinas de baixos teores

de esterificação (LMP) e demonstram espectros com perfis característicos. O valor

médio encontrado é todavia relativamente mais baixo do que os 51% calculados por

titulometria e apresentado na Tabela 15, sugerindo a importância da contribuição de

outras bandas na determinação do valor correto (MONSOOR, KALAPATHY;

PROCTOR, 2001). Marcon (2004), entretanto, apresentou os espectros FT-IR de duas

amostras padrões de pectinas de alto (89 % e 67%) e uma de baixo (22 %) grau de

esterificação, evidenciando as diferenças precisamente nas freqüências anteriormente

citadas, especificamente dos picos referentes às carboxilas livres e esterificadas.

A) 5g / 200 mL, 100 mM, 10 min., 97 ºC. DE = 43,1%

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

B) 10 g / 400 mL, 100 mM, 10 min., 97 ºC. DE = 43,3 %

C) 25g / 1000 mL, 100 mM, 10 min., 97 ºC. DE = 41,8 %

Figura 19 - Caracterização espectroscópicas FT-IR das substâncias pécticas extraídas com ácido

nítrico (100 mM; 10 min; 97ºC) a partir de 5 g/200 g (A); 10 g/400g (B) e 25 g/1000g (C).

Os espectros de transmissão por FT-IR da amostra experimental e comerciais de

pectinas são apresentados na Figura 20 para comparação do perfil espectroscópico. Com

esta análise é possível avaliar a qualidade da pectina extraída experimentalmente e

compará-las com a literatura disponível, pois a amostra experimental apresentou o

mesmo perfil comprovando a sua semelhança com as pectinas extraídas industrialmente.

A amostra experimental demonstrou maior semelhança à amostra comercial de baixa

esterificação (LMP) tanto ao perfil espectroscópico quanto ao grau de esterificação

70.0

80.0

90.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

70.0

80.0

90.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

calculado pela razão das áreas dos picos relativos aos grupamentos carboxílicos

esterificados e pela área total dos picos relativos aos grupamentos carboxílicos totais.

A) HNO

ponto central 100 mM 10 min/97ºC; DE =44%

B) FT-IR da amostra HMP comercial; DE = 62%

C) FT-IR da amostra LMP comercial; DE = 49%

Figura 20 - Espectroscopia de infravermelho das amostras experimental (A) e comerciais (B) e

(C).

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

70.0

80.0

90.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

80.0

85.0

90.0

95.0

100.0

500.01000.01500.02000.03000.04000.0

1/cm

5.4.3 Características de qualidade cromatográfica

Com o emprego de técnicas cromatográficas foram qualificadas as amostras de

pectina quanto à sua dispersão em tamanho molecular com permeação em gel, tendo

sido detectados por espalhamento de luz em multiângulos (LS) - cor vermelha, e pelo

índice de refração (IR) - cor azul. Também foram caracterizadas as pectinas por

cromatografia gasosa com relação aos seus conteúdos em açúcares neutros, reduzindo-

os à alditóis e confirmando sua estrutura por espectroscopia de massa.

5.4.3.1 Cromatografia de exclusão estérica (HPSEC-MALLS)

Na Tabela 16 são mostrados os resultados da cromatografia em HPSEC-MALLS

das três amostras de pectina em termos e tempos de retenção considerando o detector de

espalhamento de luz (LS- 90º) e índice de refração.

Tabela 16 - Tempo de retenção de pectinas em minutos.

Amostra Tempo inicial Tempo do pico Tempo final Amplitude

HNO

* 33,56 37,29 44,07 10,51

HMP 34,00 38,00 46,67 12,67

LMP 34,24 38,64 47,80 13,56

(* amostra experimental = ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

A análise dos tempos iniciais de retenção ao valor médio de 33,56 min indica

que se trata de polímeros de elevada massa molecular, enquanto a amplitude dá uma

idéia da distribuição das moléculas.

A amostra de pectina experimental apresentou menor tempo de retenção mesmo

assim semelhante às amostras comerciais eluindo moléculas maiores primeiro como

sugere a técnica cromatográfica, entretanto o índice de refração representa uma

distribuição heterogênea com moléculas de tamanhos variados.

A Figura 21 ilustra com os cromatogramas das amostras de pectina.

(A)

(B)

(C)

Figura 21 - Cromatogramas em HPSEC-MALLS das amostras de pectina comercial (A) HMP e (B) LMP

e (C) amostra experimental = HNO3, 100 mM, 10 min, 97ºC, (Gráfico vermelho: espalhamento

de luz (LS); em azul: índice de refração (IR)).

Os perfis das três amostras se apresentam semelhantes com o tempo de eluição

das moléculas de alta massa molar em aproximadamente 34 min, representado pelo

gráfico em vermelho referindo-se ao espalhamento de luz. O índice de refração,

representado pelo gráfico em azul, confirma a distribuição da maior quantidade de

moléculas de pectina com tempo de eluição por volta de 45 min.

As frações extraídas de bagaço desidratado de maçã por Marcon (2004)

segundo um planejamento fatorial 2

e triplicata do ponto central, com ácido cítrico a

5g% apresentaram perfis com tempos de eluição variando de 34 a 38 min o que revela

uma massa molar semelhante à encontrada neste trabalho, com eluição em 34 min,

embora as condições de extração tenham sido diferentes.

5.4.3.2 Composição em monossacarídeos (GLC)

Na Tabela 17 são apresentados os tempos de retenção em cromatografia líquido-

gasosa dos padrões de açúcares e os dos açúcares presentes nas amostras, mediante os

quais estes podem ser identificados por comparação.

Tabela 17 - Identificação dos açúcares neutros pela mobilidade cromatográfica(GLC).

Velocidade de eluição, min.

Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc

Padrões 7,902 8,137 9,592 11,284 15,967 17,236 18,902

Amostra* 7,904

± 4,84

8,150 9,596

± 5,17

11,297

± 8,41

16,099

± 118,26

17,256

± 10,28

18,943

± 24,75

(* amostra experimental, ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

Além de terem sido identificados os açúcares que são considerados como parte

da estrutura, nominalmente a ramnose, arabinose, galactose, xilose e manose, foi

constatada a presença de fucose, um açúcar considerado raro em pectinas, na amostra

extraída experimentalmente de bagaço de maçã.

De acordo com Kravitchenko, Voragen e Pilnik (1991), os açúcares arabinose,

galactose, xilose e glucose estão ligados ao carbono 4 da ramnose, embora os três

primeiros já tenham sido encontrados ligados aos resíduos de ácido galacturônico e a

fucose, embora considerada um açúcar raro, já foi encontrado em certas substâncias

pécticas sem que se tenha determinado o local de sua ligação.

Na Tabela 18 são apresentados os resultados da análise por espectroscopia de

massa dos eluatos da cromatografia gasosa, sendo indicados os fragmentos moleculares

considerando a sua intensidade relativa por ordem decrescente.

Tabela 18 - Identificação dos açúcares neutros pela composição dos fragmentos obtidos

em espectrógrafo de massa

Fração Rha % Fuc % Ara % Xyl % Man % Gal % Glc %

Padrões

128 115

85 99

187

128 115

187 85

99 155

115 85

187 127

145 217

115 85 145

127 103

217 187

139 115 187

97 127

85 145

139 115

187 127

85 97

115 139 187

127 85 97

145

HNO

128 115

85 99

187

128 115

85 100

187 155

115 85 187

127 145

217

115 85 145

127 103

217 187

139 115 97

187 127

85 145

139 187

115 127

85 97

139 115 187

127 85 97

145

HMP 128 115

85 99

115 85 127

187 145

217

115 85 145

103 127

217

139 115 127

97 85

187

139 115

187 127

85 97

115 139 127

187 85 97

145

LMP 115 128 85

115 85

145 127

217

115 85 145

127 103

217

139 115 97

127 85

187

139 187

115 127

85 97

115 139 187

127 85 97

145

(* amostra experimental, ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

Na Tabela 19 são apresentados os teores relativos de açúcares neutros presentes

nas frações experimental e comerciais de pectina como parte agregada à estrutura do

polissacarídeo ácido.

Tabela 19 - Proporção relativa de açúcares neutros identificados nas amostras

Fração Rha % Fuc % Ara % Xyl % Man % Gal % Glc %

HNO

* 3,44 0,72 8,01 11,93 3,65 40,51 31,70

HMP 2,16 - 19,58 7,55 1,31 49,70 19,70

LMP 3,65 - 4,34 12,40 2,87 56,23 20,47

(* amostra experimental = ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

É possível observar que as proporções dos componentes monossacarídicos

neutros da fração experimental são intermediárias se comparados com as frações

comerciais no que diz respeito à ramnose, arabinose e xilose, mas são mais elevadas

quanto à manose e glucose. Na amostra experimental foi encontrada a menor proporção

de galactose e também de fucose, uma metil-pentose, usualmente não presente em

amostras de pectinas.

Na Tabela 20 estão apresentados os resultados combinados do método

titulométrico, que fornece as proporções da fração ácida, com os do cromatográfico, que

possibilita estabelecer as proporções de cada um dos açúcares neutros. Nesta tabela

constam os valores relativos às metoxilas apenas para completar os valores em 100%.

Tabela 20 - Proporção relativa dos açúcares neutros e ácidos

Cadeia principal Cadeias laterais

AUA MeO Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc

Fração

HNO

* 53,75 4,81 1,42 0,29 3,31 4,95 1,51 16,78 13,31

HMP 61,41 8,45 0,65 0 5,90 2,27 0,40 14,99 5,94

LMP 60,00 5,02 1,27 0 1,51 4,33 1,00 19,66 7,16

(* amostra experimental = ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

Os teores de ácido galacturônico e de metoxilas já caracterizaram a amostra

experimental como de baixo grau de esterificação, e nesta tabela pode ser observado que

os teores de ramnose são semelhantes nas duas amostras. Na amostra experimental

foram encontrados resíduos de fucose, açúcar considerado raro em pectina de maçã mas

já relatado por Renard, Crepeau e Thibault (1995) e por Marcon (2004).

Na Tabela 21 estão apresentadas as razões entre os percentuais dos açúcares que

fazem parte da cadeia principal e parte das cadeias laterais.

Tabela 21 - Relações entre os açúcares da cadeia principal e os das cadeias laterais

Fração Acido galacturônico

por ramnose

Galactose + arabinose

por ramnose

Galactose + arabinose

por ácido galacturônico

HNO

* 37,85 14,17 0,37

HMP 94,48 32,14 0,34

LMP 47,24 16,67 0,35

(* amostra experimental = ácido HNO

, 100 mM, 10 min, 97ºC)

A relação entre ácidos galacturônicos e ramnose indicam quantas moléculas do

acido fazem parte da cadeia por unidade de ramnose. Os valores encontrados para as

pectinas de baixa metoxilação foram de 47, 24:1 e 37, 85:1 para as frações comercial e

experimental, respectivamente; no caso de HMP a relação é 94, 48:1. De acordo com

Wang; Pagán e Shi, (2002) as razões encontradas foram de 25:1 a 35:1, o que significa

que existe um resíduo de ramnose a cada 25-35 resíduos de ácido galacturônico.

Entretanto, segundo Renard, Crépeau e Thibault (1995) a ramnose está presente na

pectina de maçã em uma proporção de 22% na fração ácida e o restante na fração

ramificada, o que acarreta um número muito maior de resíduos de ácido galacturônico

por unidade de ramnose.

As proporções da somatória dos dois principais açúcares neutros das pectinas,

arabinose e galactose com a ramnose indicam as possibilidades de tamanho de cadeia

lateral. Neste estudo as pectinas de baixo teor de metoxilas apresentaram valores de 14,

17:1 e 16, 67:1, muito diferentes do valor encontrado para a HMP, que foi de 32:1.

Como há possibilidade de ligações da galactose e da arabinose diretamente no ácido

urônico (KRAVTCHENKO; VORAGEN; PILNIK, 1991), foi calculada a proporção da

somatória dos dois açúcares e os valores encontrados são baixos e da mesma ordem de

grandeza para todas as amostras.

A Figura 22 ilustra a proporção dos ácidos urônicos e da somatória dos açúcares

galactose e arabinose por unidade de ramnose.

100

HNO3 LMP HMP

Tipos de pectinas

Proporção, %

AUA/Rha

GalAra/Rha

Figura 22 - Proporção dos ácidos urônicos e da somatória dos açúcares galactose e arabinose por

unidade de ramnose.

6 CONCLUSÕES

O teor de umidade de 11% é adequado para o armazenamento do bagaço em pó,

sendo que a composição físico-química apresentou 29% de açúcares redutores totais e

36% de fibras, incluindo as pectinas, em base seca.

O processo de solubilização da protopectina de bagaço de maçã com diferentes

ácidos de 1 a 750 mM (10 min/100ºC), definiu o ácido nítrico como melhor agente

extrator.

Com ácidos diluídos até 100 mM o processo de extração seguiu tendências

logarítmicas ou lineares com R

> 95%.

O ensaio mais adequado para extração de pectina em laboratório foi com 10 g de

bagaço em pó em 400 mL de volume total.

O planejamento experimental foi eficiente para o rendimento com resultados

significativos ao nível de 98%.

O grau de esterificação apresentou resultados significativos e confirmou a

extração de uma pectina de baixo grau de esterificação (LMP).

A amostra experimental apresentou proporções distintas de monossacarídeos

assim como as amostras comerciais.

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